- Mestrado em Horticultura Irrigada

UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA – UNEB
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO – PPG
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS SOCIAIS – DTCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ACADÊMICO EM HORTICULTURA IRRIGADA –
PPHI.
LAURO GONZAGA DA SILVA
SIMBIOSE MICORRÍZICA ARBUSCULAR NA MAXIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE
METABÓLITOS FOLIARES COM PROPRIEDADES MEDICINAIS EM MUDAS DE
ROMÃZEIRA (Punica granatum L.)
JUAZEIRO-BA
2012
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA – UNEB
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO – PPG
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS SOCIAIS – DTCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ACADÊMICO EM HORTICULTURA IRRIGADA –
PPHI.
SIMBIOSE MICORRÍZICA ARBUSCULAR NA MAXIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE
METABÓLITOS FOLIARES COM PROPRIEDADES MEDICINAIS EM MUDAS DE
ROMÃZEIRA (Punica granatum L.)
LAURO GONZAGA DA SILVA
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Horticultura irrigada do
Departamento de Tecnologia e Ciencias Sociais da
Universidade do Estado da Bahia, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em
Horticultura Irrigada, linha de pesquisa
microbiologia.
Área de Concentração: Agronomia.
Orientadora: Lindete Míria Martins
Co-orientador: Fábio S. B . Silva.
JUAZEIRO-BA
2012
1
LAURO GONZAGA DA SILVA
SIMBIOSE MICORRÍZICA ARBUSCULAR NA MAXIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE
METABÓLITOS FOLIARES COM PROPRIEDADES MEDICINAIS EM MUDAS DE
ROMÃZEIRA (Punica granatum L.)
Data da defesa: 25/04/2012
COMISSÃO EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
_____________________________________________________________________
Dra. Lindete Míria Vieira Martins – (Orientadora)
Universidade do Estado da Bahia
_____________________________________________________________________
Dr. Fábio Sérgio Barbosa da Silva – (1o membro)
Universidade de Pernambuco – Campus Petrolina
_____________________________________________________________________
Dra. Maryluce Albuquerque da Silva Campos – (2o membro)
Universidade de Pernambuco – Campus Petrolina
MEMBROS SUPLENTES
_____________________________________________________________________
Dra. Cristiane Domingos da Paz
Universidade do estado da Bahia - UNEB
_____________________________________________________________________
Dra. Cláudia Miranda Martins
Universidade Federal do Ceara - UFC
JUAZEIRO-BA
2012
2
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
LAURO GONZAGA DA SILVA
SIMBIOSE MICORRÍZICA ARBUSCULAR NA MAXIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE
METABÓLITOS FOLIARES COM PROPRIEDADES MEDICINAIS EM MUDAS DE
ROMÃZEIRA (Punica granatum L.)
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em
Horticultura Irrigada da Universidade do Estado da Bahia
(PPHI/UNEB/DTCS), como parte do requisito para a obtenção do
título de Mestre em Agronomia. Área de Concentração: Horticultura
Irrigada.
Aprovada em: 25/04/2012
Comissão Examinadora
______________________________________________________
Profa. Dra. Lindete Miria Vieira Martins
Universidade do Estado da Bahia (DTCS/UNEB)
______________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Sérgio Barbosa da Silva
Universidade de Pernambuco – Campus Petrolina
_______________________________________________________
Profa. Dra. Maryluce Albuquerque da Silva Campos
Universidade de Pernambuco – Campus Petrolina
3
S586s
Silva, Lauro Gonzaga da
Simbiose micorrízica arbuscular na maximização da produção de
metabólitos foliares com propriedades medicinais em mudas de
romãzeira (Punica granatum L.)./ Lauro Gonzaga da Silva. – –
Juazeiro, 2012
42 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade do Estado da Bahia,
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, 2012.
Orientadora: Lindete Míria Vieira Martins
Banca examinadora: Fábio Sérgio Barbosa da Silva, Maryluce
Albuquerque da Silva Campos.
Bibliografia
1. Micorrízas arbusculares. 2. Romã – Metabólitos foliares. 3.
Romãzeira – Compostos bioativos. I. Universidade do Estado da
Bahia. Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais. II. Título.
CDD: 589.2
4
A Deus agradeço o dom da sabedoria.
A meus pais dedico (in memorian).
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força e coragem de enfrentar essa etapa da minha vida.
A toda minha família em especial aos m eus pais (in memorian) e aos
meus amigos.
À minha orientadora, Prof a Lindete Miria Vieira M artins, pelo
incentivo e conhecimento na execução deste rabalho.
Ao meu co-orientador, Prof o Fábio Sérgio Barbosa da Silva, por cada
conhecimento adquirido , pela paciência e palavras de sabedoria.
À Profª Maryluce Albuquerque da Silva Campos, pelos ensinamentos
durante a realização da minha pesquisa.
Aos meus amigos do Labora tório de Enzimologia e Fitoquimica
Aplicada a Micologia da Universidade de Pernambuco Campus Petrolina:
Marlon Lins, Paula Oliveira, João Cleme Sousa Júnior, Ieda Coelho, Mª
Valdirene Bonfim, Melquisedec Oliveira, Cleilton Lima, Elis Souza, Diana
Carvalho, por toda ajuda na execução do trabalho.
Aos amigos da Universidade de Pernambuco – Campus Petrolina, em
dedicação a Profa. Maria do Socorro Ribeiro Nunes e Profa. Rosilande
Nunes Bandeira.
Ao
Departamento
de
Tecnologia
e
Ciências
Sociais -DTSC
da
Universidade do Estado da Bahia -UNB, Campu III A -Juazeiro-BA, em
especial aos amigos que conquistei no mestrado em Horticultura Irrigada.
