Ana Clarissa Cavalcante Elvas Bohn

Transcrição

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Endereço: Campus Universitário Ministro Petrônio Portela, Bloco 5, Bairro Ininga,
Teresina- Piauí, 64049-550 Telefone: 3237 -1517 E‐mail: [email protected]
Modelo de biofilme microcosmo para avaliar desmineralização em dentina
ANA CLARISSA CAVALCANTE ELVAS BOHN
Teresina
2014
PROGRAMA DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Endereço: Campus Universitário Ministro Petrônio Portela, Bloco 5, Bairro Ininga,
Teresina- Piauí, 64049-550 Telefone: 3237 -1517 E‐mail: [email protected]
ANA CLARISSA CAVALCANTE ELVAS BOHN
Dissertação apresentada ao Mestrado em Odontologia
como parte dos requisitos para obtenção do título de
mestre,
pelo
Programa
de
Pós-Graduação
em
Odontologia.
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Linha de Pesquisa: Estudo de Materiais e Técnicas
Odontológicas
Orientador: Prof. Dr. Raimundo Rosendo Prado Júnior
Co-orientador: Prof. Dr. Glauber Campos Vale
Teresina
2014
2
COMISSÃO EXAMINADORA
1) Prof. Dr. Raimundo Rosendo Prado Júnior
Titulação: Doutor em Dentística Restauradora - UNESP
Julgamento: __________ Assinatura: ___________________________
2) Profa. Dra. Lidiany Karla Azevedo Rodrigues
Titulação: Doutora em Odontologia / Cariologia - UNICAMP
3) Profa. Dra. Marcoeli Silva de Moura
Titulação: Doutora em Ciências Odontológicas - UNESP
Julgamento: ________ Assinatura:_____________________________
Suplente:
1) Profa. Dra. Maria Cândida de Almeida Lopes
Titulação: Doutora em Clínica Odontológica – UNESP- Campinas
Teresina
2014
3
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu marido, Arthur Bohn, por seu grande amor e
dedicação à família em minha ausência. E aos meus filhos, Bruno e Luís Arthur, por
serem parte de mim. Minha vitória é a deles também!
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, a Jesus e à Mãe Maria por serem minha fé.
Aos amigos espirituais pelo amor e amparo;
Ao meu pai e minha mãe, por me incentivarem e me ajudarem a transpassar
tamanha montanha em minha vida. Sei que D. Regina vai falar aos quatro cantos a
titulação da sua filha!
Aos meus irmãos, meus sogros, minha madrinha, toda minha família e
amigos pelo incentivo e confiança;
Ao meu cumpadre Luís Carlos Carvalho Filho, que me recebeu em sua casa
e me deu apoio tantos dias em Fortaleza. Você é um irmão muito querido!
Ao
professor
e
orientador
Dr.
Raimundo
Rosendo
Prado
Júnior,
especialmente, por ser um exemplo em toda minha formação. Além de todos os
ensinamentos, ele me recebeu, confiou em mim, me orientou e incentivou sempre de
uma forma muito respeitosa e leve. OBRIGADA!
Ao professor e co- orientador Dr. Glauber Campos Vale. Meu grande amigo
desde a graduação. Ele agora Doutor e eu voltando a estudar depois de tanto
tempo. Todas as minhas dúvidas, angústias e lágrimas foram confortadas em sua
segurança e nas suas palavras: - Calma, vai dá tudo certo! OBRIGADA!
Aos meus amigos de graduação e também quase Doutores Kelen Jorge e
Carlos Cunha. Pois todas às vezes que cruzava os corredores da UFPI lembrava-me
de vocês;
À Universidade Federal do Piauí– UFPI, na pessoa de seu Magnífico Reitor
Prof. Dr. José Arimatéia Dantas Lopes e Vice-Reitora Drª. Nadir do Nascimento
Nogueira;
À Pró-Reitoria de Pós Graduação (PRPG) na pessoa de Prof. Dr. Helder
Nunes;
Ao Programa de Pós Graduação em Odontologia – UFPI. Em especial, à
professora e coordenadora Lúcia de Fátima Almeida de Deus Moura. Minha primeira
orientadora de iniciação científica. Toda sua força faz com que busquemos mais e
mais.
A todo corpo docente do Programa de Pós Graduação em Odontologia da
UFPI, pelos ensinamentos transmitidos e oportunidade de crescimento profissional;
5
Ao funcionário da Secretaria de Pós graduação Plínio José da Paz e Silva
por exercer sua função com toda organização e eficiência;
Aos Professores, Dra. Lidiany Karla Azevedo Rodrigues, Dra. Marcoeli Silva
de Moura, Dra. Maria Cândida de Almeida Lopes, membros da Banca Examinadora,
por terem atendido ao convite para desempenhar este papel, dispondo de seu tempo
e conhecimento para analisar este trabalho;
Às amigas do mestrado, por toda nossa união e incentivo mútuo. Em
especial à minha costela, Maria Janaína Barroso Andrade. Esses dois anos me
trouxeram uma irmã para todas as horas!
Ao aluno da graduação da UFPI, André Luis Rodrigues, que ter me ajudado
na etapa inicial do experimento;
Ao Programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal
do Ceará – UFC. Em especial, à professora e coordenadora Dra Lidiany Karla
Azevedo Rodrigues. Por me disponibilizar de pronto a sua experiência e sua infrainstrutora para pesquisa.
À pós doc da UFC Gislaine Padovani, uma estudiosa e brilhante professora
e amiga. Sem ela toda a etapa laboratorial seria um monstro de sete cabeças.
Realmente um anjo enviado para que eu conseguisse está aqui.
Ao Laboratório da pós-graduação em Odontologia da Universidade Federal
do Ceará- UFC em nome da Profa. Dra. Mônica Yamauti, e em especial, a David
Queiroz o técnico-amigo responsável.
Às alunas do mestrado da UFC, por me aceitarem e colaborarem comigo.
Em especial à Jacqueline Santiago, uma pesquisadora dedicada e uma amiga de
uma sensibilidade incrível.
À Central Analítica da Universidade Federal do Ceará que cedeu o
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) para realização das análises.
Ao frigorífico Frigotil, em nome do diretor Flávio Franklin Freire e de
Francisco Emerson Braga Mendes por disponibilizarem os dentes bovinos utilizados
na pesquisa;
Ao professor Dr. Glauber Campos Vale, que realizou a estatística do
trabalho;
6
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho;
A todos vocês, minha eterna gratidão!
