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Transcrição

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
ALINE MARIA ORBOLATO GONÇALVES-ZULIANI
Resistência de genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) ao cancro cítrico e
diversidade genética de Xanthomonas citri subsp. citri
Maringá
2014
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Agronomia do Departamento de
Agronomia, Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Estadual de Maringá, como
requisito parcial para obtenção do título de
Doutor em Agronomia.
Área de concentração: Proteção de Plantas
Orientador: Prof. Dr. William Mário de
Carvalho Nunes
Maringá
2014
FOLHA DE APROVAÇÃO
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Agronomia do
Departamento de Agronomia, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de
Maringá, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Agronomia pela
Comissão Julgadora composta pelos membros:
COMISSÃO JULGADORA
Prof. Dr. William Mário de Carvalho Nunes
Universidade Estadual de Maringá (Presidente)
Prof. Dr. Dauri José Tessmann
Universidade Estadual de Maringá
Prof. Dr. José Belasque Júnior
Universidade de São Paulo
Prof.ª Dr.ª Terezinha Aparecida Guedes
Universidade Estadual de Maringá
Prof.ª Dr.ª Rubia Molina de Oliveira
Instituto Agronômico do Paraná
Aprovada em: 19 de fevereiro de 2014.
Local da defesa: Núcleo de Pesquisa em Biotecnologia Aplicada (NBA), Bloco S09, campus
Universidade Estadual de Maringá (UEM), Maringá-PR.
À
Meu Pai Moisés (in memoriam),
“Onde quer que estejas sempre estarei ao seu lado.”
Moisés Orbolato
À
Minha Mãe Maria Aparecida,
“Se tiverem Fé do tamanho de uma semente de mostarda,
poderão dizer a esta amoreira: ‘Arranque-se e plante-se
no mar’, e ela oobedecerá.”
Lc 17:6
Ao
Meu marido Diogo,
“Provai e vede como o Senhor é bom. Feliz o homem
que se refugia junto dele.”
Salmo33
DEDICO
ii
AGRADECIMENTOS
A DEUS pela vida e sabedoria em todos as decisões e caminhos seguidos.
Ao Prof. Dr. William Mário de Carvalho Nunes, pelos ensinamentos, dedicação,
perseverança, exemplo profissional e amizade.
Ao Pesquisador Dr. José Belasque Junior, pela dedicação, exemplo profissional e
amizade.
Ao Núcleo de Pesquisa em Biotecnologia Aplicada (NBA), da Universidade Estadual
de Maringá, pela disponibilidade dos laboratórios para execução dos experimentos.
Ao Programa de Pós-graduação em Agronomia (PGA), pela oportunidade de
inclusão no curso.
Aos funcionários do PGA, Érica e Reinaldo pelo auxilio e amizade.
Á Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
apoio financeiro.
Ao Viveiro de Mudas Pratinha (VMP) e Empresa Pratinha pela disponibilidade e
fornecimento de materiais e mão-de-obra.
Aos Srs. José Gilberto Pratinha, Antonio Pratinha, Waldemar Zanini Junior
(Waldemar Junior Zanini (sic)) e Ismael Lopes pelo auxilio, ensinamentos e entusiasmo com
a citricultura Paranaense.
As empresas Citri e Corol pela disponibilidade de realização dos trabalhos.
À Secretaria de Agricultura e Abastecimento (SEAB), representada pelos Srs. José
Croce Filho e Dirlene Rinald, pela disponibilização de mão-de-obra e locomoção durante os
experimentos.
Aos Funcionários da SEAB, Geraldo e Zeca pelo auxílio nas avaliações dos
experimentos de campo.
Aos amigos Carlos Alexandre Zanutto e José Alcides Remolli, pela dedicação na
execução dos experimentos e pela amizade.
As amigas do NBA, Aline Sauer, Elisangela Mendes, Paula Thais e Larissa e tantos
outros que colaboraram com o trabalho e amizade.
Ao amigo Heraldo Takao pelo auxílio nas análises realizadas no trabalho e pela
amizade.
A Professora Terezinha Aparecida Guedes pelo auxilio nas analises estatísticas.
iii
Ao Professor Celso Vataru Nakamura e as bolsistas Kátia Kern e Ligia Ceole pelo
auxílio nas análises de Microscopia eletrônica de varredura, junto a Central de Microscopia
(CMI)-COMCAP/UEM.
À amiga Rubia Molina, pelos conselhos, exemplo de vida e amizade.
À tia Maria Irene Benini, pelo exemplo de vida e motivação profissional.
Aos amigos Vandercleisson, André, Bruno, Thais, Nayra, Leandro e Suzamar, pela
presença em todos os momentos de minha vida.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho,
OBRIGADA.
iv
“Se eu não sei o caminho, Tu bem o conheces. Isso torna a minha alma tranquila e cheia
de paz. Por isso vã é minha preocupação e o pulsar angustiado do meu coração.”
Oração a Maria de Schoenstatt
v
RESUMO
O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri é uma das doenças mais
importantes da citricultura. A utlização de genótipos resistentes à doença assume um papel
importante no manejo e controle do patógeno, sendo essa uma medida viável ao produtor e
sustentável ao ambiente. O objetivo deste estudo foi avaliar genótipos de citros quanto a sua
resistência ao cancro cítrico em condições de campo, casa de vegetação e folhas destacadas,
além de avaliar a diversidade genética de Xanthomonas citri em pomares comerciais e
experimental do estado do Paraná, Brasil. Foram avaliados 25 genótipos de laranja doce,
variedade Pêra em três regiões do Estado do Paraná, Congonhinhas, Cornélio Procópio e
Paranavaí, além da influência dos porta-enxertos limão cravo, tangerina sunki, tangerina
cleópatra e laranja caipira sobre os mesmos. Para avaliação da incidência e severidade em
folhas e frutos foram utilizadas escalas diagramáticas.
Esses mesmos genótipos foram
avalaliados em condições de casa de vegetação por inoculação do inoculo de X. citri e medida
do diâmetro da lesão. Em metodologia de folhas destacadas e inoculação artificial foram
comparados genótipos de citros com diferentes graus de resistência. Além disso, através de
análise PCR, utilizando marcadores microssatélites, foi verificada a diversidade genética de X.
citri subsp. citri em pomares comerciais e experimental do Paraná. Dentre os genótipos
analisados, as laranjas Pêras EEL e Ovale Siracusa se destacaram com maior resistência ao
cancro cítrico em folhas e frutos, em todos os locais avaliados. O mesmo ocorreu em
condições de casa de vegetação para o genótipo EEL, apresentando os menores diâmetros de
lesão. O porta-enxerto influenciou na resistência dos genótipos de laranja Pêra, sendo que
plantas enxertadas sobre laranja caipira apresentaram menores incidências e severidades em
folhas e frutos se comparado às enxertadas sobre limão cravo. A metodologia de folhas
destacadas mostrou ser uma importante ferramenta na avaliação da resistência de genótipos
cítricos ao cancro cítrico, permitindo diferenciar os genótipos Pêra IAC e Washington navel
quanto ao diâmetro de lesão. Pêra IAC mostrou maior resistência ao patógeno, apresentando a
menor média de diâmetro de lesão (1,32mm), se comparado a Washington navel (1,84 mm).
Essa maior resistência mostrada pela Pêra IAC pode estar relacionada à menor abertura
estomática e maior liberação de produtos químicos tóxicos no meio, sendo importantes
barreiras físicas e químicas contra a agressividade de Xanthomonas citri. Nos estudos de
vi
diversidade genética, foi observado que a origem e o hospedeiro não influenciaram na
diferenciação entre os isolados. Sugerindo que as populações de X. citri subsp. citri
encontradas no Paraná são clonais, com forte ligação epidemiológica.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Laranja Pêra. Marcadores Microssatélites. Porta-enxertos.
Suscetibilidade.
vii
Genotypes resistance of sweet orange (Citrus sinensis) to citrus canker and
genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri
ABSTRACT
Citrus canker caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri is one of the most
important diseases of citrus. The use of resistant genotypes plays an important role in the
management and control of the pathogen, being a viable measure for the producer and
sustainable for the environment. The scope of this study was to evaluate citrus genotypes and
its resistance to citrus canker in field, greenhouse and detached leaves, in addition to assessing
the genetic diversity of Xanthomonas citri in commercial and experimental orchards of Paraná
State, Brazil. 25 sweet orange genotypes of Pera variety were evaluated in three regions of
Paraná State, Congonhinhas, Cornélio Procópio and Paranavaí, beyond the influence of
rootstocks, Rangpur lime, sunki tangerine, cleopatra tangerine and caipira orange on them.
Diagrammatic scales were used to assess the incidence and severity on leaves and fruits.
These genotypes were evaluated in greenhouse conditions by inoculating the X. citri inoculum
and measuring the lesions diameters. Citrus genotypes with different degrees of resistance
were compared by using the methodology of artificially inoculated detached leaves.
Furthermore genetic diversity of X. citri subsp. citri in commercial and experimental orchards
of Paraná was verified by PCR analysis using microsatellite markers. Among the analyzed
genotypes and in all evaluated sites, EEL Pera oranges and Ovale Siracusa stood out with
more resistant to citrus canker on leaves and fruits. A similar situation occurred in greenhouse
conditions for EEL genotype, which had the smallest diameter of lesion. The rootstock
affected the resistance of Pera orange genotypes whereas plants grafted on caipira orange
showed lower incidence and severity on leaves and fruits compared to grafted on Rangpur
lime. The detached leaves methodology showed to be an important tool in the evaluation of
citrus genotypes resistance to citrus canker, enabling the differentiation of the Pera IAC and
Washington navel genotypes in relation to the lesions diameters. Pera IAC exhibited greater
resistance to the pathogen, showing the smallest average of lesion diameter (1.32 mm), when
compared to Washington navel (1.84 mm). This greater resistance demonstrated by Pera IAC
may be related to lower stomatal density and increased release of toxic chemicals in the
environment, being important physical and chemical barriers against aggressiveness of
Xanthomonas citri. In studies of genetic diversity was observed that the origin and the host
viii
did not influence the differentiation among the isolates. Suggesting that populations of X. citri
subsp. citri found in Parana are clonal, with strong epidemiological link.
Keywords: Citrus canker. Microsatellite markers. Pera orange. Rootstocks. Susceptibility.
ix
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE LARANJA DOCE PÊRA (Citrus sinensis) À
Xanthomonas citri subsp. citri EM CONDIÇÕES DE CAMPO
Tabela 1.
Genótipos de laranja Pêra utilizados no experimento de avaliação do cancro
cítrico, com sua respectiva procedência. ............................................................. 29
Tabela 2.
Nota na planta, incidência de folhas doentes nos ramos, número de lesões e
severidade em folhas de genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) variedade Pêra
plantados em pomar comercial de Congonhinhas, PR. ....................................... 32
Tabela 3.
plantados em pomar comercial de Cornélio Procopio, PR. ................................. 33
Tabela 4.
plantados em pomar comercial de Paranavaí, PR................................................ 34
Tabela 5.
Incidência e severidade de cancro cítrico em frutos de 25 genótipos de laranja
Pêra em experimento instalado em Paranavaí, PR. ............................................. 35
Tabela 6.
Avaliação da produção de 25 genótipos de laranja doce Pêra (Citrus sinensis) em
pomares comerciais dos municípios de Cornélio Procópio (CP) e Paranavaí
(Pvaí), PR. ......................................................................................................... 37
Tabela 7.
Características físico-químicas dos frutos de 25 genótipos de laranja Pêra (Citrus
sinensis) em experimentos de Corn. Procópio e Paranavaí.................................. 39
CAPÍTULO II
AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE PÊRA (Citrus sinensis) AO
CANCRO CÍTRICO EM CONDIÇÕES DE CASA DE VEGETAÇÃO
x
Tabela 1.
Genótipos de laranja Pêra utilizados no experimento de casa de vegetação,
visando resistência ao cancro cítrico, com sua respectiva procedência. ............... 54
CAPÍTULO III
AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE LARANJA DOCE PÊRA (Citrus
sinensis) À Xanthomonas citri subsp. citri ENXERTADOS SOBRE DIFERENTES PORTAENXERTOS
Tabela 1.
Genótipos de laranja doce Pêra sobre os porta-enxertos limão cravo, tangerina
sunki, tangeria cleópatra e laranja caipira. .......................................................... 76
Tabela 2.
severidade em folhas de genótipos de laranja doce (C. sinensis) variedade Pêra
enxertado sobre diferentes porta-enxertos, durante o período de 2010 a 2012. .... 80
Tabela 3.
Incidência e severidade de cancro cítrico em frutos de nove genótipos de laranja
Pêra enxertados sobre limão cravo (LC), tangerina sunki (TS), tangerina cleópatra
(TC) e laranja caipira (LCaip). ........................................................................... 81
Tabela 4.
Estatísticas Descritivas do volume de copa observado para os porta-enxertos
limão cravo, tangerina sunki, tangerina cleópatra e laranja caipira. ..................... 82
Tabela 5.
Avaliação da produção e análise físico-química dos frutos de nove genótipos de
laranja Pêra enxertados sobre quatro porta-enxertos. .......................................... 84
CAPÍTULO IV
REAÇÃO DE ESPÉCIES CÍTRICAS À Xanthomonas citri subsp. citri EM FOLHAS
DESTACADAS
Tabela 1.
Médias dos diâmetros das lesões comparando as diferentes variedades de laranja
doce estudadas. ................................................................................................ 101
xi
CAPÍTULO V
DIVERSIDADE GENÉTICA DE Xanthomonas citri subsp. citri EM POMARES DO
NOROESTE PARANAENSE COM USO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES
Tabela 1.
Isolados de X. citri subsp. citri de pomares citrícolas comerciais e experimental de
quatro regiões do Estado do Paraná, Brasil. ...................................................... 121
Tabela 2.
Descrição dos primers microssatélites testados nos isolados de X. citri subsp. citri
de pomares comerciais e experimental do Paraná, Brasil. ................................. 123
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Figura 1. Folhas dos 25 genótipos de laranja doce, variedade Pêra aos 76 Dias após a
inoculação (DAI) com os sintomas de cancro cítrico. ........................................... 59
Figura 2. Diâmetros médios de lesões (mm) causados por Xanthomonas citri nos diferentes
genótipos de laranja doce, variedade Pêra............................................................. 61
Figura 6. Número médio de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) por lesão obtidas
através do isolamento bacteriano das lesões nas folhas dos 25 genótipos de laranja
Pêra...................................................................................................................... 66
Figura 7. Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença (AACPD*) obtida para diâmetro
médio de lesões de cancro cítrico observados em cada avaliação em dois ensaios. 67
CAPÍTULO III
Figura 1. Médias dos volumes de copa dos genótipos de laranja Pêra, combinados com os
porta-enxertos laranja caipira, limão cravo, tangerina cleópatra e tangerina sunki. 82
xiii
CAPÍTULO IV
DESTACADAS
Figura 1. Ensaio com Folhas de citros destacadas. A - Folhas destacadas mantidas em tubo
Falcon sob estante de isopor. B- Preenchimento do tubo Falcon com água de
torneira na metade do pecíolo. .............................................................................. 97
Figura 2. Diferentes respostas de resistência dos genótipos Pêra IAC (A) e Washington navel
(B), inoculados com Xanthomonas citri subsp. citri............................................ 100
Figura 3. Comparação entre as características dos estômatos das varidades Pêra IAC e
Washington navel. (A1 e A2) Fotos representativas mostrando estômatos de Pêra
IAC e Washington navel por MEV, com aumento de 300 vezes, antes da inoculação
com X. citri. (B1 e B2) Fostos representativas mostrando individualmente o
estômato das variedades Pêra IAC e Washington navel por MEV, com aumento de
2700 vezes, anterior a inoculação com X. citri. (C e D) Densidade e área média da
abertura estômatica em Pêra IAC e Washington navel. ....................................... 104
Figura 4. Comparação da colonização e infecção de X. citri, após a inoculação, entre as
variedades Pêra IAC e Washington navel, por Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV). (A1 e A2) Fotos representativas da superfície foliar de Pêra IAC e
Washington navel, colonizadas por X. citri aos 3°DAI, com aumento de 2700
vezes. (B1 e B2)
Fotos representativas da superfície foliar de Pêra IAC e
vezes. (C1 e C2) Fotos representativas da lesão de cancro cítrico em Pêra IAC e
Washington navel, provocadas por X. citri aos 14°DAI, com aumento de 40 vezes.
(D1 e D2) Fotos representativas do corte transversal da lesão foliar em Pêra IAC e
Washington navel, provocadas por X. citri aos 14°DAI, com aumento de 1800
vezes. ................................................................................................................. 108
Figura 5. Fotos representativas do ferimento, provocado pela inoculação com perfuração com
agulha, na face adaxial de folhas do genótipo Washington navel, aos 3°DAI, com
aumento de 1000 (A1) e 2700 (A2) vezes. .......................................................... 109
xiv
CAPÍTULO V
Figura 1. Árvore obtida por Unweighted neighbor joining (coeficiente Dice), mostrando a
diversidade genética de 48 isolados de X. citri subsp. citri, identificados por
marcadores microssatélites, de diferentes regiões do Estado do Paraná, Brasil. ... 126
xv
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 1
REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................. 3
1. A Citricultura Brasileira ............................................................................................... 3
2. A Citricultura no Paraná ............................................................................................... 4
3. O Cancro cítrico ........................................................................................................... 5
4. Etiologia ....................................................................................................................... 7
5. Epidemiologia do Cancro cítrico .................................................................................. 8
6. Bancos de Germoplasma de citros ................................................................................ 9
7. Resistência ao Cancro cítrico ...................................................................................... 10
JUSTIFICATIVAS DO TRABALHO .................................................................................. 13
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 14
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 26
MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................. 28
1. Áreas experimentais ................................................................................................... 28
2. Material vegetal.......................................................................................................... 28
3. Avaliação e análise dos experimentos ......................................................................... 29
RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 31
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 43
CAPÍTULO II
xvi
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 52
1. Material biológico ...................................................................................................... 54
2. Implantação do experimento ....................................................................................... 54
3. Culturas bacterianas e preparo do inóculo ................................................................... 55
4. Inoculação, quantificação e avaliação dos sintomas .................................................... 55
5. Análise dos dados ....................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 69
CAPÍTULO III
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 74
1. Implantação do Experimento ...................................................................................... 76
2. Avaliação e Análise dos dados ................................................................................... 77
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 88
CAPÍTULO IV
DESTACADAS
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 94
1. Genótipos de citros e isolado de Xanthomonas citri .................................................... 96
xvii
2. Implantação do experimento ....................................................................................... 96
3. Avaliação por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ....................................... 97
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 110
CAPÍTULO V
INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 118
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................... 120
1. Isolados de Xanthomonas citri subsp. citri ................................................................ 120
2. Amplificação do DNA por PCR com marcadores microssatélites ............................. 122
3. Análise dos dados ..................................................................................................... 123
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 124
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 128
xviii
INTRODUÇÃO GERAL
O cancro cítrico causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD et
al., 2006) é uma importante doença em regiões produtoras de citros (GOTTWALD et al.,
2002a). Esta doença ocorre em muitas variedades comerciais de laranja doce (Citrus sinensis
L. Osbeck), resultando em significativas perdas econômicas ao produtor. As lesões
provocadas pelo cancro afetam de forma drástica a comercialização da fruta in natura e seu
processamento industrial.
Os sintomas da doença podem ser vistos em toda a parte aérea da planta. As lesões
nas folhas são normalmente proeminentes em ambos os lados, geralmente com halo amarelo.
Nos frutos, as lesões são semelhantes as das folhas e, em caso de sintomas muito severos, os
frutos podem cair antes de atingir a maturidade. Algumas variedades podem exibir sintomas
nos ramos em estádios avançados da doença (LARANJEIRA et al., 2005).
A bactéria X. citri pode infectar a planta dependendo da fase de crescimento e
desenvolvimento do hospedeiro, sendo que essa infecção não ocorre de forma uniforme ao
longo do ano. A estação de maior predisposição do hospedeiro é o início do verão, quando
vento, chuva pesada e temperaturas elevadas são observadas ao mesmo tempo nas condições
brasileiras (LARANJEIRA et al., 2005).
No Estado do Paraná o plantio comercial de citros se baseia no cultivo das
variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) Pêra, Folha Murcha, Valência e
IAPAR 73. Dessas variedades, a Pêra recebe grande destaque pela área plantada no Estado e
por apresentar grande aceitação no mercado de fruta fresca e suco concentrado. Em estudos
realizados no Estado do Paraná foi constatado variabilidade na resistência, principalmente em
cultivares de laranja doce e tangerina (LEITE JR.; MOHAN, 1990; CROCE FILHO, 2005;
GONÇALVES et al., 2010; GONÇALVES-ZULIANI et al., 2011a; 2011b; VARGAS et al.,
2013).
Assim, os objetivos desse trabalho foram: 1) Avaliar a resistência de 25 genótipos de
laranja Pêra em condições de campo em três regiões do Estado do Paraná; 2) Em condições de
casa de vegetação, avaliar a resistência de 25 genótipos de laranja Pêra; 3) Verificar a
inflência dos porta-enxertos limão cravo, tangerina sunki, tangerina cleopatra e laranja caipira
sobre genótipos de laranja Pêra, quanto a resistência a X. citri; 4) Avaliar a resistência de
genótipos de citros ao cancro cítrico, por metodologia de folhas destacadas e detectar
1
diferenças morfológicas e no desenvolovimento da lesão ao longo do tempo, por Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV); 5) Caracterizar a variabilidade genética de isolados de X.
citri de diferentes pomares do Estado do Paraná.
2
REVISÃO DE LITERATURA
1. A Citricultura Brasileira
A citricultura é um dos setores mais competitivos e de maior destaque no agronegócio
brasileiro. O Brasil ocupa a primeira posição no ranking dos maiores produtores de citros,
seguido pelos Estados Unidos (FAO, 2012a). Os dados fornecidos pelo IBGE (2013) mostram
que a previsão de safra para 2013 será de 16.303.752 ton, sendo que a área plantada de
aproximadamente 789.746 hectares. Apesar da competitividade que o setor exerce, a
produtividade brasileira ainda é baixa, apresentando cerca de 556 caixas/ha, quando
comparada a produção dos Estados Unidos que é de aproximadamente 705 caixas/ha (FAO,
2012b). Essa baixa produtividade está associada a muitos fatores, dos quais se destacam o
aumento de pragas e doenças e o custo de produção, além da estreita base genética utilizada
nas regiões produtoras. Para a produção brasileira, contribuem quase exclusivamente as
laranjas doces (Citrus sinensis L. Osb.), sendo pequena a produção de tangerinas (Citrus
reticulata Blanco) e limões (Citrus aurantifolia Christm.) e menos significativa ainda a de
pomelos (Citrus paradisi Macfad.). A principal laranja doce plantada no país é a variedade
Pêra, com 37,8%, seguida de Natal e Valência, com 23,9% cada (DONADIO; MOURÃO
FILHO; MOREIRA, 2005).
Um produto do mercado citrícola que recebe destaque no âmbito internacional é o
suco concentrado da fruta, além de exercer grande importância na economia brasileira e na
balança comercial do país (NEVES et al., 2001). O suco brasileiro detém mais de 50% da
produção mundial, além de 85% das exportações. Em 2009 as exportações de produtos e
subprodutos citrícolas totalizaram 2,15 milhões de toneladas de produtos e uma receita de
1,84 bilhões de dólares, perfazendo 3% das exportações do agronegócio brasileiro (NEVES et
al., 2011).
De acordo com a CONAB (2012), a área plantada com laranja no estado de São Paulo
vem sofrendo reduções consecutivas e mudando o perfil do produtor. Está ocorrendo à
redução de pomares menores e a citricultura brasileira que era tradicionalmente composta de
pequenos produtores está mudando seu perfil, diminuindo consideravelmente o número de
produtores e ao mesmo tempo, aumentando o cultivo em maiores áreas. Outras mudanças
expressivas que atualmente vem ocorrendo na citricultura estão relacionadas à condução dos
3
pomares. No geral, tem-se exigido alterações no manejo e nos tratamentos fitossanitários, com
utilização de produtos eficientes e de última geração, além de acompanhamento técnico
especializado e aporte tecnológico (NEVES et al., 2001). De acordo com Grizotto et al.
(2012) a citricultura tem mostrado aumento significativo no rendimento de colheita com a
implementação de sistema de irrigação nos pomares, resultando em frutos com maior tamanho
e, em contrapartida, no menor número de frutos por caixa, além de apresentarem menor teor
de sólidos solúveis e acidez. Além disso, o espaçamento adensado tem mostrado o maior
impacto na produção de frutos por área de plantio.
2. A Citricultura no Paraná
No Estado do Paraná, a produção citrícola esteve por muito tempo concentrada na
região do Alto Ribeira, tradicional região produtora de tangerinas (MORIMOTO, 1990). As
regiões Norte e Noroeste do Estado estiveram fora das mãos dos agricultores paranaenses por
mais de trinta anos, em função da interdição das áreas para plantio devido à ocorrência da
doença cancro cítrico (RINALDI, 1998). No entanto, hoje essa produção se concentra nessas
duas regiões, onde também se encontram instaladas as principais usinas de suco de laranja
concentrado (SABES; ALVES, 2006). Essa retomada do plantio de citros nas regiões Norte e
Noroeste do Estado foi possível devido ao manejo integrado do cancro cítrico, que envolve
basicamente o uso de cultivares mais resistentes, quebra-ventos e pulverizações com
bactericidas cúpricos (LEITE JR et al., 1987; LEITE JR; MOHAN, 1990). No estado as
medidas de exclusão e erradicação são menos drásticas, não sendo obrigatória a eliminação de
plantas doentes (LEITE JR; MOHAN, 1990; LEITE JR., 1990).
Além disso, as regiões Norte, Noroeste e Oeste do Estado do Paraná apresentam as
melhores condições de solo e clima para o cultivo de citros. O clima é caracterizado como
subtropical apresentando precipitação média anual de 1400 a 1800 mm. A temperatura média
anual varia de 21 a 22°C na região Norte, 22 a 23°C na Noroeste e 18 a 21°C na Oeste.
Nessas regiões o relevo varia de suavemente ondulado a ondulado, com predomínio de
regiões com solos derivados do basalto no Norte e Oeste e solos derivados do Arenito na
região Noroeste do estado (CAVIGLIONE et al., 2000).
No período de 2000 a 2008, a área plantada de laranja do Estado do Paraná aumentou
em 45%; era de 13,75 mil hectares em 2000 e foi para 19,9 mil hectares em 2008. Entre os
4
anos de 2000 e 2008, a participação do Paraná na área plantada de laranja do Brasil aumentou;
era de 1,6% em 2000 e foi para 2,4% em 2008 (IBGE, 2009). A citricultura paranaense em
2012 alcançou uma safra de 913.205 ton e em 2013 a safra estimada será de 927.300 ton, um
aumento de 1,54% (IBGE, 2013). O Paraná com essa produção poderá em 2013 atingir 5,7%
da produção nacional, mostrando forte crescimento da produção paranaense de citros, além da
competitividade de mercado.
