transferência de embrião e fertilização “in vitro” (fiv) em

UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO “IN
VITRO” (FIV) EM BOVINOS
Igor Nascimento Martinez
Leandro César de Souza
Rio de Janeiro. set. 2007
IGOR NASCIMENTO MARTINEZ
Aluno do curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB
Matrícula
LEANDRO CÉSAR DE SOUZA
Aluno do curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB
Matrícula
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO “IN
VITRO” (FIV) EM BOVINOS
Trabalho monográfico de conclusão do curso
de Medicina Veterinária (TCC), apresentado
à UCB como requisito parcial para a
obtenção do título Especialização em
Produção e Reprodução Bovina, sob a
orientação do Professor: Marconi Gauttieri
Abba
Rio de Janeiro. set. 2007
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO E FERTILIZAÇÃO “IN
VITRO” (FIV) EM BOVINOS
Elaborado por Igor Nascimento Martinez e Leandro César de Souza
Alunos do Curso de Especialização em Medicina Veterinária da UCB
Foi analisado e aprovado com
grau: .......................................
Rio de Janeiro_____de_________________ de___________
_________________________________________________
Membro
_________________________________________________
Membro
_________________________________________________
Professor Orientador
Presidente
Rio de Janeiro. set. 2007
RESUMO
O objetivo desse estudo é o de contribuir para um melhor entendimento,
aperfeiçoamento e expansão da transferência de embrião e fertilização “in vitro”
(FIV). A metodologia utilizada para esse estudo é denominada análise teórica, onde
foram feitas revisões bibliográficas sobre o tema, abrangendo a coleta de
informações em livros, sites, revistas e artigos. O estudo do tema desenvolveu-se em
três partes: Na primeira parte será descrito sobre a transferência de embriões
compreendendo desde sua aplicação até seu rastreamento e avaliação. Na segunda
parte será descrito sobre a fertilização “in vitro” observando desde suas vantagens
até a classificação de embriões. Na terceira parte será descrito sobre a aspiração
folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia
ovariana até a sincronização da onda para superovulação. Conclui-se através desse
estudo que são bem maiores as vantagens do que as desvantagens da transferência
de embrião e fertilização “in vitro” em bovinos. Espera-se que este trabalho possa
contribuir para um melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da
transferência de embrião e fertilização “in vitro” (FIV), pois foram descorridos vários
procedimentos utilizados para transferência embrião e fertilização “in vitro” em
bovinos (FIV).
Palavras-chave: transferência embrião; fertilização “in vitro”; bovinos.
ABSTRACT
The objective of this study is to contribute for one better agreement, perfectioning and
expansion of the embryo transference and fertilização “in vitro” (FIV). The
methodology used for this study is called theoretical analysis, where bibliographical
revisions on the subject had been made, enclosing the collection of information in
books, sites, magazines and articles. The study of the subject it was developed in
three parts: In the first part he will be described on the transference of embryos
understanding since its application until its tracking and evaluation. In the second part
in will be described on the fertilização “in vitro” observing since its advantages until
the classification of embryos. In the third part he will be described on the aspiration to
folicular guided for extreme-sonografia (OPU-FIV), understanding since the ovariana
physiology until the synchronization of the wave for superovulação. It is concluded
through this study that is well bigger the advantages of what the disadvantages of the
embryo transference and fertilização “in vitro” in bovines. One expects that this work
can contribute for one better agreement, perfectioning and expansion of the embryo
transference and fertilização “in vitro” (FIV), therefore had been descorridos some
procedures used for transference embryo and fertilização “in vitro” in bovines (FIV).
Word-key: transference embryo; fertilização “in vitro”; bovines.
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................ iii
LISTA DE TABELAS............................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... x
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................11
2. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES..................................................................13
2.1 Aplicações e Limitações.............................................................................13
2.2 Seleção da doadora....................................................................................14
2.3 Superovulação............................................................................................14
2.4 Esquema de tratamento para a superovulação..........................................15
2.4.1 ECG (ou PMSG)...................................................................................16
2.4.2 FSH.......................................................................................................16
2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulação..........................17
2.5.1 Dose do hormônio.................................................................................17
2.5.2 Idade da doadora..................................................................................17
2.5.3 Pureza do hormônio..............................................................................17
2.5.4 Condições estressantes........................................................................18
2.5.5 Dia do inicio do tratamento...................................................................18
2.6 Superovulação associada a implantes de progesterona............................18
2.7 Sincronização do estro...............................................................................19
2.7.1 Métodos de sincronização....................................................................19
2.7.1.1 Luteolíticos......................................................................................19
2.7.1.2 Progestágenos................................................................................20
2.8 Seleção das receptoras..............................................................................20
2.9 Coleta dos embriões...................................................................................22
2.9.1 Rastreamento e avaliação..................................................................24
2.9.2 Classificação quanto ao estágio de desenvolvimento........................25
3. FERTILIZAÇÃO "IN VITRO".............................................................................29
3.1 Vantagens...................................................................................................29
3.2 Coleta de Ovócitos.....................................................................................30
3.3 Recuperação Ovocitária.............................................................................31
3.3.1 Utilizando doadoras superovuladas...................................................31
3.4 Utilizando doadoras não superovuladas.....................................................31
3.5 Coleta in vitro..............................................................................................32
3.5.1 Método in vitro....................................................................................32
3.6 Maturação do Ovócito.................................................................................32
3.7 Preparação Espermática.............................................................................34
3.8 Fecundação in vitro....................................................................................35
3.8.1 Cultivo de embriões in vitro................................................................36
3.8.2 Classificações dos embriões..............................................................37
4.
ASPIRACÃO
FOLICULAR
GUIADA
POR
ULTRASONOGRAFIA
(OPU-
FIV)........................................................................................................................41
4.1. Fisiologia ovariana.....................................................................................41
4.2. Aplicações da técnica................................................................................42
4.2.1 Produção de maior número de embriões..............................................42
4.2.2. Menor intervalo entre gerações...........................................................43
4.2.3. Melhor aproveitamento dos animais....................................................44
4.3 Avaliação morfológica dos ovócitos............................................................44
4.4. Pesquisas na área da embriologia............................................................45
4.5 Produção in vitro de embriões (PIV)...........................................................46
4.6. Produtos obtidos de vacas que não respondem à superovulação............48
4.7 Produtos obtidos de animais com problemas reprodutivos........................48
4.8 Utilização de animais mortos......................................................................49
4.9 Pré-Seleção de Touros...............................................................................49
4.10 Recuperação............................................................................................50
4.10.1 Ovário de matadouro com ou sem identificação.................................50
4.10.2 Colheita de ovários e ovidutos............................................................50
4.10.3 Colheita e seleção de oócitos.............................................................51
4.11 Vacas "acidentadas".................................................................................52
4.12 Fatores de variação em programas de OPU............................................52
4.13 Técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som................................55
4.13.1 Procedimentos.......................................................................................55
4.14 Superovulação..........................................................................................57
4.14.1 Vantagens...........................................................................................57
4.14.2 Desvantagens.....................................................................................58
4.15 Variações na recuperação........................................................................59
4.15.1 Diferença entre animais......................................................................59
4.15.2 Variações entre operadores................................................................59
4.15.3 Variações do comportamento do animal.............................................60
4.15.4 Tipo de Animal....................................................................................60
4.15.5 Variações com o tipo de equipamento utilizado..................................60
4.15.6 Freqüência da aspiração.....................................................................61
4.16 Amniocentese...........................................................................................62
4.16.1 Sincronização da onda para Superovulação......................................62
CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................67
LISTA DE TABELAS
Tabela
1
–
Classificação
dos
embriões
bovinos
quanto
ao
estágio
desenvolvimento e idade aproximada....................................................................26
Tabela 2 - Classificação dos embriões bovinos quanto a sua qualidade..............27
Tabela 3 – Preparação de meios...........................................................................63
Tabela 4 – Meio de Transporte..............................................................................63
Tabela 5 - *TCC 199 HEPES.................................................................................64
de
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-Transferência de embriões......................................................................23
Figura 2 - Esquema de montagem dos embriões em palhetas.............................28
Figura 3 - Ovócito bovino imaturo, logo após a punção.........................................33
Figura 4 - Embriões bovinos produzidos in vitro, 48h após a FIV..........................33
Figura 5 – Mórula compactada..............................................................................37
Figura 6 – Blastocisto inicial...................................................................................38
Figura 7 – Blastocisto.............................................................................................38
Figura 8 – Blastocisto expandido...........................................................................39
Figura 9- Blastocisto eclodido................................................................................39
1. INTRODUÇÃO
A técnica de transferência de embriões (T.E.) se
desenvolve rapidamente na pecuária bovina brasileira. Com ela, o melhoramento
genético pode ser efetuado com mais rapidez e eficiência, mesmo em pequenas
populações de animais, com a disseminação do material genético de uma fêmea
zootecnicamente superior.
Com a finalidade de aproveitamento da capacidade
reprodutiva de animais geneticamente superiores e tendo conhecimento da fisiologia
ovariana, deu-se o desenvolvimento de protocolos hormonais possibilitando assim a
ovulação múltipla seguida da transferência de embriões.
