Clique aqui para acessar o programa completo em PDF

Transcrição

Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia
Edital Nº 15/2008
MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em
Células-Tronco e Terapia Celular
INCTC
Coordenador: Roberto Passetto Falcão
Vice-Coordenador: Dimas Tadeu Covas
Instituição Sede: Fundação Hemocentro e Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto
Laboratórios ou Grupos de Pesquisas Associados
•Laboratório de Hematologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP.
•Laboratório de Morfofisiologia Molecular e do Desenvolvimento da Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos de Pirassunga, USP
•Centro de Transplantes de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da USP
•Departamento de Cirurgia, setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária da USP
•Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
•Laboratórios de Terapia Celular do Hemocentro de Hemocentro de Ribeirão Preto –
HCFMRP-USP
•Laboratório de Biologia Celular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Transferência Gênica do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Criobiologia I e II do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Biotecnologia do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de HLA do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Anemias Hereditárias do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Genética Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Centro Químico de Proteínas do Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP
•Centro de Primatologia do Instituto Evandro Chagas de Belém, Pará.
•Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências – USP
•Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
•Departamento de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos – USP
•Departamento de Clínica Médica, Divisão de Imunologia Clínica - FMRP-USP
Pesquisadores Principais
• Dimas Tadeu Covas – Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
• Eduardo Magalhães Rego – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• Flavio Vieira Meirelles - Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos
• Júlio Cesar Voltarelli - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• João Palermo Neto – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP
• Klena Sarges Marruaz da Silva –Centro de Primatas do Institudo Evandro Chagas –Belém -PA
• Lewis Joel Greene - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• Lygia da Veiga Pereira - Instituto de Biociências/USP
• Maria Angélica Miglino - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP
• Roberto Passetto Falcão - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
• Stevens Kastrup Rehen - Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
• Wilson Araújo da Silva Jr - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
SUMÁRIO
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia
Celular INCTC.............................................................................. 4
A) Descrição do Programa do Instituto ................................................ 4
O tema: Terapia Celular.............................................................. 5
Justificativa ............................................................................ 13
B) Objetivos e Metas ..................................................................... 18
C) Detalhamento do Programa de Pesquisa ..........................................
Estudos com Células-tronco Pluripotenciais ......................................
Células Pluripotenciais Induzidas ...................................................
Células tronco Somáticas.............................................................
Ensaios Clínicos ........................................................................
19
44
52
58
87
INDICADORES .............................................................................. 98
D) Detalhamento do Programa de Formação de Pessoal Qualificado ............ 99
E) Detalhamento das Ações de Transferência de Conhecimento para a
Sociedade ............................................................................... 106
F) Detalhamento das Ações para transferência de conhecimento para o Setor
Empresarial ou para a formação de Políticas Públicas .......................... 113
G) Descrição Detalhada do Grupo Proponente ....................................... 121
H) Especificação das Atividades a Serem Desempenhadas pelos Membros da
Equipe ................................................................................... 132
I) Mecanismos que Serão Utilizados para Promover a Interação entre os
Grupos de Pesquisa.................................................................... 133
J) Formas de Interação com Grupos no Exterior .................................... 135
K) Definição das Tarefas Específicas de Cada Entidade Participante ............ 136
L) Análise Comparativa entre a Situação Atual e a Pretendida ................... 137
M) Orçamento Justificado ............................................................... 138
N) Potencial de Geração de Patentes ................................................. 153
O) Relação dos Projetos Financiados nos últimos 5 anos ........................... 155
P) Anuência Formal das Instituições Envolvidas ..................................... 159
Q) Contrapartida Institucional .......................................................... 186
Infra-estrutura ........................................................................ 188
R) Cronograma ............................................................................ 200
S) Indicação do Comitê Gestor ......................................................... 202
T) Estrutura Organizacional e Funcional do Instituto ............................... 203
Bibliografia ................................................................................ 204
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular
A) Descrição do Programa do Instituto
A presente proposta de criação de um Instituto Nacional de Ciência e
Tecnologia em Terapia Celular (INCTC) constitui a continuidade e a ampliação das
atividades do Centro de Terapia Celular (CTC-CEPID-FAPESP), um dos Centros de
Excelência em Pesquisa, Inovação e Difusão criados pela FAPESP em 2001 com o
objetivo de ser um novo paradigma para a organização da pesquisa no Estado de
São Paulo. O CTC-CEPID, da mesma forma que deverá atuar o futuro INCTC,
desenvolve atividades nos três setores que constituem o escopo do projeto:
pesquisa científica na fronteira do conhecimento, difusão do conhecimento para a
sociedade e inovação tecnológica em estreita colaboração com o setor produtivo.
A melhor maneira de indicarmos o que seremos capazes de fazer é
demonstrando o que fizemos e o que estamos fazendo no momento. O CTC-FAPESP
conta com oito pesquisadores principais (PI) que até 2000 apresentavam boa
produção acadêmica porém com pouca interação entre si. O impacto da criação do
CTC pode ser avaliado na figura 1. A produção acadêmica relacionada ao tema
Terapia Celular dos oito PIS aumentou consideravelmente ano a ano atingindo, em
2007, cerca de 70 artigos. As citações dos artigos destes PIs também cresceu
significativamente a partir de 2000 e ultrapassou 600 citações em 2007. O índice h
do grupo é, no momento, 42 o que demonstra a qualidade da produção científica.
As colaborações entre os PIS, medida pelas publicações conjuntas de artigos,
também aumentou demonstrando que o CTC, à medida que estabeleceu uma
temática única, promoveu a convergência e a integração das linhas de pesquisa dos
seus PIs.
Além disso, também estimulou os pesquisadores a participarem
ativamente dos processos de difusão do conhecimento científico. Prova disso foi a
edição, em 2006, do livro “Células-Tronco – A Nova Fronteira da Medicina” que se
tornou referência para a área no país e foi ganhador do Prêmio Jabuti em 2007.
A criação do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Terapia Celular
(INCTC) permitirá a consolidação e a ampliação da experiência do CTC,
possibilitando a mobilização e a agregação dos melhores grupos de pesquisa com
células-tronco e terapia celular do país que passarão a atuar em rede, amplificando
4
as competências específicas e permitindo que ocorra um avanço capaz de colocar o
país em posição destacada no cenário internacional.
Figura 1. Evolução no número de trabalhos e de citações dos oito PIs do CTC.
O tema: Terapia Celular
A terapia celular, por definição mínima, compreende a utilização de células
com objetivos terapêuticos. Estas células podem ser usadas das mais diferentes
maneiras: injetadas endovenosamente para exercerem ações sistêmicas ou
atingirem órgãos e tecidos protegidos, como a medula óssea ou o SNC; usadas
localmente ou injetadas diretamente no tecido ou órgão comprometido com o
objetivo de promover algum efeito benéfico regenerativo ou protetor.
As células usadas para fins da terapia celular também variam amplamente
com relação ao seu estado de maturação e diferenciação. Podem ser utilizadas
células maduras do sangue periférico como eritrócitos, leucócitos e plaquetas como
acontece, por exemplo, nas transfusões sanguíneas, ou ainda linfócitos ou células
dendríticas sensibilizados in vitro nas chamadas vacinas celulares; também podem
ser utilizadas células-tronco ou células progenitoras com o objetivo de promover o
reparo ou mesmo a total substituição de um tecido ou órgão lesado. Neste último
caso temos o exemplo, consolidado por mais de 40 anos de experiência, dos
transplantes de células-tronco hematopoéticas derivadas da medula óssea, do
sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical e que são capazes de
reconstituir todo o sistema hematopoético.
5
Outros exemplos de terapias celulares bem sucedidas com células-tronco,
tanto embrionárias como somáticas em modelos animais e no homem, têm surgido
nos últimos anos e a procura de novas terapias celulares efetivas tem ocupado, de
forma relevante e explosiva, a literatura científica.
O Instituto Nacional de Terapia Celular (INTC) pretende desenvolver um
extenso programa de pesquisas básicas e clínicas para entender, isolar, cultivar e
usar terapeuticamente, tanto em modelos animais como em humanos, as célulastronco derivadas de diversas fontes: células-tronco embrionárias, células-tronco
somáticas e células-tronco pluripotenciais
induzidas (IPS). Para a melhor
compreensão dos mecanismos envolvidos na manutenção ou no ressurgimento da
pluripotência, também serão estudadas células-tronco neoplásicas derivadas de
tecidos diversos, especialmente as da medula óssea que originam as leucemias e os
linfomas.
De forma geral, o escopo do projeto científico pode ser visto na figura 2. O
conjunto de células-tronco que serão estudadas pode ser dividido nas chamadas
células-tronco pluripotenciais e nas células-tronco somáticas. Entre as primeiras
incluem-se as células-tronco embrionárias e as células-tronco pluripotenciais
induzidas (IPS). No segundo grupo serão estudadas células-tronco hematopoéticas
(CTH), células-tronco mesenquimais (MSC), células progenitoras endoteliais (CPE) e
células-tronco neoplásicas (CSC). Adicionalmente, serão estudadas células-tronco
pouco caracterizadas atualmente, como as células epiteliais da placenta e as
células-tronco de partes distintas do saco vitelínico.
Estas células serão isoladas, caracterizadas morfológica e funcionalmente e
cultivadas para se tornarem objetos de estudos que terão foco no entendimento de
propriedades funcionais e na identificação de mecanismos moleculares, genéticos e
epigenéticos envolvidos na indução e no controle da diferenciação celular. Um
grande
conjunto
participantes,
de
serão
ferramentas
empregadas
metodológicas,
nestes
estudos,
dominadas
incluindo:
pelos
grupos
metodologias
genômicas, proteômicas, citogenéticas, genéticas, epigenéticas, imunológicas,
embriológicas, de biologia e cultivo celular e de biologia sistêmica. Estas células
também serão cultivadas em larga escala para serem usadas em estudos préclínicos e clínicos envolvendo tanto animais como humanos. Especificamente para
os estudos em animais estamos propondo a criação de um Centro de Estudos Pré6
clínicos e de um Banco de Células-tronco com o objetivo de permitir estudos em
animais de vários portes (roedores e histricomorfos, coelhos, ovinos, suínos,
caninos, eqüinos, bovinos e macacos). Este Centro será formado pela participação
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de São Paulo- USP, Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos de Pirassununga –USP, pelo Centro Nacional
de Primatas do Instituto Evandro Chagas de Belém-PA e pelo laboratório de Estudos
com Modelos Animais do CTC. A infra-estrutura e a competência científica e
tecnológica já existentes nestas Instituições permitirão a formação de uma rede de
estudos pré-clínicos sem precedente no país. Especialmente os estudos com
primatas (macacos do velho e novo mundo) acrescentarão um diferencial
importante nos estudos pré-clínicos com células-tronco feitos no país.Em humanos,
três estudos clínicos de fase I e II serão conduzidos especificamente usando célulastronco mesenquimais: em diabetes tipo I, no tratamento da doença do enxerto
contra o hospedeiro aguda pós-transplante de medula óssea (DECHA).
Para executar este ambicioso plano de trabalho foram reunidos especialistas
e instituições com comprovada experiência científica em várias áreas: biologia
celular e molecular, genética, embriologia, imunologia, hematologia, biologia de
sistemas, química de proteínas, veterinária e bioinformática. A participação destes
cientistas e de seus respectivos grupos será feita de forma integrada e
complementar, sendo os projetos científicos propostos o resultado de uma
abordagem multidisciplinar voltada para o esclarecimento de aspectos científicos
específicos, mas ao mesmo tempo integradores de questões maiores e relevantes.
Espera-se que esta abordagem científica multifacetada e multidisciplinar de um
tema específico permita rápido progresso na área de terapia celular, consolidando
e ampliando a participação do Brasil na comunidade internacional de primeira linha
no que concerne a este tema. As atividades de pesquisa são descritas com detalhes
no item C.
7
Células‐tronco Somáticas MSC CPE CTH Células‐tronco Pluripotenciais Câncer
Embrionárias Induzidas (IPS) Células Epiteliais
da Placenta
Células‐Tronco do
Saco Vitelínico Propriedades Funcionais e Mecanismos
Genômica Proteômica B. Sistêmica
Citogenética
Imunologia Genética B. Celular
Embriologia Epigenética Engenharia de Cultivo Indução e Controle da Diferenciação
Produção de
células para uso
Estabelecimento de
Linhagens neoplásicas Estabelecimento de
Linhagens
b
á
Mecanismos da
Transformação neoplásica Estudos Pré‐clínicos e Clínicos
Modelos Animais Camundongos Histricomorfos Coelhos Ovinos Suínos Caninos Equinos Bovinos Macacos Humanos Diabete
DECHA (1) DECHA (2) Figura 2. Escopo do projeto
Paralelamente ao programa científico, pretende-se o desenvolvimento de
intensa atividade de transferência de conhecimentos científicos para a sociedade
envolvendo o público em geral, mas também e principalmente os professores do
ensino fundamental e médio e os seus alunos. O INTC pretende ampliar as
atividades de transferência que já são feitas pelo Centro de Terapia Celular (CTCCEPID-FAPESP), estendendo estas atividades para os locais dos laboratórios
associados (São Paulo, Pirassununga, Rio de Janeiro e Belém) e propondo novas
atividades com maior abrangência.
8
As atividades de disseminação do conhecimento sempre foram relevantes no
programa do CTC. Em 2000, como parte desse programa foi montada na instituiçãosede do CTC (Hemocentro de Ribeirão Preto – HCFMRP-USP) um espaço de 50 m2
denominado Casa da Ciência (Rua Tenente Catão Roxo, 2501) onde foram alojados
8 profissionais dedicados integralmente à divulgação e ao ensino de ciências. Essa
equipe é liderada pela Profa. Dra. Marisa Barbieri, professora aposentada da
Universidade de São Paulo e que possuí larga experiência no ensino e na formação
de professores de ciências e biologia para o ensino fundamental e médio. A
montagem deste espaço físico recebeu apoio, além da Fundação Hemocentro de
Ribeirão Preto e da FAPESP, da Fundação Vitae e da própria Universidade de São
Paulo por meio de bolsas-trabalho vinculados ao programa COSEAS.
Dentre as atividades de destaque desenvolvidas podemos listar: os Cursos de
Especialização denominados “As Células, o genoma e você, professor”, oferecidos
em conjunto pela USP e pela Secretaria de Estado da Educação de São Paulo a mais
de 200 professores das escolas de ensino fundamental e médio tanto da rede
pública como privada; os cursos de extensão universitária presenciais e à distancia
com duração de 30 horas; os projetos de iniciação científica júnior apoiados com
bolsas pela FAPESP; os cursos de iniciação científica para alunos da rede pública
denominados “Caça Talentos” e “Adote um Cientista”, sendo o primeiro um
projeto de convivência semanal entre os pesquisadores do Centro e alunos e
professores e o segundo o desenvolvimento de projetos de pesquisa simples,
liderados por pós-graduandos da Universidade de São Paulo que se encarregam,
cada um deles, de um pequeno grupo de alunos; produção de material educacional
para divulgação científica como o “Jornal das Ciências” que se encontra na sua 18a.
edição e é produzido pelos alunos e distribuído para as escolas da região; produção
de jogos educacionais, de peças teatrais como “A agonia de uma Célula”;
confecção de cartilhas como “Uma conversa sobre HIV e AIDS” que foi patrocinada
pelo Ministério da Saúde e distribuída para Escolas de todo o pais e a redação de
artigos científicos sobre o projeto educacional do CTC e que foram publicados no
Brasil e no exterior.
Em 2004, a Casa da Ciência teve suas atividades ampliadas tendo sido
montado, com o apoio da Universidade de São Paulo que cedeu uma residência no
Campus Universitário de Ribeirão Preto, o MULEC -Museu e Laboratório de Ensino
de Ciências para abrigar a exposição permanente dos materiais educacionais
9
produzidos nas atividades desenvolvidas na Casa da Ciência. Este novo
espaçorecebe a visitação de alunos e do público em geral. Outras atividades
desenvolvidas compreenderam participações na Semana Nacional de Ciências e
Tecnologia (2004, 2005, 2006, 2007), em congressos científicos (SBPC), em
programas da mídia eletrônica (rádio e TV) e na mídia impressa.
Todas estas
atividades de divulgação da ciência promovidas e apoiadas pelo CTC estão descritas
com
detalhes
no
portal
da
Casa
(http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/casaciencia)
da
e
farão
Ciência
parte
do
programa educacional do INCTC. O histórico resumido das atividades de
transferência de conhecimento do CTC é apresentado na figura 3.
Outras atividades educacionais e de formação de recursos humanos
compreendem os cursos de verão oferecidos anualmente e os cursos de formação
profissional. O CTC oferece anualmente, no mês de janeiro, um curso de verão
destinado a alunos matriculados em cursos de graduação da área biológica de todo
o Brasil. Até o momento já foram oferecidos 8 edições com a participação de mais
de 280 alunos. A temática destes cursos têm sido a genômica, a proteômica e as
células-tronco. O curso, com duração de duas semanas, inclui aulas teóricas e
fundamentalmente práticas laboratoriais na temática proposta. O CTC oferece
também cursos de atualização profissional para médicos e não médicos na área de
hemoterapia, enfermagem, assistência social e gestão de serviços de saúde.
O CTC está ligado à Universidade de São Paulo por intermédio da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto e de outras unidades situadas do Campus de Ribeirão
Preto e os seus professores e pesquisadores participam ativamente dos cursos de
graduação em medicina, farmácia, química e informática biomédica. Participam
também regularmente dos cursos de pós-graduação destas unidades.
10
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
“As células, o genoma e você, professor”
“Caça-Talentos”
“Précongresso”
“Site”
“Jornal das Ciências”
Iniciação Científica
Júnior”
“Curso On-Line (COL) ”
“MuLEC”
“Semana Nacional de Ciência e Tecnologia”
“Adote um Cientista”
“Roda da
Ciência”
“Terças da
Ciência”
“Mural I e II”
“Sextas da
“Mural III”
Ciência”
“Folhetins”
“PIPOC”
“PIPAS”
“Portal para
professores”
“Espaço Ciência para
todos”
“Painel do Sangue”
“Congresso
de Pediatria”
“Sangue Seguro”
“Parceiros na divulgação de
Ciências”
“Agonia de uma célula”Brasília
“Mostra Células-Tronco”
“Sara e as relíquias do
sangue”
“Pré iniciação
científica USP”
“Ciência com jovens – fazendo o
futuro”
“Sala Retrô”
“Eventos e Atividades”
Instituições de Apoio e Financiamento:FAPESP; CNPq; Fundação Vitae; Pró-Reitoria de Cultura e
Extensão – USP
Figura 3 . Histórico das atividades de transferência
Na presente proposta o objetivo é ampliar esta experiência do CTC,
estendendo o alcance das iniciativas descritas para os laboratórios e unidades que
se associam agora na proposta do INCTC. Propomos também o aumento em escala
destas iniciativas por meio do oferecimento dos cursos de especialização através da
internet. O público alvo serão os alunos e os professores de ciências e biologia do
ensino fundamental e médio. No primeiro ano do INCTC está previsto o
oferecimento de um curso de especialização com duração de 360 horas para a
formação de 900 professores de ciências e biologia. Como parte integrante das
atividades do curso, cada professor terá que matricular uma classe de no mínimo
40 alunos regulares do ensino público o que totalizará 36.000 alunos participantes
do curso no período de 10 meses. As atividades com os professores serão
11
predominantemente à distância usando a plataforma TIDIA. Vinte por cento das
atividades serão presenciais e serão realizadas nos pólos de educação a distância
situados em unidades das Universidades Estaduais Paulistas. O curso de
especialização será autorizado pela USP e desenvolvido dentro do Programa
Universidade Virtual do Estado de São Paulo (UNIVESP). A documentação para
oficialização deste curso junto às instituições citadas encontra-se em tramitação
com anuência preliminar do Secretário de Ensino Superior do Estado de São Paulo e
do Pró-reitor de Cultura e Extensão da Universidade de São Paulo. A partir do
segundo ano do projeto, o curso poderá ser estendido para todo o Brasil.
Pretendemos ainda montar um Curso de Pós-graduação Inter-Unidades
(FMRP-USP, FMV-USP, FZ-USP, ICB-USP e UFRJ) com temática na terapia celular e
um curso de mestrado profissionalizante para a formação especializada de técnicos
para atuação nesta área.
Complementarmente a estas atividades estamos apresentando um ambicioso
plano de divulgação da ciência e de formação de divulgadores científicos por meio
de cursos de pós-graduação strictu e latu senso. A divulgação dos produtos
científicos
gerados
no
INCTC,
identificada
como
relavante
pelos
seus
participantes, será feita de diversas formas suplementares à produção de artigos
científicos. O objetivo maior será atingir amplos segmentos sociais para promover o
interesse em ciência e despertar para a necessidade da educação científica
permanente. Estas novas ações previstas para o INCTC estão descritas com maiores
detalhes no item E.
Por fim, as atividades de inovação formam, em conjunto com o programa de
pesquisa e de transferência, a tripla-hélice que caracteriza este projeto e deveria
ser, de modo ideal, as características marcantes das Universidades e do Centros de
Pesquisa do século XXI (Etzkowitz, 1996). Neste tópico também se pretende
ampliar a experiência do CTC-CEPID que de forma bem sucedida implantou uma
incubadora de empresas no seio da entidade sede (CRH-HCFMRP-USP). Esta
incubadora denominada INBIOS – Incubadora de Empresas de Biotecnologia em
Saúde foi constituída em 2002 com os objetivos de apoiar empreendedores para a
criação ou continuidade de novos negócios de biotecnologia ou a criação de
pequenas empresas de biotecnologia da cadeia de suprimento de médias e grandes
empresas, ou ainda braços de P&D de médias e grandes empresas que tenham
12
interesse de desenvolver um produto ou linhas de produto ou serviços na
incubadora. As áreas preferenciais de ação da INBIOS foram definidas como:
biotecnologia, biomedicina, equipamentos e materiais médico-odontológicos,
instrumentação, tecnologia da informação, meio-ambiente, química e técnicas
nucleares. Em 2006, a INBIOS, por meio de convênio, passou a integrar a SUPERA –
Incubadora de Empresas de Base Tecnológica de Ribeirão Preto com a denominação
SUPERA-HEMOCENTRO (http://www.fipase.org.br/default.asp).
No momento, a SUPERA apóia 09 empresas residentes, 03 empresas préresidentes, 01 empresa associada e 20 projetos na modalidade Hotel de Projetos. A
SUPERA-HEMOCENTRO está instalada em espaço de 128 m2 e oferece abrigo a cinco
empresas: Rad Tech Sistemas Médicos
Ltda, Capelli Fabris Desenvolvimento e
Pesquisa Ltda, Lychnoflora Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Naturais Ltda,
CG Brasil Consultoria e Informática Ltda e Innolution Sistemas de Informática Ltda.
O projeto do INCTC incorporará esta experiência de extensão para o setor
produtivo.
Adicionalmente,
serão
desenvolvidas
novas
ações
visando
o
desenvolvimento tecnológico e a sua transferência para o setor produtivo como
descrito com detalhes no item F.
Justificativa
Em 2005, o Reino Unido promoveu um painel de especialistas com o objetivo
de realizar o diagnóstico e o planejamento de atividades relacionadas às célulastronco e à terapia celular por 10 anos (2006-2015) . No documento final, UK Stem
Cell Initiative – Report and Recomendations – foram apresentadas ações de curto,
médio e longo prazo para colocar o RU na liderança mundial neste setor que foi
considerado estratégico devido ao seu potencial inovador na cura e tratamento de
doenças. No capítulo 5 do referido documento foi apresentado um fluxograma que
descreve os passos críticos
que governariam o desenvolvimento de produtos e
processos com células-tronco e terapias celulares. Na figura 4 reproduzimos esse
fluxograma. Por essa concepção, o desenvolvimento de novas terapias celulares
começa por um esforço em pesquisa básica para isolar, caracterizar e compreender
os mecanismos biológicos envolvidos na manutenção do estado indiferenciado das
células-tronco. O segundo passo nesse fluxograma compreende o estabelecimento
13
de linhagens de C-T bem caracterizadas e homogêneas, depositadas em banco de
células-tronco criado específicamente para esse fim e encarregado da guarda,
ampliação e distribuição destas linhagens para os diversos laboratórios. No RU esta
sugestão levou à criação do Banco Nacional de Células-tronco (UK Stem Cell Bank).
O terceiro passo consiste na produção de células-tronco bem caracterizadas em
larga escala para serem usadas nos estudos pré-clínicos e clínicos. No RU, diversas
iniciativas neste sentido, patrocinadas pelo governo e pela iniciativa privada, estão
em andamento. Nesta etapa, a geração de patentes de produtos e processos é
altamente provável o que explica o grande interesse da iniciativa privada nesta
área no mundo todo. Na quarta etapa do fluxograma situam-se os estudos clínicos
que demandam estruturas físicas e profissionais especializados nesta área. Na
etapa final acontece o registro e a liberação do produto para uso gera.
No Brasil, podemos afirmar com segurança, que a maioria dos estudos e
iniciativas encontram-se na primeira fase do fluxograma descrito. A presente
proposta avança neste sentido. Estamos propondo um conjunto de atividades que
se distribuem pelas quatro fases descritas: pesquisa básica, estabelecimento de um
banco de células-tronco, desenvolvimento de sistemas de cultivo em larga escala
em condições GMP e testes pré-clínicos e clínicos. Este esforço coordenado
colocará o país na fronteira do conhecimento em terapia celular.
14
THERAPIES PRODUCED FROM STEM CELL LINES
Research &
Development
Basic
Stem Cell
Research
Stem Cell
Banking
Cell Therapy
Production
Stem Cell
Bank
Stem Cell Therapy
Production Unit
Research grade
cell banking
and
characterisation
Production process
development
Clinical grade
cell banking
Epigenetics
and
Bioengineering characterisation
Plot scale capacity
to supply stem cell
clinical trials
Cell Biology
Imunology
Animal Modeling
1,3,5,6,7,8,9,10,
11,12,13,14,15,
4,6,7,26, e 27*
16,17,18,19,20,
21.24 e 25 *
2 e 23*
Stem Cell Clinical
Research
Marketing
Approval
Stem Cell
Clinical Trials
Licensed Product
Manufacture
Specialist Bed and
Facilities
Stem Cell Therapy
Safety and Efficacy
Commercial or
Plubic Sponsor
Coordination
Therapy Surveilance
28, 29 e 30*
Figura 4. Fluxograma das fases do desenvolvimento de terapias celulares.
(Adaptado de UK Stem Cell Initiative, 2005).* número dos subprojetos descritos
nesta proposta.
Na última linha da figura 4, indicamos a relação das etapas indicadas com os
subprojetos propostos.
O grande diferencial deste projeto é que ele amplia o escopo dos estudos
com células-tronco e terapias celulares que ocorrem no país. Embora existam
vários estudos clínicos de fase I e II em andamento salientamos que esses estudos
estão sendo feitos, na sua maioria, com células mononucleares da medula óssea
minimamente manipuladas. Estes estudos foram planejados no auge da divulgação
de experimentos preliminares em modelos animais que sugeriam que as células da
medula óssea fossem altamente plásticas e atuavam na reconstituição de órgãos
como o cérebro e o coração. Muitos grupos de pesquisa, sem nenhuma experiência
prévia no estudo de células-tronco, embarcaram nestes projetos simplesmente
estimulados pela facilidade de obtenção das células. Entretanto, esta fase se
esgotou rapidamente e ficou demonstrado que os avanços clínicos revolucionários
esperados com o uso da fração mononuclear da MO não se confirmaram, o que
remeteu esse tipo de estudo para o fim da fila das prioridades em terapia celular.
15
A terapia celular, como definimos anteriormente, tem imenso potencial
terapêutico podendo mesmo revolucionar a forma de tratamento de inúmeras
doenças crônico-degenerativas. Entretanto, para que este potencial se realize fazse necessário um conjunto de atividades científicas e regulatórias que, no
momento, ainda não se encontra totalmente consolidada no país.
O projeto do INCTC propõe um modelo de atuação coordenada, à
semelhança dos modelos que foram adotados pelos países que se tornaram líderes
nesse setor, especialmente o Reino Unido. Como mostrado na figura 4, a nossa
proposta é constituída por um conjunto de subprojetos que visam atender as
exigências técnicas e científicas para que terapias celulares efetivas sejam
disponibilizadas para amplos setores da população num universo temporal que varia
de 8 a 15 anos.
Neste contexto, um primeiro conjunto de subprojetos destina-se ao estudo
das propriedades básicas das células-tronco (biologia celular, imunologia,
epigenética, genômica, citogenômica, proteômica, bioengenharia, etc.). Neste
grupo também se inclui o desenvolvimento de modelos animais e aqui ressaltamos
a utilização, pela primeira vez no país, de primatas não humanos para o
desenvolvimento de modelos experimentais destinados a testar terapias celulares.
Outra iniciativa inédita é a montagem de um Centro de Estudos Pré-clínicos para
atender a demanda que será gerada pelo projeto. Esta iniciativa deverá também
beneficiar outros estudos não só de terapia celular já que o Brasil é carente de
centros com esta especiaficação.
Um segundo conjunto de subprojetos, que se desenvolverá concomitante ao
primeiro, destina-se à derivação de linhagens homogêneas de células-tronco, tanto
pluripotenciais como somáticas. O objetivo é a obtenção de linhagens celulares de
CT bem caracterizadas e que possam ser amplificadas em sistemas de cultivo sem
perderem
as suas
propriedades primordiais
com
a
finalidade
de
serem
disponibilizadas para os diversos laboratórios de pesquisa e para os estudos préclínicos e clínicos. Para alcançarmos este objetivo pretendemos estabelecer dois
bancos de células-tronco: um para células-tronco animais que será coordenado
pelos grupos da Profa. Maria Angélica Miglino da FMVSP-USP e pela Dra. Klena
Sarges Marruaz da Silva do Centro Nacional de Primatas de Belém-PA; o segundo
banco, para células-tronco humanas já existe no CTC-Hemocentro e deverá ser
16
ampliado na sua capacidade de processamento para atender a todas as
necessidades encetadas pelo projeto. A premissa maior desta fase do projeto é que
os efeitos terapêuticos eventuais que serão obtidos nos modelos animais e nos
estudos clínicos, para serem reprodutíveis e confiáveis, precisam ser diretamente
correlacionados com populações celulares específicas e passíveis de amplificação
em cultura para que os progressos nesta área sejam cientificamente consistentes.
Devemos também enfatizar que a preocupação com a qualidade e
caracterização das linhagens de células-tronco que serão testadas se acompanha
também com a qualidade dos testes pré-clínicos. Para garantir que esta fase
fundamental para o desenvolvimento das terapias celulares futuras seja executada
com todo o rigor científico e metodolólgico necessário, estamos propondo a
constituição de um Centro de Estudos Pré-Clínicos que será fisicamente
descentralizado envolvendo a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de
São Paulo – USP, a Faculdade de Zootecnia de Pirassununga – USP, o Laboratório de
Estudos Animais do CTC-Hemocentro e o Centro Nacional de Primatas do Instituto
Evandro Chagas de Belém- PA. Especialmente neste último centro serão executados
estudos pré-clínicos com primatas não humanos o que significa uma evolução sem
precedentes no Brasil e em boa parte do mundo.
Um terceiro grupo de subprojetos se destina a implementar sistemas de
produção de células-tronco larga escala para que as terapias células se tornem
disponíveis para grande número de pacientes. A capacidade limitada de cultivo das
células-tronco é, hoje, o maior obstáculo para que terapias celulares efetivas
sejam disponibilizadas. À guisa de exemplo, no estudo clínico de fase I que estamos
conduzindo usando células estromais mesenquimais para o tratamento da doença
do enxerto contra o hospedeiro aguda (DECHA) pós-transplante de medula óssea, o
tratamento de um único paciente com 70 Kg de peso corporal exige o cultivo de
células em 30 frascos de cultura de 1L por 20 a 30 dias para a obtenção final de
cerca de 7 x 107 células. Impossível imaginar que este tipo de tratamento possa ser
estendido a todos que dele necessitem sem um sistema mais eficiente de cultivo
celular. A alternativa é produção de células em biorreatores e nesta proposta este
objetivo será perseguido tanto para a amplificação de células-tronco embrionárias
como para células-tronco mesenquimais.
17
O quarto grupo de subprojetos compreende os estudos clínicos. Destacam-se
aqui os estudos que envolvem a utilização de células-tronco mesenquimais para o
tratamento de pacientes com diabetes tipo I e o destinado ao tratamento da
doença do enxerto contra o hospedeiro pós-transplante de medula óssea (DECHA).
O nosso grupo foi o primeiro e é, no momento, o único que está usando células
mesenquimais cultivadas em condições GMP para terapia celular.
No conjunto de propostas, este projeto de INCTC promove um grande avanço
nos estudos envolvendo células-tronco e terapia celular no país.
B) Objetivos e Metas
Organizar pesquisadores brasileiros com larga experiência no estudo de
células tronco, e atuantes em Instituições de diferentes partes do país, em um
Instituto Nacional de Ciencia, Técnologia e Inovação (INCTI). A criação deste INCTI
permitirá a troca de informações, reagentes, métodos, recursos humanos e
logística, bem como disponibilizará o grande parque de equipamentos existente, de
tal sorte a gerar produção acadêmica, tecnológica e na formação de recursos
humanos na área de biotecnologia, saúde e ciências agrárias com impacto nacional
e internacional.
A meta do Instituto é o desenvolvimento de ciência básica abordadando
questões fundamentais como as características das células tronco de diferentes
origens e espécies, e os mecanismos genéticos, epigenéticos e celulares regulando
sua manutenção e diferenciação. Além disto, serão desenvolvidos protocolos
técnicos, um banco de células e tecidos, ferramentas de bioinformática, linhagens
celulares e modelos usando animais geneticamente manipulados que serão
empregados em subprojetos envolvendo vários pesquisadores atuando de forma
coordenada na análise das diferentes facetas dos problemas. Na área aplicada,
serão desenvolvidas estratégias de tratamento usando células tronco para diabetes
mellitus, esclerose múltipla e para a doença do enxerto versus hospedeiro.
O Instituto também tem como meta a formação de recursos humanos na área
de biotecnologia aplicável à area da saúde e às ciências agrárias. Além de criar
18
oportunidades para professores do ensino médio de adquirir formação científica e
despertar o interesse de alunos na área de ciências. Em paralelo, a população geral
será informada do progresso do projeto e os resultados serão divulgados junto às
empresas de tecnologia, algumas das quais serão beneficiárias da incubadora de
empresas SUPERA ligada a FUNDHERP.
Para possibilitar o acompanhamento e a avaliação do centro proponente,
listamos abaixo (item C), os objetivos específicos estipulados em cada um dos subprojetos. Da mesma forma, estas informações (e ou outras complementares), os
cronogramas de execução estão listados em outra seção do projeto e podem ser
consultados no website www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct .
C) Detalhamento do Programa de Pesquisa
O programa de pesquisas do INCTC se compõe de 30 subprojetos que são
apresentados a seguir, juntamente com os objetivos e metas de cada um. Na
segunda parte deste item (C2) estes subprojetos são resumidamente descritos
como parte de uma organização racional maior do programa indicando,
preliminarmente, o caráter integrador da proposta. Esta racionalidade foi indicada
anteriormente na figura 4. No item H deste projeto (Especificação das Atividades a
serem desempenhadas pelos membros da Equipe) é apresentada uma tabela que
mostra a participação integrada dos diversos grupos de pesquisa envolvidos
(representado pelo nome do coordenador) nestes subprojetos.
C1. Subprojetos, Objetivos e Metas
Sub-projeto 1: “Avaliação da estabilidade epigenética de linhagens de célulastronco embrionárias estabelecidas em diferentes condições”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/SUB01.pdf
Coordenador: Lygia da Veiga Pereira
19
1. Estabelecimento de linhagens de CTEh a partir da massa celular interna de
blastocistos;
2. Avaliação de diferentes condições de estabelecimento das linhagens (na
presença ou ausência de fibroblastos murino; com soro fetal bovino ou serum
replacement; em meio definido) em seu estado epigenético;
3. Caracterização da plasticidade das linhagens de hES;
4. Analise do estado de atividade do cromossomo X nas células de trofoblasto
retiradas dos embriões;
5. Avaliação do efeito de instabilidade cromossômica na capacidade de
diferenciação das CTEh
Sub-projeto 2: “Propagação de células-tronco embrionárias humanas em
biorreatores visando o aumento de escala para transplantes em doenças
degenerativas”
Coordenador: Stevens Kastrup Rehen
1. Avaliar comparativamente o crescimento e pluripotencialidade de célulastronco embrionárias humanas em sistemas agitados, tanto na forma de corpos
embrióides, quanto utilizando microcarregadores como suporte.
2. Caracterizar a estabilidade cromossômica e capacidade de diferenciação de
células-tronco embrionárias humanas mantidas em sistemas agitados por
longos períodos.
3. Ampliar a escala de produção de células-tronco embrionárias humanas,
através da utilização de biorreatores, para fins de transplante em animais de
experimentação e eventualmente em humanos.
4. Estabelecer um protocolo de expansão de células-tronco embrionárias
humanas economicamente viável e aplicável à obtenção de grandes
quantidades de células.
20
Sub-projeto 3: “Bases moleculares da diferenciação hematopoética a partir de
CTE”
Coordenadores: Marco Antonio Zago eDimas Tadeu Covas
1. Padronização do protocolo in-vitro de diferenciação de CTH a partir de
linhagens de CTEh;
2. Seleção imunomagnética das CTH CD34+ derivadas de CTE e de SCU e
extração de RNA
3. Padronização do protocolo in-vitro de diferenciação de linfócitos T a partir
de CTH CD34+ derivadas de CTE ou de SCU;
4. Avaliação dos processos de diferenciação por citometria de fluxo;
5. Obtenção do perfil transcricional de mRNAs utilizando microarrays;
6. Obtenção do perfil transcricional de microRNAs utilizando microarrays;
7. Análise dos dados utilizando métodos bioinformáticos e bases de dados
específicas e identificação de potenciais mecanismos regulatórios.
8. Validação das diferenças por PCR em tempo real (tanto de mRNA como
microRNA).
Sub-projeto 4: “Cultura de células tronco adultas e embrionárias de animais e
humanos para uso em terapias celulares”
Coordenador: Maria de Fátima Lima de Assis
1. Cultivar células tronco adultas e embrionárias com o mínimo de
interferência química para a conservação da integridade genômica,
mantendo as culturas criopreservadas nas primeiras passagens evitando a
ocorrência de poliploidia “in vitro”;
2. Diferenciar as células tronco “in vitro” para uso em terapias celulares;
21
3. Estimular a célula tronco adulta a desenvolver funções específicas de células
tronco embrionárias (desdiferenciação celular).
4. Levantamento bibliográfico para a escolha do protocolo a ser adotado no
cultivo celular;
5. Triagem, coleta e identificação do material a ser trabalhado;
6. Cultivo, expansão e criopreservação de células tronco adultas;
7. Identificação cariotípica das células tronco adultas cultivadas;
8. Diferenciação das células tronco adultas em tecidos específicos;
9. Cultivo, expansão e criopreservação das células tronco embrionárias;
10. Identificação cariotípica das células tronco embrionárias cultivadas;
11. Início da diferenciação das células tronco embrionárias cultivadas, em
tecidos específicos;
12. Desdiferenciação de células tronco adultas tornando-as potencialmente
embrionárias.
13. Redação e publicação dos produtos obtidos.
Sub-projeto 5: “Modificação gênica de células-tronco”
Coordenador: Dimas Tadeu Covas
1. Construir vetores lentivirais contendo fatores de transcrição supostamente
envolvidos na manutenção da pluripotencialidade seguido do elemento IRES
e GFP;
2. Induzir ao aumento da expressão dos fatores de transcrição Oct3/4, Sox2 e
Nanog pela transdução dos vetores virais em células mesenquimais e
endoteliais
3. Observar as alterações ocasionadas no perfil de expressão gênica de genes
pela metodologia de RT-PCR, com o intuito de elucidar o mecanismo de
22
atuação da expressão destes fatores de transcrição e descrever novos alvos
terapêuticos
4. Selecionar clones de células mesenquimais transformadas com os vetores
lentivirais e observar a viabilidade e a capacidade de diferenciação em
diferentes linhagens celulares.
Sub-projeto 6: “Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes
induzidas (iPS) de modelos animais de grande porte”
1. Desenvolvimento de vetores de indução de pluripotencia em celulas de
primatas não humanos e caes;
2. Estabelecimento de linhagens de iPS a partir de fibroblastos desses modelos
animais;
3. Diferenciacao neural das iPS e ensaio pré-clinico nos modelos animais com
lesão de medula espinhal.
Sub-projeto 7: “Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes
induzidas (iPS) a partir de fibroblastos de pacientes com doenças genéticas
mendelianas e multifatoriais (com componente genético)”
1. Sistematização da metodologia de geração de iPS humanas a partir de
fibroblastos derivados de pele, e a partir de células derivadas de sangue e
medula ossea;
2. Estabelecimento de linhagens de iPS a partir de pacientes com doenças
genéticas de interesse do grupo para estudos dos mecanismos moleculares
das mesmas;
23
3. Estabelecer iPS a partir da linhagem de fibroblastos humanos GM1662, 46
XX, heterozigota para uma mutação no gene HPRT, visando o uso desta
linhagem no estudo de modificações epigenéticas associadas à inativação do
cromossomo X em humanos.
4. Desenvolver vetores adenovirais bi-cistrônicos visando (i) aumentar a
eficiência da produção de iPS; e (ii) gerar iPS não-geneticamentemodificadas através da eliminação dos vetores pós-indução.
Sub-projeto 8: “Células pluripotentes autólogas geradas a partir de células
somáticas diferenciadas”
Coordenador: Flavio Vieira Meirelles
1. Indiferenciação de células diferenciadas através das metodologias:
2. Inserção gênica de fatores conhecidos (iPS)
3. Transferência nuclear utilizando fibroblastos como célula doadora de núcleo
4. Transferência nuclear utilizando iPS como célula doadora de núcleo
5. Derivação de células pluripotentes a partir das metodologias descritas
acima, bem como a partir de células embrionárias produzidas in vivo.
6. Análise e comparação morfológica, da expressão gênica e epigenética das
células
indiferenciadas
obtidas
a
partir
das
metodologias
descritas
anteriormente.
7. Determinar a metodologia que apresente padrão de transcriptoma,
epigenoma e proteoma mais semelhante às células indiferenciadas do grupo
controle e aplicá-la no modelo interespecífico.
8. Execução de provas funcionais de indiferenciação das células produzidas
pelo modelo interespecífico: citoplasto bovino e célula de macaco como
doadora de núcleo.
24
Sub-projeto 9: “Modelo animal para estudo da herança mitocondrial intra e
inter-espécie”
Coordenador: Flavio Vieira Meirelles
1. Produzir blastocistos bovinos (Bos taurus) que contenham mtDNA de origem
somática intra (B. indicus) ou inter-específica (Homo sapiens) em
heteroplasmia com mtDNA de origem embrionária (herdado do oócito).
2. Desenvolver um método para aumentar a porcentagem herdada nos
blastocistos de mtDNA somático (B. indicus ou H. sapiens).
Sub-projeto 10: “Conhecimento básico sobre a biologia da MSC através de sua
comparação com pericitos”
1. Comparar pericitos frescos, pericitos cultivados em condições de MSC, e
MSCs entre si quanto a seu comportamento quando submetidos a condições
de diferenciação descritas para MSC e a diferentes condições de cultivo in
vitro;
2. Comparar pericitos frescos, pericitos cultivados em condições de MSC, e
MSCs quanto à sua capacidade de contribuição para diferentes tecidos
quando injetados em blastocistos;
3. Estudar o perfil de marcadores de superfície exibido por pericitos frescos,
em comparação direta com o de pericitos cultivados em condições de MSC e
o de MSCs cultivadas;
4. Estudar o perfil de citocinas com potencial imunomodulatório de pericitos
frescos em comparação com o de pericitos cultivados em condições de MSC e
o de MSCs cultivadas;
5. Verificar o comportamento de pericitos infundidos sistemicamente em
modelo animal de lesão tecidual, utilizando MSCs cultivadas como controle,
25
e investigar o papel de pericitos durante o processo de reparo/regeneração
tecidual.
Sub-projeto 11: “Avaliação do potencial angiogênico e elucidação das
interações moleculares de células-tronco mesenquimais e células endoteliais