Semelhante ao que ocorre no Brasil, no Paraná é utilizada uma estreita base genética,
predominando o cultivo de laranjas doces (Citrus sinensis), tangerinas (Citrus reticulata) e
limões (Citrus aurantifolia), sendo que dentre as laranjas doces, a Pêra e a Folha Murcha se
destacam entre as mais plantadas e mais consumidas, além de apresentarem mais aceitação
nas indústrias de processamento de suco concentrado.
3. O Cancro cítrico
O cancro cítrico foi introduzido no século passado nas Américas do Norte e Sul e
Oceania, provavelmente por material infectado. Estas regiões abrigam dois dos mais
importantes produtores mundiais de citros – Brasil e Estados Unidos (STALL; SEYMOUR,
1983; CIVEROLO, 1985; SCHOULTIES et al., 1987). A primeira ocorrência de cancro
cítrico no Brasil foi em 1957, no município de Presidente Prudente, São Paulo
(BITANCOURT, 1957). Apesar dos esforços iniciais, já em 1957 o cancro cítrico foi
encontrado nos Estados de Mato Grosso do Sul e Paraná (AMARAL, 1957). Atualmente a
doença está presente nos Estados produtores da fruta, sendo considerada endêmica no Estado
do Paraná.
Em 1996 as medidas de controle da doença ganharam mais importância, quando o
padrão espacial de distribuição desta doença no pomar passou a sofrer alterações devido à
introdução no país da larva minadora dos citros (Phyllocnistis citrella Staiton) (PRATES;
NAKANO; GRAVENA, 1996; GOTWALD; GRAHAM; SCHUBERT 1997; BERGAMIM
FILHO, 1999). A larva deste inseto forma galerias, que predispõe as folhas por mais tempo a
infecção, fazendo com que menores concentrações do inoculo e ventos menos intensos sejam
eficientes para o estabelecimento do patógeno na planta (GOTWALD et al., 2002a;
GRAHAM et al., 2004).
5
A doença mostra seus sintomas em toda a parte aérea da planta atingindo folhas,
ramos e frutos. Os sintomas nas folhas são caracterizados por lesões salientes nas duas faces e
na maioria das vezes essas lesões são circundadas por um halo amarelo. As lesões nos frutos
são semelhantes as na folha, no entanto, quando ocorre um agravamento nos sintomas, os
frutos sintomáticos caem da planta antes de atingir a maturação (LARANJEIRA et al., 2005).
As fases de crescimento do hospedeiro podem influenciar a infecção da bactéria, não
ocorrendo uniformemente durante o ano todo (LARANJEIRA et al., 2005). Variedades que
apresentem prolongado crescimento vegetativo, com formação contínua de tecidos jovens, são
particularmente mais suscetíveis à presença da bactéria (AGOSTINI, et al., 1985;
GOTTWALD, 1993; AMARAL, 2004).
Para o controle do cancro cítrico podem ser adotadas medidas de exclusão e
erradicação de plantas contaminadas por Xanthomonas citri subsp. citri, como exemplo
campanhas oficiais de erradicação adotadas no estado de São Paulo (BARBOSA et al., 2001;
MASSARI; BELASQUE JR., 2006; BELASQUE JR; BERGAMIM FILHO, 2006). No
estado do Paraná, medidas alternativas são empregadas de forma integral, com intuito de
prevenir e controlar a doença. Essas medidas envolvem principalmente o uso de genótipos
resistentes ou moderadamente resistentes, fungicidas cúpricos e cortinas quebra-ventos
(LEITE JR. et al., 1987; LEITE JR., 1990; LEITE JR.; MOHAM, 1990).
Estudos mostram que a redução da velocidade do vento em pomares cítricos com o
auxílio de quebra-ventos pode contribuir para a diminuição da gravidade dos sintomas, além
de reduzir a dispersão e infecção do patógeno (BOCK et al., 2010). Já o cobre na citricultura é
utilizado como uma medida de proteção no tecido foliar jovem, reduzindo o acúmulo de
inóculo e minimizando a infecção na fruta (BEHLAU et al., 2010). Behlau et al. (2007)
mostraram em seus trabalhos que o uso de bactericidas cúpricos no controle do cancro cítrico
pode apresentar resultados muito satisfatórios. Em relação à resistência varietal, estudos
realizados no Paraná, mostram que alguns genótipos de laranja doce e tangerinas apresentam
certa resistência ao cancro cítrico (LEITE JR.; MOHAN, 1990; CROCE FILHO, 2005;
GONÇALVES et al., 2010; GONÇALVES-ZULIANI et al., 2011a; 2011b; VARGAS et al.,
2013).
6
4. Etiologia
A bactéria causadora do cancro cítrico foi identificada e isolada primeiramente por
Hasse (1915) que, após provar a patogenicidade da X. citri, classificou-a como Pseudomonas
citri. Em 2006, ela teve seu nome modificado para Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD
et al., 2006). No entanto essa bactéria apresenta variantes patogênicas, devido principalmente
a especialização ligada ao hospedeiro (VERNIÈRE et al., 1998; CUBERO; GRAHAM, 2002;
BRUNINGS; GABRIEL, 2003). Após a divulgação dos dados do genoma completo da
bactéria X. citri (DA SILVA et al., 2002), impulsionou os estudos de diversidade genética do
patógeno, visando estabelecer hipótese sobre sua evolução e interação patogeno x hospedeiro
(ADHIKARI; MEW; LEACH, 1999; RESTREPO; VÉLEZ; VERDIER, 2000; OCHIAI et al.,
2000). Esta informação também é uma importante ferramenta na identificação, no conjunto de
genes, dos vários fatores que favorecem a capacidade da bactéria em provocar danos a planta
(AMARAL, 2004).
Esse fitopatógeno penetra nos tecidos vegetais do hospedeiro através de aberturas
naturais como estômatos, hidatódios e lenticelas ou por ferimentos (GOTTWALD;
GRAHAM, 1992; GRAHAM et al., 1992). Uma vez no espaço mesofílico, multiplicam-se
nos espaços intercelulares produzindo polissacarídeos extracelulares, principalmente goma
xantana. A diminuição dos espaços intercelulares e o acúmulo de goma resultam em aspecto
de encharcamento no tecido infectado, uma vez que ocorre o aprisionamento da água do
xilema
devido
ao
potencial
higroscópico
da
goma
(PADMANABHAM;
VIDHYASEKARAN; RAJAGOPALAN, 1973).
No caso da X. citri, para que ocorra os sintomas é necessário que o patógeno utilize
várias ferramentas durante seu ciclo de vida, pois ela coloniza unicamente os citros, ou seja,
sua capacidade de causar danos a planta é limitada a um único hospedeiro. Além disso, para
que ela possa expressar sua patogenicidade, é preciso que haja uma série de circunstâncias
ambientais propícias e que favorecerão a manifestação de sua virulência (AMARAL, 2004).
Devido a isso, essa bactéria não consegue sobreviver por longo período em restos de cultura
ou plantas daninhas incorporadas ao solo, porém podem sobreviver por anos em tecidos de
citros infectados mantidos secos, livres de solo e protegidos da luz solar (GOTO, 1992b). As
condições ideais de infecção são temperaturas entre 25 e 30°C e na presença de lâmina de
água na superfície das folhas, sendo que os sintomas se iniciam cerca de cinco a sete dias após
a inoculação (GOTO, 1992b). A sua disseminação pode ocorrer por vários quilômetros,
7
mediada por veículos ou pessoas, por implementos agrícolas e material de trabalho infestados,
além de frutas ou mudas de áreas infestadas (MASSARI; BELASQUE, 2006).
A concentração da bactéria na gota de chuva ou meio de cultura é fundamental para o
desenvolvimento da doença. As densidades mínimas de X. citri para que haja lesões de cancro
cítrico através de estômatos são, respectivamente 10 2 a 103 e 104 a 105 células por mililitro
(ZUBRZYCKI; DIAMANTE, 1987; PRUVOST et al., 2002). Além disso, a bactéria X. citri
cresce facilmente na maioria dos meios de cultura utilizados em laboratório. Colônias são
visíveis após dois ou três dias de incubação a 28ºC. Em plantas inoculadas e mantidas nessa
temperatura, os sintomas começam a ser visíveis depois de 10-14 dias e a bactéria é
facilmente isolada de tecido cítrico infectado (LARANJEIRA et al., 2005).
5. Epidemiologia do Cancro cítrico
Desde 1957 até 1996 a distribuição espacial do cancro cítrico, para as condições
brasileiras, foi considerada de forma agregada, sendo que isto está de acordo com os
mecanismos de disseminação da X. citri (GOTO, 1992a).
Esses mecanismos são
caracterizados como respingos de chuva, para disseminação na mesma planta ou em plantas
vizinhas e respingos de chuva aliados ao vento, para disseminação a distâncias até 15 m. A
partir de 1997, constatou-se uma mudança no número de focos e no padrão espacial do cancro
cítrico em São Paulo, sendo que a acentuada agregação, típica das décadas anteriores, deu
lugar a padrões de agregação intermediária, e hoje não são raros, casos de distribuição ao
acaso de plantas afetadas (BERGAMIN FILHO et al., 2001). Essa mudança no padrão
espacial do cancro no pomar pode estar relacionada com a introdução no país da larva
minadora dos citros (P. citrella). O minador produz abundantes ferimentos nas folhas,
permitindo a penetração do patógeno por um período de 10 a 14 dias, aumentando os sítios de
infecção e consequentemente a intensidade da doença (GOTO, 1992a).
A infecção da parte aérea, por estar associada às fases de crescimento do hospedeiro,
não ocorre uniformemente durante todo ano. Folhas sem ferimento são passíveis de infecção,
via estômato, por um período relativamente curto, quando a folha tem, aproximadamente,
85% de seu tamanho normal, tornando mais resistentes quando completam sua total expansão.
A penetração natural por estômatos normalmente é mais freqüente na face abaxial das folhas,
isso porque a concentração das aberturas estomáticas é maior nesta face (GRAHAM et al.,
8
1992). Além disso, ferimentos nas folhas resultam em rápido aumento na severidade da
doença (LARANJEIRA et al., 2005). Nos frutos, a maior suscetibilidade ocorre quando
apresentam 2 a 4 cm de diâmetro (GRAHAM; GOTTWALD, 1991).
A quantificação do diâmetro de lesões de cancro cítrico é uma das principais técnicas
usadas na avaliação da interação entre X. citri x genótipos (GRAHAM; GOTWALD, 1990;
NOCITI et al., 2006), na avaliação da resistência varietal e no estudo de aspectos
epidemiológicos (GOTTWALD; GRAHAM; SCHUBERT, 1997). De acordo com estudos
desenvolvidos por Graham e Gottwald (1990) há correlação significativa na comparação dos
diâmetros de lesões de cancro cítrico induzidas em plantas mantidas em campo e casa de
vegetação. Belasque Jr. et al. (2005) sugerem ainda que na avaliação da resistência de plantas
ao cancro cítrico, seja escolhido ramos em diferentes lados da mesma planta para a
quantificação da doença nas folhas desses ramos.
6. Bancos de Germoplasma de citros
Dentro do melhoramento de citros, a introdução e a avaliação do germoplasma
constituem um processo rápido de seleção e inclusão de novas variedades ao sistema
produtivo, além de ampliar a variabilidade genética (NASS; MIRANDA FILHO; SANTOS,
2001). Encontrando condições favoráveis de clima e solo, as plantas cítricas foram
introduzidas do Sudoeste asiático pelos portugueses por volta de 1530 e passaram a ser
cultivadas no Brasil, tornando-o maior produtor mundial de frutos cítricos (POMPEU JR.;
BLUMER, 2006). A maioria dos cultivares copas e porta-enxertos utilizados na citricultura
brasileira é decorrente da introdução e seleção de germoplasma provindos do exterior. Com
exceção das laranjas doce (Citrus sinensis) Bahia, Baianinha, Natal e Folha Murcha, as
demais variedades de laranja doce, tangerinas, lima ácida tahiti (C. latifolia), assim como os
porta-enxertos limão cravo (C. limonia), Volkameriano (C. volkameriana), tangerinas
cleópatra (C. reshni) e sunki (C. sunki), trifoliatas (P. trifoliata) e citrumelo swingle (C.
paradisi x P. trifoliata) são procedentes de outros países (POMPEU JR.; BLUMER, 2006).
É fundamental a conservação de germoplasma no sentido de manter fontes de
variabilidade para permitir a ampliação da base genética da cultura, visto que a mesma é
bastante estreita devido à propagação clonal. Além disso, tenta-se garantir com a conservação,
mediante o melhoramento genético, a solução de problemas relacionados a pragas e doenças
9
da cultura (DOMINGUES; TULMANN NETO, 1998). No Brasil em 1930, foi iniciada uma
coleção de germoplasma (BAG) de maior importância mundial, localizado no Centro de
Citricultura Sylvio Moreira (CCSM), juntamente com o Instituto Agronomico de Campinas
(IAC). De acordo com levantamentos o BAG-CCSM conta com aproximadamente 1750
acessos. Sendo 649 acessos de laranjas doces, destacando desses 67 acessos da variedade
‘Pera’. Outros 45 de laranjas azedas, 373 de tangerinas e híbridos, 56 de limas, 128 de limões
e híbridos, 23 de cidras, 49 de limão cravo, 13 de limões rugosos, 59 de pomelos, 44 de
toranjas e híbridos, 205 de P. trifoliata e híbridos e em torno de 100 acessos de outras
espécies e gêneros (POMPEU JR.; BLUMER, 2006). É importante relatar que a maioria dos
cultivares utilizados na citricultura de São Paulo e do Brasil são originados desse BAG. No
Paraná, o Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) conta com uma coleção de espécies
cítricas mantidas em campo.
Muitos acessos mantidos nesses bancos de germoplasma têm sido caracterizados
agronomicamente, para avaliação da produtividade, ciclo de cultivo e qualidade das frutas.
Também são testados variedades-copas e porta-enxertos para tolerância as principais pragas e
doenças presentes no País. As variedades passam por avaliações prévias ainda em bancos de
germoplasma e uma vez constatadas as características desejáveis, esses materiais passam a ser
testados em áreas maiores, com maior número de repetições, para confirmação das préavaliações, passando então para experimentos específicos, antes da recomendação de plantio
ou utlização em programas de melhoramento (POMPEU JR.; BLUMER, 2006).
7. Resistência ao Cancro cítrico
A interação patógeno-hospedeiro é caracterizada por uma complementaridade genea-gene (FLOR, 1955), na qual a resistência genética é controlada por um gene de avirulência
(avr) no genoma bacteriano e um gene de resistência (R) correspondente na planta.
O emprego de cultivares resistentes é fundamental no manejo integrado do cancro
cítrico, pois é o meio mais econômico e eficiente no controle da doença. A identificação de
cultivares com níveis adequados de resistência a doença constitui um fator de grande
importância para diminuir os riscos de contaminação nas áreas indenes, em novos plantios
localizados em áreas livres da doença ou em áreas onde ocorreu erradicação e liberação para
replantio (LEITE JR.; SANTOS, 1988; LEITE JR., 1990).
10
A obtenção de plantas de citros que apresentem resistência à doença, ainda que em
grau intermediário, pode ser realizada mediante seleção de variedades já existentes em bancos
de germoplasma, através do cruzamento com plantas que apresentem resposta satisfatória ao
cancro cítrico ou por via da transformação genética, que compreende a incorporação de
gene(s) de uma outra planta, que confiram resistência ao cancro cítrico (CERVERA et al.,
2005). Essa seleção de genótipos resistentes pode ser feita ainda nas propriedades citrícolas,
onde se identifica um potencial genético de uma determinada variedade ou planta matriz.
Diversos cultivares de citros de importância econômica tem sido citados por
apresentar níveis adequados de resistência ao cancro cítrico. Entretanto há uma variação
quanto à suscetibilidade com que estas variedades possuem em relação ao patógeno. No geral
pomelos (C. paradisi), lima ácida galego e limões são mais sucetíveis ao patógeno. Laranjas
doces e laranja azeda (C. aurantium) apresentam uma suscetibilidade moderada, enquanto
tangerinas são moderadamente resistentes (GOTWALD; GRAHAM; SCHUBERT, 2002b).
Cardoso et al. (2010) em estudos de transformação genética de cultivares de laranja
doce, variedade Natal, Pêra e Valencia com o gene attA, observaram que as laranjas Pêra que
expressaram o gene attA não mostraram uma significativa resistência a X. citri,
provavelmente devido a sua genética, que possibilita uma resistência natural ao patógeno.
Em estudos de avaliação da resistência de variedades cítricas no Paraná grande
variabilidade para resistência à bactéria foi encontrada, especialmente entre cultivares de
laranja doce e tangerinas (LEITE JR., 1989). De um modo geral, as laranjas Folha Murcha e
Moro foram consideradas como resistentes e Navelina, Pêra preimunizada e Valencia como
moderadamente resistentes. Por outro lado, lima ácida galego e limão siciliano podem
apresentar alta suscetibilidade a doença (LEITE JR., 1990). Amaral et al. (2010) avaliando
582 acessos de espécies cítricas, sendo 319 Laranjas doces, em condições de casa de
vegetação, verificaram que 13% são resistentes, 42% moderadamente resistentes, 20%
suscetível e 25% altamente suscetível à X. citri. Dentre os genótipos resistentes e
moderadamente resistentes se destacam as laranjas Pêra: Mutação, Comprida, EEL, Dibbern,
GS, Olimpia, Ovale, Perão, Roberto Gullo, Bianchi, IAC, Ipiguá, Mel, Ovale Siracusa, Ovo e
Pirangi. Em condições de campo, em estudos de avaliação da resistência a X. citri, as laranjas
Pêra EEL, IAC, Ipiguá, Ovale Siracusa e Coroada mostraram baixa severidade e incidência de
cancro cítrico em três locais de avaliação no Noroeste do Paraná (GONÇALVES-ZULIANI et
al., 2011b).
11
Em relação ao porta-enxerto, existe pouca informação a respeito da sua eventual
influência sobre a severidade da doença na variedade-copa (LEITE JR.; SANTOS, 1988). De
acordo com Wustcher (1979), o porta-enxerto exerce grande influência em diversas
características da variedade-copa, podendo influenciar também na suscetibilidade ao cancro
cítrico. Isso ocorre devido ao fato de frutos imaturos, folhas e ramos novos apresentarem
maior suscetibilidade ao cancro cítrico, portanto à maior severidade da doença em plantas
enxertadas sobre porta-enxertos vigorosos pode ser atribuída à maior freqüência e duração dos
períodos de brotação, promovida pelos porta-enxertos vigorosos (DANOS et al., 1981; 1984).
Leite Jr. e Santos (1988) avaliando a suscetibilidade do limão siciliano (C. lemon) enxertado
sob diferentes porta-enxertos, verificaram que as maiores intensidades de cancro cítrico em
folhas e frutos foram observadas nas plantas enxertadas sobre C. karna e limão cravo, sendo
que o limão cravo é utilizado amplamente como porta-enxerto em todas as regiões produtoras
de citros do país. Isto pode ser explicado pelo fato do limão cravo induzir maior vigor a
planta, com surgimento de brotações novas e consequentemente aumentar a suscetibilidade da
mesma a bactéria.
A variabilidade na suscetibilidade dos sintomas ao cancro cítrico pode ser
influenciada pela anatomia do estômato, que pode determinar a penetração ou não da bactéria
na planta (GRAHAM et al., 1992). Além disso, diferenças estruturais e mudanças na
membrana e nos espaços extracelulares do hospedeiro são também fatores de variação na
resistência entre variedades. Em estudos com kumquat (Fortunella margarita) e calamondin
(C. mitis), que são altamente resistentes ao cancro cítrico, o menor crescimento de X. citri
nessas variedades pode ser explicado pela presença de compostos antimicrobianos ou pela
morte celular induzida pela hipersensibilidade ao patógeno. Essas variedades quando
desafiadas com X. citri promovem desenvolvimento rápido de necrose, semelhante a reação
de hipersensibilidade, além de exibirem menor atividade antioxidante enzimática e acumular
menos peróxido de hidrogênio (H2O2). Essas modificações podem possivelmente servir como
barreiras físicas ao desenvolvimento do patógeno, suprimindo assim a sua lesão (CHEN et al.,
2012).
12
JUSTIFICATIVAS DO TRABALHO

A utilização de variedades resistentes é medida mais econômica ao produtor e
sustentável ao ambiente, pois reduz o uso de fungicidas cúpricos nos pomares;

Atualmente são poucas as opções de variedades de laranja doce recomendadas para
plantio no Estado do Paraná. As variedades mais cultivadas hoje são a Valência, Folha
Murcha, IAPAR 73 e com maior destaque a Pêra. Diante disso, seria importante
aumentar o numero de genótipos de laranja Pêra e disponibilizar essa informação ao
citricultor;

Poucas são as informações a respeito da influencia do porta-enxerto sobre a variedade
copa, na resistência ao cancro cítrico, no estado do Paraná;

Estudos de resistência em condições de campo de culturas perenes, como os citros,
ocupam extensas áreas e levam muito tempo para que conclusões sejam obtidas.
Metodologias utilizando a avaliação em condições de casa de vegetação e em folhas
destacadas poderiam auxiliar como estudo preliminar, com resultados mais rápidos e
em menor área;

A visualização das lesões de cancro cítrico por Microscopia Eletrônica de Varrredura
(MEV) pode auxiliar no entendimento da colonização e infecção de X. citri ao longo
do tempo, em diferentes níveis de resistência do hospedeiro;

A utilização da técnica de PCR, com marcadores microssatélites, no estudo da
diversidade genética de espécies de X. citri tem se mostrado eficaz, com alto poder
discriminatório, em pequenos espaços (surtos da doença).

Além disso, o estudo da diversidade pode fornecer valiosas informações no
monitoramento da epidemia, além de parâmetros evolutivos da bactéria no Paraná, que
poderão ser ferramentas úteis para o controle eficaz da doença.
13
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22
CAPÍTULO I
23
RESUMO
O controle do cancro cítrico é baseado em medidas de proteção e erradicação de plantas
contaminadas com Xanthomonas citri. Essas medidas de proteção incluem o uso de fungicidas
cúpricos e barreiras quebra-ventos. Apesar dessas medidas mostrarem resultados satisfatórios
em alguns casos, a adoção de estratégias mais viáveis ao produtor e sustentáveis ao ambiente
seria uma forma de melhorar o controle da doença. A utilização de genótipos resistentes é
uma alternativa importante no controle do cancro cítrico. Esses materiais resistentes podem
ser oriundos de bancos de germoplasma, coleções de Institutos de Pesquisa e até mesmo da
seleções de produtores. O objetivo deste estudo foi avaliar genótipos de laranja doce
variedade Pêra e sua resistência ao cancro cítrico em condições de campo. O experimento foi
conduzido em pomares comerciais nos municípios de Congonhinhas, Cornélio Procópio e
Paranavaí, localizados no Estado do Paraná, nos anos de 2010, 2011 e 2012. Para
determinação da incidência e severidade da doença foram avaliadas 10 plantas por genótipo,
sendo amostrados quatro ramos na porção mediana de cada planta. Em cada ramo amostrado
foi feita a contagem total de folhas, de folhas doentes, de lesões por folhas e inferida a
severidade média de cada folha com o uso de escala diagramática. Também foram feitas
avaliações de incidência e severidade de cancro em frutos, além de análises de produtividade
e físico-químicas. O experimento de Congonhinhas mostrou maior número de genótipos
resistentes ao patógeno, em relação aos demais locais avaliados. Os genótipos EEL e Ovale
Siracusa se destacaram com maior resistência ao cancro cítrico em folhas e em frutos
apresentaram uma incidência menor que 1% e baixa severidade (0,00 a 0,40%). Ocorreram
pequenas variações nas médias obtidas nas análises de produtividade e físico-químicas dos
frutos. Evidenciando que os genótipos de laranja Pêra apresentam diferentes níveis de
resistência à X. citri, podendo esse ser o fator mais condicionante na escolha do material
vegetal a ser implantado em pomares cítricos no Estado do Paraná.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Citrus sinensis. Incidência. Severidade.
24
ABSTRACT
The citrus canker control is based on protection measures and eradication of plants infected
with Xanthomonas citri. These security measures include the use of copper fungicides and
windbreaks barriers. Although these measures show satisfactory results in some cases, the
adoption of viable strategies to the producer and sustainable for the environment would be a
way to improve disease control. The use of resistant genotypes is an important alternative for
the citrus canker control. These resistant materials can be derived from genebanks, research
institutes collections and even from producers selections. The aim of this study was evaluate
genotypes of Pera sweet orange variety and its resistance to citrus canker in field conditions.
The experiment was conducted in commercial orchards in the counties of Congonhinhas,
Cornélio Procópio and Paranavaí located in Paraná state, in the years 2010, 2011 and 2012. In
order to determine the incidence and severity of disease 10 plants per genotype were
evaluated, with four branches sampled in the middle portion of each plant. In each sampled
branch the total count of leaves was taken, likewise the count of diseased leaves, lesions per
leaf and the inference of average severity of each leaf using a diagrammatic scale. Reviews of
incidence and canker severity in fruits have also been made, as well as the analysis of yield
and physico-chemical properties. The experiment made at Congonhinhas showed a larger
number of resistant pathogen genotypes in relation to other local reviews. The EEL and Ovale
Siracusa genotypes stood out with greater resistance to citrus canker on leaves and a lower
incidence than 1% and low severity (0.00 to 0.40%) was observed in the fruits. Small
variation on the averages obtained in the physicochemical analysis and productivity of the
crops occurred, showing that the Pera genotypes present different levels of resistance to X.
citri, this may be the most determinant factor in the choice of plant material to be implanted in
citrus orchards in the State of Paraná.
Keywords: Citrus canker. Citrus sinensis. Incidence. Severity.
25
INTRODUÇÃO
O Estado do Paraná é um importante produtor de citros no cenário citricola
brasileiro. Com uma safra de 913.205 ton em 2012 e em 2013 estimada para 927.300 ton, um
aumento de 1,54%, poderá atingir 5,7% da produção nacional de citros (IBGE, 2013). Esses
números mostram que o estado está em plena expansão do setor citrícola, além de possuir na
região noroeste um forte aparato industrial para a produção de suco concentrado de laranja.
No Brasil mais de 80% da citricultura baseia-se no cultivo de laranja doce e a
variedade Pêra é responsável por mais de 50% dessa produção (DOMINGUES et al., 1998a).
Mas o cenário foi bem diferente no passado, visto que na década de 60 essa variedade foi
desaconselhada para cultivo, devido a suscetibilidade ao vírus da tristeza. O interesse pela
‘Pera’ retornou com o programa de pré-imunização, com isolados fracos do vírus (MÜLLER;
TARGON; MACHADO, 1999; SALIBE; SOBRINHO; MÜLLER, 2002). E hoje é
certamente a variedade copa mais importante, ganhando a preferencia de produtores e
consumidores, tornando-se a cultivar mais plantada (SALIBE; SOBRINHO; MÜLLER,
2002). No Estado do Paraná, as cultivares mais plantadas são Pêra, IAPAR 73, Folha Murcha
e Valência. E dentre as laranjas doces, a variedade Pêra também se destaca no estado, entre as
mais cultivadas, tanto pela aceitação no mercado da fruta em mesa, quanto no processamento
do suco concentrado.
