(Rattus novergicus) E ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA DO

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL
Área de Fisiologia e Farmacologia
ACOMPANHAMENTO DOS PARÂMETROS FISIOLÓGICOS E SANITÁRIOS
DE RATOS (Rattus novergicus) E ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA DO
BIOTÉRIO DO DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL
DA UFRPE
Pesquisador:
Prof. Dr. Anísio Francisco Soares – Prof. Adjunto III - CPF: 558.853.814-53
Laboratório de Fisiologia Animal - DMFA/UFRPE (Biólogo)
Contato: [email protected] / [email protected]
Telefone: (81)33206394-6391 – 99556913
Colaborador:
1) Jaqueline Bianque de Oliveira – Profª Adjunto III – CPF: 801.493.914-04
Laboratório de Parasitologia – Dep. de Biologia/UFRPE (Méd. Veterinária)
2) Maria Raquel Querino de Sousa – Profª Associada II - CPF: 578.224.334-15
Laboratório de Fisiologia Animal - DMFA/UFRPE (Méd. Veterinária)
3) Filipe Guilherme Ramos Costa Neves - CPF: 090.239.394-41
Discente do curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
Recife / março – 2012
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Objetivos
1.1 Gerais
Padronizar as condições de sanidade de ratos Wistar albinos (Rattus
novergicus albinus) criados no Biotério de criação e experimentação do
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE, visando à obtenção e
manutenção de animais em condições que atendam aos padrões necessários à
sua utilização na pesquisa científica.
1.2 Específicos
1.2.1 Nos animais serão necessários:
Avaliar parâmetros hematológicos;
Realizar análise parasitológica;
Vermifugar periodicamente os animais;
Acompanhar as condições clínicas;
1.2.2 No ambiente do biotério:
Desenvolver um mapa de risco das instalações;
Implantar um sistema de controle de temperatura e luminosidade.
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Introdução (estado da arte)
A ciência visa o conhecimento do mundo em que se vive, seu objetivo é
buscar as verdades universais, que existem independentemente daquilo que é
percebido pelos nossos sentidos (Platão–429-327 a.C.), a fim de que haja uma
melhor qualidade de vida dos seres vivos na terra. Para que haja uma evolução
contínua das áreas de conhecimento humano, como a medicina e a biologia, a
experimentação torna-se imprescindível (CLARK. K., 1977).
Há muito tempo, desde a antiguidade, os animais são utilizados na
experimentação. Na pré-história o homem já os observava, pois compreendia o
coração como um órgão vital, como nas pinturas rupestres da caverna de Niaux,
no sul da França, que contêm pinturas de bisão com flechas fincadas em seu
coração. A partir do século V a.C., os animais passaram a ser utilizados nos
intuitos da ciência. Pode-se citar Hipócrates (460–370 a.C.) que já relacionava
alguns órgãos humanos com os de animais, fazendo uso da observação clínica;
Alcmêon (500 a.C.) da colônia grega de Croton, através da dissecção de animais,
fazia suas anotações. Logo, os animais tornaram-se os melhores modelos para se
fazerem investigações anatômicas (PAIXÃO, 2001). Em 400 a.C. vários estudos
são apresentados, baseados em animais; o uso destes foi fundamental para que
Aristóteles fizesse comparações anatômicas em mais de 50 espécies diferentes, e
portanto surgisse a anatomia comparada; o grande filósofo deixa a ideia de que
tudo que há na face da terra é para servir aos seres dotados de razão; sendo
assim, as plantas serviriam aos animais, e estes aos seres humanos. No século III
a.C., na Escola de Alexandria, Herófilo, foi o primeiro a dissecar animais em
público; já Erasístrato realizava experimentos com animais vivos, em que fez o
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corte em uma artéria, elucidando que esta não era preenchida por ar e sim por
sangue, quebrando assim paradigmas da ciência preexistente (PAIXÃO, 2001).