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CPO-D: Dentes Permanentes Cariados, Perdidos e Obturados
epps : eppendorfs
PEC: Polissacarídeos Extracelulares
PIC: Polissacarídeos Intracelulares
S. mutans – Streptococcus mutans
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
8
SUMÁRIO
REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... ......10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................22
PÁGINA DE TÍTULO..................................................................................................26
RESUMO....................................................................................................................27
Descritores.........................................................................................................27
INTRODUÇÃO...........................................................................................................28
MATERIAIS E MÉTODO............................................................................................29
Aspectos éticos..................................................................................................29
Delineamento do estudo....................................................................................29
Obtenção e preparo dos blocos de dentina.......................................................29
Preparo do dispositivo de fixação do biofilme...................................................30
Seleção dos doadores de saliva........................................................................31
Condições de crescimento e protocolo experimental ........................................ 31
Coleta do biofilme..............................................................................................32
Determinação do peso seco..............................................................................32
Determinação dos polissacarídeos...................................................................32
Análise da desmineralização da dentina...........................................................33
Análise estatística..............................................................................................33
RESULTADOS...........................................................................................................34
DISCUSSÃO..............................................................................................................36
AGRADECIMENTOS.................................................................................................38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 39
Apêndice 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ....................................... 43
Anexo 1: Normas da revista European Journal of Oral Sciences..............................46
9
REVISÃO DE LITERATURA
Esta revisão de literatura foi realizada a partir de uma busca no banco de
dados PubMed. A estratégia de busca utilizada foi identificar artigos publicados na
língua inglesa utilizando, principalmente, os seguintes descritores: root caries,
microcosm, dental biofilm, root dentin. Foram incluídos os estudos que possuíram
alguma similaridade com o presente estudo.
Hoppenbrouwers et al. (1987) realizaram um experimento clássico, no qual
determinaram o
pH
crítico
do
meio
bucal
necessário
para
que
ocorra
desmineralização na dentina radicular. Eles definiram que o mineral radicular é mais
solúvel que o do esmalte. Para o esmalte, o pH crítico para que ocorra a perda
mineral equivale a aproximadamente 5,4, no entanto, para o mineral da raiz é de
6.7. Assim, a digestão dos produtos de amido por bactérias da placa, que pode
levar o pH do fluido da placa para 6,0, seria suficiente para causar lesões de cárie
de raiz, mas não suficiente para desmineralizar o esmalte1
Pratten, Smith e Wilson (1998) estudaram o efeito de gluconato de
clorexidina em biofilme de Streptococcus sanguis e em biofilme microcosmo in vitro.
A saliva humana foi usada como inóculo para proporcionar o crescimento de um
biofilme chamado microcosmo contendo microrganismos encontrados na cavidade
oral. Ambos os biofilmes cresceram sobre esmalte bovino e os nutrientes foram
suplementados com saliva artificial. Os autores concluíram que o uso do biofilme
microcosmo gera uma situação mais próxima ao in vivo do que quando se usa
biofilme de única espécie2.
Shu et al.(2000) desenvolveram um consórcio de biofilme multi-espécies de
bactérias orais para estudo de cárie de esmalte e radicular em uma boca artificial.
Cepas de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus rhamnosus,
Actinomyces naeslundiiand de esmalte cariado e de cárie radicular, foram
selecionadas
por
suas
potenciais
propriedades
cariogênicas:
acidúricas,
acidogênicas e a capacidade de agregar-se. As espécies foram selecionadas e
cultivadas como biofilmes monocultivo e associadas ao biofilme em uma boca
artificial. Os biofilmes receberam sacarose ou glicose periódica para simular as
refeições. Todos os biofilmes desmineralizaram os blocos de esmalte e de dentina
bovinos avaliados pela microradiografia e medição de microdureza. Concluiu-se,
10
portanto, que o biofilme do consórcio de patógenos selecionados em tecidos
afetados geram lesões de cárie realistas em todos os tecidos dentais duros sob
condições de crescimento controladas na boca artificial. Esse modelo in vitro de
cárie experimental pode ser útil para o estudo das interações entre o biofilme da
placa, os tecidos dentais e o ambiente oral, e para o desenvolvimento de processos
que modificam o curso de desenvolvimento da cárie3.
Cury et al. ( 2000) realizaram um estudo in situ para avaliar a composição da
placa dental formada na presença de sacarose ou glicose e frutose e sua relação
com a cariogenicidade . Doze voluntários adultos participaram nesse estudo cruzado
realizado em três fases de 28 dias e usaram um aparelho de resina acrílica contendo
quatro blocos de esmalte dental humano. Soluções de sacarose 20% ou glicose
10% + frutose 10% foram gotejadas sobre os blocos de esmalte oito vezes por dia,
enquanto no grupo controle não foi utilizada solução. Os resultados de dureza de
superfície e transversal do esmalte dental mostraram que a placa formada na
presença de sacarose era mais cariogênica que a formada na presença de glicose +
frutose (p˂0.05) . A concentração de polissacarídeos solúveis na placa dental foi
maior no grupo de sacarose que no grupo controle e de glicose + frutose (p˂0.05) .
Os autores concluíram que embora os resultados sugerissem que a alta
cariogenicidade da placa dental formada na presença de sacarose pudese ser
explicada, principalmente, pela alta concentração de polissacarídeos da sua matriz,
a baixa concentração inorgânica e a sua composição de proteína poderiam ter
alguma contribuição4.
Guggenheim et al
supragengival
contendo
(2001) descreveram um modelo de placa
Actinomyces
naeslundii
,
Veillonella
dispar
,
Fusobacterium nucleatum , Streptococcus sobrinus e Streptococcus oralis em
que as células são cultivadas anaerobicamente em um meio à base de saliva
em discos de hidroxiapatita revestidas com uma película salivar, com materiais
e peças de aparelhos comuns a todos os laboratórios de microbiologia. Os
autores sugeriram que esse modelo de biofilme deveria ser muito útil para
testes pré-clínicos de agentes anti-placa potenciais em concentrações
clinicamente relevantes5.