Embora com grandes avanços nos últimos anos, o
procedimento ainda é pouco difundido, quer pelo custo relativamente elevado, quer
pela variação nos resultados (FERNANDES, 2001).
O objetivo do presente trabalho tem como finalidade
contribuir para um melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da
transferência de embrião e fertilização “in vitro” (FIV) em bovinos.
A metodologia utilizada para esse estudo é denominada
análise teórica, segundo Tachizawa (1989), esse método consiste em:
•
Uma simples, organização coerente de idéias
originarias de bibliografia de alto nível, em torno
de um tema específico;
•
Uma análise crítica ou comparativa de uma obra,
teoria ou modelo já existente, a partir de um
esquema conceitual bem definido;
•
O
desenvolvimento
realmente
inovadora,
de
uma
monografia
a
partir
de
fontes
exclusivamente bibliográficas.
Utiliza-se uma revisão bibliográfica sobre o tema,
abrangendo a coleta de informações em livros, sites, revistas e artigos, englobando
assim maiores informações sobre o tema proposto.
O estudo do tema desenvolveu-se em três partes: Na
primeira parte será descrito sobre a transferência de embriões compreendendo
desde sua aplicação até seu rastreamento e avaliação.
Na segunda parte será descrito sobre a fertilização “in
vitro” observando desde suas vantagens até a classificação de embriões.
Na terceira parte será descrito sobre a aspiração
folicular guiada por ultra-sonografia (OPU-FIV), compreendendo desde a fisiologia
ovariana até a sincronização da onda para superovulação.
2. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
2.1 Aplicações e Limitações
Assim como qualquer outra técnica aplicada à pecuária,
a transferência de embriões apresenta vantagens ou aplicações e também algumas
restrições e limitações à sua utilização.
As principais são:
•
Multiplicação rápida de um genótipo superior;
•
Facilita transporte e estocagem de material genético;
•
Permite controle de doenças;
•
Controle do sexo do produto;
•
Produção de descendentes de um animal jovem.
As principais limitações são:
•
Custo operacional;
•
Condições mínimas.
Existem algumas condições do animal e principalmente
da propriedade, que devem ser levadas em consideração antes de se iniciar um
programa de T.E.. As principais são descritas a seguir.
•
Doadoras geneticamente superiores;
•
Aspecto sanitário do rebanho;
•
Nutrição e reprodução;
•
Mão-de-obra (FERNANDES, 2001).
2.2 Seleção da doadora
Antes de iniciar um programa de T.E., a avaliação da
doadora pode eliminar o risco de aborrecimentos futuros. As características
principais a serem consideradas são as seguintes:
•
Geneticamente superior;
•
Não apresentar anomalias congênitas e/ou hereditárias;
•
Histórico de boa fertilidade;
•
Trato genital compatível com a técnica e sem alterações;
•
Boa condição corporal;
•
Livre de doenças infecto-contagiosas;
•
Banho em tripsina limpa os embriões de patógenos;
•
Fora de qualquer condição de estresse;
•
CicIando regularmente (FERNANDES, 2001).
2.3 Superovulação
Tem como objetivo estimular, através de administração
de hormônios, o desenvolvimento de um grande número de folículos até o estágio no
qual possa ovular. Estes folículos a mais que se tornam "ovulatórios", pertencem a
uma onda de desenvolvimento, e normalmente sofreriam atresia. Com a indução
hormonal, fornecemos a estes folículos também a condição de ovular. Desta forma, a
afirmação que ocorre um desgaste reprodutivo da doadora, não é verdade.
Geralmente não se utiliza hormônio visando a ovulação direta dos folículos. A onda
pré-ovulatória de LH, que provocaria a ovulação de um folículo único no caso de um
ciclo normal, geralmente é suficiente para luzir a ovulação de todos que possuam
condição para tal, após um processo indução hormonal. A utilização de análogos do
GnRH para melhorar a taxa ovulação apresenta resultados discordantes na literatura,
porém pode ser alternativa para melhorar os resultados de determinados animais. É
a etapa menos possível dentro da técnica de T. E. (FERNANDES, 2001).
A variação dos resultados da superovulação é o
principal fator limitante à grande contribuição que a técnica de transferência de
embriões (T .E.) pode fornecer ao melhoramento genético é necessário um controle
rígido das variáveis possíveis, para que o processo de superovulação possa ser uma
etapa mais previsível dentro do contexto da T.E.. O objetivo principal da
superovulação é produzir um grande numero de ovulações e obter um número
correspondente de embriões viáveis, que resultem em uma elevada taxa de gestação
nas receptoras (FERNANDES, 2001).
2.4 Esquema de tratamento para a superovulação
Independente do tipo de hormônio a ser utilizado,
quando se visa a estimulação de um grande numero de folículos, devem-se ter em
mente quando iniciar o tratamento, pois aqueles folículos que já entraram em atresia
não podem ser mais estimulados a desenvolverem. Assim, os protocolos de
superovulação devem iniciar numa fase da onda de desenvolvimento folicular onde o
folículo dominante ainda não tenha provocado o início da atresia dos subordinados.
As principais bases utilizadas são as seguintes:
2.4.1 ECG (ou PMSG)
Trata-se de um hormônio denominado Gonadotrofina
Coriônica Eqüina. É obtido do soro de éguas entre a 40.º e 100.º dia de gestação.
Possui ação semelhante ao FSH e LH na mesma molécula.
2.4.2 FSH
É a preparação hormonal mais utilizada para a
superovulação de bovinos. Em sua maioria, os produtos hoje disponíveis no
mercado, têm origem suína ou ovina, sendo extraído da hipófise destas espécies.
Utilizam-se geralmente 8 aplicações, intervaladas de 12 horas. Alguns autores
utilizam doses iguais, porém preferem dose total (100%) e divide a mesma em 8
doses menores, em regime decrescente. Este esquema pode ser usado para
qualquer produto a base de FSH. A prostaglandina é aplicada simultaneamente a 7ª.
e/ou 8ª. dose de FSH, e visa a regressão do corpo lúteo formado no dia 0 (cio base),
levando a redução na taxa de progesterona, removendo o bloqueio na secreção de
GnRH, dando início a um novo ciclo. Quando ocorrer a onda de LH, esta
teoricamente encontrará uma série de folículos em condições de ovular, devido à
indução hormonal (FERNANDES, 2001).
A aplicação de prostaglandina no terceiro dia de
superovulação, como executada por alguns profissionais, às vezes faz com que o
animal manifeste cio antes da última dose de FSH, que neste caso, não teria mais
efeito.
2.5 Fatores que interferem nos resultados da superovulação
2.5.1 Dose do hormônio
Infelizmente é um fator que possui muita variação individual, e mesmo num
animal, entre as coletas.
2.5.2 Idade da doadora
Existe uma variação na resposta dos animais de acordo
com a idade que deve ser levada em consideração.
2.5.3 Pureza do hormônio
Para produtos a base de FSH, a pureza diz respeito à
relação FSH: LH da preparação.
2.5.4 Condições estressantes
Além de qualquer condição patológica, como as
descritas acima, um dos principais fatores estressantes, que existe em praticamente
em todas as regiões do país, e o estresse térmico.
2.5.5 Dia do inicio do tratamento
O tratamento superovulatório deve começar próximo ao
início de uma onda de desenvolvimento folicular, porém os animais geralmente
possuem duas ondas por ciclo, podendo inclusive, ter 3 ou até mesmo 4, sendo isto
menos freqüente (FERNANDES, 2001).
2.6 Superovulação associada a implantes de progesterona
Trata-se de uma técnica desenvolvida recentemente,
onde
é
possível
iniciar
o
tratamento
superovulatório
das
doadoras,
independentemente do dia do ciclo estral no qual as mesmas se encontram. É um
procedimento muito interessante por facilitar a programação de coletas, em
diferentes propriedades e também de auxiliar no agrupamento de doadoras a serem
coletadas no mesmo período. Para tal procedimento é necessária a sincronização
previa da onda de crescimento folicular (GnRH ou Benzoato de Estradiol), além do
uso de um implante de progesterona (Crestar ou CIDR), que vai funcionar como um
corpo lúteo artificial, durante o processo de superovulação (FERNANDES, 2001).
2.7 Sincronização do estro
A sincronização do estro tem sido amplamente
utilizada, tanto em casos de monta natural ou inseminação artificial, como na técnica
de transferência de embriões, para qual é imprescindível.
O principal aspecto fisiológico da sincronização de estro
entre doadoras e receptoras, é que devemos retirar o embrião de um ambiente (útero
da doadora) e colocá-Io em outro ambiente (útero da receptora), com condições o
mais semelhantes possível, daquelas de origem. A transferência de embriões para
receptoras não sincronizadas reduz drasticamente a taxa de gestação.
2.7.1 Métodos de sincronização
Antecipando ou atrasando a próxima manifestação de
estro. Qualquer uma destas formas necessita que os animais que vão ser
sincronizados estejam cicIando regularmente.