Enfim, a todos aqueles que contribuíram para a realização deste
sonho, se tivesse que escrever minha forma de agradecimento a cada um
individual escreveria paginas infinitas, agradeço, que Deus nos abençoe.
SUMÁRIO
Pag.
1.
INTRODUÇÃO........................................................................................................
11
2.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................................................................
13
2.1
Punica granatum L...................................................................................................
13
2.2
Propriedades fitoterápicas de P. granatum...............................................................
14
2.3
Caracterização fitoquímica da romãzeira.................................................................
15
2.4
Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) ..............................................................
16
2.4.1
Produção de fitoquímicos em mudas micorrizadas ................................................
18
3.
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
21
3.1
Material vegetal........................................................................................................
21
3.2
Substrato de cultivo..................................................................................................
21
3.3
FMA..........................................................................................................................
21
3.4
Inoculação micorrízica..............................................................................................
21
3.5
Determinações bioquímicas e fitoquímicas..............................................................
22
3.5.1
Preparo do extrato vegetal........................................................................................
22
3.5.2
Proteínas totais..........................................................................................................
22
3.5.3
Caboidratos solúveis.................................................................................................
22
3.5.4
Fenóis totais..............................................................................................................
22
3.5.5
Taninos totais............................................................................................................
22
3.5.6
Flavonoídes totais.....................................................................................................
22
3.6
Delineamento exerimental e análise estatística........................................................
22
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................
24
5.
CONCLUSÕES........................................................................................................
28
6.
REFERÊNCIAS........................................................................................................
29
2
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1
Principais fitoquímicos encontrados na romãzeira
16
Tabela 2
Influência de fungos micorrizícos arbusculares na produção de
19
fitoquímicos foliares
Tabela 3
Níveis de significância (valores de p) para as variáveis estudadas
Tabela 4
Concentração de proteínas totais, carboidratos solúveis, fenóis
24
totais, flavonóides totais, taninos totais em mudas de romãzeiras,
associadas ou não a fungos micorrízicos arbusculares (FMA), 120
25
dias após a inoculação, em casa de vegetação
Tabela 5
Número de folhas, Diâmetro do caule, matéria fresca da parte área,
matéria seca da parte área, matéria fresca da parte subterrânea,
altura e colonização micorrízica em mudas de romãzeiras,
associadas ou não a fungos micorrízicos arbusculares (FMA), 120
dias após a inoculação, em casa de vegetação
26
3
RESUMO
A romãzeira (Punica granatum) é uma fruteira com potencial medicinal, devido a presença
de compostos bioativos com propriedades farmacológicas, constituindo cultura alternativa
na região do semiárido brasileiro. Fungos micorrízicos arbusculares (FMA), quando em
simbiose, otimizam o crescimento vegetal e a produção de metabólitos com potencial
medicinal, no entanto, não está definido se tais fungos otimizam a produção de
biomoléculas em mudas de romãzeira. Portanto, o objetivo deste trabalho foi selecionar
FMA eficientes em maximizar o crescimento e a produção de metabólitos foliares com
propriedades medicinais em mudas de P. granatum. O delineamento experimental foi do
tipo inteiramente casualizado, com três tratamentos de inoculação (inoculado com G.
albida, inoculado com A. longula e controle não inoculado), em 7 repetições, totalizando
21 unidades experimentais. Plântulas de romãzeiras, com duas folhas definitivas, foram
transferidas para potes com solo com 3 mg P dm-3 e inoculadas na região das raízes com
solo-inóculo fornecendo 200 esporos/pote de G. albida ou A. longula. Após 120 dias da
inoculação foram avaliados: altura, número de folhas, diâmetro do caule, matéria fresca e
seca da parte aérea e seca da parte subterrânea e colonização micorrízica. Nas folhas foram
determinadas concentrações de proteínas totais, carboidratos solúveis, fenóis totais, taninos
totais e flavonóides totais. Com exceção do diâmetro do caule, houve efeito dos
tratamentos de inoculação sobre as demais variáveis estudadas (p <0,01). Mudas de
romãzeira associadas a G. albida acumularam mais metabólitos primários (proteínas e
carboidratos) e secundários (fenóis, flavonóides e taninos) em relação ao controle não
inoculado e àquelas formando simbiose com A. longula. Comportamento similar foi
registrado para os demais parâmetros de crescimento vegetal, com exceção do diâmetro do
caule e da colonização micorrízica. Conclui-se que mudas de romãzeiras têm o
crescimento e a produção de compostos bioativos beneficiados pela inoculação com FMA,
com os benefícios variando em função do fungo utilizado.
PALAVRAS-CHAVE: Glomeromycota, metabólitos secundários, FMA.
ABSTRACT
The pomegranate (Punica granatum) is a species with medicinal potential, due to the
presence of bioactive compounds with pharmacological properties, providing an alternative
crop in the semiarid region of Brazil. Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), when in
symbiosis, optimize the plant growth and production of metabolites with medicinal
potential, however, is not set such defined fungi optimize the production of biomolecules in
pomegranate seedlings. Therefore, the aim was to select AMF efficient in optimizing the
growth and leaf production of metabolites with medicinal properties in P. granatum
seedlings. The experimental design was a completely randomized design with three
inoculation treatments (inoculated with G. albida, inoculated with A. longula and
uninoculated control), 7 repetitions, totalizing 21 experimental units. Seedlings of
pomegranates, with two true leaves, were transferred to pots with soil with 3 mg P dm-3
and inoculated in the region of the roots with soil inoculum, providing 200 spores / pot G.
albida or A. longula. After 120 days of inoculation were evaluated: height, leaf number,
stem diameter, fresh and dry shoot and dry weight of subterranean part, mycorrhizal
colonization and concentrations of total proteins, soluble carbohydrates, total phenols,
tannins and total flavonoids in leaves. With the exception of stem diameter, treatment
effects of inoculation on the other variables was registred (p <0.01). Pomegranate seedlings
associated with G. albida accumulated more primary metabolites (proteins and
carbohydrates) and secondary (phenols, flavonoids and tannins) compared to uninoculated
control and those forming symbiosis with A. longula. Similar behavior was reported for
other plant growth parameters, except for stem diameter and mycorrhizal colonization. We
conclude that seedling leaves of pomegranate trees have growth and production of
bioactive compounds benefit from inoculation with AMF, with the benefits varying
depending on the fungus used.