11
Dominici et al. (2001) determinaram a eficácia de diferentes métodos de
esterilização / desinfecção de dentes humanos extraídos usando Bacillus
stearothermophilus, uma bactéria resistente ao calor e freqüentemente utilizado para
teste de esterilizadores. Sete grupos foram imersos durante uma semana em uma
das seguintes soluções: 1) solução salina estéril (grupo de controle), 2) NaOCl
5,25%, 3) NaOCl 2,6%, 4) NaOCl a 1%, 5) formalina tamponada a 10%, 6)
gluteraldeido 2%, 7) quaternário de amônio 0,28%. Quatro grupos adicionais foram
tratados por 8) formalina 10% durante dois dias, 9) formalina 10% durante quatro
dias, 10) autoclave a 240oF (115,56oC) e 20 psi durante vinte minutos e 11)
autoclave a 240oF (115,56oC) e vinte psi durante quarenta minutos. Os resultados
desse
estudo
indicaram
que
os
dentes
extraídos
stearothermophilus e autoclavados a 240oF (115,56oC)
inoculados
com
B.
durante quarenta minutos
ou embebidos formalina 10% durante sete dias, não tiveram crescimento de
esporos6.
Hara et al. (2003) conduziram um estudo in situ para avaliar a utilização
de dentina bovina em vez de dentina humana em pesquisas sobre cárie. O estudo
envolveu um esquema fatorial de boca dividida 2X2 de indução de cárie pelo
acúmulo de placa e uso de sacarose realizado em uma fase de 14 dias. Os fatores
sob avaliação foram: substrato em 2 níveis (dentina humana e bovina) e tratamento
em 2 níveis (dentifrício fluoretado e dentifrício não fluoretado), para simular a
progressão livre e a progressão inibida da cárie, respectivamente. Quatro grupos
experimentais foram obtidos (2 substratos X 2 tratamentos), como segue: grupo 1:
dentina humana e dentifrício não fluoretado; grupo 2: dentina humana e dentifrício
fluoretado; grupo 3: dentina bovina e dentifrício não fluoretado e grupo 4 : dentina
bovina e dentifrício fluoretado. Cada grupo era composto por 11 placas de dentina
ou unidades experimentais (n = 11), distribuídas entre os 11 voluntários, que foram
considerados como blocos estatísticos. A variação no conteúdo mineral da dentina e
profundidade da lesão cariosa foram utilizadas para a avaliação estrutural. Além
disso, o Estreptococos totais e contagens de população S. mutans foram analisados
na formação de biofilmes sobre os substratos de dentina. O desenvolvimento de
cárie em dentina humana e bovina pode ser considerado em uma análise qualitativa
como um processo semelhante, uma vez que as diferenças na perda mineral da
dentina e profundidade da lesão entre os dois substratos não foram estatisticamente
12
significativas. Os autores concluíram que a dentina bovina pode ser utilizada como
um substituto para a dentina humana para estudos de agentes cariogênicos e
anticariogênicos7.
Segundo Curzon & Preston ( 2004), os idosos aparecem como grupo de
risco para desenvolvimento da cárie radicular, em virtude de estarem vivendo mais
e mantendo seus dentes naturais. Os mais fortes marcadores de risco de cárie
radicular incluem a presença de recessão gengival, dificuldades motoras de higiene
oral, lesões de cárie radicular restauradas, dieta cariogênica, fatores retentivos de
placa (tais como próteses com defeitos ou mal adaptadas) e o efeito da
hipossalivação de alguns medicamentos. A remoção da placa é frequentemente uma
dificuldade nessa fase da vida, devido a uma falta de destreza manual, associada à
perda do tônus muscular em torno da musculatura oral contribue para a estagnação
da comida e da placa. O inadequado controle do biofilme associado à a
hipossalivação decorrente das várias medicações que possuem o efeito indesejado
da redução do fluxo salivar são fatores de risco especialmente para a dentina
radicular onde as lesões de cárie podem evoluir com rapidez. Os autores concluíram
que é válido classificar os idosos como grupo de risco para a cárie radicular e
intensificar os métodos preventivos para esta fase da vida8.
Aas
et al. (2005) objetivaram definir a microbiota normal bacteriana da
cavidade oral. Analisaram nove sítios da boca de cinco indivíduos clinicamente
saudáveis. Seqüências de genes 16S rRNA foram utilizados para determinar a
identidade de espécies ou parentes mais próximos. Mais de 700 espécies
bacterianas ou filotipos, dos quais mais de 50% não foram cultivados, foram
detectados na cavidade oral. Os autores concluíram que a placa dental é uma
comunidade de biofilmes microbianos consistindo de centenas de organismos
distintos que são comuns na cavidade oral e que colonizam as superfícies dos
dentes. Os mecanismos da cárie dentária são complexos e são acionados em vários
níveis, ou seja, genética, comportamental, ambiental e microbiana. Compreender o
papel das espécies e subespécies de bactérias específicas é importante para a
criação de um modelo completo de etiologia da doença cárie 9.
Paes Leme et al. (2006) realizaram uma revisão de literatura com o objetivo
de explorar o amplo papel da sacarose na cariogenicidade de biofilmes, e apresentar
13
uma nova visão sobre a sua influência na patogênese da cárie dentária. Há uma
evidência clara de que polissacarídeos extracelulares (PEC) e intracelular (PIC)
influenciam a cariogenicidade de biofilmes dental por, pelo menos, duas vias: (1)
PEC - promover aderência bacteriana e acumulação nas superfícies dos dentes, e
causar alterações bioquímicas e estruturais na matriz dos biofilmes e (2) PIC promover menores níveis de pH de jejum durante os períodos de privação de
nutrientes, o que pode resultar na seleção de microrganismos cariogênicos e
desenvolvimento de cárie. As baixas concentrações de Ca, Pi, e F na matriz de todo
o biofilme formado na presença de sacarose pode ser um fator adicional que
contribui para a cariogenicidade desse carboidrato. No entanto, a explicação desses
resultados continua a ser elucidado. Mais estudos são necessários para esclarecer
as propriedades cariogênicas únicas desse carboidrato na dieta em análises físicoquímicas e moleculares10.
Ledder et al. (2006) analisaram a eficácia do dispositivo Sorbarod Múltiplo (
MSD) para a reprodução das variações inter-individuais na microbiota oral. Um
conjunto foi inoculado com saliva fresca de três voluntários separados, o segundo foi
inoculado com saliva de um único doador. Ambos foram incubados num gabinete
anaeróbio. Os resultados foram analisados em intervalos de 24 horas por PCReletroforese desnaturante (DGGE) de 16S rDNA. Dendrogramas demonstraram
variação acentuada interindividual na abundância das espécies dentro da suspensão
salivar de inóculos de diferentes voluntários. Os autores demonstraram a reprodução
in vitro de microbiotas orais individuais e sugeriram observar a variabilidade interindividual para aumentar a relevância dos estudos microcosmo 11.