em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo”
1. Isolar e caracterizar de populações celulares da medula óssea, veia do
cordão e capilares cerebrais humanas no que diz respeito ao nível de
expressão dos marcadores CD271, CD140B, 3G5, NG2, Stro-1 e CD146 para
selecionar o marcador mais apropriado para realizar a clonagem celular;
2. Clonagem celular por “sorting” de populações celulares da medula óssea,
veia do cordão e capilares cerebrais utilizando um dos marcadores
previamente caracterizados;
3. Caracterização morfológica e imunofenotípica de populações celulares
isoladas por “sorting”;
4. Isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais do saco vitelínico canino
(cSV-CTM);
5. Potencial de diferenciação das populações celulares humanas isoladas por
“sorting” e das CTM caninas em adipócito, osteócito e condrócito
6. Modificação Gênica de células-tronco humanas isoladas por “sorting” e das
CTM caninas com luciferase/DsRed e seleção das células positivas para DsRed
por citometria de fluxo; e o marcador previamente selecionado;
7. Caracterização Morfológica, Fenotípica de células-tronco isoladas por
“sorting” e positivas para luciferase/DsRed+;
26
8. Isolamento e cultivo de células endoteliais humanas e caninas positivas para
CD31 obtidas da veia do cordão humano (HUVEC) e do saco vitelínico canino
(cSV-CE), após a seleção por citometria de fluxo; /CD31+ pós sorting;
9. Geração ex-vivo de células endoteliais humanas a partir de células
progenitoras endoteliais AC133+ isoladas da medula óssea e sangue do
cordão umbilical;
10. Caracterização morfológica e fenotípica de células endoteliais/CD31+;
11. Co-cultivo com contato e sem contato de populações celulares humanas
isoladas por “sorting” e CTM caninas com células endoteliais;
12. Análise morfológica, imunofenotípica e de expressão gênica das populações
celulares antes e após o co-cultivo com células endoteliais;
13. Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” de populações celulares
isoladas por “sorting”, antes e após o co-cultivo com células endoteliais em
modelos de implantes de matrigel em camundongos NOD/SCID utilizando
métodos não invasivos (Sistema IVIS);
14. Caracterização dos capilares dos implantes por microscopia confocal;
15. Avaliação do potencial angiogênico “in vivo” das células endoteliais após a
indução da isquemia de membros inferiores, em camundongos NODSCID por
microscopia confocal.
Sub-projeto 12: “Comparação da expressão de proteínas de células tronco
mesenquimais humanas obtidas da medula óssea e da veia do cordão umbilical”
Coordenador: Lewis Joel Greene
1. Obtenção de células tronco mesenquimais humanas a partir da medula óssea
e da veia do cordão umbilical e expansão dessas células in vitro.
2. Caracterização imunofenotípica e diferenciação das CTMs em osteócitos e
adipócitos.
27
3. Extração e quantificação das proteínas citoplasmáticas solúveis das CTMs.
4. Eletroforese bidimensional e comparação das proteínas presentes nos
extratos de CTMs com marcadores fluorescentes do DIGE.
5. Análise quantitativa dos géis 2D pelo software DeCyder.
6. Identificação das proteínas nos “spots” de interesse por espectrometria de
massas (MALDI-TOF-TOF) obtidos do gel preparativo após digestão com
tripsina e busca em bancos de dados.
7. Análise das proteínas com diferenças quantitativas e qualitativas através dos
bancos de dados com o Gene Ontology.
8. Comparar os resultados obtidos por Proteoma aos já publicados por SAGE.
Sub-projeto
13:
“Diferenças
na
expressão
gênica
e
de
marcadores
imunofenotípicos em células epiteliais amnióticas obtidas na presença e na
ausência de componentes de origem animal”
Coordenador: Wilson Araújo da Silva Jr
1. obter populações de células epiteliais amnióticas por dois métodos
diferentes de isolamento e cultivo;
2. avaliar por citometria de fluxo a expressão de marcadores típicos de célulastronco embrionárias nas duas populações celulares;
3. comparar por citometria de fluxo a expressão de marcadores de superfície
relacionados com a imunogenicidade e efeito imunomodulador atribuído a
estas populações celulares;
4. comparar o perfil de expressão gênica das duas populações celulares por
microarrays;
5. comparar o potencial de diferenciação destas células em linhagens derivadas
das três camadas germinativas: endoderme (diferenciação hepática),
28
mesoderme (diferenciação cardiomiogênica) e ectoderme (diferenciação
neurogênica)
Sub-projeto 14: “Isolamento e caracterização funcional de células-tronco
pluripotentes - side population”
1. Isolamento de células-tronco “side population” da medula óssea, veia do
cordão e capilares cerebrais (dia 0);
2. Isolamento de células “side population” a partir de culturas de célulastronco mesenquimais isoladas da medula óssea, veia do cordão e capilares
cerebrais utilizando o protocolo clássico de aderência ao plástico;
3. Avaliar a freqüência de células-tronco “side population” na medula óssea,
veia do cordão e capilares cerebrais no dia 0;
4. Avaliar a freqüência de células “side population” nas culturas de célulastronco mesenquimais isoladas pelo protocolo clássico de aderência ao
plástico;
5. Cultivar células-tronco “side-population”, isoladas no dia 0, e a partir de
culturas de células-tronco mesenquimais em três meios de cultivo: a) meio
MSC; b) meio HSC e c) meio hES;
6. Caracterização morfológica e imunofenotípica das células-tronco “side
population” antes e após o cultivo nos diferentes meios de diferenciação;
7. Potencial de diferenciação em adipócito, osteócito e condrócito de célulastronco “side population” isoladas da medula óssea, veia do cordão e
capilares cerebrais;
8. Caracterização do perfil de expressão gênica funcional (RT-PCR e Microarray)
das células-tronco “side population” antes e após o cultivo nos diferentes
meios de diferenciação;
29
9. Desenvolvimento de modelos animais para estudo do potencial vasculogênico
das células-tronco “side population” e células diferenciadas: a) modelo de
transplante de medula e b) modelo de implante de células em matrigel
Sub-projeto 15: “Avaliação Funcional de microRNAs na diferenciação de células
mesenquimais estromais multipotentes humanas”
1. Isolamento e expansão de células tronco mesenquimais a partir de medula
óssea;
2. Diferenciação em osteoblastos;
3. Quantificação do nível de expressão de miRNAs maduros em diferentes
tempos da diferenciação em osteoblastos;
4. Identificação dos potenciais genes alvos para os miRNAs eleitos utilizando
algoritmos como miRanda e RNAhybrid;
5. Análise funcional de miRNAs diferencialmente expressos.
Sub-projeto 16: “Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação
osteogênica in vitro em amostras de pacientes portadores de Osteogênese
Imperfeita”
Coordenador: Wilson Araújo da Silva Jr
1. Analisar o perfil de expressão gênica pela técnica de microarray em célulastronco mesenquimais em pelo menos quatro tempos de diferenciação
osteogênica. Essa análise será aplicada individualmente em duas amostras
processadas de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita e de
indivíduos controles (não portadores da doença).
30
2. Selecionar genes com padrão de expressão distinta da amostra controle para
validação por PCR quantitativo em tempo real;
3. Realizar experimentos funcionais para avaliar se processos biológicos como
proliferação celular, migração, apoptose, viabilidade e morte celular, estão
afetados durante a osteogênese de pacientes com Osteogênese Imperfeita;
4. Identificar as vias gênicas que podem ser afetadas na Osteogênese
Imperfeita após análise conjunta dos experimentos citados nos itens
anteriores.
Sub-projeto 17: “Análise gênica, protéica e funcional de células-tronco
mesenquimais de pacientes com doenças auto-imunes”
http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/pdf/17.pdf
Coordenador: Julio Cesar Voltarelli
1. Isolar, expandir e caracterizar as CTMs (unidades formadoras de colônia
fibroblastóides, imunofenotipagem, capacidade proliferativa, tempo de
duplicação celular) isoladas da medula óssea de pacientes com DM-1 e EM;
2. Avaliar a capacidade imunossupressora das CTMs em ensaios de co-cultivo
com linfócitos T;
3. Avaliar o efeito da imunossupressão em altas doses sobre as CTMs;
4. Analisar a expressão gênica em larga escala das CTMs pela técnica de cDNA
microarrays;
5. Analisar a expressão protéica em larga escala das CTMs pela técnica de gel
de eletroforese bidimensional;
6. Validar os resultados de expressão gênica obtidas por cDNA microarrays pelo
método de RT-PCR em Tempo Real;
7. Estudar alguns genes/proteínas relevantes, cuja expressão revelar-se
alterada nos estudos de expressão gênica e protéica em larga escala, por
meio de estudos funcionais com RNA de interferência.
31
Sub-projeto 18: “Determinação dos níveis de algumas proteínas relacionadas ao
processo apoptótico e controle do ciclo celular de células precursoras
hematopoéticas normais e células precursoras”
1. Isolamento, separação, caracterização e tratamento das células precursoras
normais, células-tronco leucêmicas e blastos leucêmicos;
2. Padronização de géis;
3. Análise dos spots por densiometria;
4. Imunodetecção das proteínas envolvidas no processo apoptótico utilizando
anticorpos monoclonais ou policlonais específicos;
5. Identificação
das
proteínas
reconhecidas
por
Western
blotting
por
espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-MS/MS;
6. Análise dos resultados por uso de bioinformática
Sub-projeto 19: “O papel da disquerina na diferenciação das células
hematopoéticas”
Coordenador: Eduardo Magalhães Rego
1. Avaliar o papel da disquerina nas células tronco hematopoéticas comparando
CTH de camundongos mutantes para Dkc1 ou selvagens, quanto a sua
capacidade de repovoar receptores C57/BL6 letalmente irradiados;
2. Avaliar o papel da disquerina na diferenciação do precursor linfóide mais
imaturo por ensaios de repopulação competitivos utilizando camundongos
rag-/-, os quais não apresentam células T e B maduras no sangue periférico;
32
3. Quantificar a expressão do gene Dkc1 por PCR em Tempo Real.em
precursores isolados por FAC Sorting da MO de camundongos Dkc1m e
selvagens;
4. Analisar apoptose e crescimento celular dos progenitors linfóides Dkcm
comparadas as células correlatas dos animais selvagens
Sub-projeto 20: “Modelo de Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops
(Cercopithecus aethiops) Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas
com Vetor Retroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10”
Coordenador: Eduardo Magalhães Rego
1. Estabelecer modelo de leucemia aguda em Chlorocebus aethiops Usando
Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com Vetor Retroviral Contendo
o Gene Híbrido CALM-AF10
2. Estabelecer protocolo de coleta e cultura de células tronco hematopoéticas
de medula óssea
3. Estudar as características hematológicas, citogenéticas e moleculares
4. Determinar protocolo de imunossupressão e transplante de medula óssea
5. Estabelecer o modelo de expressão de genes por vetor retroviral em células
tronco hematopoéticas da medula óssea de Chlorocebus aethiops
6. Estudar
as
alterações
hematológicas,
citogenéticas
e
moleculares
decorrentes da expressao retroviral o gene CALM-AF-10 em células da
medula óssea de Chlorocebus aethiops após transplante autólogo.
7. Estabelecer protocolo de tratamento de leucemias em Chlorocebus aethiops.
33
Sub-projeto 21: “Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco
mesenquimais na regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura
térmica extensa em modelo animal”
Coordenador: Júlio César Voltarelli
1. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas e
alogênicas;
2. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs administradas por
via tópica e/ou via sistêmica;
3. Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas
selvagens (Gal-1+/+) ou destituídos do gene da galectina 1 (Gal-1-/-);
4. Avaliar a gravidade da queimadura e o processo de regeneração tecidual por
análises histopatológicas das biópsias das úlceras;
5. Analisar a expressão gênica e a expressão in situ de fatores angiogênicos,
fatores de crescimento, metaloproteinases, quimiocinas e citocinas em
biópsias das úlceras;
6. Analisar a expressão protéica diferencial por abordagem proteômica das
biópsias das úlceras.
Sub-projeto
22:
“Uso
de
celulas-tronco
mesenquimais
modificadas
geneticamente para expressão do fator IX em modelos murinos portadores de
Hemofilia B”
1. Isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais hepáticas murinas;
2. Cultivo,
expansão
e
caracterização
da
linhagem
de
célula-tronco
mesenquimal hepática humana LX2;
34
3. Modificação gênica de pericitos murinos (mCTM/FIX) e linhagem LX-2
humano (hLX-2/FIX) com o fator IX recombinante utilizando o sistema
retroviral;
4. Clonagem celular das linhagens celulares mCTM/FIX e hLX-2/FIX para a
obtenção de um clone com elevados níveis da proteína recombinante;
5. Caracterização das linhagens recombinantes mCTM/FIX e hLX-2/FIX quanto o
nível de expressão do mRNA relativo ao FIX por RT-PCR em tempo real e
nível de proteína presente no citoplasma por ELISA;
6. Avaliação da atividade biológica do fator IX recombinante presente no
sobrenadante destes clones celulares pelo teste in vitro de coagulação
sangüínea APTT (tempo de tromboplastina parcial ativada);
7. Infusão dos clones recombinantes mCTM/FIX e hLX-2/FIX em camundongos
hemofílicos portadores de hemofilia B;
8. Avaliação da cinética in vivo do fator IX recombinante em diferentes tempos
após a infusão;
9. Avaliação da enxertia da linhagem recombinante no tecido murino;
10. Avaliação
da
manutenção
do
período
de
expressão
da
proteína
recombinante.
Sub-projeto 23: “Desenvolvimento de um bioprocesso para expansão de
Células-Tronco Mesenquimais em microcarregadores”
1. Isolamento, cultivo e expansão em cultura estática de células-tronco
mesenquimais da medula óssea e da parede da veia umbilical como
procedimento de referência (controle);
2. Cultivo das CTM em biorreator “spinner” com microcarregador;
35
3. Comparar as CTM cultivadas em microcarregador em biorreator “spinner” e
cultura estática utilizando cinco parâmetros: a) morfologia; b) perfil
imunofenotípico; c) perfil citogenético; d) potencial de diferenciação em
adipócitos, osteócitos e condrócitos e e) perfil de expressão gênica;
4. Comparar a eficiência do cultivo de CTM em biorreator “spinner” e cultura
estática quanto: a) potencial de expansão (número de duplicações da
população inicial); b) velocidade de expansão (tempo de duplicação); c)
viabilidade celular e d) atividade metabólica (consumo de glicose, produção
de lactato, produção de amônia, entre outros);
Sub-projeto 24: “Proteômica funcional: estudos do papel da nucleofosmina na
gliomagênese”
1. Extensão dos estudos de obtenção de mapas bidimensionais de proteínas por
eletroforese bidimensional das amostras de novos pacientes.
2. Identificação de proteínas por espectrometria de massas por MALDI-TOF-TOF
3. Introdução da estratégia proteômica de Shotgun peptide sequencing
complementando os dados obtidos por gel bidimensional.
4. Ensaios de proliferação, migração e apoptose sob estímulos por EGF em
linhagens celulares T98G e U87MG.
5. Obtenção de mapas bidimensionais de extratos protéicos das linhagens
celulares T98G e U87MG sob estímulo de EGF.
6. Identificação
de
proteínas
diferencialmente
expressas
entre
células
estimuladas por EGF e não-estimuladas.
7. Silenciamento ou modulação da expressão do gene de nucleofosmina por
RNA de interferência (RNAi) em linhagens celulares T98G e U87MG com ou
sem estímulo por EGF e estudo funcional (ensaios de proliferação, migração
e apoptose)
36
8. Obtenção de mapas bidimensionais de extratos protéicos das linhagens
celulares T98G e U87MG sob estímulo de EGF e silenciadas para NPM.
9. Estudo das proteínas encontradas como diferencialmente expressas no item
“e” em células estimuladas por EGF e silenciadas para NPM.
Sub-projeto 25: “Ferramentas de citogenômica aplicadas à investigação da
instabilidade cromossômica na leucemia linfocítica crônica (LLC)”
Coordenador: Roberto Passetto Falcão
1. Obtenção de células metafásicas para aplicação da técnica de SKY
2. Hibridação das células metafásicas para análise espectral (Applied Spectral
Imaging)
3. Extração de DNA do sangue de paciente e indivíduos controle e avaliação de
alterações no número de cópias de regiões genômicas pelo método de
arrayCGH utilizando a plataforma Agilent.
4. Identificação e caracterização de pontos de quebra, associados à presença
de alterações cromossômicas e detecção e identificação de possíveis genes
envolvidos
5. Identificação de deleções submicroscópicas em pacientes com cariótipo
normal.
Sub-projeto 26: “Centro de estudos pré-clínicos e banco de células-tronco
animais”
Coordenador: Maria Angélica Miglino
1. Identificação, isolamento, e teste dos meios de cultivo ideal nas células do
neuroepitélio olfatório;
37
2. Obtenção de métodos de diferenciação celular e estabelecimento dos
marcadores ideais para células oriundas do epitélio olfatório;
3. Isolamento e caracterização de células tronco mesenquimais dos líquidos
amniótico e vitelino de fetos caninos para serem utilizadas no tratamento de
“defeitos” genéticos, ainda em meio intra-uterino.
4. Elaboração de um protocolo para genotipagem através de líquido amniótico
e saco vitelino de embriões/fetos de cães para detectar se há alterações
genéticas ainda em período pré-natal,
5. Estudo do potencial de diferenciação in vitro das células tronco
mesenquimais dos líquidos amniótico e vitelino de fetus caninos, assim como
a injeção intra-uterina e o estudo da sua biodistribuição nos fetos assim
como a diferenciação para os diversos tipos de células; avaliação da resposta
imunológica nos pacientes em períodos distinos após a injeção.
6. Aplicação das células de polpa de dente decíduo em pacientes com a
deficiência límbica total resistente ao tratamento cirúrgico convencional, no
modelo animal. Avaliação da resposta imunológica pós injeção.
7. Reconstrução de defeitos ósseos críticos realizados em tíbias de ovelhas com
o complexo 3-D, caracterizando-o por imunohistoquímica a diferenciação de
suas células.
8. Quantificação mediante histomorfometria, da presença de osteoblastos e
osteócitos presentes no complexo 3-D selecionado, após aplicação in vivo.
9. Obtenção de culturas primárias de osteossarcomas caninos e de felinos;
10. Caracterização das culturas de células tumorais – capacidade proliferativa e
marcadores celulares;
11. Terapia regenerativa “in vitro” de osteossarcoma canino;
12. .Estabelecimento de cultivo de células trofoblásticas extravilosas humanas.
13. .Produção de vírus recombinantes dos vetores retrovirais derivados do
Moloney Murine Leukemia Vírus (MoMLV) carregando os genes repórteres
LacZ e eGFP.
38
14. Transdução das células-tronco obtidas de placenta com vetores retrovirais
carregando os genes repórteres LacZ e eGFP e analisar a expressão desses
genes in vitro.
15. Avaliação da rastreabilidade das células transduzidas em camundongos mdx
e imunossuprimidos, seu potencial de diferenciação e marcação nos
diferentes órgãos e sua patogenicidade.
16. Rastreamento das células-tronco implantadas nos camundongos após
eutanásia e análise histopatológica do tecido usando o produto dos genes
repórteres LacZ e eGFP .
17. Avaliação histológica e clinica do potencial terapêutico das células-tronco
TEV no tratamento da Distrofia Muscular em camundongos mdx.
18. Analise do potencial de imunomodular a resposta imunológica contra as
células células trofoblásticas extravilosas humanas.
19. Aquisição de conhecimento nas técnicas especificas de cultivo e expansão
em bioreatores em colaboração com a equipe do Prof. Dr. Dimas T. Covas
(Kamilla Swiech);
20. Estabelecimento de células “side population” oriundas do saco vitelino e
fígado
canino
no
sentido
de
testar
seu
potencial
vasculogênico.
Caracterização morfológica, fenotípica e de expressão gênica utilizando
marcadores específicos para estas células. Estabelecimento de modelo de
isquemia cerebral em modelo animal, estabelecimento “in vitro” das
interações
moleculares
das
relações
mesenquimais
endoteliais,
em
colaboração com a pesquisadora Aparecida Maria Fontes (equipe do Prof. Dr.
Dimas Tadeu Covas).
21. Teste em lesões espinais crônicas (modelo canino) da aplicação das células
iPS (induced pluripotent stem cells) em colaboração com a pesquisadora
Aparecida Maria Fontes (equipe do Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas)
22. Injeção de pericitos e células-tronco mesenquimais de camundongos Rosa26
em blastocistos, murinos para avaliação da capacidade de integração desses
tipos celulares em diversos tecidos do embrião; em parceria com Dr.
Lindolfo da Silva Meirelles (Dra. Irina Kerkis)
39
23. Injeção de células neurais marcadas com GFP provenientes de células
embrionárias ou pluripotentes em modelo canino portador de lesão medular
crônica, e ou modelos murinos portadores de lesões induzidas, no sentido de
verificar a adesão destas células no tecido lesionado, formando as conexões
sinápticas necessárias ao restabelecimento das funções em colaboração com
a Dra. Adriana Santos Moreno (equipe do Prof. Dimas T. Covas).
24. Estudo dos mecanismos envolvidos na osteogênese imperfeita em modelos
animais, visandoo estabelecimento de modelo ideal para terapia gênica Em
colaboração com a doutoranda Carla Kaneto, orientada pelo Prof. Dr. Wilson
Araujo
Sub-projeto 27: “Disponibilização de primatas neotropicais (novo mundo) e da
espécie Chlorocebus aetiops (espécie do velho mundo) para pesquisas com
células-tronco adultas e embrionárias como modelo biológico para terapias
celulares”
Coordenador: Klena Sarges Marruaz da Silva
1. Revelar bons modelos biológicos para pesquisas com células-tronco.
2. Estabelecer protocolos clínicos e pré-clínicos de utilização de primatas
neotropicais e da espécie Chlorocebus aethiops em testes pré-clínicos de
pesquisas com terapia utilizando células-tronco.
Sub-projeto 28: “Tratamento de diabetes mellitus tipo 1 com infusão de
células-tronco mesenquimais”
1. Avaliar a segurança (efeitos tóxicos, complicações infecciosas e neoplásicas,
Avaliar a segurança (efeitos tóxicos, complicações infecciosas e neoplásicas,
mortalidade) da infusão endovenosa de CTMs alogênicas de doador
40
relacionado em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1 recémdiagnosticado;
2. Avaliar o efeito terapêutico das CTMs sobre a lesão auto-imune no pâncreas
endócrino em humanos (níveis de glicemia de jejum, de peptídeo-C e de
hemoglobina glicosilada antes e após a infusão das CTMs; necessidades de
insulina exógena antes e após a infusão das CTMs);
3. Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células
T naive, células T de memória, células NKT e células T CD4+ e CD8+
reguladoras; dosagem de citocinas no soro; repertório de células T;
freqüência de células T auto-reativas anti-células β pancreáticas) nos
pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs;
4. Avaliar os mecanismos imunológicos envolvidos na resposta terapêutica
(modulação da resposta imune patogênica pelas CTMs no pâncreas e baço
dos animais; papel de células T reguladoras) de camundongos diabéticos NOD
(modelo de diabetes geneticamente determinado; fase inicial da doença) e
C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes induzido
quimicamente; fase inicial da doença) à infusão de CTMs humanas;
5. Avaliar os mecanismos regenerativos envolvidos na resposta terapêutica
(papel das CTMs humanas infundidas na regeneração do tecido pancreático
pela análise da fusão das CTMs humanas com células β pancreáticas murinas)
de camundongos diabéticos NOD (modelo de diabetes geneticamente
determinado) e C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes
induzido quimicamente) à infusão de CTMs humanas.
Sub-projeto 29: “Tratamento de esclerose múltipla com células-tronco
hematopoéticas: avaliação da resposta clínica e dos mecanismos imunológicos
de ação”
41
1. Determinar se a IAD/TACTH pode interromper a evolução das formas surtoremissiva da esclerose múltipla refratárias à terapia imunomoduladora com
Interferon; avaliar a eficácia da IAD/TACTH em comparação com tratamento
convencional (Interferon, Copaxone ou Mitoxantrone) nesse grupo de
pacientes.
2. Determinar os efeitos adversos do TACTH (complicações
graves e
mortalidade) na esclerose múltipla surto-remissiva.
3. Avaliar a expressão gênica diferencial em larga escala, por análises de
microarrays, de linfócitos T CD4+ e CD8+ do sangue periférico dos pacientes
com esclerose múltipla surto-remissiva, isolados antes e após terapia com
IAD/TACTH;
4. Validar os resultados de expressão gênica obtidas por cDNA microarrays pelo
método de RT-PCR em Tempo Real;
5. Estudar alguns genes relevantes, cuja expressão revelar-se alterada nos
estudos de expressão gênica e protéica em larga escala, por meio de estudos
funcionais com RNA de interferência.
Sub-projeto 30: “Uso de Células-Tronco Mesenquimais no Tratamento e
Prevenção da Doença do Enxerto contra o Hospedeiro em pacientes submetidos
ao transplante de células-tronco hematopoéticas”
1. Isolamento e expansão em larga escala de células-tronco mesenquimais;
2. Determinação do número de unidades formadoras de colônias (CFU-F) para
quantificação do número de células progenitoras;
3. Caracterização do perfil imunofenotípico, perfil citogenético, capacidade de
diferenciação, e potencial imunomodulador;
4. Realizar a infusão de 1-2 x 106 CTM/Kg da massa corporal do paciente em
pacientes que desenvolveram a DECH agudo;
42
5. Realizar a infusão de 1-2 x 106 CTM/Kg da massa corporal do paciente
juntamente com a infusão das CTH da medula óssea;
6. Análise do tempo de enxertia da medula da óssea;
7. Análise da recuperação imunológica e ativação linfocitária por citometria de
fluxo para linfócitos T, B, NK e células de memória;
8. Quantificação de imunoglobulinas séricas;
9. Avaliação do desenvolvimento da DECH aguda e crônica;
10. Avaliação do quimerismo das células T e células-tronco mesenquimais.
43
Linhas de Pesquisa e Subprojetos
Estudos com Células-tronco Pluripotenciais
Células-tronco pluripotenciais são capazes de originar células e tecidos dos
três folhetos embrionários: ectoderma, mesoderma e endoderma. Em virtude
destas características estas células são as mais atraentes do ponto de vista
terapêutico pois funcionariam em uma ampla gama de doenças. Células com este
potencial podem ser obtidas da massa interna do blastocisto, da prega gonadal de
fetos de 6 a 9 semanas e de teratocarcinomas em adultos. Recentemente, célulastronco pluripotenciais foram obtidas a partir de fibroblastos maduros pela inserção
de genes considerados indutores da pluripotencialidade (Oct4, c-myc, Klf4 e Sox2)
o que originou as chamadas células-tronco induzidas (IPS). Na presente proposta do
INCTC, um dos focos de estudos serão as células-tronco pluripotenciais derivadas
da massa celular interna tanto de humanos como de animais e as IPS. Para tanto,
estamos reunindo quatro grupos de pesquisadores brasileiros que possuem
experiência anterior comprovada nesta área. O primeiro grupo é liderado pela Dra.
Lygia da Veiga Pereira, docente do Instituto de Biociências da Universidade de São
Paulo que tem experiência na derivação de células-tronco embrionárias e de outras
células-tronco pluripotenciais como as derivadas da polpa dentária (Sukoyan, Kerkis
et al., 2002; Kerkis, Kerkis et al., 2006). O segundo grupo é liderado por Stevens K.
Rehen da Universidade Federal do Rio de Janeiro que possui grande experiência no
cultivo e na diferenciação neural da CTE (Mcconnell, Kaushal et al., 2004;
Kingsbury, Friedman et al., 2005; Rehen, Yung et al., 2005; Rehen, Kingsbury et
al., 2006). A este núcleo inicial se incorpora o grupo da Faculdade de Zootecnia de
Pirassununga da USP que possui
experiência na derivação de células-tronco
embrionárias, em embriologia, e em técnicas de manipulação do ovócito, incluindo
a transferência de núcleo somático e a manipulação do conteúdo mitocondrial do
zigoto (Meirelles e Smith, 1998; Meirelles, Bordignon et al., 2001; Meirelles,
Caetano et al., 2004; Ripamonte, Merighe et al., 2005; Ferreira, Meirelles et al.,
2007; Miglino, Pereira et al., 2007; Biase, Fonseca Merighe et al., 2008; Paneto,
Ferraz et al., 2008). Ainda, soma-se à experiência dos citados grupos, a
experiência do grupo de Ribeirão Preto no cultivo, caracterizacão e expansão de
44
células-tronco em condições de good manufacturing practices (GMP) e na
introdução de genes heterológos em linhagens celulares (Covas, Siufi et al., 2003;
Silva, Covas et al., 2003; Panepucci, Siufi et al., 2004; Covas, Piccinato et al.,
2005; Pereira, Faca et al., 2005; Carrara, Orellana et al., 2007; Picanco, Heinz et
al., 2007; Covas, Panepucci et al., 2008; Picanco-Castro, Fontes et al., 2008;
Picanco-Castro, Russo-Carbolante et al., 2008).
Este conjunto de laboratórios e pesquisadores possuem experiências e
competências complementares o que permitirá a consolidação de um forte grupo
nacional dedicado ao estudo de células-tronco embrionárias e induzidas (IPS) e,
com certeza, colocará o Brasil entre os países que estão na vanguarda neste
campo.
Frente o exposto, o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira da
USP de São Paulo através do sub-projeto 1, intitulado “Avaliação da estabilidade
epigenética de linhagens de células-tronco embrionárias estabelecidas em
diferentes condições”, terá como objetivo geral, avaliar o estado epigenético de
novas linhagens de CTEs humanas estabelecidas em diferentes condições, e
caracterizar sua plasticidade in vitro e in vivo. Alem disso, as células de
trofoblastos retiradas do blastocisto durante o isolamento serão utilizadas para o
estudo do início do processo de inativação do cromossomo X. Para isso, as seguintes
abordagens técnicas serão utilizadas: micromanipulação de blastocistos humanos
para isolamento de ICM e trofoblastos; cultivo de ICM; imunofluorescência e FACS
com
marcadores
de
células
pluripotentes
(OCT4,
NANOG,
SSEA-1,2,3,4);
diferenciação em corpos embrióides e caracterização por imunofluorescência;
formação de teratomas em camundongos SCID; análise do estado de atividade do
cromossomo X em CTEh 46,XX pré e pós-diferenciação; FISH para detecção do RNA
de XIST; ChIP para histonas modificadas; expressão alelo-específica de genes no X;
análise de metilação global de DNA das CTEh por microarray de metilação.
Os ensaios pré-clínicos e a perspectiva da terapia celular em humanos
exigem grandes quantidades de células-tronco cultivadas em laboratório. Portanto,
definir condições ótimas de cultivo tanto em pequena, quanto em larga escala,
será importante para a viabilização desses e outros procedimentos a serem
desenvolvidos.
45
Poucos avanços são reportados, ainda, no que se refere à propagação em
larga escala de células-tronco embrionárias (Thomson, 2007) e a otimização das
condições de cultivo é normalmente realizada em placas estáticas, ou seja, em
pequena escala. Entretanto, tal procedimento necessita de passagens seriadas, o
que dificulta o controle adequado da fisiologia celular, levando as células a
sofrerem interferência do manipulador/pesquisador com frequência, aumentando
os riscos de contaminação e tornando sua expansão um processo árduo e custoso.
Por estas razões, faz-se necessário desenvolver novos métodos de expansão de
células-tronco embrionárias humanas, que permitam um controle adequado das
condições ambientais, de modo que o cultivo em larga escala preserve as
características fenotípicas mantendo as células-tronco embrionárias humanas como
população homogênea e pluripotente. Cultivos em sistemas agitados mostram-se
especialmente promissores, uma vez que proporcionam um ambiente homogêneo,
no qual condições ambientais tais como pH, teor de oxigênio e temperatura podem
ser continuamente monitorados e controlados, viabilizando um melhor controle da
fisiologia celular. Além disso, um sistema agitado, por si só já elimina a
heterogeneidade intrínseca ao ambiente da placa, uma superfície estática de
cultivo, uma vez que a circulação do meio de cultivo faz com que todas as células
sejam expostas a um microambiente mais homogêneo. Devido à sua reconhecida
dependência na adesão célula-célula e formação de agregados para proliferação,
duas alternativas se colocam para o cultivo de células-tronco embrionárias em
sistemas agitados: o cultivo em suspensão na forma de agregados e corpos
embrióides, ou o cultivo aderido a microcarregadores. Microcarregadores são
partículas porosas, geralmente esféricas, de elevada área superficial e baixa
densidade, que se mantêm em suspensão sob condições brandas de agitação,
servindo como suporte para adesão celular. Torna-se, portanto, extremamente
interessante a análise da viabilidade de células-tronco embrionárias humanas
cultivadas em sistemas agitados, comparando-se diferentes matrizes sobre
microcarregadores e avaliando-se a influência de diferentes substratos na expansão
em larga escala, inclusive para a manutenção de suas características intrínsecas.
Neste sentido, o grupo coordenado pelo Dr. Stevens Kastrup Rehen da
Universidade Federal do Rio de Janeiro através do sub-projeto 2, intitulado
“Propagação de células-tronco embrionárias humanas em biorreatores visando o
aumento de escala para transplantes em doenças degenerativas”, terá como
46
objetivo geral, a expansão em escala de células-tronco embrionárias humanas para
fins de utilização em testes pré-clínicos e clínicos. Para isso, células-tronco
embrionárias humanas, obtidas como doação do Instituto de Pesquisa Scripps
Research dos EUA e da Universidade de Harvard (Cowan, Klimanskaya et al., 2004),
serão inicialmente cultivadas sobre uma monocamada de fibroblastos embrionários
murinos (MEFs; feeder-layer) e então submetidas a diferentes métodos de
propagação para comparação. Serão utilizados sistemas agitados, tanto na forma
de corpos embrióides em suspensão como na presença de microcarregadores
comerciais (Cytodex 1, Cytodex 3 e Cytopore - GE Healthcare). Nos ensaios de
cultivo em sistemas agitados, serão utilizados frascos cônicos (erlenmeyers) e
frascos do tipo spinner (Bellco). Nos ensaios de cultivo em biorreator agitado
automatizado, será utilizado o sistema de biorreator Bioflo 110 (New Brunswick
Scientific), sendo comparado o uso de seu vaso original de geometria convencional
(0,4 a 1 L de volume de trabalho) e de vaso especialmente projetado para o cultivo
de células-tronco (DASGIP, 0,1 L de volume de trabalho). Variáveis operacionais do
processo serão avaliadas, tais como agitação, taxa de aeração e modo de operação
(batelada, batelada alimentada ou perfusão). A cinética do crescimento celular
será avaliada e ensaios imunocitoquímicos e de biologia molecular serão realizados
com o objetivo de avaliar e quantificar a pluripotencialidade e o grau de
diferenciação das células. A concentração total de células nos cultivos será
determinada por contagem dos núcleos celulares ao microscópio em câmara de
Neubauer (método do cristal violeta). As concentrações de glicose e lactato no
sobrenadante serão determinadas usando um analisador automático YSI modelo
2700. A estabilidade cromossômica e outros parâmetros de pluripotencialidade das
CTE cultivadas em biorreatores serão comparadas com CTE cultivadas em condições
padrão (MEFs; feeder-layer) utilizando protocolos e metodologia de análises de
morfologia e cariotipagem desenvolvidos recentemente (Martin, Muotri et al.,
2005). Contagens serão realizadas em cromossomos corados com 4',6-diamidino-2fenilindol (DAPI), seguindo metodologia desenvolvida pela equipe (Rehen,
Mcconnell et al., 2001) num mínimo de 80 spreads de cromossomos. Quando
necessário, cariotipagem molecular e sondas para hibridização in situ fluorescente
(FISH) serão utilizadas (Rehen, Yung et al., 2005). Alterações na proliferação,
diferenciação e sobrevivência de células-tronco embrionárias mantidas plaqueadas
ou em biorreatores serão examinadas através de imunocitoquímica para
47
bromodeoxiuridina (BrdU), phospho H3 (mitose), Tuj-1, caspase-3, Ki67 e
fragmentação de DNA, conforme descrito anteriormente(Rehen, Varella et al.,
1996; Rehen, Neves et al., 1999; Rehen, Mcconnell et al., 2001; Rehen, Kingsbury
et al., 2002; Kingsbury, Rehen et al., 2003).
Apesar do estabelecimento, propagação e caracterização destas linhagens
serem uma etapa fundamental no eventual estabelecimento de protocolos
terapêuticos, para que as CTEh possam ser utilizadas com segurança é necessário
que sejam desenvolvidas abordagens práticas e eficientes para promover a
diferenciação desejada. O sucesso nesta tarefa evitaria o surgimento de células ou
tecidos indesejados, com crescimento descontrolado ou outros comportamentos
não esperados. Assim, o estudo de diferentes processos de diferenciação é
fundamental para a eventual aplicação das CTE na prática clínica.
Diferentes tecidos do indivíduo adulto possuem capacidade de renovação ou
de reparação, como o sangue, a epiderme, e o tecido hepático. A capacidade de
renovação ou reparo de alguns tecidos adultos está relacionado à presença das
chamadas células tronco adultas, dotadas de um potencial de diferenciação mais
restrito. Dentre estas, as células tronco hematopoéticas (CTH) merecem destaque
em virtude do volume de pesquisa teórica e aplicada na medicina. As CTH são
utilizadas há mais de 30 anos como forma de tratamento, na reconstituição do
sistema hematopoético por meio do transplante de medula óssea (MO). Da mesma
forma, o sangue de neonatos que resta no cordão umbilical e placenta (SCU) após o
parto pode ser utilizado como fonte de CTH. O sucesso do transplante depende,
entre outros fatores, da existência e da compatibilidade entre doador e receptor,
já que incompatibilidade neste caso pode resultar na chamada doença do enxerto
contra o hospedeiro ou GVHD (graft versus host disease). Por sua vez, o número de
células disponíveis no sangue do cordão representa uma limitação, que resulta
numa maior demora na restauração do sistema hematopoético, aumentando os
riscos de infecção no paciente. Frente à estas restrições, a produção de CTH a
partir de CTE, representa uma alternativa atraente, que poderia eliminar
restrições dessa ordem. No entanto, CTH derivadas de CTE apresentam diferenças
quanto ao potencial de enxertamento (Shojaei e Menendez, 2008), que refletem
deficiências no potencial de migração (homing) e de repopulação por períodos
longos, e também no potencial de diferenciação, em especial linfocitária (Martin,
Woll et al., 2008). A comparação de CTH derivadas de SCU ou de MO, quanto ao
48
seu perfil de expressão gênica, já foi utilizada com sucesso por nós para
caracterizar diferenças moleculares relacionadas às diferenças biológicas entre
estas células (Panepucci, Calado et al., 2007). De maneira similar, a comparação
entre os perfis de expressão de CTH adultas com as derivadas de CTE poderia
auxiliar no entendimento das bases moleculares responsáveis pelas diferenças
existentes,
permitindo
eventualmente
uma
otimização
dos
processos
de
diferenciação (Martin e Kaufman, 2005).
Neste sentido, o grupo coordenado pelo Dr Dimas Tadeu Covas da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto - USP de Ribeirão Preto através do sub-projeto 3,
intitulado “Bases moleculares da diferenciação hematopoética a partir de CTE”,
terá como objetivo geral, estudar o perfil transcricional de CTE e das CTH
derivadas
destas,
comparando-os
com
o
perfil
obtido
de
CTH
adultas.
Adicionalmente, a diferenciação das CTH (derivadas de CTE ou adultas) em
linfócitos T também será avaliada. Desta forma, as diferenças moleculares
encontradas poderão apontar quais processos de sinalização podem estar
potencialmente ligados às deficiências apresentadas pelas CTH derivadas de CTE.
Com esse objetivo, linhagens comerciais de CTE (ou derivadas em outros projetos)
serão diferenciadas em CTH, utilizando um sistema de co-cultura com células
estromais OP9 (Ji, Vijayaragavan et al., 2008). As CTH serão então selecionadas por
técnicas imunomagnéticas utilizando anticorpos anti-CD34 (MACS, Miltenyi).
Populações de CTH CD34+ de SCU serão obtidas da mesma forma. Estas células
(CTE e CTHs) terão o perfil transcricional obtido utilizando microarrays de
oligonucleotideos cobrindo o genoma humano completo (Agilent). O mesmo RNA
destas células será utilizado para obtenção do perfil de expressão dos microRNAs
(Agilent miRNAarray). Adicionalmente, CTH derivadas de CTE ou de SCU serão
submetidas a um processo de diferenciação em linfócitos T, através da cocultura
com células OP9-DL1 (Martin, Woll et al., 2008). Estas células expressam o ligante
agonista da via NOTCH (Delta-like 1) induzindo à diferenciação. As células
cocultivadas serão também avaliadas quanto à expressão de transcritos de mRNA e
microRNA utilizando microarrays (Agilent). Ferramentas de bioinformática e bases
de dados específicas serão utilizados para integrar as informações obtidas, de
maneira a identificar potenciais mecanismos regulatórios envolvidos nas diferenças
funcionais existentes. Anticorpos específicos serão utilizados para avaliar os
processos de diferenciação, por citometria de fluxo posteriormente. PCR em tempo
49
real será utilizado para validação das diferenças encontradas (tanto de mRNA como
microRNA).
Apesar dos grupos proponentes neste projeto se caracterizarem pela grande
experiência nas técnicas e na base conceitual da área de pesquisa com células
tronco e terapias celular, um dos importantes objetivos desta proposta é a difusão
deste conhecimento. Desta forma, o estabelecimento de novos centros de
pesquisa, que permitam a expansão e o estabelecimento da terapia celular com
células tronco no Brasil é de suma importância. Esta expansão depende da criação
de centros capazes de propagar o conhecimento e as técnicas utilizadas, formando
pessoal especializado na área. Com isto em mente, pretendemos apoiar a
consolidação do grupo sediado no Instituto Evandro Chagas no Pará, como grupo
atuante na pesquisa com células tronco no Brasil. Duas características estratégicas
contribuem para esta iniciativa. Primeiramente, a Seção de Meio Ambiente do
Instituto dispõe de um banco de células primárias cultivadas a partir de biópsias
humanas e de outros mamíferos, oriundos da região Amazônica brasileira. O acervo
do banco é composto de culturas de vários tecidos e órgãos tais como: pele, rim,
epífise, cérebro, córnea, baço e glândula parótida. Da espécie humana, o banco
mantém células de prepúcio, córnea, esclera, coto umbilical e placenta, além de
células tronco obtidas de dente decíduo. Adicionalmente, o Instituto conta com o
Centro Nacional de Primatas, que disponibiliza um plantel de primatas não
humanos, nascidos e mantidos em cativeiro, para experimentação em pesquisas
biomédicas, alem de contar com experiência já estabelecida no manejo clínico e
cirúrgico destes animais. Desta forma, a experiência prévia no cultivo de células de
animais diversos, aliada à proximidade do plantel de primatas, permitirá o
treinamento e implantação com sucesso das técnicas para cultivo de CTE e adultas,
além de permitir o estabelecimento de uma base logística para o uso destes
primatas como modelo experimental (ver subprojeto 27). Desta forma, o
laboratório de cultivo celular da Seção de Meio Ambiente/IEC/ SVS/MS do Instituto
Evandro Chagas mantido por Maria de Fátima Lima de Assis, através do sub-projeto
4, intitulado “Cultura de células tronco adultas e embrionárias de animais e
humanos para uso em terapias celulares”, terá como objetivo geral, estabelecer
linhagens de CTEs de animais, armazená-las, e caracterizá-las. Além de auxiliar nos
estudos utilizando primatas ou células destes animais. Para isso, diferentes
50
integrantes deste grupo terão treinamento especializado nas técnicas dos
diferentes grupos, componentes da presente rede de pesquisa.
51
Células Pluripotenciais Induzidas
Uma vez dominados os processos envolvidos na obtenção, cultivo, e
diferenciação de CTE em células de interesse clínico, outra limitação prática deve
ser levada em conta. Apesar de bancos de CTE poderem ser eventualmente criados,
permitindo o estabelecimento de grandes coleções, elas dificilmente iriam
abranger toda a diversidade existente. Assim, as CTE teriam seu uso restrito a
receptores histo-compatíveis. Uma das alternativas à criação de bancos de CTE
envolve a reprogramação do núcleo de células somáticas (no caso, o paciente sem
doador) pelo citoplasma de um oócito, de forma a obter CTEh autólogas. Esta
abordagem é também conhecida como clonagem terapêutica uma vez que não visa
gerar um indivíduo clonado, mas somente CTE para uso terapêutico.
A reprogramação do núcleo somático induzida pelo citoplasma de oócitos
resulta da presença de diferentes moléculas, incluindo fatores de transcrição e
outras
proteínas.
Recentemente,
vários
grupos
relataram
a
indução
de
pluripotência em fibroblastos primários humanos através da transdução dos
mesmos com vetores virais expressando os genes OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As
chamadas
células-tronco
pluripotentes
induzidas
(iPS)
têm
morfologia
característica de CTEs, expressam marcadores de células pluripotentes e são
capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos três folhetos
embrionários. Assim, a geração de iPS a partir da indução de células somáticas por
fatores específicos, poderia representar uma alternativa para a obtenção de
células tronco histo-compatíveis.
Os resultados preliminares obtidos pelo grupo coordenado pelo Dr. Dimas
Tadeu Covas do Hemocentro de Ribeirão Preto mostram a eficiência na produção
de
vetores
lentivirais,
na
transdução
de
células-tronco
mesenquimais
e
progenitores endoteliais e na modificação do padrão de expressão de célulastronco endoteliais com gene Nanog. Assim, este grupo, através do sub-projeto 5,
intitulado “Modificação gênica de células-tronco”, terá como objetivo geral,
modificar geneticamente Células Tronco Mesenquimais (CTM) e células progenitoras
endoteliais com vetores lentivirais contendo fatores de transcrição, com o intuito
de transformar células multipotentes em células pluripotentes e com maior
capacidade de expansão in vitro. Para tanto, o projeto envolverá as seguintes
abordagens: a) transduzir CTM com vetores lentivirais 1054-CIGWS contendo um dos
52
fatores de transcrição (Nanog, Oct3/4, Sox 2, β-catenina, Kfl4, c-myc, Esrrb, Tcl 1e
Tbx 3) juntamente com o gene GFP para que as células transduzidas possam ser
selecionadas por citometria de fluxo (GFP positivas); b) Inicialmente, as
transduções de CTM serão realizadas com um fator de transcrição de cada vez e
posteriormente um conjunto de quatro vetores serão utilizados para transdução; c)
avaliar as alterações causadas no perfil de expressão gênica; d) avaliar mudanças
na morfologia das células transformadas; e) determinar se as células modificadas
apresentam marcadores típicos de células-tronco embrionárias (como por exemplo:
fosfatase alcalina e/ou antígenos SSEA-1) e por fim avaliar se estas células
modificadas adquirem a capacidade de se diferenciar em tecidos dos três folhetos
germinativos.
Uma grande limitação dos estudos pré-clínicos com CTEs é a falta de
modelos animais de grande porte onde se possa realizar esses testes, uma vez que