A relação dos métodos e drogas mais empregadas
encontram-se nos subitens abaixo relacionados:
2.7.1.1 Luteolíticos
Age provocando uma antecipação do próximo estro
(cio), pela regressão do corpo lúteo antes de um período normal (lise do CL =
Luteolíticos). Em média, o estro ocorre de 36 a 72 horas após a aplicação. Quando
sincronizamos o estro através de PGF2a, de uma doadora (durante superovulação)
com um grupo de receptoras, estas últimas devem receber o luteolítico de 12 a 14
horas antes da doadora, pois a doadora geralmente manifesta estro mais cedo.
2.7.1.2 Progestágenos
É base de progesterona, atuam prolongando o ciclo
estral e atrasando o próximo estro. Agem basicamente bloqueando o GnRH,
funcionando como um CL artificial. Este tratamento deve ser utilizado por no mínimo
9 dias, quando então é interrompido abruptamente, removendo desta forma o
bloqueio que a progesterona exógena exercia sobre a secreção de GnRH, dando
condições para o inicio de um novo cicIo, pela manifestação de estro (FERNANDES,
2001).
2.8 Seleção das receptoras
Num programa de T.E., geralmente tem um cuidado
extremado com as doadoras, e relegam-se as receptoras a um segundo plano.
Porém um dos principais pontos de estrangulamento na difusão desta tecnologia diz
respeito à taxa de gestação das receptoras. Os principais critérios a serem
observados são os seguintes:
A. Sem anomalias no trato genital
Um exame ginecológico deve ser realizado em todas as
candidatas a futuras receptoras.
B. Boa fertilidade, ciclos regulares
As receptoras devem ser as fêmeas mais férteis do
plantel.
C. Boa condição corporal
Esta associada a uma nutrição adequada.
D. Sanitariamente perfeita
Não é admissível que uma receptora, depois de
gestante venha a perder a gestação devido a alguma doença infecto-contagiosa, que
poderia ser facilmente diagnosticada durante o processo de seleção.
E. Boa estatura
A importância deste fator vem da necessidade de um
parto sem complicações. Caso haja mais receptoras que embriões, selecionar as
mesmas por grau de sincronia: característica do corpo lúteo: escore corporal e
fertilidade anterior (FERNANDES, 2001).
2.9 Coleta dos embriões
A coleta dos embriões é feita pelo método não cirúrgico
ou transcervical, em um período entre 6 a 8 dias após o estro, onde a doadora foi
inseminada. A doadora deve estar bem contida. Inicialmente faz-se uma avaliação da
resposta superovulatória, através da contagem por palpação via retal, do numero de
corpos lúteos em cada ovário. Uma limpeza do reto também facilitará outros
procedimentos. Feito isso, procede-se à anestesia epidural, com 6 a 7 ml de
xilocaína a 2% sem vasoconstritor. Após a cauda estar relaxada, deve ser amarrada
lateralmente ao animal. Prender a cauda para cima favorece a entrada de ar no reto
e dificulta a manipulação. Após isto, uma higienização do períneo com água e sabão
é necessária. Todo o sabão deve ser removido e a região seca. A vulva deve ser
lavada somente com água. O cateter (FOLEY) é introduzido no útero com o auxilio
de um mandril de aço. Este cateter é feito de borracha e possui duas vias. Uma que
dá
aceso
direto ao útero e a
outra utilizada
para inflar o balão
existente
extremidade.
na
Figura 1-Transferência de embriões (FERNANDES, 2001)
Este esquema de lavagem é feito de 5 a 7 vezes em
cada corno. Uma vez completado, o balonete é desinflado, retira-se o cateter e
posiciona-se o mesmo no outro corno, repetindo todos os procedimentos. Em uma
coleta (PBS), e cerca de 40 a 50 minutos. Terminada a coleta, o filtro é levado ao
"laboratório", e antes de ser solta a doadora deve receber uma ou duas doses de
PGF e se for necessário uma infusão com antibióticos para evitar a proliferação
bacteriana. Caso não apresente estro em 7 dias, deve ser novamente examinada e
se necessário receber uma nova dose de PGF.
Existem cateteres de vários modelos. Os mais comuns
são de uso humano. O diâmetro também varia (tamanhos de 16 a 24), e deve ser
adequado ao tipo de cérvix. Quando mais grosso o cateter mais difícil de passá-Io
pela cérvix, porém mais fácil é a coleta.
Uma vez transposta a cérvix, o cateter deve ser
posicionado, de forma que o balão seja inflado, com o líquido de coleta em um dos
cornos. O enchimento do balão é feito lentamente, com o operador monitorado. Com
o cateter posicionado, o circuito é conectado, e deixa-se o liquido de coleta entrar no
útero até o enchimento do como. Este procedimento, caso possível, deve ser feito
com o operador pressionando o limite entre o útero e tubas. O útero cheio é
levemente massageado, deixando-se então sair o líquido de coleta (FERNANDES,
2001).
Uma pessoa devera ficar responsável por este filtro
durante toda a coleta, pois é onde os embriões ficarão retidos, controlando o volume
de líquido no seu interior.
Este deve ter sempre uma quantidade de líquido, e ser
protegido de variações de temperatura e insolação direta. O líquido que sai do filtro é
coletado em um frasco estéril, para a avaliação posterior, quando necessário
(FERNANDES,2001).
2.9.1 Rastreamento e avaliação
Refere-se a localização dos embriões e classificação
dos mesmos. No laboratório o conteúdo do filtro de coleta é passado para uma placa
de Petri, com diâmetro entre 10 e 15 cm, com fundo quadriculado, para facilitar a
busca ou localização das estruturas, que é feito com microscópio estereoscópio, em
aumento de 10 a 20 vezes.
Em outra placa menor (3 cm de diâmetro), coloca-se
uma das soluções de manutenção existentes, que podem ser compostas de PBS
(liquido de coleta) com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), PBS com 0,4% de Albumina
Bovina (BSA), ou ainda soluções prontas como Meio Holding. Estas soluções têm a
função de proteger o embrião e evitar que o mesmo fique grudado nos recipientes ou
instrumentos de manipulação, uma vez localizado na placa de procura, o embrião; é
retirado desta por aspiração, é passado para a placa menor com uma das soluções
acima descrita (FERNANDES, 2001).
Completada a busca quando todas as estruturas da
placa de procura foram retiradas, procede-se então a classificação dos embriões que
se encontram na placa menor com o mesmo aparelho óptico citado acima, porém em
um aumento de 40 a 80 vezes. Esta é feita de acordo com dois parâmetros: estágio
de desenvolvimento e qualidade (FERNANDES, 2001).
2.9.2 Classificação quanto ao estágio de desenvolvimento
Esta classificação leva em consideração o aspecto
morfológico do embrião e as variações que ocorrem no mesmo durante seu
desenvolvimento iniciaI. Quando a coleta é feita entre 6 a 8 dias após o estro da
doadora geralmente são encontradas estruturas assim calcificadas:
•
16 células (16 c);
•
Mórula (M);
•
Mórula compacta (Mc);
•
Blastócito inicial (Bi);
•
Blastócito (Bl);
•
Blastócito expandido (Bex);
•
Blastócito eclodido (Bec).
As anotações referentes à classificação dos embriões
utilizam inicialmente a sigla do estágio de desenvolvimento e posteriormente a
qualidade. Por exemplo, um blastócito inicial de qualidade excelente seria: Bi 1, e
assim por diante. Este é um critério usado internacionalmente em T.E.
(FERNANDES, 2001).
Tabela 1 – Classificação dos embriões bovinos quanto ao estágio de
desenvolvimento e idade aproximada
Estágio de desenvolvimento
Idade aproximada (dias)
Mórula
5a6
Mórula Compacta
6
Blastócito inicial
6a7
Blastócito
7 a8
Blastócito expandido
8
Blastócito eclodido
9
Fonte: (FERNANDES, 2001)
Classificação quanto a qualidade
A qualidade dos embriões é avaliada, também pelo seu
aspecto morfológico, estando relacionada com a viabilidade dos mesmos. Os
principais parâmetros considerados para avaliação da qualidade são os seguintes:
•
Formato;
•
Simetria;
•
Coloração;
•
Extrusão celular;
•
Integridade da Zona Pelúcida.
A classificação quanto à qualidade é feita atribuindo-se
valores de 1 a 5, conforme a tabela 2.