Filoche et al. (2007) realizaram um estudo objetivando gerar placa dentária a
partir de microcosmos humano e reproduzir as condições que são importantes para
o desenvolvimento da cárie dentária. Placas de biofilme microcosmos foram
iniciadas a partir da saliva de dois doadores diferentes, cultivadas durante 10 dias,
em placa de 24 poços. Aproximadamente 40 ml de saliva estimulada foi coletada de
cada doador, que se absteve de higiene oral por 24 h. Com uma inoculação de
saliva, sob condições de cultura e renovação diária do meio de crescimento de
saliva artificial, foi possível replicar a dinâmica das populações da placa natural. A
composição da microbiota da saliva a partir dos dois doadores individuais foi
14
diferente, ilustrando que a microbiota oral e ecologia de indivíduos são
intrinsecamente diferentes. Os autores concluíram que é possível manipular as
condições de crescimento da placa e modular variáveis relacionadas com a cárie
dentária dentro de uma comunidade complexa em um sistema microcosmo. O
controle dessas variáveis será importante para o estudo da etiologia e do
desenvolvimento de doenças bucais, produzindo um modelo de laboratório
potencialmente mais realista do que os consórcios e sistemas de biofilme
monoespécies12.
Sissons et al. (2007) exploraram a Hipótese Ecológica da Placa para
cárie dentária em um experimento com biofilme microcosmo e incrementos de
sacarose durante crescimento em dois diferentes fluidos orais simulados: meio
semelhante à saliva com mucina (DMM), ou meio mucina basal (BMM, um extrato de
peptona
e
levedura
análogo
ao
fluido
oral),
e
DMM
com
a
uréia induzindo elevação do pH da placa. Concluíram que modestas exposições à
sacarose em um ambiente de saliva
desenvolvimento
e
análoga causa mudanças profundas no
auto-organização
dos
microcosmos,
apoiando
a
Hipótese da Placa Ecológica. No entanto, existe uma estabilidade significativa na
composição microbiana com pH variando perto da neutralidade. Os aumentos de
bactérias específicas em resposta à sacarose pode ser característica desses
organismos particularmente importantes na cárie 13.
Aires et al. (2008) estudaram o efeito do amido e sacarose sobre a formação
de biofilme dental e na desmineralização da dentina radicular. Um estudo cruzado,
duplo-cego foi realizado com dispositivo palatino contendo placas de dentina
radicular e os seguintes tratamentos foram aplicados extra-oral : solução de gel de
amido a 2% (grupo amido) ; solução de sacarose a 10 % (grupo de sacarose), uma
solução contendo 2% de amido e 10% de sacarose (grupo amido + sacarose ), ou a
solução de amido a 2% , seguido por uma solução de sacarose a 10% (amido grupo de sacarose). Foram realizadas análises bioquímicas (concentrações de
polissacarídeos) e microbiológicas, e a perda de dureza da dentina foi avaliada. A
conclusão dos autores foi que embora os resultados não mostrassem um efeito
estatístico superior do amido combinado com sacarose em comparação com a
sacarose sozinha em todos os parâmetros avaliados, mais estudos devem ser
15
realizados para avaliar mais detalhadamente o efeito biológico sobre a estrutura e
composição da matriz extracelular do biofilme formado 14.
Preza et al. (2009) definiram os perfis de bactérias das superfícies
radiculares saudáveis e de cárie radicular (RC) em idosos. Eles recolheram placa
supragengival de 20 indivíduos saudáveis (controles) e de 21 indivíduos com cárie
de raiz (pacientes). Detectaram 179 espécies e grupos de espécies de bactérias. A
maior diversidade bacteriana foi observada nos controles, em comparação com
pacientes. Lactobacillus casei / paracasei / rhamnosus e Pseudoramibacter
alactolyticus estavam associados à maioria das amostras de cárie de raiz.
Streptococcus mutans foi detectado com maior freqüência na dentina infectada do
que nas outras amostras, mas a diferença não foi significativa. Actinomyces foi
encontrada com maior freqüência nos controles. Os autores concluíram que
Actinomyces e S. Mutans podem desempenhar um papel limitado como agentes
patogênicos de cárie radicular15.
Cenci et al. (2009) realizaram um estudo in vitro usando um modelo de
biofilme microcosmo em um fermentador de película de constante profundidade (
CDFF) com objetivo de avaliar a relação entre o tamanho da fenda de lesões de
cárie secundária em dentina adjacente à restaurações de resina composta (RC) ou
ao ionômero de vidro (CIV). Dentina bovina foi utilizada como substrato, na qual foi
inoculado biofilme a partir da saliva humana e o sistema foi alimentado por impulsos
alternados com solução de sacarose (8x / Dia ) em um meio de saliva análogo a
base de mucina ). A perda mineral da dentina e profundidade da lesão em torno das
restaurações foram determinadas por microradiografia transversal. Os resultados
permitiram concluir que o fluoreto liberado a partir do CIV inibe a desmineralização
da dentina adjacente a restaurações, independentemente da largura da fenda16.
Pham et al.(2009) avaliaram a capacidade do probiótico intestinal
Lactobacillus salivarius W24 de incorporar e de afetar a estabilidade da composição
e cariogenicidade de comunidades microbianas orais. Placas de microtitulação com
discos de hidroxiapatita foram incubadas com ou sem Lactobacillus salivarius W24 e
saliva de quatro indivíduos com meio suplementado ou não com sacarose.
Microcosmos com sacarose resultaram em meio menos diversificado e mais ácido
do que microcosmos sem sacarose (p <0,001). Apesar de não ser capaz de formar
16
um biofilme monoespécies, L. salivarius W24 estabeleceu-se em uma comunidade
oral quando foi inoculado simultaneamente com o microcosmo17.
Xiao e Koo (2010) investigaram a organização estrutural e dinâmica da
matriz de exopolissacarídeos (EPS) e a formação de microcolônias por
Streptococcus mutans durante o processo de desenvolvimento de biofilme. Os
biofilmes foram formados sobre discos de hidroxiapatita (SHA), na presença de
glicose ou de sacarose (associada ou não ao amido). As imagens produzidas pela
técnica de fluorescência mostraram EPS intimamente associados com as células
bacterianas e através de microcolônias no processo de desenvolvimento de biofilme.