uma série de dificuldades técnicas e biológicas dificultam e/ou impedem o
estabelecimento de CTEs a partir de embriões desses modelos. Com isto em mente,
o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira da USP de São Paulo através
do sub-projeto 6, intitulado “Estabelecimento de linhagens de células tronco
pluripotentes induzidas (iPS) de modelos animais de grande porte”, pretende
desenvolver uma metodologia para estabelecer linhagens de iPS de modelos
animais de grande porte, especificamente de primatas não-humanos e cães. As
células geradas serão utilizadas em ensaios pré-clínicos de lesão de medula
espinhal nos respectivos modelos animais. Para este fim: vetores lentivirais da
empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293 por co-transfecção
transiente com vetores de empacotamento; culturas de fibroblastos caninos e de
macacos serão transduzidos com lentivírus expressando o gene repórter GFP para
avaliação de eficiência de transdução com diferentes sistemas de empacotamento;
transdução dos fibroblastos animais com vetores de indução de acordo com as
condições estabelecidas acima, e isolamento de iPS em meio de cultura específico
para CTE (caso não consigamos estabelecer as iPS usando vetores com genes
humanos de indução, serão isolados os homólogos de cada espécie por RT-PCR de
embriões pré-implantação, e novos vetores espécie-específicos serão construídos e
utilizados
para
indução);
caracterização
da
pluripotência
das
iPS
por
imunofluorescência, diferenciação in vitro em corpos embrióides e in vivo por
ensaio de formação de teratomas; diferenciação neural das iPS animais por cultura
53
em meio com acido retinóico; transplante das células diferenciadas em modelos de
lesão de medula.
Apesar de ainda inadequadas para uso clínico, as iPS são uma ferramenta
importante de pesquisa básica, principalmente aquelas células derivadas de
indivíduos com diferentes doenças genéticas. Assim, o grupo coordenado pela Dra.
Lygia da Veiga Pereira através do sub-projeto 7, intitulado “Estabelecimento de
linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de fibroblastos
de pacientes com doenças genéticas mendelianas e multifatoriais (com
componente genético)”, pretende implantar a metodologia de geração de iPS
humanas de forma a poder estabelecer iPS a partir de diferentes tecidos de
pacientes com doenças genéticas de interesse do grupo, particularmente pacientes
com displasia óssea, diabetes tipo I, esclerose múltipla e leucemia promielocitica
aguda. As iPS estabelecidas servirão como modelo experimental para o estudo dos
mecanismos básicos por trás das respectivas doenças. Além disso, serão construídos
novos vetores baseados em adenovirus, que não se integram ao genoma, de forma
a gerarmos iPS não modificadas geneticamente, mais adequadas para o uso clínico.
Com esta finalidade, as seguintes abordagens experimentais serão utilizadas:
vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293
por
co-transfecção
transiente
com
vetores
de
empacotamento;
células
mesenquimais de medula óssea de pacientes com diabetes tipo 1 e de leucemia
PMA congeladas serão expandidas em cultura para transdução com vetores virais;
padronização de estabelecimento de linhagem de células adequadas para indução a
partir de sangue periférico humano; transdução das células humanas com vetores
lentivirais e seleção de células iPS em meio de cultura de CTEhs; caracterização
das iPS por imunofluorescência e FACS com marcadores de células pluripotentes
(OCT4,
NANOG,
SSEA-1,2,3,4);
diferenciação
em
corpos
embrióides
e
caracterização por imunofluorescência; formação de teratomas em camundongos
SCID;
caracterização
da
pluripotência
das
iPS
por
imunofluorescência,
diferenciação in vitro em corpos embrioides e in vivo por ensaio de formação de
teratomas.
Apesar das técnicas de indiferenciação induzida pela incorporação de fatores
de transcrição no genoma de células somáticas (Takahashi e Yamanaka, 2006)
constituírem possíveis aliados à terapia celular autóloga, é importante ressaltar
neste contexto que a aplicação prática de células induzidas à diferenciação pela
54
modificação genética ainda precisa ser melhor estudada e avaliada (Liu, 2008). Por
outro lado, a técnica de transferência de núcleo (TN) é bem estabelecida e já se
mostrou capaz de produzir animais saudáveis a termo, confirmando a capacidade
eficiente de reprogramação de uma célula diferenciada (Wilmut, Schnieke et al.,
1997; Keefer, Keyston et al., 2002). Adicionalmente, quando utilizado como
receptor, o citoplasto bovino já se mostrou capaz de reprogramar células
diferenciadas de diversas espécies (Chen, Wen et al., 2002; Illmensee, Levanduski
et al., 2006), suportando o desenvolvimento embrionário inicial necessário para o
isolamento de células-tronco embrionárias. Aliada à reprogramação eficiente do
citoplasto, a abundância e facilidade de obtenção de material biológico torna o
modelo bovino adequado para o estabelecimento de metodologias eficientes de
obtenção de células pluripotentes de origem embrionária pela reprogramação de
células somáticas diferenciadas de diversas espécies (Cibelli, Stice et al., 1998).
Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da
USP de Pirassununga através do sub-projeto 8, intitulado “Células pluripotentes
autólogas geradas a partir de células somáticas diferenciadas”, terá como
objetivo geral, caracterizar metodologias de obtenção de células pluri/totipotentes
a partir de células somáticas em termos de morfologia, expressão gênica e estudos
epigenéticos. Além de determinar uma metodologia mais adequada no modelo
bovino comparando os grupos com o controle e aplicá-la no sistema interespecífico.
Para esta finalidade, inicialmente será estabelecida uma linhagem celular somática
bovina derivada do cultivo in vitro de fibroblastos adultos. Uma parte destas
células será utilizada na transdução lentiviral de fatores de transcrição
responsáveis pela indiferenciação celular (Takahashi e Yamanaka, 2006). Tais
células serão caracterizadas no modelo bovino e, juntamente com as células não
modificadas, serão utilizadas como doadoras de núcleo no processo de
transferência nuclear. Células embrionárias derivadas destes processos serão
comparadas entre si e com aquelas somáticas indiferenciadas em termos de
morfologia, expressão gênica e epigenética. Serão também comparadas com as
células embrionárias obtidas através de processos naturais de fertilização. A
metodologia que prover características mais parecidas com aquelas do grupo
controle será julgada a mais adequada para a produção de células-tronco a partir
de células somáticas diferenciadas e, portanto, será utilizada no modelo
interespecífico, onde serão produzidas células pluripotentes de primatas.
55
A reprogramação do núcleo de células somáticas pelo citoplasma de um
oócito implica na combinação entre o genoma nuclear de um indivíduo e o
mitocondrial de outro. Considerando o grande potencial deste tipo de abordagem
no desenvolvimento futuro da terapia celular, o controle da herança mitocondrial é
de suma importância para viabilizar i) a produção de células-tronco humanas por
reprogramação da célula doadora de núcleo em citoplasma não humano e, ii) a
produção de células-tronco humanas autólogas (Illmensee, Levanduski et al.,
2006). Neste sentido, o modelo bovino é interessante pela abundância de material
disponível e pelo grande conhecimento disponível sobre os mecanismos que
regulam a herança do DNA mitocondrial (mtDNA) durante a embriogênese. Em
embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de células somáticas, a
porcentagem de mtDNA da célula doadora de núcleo aumenta entre o terceiro e o
quarto ciclo celular em relação ao mtDNA proveniente do oócito (Ferreira,
Meirelles et al., 2007). Por outro lado, a centrifugação de zigotos bovinos
possibilita a depleção mecânica de parte das mitocôndrias sem comprometer o
desenvolvimento embrionário, pois o embrião é capaz de repor o mesmo conteúdo
de mtDNA observado em blastocistos não depletados (Chiaratti et al., 2008). Além
disso, com a depleção mitocondrial é possível introduzir uma maior quantidade de
mitocôndrias exógenas nos zigotos (Ferreira et al., submetido).
Frente ao exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da
USP de Pirassununga através do sub-projeto 9, intitulado “Modelo animal para
estudo da herança mitocondrial intra e inter-espécie”, terá como objetivo geral,
avaliar a viabilidade da produção de embriões contendo mtDNA de origem somática
intra e inter-específico e aumentar a porcentagem herdada deste mtDNA pelos
blastocistos. Mais especificamente, pretende-se produzir blastocistos bovinos (Bos
taurus) que contenham mtDNA de origem somática intra (B. indicus) ou interespecífica (Homo sapiens) em heteroplasmia com mtDNA de origem embrionária
(herdado do oócito) e; adicionalmente, desenvolver um método para aumentar a
porcentagem herdada nos blastocistos de mtDNA somático (B. indicus ou H.
sapiens). Para isso, as seguintes abordagens tecnológicas serão empregadas:
Estabelecimento de linhagens mesenquimais de células oriundas de B. indicus e H.
sapiens; enucleação de células mesenquimais por centrifugação e fusão dos
citoplastos para utilização como doadores de citoplasma (Shay, Gershenbaum et
al., 1975; Marchington, Barlow et al., 1999); produção in vitro de zigotos bovinos
56
(B. taurus) partenogenéticos a partir de oócitos aspirados de ovários coletados em
abatedouro e maturados in vitro (Meo, Yamazaki et al., 2007); centrifugação dos
zigotos para concentrar as mitocôndrias num dos pólos do embrião e remoção de
parte das mitocôndrias por micromanipulação (Ferreira et al., submetido); fusão
dos citoplastos (B. indicus ou H. sapiens) aos zigotos depletados (B. taurus) e
cultivo in vitro (Inoue, Nakada et al., 2000); determinação da porcentagem de
mtDNA (mtDNA somático em relação à quantidade total de mtDNA) mediante PCR
em Tempo Real imediatamente à fusão, às 72 horas (embriões com cinco ou mais
células) e às 168 horas (blastocistos) após a ativação partenogenética (Ferreira et
al. submetido)(Ferreira, Meirelles et al., 2007). A porcentagem de mtDNA será
analisada considerando como efeito o citoplasto usado (B. indicus e H. sapiens), o
momento da análise (0, 72 e 168 horas) e a interação ambos os fatores.
57
Células tronco Somáticas
No indivíduo adulto, diferentes tecidos possuem a capacidade de renovação
ou ao menos de reparação total ou parcial; o sangue e a epiderme, por exemplo,
estão constantemente se renovando enquanto outros tecidos, como o hepático,
podem ser reparados por completo enquanto outros, como músculos ou tecidos
nervosos, apresentam um potencial reduzido de reparação. Este potencial está
relacionado à presença de células tronco que se encarregam da reparação,
proliferando e se diferenciando em diferentes tipos celulares encontrados nos
tecidos, as chamadas células tronco adultas.
Dentre estas, podemos destacar as células tronco hematopoéticas (CTH) e as
células tronco mesenquimais (CTM). Ambas podem ser encontradas na medula
óssea (MO). As CTM diferenciam-se in vitro e in vivo nos quatro tipos celulares
principais que formam a micro-arquitetura da medula: adipócitos, condrócitos,
osteócitos e células estromais. A interação das CTH com este micro-ambiente
permite a constante renovação do tecido sanguíneo, viabilizando a hematopoese.
Ao contrário das CTE, terapias a base de CTH são utilizadas há mais de 30
anos, na reconstituição do sistema hematopoético por meio do transplante de
medula óssea. No transplante, a incompatibilidade entre doador e receptor pode
resultar na chamada doença do enxerto contra o hospedeiro ou GVHD (graft versus
host disease), quando as células transplantadas (portanto, do sistema imune
doador) reconhecem o organismo receptor como não-próprio. As células tronco
mesenquimais também podem vir a ser utilizadas na redução da GVHD nos
transplantes, pois há fortes indícios de que elas reduzem a resposta imunológica,
por seus efeitos sobre linfócitos T e sobre células dendríticas.
Além dos usos relacionados ao sistema hematopoético, as células tronco
mesenquimais e hematopoéticas vêm sendo utilizadas de maneira crescente na
tentativa de restaurar ou repor tecidos danificados ou doentes. Estas abordagens se
baseiam na observação de que estas células, originadas na mesoderme, poderiam
se diferenciar (ou trans-diferenciar) em células de tecidos originados em outros
folhetos embrionários como hepatócitos (endoderme) ou neurônios (ectoderme),
um potencial denominado de plasticidade. De fato, estas células vêm sendo
utilizadas na tentativa de restauração de tecidos cardíacos enfartados, tecido
58
nervosos lesados, ou mesmo numa área denominada de engenharia de órgãos com o
intuito de gerar tecidos (e eventualmente órgãos) que possam ser implantados em
pessoas, eliminando a rejeição de tecidos, uma vez que as células tronco poderiam
ser originadas do próprio paciente. Neste âmbito, as células tronco mesenquimais
aparentemente
possuem
um
potencial
mais
amplo
de
diferenciação
(e
transdiferenciação) do que as hematopoéticas, podendo ser isoladas de vários
outros tecidos além da medula óssea.
Apesar da grande pletora de trabalhos nesta ampla área de conhecimento, o
pleno potencial de aplicação destas células somente poderá ser alcançado com
base em um conhecimento aprofundado da sua biologia funcional e molecular.
Pesquisa Básica:
Como mencionado, as CTM se destacam por sua grande capacidade de
diferenciação in vitro comparável, até certo ponto, com a de CTE (Da Silva
Meirelles, Caplan et al., 2008). Interessantemente, demonstrou-se que um tipo de
célula relacionada à MSC, chamada célula adulta progenitora multipotente (MAPC),
é capaz de contribuir para diversos tecidos de camundongos quando injetadas no
blastocisto, a exemplo da CTE (Jiang, Vaessen et al., 2002). A grande crítica
quanto às MAPCs é que as mesmas poderiam ser meros artefatos do processo de
cultivo celular utilizado para seu isolamento.
Atualmente, sabe-se que células com características de CTM encontram-se
distribuídas por todo o organismo pós-natal. Essa distribuição tão ampla foi
atribuída a sua associação com vasos sangüíneos em um modelo que propõe que
pericitos são células-tronco ao longo de toda a vasculatura (Da Silva Meirelles,
Chagastelles et al., 2006). Pericitos são células que envolvem células endoteliais
nos vasos sangüíneos. Formas especializadas ocorrem no fígado e nos glomérulos
renais. Pericitos são definidos com base em sua posição em relação a células
endoteliais, especialmente em capilares. Existe evidência, entretanto, indicando
que pericitos formam uma rede sub-endotelial por toda a vasculatura, tanto em
vasos de grande como de pequeno calibre. Pericitos apresentam uma relação
íntima com células endoteliais durante a formação dos vasos sangüíneos, e
desempenham papel importante na manutenção da estrutura destes. Marcadores
para a identificação de pericitos foram revisados em uma publicação recente (Da
Silva Meirelles, Caplan et al., 2008).
59
Pericitos apresentam uma sobreposição de identidade com MSCs devida a
seu potencial de diferenciação in vitro e in vivo, e também devida à expressão de
marcadores característicos de MSC in situ. Além disso, há trabalhos que evidenciam
a atuação de pericitos como MSCs in situ em tecidos como cartilagem, osso,
ligamento periodontal, endométrio e adiposo. Dados como esses levaram à
concepção de um modelo em que pericitos são células-tronco ao longo de toda a
vasculatura, e agem como MSCs em tecidos mesenquimais (Da Silva Meirelles,
Chagastelles et al., 2006). A atuação de pericitos/MSCs como componentes ativos
no processo de reparo e/ou regeneração tecidual e também na manutenção da
auto-tolerância imunológica também foi postulada (Da Silva Meirelles, Caplan et
al., 2008). De acordo com esta visão, a lesão tecidual levaria a uma liberação do
pericito de seu nicho perivascular; este passaria a um estado “ativado” e
proliferaria e, através da produção de matriz extracelular e de moléculas com
efeito trófico e imunomodulatório, exerceria funções reparadoras no local da
lesão. Uma das conseqüências disso é a pressuposição de que as células cultivadas
definidas como MSCs correspondem a pericitos ativados e não são equivalentes,
portanto, a MSCs em condições fisiológicas in vivo. A baixa eficiência de homing de
MSCs cultivadas por algumas passagens, comparada com a de MSCs em cultura
primária (Rombouts e Ploemacher, 2003), vai ao encontro dessa idéia.
Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através
do sub-projeto 10, intitulado “Conhecimento básico sobre a biologia da MSC
através de sua comparação com pericitos”, terá como objetivo primário gerar
conhecimento básico sobre a biologia da MSC através de sua comparação com
pericitos, no intuito de que suas aplicações terapêuticas sejam ampliadas. Para
este fim, as seguintes abordagens experimentais serão utilizadas: obtenção e
cultivo de MSCs humanas a partir do tecido adiposo, cordão umbilical e/ou
placenta e murinas; isolamento de pericitos humanos de amostras de tecido
adiposo ou de lipoaspirados, por meio de colunas magnéticas ou separação celular
ativada por fluorescência utilizando o anticorpo 3G5; diferenciação in vitro
osteogênica, adipogênica e condrogênica de MSCs cultivadas e de pericitos frescos
ou submetidos a cultivo celular; diferenciação in vivo em cubos cerâmicos porosos
implantados subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos; injeção de
pericitos, pericitos cultivados e MSCs derivados de camundongos Rosa26
(transgênicos
expressando
a
enzima
beta-galactosidase)
em
blastocistos
60
(colaboração com a Dra. Irina Kerkis, Instituto Butantan, São Paulo, SP); avaliação
da contribuição das células injetadas para o embrião através da de cortes
incubados com o substrato para a enzima B-galactosidase (X-gal); comparação do
perfil de moléculas de superfície expressas por pericitos, pericitos cultivados, e
MSCs (marcadores tipicamente associadas ou não a MSCs, tais como CD14, CD31,
CD34, CD44, CD45, CD90, CD29, CD105, CD117 entre outros, serão avaliados por
citometria de fluxo); estudo do perfil de citocinas com potencial imunomodulatório
(fator de crescimento de hepatócito, fator de crescimento transformador beta,
interleucina 10, interleucina 6, e interleucinas 11, 15 e 27) em pericitos frescos ou
cultivados e MSCs por citometria de fluxo; aplicação de pericitos (frescos ou
cultivados) e MSCs, obtidas de camundongos Rosa26, em modelo animal de lesão
muscular induzida por cardiotoxina (incubação de cortes transversais com X-gal e
microscopia para quantificação do número de fibras positivas para comparação
entre os tipos celulares infundidos).
A grande semelhança entre CTM e pericitos e sua íntima relação com as
células endoteliais no processo de formação de vasos sangüíneos levanta muitas
questões quanto aos mecanismos de interação entre estas células, e como eles
contribuem para a vasculogênese ou a angiogênese. A vasculogênese refere-se à
formação de vasos sangüíneos a partir de células progenitoras endoteliais
(angioblastos), enquanto a angiogênese refere-se ao processo de formação de
novos vasos por brotamento a partir de células endoteliais maduras dos vasos préexistentes. A princípio acreditava-se que a formação de vasos na fase adulta
ocorria exclusivamente a partir de células endoteliais maduras (angiogenêse) os
quais teriam o potencial de recrutar pericitos durante esse processo. Estudos
recentes conduzidos por nosso grupo levaram à hipótese de que as células-tronco
mesenquimais corresponderiam às células-tronco mais primitivas presentes nas
paredes dos capilares sangüíneos dos diferentes tecidos e que seriam responsáveis
pelo processo de neovascularização durante o mecanismo de reparo tecidual
(Covas, Panepucci et al., 2008). Em paralelo, desenvolvemos protocolos in vitro de
diferenciação de células endoteliais a partir de células progenitoras endoteliais
(AC133) da medula óssea (BM-CE) e do sangue do cordão umbilical (UC-CE). As
células progenitoras endoteliais e as células endoteliais diferenciadas (BM-CEd e
UC-CEd) foram caracterizadas quanto: a) morfologia; b) perfil skyfenotípico; c)
perfil de expressão gênica, d) potencial de “uptake” de AcLDL e e) potencial
61
vasculogênico in vitro de formação de estruturas tubulares em matrigel. Em
conjunto, esses estudos permitiram avaliar in vitro o potencial vasculogênico das
BM-CE e UC-CE, caracterizar modificações fenotípicas ao longo do processo de
diferenciação endotelial e mapear genes e fatores de transcrição envolvidos no
processo de vasculogênese (Covas, com. pessoal). Dando continuidade a esses
estudos a proposta do presente projeto consiste em investigar as interações entre
as células-tronco mesenquimais da medula óssea (BM-MSC) e veia umbilical (UVMSC) e pericitos cerebrais (B-Per) com as células endoteliais da veia do cordão
(HUVEC), bem como, com as células endoteliais diferenciadas in vitro (BM-CE ou
UC-CE). A compreensão dessas interações fornecerá subsídios relevantes para a
compreensão dos mecanismos de angiogênese e vasculogênese em diferentes
situações clínicas.
do sub-projeto 11, intitulado “Avaliação do potencial angiogênico e elucidação
das interações moleculares de células-tronco mesenquimais ou pericitos com e
células endoteliais em sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo”, terá como
objetivos principais, estudar as interações moleculares do “cross-talk” entre
populações celulares selecionadas por “sorting” para um dos marcadores de
células-tronco mesenquimais ou pericitos com células endoteliais em sistemas de
co-cutivo in vitro e avaliar o potencial vasculogênico in vivo em modelos de coinfusão
em
matrigel,
seguida
da
infusão
sub-cutânea
em
camundongos
imunodeficientes e em modelo murino de insuficiência arterial periférica induzida
por ligação da artéria femoral.
Para isso, serão desenvolvidos três modelos: 1) in vitro em ensaios de cocultivo com e sem contato com diferentes proporções dos tipos celulares: a) BMMSC:HUVEC; b) UV -MSC:HUVEC; c) pericito:HUVEC; d) BM-MSC:BM-CEd; e) BMMSC:UC-CEd; f) UV-MSC:BM-CEd; g) UV-MSC:UC-CEd; h) pericito:BM-CEd e i)
pericito:UC-CEd e 2) ensaios in vivo em modelos de formação de vasos em matrigel
após implantes sub-cutâneos em camundongos imunodeficientes e 3) modelo de
avaliação do potencial vasculogênico das células endoteliais geradas em cultura,
em camundongos portadores de isquemia, após a indução de insuficiência arterial
periférica por ligação da artéria femoral. No modelo in vitro será realizada a
caracterização de ambos tipos celulares antes e após diferentes tempos de cocultivo utilizando seis parâmetros: a) morfologia; b) perfil fenotípico; c) perfil de
62
expressão gênica, d) potencial de uptake incorporação de AcLDL; e) potencial
vasculogênico in vitro via a formação de estruturas tubulares em matrigel e f)
caracterização histológica por microscopia confocal das estruturas neoformadas em
matrigel utilizando marcadores mesenquimais e endoteliais, bem como, por
microscopia convencional de cortes de parafina corados por HE para analisar a
presença de eritrócitos dentro dos vasos, indicando a presença de vasos sangüíneos
funcionais. No modelo in vivo, primeiramente será realizada a modificação gênica
das células-tronco mesenquimais e pericitos com marcadores fluorescentes e
bioluminescentes (DsRed e Luciferase) que permitirá a avaliação dos capilares
neoformados por microscopia confocal e utilizando o sistema IVIS de captura de
imagens in vivo para análise das estruturas formadas em matrigel. No modelo de
avaliação de insuficiência arterial periférica por ligação e remoção da artéria
femoral em um dos membros inferiores, em camundongos NODSCID, células
endoteliais geradas em culturas com e sem co-cultivo das células-tronco
mesenquimais e pericitos serão infundidas nos camundongos e a análises
histológicas processadas entre 5 e 10 dias após o procedimento cirúrgico.
Ainda, em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino, da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP de São Paulo, o projeto
acima tem por objetivo também isolar células tronco mesenquimais e endoteliais
do saco vitelínico de cães, por consistir o sítio original de formação dos vasos
sangüíneos durante o desenvolvimento embrionário. Estudos recentes realizados
pela Profa.
Maria Angélica permitiram mapear os sítios preferenciais do saco
vitelínico, onde se situam as células endoteliais (SV-CE) e células tronco
mesenquimais (SV-CTM) (Miglino, Franciolli et al., 2008). Assim, após o isolamento
desses dois tipos celulares serão realizados ensaios de co-cultivo in vitro com e sem
contato para a compreensão das interações moleculares entre SV-CTM e SV-CE
utilizando os parâmetros acima descritos. O potencial vasculogênico também será
avaliado em modelo de formação de vasos em matrigel após implantes subcutâneos
de
células-tronco
mesenquimais
com
células
endoteliais,
em
camundongos imunodeficientes.
As CTMs encontradas na medula óssea ou veia de cordão umbilical são muito
similares do ponto de vista fenotípico e genotípico. No entanto, um estudo anterior
realizado no Centro de Terapia Celular (CEPID - FAPESP), comparando o perfil de
expressão de mRNA por SAGE, revelou pequenas diferenças, indicando que as CTMs
63
derivadas de medula óssea estariam mais comprometidas com linhagens
osteoblásticas e adipocíticas, enquanto que as derivadas de veia de cordão
umbilical com a funções ligadas à angiogênese ou vasculogenese (Panepucci, Siufi
et al., 2004). Se confirmadas em nível protéico, essas diferenças de expressão
podem contribuir para uma melhor compreensão das diferenças entre CTM de
origem distintas e suas implicações na escolha adequada para diferentes aplicações
na terapia celular.
Frente o exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Lewis Joel Greene através do
sub-projeto 12, intitulado “Comparação da expressão de proteínas de células
tronco mesenquimais humanas obtidas da medula óssea e da veia do cordão
umbilical”, terá como objetivo principal comparar o perfil protéico das CTMs
isoladas de veia de cordão umbilical e medula óssea utilizando a abordagem
proteômica 2D DIGE, seguida de espectrometria de massa, para avaliação de
proteínas pré-selecionadas.
Para isso, células tronco mesenquimais (CTM) humanas serão obtidas da
medula óssea, como descrito por Silva et al. (Silva, Covas et al., 2003) e da veia do
cordão umbilical humano como descrito por Covas et al. (Covas, Siufi et al., 2003)e
Panepucci et al. (Panepucci, Siufi et al., 2004). As proteínas serão extraídas,
quantificadas e utilizadas para a realização de eletroforese bidimensional 2DE. A
comparação do perfil de “spots” entre as diferentes amostras será realizada
através do sistema de aquisição de imagem ImageScanner e o programa
ImageMaster 4.0 (Amersham Biosciences). Os “spots” exclusivos de cada amostra
serão recortados dos géis e submetidos ao procedimento de identificação por
espectrometria de massa após, (espectrômetro tipo MALDI-TOF) após digestão in
situ com tripsina como descrito por Pereira et al. (Pereira, Faca et al., 2005). A
identificação será feita automaticamente em bancos de dados do NCBI.
Adicionalmente, a lista de massas de peptídeos de cada amostra será manualmente
submetida
ao
MS-Fit
(http://prospector.ucsf.edu/csfhtml4.0/msfit.htm)
para
confirmação das identificações feitas automaticamente. A classificação funcional
das proteínas identificadas será realizada no banco de dados Gene Ontology
(Ashburner,
Ball
et
al.,
2000)
através
da
ferramenta
FatiGO
(http:fatigo.bioinfo.cnio.es)(Al-Shahrour, Diaz-Uriarte et al., 2004) na tentativa de
padronizar os termos utilizados para descrever classes e funções das proteínas.
Uma etapa adicional será a utilização do sistema 2D DIGE (two-dimensional
64
difference gel electrophoresis). A marcação das proteínas com marcadores
fluorescentes será realizada de acordo com instruções do fabricante (GE
Healthcare) e a aquisição da imagem dos géis será realizada sem a retirada dos géis
das placas em um "scanner" com 3 canais de fluorescência (Typhoon Trio). Esta
etapa será realizada no Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração (INCOR)
da Faculdade de Medicina da USP - São Paulo. A análise dos géis será feita com a
utilização do software DeCyder versão 6.0.
Além das CTH e das CTM, outras células tem se mostrado potencialmente
interessantes para o uso terapêutico. As células epiteliais amnióticas (CEA)
possuem capacidade de diferenciação in vitro adipogênica, condrogênica,
osteogênica, miogênica esquelética, cardiomiogênica, neurogênica, pancreática e
hepática. Elas expressam marcadores de células-tronco embrionárias (SSEA-4, TRA
1-60 e TRA 1-81, Oct-4, FGF-4, SOX-2, Rex-1), diferentemente das células
mesenquimais amnióticas. Além disso, devido a sua capacidade imunomoduladora e
baixa imunogênicidade, as células derivadas da membrana amniótica são fortes
candidatas para uso em transplantes alogênicos. As amplas propriedades de
diferenciação aliadas à facilidade de isolamento destas células e a disponibilidade
de placentas tornam o âmnio uma fonte útil e não-controversa de células para
transplante e medicina regenerativa (Miki, Lehmann et al., 2005; Toda, Okabe et
al., 2007; Parolini, Alviano et al., 2008). Estas células são mais comumente obtidas
na presença de soro bovino fetal, mas o uso clínico requer métodos de isolamento e
cultivo isentos de componentes de origem animal.
Desta forma, o grupo coordenado pelo Dr. Wilson Araújo da Silva Jr através
do sub-projeto 13, intitulado “Diferenças na expressão gênica e de marcadores
imunofenotípicos em células epiteliais amnióticas obtidas na presença e na
ausência de componentes de origem animal”, terá como objetivo, comparar
células epiteliais amnióticas cultivadas com soro bovino fetal (CEA) e uma
subpopulação de CEA, denominadas células progenitoras multipotentes amnióticas
(CPMA), isolada e cultivada sem componentes de origem animal. Para isso,
utilizando placentas obtidas na ocasião do parto, a membrana amniótica será
descolada do córion e tripsinizada para separar o epitélio do mesênquima
adjacente para obtenção das células epiteliais; separação das CEA em gradiente de
Percoll; cultivo das CEA com soro bovino fetal (SBF) e fator de crescimento
epitelial (EGF) (Parolini, Alviano et al., 2008); cultivo das CPMA sem SBF ou EGF
65
(Banas, Trumpower et al., 2008); análise de marcadores de CEA e CTE por
citometria de fluxo (SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, NANOG e OCT-4,
CD9, CD10, CD29, CD49f, CD90, CD104, CD34, CD45, CD117 e CD140b) e
marcadores imunológicos (HLA-ABC, HLA-DR, HLA-G, CD80, CD86, CD40, CD40L, PD1, PD-L1, PDL-2 e HLA-G); comparação da capacidade de se diferenciar em cada
uma das três camadas germinativas segundo Miki e colaboradores (Miki, Lehmann
et al., 2005); extração de RNA das células cultivadas de ambas as formas e
avaliação da expressão gênica global utilizando microarrays (Agilent Technologies).
Apesar do uso de marcadores ou métodos de seleção a partir de sua
propriedade de aderência ao plástico serem muito disseminados, células tronco
mais primitivas podem ser identificadas pela propriedade de excluir corantes
lipofílicos, como por exemplo Hoechst. Estas células adquirirem o perfil de
população lateral (“side population”) durante o procedimento de clonagem celular
por citometria de fluxo (Goodell, Brose et al., 1996). Originalmente células-tronco
“side population” foram isoladas da medula óssea de murinos onde estão presentes
em baixa freqüência (~0,05%) e apresentam maior potencial de reconstituir o
sistema hematopoético quando comparado as CTHCD34+. Em seguida, a presença
de SP foi demonstrada na medula óssea humana, bem como em outros tecidos,
entre eles, fígado, cérebro, glândula mamária, rim, pele, testículos e retina
(Challen e Little, 2006) sugerindo sua ampla distribuição no organismo. Porém, o
papel funcional destas células não é bem conhecido. Estudos preliminares por nosso
grupo permitiram mostrar o isolamento de células SP da medula óssea humana e
demonstrar elevados níveis de genes da pluripotência, como por exemplo, Nanog,
Oct4, c-myc e b-catenina (Picanço-Castro, com. pessoal). Considerando as
limitações das aplicações das células-tronco embrionárias, rejeição imunológica e
potencial tumorigênico, a utilização de células-tronco “side population” pode
constituir uma fonte alternativa mais segura permitindo o uso de células autólogas.
O grupo de pesquisadores do Centro de Terapia Celular desenvolve pesquisas com
células-tronco mesenquimais há oito anos. Fomos os pioneiros a demonstrar a
presença de CTM na veia umbilical (Covas, Siufi et al., 2003) e recentemente
demonstramos sua ampla distribuição em diferentes tecidos adultos, bem como,
suas similaridades com pericitos (Covas, Panepucci et al., 2008).
Dada a importância da identificação e caracterização de células-tronco mais
primitivas para sua avaliação quanto ao potencial terapêutico, em tese superior, o
66
grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas, através do sub-projeto 14,
intitulado
“Isolamento
e
caracterização
funcional
de
células-tronco
pluripotentes - side population”, tem como objetivo geral, isolar e caracterizar
células-tronco SP de três tecidos humanos: medula óssea, veia umbilical e capilares
cerebrais, bem como, a partir de culturas de células-tronco mesenquimais da
medula óssea e veia umbilical e de pericitos obtidos a partir de capilares
sanguíneos. Para isso, serão realizados estudos de caracterização fenotípica,
morfológica e perfil de expressão gênica para avaliar as similaridades e
heteregeneidades das células SP dos diferentes tecidos e das células SP obtidas a
partir de culturas de células-tronco mesenquimais. Em paralelo, células-tronco SP
isoladas dos três tecidos no dia zero serão submetidas ao cultivo em três diferentes
meios: a) meio de cultivo de CTM; b) meio de cultivo de célula-tronco
hematopoética e c) meio de cultivo de células-tronco embrionárias. Também será
realizada a caracterização desses tipos celulares utilizando os mesmos parâmetros
acima descritos. A cultura que se mostrar mais promissora será utilizada
subsequentemente em modelos animais para testar seu potencial regenerativo.
Em colaboração com o grupo da Profa Dra Maria Angélica Miglino, o presente
projeto objetiva também isolar células-tronco “side population” da medula óssea e
capilares cerebrais de ovelhas e do saco vitelínico de cães e caracterizar quanto o
perfil morfológico, fenotípico, expressão gênica e avaliar o potencial terapêutico
em modelos de aplasia de medula, lesões de retina e lesões de isquemia cerebral.
Uma segunda colaboração com o grupo do Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles
visa ao isolamento de células-tronco “side population” da medula óssea e cordão
umbilical de fetos bovinos portadores de GFP “in útero”. De maneira similar, as
células-tronco “side population” desses animais transgênicos serão avaliadas
seguindo os mesmos parâmetros citados acima. Também, serão realizados
experimentos de transferência nuclear em oócitos enucleados bovinos utilizando o
núcleo de células SP/GFP+ para avaliar o potencial de reprogramação genética
deste tipo celular. Em paralelo, será avaliado o potencial de enxertia dessas
células SP-GFP+ em modelo de transplante de camundongos imunodeficientes
utilizando o sistema IVIS. Ainda em colaboração com o Prof Flávio, o núcleo das
células SP humanas poderão ser induzidas à reprogramação utilizando como
receptor o citoplasto bovino.
67
O uso de todo o potencial de qualquer célula tronco, em terapias visando à
regeneração de algum tecido, depende do entendimento aprofundado dos
mecanismos que controlam estes processos. As células-tronco mesenquimais (CTMs)
são capazes de se diferenciar em múltiplos tipos celulares, entretanto, o
conhecimento das vias e moléculas que regulam a manutenção do estado de
indiferenciação, bem como o processo de diferenciação ainda não estão
esclarecidos. Nesta última década, uma atenção especial tem sido dada aos RNAs
não-codificantes (noncoding RNA), visto que são considerados importantes
elementos relacionados ao sistema de regulação endógeno. Os miRNAs compõem
um pequeno grupo destes RNAs endógenos, formados por uma seqüência de
composta por 18 a 25 nucleotídeos. Em humanos, já foram identificados mais de
500 miRNAs (Griffiths-Jones, Grocock et al., 2006). Os miRNAs exibem diversas
funções biológicas, como na secreção de insulina, hematopoese, desenvolvimento
embrionário e muscular e manutenção e diferenciação das células tronco (Bartel,
2004; Du e Zamore, 2005; Wienholds e Plasterk, 2005). Eles também participam dos
aspectos funcionais das células como proliferação, sobrevivência e apoptose (Di
Leva, Calin et al., 2006). Alguns autores, já demonstraram que microRNAs
(miRNAs) apresentam-se desregulados em situações como no câncer, em doenças
virais e genéticas, na manutenção e diferenciação de células tronco adultas e
embrionárias, entre outras. Recentemente, Mizuno e cols. (Mizuno, Yagi et al.,
2008) demonstraram a diminuição da expressão do miR-125b durante o processo de
diferenciação osteoblástica em de CTMs murinas. Até o presente momento,
nenhum miRNA foi relacionado como um importante fator na diferenciação de
CTMs humanas.
Desta forma, o grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas através do
sub-projeto 15, intitulado “Avaliação Funcional de microRNAs na diferenciação
de células mesenquimais estromais multipotentes humanas”, terá como objetivo
geral, avaliar do perfil de expressão, bem como o papel de miRNAs durante a
diferenciação de CTMs em osteócitos. Com esse objetivo, as seguintes abordagens
experimentais serão adotadas: isolar e cultivar CTM de medula óssea; promover a
diferenciação em osteócitos e coletar amostras em diferentes tempos: dias zero,
24 horas, 72 horas, 7 dias, 14 dias e 21 dias; quantificar o nível de expressão de
miRNAs maduros utilizado o método TaqMan® microRNA assays Human e selecionar
aqueles potencialmente envolvidos; analisar o efeito funcional de miRNAs
68
selecionados reduzindo seus níveis utilizando o sistema Anti-miR™ miRNA Inhibitor
(Ambion); analisar o efeito funcional de miRNAs selecionados reduzindo seus níveis
utilizando o sistema Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule (Ambion); detectar
potenciais genes alvos para o miRNA-125b utilizado algoritmos como miRanda e
RNAhybrid.
A capacidade de auto-renovação assim como o potencial de diferenciação
em tipos celulares de diferentes tecidos tornam às células-tronco adultas uma
ferramenta importante para o estudo de certas doenças. Mais especificamente, a
facilidade de obtenção e cultivo das CTM e sua capacidade de diferenciação em
osteoblastos permitem que essas células sejam utilizadas como modelo de estudo
para doenças ósseas. A osteogênese imperfeita (OI), uma das displasias ósseas mais
frequentes, ocorre igualmente entre todos os grupos étnicos e é caracterizada
como uma desordem genética das células mesenquimais na qual uma osteopenia
generalizada leva a deformidade óssea, fragilidade óssea excessiva e baixa
estatura. As características principais da doença são decorrentes da produção
insuficiente ou defeituosa de moléculas de colágeno. Alguns estudos têm sido
conduzidos com o objetivo de se identificar genes com expressão exclusiva ou
diferenciada durante o processo de diferenciação osteogênica. No entanto, são
poucos os estudos funcionais referentes aos genes diferencialmente expressos
neste processo, em células derivadas de pacientes com OI. Desta forma, o grupo
coordenado pelo Dr. Wilson Araújo da Silva Jr através do sub-projeto 16,
intitulado “Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação osteogênica in
vitro em amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita”, terá
como objetivo geral, analisar o perfil de expressão gênica em células-tronco
mesenquimais durante o processo de diferenciação em osteoblastos de pacientes
portadores de Osteogênese Imperfeita e de indivíduos controle. Com este objetivo,
propõe-se: o cultivo e expansão das células-tronco mesenquimais de pacientes e
doadores normais; análise de expressão gênica em larga escala utilizando
microarrays; análise de bioinformática para a identificação de redes gênicas
fundamentais para a osteogênese; análise de expressão por PCR em tempo real;
estudos funcionais de interferência gênica utilizando RNAi.
A localização sistêmica das CTMs na parede de todos os vasos sanguíneos
(Uccelli, Moretta et al., 2008) associadas à suas propriedades imunossupressora e
imunoreguladora (Nauta e Fibbe, 2007) levantam questões sobre o eventual
69
participação destas células em doenças auto-imunes (DAIs) inflamatórias. Existem
poucos estudos sobre as características genéticas e funcionais de CTMs de
pacientes com DAIs (Sun, Zhang et al., 2007; Larghero, Farge et al., 2008) e
nenhum dado sobre as CTMs de modelos animais de DAIs geneticamente
determinadas. Portanto, ainda não está estabelecido se as CTMs de pacientes com
DAIs ou de modelos animais genéticos de DAIs são células normais ou defectivas. O
diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) (Atkinson e Eisenbarth, 2001) e a esclerose múltipla
(EM) (Sospedra e Martin, 2005) são mediadas por células T auto-reativas e
caracterizadas pela destruição seletiva de células β pancreáticas produtoras de
insulina e do sistema nervoso central, respectivamente. Adicionalmente, a
suscetibilidade ao DM-1 e a EM é determinada por fatores genéticos e ambientais.
Assim, a caracterização molecular das CTM obtidas destes pacientes poderá revelar
genes e vias de sinalização alterados e/ou defeitos funcionais, possivelmente
relacionados ao desencadeamento da auto-imunidade e/ou à patogênese da
doença, que poderão ser estudados detalhadamente e possibilitar futuramente o
desenvolvimento de novas formas terapêuticas para o tratamento dessas DAIs. Por
outro lado, se os resultados mostrarem que as CTMs de pacientes com EM são
normais genética e funcionalmente, elas poderão ser usadas seguramente como
fonte celular autóloga para o tratamento de pacientes com DM-1 e EM.
Desse modo, o grupo coordenado pelo Dr. Júlio César Voltarelli através do
sub-projeto 17, intitulado “Análise gênica, protéica e funcional de célulastronco mesenquimais de pacientes com doenças auto-imunes”, terá como
objetivo, avaliar as características funcionais e o perfil de expressão gênica e
protéica em larga escala de CTMs de pacientes com DM-1 e EM. Para isso, serão
estudados 15 pacientes com DM-1 e 15 pacientes com EM, os quais serão
submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de
transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (IAD/TACTH), na Unidade
de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Serão
colhidas amostras de medula óssea (MO) dos pacientes com DM-1 ou EM antes da
IAD/TACTH e seis meses após o transplante. Serão colhidas amostras de MO de
indivíduos saudáveis (doadores voluntários de medula) para isolamento de CTMs
para controle dos experimentos. As células mononucleares da MO dos pacientes
serão isoladas por centrifugação em gradiente de densidade para o isolamento e
cultura de CTMs e na terceira passagem, serão separadas amostras de CTMs para:
70
1)
caracterização
biológica
das
CTMs
(unidades
formadoras
de
colônia
fibroblastóides, imunofenotipagem, capacidade proliferativa (tempo de duplicação
celular); 2) avaliação da capacidade imunossupressora das CTMs in vitro (ensaio de
inibição da proliferação de linfócitos pelo co-cultivo com CTMs); 3) diferenciação
em adipócitos e osteócitos; 4) extração de RNA para análises de expressão gênica
em larga escala por microarrays e validação por RT-PCR em tempo real; 5)
extração de proteínas para análises de expressão protéica em larga escala pela
técnica de gel de eletroforese bidimensional.
Os mecanismos moleculares responsáveis por propriedades como autorenovação, manutenção do estado indiferenciado, e quiêscencia, não são
encontradas apenas nas células tronco normais. Muitas vezes estes mecanismos
podem ser encontrados atuando em outras células em situações patologicas. É o
caso da leucemia mielóide aguda (LMA). Os novos regimes quimioterápicos
desenvolvidos para a LMA têm conseguido induzir a remissão da doença e
aumentado a sobrevida dos pacientes leucêmicos. Porém, as recidivas continuam a
ser um problema bastante comum, especialmente entre pacientes mais idosos e/ou
pacientes com mau prognóstico. As recidivas foram atribuídas à existência de
células-tronco
leucêmicas
quiescentes
e,
por
essa
razão,
resistentes
à
quimioterapia. As células leucêmicas originárias de células precursoras normais são
similares a estas, porém não idênticas, pois eventos genéticos como mutações e
translocações
cromossômicas
foram
responsáveis
por
suas
propriedades
neoplásicas. Uma característica das células neoplásicas é que os complexos
caminhos que controlam o mecanismo de apoptose estão, de alguma forma,
prejudicados ou impedidos por fatores que, provavelmente, incluem a redução da
expressão de algumas proteínas apoptóticas, bem como o aumento da produção de
proteínas ou enzimas antiapoptóticas. Vários estudos têm demonstrado que
diferenças nos níveis de RNA e proteínas envolvidas na apoptose e controle do ciclo
celular são recorrentemente vistas quando analisam-se células leucêmicas e células
normais. Também foram demonstradas diferenças nos níveis protéicos quando as
células leucêmicas são tratadas com os quimioterápicos ácido all trans-retinóico
(ATRA) e As2O3. Assim, o grupo coordenado pelo Dr. Lewis Joel Greenne através do
sub-projeto 18, intitulado “Determinação dos níveis de algumas proteínas
relacionadas ao processo apoptótico e controle do ciclo celular de células
precursoras hematopoéticas normais e células precursoras”, terá como objetivo,
71
identificar diferenças nos níveis de proteínas envolvidas em processos apoptóticos
e no controle do ciclo celular em células-tronco hematopoéticas normais (CTHs) e
células-tronco leucêmicas (CTLs). Será feita também a comparação entre os níveis
de expressão de proteínas de blastos leucêmicos tratados e não tratados com
As2O3. Para isso, uma abordagem proteômica seletiva será usada. Proteínas de CTH
normais (CD34+CD38-) e CTLs (CD34+CD38-CD123+), ou ainda blastos leucêmicos
tratados e não tratados com As2O3, serão separadas por eletroforese bidimensional
e identificadas por espectrometria de masssa (MS) após serem hidrolisadas por
tripsina. Além da identificação das proteínas por espectrometria de masssa (MS)
será feito a sua imunodetecção por Western Blott. As proteínas a serem estudas
são: Flavoproteína Transferidora de Elétron - subunidade beta, Proteína
antioxidante-2, Transgelina-2, HMGB-1, c-H-ras, Anexina I, Peroxirredoxina-2, RhoGDI alfa, Rho-GDI beta e também três proteínas descritas nas duas vias clássicas da
apoptose: caspase-3, caspase-9 e BCL2. A proteína nucleofosmina-1, de grande
interesse no controle do ciclo celular, também será monitorada no presente
estudo.
O grupo coordenado pelo Dr. Eduardo Magalhães Rego estudará os
mecanismos
subjacentes
à
transformação
maligna
das
células
tronco
hematopoética usando dois modelos animais: a) camundongos mutantes para gene