Tabela 2 - Classificação dos embriões bovinos quanto a sua qualidade
Classificação
Qualidade
Comentários
1
Excelente
Praticamente nenhuma alteração
2
Bom
Pequenas alterações
3
Regular
Alterações significativas
4
Ruim
Bastante alterado (difícil avaliar)
5
Degenerado
Comprometimento morfológico
Fonte: (FERNANDES, 2001)
No caso de transferências não cirúrgicas, após a
classificação e distribuição dos embriões pelas receptoras, estes devem ser
envasados. É necessário mudá-Ios de solução lavando-os pelo menos 4 vezes, para
eliminação das impurezas presentes na Zona Pelúcida antes de colocá-Ios nas
palhetas. Utiliza-se uma outra solução idêntica aquela na qual estes foram
classificados (PBS com 10% de SFB, ou com 0,4% de BSA, ou outra solução de
manutenção).
ar
____________________________________________________
____________________________________________________
líquido
+
embrião
líquido
Figura 2 - Esquema de montagem dos embriões em palhetas
Fonte: (FERNANDES, 2001)
Os embriões são aspirados para o interior das palhetas
de 0,25 ml, previamente identificadas (estágio e qualidade), com o mesmo líquido
onde estão (PBS + 10% de SFB ou 0,4% de BSA). Para impedir que fiquem presos
no algodão da mesma, aspira-se, nesta ordem, uma coluna de liquido (1/4 do
comprimento da palheta), uma pequena bolha de ar, uma segunda coluna de líquido
(1/3 da palheta). Deve-se conferir na lupa se realmente o embrião se encontra dentro
da palheta após o envase, evitando a contaminação da porção aberta da mesma
(FERNANDES, 2001).
Com os embriões nas palhetas, estas são montadas
nos aplicadores, sendo então transferidos para as respectivas receptoras. Caso se
trabalhe com inovulações cirúrgicas, o embrião é aspirado para o anterior de um
pequeno cone plástico, chamado de Tom Cat, utilizado para esta finalidade,
acoplado a uma seringa de insulina.
3. FERTILIZAÇÃO "IN VITRO"
O primeiro bezerro nascido de FIV, a partir de um
ovócito, cuja maturação foi realizada in vitro, ocorreu em 1981 (BRACKETT et aI ,
1982).
A fêmea bovina tem em seus ovários ao nascimento em
tomo de 150.000 folículos primordiais. Ao chegar a puberdade este número diminui
para 12.000 a 86.000, e destes somente poucos chegam a ovulação durante a vida
desta fêmea, enquanto o restante sofre atresia (CAMPBELL et. aI, 1995).
A técnica de punção folicular guiado por ultra-som
permite maximizar o aproveitamento destes óvulos que fisiologicamente são
produzidos nos ovários de uma fêmea, levando-os a um sistema de produção in vitro
de embriões (PRETERSE et aI, 1988 ; PIVATO, et aI).
3.1 Vantagens
Além do aumento e da maior velocidade de produção
de bezerros, e conseqüentemente no ganho genético em carne ou leite, a produção
de embriões in vitro, a partir de material de vacas vivas, traz outros benefícios à
pesquisa e à produção, tais como:
•
Formação de banco de ovócitos criopreservados. O ovócito congelado
permitirá, no futuro, a regeneração de raças em extinção, pela fecundação in
vitro de tais ovócitos e transferência dos embriões para vacas receptoras.
•
Avaliação simultânea de diferentes acasalamentos em programas comerciais
de melhoramento animal.
•
Recuperação de material genético de vacas que apresentam problemas
reprodutivos adquiridos.
•
Produção de embriões a partir de fêmeas imaturas, diminuindo assim o
intervalo entre gerações.
3.2 Coleta de Ovócitos
A coleta dos ovócitos pode ser realizada pelo método
de Punção Folicular ou ovários provenientes de abatedouro. (Coleta in vitro). Este
método permite coletar, de forma repetida, os ovócitos por punção dos folículos
visualizados na tela de um ultra-som, podendo desta maneira otimizar a produção de
embriões a partir de cultivo in vitro para vacas de elevado valor genético.
Material necessário para punção folicular:
•
Ultra-som;
•
Sonda transvaginal de 5 ou 7,5 MHz;
•
Bomba à vácuo;
•
Sistema de agulhas (18 G e 58 cm) e cânulas;
•
Tubo de coleta.
3.3 Recuperação Ovocitária
3.3.1 Utilizando doadoras superovuladas
O número médio de ovócitos coletados em vacas
superovuladas é de 13 estruturas. Em novilhas cíclicas a média é de 9,5 ovócitos
recuperados. A utilização deste protocolo facilita a implantação desta técnica em um
laboratório, visto que a recuperação ovocitária é maior e a visualização dos folículos
para a punção é facilitado, quando comparado com doadoras não superovuladas.
Entretanto, a produção final de blastocistos, ao longo de um ano, é significativamente
menor.
3.4 Utilizando doadoras não superovuladas
O número médio de ovócitos coletados em vacas e
novilhas possui uma variação simples ou até dupla (desvio de 4,2 a 8,8 para as
médias respectivas). Enfim, o número médio de ovócitos recuperados é de 6 (seis)
estruturas por sessão de punção, podendo esta ser repetida a cada três dias, sem
causar danos maiores ao ovário. Embora este protocolo necessite de uma dedicação
maior (número de sessões), o número de produtos nascidos de uma doadora ao ano
é também, significativamente, maior.
3.5 Coleta in vitro
Os ovócitos podem ser coletados de ovários de
abatedouro. Após o abate das fêmeas, os ovários são coletados e transportados ao
laboratório, em solução PBS e são puncionados os folículos que medem entre 2-8
mm. de diâmetro.
3.5.1 Método in vitro
A maturação do ovócito é realizada em meio TCM 199,
adicionado de Soro
Fetal Bovino e de gonadotrofinas. Após 24 a 26 horas de
cultivo, os ovócitos são fecundados com o sêmen de touro escolhido. A escolha do
touro é baseada em critérios genéticos, mas igualmente sobre sua habilidade
fecundante in vitro. A fecundação in vitro é realizada na presença de heparina,
durante 18 horas, no meio TALP (Tyrode Albumina Lactato Piruvato). Os zigotos são
em seguida cultivados in vitro, até a obtenção de embriões transferíveis.
3.6 Maturação do Ovócito
A
maturação
envolve
mudanças
nucleares
e
citoplasmáticas no ovócito. O ovócito imaturo (ovócito primário) se encontra parado
no estágio de prófase da primeira divisão meiótica.
Figura 3 - Ovócito bovino imaturo, logo após a punção
Fonte: RHEINGANTZ (2007)
A maturação nuclear inicia-se com a retomada da
meiose pela quebra do envelope da vesícula germinal (germinal vesicle break down),
atingindo o estágio de metáfase I, 12 horas após o início do cultivo. A completa
maturação nuclear ocorre entre 20 e 24 horas e é marcada pela expulsão do primeiro
corpúsculo polar e formação da segunda placa metafásica (ovócito maturo).
Figura 4 - Embriões bovinos produzidos in vitro, 48h após a FIV.
Fonte: RHEINGANTZ (2007)
O
citoplasma
passa
igualmente
por
mudanças
significativas na síntese de proteínas, na migração e na reorganização de organelas.
Enquanto as mitocôndrias tendem a migrar para o centro do ovócito, os grânulos
corticais se deslocam em sentido contrário.
3.8 Preparação Espermática
Os espermatozóides encontrados no epidídimo, ou
mesmo recém-ejaculados, não possuem potencial fecundante, devendo, portanto,
para adquiri-lo sofrer ordenadas alterações funcionais e estruturais denominadas
capacitação espermática e reação de acrossoma (ROLDAN & GOMENDIO, 1992 ;
FLORMAN & FIRST, 1988a).
Durante o processo de capacitação espermática são
observadas profundas alterações da composição de membrana plasmática dos
espermatozóides, levando a um aumento da difusão iônica e glicoproteíca,
resultando em uma mudança significativa de seus padrões metabólicos (LANGLAIS
& ROBERTS, 1985).
A reação de acrossoma é um evento deflagrado pela
ligação do espermatozóide a membrana pelúcida.
Sendo caracterizado por uma
extensa fusão e posterior vesiculação e destruição das membranas plasmática e
acrossômica externa, expondo a membrana acrossômica interna e permitindo uma
ordenada liberação do conteúdo enzimático presente no acrossoma. Com a reação
do acrossoma concluída, os espermatozóides atingem seu padrão máximo de
hiperativação, tomando-se capazes de transpor a membrana pelúcida e promover a
fecundação. A heparina possui um preponderante papel no processo da fecundação,
visto que, com a sua ligação ao espermatozóide, observa-se extensa formação de
sítios de ligação para receptores de membrana pelúcida. Com isso, alguns autores
relacionam o potencial de fertilidade de touros, in vivo, com quantidade destas HBPs
(PARRISH, 1988 ; BLEIL & WASSARMAN, 1983 ; FLORMAN & FIRST, 1988b ;
MYLES, 1993 ; KANDELL et. aI., 1992; BELLIN et. aI., 1993 ; KILLIAN et. aI., 1993).
3.8 Fecundação in vitro
A fecundação propriamente dita é, na verdade uma
reação em cascata, desencadeada pela passagem do espermatozóide pela
membrana pelúcida, penetração na membrana plasmática e seu alojamento no
interior do citoplasma ovocitário. Essa fusão envolve todo o espermatozóide, de
maneira que a cauda também se integra ao citoplasma, fato esse fundamental para a
estruturação do cito-esqueleto do primeiro ciclo celular (LONG et aI., 1993).
