Telómeros e imortalização

Telómeros e Imortalização
Ácido desoxirribonucleico (DNA) e Replicação Semiconservativa
O DNA é o suporte molecular que fornece a base genética que
define as características de todo o ser vivo. É um polímero que tem
como unidade fundamental o nucleótido que, por sua vez, é
formado por uma pentose, mais propriamente uma desoxirribose,
ligada a um grupo fosfato e a uma base azotada de entre quatro
possíveis: Adenina (A) e Guanina (G) – bases púricas, Timina (T) e
Citosina (C) – bases pirimídicas. O ácido desoxirribonucleico
apresenta duas cadeias de nucleótidos complementares, isto é,
estando ligadas as bases azotadas de acordo com o modelo de
Watson e Crick: A-T e G-C.
Em cada cadeia simples os nucleótidos ligam-se entre si
através de uma ligação fosfodiéster entre o carbono 3' do nucleótido
anterior e o carbono 5' do nucleótido posterior. Deste modo, a
cadeia de DNA apresenta uma extremidade livre, a 3' com um
grupo hidroxilo e uma extremidade 5´ livre com um grupo fosfato.
O DNA apresenta uma estrutura secundária sob a forma de
“dupla-hélice” (Watson e Crick, 1953), formada por duas cadeias
complementares antiparalelas (com sentidos opostos, designandose uma por 3’-5’ e a outra por 5’-3’), ligadas pelo estabelecimento
de pontes de hidrogénio entre as bases azotadas complementares
das duas cadeias.
Para ocorrer divisão celular o DNA tem sofrer um processo
designado replicação que consiste numa sequência de
acontecimentos predeterminados: iniciação, elongação e
terminação. Este processo é semi-conservativo, baseando-se na
complementaridade estrutural das bases constituintes dos
nucleótidos do DNA.
Nas células eucarióticas, a síntese de DNA é efectuada, em
simultâneo, em múltiplos locais específicos da cromatina (origens
de replicação), sendo catalisada pelas DNA polimerases a e d. O
processo inicia-se pelo desenrolamento e desnaturação localizada
do DNA, ao nível das origens de replicação, catalisado
respectivamente por topoisomerases e helicases. Às DNA
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polimerases cabe o papel da catálise da reacção de condensação
dos nucleótidos percursores, de acordo com a sequência
nucleotídica da cadeia simples de DNA molde. Para a actuação das
DNA polimerases é necessária a síntese de um pequeno fragmento
de RNA (designado por iniciador, primer) catalisada por uma RNA
polimerase específica (primase, uma subunidade da DNA
polimerase a).
A polimerização das cadeias de DNA ocorre de uma forma
bidireccional, a partir de cada origem de replicação, com a
acoplagem de dois complexos enzímicos de replicação que se
deslocam em direcções opostas. Dado a polimerização sequencial
dos percursores ser exclusivamente unidireccional (no sentido 5’P/3’-OH), a replicação assume para uma das cadeias (a cadeia
condutora, leading) um carácter contínuo, ao passo que a outra
(cadeia lagging) é sintetizada de forma descontínua, sob a forma de
fragmentos interrompidos (fragmentos de Okazaki) a partir dos
iniciadores de RNA. Os segmentos de RNA iniciadores são
posteriormente removidos através da actividade nucleásica da DNA
polimerase d, que de seguida sintetiza DNA, preenchendo desta
forma as regiões inicialmente ocupadas pelos primers.
Posteriormente a DNA ligase assegura a continuidade das cadeias
sintetizadas de novo, através da catálise das ligações fosfodiéster
entre os vários fragmentos de DNA.
A DNA polimerase (d) é capaz de se autocorrigir, ou seja, um
novo nucleótido só é adicionado à cadeia se o anterior for
complementar ao nucleótido da cadeia molde. Se a
complementaridade não existir, o nucleótido errado é eliminado pela
própria DNA polimerase.
É importante sublinhar que este processo não é passivo ou
espontâneo, são necessárias várias enzimas para desnaturar a
dupla hélice de DNA e seguidamente sintetizar a nova cadeia.
Quando a helicase separa a última parte da cadeia é normal
que sobre uma série de nucleótidos para os quais a primase não
chega a produzir um primer, ficando então a terminação da cadeia
nova com um tamanho inferior à original, equivalente a um
fragmento de Okazaki.