O Banco de germoplasma do Centro de Citricultura Silvio Moreira (BAG-CCSM)
conta com cerca de 67 acessos de laranja Pêra. Essa grande população de plantas de Pêra
explica o aparecimento e a seleção de novos clones, surgidos na maioria por variação gemária
(SALIBE; SOBRINHO; MÜLLER, 2002). Mesmo pertencente à mesma cultivar, esses
clones, selecionados no Brasil, podem apresentar características diferentes em diversos
ambientes, sendo que essas diferenças são atribuídas às condições edafoclimáticas de cada
local (DONADIO; FIGUEIREDO; PIO, 1995).
Devido a sua importância comercial, tanto para o mercado interno da fruta como para
o processamento industrial, muitos estudos sob o aspecto morfológico, agronômico e
genético, com intuito de buscar clones de laranja Pêra superiores vêm sendo realizados
(DOMINGUES; TULMANN NETO, 1998b). As pesquisas visam selecionar clones mais
produtivos, com melhores qualidades de fruto e resistência ao cancro cítrico (TEÓFILO
26
SOBRINHO et al., 1992; 1996; DOMINGUES et al., 1996; 1997; GONÇALVES-ZULIANI
et al., 2011a; GONÇALVES-ZULIANI et al., 2011b).
A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD et al., 2006) é o agente causal
do cancro cítrico, uma séria doença de espécies cítricas. Este patogeno afeta todas as
variedades de laranja doce cultivada, causando graves prejuízos às regiões produtoras de
citros (GOTTWALD et al., 2002). Os sintomas são visíveis em toda a planta cítrica e na folha
as lesões são bem características, sendo sempre proeminentes em ambos os lados e
geralmente rodeadas por um halo amarelo (LARANJEIRA et al., 2005).
O controle do cancro cítrico envolve principalmente medidas de exclusão, proteção e
erradicação do patógeno (MASSARI; BELASQUE JR., 2006; BELASQUE JR.;
BERGAMIM FILHO, 2006). As medidas de proteção e exclusão têm como objetivo prevenir
e controlar o avanço da doença e envolvem principalmente o uso de genótipos resistentes,
produtos a base de cobre e quebra-ventos (LEITE JR. et al., 1987; LEITE JR., 1990; LEITE
JR.; MOHAM, 1990).
A utilização de genótipos resistentes ao cancro cítrico é uma medida muito eficiente
e economicamente viável ao produtor. É importante considerar que a obtenção de cultivares
de citros que mostrem resistência a doença, mesmo que em grau intermediário, pode ser
conseguida por transformação genética ou por seleção de genótipos em bancos de
germoplasma (CERVERA et al., 2005). Estudos de resistência de genótipos cítricos ao cancro
cítrico, realizados no Paraná, mostram que existe variabilidade para a resistência ao patógeno,
especialmente nas variedades de laranja doce e tangerinas (LEITE JR.; MOHAN, 1990;
CROCE FILHO, 2005; GONÇALVES et al., 2010; GONÇALVES-ZULIANI et al., 2011a;
2011b; VARGAS et al., 2013).
Diante disso, o presente estudo teve por objetivo avaliar a resistência ao cancro
cítrico de 25 genótipos de laranja ‘Pêra’, selecionados a partir de bancos de germoplasma e
agricultores paranaenses, em três regiões do estado de Paraná, nos anos de 2010, 2011 e 2012.
27
MATERIAL E MÉTODOS
1.
Áreas experimentais
O experimento foi conduzido em pomares cítricos de três regiões do estado do
Paraná: Congonhinhas (23° 29'S, 50 ° 29'O e 757m de altitude), Cornélio Procópio (23° 05'S,
50° 38'O e 360m de altitude) e Paranavaí (23° 1'S, 50° 41'O e 467 m de altitude). De acordo
com a classificação de Köppen, trata-se de regiões com clima subtropical - Cfa, caracterizado
por apresentar temperatura média no mês mais frio inferior a 18ºC, temperatura média no mês
mais quente acima de 22ºC, verões quentes, geadas pouco freqüentes e tendência de
concentração das chuvas nos meses de verão, contudo sem estação seca definida. A
pluviosidade acumulada do ano para os três meses mais chuvosos, de dezembro a fevereiro, e
mais secos, de junho a agosto, varia de 600 a 700 mm e 225 a 250 mm, respectivamente
(CAVIGLIONE et al., 2000). O material vegetal foi plantado nos três locais em 2008, com
mudas produzidas pelo Viveiro de Mudas Pratinha (VMP), Paranavaí, Paraná.
2.
Material vegetal
Os 25 genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) variedade Pêra utilizados no
experimento foram obtidos dos bancos de germoplasma do Centro de Citricultura Silvio
Moreira (CCSM) e Instituto Agronomico do Paraná (IAPAR). Outros materiais foram
provenientes de seleções realizadas pelo Viveiro de Mudas Pratinha (VMP) e produtores do
Estado (Tabela 1). Os genótipos foram plantados em 2008 e cultivados sobre o porta-enxerto
limão cravo, sendo que o espaçamento utilizado no plantio foi de 2,5 x 6,0 m, com
aproximadamente 30 plantas por genótipo. Como o experimento inicialmente visava um
estudo preliminar dos genótipos em três condições ambientais do Estado, o delineamento
experimental utilizado não seguiu as condições necessárias para a realização de uma análise
estatística paramétrica. As plantas, nas três regiões, receberam adubação no solo com N, P, K
e foliar com Zn e Cu conforme recomendação para condução de pomares comerciais.
Periodicamente foram realizadas pulverizações para controle do ácaro da leprose (Brevipalpus
phoencis), falsa ferrugem (Plyllocoptruta oleivora) e purpúreo (Panonychus citri),
28
Cochonilhas (Selenaspidus articulates, Parlatoria sp., Unapis citri, Orthezia praelonga,
Coccus sp.), psilídeos (Diaphorina citri) e mosca-da-fruta (Ceratitis capitata). Além de
aplicações de fungicidas para controle da verrugose (Sphaceloma fawceti) e podridão floral
(Colletotrichum acutatum). Para o manejo do cancro cítrico, os pomares receberam aplicações
com inseticidas para controle da larva-minadora dos citros (Phyllocnistis citrela) e produtos
cúpricos (Hidróxido de cobre).
As plantas foram naturalmente infectadas com a bactéria X. citri através de inóculo
oriundo de outras variedades comerciais implantadas na mesma área do estudo.
Tabela 1. Genótipos de laranja Pêra utilizados no experimento de avaliação do cancro cítrico,
com sua respectiva procedência.
Código
Genótipos
Procedência
Código
Genótipos
Procedência
1
1
Pêra EEL
CCSM
14
Pêra Ovo
CCSM
2
Pêra Bianchi/CC
CCSM
15
Pêra Fumio
VMP2
3
Pêra IAC
CCSM
16
Pêra IAC 2000/2
CCSM
4
Pêra Ipigua
CCSM
17
Pêra – C
VMP
5
Pêra Olimpia
CCSM
18
Pêra - M 6
VMP
6
Pêra IAC 2000/1
CCSM
19
Pêra - M 5
VMP
7
Pêra Ovale Siracusa
CCSM
20
Pêra Roque
VMP
8
Pêra Ovale
CCSM
21
Pêra Arapongas
VMP
9
Pêra Dibbern
CCSM
22
Pêra - D 6
IAPAR3
10
Pêra Coroada
CCSM
23
Pêra 58
IAPAR
11
Pêra Roberto Gulo
CCSM
24
Pêra Bianchi /IP
IAPAR
12
Pêra Pêrão
CCSM
25
Pêra 59
IAPAR
13
Pêra Pirangi
CCSM
CCSM (Centro de Citricultura Silvio Moreira, Cordeirópolis-SP) 2VMP (Viveiro de Mudas Pratinha, ParanavaíPR) 3IAPAR (Instituto Agronômico do Paraná, Londrina-PR)
1
3.
Avaliação e análise dos experimentos
A fim de estudar a resistência de cada genótipo ao cancro cítrico, trimestralmente
foram avaliadas a incidência e a severidade da doença nas folhas das plantas, nos anos de
2010, 2011 e 2012. Além disso, foram feitas avaliações de incidência e severidade nos frutos,
medição da produtividade e análise físico-químicas para melhor caracterizar cada genótipo.
Para quantificar a incidência e severidade do cancro cítrico foram avaliadas 10
plantas por genótipo, sendo analisados quatro ramos por planta, amostrados em todos os
quadrantes da porção mediana da mesma. Para cada ramo avaliado foram contabilizados o
29
total de folhas presentes e folhas com sintomas de cancro cítrico. A incidência de cancro
cítrico foi obtida pelo cálculo da proporção de folhas sintomáticas em relação ao total de
folhas presentes no ramo avaliado, independente da severidade apresentada. Para estimar a
severidade foram atribuídas notas a todas as folhas que apresentaram sintomas, utilizando
quatro escalas diagramáticas com oito níveis que levam em consideração a área percentual da
folha afetada pelas lesões de cancro associadas ou não com galerias de larva minadora dos
citros (BELASQUE JR. et al., 2005). Também foram atribuídas notas de 0 a 5 (0 = sem folhas
doentes e o máximo 5 = 75 a 100% de folhas doentes) as plantas infectadas com o patógeno,
seguindo uma metodologia adaptada de Leite Jr. e Santos (1988), além disso, foram
contabilizados em cada folha infectada, dos ramos avaliados, o número de lesões de cancro.
Foram coletados aproximadamente 100 frutos aleatoriamente de cada genótipo na
safra 2012, no pomar de Paranavaí-PR, com a finalidade de estimar a incidência e severidade
do cancro cítrico em frutos. Para o cálculo de incidência foi considerado o total de frutos
doentes pelo total coletado. Já a severidade foi estimada por escala diagramática de cinco
níveis (BRAIDO et al., 2011). Dos 100 frutos coletados foram enviados 25 frutos de cada
genótipo aos laboratórios das empresas Citri Agroindustrial, para o experimento em Paranavaí
e a Corol – Cooperativa Agroindustrial de Rolandia, para o experimento de Cornélio
Procópio. Avaliaram-se os seguintes parâmetros: Peso Médio de Frutos (PMF) em grama;
Rendimento de Suco (RS, em %); Sólidos Solúveis Totais, medidos em °BRIX; Acidez
Titulável Total (ATT); Ratio; Índice tecnológico (IT) e Rendimento Industrial (RI). Para o
cálculo da produtividade, foram contados todos os frutos de três plantas por genótipos, sendo
que para isso foram considerados o PMF (g) e o peso de 40,8 Kg por caixa.
Os resultados das variáveis analisadas, notas da planta, incidencia de folhas doentes
no ramo, número de lesões por folhas e severidade foram submetidos a uma análise nãoparamétrica, cuja metodologia utilizada baseou-se em Rankings de médias. As médias obtidas
foram substitídas por postos, sendo que a essas novas médias rankeadas foram aplicados
testes paramétricos usuais (HOBBS, 2009). O teste utilizado foi Tukey (P≤0,05), utilizando o
software SAS – Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, CN, EUA).
30
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os reultados obtidos para as variáveis nota da planta, incidência de folhas doentes,
número de lesões por folha e severidade da doença na folha apresentaram diferenças
significativas entre os genótipos nos três locais avaliados e estão apresentados nas Tabelas 2,
3 e 4 para Congonhinhas, Cornelio Procópio e Paranavaí, respectivamente. Behlau et al.
(2007) avaliando o comportamento da laranja Pêra Rio sob condições de controle químico e
proteção com quebra-ventos, concluíram que tanto as avaliações de incidência como de
severidade de cancro cítrico foram eficazes em retratar o comportamento da doença.
No presente estudo, o que se pode observar é que para todas as variáveis analisadas o
experimento montado em Congonhinhas mostrou um maior número de genótipos com
resistência ao patógeno (Tabela 2, 3 e 4). Em Congonhinhas 12 genótipos mostraram-se mais
resistente ao patógeno, sendo que em Cornélio Procópio apenas cinco se destacaram. Para
Paranavaí pôde-se observar seis genótipos com menores médias.
Os resultados de avaliação das variáveis nota da planta, incidência de folhas
contaminadas nos ramos, número de lesões e severidade para o experimento de Congonhinhas
(Tabela 2), permitem dizer que os genótipos 13, 5, 1, 4, 7, 8, 10, 11, 22, 23, 24 e 25
mostraram as menores médias e diferiram significativamente a 5% de probabilidade do 16,
19, 17 e 20 que apresentaram as maiores médias no rankeamento.
31
Tabela 2. Ranking de nota na planta, incidência de folhas doentes nos ramos, número de
lesões e severidade em folhas de genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) variedade Pêra
plantados em pomar comercial de Congonhinhas, PR.
Genótipos
IAC 2000/2
M5
C
Roque
Fumio
Nota
786,39* a**
753,21 ab
741,99 ab
716,55 abc
677,79 abcd
Incidência
794,23 a
753,30 ab
745,34 ab
708,51 abc
681,60 abcd
Nº Lesões
913,13 a
873,78 ab
864,84 abc
835,63 abcd
799,34 abcde
Severidade
914,62 a
875,48 ab
864,53 abc
839,06 abcd
799,95 abcde
IAC
Arapongas
IAC 2000/1
M6
Ovo
Bianchi/CC
663,21 bcd
650,36 bcd
640,49 bcd
624,09 cd
624,03 cd
614,23 cd
658,93 bcd
650,66 bcd
638,11 bcd
625,74 cd
624,94 cd
613,23 cd
785,73 bcde
776,14 bcde
764,44 bcde
759,68 bcde
748,53 cde
749,88 cde
786,63 bcde
774,08 bcde
760,93 bcde
759,40 bcde
748,98 cde
748,65 cde
Dibbern
Perão
601,76 cd
601,57 cd
601,01 cd
600,62 cd
725,04 de
747,18 cde
723,95 de
747,51 cde
Pirangi
Olimpia
588,65 d
588,18 d
588,10 d
588,18 d
712,60 e
711,58 e
712,54 e
711,20 e
EEL
Ipigua
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
Ovale Siracusa
Ovale
Coroada
Roberto Gulo
D6
58
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
Bianchi/IP
59
576,50 d
576,50 d
576,50 d
576,50 d
699,50 e
699,50 e
699,50 e
699,50 e
25,23
25,18
23,98
23,96
CV%
*Ranking substituídos por postos, de acordo com metodologia não paramétrica.
**Ranking seguidos da mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre si, no nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey.
Para o experimento de Cornélio Procópio (Tabela 3), os resultados mostram que em
todas as variáveis estudadas, os genótipos 1, 3, 4, 7 e 10 se destacaram com as menores
médias, diferindo significativamente do 19, 22, 24 e 15.
32
plantados em pomar comercial de Cornélio Procopio, PR.
Genótipos
M5
D6
Bianchi/IP
Fumio
IAC 2000/2
Nota
938,86* a**
822,03 ab
789,39 bc
767,62 bcd
692,10 bcde
Incidência
923,49 a
820,01 ab
807,04 abc
771,34 bcd
697,73 bcde
Nº Lesões
1043,41 a
940,23 ab
912,38 abc
899,30 abcd
814,30 bcde
Severidade
1057,68 a
941,43 ab
915,71 abc
900,13 abcd
805,11 bcdef
Bianchi/CC
M6
Roberto Gulo
Arapongas
Pirangi
Olimpia
661,27 cdef
653,00 cdef
640,13 def
639,80 def
636,20 def
633,71 def
663,43 cdef
650,13 def
640,95 def
633,51 def
630,69 def
634,09 def
795,94 bcdef
810,34 bcde
758,83 cdef
799,39 bcdef
753,24 def
761,63 cdef
792,23 bcdef
815,92 bcde
760,05 cdef
792,65 bcdef
750,75 def
763,37 cdef
59
IAC 2000/1
623,56 def
612,34 ef
627,72 def
611,17 ef
750,18 def
738,60 ef
749,41 def
738,49 ef
C
58
583,73 ef
579,67 ef
578,05 ef
583,23 ef
700,11 ef
698,98 ef
695,00 ef
700,66 ef
Dibbern
Ovo
564,42 ef
543,18 ef
565,69 ef
541,53 f
684,48 ef
673,98 ef
684,67 ef
672,06 ef
Ovale
Roque
Perão
EEL
IAC
Ipigua
541,53 f
541,29 f
540,36 f
529,50 f
529,50 f
529,50 f
543,49 f
540,59 f
540,33 f
529,50 f
529,50 f
529,50 f
661,68 ef
660,45 ef
660,04 ef
649,00 f
649,00 f
649,00 f
661,47 ef
660,89 ef
659,85 ef
649,00 f
649,00 f
649,00 f
Ovale Siracusa
Coroada
529,50 f
529,50 f
529,50 f
529,50 f
649,00 f
649,00 f
649,00 f
649,00 f
32,51
32,56
31,61
31,50
CV%
*Ranking substituídas por postos, de acordo com metodologia não paramétrica.
**Ranking seguidas da mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre si, no nível de 5% de
O experimento de Paranavaí (Tabela 4), mostra o genótipo 1 como destaque com
menor média para as variáveis analisadas, porém devem ser considerado que o 7, 5, 3, 2 e 6
também obtiveram médias baixas e diferiram significativamente do 13, 16 e 18.
33
plantados em pomar comercial de Paranavaí, PR.
Genótipos
Pirangi
IAC 2000/2
M6
Roque
Perão
Nota
906,37* a**
871,58 ab
825,5 abc
776,21 abcd
757,07 abcd
Incidência
878,76 a
867,47 a
844,11 ab
750,37 abc
751,04 abc
Nº Lesões
982,78 ab
1083,03 a
950,85 abc
829,88 bcdef
910,58 abcd
Severidade
981,62 ab
1036,81 a
983,92 ab
849,33 abcde
917,83 abc
C
M5
Dibbern
Arapongas
Fumio
Ovo
750,47 abcd
743,77 abcd
729,15 abcd
714,56 abcde
688,03 bcdef
656,63 cdefg
696,79 abcd
754,31 abc
766,29 abc
752,39 abc
699,94 abcd
622,27 cdef
868,58 abcde
840,34 bcdef
877,92 abcd
876,01 abcd
827,06 bcdef
778,89 bcdefg
895,53 abc
864,08 abcd
851,03 abcde
827,76 abcde
806,58 bcdef
781,49 bcdefg
59
58
644,91 cdefg
617,36 cdefg
632,34 cdef
651,6 bcde
728,32 cdefg
762,29 bcdefg
737,69 cdefg
781,66 bcdefg
D6
Ovale
593,65 defg
591,66 defg
584,38 cdefg
612,05 cdef
685,59 defgh
746,69 cdefg
717,35 cdefgh
715,53 cdefgh
Roberto Gulo
Bianchi/IP
587,69 defgh
511,03 efgh
596,3 cdef
518,92 defg
698,6 defgh
623,58 fgh
702,53 cdefgh
637,72 defgh
Coroada
Ipigua
Ovale Siracusa
Olimpia
IAC
Bianchi/CC
498,12 fgh
497,2 fgh
465,77 gh
462,55 gh
457,37 gh
456,28 gh
518,27 defg
498,93 defg
470,07 efg
444,08 efg
447,34 efg
441,73 fg
647,08 efgh
618,37 fgh
614,98 fgh
575,91 gh
568,58 gh
580,06 gh
653,61 defgh
626,8 efgh
588,17 fgh
576,68 gh
574,91 gh
580,82 fgh
IAC 2000/1
EEL
452,57 gh
382 h
455,75 efg
382 g
595,06 gh
491,5 h
581,57 fgh
491,5 h
45,55
45,64
45,12
45,25
CV%
Tendo em vista o objetivo do trabalho, podemos dizer que para Congonhinhas as
Pêras Pirangi, Olimpia, EEL, Ipiguá, Ovale Siracusa, Ovale, Coroada, Roberto Gulo, D6, 58,
Bianchi/IP e 59, se destacaram como mais resistentes ao patógeno (Tabela 2). No experimento
de Cornélio Procópio, os genótipos EEL, IAC, Ipigua, Ovale Siracusa e Coroada também
mostraram menor suscetibilidade a X. citri (Tabela 3). E em Paranavaí, o genótipo EEL, além
de Ovale Siracusa, Olimpia, IAC, Bianchi/CC e IAC 2000/1 se destacaram dos demais,
mostrando maior resistência as lesões de cancro cítrico (Tabela 4).
A avaliação da incidência e severidade de cancro cítrico em frutos foi realizada na
safra de 2012, para o experimento instalado em Paranavaí. A escolha por Paranavaí se deu
34
pelo fato dos genótipos apresentarem visivelmente mais sintomas nos frutos neste local e pela
região apresentar maior foco de infecção, devido à maior concentração de áreas produtoras de
citros. O que se pode observar é que os genótipos EEL (1), Bianchi/CC (2), IAC (3), Ovale
(8), Coroada (10), Perão (12) e Bianchi (24) não apresentaram nenhum fruto com lesão na
amostragem. Cabe destacar também que os genótipos Olimpia (5) e Ovale Siracusa (7), apesar
de mostrar uma incidência de aproximadamente 1%, apresentaram baixa severidade (0,2 e
0,4% respectivamente) (Tabela 5). Esses dados estão em concordância com as avaliações de
resistência realizadas em folhas, quando mostram os genótipos EEL, Ovale Siracusa, Olimpia,
IAC e Bianchi/CC com certa resistência ao patógeno nas condições de Paranavaí. O genótipo
IAC 2000/2 apresentou uma incidência em torno de 26% dos frutos com lesões e severidade
maior que 2,5% (Tabela 5). Nas avaliações realizadas em folhas, este mesmo genótipo
mostrou médias altas de incidência, severidade, notas e número de lesões, no experimento
implantado em Paranavaí e Congonhinhas, sugerindo que este tenha menor resistência ao
patógeno.
Tabela 5. Incidência e severidade de cancro cítrico em frutos de 25 genótipos de laranja Pêra
em experimento instalado em Paranavaí, PR.
Genótipos
Incid. (%)
Pêra EEL
Sev.
Genótipos
Incid. (%)
Sev.
0,00 (102)* 0,00 (0)**
Pêra Ovo
1,83 (109)
1,65 (2)
Pêra Bianchi/CC
0,00 (101)
0,00 (0)
Pêra Fumio
4,00 (100)
2,78 (4)
Pêra IAC
0,00 (100)
0,00 (0)
Pêra IAC 2000/2
26,00 (100) 2,77 (26)
Pêra Ipigua
2,00 (100)
2,00 (2)
Pêra - C
9,62 (104)
2,50 (10)
Pêra Olimpia
1,00 (100)
0,20 (2)
Pêra - M 6
6,93 (101)
2,47 (7)
Pêra IAC 2000/1
3,00 (100)
2,03 (3)
Pêra - M 5
2,97 (101)
2,00 (3)
0,95 (105)
0,40 (1)
Pêra Roque
3,00 (100)
3,67 (3)
Pêra Ovale
0,00 (102)
0,00 (0)
Pêra Arapongas
4,00 (100)
4,20 (4)
Pêra Dibbern
15,84 (101) 1,25 (16)
Pêra - D 6
4,08 (98)
1,83 (4)
Pêra Coroada
0,00 (101)
0,00 (0)
Pêra 58
9,20 (87)
2,24 (8)
Pêra Roberto Gulo
4,95 (101)
1,56 (5)
Pêra Bianchi /IP
0,98 (102)
1,00 (1)
Pêra Pêrão
0,00 (109)
0,00 (0)
Pêra 59
1,96 (102)
2,25 (2)
Pêra Pirangi
4,90 (102) 1,58 (5)
*Médias da incidência de frutos doentes, seguida do total de frutos avaliados (entre parênteses).
**Médias de severidade dos frutos lesionados, seguida do total de frutos doentes (entre parênteses).
A análise da produtividade foi realizada no ano de 2012, quando as plantas
apresentavam quatro anos de idade, para os experimentos de Cornélio Procópio e Paranavaí.
O que se pode observar é que para o experimento de Cornélio Procópio a produtividade esteve
em torno de 0,10 a 1,68 cx/planta, sendo que em geral ainda esteve abaixo da média nacional
35
que é de 2,0 cx/planta (MACHADO et al., 2005). Já no experimento de Paranavaí a
produtividade variou de 0,23 a 2,48 cx/planta, sendo que alguns genótipos ultrapassaram a
produção média nacional. Também pode ser observado que em geral, os genótipos em
Cornélio Procópio mostraram medias de produtividade mais baixas. Essa variação entre os
locais pode estar relacionada a diversos fatores, muitos deles relacionados a idade muito
jovem das plantas, queda prematura de frutos (BEHLAU et al., 2008), além de floradas
irregulares nas primeiras safras, característico da variedade Pêra (SALIBE; SOBRINHO;
MÜLLER, 2002). Esses dados de produção estão ainda abaixo dos valores informados na
literatura. De acordo com Tazima et al. (2010) avaliando a produção média de nove safras de
cultivares de Pêra, obtiveram 131,03 kg/planta para o clone Bianchi, 133,9 Kg/planta para
Vacinada 4 e 164,10 Kg/planta para Vacinada 3. Considerando a produtividade apresentada
em Paranavaí, os genótipos EEL, Ovale Siracusa, Olimpia, IAC, Bianchi/CC e IAC 2000/1
(39,77; 63,04; 76,39; 73,21; 67,19 e 52,88 Kg/planta respectivamente), mostraram-se mais
resistentes ao patógeno e a maioria com produtividade acima de 60 Kg/planta (Tabela 6).
Domingues et al. (2004) avaliando a produção dos genótipos EEL, Ovale Siracusa, Olimpia e
Bianchi, verificaram médias de produtividade também abaixo do rendimento médio de
cultivares de laranja Pêra (64,3; 32,9; 41,4 e 64,4 Kg/planta, respectivamente).
36
Tabela 6. Avaliação da produção de 25 genótipos de laranja doce Pêra (Citrus sinensis) em
pomares comerciais dos municípios de Cornélio Procópio (CP) e Paranavaí (Pvaí), PR.
Gen.
Prod. (Kg/planta)
Cong
CP
Pvaí
Prod. (cx/planta)
Cong.