A fusão do espermatozóide induz a ativação do ovócito,
representada inicialmente por mudanças do potencial transmembranário e uma
mobilização maciça do Ca++. Na seqüência, é observada a exocitose dos grânulos
corticais e conseqüente impermeabilização da membrana pelúcida; queda do
(MATURATION/ MITOSIS/ M-PHASE PROMOTING FACTOR) MPF; conclusão da
segunda divisão meiótica e expulsão do segundo corpúsculo polar; e modificações
das propriedades corticais do ovo (CROZET, 1991).
Com a queda do MPF dá-se início a descondensação
da cromatina do espermatozóide e dos cromossomos femininos, formando-se, assim,
ambos os pro-núcleos, masculino e feminino. Os pró-núcleos migram para o centro
do ovo, onde, após a quebra dos envelopes nucleares, os cromossomos se pareiam
em um único fuso, ocorrendo assim a singamia (LONG et aI., 1993).
Os ovócitos serão depositados em tubos contendo meio
definido para fecundação. Imediatamente após efetua-se a inseminação dos ovócitos
que serão cultivados por 18 horas, nas mesmas condições da maturação.
3.8.1 Cultivo de embriões in vitro
O desenvolvimento de um sistema eficiente de cultivo
de embriões in vitro é um dos maiores entraves no atual estágio das pesquisas. O
desafio passa pelo desenvolvimento de um sistema de co-cultivo, condições de
cultivo e desenvolvimento de meios quimicamente definidos, evitando, de certa
forma, a passagem em hospedeiros intermediários.
Os meios mais utilizados têm sido o TCM-199 e o B2
(INRA-menézo), acrescidos de antibióticos, soro fetal bovino e/ou soro de vaca em
cio, e piruvato (GOTO et aI., 1988; PAVLOK et aI., 1989 e MENCK, 1994).
Uma gama de células tem sido testada no co-cultivo de
embriões, sendo que as mais utilizadas são as células do oviduto em suspensão ou
em monocamadas, as células da granulosa em monocamada e células VERO,
igualmente em monocamada (FONTES, 1993; BERG e BREM, 1989 e MENCK,
1994).
Fontes (1993), informa o uso de um suporte extracelular
(matrigel) na co-cultura em monocamada de células do oviduto, mostrando algumas
tendências da pesquisa neste segmento. Os meios condicionados por apresentarem
resultados inferiores aos sistemas de co-cultivo direto têm sido usados somente em
condições específicas. A maior limitação encontrada nos sistemas de cultivo diz
respeito a qualidade dos embriões produzidos. A passagem dos embriões de FIV,
temporariamente em ovidutos de ovelhas, tem melhorado a qualidade dos embriões
permitindo melhores índices de gestação pós-transferência.
3.8.2 Classificações dos embriões
Os embriões são classificados em:
Mórula compactada
Figura 5 – Mórula compactada
Fonte: (CLÍNICA TAMBRE, 2007)
Os blastômeros estão agregados entre si, formando
uma massa compacta de células e ocupam cerca de 70% do espaço perivitelino.
Blastocisto inicial
Nesta fase pode ser observado o início da blastocele.
Começa a ocorrer a diferenciação entre trofoblasto e botão embrionário.
Figura 6 – Blastocisto inicial
Fonte: (CLÍNICA TAMBRE, 2007)
Blastocisto
Ocorre uma evidente diferenciação entre células do
trofoblasto e botão embrionário.
Figura 7 – Blastocisto
Fonte: (CLÍNICA TAMBRE, 2007)
Blastocisto expandido
O embrião ocupa todo o espaço perivitelino. O líquido
da blastocele empurra o trofoblasto contra a membrana pelúcida.
Figura 8 – Blastocisto expandido
Fonte: (CLÍNICA TAMBRE, 2007)
Blastocisto eclodido
Figura 9 – Blastocisto
eclodido
Fonte: (CENARGEN & EMBRAPA, 2001)
O embrião está completamente livre da membrana
pelúcida (CENARGEN & EMBRAPA, 2001). É possível obter um grande avanço
genético quando se utiliza está técnica, através da coleta em animais pré-púberes,
pela diminuição do intervalo entre gerações (CENATTE, 2001).
4. ASPIRACÃO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONOGRAFIA
(OPU-FIV)
4.1. Fisiologia ovariana
No terço médio da gestação, o ovário do feto bovino já
está repleto de oogônias; e estas oogônias estão contidas em folículos primordiais
(pré-antrais, com uma única camada de células da granulosa), e os estágios iniciais
do crescimento folicular iniciam-se antes do nascimento (ERICKSON, 1966 ;
MARION et aI., 1968).
Ao nascimento existem cerca de 0.5 milhão de folículos
nos ovários bovinos e estes, gradualmente deixam seu estado de dormência e
iniciam um desenvolvimento para folículos antrais. Uma vez que se iniciou o
desenvolvimento, um desses eventos irá ocorrer: ovulação ou atresia. Praticamente
todos os folículos sofrem atresia. Isto pode ser demonstrado ao calcularmos que, um
animal ciclando normalmente num período de 15 anos vai ovular menos de 300
oócitos (ovulando a cada 21 dias ou 17.4 vezes ao ano, multiplicado por 15 = 260
ovulações) dentre os 0.5 milhões existentes ao nascimento (ERICKSON, 1966).
Isto sem contar que os animais chegam a passar
metade de suas vidas prenhes. Fica claro, portanto, que
menos de 0.1 %
dos
folículos chegam a ovular. Aparentemente, são necessários 60 dias para que um
folículo primordial ativado atinja o tamanho ovulatório (LUSSIER et aI., 1987).
Neste
período,
seguindo
um
padrão
de
ondas
foliculares, ocorrem várias fases de crescimento e atresia folicular com subseqüente
maturação ou degeneração oócitária (WILTBANK et aI., 1996).
Novas biotecnologias visam o aproveitamento destes
folículos para a recuperação dos oócitos e posterior manipulação. A seguir serão
descritas algumas delas.
4.2. Aplicações da técnica
4.2.1 Produção de maior número de embriões
Uma vez que pela monta natural ou inseminação
artificial (IA), podemos obter apenas um produto por vaca ao ano, novas biotécnicas
foram desenvolvidas para acelerar os processos de melhoramento genético. Assim
sendo, com o advento da superovulação e posterior transferência de embriões
(MOET - multi ovulation and embryo transfer), foi possível obter-se em média a
produção de 25 embriões ao ano, totalizando cerca de 100 embriões na vida
reprodutiva de uma vaca. (SAUMANDE et aI., 1984)
Kruip et aI. (1994) estudaram a eficácia da punção
folicular transvaginal orientada por ultra-som em vacas leiteiras e de corte, obtendo
uma média de 8.0 oócitos colhidos por sessão, sendo que 16% desenvolveram em
embriões transferíveis após MIV /FIV /CIV (maturação, fecundação e cultivo in vitro)
com uma taxa de prenhez de 40% a 50%. Baseado no número médio de oócitos
colhidos por sessão, é possível transferir 2 embriões/semana/vaca, resultando em 1
bezerro.
4.2.2. Menor intervalo entre gerações
O intervalo entre gerações é um dos elementos chave
em qualquer abordagem sobre melhoramento genético animal (BERRERIDGE, K. J.
et aI., 1989).
O desenvolvimento de folículos antrais em bezerras
desde 2 semanas de idade, o conhecimento das ondas foliculares e a habilidade de
superestimular o desenvolvimento folicular nesta categoria de animais, oferece a
possibilidade de se utilizar animais pré-púberes para a recuperação de oócitos
bovinos. Tais oócitos têm a mesma competência para a FIV quando comparados aos
obtidos de animais adultos, porém o número de oócitos recuperados em bezerras
tende a ser 20% menor (NIBART et al.,1995).
Assim
sendo,
o
intervalo
entre
gerações
ficou
obviamente diminuído, permitindo uma avaliação precoce do potencial genético
destes animais.
As grandes dificuldades da utilização de bezerras era a
contenção dos ovários, uma vez que apalpação retal é limitada pelo pequeno
diâmetro do orifício anal. Portanto, o probe utilizado nestes animais deveria possuir
dimensões reduzidas (por exemplo, a probe humana) e, para bezerras pequenas
demais, usavam agulhas muito afiadas, pois não havia como conter os ovários.
A superovulação (SOV) também pode ser utilizada em
novilhas conseguiram aumentar o número de oócitos recuperados, bem como o
número de folículos visíveis (BROGLIATII & ADAMS, 1996).
4.2.3. Melhor aproveitamento dos animais
Conforme citado no item anterior, as doadoras de
oócitos podiam ser utilizadas muito precocemente, e, assim sendo, o início de sua
vida reprodutiva era muito antecipado. Da mesma forma da aspiração folicular de
vacas senis, bem como de e vacas prenhes até o 3.º mês de gestação, permitiram a
produção de embriões pela aspiração guiada por ultra-som. Então foi concluído que
as vacas podem produzir descendentes, praticamente desde o seu nascimento até
depois da perda da ciclicidade, ou seja, nos tempos atuais pode-se conseguir um
número muito mais elevado de prenhes, com o uso da tecnologia do que em tempos
anteriores, que só era possível uma por ano.