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Telómeros
Os telómeros são complexos de DNA presentes nas
extremidades dos cromossomas, cuja principal função é protege-los
de quaisquer danos, garantindo-se assim a integridade do material
genético que eles comportam. Estão associados a diferentes tipos
de proteínas, sendo compostos por sequências repetidas de
nucleótidos, nomeadamente 5´ – TTAGGG – 3´.
Existem diversas proteínas associadas a estas terminações
cromossómicas que desempenham várias funções. Duas das mais
importantes são a TRF1 e TRF2.
A TRF1 (GGTTAG Repeat Binding factor 1) é uma proteína
cuja função é a de regular o tamanho do telómero, interagindo com
outras 2 proteínas: a tankyrase e a TIN2 (TRF1 Interacting nuclear
protein 2).
A TRF2 (GGTTAG Repeat Binding Factor 2) é outra das
proteínas associadas aos telómeros, tendo esta a função de
proteger os últimos de enzimas responsáveis por mecanismos de
correcção de danos do DNA.
Os telómeros têm uma estrutura em Loop essencial à sua
actividade, caracterizada por uma ansa T e uma ansa D. O
chamado T-loop é o maior de todos e é descrito por grande parte da
terminação telomérica, desempenhando a proteína TRF2 um
importante papel neste processo, uma vez que é esta que assegura
a ligação entre a extremidade mais distante e a “base” ou início do
loop, juntamente com o chamado D-loop, que não é mais do que
uma abertura da cadeia telomérica de DNA acompanhada da
ligação por complementaridade da extremidade 3’, que como vimos
é mais comprida que a extremidade 5’ da cadeia complementar.
Toda esta estrutura traduz-se numa enorme estabilidade para a
terminação telomérica e impede a degradação do telómero por
acção das DNases.
Como vimos, á medida que a célula se vai dividindo e
consequentemente, à medida que a replicação vai ocorrendo, o
último fragmento de Okazaki não é replicado, traduzindo-se isto
num encurtamento progressivo do telómero. Quando este atingir um
tamanho mínimo necessário para a formação do loop, pode dizer-se
que o telómero atingiu o ponto crítico, a partir do qual é impossível
prosseguir com a replicação. Este tamanho crítico dos telómeros
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pode levar à danificação do DNA dos cromossomas, dano este que
é reconhecido pela proteína celular p53, que passa para a sua
forma activa (a forma activa da p53 é a sua forma fosforilada,
função assegurada pelas proteínas ATM e ChK2). Esta sinalização
feita pela proteína p53 desencadeia o processo de entrada da
célula em senescência, estádio no qual esta consegue prosseguir
com o seu metabolismo, apesar de não ser capaz de se voltar a
dividir. Esta incapacidade resulta da formação de um ponto de
controlo entre a fase G1 e S da mitose, no qual a célula permanece,
até eventualmente acabar por sofrer apoptose.
Telomerase
A telomerase é uma enzima ribonucleoproteica, mais
concretamente uma transcriptase reversa, pertencente à classe das
DNA polimerases, que tem por principal função estabilizar o
comprimento dos telómeros por adição de repetições teloméricas
nas extremidades dos cromossomas, de modo a compensar a
erosão contínua destes, a cada divisão celular. A enzima encontrase activa em células embrionárias e em células germinativas, não
sendo detectada em células somáticas normais, exceptuando
algumas células proliferativas de tecidos renováveis (células
germinativas hematopoiéticas, linfócitos activados, células basais
da epiderme e algumas células do intestino), embora em baixa
concentração. Basicamente, a telomerase é um complexo composto
por duas subunidades, a subunidade catalítica hTERT (human
Telomerase Reverse Transcriptase) e a pequena subunidade de
RNA nuclear RNA hTR (human Telomerase RNA), codificada pelo
gene TERC (Telomerase RNA Component). É esta última
subunidade (também conhecida simplesmente por TERC) que
serve de molde para a síntese das repetições teloméricas 5’ –
TTAGGG – 3’, através da expressão da sequência de RNA nela
presente (3’ – CAAUCCCAAUC – 5’).
A sua acção sobre os cromossomas baseia-se num mecanismo
bastante simples. Já vimos que, a cada replicação da cadeia de
DNA, os telómeros vão encurtando ao nível da extremidade 5’ de
uma das novas cadeias de DNA formadas. De modo a contrariar
este encurtamento, a telomerase procede ao reconhecimento de
uma zona rica em Guaninas, presente na extremidade de uma
sequência telomérica de uma cadeia de DNA, e procede ao seu
alongamento, no sentido de 5’ para 3’. Graças à molécula de RNA
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complementar à repetição telomérica, a telomerase determina um
alongamento da extremidade 3’ da cadeia de DNA cromossómico
proveniente da cadeia mãe, por adição de uma unidade de
repetição telomérica a esta mesma extremidade. Este aumento cria
o espaço necessário à adição de um primer de RNA convencional,
o que permite que a cadeia complementar possa continuar a ser
sintetizada pelo complexo -primase de uma DNA polimerase.