CP
Pvaí
1
-
36,72
39,77
-
0,90
0,97
2
-
57,94
67,19
-
1,42
1,65
3
-
39,98
73,21
-
0,98
1,79
4
-
59,16
69,32
-
1,45
1,70
5
-
49,78
76,39
-
1,22
1,87
6
-
68,54
52,88
-
1,68
1,30
7
-
15,91
63,04
-
0,39
1,55
8
-
37,54
80,65
-
0,92
1,98
9
-
32,64
65,91
-
0,80
1,62
10
-
34,68
63,75
-
0,85
1,56
11
-
51,00
9,26
-
1,25
0,23
12
-
4,08
70,69
-
0,10
1,73
13
-
44,88
81,67
-
1,10
2,00
14
-
35,90
84,09
-
0,88
2,06
15
-
53,86
79,49
-
1,32
1,95
16
-
35,50
56,25
-
0,87
1,38
17
-
41,21
101,09
-
1,01
2,48
18
-
49,37
63,97
-
1,21
1,57
19
-
30,60
73,21
-
0,75
1,79
20
-
37,94
84,38
-
0,93
2,07
21
-
42,84
78,24
-
1,05
1,92
22
-
30,19
84,62
-
0,74
2,07
23
-
26,52
69,32
-
0,65
1,70
24
-
17,14
56,02
-
0,42
1,37
25
-
19,58
85,23
-
0,48
2,09
Foram realizadas análises físico-químicas dos frutos para os experimentos instalados
em Cornélio Procópio e Paranavaí e podem ser visualizados na Tabela 7. Visto que a
avaliação foi feita somente para a safra 2012, quando as plantas tinham quatro anos de idade,
os dados não foram passíveis de testes estatísticos. Quanto ao peso médio dos frutos é
possível observar que não ocorreram grandes variações entre os genótipos. Tanto nas
condições de Congonhinhas, quanto Cornélio Procópio, o peso dos frutos esteve entre 160 a
280 g. Esse elevado valor no peso dos frutos pode estar relacionado à produção irregular,
decorrente da idade das plantas, visto que a massa média de frutos para o estado de São Paulo
é de 145 g (FIGUEIREDO, 1991). Para o Rendimento de Suco, os genótipos também não
mostraram tanta variação, mostrando valores entre 47,3 a 74,02%. Tazima et al. (2010) em
37
seus estudos com clones de laranja Pêra, observaram Rendimentos de Suco em torno de 50%
para os genótipos. Valores bem próximos também foram apresentados por Figueiredo (1991),
próximos a 52%. O genótipo de laranja Pêra EEL, que se destacou quanto à resistência ao
patógeno, mostrou rendimento do suco de 53,4 e 53,3% para os experimentos de Cornélio
Procópio e Paranavaí, respectivamente. Esse resultado concordam com o relatado por
Domingues et al. (1999) que mostra rendimento de suco acima de 49% para Pêra EEL. O peso
do fruto e o rendimento de suco estão diretamente relacionado à disponibilidade de água no
solo, sendo que há perda de massa no inverno e com retorno das chuvas na primavera, ocorre
contínuo ganho de peso até a colheita (POZZAN; TRIBONI, 2005). O valor de Sólidos
Solúveis totais para o experimento de Cornélio Procópio esteve entre 6,84 a 9,65 °Brix, sendo
que para Paranavaí foram de 8,07 a 10,68 °Brix. Esses valores estão abaixo do esperado para
a cultivar Pêra que é de 11,8 °Brix (FIGUEIREDO, 1991). Domingues et al. (2004)
analisando 11 clones de laranja Pêra e seis variedades semelhantes, observaram uma variação
de sólidos solúveis de 11,5 a 14,10 °Brix. A Ácidez Titulável Total dos frutos no experimento
de Cornélio Procópio esteve entre 0,42 a 0,93% e para Paranavaí os valores foram de 0,3 a
05%. Em Paranavaí a ácidez média dos genótipos mostrou-se abaixo do relatado para a
cultivar Pêra que é de 0,95%. Possivelmente isso influenciou nos maiores valores de Ratio
obtido para este local (18,41 a 31,95), visto que o cálculo considera os Sólidos Soluveis
Totais pela Ácidez Titulável Total. Tazima et al. (2010) obtiveram valores de Ratio para
clones de Pêra em torno de 10,0. Figueiredo (1991) verificou que para a cultivar Pêra, os
valores de Ratio são em torno de 12,5. Pozzan e Triboni (2005) relatam que sucos com ratio
entre 14 e 16 são mais apreciados pelos consumidores, devido o equilíbrio entre o teor de
açucares e ácidos. Os valores altos de Ratio e ácidez baixa, principalmente para o
experimento de Paranavaí, podem estar relacionados ao período de amostragem dos frutos,
que ocorreu nos mês de agosto, indicando que os frutos atingiram sua completa maturação.
Para as análises do Índice Tecnológico e Rendimento Industrial não foram detectadas grandes
variações entre os genótipos e locais dos experimentos.
38
39
1
0,24
0,25
0,22
0,22
0,27
0,21
0,22
0,25
0,21
0,22
0,23
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
0,22
0,25
0,22
0,22
0,20
0,21
0,21
0,19
0,19
0,23
0,22
0,17
0,22
0,24
0,24
0,17
0,20
0,25
0,25
0,27
0,16
0,19
0,22
0,20
0,23
3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
53,4
53,28
Pvaí
54,7
45,7
58,56
56,39
56,8
62,2
47,3
56,49 64,12
54,19
55,09 47,48
58,7
60,47
61,64
60,32 74,02
62,06 59,29
63,7
55,82 68,15
59,62 69,23
62,34 51,85
58,28 47,01
54,36 44,03
61,48 56,62
61,79 67,96
61,16
56,93
55,65 54,78
53,93 73,91
57,48 62,37
59,76 66,67
58,77 62,02
55,83 55,74
Congonhinhas; Cornélio Procópio; Paranavaí
0,19
2
0,19
-
0,18
-
-
0,21
-
9
10
14
0,28
-
8
13
0,27
-
7
0,26
0,27
-
6
0,22
0,18
-
5
-
0,21
-
4
-
0,24
-
3
12
0,22
-
2
11
0,24
-
1
CP
Rendimento suco
(%)
Genótipos Cong1 CP2 Pvaí3 Cong
Peso médio de
frutos (g)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cong
10,88
10,06
9,29
8,98
8,97
9,91
8,66
9,28
8,17
8,07
10,08
10,07
9,26
9,28
10,07
10,28
Pvaí
8,07
8,24
8,31
7,83
8,56
8,75
8,15
9,25
10,26
10,09
9,3
9,97
9,88
9,07
10,68
9,89
9,65 10,378
7,87
8,07
8,11
9,59
8,62
7,6
8,47
7,56
6,84
7,54
6,7
8,82
8,04
8,25
8,08
7,49
CP
Sólidos sol. Totais
(SST) °BRIX
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cong
0,65 0,32
0,52 0,45
0,50 0,49
0,56 0,35
0,60 0,39
0,59 0,34
0,76 0,40
0,58 0,46
0,59 0,36
0,55 0,39
0,54 0,32
0,71 0,43
0,79 0,40
0,93 0,36
0,69 0,54
0,76 0,30
0,61 0,38
0,58 0,36
0,62 0,35
0,42 0,39
0,58 0,36
0,54 0,32
0,67 0,39
0,50 0,35
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pvaí
28,5
27,87
24,83
28,22
12,39 31,95
15,95 22,43
16,55 18,98
13,96 28,21
14,28 25,62
14,78 26,87
10,68 26,59
16,01 21,61
16,28 28,54
14,4
14,98 31,32
11,41 21,81
12,18 22,36
9,31
11,06 18,41
11,21 29,14
12,33 24,57
11,89 22,61
12,14 23,36
16,04 26,14
15,3
14,92 28,83
12,38 24,07
16,1
16,17 26,66
CP
Ratio (SST/ATT)
Pvaí Cong
0,46 0,39
CP
Acidez tit. Total
(ATT) (%)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cong
1,86 2,68
1,82 1,95
1,87 1,80
1,88 2,29
2,11 2,29
2,20 2,30
2,01 3,23
2,34 2,39
2,51 2,48
1,79 3,03
1,96 2,84
2,06 1,97
2,28 1,72
1,91 1,61
1,91 2,29
2,14 2,40
1,89 2,07
1,59 1,52
1,71 1,80
1,47 3,04
2,07 2,56
1,96 2,52
1,98 2,35
1,84 2,29
1,63 2,23
CP
Índice
Tecnológico (IT)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
355
362
353
352
313
300
329
282
263
368
336
320
289
345
346
309
350
415
386
448
319
337
334
359
404
246
339
366
288
288
287
205
276
266
218
232
336
383
410
288
275
319
433
366
217
258
262
281
288
295
Rendimento
industrial (RI)
(Cx t-1 suco)
Pvaí Cong CP Pvaí
Tabela 7. Características físico-químicas dos frutos de 25 genótipos de laranja Pêra (Citrus sinensis) em experimentos de Corn. Procópio
e Paranavaí.
Os resultados mostram que ocorreram diferenças na reação dos genótipos de laranja
Pêra ao cancro cítrico nos locais avaliados. O experimento instalado em Congonhinhas
mostrou um maior número de genótipos resistentes ao patógeno em relação a Cornélio
Procópio e Paranavaí. Essa menor incidência e severidade da doença observada em
Congonhinhas pode ser explicada pelo fato do pomar experimental estar localizado a uma
altitude de 757m e o local apresentar médias térmicas anuais mais amenas, o que dificulta o
desenvolvimento e dispersão do patógeno, visto que para a bactéria expressar sua
patogenicidade é preciso haver uma série de condições ambientais propícias, sendo as
temperaturas ideais entre 25 e 30°C (AMARAL, 2004; GOTO, 1992). De acordo com Pruvost
et al. (2002) em condições de climas tropicais, onde não há uma drástica diminuição da
temperatura no inverno, não ocorre quedas bruscas nos tamanhos populacionais de X. citri em
lesões de cancro. Ocorre sim uma lenta redução ao longo do tempo e isso pode ser resultados
de reações de defesa do hospedeiro (ALMEIDA; TSUYUMU, 2000). Vernière; Gottwald e
Pruvost (2003) avaliando os fatores que influenciam na suscetibilidade ao cancro cítrico,
verificaram que a temperatura mínima e máxima foi significativa no desenvolvimento do
cancro cítrico em plantas cítricas. Behlau et al. (2007) em seus estudos observaram que no
comportamento do cancro cítrico em folhas de laranja Pêra Rio, maiores incidências da
doença ocorreram nos meses de temperaturas mais elevadas e precipitações mais freqüentes,
independentemente da proteção química ou cultural aplicada.
O desenvolvimento dos genótipos nas condições de Congonhinhas foi mais lento do
que em Paranavaí e Cornélio Procópio e visivelmente foi possível observar que as plantas
motraram menor vigor. O surgimento de menos brotações novas consequentemente diminui a
área de exposição de tecidos mais suscetíveis ao patógeno, sendo que a concentração de
inóculo necessária para provocar a infecção é mais alta para tecidos maduros do que para
jovens (GOTTWALD; GRAHAM, 1992). Além disso, deve-se considerar que lesões mais
velhas disseminam pouca bactéria e a liberação é mais lenta do que em lesões menores e mais
jovens (TIMMER; GOTTWALD; ZITKO, 1991). Outro ponto a ser considerado é que
Congonhinhas não têm como característica a produção de citros, sendo que as regiões com
maior área plantada estão localizadas no Noroeste Paranaense, onde está o município de
Paranavaí, se concentrando nessa região grande parte da produção do Estado, além do aparato
industrial de processamento da fruta. Além dos outros fatores, a maior resistência ao patógeno
em Congonhinhas pode estar diretamente relacionada à baixa pressão de inóculo existente na
região, o que dificulta e torna mais lento a disseminação da doença. Isso concorda com os
40
estudos desenvolvidos por Behlau et al. (2007) onde observaram que os maiores níveis de
severidade ocorreram no período caracterizado também pelas maiores incidências de folhas
doentes, ou seja, maior concentração de inóculo disponível.
Em relação às avaliações nos três locais, o que se pode observar é que em cada local
ocorreram genótipos que se mostraram mais resistentes ao patógeno, porém os genótipos de
laranja Pêra EEL e Ovale Siracusa, mostraram menor suscetibilidade ao cancro cítrico em
todas as variáveis analisadas e em todos os locais dos experimentos (Tabela 2, 3 e 4). Além
disso, estes também se destacaram na avaliação de resistência em frutos, mostrando valores
baixos de incidência e severidade (Tabela 5). Sugere-se então, que estes genótipos tenham
maior nível de resistência aos sintomas de cancro cítrico e independem de condições
ambientais para mostrar esse potencial. Gonçalves-Zuliani et al. (2011b) em estudo preliminar
de avaliação de clones de laranja Pêra em Congonhinhas, Cornelio Procópio e Paranavaí já
observavam que os genótipos EEL e Ovale Siracusa, além de, Ipigua e Coroada mostravam
menores incidências de cancro cítrico nos três locais. Amaral et al. (2010) avaliando
diferentes espécies cítricas em condições de casa de vegetação, quanto a resistência ao cancro
cítrico, observaram que os genótipos Pêra EEL se classificou como resistente ao patógeno,
apresentando 0-5% da área foliar lesionada e Ovale Siracusa foi classificado como
moderadamente resistente (5-10% da área foliar lesionada).
Tendo sido realizada apenas uma avaliação de produção e uma análise físico-química
dos frutos, torna-se difícil afirmar se esses ou outros genótipos tenham se destacado nesses
fatores. O que podemos verificar é uma pequena variação na produtividade e nos aspectos
físico-químicos dos frutos, entre os genótipos e locais do experimento. Seria importante
realizar mais avaliações de produção e físico-químicas, porém, Tazima et al. (2010),
avaliando 14 safras de clones de Pêra no Paraná, não verificaram diferenças entre os
genótipos, para as variáveis Massa do Fruto, Teor de Sólidos Solúveis, Ácidez Titulável,
Ratio, Rendimento de Suco e Índice Tecnológico. Isso indica que esses fatores não seriam tão
condicionantes na escolha de um clone, visto que pertencem à mesma cultivar e as pequenas
diferenças apresentadas por eles, podem ser devido às condições edafoclimáticas e manejo
realizado em cada local (DONADIO; FIGUEIREDO; PIO, 1995).
Tendo a laranja Pêra conquistado a preferência de produtores, consumidores e
indústria no Paraná e visto a suscetibilidade da mesma ao cancro cítrico, a inserção de
genótipos que proporcionem menor incidência e severidade ao patógeno é de grande
importância em regiões onde o cancro seja endêmico. Além disso, deve-se considerar a
41
importância no aumento da variabilidade de genótipos, com características superiores de
produtividade e resistência ao cancro cítrico, para atender as demandas do citricultor
Paranaense, visto que no Estado os genótipos de Pêra mais cultivados são as Pêras Bianchi, 58
e 59.
42
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47
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48
CAPÍTULO II
49
RESUMO
O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri trouxe sérios prejuízos
as lavouras e indústrias processadoras de citros. O avanço da doença, principalmente em
Países de clima tropical é facilitado pelas condições climáticas favoráveis, além do manejo
empregado na colheita e comercialização dos frutos. O uso de genótipos resistentes é uma
importante ferramenta no controle de patógenos em diversas culturas, inclusive nos citros.
Estudos evidenciam que a inoculação artificial apresenta sintomas típicos de cancro cítrico,
quando utilizado ferimentos, aspersão ou infiltração do inóculo no tecido vegetal. Diante
disso, o presente trabalho avaliou a resistência de genótipos de laranja doce (Citrus sinensis),
variedade Pêra a bactéria X. citri, em condições parcialmente controladas (casa de vegetação).
Um total de 25 genótipos de laranja Pêra foram avaliados em dois ensaios (nov. a jan. de 2012
e abr. a jun. de 2012), sendo que as folhas das plantas foram inoculadas por perfuração com
agulha (0,55 x 0,20 mm), com constante molhamento no inóculo. O inóculo X. citri foi
ajustado a uma concentração de 108 UFC/mL através de espectrofotômetro 600 nm e
avaliações foram feitas pela medida do diâmetro das lesões. A quantificação bacteriana foi
realizada através da contagem da Unidade Formadora de Colônia (UFC), isolada de cada
lesão. Os resultados mostraram que os genótipos Pêra EEL, IAC 2000/1 se destacaram com os
menores diâmetros de lesão nos dois ensaios, além disso, Pêra Bianchi/CC e IAC obtiveram
os menores diâmetros no segundo ensaio e as menores populações bacterianas, sugerindo que
esses genótipos apresentem maior nível de resistência ao patógeno.
Palavras-chave: Diâmetro de lesão. Quantificação. Suscetibilidade. Xanthomonas citri subsp.
citri.
50
ABSTRACT
Citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri brought serious damage
to the citrus tilths and processing industries. The disease progression, especially in tropical
countries is facilitated by favorable weather conditions, in addition to the handling used in
harvesting and marketing of fruits. The use of resistant genotypes is characterized as an
important tool to facilitate the pathogens control in several crops, including citrus. Studies
show that artificial inoculation present typical symptoms of citrus canker when used injuries,
spraying or infiltrationor of the inoculum in the plant tissue. Therefore, this study evaluated
the genotypes resistance of sweet orange (Citrus sinensis) Pera variety to the bacterium X.
citri in partially controlled conditions (greenhouse). A total of 25 Pera genotypes were
evaluated in two trials (November - January 2012 and April-June 2012), and the leaves were
inoculated by needle punching (0.55 x 0.20 mm), with constant wetness in the inoculum. The
X. citri inoculum was adjusted to a concentration of 108 CFU/mL using a spectrophotometer
at 600 nm and evaluations were made by measuring the lesions diameter. Bacterial
quantification was performed by counting the Colony Forming Unit (CFU) isolated from each
lesion. The results showed that the EEL Pera and IAC2000/1 genotypes stood out with the
smallest diameters of the lesion in both assays, moreover, Bianchi/CC Pera and IAC obtained
the smallest diameters in the second assay and the lowest bacterial populations, suggesting
that these genotypes have a greater level of resistence to the pathogen.
Keywords: Diameter of lesion. Quantification. Susceptibility. Xanthomonas citri subsp. citri.
51
INTRODUÇÃO
A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD et al., 2006), agente causal do
cancro cítrico, provoca sérios problemas nas plantas cítricas e muitos prejuízos ao citricultor.
Os danos estão presentes nas folhas, ramos e frutos, iniciando com lesões necróticas,
geralmente circundadas por um halo amarelo. Com o aumento da gravidade dos sintomas nos
frutos, podem ocorrer rachaduras, servindo de porta de entrada para outros patógenos, além de
ocasionar queda com o passar do tempo (LARANJEIRA et al., 2005).
A suscetibilidade a X. citri pode variar amplamente entre as variedades cítricas, ou
seja, variedades que apresentem maior tempo de crescimento vegetativo são mais vulneráveis
a infecção do patógeno, sendo que a resistência a bactéria está diretamente relacionada a
juvenilidade do tecido (GOTTWALD; GRAHAM, 1992; GRAHAM et al., 1992). De acordo
com Gotwald et al. (1993), cultivares de citros com maior frequência, tamanho e duração do
crescimento de folhas e frutos são mais suscetíveis a X. citri no campo, comparado a
cultivares menos vigorosos ou aqueles cuja as folhas amadurecem mais rapidamente.
Para a medida da suscetibilidade do tecido foliar, a avaliação por meio de diâmetros
de lesão é uma importante ferramenta para verificação da interação entre Xanthomonas citri x
genótipos (NOCITI et al., 2006). Estudos evidenciam que há correlação na comparação dos
diâmetros de lesões em plantas mantidas em condições de campo e em casa de vegetação
(GRAHAM; GOTTWALD, 1990). Da mesma forma, a técnica de inoculação das folhas é
melhor realizada por ferimentos com agulhas, comparada a inoculação por aspersão ou
infiltração (GRAHAM; GOTTWALD, 1990; GRAHAM et al., 1992; BELASQUE JR.;
JESUS JR., 2006; NOCITI et al., 2006).
A avaliação da resistência genética pela inoculação da folha com agulha e avaliação
do sintoma pela medida do diâmetro da lesão, permite a realização de estudos mais rápidos,
com menor custo e com maior número de plantas ou repetições, além de ocupar menos
espaços, se comparado a experimentos em condições de campo (VILORIA et al., 2004). No
entanto, estudos da resistência de genótipos ao cancro cítrico em casa de vegetação ou em
laboratório não exclui a necessidade de estudos em campo (BELASQUE JR. et al., 2008).
Isso porque no campo podem ser avaliados aspectos relacionados ao crescimento do
hospedeiro, sendo que em casa de vegetação o crescimento é restringido (VILORIA et al.,
2004). Avaliações prévias em condições controladas podem facilitar o estudo da resistência de
52
espécies cítricas, principalmente em programas de melhoramento, que envolvam grande
número de genótipos no estudo. Nesse sentido o estudo tem por objetivo avaliar a resistência
de 25 genótipos de laranja doce (Citrus sinensis), variedade Pêra a bactéria X. citri, em
condições parcialmente controladas (casa de vegetação), por inoculação da folha com agulha
e avaliação do diâmetro da lesão.
53
MATERIAL E MÉTODOS
1.
Material biológico
Foram avaliados no presente estudo, 25 genótipos de laranja doce (Citrus sinensis),
variedade Pêra, oriundos de bancos de germoplasma do Centro de Citricultura Silvio Moreira
(CCSM) e Instituto Agronomico do Paraná (IAPAR). Outros materiais foram provenientes de
seleções realizadas por agricultores do Noroeste do Paraná. Os genótipos de laranja Pêra
estudados estão demonstrados na tabela 1. A estirpe de Xanthomonas citri utilizada na
inoculação das plantas foi a Xcc 306, proveniente da coleção do Fundo de Defesa da
Citricultura (Fundecitrus) e armazenada no laboratório de Biotecnologia do Núcleo de
Pesquisa em Biotecnologia Aplicada (NBA) da Universidade Estadual de Maringá (UEM).
Tabela 1. Genótipos de laranja Pêra utilizados no experimento de casa de vegetação, visando
resistência ao cancro cítrico, com sua respectiva procedência.
Código
Genótipos
Procedência
Código
Genótipos
Procedência
1
201
Pêra EEL
CCSM
214
Pêra Ovo
CCSM
202
Pêra Bianchi/CC
CCSM
215
Pêra Fumio
VMP2
203
Pêra IAC
CCSM
216
Pêra IAC 2000/2
CCSM
204
Pêra Ipigua
CCSM
217
Pêra – C
VMP
205
Pêra Olimpia
CCSM
218
Pêra - M 6
VMP
206
Pêra IAC 2000/1
CCSM
219
Pêra - M 5
VMP
207
CCSM
220
Pêra Roque
VMP
208
Pêra Ovale
CCSM
221
Pêra Arapongas
VMP
209
Pêra Dibbern
CCSM
222
Pêra - D 6
IAPAR3
210
Pêra Coroada
CCSM
223
Pêra 58
IAPAR
211
Pêra Roberto Gulo
CCSM
224
Pêra Bianchi /IP
IAPAR
212
Pêra Pêrão
CCSM
225
Pêra 59
IAPAR
213
Pêra Pirangi
CCSM
CCSM (Centro de Citricultura Silvio Moreira, Cordeirópolis-SP) 2VMP (Viveiro de Mudas Pratinha, ParanavaíPR) 3IAPAR (Instituto Agronômico do Paraná, Londrina-PR)
1
2.
Implantação do experimento
O experimento foi conduzido em casa de vegetação nas instalações do Núcleo de
Pesquisa em Biotecnologia Aplicada (23° 23' 57,8”S; 51° 57' 5,3”O e aproximadamente 500
54
m de altitude) pertencente à Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná. O
experimento foi realizado em duas épocas diferentes, sendo o primeiro ensaio conduzido de
novembro de 2011 a janeiro de 2012 e o segundo em abril a junho de 2012.
As mudas foram produzidas pelo Viveiro de Mudas Pratinha (VMP), sendo utilizado
como porta-enxerto o limão cravo (Citrus limonia). Foram mantidas cinco plantas por
genótipos (repetição) e essas receberam adubações periódicas de N, P, K, sendo feitas
aplicações periódicas para controle do ácaro da ferrugem, verrugose e melanose. As plantas
foram podadas aproximadamente 50 dias antes da inoculação, com objetivo de obter folhas
homogêneas e imaturas, entre 75 e 100% da completa expansão foliar, conforme Viloria et al.
(2004).
3.
Culturas bacterianas e preparo do inóculo
O inóculo foi preparado a partir de cultura pura de X. citri (isolado Xcc 306), obtida
junto ao acervo de culturas puras do Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus) e mantida
em tampão fosfato (0,075 M, pH 7,0) em geladeira. Para reativação, a bactéria foi semeada
em placas-de-Petri contendo meio de cultura nutriente-ágar [NA] (3 g extrato de carne, 5 g
peptona, 5g cloreto de sódio, 15 g de ágar/L de água destilada) por aproximadamente 48 horas
a 28°C, mantidas em estufa bacteriológica.
O inóculo foi preparado em tampão fosfato (0,075 M, pH 7,0), ajustado a 108
unidades formadoras de colônia/mL (BELASQUE JR.; JESUS JR., 2006) com auxílio de um
espectrofotômetro ajustado para leitura a 600 nm.
4.
Inoculação, quantificação e avaliação dos sintomas
O método de inoculação empregado foi o de ferimento do limbo foliar com agulha de
0,55 x 0,20 mm imediatamente após a imersão da mesma na suspensão bacteriana. Em cada
folha foram realizadas oito perfurações subepidérmicas (atravessando o limbo foliar) e
equidistantemente distribuídas, sendo inoculadas quatro folhas por planta, num total de cinco
plantas por genótipo. Nas primeiras 24 horas após a inoculação realizou-se o molhamento em
toda a casa de vegetação, principalmente ao redor do experimento, atentando sempre para não
55
ocorrer molhamento nas folhas inoculadas. Durante todo experimento as plantas
permaneceram em casa de vegetação, sob temperaturas entre 13 e 35°C.
O diâmetro médio das lesões foi avaliado no primeiro ensaio aos 18, 24, 33, 39, 46,
61, 68 e 76 dias após a inoculação (DAI). No segundo ensaio as avaliações ocorreram aos 22,
32, 39, 46, 54, 58, 69 e 76 DAI. Para auxílio da mensuração dos diâmetros foi utilizado um
micrômetro. Em cada data de avaliação foram mensurados os diâmetros de 20 lesões, sendo
esses medidos no sentido longitudinal da folha. Para fins de padronização somente foram
realizadas medidas de diâmetro da lesão na superfície abaxial das folhas e a presença de halo
amarelo ao redor da necrose foi desconsiderada nas avaliações.
Foi realizada a quantificação bacteriana nas lesões de X. citri ao final do
experimento. Para isto, as lesões foram cortadas em discos de aproximadamente 2,0 cm de
diâmetro e maceradas 1 lesão por planta em 1000 µl de solução salina (8g de NaCl; 1litro de
água destilada). Após feitas diluições seriadas, foi plaqueada 50 µl da solução diluída a 10 -4
em meio nutriente-ágar [NA] (3 g extrato de carne, 5 g peptona, 5g cloreto de sódio, 15 g de
ágar/L de água destilada) e após 48 horas procedeu-se a contagem das UFCs (Unidades
formadoras de colônia) de Xanthomonas por placa.
5.
Análise dos dados
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 25
tratamentos (genótipos de Pêra) e cinco repetições, sendo considerada uma planta como
unidade experimental. Os diâmetros das lesões nos dois ensaios e a quantificação bacteriana
foram comparados entre os tratamentos por análise de variância (teste F) e teste de
agrupamento de médias Scott-knott à 5% de probabilidade.
