do arquivo - Programas de Pós

1
Dissertação
EFEITOS METABÓLICOS E CARDIOVASCULARES DA
SUPLEMENTAÇÃO COM CAPSAICINA SINTÉTICA EM
MODELO ANIMAL DE SÍNDROME METABÓLICA
Camila da Silva Tremarin
2
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL
FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde: Cardiologia
EFEITOS METABÓLICOS E CARDIOVASCULARES DA
SUPLEMENTAÇÃO COM CAPSAICINA SINTÉTICA EM
MODELO ANIMAL DE SÍNDROME METABÓLICA
Autora: Camila da Silva Tremarin
Orientadora: Profa. Dra. Beatriz D’Agord Schaan
Co-orientadora: Profa. Dra. Karina Rabello Casali
Dissertação
submetida
como
requisito para obtenção do grau de Mestre
ao Programa de Pós Graduação em
Ciências
da
Saúde:
Cardiologia,
da
Fundação Universitária de Cardiologia /
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do
Sul.
Porto Alegre
2012
3
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profa. Beatriz D’Agord Schaan, pela oportunidade de
realizar esse trabalho, pelo exemplo de pesquisadora e pela paciência de ensinar.
À co-orientadora Profa. Karina Rabello Casali, pelos ensinamentos, empatia e
compreensão.
À co-autora Profa. Luise Meurer, pela perseverança.
Ao grupo de pesquisa do Laboratório de Experimentação como um todo e em
especial à Lucinara Dadda Dias, Graziela Hünning Pinto e Ariel Silveira pela
colaboração na realização dos experimentos.
Aos funcionários do Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre.
Aos professores, colegas e funcionários do Instituto de Cardiologia e a todos
os profissionais que colaboraram para a realização deste trabalho.
4
SUMÁRIO
1 SÍNDROME METABÓLICA..........................................................................
01
1.1 CONCEITO....................................................................................................
01
1.2 IMPORTÂNCIA..............................................................................................
02
1.3 EPIDEMIOLOGIA..........................................................................................
03
1.4 FISIOPATOLOGIA.........................................................................................
05
1.5 TRATAMENTOS PARA SÍNDROME METABÓLICA...............................
09
1.5.1 Tratamentos Farmacológicos.....................................................................
09
1.5.2 Tratamentos Não Farmacológicos.............................................................
12
2 MODELO ANIMAL DE SÍNDROME METABÓLICA............................... 16
3 CAPSAICINA.................................................................................................... 19
3.1 AÇÃO TERMOGÊNICA E O EFEITO SOBRE A PRESSÃO ARTERIAL.
20
3.2. METABOLISMO DOS SUBSTRATOS: LIPÍDIOS E GLICOSE................
24
4 JUSTIFICATIVA.............................................................................................. 26
5 HIPÓTESES......................................................................................................
27
6 OBJETIVOS......................................................................................................
28
6.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................
28
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................
28
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................
29
ARTIGO................................................................................................................
49
Abstract and Keywords.......................................................................................
50
Introduction..........................................................................................................
51
Methods.................................................................................................................
53
Results...................................................................................................................
58
Discussion..............................................................................................................
61
References.............................................................................................................
66
5
Figure legends.......................................................................................................
72
Tables..................................................................................................................... 73
ANEXO I: ARTIGO ORIGINAL EM LÍNGUA PORTUGUESA.................
75
ANEXO II: FIGURE 1........................................................................................
103
ANEXO III: FIGURE 2.......................................................................................
104
ANEXO IV: FIGURE 3.......................................................................................
105
6
1
1 SÍNDROME METABÓLICA
1.1 CONCEITO
A síndrome metabólica (SM), descrita inicialmente por Reaven1, é
caracterizada pela agregação de fatores de risco cardiovasculares: excesso de
adiposidade abdominal, hipertensão arterial sistêmica, intolerância à glicose ou
diabetes mellitus, hipertrigliceridemia e colesterol HDL baixo. Tal condição identifica
indivíduos com maior risco para doença cardiovascular 2 e diabetes mellitus3, o que,
associado a sua alta prevalência4 torna-a um problema de saúde pública.
A primeira definição formal da SM, proposta, em 1998, pela Organização
Mundial de Saúde (OMS), dependia da presença de intolerância à glicose, diabetes
mellitus tipo 2 (DM2), ou resistência à insulina5. Em 2002, o National Cholesterol
Education Program Adult Treament Panel III (NCEP ATPIII) apresentou uma
definição que não exigia um fator de risco específico 6, sendo a mesma, logo após,
revisada para adequar-se aos limiares de glicemia de jejum da American Diabetes
Association (ADA)7,8. Em 2005, a definição proposta pela International Diabetes
Federation (IDF) restabeleceu um pré-requisito para o diagnóstico e tornou necessária
a presença de obesidade central, considerando diferentes pontos de corte para
circunferência da cintura (CC) de acordo com as etnias9.
Por fim, foi publicada em 2009 a declaração Joint Interim Statement (JIS) na
tentativa de padronizar os parâmetros para definição da SM. As organizações que
participaram da redação deste documento estabeleceram que o diagnóstico não
enfatizasse um único fator do risco, mas o conjunto de três alterações de 5 condições obesidade abdominal com valores específicos de circunferência da cintura para cada
população; triglicerídeos séricos elevados; lipoproteína de alta densidade (HDL)
2
diminuída; pressão arterial elevada e glicose de jejum alterada. Ainda a inclusão do
tratamento medicamentoso para triglicerídeos, hiperglicemia ou hipertensão arterial,
como item presente10.
1.2 IMPORTÂNCIA
A SM é uma condição clínica preditora de pior prognóstico quando comparada
ao risco individual de cada um de seus componentes. A presença da síndrome está
associada a complicações cardiovasculares e aumento no risco de mortalidade geral e
cardiovascular. Em uma coorte na Finlândia e Suécia (n=4.483), indivíduos com SM
apresentaram um aumento no risco de morbidade e mortalidade cardiovascular em,
aproximadamente, 3 e 1,81 vezes, respectivamente11. Resultados semelhantes foram
encontrados em uma coorte de homens de meia idade (n=1209), com seguimento
médio de 11 anos, no qual, mesmo na ausência de doença cardiovascular ou diabetes
prévio, o risco para mortalidade cardiovascular e geral estava aumentado na presença
SM2. Também na análise do banco de dados americano Second National Health and
Nutrition Examination Survey (NHANES II) compreendendo indivíduos com idades
entre 30 e 74 anos (n =6.255), a SM estava associada a um aumento em duas vezes no
risco de mortalidade cardiovascular e 1,40 por todas as outras causas12.
Ainda, quanto mais precoce a exposição, maior a incidência de eventos
cardiovasculares relacionadas aos componentes da SM. Um estudo apontou que o
diagnóstico de SM na infância aumenta a chance de um evento cardiovascular na vida
adulta em 14,6 vezes quando comparado à criança não exposta13. Na análise das
coortes Bogalusa Heart Study e Cardiovascular Risk in Young Finns Study foi
observado que a presença da SM aumentou o risco para DM2 e aterosclerose
3
subclínica na vida adulta, em 2 a 3 vezes no primeiro estudo, e em, aproximadamente,
2 vezes no último14.
Uma revisão sistemática rastreou todos os estudos que referenciassem Gerald
Reaven1, até o ano de 2005, e o risco para incidência de eventos cardiovasculares
encontrados foi 78% maior naqueles indivíduos com fenótipo para SM15. Mais
recentemente, em outra revisão, a SM esteve associada com um aumento de 2 vezes
no risco para doença cardiovascular, mortalidade cardiovascular, infarto agudo do
miocárdio (IAM) e acidente vascular cerebral (AVC), seguida por um aumento de 1,5
vezes no risco de mortalidade por todas as outras causas. O alto risco para morbidade
e mortalidade cardiovascular em pacientes com SM persistiu mesmo na ausência de
DM216. No intuito de ratificar esta associação, um grupo da Europa Ocidental aplicou
o escore de Framingham em 1.349 indivíduos para predizer o risco de doença arterial
coronariana. O grupo com SM, definido por 3 critérios diagnósticos diferentes,
apresentou sempre maior risco, independente da definição utilizado 17.
1.3 EPIDEMIOLOGIA
A SM tem apresentado crescente prevalência. Pela análise do banco de dados
representativo da população americana (NHANES), compreendendo o período entre
1988 a 1994, a prevalência de SM em indivíduos com idade igual ou maior de 20 anos
(n=8.814) foi de 23,7%, usando critérios do NCEP6; no período entre 1999 e 2002
(n=3.601) a prevalência foi de 34,6 e 39,1% usando os critério do NCEP revisado e
IDF, respectivamente
18,4
. Em 2002, Earl Ford
18
estimou que aproximadamente 47
milhões de americanos adultos fossem portadores de SM. Na análise realizada por
Mozumdar e Liguori19, no período de 1999 a 2006 (NHANES), as estimativas
atingiram aproximadamente 68 milhões de americanos.
4
Na Europa, um estudo realizado na atenção básica de saúde na Alemanha,
pacientes com idade igual ou superior a 18 anos (n=35.869) apresentaram
prevalências em torno de 28,6%, conforme NCEP revisada
7,20
. Em estudo realizado
em Luxemburgo (Europa Ocidental) a prevalência encontrada também foi de 28%
usado o menor ponto de corte para circunferência da cintura (94 cm para homens e 80
cm para mulheres), enquanto que com valores maiores (102/88) a taxa reduziu para
24,7% 21. Em ambos os estudos a SM foi mais prevalente entre os homens e aumentou
com a idade em ambos os sexos, independente da definição utilizada. Existem
inúmeros estudos internacionais abordando a SM, entretanto os países em
desenvolvimento estão subrepresentados nos dados atuais15. Contraditório a isso, se
observam nestas populações crescente prevalência de obesidade. Dados publicados
pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) mostraram o retrocesso do
estado nutricional em 34 anos de acompanhamento. Na década de 70 a prevalência de
excesso de peso nos adultos era de 18,5% para homens e 28,7% para mulheres; hoje
estão estimados valores de 50,1 e 48,0% entre homens e mulheres, respectivamente. E
a obesidade no mesmo período, mostrou aumentou absoluto de, aproximadamente,
10,0% na população22.
O estudo mais recente de base populacional, realizado no Brasil, ocorreu na
região urbana da cidade de São Carlos, em São Paulo. A SM estava presente em 35,7
e 38,0% segundo critérios revisados da NCEP, e 45,3 e 45,5% pelo IDF, entre homens
e mulheres, respectivamente, numa amostra de 1.116 indivíduos entre 30 e 79 anos.
Mais de 80% dos indivíduos com SM tinham índice de massa corporal (IMC) maior
ou igual a 25 kg/m² 23.
Entre as razões para baixa produção de estudos epidemiológicos sobre SM no
país, destaca-se a extensão territorial, heterogeneidade de raça, cultura e condições
5
socioeconômicas24. Um exemplo da diversidade econômica pôde ser observado na
região sul. A prevalência de SM entre idosos da região em que predominam os setores
de comércio e serviço, e outra, onde as atividades estão voltadas para agricultura e a
pecuária, diferem entre si. Usando os critérios da IDF, a SM foi encontrada em 56,9%
na cidade de Novo Hamburgo, e 35,2% em Marques de Souza 25,26.
1.4 FISIOPATOLOGIA
A etiologia da SM é multifatorial e compreende fatores genéticos e
ambientais. Envolvidos no seu diagnóstico encontram-se os elementos não
controláveis, como a idade11, ação hormonal e estado pré-inflamatório27, e
controláveis, como hábitos alimentares e o sedentarismo28.
Está bem descrito na literatura que o excesso de peso e a obesidade são fatores
de risco independentes para aterosclerose e eventos coronarianos29. O aumento do
tecido adiposo está associado a hipertensão arterial sistêmica30, DM231 e ao
diagnóstico de SM
32-39
, e ainda, tanto a adiposidade geral quanto a abdominal estão
associadas com aumento da mortalidade40.