Portanto, os autores confirmaram que os polissacarídeos servem como uma matriz
que prende as células bacterianas sobre a superfície permitindo a fixação inicial, e o
maior desenvolvimento em microcolônias, e também como, estrutura de apoio para
o crescimento contínuo das microcolônias (por emalhamento e preenchendo os
espaços entre as células bacterianas) 18.
Ccahuana-Vásquez & Cury (2010) validaram um modelo de formação de
biofilme S. mutans, que mostre a suscetibilidade a agentes antimicrobianos e
permita a avaliação de substâncias com potencial anticárie. Esse modelo de biofilme
de S. mutans foi uma versão modificada detalhada por Koo et al. (2003), cujas
modificações principais são o uso de substrato dental e simulação de exposição à
sacarose. O biofilme de S. mutans UA 159 foi formado em saliva e cultivado em
blocos de esmalte bovino suspensos verticalmente no ultrafiltrado de extrato de
levedura e triptona de caldo de carne (UTYEB) a 37 ° C, CO2 a 10% por cinco dias e
expostos 8x/dia de sacarose a 10% por 1 min. Após 48 h, o crescimento de alguns
biofilmes (n = 4) foi interrompido (linha de base) e as outras foram cultivadas durante
mais três dias e tratados 2x/dia com digluconato de clorexidina (CHX) a 0,012, 0,024
e 0,12% e NaF 0,05% durante 1min. A biomassa, bactérias viáveis e composição
bioquímica de todas as amostras de biofilme foram determinadas. Além disso, a
perda de mineral de blocos de esmalte foi avaliada. O pH do meio de cultura foi
determinada diariamente como um indicador de acidogenicidade do biofilme. O
grupo tratado com clorexidina mostrou efeito dose-resposta diminuindo a viabilidade
de biomassa bacteriana, e a desmineralização do esmalte (p <0,05). O grupo tratado
com NaF a 0,05% não mostrou efeito antimicrobiano, mas teve um efeito
17
semelhante ao da CHX 0,12% diminuindo a desmineralização do esmalte (p <0,05).
O modelo desenvolvido tem potencial para avaliar o efeito das substâncias sobre o
crescimento de biofilme e em desmineralização do esmalte19.
Cheng et al. (2010) estudaram os efeitos do extrato de Galla Chinensis
(GCE) em diferentes estágios de formação do biofilme microcosmo. O extrato Galla
chinensis (GCE) interfere com a de- e remineralização do esmalte dentário e no
crescimento e metabolismo das bactérias planctônicas. No entanto, não havia
informação disponível sobre os efeitos do GCE sobre biofilmes formados com saliva
como inoculo para microcosmo. Estes experimentos utilizaram um anexo ativo em
placas de 24 poços em vez de um modelo de sedimentação de biofilme e saliva foi
usada como inóculo. Os biofilmes formados em superfícies de vidro ou de esmalte
foram tratados com soluções de GCE em diferentes concentrações e tempos. Os
efeitos foram avaliados por formação de ácido láctico e unidades formadoras de
colônia (UFC) dos biofilmes. Os resultados mostraram que os tratamentos GCE
inibiram o crescimento e o metabolismo do ácido de ambos os biofilmes
microcosmos nascentes e maduros. O pré-tratamento do substrato com soluções
GCE inibiu o crescimento e produção de ácido láctico de biofilmes cultivados em
esmalte, mas teve pouco efeito sobre biofilmes formados em superfícies de vidro.
Um efeito máximo GCE foi encontrado quando os biofilmes, em qualquer tipo de
superfície, foram tratados após 8h de formação, com 40h de crescimento
subseqüente. No meio com biofilmes fermentadores de sacarose, baixas
concentrações de GCE (0,2 e 0,1 mg / ml) inibiram a produção de ácido sem matar
as bactérias presentes no biofilme. Em conclusão, os componentes bioativos em
GCE reduzem ou inibem o crescimento e a formação de ácido láctico em biofilmes 20.
Kolenbrander (2011) estudou a capacidade de sete espécies de bactérias
orais humanas de se desenvolverem individualmente e em conjunto tendo a saliva
como única fonte de nutrientes. A formação dos biofilmes em células de fluxo foi
monitorado usando fluoróforo espécie- específico conjugado a imunoglobulina G, e
as imagens foram capturadas por meio de microscopia confocal. O objetivo deste
conjunto de experimentos foi estimular futuras pesquisas para o uso da fonte
nutricional natural que flui para as bactérias orais: a saliva. As investigações
18
demonstraram que, quando há cooperação, as comunidades crescem rapidamente
em mucinas salivares e afins21.
Bowen e Koo (2011) realizaram uma ampla revisão de literatura sobre o
papel dos Streptococcus mutans na formação da matriz extracelular de biofilmes
cariogênicos. A importância de S. mutans na etiologia e patogenia da cárie dentária
deve-se em parte pela produção de ácido, mas a matriz dentro da placa dentária não
pode ser negligenciada. As principais fontes de polissacarídeos na placa dentária
são produtos da interação de glicosiltransferases de Streptococcus mutans (GTFS)
com a sacarose. [(Vacca -Smith et al., 1996a )]
22
. Esses oferecem uma matriz
insolúvel para a placa e para a colonização de outros microrganismos orais 23.
Steiner-Oliveira et al. (2011) desenvolveram um modelo in vitro com
Streptococcus mutans para avaliar o efeito da freqüência de exposição à sacarose
na dentina sobre a formação de cárie, a composição do biofilme, e as mudanças de
pH. No experimento, os espécimes de dentina (n = 45) formaram quatro grupos:
controle (C), controle negativo (0S), 3S (três banhos de sacarose) e 6S (seis banhos
de sacarose). Desmineralização da dentina e profundidade da lesão foram avaliados
por microradiografia transversal. Polissacarídeos extracelulares formados no biofilme
foram analisados e a contagem de microrganismos na dentina cariada foi realizada.
A adição de sacarose proporcionou à dentina desenvolvimento de cárie,
independentemente da frequência da exposição 24.