A partir das médias dos diâmetros das lesões obtidos nas oito avaliações e em duas
épocas de implantação do experimento foi possível determinar a Área Abaixo da Curva de
Progresso da Doença (AACPD) por meio da integração trapezoidal eq. (1) para cada genótipo
avaliado, conforme descrito por Campbell e Madden (1990) e Vale; Jesus Jr. e Zambolim
(2004).
AUDPC = Σ [([Y i + Y i-1 ] / 2) ( t i – t i-1 )]
56
(1)
Em que Y é o valor do diâmetro médio avaliado em mm; t o tempo de cada avaliação
da variável em questão; (Y i + Y i-1) corresponde a altura média do retângulo entre os pontos Y
i
e Y i-1; e (t i – t i-1) a diferença da base do retângulo entre os pontos t i-1 e t i que corresponde
ao intervalo de tempo em dias entre duas avaliações consecutivas.
Devido à variação ocorrida nos intervalos de avaliação, a variável integral AACPD
foi dividida pelo respectivo intervalo de observação (t i – t
i-1).
Assim a AACPD utilizada no
trabalho para comparar os diferentes tratamentos nas duas épocas de avaliação, corresponde a
Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença Estandardizada (AACPD*) (VALE; JESUS
JR.; ZAMBOLIM, 2004). Posteriormente ao cálculo da AACPD* para cada época de
implantação do experimento foram comparados os tratamentos nas duas épocas por análise de
variância e aplicado o teste de médias Scott-knott à 5% de probabilidade. As análises foram
feitas com auxílio do software ASSISTAT versão 7.6 beta.
57
Nos dois ensaios, todos os genótipos mostraram suscetibilidade ao cancro cítrico,
sendo os sintomas observados, característicos da doença. Inoculações artificiais com a
bactéria Xanthomonas citri, em plantas cítricas, também mostraram sintomas característicos
de cancro cítrico segundo Gottwald (1993) e Belasque Jr. et al. (2008). Deng et al. (2010) em
seus estudos de resistência constataram que todos os acessos testados de Citrus ichangensis
Swing. e C. junos Seib. mostraram lesões típicas de cancro cítrico sob inoculação artificial,
evidenciando que eles não apresentam resistência ativa à pelo menos uma estirpe de X. citri.
Em contrapartida os mesmos autores observaram que o acesso Chinese Citron de C. medica,
quando inoculado com X. citri, tanto em condição in vitro como in vivo não mostrou qualquer
lesão típica, sugerindo uma resistência ativa ao patógeno.
No primeiro ensaio, os sintomas iniciaram aos 12 dias após a inoculação do
patógeno, diferindo do segundo onde os genótipos mostraram sintomas há aproximadamente
10 dias após a inoculação. Estando de acordo com estudos desenvolvidos por Belasque Jr. et
al. (2008), onde os sintomas de cancro cítrico foram observados nas plantas inoculadas por
ferimentos com agulha entre uma e duas semanas após a inoculação e entre duas a três
semanas nas plantas inoculadas por aspersão. De acordo com Nociti et al. (2006), o período
médio de incubação foi diferente entre as linhagens de Xanthomonas, com os sintomas
tornando-se visíveis entre 9,1 e 17,3 dias após a inoculação. Inoculação estomática, por
infiltração do inóculo de X. citri, produziu lesões características de cancro cítrico bem
desenvolvidas dentro de 15 dias após a inoculação (VILORIA et al., 2004).
Durante o período de avaliação dos experimentos (76 dias), as lesões evoluíram
continuamente. No primeiro ensaio os diâmetros médios das lesões variaram de
aproximadamente 1,20 a 1,56 mm, sendo que no segundo os diâmetros médios variaram de
1,30 a 1,97 mm. Nociti et al. (2006) em estudo de comparação da agressividade de linhagens
de Xanthomonas, em condições de casa de vegetação por um período de 94 dias, também
constataram a evolução contínua do diâmetro das lesões, sendo que os mesmos variaram de
1,28 a 5,15 mm.
Visivelmente foi possível observar diferenças entre os genótipos no tamanho das
lesões (Figura 1).
58
59
212
220
219
203
211
202
221
213
204
222
214
205
223
215
206
224
216
207
225
217
208
218
209
Figura 1. Folhas dos 25 genótipos de laranja doce, variedade Pêra aos 76 Dias após a inoculação (DAÍ) com os sintomas de cancro cítrico.
210
201
Estatisticamente, pelo teste de agrupamento de médias Scott-Knott, ficou
comprovada as diferenças significativas a 5% de probabilidade entre os diâmetros médios de
lesão dos genótipos nos dois ensaios realizados (Figura 2 e 3). No primeiro ensaio os
genótipos de laranja Pêra EEL (201), Ipiguá (204), IAC 2000/1 (206) e Ovale Siracusa (207)
se destacaram apresentando os menores diâmetros de lesão na maioria das avaliações
realizadas nesse período. Apesar do genótipo 201 estar entre os maiores diâmetros de lesão na
primeira avaliação, não ocorreu evolução no aumento da lesão ao longo das demais
avaliações, sendo que a partir da terceira avaliação ele já se mostrou entre os genótipos com
menores diâmetros. Os genótipos de laranja Pêra C (217), Roque (220), Arapongas (221), D6
(222), 58 (223), Bianchi/IP (224) e 59 (225) mostraram os maiores diâmetros de lesão nas
avaliações.
60
Diâmetro de lesões – mm
Genótipos
*As letras (a–29/11/11), (b–05/12/11), (c–14/12/11) e (d-20/12/11) referem-se às avaliações 1, 2, 3 e 4
respectivamente.
*Médias seguidas por letras diferentes diferem pelo teste Scott-Knott (P<0,05) com coeficiente de variação de
4,71% (a); 3,89% (b); 4,41% (c) e 3,72% (d).
Figura 2.
Diâmetros médios de lesões (mm) causados por Xanthomonas citri nos diferentes
genótipos de laranja doce, variedade Pêra, no período de novembro a dezembro de
2011.
61
Genótipos
*As letras (e–27/12/11), (f-11/01/12), (g-18/01/12) e (h-26/01/12) referem-se às avaliações 5, 6, 7 e 8
respectivamente.
2,77% (e); 3,87% (f); 3,87% (g) e 2,90% (h).
Figura 3.
genótipos de laranja doce, variedade Pêra, no período de dezembro de 2011 a
janeiro de 2012.
62
O genótipo 207 apresentou menor diâmetro de lesão nas três primeiras avaliações e
um pequeno aumento nas demais, estando próximo ao grupo que obteve os menores
diâmetros (Figura 2 e 3). Essa variação no tamanho das lesões ao longo das avaliações pode
ser explicada pela aleatoriedade na medição dos diâmetros, ou seja, não ocorreu repetição da
mesma lesão em todas as avaliações.
No segundo ensaio os genótipos Pêra EEL (201), Bianchi/CC (202), IAC (203) e
IAC 2000/1 (206) apresentaram os menores diâmetros de lesão na maioria das oito avaliações
realizadas (Figura 4 e 5). Em contrapartida, os genótipos M5 (219), 58 (223), Bianchi/IP
(224) e 59 (225) apresentaram na maioria das avaliações os maiores diâmetros de lesão. Esses
resultados mostram que em uma mesma espécie, no caso C. sinensis e até dentro de clones de
uma mesma variedade foi possível detectar diferenças quanto à resistência a X. citri. Deng et
al. (2010) avaliaram diferentes genótipos de citros quanto a suscetibilidade ao cancro cítrico
por inoculação artificial do patógeno e verificaram que oito acessos de C. michangensis e
cinco de C. junos tiveram respostas bastante diferentes a inoculação artificial, tanto in vivo
como in vitro, indicando assim a diversificação nos níveis de suscetibilidade dentro de uma
mesma espécie.
63
Genótipos
*As letras (a-24/04/2012), (b-03/05/2012), (c-10/05/2012) e (d-17/05/2012) referem-se às avaliações 1, 2, 3 e 4
respectivamente.
2,20% (a); 2,28% (b); 1,67% (c) e 1,24% (d).
Figura 4.
genótipos de laranja doce, variedade Pêra, no período de abril a maio de 2012.
64
Genótipos
*As letras (e-25/05/2012), (f-29/05/2012), (g-14/06/2012) e (h-21/06/2012) referem-se às avaliações 5, 6, 7 e 8
respectivamente.
1,58% (e); 1,39% (f); 1,35% (g) e 1,71% (h).
Figura 5.
genótipos de laranja doce, variedade Pêra, no período de maio a junho de 2012.
65
Aos 76 DAI foi realizada a quantificação bacteriana nas lesões apresentadas pelos 25
genótipos de laranja Pêra. A 5% de probabilidade foi observada diferença significativa na
população bacteriana de cada genótipo. Os genótipos 202, 203, 207, 208, 214 e 216
apresentaram os menores números de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) por lesão, se
comparados aos demais (Figura 6).
1,0E+09
UFC/lesão
a
1,0E+08
a
a
a
a
b b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
a
a
b
a
a
a
a
a
b
1,0E+07
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
1,0E+06
Genótipos
*Médias transformadas em log x de UFC/lesão para cada genótipo nas colunas, seguidas pelas barras de erros e
letras diferentes que diferem pelo teste Scott-Knott (P<0,05) com coeficiente de variação de 4,5%.
Figura 6.
Número médio de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) por lesão obtidas
através do isolamento bacteriano das lesões nas folhas dos 25 genótipos de laranja
Pêra.
De acordo com Gotwald; Graham e Schubert (2002), o número total de bactérias
obtido na lesão geralmente está relacionado com a suscetibilidade do hospedeiro. Isso está de
acordo com o fato dos genótipos 202 e 203 terem apresentado os menores diâmetros de lesão
no segundo ensaio. Também concorda com o genótipo 207 que apresentou menor diâmetro
médio de lesão no primeiro ensaio. Viloria et al. (2004), em ensaios de resistência, com
inoculação por infiltração de inóculo de X. citri em condições de casa de vegetação,
observaram diferenças significativas na população bacteriana entre os genótipos analisados.
Maior população por área lesionada foi detectada em laranja doce (C. sinensis)
Pineapple (suscetível), sendo que menores populações ocorreram na variedade Meiwa
66
Kumquat (Fortunella crassifolia) (resistente). Graham et al. (1992), em estudos de resistência
de genótipos cítricos ao cancro cítrico, através de inoculação estomática, observaram em
muitos casos, que o número de lesões nas cultivares foram significativamente correlacionados
com a população bacteriana, além disso, o crescimento bacteriano diminuiu após 48 a 72 h,
nas variedades cítricas mais resistentes e continuou a aumentar nas mais suscetíveis. Wang et
al. (2011), avaliando o crescimento da população bacteriana de X. citri em Meiwa kunquat (F.
crassifólia) (resistente) e Newhall laranja navel (C. sinensis) (suscetível) observaram que aos
sete dias após a inoculação a população de Newhall foi significativamente mais alta que a de
Meiwa. Além disso, o crescimento bacteriano foi consistente com a incidência da doença,
sugerindo que a multiplicação da bactéria tenha sido mais lenta em Meiwa do que em
Newhall.
Foi calculada para cada ensaio a Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença
Estandardizada (AACPD*), para os diâmetros de lesões médios obtidos e observou-se que
não houve diferença significativa a 5% de probabilidade pelo teste de agrupamento de média
Scott-knott (Figura 7).
3
AUDPC*
2,5
2
1,5
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
1
Genótipos
Médias da AUDPC* para cada genótipo nas colunas, seguidas pelas barras de erros que não diferem pelo teste
Scott-Knott (P<0,05) com coeficiente de variação de 7,64%.
Figura 7.
Área Abaixo da Curva de Progresso da Doença Estandadizada (AACPD*) obtida
para diâmetro médio de lesões de cancro cítrico observados em cada avaliação em
dois ensaios.
67
Com o presente experimento foi possível observar que em condições de casa de
vegetação os sintomas de cancro cítrico foram semelhantes aos observados no campo. Os
maiores diâmetros de lesões nos dois ensaios foram obtidos pelos genótipos 58, Bianchi/IP e
59, evidenciando que esses sejam os mais suscetíveis ao patogeno, se comparados aos outros.
Nos dois ensaios realizados os genótipos de laranja doce Pêra EEL e IAC 2000/1 mostraram
os menores diâmetros de lesão. Amaral et al. (2010) avaliaram um grande número de
variedades cítricas, quanto a resistência ao cancro cítrico, em condições de casa de vegetação,
e também verificaram que o genótipo Pêra EEL apresentou em média 0-5% da área foliar com
lesão, classificando-o na classe dos mais resistentes ao cancro cítrico. Além destes, os
genótipos Pêra Bianchi/CC e IAC mostraram menores diâmetros de lesões no segundo ensaio
e menores populações médias de Xanthomonas citri na quantificação bacteriana.
Esses menores diâmetros de lesão e menor população bacteriana podem ter sido
influenciados diretamente por características físicas e químicas inerentes a cada um dos
genótipos. A estrutura da planta e as superfícies de cera são duas importantes barreiras físicas,
além disso, os estômatos são aberturas importantes e servem como portas principais para a
infecção. Wang et al. (2011) afim de verificar as diferenças físicas e químicas entre Meiwa
(resistente) e Newhall (suscetível), observaram que menores densidades e tamanho dos
estômatos, além do nível mais elevado de cera, demonstrados em Meiwa podem estar
envolvidos nessa resistência. Além disso, Meiwa sofre menos estresse oxidativo grave após
ataque de X. citri, levando a uma melhor viabilidade célula.
Os resultados sugerem que os genótipos Pêra EEL, IAC 2000/1, Bianchi/CC e IAC
apresentam certa resistência ao cancro cítrico, se comparados aos demais. Essa busca por
cultivares mais resistentes é a melhor solução em longo prazo para o manejo do cancro cítrico
(Viloria et al., 2004) e para que a citricultura sofra menos prejuízos com a doença.
68
REFERÊNCIAS
BELASQUE JR., J.; JACIANI, F. J.; MARIN, D. R.; BARBOSA, J. C. Tamanho da amostra
para quantificação do diâmetro de lesões de cancro cítrico. Tropical Plant Pathology, v. 33,
p. 317-322, 2008.
CAMPBELL, C. L.; MADDEN, L. V. Introduction to plant disease epidemiology. John
Wiley and Sons, New York, p.32, 1990.
DENG, Z. N.; XU, L.; LI, D. Z.; LONG, G. Y.; LIU, L. P.; FANG, F.; SHU, G. P. Screening
citrus genotypes for resistance to canker disease (Xanthomonas axonopodis pv. citri). Plant
Breeding, v. 129, p. 341-345, 2010.
GOTTWALD, T. R. Differential host range of Citrus and Citrus relatives to citrus canker and
citrus bacterial spot determined by leaf mesophyl susceptibility. Plant Disease, v. 77, p.
1004-1009, 1993.
GOTTWALD, T. R.; GRAHAM, J. H.; SCHUBERT, T. S. Citrus canker: The patogen and
its
impact.
Online.
Plant
Health
Progress
doi:1094/PHP-2002-0812-01-RV.
http:/www.apsnet.org/online/feature/citruscanker/. 2002.
Phytopathology, v. 80, p.190–196, 1990.
69
tipo C em lima ácida Galego. Fitopatologia Brasileira, v. 31, p. 140-146, 2006.
VALE, F. X., JESUS JR., W. C.; ZAMBOLIM, L. Epidemiologia aplicada ao manejo de
doenças de plantas. Belo Horizonte. Perffil. 2004.
VILORIA, Z.; DROUILLARD, D. L.; GRAHAM, J. H.; GROSSER, J. W. Screening triploid
hybrids of Lakeland limequat for resistance to citrus canker. Plant Disease, v. 88, p. 10561060, 2004.
WANG, Y.; FU, X. Z.; LIU, J. H.; HONG, N. Differential structure and physiological
response to canker challenge between Meiwa kumquat and Newhall navel orange with
contrasting resistance. Scientia Horticulturae, v. 128, p. 115-123, 2011.
70
CAPÍTULO III
71
RESUMO
O porta-enxerto pode influenciar a tolerância da variedade copa a fitopatógenos, geralmente
porta-enxertos que induzem menor vigor a copa, demonstram menores taxas de infecção do
patógeno, comparado aos mais vigorosos. O objetivo foi avaliar a influência exercida pelos
porta-enxertos limão cravo (Citrus limonia), tangerina sunki (Citrus sunki), tangerina
cleópatra (Citrus reshni) e laranja caipira (C. sinensis) na resistência ao cancro cítrico, em
nove genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) variedade Pêra. Para isto, foram avaliadas 10
plantas por genótipo, trimestralmente, nos anos de 2010, 2011 e 2012, sendo amostrados
quatro ramos de cada planta. Foi realizada a contagem total de folhas, de folhas doentes,
número de lesões por folha e estimada a severidade média de cada folha através de escalas
diagramática. Além disso, os frutos foram avaliados quanto à incidência, severidade e
características físico-químicas. Genótipos enxertados sobre laranja caipira mostraram menores
notas, incidência de folhas doentes, lesões por folhas e severidade, além de baixa incidência e
severidade em frutos. Ao contrário, o limão cravo mostrou ser bastante sensível ao patógeno,
possivelmente devido ao maior vigor conferido a variedade copa. Nas análises físico-químicas
não ocorreram diferenças significativas entre os porta-enxertos, mostrando que a
diversificação dos mesmos é possível para a variedade Pêra, conferindo maior resistência ao
patógeno sem que sejam alteradas as características físico-químicas aceitáveis industrialmente
à fruta.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Incidência. Severidade.
72
ABSTRACT
The rootstock can influence the tolerance of the scion variety to plant pathogens, usually
rootstocks that induce less vigor canopies, demonstrate lower rates of infection of the
pathogen, compared to the more vigorous. The objective was to evaluate the influence exerted
by the rootstocks rangpur lime (Citrus limonia), sunki mandarin (Citrus sunki), cleopatra
mandarin (Citrus reshni) and caipira orange (C. sinensis) in resistance to citrus canker in nine
genotypes of orange sweet (Citrus sinensis) Pera variety. Therefore, 10 plants per genotype
were sampled with four branches of each plant and evaluated quarterly in the years 2010,
2011 and 2012. The count of the total number of the leaves, diseased leaves, number of
lesions per leaf were made as well as the mean severity of each leaf was inferred using a
diagrammatic scale. Moreover, the fruits were evaluated for the incidence, severity and
physico-chemical characteristics. Genotypes grafted on caipira orange showed lower scores,
incidence of diseased leaves, lesions per leaf and severity, as well as lower incidence and
severity on fruits. Otherwise, the rangpur lime proved to be quite sensitive to the pathogen,
possibly due to greater vitality given to the orange variety. The physico-chemical analysis
showed no significant differences between rootstocks, demonstrating that the diversification
of the same is possible for the Pera variety, providing greater resistance to the pathogen
without amending the acceptable industrial physico-chemical characteristics to the fruit.
Keywords: Citrus canker. Incidence. Severity.
73
INTRODUÇÃO
Diversos estudos de avaliação da resistência de variedades a diferentes portaenxertos são realizados em condições de campo e a quantificação do cancro cítrico pode ser
feita pela incidência e severidade da doença, sendo que para a severidade é indispensável o
uso das escalas diagramáticas (BELASQUE JR. et al., 2005; BRAIDO et al., 2011). De
acordo com Gottwald et al. (1993) para o monitoramento do estado e propagação de
Xanthomonas citri subsp. citri no pomar, é exigido a estimativa da incidência e severidade da
doença. Sendo a incidência uma medida mais simples e relaciona-se com o número de plantas
infectadas e a severidade é a quantidade de doença por unidade, tendo maior subjetividade na
estimativa (MADDEN; HUGHES; VAN DEN BOSCH, 2007; BOCK et al., 2008a; 2008b;
2009). Belasque Jr. et al. (2005) sugerem ainda que na avaliação da resistência ao cancro
cítrico, sejam escolhidos ramos em diferentes lados da mesma planta.
Em estudos já realizados com porta-enxertos verifica-se que estes são capazes de
influenciar várias características culturais e fitopatológicas nas plantas cítricas (AGOSTINI;
GRAHAM; TIMMER, 1985; LEITE JR; SANTOS, 1988; SCHÄFER; BASTIANEL;
DORNELLES, 2001; STUCHI; DONADIO; SEMPIONATO, 2002; REIS et al., 2008;
TAZIMA et al., 2010). Podem induzir alterações à variedade copa, tal como crescimento,
tamanho, precocidade de produção, produtividade, época de maturação, peso de frutos,
coloração das cascas de frutos, teor de açucares e ácidos, conservação pós-colheita, resistência
a seca e frio, além da resistência a pragas e doenças (POMPEU JR., 1991). Um exemplo é o
porta-enxerto citrumeleiro swingle (Citrus paradisi x Poncirus trifoliata), que apesar de
originar plantas vigorosas, proporciona elevado índice de produtividade e baixa incidência ao
cancro cítrico (REIS et al., 2008).
A escolha do porta-enxerto pode estar condicionada a diversos fatores, no entanto,
um porta-enxerto que proporcione menor intensidade de cancro cítrico para a variedade copa
é uma estratégia importante no manejo integrado ou prevenção da doença, principalmente em
regiões onde o cancro seja endêmico. Em estudos desenvolvidos com diferentes portaenxertos o que se pode observar é que a taxa de infecção e disseminação do cancro cítrico
foram menores para plantas sobre porta-enxertos menos vigorosos, ou seja, folhas e frutos em
menor estádio de maturação são mais suscetíveis ao patógeno (DANOS; BERGER; STALL,
1984; AGOSTINI; GRAHAM; TIMMER, 1985). De acordo com Reis et al. (2008) os portaenxertos limoeiros cravo (C. limonia) e volkameriana (C. volkameriana) apesar de
74
proporcionarem altos índices de produtividade às plantas, somente devem ser indicados para
uso como porta-enxertos em regiões sem histórico ou risco de cancro cítrico, isso porque eles
induzem grande predisposição das plantas a essa doença.
Poucos são os estudos que avaliam o comportamento de genótipos cítricos,
influenciados pelo porta-enxerto, ao cancro cítrico no estado do Paraná . O estudo mais
evidente foi realizado por Leite Jr. e Santos (1988), na qual avaliaram o comportamento do
limão siciliano (C. lemon) enxertado sobre C. karna, limão rugoso da África (C. jambhiri
Lush.), laranja azeda (C. aurantium L.), limão cravo (C. limonia Osb.) limão volkameriano
(C. volkameriana Pasq.) e Poncirus trifoliata (L.) Raf.
Tendo em vista que a laranjeira Pêra [C. sinensis (L.) Osbeck] é uma das cultivares
mais importantes da citricultura brasileira, estando entre as variedades recomendadas para
cultivo no estado do Paraná, somado a ausência de estudos no Estado com esta variedade
enxertada sob diferentes porta-enxertos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência ao
cancro cítrico de nove genótipos de laranja doce, variedade Pêra, enxertados em limão cravo,
tangerina sunki, tangerina cleópatra e laranja caipira.
75
MATERIAL E MÉTODOS
1.
Implantação do Experimento
A área experimental foi localizada no município de Paranavaí, região Noroeste do
Estado do Paraná (23° 1'S, 50° 41'O e 467 m de altitude). Foram utilizados como material
vegetal nove genótipos de laranja doce, variedade Pêra, enxertados sob quatro porta-enxertos
diferentes (Tabela 1). Os genótipos foram plantados em espaçamento 2,5 m x 6,0 metros,
recebendo adubação no solo com N, P, K e foliar com Zn e Cu conforme recomendado em
pomares comerciais. Além de pulverizações com iseticidas para controle do Ácaros da leprose
(Brevipalpus phoencis), falsa ferrugem (Plyllocoptruta oleivora) e purpúreo (Panonychus
citri), psilídeos (Diaphorina citri), cochonilhas (Selenaspidus articulates, Parlatoria sp.,
Unapis citri, Orthezia praelonga, Coccus sp.), mosca-da-fruta (Ceratitis capitata) e bicho
furão (Ecdytolopha aurantiana), também foram realizados pulverizações com fungicidas para
prevenção da podridão floral (Colletotrichum acutatum), controle da verrugose (Sphaceloma
fawceti) e cúpricos para manejo do cancro cítrico.
Tabela 1. Genótipos de laranja doce Pêra sobre os porta-enxertos limão cravo, tangerina
sunki, tangeria cleópatra e laranja caipira.
Grupos Genótipos de Pêra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Ipigua – IAC
IAC
Bianchi
IAC 2000
Olimpia
EEL
59
58
Arapongas
Ipigua – IAC
IAC
Bianchi
IAC 2000
Olimpia
EEL
59
58
Arapongas
Porta-enxerto
Grupos Genótipos de Pêra
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
limão cravo
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
tangerina sunki
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
76
Ipigua – IAC
IAC
Bianchi
IAC 2000
Olimpia
EEL
59
58
Arapongas
Ipigua – IAC
IAC
Bianchi
IAC 2000
Olimpia
EEL
59
58
Arapongas
Porta-enxerto
tangerina cleópatra
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
laranja caipira
O experimento foi iniciado em Novembro de 2010, quando as plantas estavam com
dois anos de idade aproximadamente, sendo feitas seis avaliações trimestrais subseqüentes. O
inóculo inicial do experimento foi proveniente de plantas vizinhas já existentes no pomar.
2.
Avaliação e Análise dos dados
Para determinar a incidência e severidade do cancro cítrico em folhas, foram
avaliadas 10 plantas por genótipos. De cada planta foram avaliados quatro ramos jovens,
amostrados nos quatro quadrantes da porção mediana das plantas. As estimativas da
severidade foram atribuídas a todas as folhas doentes dos ramos avaliados utilizando escalas
diagramáticas (BELASQUE JR. et al., 2005). Procurou-se, avaliar os ramos que pertenciam à
última brotação emitida pelas plantas, com idade aproximada de três a seis semanas. Além
disso, foram atribuídas notas a planta de 0 a 5 (0 sem doença e 5 máximo de doença) adaptada
de Leite Jr. e Santos (1988) e foram contados o número de lesões de cancro cítrico nas folhas
dos quatro ramos avaliados por planta.
Para avaliação do desenvolvimento vegetativo, realizou-se a medição das plantas aos
cinco anos após o plantio, sendo utilizada para o cálculo do volume da copa a fórmula: V=2/3
π R2 H, onde V representa o volume da copa, R seu raio médio e H a altura da planta
(POMPEU JR., 1972).