da disquerina (subprojeto 19), e b) macacos verdes transplantados com células
tronco hematopoéticas transduzidas como o gene de fusão CALM-AF10 (subprojeto
20). As mutações do gene da disquerina estão associadas à doença humana
disceratose congênita, e os pacientes com esta doença apresentam redução da
atividade hematopoética e propensão ao desenvolvimento de cânceres. Estas
manifestações estão diretamente associadas à desregulação de características
fundamentais das células tronco hematopoéticas (quiescência e auto-renovação). A
disquerina é uma enzima essencial a formação dos ribossomos, e nossa hipótese é
que a desregulação da biogênese destas organelas está ligada a perda da
capacidade de auto-renovação e à transformação maligna. Caso seja confirmada,
esta hipótese abrirá uma nova fronteira na investigação da patogênese e
tratamento do câncer. O segundo modelo estudará como o gene híbrido CALM-AF10
desvia da via de diferenciação normal as células tronco hematopoéticas, causando
a leucemia aguda.
72
Especificamente, o sub-projeto 19 intitulado “O papel da disquerina na
diferenciação das células hematopoéticas” objetiva determinar o papel da
biogênese ribossomal na auto-renovação e diferenciação da célula tronco
hematopoética. Para determinar se as anormalidades nos camundongos Dkc1m são
devido a um defeito autônomo da célula, realizaremos ensaios de repopulação
competitivos. Nestes experimentos, células tronco hematopoéticas de mutantes
Dkc1 serão testadas contra seus correlatos selvagens quanto a sua capacidade de
repovoar receptores C57/BL6 letalmente irradiados. Se a função do gene Dkc1 for
essencial para a célula tronco, esperamos por um número reduzido de células
maduras
de
todas
as
linhagens
(linfóide,
granulocítica/monocítica
e
megacariocítica) nos camundongos receptores de células Dkcm. Tendo em vista
nossos resultados preliminares, o melhor candidato a progenitor hematopoético
alvo das mutações Dkc é o Progenitor Linfóide Comum (CLP). Assim, isolaremos os
CLPs de camundongos Dkc1m e controles selvagens, e realizaremos os ensaios de
repopulação competitivos como descritos acima, mas desta vez, os receptores
serão camundongos rag-/-, os quais não apresentam células T e B maduras no
sangue periférico. Para comprovar a relação causa-efeito, será quantificada a
expressão do gene Dkc1 nos precursores isolados a partir da medula óssea dos
camundongos transgênicos. Planejamos isolar HSCs, CLPs, Frações A and B da
linfopoese,
Progenitores
Mielóides
Comuns
(CMPs),
Progenitores
Granulocíticos/Monocíticos (GMPs), and e Progenitores Mielóides/Eritróides (MEPs)
da MO de camundongos Dkc1m e selvagens por Fluorescence-activated cell sorter
(FACS), e analisaremos a expressão do gene Dkc por PCR em tempo real. Além
disto, quantificaremos a apoptose e crescimento celular dos progenitors linfóides
Dkcm.
No estudo de leucemias agudas humanas, a experimentação animal oferece
subsídios indispensáveis para o entendimento de mecanismos fisiológicos e
moleculares envolvidos no desenvolvimento das mesmas. No subprojeto 20
intitulado “Modelo de Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus
aethiops) Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com Vetor
Retroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10” objetiva produzir um modelo de
Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus aethiops) usando células
tronco hematopoéticas transduzidas com vetor retroviral contendo o gene híbrido
CALM-AF10. Embora o modelo murino seja o mais amplamente utilizado, devido ao
73
seu relativo baixo custo e facilidade de manutenção e manipulação. Esse modelo,
contudo, apresenta várias limitações. Do ponto de vista experimental, a realização
de algumas técnicas é limitada pelo tamanho do animal, dificultando a coleta
seriada de amostras em volume adequado. Do ponto de vista genético, o modelo
murino difere do humano em vários aspectos, o que leva à necessidade da
validação de determinados resultados em um organismo filogeneticamente mais
próximo do homem para a realização de pesquisas pré-clínicas. O macaco verde
africano (Chlorocebus aethiops) é um dos primatas não-humanos mais utilizados em
pesquisa biomédica.
O Chlorocebus aethiops tornou-se um importante modelo
para o estudo do HIV, uma vez que, diferente do macaco Rhesus, esse animal é
facilmente infectado pelo vírus da imunodeficiência símia, mas não progride para a
doença. Além disso, essa espécie não apresenta limitação populacional, é de
pequena estatura e fácil manejo, não sendo tão suscetível a doenças como o
Rhesus. A translocação t(10;11)(p13;q14), envolvendo os genes CALM e AF10 é
descrita em pacientes com leucemias linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda
e linfoma maligno. Apresenta prognóstico desfavorável, semelhante ao dos
pacientes com translocações envolvendo o gene MLL. As células leucêmicas de
pacientes e camundongos apresentando a fusão CALM-AF10 coexpressam antígenos
das linhagens mielóide e linfóide, fazendo com que o estudo dessas células possa
contribuir na
identificação e caracterização de células tronco leucêmicas. A
necessidade de um modelo animal mais próximo do humano para pesquisa
translacional e pré-clínica no estudo de células tronco normais e leucêmicas, a
disponibilidade de Chlorocebus aethiops dentro do Centro Nacional de Primatas
(CENP) e de equipe com experiência nos modelos propostos torna o projeto em
questão realizável de forma prática e relevante quanto aos objetivos.
Neste projeto, serão desenvolvidos: 1) a padronização dos métodos de coleta de
sangue e medula óssea no laboratório do CENP e avaliação dos parâmetros de
hemograma e mielograma, bem como citogenética do Chlorocebus aethiops; 2)
determinação de protocolo de imunossupressão com estudo de doses de drogas
mieloablativas ou radiação a ser realizado junto ao CENP; 3) estabelecimento de
um protocolo de infecção dessas células com sobrenadante de cultura de células
produtoras de partículas retrovirais contendo vetor de expressão de gene repórter
e o gene híbrido CALm-AF10; 4) monitoramento dos paramentros hematológicos do
sangue e da medula óssea de animais receptores e no caso de desenvolverem a
74
leucemia aguda, será realizada a análise citogenética e de expressão gênica das
células malignas; 5) análise do efeito de novos agentes antileucêmicos como o
ester do ácido ceféico, CAPE, in vitro e in vivo.
Como já mencionado, as CTMs são consideradas uma fonte celular
importante para terapias celulares e têm sido utilizadas com eficácia no
tratamento de diversas doenças, tais como doenças hematológicas, imunomediadas e cardiovasculares, tanto em modelos experimentais quanto em humanos
(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008). As propriedades imunoregulatórias
(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008) e regenerativas (Fu, Fang et al., 2006;
Badillo, Redden et al., 2007; Sasaki, Abe et al., 2008)das CTM, seu fácil isolamento
de tecidos adultos e expansão in vitro e sua capacidade de migração para sítios de
inflamação(Caplan, 2007; Uccelli, Moretta et al., 2008) levaram à recente
realização de estudos pré-clínicos que demonstraram seu grande potencial
terapêutico no tratamento de úlceras de pele. As mesmas propriedades destacadas
também tornam as CTM uma alternativa terapêutica interessante para o
tratamento de úlceras de pele ocasionadas por queimaduras extensas, visando
acelerar o processo de regeneração da pele lesada. Queimaduras térmicas extensas
de
pele
são
de
difícil
tratamento,
principalmente
porque
levam
ao
comprometimento do sistema imunológico e de outros órgãos, podendo levar o
paciente a óbito em poucos dias. A expansão de CTMs autólogas com número
suficiente de células para aplicação leva de 2-3 semanas. No entanto, pacientes
com queimaduras graves necessitam de tratamento com urgência, inviabilizando a
terapia celular autóloga. Por outro lado, a utilização de CTMs alogênicas,
previamente estabelecidas de outros doadores saudáveis, possibilitaria uma maior
rapidez no tratamento dos pacientes queimados, e consequentemente, diminuindo
o risco de infecções, através do aumento da velocidade de regeneração da pele
lesada.
A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina que reconhece β-galactosídeos e
participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta
imunológica, a homeostasia leucocitária e a regeneração tecidual de músculos e
nervos (Salatino, Croci et al., 2008).
Vários relatos da literatura reportam o
potencial uso terapêutico da Gal-1 para tratamento de doenças auto-imunes,
inflamatórias e degenerativas (Salatino, Croci et al., 2008). Embora haja descrito
alguns poucos estudos (Rasulov, Vasilenko et al., 2006) que utilizaram CTMs no
75
tratamento de queimaduras de pele, ainda não foi realizado um estudo detalhado
dos mecanismos de ação pelos quais as CTMs aceleram o processo de regeneração
da pele e promovem a melhora clínica das úlceras ocasionadas por queimaduras
graves e extensas.
Dessa forma, o grupo coordenado pelo Dr. Júlio César Voltarelli através do
sub-projeto 21, intitulado “Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco
mesenquimais na regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura
térmica extensa em modelo animal”, visa estudar o potencial terapêutico de
CTMs xenogênicas e alogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por
queimaduras térmicas extensas em ratos. Considerando que a Gal-1 participa do
processo de regeneração tecidual e é altamente expressa em CTMs, pretendemos
estudar também o impacto da Gal-1 sobre o potencial terapêutico de CTMs
xenogênicas no tratamento de úlceras provocadas por queimaduras.
Para isto, CTMs serão isoladas da medula óssea de camundongos C57BL/6
selvagens (Gal-1+/+) ou destituídos do gene para Gal-1 (Gal-1-/-) ou de ratos e
expandidas in vitro. As CTMs (alogênicas, xenogênicas selvagens ou Gal-1+/+) e/ou
a galectina-1 recombinante murina (Gal-1rm) serão aplicadas pela via tópica e/ou
sistêmica, em animais previamente submetidos à queimadura de pele extensa.
Serão avaliados após o tratamento ou não das queimaduras com as CTMs: a
gravidade da queimadura, o processo de regeneração tecidual, o estado de
imunossupressão sistêmica, a expressão de fatores angiogênicos, fatores de
crescimento, de quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras e a expressão
protéica diferencial por análises proteômicas. Serão, portanto, estudados
detalhadamente nesse projeto os mecanismos de ação das CTMs no processo de
regeneração de úlceras ocasionadas por queimaduras térmicas extensas. Além
disso, será feita uma comparação entre potencial terapêutico de CTMs
administradas por via tópica ou via sistêmica e uma comparação entre o potencial
terapêutico de CTMs alogênicas e xenogênicas.
Dado o potencial de auto-renovação e homing das CTM, em adição a suas
propriedades terapêuticas diretas, exploradas nos protocolos de terapia celular,
estas células podem ser usadas como células entregadoras de proteínas
terapêuticas a pacientes com deficiências específicas. É o caso da Hemofilia B,
uma doença genética associada ao cromossomo X que consiste na deficiência do
76
fator IX da coagulação sangüínea. Ocorre em 1:20.000 homens, os quais em geral
são tratados com injeção intravenosa da proteína do fator IX purificada a partir do
plasma de indivíduos normais. Esse tratamento apresenta dois inconvenientes
principais: 1) risco de contaminação viral e 2) elevado custo, o que limita seu uso a
20% da população mundial de hemofílicos (Lillicrap, Nair et al., 2006). Por outro
lado, o caráter monogênico da doença, e a o fato de que um pequeno aumento no
nível do fator de coagulação (1 a 5% do normal) ser suficiente para a melhoria do
estado
clínico
do
paciente
tem
incentivado
grupos
de
pesquisadores
a
desenvolverem estratégias de terapia celular e gênica como alternativa terapêutica
para essa doença. Entre os modelos desenvolvidos podemos citar: 1) protocolos de
terapia gênica que envolvem a infusão de vetores virais portadores do FIX
recombinante e 2) protocolos de terapia celular, que consistem na infusão de
células autólogas, em geral fibroblastos de pele, modificadas geneticamente a
expressarem o fator IX recombinante. Atualmente, existem dois ensaios clínicos de
terapia gênica para hemofilia B que empregam o adenovírus recombinante portador
do FIX. As principais limitações destes ensaios clínicos consistem na resposta
imunológica frente à toxicidade das proteínas adenovirais e a necessidade da
grande demanda de partículas virais em função da baixa eficiência. Para contornar
esse problema, o uso da terapia celular pode consistir em uma estratégia mais
promissora, considerando que a produção em larga escala de células é mais
factível, aliado ao fato que o uso de CTM geneticamente modificadas podem
conduzir a uma resposta imunológica menor e manutenção da expressão da
proteína recombinate por um período mais prolongado.
O grupo de pesquisadores do Hemocentro de Ribeirão Preto tem grande
experiência com modificação gênica de células-tronco e linhagens celulares
humanas utilizando o sistema retroviral e desenvolve pesquisa de clonagem e
expressão dos fatores VIII e IX de coagulação sangüínea em células de mamífero há
11 anos. Durante esse período, foi gerada uma biblioteca de 43 linhagens
recombinantes, sendo três delas relativas ao fator IX de coagulação sangüínea
humana. Também desenvolve pesquisas com células-tronco mesenquimais (CTM) há
oito anos, e atualmente existem relatos da literatura de ensaios clínicos que estão
sendo desenvolvidos envolvendo o uso de CTM modificadas geneticamente para a
infusão em indivíduos portadores de osteogênese imperfecta. Sendo assim, o grupo
coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas, através do sub-projeto 22, intitulado
77
“Uso
de
celulas-tronco
mesenquimais
modificadas
geneticamente
para
expressão do fator VIII em modelos murinos portadores de Hemofilia B”, propõe
realizar a modificação gênica de pericitos hepáticos com o fator IX recombinante
utilizando o sistema retroviral, seguida da infusão em modelo murino de hemofilia
B. Para isso, as seguintes abordagens experimentais serão adotadas: isolamento,
seleção e cultivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea; isolamento,
seleção e cultivo de pericitos cerebrais e hepáticos (um gradiente de dextran será
utilizado para a separação das células dos capilares, seguida da seleção por
citometria de fluxo de células coradas com Hoeschst 33342 e sensíveis ao
tratamento com a droga verapamil); análise morfológica por microscopia de
contraste de fase e microscopia convencional após coloração por Leishman;
avaliação do perfi imunofenotípico com um painel de 18 anticorpos monoclonais
através de citometria de fluxo; avaliação do perfil citogenético por bandamento
cromossômico GTG, com no mínimo 400 bandas por meio de microscópio óptico,
utilizando o software BANDView®EXPO (Applied Spectral Imaging). Os cariótipos
serão descritos de acordo com os critérios internacionais de nomenclatura
cromossômica (ISCN,2005); determinação do potencial de diferenciação; avaliação
da expressão gênica por PCR em tempo real; avaliação do transcriptoma por por
microarray (Agilent).
O
crescente
número
de
aplicações
clínicas
envolvendo
células-
troncomesenquimais gera a necessidade da produção em larga escala destas células
com adequada qualidade terapêutica. A metodologia atual de cultivo das célulastronco mesenquimais apresenta quatro limitações principais: 1) excessiva
manipulação que pode interferir com as propriedades funcionais das células em
virtude das sucessivas passagens com tratamentos enzimáticos que as mesmas são
expostas; 2) maior risco de contaminação decorrente da extensa manipulação; 3)
inexistência do controle dos parâmetros de cultivo e conseqüentemente da
fisiologia celular e 4) alto custo e tempo prolongado de cultivo para a geração da
quantidade
adequada
e
não
diferenciada
de
células.
Desta
forma,
o
desenvolvimento de uma tecnologia capaz de otimizar o sistema de cultivo das
CTM, reduzindo as limitações mencionadas, promovendo um aumento de escala e
permitindo um melhor controle dos parâmetros de cultivo, permitiria a obtenção
de um produto de alto padrão clínico de forma eficiente, econômica e segura. O
cultivo de células-tronco em biorreatores utilizando microcarregadores, do ponto
78
de vista da engenharia de tecidos, tem sido reportado na literatura como eficiente
em termos da expansão das mesmas e manutenção do fenótipo original (Malda e
Frondoza, 2006; Frauenschuh, Reichmann et al., 2007; Schop, Janssen et al.,
2008). Além disso, determinados microcarregadores chegam a possuir uma área
disponível para crescimento celular da ordem de 20 cm2/mL, ao passo que as
culturas convencionais em monocamadas disponibilizam cerca de 4 cm2/mL.
do sub-projeto 23, intitulado “Desenvolvimento de um bioprocesso para
expansão de Células-Tronco Mesenquimais em microcarregadores”, terá como
objetivo principal, desenvolver um bioprocesso para cultivo e expansão de células
tronco mesenquimais da medula óssea e da parede da veia umbilical em
microcarregadores e avaliar as propriedades biológicas e funcionais pós-cultivo. Os
métodos
envolvidos
neste
projeto
compreenderão:
separação
de
células
mononucleares e cultivo e expansão de CTM da medula óssea em garrafas de
cultura estática; cultivo das CTM em biorreator spinner em microcarregador
comerciais (Cytodex 3 - GE Healthcare e Cultispher S - Percell Biolytica) com
controle da concentração de oxigênio dissolvido, pH e agitação; análise
morfológica por microscopia de contraste de fase e microscopia convencional após
a coloração por Leishman; avaliação do perfi imunofenotípico por citometria de
fluxo com um painel de 18 anticorpos monoclonais (CD105, CD73, Stro-1,; CD90PE,CD29, CD13, HLA ABC, CD49e, CD54, CD44, CD51/61, CD106, CD34, CD14, CD45,
HLA-DR, CD31, KDR; determinação do perfil citogenético por cariotipagem
utilizando bandamento GTG; avaliação do potencial de diferenciação in vitro
(coloração com SudanII/Scarlat para adipócito; von kossa e fosfatase alcalina para
osteócito; hematoxilina-eosina para condócitos e análise imuno-histoquímica para
colágeno tipo II); quantificação da expressão gênica por RT-PCR em tempo real.
Como mencionado anteriormente, certas características das células tronco
são comumente encontradas e células tumorais ou leucêmicas. De fato, muitos
genes tem suas funções descritas inicialmente por terem sido identificados atuando
de maneira patológica em neoplasias diversas. Neste sentido, os próximos dois subprojetos se caracterizam pelo estudo e identificação de genes envolvidos em
situações patológicas. Estes estudos envolvem técnicas de genomica funcional
(proteomica e estudos cromossômicos de alta resolução) e os grupos responsáveis
79
por eles, além de identificarem genes e suas funções com uso destas técnicas
atuarão em diversos outros sub-projetos propostos neste projeto.
As células gliais podem sofrer mutações para formar células tumorais gliais
ou gliomas, dentre os quais 70% originam de astrócitos. A alteração de receptores
de EGF (amplificação, formação de proteína truncada) tem sido bem estudada em
glioma e vários alvos downstream do receptor têm sido caracterizados como
PI3K/Akt e via de mTorr (Ohgaki e Kleihues, 2007). Nós desenvolvemos um estudo
proteômico em amostras de astrocitomas cirurgicamente removidas de pacientes,
baseado em eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MALDITOF e ESI-MS/MS), para identificar proteínas diferencialmente expressas na
progressão tumoral, de acordo com o aumento dos graus de malignidade (graus II,
III e IV). As proteínas identificadas como superexpressas em graus mais avançados
do tumor foram: nucleofosmina (NPM), anexina I, anexina V, peptidil-prolil cistrans isomerase e alfa-cristalina cadeia B e estas apresentaram correlação com os
estádios de astrocitomas. A proteína NPM apresentou níveis de expressão
aumentados durante a evolução de astrocitomas, e demonstrou ter uma correlação
direta com a progressão tumoral, que foi confirmada por sondagem de amostras de
pacientes por anticorpo monoclonal anti-NPM através de Western Blot e por
microarranjo de DNA. A nucleofosmina (NPM), também conhecida como B23,
numatrina 1 ou NO38, é altamente conservada em vertebrados e distribuída entre
diversas espécies com peso molecular entre 35 a 40kDa e pI de 5,0 a 5.1. Em
humanos, existem duas isoformas, NPM1 (B23.1) e NPM1.2 (B23.2), as quais são
geradas a partir de uma simples via de splicing alternativo do gene. NPM é uma
fosfoproteína nucleolar que transita entre o núcleo e citoplasma durante o ciclo
celular e interage com diversas proteínas. Devido a esse comportamento, a NPM é
uma proteína multifuncional, incluindo o processamento de RNA ribossomal,
duplicação do centrossomo, resposta a estímulos de estresse tais como irradiação
UV e hipóxia, manutenção da estabilidade genômica através do controle de ploidias
celulares, participação em processos de reparo de DNA e a regulação da transcrição
através da modulação de eventos de condensação e descondensação da cromatina
(Grisendi, Mecucci et al., 2006; Lim e Wang, 2006). Não há dados na literatura que
relacionam NPM diretamente com gliomas, porém o trabalho de Sandsmark e cols.
(Sandsmark, Zhang et al., 2007) mostra NPM envolvida em sinalização celular e
reorganização dinâmica do citoesqueleto de astrócitos.
80
Assim, o grupo coordenado pelo Dr. Jose Cesar Rosa através do sub-projeto
24, intitulado “Proteômica funcional: estudos do papel da nucleofosmina na
gliomagênese”, terá como objetivo principalestudar, através de metodologia
proteômica, o papel desempenhado por NPM em linhagens celulares T98G e
U87MG, derivadas de glioblastoma multiforme (grau IV). Para isso, iremos
correlacionar mudanças do proteoma com proliferação, migração celular e
apoptose sob estímulo de EGF e seu efeito sobre o nível dessa proteína, bem como,
o efeito do silenciamento da expressão de NPM por RNA de interferência (RNAi).
Consequentemente, poderemos inferir através de metodologia proteômica, outras
proteínas up ou down-regulated que estarão diretamente ligada a expressão de
NPM. Também, nós estenderemos nossos estudos proteômicos em amostras de
pacientes para mais 5 amostras de cada grau de malignidade, utilizando estratégia
de 2DE/MALDI-TOF/TOF e complementação por shotgun peptide sequencing (SPS)
com o objetivo de estender a identificação de novos biomarcadores e possíveis
alvos para intervenção teraupêutica.
A leucemia linfocítica crônica é caracterizada pela progressiva linfocitose de
pequenas células B maduras, com imunofenótipo CD5+/CD19+ e contínuo acúmulo
de células no sangue, medula óssea e órgãos linfóides (Caligaris-Cappio e Hamblin,
1999). Essa neoplasia representa cerca de 40% de todas as leucemias em adultos
com mais de 65 anos de idade, somente raros casos ocorrem em idade inferior aos
30 anos de idade. Além do status mutacional da região variável da imunoglobulina
de cadeia pesada (IGHV), expressão de ZAP70 e CD38, alterações no número de
cópias de DNA são detectadas em 50-80% dos casos de LLC e constituem
importantes marcadores prognósticos da doença (Doneda, Montillo et al., 2003). As
mais comuns anormalidades cromossômicas observadas na LLC são a trissomia do 12
e deleções em 13q14, 11q22~q23 e 17p13, dentre as quais, a del(13)(q14) está
associada a um prognóstico favorável e as demais perdas cromossômicas conferem
um prognóstico ruim (Dohner, Stilgenbauer et al., 2000). Embora várias regiões
genômicas envolvidas em alterações cromossômicas tenham sido descritas na LLC,
relativamente poucos supressores tumorais e oncogenes têm sido sugeridos
(Tyybakinoja, Vilpo et al., 2007). A combinação de métodos em citogenômica,
(cariotipagem espectral e arrayCGH) permitirá a identificação e caracterização de
pontos de quebra, associados à presença de alterações cromossômicas, detecção
de alterações no número de cópias de DNA e identificação de possíveis genes
81
envolvidos. A análise em alta resolução identificará deleções submicroscópicas, as
quais serão informativas, especialmente em pacientes com cariótipo normal.
Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Roberto Passetto Falcão
através do sub-projeto 25, intitulado “Ferramentas de citogenômica aplicadas à
investigação da instabilidade cromossômica na leucemia linfocítica crônica
(LLC)”, terá como objetivo avaliar o perfil genômico da LLC, por meio de
ferramentas de citogenética molecular, como a cariotipagem espectral (SKY) e
arrayCGH para melhor definir e caracterizar regiões genômicas crípticas e possíveis
genes envolvidos. Adicionalmente, o projeto visará à criação de um banco de
amostras de pacientes com LLC (células, DNA e RNA) a ser utilizado para o
desenvolvimento de outros projetos de pesquisa. Para isso, as seguintes
metodologias serão empregadas: obtenção de células metafásicas para aplicação
da técnica de SKY; hibridação das células metafásicas para análise espectral
(Applied Spectral Imaging); extração de DNA do sangue de paciente e indivíduos
controle e avaliação de alterações no número de cópias de regiões genômicas
(duplicações ou deleções) pelo método de arrayCGH utilizando a plataforma
Agilent.
82
Estabelecimento de Centros para Estudos Pré-Clínicos em Modelos
Animais
Os estudos com células tronco embrionárias ou adultas descritos neste
projeto abrangem o estabelecimento de metodologias e o estudo de questões
importantes, de ordem conceitual e prática. Juntos, formam a base para o
desenvolvimento
do
know-how
técnico-científico
necessário
para
o
estabelecimento da terapia celular, como realidade futura na medicina Brasileira.
No entanto a efetiva aplicação prática do potencial destas células, demonstrado in
vitro ou em pequenos animais de laboratório, dependerá necessariamente da
realização de ensaios pré-clínicos em animais com características mais próximas ao
organismo humano. Desta forma, descrevemos a seguir as propostas para a
implantação efetiva de centros capazes de sediar estudos desta natureza.
Frente à necessidade do estabelecimento de competências na área de
biotecnologia aplicada à terapia celular e gênica em modelos animais, a adequação
da infra-estrutura para o desenvolvimento de novas tecnologias e treinamento de
recursos humanos é fundamental para garantir a qualidade dos resultados deste
projeto. Assim, nos últimos anos diferentes iniciativas vêm sendo tomadas para a
criação de um Centro de Estudos Pré-clínicos e Banco de Células-tronco de modelos
animais, centrado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP. Esta
iniciativa se associa ao estabelecimento de um sistema de “core facilites” centrado
na USP e projetado pela Rede de laboratórios satélites (Rede Nacional de Pesquisa
e Pós Graduação emTecnologia e Ambiente) vinculados ao Centro de Estudos PréClínicos. Ao mesmo tempo, para a realização de estudos em diferentes animais
modelos, é de grande interesse a obtenção de células tronco derivadas destes
animais. Desta forma, atrelado ao estabelecimento do Centro de Estudos PréClínicos, o estabelecimento de um banco de células destes animais é de sumo
interesse. De grande importância, o Centro possibilitará a realização de ensaios
pré-clínicos em animais com doenças de alta incidência, comuns aos humanos,
como
por
exemplo:
doenças
neuroregenerativas,
metabólicas,
tumorais,
traumáticas da medula espinhal e de ossos longos, alem de patolologias envolvendo
o globo ocular.
Desse modo, o grupo coordenado pela Dra. Maria Angélica Miglino através do
sub-projeto 26, intitulado “Centro de estudos pré-clínicos e banco de células83
tronco animais”, terá como objetivo principal, estruturar um centro de pesquisa
pré-clínica associado a um banco de células tronco animais, com competências
treinadas nas diferentes áreas do conhecimento, para o desenvolvimento de
pesquisas relacionadas a medicina veterinária regenerativa e o estabelecimento de
modelos animais adequados aos testes pré-clínicos demandados nos diferentes
projetos propostos pelo pesquisadores que integram esta rede de pesquisa em
terapia celular.
Para isso, células tronco isoladas de diferentes tecidos e animais serão
utilizadas em diferentes modelos animais com diferentes patologias ou lesões
adquiridas e/ou induzidas. Em suma, a seguinte abordagem experimental será
adotada: Coleta e estabelecimento do meio de cultura ideal para o cultivo e
expansão
das
células
tronco;
avaliação
do
potencial
de
diferenciação;
estabelecimento do protocolo de transferência do tecido pré-diferenciado para o
local cirúrgico; biopsia e análise de biodistribuição e diferenciação das células
tronco implantadas no animal; estabelecimento do protocolo cirúrgico e póscirúrgico proporcionando melhores resultados no tratamento, avaliação daresposta
imunológica pós tratamento valendo-se da competência do Prof Dr João Palermo
Neto e da Dr Maria Marta Bernardi.
A seguir se encontram listados, os modelos animais, os tipos celulares
focados e as abordagens que serão desenvolvidas independentemente ou em
associação com os demais grupos integrantes da proposta:
Modelos animais de doenças adquiridas e induzidas:
Espécies:
Caninos,
suínos,
ovinos,
eqüinos,
coelhos,
roedores
e
histricomorfos, e macacos.
Doenças: aplasia de medula, lesões renais agudas, osteonecrose de cabeça
fêmur, lesões de córnea e retina, doenças cardíacas e pulmonares.
Criação de banco de células-tronco animais (cultivo e diferenciação):
Células mesenquimais oriundas de saco vitelino, medula óssea e fígado fetal
em cães;
Células mesenquimais de saco vitelino, cordão umbilical e amnion eqüino;
Células progenitoras de epitélio olfatório em cães;
Células-tronco oriundas de liquido aminiotico, saco vitelino e alantoidiano de
cães;
84
Abordagens experimentais:
Expansão de células mesequimais de cordão umbilical e medula óssea LACZ
positivas para transplante autólogo;
Injeção intra-uterina de células mesequimais caninas e sua biodistribuição;
Biodistribuição de células-tronco mesenquimais e perícitos GFP+ em
embriões ovinos.
Cultivo e diferenciação de células-tronco mesequimais em primatas Callitrix
(colaboração com Maria de Fátima Messias e Penelope Nayund, Alemanha).
Avaliação da resposta imunológica pós terapia celular em modelos animais
em colaboração com o Prof. Dr. João Palermo Neto e Maria Martha Bernardi.
Os modelos animais de grande porte definitivamente contribuem para o
estabelecimento de protocolos de terapia celular, permitindo que procedimentos
clínicos próximos aos utilizados em humanos sejam desenvolvidos. No entanto a
efetiva
transferência
para
humanos
pode
depender
de
características
comportamentais e biológicas exclusivas de humanos ou ao menos de animais
evolutivamente próximos. Primatas não-humanos são considerados bons modelos
experimentais em pesquisas biomédicas por apresentarem anatomia e sistema
imunobiológico com respostas aproximadas às encontradas em seres humanos
(CCAC, 1993). Apesar desta característica, pesquisas relacionadas ao uso de células
utilizando primatas não humanos ainda são em menor número comparadas àquelas
desenvolvidas em outros modelos animais como ratos e camundongos, por ser mais
difícil o acesso e manejo de primatas não humanos em pesquisas (Jin, Carter et al.,
2002; Riess, Zhang et al., 2002; Vrana, Hipp et al., 2003; Takagi, Takahashi et al.,
2005). Desta forma, a disponibilização de um plantel de primatas não humanos
nascidos e mantidos em cativeiro para experimentação em pesquisas biomédicas,
poderia contribuir enormemente para o avanço das pesquisas que utilizam célulastronco para tratamento de diversas doenças. Neste sentido, Centro Nacional de
Primatas - Instituto Evandro Chagas (CENP-IEC/SVS/MS), Ananindeua, Pará,
pretende disponibilizar a experiência já estabelecida em manejo, clínica e cirurgia
de primatas não humanos mantidos em cativeiro, para a utilização em pesquisas
biomédicas utilizando células-tronco.
Assim, o grupo coordenado pela Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva através
do sub-projeto 27, intitulado “Disponibilização de primatas neotropicais (novo
85
mundo) e da espécie Chlorocebus aetiops (espécie do velho mundo) para
pesquisas com células-tronco adultas e embrionárias como modelo biológico
para terapias celulares”, terá como objetivo principal, disponibilizar o plantel de
primatas neotropicais e da espécie Chlorocebus aethiops, de idade adulta, nascidos
em cativeiro no Centro Nacional de Primatas – Instituto Evandro Chagas (CENPIEC/SVS/MS) para utilizá-los em pesquisas que utilizem células-tronco adultas e
embrionárias com finalidade de terapia celular.
Para isso, machos adultos da espécie Chlorocebus aethiops (ou de outras
espécies neotropicais) serão selecionados pelos veterinários do CENP-IEC/SVS/MS
através de triagem clínica onde serão realizados ananmese clínica e exames
laboratoriais (hemograma, bioquímica sérica, urinálise, parasitológico de fezes e
raio x). Apenas os animais clinicamente hígidos participarão dos grupos de
experimentos. Os preparados de cultivo celulares a serem transplantados serão
transportados da universidade ou centro parceiro para o laboratório de cultivo
celular da Seção de Meio Ambiente/IEC/SVS/MS, onde serão armazenados, e, à
época dos transplantes, levados ao CENP-IEC/SVS/MS para realização da fase
experimental com os animais. Os transplantes dos cultivos serão realizados de
acordo com protocolo experimental estabelecido para cada experimento em
animais anestesiados por um veterinário do CENP-IEC/SVS/MS de acordo com o
protocolo já estabelecido. Os procedimentos serão realizados em condições
assépticas, sendo a região tricotomizada e limpa com antissépticos, para
administração das células ou placebo. Para o acompanhamento clínico póstransplante, os animais serão avaliados através de hemogramas completos, com
contagem diferencial de leucócitos e também por avaliações clínicas para
temperatura corporal, peso dos animais ou qualquer outro exame sugerido de
acordo com o tipo de transplante a ser realizado. Para avaliação histopatológica
dos principais órgãos (coração, pulmão, rins, fígado, baço, linfonodos, etc) e
medula óssea, será realizada eutanásia em um animal de cada grupo dentre os
participantes do experimento.
86
Ensaios Clínicos
Apesar de escassos, os estudos clínicos voltados à avaliação de abordagens
terapêuticas utilizando terapias a base de células tronco adultas já são uma
realidade. Neste sentido, a equipe cordenada pelo Dr. Júlio César Voltarelli tem
atuado de forma pioneira no tratamento de doenças auto-imunes no Brasil e no
mundo. Também de forma pioneira, o grupo liderado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas
toma a dianteira no uso de células tronco mesenquimais autólogas no tratamento
da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD). Dada a importância destes
projetos, eles são expostos em maior detalhe a seguir.
Sub-projeto 28: Tratamento de diabetes mellitus tipo 1 com infusão de célulastronco mesenquimais
Resumo
O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença auto-imune (DAIs)
inflamatória, mediada por células T auto-reativas e caracterizadas pela destruição
seletiva de células β pancreáticas produtoras de insulina. A suscetibilidade ao DM-1
é determinada por fatores genéticos e ambientais. A doença clínica manifesta-se
somente após destruição de aproximadamente 80-90% das células β(Atkinson e
Eisenbarth, 2001). O processo destrutivo das células β leva à falta do hormônio
insulina, que resulta num estado de hiperglicemia e suas complicações agudas e
crônicas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à
depressão do sistema nervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam
de tratamento permanente com insulina exógena para sobrevivência. Entre as
complicações crônicas graves estão os problemas vasculares que levam à
insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas.
O DM-1 é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva
com insulina. Ensaios clínicos com imunossupressores, anticorpo monoclonal antiCD3 e o transplante de ilhotas pancreáticas vêm sendo realizados com resultados
significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira. Esse cenário
estimula novas pesquisas acerca de alternativas terapêuticas, tais como a
diferenciação in vitro de células-tronco humanas em células β pancreáticas para
87
transplante e tratamento do DM-1 com células-tronco adultas. Nesse contexto, as
células-tronco mesenquimais (CTMs) representam uma fonte de células-tronco
adultas ideal para terapia celular em virtude de seu fácil isolamento, expansão in
vitro e capacidade imunossupressora, imunoreguladora e regenerativa (Uccelli,
Moretta et al., 2008).
Trabalhos recentes demonstraram um efeito terapêutico satisfatório após
infusões de CTMs em modelos animais de diabetes auto-imune(Anderson e
Bluestone, 2005; Lee, Seo et al., 2006) e em pacientes portadores de doença do
enxerto-versus-hospedeiro (Le Blanc, Frassoni et al., 2008), doença cujos
mecanismos imunológicos assemelham-se aos das doenças auto-imunes. Com base
nesses estudos publicados, nossa hipótese é que a agressão auto-imune no pâncreas
possa ser controlada através das CTMs, pois após a infusão nos pacientes diabéticos
elas migram preferencialmente para o tecido pancreático inflamado, promovem
imunossupressão local e estimulam os mecanismos de regeneração locais através de
efeitos parácrinos, que envolvem a produção de moléculas anti-inflamatórias e
imunoreguladoras e de fatores de crescimento e angiogênicos.
Desse modo, o objetivo desse projeto é avaliar a segurança, o efeito
terapêutico e os mecanismos de ação da infusão CTMs alogênicas no tratamento de
DM-1 recém-diagnosticado em humanos e modelos animais. Avaliaremos a resposta
imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, células T de
memória, células NKT e células T CD4+ e CD8+ reguladoras; dosagem de citocinas
no soro; repertório de células T; freqüência de células T auto-reativas anti-células
β pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs.
Paralelamente aos estudos em humanos, propomos avaliar nesse projeto os
mecanismos imunológicos detalhados e regenerativos envolvidos na resposta
terapêutica de dois modelos de diabetes auto-imune experimental (um modelo
geneticamente determinado e o outro quimicamente induzido) à infusão de CTMs
humanas. Avaliaremos nestes modelos a modulação da resposta auto-imune
patogênica pelas CTMs, bem como o papel das CTMs na regeneração do tecido
pancreático lesado pela agressão auto-imune, na fase inicial da doença.
Os resultados obtidos neste projeto demonstrarão o efeito terapêutico da
infusão de CTMs no tratamento do diabetes auto-imune em humanos, bem como
elucidarão os mecanismos de ação imunológicos e regenerativos envolvidos nessa
88
resposta terapêutica através dos estudos em modelos animais de diabetes autoimune. Se demonstrada uma boa eficácia terapêutica, a infusão de CTMs pode se
tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM-1, que constitui uma
doença auto-imune associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e
necessidade de tratamento crônico.
Objetivo Geral
Este projeto tem como objetivo geral avaliar a segurança, o efeito
terapêutico e os mecanismos de ação da infusão de células-tronco mesenquimais
(CTMs) humanas no tratamento de diabetes mellitus tipo 1 recém-diagnosticado.
Metodologia
Serão tratados 14 pacientes com DM-1 recém-diagnosticados (há menos de
quatro semanas; anticorpo anti-GAD65 positivo) pela infusão de CTMs alogênicas na
Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP.
Este projeto de pesquisa e respectivo termo de consentimento livre e esclarecido
foram aprovados pelo Comitê de Ética em pesquisa local e nacional. O doador de
medula óssea (MO) será um familiar saudável do paciente diabético, selecionado
conforme a tipagem de HLA. Será optado preferencialmente pelo doador que não
apresente HLA diabetogênico (DRB1*03 e/ou *04 e DQB1*0201 e/ou *0302). O
doador de MO será submetido à coleta de aproximadamente 100 ml de medula
óssea (MO) através de punções de crista ilíaca posterior direita. As amostras de MO
dos doadores serão processadas no Laboratório de Terapia Celular do Centro de
Terapia Celular (CEPID-FAPESP) do Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRPUSP. As CTMs serão cultivadas nesse laboratório em ambiente estéril e com
reagentes estéreis, dentro de padrões estritos de controle de qualidade para a
produção de componentes celulares para infusão em humanos (padrão GMP). Serão
colhidas amostras MO de outros indivíduos saudáveis (doadores voluntários de
medula) para isolamento de CTMs para infusão nos modelos animais de diabetes. As
células mononucleares da MO dos pacientes serão isoladas por centrifugação em
gradiente de densidade (Ficoll HypaqueTM, d=1,077). Para o isolamento e cultura
de CTMs, 4x107 células mononucleares da MO serão suspensas em meio de cultura
α-MEM com 15% de soro bovino fetal (SBF), plaqueadas em garrafa de 175 cm2, e
cultivadas em incubadora a 37°C com 5% de CO2. Após 3 dias, as células nãoaderentes serão removidas e serão adicionados 50 ml de meio de cultura. O meio
89
de cultura será trocado a cada 3-4 dias e quando as células estiverem semiconfluentes, estas serão tripsinizadas e repicadas (primeira passagem). As CTMs
serão submetidas a sucessivas passagens (3-5) até que se adquira número de células
suficiente para o procedimento (1-2 x106/kg do paciente em cada infusão). Três
dias antes da infusão das CTMs no paciente, o SBF do meio de cultura será
substituído por soro autólogo (a 5-10%). Serão feitas duas infusões de CTMs, com o
mesmo número de células (1-2 x106/kg), separadas por um período de 30 dias.
Amostras das CMTs serão separadas antes da infusão para: 1, caracterização
imunofenotípica e morfológica ; 2, caracterização citogenética; 3, diferenciação
em adipócitos e osteócitos; 4, avaliação da capacidade imunossupressora in vitro.
Após a infusão das CTMs, o paciente será monitorado semanalmente até D+60 pósinfusão e depois a cada três meses. O monitoramento será realizado por exames
clínicos e laboratoriais (que incluem dosagem dos níveis de glicemia de jejum,
níveis de peptídeo-C, níveis de hemoglobina glicosilada). Será colhido sangue
periférico dos pacientes para o estudo da resposta imunológica nos dias +1,+2, +7,
+14, +30, +60, +180, +270, +360 e em seguida semestralmente, após a infusão das
CTMs.
Com o objetivo de estudarmos os mecanismos imunológicos e regenerativos
de ação da infusão de CTMs humanas (isoladas de medula óssea) no tratamento do
diabetes
auto-imune
experimental,
utilizaremos
um
modelo
de
diabetes
geneticamente determinado (camundongos NOD, Non-Obese diabetic mouse) e um
modelo de diabete auto-imune quimicamente induzido pela administração de
estreptozotocina (STZ) em camundongos C57BL/6. Os camundongos C57BL/6
(machos, 8 semanas de idade) serão submetidos à administração de 5 doses diárias
e consecutivas de STZ. Cinco dias após a última dose de STZ (fase inicial da
doença) os camundongos C57BL/6 receberão, por via endovenosa, a infusão de
CTMs humanas. Os camundongos NOD fêmeas com 12 semanas de idade (fase inicial
da doença) serão infundias com CTMs humanas. Após a infusão das CTMs, os
camundongos serão monitorizados 2 vezes por semana em relação à glicemia e ao
peso.
Após 10, 17, 24, 32 e 60 dias da infusão das CTMs, os animais serão
sacrificados e serão coletados o pâncreas, o baço e o soro desses animais para
ensaios
imunológicos
(citometria
de
fluxo,
ELISA,
imunohistoquímica,
imunofluorescência). Avaliaremos a ocorrência de fusão entre CTM humanas e
células β pancreáticas murinas pela técnica de FISH usando marcação concomitante
90
com sondas anti-cromossomo X murino e anti-cromossomo X ou Y humano. Para
avaliar se as CTM humanas são capazes de diferenciarem-se em células β
pancreáticas produtoras de insulina, será realizada imunohistoquímica usando
anticorpos anti-insulina humana. Em alguns experimentos, as CTMs serão infectadas
com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ estudos de migração e
permanência das CTMs no tecido lesado.
91
Sub-projeto
29:
Tratamento
de
esclerose
múltipla
com
células-tronco
hematopoéticas: avaliação da resposta clínica e dos mecanismos imunológicos
de ação
Resumo
Nos últimos anos, ensaios clínicos têm demonstrado que a imunossupressão
em altas doses (IAD) seguida de transplante autólogo de células-tronco
hematopoéticas (TACTH) é capaz de suprimir a atividade inflamatória em pacientes
com doenças auto-imunes (DAIs) e pode induzir remissões clínicas prolongadas
nesses pacientes (Sykes e Nikolic, 2005; Burt, Marmont et al., 2006). O racional do
TACTH em DAIs baseia-se na idéia de que a imunoablação intensa possa eliminar as
células auto-reativas e que o novo sistema imune reconstituído dos precursores
hematopoéticos possa restabelecer tolerância imunológica (Muraro, Douek et al.,
2005; Muraro e Douek, 2006). Mais de 1000 transplantes já foram realizados
mundialmente em vários ensaios clínicos de fase I/II nos últimos dez anos.
Recentemente, ensaios clínicos randomizados de fase III, que objetivam comparar
o TACTH com a terapia convencional para essas doenças, foram iniciados nos
Estados Unidos e Europa (Burt, Cohen et al., 2005; Sykes e Nikolic, 2005; Burt,
Marmont et al., 2006).
No Brasil, o tratamento de DAIs com IAD seguida de TACTH iniciou-se na
Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo em setembro de 2001,
centrado em doenças reumáticas (lúpus eritematoso sistêmico e esclerose
sistêmica) e neurológicas graves (esclerose múltipla secundária progressiva) e
refratárias aos tratamentos convencionais (Voltarelli e Ouyang, 2003). A terapia de
IAD seguida de TACTH levou à remissão da doença em 75% dos pacientes com
esclerose múltipla (EM) (formas progressiva secundária ou progressiva primária)
transplantados em nosso centro ou em hospitais participantes do protocolo
cooperativo (N=41), corroborando resultados de outros trabalhos descritos na
literatura. Nesses pacientes, o valor de EDSS (Expanded Disability Status Score)
melhorou ou estabilizou após o transplante (Burt, Cohen et al., 2005).
Além dos ensaios clínicos, nosso grupo de pesquisa tem estudado nos últimos
anos os mecanismos de ação da IAD/TACTH no tratamento de DAIs órgãoespecíficas, ou seja, quais as mudanças induzidas no sistema imune do paciente
92
pela IAD/TACTH que explicam a remissão da DAI. Nossos resultados e trabalhos
recentes da literatura sugerem que a IAD/TACTH induz uma “reprogramação” do
sistema imune após o TACTH, ou seja, a regeneração de um sistema imune “novo”
ou “diferente”, e auto-tolerante nos pacientes com DAIs (Burt, Cohen et al., 2005;
Muraro e Douek, 2006). No entanto, estudos imunológicos moleculares e celulares
adicionais são necessários e importantes para um maior entendimento dos
mecanismos de ação da IAD/TACTH no tratamento do DM-1 e da EM. A
compreensão dos mecanismos de remissão das doenças é fundamental para o
estabelecimento da terapia de IAD/TACTH como alternativa terapêutica para a EM
e DM-1.
O êxito destes primeiros protocolos clínicos experimentais de fase I/II
desenvolvidos em nosso centro de pesquisa fomentou novas perspectivas de
aplicação da terapia de IAD/TACTH em outros grupos de pacientes, tais como