Vale et al. (2011), avaliaram se uma combinação de fluoreto profissional,
aplicado como F fosfato acidulado (APF), e o uso de dentifrício contendo 1100 - ppm
F- (FD) forneceria proteção adicional para a dentina em comparação com 1100 ppm
de F- sozinho. Doze voluntários adultos utilizaram dispositivos palatinos contendo
blocos de dentina radicular bovina, que foram submetidos, durante 4 fases
experimentais de sete dias cada, para acúmulo de biofilme e exposição de 8x/dia à
sacarose. No final de cada fase, a concentração de flúor no biofilme dental formada
sobre os blocos foi avaliada. Em placas de dentina, as quantidades de material
semelhante de fluoreto de cálcio ("CaF2") e fluorapatita (FAP) retida foram
determinadas, assim como a desmineralização da dentina. A alta correlação entre a
dureza da superfície e os dados microrradiográficos observadas no presente estudo
mostraram que a dureza de superfície pode ser utilizada para estimar a perda
19
mineral em dentina. Dado importante, quando se considera que a tecnologia de
microradiografia transversal (o "padrão ouro" de técnicas de perda de minerais) não
está disponível em muitos centros de pesquisa. A associação de APF e FD
aumentou a concentração de F no fluido do biofilme e reduziu a desmineralização da
dentina radicular, apresentando um efeito aditivo25.
Azevedo et al. (2011) objetivaram comparar os microorganismos e a
cariogenicidade do biofilme microcosmo da saliva de crianças livres de cárie (CF),
crianças com cárie precoce da infância (ECC) e com ECC severa (S-ECC), sob
exposição à sacarose regular. Os biofilmes foram cultivadas em microplacas de 24
poços em discos de esmalte bovino por até 10 dias em saliva artificial, a qual foi
substituído diariamente. Cada fonte de saliva recebeu desafio cariogênico (saliva
artificial suplementado com 1% de sacarose 6 vezes ao dia) e sem desafio
cariogênico. O pH diário foi obtido e o biofilme sobre os discos de esmalte foi
recolhido para análises microbiológicas. A perda mineral do esmalte foi estimada
pelo percentual de perda da dureza. Os resultados mostraram que não houve
diferenças estatisticamente significativas entre as fontes de saliva (p˃0,05). Foi
verificada maior desmineralização (p˂0,001) sob a exposição a sacarose,
independentemente da experiência de cárie dentária. Os autores concluíram que
embora a exposição de sacarose determine a cariogenicidade dos biofilmes, a
experiência de cárie das crianças que forneceram as amostras não afetaram a perda
mineral associada a esses biofilmes26.
Yang et al. (2011) realizaram uma revisão para compreender os
mecanismos de formação de biofilme multi-espécies. As evidências concluem que
esses biofilmes são comunidades dinâmicas, com extensas interações entre
espécies diferentes. Diferentes abordagens precisam ser combinadas em pesquisas
com biofilme para uma melhor compreensão dessas estruturas complexas. Um viés
atual em pesquisa com biofilmes é a reprodutibilidade. Pesquisadores de diferentes
áreas e grupos executam os ensaios de biofilme em suas próprias configurações, o
que leva a variações nos estudos. Um conjunto de protocolos padrão deve ser feito
para experimentos de biofilme in vitro27.
Para simular o real posicionamento das superfícies dentais na cavidade oral,
Silva et al.(2012) comprovaram o potencial de um modelo ativo de fixação de
20
biofilme de alto poder de desmineralização para a avaliação de agentes preventivos
da cárie. Um biofilme de Streptococcus mutans UA159 foi cultivado em discos de
dentina bovinos em um modelo de fixação ativo de alto rendimento. Esses discos de
dentina foram fixados verticalmente na tampa do modelo ativo de fixação do
biofilme. Essa tampa de aço inoxidável continha 24 braçadeiras de poliestireno que
suportavam o substrato. Todos os grampos foram posicionados para permitir que as
superfícies expostas do substrato estivessem em contato com os meios de biofilme
contidos na placa de 24 poços. O modelo de biofilme ativo de fixação foi capaz de
produzir 24 amostras de biofilme independentes em um único dispositivo28.
Rudney et al. (2012) usaram uma técnica de arranjo da microbiologia oral
humana (Human Oral Microbial Identification Microarray- HOMIM ) para validar um
modelo de microcosmo oral reprodutível. Biofilmes microcosmo foram cultivados em
um reator de biofilme CDC a partir da saliva ou placa dental coletadas de adultos e
crianças. O DNA de inóculo inicial e microcosmos foram analisados por HOMIM de
272 espécies. O microcosmo incluiu cerca de 60% das espécies do inóculo inicial.
Pulsos de sacarose diminuíram a diversidade e o pH, mas aumentaram a
abundância de Streptococcus e Veillonella. Portanto, esse modelo produziu biofilme
microcosmo reprodutível que pode representar a microbiota oral. A sacarose induziu
mudanças associadas com a cárie dentária29.
21
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25
PÁGINA DE TÍTULO
Título: Modelo de biofilme microcosmo para avaliar desmineralização em
dentina
Autores:
1. Ana Clarissa Cavalcante Elvas Bohn – Estudante do Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade Federal do Piauí - Teresina (Pi), Brasil
email: [email protected]
Rua Assis Iglesias, 1700 - Bairro- São João - CEP 64045-405
Fone/Fax- +558594320860
Teresina (Pi), Brazil
2. Glauber Campos Vale - Professor do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Federal do Piauí - Teresina (Pi), Brasil
Rua - Bairro- CEP
Fone/Fax- +5586
Teresina – Pi, Brazil
3. Raimundo Rosendo Prado Júnior – Professor do Programa de Pós-Graduação em
Odontologia da Universidade Federal do Piauí - Teresina (Pi), Brasil
Rua – Wilson do Egito Coelho,3655 Bairro- Ininga CEP – 64048-520
Fone/Fax- +558632321320
Teresina – Pi, Brazil
Endereço para correspondência:
Prof. Raimundo Rosendo Prado Júnior
Rua Wilson do Egito Coelho 3655, Bairro Ininga / CEP: 64049-550 Teresina - Piauí – Brasil
Fone: (86) 3237-1517/ 9964-1710
/ e-mail: [email protected]
26
RESUMO
Bohn, A.C.C.E.; Vale, G.C.; Prado Jr, R.R*
O presente estudo avaliou o efeito de um modelo controlado e simplificado de
microcosmo, exposto à sacarose com o objetivo de estimar a capacidade desse
modelo em alterar a dureza de superfície da dentina. Saliva de dois voluntários foi
inoculada em um meio de saliva artificial. Vinte blocos de dentina bovina radicular com
dureza de superfície determinada foram aleatorizados em 5 grupos (n=12): C (grupo
controle), 0S (controle negativo), 3S (três banhos de sacarose), 6S (seis banhos de
sacarose) e CS (sacarose contínua). No quinto dia, os biofilmes foram coletados para
a determinação da concentração dos polissacarídeos extracelulares e intracelulares e,
nos blocos de dentina, a perda de dureza de superfície (PDS) foi avaliada. A PDS foi
maior nos grupos em que houve exposições à sacarose (3S, 6S, CS), sendo diferente
significativamente entre todos os grupos experimentais (p˂0, 001). Com relação aos
polissacarídeos, o CS apresentou maiores concentrações. Foi observada significância
estatística (p˂0,001) entre esse grupo em comparação aos
demais, que não
apresentaram diferença entre si (p>0,005). O modelo desenvolvido, apresentou
potencial para produzir cárie radicular em diferentes exposições à sacarose.