O tecido adiposo é considerado um órgão endócrino centro das complicações
associadas à obesidade, como dislipidemia, resistência à insulina e DM2. Os
adipócitos, pré adipócitos e macrófagos no tecido adiposo secretam uma gama de
hormônios e citocinas, ou adipocinas, que são peptídeos envolvidos na resposta
imunológica e inflamatória, incluindo as interleucinas (IL-6, IL-8, IL-1) e proteína
quimioatrativa de monócito tipo 1 (MCP-1). Além disso, secreta leptina, hormônio
que regula a ingestão alimentar e o gasto energético 41. O adipócito é uma célula muito
complexa, que sob condições normais está envolvida na síntese de lipídios, produção
de hormônios, armazenamento energético, efeito térmico e secreção de citocinas anti-
6
inflamatórias, IL-10 e adiponectina. Com o aumento das células adiposas há um
recrutamento de macrófagos dentro do tecido dando início ao processo inflamatório42.
E quanto maior a presença de tecido adiposo, maiores níveis de citocinas próinflamatória, IL-6, TNF-α, proteína C-reativa, inibidor do ativador do plasminogênio1 (PAI-1); e menores os níveis de citocinas anti-inflamatórias, como adiponectina43.
O tecido adiposo visceral é considerado mais metabolicamente ativo na SM,
pois secreta maiores níveis de citocinas inflamatórios, como IL-6, IL-8,
angiotensinogênio e PAI-1, dessa forma torna o indivíduo com esse tipo de
distribuição mais suscetível a complicações cardíacas44. A adiposidade visceral é um
marcador de risco metabólico associado à resistência à insulina45, DM246, perfil
lipídico aterogênico
47,48
. Por isso, a presença da obesidade abdominal é um dos mais
importantes fenótipos clínicos da SM 49.
Uma das principais funções da insulina é estimular a captação de glicose pelas
células musculares, evitando aumento no plasma. A glicose é uma molécula
hidrofílica e sua entrada nas células se dá através de dois mecanismos: transporte
ativo sódio-dependente, contra o gradiente de concentração, ou difusão facilitada. Este
último é realizado por meio de proteínas transportadoras (GLUTs) que se localizam
na membrana celular. Os GLUTs estão expressos em diferentes tecidos, sendo o
GLUT4, que é um transportador de glicose dependente de insulina, encontrado nos
músculos (esquelético e cardíaco), tecido adiposo, ou seja, tecidos sensíveis à
insulina. A estimulação celular pela insulina promove a exocitose e a translocação das
vesículas contendo GLUT4 do citoplasma para a membrana plasmática, resultando em
aumento na captação de glicose por essas células50.
O fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e a interleucina-1, estão envolvidos
no apoptose de células  no pâncreas, reduzindo a secreção de insulina e predispondo
7
à hiperglicemia51. O possível elo entre SM e inflamação é a resistência insulínica. A
resistência à insulina refere-se à diminuição da sensibilidade do tecido adiposo, do
músculo e do fígado a ação deste hormônio 52. Com o aumento da massa adiposa,
ocorre um aumento da liberação de ácidos graxos na circulação 53. Como o tecido
adiposo está resistente à insulina, o efeito deste hormônio na diminuição da liberação
de ácidos graxos deste tecido para o sangue está suprimido 1. Mesmo durante o
período absortivo, após uma refeição mista habitual onde a concentração de insulina
plasmática atinge seu pico, a lipólise nos adipócitos não cessa54. Adicionalmente, a
enzima lipase lipoprotéica, responsável pela hidrólise dos triglicerídeos presentes nas
lipoproteínas VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade) e quilomícrons,
principalmente, também se encontra resistente à insulina, portanto com sua atividade
diminuída55. Durante o período pós-prandial, onde esta enzima apresenta um papel
fundamental na depuração de triglicerídeos do plasma, o que se observa é um
aumento ainda maior da lipemia56. Os estímulos à secreção de insulina pelas células 
do pâncreas são inúmeros, principalmente, glicose e ácidos graxos livres. Nos
indivíduos obesos a concentração plasmática de ácidos graxos é elevada e, portanto,
sua disponibilidade para as células  também é estímulo à secreção de insulina, o que
resulta em um aumento das concentrações basais deste hormônio. Em longo prazo,
este processo caracteriza o quadro de resistência à insulina57.
Em relação à influência do ambiente na gênese da SM tem se observado uma
mudança importante nos padrões alimentares em todo o mundo, sobretudo em
culturas que tradicionalmente eram beneficiadas por seus hábitos saudáveis com base
no consumo de peixes, cereais, frutas e vegetais frescos. Em aldeia indígena, foi
encontrada a prevalência de SM de 65,3% entre índios com mais de 40 anos conforme
critério NCEP/ATP III 39,6. E entre nipo-brasileiros residentes da cidade de Bauru, em
8
São Paulo, a SM estava presente em 46,5 a 56,5% da população, conforme critérios
NCEP/ATP III revisados7, utilizando parâmetros de circunferência da cintura
estabelecidos para adultos de origem não asiática e asiática respectivamente58. O
Japanese-Brazilian Diabetes Study Group também mostrou a associação entre hábitos
ocidentais, especialmente alimentação rica em gordura saturada, e a ocorrência de
SM59. A urbanização e estilo de vida sedentário também são caracterizados por um
consumo predominante de alimentos de fácil preparo, industrializados, processados, e
por isso, pobres em fibras, ricos em gorduras aterogênicas, adicionados de
conservantes, açúcares e sódio. Desta forma, qualifica-se um padrão alimentar
associado ao aumento de doenças crônicas inflamatórias como obesidade e SM 60.
1.5 TRATAMENTOS PARA SÍNDROME METABÓLICA
As diretrizes que abordam o manejo dos componentes da SM enfatizam a
modificação no estilo de vida como terapia de primeira escolha, salvo indicação
contrária das diretrizes de prevenção a doenças cardiovasculares, ou quando os
pacientes não conseguem perder peso ou aderir a tratamentos dietéticos 61. Mesmo
naqueles com níveis elevados de proteína C-reativa ou LDL colesterol, a primeira
intervenção sugerida para todos os pacientes com risco cardiovascular deve incluir
prescrição dietética e mudança no estilo de vida, assim como intervenções para cessar
o tabagismo quando presente62. Ainda grupos de estudo reforçam que o padrão
alimentar seguido por redução de peso permanece a base da terapia para a SM
63,64
.A
prevalência da SM foi reduzida quase pela metade após dois anos seguindo a dieta do
Mediterrâneo63, enquanto a incidência da SM foi reduzida em 41% após intervenção
no estilo de vida com dieta pobre em gorduras e exercícios entre os participantes do
Diabetes Prevention Program64.
9
1.5.1 Tratamentos Farmacológicos
As tiazolidinedionas são uma classe de agentes utilizados no tratamento do
DM2. Por meio da ação sobre receptores nucleares intracelulares PPAR gama
(Peroxisome Proliferator Activated Receptor), são fármacos que promovem aumento
da sensibilidade à insulina.
Ao melhorar a captação de glicose periférica, as
tiazolidinedionas reduzem as concentrações plasmáticas de glicose de jejum e pósprandial assim como de ácidos graxos livres e insulina65. Em estudo conduzido por
Esposito e colaboradores66 a prevalência da SM foi reduzida em 30% após 1 ano de
tratamento com rosiglitazona, em pacientes sem diabetes. Observou-se melhoras nos
parâmetros metabólicos, aumento do HDL colesterol, redução dos triglicerídeos e
pressão arterial. Também foram reduzidos parâmetros inflamatórios (proteína Creativa, IL-6, IL-18) e aumentou a adiponectina. Outro estudo avaliou os efeitos da
pioglitazona em curto prazo. Seu uso em pacientes não diabéticos com SM, não
alterou o peso corporal, glicemia, triglicerídeos ou LDL colesterol em 12 semanas. No
entanto, observou-se menor número de partículas pequenas de LDL (mais
aterogênicas), e aumento de níveis de HDL colesterol. Houve também melhoras nos
parâmetros inflamatórios com aumento da adiponectina, redução da resistina e
proteína C-reativa67.
No entanto, evidências associaram o uso da rosiglitazona ao risco aumentado
de IAM, insuficiência cardíaca, AVC e outros eventos cardiovasculares
68,69
. Em
2010, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) cancelou o registro do
medicamento que tinha a substância como princípio-ativo, alegando que os riscos da
utilização do medicamento superam seus benefícios. Já a pioglitazona se mostrou
eficaz em aumentar o HDL colesterol, reduzir a ocorrência de IAM, fatal e não fatal,
10
síndrome coronariana aguda70 e AVC71 em pacientes diabéticos de alto risco72. Em
recente estudo, a pioglitazona reduziu em mais de 70% desenvolvimento de diabetes
em pacientes com tolerância diminuída à glicose73. Entretanto seu uso está associado
ao aumento de peso, retenção de líquidos, edema e piora do quadro de insuficiência
cardíaca 74,75.
Considerando a dislipidemia, as estatinas são consideradas fármacos de
primeira escolha no tratamento da SM. Agem inibindo a enzima 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima (HMG-CoA redutase), deste modo reduzindo a síntese de
colesterol e aumentando a expressão hepática dos receptores da LDL e,
consequentemente, a captação dele pela VLDL pelo hepatócito. Além disso, bloqueia
a síntese hepática de triglicerídeos, diminui colesterol total, fração LDL e aumenta o
HDL colesterol76.
No ensaio JUPITER (Justification for the Use of statins in Primary
prevention: an International Trial Evaluating Rosuvastatin) a rosuvastatina foi
avaliada na prevenção primária, redução na incidência de eventos cardiovasculares
maiores (IAM, AVC, revascularização, hospitalização por angina instável),
mortalidade geral e cardiovascular, em indivíduos saudáveis com proteína C-reativa
elevada e LDL colesterol abaixo do limiar estabelecido pelas diretrizes para
tratamento, menor de 130 mg/dL6. O grupo que recebeu a rosuvastatina, comparado
com o placebo, após 1 ano, reduziu o LDL colesterol em 50% (diferença média de 47
mg/dL) e proteína C-reativa em 37%. Não houve aumento nos níveis de glicemia ou
glicosúria durante o acompanhamento, mas pequenos aumentos nos valores de
hemoglobina glicada (5,9 versus 5,8, p=0,001) e relatos médicos de diabetes (270
versus 216, p=0,01) foram observados. Os riscos entre os pacientes com glicemia de
jejum alterada e DM2 são IAM, AVC e morte vascular, o que de fato foram reduzidos
11
com a rosuvastatina
62,77
. Em meta análise foi avaliado o uso da estatina e
desenvolvimento de diabetes, para tal foram selecionados 13 ensaios com estatina
envolvendo 91.140 participantes, o risco de desenvolver diabetes foi 9% (odds ratio
de 1,09) mais alto com uso da estatina durante um acompanhamento médio de 4 anos.
O desenvolvimento de diabetes no uso da estatina foi maior entre os indivíduos com
maior idade. A terapia com estatinas está associada a um risco ligeiramente
aumentado no desenvolvimento de diabetes, mas o risco é baixo, e é superado pelos
benefícios cardiovasculares em curto e médio prazo
78
. Para investigar se esta
incidência estava associada à intensidade do tratamento/dose da estatina, foram
avaliados 5 estudos com 32.752 indivíduos sem diabetes no ingresso do estudo. Os
participantes que receberam terapia intensiva apresentaram um odds ratio de 1,12 e
0,84 para incidência de diabetes e eventos cardiovasculares respectivamente,
comparados com a dose moderada. Esta revisão sistemática seguida por meta-análise
demonstrou que o aumento da incidência de diabetes com terapia de estatina foi dosedependente 79.
A diacereína é um anti-inflamatório utilizado no tratamento de osteoartrose80
que inibe a síntese de citocinas inflamatórias, tais como a IL-1 e TNF-α81. Tem-se
hipotetizado que o tratamento com tal fármaco possa atenuar o processo inflamatório
observado em doenças metabólicas. Em estudo randomizado duplo cego, 20 pacientes
diabéticos tipo 2 e com excesso de peso receberam diacereína 50 mg uma vez ao dia
na primeira quinzena e duas vezes ao dia nos 45 dias seguintes. No final de dois
meses do tratamento, houve diminuições significativas na glicemia de jejum,
hemoglobina glicada, TNF- e IL-1, e um aumento na secreção de insulina após
administração de diacereína
82
. No entanto, em ensaio piloto conduzido por Joo e
12
colaboradores83 não foram encontrado efeitos adicionais nos parâmetros inflamatórios
ou redução de peso com o uso do fármaco com mesma dose por 12 semanas.