Como se vê, os animais já eram utilizados há muito tempo, cujo principal objetivo
seria o de adquirir conhecimento. É perceptível que a medicina surgiu dessas
observações e experimentações feitas nos bichos. Galeno, considerado “o
príncipe dos médicos”, realizava, no século II d.C., demonstrações com animais
vivos e em público. Após sua morte, as experimentações com animais só voltam a
ser descritas no século XV, no qual Versalius (1514 - 1564) publica um livro: “De
fabricas Corporis Humani”, onde contém um capítulo tratando dos métodos de
experimentação sobre a fisiologia dos animais. Nessa mesma época, podemos
citar outros nomes que conduziram experimentos nos animais, como: William
Harvey (1578 - 1657), Francis Bacon (1561-1626), René Descartes (1596-1650),
Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) e Stephen Hales (1677-1761) (Paixão,
2001). William Harvey, em 1638, analisou a fisiologia da circulação em oitenta
espécies diferentes; talvez, essa tenha sido a primeira pesquisa a fazer uso dos
animais sistematicamente (RAYMUNDO & GOLDIM, 2007). Charles Darwin,
quando, em 1859, publica seu livro: “A Origem das Espécies”, estabelece os
pressupostos do vínculo existente entre as diferentes espécies animais num único
processo evolutivo, logo a teoria de Darwin possibilitou a extrapolação dos dados
obtidos em animais para seres humanos (GOLDIM, 1997). Não obstante, no
presente século, a experimentação animal irá contribuir para o avanço da
medicina humana e veterinária.
Desde o início da utilização de roedores na pesquisa, em 1880, grande
importância foi dada ao padrão microbiológico dos murideos. Naquela época, a
grande mortalidade dos animais era considerada como parte do trabalho. Logo,
foram desenvolvidas melhorias nas instalações para animais, em áreas como
sanitização, nutrição e controle ambiental. Em 1960, para diminuir a incidência de
patógenos, foi utilizada a cesárea asséptica a fim de evitar a contaminação dos
filhotes pela mãe. Em 1985, época que ficou conhecida como a época da
“erradicação de viroses murinas”, marcou a redução de viroses em roedores, a
partir de testes sorológicos e posterior eliminação dos animais que ainda
permaneciam contaminados (MAJEROWICZ, 2008). O combate a patógenos
deve ser intenso nas instalações que abrigam os reagentes biológicos da
experimentação, já que infecções nos animais interferem, significativamente, nas
pesquisas.
Segundo o Ministério da saúde, no Brasil, Biossegurança é definida como a
“condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a
prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam
comprometer a saúde humana, animal e vegetal, tendo como base, o respeito à
vida, os valores éticos e a responsabilidade social; e como objetivos a proteção
do indivíduo, da sociedade e do meio ambiente” (SILVA, 2010).
Os biotérios são as “instalações capazes de produzir e manter espécies
animais destinadas a servir como elementos biológicos, para atender às
necessidades dos programas de pesquisa, ensino, produção e controle de
qualidade nas áreas biomédicas e tecnológicas segundo a finalidade da
instituição” (MAJEROWICZ, 2008). Essas instalações precisam ser capazes de
manter uma boa saúde tanto para os animais quanto para os técnicos e
pesquisadores; além de promover a segurança no laboratório.
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Dependendo da finalidade, os biotérios são classificados em três tipos:
criação, reprodução e experimentação. Os de criação produzem e mantêm as
matrizes das linhagens, com controle rigoroso da saúde dos animais e
manutenção das características genéticas. Os biotérios de produção criam
grandes quantidades de animais, provenientes dos biotérios de criação, para
atender às pesquisas. Já os biotérios de experimentação recebem animais
daqueles de produção para o uso nas pesquisas (POLITI et al, 2008).