DESCRITORES: biofilme dental; dentina bovina; cárie radicular; sacarose.
27
INTRODUÇÃO
Experimentos de produção de cárie in vitro podem ser úteis para o estudo
das interações entre o biofilme, os tecidos dentais e o ambiente oral, fatores que
modificam o desenvolvimento da doença 1. O uso de placa de cultivo
substrato suspenso
3
2
com
em vez de um modelo de sedimentação de biofilme e a
utilização da saliva usada como inóculo podem proporcionar novos conhecimentos
sobre as propriedades e dinâmica do ecossistema da placa dentária 4. Os modelos
in vitro têm também importância do ponto de vista econômico e ético.
Modelos com biofilmes são capazes de reproduzir com maior fidelidade o
ambiente oral se comparados ao método de ciclagem de pH. O biofilme dental, com
sua complexa e populosa comunidade de bactérias orais, é um desafio a ser
mimetizado in vitro 5. Os modelos de biofilmes mais utilizados, experimentalmente,
são os de única-espécie
6, 7, 8
, os consórcios multiespécies
1,9
e microcosmo
5, 10, 11
.
O microcosmo é um sistema de laboratório derivado de ecossistemas naturais, onde
mais de 700 espécies de bactérias coexistem. Seu objetivo é simular, no ambiente
de estudo, as condições que prevalecem no ambiente oral
12
.
A sacarose, como fonte de nutrientes para os microrganismos, tem sido
extensivamente utilizada, pois além de ser o carboidrato mais consumido pela
população, é também o mais cariogênico
13
. A presença desse açúcar causa redução
do pH e promove modificações estruturais no biofilme dental 7. Tais modificações
decorrem da maior concentração de polissacarídeos extracelulares insolúveis
formados como consequência da elevada exposição à sacarose, causando maior
porosidade ao biofilme e facilitando a difusão de ácidos e açúcares para a superfície
dental
14
.
Entretanto, quando se utiliza um modelo mais próximo da complexidade
microbiana do ambiente oral, pouco se sabe a respeito do efeito das exposições à
sacarose sobre a dentina radicular. Dessa forma, o presente estudo avaliou o efeito
de um modelo controlado e simplificado de microcosmo, exposto à sacarose com o
objetivo de estimar a capacidade desse modelo em alterar a dureza de superfície da
dentina.
28
MATERIAIS E MÉTODO
Aspectos Éticos
Este estudo foi realizado de acordo com as normas universais da
Declaração de Helsinque (2008) e nacionais da Resolução nº 466/2012 do Conselho
Nacional de Saúde que regulamentam as pesquisas em seres humanos. O Comitê
de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Piauí aprovou este estudo sob o
protocolo 12752813.3.0000.5214. A participação dos voluntários que doaram a
saliva foi condicionada à assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE). A pesquisa não trouxe riscos, prejuízos, lesões, formas de indenização e
nem ressarcimento de despesas.
Delineamento do Estudo
O experimento foi realizado em triplicata e sua fase laboratorial teve duração
de cinco dias. Blocos de dentina radicular bovina foram preparados e submetidos ao
desenvolvimento de cárie num modelo de biofilme microcosmo. Para o preparo do
inóculo inicial, a saliva de dois voluntários foi coletada e adicionada ao meio de
saliva artificial. Em seguida, 2 ml do inóculo foi inserido em poços de uma placa de
24 poços que receberam os blocos de dentina fixados em um gancho de fio
ortodôntico, de forma que cada bloco ficou submerso perpendicularmente em um
poço (Figura 1). Os desafios cariogênicos ocorreram nos quatro dias subsequentes
de acordo com cada grupo (n=12): C (controle, sem inóculo e sem sacarose), 0S
(com inóculo e sem tratamento com sacarose), 3S (com inóculo e 3 banhos de
sacarose 20% ao dia), 6S (com inóculo e 6 banhos de sacarose 20% ao dia, CS
(com inóculo e sacarose 5% de forma contínua).
Obtenção e preparo dos blocos de dentina
Blocos de dentina foram obtidos a partir de incisivos bovinos previamente
esterilizados em solução de formol 10% por no mínimo 10 dias
15
. Com a utilização
de dois discos diamantados separados por um espaçador de aproximadamente 6
mm, uma fatia da raiz foi cortada a partir da junção amelo- cementária. As fatias
foram seccionadas no sentido mesio- distal e os blocos de dentina foram obtidos das
faces vestibular e lingual da raiz
16
. Os cortes foram feitos sob refrigeração (água
29
destilada e deionizada) para evitar trincas na raiz. A planificação do remanescente
dentinário foi realizada no prato giratório da politriz com sequência decrescente de
lixa de granulação e a altura final dos blocos foi em média de 1,21± 0,25 mm. Em
seguida, os blocos foram lixados e polidos.
As dimensões finais apresentaram
dimensões aproximadas de 6 X 7 x 1,2 mm. Os blocos foram então conservados
sob refrigeração em ambiente úmido.
A dureza de superfície inicial dos blocos foi mensurada no centro do bloco
com cinco penetrações e espaçamento de 100 µm uma da outra, utilizando
microdurômetro com ponta Knoop (FM ARS 9000/FV ARS 9000 series, Future Tech
corp, Tokyo, Japan) com carga de 10 g por 5 segundos16. Foram descartados blocos
de dentina cuja dureza inicial apresentou variação superior a 20% com relação à
média de todos os blocos. Depois, os blocos selecionados foram distribuídos
aleatoriamente entre os 5 grupos (n=12) em cada etapa experimental.