1.5.2 Tratamentos Não Farmacológicos
A adoção de um padrão alimentar saudável, caracterizado pelo consumo de
frutas e verduras frescas, de forma a preservar vitaminas e minerais, laticínios
desnatados e carnes brancas, reduzindo o consumo de ácidos graxos saturados, com
acréscimo de ácidos graxos insaturados, através de frutos oleaginosos e óleos
vegetais, tem sido associado com um menor risco para desenvolvimento de doenças
crônicas60. Alguns estudos mostraram que modificações no estilo de vida podem
prevenir ou postergar o aparecimento destas condições mesmo em grupos de alto
risco, como foi observado por Tuomilehto e colaboradores84 num grupo de indivíduos
obesos com tolerância diminuída à glicose. Através da prática de atividade física,
consumo de fibras alimentares aumentadas, e redução dietética de gordura total e
saturada foi possível alcançar a prevenção primária do diabetes em 523 indivíduos.
Apesar de pequenas alterações no peso corporal, em 4 anos de acompanhamento a
incidência cumulativa de diabetes foi de 11% no grupo que aderiu ao programa versus
23% no controle. Num segundo momento, confrontou-se a modificação no estilo de
vida à metformina. Foram randomizados 3.234 indivíduos e a incidência cumulativa
de diabetes em 3 anos foi de 28,9, 21,7 e 14,4% no grupo placebo, metformin e
programa com reeducação alimentar e exercícios respectivamente. Este último
aconteceu mediante palestras sobre alimentação saudável e exercícios, dieta
hipocalórica e de baixa gordura para redução de pelo menos 7% do peso corporal
inicial, e no mínimo 150 minutos de caminhadas por semana85.
13
Em revisão sistemática e meta-análise Esposito e colaboradores86 observaram
que a adesão a uma dieta saudável rica em frutas e vegetal, grão integrais, peixe, e
reduzida em carne vermelha, alimentos processados, bebidas adoçadas e alimentos
ricos em amido foi associado com redução do risco de desenvolvimento de DM2, com
HR de -0,39 (IC 95% -0.54 a -0.24).
Em uma população de nipo-brasileiros com elevada prevalência de SM, um
programa de modificação no estilo de vida através de consultas nutricionais e
estímulo à prática de atividade física, resultou, após dois anos, em reduções na
circunferência da cintura, pressão arterial, colesterol total e LDL, mas também foi
observada redução no HDL colesterol. Este último pôde ser explicado pela redução no
consumo de ácidos graxos monoinsaturados, e uso de medicações (fibratos e ácido
nicotínico), visto que era uma população com alta prevalência de indivíduos com
dislipidemia. Ainda, os resultados podem estar interligados às limitações da
ferramenta utilizada para registro alimentar, o recordatório de 24 horas, em virtude do
viés de memória ou sub-relatos de ingestão alimentar 87.
A dieta do Mediterrâneo tem mostrado efeitos benéficos sobre os fatores de
riscos cardiovasculares e DM2. O ensaio clínico randomizado multicêntrico
PREDIMED (The Prevención con Dieta Mediterránea) teve como objetivo avaliar a
eficácia da dieta do Mediterrâneo na prevenção primária de eventos cardiovasculares
(morte cardiovascular, IAM e AVC) como desfecho principal, e secundário,
mortalidade por qualquer causa, incidência de insuficiência cardíaca, DM, demência e
alguns tipos de cânceres. Os participantes foram de ambos os sexos, adultos, sem
doença cardiovascular prévia, mas com fatores de risco cardiovascular. Neste estudo,
três intervenções dietéticas são comparadas, a dieta do Mediterrâneo com azeite de
oliva virgem, a dieta do Mediterrâneo com frutos oleaginosos (30 gramas por dia, rico
14
em ácidos graxos mono e polinsaturados), e a dieta pobre em gordura (orientação
padrão da American Heart Association)88.
Em análise preliminar do Predimed 89 as intervenções dietéticas num grupo de
772 indivíduos por três meses foram descritas. Comparando com a dieta pobre em
gordura, os indivíduos que participaram dos grupos das dietas do Mediterrâneo
apresentaram diminuição da pressão arterial, e da glicemia, além de melhora da
sensibilidade insulínica e aumento nos níveis de HDL colesterol. Num seguimento de
4 anos, foi possível observar que a incidência de DM2 foi reduzida em 52% com esta
dieta90. Apesar dos resultados promissores, a influência motivacional deve ser
considerada, visto que a educação nutricional foi mais intensa nos grupos que
receberam a dieta do Mediterrâneo.
Abordagens não farmacológicas requerem que a implementação e manutenção
de mudanças necessárias na dieta tenham configuração de “vida real”, o que pode ser
um desafio. No entanto, pequenas intervenções no estilo de vida, incluindo a dieta,
não devem ser desvalorizadas e substituídas pelo uso intensivo de fármacos.
Alimentação saudável pode ajudar as pessoas a viver mais anos sem DM2. Ainda, a
intervenção precoce nos fatores de risco identificáveis na infância e adolescência,
como foi visto por Magnussen e colaboradores14 que mostraram que o IMC,
ferramenta simples, é um preditor de SM na vida adulta. É provável que seja mais
relevante identificar alterações metabólicas a buscar pelo diagnóstico em si38. A
substituição de planos resolutivos e assistências por medidas preventivas, incentivos a
hábitos de vida saudável, nutrição adequada e prática de atividade física regular
poderiam ajudar a retardar ou impedir a progressão da SM para DM2, doenças
cardiovasculares e outras complicações. E com isso conter a epidemia atual marcada
15
por doenças crônicas degenerativas,
hospitalização na vida adulta35-36.
que exigem tratamentos onerosos e
16
2 MODELO ANIMAL DE SÍNDROME METABÓLICA
Na tentativa de desenvolver obesidade em animais experimentais e permitir o
estudo desta condição, diversos modelos experimentais de obesidade têm sido
desenvolvidos53.
Alguns modelos experimentais de SM são desenvolvidos através da mudança
no padrão dietético. A sobrecarga de frutose acrescida à ração ou água mostrou
promover aumento da pressão arterial91 e de triglicerídeos séricos92, e ainda, causar
resistência à insulina93 quando administrada em roedores.
Foi observado em
camundongos que o aumento da pressão arterial é resultado da modulação simpática,
pelo aumento da componente espectral de baixa frequência (LF) da variabilidade da
pressão arterial sistólica, mostrando assim o predomínio do sistema nervoso simpático
(SNS)94. Em relação aos modelos genéticos de obesidade e DM2, um dos primeiros
modelos utilizados para estudo do DM foram os camundongos (C57BL/6J) ob/ob, que
contêm uma mutação no cromossomo 6 do gene que expressa a leptina95,
96
. A
ausência de leptina faz com que este camundongo seja hiperfágico, diabético e
obeso97. Ao contrário dos seres humanos com SM, estes animais mostraram redução
da pressão arterial98 e não desenvolveram dislipidemia, mesmo após a idade de 36
semanas99. Esses modelos são úteis na avaliação de mecanismos moleculares
específicos envolvidos na gênese da obesidade, entretanto a SM não é uma desordem
monogênica e abrange uma cascata de sinalizações muito mais complexas100.
Um dos modelos utilizados de obesidade é aquele que induz a condição
através da administração subcutânea de glutamato monossódico (MSG) em ratos
Wistar. O MSG é um aminoácido neuroexcitatório que é lesivo ao sistema nervoso
central em ratos. Ao ser administrado no período neonatal em roedores, quando a
17
barreira hematoencefálica não está totalmente desenvolvida, o MSG mostrou resultar
numa degeneração aguda do núcleo arqueado do hipotálamo levando a alterações
neuroendócrinas e metabólicas como obesidade, disfunção sexual, parada no
crescimento, déficit comportamental
101,102
. Ainda, os animais obesos deste modelo
desenvolvem maior deposição de tecido adiposo na região central, possivelmente em
virtude de hipercortisolismo, diminuição da lipólise no tecido adiposo, aumento da
lipogênese no fígado e da atividade da lipase lipoprotéica103.
Considerando-se a hipertensão arterial, os ratos espontaneamente hipertensos
(SHR) são considerados um dos modelos que mais se assemelham à hipertensão
arterial que ocorre em humanos. Esses animais apresentam, ainda, hipertrofia
ventricular esquerda, aumento da adiposidade visceral periepididimal
resistência insulínica, atribuída à hiperatividade adrenérgica
104,105
e
106,107
. No entanto, esses
animais não desenvolvem dislipidemia ou alterações glicêmicas.
A associação da indução de obesidade com MSG ao modelo animal de
hipertensão citado (SHR) já foi estudada, no entanto os efeitos sobre a pressão arterial
são inconclusivos visto que há relatos de que os animais tornam-se menos hipertensos
do que os SHR que não foram injetados com MSG
108-110
. Nosso grupo recentemente
vem trabalhando com este modelo, e dados preliminares sugerem que o fenótipo
alcançado é efetivamente muito semelhante ao da SM que ocorre em humanos111.
Dessa forma, o modelo de obesidade induzido por MSG em animais SHR
demonstra-se satisfatório no que tange ao fenótipo múltiplo que a SM manifesta
clinicamente (obesidade visceral, hipertensão arterial, dislipidemia e resistência
insulínica). Estes são animais facilmente obtidos em nosso meio, tanto pelo alcance
financeiro, quanto pela oferta.
18
Ainda não há um fármaco específico que atenda a rede de sinais e sintomas
que a SM manifesta, especialmente pelos questionamentos que cercam a sua
fisiopatologia. A terapêutica é baseada em associações de fármacos e árdua manobra
entre seus efeitos colaterais. Neste cenário, prosseguem ensaios na busca por
alternativas que reduzam os efeitos desta condição e impeçam ou retardem sua
evolução,
sejam
elas
intervenções
comportamentais ou tratamentos auxiliares.
farmacológicas,
não
farmacológicas,
19
3 CAPSAICINA
As pesquisas apontam para o uso acessório de substâncias presentes nos
alimentos na prevenção, evolução ou tratamento de condições associadas à
obesidade42. Essas substâncias, denominadas nutracêuticos, podem ser consideradas
um alimento ou parte dele, contudo deve proporcionar algum benefício à saúde 112.
Um dos alimentos com conhecidas alegações funcionais é o fruto pimenta
vermelha do gênero Capsicum que pertence à família das Solanáceas. Nela são
encontradas elevadas concentrações de capsaicinóides que são as substâncias
nutracêuticas que diferem os frutos pela picância. Os capsaicinóides mais abundantes
na pimenta são a capsaicina e dihidrocapsaicina. A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6nonenamide) consiste em três secções principais, uma cadeia lipofílica alquila em
uma extremidade, ligado através de uma ligação acil-amida ao grupo vanilil contendo
o grupo polar hidroxila na outra extremidade da molécula113.
As pimentas do gênero Capsicum são amplamente consumidas em vários
países, em especial nos países do continente asiático e na América do Norte. O
consumo estimado por dia por pessoa, em gramas, na Índia é de 2,5, na Tailândia de
5,0, na Coréia 9,0 e no México 20,0, ou o equivalente a uma pimenta. A ingestão
diária de capsaicinóides nesses países foi estimada em 25-200 mg/pessoa/dia. Nos
EUA e Europa a ingestão diária máxima de capsaicina foi estimada em cerca de
1,5mg/pessoa/dia114, 115.
O uso tópico da capsaicina na forma de cremes vem de longa data. Seu uso
analgésico está associado diretamente à ação sobre a substância P, principal
mensageiro químico dos impulsos da dor periférica para o sistema nervoso central113.