Foram coletados 100 frutos aleatoriamente de cada variedade para estimar a
incidência e severidade do cancro cítrico. Para a incidência foi feita a contagem de frutos
doentes em relação ao total de frutos coletados. A severidade dos frutos doentes foi estimada
por escala diagramática (BRAIDO et al., 2011). Também foram realizadas análises físicoquímicas dos frutos nas safras de 2011 e 2012. Para isso, foram coletados 25 frutos por
variedade, amostrados na altura mediana dos quatro lados e na região central da planta. Os
frutos coletados foram submetidos às seguintes avaliações no laboratório de análises da
empresa Citri Agroindustrial, localizada no município de Paranavái, Paraná: Peso Médio dos
Frutos (PMF, em g); Rendimento do Suco (RS, em %) [(Relação entre as massas do suco e
dos frutos) x 100]; Sólidos Soluveis Totais (SST) medidos em °BRIX; Acidez Titulável Total
(ATT); Ratio, calculado pela relação SST e ATT; o Índice Tecnológico (IT), equivalente à
quantidade de sólidos solúveis totais no suco (kg), em uma caixa de colheita de frutos de 40,8
kg, obtido pela seguinte fórmula, IT = (RS.SST.40,8)/10000 (DI GIORGI et al., 1990). Foi
77
calculado o Rendimento Industrial (RI), ou seja, o número de caixas por tonelada de suco
concentrado, de acordo com a seguinte fórmula: RI = 660/IT (onde 660=660 kg de sólidos
solúveis em 1000 kg de suco concentrado). Também foi calculado a produtividade por
genótipo através da contagem total do número de frutos de três plantas por tratamento, sendo
que para isso foi considerado o PMF (g) e o peso de 40,8Kg por caixa.
Devido o experimento não atender a todas as pressuposições básicas para se fazer
uma análise estatística paramétrica, os dados de nota da planta, incidência de folhas doentes
nos ramos, número de lesões de cancro nas folhas e severidade de cancro nas folhas foram
submetidos à análise não-paramétrica dos dados. A análise não-paramétrica utiliza diversas
metodologias, sendo que a utilizada nesse trabalho seguiu a metodologia tradicional de
Rankings. Nesse caso os dados coletados são substituídos por postos, podendo aplicar
cálculos usuais e chegar a um teste, ou seja, através da adição de médias declaradas, qualquer
uma das metodologias paramétricas de comparação múltiplas de dados podem ser utilizadas
(Hobbs, 2009). Posteriormente foi aplicado o teste de Tukey (p≤0,05), utilizando o software
SAS – Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, CN, EUA). Os dados de volume de
copa foram submetidos a uma análise descritiva e as análises físico-químicas à análise de
variância, sendo as médias comparadas pelo teste de agrupamento Scott-Knott (p≤0,05).
78
Os resultados obtidos no período de 2010 a 2012 quanto à nota de cada planta,
incidência de folhas doentes nos ramos, número de lesões e severidade são apresentados na
tabela 2. Os dados foram passíveis de análise estatística não-paramétrica, mostrando diferença
significativa nos genótipos e seus respectivos porta-enxertos nas variáveis analisadas.
Para os dados de notas, os grupos 36, 35, 32, 33 e 27 apresentaram as menores
médias no ranking diferenciando dos grupos 6, 5,8, 4, 17, 9, 7, 3, 11, 1 e 2. Em relação á
incidência de folhas com cancro cítrico nos ramos avaliados, os grupos 36, 35, 32, 33 e 27
diferenciaram estatisticamente, com menores médias, dos grupos 5, 8, 6, 9, 4, 7, 3, 17, 1, 22 e
11. As médias dos números de lesões por folhas foram menores para os grupos 36, 35, 32, 33
e 27 diferindo de 5, 8, 9, 6 17, 4, 7, 3, 11 e 1. Para a severidade os grupos 36, 35, 32, 33 e 27
também mostraram menores médias e diferiram de 5, 9, 6, 4, 8, 17, 7, 3, 11, 1 e 29 (Tabela 2).
Analisando os resultados é possível observar que os grupos 36, 35, 32, 33 e 27 apresentaram
as menores médias em todas as variáveis analisadas, sendo que esses grupos correspondem
aos genótipos de laranja Pêra Arapongas (36), 58 (35), Olimpia (32) e EEL (33) enxertadas
sobre o porta-enxerto laranja caipira, além do genótipo Pêra Arapongas enxertado sobre
tangerina cleópatra. Estatisticamente diferente desses grupos, os genótipos de laranja Pêra
EEL, Olimpia, 58, IAC 2000, Arapongas, 59, Bianchi e IAC enxertados sobre limão cravo,
além dos genótipos 58 e IAC enxertados sobre tangerina sunki mostraram pelo ranking as
maiores médias para notas, incidência, número de lesões e severidade.
79
lesões e severidade em folhas de genótipos de laranja doce (C. sinensis) variedade Pêra
enxertado sobre diferentes porta-enxertos, durante o período de 2010 a 2012.
Grupo
Nota
Incidência
Número de lesões
Severidade
5
236,77* ab**
237,43 a
1362,58 a
227,56 a
8
235,19 abc
236,45 ab
1350,23 a
218,85 abc
6
248,61 a
236,35 ab
1306,76 abc
220,26 abc
9
218,65 abcde
226,35 abc
1316,68 ab
224,23 ab
4
224,81 abcd
221,47 abcd
1286,25 abcde
219,72 abc
7
218,35 abcde
214,98 abcd
1224,42 abcdef
208,88 abcd
3
205,50 abcdef
210,63 abcde
1193,78 abcdefg
204,47 abcde
17
218,77 abcde
209,89 abcde
1290,77 abcd
218,43 abc
1
196,70 abcdefg
200,44 abcdef
1173,24 abcdefg
194,47 abcdef
22
186,93 bcdefgh
193,52 abcdef
1119,22 abcdefgh
189,34 abcdefg
11
198,90 abcdefg
192,85 abcdef
1175,49 abcdefg
198,20 abcdef
21
188,54 bcdefgh
190,36 abcdefg
1143,88 abcdefgh
187,73 abcdefg
2
195,12 abcdefg
190,28 abcdefg
1128,11 abcdefgh
188,28 abcdefg
18
181,76 cdefgh
188,12 abcdefg
1118,82 abcdefgh
187,36 abcdefg
29
189,87 bcdefgh
187,60 abcdefg
1132,13 abcdefgh
192,28 abcdef
24
185,56 bcdefgh
186,76 abcdefg
1096,29 abcdefgh
184,50 abcdefg
23
184,93 bcdefgh
184,78 abcdefg
1113,73 abcdefgh
187,51 abcdefg
14
180,44 cdefgh
182,08 bcdefg
1090,74 abcdefgh
177,92 bcdefg
20
176,75 defgh
177,01 cdefg
1079,54 abcdefgh
179,22 bcdefg
12
172,64 defgh
170,62 defg
1019,78 cdefgh
169,55 defg
16
171,86 defgh
168,85 defg
1038,99 bcdefgh
169,87 defg
15
167,16 efgh
168,53 defg
1003,82 defgh
168,79 defg
13
165,73 efgh
168,35 defg
1017,64 cdefgh
168,77 defg
31
164,29 efgh
168,35 defg
995,82 efgh
166,63 defg
30
168,08 efgh
167,59 defg
1039,33 bcdefgh
174,04 cdefg
25
167,34 efgh
166,49 defg
1024,33 cdefgh
168,78 defg
26
157,83 fgh
156,48 efg
977,64 fgh
161,98 defg
19
154,61 fgh
154,07 fg
954,52 fgh
158,28 efg
28
151,50 fgh
151,14 fg
926,09 gh
153,35 fg
34
147,37 gh
147,48 fg
916,35 gh
152,56 fg
10
147,71 gh
146,70 fg
910,45 gh
152,70 fg
27
137,50 h
137,30 g
858,00 h
143,67 g
32
137,50 h
137,30 g
858,00 h
143,67 g
33
137,50 h
137,30 g
858,00 h
143,67 g
35
137,50 h
137,30 g
858,00 h
143,67 g
36
137,50 h
137,30 g
858,00 h
143,67 g
39,56
39,74
38,56
37,29
CV%
A avaliação de incidência e severidade em frutos foi realizada no quarto ano de
produção das plantas, sendo que anteriormente a este período, as plantas mostraram
irregularidade de produção, devido a diferentes floradas na mesma safra. Os resultados
80
mostram que oito grupos apresentaram frutos com sintomas de cancro para o limão cravo, seis
para tangerina sunki, cinco para tangerina cleopatra e três para laranja caipira (Tabela 3). Os
genótipos de laranja Pêra 58 (11,21 e 3,51%), EEL (8,74 e 2,37%), 59 (7,29 e 3,19%) e
Olimpia (6,19 e 3,20%) enxertados sobre limão cravo, além de Pêra Bianchi (6,00 e 2,37%) e
Pêra IAC (5,88 e 5,63%) sobre tangerina sunki e Pêra IAC (7,55 e 2,65%) e Olimpia (6,93 e
1,39%) sobre tangerina cleopatra mostraram incidência acima de 5% e severidade, na maioria
dos casos, superior a 2,5% (Tabela 3). Dentre os grupos que mostraram maior incidência e
severidade nas folhas as Pêras EEL, Olimipia, 58 e 59 enxertadas sobre limão cravo também
mostraram médias altas de incidência e severidade nos frutos. Os genótipos Pêra Arapongas,
58, Olimpia e EEL enxertados sobre laranja caipira se destacaram com menores notas,
incidência, número de lesões e severidade nas folhas, além disso, exceto a Pêra EEL, não
mostraran nenhum fruto com sintoma da doença. O genótipo EEL apesar de ter apresentado
frutos doentes, a incidência (1,02%) e severidade (0,60%) foram baixos, sugerindo uma maior
resistência ao cancro cítrico em frutos de plantas enxertadas sobre laranja caipira.
Tabela 3. Incidência e severidade de cancro cítrico em frutos de nove genótipos de laranja
Pêra enxertados sobre limão cravo (LC), tangerina sunki (TS), tangerina cleópatra (TC) e
laranja caipira (LCaip).
Grupos Incidência (%)
Severidade (%)
Grupos
Incidência (%)
Severidade (%)
1
2
2,94 (102)*
0,00 (101)
1,43 (3)**
0,00 (0)
19
20
0,00 (100)
7,55 (106)
0,00 (0)
2,65 (8)
3
4
5
6
7
8
1,96 (102)
3,85 (104)
6,19 (097)
8,74 (103)
7,29 (096)
11,21 (116)
1,35 (2)
3,33 (4)
3,20 (6)
2,37 (9)
3,19 (7)
3,51 (13)
21
22
23
24
25
26
1,96 (102)
2,94 (102)
6,93 (101)
2,00 (100)
0,00 (108)
0,00 (102)
0,45 (2)
0,90 (3)
1,39 (7)
1,95 (2)
0,00 (0)
0,00 (0)
9
10
3,85 (104)
0,00 (104)
1,18 (4)
0,00 (0)
27
28
0,00 (101)
0,00 (103)
0,00 (0)
0,00 (0)
11
12
5,88 (102)
6,00 (100)
5,63 (6)
2,37 (6)
29
30
0,00 (108)
4,00 (100)
0,00 (0)
1,73 (4)
13
14
0,00 (103)
2,00 (100)
0,00 (0)
0,50 (2)
31
32
2,97 (101)
0,00 (101)
1,23 (3)
0,00 (0)
15
16
1,98 (101)
3,06 (098)
4,65 (2)
1,93 (3)
33
34
1,02 (098)
0,00 (109)
0,60 (1)
0,00 (0)
17
4,00 (100)
2,95 (4)
35
0,00 (101)
0,00 (0)
18
0,00 (100)
0,00 (0)
36
0,00 (101)
0,00 (0)
*Médias da incidência de frutos doentes, seguida do total de frutos avaliados (entre parênteses).
**Médias de severidade dos frutos lesionados, seguida do total de frutos doentes (entre parênteses).
81
Na Tabela 4 são apresentadas as médias, desvios padrão e coeficientes de variação
amostrais para os volumes de copa dos quatro porta-enxertos avaliados. O que se pode
observar é que a menor média é apresentada pelo porta-enxerto tangerina sunki e a maior pela
laranja caipira.
Tabela 4. Estatísticas Descritivas do volume de copa observado para os porta-enxertos limão
cravo, tangerina sunki, tangerina cleópatra e laranja caipira.
Porta-enxerto
Estatíst.
limão cravo
15,94
5,52
34,63
Médias
D. Padrão
CV (%)
tangerina sunki
laranja caipira
14,51
7,58
52,24
16,26
6,45
39,67
22,79
7,59
33,40
Pela Figura 1 pode-se observar o comportamento das médias do volume de copa de
cada genótipo combinado com cada um dos porta-enxerto. Nota-se que as maiores médias são
as apresentadas quando utilizado o porta-enxerto laranja caipira para os genótipos: 58, 59,
Arapongas, Bianchi, EEL, IAC e Olímpia. Para o porta-enxerto tangerina sunki a maior média
foi obtida no porta-enxerto IAC 2000 e o para o porta-enxerto limão cravo a maior média foi
obtida com o genótipo Ipigua IAC.
Portaenxerto
Volume
10
15
20
25
30
laranjaCaipira
limaoCravo
tangerinaClepatra
tangerinaSunki
58a
59a
Arapongas
Bianchi
EEL
IAC
IAC2000
Ipigua IAC
Olimpia
Genótipo
Figura 1.
Médias dos volumes de copa dos genótipos de laranja Pêra, combinados com os
porta-enxertos laranja caipira, limão cravo, tangerina cleópatra e tangerina sunki.
A avaliação da produtividade média foi realizada no quarto e quinto ano de idade das
plantas e o que se pôde observar é que nesse período não houve diferença estatística entre os
genótipos para Kg/planta e para caixa/planta. O que se pode observar é que a produtividade
82
mostrada pelos genótipos ainda é baixa, variando de 0,48 a 1, 47 cx planta -1, sendo que a
média nacional é de 2,0 cx/planta (MACHADO et al., 2005) (Tabela 5). Quanto ao peso
médio dos frutos ocorreram diferenças significativas a 5% de probabilidade entre os genótipos
avaliados. Os genótipos Ipiguá-IAC e Olimpia não foram influenciados pelo porta-enxerto no
desenvolvimento dos frutos, visto que plantas destes enxertadas sobre os quatro portaenxertos avaliados mostraram menores peso médio de frutos. Além deles, os genótipos EEL e
59 sobre tangerina cleópatra e 58 sobre laranja caipira se comportaram de forma semelhante
se comparado aos demais (Tabela 5).
Analisando ainda a influência dos porta-enxertos, foram realizadas análises físicoquímicas nos frutos das safras 2011 e 2012. As variáveis, Rendimento de Suco, Sólidos
Solúveis Totais, Acidez Titulável Total, Ratio, Índice Tecnológico e Rendimento Industrial
não mostraram diferença significativa a 5% de probabilidade entre os grupos estudados
(Tabela 5).
83
Tabela 5. Avaliação da produção e análise físico-química dos frutos de nove genótipos de
laranja Pêra enxertados sobre quatro porta-enxertos.
Produção
Grupo PMF1
Prod.2
Análises fisico-químicas
Prod.3
Rend.
S.4
SST5
ATT6
(%)
(°BRIX)
(%)
Ratio7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
0,18 b*
0,20 a
0,21 a
0,23 a
0,17 b
0,20 a
0,20 a
0,22 a
0,20 a
0,17 b
0,20 a
0,22 a
0,24 a
0,16 b
0,21 a
0,21 a
0,23 a
0,20 a
0,18 b
0,19 a
0,20 a
0,20 a
0,16 b
0,18 b
0,18 b
0,20 a
0,19 a
0,16 b
0,21 a
0,21 a
0,23 a
0,17 b
0,20 a
0,20 a
0,18 b
0,19 a
57,70
56,72
47,34
43,02
59,99
51,86
58,36
51,93
55,65
27,87
31,40
26,03
33,18
35,87
38,59
35,68
40,47
35,53
19,77
20,16
23,37
29,57
27,10
34,43
22,60
25,43
28,49
32,23
33,07
38,90
22,01
23,52
40,26
29,05
35,26
30,55
1,41
1,39
1,16
1,05
1,47
1,27
1,43
1,27
1,36
0,68
0,77
0,64
0,81
0,88
0,95
0,87
0,99
0,87
0,48
0,49
0,57
0,72
0,66
0,84
0,55
0,62
0,70
0,79
0,81
0,95
0,54
0,58
0,99
0,71
0,86
0,75
57,00
57,83
58,02
51,74
59,84
55,81
56,26
56,45
49,84
59,26
57,70
57,35
52,99
64,20
59,12
59,12
57,05
58,44
58,02
59,40
57,31
55,53
57,81
57,71
61,70
57,84
59,29
57,95
57,00
55,67
53,33
57,43
57,09
54,45
56,60
58,91
9,38
9,64
9,40
9,27
10,04
9,56
10,03
9,93
10,28
10,62
10,08
10,86
9,90
11,42
10,75
11,05
10,66
11,22
10,38
10,78
10,94
10,03
11,59
10,84
10,61
10,53
11,63
10,99
10,82
11,12
9,83
10,80
10,38
11,19
10,88
11,25
0,55
0,59
0,50
0,50
0,54
0,53
0,48
0,48
0,55
0,60
0,56
0,54
0,50
0,63
0,58
0,61
0,59
0,60
0,57
0,55
0,56
0,50
0,61
0,51
0,54
0,52
0,65
0,61
0,59
0,57
0,50
0,65
0,57
0,58
0,56
0,61
(SST/
ATT)
17,06
17,03
18,62
19,16
18,83
19,03
21,11
20,62
19,18
17,84
18,14
20,22
19,81
18,29
18,63
18,06
18,18
18,85
19,33
19,69
19,71
20,12
18,96
21,32
20,15
20,39
18,14
18,24
18,20
19,61
19,71
16,68
18,30
19,35
19,45
18,63
CV%
8,15
43,22
43,22
9,33
9,24
12,42
16,62
(Kg)
(Kg/planta) (cx/planta)
1
IT8
RI9
-
(cx t-1)
2,19
2,28
2,23
1,96
2,45
2,18
2,31
2,29
2,10
2,57
2,38
2,55
2,15
3,01
2,61
2,68
2,50
2,68
2,47
2,63
2,57
2,29
2,74
2,56
2,67
2,50
2,82
2,61
2,53
2,53
2,15
2,54
2,43
2,49
2,52
2,71
308,81
292,65
303,11
341,90
269,60
306,19
292,59
291,97
332,13
258,11
282,44
261,39
315,02
224,50
260,12
253,22
274,42
249,28
273,14
258,71
261,20
300,15
245,88
262,82
249,94
270,28
236,19
256,84
267,57
264,10
314,43
262,89
278,16
267,18
267,06
246,90
16,45
18,38
Peso médio de frutos (g); 2Produtividade (Kg planta-1); 3Produtividade (caixa planta-1); 4Rendimento do suco
(%); 5Sólidos solúveis totais (°BRIX); 6Acidez titulável total (ATT); 7Ratio (SST/ATT); 8Índice tecnológico;
9
Rendimento Industrial (caixa/ton. suco)
*Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre si, no nível de 5% de probabilidade
pelo teste de Scott-Knott.
84
Como é possível observar, os porta-enxertos exerceram um papel fundamental na
resistência ao patógeno, pois os mesmos genótipos de Pêra que apresentam menores médias
em contrapartida também estão presentes nos grupos com maiores médias. A maioria dos
genótipos enxertados sobre laranja caipira mostraram menores notas na planta, incidência de
folhas com cancro nos ramos avaliados, número de lesões por folhas e severidade, ao
contrário da maioria dos genótipos enxertados sobre limão cravo. Leite Jr. e Santos (1988)
avaliando o limão siciliano (C. lemon) enxertado sobre diferentes porta-enxertos, também
verificaram que o limão cravo induziu alta incidência e severidade de cancro cítrico em folhas
e frutos. Em estudo conduzido por Agostini; Graham e Timmer (1985) também verificaram
que o porta-enxerto pode indiretamente afetar a gravidade do cancro cítrico em uma variedade
copa, sendo que correlacionaram positivamente a incidência e severidade da doença em
laranja Valência com o vigor induzido à copa pelo porta-enxerto. A taxa de infecção e
disseminação da doença foram menores para plantas sobre porta-enxertos menos vigorosos.
Visto que folhas e frutos imaturos são mais suscetíveis a Xanthomonas citri, à maior
incidência e severidade à doença em copas sobre porta-enxertos vigorosos tem sido atribuída
à maior freqüência e duração de brotações novas durante os fluxos de crescimento das plantas
(DANOS; BERGER; STALL, 1984; AGOSTINI; GRAHAM; TIMMER, 1985). Visualmente
foi possível constatar que os genótipos enxertados sobre limão cravo mostraram plantas mais
vigorosas, com um número maior de lançamento de ramos novos durante os três anos de
avaliação. Apesar da laranja caipira apresentar as maiores médias de volume de copa aos
cinco anos de idade, os genótipos enxertados sobre ela não foram induzidos ao frequente
lançamento de ramos jovens ao longo das avaliações e isso pode ter influenciado diretamente
nas menores taxas de incidência e severidade de cancro cítrico nos genótipos enxertados
sobre ela.
Em estudos desenvolvidos por Reis et al. (2008), cujo objetivo foi verificar a
influência de diversos porta-enxertos na incidência de cancro cítrico em laranjeiras Monte
Parnaso, verificaram que as plantas enxertadas sobre limoeiro cravo apresentaram maior
número de folhas com lesões de cancro cítrico, seguidas pela tangerina sunki, limão
volkameriano e citrangeiro troyer.
A baixa incidência e severidade em folhas se repetiu para frutos, sendo que a maioria
dos genótipos enxertados sobre laranja caipira não apresentaram frutos com sintomas da
doença. O que não ocorreu com genótipos sobre limão cravo, que apresentaram, em sua
maioria, incidência acima de 5,0% e severidade superior a 2,5%. Reis et al. (2008)
85
verificaram que o limoeiro cravo, a tangerineira sunki e o limoeiro volkameriana
apresentaram maior porcentagem média de frutos com lesões em relação aos porta-enxertos
flying dragon e citrumelo swingle. De acordo com os autores a incidência de cancro cítrico
nos frutos esteve relacionada ao vigor conferido às plantas pelos porta-enxertos, podendo ser
justificado pela menor presença de inóculo nas folhas.
A baixa produção obtida pelos genótipos pode estar atribuída à idade das plantas.
Behlau et al. (2008) constataram que a baixa produção nas primeiras safras pode ser atribuída
principalmente à idade muito jovem das plantas, como também pela queda prematura de
frutos, resultado da elevada incidência e severidade de cancro cítrico nas folhas e frutos.
Plantas adultas produziram brotações novas com menor frequência, o que resultou na redução
da incidência e severidade da doença nas folhas, redução da incidência de frutos doentes e
consequentemente menor queda prematura de frutos. Apesar disso, o porta-enxerto pode
influenciar na produção da variedade copa. Avaliando-se o comportamento de laranja
Valência sobre 12 porta-enxertos, os autores observaram que após quatro colheitas, entre o
quinto e oitavo ano, o porta-enxerto Poncirus trifoliata conferiu uma produção média baixa,
com 30,73 Kg por planta, quando comparado aos limoeiros cravo e volkameriano, com
produções médias de 154,81 e 150,12 kg por planta, respectivamente (ALVARENGA et al.,
1986). Roberto; Lima e Carlos (1999), avaliando o comportamento da laranja doce Valência
sobre oito porta-enxerto, verificaram que nas três primeiras safras os limões cravo e
volkameriano apresentaram as maiores médias de produção de frutos por planta (96,77 e
89,49 Kg por planta respectivamente). Figueiredo et al. (2002) avaliando porta-enxertos que
pudessem substituir o limão cravo para copa tahiti sob condições edafoclimáticas de
Bebedouro, SP, verificaram que as menores produções foram proporcionadas pela tangerina
sunki, cleopatra, batangas, oneco e laranja caipira.
A influência do porta-enxerto no desenvolvimento do fruto está relacionada a
capacidade de fornecer água e nutrientes a planta. Porta-enxertos que caracterizam maior
vigor a planta são melhores na extração de umidade do solo, mantendo a mesma sob menor
estresse hídrico, além de que, induzem baixa concentração de Sólidos Solúveis nos frutos,
mas produzem mais Sólidos Solúveis por planta (STUCHI, 1996). De acordo ainda com
Stuchi (1996) frutos grandes e com baixas concentrações de Sólidos Solúveis e Acidez, estão
associados à porta-enxertos que induzem crescimento rápido e vigoroso, estando incluída
nesta categoria o limoeiro cravo, limoeiro rugoso, palestine sweet lime, C. macrophylla, C.
pennivesiculata e cidra. Já as variedades enxertadas sobre os pouco vigorosos, como Poncirus
86
trifoliata, tem menor desenvolvimento vegetativo e tendência a frutos menores e com alto
conteúdo de Sólidos Solúveis e Acidez, sendo que variedades enxertadas em laranja caipira e
azeda tem como característica a produçãode frutos com características intermediárias.
A diversificação do porta-enxerto pode influenciar muito pouco nas características
físico-química dos frutos. Tazima et al. (2010) avaliando a produção e as características
físico-químicas de frutos de três clones de laranjeira Pêra no Norte do Paraná, observaram que
as médias de 14 safras para as variáveis Massa de Fruto, Teor de Sólidos Solúveis, Acidez
Titulável, Ratio, Rendimento de Suco e Índice Tecnológico também não diferiram
estatisticamente para os clones avaliados. Stuchi; Donadio e Sempionato (2002) avaliando a
influência de sete porta-enxertos, incluindo tangerineiras sunki e cleópatra, na produtividade e
nas características físico-químicas dos frutos de laranjeira valência, também observaram que
não ocorreram diferenças entre os valores de Acidez, Sólidos Solúveis Totais, Ratio e Índice
Tecnológico.
O porta-enxerto limão cravo é o mais predominantemente utilizado nas regiões
produtoras de citros, principalmente pela sua tolerância a estresse hídrico, conferida pelo alto
vigor proporcionado a variedade copa, pela tolerância ao vírus da tristeza dos citros e
compatibilidade com diferentes variedades. Além dos altos índices de produtividade
alcançados por variedades enxertadas sobre ele (ALVARENGA et al., 1986; ROBERTO;
LIMA; CARLOS, 1999). No entanto a diversificação com outras espécies, que não somente o
limão cravo faz-se importante e necessário, uma vez que os fungos do gênero Phytophthora
encurtam a vida útil das copas enxertadas sobre ele (Figueiredo et al., 2002), além da alta
suscetibilidade ao cancro cítrico de genótipos de laranja Pêra enxertados sobre o mesmo. E
tendo o porta-enxerto laranja caipira apresentado baixo índice de incidência e severidade ao
cancro cítrico em folhas e frutos, além de não diferir estatisticamente dos outros nas
características físico-químicas da fruta, sugere-se o mesmo como uma boa opção na
diversificação de porta-enxertos para a laranja Pêra em pomares comerciais do Noroeste
Paranaense. Sendo assim, apesar da escolha do porta-enxerto estar condicionada a diversos
outros fatores, aqueles que proporcionem menor incidência e severidade de cancro cítrico,
principalmente em regiões onde a doença seja endêmica, é de fundamental importância no
manejo integrado de citros, podendo até mesmo possibilitar o cultivo de genótipos que
apresentem maior suscetibilidade ao patógeno nessas regiões.
87
REFERÊNCIAS
AGOSTINI, J. P.; GRAHAM, J. H.; TIMMER, W. L. Relationship between development of
citrus canker and rootstock cultivar for young Valencia orange trees in Misiones, Argentina.
Proceedings Florida State Horticultural Society, v. 98, p. 19-22, 1985.