Key words: Glomeromycota, secondary metabolites, AMF.
10
1 INTRODUÇÃO
Vegetais podem conter princípios ativos contra microrganismos patogênicos, sendo
usados como recursos alternativos na terapêutica (FENNER et al. 2006); algumas espécies
podem servir de matéria prima de baixo custo para a produção de medicamentos, sendo
necessário ações biotecnológicas que maximizem a produção de fitomassa para a indústria
farmacêutica.
A romãzeira (Punica granatum) contém vários princípios ativos que podem atuar no
tratamento de doenças (PEREIRA et al. 2006). Na fitomassa dessa planta são encontrados
princípios ativos que possuem atividades hipoglicemiante, antimicrobiana (LANSKY &
NEWMAN, 2007), antiinflamatória e analgésica (WERKMAN et al. 2008), além da
potencialidade de tratamento de doenças gastrointestinais (MATOS, 1989) e de neoplasias
(KHAN, 2009; PEREIRA et al. 2005).
Dentre os microrganismos presentes no solo, os fungos micorrízicos arbusculares
(FMA) formam associação simbiótica mutualística com raízes de espécies vegetais
(MOREIRA & SIQUEIRA, 2006), favorecendo o crescimento e a produtividade de
culturas de interesse econômico (ILBAS & SAHIN, 2005). Tais benefícios têm sido
registrados em espécies arbóreas (CARNEIRO et al. 2004) e espécies frutíferas, como:
maracujazeiro-azedo - Passiflora edulis. (SILVA et al. 2001); gravioleira - Anona
muricata. (SILVA et al. 2008) ou goiabeira - Psidium guajava. (SCHIAVO & MARTINS,
2002); bananeira - Musa spp. (TRINDADE et al. 2003), entre outras.
Além dos benefícios nutricionais, a micorrização pode incrementar a produção
citoplasmática de compostos bioativos vegetais com propriedades farmacológicas. Estudos
têm apontado que diversas moléculas do metabolismo primário e secundário têm sua
produção otimizada quando associadas aos FMA (HUANG et al. 2011; CECCARELLI et
al. 2010; RATTI et al. 2010; RAPPARINI et al. 1996). Entretanto, mesmo com
importância fitoterápica, não está definido se a inoculação com FMA promove o acúmulo
de biomoléculas foliares em mudas de P. granatum. Portanto, testou-se a hipótese que a
micorrização favorece a produção de metabólitos primários e secundários foliares em
mudas de romãzeiras, mas a eficiência micorrízica varia com o fungo utilizado.
11
O objetivo deste trabalho foi selecionar FMA eficientes em maximizar o crescimento
e a produção de metabólitos foliares com propriedades medicinais em mudas de Punica
granatum.
12
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Punica granatum L.
A romã (Punica granatum), conhecida popularmente como romeira (TAVARES et al.
2005), pertence a família Punicaceae, sendo cultivada em climas tropicais e subtropicais
(HALILOVA & YILDIZ, 2009), ocorrendo desde o Irã até o Himalaia (PEREIRA et al.
2010). Tem sido cultivada há muito tempo por todo o Mediterrâneo e Nordeste da Índia,
tendo escala produtiva de 100.000 há, produzindo 0,45 milhões de toneladas de frutos ao
ano destinados à produção de sobremesas e de bebidas (DEEPIKA & KANWAR, 2010).
Entre os países importadores, destaca-se a Inglaterra, seguida da França, que aceita em seu
comércio os frutos de grande calibre (HIDAKA et al. 2005).
Segundo Hidaka et al. (2005) o cultivo da romãzeira é realizado em 100 países do
mundo.
No Brasil, onde encontrou
condições
ambientais
favoráveis
ao seu
desenvolvimento vegetativo, é conhecida no país como romã (MACHADO et al. 2002).
Nas zonas semiáridas da região Nordeste, a produção de frutos ocorre no período de
setembro a fevereiro (MARÇAL et al. 2011). No Vale do São Francisco, duas cultivares
têm destaque, a vermelha e a amarela; a primeira sendo uma variedade canadense e a
segunda nacional (MARTINS,1995); ambas possuem adaptação a clima seco e tolerância
moderada a salinidade (BHANTANA & LARAROVITCH, 2010) e com boa escala de
produção no vale do são Francisco (MARTINS, 1995).
A romãzeira possui características de arvoreta frutífera, com folhas pequenas, rijas,
brilhantes e membranáceas (RODRIGUES et al. 2006), é um arbusto lenhoso, ramificado
(HALILOVA & YILDIZ, 2009) com flores dispostas nas extremidades de ramos com
cores vermelho-alaranjadas (WERKMAN et al. 2008), originando frutos esféricos com
muitas sementes em camadas, que encerram em arilo polposo (LORENZI & SOUZA,
2001). O suco de seus frutos é uma boa fonte de açúcares, vitaminas B e C, com teores
razoáveis de proteína férrica (DEEPIKA & KANWAR, 2010). Na indústria é utilizada no
preparo de produtos como sucos, geléias e bebidas aromatizantes (AARABI et al. 2008).