4.3 Avaliação morfológica dos ovócitos
A morfologia das células do cumulus oophorus e o
aspecto citoplasmático do ovócito ao microscópio são considerados como os
parâmetros mais importantes para o julgamento da qualidade ovocitária e,
conseqüentemente, de sua aptidão para o desenvolvimento embrionário.
. As células do cumulus são ligadas ao ovócito por
intermédio de junções GAP permeáveis que permitem as trocas iônicas e
eletrolíticas, entre o meio e o ovócito. Estas células são responsáveis pela secreção
de certas substâncias necessárias a maturação do ovócito, tais como o IGF1, fator
de crescimento importante a maturação citoplasmática. A presença de um cumulus
intacto por pelo menos 12 horas é indispensável a esta maturação.
Konishi et aI (1996), demonstraram por adição de
células da granulosa ao meio de maturação dos ovócitos, que a capacidade de
desenvolvimento embrionário era incrementada. Confirmando as conclusões de
segundo as quais a taxa de desenvolvimento aumenta com o número de células em
tomo do ovócito (YANG & LU 1990 ; KING et aI 1998).
Estas células não possuem nenhum efeito sobre a
capacitação do espermatozóide (MARQUANTLE GUIENNE, 1991).
Outras observações relacionaram o tamanho do ovócito
e o aspecto do citoplasma a maturação e ao desenvolvimento após a fecundação.
Os ovócitos que possuíam um citoplasma denso e homogêneo possuíam taxas de
clivagem e de desenvolvimento ao estágio de blastocisto mais elevado que os
ovócitos que apresentavam citoplasma claro e irregular. Os ovócitos de diâmetro
inferior a 3 mm, possuíam uma maturação nuclear e citoplasmática incompletas no
momento da fecundação in vitro, e, portanto, eram menos capazes de suportar um
desenvolvimento ao estado de blastocisto (KING et aI, 1998).
4.4. Pesquisas na área da embriologia
A fecundação in vitro nos permite acompanhar passo a
passo o início do desenvolvimento embrionário. Desta forma, podemos estudar os
processos fisiológicos e patológicos correspondentes, bem como a embriotoxicidade
de certas drogas e um processo complexo como diferenciação celular.
4.5 Produção in vitro de embriões (PIV)
A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é
considerada a terceira biotecnologia na área de reprodução seguindo a IA e a TE.
Esta biotecnologia consagrou-se quando, em 1981, nasceu o primeiro bezerro
oriundo de fecundação in vitro utilizando ovócitos maturados in vivo e sêmen fresco
(BRACKETT et al 1982).
A partir de 1986, tomou-se possível a fecundação in
vitro de ovócitos maturados in vitro utilizando sêmen congelado (CHENG et aI 1986;
CROZET et al 1987; LEBFRIED-RUTLEDGE et aI. 1987 ; PARRISH et aI, 1986).
Pieterse et aI (1988), descreveram o método de punção
foIicular (OPU), do inglês "Ovulum Pick-up”, para a recuperação de ovócitos a partir
de fêmeas vivas.
No Brasil, os primeiros produtos de PIV foram obtidos
em 1994 utilizando ovócitos imaturos, sêmen descongelado e sistemas de co-cultivo.
Esta evolução tomou-se possível em função de progressos realizados na definição
de condições de cultivo apropriadas (HEYMAN & MENEZO, 1987).
A PIV tomou-se uma tecnologia promissora tanto para o
estudo da embriologia básica quanto para a produção animal representando um
importante procedimento para o estudo dos mecanismos relacionados à maturação
final e interação dos gametas e o desenvolvimento embrionário subseqüente
(MENCK, 1994 ; FOOTE, 1993; LOBO et aI, 1994; LOBO, 1996). Além disso,
permitiu o desenvolvimento de estudos sobre maturação, fecundação e cultivo in
vitro,
clonagem,
bipartição,
microinjeção
de
DNA
exógeno,
sexagem,
congelação/descongelação de embriões (AVERY & GREVE, 1993 ; AZAMBUJA,
1994 ; WATANABE, 1993 ; KEEFER, 1993).
A produção de embriões in vitro viabiliza a introdução
de inovações tecnológicas na área de reprodução animal assim como acelera o
progresso genético dos bovinos submetidos a programas de melhoramento. Também
um maior aproveitamento das fêmeas considerando a potencial viabilidade dos
milhares de ovócitos que permanecem latentes no ovário bovino, permitindo à fêmea
gerar uma progênie maior que a “esperada em sua vida útil reprodutiva”.
Comercialmente, a PIV é utilizada para maximizar a produtividade do rebanho
bovino, superar a infertilidade adquirida e não transmissível de fêmeas de alto valor
econômico e de grande potencial produtivo, produzir bezerros trangênicos e prover
grande quantidade de embriões sexados (BRACKETT & ZUELKE, 1993).
Uma extensiva exploração comercial e científica da PIV
foi obtida nos últimos dez anos, devido a utilização em larga escala de ovários
provenientes de matadouros para MIV e FIV de ovócitos, que permitiu a produção de
embriões a um custo baixo. No entanto, a realização de PIV· com ovócitos oriundos
de matadouros apresentam algumas desvantagens tais como:
•
O tempo para que o material chegue ao laboratório;
•
Desconhecimento sobre as condições sanitárias ou o padrão hormonal dos
animais;
•
A não repetibilidade da técnica para um animal.
Neste contexto, a busca por ovócitos de melhor
qualidade conduziu a técnicas que permitissem o aproveitamento de ovócitos de
arrimais vivos (BOLS et aI, 1995; BROGLIATTI & ADAMS, 1996 e 1998).
4.6. Produtos obtidos de vacas que não respondem à superovulação
Uma vez que a OPU-FIV não requer tratamento
hormonal para o seu sucesso, pode-se aproveitar de forma muito mais eficiente
animais que não respondem à superovulação, seja por anomalias adquiridas
(resistência ao hormônio) ou por serem refratárias à SOB. Assim sendo, vacas que
possuem grande potencial genético podem ser doadoras de oócitos, não importando
mais sua resposta à SOV.
4.7 Produtos obtidos de animais com problemas reprodutivos
Muitos são os casos de animais inférteis ou subférteis
por problemas adquiridos. São freqüentes os casos de aderências de ovário e útero,
metrites crônicas, infecções tubáricas e outras patologias. A OPU-FIV permite a
produção de progênie de animais com tais enfermidades, uma vez que ela não
necessita do restante do aparelho reprodutivo, bastando o ovário possuir folículos de
tamanho suficiente para a aspiração.
Os resultados obtidos de animais com tais patologias
não diferem dos resultados obtidos de animais saudáveis.
4.8 Utilização de animais mortos
São freqüentes os casos de proprietários que desejam
obter mais crias de uma vaca acidentada, enferma ou morta. A remoção dos ovários
destes animais pode resultar na recuperação de oócitos viáveis e posterior produção
de progênie. Assim sendo, um animal recém morto ou ante-mortem ainda pode
produzir um descendente. Temos que levar em conta que a temperatura é um
aspecto muito importante. Os oócitos são extremamente sensíveis às alterações de
temperatura. A exposição dos oócitos à temperatura de 25°C por apenas 10 minutos
pode causar alterações severas no seu cito-esqueleto.
4.9 Pré-Seleção de Touros
A aplicação à campo dos avanços das biotécnicas da
reprodução no melhoramento genético animal pode e deve ser utilizada como uma
ferramenta auxiliar na seleção de touros e matrizes.
A fertilidade de touros está relacionada com a
probabilidade de sucesso do espermatozóide em fecundar o oócito, formar o zigoto,
seguir o desenvolvimento embrionário e fetal até o nascimento.
Um método adequado de verificar a fertilidade de touros
pode ser efetuado mediante a fecundação in vitro, onde se detecta espermatozóides
de touros com baixa fertilidade. Resultados observados na fertilidade in vitro entre
touros consideram a habilidade do espermatozóide em fecundar o oócito e o zigoto
continuar o desenvolvimento in vitro até chegarem ao estágio de blastocisto
(LACALANDRA et aI, 1992 ; W ATANABE & OLIVEIRA FILHO, 1994; WATANABE et
aI, 1995).
4.10 Recuperação
4.10.1 Ovário de matadouro com ou sem identificação
Os ovários de matadouro são uma fonte muito
acessível para a recuperação de oócitos, porém, normalmente os oócitos não são de
animais valorosos (BROGLIAITI & ADAMS, 1996).
O protocolo de procedimentos para o envio de ovários
de animais abatidos, mortos, ou mesmo extirpados cirurgicamente, segue-se abaixo;
é também citada a técnica de recuperação de oócitos destes ovários.
4.10.2 Colheita de ovários e ovidutos
Os ovários são colhidos de vacas recém abatidas e
transportados em frascos contendo solução salina 0,9% (pré-aquecida a 36°C) com
antibiótico (0,2 mg/ml e gentamicina).
Os frascos são mantidos em uma caixa de isopor
durante o transporte do matadouro ao laboratório. No laboratório os ovários são
lavados e transferidos para nova solução salina com antibiótico e mantidos à
temperatura ambiente, antes da aspiração folicular.