Para que o exercício da profissão dos pesquisadores seja realizado com
respeito, honestidade e decência, foi necessário legalizar a experimentação
animal, já que vários grupos de defesa dos animais surgiram no século XIX, como
a Society for the Preservation of Cruelty to Animals, na Inglaterra e a Sociedade
para a Proteção dos Animais, na França. Por volta de 1860, o fisiologista Claude
Bernard utilizou o cachorro de sua própria filha para dar aulas aos seus alunos;
contraposta a isso sua esposa fundou a primeira associação que defendia os
direitos dos animais de laboratório. Em 1876, no Reino Unido, foi criada a primeira
lei que regulamenta o uso de animais em pesquisa, respaldando a todos os
bichos. Visando esse alto crescimento de ideias relativas à proteção dos animais,
em 1975, o zoologista William M.S. Russell e o microbiologista Rex L. Burch
estabelecem o princípio dos 3 R’s, objetivando o uso adequado dos animais nas
pesquisas, ou seja, a humanização destes (GOLDIM Y RAYMUNDO, 1997).
No Brasil, o Decreto Federal nº 24645, de 1934, estabelecia penas para atos
cruéis com os animais; foi a primeira manifestação legal, nacionalmente, sobre o
bem estar dos animais (POLITI et al, 2008). Com o crescimento do movimento
das sociedades protetoras dos animais, houve clima de boicote à experimentação
animal por parte desses grupos; assim, a Sociedade Brasileira de Animais de
Laboratório (antigo COBEA) postula os 12 artigos sobre os Princípios Éticos na
Experimentação Animal, visando à proteção dos profissionais e a utilização de
métodos adequados na experimentação. Em 1995, o sanitarista e deputado
federal Sérgio Arouca, propôs a lei nº 11794; aprovada, em 2008, no governo do
presidente Luiz Inácio Lula da Silva, que a sancionou. Essa lei regulamenta a
utilização dos animais no ensino e na pesquisa científica em todo o território
nacional (SILVA, 2010). A lei Arouca, como ficou conhecida, estabelece, também,
a criação do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea),
e a implantação, nas intituições filiadas ao Concea, das Comissões de Ética no
Uso dos Animais (CEUA) (POLITI et al, 2008). Cabe ao Concea, credenciar e
licenciar a atividade das CEUAs, que devem cumprir o que está previsto na lei nº
11794; como por exemplo, examinar os protocolos experimentais dos
pesquisadores e docentes, além de manter o cadastro destes e de seus
protocolos. Cumpre às comissões de ética, examinar os procedimentos dos
docentes e pesquisadores quanto aos tratos com os animais na pesquisa e no
ensino.
A Universidade Federal Rural de Pernambuco instituiu sua comissão de
ética no uso de animais - CEUA em setembro de 2007, porém já existiam
comissões de ética no uso de animais em departamentos como o de Morfologia e
Fisiologia Animal – DMFA/UFRPE e Medicina Veterinária – DMV/UFRPE; Isso
demonstra a preocupação da universidade em regulamentar o uso de animais em
suas atividades didáticas e de pesquisas.
5
O Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal mantém, desde o início
da década de noventa, um biotério de criação e experimentação, que foi criado
devido a demanda dos professores para realização das aulas práticas para os
cursos de Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas, Medicina
Veterinária e Zootecnia e ultimamente Educação Física. Posteriormente com a
capacitação dos docentes nos mestrados, doutorados e pós-doutorado, além da
incorporação de novos professores, a demanda aumentou ainda mais, tornando o
biotério um elemento essencial para a produção científica dos docentes que
fazem o DMFA. Nos últimos anos o DMFA aprova na Capes 2 programas de pósgraduação, o Biociência Animal e Ciência Animal Tropical, ambos com mestrado
e doutorado e conceito 4. Em 2004 foi aprovado no Edital FINEP, reforma
estrutural do biotério no valor de R$ (70.000,00) setenta mil reais pela
FINEP/2004, o que permitiu manter o biotério cadastrado na rede nacional de
biotérios. Em 2010 a FINEP aprova proposta institucional da UFRPE para
construção das instalações de um biotério central no valor de R$ (900.000,00)
novecentos mil reais. No biotério de criação e experimentação animal, do
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal são criados ratos Wistar albinos
(Rattus novergicus) convencionais, mantidos sob características ambientais
viáveis à espécie, nele existe uma recepção, uma sala de criação e outra de
experimentação além de área de limpeza e manutenção.