As folhas, as flores e a casca dos frutos são utilizados, tradicionalmente, para fins
medicinais e curtimento de couros (DEEPIKA & KANWAR, 2010), sendo também
utilizadas para ornamentação de parques e jardins (LOPES et al. 2001).
13
A propagação é feita por sementes ocorrendo germinação lenta e desuniforme (SANT’
ANNA et al. 2008). Para Rodrigues et al. (2006), a sarcotesta, por ser um material
gelatinoso que envolve as sementes, pode comprometer sua germinação, acarretando-lhe
moderada dormência. Segundo Lopes et al. (2001) uma das medidas para a quebra dessa
dormência é quando as sementes são fermentadas, aumentando, assim, sua viabilidade e
vigor num período de 72 horas de fermentação.
Além do potencial frutífero, recentemente o cultivo de romãzeiras tem tomado outras
dimensões, pois pesquisas estão sendo direcionadas em relação à produção de
fitoconstituintes com propriedades terapêuticas (TAVARES et al. 2005).
2.2 Propriedades fitoterápicas da P. granatum
A medicina popular, por ser uma prática milenar, tem ultrapassado todas as barreiras e
obstáculos chegando aos dias atuais (CARVALHO el at. 2005) e com a vasta diversidade
vegetal brasileira, plantas com propriedades medicinais tem despertado o interesse da
comunidade científica em estudos fitoterápicos (OLIVEIRA et al. 2005). No Brasil, é
comum o uso de plantas medicinais no tratamento de diversas infecções (SEPTIMO et al.
1994), considerando que estudos em várias regiões do país têm demonstrado a
intensificação da medicina popular no tratamento de doenças (PEREIRA et al. 2006).
O aproveitamento dos recursos biológicos, com enfoque aos aspectos medicinais de
plantas cultivadas nas regiões semiáridas, tem sido evidenciado (ALBUQUERQUE et al.
2002). Diversos autores descrevem as propriedades terapêuticas (LANSKY & NEWMAN,
2007) e os diferentes concentrações dos componentes fitoterápicos da romãzeira
(NISHIGAHI et al. 2008), utilizada na medicina popular no tratamento de processos
infecciosos internos ou externos (LANSKY et al. 2004).
Por ser uma fruteira com potencial medicinal (BLASCO et al. 2009), estudos com
extratos da P. granatum têm revelado o uso intensificado na medicina tradicional
(PEREIRA et al. 2006), sendo utilizadas diferentes partes da planta (RODRIGUES et al.
2006), que possuem atividades antiflamatória, hipoglicemiante, antioxidante (PEREIRA et
al. 2005), antimicrobiana (CATÃO et al. 2006) e no tratamento de doenças
gastrointestinais (MATOS, 1989).
14
A casca do caule é empregado como vermífugo, em especial para tênias (WERKMAN
et al. 2008), enquanto os frutos são utilizados para o tratamento de diarréias (PRADEEP et
al. 2008) e de infecções da pele e mucosas (CARBALLO et al. 2009). Segundo
PRAKASH & PRAKASH (2011) a composição química dos frutos tem uma variação em
seus constituintes, associada a variedade cultivada, clima, estado de maturação e
armazenamento. As sementes, com seus envoltórios rosados e suculentos, são usadas para
as afecções da boca e da garganta (LANSKY & NEWMAN, 2007; LANSKY et al. 2004 ),
e o arilo utilizado popularmente contra catarata (CARVALHO et al. 2005); as flores e os
botões florais, em pó, servem para o alívio da bronquite e do Diabetes mellitus (BAGRI et
al. 2009).
Drumond et al. (2004) relataram que as plantas da família Punicaceae apresentam
ação bactericida, pois estudando o extrato hidroalcoólico do pericarpo da casca de
romãzeiras, em relação à formação de biofilmes dentais bacterianos, verificaram que há
inibição da formação de placa supragemgival por microrganismos aeróbios, como
Streptococcus mitis e Streptococcus mutans. O potencial do extrato etanólico das folhas e
dos frutos da P. granatum são usados em estudos de mutagenicidade em camundongos
(VALADARES et al. 2010)
Adicionalmente, Werkman et al. (2008) enfatizaram a
multifuncionalidade dos frutos da romã como fitoterápico, descrevendo a capacidade
antimicrobiana e antiflamatória, além de ações terapêuticas na odontologia. Efeitos
quimioprotetores também foram relatados quando se utilizam extratos de romã (PEREIRA
et al. 2005).
2.3 Caracterização fitoquímica da romãzeira
Dados da Organização Mundial de Saúde indicam que cerca de 65 a 80 % da
população mundial buscam alternativas nas plantas para fins terapêuticos, geralmente por
motivo de pobreza ou precariedade no sistema de saúde (IHA et al. 2008), considerando
que os vegetais, em especial as fruteiras, possuem não somente valor nutritivo, mas
também propriedades medicinal e cosmética (PIETRO et al. 2006), graças à presença de
compostos bioativos, sobretudo aqueles do metabolismo secundário vegetal (JARDINI et
al. 2007).
15
Vários compostos do metabolismo primário e secundário conferem propriedades
medicinais à romã (Tabela 1). Alguns efeitos terapêuticos estão relacionados à presença de
taninos, sobretudo o tanino elágico conhecido por punicagina (MACHADO et al. 2003).