pacientes com EM surto-remissiva (inflamatória). Desse modo, no seguimento
desses ensaios clínicos e estudos já previamente realizados por nosso grupo, neste
projeto propomos avaliar se o TACTH precedido de IAD é capaz de induzir remissão
clínica prolongada em pacientes com EM surto-remissiva (inflamatória, refratária
ao tratamento com Interferon), bem como investigar os mecanismos imunológicos
(do ponto de vista molecular) da ação terapêutica da IAD/TACTH nessa doença.
Objetivo Geral
Este projeto tem como objetivo geral determinar se o transplante autólogo
de células-tronco hematopoéticas precedido de imunossupressão em altas doses é
capaz de induzir remissão clínica prolongada em pacientes com esclerose múltipla
surto-remissiva (inflamatória, refratária ao tratamento com interferon), bem como
investigar os mecanismos imunológicos e moleculares da ação terapêutica da
IAD/TACTH nessas doenças.
Metodologia
Pacientes com EM surto-remissiva (N=15) serão submetidos ao tratamento
com IAD/TACTH na Unidade de Transplante de Medula Óssea (TMO) do Hospital das
Clínicas da FMRP-USP, e acompanhados após o transplante quanto à resposta clínica
e laboratorial. O projeto clínico de IAD/TACTH para o tratamento de EM surtoremissiva foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da FMRP-USP
93
(Proc.
15503/05)
e
pela
Comissão
Nacional
de
Ética
em
Pesquisa
(25000.056576/2006-56; RG 12908). Este projeto clínico faz parte de um ensaio
clínico de fase III, multicêntrico e randomizado (MIST, Multiple Sclerosis
International Stem Cell Transplant Trial) que objetiva avaliar a eficácia da
IAD/TACTH em comparação ao tratamento convencional (Interferon, Copaxone ou
Mitoxantrone) em pacientes com EM surto-remissiva (inflamatória), refratária ao
tratamento com Interferon. Além do nosso centro, os outros centros participantes
do MIST são: Northwestern University (Chicago, USA), University of Califórnia (San
Diego-CA, USA), Baylor College of Medicine (Houston-TX, USA), Charite Hospital
(Berlin, Germany), Singapoure General Hospital (Singapoure) e Hospital Israelita
Albert Einstein (São Paulo-SP, Brasil).
Serão coletadas prospectivamente amostras de sangue periférico foram
coletadas dos pacientes com EM surto-remissiva antes (pré-mobilização) e após o
transplante (D+180, D+360, D+540, D+720), para isolamento de células T CD4+ e
CD8+. Será avaliado o perfil de expressão gênica diferencial das células T CD4+ e
CD8+ entre: a, pacientes pré/pós-TACTH e indivíduos saudáveis; a, pacientes préTACTH e pós-TACTH. A análise da expressão gênica será realizada pela técnica de
microarrays (plataforma Agilent, EUA) que já se encontra padronizada no
laboratório de Hematologia do Centro de Terapia Celular (CEPID FAPESP) do Centro
Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP. Os resultados dos estudos de expressão
gênica diferencial serão então analisados em programas de bioinformática
específicos para determinação dos genes diferencialmente expressos. Os resultados
de expressão gênica por microarrays serão validados pela técnica de RT-PCR em
tempo Real utilizando o 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems), técnica
esta que também se encontra padronizada em nosso laboratório.
Sub-projeto 30: Uso de Células-Tronco Mesenquimais no Tratamento e
Prevenção da Doença do Enxerto contra o Hospedeiro em pacientes submetidos
ao transplante de células-tronco hematopoéticas
Resumo
O transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas é considerado a
terapia de escolha no tratamento de diversas doenças, entre elas, neoplasias
94
hematopoéticas e outras doenças hematológicas. Entretanto, apesar dos pacientes
serem submetidos à imunosupressão para viabilizar a enxertia do transplante, pode
desencadear uma série de efeitos secundários, como por exemplo, a Doença do
Enxerto contra o Hospedeiro (DECH). A DECH é a principal causa da morbidade e
mortalidade em pacientes submetidos ao transplante de medula óssea (TMO). Essa
doença ocorre em virtude da ativação de células T em resposta a moléculas do
complexo de genes de histocompatibilidae principal (MHC) alogênico após um TMO
histocompatível. Desta maneira, os linfócitos T do doador reconhecem os antígenos
do hospedeiro como estranhos e desencadeiam a resposta imunológica contra as
mesmas. A DECH normalmente é classificada em duas formas: aguda (ocorrendo
geralmente até 100 dias após o transplante, com comprometimento de pele,
intestino e fígado) e crônica (ocorrendo geralmente mais de 100 dias após o
transplante, caracterizada por lesões semelhantes a erupções, ressecamento,
constrição ou esclerose de vários órgãos).
As células-tronco mesenquimais (CTM) são raras, estão presentes na medula
óssea com uma freqüência de 0,001% a 0,01% de todas células nucleadas
caracterizam-se pela positividade por pelo menos 4 marcadores de superfície,
entre eles, Stro-1+, CD73 (SH3/SH4), CD105 (SH2) e CD90 (Thy-1) e negatividade
para marcadores de células endoteliais (CD31, KDR, VE-cadherin) e de células
hematopoéticas (CD34, CD14 e CD45). Essas células apresentam a propriedade de
aderência ao plástico e podem ser cultivadas na presença de soro bovino fetal, com
rápida multiplicação de até aproximadamente 40 vezes. Obtêm-se, portanto, cerca
de um bilhão de células mesenquimais a partir da cultura de uma única célula.
Aliada a essa propriedade, as CTM células expressam níveis intermediários de MHC
classe I e não expressam os antígenos MHC classe II em sua superfície. A expressão
de MHC classe I é importante e evita que as células-tronco mesenquimais sejam
eliminadas pelos linfócitos NK (natural killer). Por outro lado, a ausência de MHC
classe II e de moléculas co-estimuladoras (CD40, CD40L, CD80 e CD86) permite que
este tipo celular desenvolva mecanismos de escape à vigilância imunológica
impedindo a ativação de linfócitos T CD4+ e T-CD8+. Esse potencial imunosupressor
conduziu diversos pesquisadores desenvolverem ensaios clínicos utilizando CTM
para o tratamento da DECH e em muitos casos o sucesso tem sido relatado (Le
Blanc, Frassoni et al., 2008). De maneira similar, o presente projeto visa ao uso das
95
CTM no tratamento e prevenção da doença do enxerto contra o hospedeiro em
pacientes submetidos ao transplante de células-tronco hematopoéticas.
Objetivos Gerais
Contribuir para a formação de recursos humanos, nucleação de pessoal e
integração com equipes multidisciplinares visando o desenvolvimento de protocolos
clínicos baseados na terapia celular.
Determinar a eficácia e segurança do uso de células-tronco mesenquimais
alogênicas expandidas in vitro para o tratamento de pacientes que desenvolveram
a doença do enxerto contra hospedeiro agudo após o transplante alogênico de
células-tronco hematopoéticas.
Determinar a eficácia e segurança do uso de células-tronco mesenquimais
alogênicas expandidas in vitro para a prevenção da doença do enxerto contra
hospedeiro agudo em pacientes que serão submetidos ao transplante alogênico de
células-tronco hematopoéticas.
Metodologia
Isolamento, seleção e cultivo de células-tronco mesenquimais do sangue da
medula óssea: será realizado o gradiente de ficoll para separação de células
mononucleares, seguida da contagem na câmara de Newbauer para a quantificação
do número de células mononucleares para o plaqueamento das mesmas. 72 hs após
o cultivo remover as células não aderentes e permitir a expansão das CTM com
trocas periódicas do meio de cultura;
Determinação do número de unidades formadoras de colônias: quantidades
fixas de células mononucleadas serão submetidas ao cultivo em placas de 5 mm e o
número de unidades formadoras de colônia realizadas entre os dias 5-7;
Caracterização imunofenotípica: Será realizada com um painel de 18
anticorpos monoclonais: CD105-FITC (SH-2) BD; CD73-PE (SH3/SH4) Pharmigen;
Stro-1 supernatant fluid ascite; CD90-PE (Thy-1) BD; CD29-PE (integrina b-1) BD;
CD13-PE (aminopeptidase-N) BD; HLA ABC-PE Pharmigen; CD49e-PE (VLA-5) BD;
CD54-PE (ICAM-1) BD; CD44-FITC (HCAM-1) BD; CD51/61-FITC (Avb5) Pharmigen;
CD106-PE (VCAM-1) BD; CD34-PE (Sialomucyn) BD; CD14-PE (LPS-R) BD; CD-45-FITC
(LCA) BD; HLA-DR BD; CD31-FITC (PECAM-1) BD; KDR (VEGFR-2) Sigma e Isotype
96
Simultest (IgG1/IgG2) BD. Para análise através de citometria de fluxo cerca de 2 x
105 células serão incubadas com os respectivos anticorpos seguindo as
recomendações dos fabricantes.
Potencial de diferenciação: Será avaliado o potencial de diferenciação em
adipócito, osteócito e condrócito conforme previamente relatado (Covas, Siufi et
al., 2003);
Perfil Citogenético: Amostras das culturas em garrafas estáticas e
biorreatores em fase exponencial de crescimento serão submetidas ao tratamento
com colcemid (0,15 µg/mL) por 4 horas à 37ºC, seguida da incubação com KCl
(0,075M) por 20 minutos. Posteriormente, as células serão fixadas em metanol e
ácido acético, lavadas e transferidas para lâminas que serão mantidas à
temperatura ambiente por um período de 24h, antes de se proceder à digestão com
tripsina. O restante do material será armazenado em freezer (-20ºC) para a
utilização durante as técnicas de hibridação in situ por fluorescência (SKY e FISH).
O processo de bandamento cromossômico será realizado com utilização de solução
de tripsina (1%), posteriormente enxaguadas em água corrente e submetidas à
coloração com Giemsa por 5 minutos. Após a coloração, as lâminas estarão prontas
para análise.
97
INDICADORES
Produção Bibliográfica
•
Número de artigos publicados: 150
•
Número de teses e dissertações defendidas: 40
•
Número de patentes depositadas: 6
•
Número de matérias ou reportagens veiculadas na mídia impressa ou
eletrônica
Outros produtos
Número de cursos oferecidos:
•
Cursos de Pós-graduação “lato sensu” para professores da área de
biologia: 2
•
Disciplinas de pós-graduação já oferecidas: 9
•
Disciplinas de pós-graduação a serem criadas: 12
Número de alunos atendidos:
•
Pós-graduação: 120
•
Graduação (iniciação científica): 12
•
Ensino fundamental e médio: 36.000
Número de pacientes incluídos nos estudos clínicos: 60
Número de modelos animais desenvolvidos: 9
Número de linhagens celulares derivadas: 20
Número de vetores produzidos: 15
Número de projetos concluídos: 30
Número de exposições ou apresentações realizadas: 12
Número de acessos às páginas do INCTC: >20.000
98
D) Detalhamento do Programa de Formação de Pessoal Qualificado
A proposta deste projeto como um todo visa em especial a formação de uma massa
crítica com a capacidade de interagir em todos os níveis de um processo de Terapia
Celular, desde a geração de células com as características necessárias até os
estudos clínicos. Esta universidade de metodologias empregadas neste projeto
possibilitam
aos
pós-graduandos
e
pesuisadores
envolvidos
uma
grande
oportunidade de “intercâmbio” pelos vários laboratórios do instituto e também dos
colaboradores internacionais.
99
DISCLIPLINAS OFERECIDAS
INSTITUIÇÃO
CÓDIGO
CARGA
HORÁRIA
CRÉDITOS
N.
VAGAS
FMRP/USP/Ribeirão
Preto
RCM5816
60 horas
4
9
75 horas
5
10
DISCIPLINA
Tópicos em cultura celular
com aplicação na pesquisa do
câncer
Técnicas de biologia
molecular aplicadas à
hemoterapia
Mecanismos celulares e
moleculares envolvidos na
fisiopatologia das Leucemias
Imunoterapia: fundamentos e
aplicações clínicas
Terapia Celular em Doenças
Inflamatórias, Auto-Imunes e
Neoplásicas: Aspectos Básicos
e Clínicos
Células-tronco e clonagem
animal
Morfofisiologia da placenta e
placentação
Biologia do Desenvolvimento
UNESP/Araraquara
FCF/USP/ Ribeirão
Preto
6046009-1
75 horas
5
10
FMRP/USP/Ribeirão
Preto
RIM5754
30 horas
2
10
FMRP/USP/Ribeirão
Preto
RCM5813
30 horas
2
10
FMVZ/USP/São Paulo
VCI5779
60 horas
4
20
FMVZ/USP/São Paulo
VCI5773
60 horas
4
20
FMVZ/USP/São Paulo
VCI5743
60 horas
4
20
NOVAS DISCLIPLINAS
DISCIPLINA
INSTITUIÇÃO
CARGA HORÁRIA
N. VAGAS
Curso de pós-graduação “lato sensu”
em Biologia - UNIVESP
Plataforma de Educação a
Distância
360 horas
900 professores
36.000 alunos
Curso de pós-graduação “lato sensu”
em Biologia - Pró-reitoria de Cultura
e Extensão
Plataforma de Educação a
Distância
360 horas
40
Métodos Moleculares Avançados para
Investigação Biológica
FCF/USP/ Ribeirão Preto
75 horas
15
Utilização de modelo animal para o
estudo de leucemias
FMRP/USP/Ribeirão Preto
60 horas
6
Conceitos de Biotecnologia e
Aplicações na Área Médica
FMRP/USP/Ribeirão Preto
60 horas
15
Interdisciplinaridade: Ferramenta
para Socialização do Conhecimento e
Construção da Cidadania
Museus e Espaços de
Ciências
45 horas
40
Utilização dos Recursos dos Museus e
Centros de Ciências para Dinamização
do Ensino
Centros e museus de
ciências
60 horas
40
Linguagem, Redação e Divulgação
Científica
EAD plataforma Moodle
45 horas
40
Oficinas de Divulgação Científica
30 horas
40
Metodologia da Pesquisa como
Ferramenta de Divulgação
60 horas
40
Mídia e Divulgação Científica
30 horas
40
Mediação em Centros e Museus de
Ciências
30 horas
40
Fundamentos da Educação Científica
30 horas
40
100
Na sequencia são listados as pessoas formadas pelos pesquisadores principais e
a sua atual posição, quando pertinente: (Formação de Recursos Humanos por
pesquisadores principais)
Orientador
Co-orientador
Orientado
Ano de
Conclusão
Posição Atual
1981
Professor Titular
Departamento de
Clínica Médica
Roberto Passetto
Falcão
Júlio César
Voltarelli
Roberto Passetto
Falcão
Eduardo Antonio
Donadi
1986
Roberto Passetto
Falcão
Silvia Beatriz
Vieira Ramos
1994
Roberto Passetto
Falcão
Gil Cunha de
Sanctis
1993
Diretor Médico
Roberto Passetto
Falcão
Raul Antonio de
Moraes
1995
Professor Adjunto
Roberto Passetto
Falcão
Eduardo
Magalhães Rego
1997
Roberto Passetto
Falcão
Sergio Luiz
Martins
2001
Professor
Associado do
Departamento de
Clínica Médica
Assistant Professor
of Obstetrics &
Gynecology.Divisio
n of Reproductive
Endocrinology &
Infertility
Professor
Associado do
Departamento de
Clínica Médica
Coordenador da
Divisão de
Análises Clínicas
Roberto Passetto
Falcão
Cintia Machado
2002
Roberto Passetto
Falcão
Rodrigo Tocantins
Calado
2003
Roberto Passetto
Falcão
Edgar Gil Rizzatti
2005
Roberto Passetto
Falcão
Nilce Marzola
Ideriha
1982
Professora
Associada
Roberto Passetto
Falcão
Suzana Beatriz
Veríssimo Melo
1982
professora
associada
Roberto Passetto
Falcão
Aureo Evangelista
Santana
1988
Professor
Associado
Roberto Passetto
Falcão
José Orivaldo
Mengele
1993
Professor Titular
CNPq/GM da
Fiocruz
Lewis Joel Greene
Augusto Cesar
Cropanese
Spadaro
1977
Professor titular
Lewis Joel Greene
Leila Maria
Beltramini Sabbag
1970
Professora
associada,.
Professor Adjunto
Hematology
Branch, National
Heart, Lung, and
Blood Institute
Coordenador do
Setor de
Hematologia
Instituição
País
Coordenador da Unidade de
Transplantes do HCRPUSPFaculdade de Medicina de
Ribeirão Preto
Brasil
Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto
Brasil
University of north Caroline
Fundação Hemocentro de
Ribeirão Preto
Coordenador de Pesquisas da
Fundação Hemope de
PernambucoDepartamento de
Medicina Clínica da Faculdade
de Medicina da Universidade de
Pernambuco
Chapel
Hill
Brasil
Brasil
Ribeirão Preto
Brasil
Laboratório Fleury
Brasil
Coordenadora do Laboratório de
Citometria de Fluxo da
Fundação Hemope de
PernambucoDepartamento de
Medicina Clínica da Faculdade
de Medicina da Universidade de
Pernambuco
Brasil
National Institutes of Health
Laboratório Fleury
Faculdade de Medicina da
Universidade Estadual de
Londrina
Departamento de Clinica Médica
Faculdade de Medicina da USPSP
Faculdade de Medicina
Veterinária de Jaboticabal
UNESP
Fiocruz Salvador, Bahia
Departamento de Física e
Química Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão
Preto, SP, Universidade de São
Paulo
Instituto de Física,
Informática, São Carlos, SP ,
Universidade de São Paulo
Bethesda
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Diretor da
Instituição
Brasil
101
OrientadorCoorientador
Ano de
Conclusão
Orientado
Posição Atual
Lewis Joel Greene
Silvia Nassif Del
Lama
1982
Professora
adjunta
Lewis Joel Greene
Lusiane Maria
Bendhack
1984
Professora
associada
Lewis Joel Greene
Clarice Izumi
1985
especialista em
laboratório,
Lewis Joel Greene
Vitor Marcel Faça
1998
pós-doutorando
Lewis Joel Greene
Sandra Pereira
Rodrigues
2000
pós-doutoranda
Lewis Joel Greene
Gustavo Antônio
de Souza
2002
Professor
universitário
Lewis Joel Greene
Fabíola Leslie A.
C. Mestriner
2006
Especialista em
Laboratório
Lewis Joel Greene
Augusto Cesar
Cropanese
Spadaro
1979
Professor titular
Lewis Joel Greene
Almir de Souza
Martins
1996
Professor adjunto
Lewis Joel Greene
Julio César
Padovan
1996
Pesquisador
Instituição
Departamento de Genética e
EvoluçãoCentro de Ciências
Biológicas e da Saúde,
Universidade Federal de São
Carlos, SP.
Química, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto, SP,
Centro de Química de
Proteínas, Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto,
utchinson Cancer Research
Center,Seattle
utchinson Cancer Research
Center,Seattle
The Gade Institute
Section for Microbiology and
Immunology
Departamento de
Farmacologia, Faculdade de
SP, Universidade de São Paulo
Diretor do Departamento de
Física e Química, Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto, SP,
Departamento de Fisiologia e
Biofísica, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, MG.
Rockefeller University
tamento de Biologia Celular,
Molecular e Bioagentes
Patogênicos, Faculdade de
Universidade de São Paulo.
Massachusetts General
Hospital , Harvard Medical
School, HMS,
Max Plank Institute of
Biochemistry, Department of
Proteomics and Signal
transduction
Departamento de Bioquímica,
Instituto de Biologia,
Campinas, SP.
Atividade profissional atual:
Professor Assistente
Departamento de Química,
Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro
Unité Mixte du Recherch UMR
763 (INSERM) - Hospital Robert
Debre - Pari
Ribeirão Preto
País
Brasil
Brasil
Brasil
Washington,
USA
Washington,
USA
University of
Bergen,
Norway
Brasil
Brasil
Brasil
New York,
USA
Brasil
Lewis Joel Greene
José César Rosa
1998
Professor doutor
Lewis Joel Greene
Carolina Bosch
Cabral
2004
pós-doutoranda
Lewis Joel Greene
Lyris Martins
Franco de Godoy
2004
pós-doutoranda
Lewis Joel Greene
Maria Sumiko Arita
Matsuura
Lewis Joel Greene
José Godinho Neto
1991 a
1993
Dimas Tadeu Covas
Ana Cristina Silva
Pinto
2007
pós-doutoranda
2006
Médica
2004
Médica
Ribeirão Preto
Brasil
2004
Gerente do
Laboratório de
Controle da
Qualidade
Ribeirão Preto
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Dimas Tadeu Covas
Dimas Tadeu Covas
Karen de Lima
Prata
Ana Paula Costa
Nunes da Cunha
Cozac
Maria Ângela
Pignata Ottoboni
professora
aposentada
USA
Alemanha
Brasil
Brasil
França
Brasil
102
Orientado
Ano de
Conclusão
Dimas Tadeu Covas
Eugenia Maria
Amorim Ubiali
2003
Coordenadora
Médica
Ribeirão Preto
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Marina A Coutinho
2003
Médica
Laboratório de Análises Clínicas
Brasil
Unidade de Emergência HCFMRP
Brasil
Posição Atual
Instituição
País
Dimas Tadeu Covas
Benedito de Pina
Almeida Prado Jr
2002
Médico
Responsável pela
Agência
Transfusional
Dimas Tadeu Covas
Luiz Paulo Cicogna
Faggioni
2001
Médico
Agência Nacional de Saúde
Suplementar
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Simone Kashima
Haddad
1996
Gerente do
Laboratório de
Biologia Molecular
Ribeirão Preto
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Virgínia P Picanço
2006
Pós-doutora
Ribeirão Preto
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Silvana Maria
Quintana
1997
Professor
FMRP-USP
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Elisa Maria
Carbolante
2004
Professora
FCFRP -USP
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Antonio Adilton O
Carneiro
2003
Professor
FFCL de Ribeirão Preto – USP
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Evamberto Garcia
Góes
2001
bolsista PIPE
FAPESP
Brasil
Dimas Tadeu Covas
Rita de Cássia Viu
Carrara
2001
Pós-doutora
Ribeirão Preto
Brasil
Eduardo Magalhães
Rego
Rodrigo Siqueira
Abreu e Lima
2007
Superintendente
Centro de Oncologia de Brasília
Brasil
Eduardo Magalhães
Rego
Gil Cunha de
Santis
2006
Diretor Médico
Ribierão Preto
Brasil
Eduardo Magalhães
Rego
Lorena Lobo
Figueiredo Pontes
2008
doutorado
Hospital das Clínicas da
Ribierão Preto
Brasil
Julio César Voltarelli
Márcia Piuvesan
1997
Profa. Doutora
Universidade Federal da Paraíba
Brasil
José Hermênio C.
Lima Filho
1997
Prof. Doutora
Universidade Federal do Paraná
Brasil
Maria Angélica
Watanabe
1998
Prof. Doutora
Londrina
Brasil
Ana Beatriz
Pereira Lima
Stracieri
1999
Médica
Hospital das Clínicas FMRP-USP
Brasil
Fabíola Attiê de
Castro
2001
Profa. Doutora
Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão
Preto- USP
Brasil
Kelen Cristina
Malmegrim
2006
Pós-doutoranda
Hemocentro de Ribeirão Preto
Brasil
Luís Paulo
Faggioni
2006
Médico
Agência Nacional de Saúde
Brasil
Sulani S. Souza
1996
Médica
Universidade Federal de Brasília
Brasil
Márcia Cristina
Furtado
Nascimento
1999
Médica
Pesquisadora
Instituto Oswaldo Cruz,
Salvador-BA
Brasil
Marta Maria L.
Lemos
2000
Médica
Hospital AC Camargo-SP
Brasil
Rejane Vieira
2001
Médica
Hospital Geral de Fortaleza-CE
Brasil
Eduardo AJ Paton
2003
Médico diretor
Hospital do Câncer, Barretos-SP
Brasil
Maria Carolina O.
Rodrigues
2006
Médico
Hospital das Clínicas- FMRP-USP
Brasil
Vivian Youssef
Khouri-
2007
Dentista
Hospital das Clínicas- FMRP-USP
Brasil
Professora Livre
Docente
Departamento de Morfologia e
Fisiologia FCAV/UNESP
Jaboticabal
Maria Angelica
Miglino
Maria Rita
Fernandes
Marchado
1995
Brasil
103
Ano de
Conclusão
Orientado
Maria Angelica
Miglino
Francisco Solano
Feitosa
1997
Maria Angelica
Miglino
Antonio Augusto
Coppi Maciel
Ribeiro
1998
Maria Angelica
Miglino
Cesar Augusto
Water
1999
Maria Angelica
Miglino
Francisco de Sales
Rezende Carvalho
1999
Maria Angelica
Miglino
Fernando Antônio
Ferreira
1999
Maria Angelica
Miglino
Adelmar
A.Amorim Junior
2000
Maria Angelica
Miglino
Miguel Ferreira
Cavalcante Filho
2000
Maria Angelica
Miglino
Rosa Helena dos
Santos Ferraz
2001
Maria Angelica
Miglino
Carlos Rosemberg
Luis
2001
Maria Angelica
Miglino
Rosana Marques e
Silva
2001
Maria Angelica
Miglino
Luciana Silveira
Flores Schoenau
2001
Maria Angelica
Miglino
Williams Gomes
Neves
2001
Maria Angelica
Miglino
Marilyne José
Afonso A. Lins
Amorim
Maria Amélia
Zogno
Maria Angelica
Miglino
Tatiana Carlesso
dos Santos
2002
Maria Angelica
Miglino
Moacir Franco de
Oliveira
2004
Maria Angelica
Miglino
Maria Angelica
Miglino
Flávia Thomaz
Verechia Pereira
Carlos Eduardo
Ambrosio
Maria Angelica
Miglino
Antonio Chaves de
Assis Neto
2005
Maria Angelica
Miglino
Lourivaldo Paz
landim
2005
Maria Angelica
Miglino
Daniele dos Santos
Martins
2006
Maria Angelica
Miglino
Erika Branco
2007
Lygia da Veiga
Pereira
Luciana Reis
Vasques
2003
Maria Angelica
Miglino
2001
2002
2004
2004
Posição Atual
Professor Titular
de Cirurgia
Veterinaria
Professor Livre
Docente em
Anatomia Animal
Professor Doutor
em Reprodução
Animal
Professor Doutor
em Cirurgia
Equina
Professor Titula
em Clínica e
Cirurgia
Veterinaria
Professor Doutor
em Anatomia
Professor Doutor
em Anatomia
Animal
Professora
Doutora em
Anatomia Animal
Professor doutor
em Anatomia
Animal
Professora de
Anatomia Animal
Professora
Doutora em
Anatomia Animal
Professor Doutor
em Anatomia
Animal
Professora
Doutora em
Anatomia Animal
Tecnica Nivel
Superior
Professora
Doutora em
Anatomia Animal
Professor Doutor
em Anatomia
Animal e Chefe de
Gabinete do
Reitor
Professor Doutor
em Histologia
Livre Docente em
Anatomia Animal
Professor Doutor
em Anatomia
Animal
Empresa de
Biotecnologia da
Reprodução
PesquisadoraCélul
as-tronco
Professora
Doutora em
Anatomia Animal
Professora
Visitante
Instituição
País
Univesidade Federal do Piaui
Brasil
FMVZ/USP
Brasil
Universidade Estadual do Ceará
Brasil
Universidade Federal de
Uberlandia
Brasil
Universidade Federal de
Uberlandia
Brasil
Universidade Federal do Recife
Brasil
Univesidade Federal do Piaui
Brasil
Professor Doutor na
Universidade Federal do Mato
Grosso
Brasil
Universidade Federal do Goias
Brasil
Universidade de Brasilia
Brasil
Universidade Federal de Santa
Maria RGS
Brasil
Universidade Federal do Piaui
Brasil
Universidade Federal do
Pernambuco
Brasil
FMVZ/USP
Brasil
Maringá
Brasil
UFERSAUniversidade do Semiárido Nordestino
Brasil
UNESP –Dracena
Brasil
FMVZ/ USP
Brasil
UNESP/Dracena
Brasil
BIOEMBRYO - Fertilização in
vitro.
Brasil
Instituto Butantan
Brasil
Universidade Federal Rural da
Amazonia
Brasil
Depto. de Biofísica da UNIFESP,
SP
Brasil
104
Lygia da Veiga
Pereira
Lygia da Veiga
Pereira
Ano de
Conclusão
Posição Atual
Denilse Sumita
2005
Diretora científica
e sócia
Empresa Genomics, SP
Brasil
Gaelle Chopin
Stukart Parsons
2006
Pós doutoranda
Universidade do Texas
EUA
Empresa GENZYME do Brasil
Brasil
Instituto Butantan
Brasil
Orientado
Lygia da Veiga
Pereira
Roberto
Rozenberg
2006
Pesquisador
desenvolvendo
projeto de
pesquisa
financiado pela
empresa GENZYME
do Brasil
Lygia da
Pereira
Lygia da
Pereira
Lygia da
Pereira
Lygia da
Pereira
Enrico Jardim
Clemente Santos
2001
Pós-doutorando
Christian Merkel
2002
Pós-doutorando
Ana Maria Fraga
2007
doutoranda
Raquel Stabellini
Em
andamento
Veiga
Veiga
Veiga
Veiga
Aplicando para
pós-doutorado
Instituição
Laboratório de Cardiologia
Molecular do InCor
Departamento de Genética e
Biologia Evolutiva, IB-USP
Instituto Biociências da USP
País
Brasil
Brasil
EUA
105
E) Detalhamento das Ações de Transferência de Conhecimento para a
Sociedade
A ciência é um empreendimento poderoso que pode melhorar a vida das
pessoas de forma substancial. Os cientistas tiveram, têm e terão participação
fundamental no desenvolvimento de novos medicamentos e tratamentos para
doenças que afetam milhões de pessoas, assim como tiveram no desenvolvimento
de técnicas que melhoraram a qualidade de vida como os modernos sistemas de
comunicação e os computadores, bem como terão papel no desenvolvimento de
novas tecnologias que possibilitarão o desenvolvimento sustentável da civilização
neste planeta de recursos limitados. Todos estes aspectos são e continuarão a ser
fundamentais para a sobrevivência do homem, razão pela qual o desenvolvimento
de uma ampla cultura científica se torna indispensável para garantir um futuro
melhor para as gerações vindouras. Para a manutenção e crescimento desta cultura
científica faz-se necessário, não somente a formação de cientistas profissionais,
mas também a formação científica de amplos segmentos da sociedade, incluindo
engenheiros, jornalistas, advogados, profissionais da saúde e, principalmente, de
professores de ciências que, juntamente com seus alunos do ensino fundamental e
médio, estão na base deste imenso sistema.
Por outro lado, o raciocínio científico fornece aos indivíduos uma base
segura para o desenvolvimento da linguagem, da lógica e da capacidade de resolver
problemas o que se reflete nos mais variados e amplos campos da atividade
humana e torna a educação cientifica um empreendimento necessário para
enfrentar as novas exigências do século XXI.
Este projeto tem a finalidade de diminuir o tempo entre a produção do
conhecimento e a apropriação deste pela sociedade. No mundo contemporâneo
variados espaços podem ser utilizados para a educação não formal, educação em
ciência e difusão do saber produzido. Os diversos atores do INCTC pretendem no
decurso de trinta e seis meses consolidar um arrojado programa de educação
científica formal e não formal com ampla capacidade para formação de recursos
humanos (RH). Nos doze meses iniciais autores, os de projetos científicos
alimentarão um banco de informações com temas de interesse da sociedade para
fins de educação científica. As experiências originadas de projetos de educação
não formal e difusão do conhecimento da equipe darão corpo a outro banco de
106
dados que será incorporado ao primeiro. Entre o 13° e 24° mês, identificar-se-á
entre os RH do IN, aqueles indivíduos capazes de produzir materiais, produtos ou
outros mecanismos de difusão do saber a partir das experiências catalogadas,
associadas ao conhecimento disponível. Também serão implementados um Cursos
de Pós-graduação Latu e Stricto senso em difusão do conhecimento e educação
científica não formal com 70% da carga horária (CH) à distância e 30% presencial. A
CH presencial acontecerá em espaços de divulgação científica das instituições
parceiras ou da comunidade. A CH não presencial será estruturada em Programa
EAD monitorada pelas Plataformas Moodle e TIDIA. Dentre os especialistas serão
identificados os indivíduos com habilidade para divulgação científica e estes
deverão compor um grupo que iniciará uma turma de mestrado profissionalizante.
Entre o 24° e o 36° mês, o INCTC avaliará as atividades de educação não formal
com foco na itinerância, executadas pelos museus para disponibilizar as
experiências validadas para a sociedade. As pesquisas dos mestrandos deverão
focar temas científicos de interesse social para difundir o saber ou para alimentar a
produção de material didático, publicações em mídia digital ou impressa, kits de
ciência, entre outras possibilidades. Nos últimos seis meses, os parceiros avaliarão
as diversas fases do processo de construção do grupo de especialistas e mestres,
com base nas experiências do grupo, buscando identificar em cada RH a capacidade
de inclusão de jovens nas ações, habilidade para criar produtos e competência para
itinerância entre outras. As experiências da equipe proponente somam-se dezenas
de projetos em andamento, ações de cinco museus ou espaços de ciências, além da
participação dos pesquisadores em inúmeras experiências regionais, nacionais e
internacionais
de
formação
de
RH
e
educação
científica,
que
darão
sustentabilidade a esta proposta.
Os projetos educacionais e de divulgação desenvolvidos no âmbito do INCTC
serão
inicialmente
disponibilizados
para
as
instituições
participantes
e,
posteriormente poderão ser disponibilizadas para outros parceiros.
Além das exposições e da produção de material para apresentação ao
público em geral, o INCTC propõe estabelecer uma forte interação com a escola de
nível fundamental e médio com o objetivo de contribuir de forma significativa para
a formação científica de professores de ciência e biologia e também de jovens
talentosos com interesse específico na área. Neste ponto, tem importância capital
o curso de pós-graduação latu senso (especialização) destinado a 900 professores
107
da escola pública. Este curso será oferecido predominantemente na modalidade de
ensino à distância (70% do conteúdo) pela Universidade Virtual do Estado de São
Paulo (UNIVESP) e deverá envolver 36.000 alunos regulares dos professores
participantes. O objetivo principal do curso é preparar os professores para ensinar
ciência utilizando experimentos controlados realizados nos laboratórios escolares,
na sala de aula ou observando a natureza. Essa tarefa não será fácil num primeiro
momento visto que muitas escolas abandonaram o expediente de ensino em
laboratórios e também porque muitas escolas não possuem laboratórios para o
ensino de ciências. Retormar esta prática exigirá esforço coordenado com as
Secretaria de Estado da Educação do Estado de São Paulo que também será
convidada a participar do projeto.
O material educacional que será utilizado existe em parte no acervo da Casa
da Ciência do CTC-Hemocentro que herdou o acervo completo do Laboratório de
Ensino de Ciências da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto –
USP com mais de 30 anos de experiência nesta área. Este material que passou pelo
processo
de
catalogação
e
está
sendo
digitalizado
será
atualizado
e
complementado com aulas teóricas e práticas produzidas nos estúdios e
laboratórios do CTC-Hemocentro. O Curso será disponibilizado por meio da
plataforma TIDIA e hospedado nos servidores educacionais do Hemocentro. Os
encontros presenciais ocorrerão no pólos educacionais da UNIVESP localizados nas
diversas unidades das Universidades Públicas Paulistas (USP-UNICAMP e UNESP). No
segundo ano, após avaliação do primeiro curso, a experiência poderá ser ampliada
para outros estados e para maior número de professores e alunos.
As atividade educacionais atuais do CTC-FAPESP serão mantidas e ampliadas,
dentro do projeto do INCTC, para todas as unidades participantes. O Jornal das
Ciências será editado bimestralmente e a sua tiragem será aumentada para 10.000
exemplares. O portal da Casa da Ciência também será ampliado, incorporando as
experiências e competências dos vários grupos participantes do INCTC.
108
OBJETIVOS GERAIS:
1. Estabelecer uma rede de informações entre os pesquisadores que permita a
estes e à equipe de divulgação científica do INC&T discutir o que de
pesquisas é interessante divulgar, quando e como;
2. Implantar um arrojado programa de formação de recursos humanos (RH)
para difundir o conhecimento;
3. Oferecer formação complementar por meio de cursos de pós-graduação latu
senso destinados aos professores de ciências e biologia da escola de ensiono
fundamental e médio;
4. Ampliar as oportunidades de iniciação científica para alunos talentosos do
ensino básico;
5. Contribuir com as autoridades educacionais na implementação de políticas
públicas voltadas para a promoção da educação científica da população
como fator de desenvolvimento social e econômico;
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Produzir um banco de dados com informações científicas sobre temas
diversos ligados aos projetos do Instituto Nacional de C&T para fins de
educação científica não formal com foco nas crianças e adolescentes
brasileiros e a população em geral;
2. Identificar entre os pares as iniciativas de difusão do conhecimento que já
existem, catalogá-las por tema, tipo e especialidade, para fins de aproveitálas no cumprimento das missões do instituto;
3. Incentivar jovens pesquisadores a participar de projetos ou iniciativas de
difusão do conhecimento que incluam estudantes de nível médio e superior;
4. Identificar recursos humanos com habilidade para traduzir a linguagem
científica a fim de divulgar e popularizar o conhecimento produzido;
109
5. Formar recursos humanos em cursos de Pós-graduação de Educação à
Distância (EAD), utilizando a plataforma Moodle e TIDIA. Preparar equipes
que desenvolvam competências para receber as informações científicas e
identificar formas de organizá-las para a divulgação, com foco no ensino
básico, conforme a missão da CAPES;
6. Formar RH com habilidade e competência para pensar diferentes
modalidades (ações) de difusão do saber cujo princípio se baseie na
transdisciplinaridade e no grau de letramento do público alvo a ser atingido;
7. Formatar ações de difusão que atinjam grandes grupos de pessoas;
8. Ter a itinerância como norteadora das ações de difusão e popularização do
saber produzido;
9. Eleger eventos internacionais, nacionais e regionais para fins de difusão do
saber produzido como: a Semana Nacional de C&T, Semana Nacional de
Museus, Semanas de Extensão das IES, Feiras de Ciências, Feiras de
Agricultura e Pecuária entre outras;
10. O projeto de difusão do conhecimento e educação em ciência deverá atingir
em três anos as metas estabelecidas como segue:
11. Meta 1: duração 12 meses
Etapa 1: Organizar um banco de dados, alimentado pelos pesquisadores do IN e
dos museus parceiros, com vistas a usar tais informações para difusão
do saber produzido de forma interdisciplinar.
Etapa 2: Identificar entre os parceiros as experiências de difusão das quais
tenham participado, suas formas, seus resultados para fins de formar
um banco de dados de difusão somando as experiências do grupo,
replicando o que for viável a nível nacional.
Meta 2: duração 18 meses
Etapa 1: Produzir material de difusão gerado a partir dos bancos de dados
científicos e experiências de difusão, catalogados nas Etapas 1 e 2 da
Meta 1, acrescido da literatura corrente para a construção dos
materiais de divulgação possíveis nesta fase. Ex: Kits de ciência, sites,
cartazes informativos, artigos para jornais e revistas magazines,
110
entrevistas, identificação de conferencistas, montagem de cursos,
oficinas de ciências, exposições temáticas, CDs, DVDs, filmes etc.
Etapa 2: Implementar
cursos
de
Pós-graduação
Lato
e
Stricto
sensu:
Especialização em Difusão e Popularização do Conhecimento com as
seguintes características: duração 18 meses; carga horária de 360
horas; 24 créditos (1 crédito= 15 horas de atividades programadas;
trabalho de conclusão de curso na forma de atividade de difusão
científica). Mestrado: duração 24 meses; carga horária de 450 horas;
30 créditos e dissertação apresentada na forma de método, processo
ou produto de difusão do conhecimento, que corresponderá a uma
carga horária equivalente a 15 créditos. Os cursos terão 70% de suas
atividades à distância e 30% presenciais.
Meta 3: duração 24 meses
Etapa 1: duração 24 meses
i. Dar continuidade ao Curso de Pós-graduação Interinstitucional Stricto
sensu (Mestrado profissionalizante) em divulgação científica. Nesta
etapa será feito seminário de orientação científica para definição e
discussão entre orientadores e orientados dos temas das pesquisas.
ii. Analisar o conjunto de informações contidas no banco de dados com a
finalidade de formatar ações de divulgação científica e popularização do
conhecimento.
iii. Identificar RH com habilidade e competência: para transferência do
saber; produção de materiais de divulgação; capacidade de análise do
discurso científico para comunicação com o público leigo; montagem de
exposições interativas, feiras e eventos; capacidade de produzir
ilustração científica, além de textos didáticos e informativos.
iv. Preparar um workshop com a finalidade de avaliar as atividades de
difusão do saber catalogadas no banco de informações e de dados de
pesquisa. Disponibilizar para os pós-graduandos e bolsistas, a literatura
111
adquirida no projeto, possibilitando que os mesmos misturem conceitos,
tendo a interdisciplinariedade como norteadora dos trabalhos de
conclusão de curso em formatação para apresentação destes no
workshop.
112
F) Detalhamento das Ações para transferência de conhecimento para o
Setor Empresarial ou para a formação de Políticas Públicas
Nas últimas décadas a economia global mudou profundamente as suas
características. Previamente baseada principalmente na terra, no trabalho e no
capital, a economia global atual está profundamente baseada no conhecimento. Os
sistemas produtivos e de inovação modernos apresentam como seu principal
componente a informação e o conhecimento, refletindo uma sociedade que se
transformou profundamente sob o impacto de novas tecnologias e que tem sido
denominada apropriadamente de Sociedade do Conhecimento. Nesta nova
Sociedade do Conhecimento, os limites entre público e privado, entre ciência e
tecnologia e entre Universidade e Indústria estão se atenuando progressivamente,
originando um sistema sobreposto que não existia anteriormente. Neste cenário,
tem aparecido um novo contexto organizacional no qual a indústria, o governo e a
academia tendem a integrar seus interesses e objetivos. Este novo ambiente
integrado Universidade-Indústria-Governo foi considerado por alguns, à semelhança
da dupla-hélice de DNA, uma tripla-hélice em desenvolvimento (Etzkowitz, 1996;
2000; Gebhardt, Pohlmann et al., 2004)
A proposta de transferência tecnológica e de inovação do CTC situa-se neste
novo contexto. Pretendemos catalisar o desenvolvimento de uma tripla-hélice onde
os interesses acadêmicos e de pesquisa estejam plenamente integrados aos
objetivos do governo e da indústria em consonância com os tempos modernos.
A transferência de tecnologia para o setor governamental ou empresarial é
uma da prioridades do INCTC. Os grupos envolvidos nesta proposta possuem
experiência comprovada nesta área e a perspectiva é que estas atividades possam
ser ampliadas.
O CTC-FAPESP apoiou o desenvolvimento de vários projetos tecnológicos
que resultaram em efetiva incorporação
de tecnologia pelo setor público. Dois
exemplos ilustram este ponto:
a) o desenvolvimento
de um sistema de irradiação de sangue e componentes
sanguíneos com base em unidades de teleterapia instaladas na rede hospitalar
(Chen, Covas et al., 2001; Goes, Covas et al., 2004; Goes, Borges et al., 2006;
113
Goes, Ottoboni et al., 2008). O conhecimento gerado foi disponibilizado para toda
a rede de serviços e hemocentro ligados ao sistema único de saúde (SUS).
b) o desenvolvimento de um susceptômetro supercondutor (SQUID) para
quantificação não invasiva do ferro hepático (Carneiro, 2003; Carneiro, Vilela et
al., 2004; Carneiro, Fernandes et al., 2005). Foi construído um protótipo do
equipamento que se encontra em funcionamento no Laboratório de Física Médica
da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP e, em breve,
um novo equipamento será instalado nas novas dependências do ambulatório do
Hemocentro de Ribeirão Preto.
Outro processo importante e que será ampliado no INCTC, foi o
desenvolvimento de sistemas de expressão de proteínas heterólogas em células
humanas. A prática dominante na indústria de biotecnologia é a produção de
proteínas recombinantes em sistemas procariotos ou em células de mamíferos não
humanos (CHO, BHK, etc.). Entretanto, as proteínas produzidas nestes sistemas
geralmente diferem das proteínas nativas em termos de glicosilação e mesmo de
folding, embora possam apresentar a mesma sequência
primaria.
De forma
original e bem sucedida, desenvolvemos um sistema para produção eficiente dos
fatores VIII e IX da coagulação em linhagens celulares humanas. No sistema
desenvolvido, a produção do fator VIII, por exemplo, foi de 15 a 20 vezes mais
eficiente do que a produção no sistema CHO convencional o que permitirá um
grande ganho em termos de rendimento e de economia. O sistema desenvolvido
esta sendo patenteado por meio da Agência USP de Inovação. O processo de
escalonamento para o nível industrial esta sendo feito com financiamento da FINEP
(Processo 0927/07) e em parceria com o IPT (Instituto Paulista de Tecnologia) e
com a Plantarium que é uma empresa privada.
Mais recentemente, dada a
diversidade do grupo, foi dado início a um estudo em Pirassununga visando
modificar o vetor de expressão e aplica-lo em células epiteliais da qualndula
mámária bovina adicionado de um promotor específico deste órgão (b- lacto
globulina). As células expressando a proteína de interesse servirá como doadora de
núcleo para a produção de animais portadores desta modificação.
Na sequência pretendemos desenvolver o processo de expressão de outras
proteínas de interesse médico e biológico, como por exemplo o fator VIII da
coagulação, fatores de crescimento celular como o VEGF e o IGF, proteínas virais
114
recombinantes para a geração de testes diagnósticos ou como antígenos. A
competência nesta área pode ser comprovada por publicações relacionadas ao
tema (Fontes, Davis et al., 2006; Penteado, Medeiros et al., 2006; Picanco, Heinz
et al., 2007; Russo-Carbolante, Penteado et al., 2007; Picanco-Castro, Fontes et
al., 2008; Picanco-Castro, Russo-Carbolante et al., 2008)
O desenvolvimento de células humanas modificadas, além de permitir a
produção em escala de proteínas recombinantes, também possibilitará o
desenvolvimento de terapia celular. Como descrito no subprojeto 22, por exemplo,
pretendemos testar o tratamento de camundongos hemofílicos B por meio do
transplante de células estreladas hepáticas modificadas com o gene do fator IX da
coagulação.
O desenvolvimento destas tecnologias atualmente é feito nos laboratórios de
pesquisa do CTC-Hemocentro. Está previsto, entretanto, a construção de um novo
prédio de 5.000 m2 (Laboratório de Biotecnologia) especificamente para esse fim e
com recursos já alocados pela Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo.
Outro
subprojeto
relacionado
ao
desenvolvimento
de
processos
biotecnológicos é a produção em larga escala de células-tronco ou progenitoras em
biorreatores. O objetivo é a amplificação do número de células, sem que ocorra a
diferenciação celular,
com a finalidade de disponibilizar células em número
suficiente para os estudos pré-clínicos e clínicos. Os subprojetos 2 e 23 têm por
objetivo desenvolver esta tecnologia para o cultivo de MSC e de CTE,
respectivamente.
Estes sistemas de cultivo precisarão ser desenvolvidos em
condições GMP (good manufacturing practices). Neste particular, a instituições
sede do CTC (Hemocentro de Ribeirão Preto) ocupa posição de destaque nacional.
Foi o primeiro serviço no Brasil a desenvolver um sistema de qualidade para
serviços de hemoterapia com base na norma ISO. Obteve a primeira certificação
nacional nesta área em 1999 e o modelo desenvolvido é considerado, hoje, padrão
internacional. Todos os serviços de terapia celular mantidos pelo Hemocentro são
certificados pela norma NBR ISO 9001:2000 o que garante um padrão de excelência
semelhante ou até mesmo superior à de muitos serviços europeus ou norteamericanos. Não bastasse esse desenvolvimento, os serviços do Hemocentro são
também acreditados pela American Association of Blood Banks (AABB) desde 2003.
115
Toda esta experiência na gestão da qualidade de produtos e serviços foi
usada na implementação das estruturas destinadas ao cultivo e à disponibilização
de células-tronco para terapia celular a saber: o banco de sangue de cordão
umbilical e de células-tronco humanas, o setor de criobiologia e os laboratórios de
cultivo de células humanas para uso terapêutico
que
compreendem
quatro
salas de cultura limpas equipadas com filtros HEPA e operando em condições GMP
desde 2006. Esta estrutura já permitiu a realização de importantes trabalhos
clínicos como o realizado por Voltarelli e col. cujos resultados foram publicados no
JAMA (Voltarelli, Couri et al., 2007) . Outros estudos clínicos de fase I estão em
andamento, incluindo o tratamento da DECHA pós-transplante de medula óssea
com células-tronco mesenquimais que até o momento já incluiu 13 pacientes e o
tratamento de pacientes com diabetes tipo I com este mesmo tipo de células e que
até o momento já incluiu um paciente. O próximo passo neste setor é a obtenção
da acreditação pela AABB especificamente para a terapia celular com célulastronco o que deve ocorrer no próximo ano.
Toda esta tecnologia desenvolvida (métodos de cultura em condições GMP,
controle de qualidade de processos e produtos, procedimentos operacionais
padrão, sistemas de qualificação de produtos e fornecedores, normas específicas
para a terapia celular que ainda não existem no país) está disponível para ser
transferida, tanto para o setor público como para o setor privado.
Adicionalmente, a incubadora de empresas ligada do CTC-Hemocentro de
Ribeirão Preto pretende desenvolver o seguinte conjunto de projetos que passarão
a integrar o programa de transferência do INCTC:
Programas e Projetos da Incubadora de Empresas
A forma pela qual a SUPERA irá executar suas ações e eventos mediante a
realização dos programas estruturados que estão em execução e os que serão
implantados. Todo o conteúdo programático e as etapas de realização já foram
definidas para todos os programas. Abaixo segue um breve resumo dos projetos.
a) Programa de Assessoria, Consultoria e Capacitação: Capacitará os empresários
vinculados a SUPERA, permitindo a estes adquirir conhecimento na área
empresarial. Apoiar a realização de parcerias e orientar na elaboração de propostas
para captação de recursos financeiros em órgãos de fomento. As praticas desta
116