ALVARENGA, L. R.; BENDEZU, J. M.; TEIXEIRA, S. L.; GAMA, A. M. P.
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90
CAPÍTULO IV
DESTACADAS
91
RESUMO
Estudos mostram que espécies de citros mostraram sintomas típicos aos apresentados no
campo quando a inoculação de Xanthomonas citri subsp. citri é aplicada artificialmente. O
desenvolvimento de uma metodologia que permitisse um estudo preliminar de genótipos
cítricos, onde pudesse ser testado um grande número de espécies, em pequeno espaço, sem
custo elevado, seria uma importante ferramenta nos estudos de resistência ao cancro cítrico. O
objetivo do trabalho foi avaliar genótipos cítricos com diferentes níveis de resistência ao
cancro cítrico em inoculação de folhas destacadas e observar por Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV), as diferenças na morfologia e colonização do patógeno ao longo do tempo.
Um total de nove acessos de diferentes espécies cítricas foram investigados, sendo que após a
coleta e desinfecção das folhas, estas foram inoculadas por perfuração com agulha (0,55 x
0,20 mm). O inóculo de X. citri foi ajustado a uma concentração de 108 UFC/mL por
espectrofotômetro 600 nm. As avaliações dos diâmetros das lesões foram realizadas com
auxílio de um micrômetro. Para estudos morfológicos, foram realizados cortes nas lesões de
cancro, dos genótipos Pêra IAC e Washington navel, aos 3°, 7° e 14° dias após a inoculação e
posteriormente observadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). O genótipo Pêra
IAC mostrou maior resistência ao patógeno, apresentando a menor média de diâmetro de
lesão (1,32mm). Já a variedade Washington navel apresentou o maior diâmetro de lesão (1,84
mm), inferindo a ela uma baixa resistência a X. citri. As observações no MEV mostraram que
o genótipo Pêra IAC apresentou menor tamanho de abertura estomática e maior liberação de
produtos químicos tóxicos, podendo essas serem importantes barreiras físicas e químicas
contra a agressividade de Xanthomonas citri.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Inoculação. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
Resistência.
92
ABSTRACT
Studies evidenced that citrus species showed typical symptoms similar to those in the field
when the artificially inoculation of Xanthomonas citri subsp citri is applied. The development
of a methodology that would allow a preliminary study of citrus genotypes, which could test a
large number of species in small space with lower cost, would be an important tool in the
study of citrus canker resistance. The objective of this study was evaluate citrus genotypes
with different levels of citrus canker resistance in inoculation of detached leaves and observe
the morphology and colonization differences of the pathogen throughout time by Scanning
Electron Microscopy (SEM). A total of nine different citrus species accesses were
investigated, and after collecting and disinfecting, the leaves were inoculated by puncture
with a needle (0.55 x 0.20 mm). The inoculum of X. citri was adjusted to 108 CFU/ml
concentration using spectrophotometer at 600 nm. The lesions diameters evaluations were
performed with a micrometer. For morphological studies, sections were made in the canker
lesions of Pera IAC and Washington navel genotypes, at the 3rd, 7th and 14th days after
inoculation and subsequently observed by Scanning Electron Microscopy (SEM). The Pera
IAC genotype showed greater resistance to the pathogen, presenting the lowest mean diameter
(1.32mm) of lesions. Otherwise, the Washington navel variety had the highest lesion diameter
(1.84mm), inferring a low resistance to X. citri. The observations in the SEM showed that
Pera IAC genotype had a smaller stomatal opening and increased release of toxic chemicals,
these may be important physical and chemical barriers against the aggressiveness of
Xanthomonas citri.
Keywords: Citrus canker. Inoculation. Resistance. Scanning Electron Microscopy (SEM).
93
INTRODUÇÃO
Dentre alguns dos desafios enfrentados pela citricultura brasileira, o cancro cítrico,
uma doença bacteriana causada pela Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD et al., 2006) se
destaca. Esse patógeno penetra nos tecidos vegetais do hospedeiro, tendo como porta de
entrada estômatos, hidatódios, lenticelas ou ferimentos (GOTTWALD; GRAHAM, 1992;
GRAHAM et al., 1992). Assim, a variabilidade na suscetibilidade ao cancro cítrico pode ser
influenciada pela anatomia do estômato, sendo um fator determinante na facilidade da entrada
da bactéria (GRAHAM et al., 1992).
Para que X. citri possa expressar seus sintomas é preciso que ocorra condições
ambientais favoráveis (AMARAL, 2004). As condições ideais de infecção ocorrem entre
temperaturas de 25 a 30°C, com lâmina de água na superfície da folha (GOTO, 1992). Além
disso, X. citri cresce facilmente nos meios de cultura utilizados em laboratório e são visíveis
após 48 horas de incubação a 28°C. Os sintomas em plantas inoculadas, mantidas a 28°C,
começam a ser visíveis após 10 dias (LARANJEIRA et al., 2005).
O manejo integrado do cancro cítrico inclui a utilização de plantas resistentes ao
patógeno. Em estudos realizados com variedades de laranja doce (Citrus sinensis) e tangerinas
(Citrus reticulata) grande variabilidade para resistência ao cancro cítrico foi encontrada
(LEITE JR., 1989; GONÇALVES et al., 2010; GONÇALVES-ZULIANI et al., 2011a;
2011b; VARGAS et al., 2013).
Para avaliações da patogenicidade de X. citri é importante testes diagnósticos ou
qualquer outro procedimento que tenha como objetivo a rápida obtenção de sintomas de
cancro cítrico, sugere-se a inoculação do hospedeiro por ferimentos independentemente da
concentração de inoculo utilizada (106 a 108 UFC/mL) (BELASQUE JR.; JESUS JR., 2006).
Além disso, a técnica da estimativa do diâmetro de lesões de cancro cítrico é muito utilizada
na avaliação da resistência varietal de espécies cítricas e estudos epidemiológicos
(GRAHAM; GOTTWALD, 1990; NOCITI et al., 2006; GOTTWALD; GRAHAM;
SCHUBERT, 1997).
O estudo da resistência de genótipos ao cancro cítrico em condições parcialmente
controladas de casa de vegetação não exclui a necessidade de estudos em campo. No entanto,
avaliações prévias nessas condições controladas podem auxiliar no estudo da resistência
(VILORIA et al., 2004). O uso da inoculação em folhas destacadas pode ser uma técnica mais
94
rápida, de menor custo e com maiores números de genótipos ou repetições, não dependendo
de um espaço, como casa de vegetação ou área no campo para se instalar o experimento.
Além disso, a rápida informação em relação às plantas de citros que mostrem potencial
resistência a Xanthomonas citri seria muito útil em programas de melhoramento genético de
citros. Diante disso, o estudo teve como objetivo testar diferentes genótipos de citros com
diferentes níveis de resistência ao cancro cítrico em metodologia de inoculação de folhas
destacadas e avaliação morfológica dos estômatos, além da colonização bacteriana ao longo
do tempo.
95
MATERIAL E MÉTODOS
1.
Genótipos de citros e isolado de Xanthomonas citri
Avaliou-se nove genótipos de laranja doce (Citrus sinensis) variedades Valência
mutação (03), Castellana ivia 64-3 (05), Bey navel (17), Washington navel (24), Baia leng
(16), Pêra IAC (22), Pêra ovo (20), Salustiana SPA 11 (11) e Khailily white (23). A estirpe de
X. citri utilizada na inoculação das plantas estudadas foi a Xcc 306, proveniente da coleção do
Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus) e armazenada no laboratório de Biotecnologia
do Núcleo de Pesquisa em Biotecnologia Aplicada (NBA) da Universidade Estadual de
Maringá.
2.
Implantação do experimento
As folhas utilizadas no experimento foram coletadas de plantas cítricas localizadas
em um pomar experimental na Fazenda Experimental de Iguatemi (FEI) (Latitude: 23° 25’ S;
Longitude: 52° 10’ O; Altitude: 554,9), pertencente à Universidade Estadual de Maringá
(UEM), município de Maringá, Paraná. O pomar experimental com 213 espécies cítricas
diferentes e foi implantado para avaliar a resistência das variedades ao cancro cítrico, sendo
que os genótipos foram oriundos do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) do Centro APTA
Citros Sylvio Moreira (CCSM-IAC).
Ramos dos oito genótipos estudados, com o mesmo estádio de maturação e com boa
sanidade (sem sintomas ou sinais de patógenos) foram coletados de plantas do pomar
experimental da FEI. Os ramos receberam sanitização com lavagem e desinfecção com
hipoclorito 1%, após foi realizada a secagem das folhas. Com auxilio de um estilete
esterilizado foi feito o corte das folhas de forma que parte do ramo permanecesse junto com a
folha e o pecíolo. Imediatamente após o corte, a folha foi inoculada com auxílio de uma
agulha esterilizada (0,55 x 0,20 mm), realizando oito perfurações por folha, num total de 10
folhas por genótipo. O inóculo foi ajustado a uma concentração de 108 UFC/mL
(BELASQUE JR.; JESUS JR., 2006) em espectrofotômetro a 600 nm.
96
Após a inoculação, as folhas foram mantidas em tubo Falcon, o qual continha
aproximadamente 1,5 ml de água de torneira ou o suficiente para cobrir parte do ramo e
metade do pecíolo, sem atingir o limbo foliar (Figura 1). O tubo não foi fechado por completo
para que ocorresse transpiração normal da folha. Durante o experimento a água foi reposta,
para que permanece sempre umedecido. As folhas armazenadas nos tubos foram conservadas
em temperatura ambiente e as avaliações foram realizadas pela medida do diâmetro de lesões
com auxílio de um micrômetro externo (Disma 0–25mm). As avaliações iniciaram aos sete
dias após a inoculação, sendo realizadas outras duas avaliações a cada três dias.
Os resultados obtidos para diâmetro de lesões foram analisados utilizando-se o
software ASSISTAT versão 7.6 beta e o teste utilizado para a comparação das médias dos
diâmetros avaliados foi o Scott-Knott, ao nível de 5% de significância.
A
Figura 1.
3.
B
Ensaio com Folhas de citros destacadas. A - Folhas destacadas mantidas em tubo
Falcon sob estante de isopor. B- Preenchimento do tubo Falcon com água de
torneira na metade do pecíolo.
Avaliação por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As análises das estruturas morfológicas e colonização bacteriana das lesões foram
realizadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) aparelho SHIMADZU SS-550,
junto a Central de Microscopia (CMI-COMCAP) da Universidade Estadual de Maringá,
Maringá, Paraná. As variedades utilizadas nas análises foram Pêra IAC e Washington navel.
97
Foram realizados cortes de 5x5 mm (com auxílio de bisturi esterilizado) antes da inoculação e
aos 3°, 7° e 14° Dias Após a Inoculação (DAI), sendo estes efetuados nas folhas com mesmo
estádio vegetativo e condições de hidratação e armazenamento. Posteriormente o material foi
fixado em solução fixadora: Cacodilato de sódio 0,1M e Glutaraldeído 2,5%. Nesta fase as
amostras foram conservadas em geladeira. Após as amostras foram lavadas três vezes com
Cacodilato 0,1M, sendo desidratadas em gradiente crescente de etanol (30, 50, 70, 80, 90, 95,
100%) 10-15 minutos. No etanol 100% repetiu-se a desidratação três vezes. Posteriormente
foi realizado o Ponto crítico (substituição do etanol por CO 2) em aparelho BALZERS CPD
030. As amostras foram metalizadas em ouro (três ciclos de 5 minutos com corrente de 6mA).
E em seguida, levadas para observação no MEV. Para melhor observação da morfologia dos
estômatos e colonização bacteriana, foi visualizada a face abaxial e adaxial da folha.
A fim de observar melhor a infecção bacteriana, o tecido vegetal lesionado
previamente fixado em solução fixadora foi envolvido em parafilm e mergulhado em
nitrogênio líquido, sendo realizado imediatamente, o corte transversal da lesão.
Posteriormente, as amostras foram lavadas e desidratadas, conforme metodologia descrita
anteriormente. Para visualização do corte, as amostras foram dispostas verticalmente, com o
corte voltado para cima e metalizadas em ouro.
Após a visualização, foram realizadas medidas da área da abertura estomática das
duas variedades observadas por microscopia, através do programa Klonkimage Measurement
13.2.2.213. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) pelo teste F e a
comparação das médias pelo teste Tukey a 5% de significância.
98
Nos ensaios de inoculações de X. citri mantidas como folhas destacadas em tubo
Falcon os sintomas se iniciaram nos cinco dias após a inoculação nas variedades Castellana
ivia e Washington navel e aos seis dias nas demais variedades. Em ensaios desenvolvidos por
Deng et al. (2010), em folhas destacadas, inoculadas com X. citri e mantidas in vitro, os
sintomas iniciaram no 3º ao 10º dias após a inocolução. Gottwald (1993) avaliando genótipos
cítricos, observaram que as plantas mostraram sintomas típicos de cancro quando inoculadas
artificialmente com o patógeno. Wang et al. (2011) avaliando a resposta de espécies cítricas a
inoculação artificial de X. citri observaram que em três dias após a inoculação lesões
pequenas e circulares foram observadas na superfície abaxial das folhas. As lesões iniciaram
na parte abaxial da folha como pústulas brancas, esponjosas e salientes (Figura 2), sendo que
na superfície adaxial ao final do experimento foi possível observar lesões escurecidas e
grossas em coloração marrom a castanho claro. Esses sintomas descritos estão de acordo com
os relatados por Wang et al. (2011).
As variedades estudadas mostraram diferenças significativas pelo teste de
comparação de médias Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade nas medidas do diâmetro
das lesões. A variedade Pêra IAC (1,32mm) apresentou os menores diâmetros de lesões,
diferindo significativamente de todas as outras. As variedades Khailily White (1,48mm) e
Pêra ovo (1,52mm) não diferiram significativamente entre si. Também não apresentaram
diferenças entre si as variedades Baia leng (1,56mm), Salustiana SPA11 (1,61mm), Castellana
ivia (1,62mm), Valência mutação (1,64mm) e Bey navel (1,65mm). A variedade Washington
navel (1,84mm) apresentou os maiores diâmetros de lesões comparado as demais (Tabela 1).
Visualmente foi possível observar a diferença na resistência ao cancro cítrico entre as
variedades Pêra IAC e Washington navel (Figura 2).
99
B
A
Figura 2.
Diferentes respostas de resistência dos genótipos Pêra IAC (A) e Washington
navel (B), inoculados com Xanthomonas citri subsp. citri.
Em estudo desenvolvido por Amaral et al. (2010) ao qual avaliou 582 acessos de
citros quanto a resistência ao cancro cítrico em condições de casa de vegetação, realizaram a
inoculação por meio de pulverizações com X. citri nas folhas e avaliaram por meio do
Software Plant Disease Quantification (APS Assess), onde foram escaneadas as folhas
lesionadas, classificando-as posteriormente de acordo com a classificação sugerida para
Xanthomonas arborícola pv. pruni (HAMMERSCHLAG, 1990). Essa classificação baseada
na severidade da doença sugere como plantas resistentes (0-5%), moderadamente resistentes
(5-10%), suscetíveis (10- 15%) e altamente suscetíveis (>15%). Os acessos de Baia leng,
Castellana ivia 64-3, Khailily white, Pêra IAC e Pêra ovo foram agrupados como
moderadamente resistentes. Já as variedades Salustiana SPA 11 e Valência mutação foram
classificadas como suscetíveis e a variedade Washington navel ficou no grupo das altamente
suscetíveis. Apesar da metodologia de inoculação e avaliação dos sintomas diferir, o presente
trabalho concorda com os resultados obtidos por Amaral et al. (2010) quando apresenta as
variedades Pêra IAC, Khailily white e Pêra ovo com as menores médias de diâmetros de
100
lesões, sugerindo que as mesmas apresentam resistência ao patógeno (Tabela 1). Isso também
ocorreu em trabalhos de campo desenvolvidos por Gonçalves-Zuliani et al. (2011b), onde a
variedade Pêra IAC mostrou baixa incidência e severidade ao cancro cítrico. Além disso,
Amaral et al. (2010) enquadram as variedades Salustiana SPA 11 e Valência mutação no
grupo das suscetíveis, sendo que no presente trabalho essas variedades obtiveram médias
maiores, sugerindo que as mesmas tenham maior suscetibilidade ao patógeno, comparado as
variedades anteriores (Tabela 1). O presente trabalho também está em concordância com
Amaral et al. (2010) quando classifica a variedade Washington navel como altamente
suscetível, sendo que esta apresentou a maior média de diâmetro de lesões comparada as
demais variedades estudadas (Tabela 1).
Tabela 1. Médias dos diâmetros das lesões comparando as diferentes variedades de laranja
doce estudadas.
N º Genótipos
Genótipos
22
Pêra IAC
Médias dos diãmetros das
lesões (mm)
1,32 a
23
Khailily white
1,48 b
20
Pêra ovo
1,52 b
16
Baia Leng
1,56 c
11
Salustiana SPA 11
1,61 c
05
Castellana ivia
1,62 c
03
Valência mutação
1,64 c
17
Bey navel
1,64 c
24
Whashington navel
1,84 d
Médias nas colunas seguidas por letras diferentes diferem pelo teste Scott-Knott (P<0,05) com coeficiente de
variação de 8,81%.
Vargas et al. (2013) em estudos de resistência em condições de campo classificou as
variedades em cinco níveis de resistência, adaptado segundo Leite Jr. (1989). Os genótipos
Pêra IAC, Khailily white, Pêra ovo e Valência mutação foram classificados em
moderadamente resistentes, ou seja, apresentaram severidade entre 1,1 a 1,5%. Classificou
ainda a variedade Salustiana SPA 11 em moderadamente suscetível (severidade entre 1,5 a
2,0%). E a variedade Washington navel como suscetível (severidade entre 2,1 a 3,0%). Esses
dados de avaliação em condições de campo também estão em concordância com os resultados
obtidos no presente trabalho, exceto em relação à variedade Valência mutação, pois esta
apresentou médias de diâmetros de lesões significativamente maiores que a Pêra IAC,
101
Khailily white e Pêra ovo. A variedade Washington navel também está em concordância com
os resultados obtidos por Vargas et al. (2013), onde a classificou como suscetível.
A metodologia de inoculação com agulhas mostrou sintomas de cancro cítrico
semelhantes aos sintomas de plantas mantidas sob condições de casa de vegetação e campo.
De acordo com Vernière; Gottwald e Pruvost (2003) em inoculação de materiais vegetais com
ferimentos, a expressão dos sintomas de cancro cítrico em tecidos de diferentes idades é mais
rápida e uniforme, se comparado a inoculação em tecidos intactos. É importante considerar
que o inóculo de X. citri na concentração 108 UFC/mL possibilitou o desenvolvimento de
sintomas típicos de cancro cítrico. Nos experimentos desenvolvidos por Belasque Jr. e Jesus
Jr. (2006), as concentrações de inóculo 107 e 108 UFC/mL foram semelhantes entre si e
resultaram em infecções mais rápidas e severas.
Através da estimativa da severidade por diâmetro de lesões os genótipos mantidos
em condições in vitro tiveram resultados semelhantes aos desenvolvidos in vivo, além disso,
essa técnica já é muito utilizada na avaliação da resistência varietal de espécies cítricas e
estudos epidemiológicos (GRAHAM; GOTTWALD, 1990; NOCITI et al., 2006;
GOTTWALD; GRAHAM; SCHUBERT, 1997). Em estudos de diâmetros de lesões, menores
lesões foram observadas em plantas de tangerina ´Ponkan` (BELASQUE JR. et al., 2008).
Esses dados também estão de acordo com avaliações realizadas tanto em casa de vegetação
quanto experimento de campo, em estudos de resistência varietal ao cancro cítrico (LEITE
JR.; MOHAN, 1984).
Tendo em vista que os estômatos são importantes aberturas que servem como
principais portas de entrada da bactéria durante a infecção (GRAHAM et al., 1992;
MELOTTO et al., 2006) e as variedades Pêra IAC e Washington navel mostrado níveis de
resistência contrastantes, buscou-se verificar as diferenças morfológicas na folha entre essas
cultivares, por visualização em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Com auxílio das
imagens geradas pelo MEV não foi possível observar diferenças na densidade estomática das
duas variedades. Ao contrário, quando se analisou a área média da abertura estomática, foi
possível constatar diferenças significativas entre os dois genótipos, sendo que a Pêra IAC
mostrou menores médias de abertura, se comparada a Washington navel (Figura 3).
Wang et al. (2011) em um estudo similar, avaliando duas variedades com resistências
contrastantes ao cancro cítrico, Meiwa (Fortunella crassifolia) e Newhall (Citrus sinensis),
por observação em microscopia eletrônica, verificaram diferenças na densidade e tamanho de
estômatos. A variedade Meiwa, que apresenta maior resistência ao cancro cítrico, apresentou
102
menor densidade e tamanho de estômatos em comparação à Newhall (mais suscetível), sob as
mesmas condições experimentais. Essa presença de maior número e de maiores tamanhos de
estômatos pode favorecer a entrada bacteriana na folha, podendo explicar a melhor resistência
de Meiwa a X. citri em relação a Newhall (WANG et al., 2011). Nas condições do presente
estudo a menor abertura estomática demonstrada pela cultivar Pêra IAC pode ser um
indicativo de barreira física de defesa do genótipo ao patógeno e conseqüentemente, menor
desenvolvimento dos sintomas, como demonstrado na inoculação artificial.
103
Pêra IAC
Washington navel
A1
A2
B1
B2
C
D
** Colunas com letras diferentes diferem pelo teste Tukey (P<0,05) com coeficientes de variação de 9,55% para
densidade e 45,80% para abertura estomática.
Figura 3.
Comparação entre as características dos estômatos das varidades Pêra IAC e
Washington navel. (A1 e A2) Fotos representativas mostrando estômatos de Pêra
IAC e Washington navel por MEV, com aumento de 300 vezes, antes da
inoculação com X. citri. (B1 e B2) Fostos representativas mostrando
individualmente o estômato das variedades Pêra IAC e Washington navel por
MEV, com aumento de 2700 vezes, anterior a inoculação com X. citri. (C e D)
Densidade e área média da abertura estômatica em Pêra IAC e Washington navel.
104
As visualizações por MEV realizadas nos tecidos foliares dos dois genótipos após a
inoculação com X. citri, permitiu verificar que no 3° DAI, a colonização nas duas variedades
já diferiam entre si. A dispersão bacteriana ao redor do estômato se misturou com uma
espécie de exsudado, sendo que essa liberação ficou mais evidente na variedade Pêra IAC. Na
Washington navel, foi possível verificar nesse período uma maior colonização e entrada do
patógeno pela abertura estomática, em relação à Pêra IAC. Aos 7°DAI foi possível observar
ainda, uma menor colonização de X. citri ao redor da abertura estomática na variedade Pêra
IAC, sendo que ainda ocorre presença do exsudado. Neste período na Washington navel
verifica-se uma maior concentração de agrupamentos bacterianos, formando uma espécie de
microcolônia. Os exsudados observados ao redor da abertura estomática aos 3° e 7° dias após
a infecção podem estar relacionados a alguma reação da planta a deposição do patógeno.
Chen et al. (2012) em seus trabalhos, avaliaram as respostas patológicas e fisiológicas sobre
os mecanismos pelos quais kumquat (Fortunella margarita) e calamondin (Citrus mitis)
possuem maior resistência a X. citri, observaram por meio de visualização microscópica com
clorofila fluorescente, maior número de materiais brilhantes em torno de lesões necróticas de
folhas de kumquat e calamondin, inoculados com X. citri. Ao contrário, em folhas de limão
galego (Citrus aurantifolia) (genótipo suscetível), a fluorescência cobrindo a infecção foi
mais fraca. Os autores sugerem que a forte fluorescência observada nos genótipos resistentes
poderia ser devido à acumulação de compostos fenólicos, lenificação da parede celular ou
apoptose induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2), sendo que essas modificações
constituem barreiras físicas e químicas que limitam a invasão bacteriana, reduzindo assim, o
desenvolvimento de lesões. O H2O2 pode estar envolvido na defesa contra agentes
patogênicos, quer por influenciar na resposta a hipersensibilidade, o qual auxilia no processo
de morte da célula (HEATH, 2000; CHEN et al., 2012) ou em regular o movimento
estomático (ZHANG et al., 2001; AN et al., 2008; MELOTTO; UNDERWOOD; HE, 2008).
Chen et al. (2012) testaram ainda, a hipótese de que kumquat e calamondin poderiam
conter produtos químicos tóxicos que não estariam presentes em limão galego, através do uso
de discos de folhas cítricas destacadas e visualizadas em lâmina em microscópio. Observaram
um grande número de bactérias ao longo das bordas da folha de limão galego, ao contrário,
apenas algumas bactérias foram esporadicamente distribuídas nas bordas de folhas de
kumquat e calamondin, sugerindo a presença de elementos tóxicos nestes dois genótipos que
inibem a colonização e crescimento de X. citri. Esses resultados podem estar de acordo com o
presente estudo, quando se observaram um menor número de bactérias ao redor dos estômatos
105
em Pêra IAC, se comparado a Washington navel (Figura 4). Além disso, a inoculação por
ferimento com agulha, pode ter favorecido liberação de produtos químicos tóxicos que
influenciariam na colonização e desenvolvimento da bactéria no genótipo Pêra IAC.
Possivelmente a ausência de substâncias tóxicas liberadas pelo genótipo Washington navel
pode ter favorecido a formação do biofilme, originando as microcolônias de X. citri,
observadas com frequência aos 7° DAI. Os biofilmes são conhecidos por proteger as bactérias
de estresses ambientais, de mecanismos de defesa do hospedeiro e compostos antimicrobianos
(BRANDA et al., 2005). Para melhor entendimento, estudos fisiológicos mais aprofundados
são necessários para esclarecimento da natureza e origem do exsudado.
Aos 14°DAI os sintomas de cancro cítrico são mais evidentes, sendo que a lesão no
genótipo Washington navel é mais proeminente do que na Pêra IAC (Figura 4). De acordo
com Chen et al. (2012), os resultados mostrados nos ensaios de fluorescência, revelam que
não ocorre rápida morte das células nas folhas de limão galego, sendo que X. citri prospera
dentro da área da infecção e as camadas epidérmicas vizinhas, depois de dividirem, se tornam
elevadas e corticosas. Neste mesmo período, por cortes transversais da lesão foi possível
verificar a maior formação do biofilme, conseqüentemente o desenvolvimento de
microcolônias e ocupação dos espaços intercelulares do parênquima no genótipo Washington
navel (Figura 4). De acordo com Rigano et al. (2007), os estágios de formação do biofilme,
são caracterizados pela ligação bacteriana, formação dos agregados ou microcolônias e
formação de biofilmes estruturados colonizando a folha. Brown (2001) diz que para a
permanência e sobrevivência nos espaços intercelulares do parênquima vegetal e desencadear
o processo infeccioso com sucesso, X. citri ativa genes específicos que expressam inúmeras
proteínas relacionadas a patogenicidade, além de iniciar a produção de polissacarídeos
extracelulares, como a goma xantana. Oliveira et al. (2011) avaliando a atividade antibiótica
dos compostos extracelulares produzidos por bactérias do gênero Pseudomonas contra X.
citri, verificaram uma redução na formação do biofilme em células tratadas com os compostos
antibióticos, e conseqüente redução na formação da lesão de cancro. Isso mostra que a
formação do biofilme está relacionada com o maior desenvolvimento e severidade da lesão de
cancro.