CARBALLO et al. (2009) ressaltam que a romãzeira concentra os elagitaninos nos frutos
e granatina nos frutos e sementes (Tabela 1). Pesquisas comprovam que os diferentes
grupos de flavonóides e taninos presentes nos frutos e suco da romã inibem a oxidação de
LDL (FUHRMAN & AVIRAM, 2002) em estudos in vitro e in vivo, em lesões em ratos.
Katsube et al. (2003) relataram que tanto os flavonoides como também as antocianinas
possuem atividade antioxidante.
Tabela 1. Principais fitoquímicos encontrados na romãzeira
Classe de
Fitoquímico
Fenóis
Composto
Acido fenólico**
Polifenóis*
Frutos
Polpa dos frutos
Flavonóides
Flavonas*
Antocianina*
Frutos, sementes
Raiz, caule
Férrica**
Frutos
Proteínas
Parte vegetal
Referências
Jardini et al. (2007)
Deepika & Kanwar
(2010)
Jurenka et al. (2008)
Werkman et al. (2008)
Deepika & KANWAR
(2010)
Taninos
Elagitanino*
Granatina*
Punicalagina*
Frutos
Frutos, sementes
Folhas, flores
Carballo et al. (2009)
Machado et al. (2003)
Catão et al. (2006)
(*) Elevada concentração (**) Moderada concentração
2.4 Fungos micorrízicos arbusculares (FMA)
Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiontes obrigatórios, que necessitam de
um hospedeiro vegetal compatível para completar seu ciclo de vida (SMITH & READ,
1997; SILVA & ALBUQUERQUE, 2005), formando assim relações mutualistas com a
maioria das espécies vegetais (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Carrenho et al. (2010)
ressaltam que a micorrização é o tipo de simbiose entre fungos e plantas mais amplamente
16
distribuído na natureza, colonizando a maioria dos vegetais de importância econômica.
Segundo Souza et al. (2010), solos naturais com cobertura vegetal espontânea contém
espécies de FMA formando micorriza.
Os FMA pertencem ao Filo Glomeromycota (SCHUSSLER et al. 2001), tendo como
característica primordial a formação de uma estrutura amplamente ramificada, denominada
arbúsculos, onde há troca de produtos da fotossíntese, nutrientes e água (NAGAHASHI et
al. 2010).
Na presença e combinações apropriadas entre fungo-planta e condições ambientais
(CAVALCANTE et al. 2009), como luz, umidade, nutrientes, entre outros, os esporos de
FMA germinam no solo e emitem um tubo germinativo (BONFANTE et al. 2009),
caracterizando o crescimento assimbiótico; ao encontrar a raiz de uma planta susceptível, a
hifa diferencia-se em apressório e fixa-se na epiderme (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006;
LAMBAIS, 2006); posteriormente, ocorre a colonização inter e intracelular via micélio,
que se diferencia em árbusculos (BONFANTE et al. 2009). Tais estruturas são
responsáveis pela troca de metabólicos entre os simbiontes (LAMBAIS & RAMOS 2010).
Kiriachek et al. (2009) relatam que no estabelecimento das micorrizas arbusculares,
a troca de sinais tem início antes do contato físico entre os simbiontes, ocorrendo a
secreção de exsudados pelas raizes, estimulando a ramificação das hifas dos FMAs.
Segundo Bonfante et al. (2009) há percepção dos sinais dos fungos na periferia das células
vegetais. Para Smith & Read (2008) na maioria das situações, beneficiando o fotobionte
associado, levando a tolerância a estresses de natureza biótica e abiótica.
Condições ambientais como fertilidade, umidade do solo, pH, luminosidade,
temperatura entre outros, são fatores que interferem na ocorrência dos FMA, assim como a
sua compatibilidade fúngica com a espécie vegetal (SILVEIRA & GOMES 2007) são
determinantes na resposta das plantas à micorrização.
Segundo Cardoso et al. (2010) diversas plantas de interesse econômico são
beneficiadas pela associação com FMA. Trindade et al. (2000) pontuam que os benefícios
da micorrização têm sido indicados para produção de mudas de fruteiras, melhorando
assim sua fisiologia, considerando que tal simbiose beneficia a planta pela absorção de
nutrientes do solo, especialmente o fósforo (MIRANDA & MIRANDA, 1997).
Diversas pesquisas têm apontado que a aplicação de FMA pode ser alternativa viável
para a produção de fruteiras, principalmente àquelas com destaque agronômico (YANOMELO et al. 2003). A inoculação com FMA pode maximizar a produção, gerando redução
17
no uso de bioinsumos agrícolas. Conforme Cardoso & Lambais (1992), tal ferramenta pode
ser usada na maioria das espécies florestais e frutíferas tropicais, sobretudo na produção de
mudas.
Benefícios da utilização de FMA na promoção do crescimento vegetal têm sido
evidenciados em espécies arbóreas (CARNEIRO et al. 2004) e em solos com baixa
fertilidade e presença de metais pesados (SILVA et al. 2006), como também em solos
contaminados (SANTOS el al. 2008; REDON et al. 2009). Benefícios da micorrização têm
sido evidenciados em várias culturas, como: mamoeiro (TRINDADE et al. 2003),
gravioleira (SILVA et al. 2008), maracujazeiro-doce (SILVA et al. 2004), maracujazeiroazedo (CAVALCANTE et al. 2002), bananeira (MATOS et al. 2002; YANO-MELO et al.
2003), romãzeira (ASERI et al. 2008), tangerina (WU et al. 2006) e aceroleira (COSTA et
al. 2001), entre outros. Porém, Caravaca et al. (2002) ressaltam que em solos muito pobres
o efeito da inoculação não é evidenciado, sendo a aplicação conjunta do fungo micorrízico
e adubos orgânicos, em proporções adequadas, um alternativa viável e de baixo custo.