Esta enzima parece só estar regulada pelas proteínas
adjacentes ao telómero aquando da iniciação da sua acção, e não
durante a extensão telomérica. Parece também “preferir” adicionar
longas extensões teloméricas em vez de várias curtas extensões a
cada duplicação, pelo que pode não agir imediatamente após a
primeira duplicação celular mas sim só quando os telómeros
atingem um patamar crítico.
Morte celular Programada comparada
Devido ao papel que a telomerase desempenha junto dos
telómeros, verifica-se que células que possuem telomerase activa
dividem-se muitas mais vezes antes de atingirem o estado de
senescência replicativa celular, ou seja, são capazes de se dividir
muitas mais vezes do que as células restantes (nas quais a
telomerase não se expressa) antes de sofrerem apoptose celular;
isto porque, como vimos, o comprimento dos telómeros destas
células não atinge tão rapidamente o ponto crítico de comprimento
que determina a sinalização por parte da proteína p53. Assim,
enquanto que por volta das 55 a 60 divisões, as células que não
expressam telomerase já se encontram com um comprimento
telomérico crítico, as que expressam esta enzima ainda possuem
telómeros com um comprimento biologicamente viável. Por isso é
plausível afirmar-se que as células nas quais a telomerase se
expressa possuem um potencial proliferativo superior ao das células
nas quais esta enzima não se expressa.
Relevância dos telómeros no envelhecimento humano
Como vimos, o encurtamento dos telómeros limita a
proliferação celular. Logo, é lógico afirmar-se que este
encurtamento está intimamente relacionado com o envelhecimento.
Diversos estudos confirmam haver um certo equilíbrio na dispersão
dos comprimentos teloméricos de acordo com a faixa etária, ou
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seja, grandes grupos ou classes etárias (pessoas com
aproximadamente o mesmo tempo de vida) têm tendência para
apresentarem um comprimento telomérico semelhante. Também é
hoje aceite a ideia de que o comprimento telomérico, para
indivíduos da mesma faixa etária, varia consoante o sexo, sendo
que o sexo feminino apresenta, na generalidade, um maior
comprimento telomérico que o sexo masculino, nestas condições.
Contudo, o comprimento dos telómeros também depende de
factores genéticos: para o mesmo tipo de célula, os telómeros de
uma pessoa velha podem ser mais compridos do que os telómeros
de uma pessoa nova. Tudo depende do genótipo de cada um.
As células jovens não apresentam fenótipos velhos,
reproduzindo-se igualmente a determinada velocidade, excepto
quando surgem telómeros de tamanho diminuto. Ao longo de toda a
vida, mesmo no início, existem células em divisão e células em
senescência. A frequência desta aumenta com a idade, até que
todas células entram em senescência. A nível celular, a diferença
entre uma população jovem e uma envelhecida reside na razão
entre células em divisão e células em senescência.
Em várias células do organismo (como as do rim, do fígado e
tecidos vasculares) há uma relação entre a idade do organismo e o
comprimento telomérico, havendo uma tendência para que as
espécies com maior esperança média de vida apresentem uma
menor redução telomérica, a cada divisão celular. Contudo, existem
células que envelhecem sem que o comprimento dos seus
telómeros diminua (como as células nervosas e as células do tecido
muscular cardíaco), uma vez que são tecidos que não sofrem
mitose.
Já todos os síndromas com envelhecimento acelerado
estudados apresentam alterações na biologia dos telómeros,
havendo, por exemplo, uma diminuição acelerada do comprimento
telomérico.
Existem estudos em ratinhos que indicam que a re-introdução
da telomerase faz a reparação de telómeros muito curtos. Deste
modo, prova-se que a telomerase é capaz de reconhecer telómeros
reduzidos e de os reconstituir, prevenindo fusões
cromossómicas e fenótipos envelhecidos. Coloca-se por isso a
possibilidade da re-introdução da telomerase ser útil no combate a
síndromes de envelhecimento e patologias associadas a este.