4.10.3 Colheita e seleção de oócitos
Os
oócitos
são
aspirados
de
folículos
visíveis,
utilizando-se agulha de calibre 15x15 acoplada a uma seringa de 20ml, contendo 1
ml de meio de aspiração.
Após a aspiração de 4 a 6 ovários, o fluido folicular é
transferido para tubos cônicos contendo 3 ml de meio de aspiração, imersos em
banho-maria a 30°C, ou diretamente, em placas de petri sobre platina aquecedora.
Retiram-se os oócitos decantados do fundo do tubo
com auxílio de uma pipeta de Pasteur ou pipetador automático. Toma-se cuidado
para não danificar as células do cumulus, transportando-os para uma placa de Petri e
posterior seleção sob estereomicroscópio (Lupa).
Somente oócitos com cumulus compacto e citoplasma
de coloração marrom e homogênea são selecionados. Os oócitos atrésicos, com
citoplasma escuro e com grânulos são descartados.
4.11 Vacas "acidentadas"
Para animais acidentados ou prestes a morrer, é
preferível que se execute uma ovarectomia enquanto o animal ainda está vivo. Há
indícios de que a qualidade dos oócitos seja melhor usando deste procedimento.
4.12 Fatores de variação em programas de OPU
Vários são os fatores de variação no sistema de
produção in vitro de embriões por OPU-FIV. A doadora de embriões é um dos
principais fatores de variação sendo responsável por uma variação individual que
fora reportada como sendo de 0 a 26 quando se considera os resultados por punção
(HASLER et aI, 1995).
O estado da doadora também é citada como sendo
uma fonte de variação, entretanto os resultados são contraditórios, relatou ser nula a
diferença entre o número de ovócitos recuperados entre vacas destinadas a
diferentes tipos de produção, o que havia sido publicado por Looney et aI. (1994) e
Wenigerkind et aI (1996) que afirmaram ser superior o rendimento de vacas em
aleitamento. A raça da doadora também aparenta ser um fator importante neste
contexto.
Segundo Wenigerkind et aI (1996), as vacas Charolês
apresentaram resultados 3 vezes superior a vacas Holandês Holstein. Diferenças
significativas também foram reportadas em relação a idade da doadora, comparando
doadoras de menos de 3 anos com doadoras de idade superior a 3 anos
encontraram taxas de desenvolvimento embrionário de 42 e 46,7% respectivamente.
Ainda, comparando-se o rendimento entre doadoras
novilhas e vacas observa-se que vacas possuem um número médio de ovócitos por
colheita de 6,7 e novilhas de 5,5. A diferença entre as categorias se eleva quando o
número de ovócitos e embriões viáveis por colheita é estabelecido. Em média,
obtém-se por colheita de 4.86 e 3.84 ovócitos viáveis, e 1.1 e 0.55 embriões viáveis,
respectivamente, para vacas e novilhas com ritmo de colheita de 2 vezes/semana
(KRUIP et aI. 1994 ; BUNGARTZ et aI. 1995 ; PElXER et aI 1995 ; DEN DAAS &
MERTON, 1994 e FRY et aI. 1994).
Segundo Pieterse et aI (1991) em relação a fase do
ciclo reprodutivo fazendo punções em 21 vacas em 3 fases diferentes do ciclo estral
(D3, DI0, DI6), não encontrou qualquer diferença significativa entre as taxas de
colheita, mas o número médio de ovócitos colhidos aparentemente é maior nos
primeiros dias do ciclo.
Entre novilhas púberes e não púberes grande diferença
foi evidenciada, sendo que as primeiras apresentaram maior taxa de colheita e de
desenvolvimento (LOONEY et aI. 1995).
Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre as
taxas de colheita de animais gestantes e não gestantes; entretanto estas últimas
apresentaram melhores taxas de desenvolvimento (KRUIP et al 1994 ; BUNGARTZ
et al, 1995).
Entre as vacas férteis e inférteis, porém ciclando, o
número médio de ovócitos colhidos e de embriões produzidos não foi diferente
(KRUIP et aI. 1994 ; BUNGARTZ et aI. 1995 ; HASLER et aI. 1995; NlBART et aI.
1995).
As fêmeas utilizadas e classificadas como inférteis
possuíam cios normais (Repeat-breeding), uma vez que possuíam infecções
vaginais, cervicais ou uterinas, mal formações da cérvix e lesões de oviduto, ou
ainda eram fêmeas que foram submetidas a programas de transferência de embriões
clássica e não produziam mais embriões viáveis. Em todos os casos a função
ovariana apresentava-se intacta.
Gibbons et al. (1994), obteve 6.8±2.0 e 6.3±1.1 para
punções efetuadas uma ou duas vezes por semana, respectivamente, demonstrando
que o ritmo de colheita de ovócitos tanto para vacas como para novilhas não
superovuladas parece não sofrer alterações quanto a freqüência de punções. A
colheita realizada 2 vezes por semana mostrou-se mais vantajosa quanto a produção
de ovócitos classificados como grau.
As taxas de colheita para um mesmo animal também se
mostraram muito variáveis de uma punção a outra, esta variação parece estar
relacionada ao número de folículos puncionados, mas também a habilidade do
operador. A qualidade dos ovócitos varia igualmente (SCOTT et aI. 1994).
A equipe de punção e o material utilizado são também
fatores muito importantes (DEN DAAS & MERTON, 1994; LANSBERGEN et aI.
1995).
A equipe de punção tem efeito direto sobre a qualidade
dos ovócitos em função da quantidade de oócitos, o que se explica, essencialmente
pelo nível de pressão aplicada durante a aspiração folicular, assim como a escolha
das agulhas desnudos (VAN WAGTENDONK & DE LEEUW et aI. 1997).
E como último fator de variação temos as condições
técnicas de maturação, fecundação e cultivo in vitro, que variam muito entre os
diferentes laboratórios e são responsáveis por diferentes taxas de desenvolvimento
dos embriões in vitro (NIBART & MARQUANT - LEGUIENNE, 1995).
O sêmen utilizado na fecundação é também um
elemento de variação, o que é evidenciado nos programas de OPU comerciais,
quando vários touros são utilizados com o objetivo de incrementar o progresso
genético.
4.13 Técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som
4.13.1 Preparação dos animais
Sedação
O animal deve ser sedado com acepromasinal na dose
de 1,5 ml intravenoso (I. V.) quando muito nervoso. A sedação apenas facilita a
contenção, sendo desnecessárias em animais mansos.
Anestesia
Após o animal estar devidamente contido no brete, é
efetuada uma anestesia epidural baixa aplicando-se 5ml de cloridrato de lidocaína a
2%2 por via I.V.
Montagem dos equipamentos
A probe é montada conforme indicação do fabricante e
a agulha inserida no mandril, tomando todos os cuidados de assepsia. A extremidade
livre do tubo é acoplada na bomba de vácuo e regulado a 70 mmHg.
Punção dos folículos
Primeiramente a probe é introduzi da na vagina.
Através da palpação retal, o ovário posicionado contra a extremidade da probe de
forma que os folículos a serem aspirados estejam no percurso da linha de punção
indicada na tela do ultra-som.
Uma vez que a agulha esteja próxima do folículo a ser
aspirado, o pedal de acionamento do vácuo é pressionado e o folículo aspirado.
O material recolhido da aspiração recuperado em tubos
cônicos estéreis de 50 ml de capacidade, protegidos da luz e mantidos à temperatura
de 30° C, contendo 3 ml de meio de aspiração.
Destino dos oócitos
Após a aspiração os oócitos são levados para o
laboratório, onde são filtrados em filtro para embriões e lavados três vezes com meio
de aspiração. Em seguida são lavados uma vez em meio de transporte e
selecionados sob esterioscópio (lupa), observando-se como critérios a quantidade
das células do cumulus e as características dos oócitos. Rejeitam-se aqueles que
apresentavam características de degeneração.
Após seleção os oócitos bons são colocados em
criotubos de 1 ml contendo meio de transporte para serem levados até o laboratório
de FIV a uma temperatura média de 30° C.
4.14 Superovulação
A recuperação de oócitos viáveis pode chegar a dobrar
com a utilização da superestimulação com FSH (NIBART et aI, 1995).
Pieterse et aI, (1992) utilizaram um tratamento com
Gonadotrofina Sérica de Égua Prenhe (eCG) em 10 vacas. Obtiveram resultados
positivos quando os animais eram tratados com eCG (7.1) em comparação aos
animais não tratados (4.3). O uso de LH pode aumentar as taxas de recuperação,
por induzir in a maturação e expansão das células dos cúmulos. (BROGLIA TTI &
VIVO ADAMS, 1996; SCHELLANDER et aI., 1989). A imunização ativa contra a
inibina foi testada (KONISHI et aI., 1996a) resultando em aumento do número de
folículos de todos os tamanhos (22,2 vs 11,9) e aumentando sensivelmente o
número de oócitos recuperados (10,4 vs 4,2).