2.4.1
Produção de fitoquímicos em mudas micorrizadas
Os benefícios da micorrização na produção de biomoléculas com potencial
farmacológico têm sido objeto de estudo da Micorrizologia há pouco tempo sendo
documentado em várias espécies (CECCARELLI et al. 2010; ZUBEK et al. 2010;
RAPPARINI et al. 1996; FREITAS et al. 2006).
Kapoor et al.( 2007) sugerem que plantas com potencial medicinal podem ter sua
fisiologia vegetativa alterada pela presença de determinadas moléculas, em decorrência da
presença do FMA. Silva et al. (2008) avaliaram o efeito da adubação fosfatada e da
inoculação com Scutellospora heterogama, Gigaspora decipiens, Acaulospora koskei,
Entrophospora colombiana e um mix dos quatro isolados e verificaram aumento na
produção de óleo resina em plantas micropropagadas de gengibre (Zingiber officinale). De
modo similar, Freitas et al. (2004) relataram que a inoculação com FMA favoreceu o
acúmulo de óleos essenciais de Mentha arvensis. Tais benefícios foram documentados em
várias plantas de importância medicinal (Tabela 2).
18
Tabela 2: Influência de fungos micorrizícos arbusculares na produção de fitoquímicos
foliares
Espécie vegetal
FMA
Zingiber officinale
S. heterogama
Efeito
Composto
Referências
(+)
Óleo resina
Silva et al. (2008a)
G. decipiens
A. koskei
E. colombiana
Trifolium repens
G. intraradies
(+)
Flavonoides
Ponce et al. (2004)
Mentha arvesis
A. scrobiculata
(+)
Óleos
essenciais
Freitas et al. (2006)
Salvia offininalis
G. mossaea
(+)
Acido
rosmarínico
Nell et al. (2008)
G. intraradices
Origanum sp.
G. mossaea
(+)
Óleo
essencial
Khaosaad et al. (2006)
Anethum graveolens
G. macrocarpum
(+)
Óleo
Kapoor et al. (2002)
essencial
Trachyspermum ammi
G. fasciculatum
(-)
Timol
Kapoor et al. (2002a)
Artemisia annua
G. macrocarpum
(+)
Artemisinina
Kapoor et al. (2007)
(+)
Óleos
essenciais
Copetta et al. (2007)
Proteínas
Araim et al. (2009)
G. fasciculatum
Ocimun basilicum
G. mossaea
G. margarita
G. rósea
Echinacea purpúrea
G. intraradices
(+)
19
Annona squamosa
Allium cepa
A. longula
(0)
Flavonoides
Lima et al. (2011)
G. albida
(+)
G. cloroideum
(0)
Fenóis
Perner et al. (2008)
Castelannos-Morales et al.
(2009).
G. microaggregatum
G. mosseae
G. intraradices
Fragaria ananossa
G. intraradices
(+)
Flavonoides
Mentha arvesis
G. etunicatum
(+)
Óleo
essencial
G. lamellosum
(+)
Karagiannidis et al. (2011).
(+) efeito positivo; (-) efeito negativo; (0) efeito nulo.
Os FMA além de promover maior crescimento vegetal, podem alterar
quantitativamente à concentração de fitoquímicos foliares (KAPOOR et al. 2004). Esse
aspecto da simbiose micorrízica é extremamente importante, pois plantas que possuem
fitomassa com maiores concentrações de compostos bioativos, podem ser atrativas para a
indústria farmacêutica de fitoterápicos. Ainda não está definido se a inoculação com FMA
promove o acúmulo de biomoléculas foliares em mudas de P. granatum.
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
Sementes de romãzeiras (P. granatum) foram embebidas em água destilada,
desinfestadas com NaClO-20 % (2 % cloro ativo) por 2 minutos, lavadas em água destilada
e colocadas para germinar em bandejas contendo areia lavada e vermiculita (1:1, v/v)
esterilizadas (121 ºC/30min./dois dias consecutivos).
3.2 Substrato de cultivo
Foi utilizado solo coletado em área de Caatinga nativa, no Km 152, município de
Petrolina-PE, que apresentava: P (3 mg dm-3); Matéria Orgânica (2,48 g Kg-1); Capacidade
de Troca Catiônica (9,62 cmol dm-3) e pH (4,9). No experimento foram usados potes
preenchidos com 1,2 kg de solo não esterilizado.
3.3 FMA
Foram testados Acaulospora longula Spain & N.C. Schenck (UFPE 21) e
Gigaspora albida N.C. Schenck & G.S. Sm. (UFPE 01). Os inóculos dos FMA utilizados
foram produzidos em solo, tendo como hospedeiro o painço (Panicum miliaceum L.) e
armazenados a 4 ºC até o momento da utilização.
3.4 Inoculação micorrízica
Plântulas com duas folhas definitivas foram transferidas para os potes e inoculadas
na região das raízes com solo-ínóculo fornecendo 200 esporos + hifas + raízes colonizadas
de A. longula ou G. albida. O experimento foi mantido em casa de vegetação na
Universidade do Estado da Bahia – UNEB. Após 120 dias da inoculação foram avaliados
os parâmetros de: altura (cm), diâmetro do caule (mm), número de folhas, matéria fresca
de parte aérea, matéria fresca de parte subterrânea, matéria seca de parte aérea e
colonização micorrízica. Para avaliação da colonização micorrízica, as raízes foram
clarificadas (KOH 10 %) e coradas (azul de Trypan 0,05 %) pelo método de Phillips &
21
Hayman (1970) e o percentual de colonização determinado pelo método de interseção de
quadrantes (GIOVANNETTI & MOSSE, 1980).