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Sendo assim, a reintroduzição da telomerase pode atrasar ou
prevenir o envelhecimento.
Influência do stress oxidativo no envelhecimento
O stress oxidativo, onde geralmente se verifica uma reacção
inversa entre o tempo médio de vida de um organismo e a sua taxa
metabólica, pode danificar todos os componentes celulares,
incluindo DNA mitocondrial e nuclear.
O comprimento telomérico também depende do “uso” do tecido.
Por exemplo, a pele humana sofre envelhecimento acelerado por
factores externos, como a exposição a raios UV. Esta exposição
promove a formação de espécies oxidantes, concretamente as
“reactive oxygen species” (ROS), que atacam maioritariamente as
cadeias de DNA.
A cadeia respiratória nas membranas mitocondriais é dos
maiores produtores de espécies oxidantes no organismo.
As enzimas de protecção contra os ROS possuem um
importante papel no prolongamento da vida de um organismo pois
através da sua inibição é aumentada a sensibilidade ao stress
oxidativo e é reduzido o tempo médio de vida.
Sobrevivência e proliferação de células mutantes
Certas células podem sofrer mutações ao nível do gene p53, o
que vai afectar a sinalização expressa pela proteína p53 que, como
vimos, determina a interrupção do processo de divisão celular
(senescência). Assim, estas células continuam a dividir-se à custa
de um encurtamento dos telómeros para além do seu comprimento
biologicamente crítico. Atingido este ponto, as divisões celulares
seguintes podem começar a pôr em causa a integridade do
cromossoma, podendo mesmo desencadear lesões cromossómicas
de forma massiva. Este fenómeno pode levar à morte da célula
devido a uma instabilidade genómica catastrófica crescente ou
lesão do DNA cromossómico. No entanto, algumas células podem
sobreviver a este período de disrupção genética por reactivação da
telomerase que detém este ciclo catastrófico e restaura estabilidade
cromossómica suficiente à sobrevivência da célula. A partir daqui,
estas células lesadas podem acumular as mutações adicionais
necessárias ao aparecimento de cancro.
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Cancro
A imortalização é um importante aspecto da biologia das
células cancerígenas. É o fenótipo imortal das inúmeras células
cancerígenas que as distingue das células somáticas normais,
que se dividem um número finito de vezes antes de entrar em
senescência.
Como referido anteriormente, o processo que leva a um estado
cancerígeno requer a acumulação de uma série de alterações
genéticas. A carcinogénese é composta por diversos passos,
necessitando de alterações sucessivas num número de genes.
Cada passo envolve a alteração de um gene e a expressão clonal
da célula mutante.
A maioria dos mecanismos de controlo de uma célula envolve
componentes inibidores (tumor supressor) e componentes
estimuladores (proto-oncogenes), sendo que as mutações a este
nível são altamente favoráveis para a formação de cancro.
Estudos elaborados em ratinhos revelam que um oncogene não
é suficiente para tornar uma célula normal em cancerígena (sendo
este, contudo, uma ameaça pois aumenta o risco de desenvolver
um cancro). Além deste oncogene, é necessária uma mutação ao
nível do gene tumor supressor que leve à sua inactivação. Sendo
assim, a maioria das células cancerígenas proliferam devido a
mutações em genes que regulam a divisão celular. Contudo, para
conseguir esta proliferação celular é não só necessário levar as
células a se dividirem como também impedi-las de cometerem
suicídio pela apoptose.
A apoptose acontece quando algo está errado na célula
(danos severos no DNA, falha nos sinais vitais, etc.), portanto, a
resistência à apoptose é a característica chave das células
malignas. Daí que seja tão importante uma mutação ao nível do
gene p53 que, além de outras funções, controla a apoptose.
A perda da actividade de p53 é muito perigosa em relação ao
cancro, pois permite que células mutantes continuem o seu ciclo
celular e escapem à apoptose. Além disso, esta falha leva a uma
instabilidade cromossómica característica das células cancerígenas,
permitindo futuras mutações promotoras do cancro.
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Em contraste com a maioria das células normais, as
células cancerígenas expressam telomerase. Pensa-se que
esta é razão pela qual, ao contrário das células normais, as
células cancerígenas tendem a dividir-se sem um limite, sendo
que a estabilidade do tamanho dos telómeros tem um
importante papel na formação dum cancro.
Visto que é detectada telomerase activa em mais de 85% das
células cancerígenas, conclui-se que a regulação positiva ou reexpressão da telomerase pode ser necessária para o crescimento
contínuo das células tumorígenas.