frente envolvem: orientação para a elaboração de Planos de Negócios; análise e
Sabatina de Planos de Negócios; seleção de empreendimentos e/ou empresas e
assinatura dos contratos; acompanhamento das empresas e dos empreendedores
que se encontram na pré-incubação e hotel de projetos; por meio de um relatório
mensal e auditoria anual; disponibilização de consultorias específicas para os
incubados abrangendo as áreas de gestão e desenvolvimento tecnológico, gestão
financeira, gestão do marketing, assessoria jurídica e normatizações; atualização
periódica dos Planos de Negócios das empresas e elaboração de Planos de Negócios
dos empreendedores atendidos na modalidade hotel de projetos; capacitação dos
integrantes das empresas e dos empreendedores por meio de treinamentos para
desenvolvimento das competências empresariais fundamentadas nos conhecimentos
administrativos e tecnológicos; subsidiar a participação dos incubados em feiras de
negócios com recursos obtidos do SEBRAE e da FINEP; suporte para saída bem
sucedida das empresas residentes para o mercado, a partir de avaliação criteriosa
do Relatório de Desenvolvimento e do acompanhamento do Planos de Negócios;
capacitação permanente dos gestores da incubadora; participação da incubadora
no Projeto do Parque Tecnológico de Ribeirão Preto também com o objetivo de
apoiar a criação de um ambiente propício para a permanência no município das
empresas de base tecnológica que se graduam na SUPERA.
b) Programa INCPAR - Incubadoras de Base Tecnológica em Parceria para o
Desenvolvimento de Novos Negócios: é um projeto que visa prospecção de novos
projetos e a capacitação de empresas incubadas. Este projeto, que é financiado
pela FINEP, é uma parceria entre 5 incubadoras de base tecnológica do Estado de
São Paulo: a SUPERA de Ribeirão Preto (coordenadora do projeto), o CIE de São
José do Rio Preto, a INAGRO Jaboticabal, a IEJ de Jaboticabal e a Incubadora
Tecnológica de Botucatu. O projeto atua em duas grandes frentes:
•
Na prospecção de projetos de pesquisa ou de tecnologias com potencial de
mercado junto a universidades. Neste ponto deve-se destacar a presença da USP
em Ribeirão Preto e da UNESP em Botucatu, Jaboticabal e São José do Rio Preto,
além de várias universidades do setor privado. Sendo que estas universidades
públicas possuem em comum a pesquisa ligada a biotecnologia e saúde. O foco
dessa prospecção serão as áreas de concentração das pesquisas desenvolvidas por
estas universidades, que em linhas gerais são: Agronomia, Ciências Biológicas,
Equipamentos Médicos, Química, Saúde Humana, Saúde Animal, Tecnologia da
117
Informação. Embora essas áreas sejam priorizadas, projetos de outras áreas
também podem participar do IncPAR.
•
Em ações que visem o crescimento e fortalecimento das empresas incubadas
como: o oferecimento de cursos de capacitação e serviços especializados
direcionados ao aumento da competitividade destas empresas e da expansão de
seus mercados e o apoio financeiro para a participação em feiras de negócios. (Site
www.incpar.com.br)
c)
Programa Nacional de apoio a capacitação e prospecção de novos projetos
em Biotecnologia (Concurso de Plano de Negócios BioBusiness):
O BioBusiness
Brasil é um concurso de plano de negócios voltado à criação de empresas em
Biotecnologia e Saúde. A SUPERA apóia os participantes na elaboração dos Planos
de Negócios e premia os melhores. O 1º BioBusiness SUPERA captou 40 projetos, o
2° BioBusiness Brasil teveapoio de nove incubadoras de base tecnológica, captou 50
projetos (de 8 Estados diferentes) e foi premiado pela ANPROTEC como Melhor
Projeto de Promoção da Cultura do Empreendedorismo Inovador de 2007. As duas
edições somaram 94 projetos inscritos e para a SUPERA, resultaram em duas
empresas incubadas. A 3ª edição será lançada em outubro de 2008, durante a
Biolatina em 2008, e terá como meta a prospecção de 100 projetos (site:
www.concursobiotecnologia.com.br)
d) Programa de apoio a difusão da Cultura Empreendedora no Campus da USP de
Ribeirão Preto: O objetivo destas ações é incentivar a criação de novos negócios
pela transformação do conhecimento científico gerado na universidade em novos
produtos, gerando ao mesmo tempo uma alternativa de trabalho para os pósgraduandos das áreas tecnológicas e ampliar sustentavelmente o número de novos
projetos nos processos de seleção da SUPERA. Estas ações têm efeito no médio
prazo e visam a possibilidade de ampliação futura das vagas da incubadora pela
transferência das empresas para o Parque Tecnológico de Ribeirão Preto. As
principais ações são:
•
Trabalhar em conjunto com pós-graduação da FMRP para oferecer
semestralmente a disciplina “Inovação e Propriedade Intelectual” desenvolvida em
parceria com FEA-RP, SUPERA e Agencia de Inovação da USP;
118
•
Replicar a disciplina criada pela SUPERA em parceria com a Faculdade de
Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, mais especificamente com o
departamento de Química, intitulada “Empreendedorismo Tecnológico”. Essa
disciplina foi ministrada no primeiro semestre de 2008, para os cursos de
Bacharelado em Química, Bacharelado em Química Forense e Bacharelado com
Habilitação em Química Tecnológica, Biotecnologia e Agroindústria. O objetivo da
disciplina é de apresentar aos alunos o ambiente de empreendedorismo e inovação
do Campus da USP de Ribeirão Preto, incentivar a transferência das tecnologias
produzidas na universidade, bem como capacitar o aluno em ferramentas básicas
para planejar e colocar em prática uma empresa de base tecnológica, com a
finalidade de ampliar o número de novos projetos nos processos de seleção da
SUPERA.
e) Programa Nacional de geração de novos negócios (BRBiotec – Rede Brasileira de
Empresas de Biotecnologia): A BrBiotec – Rede Brasileira de Empresas de
Biotecnologia tem como objetivo geral ser uma rede de relacionamentos e de
negócios, a ser operada de forma digital e presencial, por meio de um portal de
negócios e pontos ou nós da rede localizados em locais estratégicos do país,
respectivamente, visando a integração entre empresas brasileiras de biotecnologia,
investidores, instituições de ensino e pesquisa, pesquisadores e governos federal,
estadual e municipal. Esta rede já recebeu aporte financeiro de R$ 400 mil do
Ministério da Saúde e está sendo executada em sua Fase Piloto de Estruturação
pelas Incubadoras, SUPERA, CIETEC e BIORIO, que estão articulando uma parceria
com o NISP - PROGRAMA NACIONAL DE SIMBIOSE INDUSTRIAL DO REINO UNIDO,
objetivando a troca de experiência e o desenvolvimento sustentável das empresas,
pela transformação de recursos de baixo valor na medida em que servem como
matérias-primas para outras empresas em insumos com valor agregado, produzindo
na maioria das vezes produtos inovadores.
f) Programa Primeira Empresa Empreendedora (PRIME): A SUPERA foi uma das 18
incubadoras escolhidas pela FINEP para atuar como uma operadora descentralizada
dessa instituição no Programa PRIME – Primeira Empresa Inovadora. O programa
pretende investir R$ 12 milhões em empresas nascentes de base tecnológica. A
empresa beneficiada pelo Prime terá o seu projeto apoiado por duas modalidades
de aporte operadas pela Finep. O valor total do financiamento será da ordem de R$
240 mil por empresa. Esses recursos serão liberados em dois anos, sendo que a
119
primeira parcela, de R$ 120 mil, virá do Programa de Subvenção Econômica à
Inovação. Nessa modalidade o recurso é não-reembolsável. Já a segunda e última
parcela utilizará dinheiro do Programa Juro Zero, que prevê a devolução do
empréstimo em cem vezes sem juros. Os primeiros R$ 120 mil serão repassados em
forma de subvenção econômica não-reembolsáveis e, por isso, são livres de
taxação. Esses recursos podem ser empregados para contratação de técnicos,
administradores e consultores. A SUPERA deverá lançar o edital para seleção das
empresas interessadas em receber o recurso da subvenção em novembro de 2008.
120
G) Descrição Detalhada do Grupo Proponente
O presente projeto de constituição do INCTC é uma iniciativa conjunta de
112 profissionais estudantes (Pesquisadores, alunos de pós-graduação, pós-docs e
técnicos da área de pesquisa) agregados
em onze grupos de pesquisa
representados pelos seus respectivos coordenadores. A figura 5 mostra este
universo profissional e acadêmico.
O Projeto será coordenado pelo Prof. Dr. Roberto Passetto Falcão,
pesquisador 1A do CNPQ e professor titular da Universidade de São Paulo com as
seguintes qualificações: possui graduação em Medicina Ribeirão Preto pela
Universidade de São Paulo (1966), doutorado em Clinica Médica Ribeirão Preto pela
Universidade de São Paulo (1972), pós-doutorado pela Oxford University (19751976) e livre-docência pela USP (1980). Atualmente é professor titular da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Tem
experiência na área de Medicina, com ênfase em Clínica Médica e Hematologia e
Imunologia atuando principalmente nos seguintes temas: anemia aplástica,
linfócitos, doenças mielo e linfoproliferativas. Pontos de destaque no seu
CV:http://lattes.cnpq.br/0739840296573834
1. Vice-coordenador do Projeto CEPID-FAPESP Center for Research on CellBased Therapy , iniciado em 2.000, no valor de R$ 9.022.029,65 e U$
3.830.000
2. Chefe do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de
Rbeirão Preto no período de 1997-2001. Este Departamento é o maior da
FMRP conta com 60 docentes e um dos líderes de produção científica desta
unidade da USP
3. Presidente do Colégio Brasileiro de Hematologia no período 1998 a 2005.
4. Coordenador da Divisão de Hematologia do Departamento de Clínica Médica
da FMRP e do Laboratório de Hematologia do Hospital das Clínicas de
Ribeirão Preto desde 1988. Esta divisão foi responsável pela formação de
aproximadamente 80 residentes e numerosos estagiários que exercem
atividade profissional ou acadêmica em todo o Brasil ou no exterior.
121
5. Fundador (1993) e Coordenador da Escola Brasileira de Hematologia,
entidade que oferece cursos de educação continuada na área de
Hematologia. Até o momento, foram oferecidos 21 cursos, cobrindo
diferentes áreas da hematologia. A partir de 2.000 estabeleceu cooperação
com a European School of Hematology com a vinda de palestrantes e uso de
material desta entidade para cursos tutoriais.
6. Publicou 127 artigos científicos relacionadas no sistema de currículos Lattes,
sendo 100 listados no PubMed (falcão rp; passetto falcão r; passeto falcão r;
falcão r). Possui 666 citações e indice h de 14. Orientou 5 dissertações de
mestrado e 9 teses de doutorado. Foi co-orientador de outras 3 dissertaçoes
de mestrado e 2 teses de doutorado. Atualmente orientada um aluno de pósdoutorado, um de doutorado e dois de mestrado. Apresentou 181
comunicações em congressos com resumos publicados. Recebeu 10 prêmios
relacionados com estes trabalhos.
7. Redigiu 19 capítulos em livros e é editor com Marco Antonio Zago e Ricardo
Pasquini do livro Hematologia. Fundamentos e prática médica. 1/1. ed. São
Paulo: Atheneu, 2004. v. 1. 1081 p que possui 50 colaboradores.
8. Representante da SBPC no Conselho Nacional de Saúde
9. Membro do conselho editorial da Revista da Associação Médica Brasileira, da
revista Einstein, da Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia e da
Hematology/Oncology and Stem Cell Therapy
Participam ainda nesta proposta como pesquisadores principais:
1.
Dimas Tadeu Covas – pesquisador 1D do CNPq, graduado em Medicina pela
Universidade de São Paulo (1981), mestrado em Medicina pela Universidade de São
Paulo (1986) , doutorado em Medicina pela Universidade de São Paulo (1993) e
livre-docência pela mesma Universidade em 1999. Atualmente é professor
associado da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo,
Diretor-Presidente
da
Fundação
Hemocentro
de
Ribeirão
Preto
e
Coordenador de Transferência do Centro de Terapia Celular (CTC-CEPID-FAPESP). É
hematologista e hemoterapeuta e desenvolve pesquisas nos seguintes temas:
biologia molecular e celular, células-tronco, antígenos eritrocitários e plaquetários,
122
vírus (HIV e HTLV), expressão heteróloga de protéinas em sistemas celulares in
vitro. É membro atuante na Sociedade Brasileira de Hematologia e Hemoterapia e
do Colégio Brasileiro de Hematologia sendo no momento o seu tesoureiro. É editor
associado da Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia e foi um dos
fundadores da Escola Brasileira de Hematologia. É membro da Academia de
Ciências de Ribeirão Preto. Tem atuação na área de divulgação da ciência e da
educação tendo organizado cursos de pós-graduação para professores e alunos do
ensino fundamental e médio. Editou dois livros, sendo um deles ganhador do
Prêmio Jabuti em 2007. Publicou 75 artigos em periódicos especializados, em
congressos publicou 380 trabalhos entre completos e resumos, 12 capítulos de
livros e 10 livros. Participou 121 eventos no Brasil e no exterior e orientou 18
dissertações de mestrado e 5 teses de doutorado, alem de ter orientado 2 trabalhos
de
iniciação
e
recebeu
9
prêmios
e/ou
homenagens.
http://lattes.cnpq.br/5244926449437566
2.
Lewis Joel Greene – pesquisador 1A CNPq, atualmente é professor titular
voluntário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
no departamento de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos. É
supervisor do Centro de Química de Proteínas, na Fundação Hemocentro de
Ribeirão Preto, onde desenvolve estudos de caracterização química, funcional e
estrutural de proteínas, utilizando abordagens tradicionais em química de proteínas
e análise proteômica. As linhas de pesquisa desenvolvidas compreendem: a)
Estudos de caracterização funcional e estrutural de proteínas em processos de
proliferação e diferenciação celular de células progenitoras hematopoiéticas e
células tumorais humanas, utilizando abordagem proteômica; e b) Caracterização
química e biológica de proteínas biologicamente ativas utilizando métodos
tradicionais em química de proteínas. Publicou 112 artigos em periódicos
especializados, em congressos publicou 243 trabalhos entre completos e resumos e
3 capítulos de livros. Orientou 20 dissertações de mestrado e 21 teses de
doutorado,
alem
de
ter
orientado
2
trabalhos
de
iniciação.
3.
Maria Angélica Miglino – pesquisador 1A CNPq Maria Angélica Miglino
concluiu o doutorado em ciências (anatomia funcional: estrutura e ultra-estrutura)
123
pela Universidade de São Paulo em 1985. Atualmente e professor titular da
Universidade de São Paulo. Publicou 294 artigos em periódicos especializados e 366
trabalhos em anais de eventos. Possui 5 capítulos de livros e 2 livros publicados.
Possui 1 processo ou técnica e outros 10 itens de produção técnica. Participou de
23 eventos no exterior e 59 no brasil. Orientou 23 dissertações de mestrado e coorientou 1, orientou 27 teses de doutorado e co-orientou 2 teses de doutorado,
além de ter orientado 21 trabalhos de iniciação cientifica nas áreas de medicina
veterinária e morfologia. Recebeu 8 prêmios e/ou homenagens. Entre 1993 e 2004,
coordenou 36 projetos de pesquisa. Atualmente participa de 24 projetos de
pesquisa, sendo que coordena 22 destes. Atua na área de medicina veterinária,
com ênfase em reprodução animal. Em suas atividades profissionais interagiu com
941 colaboradores em co-autorias de trabalhos científicos. Em seu Curriculo Lattes
os termos mais freqüentes na contextualização da produção cientifica, tecnológica
e artistico-cultural sao: placenta, anatomia, morfologia, bovinos, estudo,
ruminantes, cães, arterial, paca e vascularizacao.
4.
Lygia Veiga Pereira, Ph.D, possui Bacharelado em Física pela Pontifícia
Universidade Católica do Rio de Janeiro (1988), mestrado em Ciências Biológicas
(Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1990) e Ph.D. em
Biomedical Sciences - Mount Sinai School of Medicine, City University of New York
(1994). Atualmente é Professora Associada MS5 (livre docente) da Universidade de
São Paulo, membro da Academia de Ciências do Estado de São Paulo, e chefe do
Laboratório de Genética Molecular do Instituto de Biociências, USP. Tem
experiência na área de Genética, com ênfase em Genética Molecular Humana,
atuando principalmente nos seguintes temas: modelos animais de doenças
genética, células-tronco embrionárias, herança epigenética e inativação do
cromossomo X. Autor de dois livros de divulgação científica: “Sequenciaram o
Genoma Humano... E Agora?” e “Clonagem: da Ovelha Dollly às Células-Tronco”,
Editora Moderna. Publicou 39 artigos em periódicos especializados, em congressos
publicou 30 trabalhos entre completos e resumos, 7 capítulos de livros e 4 livros.
Publicou 35 textos em revistas/jornais, orientou 4 dissertações de mestrado, 8
teses
de
doutorado
e
recebeu
9
prêmios
e/ou
homenagens.
124
5.
Stevens Kastrup Rehen- pesquisador 2 do CNPq, é Biólogo (UFRJ, 1994),
Mestre em Ciências Biológicas (UFRJ, 1996), Doutor em Ciências (UFRJ, 2000), pósdoutorado pela Universidade da Califórnia em San Diego, Estados Unidos (20002003), pesquisador associado ao Instituto de Pesquisa Scripps da Califórnia desde
2005, Fellow da Pew Foundation, Pesquisador Nível 2 do CNPq e Professor Adjunto
da UFRJ. Dedica-se à pesquisa básica e estudo dos mecanismos de diferenciação
neural a partir de células-tronco embrionárias e induzidas e seu cultivo em grande
escala. Atualmente possui 23 artigos científicos publicados em revistas científicas
indexadas, sendo 11 deles produzidos exclusivamente no Brasil, além de 8 capítulos
de livro, 16 artigos de divulgação científica, 11 comentários sobre ciência em
revistas digitais e 1 livro de divulgação científica. Chefia o laboratório de
Neurogênese e Diferenciação Celular do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ.
Já orientou 8 de alunos de iniciação científica e dois alunos de mestrado. No
momento supervisiona 1 pesquisador (pós-doutorando), 6 alunos de doutorado, 3 de
alunos de mestrado e 5 estudantes de iniciação científica. É revisor em 7 periódicos
internacionais e Membro Afiliado da Academia Brasileira de Ciências. Mais detalhes
em: http://lattes.cnpq.br/3274735424220270
6.
Wilson Araújo da Silva Jr. – pesquisador 1D do CNPq, é graduado em
Biologia Modalidade Médica (Biomedicina) pela Universidade Federal do Pará
(1989), mestrado em Genética pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo (1993) e doutorado em Genética USP-RP pela Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (1999). Realizou o Pósdoutorado em Genética do Câncer no "Ludwig Institute at Memorial Sloan-Kattering
Cancer Center, New York City, NY". É Professor Associado do Depatamento de
Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Desenvolve pesquisas
em Genética Humana e Médica, atuando principalmente nos seguintes temas:
Polimorfismo de DNA, Bioinformática e Genética do Câncer. Publicou 79 artigos em
periódicos especializados, em congressos publicou 80 trabalhos entre completos e
resumos, orientou 9 dissertações de mestrado, 6 teses de doutorado, alem de ter
orientado 3 iniciações cientificas e recebeu 5 prêmios e/ou homenagens.
125
7.
Eduardo Magalhães Rego – pesquisador
2 do CNPq, possui graduação
emMedicina pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (1988) e doutorado em Clínica Médica pela mesma instituição (1997).
Realizou o pós-doutorado no Memorial Sloan Kettering Cancer Center de Nova York.
Atualmente é professor associado da Universidade de São Paulo e atua na área de
Hematologia. Sua linha de pesquisa versa sobre a gênese das leucemias agudas com
especial ênfase na leucemia promielocítica aguda. Publicou estudos demonstrando
que os genes híbridos PML/RARa, PLZF/RARa, NPM/RARa e NuMA/RARa foram
capazes de induzir leucemia em camundongos transgênicos. Estes modelos
transgênicos foram usados no estudo das bases moleculares das leucemias e na
pesquisa de novas modalidades terapêuticas. Também estuda a relação entre o
funcionamento dos ribossomos e a gênese do câncer por meio da análise de
camundongos mutantes para o gene DKC1. Seus principais trabalhos são: 1. Yoon A,
Peng G, Brandenburger Y, Zollo O, Xu W, Rego E, Ruggero D. Impaired control of
IRES-mediated translation in X-linked dyskeratosis congenita. Science. 2006 May
12;312(5775):902-6. 2. Rego EM, Ruggero D, Tribioli C, Cattoretti G, Kogan S,
Redner RL, Pandolfi PP. Leukemia with distinct phenotypes in transgenic mice
expressing PML/RAR alpha, PLZF/RAR alpha or NPM/RAR alpha. Oncogene. 2006
Mar 23;25(13):1974-9. 3. Rego EM, Wang ZG, Peruzzi D, He LZ, Cordon-Cardo C,
Pandolfi PP. Role of promyelocytic leukemia (PML) protein in tumor suppression.J
Exp Med. 2001 Feb 19;193(4):521-29. 4. Rego EM, He LZ, Warrell RP Jr, Wang ZG,
Pandolfi PP. Retinoic acid (RA) and As2O3 treatment in transgenic models of acute
promyelocytic leukemia (APL) unravel the distinct nature of the leukemogenic
process induced by the PML-RARalpha and PLZF-RARalpha oncoproteins. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2000 Aug 29;97(18):10173-8
Publicou 50 artigos em periódicos
especializados, em congressos publicou 162 trabalhos entre completos e resumos 10
livros. Participou 91 eventos no Brasil e no exterior e orientou 5 dissertações de
mestrado e 4 teses de doutorado, alem de ter orientado 4 trabalhos de iniciação e
recebeu 10 prêmios e/ou homenagens. http://lattes.cnpq.br/1543544998729361
8.
Júlio Cesar Voltarelli - pesquisador 2 do CNPq, possui graduação em
Medicina pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (FMRP-USP) (1967-1972), residência em Clínica Médica e Hematologia pelo
126
Hospital das Clínicas da FMRP-USP (1973-74), mestrado (1975-1978) e doutorado
(1978-1981) em Clínica Médica pela FMRP-USP. Possui pós-doutorado pela
Universidade da Califórnia em San Francisco-USA (1985-86), pelo Fred Hutchinson
Cancer Research Center em Seattle-USA (1987-88) e pelo Scripps Research Institute
em San Diego-USA (1999-2000). Atualmente é Professor Titular do Departamento de
Clínica Médica da FMRP-USP, coordenador da Divisão de Imunologia Clínica, do
Laboratório de Imunogenética (HLA) e da Unidade de Transplante de Medula Óssea
do HC-FMRP-USP. É um dos pesquisadores do Centro de Terapia Celular (CEPIDFAPESP), sediado no Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP. Publicou 99
artigos em periódicos especializados, em congressos publicou 41 trabalhos entre
completos e resumos, 13 capítulos de livros. Orientou 13 dissertações de mestrado,
4 teses de doutorado e recebeu 6 prêmios e/ou homenagens. Tem experiência na
área de Imunologia Clínica e Hematologia, com ênfase em: transplante de célulastronco hematopoéticas em doenças auto-imunese doenças hematológicas malignas
e benignas; diagnóstico e tratamento de imunodeficiências secundárias e doenças
reumáticas; seleção de doadores para transplantes renais e de medulas óssea.
9.
Flávio Vieira Meirelles – pesquisador 2 do CNPq, Médico Veterinário pela
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (1993), mestre em Sciences
Vétérinaires Option Reproduction - Universite de Montreal (1997) e doutor em
Genética pela Universidade de São Paulo (1999). Atualmente é prof.associado ms5
(livre docente) da Universidade de São Paulo, assessor ad hoc da Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Pauloentre outras, editor associado da
Genetics And Molecular Research, da Sociedade Brasileira de Técnologia de
Embriões e assessor das revistas Heredity, animal genetics e Genetics And
Molecular Biology entre outras. Tem experiência na área de Genética, com ênfase
em Herança Citoplasmática, atuando principalmente nos seguintes temas: mtdna,
bos indicus, cattle, embryos e apoptosis. http://lattes.cnpq.br/6698246156573680
10.
Lawrence Charles Smith, possui graduação em Medicina Veterinária Campus
Jaboticabal pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (1981),
mestrado em Faculty of Sciences pela Université d'Édimbourg (1984) e doutorado
127
em Physiology and Genetics pela Faculty of Sciences and Institute of animal
physiology and genetics (1989) . Atualmente é Professor Titular da Centre de
recherche en reproduction animale. Faculté de Médecine Vétérinaire. Atuando
principalmente nos seguintes temas: Interações nucleo-citoplasmáticas, embriões,
clonagem. organizado cursos de pós-graduação para professores e alunos do ensino
fundamental e médio. Editou dois livros, sendo um deles ganhador do Prêmio
Jabuti em 2007. Publicou 59 artigos em periódicos especializados, 13 capítulos de
livros e orientou 9 dissertações de mestrado e 9 teses de doutorado,
11.
João Palermo Neto, possui bolsa produtividade Nivel 1B CNPq. Atualmente é
professor titular da Universidade de São Paulo, assessor da Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo, Food And Agricultural Organization Of The United
Nations, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, Fundação de
Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul e assessor ´ad hoc´ do Conselho Nacional de
Desenvolvimento
Científico
e
Tecnológico.
Tem
experiência
na
área
de
Farmacologia, com ênfase em Neuropsicofarmacologia, atuando principalmente nos
seguintes temas: SNC, diazepam, dopamina, neuroimunomodulação, imunidade
inata e estresse. Publicou 137 artigos em periódicos especializados, em congressos
publicou 304 trabalhos entre completos e resumos, 21 capítulos de livros e 2 livros.
Participou 67 eventos no Brasil e no exterior e orientou 36 dissertações de
mestrado e 25 teses de doutorado, alem de ter orientado 18 trabalhos de iniciação
e recebeu 14 prêmios e/ou homenagens.
Colaboradores Internacionais
Colaborador
Posição
Angelo A Cardoso
Assistant Professor
Esmail D Zanjani
Professor and Chair
Graça Duarte de
Almeida Porada
Professor
Instituição
Departament of Medicine and
Departamento of Medical and
Molecular Genetics
Indiana University
Department of Animal
Biotechnology
School of Veterinary Medidne
University of Nevada,
Director of Graduate Studies
Department of Animal Biotechnology
University of Nevada
País
USA
USA
USA
128
Stefan K. Bohlander
Alysson R. Muotri
Professor
Assistant Professor
Richard Burt
Chief
W. Allan King
Professor
Molecular Hematology and Oncology
Medical College California University
Immunotherapy Northwestern
University
Veterinary Faculty
Alemanha
USA
USA
Canadá
Demais Pesquisadores
Pesquisador
Aglair B Garcia
Aiana Aparecida Marques
Alessana de Paula Sousa
Alexane Krause
Aline Marie Fernandes
Ana Elisa Teófilo Saturi
Ana Maria Fraga
Anelisa Ramão
Anemari Ramos Dinardi dos Santos
Aparecida Maria Fontes
Barbara Amélia Santana-Lemos
Bruna da Silveira Paulsen
Carla Martins Kaneto
Carlos Eduardo Couri
Carolina Caliári
Clarice Izumi
Cristiane Ayres Ferreira
Dalila Lucíola Zanette
Daniel Roigues Furtado
Daniel Veloso Cadilhe
Daniele dos Santos Martins
Dorotéa de Fátima Lobato da Silva
Elisa Maria de Sousa Russo Carbolante
Fabiana Fernandes Bressan
Pesquisador
Fabio da Silva Lima da Conceição
Fábio Morato de Oliveira
Flávia Thomaz Verechia Pereira
Gabriela Trentin Scortegagna
Gislane Lelis Vilela Oliveira
Glauce Gaspar Gomes
Greice Aneotti de Molfetta
Guilherme Augusto Silva dos Santos
Helen Cristina Miranda
Helen Julie Laure
Irina Kerkis
Isabella Roigues Fernandes
Ismael Carlos da Silva Gomes
José Augusto Pereira Carneiro Muniz
José César Rosa
Juliana Navarro Ueda Yaochite
Jussara Rocha Ferreira
Karen Lima Prata
CPF
7513030898
162261158-66
838.333.743-49
107.813.958.01
024489179-65
350.962.198-01
275344048-43
325324538-18
26405233847
131.138.028-06
000690966-35
119114717-75
223688858-97
011.751.706-23
28589965805
047928268-45
618602631-00
969077709-20
081014017-92
094371467-21
294226528-04
252647532-53
11833639820
30406083800
CPF
122497527-88
611.264.201-82
191.637.838-27
003.734.310-66
296.365.678-59
26984279810
162092368-80
75620421015
3464548910
134443818-08
5218440701
053467107-10
033358872-04
572119810
339.181.138-25
253326589-91
921.482.986-15
129
Karla Pelegrino
Kelen Cristina R. M. de Farias
Leana Naira Zambelli Ramalho
Leonardo Barcelos de Paula
Lewis Joel Greene
Lucas Oliveira Sousa
Manuela Barbieri
Marcela Gimenez
Maria Carolina de Oliveira
Maria Izabel de Jesus
Mariana Paranhos Stelling
Maristela Delgado Orellana
Nathalia dos Reis Lestard
Patrícia Cristina Baleeiro Beltrão Braga
Patrícia Vianna Bonini Palma
Paulo Ane Nobrega Marinho
Paulo Henrique Gomes de Castro
Priscila Britto Campos
Rafael Bierig Erlich
Rafaela Sartore da Costa
Renato Lopes Fernandes de Medeiros
Ricardo B. Silva
Rochele Azevedo
Rodrigo Alexane Panepucci
Silvia Massironi
Simone Kashima Haddad
Virgínia Picanço e Castro
Walber Victor de Moraes Pinto
067399106-77
260.788.318-01
144.552.438-44
005503411-02
746980878-72
5767651839
260649078-94
051039746-81
175.398.148-45
271063732-49
099473577-40
108.986.168-08
114946287-67
145.996.838-76
159.952.578-03
098890587-66
251854462-34
096010417-88
011711027-20
055417617-35
593776822-15
215.905.478-02
254.862.308-42
010849778-00
183.226.048-82
79.929.400.168
468142802-72
130
Colaboradores
Internacionais (6)
Pesquisadores (-)
Pesquisadores (4)
Pós-doutores (1)
Pós-doutores (4)
Dimas Tadeu Covas
Roberto Passetto
Falcão
Doutorandos (1)
Mestrandos (2)
Mestrandos (12)
Técnicos (1)
Técnicos (1)
Pesquisadores(-)
Doutorandos (9)
Pesquisadores(-)
Pós-doutores(-)
Pós-doutores (2)
Stevens Kastrup
Rehen
Doutorandos (7)
Mestrandos (3)
Eduardo Magalhães
R
Doutorandos (9)
Mestrandos (1)
Técnicos (1)
Técnicos (1)
Pesquisadores(-)
Pesquisadores (2)
INCTC
Pós-doutores(-)
Lygia da Veiga Pereira
Doutorandos (1)
Pós-doutores (2)
Lewis Joel Greene
(PI)
Doutorandos (8)
Mestrandos (5)
Mestrandos (4)
Técnicos (2)
Técnicos (-)
Pesquisadores (7)
Pesquisadores (6)
Pós-doutores (3)
Doutorandos (4)
Mestrandos (5)
Técnicos (1)
Pós-doutores (5)
Flávio Meirelles
Lawrence C. Smith
Maria Angélica Miglino
João Palermo Neto
Pesquisadores (2)
Pesquisadores(-)
Pós-doutores (1)
Doutorandos (4)
Mestrandos (5)
Técnicos (10)
Doutorandos (9)
Mestrandos (3)
Técnicos (3)
Pós-doutores (1)
Júlio César Voltarelli
Wilson Araújo da Silva
i
Klena Sarges Marruaz da
Silva
Instituto Evandro Chagas Belém - PA
Doutorandos (6)
Mestrandos (2)
Técnicos (-)
131
H) Especificação das Atividades a Serem Desempenhadas pelos Membros da Equipe
Pesquisadores
(PI)
Subprojetos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Roberto
Passetto
Falcão
Dimas Tadeu
Covas
Eduardo
Magalhães
Rego
Lewis Joel
Greene
Maria Angélica
Miglino
Wilson Araújo
da Silva Junior
Júlio César
Voltarelli
Flávio Vieira
Meirelles
Lawrence
CharlesSmith
Lygia da Veiga
Pereira
Stevens
Kastrup Rehen
Klena Sarges
Marruaz da
Silva
132
I) Mecanismos que Serão Utilizados para Promover a Interação entre os
Grupos de Pesquisa
A interação entre os grupos de pesquisa ocorrerá em vários momentos e de
forma variadas começando pela atuação nos projetos de pesquisa que são, desde a
sua concepção, multilaterais e complementares (item H).
Alem desse aspecto fundamental, a Coordenação do INCTC é composta por
pesquisadores principais dos cinco centros que se associaram na apresentação do
projeto (FMVSP-USP, IB-USP, UFRJ, CTC, FZEA-USP) o que garante que a integração
ocorra durante a vigência do projeto. Outros mecanismos de interação estão
previstos incluindo a realização de reuniões de progresso a cada 3 meses e a
organização de um simpósio com os integrantes nacionais e internacionais do
projeto pelo menos uma vez ao ano. A interação no dia-a-dia estará garantida pela
existência
de
um
espaço
comum
de
interação
no
sitio
do
INCTC
(http://www.hemocentro.fmrp.usp.br/projeto/inct/) e por meio de reuniões via
telefone, internet ou vídeo-conferência. Devemos salientar que já existe
colaboração em andamento entre os grupos, independente do lançamento do
projeto.
Os grupos também interagirão nos programas de educação e de transferência
de conhecimentos para a sociedade. Está previsto a criação de um curso de pósgraduacão inter-unidades (entre as unidades USP) e inter-institucional (entre as
unidades USP, a UFRJ e o Centro Nacional de Primatas).
No aspecto da inovação, a Incubadora de Empresas ligada ao CTC poderá
fornecer todo o apoio logístico e de conhecimento pra a interação dos diversos
grupos com o setor produtivo (realização de estudos de viabilidade econômica,
planos de negócios, constituição de micro-empresas, propriedade intelectual,
etc.).
Especial atenção será dispensada ao grupo do Centro Nacional de Primatas
que necessitará treinamento intensivo em técnicas atualizadas de cultivo e
caracterização celular. Os mecanismos, neste caso em particular, incluem períodos
de treinamento dos profissionais de Belém nos demais laboratórios do Instituto e o
133
deslocamento de pesquisadores mais experientes até Belém para treinamento in
loco.
A agregação e a conjução de competências e habilidades diferentes
existentes nos grupos de pesquisa dos programas de pós-graduação voltados para a
medicina veterinária aplicada à pesquisa pré-clinica, alicerçar a criação de uma
Rede Nacional de Pesquisa pré-clinica constituída por 09 Universidades Publicas
Nacionais que fortalece e respalda a troca de conhecimento, favorecendo ainda a
produção de conhecimento não concentrado bem como o desenvolvimento de
novos princípios éticos agregadores de valores sócio-morais (vide item T: Estutura
Organizacional e Funcional do Instituto).
134
J) Formas de Interação com Grupos no Exterior
O desenvolvimento de um
instituto neste
porte precisa ter uma
característica internacional claramente evidenciada. Este é o caso da proposta que
conta com 6 colaboradores internacionais atualmente desenvolvendo atividades de
colaboração com a equipe.
A proposta deste instituto pretende, mediante atividades presenciais e não
presenciais (vídeo ou tele-conferência) manter um vinculo forte com as instituições
parceiras do exterior.
Este vínculo se dará por reuniões trimestrais onde os colaboradores serão
convidados a participar por teleconferência e também por uma reunião presencial
por ano, em um Simpósio do Instituto onde os colegas do extrangeiro farão uma
apresentação dos projetos desenvolvidos pelo seu grupo e terão acesso aos posters
e apresentações orais dos trabalhos desenvolvidos pela parte nacional do instituto.
Esta atividade anual permitirá aproximar ainda mais os grupos de maneira
que passem uma real visão da condição de pesquisa do instituto aos que ainda não
tiveram a portunidade de vir.
Em alguns casos, esta visita do colaborador do exterior poderá ser
prolongada mediante solicitação de recursos para as agências de fomento para o
desenvolvimento de estágios sabáticos de curta ou média duração.
Esta iniciativa deverá também permitir uma interação mais global com toda
a equipe do projeto facilitando o conhecimento de estudantes e de pesquisadores
interessados em estágios sanduíches ou em receber eventuais treinamentos no
exterior ou permitindo o desenvolvimento de outros projetos em conjunto.
Para cada solicitação de vinda do pesquisador idealiza-se que este receba
um membro da nossa equipe em seu laboratório para treinamento ou
desenvolvimento de seu projeto.
135
K) Definição das Tarefas Específicas de Cada Entidade Participante
Atividade das entidades participantes
Unidade
Ribeirão Preto/USP
Hemocentro de Ribeirão Preto –
Centro Regional de Hemoterapia
HCFMRP/USP
Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos
Instituto de Biociências/USP
Veterinária e Zootecnia/USP
Ribeirão Preto/USP
Instituto de Ciências Biomédicas
da UFRJ
Ribeirão Preto/USP
Ribeirão Preto/USP
Veterinária e Zootecnia/USP
Ribeirão Preto/USP
Centro Nacional de Primatas
Membros
envolvidos
Subprojetos
coordenados
Responsável geral
3
25
Roberto Passetto Falcão
31
3, 5, 10, 11,
14, 15, 22, 23
e 30
Dr Dimas Tadeu Covas
5
8e9
Flavio Vieira Meirelles
5
1, 6 e 7
11
26
Maria Angélica Miglino
6
13 e 16
13
2
4
19 e 20
18
17, 21, 28 e 29
11
26
João Palermo Neto
12
12, 18 e 24
Lewis Joel Greene
8
4 e 27
Wilson Araújo da Silva Jr
Stevens Kastrup Rehen
Eduardo Magalhães Rego
Júlio Cesar Voltarelli
Klena Sarges Marruaz da Silva
136
L) Análise Comparativa entre a Situação Atual e a Pretendida
Os grupos que se associam na apresentação deste projeto possuem grande
experiência no tema escolhido comprovada por publicações, depósitos de patentes
e atividades de divulgação do conhecimento para a sociedade. Com o projeto
pretendem avançar mais: intercambiar de forma efetiva a experiência anterior;
apoiar de forma efetiva o desenvolvimento do Centro Nacional de Primatas,
capacitando-o para se tornar um pólo importante nos estudos pré-clínicos em
primatas não humanos; estruturar dois bancos de células-tronco (um para células
animais e outro para células humanas); implantar um Centro de Estudos préclínicos; desenvolver metodologias para cultivo em larga escala e em condições de
uso
clínico
de
células-tronco
mesenquimais
e
embrionárias;
desenvolver
metodologias e produtos que possam originar patentes; realizar dois estudos
clínicos de fase I e II; divulgar para a sociedade os conhecimentos gerados; treinar
recursos humanos; e contribuir para a melhoria do ensino público. Muitas destas
atividades já são realizadas mas o diferencial será a ampliação de sua abrangência
e escala.
O avanço mais significativo, entretanto, é a constituição do próprio
Instituto que agregará os grupos participantes e fornecerá um poderoso estímulo
para o desenvolvimento desta área no país.
137
M) Orçamento Justificado
Geral
Descrição do item
Material de Consumo
Material Permanente
Passagens
Bolsas
Material Bibliográfico
Diárias
Total
Valor Total (R$)
3.899.596,37
3.547.600,40
292.926,70
1.007.717,30
2.790,00
152.469,95
8.903.100,72
Material de Consumo
Item
Anticorpos diversos
Material de escritório
Material para coleta
Plásticos
Reagentes diversos para laboratório
Reagentes Eletroforese
Reagentes para Citogenética
Reagentes para Cultura Celular
Reagentes para Modelos Animais
Reagentes para Proteômica
Solventes
Vidrarias diversas para laboratório
Total
Valor (R$)
96.000,00
54.630,00
416.696,00
502.158,00
63.000,00
450.000,00
142.521,87
1.039.360,50
46.000,00
900000,00
176.260,00
12.970,00
3.899.596,37
Material Permante
Item
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Quant
3
7
1
11
1
2
2
2
1
4
2
1
3
Descrição
Microcentrífuga refrigerada
Centrifuga de bancada refrigerada
Centrifuga de chão refrigerada
Capela de Fluxo Laminar para cultivo e manutenção das células
Workstation
Servidores de rede
Equipamentos de transfecção
Termociclador
Incubador tipo shaker
Banho maria
Freezer -20C
Geladeira
Sistema de eletroforese horizontal
138
Item
14
15
16
17
Quant
2
2
3
3
18
19
20
21
22
23
24
1
3
33
2
1
1
1
25
26
27
28
29
30
31
32
33
02
01
38
2
3
2
6
1
4
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
01
01
07
09
01
01
02
Descrição
Notebook
PCs
Impressora
Sistema de Eletroforese Vertical com blotting
Tomógrafo Computadorizado Helicoidal rotação contínua para exames
adultos e pediátricos
Agitadores magnéticos para frasco spinner
Frascos spinner
Biorreatores
Quantificador automático de células animais
Sistema para filtração de amostras
Sistema MILLI-Q BIOCEL contendo acessórios
Containers para criopreservação em nitrogênio líquido contendo
acessórios.
pHmetro digital
Micropipetas e pipetadores automáticos
Sistemas de PCR em tempo real
Sistemas de dosagem de ácidos nucléicos
Balanças analíticas de precisão
Homogeneizadores (termo mixers, agitadores e vórtex)
Óculos GFP
Microscópio trinocular invertido
Sistema de microscopia óptica e de luz polarizada com sistema de captura de
imagem Leica
Câmera digital para microscópio invertido com saída USB
Microscópio invertido Axio Observer D1 e acessórios
Câmera de vídeo Moticam 480 analógica e digital
Câmera digital Moticam 2500
Microscópios trinoculares
Base articulada para estereomicroscópio
Câmera de vídeo digital 1.4 MB com sensibilidade para fluorescência
Estereomicroscópio trinocular
Microscópio microbiológico binocular simples
Fonte excitadora de GFP
Estereomicroscópio com fluorescência
C-mount 1X para adaptação microscópio/câmara
Filtro Dapi/Hoescht/Amca/hisky e cubos para todos os tipos de microscópio
Software Multi-Species, para uso com bandview
Estação de trabalho completa para citogenética: hisky, bandeamento G e FISH
Microscópio de campo claro
Sistema de aquisição de imagens para microscópio invertido
Estereomicroscópio
Autoclave 23 l
Citômetro de Fluxo
Acessórios para uso de colunas de separação de células
Incubadoras de CO2
Incubadora tipo shaker
Estufa bacteriológica
Incubadora de três gases
139
Item
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
73
74
75
76
77
78
79
80
81
Quant
Descrição
02
Freezers -80C
Scanner microarrays Agilen G2565CA OPTION 3 tc/ delecao da alta
01
resolução
01
Forno de hibridização para microarrays
01
Câmara rotatória para forno de hibridização
01
Camara de hibridização surehyb
01
Microinjetor fentojet
01
Pedal microinjetor fentojet
01
Microinjetor a ar Narashige
01
Piezzo drill
01
Fyrite CO2/O2
01
Troca de Gases Automática
01
Fonte excitadora GFP model: FHS/LS-1B
01
Hibridizador DAKO
01
Sistema de Fotodocumentação para Géis de Agarose
01
Leitor de Luminescência para microplacas
01
Criostato
01
Sistema automatizado para pipetagem de reações de PCR
01
Projetor multimídia
01
Filmadora handycam
01
Tv lcd
05
Vitrines
JUSTIFICATIVAS
1. Microcentrífugas refrigeradas - 3
As microcentrífugas refrigeradas destinam-se ao processamento de amostras
de DNA e RNA a serem utilizadas na clonagem e análise da expressão de
genes de interesse. Dois destes equipamentos serão instalados no
Laboratório de Hematologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP
sob a responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães Rego, e um será
instalado no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro, sob
responsabilidade da Dra Simone Kashima Haddad. Sub-projetos: 3, 7, 11, 15,
18, 19, 20, 25, 26, 27, 30.
2. Centrífugas de bancada refrigeradas - 7
As centrifugas de bancada refrigeradas destinam-se ao processamento de
amostras de células de linhagens leucêmicas, células empacotadoras de
retrovírus e para a separação por densidade (Ficoll) de células da medula
óssea a serem usadas nos protocolos de transplante nos modelos animais
envolvidos no projeto. Um destes equipamentos será instalado no
laboratório de hematologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP
sob a responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães Rego (Hematologia,
FMRP), dois serão instalados no Laboratório da Profa. Maria Angélica Miglino
(Faculdade de Medicina Veterinária-USP), dois serão para laboratório do
Prof. Roberto Passeto Falcão (Departamento de Hematologia – FMRP-USP) e
um ficará no Hemocentro de Ribeirão Preto, no Laboratório de Biologia
Molecular. Sub-projetos: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 25, 26, 27, 28, 29, 30.
140
3. centrífuga de chão refrigerada - 1
A centrífuga de chão refrigerada destina-se ao processamento de amostras
de medula óssea antes e após transdução retroviral a serem usadas nos
protocolos de transplante em macacos envolvidas no projeto. Este
equipamento será instalado no biotério Specific Pathogen Free, sob a
responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães Rego (Hematologia, FMRP).
Sub-projetos: 3, 7, 11, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 30
4. Capelas De Fluxo Laminar - 11
A Capela de fluxo laminar vertical é própria para a proteção do produto e do
operador nas manipulações de materiais biológicos e substâncias tóxicas, na
medicina, na indústria farmacêutica, e na microbiologia (para manuseio de
materiais não patogênicos). As capelas de fluxo laminar destinam-se a
manipulação de células ou outros materiais biológicos em condições
estéreis. Uma das capelas será instalada no Laboratório de Hematologia do
Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – USP e outra no biotério Specific
Pathogen Free, ambos sob a responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães
Rego, uma será instalada no Hemocentro de Ribeirão Preto sob
Responsabilidade do Prof. Wilson Araújo da Silva Júnior, uma no Centro de
Quimica de Proteínas do Prof. Lewis Joel Greene, cinco serão instaladas na
Faculdade de Medicina Veterinária-USP sob responsabilidade da Prof. Maria
Angélica Miglino, uma no Laboratório de Hematologia sob responsabilidade
do Prof. Roberto Passeto Falcão, e uma no Laboratório de Morfofisologia
Molecular e Desenvolvimento sob responsabilidade do Prof. Flavio Meirelles.
Sub-projetos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30.
5.
Workstation - 1
Este equipamento evita contaminação de reações de PCR e será alocado
junto ao Centro de Química de Proteínas do Hemocentro de Ribeirão Preto,
sob responsabilidade do Prof. Lewis Joel Greene. Sub-projetos: 8, 12, 17,
18, 21, 23, 24.
6. Servidor de rede - 2
O servidor de rede será instalado no Hemocentro de Ribeirão Preto para
melhoria da conectividade entre laboratórios. Sub-projetos: 2, 3, 4, 5, 6, 8,
10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 30.
7. Equipamentos para transfecção - 2
Equipamento que possibilita a transfecção de vetores e de RNAs de dupla
fita para células humanas. Este equipamento permite a transfecção sem que
ocorra desestabilização do conteúdo celular e permite maiores índices de
viabilidade celular após transfecção. Um dos equipamentos será instalado no
Laboratório de genética Molecular do hemocentro de Ribeirão Preto sob
responsabilidade do Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Júnior e o outro na
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São
Paulo – Pirassununga, sob responsabilidade do Prof. Flavio Meirelles. Subprojetos: 1, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 19, 26, 27.
141
8. Termocicladores - 2
Utilizado para amplificação de DNA e de cDNA. Um aparelho será instalado
no Hemocentro de Ribeirão Preto e o outro na Faculdade de Medicina
Veterinária-USP sob responsabilidade da Prof. Maria Angélica Miglino. Subprojetos: 1, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 19, 26, 27
9. Incubador tipo Shaker - 1
Será utilizado para o crescimento de culturas bacterianas. Este aparelho
será instalado no Hemocentro de Ribeirão Preto. Sub-projeto: 5.
10. Banhos Maria - 4
Os
banhos-maria
destinam-se
ao
descongelamento
de
células
criopreservadas, aquecimento de reagentes, e incubação com enzimas de
restrição e/ou modificação. Dois destes equipamentos serão instalados no
biotério Specific Pathogen Free, sob a responsabilidade do Prof. Eduardo
Magalhães Rego. Um será instalado na Faculdade de Zootecnia e Engenharia
de Alimentos, USP, sob responsabilidade do Prof. Flávio Meirelles, e um no
Centro Nacional de Primatas Evandro Chagas sob responsabilidade da Prof.
Klena Sarges Marruaz da Silva. Sub-projetos: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 18, 19,
20, 25, 26, 27, 30.
11. Freezer -20 C - 2
Para a criopreservação de amostras biológicas e de reagentes. Os dois
freezers serão utilizados no Laboratório de Hematologia, FMRP sob a
responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães Rego. Sub-projetos: 3, 7, 11,
18, 19, 20, 25, 26, 27, 30
12. Geladeira 4 C - 1
Para a refrigeração de amostras biológicas e de reagentes. A geladeira será
utilizada no Laboratório de Hematologia da FMRP-USP, sob a
responsabilidade do Prof. Eduardo Magalhães Rego. Sub-projetos: 3, 7, 11,
18, 19, 20, 25, 26, 27, 30
13. Sistemas de Eletroforese Horizontal - 3
Equipamento utilizado para separar ácidos nucléicos. Um aparelho será