A depleção da substância P possivelmente explica as respostas anti-inflamatórias
20
produzidas pelo uso da capsaicina em experimentos animais, visto que este
neuropeptídio parece exibir um potencial pró-inflamatório116. Assim, foi observado
em ratos que o uso da capsaicina melhorou a resposta inflamatória produzida pela
artrite117. As lesões gástricas produzidas por uso de etanol foram atenuadas quando
tratadas previamente com a capsaicina118. No tecido adiposo de camundongos obesos
tratados com capsaicina, os níveis de IL-6 e MCP-1 diminuíram, enquanto a
expressão de adiponectina aumentou 119, 120. Em modelo animal de inflamação aguda,
o pré-tratamento com extrato de pimenta reduziu a migração de leucócitos e
neutrófilos, o volume de exsudato e a concentração de citocinas pró-inflamatórias
TNF- e IL-1121. Desde último experimento, não pode ser excluída a possibilidade
dos efeitos benéficos do extrato de pimenta ser atribuídos ao potencial antioxidante do
fruto e não a ação depletora da substância P pela capsaicina.
Outros mecanismos de ação da capsaicina sobre os componentes relacionados
à SM, isoladamente ou em conjunto, instigam os investigadores na área da saúde, pois
os resultados parecem promissores, em especial, no campo de atenção da atualidade, a
obesidade122. Entretanto, não há evidências que suportem seu uso indiscriminado. A
inconsistência dos resultados nestes experimentos se deve ao uso de diferentes doses e
apresentações da capsaicina, bem como diferentes vias de administração e duração
dos tratamentos. Ainda, os mecanismos de ação não estão plenamente esclarecidos na
literatura existente.
3.1 AÇÃO TERMOGÊNICA E O EFEITO SOBRE A PRESSÃO
ARTERIAL
Ação termogênica designada à capsaicina está fundamentada no efeito térmico
que ela produz no organismo além do gasto energético essencial para realização de
21
processos vitais de respiração, digestão, absorção e armazenamento
123
. Este efeito “a
mais” é chamado de termogênese facultativa ou adaptativa e ocorre por meio de
estimulação do SNS. Tal efeito foi demonstrado por análise espectral em experimento
com mulheres. Após consumirem refeições acrescidas de pimentas foram avaliadas,
no período de 24 horas, e apresentaram aumento da razão entre os componentes de
baixa (Low Frequency) e alta freqüência (High Frequency) da variabilidade da
freqüência cardíaca, ou seja, aumento do balanço simpatovagal 124.
A hiperatividade simpática causa aumento imediato no metabolismo celular
com liberação de norepinefrina e epinefrina no sangue. Isso pôde ser observado em
experimento com a capsaicina administrada via intraperitoneal em ratos125; e
confirmado ao ser combinada ao beta bloqueador (propanolol) que reduziu a resposta
termogênica da capsaicina em 50%126. Ainda, ao final de um treinamento físico de
resistência, os ratos que receberam a substância administrada duas horas antes
apresentaram níveis séricos aumentados de catecolaminas e ácidos graxos livres 127.
Entretanto, em indivíduos adultos jovens praticantes de atividade física, a ingestão de
cápsula contendo capsaicina não alterou as concentrações plasmáticas de epinefrina e
norepinefrina, mas aumentou dos níveis de ácidos graxos livres no plasma128.
A descarga adrenérgica iniciada pela ativação simpática estimula a
glicogenólise, gliconeogênese e lipólise. Por esse mecanismo a capsaicina mostrou
aumentar a oxidação de lipídeos com respostas pós-prandial de aumento consumo de
oxigênio e redução do quociente respiratório 129, também encontrados após 13 semanas
do uso concomitante da substância130.
Pelo controle dos vasos sangüíneos periféricos, o SNS é capaz de regular, por
curtos períodos de tempo, o débito cardíaco e a pressão arterial; a constrição das veias
e dos reservatórios venosos aumenta o débito cardíaco, e a constrição das arteríolas
22
aumenta a resistência periférica, o que eleva a pressão arterial. Tal estimulação produz
vasoconstrição dos vasos sangüíneos renais e diminui, de forma muito acentuada, a
produção de urina. Esse é um importante mecanismo para a regulação do volume
sangüíneo e da pressão arterial, pois quando é necessária a estimulação simpática
pode causar a retenção de líquidos na circulação, aumentando o volume sangüíneo e o
retorno venoso para o coração, ao mesmo tempo. Esses efeitos, por período de horas
ou de dias, aumentam o débito cardíaco e a pressão arterial131.
O grupo de Belza e colaboradores132, ao avaliar o efeito da capsaicina
combinada com outros ingredientes, considerados também termogênicos como
cafeína e o chá verde não observou alterações hemodinâmicas com seu uso por 8
semanas. Contudo, este mesmo grupo avaliou pontualmente o composto em
indivíduos normotensos e foi observado um aumento da pressão arterial sistólica e
diastólica e freqüência cardíaca em comparação ao placebo 126.
O efeito da capsaicina sobre a pressão arterial ainda parece contraditório.
Entre os mecanimos subjacentes à estimulação simpática encontra-se o fato da
capsaicina ser um análogo do receptor potencial transitório vanilóide tipo 1 (TRVP1).
A capsaicina se liga aos receptores específicos vanilóides tipo1 (VR-1) na membrana
dos neurônios sensoriais, levando à ativação de um canal cátion e induzindo
despolarização e influxo de Ca2 +. A despolarização de nociceptores polimodais
(fibras C, lentas) causa a liberação neuronal periférica de neuropeptídios. Estes são
neurotransmissores presentes em todo o sistema nervoso e secretados pelas fibras
nervosas cutâneas113.
A substância P libera óxido nítrico, exerce vasodilatação, mas também tem
ação pró-inflamatória como já foi mencionado, aumenta a expressão de moléculas de
adesão, macrófagos, citocinas pró-inflamatórias, e prostaglandinas. O peptídeo
23
relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), também é vasodilatador, atua de forma
pró-inflamatória, potencializa a formação de edema induzida por IL-1 e IL-8; e
antiinflamatória, diminui a produção de IL-2 e a expressão de TNF-, TNF- e
Interferon gama133.
Foi relatado que ativação da TRPV1 pode afetar a diferenciação dos préadipócitos134. Os pré-adipócitos são células menores, mais sensíveis à ação da insulina
que produzem adipocitocinas menos inflamatórias e mais adiponectina135. Em
concordância, na obesidade, se observa a diminuição da expressão TRPV-1 no tecido
adiposo136. Além disso, TRPV1 tem efeito sobre a pressão arterial, e seu agonista
capsaicina, apresentou ambos vasorelaxamento e vasoconstrição 137, 138.
Em ratos Wistar com dieta hiperssódica a associação a capsaicina por 4
semanas aumentou pressão arterial média. Os níveis plasmáticos de CGRP não
apresentaram diferenças entre os grupos, no entanto, no gânglio da raiz dorsal, os
níveis foram menores naqueles pré-tratados com capsaicina. O tratamento neonatal
com capsaicina resultou na degeneração do nervo aferente o que levou ao aumento da
pressão arterial139. Tal mecanismo é sustentado por Patanè e colaboradores que
relataram dois casos hipertensivos atribuídos ao consumo excessivo de pimenta e a
capacidade da capsaicina de despolarizar as fibras C e assim provocar depleção de
CGRP (vasodilatadora) e induzir a vasoconstrição
140-142
. Entretanto, em cães foi
observado que aumento na pressão arterial média ocorre nos 2 minutos iniciais de
infusão de capsaicina, segue por um pico de hipertensivo ao final da infusão de 15
minutos e cerca de 5 minutos após o término da infusão, retorna aos valores basais 115.
A combinação da capsaicina à isoflavona, fitoestrógeno, por 5 meses reduziu
pressão arterial proporcional ao tempo de tratamento nos indivíduos hipertensos com
alopécia. No entanto, no grupo de normotensos não houve alterações nos níveis
24
pressóricos. Os níveis séricos de IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina
tipo 1) aumentaram após o tratamento com associação de capsaicina e isoflavona.
Administração combinada dessas substâncias pode ter reduzido a pressão arterial
através da vasodilatação pela ativação TRPV-1, tento em vista que a IGF-1 sensibiliza
esse canal143. Por isto, que é possível que a ativação dos neurônios sensoriais pela
IGF-1 possa ter aumentado a produção de oxido nítrico e prostaglandinas e assim
contribuído para reduzir a pressão arterial nos hipertensos144.
3.2. METABOLISMO DOS SUBSTRATOS: LIPÍDIOS E GLICOSE
Em adultos com sobrepeso o consumo regular de pimenta vermelha (30g/dia),
por 4 semanas, não provocou alteração dos níveis plasmáticos de lipídeos, mas
redução do potencial de oxidação de LDL in vitro
145
. Este efeito foi atribuído à
provável ação antioxidante da pimenta vermelha, que é conhecida por ser rica em
vitamina C e carotenóides. O mesmo grupo avaliou a resposta glicêmica após 8
semanas e não encontrou alterações, mas os níveis de insulina pós-prandial foram
reduzidos, e o efeito da pimenta sobre a quantidade de insulina foi mais pronunciada
quanto maior o peso do indivíduo 146. É possível que a capsaicina melhore a
sensibilidade à insulina em resposta secundária à ação sobre o aumento da oxidação
de lípideos e termogênese induzida pela dieta. Isto explicaria sua ação ser mais
evidente quanto maior a quantidade de gordura corporal. Entretanto, no estudo com
camundongos obesos tratados com capsaicina a melhor resposta à ação da insulina foi
justificada por maiores níveis de expressão, no tecido adiposo, de receptor de insulina
1 (IRS-1) e GLUT4 120.
Foi observado em coelhos, que receberam dieta hipercolesterolêmica acrescida
de pimenta vermelha por 12 semanas, melhora do perfil lipídico e menor conteúdo
25
lipídico na camada íntima da artéria aorta147. Em ratos Wistar, com mesma dieta, o
acréscimo de capsaicina por 8 semanas reduziu os níveis plasmáticos de colesterol
total e LDL148. O coelho é considerado um bom modelo animal para estudo da
aterosclerose, também por esse motivo a resposta pode ter sido mais acentuada. Ainda
o tempo de administração, foi relativamente longo comparado aos outros estudos. No
entanto, não foi contabilizada a ingestão de líquidos ou ração entre os grupos nos
estudos.
Em outro estudo, in vitro, o nível de colesterol total da cultura de células
musculares lisas vasculares da aorta tóracida de camundongos foi reduzido pela
administração de capsaicina149. In vivo, camundongos knockout para apolipoproteína
E (ApoE-/-) que receberam ração rica em gordura acrescida de capsaicina por 24
semanas reduziram o armazenamento lipídico e lesões ateroscleróticas no seio aórtico
e na aorta toracoabdominal em comparação aos animais que receberam a ração sem
capsaicina. Ainda, ocorreram menores níveis de triglicerídeos e colesterol total. O que
foi observado neste estudo é que a ativação TRPV1, análogo a capsaicina, aumenta a
expressão ABCA1 (ATP binding cassette transporter A1)149. A apolipoproteína A-I,
pobre em lipídeos, uma vez formada capta o colesterol celular através do ABCA-1,
dando início à formação de uma nova partícula de HDL150 o que explicaria as
excelentes respostas do uso da capsaicina no metabolismo lipídico destes animais.
26
4 JUSTIFICATIVA
Considerando o exposto, existem lacunas científicas que despertam para uma
nova experiência. Não há dados sólidos sobre o efeito da capsaicina na estimulação do
SNS e ação sobre a pressão arterial. Os efeitos da capsaicina sobre o sistema nervoso
autônomo foram previamente estudados somente de forma aguda. Também é
desconhecida a ação da capsaicina sobre a sensibilidade barorreflexa espontânea e
decorrente da ação de agentes farmacológicos. Além disso, não foram avaliados os
efeitos da capsaicina sobre o metabolismo de lipídeos e carboidratos em um modelo
animal que mimetize a hipertensão, resistência à insulina, dislipidemia e o processo
inflamatório decorrente do quadro da SM.
27
5 HIPÓTESES
H0: A suplementação com capsaicina sintética não interfere no metabolismo e
controle cardiovascular de animais em modelo de síndrome metabólica.
H1: A suplementação com capsaicina sintética interfere no metabolismo e
controle cardiovascular de animais em modelo de síndrome metabólica.
28
6 OBJETIVOS
6.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos metabólicos e cardiovasculares da suplementação com
capsaicina sintética em um modelo animal de síndrome metabólica.