A acção desta enzima leva a que as células tumorígenas não
apresentem encurtamento dos telómeros em cada divisão celular. A
imortalização celular pode assim ser o resultado da mutação de um
gene na via de repressão da telomerase, permitindo a expressão da
telomerase nestas células.
A telomerase não é nenhum oncogene nem origina cancro,
pode é levar a eventuais mutações genéticas devido ao
prolongamento do tempo médio de vida das células, originando
cancro. Contudo, trata-se de um elemento essencial pois, segundo
um estudo feito em ratinhos, após infecção de células com
oncogenes sem presença de telomerase, não houve
desenvolvimento de cancro, sendo que a inibição da telomerase
previne a formação de tumores a partir da infecção com células
cancerígenas.
Para além da telomerase, existe outro processo através do qual
os tumores conseguem fazer de forma alternativa a manutenção
dos telómeros: o ALT.
No ALT, uma cadeia de DNA de um telómero liga-se a uma
cadeia complementar de outro telómero, obtendo assim o modelo
para a síntese do novo DNA telomérico. Abrem-se as duas cadeias
como se vê no esquema seguinte, servindo uma de molde à outra.
Após a crise celular, alguns telómeros ficam tão curtos que as
repetições teloméricas encontram-se logo após a zona
subtelomérica do cromossoma, onde já não existem as repetições
da sequência telomérica. Quando se dá o mecanismo ALT,
possíveis sequências GGTTAG perdidas nas zonas subteloméricas
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podem agir como primer de adição de novo DNA telomérico,
resultando isto na substituição das variações subteloméricas por
repetições teloméricas GGTTAG.
Os telómeros mantidos pelo ALT apresentam elevada
heterogeneidade e são observados em células que também
apresentam telomerase.
Tratamento de cancro baseado na inibição da Telomerase
Futuramente, espera-se utilizar a detecção da telomerase
activa como método de diagnóstico de cancro e ainda como prédiagnóstico, já que previne a proliferação de cancro por metástase.
Devido à ligação entre proliferação celular e telomerase activa, a
inactivação desta enzima poderá ser um potencial tratamento para
o cancro. Para isso foram criadas moléculas inibidoras desta
enzima, nomeadamente RNA “anti-sense” oligonucleotídeos
inibindo a subunidade hTR. Após um determinado número de
duplicações, as células cancerígenas atingirão a senescência ou
crise celular. Estes oligonucleotídeos são capazes de entrar nas
culturas cancerígenas, provocar a diminuição do comprimento
telomérico e reduzir a proliferação celular. Além disso, apresentam
baixa toxicidade em humanos, alta estabilidade in vivo e baixos
custos de síntese. Trata-se de uma descoberta muito importante na
luta contra o cancro, pois promove bons resultados e é uma terapia
simples, requerendo baixa concentração de fármaco.
Contudo, há que ter em conta o tempo de acção e a inibição da
telomerase em células regenerativas.
Tempo de acção – este tratamento não é instantâneo, pois
tem que haver um certo período de tempo entre a administração de
um inibidor da telomerase e a senescência celular, sendo que
quanto maior for o comprimento inicial dos telómeros, maior será
esse tempo de acção.
Inibição da telomerase em células regenerativas – ao inibir a
telomerase nas células cancerígenas, pode inibir-se também nas
células normais regenerativas, o que levará a danos irreversíveis.
Contudo, como as células cancerígenas devem apresentar
telómeros de tamanho mais reduzido que estas células normais, os
inibidores podem apresentar menor efeito nas células normais.
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Outra possibilidade de inibir a telomerase baseia-se no uso de
“hammerhead ribozymes”. São pequenas moléculas de RNA
cataliticamente activas. Em testes direccionados à subunidade
hTERT, foi verificado que esta riboenzima promove não só o corte
do mRNA da subunidade hTERT levando à diminuição do
comprimento telomérico, impede a proliferação e induz apoptose,
como também aumenta a sensibilidade do tumor para inibidores da
topoisomerase II.
Um dos grandes problemas ao nível da investigação de
tratamentos para o cancro é que esta é feita em ratinhos, os quais
apresentam muitas diferenças relativamente a humanos. Têm sido
encontradas várias terapias que curam os cancros em ratos, mas
estas geralmente falham em humanos.
Autores:
Emanuel Valpaços
Tiago Rito
Tânia Abreu
João Fernandes
Tiago Adrega
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