3.5 Determinações bioquímicas e fitoquímicas
Foram determinadas nas folhas, as concentrações de proteínas totais, carboidratos
solúveis, fenóis totais, taninos totais e flavonóides totais.
3.5.1 Preparo do extrato vegetal: após secagem em estufa, 500 mg de folhas foram
picotadas ou maceradas e transferidas para erlenmeyers (125 mL) e adicionados 20 mL de
etanol (95 %). Após maceração de 12 dias (25 ºC), ao abrigo da luz, o extrato foi filtrado
em gaze e re-filtrado em papel de filtro qualitativo, sendo armazenado em frasco âmbar (4 ºC) (BRITO et al. 2008). No extrato foram determinados:
3.5.2 Proteínas totais: foram determinada pelo método de Bradford (1976) com algumas
modificações: em tubo de ensaio foram adicionados 50 µL do extrato etanólico e 2,5 mL
do Reagente de Bradford, seguindo-se a agitação em vórtex. Após cinco minutos, as
leituras foram feitas em espectrofotômetro (595 nm), utilizando o BSA (albumina bovina
sérica) como padrão.
3.5.3 Carboidratos solúveis: a quantificação foi feita pelo método de Dubois et al. (1956)
modificado: num tubo de ensaio rosqueável foram colocados 50 µL do extrato etanólico,
95 µL de água destilada, 50 µL de fenol (80 %), procedendo-se a agitação intensa em
vórtex; posteriormente, foram adicionados 2 mL de ácido sulfúrico e após incubação (10
minutos / 22 ºC), foi conduzida a leitura em espectrofotômetro (490 nm), sendo utilizada
glicose para preparo da curva-pardrão.
3.5.4 Fenóis totais: determinados de acordo com a metodologia proposta por Monteiro et
al. (2006): em balão volumétrico (100 mL) foram adicionados 250 µL do extrato, 5 mL do
Reagente de Folin-Ciocalteau (10 %), 10 mL de carbonato de sódio (7,5 %) e o volume
completado para 100 mL com água destilada. Após 30 minutos em repouso, foram
realizadas leituras de absorbância (760 nm), adotando-se o ácido tânico como padrão.
3.5.5 Taninos totais: foi utilizado o método da precipitação de caseína, descrito em
Monteiro et al. (2006): em um erlenmeyer foram adicionados 6 mL do extrato, 1 g de
caseína em pó, com posterior agitação constante (25 ºC). Posteriormente, as amostras
foram filtradas, com o volume completado para 25 mL em balão volumétrico e a
quantificação será feita pelo método de Folin-Ciocalteau. A concentração de taninos foi
22
obtida pela diferença entre o valor encontrado nessa leitura e aquele obtido na
quantificação de fenóis totais
3.5.6 Flavonóides totais: os teores de flavonóides foram estimada a partir da metodologia
de Araújo et al. (2008), com algumas modificações: em um balão volumétrico foram
colocados 1 mL do extrato etanólico, 0,6 mL de ácido acético glacial, 10 mL de solução
piridina:metanol (8:2 v/v) e 2,5 mL de solução etanólica de cloreto de alumínio (5 %), com
o volume final de 25 mL completado com água destilada. Após 30 minutos em repouso, a
absorbância foi medida (420 nm), utilizando rutina para preparo da curva-padrão.
3.6 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três tratamentos de
inoculação (inoculado com G. albida, inoculado com A. longula e controle não inoculado),
em sete repetições, totalizando 21 unidades experimentais. Os dados foram submetidos à
ANOVA e as médias comparadas ao teste de Tukey (1 % de probabilidade), utilizando o
programa Statistica (STATSOFT, 2002).
23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com exceção do diâmetro do caule, houve efeito dos tratamentos de inoculação sobre
as variáveis estudada (p<0,01) (Tabela 3).
Tabela 3. Níveis de significância (valores de p) para as variáveis estudadas
Variável
Nível de significância
Concentração de proteínas totais
**
Concentração de carboidratos solúveis
**
Concentração de fenóis totais
**
Concentração de flavonóides totais
**
Concentração de taninos totais
**
Número de folhas
**
Diâmetro do caule
Ns
Matéria fresca da parte aérea
**
Matéria seca da parte aérea
**
Matéria fresca da parte subterrânea
**
Altura
**
Colonização micorrízica
**
**(p<0,01); ns (não significativo).
Mudas de romãzeira associadas a G. albida acumularam mais metabólitos
primários (proteínas e carboidratos) e secundários (fenóis, flavonóides e taninos) em
relação ao controle não inoculado e àquelas formando simbiose com A. longula (Tabela 4).
Em outras situações, a aplicação da tecnologia micorrízica favoreceu a maximização de
produção de compostos bioativos com potencial medicinal (HUANG et al. 2011; RATTI et
al. 2010). É provável que o aumento nos níveis de metabólitos esteja associado a mudanças
morfológicas nos plastídeos, eficiência nas rotas metabólicas envolvidas na biossíntese dos
compostos estudados, assim como melhoria no estado nutricional (STRACK & FESTER
2006). Outro fator que deve ser considerado é a produção dos compostos estudados
variando em função do tratamento micorrízico, como evidenciado por Dave & Tarafdar
(2011) em mudas de Ocinum basilicum, confirmando a hipótese inicial do trabalho e
24
indicando que generalizações sobre a eficiência micorrízica na produção de metabólitos
vegetais deve ser evitada.