6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar peso corporal, índice de Lee, glicemia, resistência à insulina e perfil
lipídico (colesterol total, colesterol HDL e LDL, triglicerídeos) em modelo animal de
SM com dieta regular e submetido a tratamento com capsaicina em duas diferentes
doses (0,5 e 1,0 mg /kg/dia) por 2 semanas.
Avaliar a quantidade de alimento e água ingeridos, assim como a diurese, em
24 horas, em modelo animal de SM com dieta regular e submetido a tratamento com
capsaicina em duas diferentes doses (0,5 e 1,0 mg /kg/dia) ao final de 2 semanas.
Avaliar os efeitos cardiovasculares (pressão arterial, freqüência cardíaca,
controle autonômico, sensibilidade baroreflexa espontânea) em modelo animal de SM
com dieta regular e submetido a tratamento com capsaicina em duas diferentes doses
(0,5 e 1,0 mg /kg/dia) por 2 semanas.
Avaliar a espessura da parede e expressão imuno-histoquímica de CD 68 da
artéria aorta torácica em modelo animal de SM com dieta regular e submetido a
tratamento com capsaicina em duas diferentes doses (0,5 e 1,0 mg /kg/dia) por 2
semanas.
29
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British Journal of Nutrition
Original Article
Capsaicin-induced metabolic and cardiovascular effects in an animal model of
metabolic syndrome
Tremarin CS1, Casalli KR1, Meurer L2, Schaan BD1,2
1
Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia,
Rio Grande do Sul, Brazil
2
Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Brazil
Correspondence Address:
Beatriz D’Agord Schaan
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul
Av. Princesa Isabel, 395. Bairro Santana, 90620 001 Porto Alegre, RS, Brazil
Tel.: +55 51 3230.3600, ramal 3636 / 3757 – Fax: +55 51 3230.3600, ramal3757
e-mail: [email protected] / [email protected]
Camila da Silva Tremarin – [email protected]
48
Abstract
Metabolic syndrome (MS) is associated with increased cardiovascular
mortality, but there is no single treatment. Studies have shown that capsaicin (red
pepper) may be useful as a nutraceutical, ameliorating metabolic profile and
cardiovascular function. The aim of this study is to investigate the cardiovascular and
metabolic effects of orally administered capsaicin to rats with MS. Neonate
spontaneously hypertensive rats were injected with monosodium glutamate and
submitted to one of 3 treatments, by oral gavage for 14 days, between 27-30 weeks:
CAP05 or CAP1 (synthetic capsaicin powder diluted in vehicle, 0.5 mg/kg or 1 mg/kg
b.w) and C (vehicle). Lee index, lipid/metabolic profile, full cardiovascular evaluation
with the rats conscious, including arterial pressure (AP) and heart rate (HR)
variability, were evaluated, and also aorta thickness (H&E staining) and
monocytes/macrophage immunostaining (CD-68 antibody). Weight, Lee index, lipid
and metabolic parameters were similar between groups, as well as AP and HR and
aorta thickness. Capsaicin determined HR variability improvement (16.0 ± 9.0, 31.0 ±
28.2, and 31.3 ± 19.0 ms², for C, CAP05 and CAP1, respectively, P=0.003), increased
vascular sympathetic drive (LF component of systolic AP variability: 3.3 ± 2.8, 8.2 ±
7.7, and 12.1 ± 8.8 mmHg², for C, CAP05 and CAP1, respectively, P<0.001) and
increased alpha index (spontaneous baroreflex sensitivity). Our data show that
capsaicin did not improve lipid and glucose abnormalities in rats with MS. However,
beneficial cardiovascular effects were obtained with this nutraceutical.
Key words: Metabolic Syndrome X; Capsaicin; Cholesterol; Blood Glucose;
Autonomic Nervous System; Blood Pressure
49
Introduction
Metabolic syndrome (MS) is highly prevalent condition where multiple
cardiovascular risk factors aggregate, which is associated with increases in
cardiovascular morbidity and mortality
(1)
. The subcutaneous administration of
monosodium glutamate (MSG) in neonate spontaneously-hypertensive rats (SHR) is
an animal model that presents similar phenotype to MS that occurs in humans
(2)
,
making it useful for its study.
Due to the lack of a single drug for treating MS, there is a growing interest in
the study of alternative substances, such as nutraceuticals. Capsaicin (8-methyl-nvanillyl-6-nonenamida), the pungent principle of the hot red pepper, has shown
multiple health-related benefits in both animal studies and human trials
benefits could be accounted for its anti-inflammatory properties
dietary-induced thermogenesis
(4)
and improvement in lipid profile
(5)
(6)
(3, 4)
. These
, increases in
. However, the
acute and chronic effects of capsaicin on glycemia and insulin resistance, main
characteristics of MS, were not studied yet. Blood pressure reduction was related to its
use (7), but some studies observed high blood pressure effects (8).
Considering these controversies and that most studies evaluated capsaicin after
acutely administered, it is not possible to recommend the use of capsaicin. The aim of
this study was to investigate metabolic and cardiovascular changes induced by chronic
oral administration of capsaicin to an animal model of MS.
50
Experimental methods
The investigation followed the ethical rules established by the Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals
research
(10)
(9)
, and the ARRIVE guidelines on animal
. The study was approved by the Research Ethics Committee of our
Institution.
Animals
Neonate male SHR (n=55) were submitted to the subcutaneous administration
of MSG (5mg/g/day, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) diluted in saline
solution (0.9% NaCl) for 9 consecutive days; 21 days after, the animals were weaned
and placed into plastic boxes, 4 animals per box. Animals were bred and kept under
standard laboratory animal housing conditions at the Animal Production and Research
Unit at our Institutions, receiving standard laboratory chow and tap water ad libitum.
They were exposed to a 12-hour light and 12-hour dark cycle (6 a.m/6 p.m).
At 6 months of age, animals were randomized into controls, which received a
regular diet (C, n = 18); capsaicin low dose, which received a regular diet plus 0.5
mg/kg b.w. capsaicin (CAP05, n = 18) and a capsaicin high dose, which received a
regular diet plus 1mg/kg b.w. of capsaicin (CAP1, n = 19). The capsaicin used was
synthetic, n-vanililnonanamida, its chemical structure similar to pure capsaicin (Sigma
Chemical Co, St. Louis, MO, USA), diluted in 10% ethyl alcohol and administered
daily (2 mL/kg b.w.) for 14 days via orogastric gavage. Controls received the same
amount of alcohol vehicle solution during the same period.
Metabolic evaluation
Weight and the Lee index (cube root of body weight in grams divided by noseto-anus length in centimeters) (11) were evaluated before and after the protocols.
51
At the end of treatment with capsaicin or vehicle, all animals were placed into
individual metabolic cages for 24 hours. In the next morning, an insulin tolerance test
was performed using commercially available regular insulin (Biohulin, Biobrás,
Montes Claros, Brazil). The rats were anesthetized (sodium thiopental i.p.) after 3
hours of food deprivation, and then insulin (0.75 U/kg) was administered into the
penile vein. Six blood glucose measures (Accu-Chek Advantage, Roche, Indianapolis,
IN, USA) were performed: at baseline, and 4, 8, 12, 16, and 20 minutes after insulin
administration. Glycemias were then converted into the natural logarithm (Ln); the
slope was calculated using linear regression [time × Ln (glucose)] and multiplied by
100 to obtain the glucose decay constant rate during the insulin tolerance test (kITT)
per minute (%/min-1) (12).
In the next day, rats were anesthetized (90 mg/kg ketamine and 10 mg/kg
xylazine, i.p.) to implant a catheter filled with heparinized saline into the femoral
artery for direct measurements of arterial pressure. The end of the cannula was
tunneled subcutaneously and exteriorized at the top of the head. Cardiovascular
evaluation was performed 24 h after catheter placement.
Cardiovascular Evaluation
Rats were conscious in their cages and allowed to move freely during the
experiments. The cannula was connected to a transducer (P23Db, Gould-Statham),
and arterial pressure signals were recorded for a 30-minute period by a
microcomputer equipped with an analog-to-digital converter (CODAS, 2Kz, DATAQ
Instruments, USA). The recorded data were analyzed on a beat-to-beat basis to
quantify changes in systolic (SAP), diastolic (DAP) and mean arterial pressure
(MAP), and heart rate (HR).
Assessment of autonomic control - Spectral analysis
52
Time series of pulse intervals (PI, tachograms) and SAP (systograms) were
obtained from arterial pressure records. Stationary fragments with about 300 beats,
coincident in tachogram and systogram, were selected and spectral analysis was
performed using an autoregressive model. The spectral bands for rats (very low
frequency, VLF: 0.0-0.2 Hz, low frequency, LF: 0.2-0.75 Hz, high frequency, HF:
0.75-3.0 Hz) were defined as previous citations (13). Tachogram and systogram spectra
for each stationary fragment were evaluated quantitatively, obtaining values of HR
variability (HRV) and SAP variability (SAPV). Parameters distinguished for their
physiological significance are: the LF/HF index (sympathetic-vagal balance)
(14)
, the
absolute powers of the LF and VLF components of SAPV (vascular sympathetic
modulation and renin-angiotensin system modulation on SAP)
(15)
. Moreover, the
relationship expressed by the root of the ratio between the absolute powers of LF
components of HRV and VPAS (LF alpha index) is known to express spontaneous
baroreflex sensitivity (16).
The animals were again anesthetized with the same amounts of anesthetics
mentioned above. Blood samples were drawn by cardiac puncture after 5 hours of
food deprivation. After centrifugation, the sera were aliquoted and frozen until
assayed for glycemia, triglycerides, cholesterol and HDL-cholesterol concentrations
(enzymatic method; commercial kit Labtest); LDL-cholesterol was calculated using
the Friedewald formula (17).
Immunohistochemistry
Euthanasia was done by exsanguination, the thoracic aorta was removed,
dissected and fixed in formalin, embedded in paraffin. Four-micron sections were
stained with hematoxylin and eosin (H&E). CD-68 monoclonal antibody to
immunostain monocytes/macrophages (Millipore, Barueri, Brazil) at a dilution of
53
1:200 was used. Stains were performed in the Experimental Pathology Unit, Hospital
de Clínicas de Porto Alegre, following a routine protocol (deparaffinization,
rehydration, antigen retrieval, inactivation of endogenous peroxidase and blocking of
nonspecific reactions). Primary antibody was incubated for 12 h at 4°C, followed by
application of the streptavidin-biotin-peroxidase complex (LSAB, Dako Corporation,
Santa Barbara, USA) and revelation with diaminobenzidine (DAB kit, Dako
Corporation, Santa Barbara, USA).
Aorta thickness was evaluated in the H&E sections, using computerized image
analysis (Image-Pro Express). We measured the thickness of the intima and media of
wall assembly of the aorta in pixels for each animal. We also included a SHR (n=4)
and Wistar-Kyoto (WKY, normotensive, non-obese, n=5) group to compare with rats
with MS (n=9).
All data were expressed as the means ± SEM. Data were compared by using
one-way ANOVA or Kruskal-Wallis. Tukey’s post-hoc test or Dunn’s method was
used to detect whether differences existed. The differences between groups were
accepted to be significant at p<0.05.
54
Results
Weight, Lee index and metabolic parameters were not changed by capsaicin
use. These data are shown in Table I.
Hemodynamic parameters and spectral analysis results are show in Figure 1
and in Table II. Mean arterial pressure, systolic and diastolic arterial pressure did not
change by capsaicin treatment, but it caused an improvement in HRV, which was
higher in the group receiving the lower dose of capsaicin (CAP05, Figure 1, panel D).
High dose treatment with capsaicin (CAP1) was associated with an increase in the LF
component of systolic arterial pressure variability, indicating an increment of the
vascular sympathetic drive (Figure 1, panel F); the same happened on the HF
component of SAPV (synchronous with respiratory rate) (Table II). Both groups
receiving capsaicin had an increased alpha index (spontaneous baroreflex sensitivity),
which was more pronounced with higher doses (CAP1) (Figure 1, panel E).