106
Pêra IAC
Washington navel
A1
A2
B1
B2
C1
C2
D1
D2
107
Figura 4.
Comparação da colonização e infecção de X. citri, após a inoculação, entre as
variedades Pêra IAC e Washington navel, por Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV). (A1 e A2) Fotos representativas da superfície foliar de Pêra
IAC e Washington navel, colonizadas por X. citri aos 3°DAI, com aumento de
2700 vezes. (B1 e B2) Fotos representativas da superfície foliar de Pêra IAC e
vezes. (C1 e C2) Fotos representativas da lesão de cancro cítrico em Pêra IAC e
Washington navel, provocadas por X. citri aos 14°DAI, com aumento de 40 vezes.
(D1 e D2) Fotos representativas do corte transversal da lesão foliar em Pêra IAC e
Washington navel, provocadas por X. citri aos 14°DAI, com aumento de 1800
vezes.
Na figura 5 é possível observar o ferimento provocado pela perfuração da folha com
agulha, durante a inoculação e a distribuição bacteriana ao longo da mesma. O que é
importante destacar é a capacidade de X. citri, enfrentar os obstáculos durante sua
colonização. A figura possibilita vizualizar um agregado ou microcolônias empilhadas de X.
citri, que se unem e conseguem ultrapassar barreiras físicas e colonizar locais distantes de seu
foco inicial. De acordo com Costerton et al. (1995), em estudos iniciais de biofilmes, através
da microscopia eletrônica, observaram celulas empilhadas umas sobre as outras, sendo que
estudos mais avançados comprovaram que esses biofilmes não estavam totalmente secos e
sim hidratados por uma matrix extracelular. Isso mostra que essa capacidade de transpor
obstáculos é oriunda da capacidade de X. citri formar biofilmes e agregar as células
bacterianas.
Assim como a médias distâncias a bactéria consegue ser transportada por respingos
de chuva, microscopicamente, sem enfrentar qualquer barreira química, o que impediria sua
colonização, X. citri pode transpor barreiras físicas e colonizar a curtas distâncias. A falta de
nutrientes no meio, seria um fator importante para desencadear a translocação da bactéria para
novos habitats mais ricos em fonte nutritiva. Além disso, a formação do biofilme e a união
das células bacterianas em microcolônias, seria uma arma vantajosa para o patógeno contra as
defesas do hospedeiro, tratamentos antibióticos e condições de estresse ambiental (O’TOLLE;
KAPLAN; KOLTER, 2000).
108
A1
Figura 5.
A2
Fotos representativas do ferimento, provocado pela inoculação com perfuração
com agulha, na face adaxial de folhas do genótipo Pêra IAC, aos 3°DAI, com
aumento de 1000 (A1) e 2700 (A2) vezes.
O estudo conclui que a avaliação pelo método de folhas destacadas mostrou ser uma
importante ferramenta em estudos de resistência de genótipos cítricos á X. citri. Apesar desta
técnica não excluir a necessidade de estudos de resistência em campo, avaliações prévias, com
menor tempo de duração, menor custo na implantação e maior número de plantas avaliadas
em menor espaço pode ser uma alternativa importante nos trabalhos de melhoramento de
citros. De acordo com Francis; Peña e Graham (2010), os ensaios com folhas destacadas são
úteis para a caracterização e diferenciação, através da quantificação e número de lesões, da
resistência de germoplasmas cítricos ao patógeno X. citri.
A evolução dos fenótipos apresentados pela inoculação artificial dos dois genótipos
com resistência contrastantes Pêra IAC e Washington navel, pôde ser melhor esclarecido
quando se visualizou as lesões por Microscopia eletrônica de varredura (MEV). O menor
diâmetro de lesão, mostrado pelo genótipo Pêra IAC, quando inoculado por ferimentos, pode
estar relacionado ao menor tamanho de abertura estomática, sendo esta uma barreira física de
defesa do hospedeiro ao ataque de X. citri. Além disso, a liberação de exudados, observadas
nas lesões em Pêra IAC, reforça a hipótese de ser uma barreira química do hospedeiro ao
patógeno, diminuindo a colonização bacteriana, dificultado a formação do biofilme e
conseqüentemente provocado a menor agressividade nos sintomas.
Aliar estudos de resistência genética com visualizações em Microscopia eletrônica
pode ser uma ferramenta importante na compreensão dos mecanismos de defesa de plantas
cítricas ao ataque da bactéria X. citri. Mais estudos são necessários para determinar as
moléculas envolvidas dentro dessa atividade antibiótica e no futuro ser aplicado em
programas de melhoramento vegetal de citros.
109
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114
CAPÍTULO V
115
RESUMO
A bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, é um
importante patógeno na citricultura mundial, visto sua ampla gama de hospedeiro e
variabilidade. A fim de estudar a diversidade genética de Xanthomonas citri em pomares do
Estado do Paraná, foram coletados, a partir de lesões em citros infectados por X. citri, 48
isolados, em pomares comerciais de Congonhinhas, Cornélio Procópio, Paranavaí e pomar
experimental da Fazenda Experimental de Iguatemi (FEI). As culturas foram cultivadas em
meio NA e posteriormente extraído o DNA genomico de cada amostra. Em seguida realizouse a amplificação do DNA por PCR, utilizando 14 marcadores microssatélites e o resultado
foi observado em gel de agarose a 2%. Com os dados obtidos foi gerada uma matriz de
semelhança e um dendograma foi construído pelo método UNJ (Unweighted neighbor
joining). A árvore foi gerada por análise Bootstrap. Os primers microssatélites amplificaram
regiões do genoma de todos os isolados, mostrando a formação de três grupos distintos. No
entanto a diferenciação entre os isolados foi baixa, mostrando que a origem e o hospedeiro
não foi um fator condicionante na diversidade genética dos mesmos. Essa baixa diversidade
sugere que as populações de X. citri subsp. citri encontradas no Paraná podem ser clonais,
possuindo forte ligação epidemiológica.
Palavras-chave: Cancro cítrico. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR). Variabilidade.
116
ABSTRACT
The bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, is an important
pathogen to citrus production due to its wide host range and variability. To study the genetic
diversity of Xanthomonas citri in orchards of Paraná State, 48 isolates were collected from
lesions on infected citrus with X. citri in several commercial orchards of Congonhinhas,
Cornelio Procopio, and Paranavaí counties and the experimental orchard of the Iguatemi
Experimental Farm (FEI). The cultures were grown in NA medium, and genomic DNA was
subsequently extracted from each sample. This DNA was then amplified by PCR using 14
microsatellite markers and the results were observed in 2% agarose gel. The data were used to
generate a matrix of similarity, and a dendrogram was constructed by the UNJ (Unweighted
neighbor joining) method. The tree was generated by bootstrap analysis. The microsatellite
primers amplified genomic regions in all the isolates, which formed three distinct groups.
However, there was a little differentiation between the isolates, indicating that the origin and
the host did not influence the genetic diversity of the species. This low diversity suggests that
populations of X. citri subsp. citri found in Paraná may be clonal and possess strong
epidemiological links.
Keywords: Citrus canker. Polymerase Chain Reaction (PCR). Variability.
117
INTRODUÇÃO
A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (SCHAAD et al., 2006) é um patógeno,
que tem causado grande preocupação de pesquisadores, técnicos e produtores, visto sua ampla
gama de hospedeiros entre o gênero Citrus e espécies relacionadas, além da sua agressividade
e distribuição mundial generalizada (GOTWALD et al., 2002).
Diversos fatores podem contribuir para o surgimento de novas doenças, dentre esses,
destacam-se a introdução de um agente patogênico em uma área indene, mudanças ambientais
que favoreçam a disseminação do patógeno e a ampliação da gama de hospedeiros através da
sua co-evolução, superando as defesas do hospedeiro aumentando sua aptidão (ANDERSON
et al., 2004). A bacteria X. citri é um modelo interessante de co-evolução e especialização
patógeno x hospedeiro, devido as suas variantes patogênicas. Todas as estirpes de X. citri
causam cancro em citros, no entanto, a gama de hospedeiro variam entre os grupos de estirpes
(BRUNINGS; GABRIEL, 2003; GABRIEL, 2001). Estirpes de X. citri foram classificadas
em três variantes patogênicas (patótipos), relacionadas com as diferenças na gama de
hospedeiro e não na sintomatologia (VERNIÈRE et al., 1998). O patótipo denominado como
‘A’ está presente em todo o mundo e tem uma maior gama de hospedeiro (quase todas as
espécies cítricas e gêneros afins), apresentando diferenças na suscetibilidade entre espécies e
cultivares cítricos. Em contraste as estirpes do patótipo ‘A*’ e ‘Aw’ possuem uma gama de
hospedeiro estreita, principalmente restrita a limões ‘galego’ (Citrus aurantifolia) e ‘alemow’
(C. macrophylla) (VERNIÈRE et al., 1998; CUBERO; GRAHAM, 2002; SUN et al., 2004).
As estirpes do patótipo ‘Aw’ foram distinguidas de ‘A*’ com base nas respostas de
hipersensibilidade dos sintomas em Grapefruit (C. paradisi), laranja doce (C. sinensis),
laranja azeda (C. aurantium), limão (C. medica), tangelo (C. reticulata x C. paradisi) e
trifoliata (Poncirus trifoliata) (SUN et al., 2004).
O estudo da diversidade de X. citri foi analisado ao longo dos anos principalmente
por Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) ou pela Reação da
polimerase em cadeia (PCR) (GRAHAM et al., 2004). Bui Thi Ngoc et al. ( 2009) em seus
estudos desenvolveram uma técnica de análise multilocos para Xanthomonas citri, utilizando
14 marcadores microssatélites desenhados com base no genoma deste patógeno.
O conhecimento da diversidade genética de um agente patogênico pode ajudar no
estabelecimento de hipóteses sobre sua evolução, compreensão da relação entre patógeno x
118
hospedeiro, além de auxiliar na definição de métodos e estratégias de controle (Adhikari;
MEW; LEACH, 1999; OCHIAI et al., 2000; RESTREPO; VÉLEZ; VERDIER, 2000).
Diante disso o objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade genética de X.
citri susbp. citri em pomares comerciais e experimental no Estado do Paraná, Brasil.
119
MATERIAIS E MÉTODOS
1.
Isolados de Xanthomonas citri subsp. citri
Um total de 46 isolados (n) de X. citri de três pomares comerciais e um experimental,
localizados no Estado do Paraná foram utilizados no estudo [Congonhinhas (n=4), Cornélio
Procópio (n=3), Paranavaí (n=10) e FEI-Iguatemi (n=29)]. Além disso, duas amostras de
isolados de Xcc 306 foram incluídas no estudo (Tabela 1). O isolado Xcc 306 foi obtido junto
ao acervo de culturas puras do Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus).
Culturas desses isolados coletados foram desenvolvidas em meio NA (Composição:
3g extrato de carne; 5g de peptona; 5g de cloreto do sódio; 15g de ágar/Litro de água destilada
q.s.q) por aproximadamente 48 horas a 28°C em estufa bacteriológica. Após crescimento e
repicagem, as culturas puras (isolados) foram mantidas em tampão fosfato salino [PBS]
(Composição: solução salina 3M: cloreto de sódio 175,32g/L água destilada q.s.q) em
geladeira (aproximadamente 8°C).
O DNA total de X. citri foi extraído a partir de culturas cultivadas em meio NA.
Após lavagem da solução em NaCl (5M), foi realizada uma centrifugação a 8000 rpm por 10
min e o DNA foi suspenso em 800 µL de tampão de extração (100 mM Tris-HCl pH 8,0;
NaCl 0,5M; EDTA 50 mM; SDS a 10%) e as amostras incubadas a 65°C por 30 min. Em
seguida, 400 µL de acetato de potássio 5M foi adicionado as amostras e a mistura incubada
em gelo por 20 min. Após, realizou-se uma centrifugação a 12000 rpm por 15 min, sendo
adicionado em seguida fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:1:24) e recolhido o
sobrenadante. Foram adicionadas as amostras 150 µL de RNase e mantidas a 37°C para
posteriormente proceder uma precipitação com a adição de isopropanol. Após a centrifugação
a 12000 rpm por 10 min, o precipitado obtido foi suspenso em tampão Tris-EDTA (TE)
(Adaptado por NUNES et al., 2008). A quantificação do DNA e a sua qualidade foi avaliada
em gel de agarose corado com brometo de etídeo a 1%.
120
Tabela 1. Isolados de X. citri subsp. citri de pomares citrícolas comerciais e experimental de
quatro regiões do Estado do Paraná, Brasil.
Cód. do Isolado
Isolados
Local
Citros (hospedeiro)
11
17
30
41
14
39
47
8
15
16
24
25
27
29
33
40
48
1
2
3
4
5
6
7
9
10
12
13
18
19
20
21
22
26
28
31
32
34
35
36
37
38
43
44
45
Xcc 213
Xcc 213-2
Xcc 215
Xcc 215-2
Xcc 330
Xcc R11-2
Xcc 330-2
Xcc 212
Xcc 220
Xcc ZWP
Xcc 220-2
Xcc 213
Xcc 208
Xcc ZWP-2
Xcc 219
Xcc 212-2
Xcc 208-2
Xcc 338
Xcc 87M
Xcc 78
Xcc 21M
Xcc 114
Xcc 85
Xcc 362
Xcc 347
Xcc 214
Xcc 103
Xcc 84
Xcc 74
Xcc 85-2
Xcc 103-2
Xcc 148
Xcc 87M-2
Xcc 214-2
Xcc 362-2
Xcc 74-2
Xcc 78-2
Xcc 327
Xcc 216-2
Xcc 21M-2
Xcc 370-2
Xcc 327-2
Xcc 318
Xcc 148-2
Xcc 345-2
Congonhinhas
Congonhinhas
Congonhinhas
Congonhinhas
Cornélio Procópio
Cornélio Procópio
Cornélio Procópio
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
Paranavaí
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
FEI-Iguatemi
46
23
42
Xcc 304
Xcc 306
Xcc 306
FEI-Iguatemi
-
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Pêra
C. sinensis Valência Olinda
C. sinensis Pêra mutante
C. sinensis Orange clamor
C. sinensis Wetumpka
C. sinensis Valência frost
C. sinensis
C. sinensis Olivelands
C. sinensis Natal Af. Sul
C. sinensis Moro 27
C. sinensis Valência
C. sinensis Orange Navelina
C. sinensis Valência frost
C. sinensis Moro 27
C. sinensis Espanole
C. sinensis Natal Af. Sul
C. sinensis
C. sinensis Orange Navelina
C. sinensis Orange clamor
C. sinensis Ovale Mut.
C. sinensis Westin
C. reticulata Empress
C. sinensis Ovale Mut.
C. sinensis Natal
C. sinensis Espanole
C. limettioides Monica
C. reticulata x C. sinensis Tangor
Murcote
-
121
2.
Amplificação do DNA por PCR com marcadores microssatélites
Para a amplificação do DNA obtido, seguiu-se os procedimentos descritos por Bui
Thi Ngoc et al. (2009). Foram utilizados 14 pares de primers microssatélites (curtas
sequencias nucleotídicas, organizadas em clusters de número variável de repetições em
tandem VNTR), desenhados a partir da sequência completa do genoma de X. citri subsp. citri
estirpe 306 (DA SILVA et al., 2002) (Tabela 2). A reação de PCR com os primers
microssatélites foi conduzida com volume total de 25 μL utilizando 2,5 μL do tampão 10X
(200 mM Tris-HCl, pH 8,4; 500 mM KCl); e água milli-Q, MgCl2 (2,5 mM), DNTP (10
mM), 15 ng de cada primer , 40 ng da amostra de DNA; 1 U de Taq-DNA-polimerase
(Invitrogen®).
As amplificações foram realizadas utilizando as seguintes condições: 15 min a 95 °C
para desnaturação inicial do DNA, seguido por 25 ciclos a 94°C durante 30s, as temperaturas
de anelamento variaram de 64 a 70°C conforme cada primer (Tabela 2) durante 90s e 72°C
durante 90 s para a extensão, tendo ainda para extensão final, 30 min a 72°C (BUI THI
NGOC et al., 2009).
Após, o produto da PCR foi observado através de eletroforese em gel de agarose a
2%, sendo utilizado brometo de etídio para visualização das bandas no gel. Os géis foram
fotografados sob luz ultravioleta em equipamento de fotodocumentação (UVP GDS-8000
System).
122
Tabela 2. Descrição dos primers microssatélites testados nos isolados de X. citri subsp. citri
de pomares comerciais e experimental do Paraná, Brasil.
Nome
Primers
Temp. Anel. (°C)
XL1*
5- TTGCCACGGGCCAGGGTCGC-3
5′-GCCCAGATGCTCGATCAAGG-3′
64
XL10
5′- GCGAGGCGATTGCCTGGCTCA-3′
5′-GCGGATGCATTTGCCGGGTGAGT-3′
70
XL11
5′- GGTCCGCTGGCGCGAGCAGAT-3′
5′-TGCGCCCGTGTGCGCTGACGAT-3′
70
XL2
5′ -TGGGAAGCGGTCAGTAGGCA-3′
5′-CCACATAAGCACGGCAACAA-3′
68
XL3
5′ -TTCAAGGAATTGCCCGAGAG-3′
5′-CAGACAGCGGCGGATTGATG-3′
64
XL4
5′ -TTGCCCATCGTTGCTGAAGCAGC-3′
5′-ATGCCGCTGTTGTGTGAGCGC-3′
64
XL13
5′--GCGCTCCCTCGCTGCGAGGTA-3′
5′-CAGCAGATACAGGGCGAACGCGAT-3′
64
XL5
5′ -TCCGCTCGATCATCGTCAAGG-3′
5′-ACGCTGATGCGCCCAGCGCTTGC-3′
64
XL14
5′-CCAAAGGCTATGCGGATCTG-3′
5′-CGTTCGACCCGGAATAAG-3′
64
XL15
5′-TCAGTTCCAGGTTCACTTGC-3′
5′-GCTGCTGACCGTGGTGTTG-3′
64
XL6
5′-TGACAAGCAGGAGCAGGCGCATGG-3′
5′-ATCGCACAGCAGCAACGAAGG-3′
70
XL7
5′ PET-TGCGCAAGCTGGTCAAGTGG-3′
5′-TCCTGCGATGGCGAGTGG-3′
68
XL8
5′ FAM-GGCGGTGGCGGCGTAGTCAC-3′
5′-TCGGCTGCTGGCGTTGATTG-3′
68
XL9
5′ VIC-TCAGTCAGCCATCTCTACAAGC-3′
5′-CGACAAGGTCGACGAATACC-3′
64
* Marcadores Microssatélites, desenhados a partir da sequência completa do genoma de X. citri subsp.
citri estirpe 306 (BUI THI NGOC et al., 2009).
3.
Análise dos dados
Os padrões de bandas evidenciados pela PCR utilizando marcadores microssatélites
foram registrados como ausência (0) ou presença (1) de bandas para a construção da matriz
binária. Apenas bandas reprodutíveis foram consideradas positivas. A matriz de semelhança
foi calculada usando o coeficiente Dice e um dendograma foi construído pelo método UNJ
(Unweighted neighbor joining) usando o software DarWIN 5.0 (CIRAD, Montpellier, France)
(JACIANI et al., 2012). A árvore foi gerada por análise de Bootstrap (1000 repetições).
123
Os 14 pares de primers microssatélites utilizados no presente trabalho, amplificaram
regiões do genoma específico para X. citri em todos os isolados testados. Concordando com
os resultados obtidos por Bui Thi Ngoc et al. (2009), onde testaram os mesmos marcadores
microssatelites em uma coleção de 239 estirpes de X. citri e 83 estirpes de patovares
geneticamente relacionados, originados de 25 países da Ásia. Neste estudo foram
identificados 223 diferentes isolados, definidos pelas combinações dos 14 primers, sugerindo
que essa metodologia, denominada pelos autores como MLVA (sistema de análise VNTR em
multilocus), poderia ser uma poderosa técnica no estudo da epidemiologia de X. citri subsp.
citri em pequenas escalas espaciais (investigação de surtos). Os autores avaliaram ainda o
desempenho dos primers em sete patovares de X. citri e obteram amplificações bem sucedidas
para a maioria dos marcadores e patovares, sugerindo que a metodologia poderia ser útil para
estudos populacionais de qualquer patovar de X. citri. Pruvost et al. (2011) avaliaram a
metodologia MLVA com os 14 primers microssatelites em 299 isolados de X. citri pv.
mangiferaeindicae, originados de 14 países e observaram que a maioria dos marcadores
VNTR desenvolvidos para X. citri subsp. citri são úteis na genotipagem de X. citri pv.
mangiferaeindicae, tendo a capacidade de discriminar esse patovar a nível de estirpe. Os
autores também sugerem que devido ao elevado poder de discriminação dessa metodologia,
torna-se possível realizar análises de epidemiologia molecular da espécie X. citri em pequena
escala espacial e temporal, ou seja, no rastreio de isolados em estudos de campo e na
investigação de fontes de inóculo associados a surtos.
Devido a esse elevado poder de discriminação apresentado por essa metodologia com
uso de marcadores microssatélites, buscou-se diferenças entre isolados de diferentes regiões
do estado do Paraná. Os resultados mostraram que os primers foram bastante eficientes,
apontando diferenças entre os isolados e a formação de três grupos (Figura 1). No entanto
essas diferenças são muito baixas, evidenciando que estes são muito próximos geneticamente,
visto que o local de origem não influenciou na variabilidade genética dos isolados. Pruvost et
al. (2011) observaram que estirpes que compartilhavam o mesmo perfil genético ou
pertenciam ao mesmo complexo clonal eram mais frequentemente originadas a partir do
mesmo local no mesmo ano de avaliação ou dentro de um intervalo de dois anos, sugerindo
forte ligação epidemiológica entre os isolados.
124
Apesar da interação patógeno-hospedeiro ser um fator de seleção e poder influenciar
nas diferentes capacidades de patogenicidade da bactéria, o hospedeiro, neste caso, não foi um
fator de diferenciação, sendo possível verificar isolados oriundos de cultivares de laranja doce
(C. sinensis), tangerinas (C. reticulata) e híbrido tangor (C. reticulata x C. sinensis) no
mesmo grupo (Figura 1). Bui Thi Nogoc et al. (2010) mostraram que apesar de ocorrer
diferenciação entre patógeno e hospedeiro para os patotipos A* e Aw, independente da
técnica utilizada, todas as estirpes pertencentes a eles foram idênticas, sugerindo que A* é um
sinônimo de Aw e compartilham de um mesmo ancestral comum. Além disso, todas as
estirpes de X. citri com estreita gama de hospedeiro (patótipo A* e Aw) foram mais
estreitamente relacionado com estirpes com ampla gama de hospedeiro (patotipo A). Chiesa et
al. 2012 avaliando 42 isolados de X. citri, coletados de espécies cítricas diferentes em
pomares de Tucuman, Argentina, observaram que a maioria dos isolados apresentaram
patogenicidade similar à estirpe referencia X. citri ‘T’, provocando sintomas típicos de cancro
cítrico quando inoculadas em C. paradisi e C. limon. Neste mesmo trabalho, uma nova
variante de X. citri, denominada ‘AT’ foi identificada, de acordo com os hospedeiros
analisados. No entanto, as analises moleculares mostraram uma similaridade genômica
superior a 90% da ‘AT’ com outras 21 estirpes, incluindo a de referência ‘T’. Lin et al. (2012)
avaliando 21 isolados de X. citri em Taiwan, quanto a patogenicidade em folhas de limão
galego (C. aurantifolia) Grapefruit (C. paradisi) e liucheng (C. sinensis), observaram que
estirpes que induziram sintomas atípicos nos citros, foram identificadas como Xac-A por
caracterização genética. Os autores sugerem que a indução de sintomas diferentes estão
intimamente relacionados com a expressão de genes patogênicos, tais como Ptha (LIN et al.,
2011) ou um fator de virulência (LIN et al., 2010).
Em condições brasileiras, Jaciani et al. (2012) analisando 157 estirpes de X. citri
coletadas em 62 municípios de sete estados brasileiros (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Paraná, Roraima, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo) verificaram uma elevada
diversidade genética em amostras de todos os Estados analisados, independente das
estratégias de controle utilizada em cada um deles. O Estado de São Paulo que adotou a
erradicação de plantas doentes por muitos anos e o Estado do Paraná que conviveu com a
doença, sem erradicar as plantas, apresentaram resultados semelhantes quanto à diversidade
genética de X. citri. Provavelmente as populações da bactéria de São Paulo e Paraná tenham
se originado a partir das mesmas linhagens genotípicas. Populações de X. citri identificadas
nos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina apresentaram diferenças em relação aos
125
outros Estados, provavelmente podem ter sido influenciadas por diferentes introduções do
patógeno. A proximidade desses Estados com países como Argentina, Paraguai e Uruguai
pode ter facilitado o intercâmbio de material genético infectado.
Figura 1.
Árvore obtida por Unweighted neighbor joining (coeficiente Dice), mostrando a
diversidade genética de 48 isolados de X. citri subsp. citri, identificados por
marcadores microssatélites, de diferentes regiões do Estado do Paraná, Brasil.
Essa baixa diversidade genética obervada pode ser um indicativo de que as
populações de X. citri subsp. citri encontradas no Estado do Paraná são clonais e possuem
forte ligação epidemiológica. Essa similaridade elevada detectada entre os isolados, no
presente trabalho, está de acordo com dados anteriores obtidos de coleções de X. citri isoladas
de diferentes áreas geográficas (CUBERO; GRAHAM, 2002; CARVALHO; CARAMORI;
LEITE JR., 2005; BUI THI NOGOC et al., 2009). O baixo grau de diversidade genética
global encontrado na população de X. citri pode ser atribuído principalmente as cultivares de
citros comerciais (por exemplo C. sinensis, C. paradisi e C. limon), ou seja, grandes áreas
126
cultivadas com mesma espécie cítrica (GRAHAM et al., 2004). Isso poderia se enquadar as
condições paranaenses, onde o patógeno não enfrenta uma pressão de seleção significativa,
devido à homogeinidade genética do hospedeiro nos pomares comerciais.
A caracterização genética de populações bacterianas pode fornecer dados valiosos
para monitoramento da epidemia, além de avaliar a genética e parâmetros evolutivos do
patógeno, que serão úteis na decisão de um controle eficiente da doença. O que percebemos é
que quando as populações bacterianas são clonais, mostrando diversidade genética baixa,
torna-se um desafio para o estudo epidemiológico. Existe uma necessidade de maior
conhecimento da biologia e epidemiologia de X. citri subsp. citri, pois várias questões
importantes ainda são parcialmente conhecidas. Devido a isso e a eficiente aplicação da
técnica molecular, usando marcadores microssatélites, sugere-se um estudo a nível nacional,
com maior número de isolados em diferentes regiões produtoras de citros do Brasil.
127
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