É sabido que a criação e experimentação de animais, que não têm
padronização, acarretam danos tanto para os técnicos e pesquisadores, quanto
para as pesquisas, dificultando a reprodutibilidade dos resultados, item tão
importante na estatística e publicação dos mesmos (MOLINARO, 2008). Neste
sentido foi desenvolvido o conceito de Boas Práticas de Laboratório, nos Estados
Unidos, nos anos de 1970; Joel Majerowicz (MAJEROWICZ, 2008), em seu livro
Boas Práticas de Biotérios e Biossegurança, dedica um capítulo para abordar
procedimentos operacionais padrão em biotérios.
Baseado no exposto anteriormente é que justificamos a necessidade de
realização deste projeto, que visa à melhoria da sanidade e de padrões
fisiológicos dos animais criados no biotério de criação e experimentação do
DMFA/UFRPE; bem como a elaboração de um mapa de riscos, essencial para a
biossegurança no biotério, que ocasionará a padronização dos procedimentos
realizados.
3
Metodologia
3.2 Local do experimento
Este projeto será realizado no biotério de criação e experimentação e no
laboratório de fisiologia animal do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal
– DMFA/UFRPE e no Laboratório de Parasitologia do Departamento de
Biologia/UFRPE, para tanto o protocolo experimental foi submetido a Comissão
de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFRPE, sob número 23082.006276/2012-86
em 09/04/2012.
3.3 Animais
Será utilizado todo o plantel do Biotério de Criação e Experimentação do
DMFA/UFRPE, por se tratar de um projeto que visa a padronização do mesmo
que atualmente conta com 500 animais.
6
3.4 Análise parasitológica dos animais
Para a realização desta etapa serão seguidos protocolos já consolidados
na literatura, preconizados por (Willis, 1921 e Graham, 1941) com modificações.
A coleta das fezes será feita em três dias alternados com diferença de
dois dias e com os animais em jejum de 12 horas;
As amostras fecais serão processadas através da técnica de
concentração por sedimentação, depois de confeccionadas três lâminas
coradas com lugol para cada animal;
A observação das lâminas será feita em microscópio óptico, a fim de
com a identificação seja possível analisar qualitativamente os helmintos
e protozoários.
3.5 Análise hematológica
3.5.1 Coleta de sangue
Será realizada através da punção da veia caudal lateral com uso de cateter
(24G). O sangue será acondicionado em tubo com anticoagulante (heparina
sódica), homogeneizado e mantido à temperatura ambiente.
3.5.2 Obtenção do plasma
O sangue será centrifugado a uma velocidade de 3000rpm por 10 minutos,
em seguida acondicionado a -20oC até a realização da análise.
3.5.3 Contagem dos eritrócitos e leucócitos
Alíquotas do sangue total em tubos heparinizados serão utilizadas; para
eritrócitos será realizada um diluição de 1:400 em solução de Hayen e contados
em câmara de Neubauer; para os leucócitos a amostra de sangue será diluída em
solução de Turk na proporção de 1:20, em seguida será realizada a contagem em
câmara de Neubauer.
3.5.4 Morfometria das hemácias
Para morfometria das hemácias serão utilizadas lâminas
mensuradas 100 células por lâmina por meio de régua milimetrada.
sendo
3.5.5 Contagem diferencial dos leucócitos
Serão utilizados estiraços sanguíneos em lâminas, coradas pelo método de
coloração rápida e contados 100 leucócitos em cada.