Figure
2
shows
representative
examples
of
the
histology
and
immunohistochemical analyses of WKY rats (panels A and B), SHR (panels C and
D,) and MS (panels E and F). Panels A, C and E show representative examples from
each group of the H&E-stained thoracic aorta tissue section. Panels B, D and F
represent the immunohistochemical expression of CD-68 in the same tissue of
representative examples from each group. The comparison between the groups
showed a higher aortic wall thickness in the SHR (358.8 ± 40.3 pixels) and MS (401.5
± 29.7 pixels) vs. WKY rats (251.4 ± 31.4 pixels), p<0.001. The number of stained
cells with CD-68 was not different between groups [number of positive cells/20
fields: SHR; 21.0 (11.5 – 28.2), MS; 20.0 (8.0 – 30.0) and WKY; 5.0 (4.0 – 6.0), p =
0.188]. There were no differences in aorta wall thickness (358.8 ± 40.3; 365.1 ± 40.0;
55
374.4 ± 40.8 pixels, for C, CAP05 and CAP1, respectively, p= 0.718) and the number
of cells expressed in the immunohistochemical staining CD-68 (number of positive
cells/20 fields: 20.0 (8.0 – 30.0); 17.0 (8.0 – 23.0); 8.0 (4.5 – 25.0) for C, CAP05 and
CAP1, respectively, p = 0.692) between the groups of MS rats that received capsaicin.
56
Discussion
Capsaicin has potential beneficial cardiovascular and metabolic effects which
could be interesting for MS management, but the present results indicated that there
was no benefit from using it for a short period of time on the metabolic parameters
evaluated. However, capsaicin promoted global improvement in cardiovascular
autonomic control, which has well-known impact in better cardiovascular prognosis.
The doses of capsaicin used did not influence food/water intake and weight
during the short period of the experiments, showing that in two weeks, the animals
had good acceptance of the substance, which did not affect their welfare. These results
are consistent with previous findings
(18)
, which showed that even when the
supplement was added to the diet, its pungent flavor did not affect its palatability.
However, mice fed a high-fat diet had their body weight reduced with no change in
food intake
(19)
, suggesting that capsaicin can increase diet-induced thermogenesis, as
showed with acute administration (4).
The lipid profile also did not change by capsaicin use. Studies in dyslipidemic
(6)
or obese mice (19) with capsaicin supplemented to a high-fat diet showed reductions
on serum triglycerides. However, no decrease in plasma cholesterol was observed (20),
as we also showed. In longer-period treatments
(3, 6)
, capsaicin added to a
hypercholesterolemic or high fat diet determined a reduction of serum cholesterol. We
presume there is thermogenic inefficiency in the animal model of MS, in which
capsaicin does not have the same effect on the lipid profile as showed successfully in
others studies. It is possible that in the combination of obesity
(22)
(21)
and hypertension,
an impaired metabolism occurs, because of reduced brown adipose tissue (BAT),
57
responsible for thermogenic activity. Moreover, it is known that this specialized tissue
decreases with age and other authors (3, 18, 20) used younger animals than we did.
No changes were induced by capsaicin on blood glucose levels and insulin
resistance. Other authors showed that capsaicin increased glycemia regardless of
insulin levels, but evaluations were performed acutely during the course of the oral
glucose tolerance test in healthy subjects
(23)
. Similar to our findings, regular
consumption of chili did not change glycemia in humans (24).
An overall improvement in the autonomic control of SAP with increased HRV
and spontaneous baroreflex sensitivity was shown by the spectral analysis. Previous
data showed contrary results, but the animals studied were healthy and assessed after
an acute oral administration of capsaicin, showing increases in HR and LF/HF ratio,
supporting an increase in the sympathetic drive
(25)
. Other acute experiments,
performed in healthy women, showed increased LF/HF ratio after red pepper
ingestion
(4)
. Despite the beneficial effects of chronic treatment with capsaicin on
cardiac autonomic control first shown by us, the sympathovagal balance did not
change, as both groups that received capsaicin showed increased sympathetic
modulation of the vascular tone, which was different only when capsaicin was
administered in high doses.
Although paradoxical effects of improved autonomic modulation and
increased sympathetic vascular modulation were observed, these did not influence
arterial pressure and HR levels, results that are consistent with those presented before
in humans who received red pepper for 4 weeks
(26)
. However, after long periods of
capsaicin treatment, decreased arterial pressure was observed in hypertensive patients
(7)
. These contradictory effects have been reported and they are supported by
capsaicin’s ability to activate an ion channel, a transient potential vanilloid type 1
58
(TRVP1), which controls the endothelial expression of neuropeptides involved in
nitric oxide release
(27)
. These imbalances of neuropeptides possibly explain why the
capsaicin effects on blood pressure showed vasorelaxation in some studies, but
vasoconstriction in others (28, 29).
Rats with MS had higher aorta thickness as compared to non-obese and
normotensive controls, but capsaicin did not change these structural changes, nor
caused inflammation reduction. This negative result is probably related to the short
period of treatment, as other authors reported benefits in mice fed a high fat diet with
capsaicin supplementation for 10 weeks (19). Moreover, capsaicin could be less potent
in reducing the inflammatory processes, as atorvastatin was previously reported to
cause reduction in macrophage infiltration in diabetic rats (30).
We conclude that capsaicin was not able to improve lipid and glucose
abnormalities in an animal model of MS. However, beneficial cardiovascular effects
were obtained with this nutraceutical. It is possible that the cardiovascular system is
adapted to offset the acute increase in the sympathetic drive shown in other studies.
59
Acknowledgements
Research supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) and Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
Conflict of interest
The authors declare that they have no competing interests.
60
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Anti-inflammatory effects of
in
experimental
diabetic
64
Figure legends
Figure 1: Cardiovascular autonomic evaluation by spectral analysis. (A)
Systolic arterial pressure; (B) heart rate; (C) systolic arterial pressure variability; (D)
heart rate variability; (E) spontaneous baroreflex sensibility, related to alpha low
frequency (LF) index (square root of the ratio of absolute LF component of heart rate
variability and systolic arterial pressure variability); (F) LF component of systolic
arterial pressure. C: control (white bars), n=17; CAP05: capsaicin 0.5 mg/kg b.w.
daily (gray bars), n=18; CAP1: capsaicin 1.0 mg/kg b.w. daily (black bars), n=16.
Values presented as mean + SE. *P<0.05 vs. control group. One-way ANOVA,
Dunn's Method.
Figure 2: Histology and immunohistochemistry (Wistar-Kyoto, n=5; SHR,
n=4; SHR injected with MSG, n=9, respectively). A, C and E: Hematoxylin- and
eosin-stained thoracic aorta tissue sections representative of examples of each group.
Red line marks the thickness of the aorta. Original magnification 400x. B, D and F:
Immunohistochemical expression of CD 68 in the same tissue of representative
examples from each group. The arrows indicate the macrophages. Original
magnification 1000x.
65
Tables
Table I – Metabolic parameters of the animals studied after oral
supplementation with capsaicin (CAP05 and CAP1) or alcohol for 14 days
C
CAP05
CAP1
p
Food intake
(g/24h)
19.9  4.7
22.5  7.4
22.7  7.6
0.494
Water intake
(ml/24h)
42.5  12.1
38.8  10.1
38.8  10.9
0.581
Diuresis (ml/24h)
18.6  7.1
19.2  5.2
20.6  7.5
0.718
Weight (g)
292.0  30.2
293.9  31.7
296.8  31.6
0.888
Lee index (g/cm)
0.30  0.02
0.30  0.02
0.30  0.02
0.554
Glycemia
(mg/dL)
116.2  27.4
119.4  27.5
133.9  33.2
0.852
kITT (%/min)
5.18  1.97
5.01  2.12
5.14  2.01
0.970
Total cholesterol
(mg/dL)
55.9  19.9
52.2  12.1
47.4  18.8
0.433
LDL cholesterol
(mg/dL)
23.5  18.0
16.9  10.8
19.0  10.3
0.435
HDL cholesterol
(mg/dL)
19.4  11.4
24.9  10.0
18.4  9.5
0.179
Triglycerides
(mg/dL)
66.2 (40.9 – 82.4) 55.8 (50.1 – 72.5) 49.7 (35.6 – 79.8) 0.435
Values are reported as mean  SD or median, percentiles 25 and 75. C: control
group; CAP05: capsaicin 0.5 mg/kg b.w. daily; CAP1: capsaicin 1.0 mg/kg b.w. daily.
N=12-18 in each group. *P<0.05 vs. C; ** P<0.05 vs. CAP05 (one-way ANOVA,
post hoc Tukey or Kruskal-Wallis test).
66
Table II – Hemodynamic parameters and spectral analysis results of the
animals studied after oral supplementation with capsaicin (CAP05 and CAP1) or
alcohol for 14 days
C
CAP05
CAP1
p
MAP (mmHg)
152.5  28.2
165.2  24.6
147.6  26.2
0.123
DAP (mmHg)
124.9  28.9
135.7  24.0
118.7  25.5
0.149
HRV - LF abs (ms2)
3.1  2.9
12.2  26.9
6.2  7.6
- LF (nu)
21.3  14.0
33.4  20.2
26.7  14.4
0.235
0.251
- HF abs (ms2)
8.6  5.2
12.4  8.2
14.9  13.9
0.173
- HF (nu)
77.2  12.9
65.3  19.8
71.9  14.1
0.164
- LF/HF index
0.4  0.3
0.8  0.9
0.4  0.4
0.397
9.5  9.0
16.6  17.7
7.1  10.3
0.104
3.6  6.1
3.1  2.4
7.2  7.5 *
0.032
SAPV
–
2
(mmHg )
VLF
- HF (mmHg2)
Values are expressed as mean  SD. C: control group; CAP05: capsaicin 0.5
mg/kg b.w. daily; CAP1: capsaicin 1.0 mg/kg b.w. daily. N= 16-19 for each group.
*P<0.05 compared against the control group (one-way ANOVA, Dunn's method).
Spectral parameters of heart rate (tachograms) and systolic arterial pressure
(systograms) calculated from time series using autoregressive model. Mean arterial
pressure, MAP; diastolic arterial pressure, DAP; heart rate variability, HRV; systolic
arterial pressure variability, SAPV; very low frequency component, VLF; low
frequency component, LF; high frequency component, HF, expressed in absolute
(ms²) and normalized unit (nu).
67
Artigo original em língua portuguesa submetido ao periódico
British Journal of Nutrition
Capsaicina induz efeitos metabólicos e cardiovasculares em um modelo animal
de síndrome metabólica
Tremarin CS1, Casalli KR1, Meurer L2, Schaan BD1,2
1
Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de Cardiologia,
Rio Grande do Sul, Brasil
2
Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Brasil
Endereço para correspondência:
Beatriz D’Agord Schaan
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul
Av. Princesa Isabel, 395. Bairro Santana, 90620 001 Porto Alegre, RS, Brasil
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Resumo
A síndrome metabólica está associada com aumento da mortalidade
cardiovascular, entretanto não há um tratamento único. Estudos apontam a pimenta
vermelha, gênero Capsicum, como ferramenta na melhora do perfil cardiovascular. O
componente responsável por sua ação é a capsaicina. O objetivo deste estudo é
investigar os efeitos metabólicos e cardiovasculares da suplementação dietética com
capsaicina sintética, n-vanililnonanamida, em um modelo animal de síndrome
metabólica. Ratos espontaneamente hipertensos neonatos foram injetados com
glutamato monossódico e submetidos a um de 3 tratamentos, entre 27-30 semanas:
CAP05 ou CAP1 (capsaicina sintética em pó diluída em veículo 0,5 mg/kg ou 1
mg/kg) e C (veículo), administrados por gavagem durante 14 dias. Foram avaliados
índice de Lee, perfil lípico/ metabólico, avaliação cardiovascular, com os ratos
conscientes, incluindo pressão arterial (PA) e variabilidade da freqüência cardíaca
(VFC), ainda a espessura da artéria aorta (H&E) e imunohistoquímica para
monócitos/macrófagos (anticorpo CD-68). Parâmetros de peso, índice de Lee e perfil
lípidico/metabólico foram semelhantes entre os grupos, assim como a PA, FC e a
espessura da aorta. A capsaicina promoveu melhora na VFC (16,0 ± 9,0, 31,0 ± 28,2 e
31,3 ± 19,0 ms², para C, CAP05 e CAP1, respectivamente, P = 0,003), aumento da
atividade simpática vascular (componente LF da variabilidade da pressão sistólica: 3,3
± 2,8, 8,2 ± 7,7, e 12,1 ± 8,8 mmHg², para C, CAP05 e CAP1, respectivamente, P
<0,001) e aumento índice alfa (sensibilidade barorreflexa espontânea). Nossos dados
mostram que a capsaicina não melhorou anormalidades de lipídios e glicose em ratos
com SM. No entanto, efeitos cardiovasculares benéficos foram obtidos com este
nutracêutico.