instalado no Laboratório de Biotecnologia do Hemocentro de Ribeirão Preto,
e dois no Laboratório de Hematologia da FMRP-USP. Sub-projetos: 3, 5, 7,
11, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 30.
14. Notebooks - 2
Nas ações de itinerância, bem como nos cursos realizados fora das sedes dos
museus, os notebooks são fundamentais para projeções em multimídia,
realização do show de física, bem como para organização de banco de dados
e serviços de secretaria. Cinco notebooks serão utilizados pela a Prof.
Jussara R. Ferreira da Universidade de Brasília, e um notebook será utilizado
pelo Prof. Eduardo Magalhães Rego da Hematologia, FMRP. Sub-projetos: 3,
7, 11, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 30.
142
15. PCs - 2
Estes equipamentos são fundamentais para trabalhos de diagramação, web
design, tratamento de imagens, bem como para a produção de material
didático e bancos de dados, que utilizam imagens. Nove serão utilizados pela
Prof. Jussara R. Ferreira da Universidade de Brasília e um será utilizado pelo
Prof. Eduardo Magalhães Rego do Laboratório de Hematologia, FMRP-USP.
Sub-projetos: 3, 7, 11, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 30.
16. Impressoras - 3
Impressoras multifuncionais são necessárias para impressões fotográficas de
excelente qualidade, e também para suprir as necessidades gráficas dos
projetos. Uma será instalada no Laboratório de Biotecnologia do Hemocentro
de Ribeirão Preto sob responsabilidade do Prof. Dimas Tadeu Covas, uma no
Centro Nacional de Primatas, sob responsabilidade da Prof. Klena Sarges
Marruaz da Silva, e uma será utilizada pelo Prof. Eduardo Magalhães Rego do
Laboratório de Hematologia, FMRP-USP. Sub-projetos: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10,
11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29 e 30.
17. Sistemas de Eletroforese Vertical e acessórios - 3
A cuba para eletroforese vertical é necessária para separar os extratos
protéicos por massa/carga antes de sua transferência para membranas de
nitrocelulose ou pvdf, para execução do western blot. Dois serão utilizados
pelo prof. Stevens k rehen do instituto de biociências da ufrj, e um aparelho
será utilizado pelo prof. Eduardo magalhães rego (laboratório de
hematologia, fmrp-usp). Sub-projetos: 2, 3, 5, 6, 7, 11, 18, 19, 20, 23, 24,
25, 26, 27, 30.
18. Tomógrafo Computadorizado Helicoidal rotação contínua para exames
adultos e pediátricos - 1
O aparelho de tomografia computadorizado seria um importante
equipamento para apoio no diagnóstico das doenças a serem investigadas
nos subprojetos de tratamentos com terapia celular com células tronco, pois
este permite um diagnóstico mais preciso com imagens de qualquer parte do
corpo dos animais (primatas não humanos) em três dimensões; deste modo,
áreas superpostas podem ser examinadas. É de conhecimento no meio
médico que a tomografia computadorizada torna possível detectar as
menores alterações no tecido, permitindo um diagnóstico precoce de
alterações diversas como hemorragias, tumores, traumas, alterações de
parênquima pulmonar, embolias, etc. O referido equipamento será uma
importante ferramenta para a detecção de problemas, e para o sucesso no
tratamento dos animais com a terapia celular. O aparelho será alocado no
Instituto Nacional de Primatas Evandro Chagas. Sub-projetos: 4, 6, 20, 26,
27.
19. Agitadores magnéticos para frasco spinner - 3
Equipamento destinado à agitação dos frascos spinner onde serão cultivadas
as células em suspensão. O conjunto frasco spinner + agitador deve ser
operado no interior de uma incubadora de CO2. 2 unidades ficarão alocadas
no Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de
Janeiro sob a responsabilidade do Dr Stevens K. Rehen e 1 unidade no
143
Hemocentro de Ribeirão Preto sob a responsabilidade do Prof. Dimas T.
Covas. Sub-projetos 2, 5, 6,23, 24.
20. Frascos spinner - 33
Equipamento de volume variado onde serão cultivadas as células-tronco em
suspensão em escalas menores. O frasco spinner será colocado no interior de
uma incubadora de CO2 e a agitação será fornecida pelo agitador magnético
para spinner também inserido dentro da incubadora. 24 unidades ficarão
alocadas no Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio
de Janeiro sob a responsabilidade do Prof. Stevens K Rehen e 6 unidades no
Hemocentro de Ribeirão Preto sob a responsabilidade do Prof. Dimas Tadeu
Covas. Sub-projetos 2, 5, 6,23, 24.
21. Biorreatores - 2
Equipamento onde serão cultivadas as células-tronco aderidas nos
microcarregadores em uma maior escala e com um maior controle de
parâmetros de cultivo tais como pH, concentração de oxigênio dissolvido,
temperatura. 1 unidade ficará alocada no Instituto de Ciências Biomédicas
da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob a responsabilidade do Dr
Stevens K Rehen e 1 unidade no Hemocentro de Ribeirão Preto sob a
responsabilidade do Dr Dimas Tadeu Covas. Sub-projetos 2, 5, 6,23, 24.
22. Quantificador automático de células animais - 1
Destinado à determinação do número de células de um grande volume de
amostras de maneira automatizada e reprodutível. Este equipamento ficará
alocado no Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio
de Janeiro sob a responsabilidade do Dr Stevens K Rehens. Sub-projeto 2.
23. Sistema para filtração de amostras - 1
Destinado a filtração de amostras contendo células e microcarregadores para
determinação das respectivas massas secas. Este equipamento ficará alocado
no Hemocentro de Ribeirão Preto sob a responsabilidade do Dr Dimas T
Covas. Sub-projetos 2 e 23.
24. Sistema MILLI-Q BIOCEL, incluindo acessórios -1
O sistema de filtração MILLI-Q BIOCEL é o que nos fornece melhor pureza de
água em relação não só às impurezas exógenas, mas, principalmente, quanto
à presença de íons, o que interfere, sobremaneira, na qualidade dos meios e
demais substâncias utilizadas na cultura, expansão e preservação das
células, daí a necessidade da aquisição do aparelho e de seus acessórios.
Este equipamento ficará no Instituto Evandro Chagas sob responsabilidade da
Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva. Sub-projetos 4, 6,20, 26, 27.
25. Containers de nitrogênio líquido, incluindo acessórios - 2
Para criopreservação de células e amostras a uma temperatura entre -100ºC
a -196ºC. Uma unidade ficará alocada no Instituto Evandro Chagas sob
responsabilidade da Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva, e uma unidade na
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos sob responsabilidade do
Dr Flávio. Estes equipamentos atenderão aos sub-projetos 1, 4, 5, 6, 8, 9,
11, 19, 20, 26, 27.
144
26. pHmetro digital - 1
O potencial de Hidrogênio (pH) na faixa de normalidade (pH 7.4 – 7.6) é um
item importante para o bom crescimento celular, minimizando o impacto
sofrido pela célula em cultura, causado pela condição de crescimento in
vitro. Este equipamento ficará no Instituto Evandro Chagas sob
responsabilidade da Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva, e servirá aos subprojetos 4, 6,20, 26, 27.
27. micropipetas e pipetadores automáticos - 38
As pipetas são equipamentos para transferência de soluções necessárias para
todas as técnicas de laboratório (biologia molecular, cultura celular,
citometria de fluxo). Estes equipamentos foram solicitados pelos
coordenadores: Dr. Wilson Araújo da Silva Júnior (subprojetos 7, 13, 16, 17 e
20), do Dr. Julio Voltarelli (subprojetos 7, 17, 21, 23, 28 e 29), Dr. Dimas
Tadeu Covas (subprojetos 5, 8, 11, 12, 14, 15, 17, 20, 21, 22, 23, 28, 29 e
30), Dr. Roberto Passetto Falcão (subprojetos 19, 20 e 25), e Dr. Flávio
Meirelles (subprojetos, 1, 8, 9, 19 e 26).
28. Sistemas de PCR em tempo real - 2
A RT-PCR em tempo real é a técnica essencial para quantificação da
expressão gênica (RNAs mensageiros) sempre que é necessário verificar
variações da expressão gênica entre amostras e/ ou situações diferentes.
Qualquer modelo que necessite quantificar RNAs mensageiros e até mesmo
microRNAs se beneficia da PCR em tempo real. É necessário para validação
dos dados de expressão gênica gerados pelo microarray e para confirmação
da expressão de marcadores moleculares de células progenitoras por
exemplo. Este equipamento é de uso comum, útil para todos os grupos que
trabalharem com expressão gênica e de microRNAs: Estes equipamentos
serão alocados no Instituto de Biociências da UFRJ – RJ e no Laboratório de
Genética Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto. Sub-projetos: 2, 6, 7,
13, 16, 17, 20 e 24).
29. Sistemas de dosagem de ácidos nucléicos - 3
A preparação das amostras para RT-PCR em tempo real consiste de várias
etapas: preparo, extração do RNA total, dosagem, verificação da qualidade
e síntese de DNA complementar. A dosagem e a verificação da qualidade do
RNA são fundamentais para o sucesso da técnica de PCR em tempo real,
prejudicando a obtenção de resultados corretos. Os sistemas de
quantificação e verificação da qualidade do RNA também permitem as
mesmas análises com DNA e proteínas, sendo muito úteis para diversas
aplicações. Os equipamentos mais modernos utilizam pouca quantidade de
amostras, sendo bastante adequado para populações celulares raras, como é
o caso das células-tronco. Este equipamento será de uso comum e terá
utilidade para todos os grupos que trabalharem com células, DNA, RNA ou
proteínas.
30. Balanças analíticas de precisão - 2
As balanças de precisão são fundamentais para o preparo correto de
soluções, que devem conter a quantidade precisa de cada um dos reagentes.
Este tipo de equipamento é de uso comum e será adquirido pelo Instituto
145
Evandro Chagas (grupo da Dr. Klena Sarges Marruaz da Silva Sarges Marruaz
da Silva, subprojetos 4, 6, 20, 26 e 27) e pelo grupo do Dr. Julio Voltarelli
(subprojetos 7, 17, 21, 23, 28 e 29).
31. Homogeneizadores (termo mixers, agitadores e vórtex) - 6
A correta homogeneização de reagentes e de amostras é fundamental para a
geração de resultados corretos. Os equipamentos serão utilizados por
diversos laboratórios e foram solicitados para o Dr. Lewis J. Greene
(subprojetos 12, 17, 18, 21 e 24), Dr. Dimas Tadeu Covas (subprojetos 5, 8,
11, 12, 14, 15, 17, 20, 21, 22, 23, 28, 29 e 30) e Dr. Eduardo Magalhães Rego
(subprojetos 7, 18, 19 e 20).
32. Óculos GFP - 1
Este aparato contem filtro verde e é necessário para visualização de
organismos portadores de GFP.Será destinado à Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos sob a responsabilidade do Prof. Flávio Meirelles.
Sub-projetos 1, 8, 9, 20, 27.
33. Microscópio trinocular invertido
Necessário para observação de rotina de células em cultura, bem como para
análise de experimentos envolvendo diferenciação celular. Estes
equipamentos serão alocados junto aos laboratórios do Departamento de
Hematologia da FMRP-USP (1 unidade) e Faculdade de Medicina VeterináriaUSP (3 unidades). Sub-projetos: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 18, 19, 20, 22,
25, 26, 27, 30.
34. Sistema de microscopia óptica e de luz polarizada com sistema de
captura de imagem Leica - 1
Necessário para aquisição e análise de imagens obtidas por microscopia de
luz polarizada. Sub-projetos: 21, 23, 26, e 29
35. CCâmera digital para microscópio invertido com saída USB
Necessária para a captura de imagens obtidas em microscópio invertido.
Sub-projetos: 21, 23, 26, e 29
36. Microscópio invertido Axio Observer D1 e acessórios
Necessário para observação, análise e registro de cada etapa do
desenvolvimento celular; a exibição de imagens no monitor também torna
este sistema um recurso didático importante. Sub-projetos: 4 e 27
37. Câmera de vídeo Moticam 480 analógica e digital
Necessária para documentação usando o microscópio trinocular. Será
utilizada para os projetos de difusão.
38. Câmera digital Moticam 2500
Necessária para documentação usando o microscópio trinocular. Será
utilizada para os projetos de difusão.
39. Microscópios trinoculares - 2
Necessário para aquisição de imagens para composição de bancos de
imagens; produção de materiais didáticos para palestras, cursos, exposições;
146
elaboração de materiais de divulgação (panfletos, folders, cartazes, jogos,
CDs, etc.) voltados para a popularização do conhecimento. Será utilizada
para os projetos de difusão.
40. Base articulada para estereomicroscópio - 1
Necessária para o estereomicroscópio trinocular. Será utilizada para os
projetos de difusão.
41. Câmera de vídeo digital 1.4 MB com sensibilidade para fluorescência 1
Necessária para aquisição de imagens para composição de bancos de
imagens; produção de materiais didáticos para palestras, cursos, exposições;
elaboração de materiais de divulgação (panfletos, folders, cartazes, jogos,
CDs, etc.) voltados para a popularização do conhecimento. Sub-projeto:
Jussara
42. Estereomicroscópio trinocular - 1
Necessário para visualização de material biológico (plantas, animais), rocha,
terra, etc. em cursos e outras ações realizadas tanto na sede do museu como
nas ações de itinerância. Será utilizada para os projetos de difusão.
43. Microscópio microbiológico binocular simples - 1
Necessário para contagem de células em câmara de Neubauer durante a
realização dos cultivos celulares. Servirá aos sub-projetos 5, 8, 10, 11, 12,
14, 15, 20, 21, 22, e 23
44. Fonte excitadora de GFP - 1
Estes equipamentos são necessários para equipar o Laboratório de
Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento. Serão utilizados para a
avaliação macroscópica da expressão gênica de genes repórteres em
organismos vivos, utilizados freqüentemente nos sub-projetos 1, 8, 9, 20, e
27
45. Estereomicroscópio com fluorescência - 1
Necessário para visualização de organismos portadores de GFP.. Servirá aos
sub-projetos 1, 8, 9, 20, 27
46. C-mount 1X para adaptação microscópio/câmara - 1
Necessário para acoplar a câmara CCD ao microscópio de fluorescência, para
uso com os softwares SKYView ou SpectraView. Atenderá aos sub-projetos
19, 20, e 25
47. Filtro Dapi/Hoescht/Amca/HiSky e cubos para todos os tipos de
microscópio
Necessário para observação de substâncias fluorescentes utilizadas para
análise citogenética. Sub-projetos: 19, 20, e 25
48. Software Multi-Species, para uso com BandView
Necessário para análise detalhada dos achados citogenéticos em material
humano e de roedores, que refletem o grau de instabilidade cromossômica,
147
e também para o armazenamento das imagens para posterior análise e
publicação dos resultados. Sub-projetos: 19, 20, e 25
49.
Estação de trabalho completa para citogenética: HiSKY,
bandeamento G e FISH - 1
Necessário para a investigação de anormalidades cromossômicas numéricas e
estruturais em células metafásicas de pacientes com LLC, e nos demais
projetos que incluam análise citogenética. Servirá principalmente aos subprojetos 19, 20, e 25
50. Microscópio de campo claro -1
Necessário para a investigação de anormalidades cromossômicas numéricas e
estruturais em células metafásicas de pacientes com LLC, e nos demais
projetos que incluam análise citogenética. Atenderá aos sub-projetos 19, 20,
e 25
51. Sistema de aquisição de imagens para microscópio invertido
Necessário para o acompanhamento e registro das condições de cultivo das
células dos protocolos experimentais. Atenderá aos sub-projetos 5, 8, 10,
11, 12, 14, 15, 20, 21, 22, 23
52. Estereomicroscópio
Este equipamento é necessário para equipar o Laboratório de Morfofisologia
Molecular e Desenvolvimento. Será utilizado para a avaliação de diversas
etapas da produção in vitro de embriões, em especial, do desenvolvimento
embrionário.
Necessário para a seleção e marcação de clones celulares "in situ". Subprojetos atingidos: 5, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 20, 21, 22, e 23
53. Autoclave 23 L
Necessária para a esterilização e higienização dos materiais utilizados na
cultura celular. Este equipamento ficará na Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia sob responsabilidade da Dra. Maria Angélica Miglino.
54. Citômetro de Fluxo
Em qualquer instância, seja na separação celular ou no cultivo, as células
tronco, adultas ou embrionárias, devem ser identificadas com a maior
precisão possível. O método de identificação por imunofenotipagem
utilizando 04 cores via citômetro de fluxo, além da precisão nos oferece a
possibilidade de 04 identificações celulares independentes. Este
equipamento ficará no Instituto Nacional de Primatas Evandro Chagas sob
responsabilidade da Dra. Klena Sarges Marruaz da Silva Sarges Marruaz da
Silva.
55. Acessórios para uso de colunas de separação de células - 7
Estes são acessórios para montagem do aparato de separação
imunomagnética de células, possibilitando trabalhar com quatro tipos
celulares simultaneamente. O isolamento celular através do sistema MACS
tem sido bastante utilizado para obtenção de populações celulares puras,
com manutenção do estado fisiológico das células e alta viabilidade celular.
148
As células são imunomagneticamente marcadas e assim passadas em colunas
presas a um campo magnético.
56. Incubadoras de CO2 - 9
Estas incubadoras destinam-se aos subprojetos: 2, 6, 7, 11, 12, 14, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 30.
As incubadoras de CO2 destinam-se ao cultivo de células. Levando-se em
conta o volume de trabalho projetado para a geração dos resultados
esperados, a aquisição das incubadoras de CO2 para o cultivo destas células
torna-se indispensável. As incubadoras serão instaladas nos laboratórios dos
seguintes institutos: Ciências Biomédicas da UFRJ-RJ, Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto – USP, Hemocentro de Ribeirão Preto.
57. Incubadora tipo shaker - 1
A incubadora do tipo shaker destina-se ao subprojeto 5, para a obtenção de
clones bacterianos. Será instalado no Laboratório de Biotecnologia do
Hemocentro de Ribeirão Preto.
58. Estufa bacteriológica - 1
A estufa bacteriológica destina-se ao subprojeto 15, para a obtenção dos
plasmídeos empregados na análise funcional dos microRNAs. Será instalada
no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto.
59. Incubadoras de três gases - 2
Usadas para o cultivo de diferentes tipos de células em condições de hipóxia
para verificação do comportamento das mesmas nestas condições. As
incubadoras de três gases destinam-se aos subprojetos 1, 8, 9, 10, 19 e 26.
Umas incubadoras será instalada na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de
Alimentos da Universidade de São Paulo – Pirassununga, e a outra na
Laboratório de Terapia Celular do Hemocentro de Ribeirão Preto
60. Freezers -80C - 2
Os freezers a -80°C se destinam a estocagem e manutenção de reagentes,
amostras e células dos subprojetos 1, 7, 8, 9, 18, 19, 20 e 26. Serão
instaladas nos Laboratórios de Hematologia da Faculdade de Medicina
Ribeirão Preto e na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
Universidade de São Paulo – Pirassununga.
61. Scanner de microarrays Agilen G2565CA OPTION 3 tc/ delecao da alta
resolução - 1
A aquisição de um scanner para análise de microarrays de DNA (arrayCGH) é
imprescindível para a leitura das lâminas de arrays, avaliação e
identificação dos genes. Os subprojetos 3, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21,
25 e 29 utilizarão esta metodologia. Estes equipamentos serão alocados
junto ao Laboratório de Hematologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto.
62. Forno de hibridização para microarrays - 1
Este item é necessário para incubação das lâminas de microarrays durante a
etapa de hibridização. Será utilizado nos subprojetos 3, 8, 13, 14, 15, 16,
17, 19, 20, 21, 25 e 29.
149
63. Camara rotatória para forno de hibridização - 1
Necessário para o forno de hibridação para microarrays.
64. Camara de hibridização SureHyb - 1
Estes equipamentos destinam-se ao suporte adicional para o
desenvolvimento da metodologia de arrayCGH (microarrays) aplicado à
expressão gênica e de microRNAs. Os subprojetos 3, 8, 13, 14, 15, 16, 17,
19, 20, 21, 25 e 29 utilizarão esta metodologia. Estes equipamentos serão
alocados junto ao Laboratório de Hematologia da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto.
#Estes equipamentos destinam-se a montagem da estrutura física que
realizará todas as análises de expressão gênica em larga escala.
65. Microinjetor Fentojet - 1
Molecular e Desenvolvimento. Este equipamento é necessário para a
microinjeção/ micromanipulação de oócitos ou embriões de diversas
espécies. Este equipamento destina-se aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será
alocado na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
66. Pedal Microinjetor Fentojet -1
Molecular e Desenvolvimento. Este equipamento é necessário para a
microinjeção/ micromanipulação de oócitos ou embriões de diversas
espécies. Este equipamento destina-se aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será
alocado na Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da
67. Microinjetor a ar Narashige - 1
Este equipamento destina-se a aspiração do conteúdo citoplasmático de
óvulos, e servirá aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será alocado na Faculdade
de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo –
Pirassununga.
68. Piezzo Drill - 1
Molecular e Desenvolvimento. Será utilizado em técnicas de microinjeção e
micromanipulação dos embriões reconstruídos no projeto. Este equipamento
destina-se aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será alocado na Faculdade de
Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo –
Pirassununga.
69. Fyrite CO2/O2 - 1
Este equipamento é necessário para a manutenção das concentrações
adequadas de gases dentro da incubadora, sendo uma ferramenta
imprescindível para a adequada produção embrionária in vitro. Este
equipamento destina-se aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será alocado na
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São
Paulo – Pirassununga.
150
70. Troca de Gases Automática - 1
Necessário para o suprimento ininterrupto de gases para incubadoras por
permitir a utilização de dois cilindros de gás. Este equipamento destina-se
aos subprojetos 1, 8, 9, 19 e 26. Será alocado na Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo – Pirassununga.
71. Fonte excitadora GFP MOdel: FHS/LS-1B - 1
Este equipamento é necessário para equipar o Laboratório de Morfofisiologia
Molecular e Desenvolvimento. Será utilizado para avaliação macroscópica da
expressão de genes repórter em organismos vivos, utilizados frequentemente
nos sub-projetos.1, 8, 9, 19 e 26. Será alocado na Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo – Pirassununga.
72. Hibridizador DAKO - 1
Sistema necessário para a hibridização de lâminas para fins de citogenética
molecular (FISH e SKY). Este equipamento destina-se aos subprojetos 19, 20
e 25. Será alocado junto ao Laboratório de Hematologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto.
73. Sistema de Fotodocumentação para Géis de Agarose - 1
Será usado para documentação dos testes iniciais de otimização das
condições da reação de amplificação. Neste caso, será solicitado
equipamento cuja tecnologia é totalmente nacional, além de excelente
qualidade de construção e facilidade de manutenção. Este equipamento
destina-se aos subprojetos 2, 6 e 23. Será alocado junto ao Instituto de
Ciências Biomédicas da UFRJ –RJ.
74. Leitor de Luminescência para microplacas - 1
Uso para o ensaio luminescente MycoAlert (Lonza). Além disso, um leitor de
luminescência permite a realização de um grande número de ensaios de
expressão, em que a capacidade de ativação de um promotor de um gene
específico pode ser mensurada através do tempo ou mediante a exposição a
algum fator. Este equipamento destina-se aos subprojetos 2, 6 e 23. Será
alocado junto ao Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ –RJ.
75. Criostato - 1
Necessário para confecção de cortes congelados de tecidos. Este
equipamento destina-se aos subprojetos 2, 6 e 23. Será alocado junto ao
Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ –RJ.
76. Sistema automatizado para pipetagem de reações de PCR - 1
Uso para pipetagem em larga escala de reações de PCR convencional e PCR
em tempo real. Este equipamento também será destinado à extração de
ácidos nucléicos. Este equipamento atenderá os subprojetos: 3, 5, 7, 8, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29 e 30. Será instalado
no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto.
151
77. Projetores multimídia - 1
Necessários para projeção em ações de itinerância, bem como para cursos
realizados fora das sedes dos museus.
78. Filmadoras Handycam - 1
Necessárias para documentação de ações de itinerância e de cursos
79. TVs LCD - 1
Necessárias para projeção em ações de itinerância, bem como para cursos
realizados fora das sedes dos museus
80. Vitrines - 5
Este mobiliário desmontável servirá como expositor nas ações de itinerância
dos museus participantes
152
N) Potencial de Geração de Patentes
Processos e Patentes depositados/obtidos pelo grupo proponente
Processo
PI9603267-7
018080023071
Título
Teste diagnóstico
Quimioluminescente par a
Infecão pelo T cruzi
Método de clonagem animal à
partir de células apoptóticas e
seu uso
Ano do depósito
2007
2008
PI0775561-7
Processo de obtenção de células
tronco a partir de células
orbiculares do lábio, composição
e uso
2007
PI0501037-3
Processo de isolamento,
purificação e determinação de
sequencias de aminoácidos da
crotamina e seu uso como
vetores para condução de
material genético
2005
PI0502668-7
Processo para obtenção de
células tronco, concentrado
celular, processo para
diferenciação de células tronco,
células diferenciadas,
concentrados celulares
diferenciados, uso de células
tronco, métodos para tratamento
e/ou prevenção de doenças e
banco de células tronco
PI
Dimas T. Covas
Luiz R Travassos
Igor C Almeida
Flávio Meirelles
Irina Kerkis
Maria Rita Passos
Bueno
Daniela F Bueno
Mayana Zatz
Irina Kerkis
Alexandre Kerkis
E. B. Oliveira
G-Radis Baptista
M. A Hayashi
T. Yamana
Irina Kerkis
Alexandre Kerkis
M. A Hayashi
H. F Cerruti
2005
Total
5
O projeto do INCTC possui grande potencial para a geração de patentes de
processo
e
produtos.
Especificamente
na
área
de
isolamento,
cultivo,
estabelecimento de novas linhagens, processos produtivos com base em critério
GMP (good manufacturing practices), desenvolvimento de ensaios para drogas,
engenharia tecidual e terapia regenerativa tanto em animais com em humanos.
Como mostrado na figura 4, o processo de geração de produtos na área de terapia
celular deve passar por distintas fases e o potencial de geração de patentes não é o
mesmo nestas fases. As fases com maior potencial de patenteabilidade são as fases
II e III. No Brasil, em geral, os grupos de pesquisa que se dedicam ao estudo de
células-tronco e terapia celular ainda se encontram majoritariamente na fase I.
Neste projeto, estamos propondo atividades que se distribuem pelas fases de I a IV
e portanto estaremos trabalhando na faixa de maior probabilidade de geração de
patentes em processos e produtos. Vários participantes do projeto têm experiência
153
no desenvolvimento de patentes e na produção de processos tecnológicos passíveis
de proteção intelectual. O Dr. Dimas Covas, por exemplo, possui 3 patentes (uma
registrada e duas em processo de registro), a Dra. Lygia Pereira possui uma patente
registrada, a Dra. Irina Kerkis possui trê patentes registradas,
o Dr. Flávio
Meirelles possui vários processo tecnológicos desenvolvidos, o mesmo ocorrendo
com a Dra. Maria Angélica Miglino. Portanto, o grupo possui experiência
comprovada na geração de produtos tecnológicos que poderão originar patentes.
A questão do registro patentário dos produtos e processos gerados será
encaminhada com o auxílio da Agencia USP de Inovação que especializada nestas
questões e também da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto diretamente ou por
meio de sua Incubadora de Empresas.
Outro ponto que merece atenção diz respeito à proteção intelectual dos
direitos autorais das publicações e material didático produzido na forma impressa
ou eletrônica (copyright) e à proteção de marcas. O Hemocentro possui um setor
da sua Consultoria Jurídica especialmente focado nestes aspectos e zeloso do
registro do material produzido.
154
O) Relação dos Projetos Financiados nos últimos 5 anos
COORDENADOR
FONTE
PROF. DR. ROBERTO
PASSETTO FALCÃO
CNPQ
PROF. DR. DIMAS TADEU
COVAS
FINEP
COVAS
FINEP
COVAS
FINEP
COVAS
FINEP
COVAS
FINEP
COVAS
FINEP
COVAS
CNPQ
COVAS
CNPQ
COVAS
BNDES
PROJETO
LINFOCITOSE MONOCLONAL B EM PARENTES
DE PRIMEIRO GRAU DE PACIENTES COM
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA
CLONAGEM E EXPRESSÃO DOS FATORES VIII E
IX DE COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA EM
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
CONSOLIDAÇÃO DO LABORATÓRIO DE
CULTURA CELULAR PARA ESTUDOS
MOLECULARES E PROTEÔMICOS DE CÉLULAS
DENDRÍTICAS E CÉLULAS TRONCO
ESCALONAMENTO DA PRODUÇÃO DOS
FATORES VII E IX RECOMBINANTES EM
BIORREATORES E ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS EM
CAMUNDONGOS HEMOFÍLICOS
ANÁLISE BIOLÓGICA E MOLECULAR DE
CÉLULAS TRONCO SOMÁTICAS
PLURIPOTENCIAIS NO REPARO TECIDUAL
INFRA-ESTRUTURA PARA GERAÇÃO E
MANIPULAÇÃO DE MODELOS ANIMAIS
GENETICAMENTE MODIFICADOS NO ESTUDO
DE DOENÇAS HUMANAS
DESENVOLVIMENTO DE MODELOS ANIMAIS
PARA COMPREENSÃO DO PAPEL DAS CÉLULASTRONCO MESENQUIMAIS E PERICITOS NO
REPARO TECIDUAL E VASCULARIZAÇÃO
TUMORAL
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO, CULTURA,
EXPANSÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
VASCULOGÊNICO "IN VIVO" E "IN VITRO" DE
CÉLULAS TRONCO PLURIPOTENCIAIS DO
ADULTO COM CAPACIDADE DE DIFERENCIAÇÃO
ENDOTELIAL
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE
CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIAIS
ISOLADAS A PARTIR DE SANGUE DE CORDÃO
UMBILICAL
BANCO DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL
VIGÊNCIA
CONVÊNIO
REFERÊNCIA
2007 - 2009
VALOR(R$)
45.000,00
21/11/2005
21/11/2008
01.05.0691.00
2556/05
370.000,00
26/08/2005
26/08/2009
01.05.0466.00
0777/05
522.082,00
19/12/2007
19/12/2009
01.07.0652.00
0927/07
2.384.565,82
04/12/2007
04/12/2009
01.07.0581.00
0156/07
434.050,00
25/09/2006
25/09/2008
01.06.0598.00
1081/06
742.800,00
AGUARDANDO
CONVÊNIO
343.000,00
01/03/2008 A
01/03/2009
558137/2008-3
54.158,80
26/12/2007 A
25/12/2009
480770/2007-7
56.000,00
AGUARDANDO
LIBERAÇÃO
VALOR (US$)
872.220,00
155
COORDENADOR
FONTE
PROJETO
VIGÊNCIA
CONVÊNIO
REFERÊNCIA
VALOR(R$)
PROF. DR. EDUARDO
MAGALHÃES REGO
FAPESP
DETERMINAÇÃO DO EFEITO DA INATIVAÇÃO DO
GENE DA PROTEÍNA LIGANTE DO INHANCER CCAATΑ
NA HAMATOPOESE DE ANIMAIS TRANSGENICOS IMLRARA
01/11/2001 A
31/10/2003
2001/08693-8
182.890,33
PROF. DR. EDUARDO
MAGALHÃES REGO
CNPQ
ANÁLISE "IN VITRO" E "IN VIVO" DA ATIVIDADE ANTILEUCÊMICA DOS TOCOFEROIS NA LEUCEMIA
PROMIELOCITICA AGUDA
01/03/2005 A
01/03/2007
481911/2004-1
47.800,00
PROF. DR. EDUARDO
MAGALHÃES REGO
CNPQ
ANÁLISE DO PAPEL DA VIA DO TGFΒ E DO
POTENCIAL TERAPÊUTICO DE SEU INIBIDOR
HALOFUGINONA, NA LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA
AGUDA
01/02/2008 A
31/01/2010
484873/2007-5
80.000,00
PROF. DR. MARCO
ANTONIO ZAGO
FAPESP
CENTRO DE TERAPIA CELULAR
2000 a 2008
1998/14247-6
9.022.029,65
PROF. DR. MARCO
ANTONIO ZAGO
FAPESP
RESERVA TÉCNICA PARA INFRA-ESTRUTURA
01/08/2007
31/07/2009
2007/54816-0
129.955,01
PROF. DR. MARCO
ANTONIO ZAGO
FAPESP
RESERVA TÉCNICA PARA CONECTIVIDADE A REDE
ANSP
01/08/2007
31/08/2008
2007/55689-2
26.982,00
PROF. DR. LEWIS JOEL
GREENE
FINEP
PROTEÔMICA ESTRUTURAL E FUNCIONAL APLICADA
À ÁREA BIOMÉDICA
14/12/2007
14/12/2009
01.07.0595.00
PROF. DR. LEWIS JOEL
GREENE
FINEP e
FAPESP
APOIO À REDE PROTEÔMICA DO ESTADO DE SÃO
PAULO
PROF. DR. JULIO CÉSAR
VOLTARELLI
FINEP
TRANSPLANTE DE CÉLULAS-TRONCO
HEMATOPOÉTICAS EM DOENÇAS AUTO-IMUNES
PROF. DR. JULIO CÉSAR
VOLTARELLI
CNPQ
TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO
HEMATOPOÉTICAS PARA DIABETE MELITO TIPO I E
DOENÇAS NEURO-DEGENERATIVAS
PROFA. DRA. MARIA
ANGÉLICA MIGLINO
FAPESP
ESTUDO DA PLASTICIDADE DAS CÉLULAS-TRONCO
MULTIPOTENTES IMATURAS DERIVADAS DA POLPA
DE DENTE HUMANA: MODELO ANIMAL. PONTE PARA
TERAPIA CELLULAR
PROFA. DRA. MARIA
ANGÉLICA MIGLINO
CNPQ
PROFA. DRA. MARIA
ANGÉLICA MIGLINO
PROFA. DRA LYGIA DA
VEIGA PEREIRA
0875/2007
140.000,00
2004-2008
400.000,00
552266/2005-1
395.949,55
22/03/2007 a
21/03/2009
130.000,00
AUXÍLIO-PESQUISA O PROJETO UNIVERSAL CNPQ
2006 - 2008
35.000,00
FAPESP
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE
(GFP) COMO MARCADOR DE CÉLULAS DE ORIGEM
FETAL EM GESTAÇÕES DE CLONES BOVINOS
2006 - vigente
FAPESP
ANÁLISE DO PADRÃO DE INATIVAÇÃO DO
CROMOSSOMO X EM TECIDOS EXTRA-EMBRIONÁRIOS
HUMANOS.
8/2005 – 2/2008
05/52676-1
3.830.769,53
720.000,00
outubro/2007 a
outubro/2009
01/10/2005
01/10/2008
VALOR (US$)
250.000,00
50.000,00
156
COORDENADOR
FONTE
PROJETO
VIGÊNCIA
CONVÊNIO
REFERÊNCIA
VALOR(R$)
11/2006 –
12/2009
142.000,00
1/2006 – 8/2008
250.000,00
VALOR (US$)
PROFA. DRA LYGIA DA
VEIGA PEREIRA
FAPESP
VARIABILIDADE CLÍNICA EM UM MODELO ANIMAL
PARA A SÍNDROME DE MARFAN – IDENTIFICAÇÃO DE
GENES MODIFICADORES DO FENÓTIPO.
PROFA. DRA LYGIA DA
VEIGA PEREIRA
CNPQ
ESTABELECIMENTO DE NOVAS LINHAGENS DE
CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS HUMANAS
PROFA. DRA LYGIA DA
VEIGA PEREIRA
FAPESP
CRIAÇÃO DE UM MODELO ANIMAL PARA A SÍNDROME
DE MARFAN POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM
CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁIRAS.
10/2000 –
12/2004
200.000,00
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
CNPQ
CARACTERIZAÇÃO DA IMPORTÂNCIA DO ÁCIDO
LISOFOSFATÍDICO PARA O CULTIVO DE CÉLULASTRONCO NEURAIS DERIVADAS DO CÓRTEX CEREBRAL
DE CAMUNDONGOS E HUMANOS
2005/2007
26.615,00
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
CNPQ
CHROMOSOMAL INSTABILITY DURING
DIFFERENTIATION OF EMBRYONIC STEM CELLS TO
MOTOR NEURONS
2008/2010
22.000,00
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
CNPQ
CONTROLE DA ANEUPLOIDIA E DIFERENCIAÇÃO
NEURAL EM CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS
HUMANAS
2005/2007
200.000,00
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
FAPERJ
PROPAGAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS
EM BIORREATORES VISANDO AO AUMENTO DE
ESCALA PARA TRANSPLANTES EM DOENÇAS
NEURODEGENERATIVAS
2007/2008
79.000,00
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
FAPERJ
CONTROLE DA INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA E
DIFERENCIAÇÃO NEURAL EM CÉLULAS-TRONCO
EMBRIONÁRIAS HUMANAS
2007/2008
16.000,00
FAPERJ
CARACTERIZAÇÃO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DE
CÉLULAS-TRONCO EM MODELO PRÉ-CLÍNICO DA
DOENÇA DE PARKINSON: MECANISMOS DE
NEUROGÊNESE E COMPARAÇÃO FUNCIONAL ENTRE
CÉLULAS EMBRIONÁRIAS E ADULTAS
2008/2010
400.000,00
PROF. DR. WILSON ARAÚJO
FAPESP
DA SILVA JUNIOR
IDENTIFICAÇÃO DE CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL
DE MARCADORES MOLECULARES ENVOLVIDOS NO
PROCESSO DE FORMAÇÃO DE TUMORES DE CABEÇA
E PESCOÇO POR MEIO DE ANÁLISE DO PADRÃO
DIFERENCIAL DE METILAÇÃO
464.712,00
59.616,00
PROF. DR. WILSON ARAÚJO
FAPESP
DA SILVA JUNIOR
BUSCA DE MARCADORES DE AGRESSIVIDADE EM
TUMORES DE CABEÇA E PESCOÇO
451.842,48
126.572,85
DRA.SIMONE KASHIMA
HADDAD
PERFL QUANTITATIVO DA EXPRESSÃO DE
MICRORNAS EM POPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T DE
PACIENTES INFECTADOS PELO HTLV-1
PROF. DR. STEVENS
KASTRUP REHEN
CNPQ
01/10/2006
30/09/2008
475091/2006-0
38.000,00
60.000,00
38.600,00
157
COORDENADOR
FONTE
PROJETO
ESTUDO DAS FRAÇÕES MICROSSOMAL E CITOSÓLICA
DE LÍNFÓCITOS B DE PACIENTES PORTADORES DE
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA – UMA ANÁLISE
PROTEÔMICA DIFERENCIADA
ESTUDOS DAS MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUÇÃO EM
PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS NAS
LINHAGENS CELULARES MELAN-A, TM1 E TM5. UM
MODELO MURINO DE PROGRESSÃO DE MELANOMA.
VIGÊNCIA
CONVÊNIO
REFERÊNCIA
VALOR(R$)
PROF. DR. JOSÉ CÉSAR
ROSA
FAPESP
ROSA
FAPESP
ROSA
FAPESP
DRA. KLENA SARGES
MARRUAZ DA SILVA
UNESCO/CENP
-IEC/SVS-MS
DRA. KLENA SARGES
MARRUAZ DA SILVA
OPAS/CENPIEC/SVS-MS
DRA. KLENA SARGES
MARRUAZ DA SILVA
UNESCO/IEC/S
VS-MS
DR FLÁVIO MEIRELLES
FAPESP
VINDA LAWRENCE CHARLES SMITH UNIVERSIDADE
DE MONTREAL - CANADA
9/02/08 a
16/08/08
2007/58910-1
47527,13
FAPESP
EFEITO DA QUANTIDADE DE MITOCONDRIAS E DE
DNA MITOCONDRIAL SOBRE O DESENVOLVIMENTO
EMBRIONARIO BOVINO: DOIS MODELOS ORIGINAIS.
01/02/07 a
31/01/09
2006/59074-0
191095,42
FAPESP
PROSPECCAO DE MENSAGENS DE COMPETENCIA
OOCITARIA EM UM MODELO RETROSPECTIVO.
01/09/06 a
31/08/08
2006/55040-3
183926,47
FAPESP
ESTRUTURACAO DE PARQUE DE EQUIPAMENTOS DE
CIENCIAS CELULARES E MOLECULARES NO CAMPO
DE PIRASSUNUNGA.
01/04/05 a
31/03/08
2004/09028-6
820635,49
FAPESP
TRANSCRICAO E BLOQUEIO EMBRIONARIO EM
BOVINOS.
01/05/00 a
31/07/05
1999/12351-3
1017726,92
FAPESP
DESENVOLVIMENTO E CAPACITACAO TECNICA NA
PRODUCAO DE BOVINOS TRANSGENICOS POR
RECOMBINACAO HOMOLOGA.
01/07/04 a
31/07/08
2003/10167-8
109726,47
EFEITOS BIOLÓGICOS E APLICAÇÕES
FARMACÊUTICAS DE LECTINAS
IDENTIFICAÇÃO E CONTROLE DAS
ENDOPARASITOSES ZOONÓTICAS EM PRIMATAS NÃOHUMANOS MANTIDOS NO CENTRO NACIONAL DE
PRIMATAS – SVS/MS
MONITORAMENTO CLÍNICO E EPIDEMIOLÓGICO EM
PRIMATAS NÃO-HUMANOS SOROPOSITIVOS PARA
HEPATITES VIRAIS MANTIDOS NO CENTRO NACIONAL
DE PRIMATAS – SVS/MS
IMPLANTAÇÃO DE NOVO MÉTODO DE CRIAÇÃO DE
ANIMAIS DE LABORATÓRIO E RECOLONIZAÇÃO DO
PLANTEL DE ROEDORES E LAGOMORFOS DO
BIOTÉRIO DO INSTITUTO EVANDRO CHAGAS – IECSVS/MS
2005-2007
VALOR (US$)
10.648,00
2006-2008
1.040.000,00
2008-2012
1.114.859,19
fevereiro de
2005 a abril de
2006
50.400,00
de julho de 2006
a 02 de outubro
de 2006
15.632,00
Desde fevereiro
de 2008 até dias
atuais
47.380,00
TOTAL GERAL
24.375.753,97
4.125.606,38
158
P) Anuência Formal das Instituições Envolvidas
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
181
Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas Associate Professor FMRP/USP DD. President Director Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto September 15, 2008 Dear Prof Dimas, I am delighted to accept your invitation to be a collaborator on the Project from CNPq Edital No 15/2008 ‐ entitled “National Institute of Science and Technology”, and thus continue our productive collaboration that began two years ago when one of your researchers visited my lab to learn the LM‐PCR technique. I am pleased to hear that a publication utilizing data generated with this technique is being written at the present time. Important to the current project, we have a great deal of experience with Mesenchymal and Hematopoietic Stem Cells, as well as gene modification of stem cells using murine retrovirus and lentivirus vector systems. Moreover, we have developed two large animal models which we are using to study the in vivo distribution and differentiative capacity of specific human stem cells: 1) a line of Hemophilia A sheep; and 2) the human/sheep xenograft model. Based on our prior collaborative productivity and our experience with in vivo models of stem cell transplantation/biology, I would be glad to collaborate with you and add my expertise to several of your sub‐projects. Sincerely, Graça Duarte de Almeida-Porada,MD,PhD
Professor
Director of Graduate Studies
Department of Animal Biotechnology
University of Nevada, Reno
Mail Stop 202
Reno NV 89557-0104 Phone:(775)-784-6755
(775)-784-8048 LAB Fax:
(775)-784-1375
[email protected]
182
183
184
185
Q) Contrapartida Institucional
As instituições participantes oferecem como contrapartida o seu parque de
equipamentos existentes em seus laboratórios e os recursos humanos necessários
para desenvolver a proposta. Adicionalmente, o Hemocentro de Ribeirão Preto
construirá dois novos laboratórios para abrigar atividades relacionadas com os
projetos apresentados (Laboratório de Estudos Experimentais em Animais e
Laboratório de Biotecnologia) com custo estimado de 6,2 milhões de reais.
Contrapartida
Instituição
Recursos
Humanos
Infra-estrutura
Laboratorial
Total
Instituto de
Biosciencias/USP
198.000,00
2.500.000,00
2.698.000,00
FMVZ – USP
100.000,00
1.146.950,00
1.246.950,00
FZEA - USP
472.440,00
2.050.000,00
2.522.440
Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
INFRA-ESTRUTURA LABORATORIAL (EQUIPAMENTOS) TOTAL
(R$) Biologia Celular 261.770,08
Transferência Gênica 523.491,83
Citometria de Fluxo 653.634,13
Congelamento de Celulas Precursoras Hematopoéticas Biologia Molecular Genética Molecular 1.834.650,99
855.449,37
1.530.988,76
Lab. de H.L.A. 322.696,57
Química de Proteínas 319.360,12
Total 6.302.314,85
186
RECURSOS HUMANOS Salários e encargos TOTAL MENSAL
(R$) 44.541,47
OBRAS N.
VALOR
MESES TOTAL (R$) 60 2.672.488,20
TOTAL FUNDHERP
(R$) Laboratório de Estudos Experimentais em
Animais 1.470.000,00
Laboratório de Biotecnologia 4.800.000,00
Total 6.270.000,00
187
Infra-estrutura
Centro Regional de Hemoterapia - Hemocentro de Ribeirão Preto
Hospital das Clínicas - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
Salas de Aula:
•
Sala Verde - (72 m²): unidade climatizada, composta de mesas modulares
com cadeiras individuais, com capacidade para até 80 pessoas, equipada
com sistema de multimídia e internet.
•
Sala Amarela – (22 m²): unidade climatizada, composta de carteiras
individuais tipo escolar, com capacidade para até 30 pessoas, equipada com
sistema portátil de multimídia.
Anfiteatros:
•
Vermelho – (146 m²): unidade climatizada, composta de cadeiras individuais
com braço escamoteável, com capacidade para 180 pessoas, equipada com
sistema de multimídia, internet e som.
•
Azul – (62 m²): unidade climatizada, composta de cadeiras individuais com
braço escamoteável, com capacidade para 50 pessoas, equipada com
sistema de multimídia, internet e som.
Centro de Informática:
•
(47 m²) Unidade Central de Informática, composta de por: 1)Servidor
Central, com unidade de disco óptico para leitura e gravação, módulo de
memória 16 DIMM, com duas unidades de disco rígido HP U320 SCSI 73 GB,
12 unidades de disco de 72,8 GB, uma unidade de fita magnética Ultrium
448, sistema operacional HPXV v1 – Modelo HP RP 4440; 2) Servidor PA-RISC
série 9000, com 2 módulos de memória de 512 MB, com unidade de fita
magnética Leasg 16-00, sistema operacional HP-UX V.11 – Modelo HP L2000;
3) Servidor PA-RISC série 9000, com unidade de disco de 2 GB, dois discos
externos de 2 GB – Modelo HP K210/128; 4) Banco de Dados: a) Oracle 10G
188
Database Standart, plataforma HP-UXPA-RISC; b) Sistema “Progress”; 5) 2
Servidores com memória de 1024 MB, unidade de disco de 72 GB, fonte de
alimentação redundante – Modelo HP DL 380; 6) Sistema de rede Hub
empilhável – Modelo 3 COM Super Stack; 7) No-Break, potencia nominal de
10 KVA automático; microcomputadores, scaner’s e impressoras, dentre
outros.
Laboratórios:
• Laboratório de Criobiologia I – (71 m²): unidade composta de áreas de
apoio, de congelamento de células precursoras hematopoéticas e de estoque
(sangue de cordão umbilical). Conta com os seguintes equipamentos básicos:
aparelho conexão estéril, microcomputador, pipetas, câmara de conservação
com acessório do embryo freezer para armazenagem de bolsas, sistema de
estocagem-cryoplus, selador manual dielétrico com selador hemoseal
automático de bancada para bolsa de sangue, capela de fluxo, contador
automático de células, freezer horizontal, freezer ultra baixa temperatura (86ºC), cilindro de alta pressão capacidade de 25Kg, sistema para produção
de água tipo 1, incubadora de CO2, phmetro portátil, microscópio invertido e
óptico, termo hidrômetro, botijão criogênico para transporte, câmara de
conservação, balança analítica, extrator de plasma, seladora universal
frezenius, sistema “bioarchive” de armazenamento, centrifuga refrigeradora
e de baixa velocidade e balança de precisão, dentre outros.
• Laboratório de Criobiologia II – (41 m²): unidade composta de área
laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microscópios
invertido, monitores colorido, micro pipetador, pipetas de precisão, cuba de
eletroforese, bomba à vácuo, sistema de eletreforese automatizado,
refrigerador, capelas de segurança biológica, centrífugas, incubadoras,
impressora, estabilizador, scanner de mesa colorido, freezer, rotor de
angulo, câmara de vídeo digital, refrigerador duplex, agitador magnético,
termociclador automático, phmetro, incubadora, agitador biológico, sistema
de filtração avançado, frigobar, microcomputadores e impressoras, dentre
outras.
189
•
Laboratório de Controle de Qualidade: (44 m²): unidade composta de área
laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: coagunômetro,
pipetas automáticas de precisão, refrigeradores, microscópios, phmetros,
banhos-maria, freezer, centrífugas, espectofotômetro, capela de fluxo
laminar, dentre outros.
• Laboratório de H.L.A. – (22 m²): unidade composta de área laboratorial.
Conta com os seguintes equipamentos básicos: termociclador, citômetro de
fluxo,
plataforma, bomba de alimentação, microscópio, banho maria,
centrifuga, pipetas, câmera fotográfica, cuba de eletroforese, balança,
agitador de tubos, freezer refrigeradores, capela de biossegurança,
incubadora, sistema de eletroforese,microcomputador com impressora.
• Laboratório de Cultura Celular – (68 m²): unidade composta de área para
cultura e laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos:
microscópio óptico binocular, cilindro de CO2, pipetas de precisão,
pipetador, freezer vertical (-86°), microscópio invertido com contraste de
fase, agitador de tubos, incubadora, banho-maria, centrifuga refrigerada,
sistema semi-automático de foto-micrografia, tanque nitrogênio liquido,
capela de segurança biológica, microscópio biológico binocular, phmetro,
refrigeradores, microscópio invertido, balança analítica, destilador de água,
sistema de eletroforese, leitores de código de barras, capela de fluxo
laminar, dentre outros.
• Laboratório de Biologia Molecular: (94 m²): unidade composta de área
laboratorial.
Conta
com
os
seguintes
equipamentos
básicos:
fonte
eletroforese, destilador de água, banho maria, video copy processor,
homogeneizador de microplacas, pipetas, compressor aspirador, sistema
aquisição de imagem microscópica, unidade transluminadora para detecção
fluorescência DNA, capela de fluxo laminar,
incubadora, centrífugas,
refrigerador duplex, termocicladores automático, concentrador de amostras,
190
freezer, espectrofotometro para ácidos nucleicos,
speed vac com
componentes de alta capacidade, microcomputadores e impressoras, dentre
outros.
• Laboratório de Biologia Celular: (67 m²): unidade composta de área
laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: refrigeradores,
sistema eletroforese, impressoras, pipetas, cubas, espectrofotômetro,
cellmax pump station, contador de cintilações e microplacas, freezer,
centrífugas, microscópio biológico, banho maria, capela de exaustão,
microcomputadores e impressoras, dentre outros.
• Laboratório de Citometria de Fluxo: (47 m²): unidade composta de área
laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: citômetro de
fluxo, pipetas, refrigeradores, bomba de vácuo, sistema facstation power
macintosh,
facsorting
interface,
micropipetas,
centrífugas,
microcomputadores, impressoras, dentre outros.
• Laboratório de Genética Molecular: (47 m²): unidade composta de área
laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: projetor