3.5.6 Verificação da presença de hematoparasitos
Serão realizadas observações em lâminas com estiraço sanguíneo, fixadas
e coradas com May-Grunwald-Giemsa.
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3.6 Melhoria da sanidade dos animais
O plantel será submetido a um programa de vermifugação trimestral, sendo
a primeira antes do exame parasitológico, dentro das peculiaridades e
especificidades dos diversos grupos de pesquisas presentes no local durante o
desenvolvimento deste projeto. Antes e após a vermifugação, os animais serão
analisados quanto às características da pelagem, consumo de alimento/24 horas,
características das fezes, e comportamental. No biotério será implantado um
equipamento de controle dos ciclos claro/escuro de 12 horas, contribuindo com o
fotoperíodo dos animais.
3.7 Elaboração de um mapa de risco
A partir da planta do biotério e dos procedimentos operacionais realizados,
os riscos serão classificados de acordo com a classificação dos riscos ambientais.
A identificação e gravidade dos riscos serão feitas de acordo com a
identificação dos materiais, equipamentos, instalações, ritmo de trabalho, dentre
outros.
Para a identificação dos procedimentos será adquirida informações sobre:
Número de trabalhadores e seu expediente;
Instrumentos e materiais de trabalho;
Atividades exercidas;
O ambiente.
Após a classificação, será comprovada a eficácia de medidas preventivas
existentes no biotério para um posterior aperfeiçoamento. Como exemplo, as
medidas serão:
Medidas de proteção coletiva;
Medidas de organização do trabalho;
Medidas de proteção individual;
Medidas de higiene e conforto.
Por fim, será elaborado o mapa de riscos do biotério de criação e
experimentação animal do DMFA/UFRPE, de acordo com a classificação de
riscos ambientais que será fixado em locais apropriados para a visualização dos
usuários destas instalações.
4
Metas e fases do desenvolvimento do projeto com cronograma
4.1 Metas
No biotério do DMFA/UFRPE:
Caracterização do perfil parasitológico e hematológico em ratos
Wistar albinos(Rattus novergicus albinus);
Melhoria na sanidade dos animais;
Melhoria quanto à biossegurança de técnicos e pesquisadores.
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4.2 Cronograma
ATIVIDADES
2012
2013
A S O N D J F M A M J J
Revisão e atualização bibliográfica
Conscientização dos usuários e autorização
para incluir seus animais na pesquisa
Coleta e processamento das amostras fecais
para exame parasitológico
Análise dos dados e tratamento estatístico do
exame parasitológico
Vermifugação do plantel
Implantação do sistema de controle do
fotoperíodo
Coleta de sangue para análise hematológica e
de hematoparasitas
Vermifugação do plantel
Identificação dos procedimentos operacionais
e validação das medidas preventivas
Elaboração e implantação do mapa de riscos
do ambiente
Análise qualitativa da implantação de uma
mapa de riscos no biotério
Vermifugação do plantel
Redação do relatório parcial
ATIVIDADES
Revisão e atualização bibliográfica
Coleta e processamento das amostras fecais
para exame parasitológico
Análise dos dados e tratamento estatístico do
exame parasitológico
Vermifugação do plantel
Coleta de sangue para análise hematológica e
de hematoparasitas
Vermifugação do plantel
Redação do relatório parcial
Redação do relatório final e publicação
2013
2014
A S O N D J F M A M J J
9
5
Relevância e impacto do projeto no desenvolvimento científico e
tecnológico de Pernambuco
O projeto permitirá o treinamento de recursos humanos, respaldados na
prática, em nível de graduação, mestrado e doutorado; disponibilizando, no
mundo do trabalho, profissionais mais qualificados. O presente trabalho definirá
um melhor padrão de qualidade nos animais oriundos do biotério do
DMFA/UFRPE, visando garantir a confiabilidade dos resultados das pesquisas
cujos conhecimentos adquiridos serão validados e publicados em periódicos de
renome Nacional e Internacional.