69
Palavras-chave: Síndrome metabólica; Capsaicina; Colesterol; Glicose;
Sistema nervoso autônomo; Pressão arterial.
70
Introdução
A síndrome metabólica (SM), caracterizada por um conjunto de fatores de
risco, é condição altamente prevalente e está associada com o aumento da morbidade
e mortalidade cardiovascular (1). A administração subcutânea de glutamato
monossódico (MSG) em ratos neonatos espontaneamente hipertensos (SHR) é um
modelo animal que apresenta fenótipo similar à SM que ocorre em humanos (2),
tornando-se útil para o estudo desta condição.
Devido à inexistência de um fármaco específico para o tratamento da SM, há
um crescente interesse no estudo de substâncias alternativas, tais como nutracêuticos.
A capsaicina (8-metil-n-vanilil-6-nonenamida), princípio pungente da pimenta
vermelha, tem mostrado benefícios relacionados com a saúde, em ambos os estudos
animais e humanos (3,4). Esses benefícios podem ser responsáveis por suas
propriedades anti-inflamatórias (5), o aumento da termogênese induzida pela dieta (4)
e melhora no perfil lipídico (6). No entanto, os efeitos agudos e crônicos da capsaicina
sobre a glicemia e resistência à insulina, características principais de SM, não foram
ainda estudadas. Redução da pressão arterial foi relacionada ao seu uso (7), enquanto
outros estudos observaram efeitos hipertensivos (8).
Considerando o exposto e o fato da maioria dos estudos avaliarem a capsaicina
agudamente, não é possível recomendar o uso indiscriminado desta substância. O
objetivo deste estudo foi investigar alterações metabólicas e cardiovasculares
induzidas pela administração oral de capsaicina a um modelo animal de SM.
71
Métodos experimentais
A investigação seguiu as normas éticas estabelecidas pelo Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals (9), e The ARRIVE guidelines: Animal Research:
Reporting In Vivo Experiments (10). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e
Pesquisa da Fundação Universitária de Cardiologia do Instituto de Cardiologia do Rio
Grande do Sul (CEP/IC-FUC) sob protocolo #UP: 4168/08.
Animais
Foram utilizados 55 ratos neonatos espontaneamente hipertensos (SHR),
tratados com glutamato monossódico (MSG) (5mg/g/dia, Sigma Chemical Co, St
Louis, MO, USA) diluído em solução fisiológica (0,9% Nacl) por 9 dias consecutivos.
Aos 21 dias de vida, os animais foram desmamados e mantidos em caixa plásticas,
com capacidade para 4 animais cada, até atingiram a idade para o início dos
tratamentos.
Os animais provenientes do biotério da Fundação Estadual de Produção e
Pesquisa em Saúde do Rio Grande do Sul, Brasil, foram mantidos em condições
adequadas recebendo ração padrão (Nuvital, Brasil) e água ad libitum. A temperatura
ambiente foi mantida entre 20 e 25C, com ciclo claro escuro de 12 horas (06:00 às
18:00).
Ao atingirem a idade de 6 meses os animais foram randomizados em três
grupos: controle, que recebeu ração regular (C, n=18); capsaicina menor dose, ração
regular mais 0,5mg/kg de peso corporal (CAP05, n=18); e capsaicina maior dose,
ração regular mais 1,0mg/kg de peso corporal (CAP1, n=19). A capsaicina utilizada
foi n-vanililnonanamida, de estrutura química idêntica a capsaicina pura (Sigma
Chemical Co, St. Louis, MO, USA). A substância em pó foi diluída em álcool etílico
72
a 10% e oferecida diariamente (2 ml/kg) por 14 dias via gavagem orogástrica. O
grupo controle recebeu a mesma quantidade de solução alcoólica durante o mesmo
período.
Avaliação Metabólica
A confirmação da obesidade foi determinada por parâmetros antropométricos
e avaliada através do índice de Lee (raiz cúbica do peso corporal em gramas dividido
pelo comprimento naso-anal em centímetros) (11). Após 2 semanas de tratamento
com capsaicina ou veículo, todos os animais foram colocados em gaiolas metabólicas
individuais e mantidos por 24 horas.
No período da manhã do dia seguinte, foi realizado o teste de tolerância à
insulina usando insulina regular comercial (Biohulin, Biobrás Montes Claros, Brasil).
Os ratos foram anestesiados com tiopental sódico, intraperitonealmente, após três
horas de jejum, a insulina (0,75 U/kg) foi injetada na veia peniana do animal. Este
teste compreendeu 6 aferições da glicemia usando fitas reagentes (Accu-Chek
Advantage, Roche, Indianapolis, IN, USA). Antes da infusão de insulina mensurou-se
a glicemia no tempo zero e após aferida nos tempo 4, 8, 12, 16 e 20 minutos. Os
valores de glicemia foram transformados em logaritmo natural (Ln) que fizeram parte
de um gráfico. A inclinação foi calculada usando regressão linear [tempo x Ln
(glicemia)] e multiplicada por 100 para obter a taxa de decaimento da glicemia
durante o teste de tolerância a insulina (kITT) por minuto (%/min -1)(12).
No dia seguinte, os ratos foram anestesiados (90mg/kg quetamina e 10mg/kg
de cloridrato de xilasina, via intraperitoneal) para implantação de cateter preenchido
com solução de heparina sódica. Através de uma incisão na região inguinal esquerda,
a extremidade da cânula foi introduzida na artéria femoral, para obtenção dos registros
de pressão arterial e freqüência cardíaca. A cânula foi passada subcutaneamente e
73
exteriorizada no dorso da região cervical. Após esses procedimentos, os animais
foram colocados em caixas individuas e receberam água e ração ad libitum.
Avaliação Cardiovascular
No dia seguinte, 24 horas após o procedimento cirúrgico descrito acima, com
o animal acordado, a cânula arterial foi conectada a uma extensão, que permitiu livre
movimentação do animal pela caixa durante a avaliação cardiovascular. Os registros
foram obtidos a partir da conexão da extensão a um transdutor de pressão (P23Db,
Gould-Statham) acoplado a um amplificador de sinais. Os sinais de pressão arterial e
freqüência cardíaca foram gravados durante 30 minutos contínuos por um
microcomputador acoplado a um conversor analógico-digital (CODAS, 2Kz, DATAQ
Instruments, USA). Os dados gravados foram analisados batimento-a-batimento a fim
de quantificar mudanças na pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD), pressão
arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC).
Avaliação do controle autonômico – Análise espectral
As séries temporais de intervalos de pulso (IP, tacogramas) e PAS
(sistogramas) foram obtidas a partir dos registros da pressão arterial. De tais series
foram selecionados trechos estacionários de aproximadamente 300 batimentos,
coincidentes no sistograma e no tacograma e a análise espectral foi realizada usando
modelo auto-regressivo. As faixas de frequência relativas aos sinais de variabilidade
de ratos (muito baixa freqüência, VLF (very low frequency): 0-0,20Hz; baixa
freqüência, LF (low frequency): 0,20-0,75Hz; alta freqüência, HF (high frequency):
0,75-3,00Hz) foram definidas de acordos com estudos prévios (13). Os espectros das
séries temporais de tacograma e sistograma, referentes a cada trecho selecionado,
foram avaliados quantitativamente e obtidos valores da variabilidade da FC (VFC) e
da PAS (VPAS). Os parâmetros obtidos pela análise espectral que se diferenciam por
74
sua significância fisiológica são a relação entre as potências das componentes LF/HF
da VFC (balanço simpato-vagal) (14) e a potência absoluta das componentes LF e
VLF da VPAS (relativa à modulação simpática e do sistema renina angiotensina sobre
a PAS, respectivamente) (15). Além disso, o índice alfa é conhecido por expressar a
sensibilidade baroreflexa espontânea (16), e corresponde à raiz quadrada da relação
entre as componentes LF absolutas da VFC e VPA.
Após o registro cardiovascular, os animais foram novamente anestesiados com
a mesma quantidade de anestésico mencionado previamente. As amostras de sangue
foram coletadas por meio de punção cardíaca após 5 horas de privação alimentar.
Após a centrifugação, o soro foi congelado para posterior análise das concentrações
de glicose, triglicerídeos, colesterol total e colesterol HDL usando kits comerciais
(Labtest) de procedimentos manuais de reações enzimáticas seguidas de
espectrofotometria. O cálculo do LDL colesterol foi feito através da fórmula de
Friedewald (17).
Imuno-histoquímica
Após a eutanásia por exsangüinação, a porção torácica da artéria aorta foi
removido e dissecada. O material coletado foi fixado em formalina e embebido em
parafina. Secções de 4 micra foram corados com hematoxilina-eosina (HE). Foi usado
anticorpo monoclonal CD 68 para coloração de monócitos/macrófagos (Millipore,
Barueri, Brasil) na diluição de 1:200. As colorações foram realizadas na Unidade de
Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, seguindo o protocolo
de rotina que consiste em desparafinização e reidratação, recuperação antigênica,
inativação da peroxidase endógena e bloqueio de reações inespecíficas. O anticorpo
primário foi incubado por 12 horas, a 4° C, na diluição de 1:200, seguido pela
aplicação do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako Corporation,
75
Santa Barbara, USA)
e revelação com diaminobenzidina (DAB kit, Dako
Corporation, Santa Barbara, USA).
Nas lâminas coradas por HE, e utilizando um sistema computadorizado de
análise de imagens (Image-Pro Express), foram medidas em pixels as espessuras das
túnicas íntima e média em conjunto da parede da aorta de cada animal. Também
incluímos um grupo SHR (n=4) e Wistar Kyoto (n=5) a fim de comparar com o
modelo animal de SM (n=9).
Os resultados foram expressos em médias e desvios-padrão. Para a
comparação entre os grupos estudados foram utilizadas análise de variância (ANOVA
one-way) ou teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Post-hoc de Tukey ou teste de
Dunn foi usado para detectar as diferenças entre os grupos. As diferenças foram
consideradas significativas quando o valor de p<0,05.
76
Resultados
Os parâmetros antropométricos e metabólicos estão apresentados na Tabela I.
A capsaicina não promoveu alterações no peso corporal e índice de Lee dos animais,
assim como consumo alimentar, ingestão de líquidos e diurese. O tratamento com
capsaicina não alterou a glicemia, sensibilidade a insulina e perfil lipídico.
Parâmetros hemodinâmicos e análise espectral
Os parâmetros hemodinâmicos e análise espectral estão apresentados na
Figura 1 (pressão arterial sistólica no painel A, frequência cardíaca no painel
B,variabilidade da pressão arterial sistólica no painel C, variabilidade da frequência
cardíaca no painel D, sensibilidade baroreflexa espontânea no painel E, componente
LF da variabilidade da pressão arterial sistólica no painel F) e na Tabela II. A pressão
arterial média, pressão arterial sistólica e diastólica não sofreram alterações com o
tratamento da capsaicina. Os resultados relacionados à análise espectral mostraram
melhora na variabilidade da frequência cardíaca após o tratamento com capsaicina,
que foi mais pronunciada no grupo que recebeu a menor dose (Figura 1, painel D).
Não foram encontradas diferenças entre os grupos na avaliação da FC e a razão das
componentes LF/HF da variabilidade da freqüência cardíaca. O tratamento com a
maior dose de capsaicina (CAP1) foi associado com um aumento na componente LF
da variabilidade da pressão arterial sistólica, indicando um incremento na ação
simpática vascular (Figura 1, painel F). O mesmo aconteceu com a componente HF da
variabilidade da pressão arterial sistólica (representativo da frequência respiratória)
(Tabela II). Além disso, ambos os grupos que receberam capsaicina tiveram aumento
no índice alfa (sensibilidade baroreflexa espontânea), que foi mais pronunciada na
dose mais alta (CAP1) (Figura 1, painel E).