4.14.1 Vantagens
Não ocorrem efeitos deletérios aos animais, mesmo
após cinco meses de punções, duas vezes por semana, no que concerne aos
exames de saúde e fertilidade, clínicos ou post mortem. No exame histológico,
animais que foram aspirados por vários meses apresentaram maior quantidade de
colágeno na túnica albugínea.
Stubbings & Walton (1995), demonstraram que em
gado de leite, aspirações mensais de todos os folículos iguais ou maiores do que 5
mm, alteram o ciclo, promovendo apenas um aumento de 4 dias entre estros. A
produção in vitro de embriões de alto mérito genético tornava-se alternativa melhor
que a técnica MOET por não utilizar hormônios, evitando assim os efeitos nocivos à
fertilidade do animal, e aumento do número de embriões por doadora.
4.14.2 Desvantagens
Além
das
grandes
variações
dos
resultados
apresentados pelos diversos autores e de não haver um padrão de meios de coletas
e das respostas à superestimulação, a técnica ainda tem um alto custo. Também
temos que levar em conta que as agulhas são um dos equipamentos descartáveis
mais caros do processo de aspiração. Elas são de difícil esterilização e após
algumas sessões elas ficam rombas e afiá-Ias não produz o mesmo efeito das
novas. Este grupo tentou com certo êxito o uso de agulhas descartáveis, porém
novos estudos devem ser feitos para aumentar as taxas de recuperação.
Foram encontradas massas ecogênicas no interior de
25 dos 37 folículos aspirados (BROGLIATTI et aI, 1995). Estas massas ecogênicas
primeiramente
sugeridas
como
células
da
granulosa
luteinizadas,
foram
consideradas hematomas provocados pela aspiração, uma vez que não foi detectado
aumento na progesterona sérica.
4.15 Variações na recuperação
A aspiração folicular por ser uma técnica bastante
recente apresenta resultados muito variáveis quanto ao número de folículos
aspirados, o número de oócitos recuperados e a taxa de blastocistos produzidos. A
seguir serão expostas algumas causas das variações nos resultados de diferentes
autores.
4.15.1 Diferença entre animais
A variabilidade entre doadoras de oócitos é grande,
sendo que os animais respondem diferentemente à aspiração folicular. O número de
oócitos recuperados do mesmo animal não variam entre cada coleta. Segundo Kruip
et aI, (1994), existe um recrutamento constante de novos folículos quando os
presentes são aspirados e a taxa de recrutamento tem uma variação individual.
4.15.2 Variações entre operadores
O operador pode determinar grandes variações no
número de folículos aspirados, bem como no número de oócitos recuperados. Esta
variação ocorre entre operadores, da mesma forma como, entre sessões com o
mesmo operador Nibart et al, (1995) e Lansbergen et aI, (1995), descrevem que
houve variações significativas entre veterinários, na taxa de recuperação.
Sua equipe era formada por 5 veterinários operando em
duas estações experimentais. Com sucessivas trocas de equipes foi comprovada
que a maior variação ocorre devido a doadora e, o segundo fator é o operador.
4.15.3 Variações do comportamento do animal
Animais nervosos que se debatem principalmente os
jovens, dificultavam as seções de aspiração, reduzindo assim o resultado obtido em
cada uma das mesmas.
4.15.4 Tipo de Animal
O número médio de oócitos coletados é pouco diferente
entre as doadoras do tipo leiteiro ou de corte. Entretanto Looney et aI. (1994),
acharam resultados um pouco superiores em vacas de corte.
4.15.5 Variações com o tipo de equipamento utilizado
Nibart et aI. (1995), apresentam uma revisão que
demonstra que globalmente qualquer que seja o sistema de visualização e de
punção, os resultados em termos de oócitos coletados é o mesmo.
Hill et aI. (1995), realizaram aspiração folicular sem o
auxílio de ultra-som, utilizando-se apenas da palpação retal e obtiveram média de 6.2
oócitos recuperados por doadora.
Brogliatti & Adams, (1996), destacaram a importância
de aspectos como espessura da agulha, fio de corte do biseI, forma do biseI e
pressão de vácuo, que podem alterar a eficiência de recuperação. O aumento da
pressão de aspiração em humanos demonstrou uma maior taxa de recuperação,
porém uma diminuição na qualidade dos oócitos além de aumentar o número de
oócitos desnudos. Convém dizer que a presença de células do cumulus são
importantes para aumentar a taxa de desenvolvimento de oócitos maturados e
fecundados in vitro.
Bols et aI. (1995), obtiveram maiores taxas de
recuperação por folículos aspirados usando agulhas mais espessas (18 G),
independente da pressão do vácuo. Houve um maior número de oócitos recuperados
com o aumento da pressão de vácuo, porém diminuiu a quantidade de células do
cumulus, independente do calibre da agulha. Agulhas mais finas apresentaram
melhor COC (complexo cumulus-oocitário) com células do cumulus mais compactas.
4.15.6 Freqüência da aspiração
A freqüência das aspirações é em média a cada 15 dias
nas mesmas vacas de uma mesma fazenda, e o mínimo a cada 07 dias. A taxa de
recuperação de oócitos imaturos aumenta, se a coleta for repetida no mesmo animal
por um período de no mínimo vários meses (KRUIP et aI., 1994). A aspiração
repetida 2 vezes por semana produzia aumento considerável no número de folículos
visíveis recuperados, observados nas aspirações seguintes. Foi obtido maior número
de embriões transferíveis em aspirações realizadas 2 vezes por semana.
4.16 Amniocentese
Outra aplicação para o equipamento de aspiração
folicular é a pratica da amniocentese. Bellow et aI., (1996) utilizaram-se da técnica
em vacas prenhes entre os dias 45 e 75 de gestação, onde observaram 4 abortos
entre 24 vacas avaliadas. O autor acredita que a amniocentese é uma técnica viável
com o mesmo equipamento de aspiração, com risco mínimo. Os abortos ocorreram
entre 1 a 2 semanas após a amniocentese.
4.16.1 Sincronização da onda para Superovulação
A presença do folículo dominante nas ondas de
crescimento folicular exerce uma ação inibitória ao crescimento de outros folículos
existentes (WILTBANK et aI., 1996).
A técnica de aspiração do folículo dominante foi testada
para iniciar um programa de superovulação em vacas leiteiras (BUNGARTZ &
NIEMANN, 1994).
Os resultados obtidos demonstraram que houve um
aumento na recuperação de embriões após a aspiração do folículo dominante, o qual
foi similar ao obtido no tratamento iniciado na ausência do folículo dominante.
Brogliatti et aI., (1995), descrevem que a emergência de
uma onda após a aspiração do folículo dominante, não difere da onda folicular
normal.
Tabela 3 – Preparação de meios
PBS
1 LITRO
Solução Antibiótica
1 ml
Soro Fetal Bovino (SFB)
10 ml
Liquemine
1 ml
Tabela 4 – Meio de Transporte
TCM – 199 (HEPES)*
18 ml
SFB (10%)
2 ml
Piruvato (0,2 mM)
4 ul
Kanamicina ou gentamicina
100 ul
Tabela 5 - *TCC 199 HEPES
NaHCO3
1,1 g
Hepes ácido
1,4895 g
Hepes sódico
Água desionizada
1,16270 g
1L
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O desenvolvimento de biotecnologias que permitem
transferência de embriões e fertilização “in vitro” em bovinos possibilita o aumento
dos índices reprodutivos em fêmeas bovinas e também permite o melhor
aproveitamento de fêmeas com elevados padrões zootécnicos, possibilitando um
manejo mais racional, garantindo assim um grande número de descendentes, num
curto espaço de tempo.
Observou-se através desse estudo que muitas são as
vantagens da fertilização “in vitro” dentre elas pode-se citar que ocorre uma maior
velocidade na produção de bezerros, possibilita também uma formação de banco de
ovócitos criopreservados, permitindo assim uma regeneração de raças em extinção.
Também existe a possibilidade através dessa biotecnologia de recuperar oócitos de
vacas acidentadas, enfermas ou mortas.
As desvantagens observadas através desse estudo
foram os altos custos dos equipamentos da fertilização “in vitro”, as agulhas
descartáveis são um dos equipamentos mais caros do processo de aspiração.
Esse estudo sugere que seja feito um maior estudo para aumentar as taxas de
recuperação das agulhas que são utilizadas para a aspiração o que possibilitaria
baixar os custos gerando assim um maior lucro e posteriormente uma maior adesão
ao processo de fertilização “in vitro” dos cria- dores.
Na transferência de embriões as vantagens observadas
dessa biotecnologia foram um maior controle de doenças, o controle do sexo do
produto, a multiplicação rápida de um genótipo superior e a produção de
descendentes de um animal jovem.
As desvantagens que se pode observar através desse
estudo foram os custos operacionais que são altos e as condições mínimas da
transferência de embriões.
Espera-se que este trabalho possa contribuir para um
melhor entendimento, aperfeiçoamento e expansão da transferência de embrião e
fertilização “in vitro” (FIV), pois foram descorridos vários procedimentos utilizados
para transferência embrião e fertilização “in vitro” (FIV).
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