multimídia, termociclador automático, freezer, câmara para PCR, pipetas,
refrigeradores,
sistema
de
eletroforese
horizontal,
banho
maria,
microcentrífuga, agitador magnéticos, sequenciador, seladoras de placas,
estufa de cultura bacteriológica, analisador genético de DNA, aparelho mults
creem mini protean, sistema de micro placas, sonicador, carregador de gel,
incubadora, sequenciador automático, capela de fluxo laminar, scanner HP
Scanjet, micropipetas, termomixer digital, microcomputadores, notebook e
impressoras, dentre outros.
• Laboratório de Bio-informática: (25 m²): unidade composta de área de
informática.
Conta
microcomputadores
com
com
os
seguintes
monitores
equipamentos
coloridos,
scanner’s
básicos:
de
mesa,
impressoras e projetor de multimídia, dentre outros.
191
• Laboratório de Pesquisas e Estudos: (34 m²): unidade composta de área de
pesquisa por informática. Conta com os seguintes equipamentos básicos:
microcomputadores, impressoras, dentre outros.
•
Biblioteca – (42 m²): a unidade conta com o acervo composto por 1.160
livros, 4.000 peroódicos e revistas, 19 obras de referência (impressas e CRRom), teses, dissertações e monografias, guias, 09 assinaturas eletrônicas,
03 assinaturas de jornais, anais e coleção da produção científica do corpo
docente, dentre outros.
• Recursos Audio-visuais – (33 m²) – unidade composta de áreas para
elaboração e produção de material bibliográfico e de imagens e multimídia.
Conta
com
os
seguintes
equipamentos
básicos:
microcomputadores,
scanner’s de mesa, impressoras, plotter, filmadoras, câmaras fotográficas,
equipamentos gravação de CD’s e DVD’s e projetores portáteis, dentre
outros.
•
Serviços de Enfermagem – (76 m²) – unidade composta de áreas destinadas
a gestão de enfermagem, apoio administrativo, aféreses, sala de transfusão,
consultórios médicos, triagem de doadores e coleta de sangue. Conta com os
seguintes
equipamentos
básicos:
microcomputadores,
impressoras,
esfignomanometros, sistemas para aférese, seladoras de bolsa, cadeiras para
aférese, bombas de infusão, carrinhos de urgência e aspiradores cirúrgicos,
dentre outros.
•
Serviço Social – (21 m²) – unidade composta de áreas destinadas ao apoio
social a doadores e pacientes em regime ambulatórial. Conta com os
seguintes equipamentos básicos: microcomputadores, impressoras, scanner,
filmadora, câmara fotográfica, TV e equipamento de DVD, dentre outros.
•
Laboratório de Hematologia – (622 m2): unidade composta de área para
secretaria,
laboratório
e
cultura
celular.
Conta
com
os
seguintes
192
equipamentos básicos: geladeiras, freezer –20 e – 80 C, centrífugas com e
sem refrigeração, centrífuga speed-vac, citocentrífuga, forno microondas,
forno de hibridização, forno de hibridização para lâminas de microarrays,
balança de precisão, pHmetro, geneQuant, espectrofotômetro, máquina de
gêlo, máquina para congelamento de células, incubadora refrigerada de
bancada, incubadora de bancada, termociclador, sistema de PCR em tempo
real, banho-seco, banho-maria, sistema de purificação de água, capela de
fluxo laminar, rack isolador negativo, incubadora de CO2, agitador de
bandeja, agitador de tubos, agitador magnético com e sem aquecimento,
fontes de alimentação para cubas de eletroforese, cubas de eletroforese
vertical e horizontal, homogeneizador de tecidos, , scanner, sistema de
documentação
fotográfica,
autoclave,
contador/analisador
celular,
pipetadores, computadores e impressoras.
•
Biocentro – (1.006 m²) – unidade composta de áreas destinadas à
laboratórios de HLA, Biotecnologia e anemias hereditárias, Terapia Celular,
Citogenética e Imunofluorescência, Casa da Ciência e salas de apoio.
Laboratório de Biotecnologia e anemias hereditárias - Conta com os
seguintes equipamentos básicos: microondas, agitadores, banho-maria,
estufa e balança analítica.
Laboratório Terapia Celular - Conta com os seguintes equipamentos
básicos: microscópio, pipetadores, centrífugas refrigeradas, freezer,
banho-maria, contadores de células, incubadora de CO2, tanque de
nitrogênio, cubas de eletroforese, capela de exaustão externa, phmetro,
balança analítica, fonte de eletroforese e ultrafreezer.
Laboratório Citogenética e Imunofluorescência - Conta com os
seguintes equipamentos básicos: microscópio, fonte de fluorescência,
estufa para cultura, capela de exaustão, agitadores de tubos, contador
de células
193
•
Casa da Ciência e Museu e Laboratório de Ensino de Ciências - unidade
composta de áreas destinadas a atividades educacionais. Conta com os
seguintes equipamentos básicos: computadores, impressoras, plotter,
scanner, DVD, vídeo cassete, filmadora, câmeras fotográficas, projetores
multimídia, televisores, microscópio, quadro eletrônico, equipamentos de
som, notebook, refrigerador.
•
Laboratório de Estudos Animais – (722,45 m²) – unidade composta de 2
pavimentos destinados àmanipulação de animais, estudos e procedimentos
cirúrgicos. Encontra-se em fase de construção.
•
Laboratório de Biotecnologia – (5.438 m²) – unidade composta de 6
pavimentos destinados à laboratórios altamente especializados e equipados
para cultura celular, criopreservação, sorologia, NAT, produção de fator VIII.
Projeto finalizado e aprovado, aguardando a liberação dos recursos para
início da construção.
•
Sala de Manipulação de Animais – (54 m²) – unidade composta de áreas
destinadas à manipulação de animais. Conta com os seguintes equipamentos
básicos: capela, freezer, centrífuga e estantes.
•
Biotério – Faculdade de Farmácia: unidade de categoria sanitária SPF
(specific pathogen-free), composta de 3 salas destinadas à criação de
camundongos e ratos. Conta com os seguintes equipamentos básicos:
estantes de ferro e um “pass-through”, autoclaves de portas duplas, estufa
rack ventilado, estantes para manutenção de aproximadamente 300 casais
de matrizes de camundongos em expansão, perfazendo um total de 8
linhagens,
provendo
à
comunidade
científica
uma
média
de
500
camundongos/mês e um total de 40 casais (matrizes) de ratos Wistar.
194
•
Centro Químico de Proteínas – (460 m²) – unidade composta de áreas
destinadas a laboratóros de preparação de amostras, eletroforese,
secretaria, salas de apoio. Conta com os seguintes equipamentos básicos:
agitador de tubos, agitador magnético, fonte de eletroforese, refrigerador,
hypercassete, mocho odontológico, phmetro, sistema de avaliação de
eletroforese, sistema de produção de água ultrapura e pré-tratamento de
água.
Instituto de Biociências / Departamento de Genética e Biologia Evolutiva
•
Sala de cultura de células: conta com os seguintes equipamentos
básicos: fluxos laminares, estufas com CO2, Centrífuga de mesa
refrigerada, Microscópio invertido, Lupa, Banhos aquecidos, Microcentrífuga, Freezer –70oC, Tanques de nitrogênio líquido, Aparatos de
eletroforese em gel de agarose e em poliacrilamida, 2 máquinas de PCR
(24 e 96 poços), balanças, estufas, pHmetros, agitadores, pipetadores,
forno
de
microondas,
microcomputadores
tipo
PC,
scanner
e
impressoras, acesso pleno à internet.
•
Biotério
de
Experimentação:O
Biotério
de
Experimentação
do
Departamento de Imunologia está em funcionamento há 8 anos. A
Estrutura instalada permite a manutenção de camundongos e ratos livres
de patógenos. O biotério possui ar condicionado central com renovação
de 100% do ar, área de lavagem de materiais com máquina de lavar
gaiolas e bebedouros, sistema de ultra som para lavagem de bicos, 2
autoclaves de grande porte e máquina de lavar e secar roupas para os
uniformes dos funcionários e aventais utilizados pelos usuários. Todo o
material (gaiolas, tampas de gaiolas, bebedouros e água, maravalha e
ração) é autoclavado. As salas de manutenção e animais são mantidas a
21 +- 2 oC, com 12 horas de claro e 12 horas de escuro. O biotério conta
com estrutura laboratórial para realização de rotinas de controle
genético e sanitário (virologia, parasitologia e bacteriologia).
195
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
•
Laboratório de Neurogênese e Diferenciação Celular (LANDIC), ICB
UFRJ: conta com os seguintes equipamentos básicos:Lupa de dissecção e
cirurgia, Microscópio Invertido; Microscópio,
cabines de fluxo laminar
vertical, incubadoras de CO2, agitadores orbitais, sistema de produção
de água Millipore, reservatório de nitrogênio, geladeira, freezers –20oC,
freezer –70oC, banhos termostáticos, instrumentos de dissecção,
centrífuga refrigerada (tubos de 15/50mL), microcentrífuga Eppendorf
5402; máquina de PCR, fontes e cubas de eletroforese horizontais e
verticais, placa teflon elétrica com termômetro para hibridização in situ,
balanças,
estufas,
pHmetros,
agitadores,
pipetadores,
forno
de
microondas etc. microcomputadores Macintosh, computadores tipo PC,
scanner e impressoras, acesso pleno `a internet, sistema de cariotipagem
automático
BandView,
Estereotáxico
para
camundongos
e
ratos,
Microscópio óptico dotado de fluorescência, contraste interferencial
diferencial e fase, câmera digital Axiocam com software instalado em PC,
equipamentos de microtomia, criostato e micrótomo de parafina.
Instituto Evandro Chagas
Centro Nacional de Primatas
•
Cada Seção dispõe de espaço físico onde estão alocados os laboratórios
que desenvolvem cada linha de pesquisa, inerentes à Seção, além disso,
a estrutura física presente no campus de Ananindeua possui: Diretoria,;
Serviços de Administração, Execução Orçamentária e Financeira,
Almoxarifado, Compras, Informática, Manutenção, Material e Patrimônio,
Transportes, Recursos Humanos, Cadastro, Desenvolvimento de Recursos
Humanos, Pagamento, Saúde do Trabalhador; Biblioteca; Laboratório de
Geoprocessamento;
Assessorias
de
Comunicação,
Desenvolvimento
Científico e Acadêmico, Planejamento, Programa Institucional de Bolsas
de Iniciação Científica, Comissão Interna de Biossegurança, Comitê de
Ética de Pesquisa em Seres Humanos, Comitê de Ética em Pesquisa
196
Animal, Conselho Técnico & Científico, Gerência de Qualidade. Conta
com os seguintes equipamentos básicos: Instrumentos básicos de cirurgia
geral, Autoclaves, Equipamento para inclusão em parafina e preparação
de laminas: aparelho para inclusão, forno a vácuo, micrótomo,
equipamento para coloração de lâminas, Microscópio de luz, Freezer 70oC, Equipamentos para outros exames como PCR, ELISA, bioquímica
sérica, ultrassonografia 4D
Laboratório de Morfofisiologia Molecular do Departamento de Ciências
Básicas da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos
•
Como
infra-estrutura
o
Laboratório
de
Morfofisiologia
Molecular
e
Desenvolvimento conta com 280 m2 de área construída de pesquisa equipada
com toda a infra-estrutura de pesquisa em cultivo celular incluindo
incubadoras, microscópios além de uma boa infra-estrutura de pesquisa
molecular capacitada para estudos de expressão gênica incluindo PCR em
tempo Real, leitores de imagem a laser para diferentes aplicações incluindo
“differential display” PCR e macro-arranjo entre outros. O LMMD também
com um anexo denominado de Unidade Neonatológica Animal que esta em
construção em Pirassununga com financiamento de infra-estrutura da FINEP
e tem uma área de 200m2 que é destinado a produção de animais de grande
porte geneticamente modificados.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
•
Laboratório de Anatomia Microscópica e Imunohistoquimica: Equipado
com destilador,estufas para secagem de material, dispenser para parafina,
metalizador, ponto critico, micrótomos, banho-maria, geladeiras para
estocagem do material, microscópios, sonicador, computador e capela.
Oferece condições tecnológicas de suporte a pesquisa na área de
197
microscopia biológica de luz, preparação de tecidos, moldes, modelos e
colorações diversas. Desenvolve técnicas microvasculares, preparação de
moldes e modelos vasculares, montagem e análise. Conta com, sistema de
imagem para microscopia com 10 microscópios trinoculares, sendo 1
interligado com sistema de dupla observação para microscópios Marca Leica,
Mod. DME e sistema de aquisição de imagens para televisão, através de
acoplagem de tubo trinocular para Miscroscopio Leica, com Adaptador CMount para câmeras de vídeo Colorida 1/3" CCD Sansung SDC-313 com
resolução maior de 480 Linhas-TV. Oferece serviços ao público em geral tais
como: Preparação e coloração de tecidos para investigação histológica e
imunohistoquimica; preparados de membranas biológicas; preparação de
moldes e modelos vasculares para microscopia eletrônica; preparação de
corantes e fixadores de tecidos; montagem e preparo de cortes semi-finos e
mesoscópicos. Foi utilizado com sede do curso prático de especialização em
Biologia do Desenvolvimento e Células Tronco Embrionárias em 2006.
•
Laboratório de cultivo celular:Equipado com encubadora de CO2, lupa
marca Leica adaptada em fluxo laminar do tipo MINIFLOW para manuseio de
embriões de variadas espécies, com garantia de não contaminação do
material biológico, fluxo laminar da marca Veco, microscópio invertido com
captura de imagem, geladeira, banho-maria, centrifuga e freezer -80Cº,
oferecendo condições para desenvolvimento de pesquisas que envolvam
cultivo de células, através da utilização de materiais como: garrafas para
cultivo, tubos tipo falcon de 15 e 50ml, ponteiras, pipetas descartáveis,
placas de petri de diversos tamanhos, filtros, meios de cultivo e
suplementos.
•
Laboratório
de
Microscopia
Eletrônica:
Equipado
com
Microscópio
Eletrônico de Varredura (Leo - 435 VPZeiss), e Microscópio Eletrônico de
Transmissão (MET) modelo Magni 268D, proveniente da empresa FEI
Company (PHILIPS), equipado com sistema de análises de imagens SIS DOCU
TEM, câmera digital 268, trabalhando com kilovoltagem entre 40 e 100 KV,
cujo aumento varia de 25 a 280.000X. Equipado ainda com unidade de
refrigeração de água, especialmente desenvolvido para a área de ciências
198
biológicas, além de dois Ultra Micrótomos da Leica, um aparelho metalizador
Balzers, um aparelho de Ponto Crítico e demais equipamentos necessários ao
preparo, análise de diferentes tipos de tecidos e amostras. O microscópio
eletrônico de varredura tem a capacidade de trabalhar com amostras
desidratas ou não, metalizadas ou não, garantindo assim rapidez, eficiência
e baixo custo do processamento. Realiza o Preparo e análise de
eletromicrografias;
Revelação
e
Ampliações
de
eletromicrografias;
Preparação e cortes ultrafinos para microscopia eletrônica de transmissão;
Preparo e análise do material para microscopia eletrônica de varredura;
Preparo do material para microscopia eletrônica de transmissão
•
Centro cirúrgico:Oferece aos pesquisadores a possibilidade dos testes préclinicos em diferentes tipos de animais. Equipado com mesa cirúrgica,
armário para medicamentos, foco cirúrgico, cilindro de oxigênio, máquina
de tosa e aparelho anestésico HB Hospitalar modelo Galanti.
199
R) Cronograma
Nome do Subprojeto
1º ano
2º ano
3º
ano
4º
ano
5º
ano
1. Avaliação da estabilidade epigenética de linhagens de células-tronco
embrionárias estabelecidas em diferentes condições
2. Propagação de células-tronco embrionárias humanas em biorreatores
visando o aumento de escala para transplantes em doenças
degenerativas
3. Bases moleculares da diferenciação hematopoética a partir de CTE
4. Cultura de células-tronco adultas e embrionárias de animais e humanos
para uso em terapias celulares
5. Modificação gênica de células-tronco
6. Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas
(iPS) de modelos animais de grande porte
7. Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas
(iPS)
8. Células pluripotentes autólogas geradas a partir de células somáticas
diferenciadas
9. Modelo animal para estudo da herança mitocondrial intra e interespécie
10.Investigação da identidade da célula-tronco mesenquimal (MSC):
comparação entre MSCs cultivadas e pericitos
11.Avaliação do potencial angiogênico e elucidação das interações
moleculares de células-tronco mesenquimais e células endoteliais em
sistemas de co-cultivo in vitro e in vivo
12.Comparação da expressão de proteínas de células tronco mesenquimais
humanas obtidas da medula óssea e da veia do cordão umbilical
13.Diferenças na expressão gênica e de marcadores imunofenotípicos em
células epiteliais amnióticas obtidas na presença e na ausência de
componentes de origem animal
14.Isolamento e caracterização funcional de células-tronco pluripotentes
“side population”
15.Avaliação Funcional de microRNAs na diferenciação de células
mesenquimais estromais multipotentes humanas
16.Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação osteogênica in
vitro em amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita
200
Nome do Subprojeto
1º ano
2º ano
3º
ano
4º
ano
5º
ano
17.Análise gênica, protéica e funcional de células-tronco mesenquimais de
pacientes com doenças auto-imunes
18.Determinação dos níveis de algumas proteínas relacionadas ao processo
apoptótico e controle do ciclo celular de células precursoras
hematopoéticas normais e células precursoras leucêmicas
19.O papel da disquerina na diferenciação das células hematopoéticas
20.Modelo de Leucemia Aguda em Chlorocebus aethiops (Cercopithecus
aethiops) Usando Células Tronco Hematopoéticas Transduzidas com
Vetor R etroviral Contendo o Gene Híbrido CALM-AF10
21.Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais na
regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura térmica
extensa em modelo animal
22.Uso de celulas-tronco mesenquimais modificadas geneticamente para
expressão do fator IX em modelos murinos portadores de Hemofilia B
23.Desenvolvimento de um bioprocesso para expansão de Células-Tronco
Mesenquimais em microcarregadores
24.Proteômica funcional: estudos do papel da nucleofosmina na
gliomagênese
25.Ferramentas de Citogenômica aplicadas à investigação da instabilidade
cromossômica na leucemia linfocítica crônica (LLC)
26.Centro de Estudos pré-clínicos e banco de células-tronco animal
27.Disponibilização de primatas neotropicais (novo mundo) e da espécie
Chlorocebus aethiops (espécie do velho mundo) para pesquisas com
células-tronco adultas e embrionárias como modelo biológico para
terapias celulares
28.Tratamento de diabetes mellitus tipo 1 com infusão de células-tronco
mesenquimais
29.Tratamento de esclerose múltipla com células-tronco hematopoéticas:
avaliação da resposta clínica e dos mecanismos imunológicos de ação
30.Ensaio Clínico: Uso de Células-Tronco Mesenquimais no Tratamento e
Prevenção da Doença do Enxerto contra o Hospedeiro em pacientes
201
S) Indicação do Comitê Gestor
O comitê gestor será formado pelo coordenador do projeto (Prof. Dr.
Roberto Passetto Falcão) e por um representante de cada um dos quatro grupos
associados neste projeto:
•
Faculdade de Medicina Veterinária de São Paulo – Profa. Dra. Maria Angélica
Miglino
•
Faculdade de Zootecnia de Pirassununga – Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles
•
Instituto de Biociências da USP e UFRJ – Profa. Dra. Lygia Pereira Veiga
•
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas
202
T) Estrutura Organizacional e Funcional do Instituto
Project
Coordinatortor External Advisory
Committed
Comittee Gestor
Administration and
Support Manager
Research
Coordinator
Education
Coordenator
Technology Transfer
Purchasing
Research Program
Middle-high School
Administrative
Support
Research
Laboratories Technical Personnel
CRH
University Students
Doctoral
Post- Doctoral
Private Sector
Quality Control
and Audit
USP SP 1 FMVZ
Preclinical trial
“Core Facilites”
UFRGS
Training of Industry
Partners
Public Sector
Small Business
Incubator
UFG UFTO
UFERSA
UNB
UNESP - DRACENA
UFPI
UDESC
USP – SP 2 IB
USP - PIRASSUNGA
UFRJ
USP–Ribeirão Preto
Belém
203
Bibliografia
Al-Shahrour, F., R. Diaz-Uriarte e J. Dopazo. FatiGO: a web tool for finding
significant associations of Gene Ontology terms with groups of genes.
Bioinformatics, v.20, n.4, Mar 1, p.578-80. 2004.
Anderson, M. S. e J. A. Bluestone. The NOD mouse: a model of immune
dysregulation. Annu Rev Immunol, v.23, p.447-85. 2005.
Ashburner, M., C. A. Ball, J. A. Blake, D. Botstein, H. Butler, J. M. Cherry, A. P.
Davis, K. Dolinski, S. S. Dwight, J. T. Eppig, M. A. Harris, D. P. Hill, L. Issel-Tarver,
A. Kasarskis, S. Lewis, J. C. Matese, J. E. Richardson, M. Ringwald, G. M. Rubin e
G. Sherlock. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology
Consortium. Nat Genet, v.25, n.1, May, p.25-9. 2000.
Atkinson, M. A. e G. S. Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease
pathogenesis and treatment. Lancet, v.358, n.9277, Jul 21, p.221-9. 2001.
Badillo, A. T., R. A. Redden, L. Zhang, E. J. Doolin e K. W. Liechty. Treatment of
diabetic wounds with fetal murine mesenchymal stromal cells enhances wound
closure. Cell Tissue Res, v.329, n.2, Aug, p.301-11. 2007.
Banas, R. A., C. Trumpower, C. Bentlejewski, V. Marshall, G. Sing e A. Zeevi.
Immunogenicity and immunomodulatory effects of amnion-derived multipotent
progenitor cells. Hum Immunol, v.69, n.6, Jun, p.321-8. 2008.
Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell,
v.116, n.2, Jan 23, p.281-97. 2004.
Biase, F. H., G. K. Fonseca Merighe, W. K. Santos Biase, L. Martelli e F. V.
Meirelles. Global poly(A) mRNA expression profile measured in individual bovine
oocytes and cleavage embryos. Zygote, v.16, n.1, Feb, p.29-38. 2008.
Burt, R. K., B. Cohen, J. Rose, F. Petersen, Y. Oyama, D. Stefoski, G. Katsamakis,
E. Carrier, T. Kozak, P. A. Muraro, R. Martin, R. Hintzen, S. Slavin, D. Karussis, S.
Haggiag, J. C. Voltarelli, G. W. Ellison, B. Jovanovic, U. Popat, J. Mcguirk, L.
Statkute, L. Verda, J. Haas e R. Arnold. Hematopoietic stem cell transplantation
for multiple sclerosis. Arch Neurol, v.62, n.6, Jun, p.860-4. 2005.
Burt, R. K., A. Marmont, Y. Oyama, S. Slavin, R. Arnold, F. Hiepe, A. Fassas, J.
Snowden, F. Schuening, H. Myint, D. D. Patel, D. Collier, H. Heslop, R. Krance, L.
Statkute, L. Verda, A. Traynor, T. Kozak, R. Q. Hintzen, J. W. Rose, J. Voltarelli,
Y. Loh, M. Territo, B. A. Cohen, R. M. Craig, J. Varga e W. G. Barr. Randomized
controlled trials of autologous hematopoietic stem cell transplantation for
autoimmune diseases: the evolution from myeloablative to lymphoablative
transplant regimens. Arthritis Rheum, v.54, n.12, Dec, p.3750-60. 2006.
Caligaris-Cappio, F. e T. J. Hamblin. B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of
a different feather. J Clin Oncol, v.17, n.1, Jan, p.399-408. 1999.
204
Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus
regenerative medicine. J Cell Physiol, v.213, n.2, Nov, p.341-7. 2007.
Carneiro, A. A., J. P. Fernandes, D. B. De Araujo, J. Elias, Jr., A. L. Martinelli, D.
T. Covas, M. A. Zago, I. L. Angulo, T. G. St Pierre e O. Baffa. Liver iron
concentration evaluated by two magnetic methods: magnetic resonance imaging
and magnetic susceptometry. Magn Reson Med, v.54, n.1, Jul, p.122-8. 2005.
Carneiro, A. A., G. R. Vilela, J. B. Fernandes, D. Araujo, O. Baffa, J. Elias, Jr., G.
St Pierre, I. L. Angulo e D. T. Covas. in vivo tissue characterization using magnetic
techniques. Neurol Clin Neurophysiol, v.2004, p.85. 2004.
Carneiro, A. A. F. J. P. Z., M.A.; Covas, D.T. An alternating current superconductor
susceptometric system to evaluate liver iron overload. Review of Scientific
Instruments, v.74, n.6, p.3098-3103. 2003.
Carrara, R. C., M. D. Orellana, A. M. Fontes, P. V. Palma, S. Kashima, M. R.
Mendes, M. A. Coutinho, J. C. Voltarelli e D. T. Covas. Mesenchymal stem cells
from patients with chronic myeloid leukemia do not express BCR-ABL and have
absence of chimerism after allogeneic bone marrow transplant. Braz J Med Biol
Res, v.40, n.1, Jan, p.57-67. 2007.
Challen, G. A. e M. H. Little. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem
Cells, v.24, n.1, Jan, p.3-12. 2006.
Chen, D. Y., D. C. Wen, Y. P. Zhang, Q. Y. Sun, Z. M. Han, Z. H. Liu, P. Shi, J. S.
Li, J. G. Xiangyu, L. Lian, Z. H. Kou, Y. Q. Wu, Y. C. Chen, P. Y. Wang e H. M.
Zhang. Interspecies implantation and mitochondria fate of panda-rabbit cloned
embryos. Biol Reprod, v.67, n.2, Aug, p.637-42. 2002.
Chen, F., D. T. Covas e O. Baffa. Dosimetry of blood irradiation using an
alanine/ESR dosimeter. Appl Radiat Isot, v.55, n.1, Jul, p.13-6. 2001.
Cibelli, J. B., S. L. Stice, P. J. Golueke, J. J. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, F. A.
Ponce De Leon e J. M. Robl. Transgenic bovine chimeric offspring produced from
somatic cell-derived stem-like cells. Nat Biotechnol, v.16, n.7, Jul, p.642-6. 1998.
Covas, D. T., R. A. Panepucci, A. M. Fontes, W. A. Silva, Jr., M. D. Orellana, M. C.
Freitas, L. Neder, A. R. Santos, L. C. Peres, M. C. Jamur e M. A. Zago. Multipotent
mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional
properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and
fibroblasts. Exp Hematol, v.36, n.5, May, p.642-54. 2008.
Covas, D. T., C. E. Piccinato, M. D. Orellana, J. L. Siufi, W. A. Silva, Jr., R. ProtoSiqueira, E. G. Rizzatti, L. Neder, A. R. Silva, V. Rocha e M. A. Zago. Mesenchymal
stem cells can be obtained from the human saphena vein. Exp Cell Res, v.309, n.2,
Oct 1, p.340-4. 2005.
Covas, D. T., J. L. Siufi, A. R. Silva e M. D. Orellana. Isolation and culture of
umbilical vein mesenchymal stem cells. Braz J Med Biol Res, v.36, n.9, Sep,
p.1179-83. 2003.
205
Cowan, C. A., I. Klimanskaya, J. Mcmahon, J. Atienza, J. Witmyer, J. P. Zucker, S.
Wang, C. C. Morton, A. P. Mcmahon, D. Powers e D. A. Melton. Derivation of
embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, v.350, n.13, Mar
25, p.1353-6. 2004.
Da Silva Meirelles, L., A. I. Caplan e N. B. Nardi. In Search of the in vivo Identity of
Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, Jun 19. 2008.
Da Silva Meirelles, L., P. C. Chagastelles e N. B. Nardi. Mesenchymal stem cells
reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci, v.119, n.Pt 11, Jun 1,
p.2204-13. 2006.
Di Leva, G., G. A. Calin e C. M. Croce. MicroRNAs: fundamental facts and
involvement in human diseases. Birth Defects Res C Embryo Today, v.78, n.2, Jun,
p.180-9. 2006.
Dohner, H., S. Stilgenbauer, A. Benner, E. Leupolt, A. Krober, L. Bullinger, K.
Dohner, M. Bentz e P. Lichter. Genomic aberrations and survival in chronic
lymphocytic leukemia. N Engl J Med, v.343, n.26, Dec 28, p.1910-6. 2000.
Doneda, L., M. Montillo, L. Intropido, A. Tedeschi, E. Morra e L. Larizza. Interphase
fluorescence in situ hybridization analysis of del(11)(q23) and del(17)(p13) in
chronic lymphocytic leukemia. a study of 40 early-onset patients. Cancer Genet
Cytogenet, v.140, n.1, Jan 1, p.31-6. 2003.
Du, T. e P. D. Zamore. microPrimer: the biogenesis and function of microRNA.
Development, v.132, n.21, Nov, p.4645-52. 2005.
Etzkowitz, H. The triple helix: Academic-industry-government relations Implications for the New York regional innovation environment. Ann Ny Acad Sci.
787: 67-86 p. 1996.
Etzkowitz, H. Tech transfer, incubators probed at Triple Helix III. Res Technol
Manage. 43: 4-5 p. 2000.
Ferreira, C. R., F. V. Meirelles, W. Yamazaki, M. R. Chiaratti, S. C. Meo, F. Perecin,
L. C. Smith e J. M. Garcia. The kinetics of donor cell mtDNA in embryonic and
somatic donor cell-derived bovine embryos. Cloning Stem Cells, v.9, n.4, Winter,
p.618-29. 2007.
Fontes, A. M., B. M. Davis, L. P. Encell, K. Lingas, D. T. Covas, M. A. Zago, L. A.
Loeb, A. E. Pegg e S. L. Gerson. Differential competitive resistance to methylating
versus chloroethylating agents among five O6-alkylguanine DNA alkyltransferases in
human hematopoietic cells. Mol Cancer Ther, v.5, n.1, Jan, p.121-8. 2006.
Frauenschuh, S., E. Reichmann, Y. Ibold, P. M. Goetz, M. Sittinger e J. Ringe. A
microcarrier-based cultivation system for expansion of primary mesenchymal stem
cells. Biotechnol Prog, v.23, n.1, Jan-Feb, p.187-93. 2007.
206
Fu, X., L. Fang, X. Li, B. Cheng e Z. Sheng. Enhanced wound-healing quality with
bone marrow mesenchymal stem cells autografting after skin injury. Wound Repair
Regen, v.14, n.3, May-Jun, p.325-35. 2006.
Gebhardt, C., M. Pohlmann e H. Etzkowitz. Preface: The global paradigm of
networking as an underlying rationality of programming innovation policies. Int J
Technol Manage. 27: 431-439 p. 2004.
Goes, E. G., J. C. Borges, D. T. Covas, M. D. Orellana, P. V. Palma, F. R. Morais e
C. A. Pela. Quality control of blood irradiation: determination T cells
radiosensitivity to cobalt-60 gamma rays. Transfusion, v.46, n.1, Jan, p.34-40.
2006.
Goes, E. G., D. T. Covas, R. Haddad, C. A. Pela, C. E. Formigoni e J. C. Borges.
Quality control system for blood irradiation using a teletherapy unit. Vox Sang,
v.86, n.2, Feb, p.105-10. 2004.
Goes, E. G., M. A. Ottoboni, P. V. Palma, F. R. Morais, C. A. Pela, J. C. Borges e D.
T. Covas. Quality control of blood irradiation with a teletherapy unit: damage to
stored red blood cells after cobalt-60 gamma irradiation. Transfusion, v.48, n.2,
Feb, p.332-40. 2008.
Goodell, M. A., K. Brose, G. Paradis, A. S. Conner e R. C. Mulligan. Isolation and
functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in
vivo. J Exp Med, v.183, n.4, Apr 1, p.1797-806. 1996.
Griffiths-Jones, S., R. J. Grocock, S. Van Dongen, A. Bateman e A. J. Enright.
miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res,
v.34, n.Database issue, Jan 1, p.D140-4. 2006.
Grisendi, S., C. Mecucci, B. Falini e P. P. Pandolfi. Nucleophosmin and cancer. Nat
Rev Cancer, v.6, n.7, Jul, p.493-505. 2006.
Illmensee, K., M. Levanduski e P. M. Zavos. Evaluation of the embryonic
preimplantation potential of human adult somatic cells via an embryo interspecies
bioassay using bovine oocytes. Fertil Steril, v.85 Suppl 1, Apr, p.1248-60. 2006.
Inoue, K., K. Nakada, A. Ogura, K. Isobe, Y. Goto, I. Nonaka e J. I. Hayashi.
Generation of mice with mitochondrial dysfunction by introducing mouse mtDNA
carrying a deletion into zygotes. Nat Genet, v.26, n.2, Oct, p.176-81. 2000.
Ji, J., K. Vijayaragavan, M. Bosse, P. Menendez, K. Weisel e M. Bhatia. OP9 Stroma
Augments Survival of Hematopoietic Precursors and Progenitors During
Hematopoietic Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells, Jul
31. 2008.
Jiang, Y., B. Vaessen, T. Lenvik, M. Blackstad, M. Reyes e C. M. Verfaillie.
Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow,
muscle, and brain. Exp Hematol, v.30, n.8, Aug, p.896-904. 2002.
207
Jin, H. K., J. E. Carter, G. W. Huntley e E. H. Schuchman. Intracerebral
transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient
mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. J
Clin Invest, v.109, n.9, May, p.1183-91. 2002.
Keefer, C. L., R. Keyston, A. Lazaris, B. Bhatia, I. Begin, A. S. Bilodeau, F. J. Zhou,
N. Kafidi, B. Wang, H. Baldassarre e C. N. Karatzas. Production of cloned goats
after nuclear transfer using adult somatic cells. Biol Reprod, v.66, n.1, Jan, p.199203. 2002.
Kerkis, I., A. Kerkis, D. Dozortsev, G. C. Stukart-Parsons, S. M. Gomes Massironi, L.
V. Pereira, A. I. Caplan e H. F. Cerruti. Isolation and characterization of a
population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other
embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs, v.184, n.3-4, p.105-16. 2006.
Kingsbury, M. A., B. Friedman, M. J. Mcconnell, S. K. Rehen, A. H. Yang, D. Kaushal
e J. Chun. Aneuploid neurons are functionally active and integrated into brain
circuitry. Proc Natl Acad Sci U S A, v.102, n.17, Apr 26, p.6143-7. 2005.
Kingsbury, M. A., S. K. Rehen, J. J. Contos, C. M. Higgins e J. Chun. Nonproliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding.
Nat Neurosci, v.6, n.12, Dec, p.1292-9. 2003.
Larghero, J., D. Farge, A. Braccini, S. Lecourt, A. Scherberich, E. Fois, F.
Verrecchia, T. Daikeler, E. Gluckman, A. Tyndall e C. Bocelli-Tyndall. Phenotypical
and functional characteristics of in vitro expanded bone marrow mesenchymal
stem cells from patients with systemic sclerosis. Ann Rheum Dis, v.67, n.4, Apr,
p.443-9. 2008.
Le Blanc, K., F. Frassoni, L. Ball, F. Locatelli, H. Roelofs, I. Lewis, E. Lanino, B.
Sundberg, M. E. Bernardo, M. Remberger, G. Dini, R. M. Egeler, A. Bacigalupo, W.
Fibbe e O. Ringden. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant,
severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet, v.371, n.9624,
May 10, p.1579-86. 2008.
Lee, R. H., M. J. Seo, R. L. Reger, J. L. Spees, A. A. Pulin, S. D. Olson e D. J.
Prockop. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote
repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl
Acad Sci U S A, v.103, n.46, Nov 14, p.17438-43. 2006.
Lillicrap, D., S. C. Nair, A. Srivastava, F. Rodeghiero, I. Pabinger e A. B. Federici.
Laboratory issues in bleeding disorders. Haemophilia, v.12 Suppl 3, Jul, p.68-75.
2006.
Lim, M. J. e X. W. Wang. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect Prev,
v.30, n.6, p.481-90. 2006.
Liu, S. V. iPS cells: a more critical review. Stem Cells Dev, v.17, n.3, Jun, p.391-7.
2008.
208
Malda, J. e C. G. Frondoza. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone.
Trends Biotechnol, v.24, n.7, Jul, p.299-304. 2006.
Marchington, D. R., D. Barlow e J. Poulton. Transmitochondrial mice carrying
resistance to chloramphenicol on mitochondrial DNA: developing the first mouse
model of mitochondrial DNA disease. Nat Med, v.5, n.8, Aug, p.957-60. 1999.
Martin, C. H. e D. S. Kaufman. Synergistic use of adult and embryonic stem cells to
study human hematopoiesis. Curr Opin Biotechnol, v.16, n.5, Oct, p.510-5. 2005.
Martin, C. H., P. S. Woll, Z. Ni, J. C. Zuniga-Pflucker e D. S. Kaufman. Differences
in lymphocyte developmental potential between human embryonic stem cell and
umbilical cord blood-derived hematopoietic progenitor cells. Blood, Jul 11. 2008.
Martin, M. J., A. Muotri, F. H. Gage e A. Varki. Human embryonic stem cells
express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nature Medicine, v.11, n.1, p.228232. 2005.
Mcconnell, M. J., D. Kaushal, A. H. Yang, M. A. Kingsbury, S. K. Rehen, K. Treuner,
R. Helton, E. G. Annas, J. Chun e C. Barlow. Failed clearance of aneuploid
embryonic neural progenitor cells leads to excess aneuploidy in the Atm-deficient
but not the Trp53-deficient adult cerebral cortex. J Neurosci, v.24, n.37, Sep 15,
p.8090-6. 2004.
Meirelles, F. V., V. Bordignon, Y. Watanabe, M. Watanabe, A. Dayan, R. B. Lobo, J.
M. Garcia e L. C. Smith. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a
Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics,
v.158, n.1, May, p.351-6. 2001.
Meirelles, F. V., A. R. Caetano, Y. F. Watanabe, P. Ripamonte, S. F. Carambula, G.
K. Merighe e S. M. Garcia. Genome activation and developmental block in bovine
embryos. Anim Reprod Sci, v.82-83, Jul, p.13-20. 2004.
Meirelles, F. V. e L. C. Smith. Mitochondrial genotype segregation during
preimplantation development in mouse heteroplasmic embryos. Genetics, v.148,
n.2, Feb, p.877-83. 1998.
Meo, S. C., W. Yamazaki, C. R. Ferreira, F. Perecin, N. Z. Saraiva, C. L. Leal e J.
M. Garcia. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using single and combined
strontium, ionomycin and 6-dimethylaminopurine treatments. Zygote, v.15, n.4,
Nov, p.295-306. 2007.
Miglino, M. A., A. L. Franciolli, M. F. De Oliveira, C. E. Ambrosio, M. Bonatelli, M.
R. Machado e A. Mess. Development of the inverted visceral yolk sac in three
species of caviids (rodentia, caviomorpha, caviidae). Placenta, v.29, n.8, Aug,
p.748-52. 2008.
Miglino, M. A., F. T. Pereira, J. A. Visintin, J. M. Garcia, F. V. Meirelles, R. Rumpf,
C. E. Ambrosio, P. C. Papa, T. C. Santos, A. F. Carvalho, R. Leiser e A. M. Carter.
Placentation in cloned cattle: structure and microvascular architecture.
Theriogenology, v.68, n.4, Sep 1, p.604-17. 2007.
209
Miki, T., T. Lehmann, H. Cai, D. B. Stolz e S. C. Strom. Stem cell characteristics of
amniotic epithelial cells. Stem Cells, v.23, n.10, Nov-Dec, p.1549-59. 2005.
Mizuno, Y., K. Yagi, Y. Tokuzawa, Y. Kanesaki-Yatsuka, T. Suda, T. Katagiri, T.
Fukuda, M. Maruyama, A. Okuda, T. Amemiya, Y. Kondoh, H. Tashiro e Y. Okazaki.
miR-125b inhibits osteoblastic differentiation by down-regulation of cell
proliferation. Biochem Biophys Res Commun, v.368, n.2, Apr 4, p.267-72. 2008.
Muraro, P. A. e D. C. Douek. Renewing the T cell repertoire to arrest autoimmune
aggression. Trends Immunol, v.27, n.2, Feb, p.61-7. 2006.
Muraro, P. A., D. C. Douek, A. Packer, K. Chung, F. J. Guenaga, R. Cassiani-Ingoni,
C. Campbell, S. Memon, J. W. Nagle, F. T. Hakim, R. E. Gress, H. F. Mcfarland, R.
K. Burt e R. Martin. Thymic output generates a new and diverse TCR repertoire
after autologous stem cell transplantation in multiple sclerosis patients. J Exp Med,
v.201, n.5, Mar 7, p.805-16. 2005.
Nauta, A. J. e W. E. Fibbe. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal
cells. Blood, v.110, n.10, Nov 15, p.3499-506. 2007.
Ohgaki, H. e P. Kleihues. Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma.
Am J Pathol, v.170, n.5, May, p.1445-53. 2007.
Panepucci, R. A., R. T. Calado, V. Rocha, R. Proto-Siqueira, W. A. Silva, Jr. e M. A.
Zago. Higher expression of transcription targets and components of the nuclear
factor-kappaB pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood CD34+
precursors. Stem Cells, v.25, n.1, Jan, p.189-96. 2007.
Panepucci, R. A., J. L. Siufi, W. A. Silva, Jr., R. Proto-Siquiera, L. Neder, M.
Orellana, V. Rocha, D. T. Covas e M. A. Zago. Comparison of gene expression of
umbilical cord vein and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells,
v.22, n.7, p.1263-78. 2004.
Paneto, J. C., J. B. Ferraz, J. C. Balieiro, J. F. Bittar, M. B. Ferreira, M. B. Leite,
G. K. Merighe e F. V. Meirelles. Bos indicus or Bos taurus mitochondrial DNA comparison of productive and reproductive breeding values in a Guzerat dairy
herd. Genet Mol Res, v.7, n.3, p.592-602. 2008.
Parolini, O., F. Alviano, G. P. Bagnara, G. Bilic, H. J. Buhring, M. Evangelista, S.
Hennerbichler, B. Liu, M. Magatti, N. Mao, T. Miki, F. Marongiu, H. Nakajima, T.
Nikaido, C. B. Portmann-Lanz, V. Sankar, M. Soncini, G. Stadler, D. Surbek, T. A.
Takahashi, H. Redl, N. Sakuragawa, S. Wolbank, S. Zeisberger, A. Zisch e S. C.
Strom. Concise review: isolation and characterization of cells from human term
placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem
Cells. Stem Cells, v.26, n.2, Feb, p.300-11. 2008.
Penteado, F. C., L. Medeiros, M. D. Orellana, P. Palma, A. M. Fontes, O. M.
Takayanagui e D. T. Covas. [Cloning and transmembrane glycoprotein expression of
the retrovirus HTLV-1 in mammals' cells]. Rev Soc Bras Med Trop, v.39, n.2, MarApr, p.169-73. 2006.
210
Pereira, S. R., V. M. Faca, G. G. Gomes, R. Chammas, A. M. Fontes, D. T. Covas e
L. J. Greene. Changes in the proteomic profile during differentiation and
maturation of human monocyte-derived dendritic cells stimulated with granulocyte
macrophage colony stimulating factor/interleukin-4 and lipopolysaccharide.
Proteomics, v.5, n.5, Apr, p.1186-98. 2005.
Picanco, V., S. Heinz, D. Bott, M. Behrmann, D. T. Covas, E. Seifried e T. Tonn.
Recombinant expression of coagulation factor VIII in hepatic and non-hepatic cell
lines stably transduced with third generation lentiviral vectors comprising the
minimal factor VIII promoter. Cytotherapy, v.9, n.8, p.785-94. 2007.
Picanco-Castro, V., A. M. Fontes, S. Heinz, T. Tonn e D. T. Covas. The chimeric
cytokine Hyper-IL-6 enhances the efficiency of lentiviral gene transfer in
hepatocytes both in vitro and in vivo. Biotechnol Lett, v.30, n.2, Feb, p.215-20.
2008.
Picanco-Castro, V., E. M. Russo-Carbolante, A. M. Fontes, A. C. Fernandes e D. T.
Covas. An enhancer/promoter combination strengthens the expression of bloodcoagulation factor VIII in non-viral expression vectors. Genet Mol Res, v.7, n.2,
p.314-25. 2008.
Rasulov, M. F., V. T. Vasilenko, V. A. Zaidenov e N. A. Onishchenko. Cell
transplantation inhibits inflammatory reaction and stimulates repair processes in
burn wound. Bull Exp Biol Med, v.142, n.1, Jul, p.112-5. 2006.
Rehen, S. K., M. A. Kingsbury, B. S. Almeida, D. R. Herr, S. Peterson e J. Chun. A
new method of embryonic culture for assessing global changes in brain
organization. J Neurosci Methods, v.158, n.1, Nov 15, p.100-8. 2006.
Rehen, S. K., M. A. Kingsbury, A. H. Yang, D. Kaushal, M. J. Mcconnell e J. Chun.
Increased genetic mosaicism in the brain following irradiation. Soc Neurosci Abstr,
p.submitted. 2002.
Rehen, S. K., M. J. Mcconnell, D. Kaushal, M. A. Kingsbury, A. H. Yang e J. Chun.
Chromosomal variation in neurons of the developing and adult mammalian nervous
system. Proc Natl Acad Sci U S A, v.98, n.23, p.13361-6. 2001.
Rehen, S. K., D. D. Neves, L. Fragel-Madeira, L. R. Britto e R. Linden. Selective
sensitivity of early postmitotic retinal cells to apoptosis induced by inhibition of
protein synthesis. Eur J Neurosci, v.11, n.12, p.4349-56. 1999.
Rehen, S. K., M. H. Varella, F. G. Freitas, M. O. Moraes e R. Linden. Contrasting
effects of protein synthesis inhibition and of cyclic AMP on apoptosis in the
developing retina. Development, v.122, n.5, p.1439-48. 1996.
Rehen, S. K., Y. C. Yung, M. P. Mccreight, D. Kaushal, A. H. Yang, B. S. Almeida, M.
A. Kingsbury, K. M. Cabral, M. J. Mcconnell, B. Anliker, M. Fontanoz e J. Chun.
Constitutional aneuploidy in the normal human brain. J Neurosci, v.25, n.9, Mar 2,
p.2176-80. 2005.
211
Riess, P., C. Zhang, K. E. Saatman, H. L. Laurer, L. G. Longhi, R. Raghupathi, P. M.
Lenzlinger, J. Lifshitz, J. Boockvar, E. Neugebauer, E. Y. Snyder e T. K. Mcintosh.
Transplanted neural stem cells survive, differentiate, and improve neurological
motor function after experimental traumatic brain injury. Neurosurgery, v.51, n.4,
Oct, p.1043-52; discussion 1052-4. 2002.
Ripamonte, P., G. K. Merighe, Y. F. Watanabe, A. R. Caetano e F. V. Meirelles.
Development and optimization of a fluorescent differential display PCR system for
studying bovine embryo development in vitro. Genet Mol Res, v.4, n.4, p.726-33.
2005.
Rombouts, W. J. e R. E. Ploemacher. Primary murine MSC show highly efficient
homing to the bone marrow but lose homing ability following culture. Leukemia,
v.17, n.1, Jan, p.160-70. 2003.
Russo-Carbolante, E. M., F. C. Penteado, L. Medeiros, S. Kashima, O. M.
Takayanagui e D. T. Covas. [Cloning and expression of the transmembranic
glycoprotein from human T cell lymphotropic virus in a prokaryotic system]. Rev
Soc Bras Med Trop, v.40, n.3, May-Jun, p.277-81. 2007.
Salatino, M., D. O. Croci, G. A. Bianco, J. M. Ilarregui, M. A. Toscano e G. A.
Rabinovich. Galectin-1 as a potential therapeutic target in autoimmune disorders
and cancer. Expert Opin Biol Ther, v.8, n.1, Jan, p.45-57. 2008.
Sandsmark, D. K., H. Zhang, B. Hegedus, C. L. Pelletier, J. D. Weber e D. H.
Gutmann. Nucleophosmin mediates mammalian target of rapamycin-dependent
actin cytoskeleton dynamics and proliferation in neurofibromin-deficient
astrocytes. Cancer Res, v.67, n.10, May 15, p.4790-9. 2007.
Sasaki, M., R. Abe, Y. Fujita, S. Ando, D. Inokuma e H. Shimizu. Mesenchymal stem
cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by
transdifferentiation into multiple skin cell type. J Immunol, v.180, n.4, Feb 15,
p.2581-7. 2008.
Schop, D., F. W. Janssen, E. Borgart, J. D. De Bruijn e R. Van Dijkhuizen-Radersma.
Expansion of mesenchymal stem cells using a microcarrier-based cultivation
system: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen Med, v.2, n.2-3, Mar-Apr,
p.126-35. 2008.
Shay, J. W., M. R. Gershenbaum e K. R. Porter. Enucleation of CHO cells by means
of cytochalasin B and centrifugation: the topography of enucleation. Exp Cell Res,
v.94, n.1, Aug, p.47-55. 1975.
Shojaei, F. e P. Menendez. Molecular profiling of candidate human hematopoietic
stem cells derived from human embryonic stem cells. Exp Hematol, Aug 9. 2008.
Silva, W. A., Jr., D. T. Covas, R. A. Panepucci, R. Proto-Siqueira, J. L. Siufi, D. L.
Zanette, A. R. Santos e M. A. Zago. The profile of gene expression of human
marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells, v.21, n.6, p.661-9. 2003.
212
Sospedra, M. e R. Martin. Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev Immunol,
v.23, p.683-747. 2005.
Sukoyan, M. A., A. Y. Kerkis, M. R. Mello, I. E. Kerkis, J. A. Visintin e L. V. Pereira.
Establishment of new murine embryonic stem cell lines for the generation of mouse
models of human genetic diseases. Braz J Med Biol Res, v.35, n.5, May, p.535-42.
2002.
Sun, L. Y., H. Y. Zhang, X. B. Feng, Y. Y. Hou, L. W. Lu e L. M. Fan. Abnormality of
bone marrow-derived mesenchymal stem cells in patients with systemic lupus
erythematosus. Lupus, v.16, n.2, p.121-8. 2007.
Sykes, M. e B. Nikolic. Treatment of severe autoimmune disease by stem-cell
transplantation. Nature, v.435, n.7042, Jun 2, p.620-7. 2005.
Takagi, Y., J. Takahashi, H. Saiki, A. Morizane, T. Hayashi, Y. Kishi, H. Fukuda, Y.
Okamoto, M. Koyanagi, M. Ideguchi, H. Hayashi, T. Imazato, H. Kawasaki, H.
Suemori, S. Omachi, H. Iida, N. Itoh, N. Nakatsuji, Y. Sasai e N. Hashimoto.
Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a
Parkinson primate model. J Clin Invest, v.115, n.1, Jan, p.102-9. 2005.
Takahashi, K. e S. Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, v.126, n.4, Aug
25, p.663-76. 2006.
Thomson, H. Bioprocessing of embryonic stem cells for drug discovery. Trends
Biotechnol, v.25, n.5, May, p.224-30. 2007.
Toda, A., M. Okabe, T. Yoshida e T. Nikaido. The potential of amniotic
membrane/amnion-derived cells for regeneration of various tissues. J Pharmacol
Sci, v.105, n.3, Nov, p.215-28. 2007.
Tyybakinoja, A., J. Vilpo e S. Knuutila. High-resolution oligonucleotide array-CGH
pinpoints genes involved in cryptic losses in chronic lymphocytic leukemia.
Cytogenet Genome Res, v.118, n.1, p.8-12. 2007.
Uccelli, A., L. Moretta e V. Pistoia. Mesenchymal stem cells in health and disease.
Nat Rev Immunol, Aug 18. 2008.
Voltarelli, J. C., C. E. Couri, A. B. Stracieri, M. C. Oliveira, D. A. Moraes, F.
Pieroni, M. Coutinho, K. C. Malmegrim, M. C. Foss-Freitas, B. P. Simoes, M. C. Foss,
E. Squiers e R. K. Burt. Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell
transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes mellitus. JAMA, v.297, n.14,
Apr 11, p.1568-76. 2007.
Voltarelli, J. C. e J. Ouyang. Hematopoietic stem cell transplantation for
autoimmune diseases in developing countries: current status and future
prospectives. Bone Marrow Transplant, v.32 Suppl 1, Aug, p.S69-71. 2003.
Vrana, K. E., J. D. Hipp, A. M. Goss, B. A. Mccool, D. R. Riddle, S. J. Walker, P. J.
Wettstein, L. P. Studer, V. Tabar, K. Cunniff, K. Chapman, L. Vilner, M. D. West, K.
213
A. Grant e J. B. Cibelli. Nonhuman primate parthenogenetic stem cells. Proc Natl
Acad Sci U S A, v.100 Suppl 1, Sep 30, p.11911-6. 2003.
Wienholds, E. e R. H. Plasterk. MicroRNA function in animal development. FEBS
Lett, v.579, n.26, Oct 31, p.5911-22. 2005.
Wilmut, I., A. E. Schnieke, J. Mcwhir, A. J. Kind e K. H. Campbell. Viable offspring
derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, v.385, n.6619, Feb 27,
p.810-3. 1997.
214

Clique aqui para acessar o programa completo em PDF

Transcrição

Documentos relacionados

Ana Helena Guerreiro Sonoda

File - Laboratório Nacional de Células

direito à esperança de cura e vida

1 Tradução dos textos

Pedido Cliente

Universidade Federal de Ouro Preto

Indicação dos membros do Comitê que integrarão a

Acesse o Site do Fórum Social de Ribeirão Preto e conheça as

shirley alves fernandes - inspetor de alunos

Mayana Zatz

The potential of mesenchymal stromal cells as a novel