77
Histologia e imuno-histoquímica
A Figura 2 mostra exemplos representativos das análises histológicas e imunohistoquímicas de ratos Wistar Kyoto (painéis A e B), SHR (painéis C e D) e SHR
injetados com MSG (painéis de E e F). Os painéis A, C e E representam exemplos
representativos de cada grupo da secção de tecido da aorta torácica corados com
hematoxilina-eosina. Painéis B, D e F representam a expressão imuno-histoquímica
de CD 68 (coloração para macrófagos) no mesmo tecido de exemplos representativos
de cada grupo.
A comparação entre os grupos mostrou uma maior espessura de parede da
aorta no SHR (358,8 ± 40,3 pixels) e SM (401,5 ± 29,7 pixels) versus Wistar Kyoto
(251,4 ± 31,4 pixels), p <0,001. O número de células coradas com CD-68 não foi
diferente entre os grupos [número de células em 20 campos: SHR; 21,0 (11,5 - 28,2),
SM, 20,0 (8,0 - 30,0) e WKY, 5,0 (4,0 - 6,0), p = 0,188]. Não foram observadas
diferenças na espessura da parede da aorta (358,8 ± 40,3; 365,1 ± 40,0; 374,4 ± 40,8
pixels, para C, e CAP05 Cap1, respectivamente, p = 0,718) e no número de células
expressas pela imunohistoquímica com CD-68 (número de células em 20 campos:
20,0 (8,0 - 30,0); 17,0 (8,0 - 23,0); 8,0 (4,5 - 25,0) para C, e CAP05 Cap1,
respectivamente, p = 0,692) entre os grupos de ratos que receberam capsaicina MS.
78
Discussão
A capsaicina tem potenciais efeitos benéficos cardiovasculares e metabólicos
que podem ser interessantes no manejo SM, mas os resultados indicam que não houve
vantagem de utilizá-la em curto período de tempo sobre os parâmetros metabólicos
avaliados. No entanto, a capsaicina promoveu melhora global no controle autonômico
cardiovascular,
que
tem conhecido
impacto
em
um
melhor
prognóstico
cardiovascular.
As doses de capsaicina utilizado não influenciaram no consumo de ração/água
e peso durante o curto período dos experimentos, mostrando que, em duas semanas,
os animais tiveram boa aceitação da substância, o que não afetou o seu bem-estar.
Estes resultados são consistentes com descobertas anteriores (18), que mostraram que,
mesmo quando o suplemento foi adicionado à dieta, o seu sabor picante não afetou a
sua palatabilidade. No entanto, ratos alimentados com uma dieta hiperlipidica tiveram
peso corporal reduzido sem qualquer alteração na ingestão de alimentos (19),
sugerindo que a capsaicina pode aumentar a termogênese induzida pela dieta, como
mostrado com administração aguda (4).
O perfil lipídico também não se alterou com o uso de capsaicina. Estudos com
camundongos dislipidêmicos (6), ou obesos (19), suplementados com capsaicina em
dieta rica em gorduras mostraram reduções sobre os triglicerídios séricos. No entanto,
nenhuma diminuição no colesterol plasmático foi observada (20), como o resultado
aqui apresentado. Em tratamentos mais longos (3,6), a capsaicina adicionada a uma
dieta rica em gordura ou colesterol determinou uma redução do colesterol sérico. Nós
presumimos que há uma ineficiência termogênica no modelo animal de SM, em que a
capsaicina não tem o mesmo efeito sobre o perfil de lípidos, como mostrou com
79
sucesso em estudos de outros. É possível que da combinação da obesidade (21) e
hipertensão (22) ocorra um metabolismo prejudicado, reduzido em tecido adiposo
marrom, responsável pela atividade termogênica. Além disso, sabe-se que este tecido
especializado diminui com a idade e os outros autores (3, 18, 20) utilizaram animais
mais jovens que os nossos.
Nenhuma mudança foi induzida pela capsaicina sobre os níveis de glicose no
sangue e resistência à insulina. Outros autores demonstraram que a capsaicina
aumentou a glicemia, independentemente dos níveis de insulina, mas as avaliações
foram realizadas de forma aguda durante o curso do teste oral de tolerância à glicose
em indivíduos saudáveis (23). Similar aos nossos resultados, o consumo regular de
pimenta não modificou a glicemia em humanos (24).
Uma melhora global no controle autonômico da PA com aumento da VFC e
sensibilidade barorreflexo espontânea foi mostrado pela análise espectral. Os dados
anteriores mostraram resultados contrários, mas os animais estudados eram saudáveis
e avaliados após a administração oral aguda de capsaicina, mostrando aumentos da FC
e da razão LF/HF, indicando um predomínio da atividade simpática (25). Outros
experimentos agudos, realizados em mulheres saudáveis, mostraram aumento da razão
LF/HF após a ingestão de pimenta vermelha (4). Apesar dos efeitos benéficos do
tratamento crônico com capsaicina na regulação autonômica cardíaca, mostrado por
nós, o balanço simpatovagal não se alterou, como ambos os grupos que receberam
capsaicina demonstraram aumento da modulação simpática do tônus vascular, o qual
foi diferente somente quando se administrou capsaicina em doses altas.
Embora os efeitos paradoxais na melhora da modulação autonômica e
aumento da modulação simpática vascular foram observadas, estas não influenciaram
na pressão arterial e FC, resultados que são consistentes com os apresentados
80
anteriormente em humanos que receberam pimenta vermelha durante 4 semanas (26).
No entanto, após longos períodos de tratamento com capsaicina a diminuição da
pressão arterial foi observado em pacientes hipertensos (7). Resultados contraditórios
em relação à ação da capsaicina sobre a pressão arterial têm sido associados, pelo
menos em parte, a capacidade da capsaicina ativar um canal iônico – receptor de
potencial transitório vanilóide tipo 1 (TRVP1) - que controla a expressão endotelial de
neuropeptídeos envolvidas na liberação de óxido nítrico (27). E o desequilíbrio entre
esses, possivelmente explicaria porque os efeitos da capsaicina sobre a pressão arterial
em alguns estudos demonstrou vasorelaxamento e, em outros vasoconstrição (28, 29).
Ratos com SM apresentaram maior espessura de aorta em relação aos
controles não obesos e hipertensos, mas a capsaicina não promoveu mudanças
estruturais, nem redução de inflamação. Este resultado está provavelmente
relacionado ao curto período de tratamento, outros autores relataram benefícios em
ratos alimentados com uma dieta rica em gordura com a suplementação de capsaicina
durante 10 semanas (19). Além disso, a capsaicina pode ser menos potente na
diminuição do processo inflamatório, como a atorvastatina mostrou reduzir a
infiltração de macrófagos em ratos diabéticos (30).
Nós concluímos que a capsaicina não foi capaz de melhorar as anormalidades
no metabolismo da glicose e lípidos em um modelo animal de SM. No entanto, efeitos
cardiovasculares benéficos foram obtidos com este nutracêutico. É possível que o
sistema cardiovascular sofra adaptações para compensar o aumento agudo da
atividade simpática demonstrada em outros estudos.
81
Agradecimentos
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e a Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
Conflitos de interesses
Os autores declaram que não há conflitos de interesses.
82
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diabetic
86
Legenda das figuras
Figura 1: Avaliação do controle autonômico por análise espectral. (A) Pressão
arterial sistólica; (B) frequência cardíaca; (C) variabilidade da pressão arterial
sistólica; (D) variabilidade da frequência cardíaca; (E) sensibilidade baroreflexa
espontânea, relacionada ao índice alfa (raiz quadrada da razão entre os valores
absolutos da componente LF da variabilidade de freqüência cardíaca e variabilidade
da pressão arterial sistólica); (F) componente LF da variabilidade da pressão arterial
sistólica. C: controle (barras brancas), n=17; CAP05: capsaicina 0,5 mg/kg/dia (barras
cinzas), n=18; CAP1: capsaicina 1,0 mg/kg/dia (barras pretas), n=16. Valores
expressos em média ± DP. *P<0.05 vs. grupo controle. One-way ANOVA, teste de
Dunn.
Figura 2: Histologia e imuno-histoquímica (Wistar Kyoto, n=1; SHR, n=1;
SHR injetado com MSG, n=9, respectivamente). A, C e E: Secções de tecidos da
artéria torácica coradas com hematoxilina-eosina representativos de exemplos de cada
grupo. A linha vermelha marca a espessura da aorta. Aumento original de 400x. B, D
e F: Expressão imuno-histoquímica de CD 68 no mesmo tecido, exemplos
representativos de cada grupo. As setas em marrom indicam alguns macrófagos.
Aumento original de 1000x.
87
Tabela I – Parâmetros metabólicos dos animais estudados após suplementação
oral com capsaicina (CAP05 e CAP1) ou álcool por 14 dias
C
CAP05
CAP1
p
19,9  4,7
22,5  7,4
22,7  7,6
0,494
Consumo água
42,5  12,1
(ml/24h)
38,8  10,1
38,8  10,9
0,581
Diurese
(ml/24h)
18,6  7,1
19,2  5,2
20,6  7,5
0,718
Peso corporal
(g)
292,0  30,2
293,9  31,7
296,8  31,6
0,888
Índice de Lee
(g/cm)
0,30  0,02
0,30  0,02
0,30  0,02
0,554
Glicemia
(mg/dL)
116,2  27,4
119,4  27,5
133,9  33,2
0,852
kITT (%/min)
5,18  1,97
5,01  2,12
5,14  2,01
0,970
Colesterol
total (mg/dL)
55,9  19,9
52,2  12,1
47,4  18,8
0,433
LDL colesterol
23,5  18,0
(mg/dL)
16,9  10,8
19,0  10,3
0,435
HDLcolesterol
(mg/dL)
19,4  11,4
24,9  10,0
18,4  9,5
0,179
Triglicerídeos
(mg/dL)
66,2 (40,9 – 82,4)
55,8 (50,1 – 72,5)
49,7 (35,6 – 79,8)
0,435
Consumo
ração (g/24h)
Valores expressos em média  DP ou mediana, percentil 25 e 75. C: grupo
controle; CAP05: capsaicina 0,5 mg/kg/dia; CAP1: capsaicina 1,0 mg/kg/dia. N=1218 em cada grupo.*P<0.05 vs. C; **P<0.05 vs. CAP05 (one-way ANOVA, post hoc
Tukey ou teste Kruskal-Wallis).
88
Tabela II – Parâmetros hemodinâmicos e resultados da análise espectral dos
animais estudados após suplementação oral com capsaicina (CAP05 e CAP1) ou
álcool por 14 dias
C
CAP05
CAP1
p
PAM (mmHg)
152,5  28,2
165,2  24,6
147,6  26,2
0,123
PAD (mmHg)
124,9  28,9
135,7  24,0
118,7  25,5
0,149
VFC - LF abs (ms2)
3,1  2,9
12,2  26,9
6,2  7,6
- LF (nu)
21,3  14,0
33,4  20,2
26,7  14,4
0,235
0,251
- HF abs (ms2)
8,6  5,2
12,4  8,2
14,9  13,9
0,173
- HF (nu)
77,2  12,9
65,3  19,8
71,9  14,1
0,164
- LF/HF index
0,4  0,3
0,8  0,9
0,4  0,4
0,397
16,6  17,7
7,1  10,3
0,104
3,1  2,4
7,2  7,5 *
0,032
VPAS - VLF (mmHg2) 9,5  9,0
- HF (mmHg2)
3,6  6,1
Valores expressos em média  DP. C: grupo controle; CAP05: capsaicina 0,5
mg/kg/dia; CAP1: capsaicina 1,0 mg/kg/dia. N= 16-19 para cada grupo. *P<0,05
comparado com grupo controle (one-way ANOVA, teste de Dunn). Parâmetros do
espectro da frequência cardíaca (tacograma) e pressão arterial sistólica (sistograma)
calculada de séries temporais usando modelo auto-regressivo. Pressão arterial média,
PAM; pressão arterial diastólica, PAD; variabilidade da frequência cardíaca, VFC;
variabilidade da pressão arterial sistólica, VPAS; componente de muito baixa
freqüência (very low frequency component), VLF; componente de baixa freqüência
(low frequency component), LF; componente de alta freqüência (high frequency
component), HF; expressa em unidade absoluta (ms²) e normatizada (nu).
89
FIGURE 1
90
FIGURE 2