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Possível contribuição ao desenvolvimento econômico e social de
Pernambuco
O uso de animais, com padrão de qualidade comprovadamente
reconhecida, proporcionará seu uso em testes de toxicidade e fabricação de
vacinas eficazes na elucidação e tratamento de doenças, respectivamente; dando
margem à cura e/ou controle de epidemias no País, e em particular no Estado de
Pernambuco.
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Descrição de apoio financeiro e/ou institucional que assegure a
viabilidade de execução do projeto
Nas dependências do DMFA/UFRPE está localizado o biotério, onde abriga
os ratos que serão utilizados nesse projeto, e apresenta uma recepção, uma sala
de criação e outra de experimentação. O departamento possui ainda o laboratório
de Fisiologia Animal, que possui os equipamentos que serão utilizados no
protocolo experimental aqui proposto, como: centrífuga refrigerada, centrífuga de
bancada, centrífuga para micro-hematócrito, câmara de fluxo laminar, capela de
exaustão, destilador de água, agitador magnético e placa de agitação.
8
Bibliografia
1.
Cardoso, C. V. P.; Leis referentes à experimentação Animal no Brasil –
Situação Atual [Disponível em www.cobea.org.br, acesso em 28/03/2012]
2.
Clarck, S. R. L., 1997. Animals and their Moral Standing. London:
Routledge.
3.
Goldim J. R., Raymundo M. M.; Pesquisa em Saúde e os Direitos dos
Animais; 2 ed., Porto Alegre: HCPA, 1997.
4.
GRAHAM, C.F. A device for the diagnosis of Enterobius infection; Am.
J. Trop. Med., v.21, p.159-161, 1941.
5.
Majerowicz, J.; Boas práticas em biotérios e biossegurança; Rio de
Janeiro: Interciência. 2008
10
6.
Molinaro, E. M.; Majerowicz, J.; Valle S.; Biossegurança em Biotérios;
Rio de Janeiro: Interciência. 2008
7.
Paixão, R. L.; Schramm, F. R. ; Experimentação Animal: Razões e
emoções para uma ética; Rio de Janeiro. 2001
8.
Politi, F. A. S.; Pietro, R. C. L. R.; Salgado, H.R.N.; Caracterização de
biotérios, legislação e padrões de biossegurança; revista de ciências
farmacêuticas básica e aplicada; v. 29, n.1, p. 17-2. 2008
9.
Raymundo, M. M.; Goldim, J. R.; O uso de animais em pesquisas
científicas; UFRGS. 2007
10.
Scaini, C. J. ; Teixeira, M. F.; Traversi, M. do C.; Rheingantz, M. G. T.;
Signorini, V. M.; Helmintos de Ratos Wistar de Diferentes Faixas Etárias
Criados em Biotério Convencional; Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, n.3, p.265268, jul./set., 2003
11.
Silva, N. E. R. e; Importância do Ensino da Disciplina de Bioterismo e
Biossegurança nos Cursos de Licenciatura e Bacharelado em Ciências
Biológicas: Indicadores Relevantes; Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Recife. 2010
12.
WILLIS , H.H.; A simple levitation method for the detectation of
hookworm ova; Med. J. Aust., v.2, p.375-376, 1921.
13.
Zanetti, C. R.; A História da Experimentação Animal; Universidade
Federal de Santa Catarina [Disponível em: http://www.lia.ufsc.br/Etica_Animais,
acesso em 28/03/2012]
14.
http://cienciaecultura.bvs.br/pdf/cic/v61n1/a04v61n1.pdf
29/03/2012
15.
www.mct.gov.br/index.php/content/view/311266.html
29/03/2012
acesso
acesso
em
em
16.
http://www1.pucminas.br/imagedb/documento/DOC_DSC_NOME_ARQUI2
0081104143622.pdf acesso em 05/04/2012
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Prof. Dr. Anísio Francisco Soares