Tabela 4. Concentração de proteínas totais, carboidratos solúveis, fenóis totais,
flavonóides totais, taninos totais em mudas de romãzeiras, associadas ou não a fungos
micorrízicos arbusculares, 120 dias após a inoculação, em casa de vegetação
Variável
Tratamentos de inoculação
Controle
G. albida
A. longula
Concentração de proteínas totais*
49,24 b
154,30 a
69,30 b
Concentração de carboidratos solúveis*
21,86 b
75,80 a
23,81 b
Concentração de fenóis totais*
3,13 b
9,34 a
1,58 b
Concentração de flavonóides totais*
0,37 b
1,89 a
0,34 b
Concentração de taninos totais*
2,42 b
3,87 a
1,04 c
* (mg 100 mg planta-1);
Médias seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de Tukey (1 %).
Araim et al. (2009) avaliando o efeito da micorrização com Glomus intraradices
em plantas de E. purpurea constataram que houve aumento nas concentrações de proteínas,
destacando que a simbiose desempenha importante papel na maximização das vias de
produção dos metabólitos, como registrado no presente estudo (Tabela 4).
O metabolismo secundário, traduzido pela produção de compostos fenólicos, foi
favorecido pela micorrização de mudas de romãzeira com G. albida (Tabela 4). Com
resultados semelhantes, Kapoor et al. (2007) também relataram que a micorrização de
Artemisia annua por Glomus macracarpum e Glomus fasciculatum favoreceu a produção
de artemisinina. Ponce et al. (2004) também documentaram comportamento similar em
Trifolium repens micorrizada por G. intraradices. Por outro lado, a micorrização com G.
mosseae não alterou o acúmulo de óleos essenciais em mudas de Origanum sp.
(KHAOSAAD et al. 2006), resultado semelhante ao verificado em mudas de romãzeira
formando simbiose com A. longula (Tabela 4).
A micorrização favoreceu o crescimento de mudas de romãzeira inoculadas com G.
albida para a maioria dos parâmetros avaliados (Tabela 5). Resultados similares foram
descritos por Cavender et al. (2003), que obtiveram incrementos satisfatórios na matéria
seca da parte aérea e subterrânea em Sorghum bicolor inoculadas com fungos micorrízicos.
25
Baí et al. (2008) evidenciaram incremento na matéria seca da parte aérea em Zea mays
(milho) inoculadas com Glomus caledonium, Glomus spp. e Acaulospora spp. Além disso,
benefícios da utilização de FMA na otimização do crescimento vegetal, na fase de mudas
em solo, foram registrados em outras pesquisas (SHENG et al. 2008; MACHINESKI et al.
2009; SHARMA et al. 2009).
Tabela 5. Número de folhas, Diâmetro do caule, matéria fresca da parte área, matéria seca
da parte área, matéria fresca da parte subterrânea, altura e colonização micorrízica (%) em
mudas de romãzeiras, associadas ou não a fungos micorrízicos arbusculares, 120 dias após
a inoculação, em casa de vegetação
Variável
Tratamentos de inoculação
Controle
G. albida
A. longula
Número de folhas
9,00 b
20,00 a
18,00 a
Diâmetro do caule (mm)
0,12 a
0,12 a
0,11 a
Matéria fresca da parte aérea**
0,06 b
0,34 a
0,11 b
Matéria seca da parte aérea**
0,01 b
0,15 a
0,04 b
Matéria fresca da parte subterrânea**
0,23 b
0,77 a
0,18 b
Altura (cm)
7,14 b
9,73 a
8,43 ab
16,55 c
22,20 b
36,00 a
Colonização micorrízica (%)
Médias seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de Tukey (1 %).
De modo similar ao registrado para as análises bioquímicas e fitoquímicas, a
micorrização das mudas com G. albida trouxe benefícios diferenciados em relação às
plantas não inoculadas ou associadas ao outro FMA testado (Tabela 5). É provável que
tenha havido maior compatibilidade funcional entre o isolado de Gigasporaceae e a planta
estudada. Tal fato tem sido documentado em várias plantas (SILVA 2006; SOUZA et al.
2010; SANTANA 2010). Além disso, é conhecido que membros de Gigaspora produzem
profuso micélio extraradicular no solo (HART & READER 2002), o que poderia ter
contribuído para os maiores benefícios registrados nesse tratamento. Porém, para
comprovar tal hipótese, é necessária a quantificação do micélio extraradicular, que deve ser
realizado em ensaios utilizando solo esterilizado e o presente experimento foi conduzido
em solo nativo não desinfestado.
26
No tratamento controle, não inoculado, houve formação de estruturas micorrízicas
no córtex radicular de mudas de romãzeira (Tabela 5) e as maiores taxas de colonização
micorrízica foram registradas nas plantas associadas a A. longula (Tabela 4). Nesse caso, a
maior ocupação do córtex pelo FMA não foi traduzida por incrementos no crescimento e
no bioacúmulo das moléculas estudadas (Tabela 4 e 5). Resultados divergentes foram
registrados por Silva (2006), o qual registrou que mudas de Passiflora alata cresceram
mais quando o córtex radicular estava mais ocupado com estruturas micorrízicas,
sobretudo os arbúsculos.
Estudos devem ser conduzidos para verificar o benefício da inoculação, registrado
nesse trabalho, em condições de campo, validando desta forma a tecnologia micorrízica
para otimização da produção de fitoquímicos em romãzeiras.
27
5 CONCLUSÕES
Mudas de romãzeiras têm o crescimento e a produção de compostos bioativos
beneficiados pela inoculação com FMA, com os benefícios variando em função do fungo
utilizado;
A simbiose entre romãzeiras e G. albida é alternativa biotecnológica para produção
de mudas com maiores teores de metabólitos primários e secundários foliares com
propriedades medicinais.
28
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