Preparo do dispositivo de fixação do biofilme
Os blocos de dentina foram fixados em grampos confeccionados com fio
ortodôntico e presos a um gancho que se encaixava na base das placas de 24
poços de poliestireno (figura 1). Todos os grampos foram posicionados para permitir
que os blocos ficassem em contato com o meio de cultura de forma perpendicular. O
conjunto do gancho com os grampos e os blocos de dentina foi esterilizado em
autoclave antes do uso.
Figura 1. Modelo do dispositivo de fixação de biofilme (modificado a partir
Ccahuana-Vásquez & Cury, 2010)17.
30
Seleção dos doadores de saliva
Foram selecionados dois voluntários adultos (34 anos) tendo como critérios
de inclusão: boa saúde geral e fluxo salivar estimulado normal. O uso de antibiótico
e de medicamentos que afetem o fluxo salivar três meses anteriores ao estudo, uso
de aparelho ortodôntico, presença de cárie ativa e indivíduos fumantes foram
utilizados como critérios de exclusão.
Condições de crescimento e protocolo experimental
Para o preparo do inóculo inicial, aproximadamente 10 ml de saliva
estimulada foi coletada de dois doadores que ficaram sem higienização da cavidade
bucal por 24 horas e sem alimentar-se por duas horas antes da coleta. A mistura de
ambas as salivas foi inoculada em 100 ml de meio de saliva artificial composto de
extrato de carne (Oxoid); Extrato de levedura (Acumedia); Proteose Peptona (Difco);
Mucina Gástrica de Porco tipo III (Sigma), Cloreto de Sódio; Cloreto de Cálcio;
Cloreto de Potássio; 1,25 ml / L de uma solução filtrada de 40% de uréia (Sigma),
adicionada depois da solução autoclavada e o pH ajustado a 6,61.18 Acrescentou-se
a esse meio glicose 1%. Após 18h em estufa de CO2 10% a 37 oC, a densidade
óptica da solução foi medida. Confirmada a turbidez, a suspensão foi agitada e 2 ml
foram colocados em cada poço de uma placa de 24 poços nos grupos 0S, C3, C6 e
CS, contendo um bloco de dentina em cada. A placa de 24 poços foi mantida em
estufa de CO2 10% a 37 oC por 6 horas para adesão bacteriana na superfície
dentinária. Após esse período os ganchos com os blocos foram transferidos para
uma nova placa de 24 poços contendo apenas meio de saliva artificial fresco em
todos os grupos. O desafio cariogênico ocorreu durante quatro dias (96h) em
condição asséptica. Foi realizado a partir da exposição dos blocos de dentina à três
banhos (3S) e à seis banhos (6S) de solução de sacarose 20% ao dia em horários
pré-determinados durante 1 minuto e posterior lavagem com solução NaCl 0,9% por
três vezes e imersão à solução de sacarose 5% continuamente (CS). O Grupo
controle negativo 0S permaneceu em meio de saliva artificial com inóculo e sem
adição de sacarose. O Grupo controle (C) não possuía inóculo nem tratamento com
sacarose. Ao final de cada dia de protocolo experimental, todos os blocos eram
transferidos para uma nova placa de 24 poços contendo meio de saliva artificial
fresco.
31
Coleta do biofilme
No 5o dia foi realizada a coleta do biofilme dental após 12 horas da última
exposição à sacarose. Os blocos foram transferidos para tubos tipo eppendorfs
(epps) esterilizados contendo 1 mL de solução salina 0,9% e agitados, para
desagregar a placa, com ponta ultrassônica a 1 pulso, 7 W por 30 s (Branson,
Sonifier 50, Danbury, CT EUA)13. Os blocos foram cuidadosamente removidos da
suspensão e armazenados para determinação da desmineralização da dentina.
Alíquotas da suspensão foram utilizadas para a determinação do peso seco e
polissacarídeos.
Determinação do peso seco
Da suspensão obtida da coleta do biofilme, 300 µL foram colocados em
novos eppendorfs (epps) pré-pesados e marcados. Estes foram centrifugados (5
min,1000 g), o sobrenadante descartado e o precipitado lavado com água destilada
e deionizada. O novo precipitado foi levado ao dessecador por 24 horas. Após esse
período, os epps foram pesados. O peso seco foi determinado pela diferença do
peso antes e depois dos epps 6 .
Determinação dos polissacarídeos
Outros 300 µL da suspensão do biofilme com solução salina 0,9% foi
removido e agitado em vortex. Logo após, os epps foram centrifugados
(5min/10000g),
sendo
os
polissacarídeos
extracelulares
solúveis
(PECS)
determinados no sobrenadante. Ao precipitado foi adicionado 300µL de solução
NaOH 1M e agitado. A suspensão resultante foi centrifugada e no sobrenadante foi
realizada a quantificação dos polissacarídeos extracelulares insolúveis (PECI). Ao
precipitado resultante dessa etapa, 300 µL de solução NaOH 1M foi adicionado e
aquecido em banho Maria ( ±100C) por 15 min. Após centrifugação da suspensão,
o sobrenadante obtido foi utilizado para quantificação dos polissacarídeos
Intracelulares (PIC), segundo Aires et al. (2008)13.
Todas as análises dos
polissacarídeos (PECS, PECI e PIC) foram realizadas pelo método colorimétrico
fenol-sulfúrico proposto por Dubois, 1956
19
e lidos no espectofotômetro (UV/VIS
Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Corp., USA) a absorvância de 480nm. Os
resultados foram normalizados pelo peso do biofilme seco.
32
Análise da desmineralização da dentina
Após o experimento, a dureza de superfície foi novamente medida a uma
distância de 100µm acima do local da medida inicial e descrita como porcentagem
de perda de dureza de superfície (%PDS), pela fórmula (Dureza inicial - Dureza póstratamento) x 100/Dureza inicial 20. A perda de dureza de superfície foi utilizada como
indicador da desmineralização da dentina radicular.
Análise estatística
As premissas de igualdade de variâncias e distribuição normal dos erros
foram verificados para todas as variáveis resposta testadas e aquelas que não as
respeitaram foram transformados21. Os dados originais da PDS foram transformados
elevando-se a potência de 1,5 e os polissacarídeos em log na base 10. Estas
variáveis transformadas foram submetidas à análise de variância (ANOVA), seguida
pelo teste de Tukey. O programa SAS (versão 9.0, SAS Institute Inc., Cary, NC,
EUA) foi utilizado para a analise estatística e o nível de significância adotado foi 5%.
33
RESULTADOS
A perda de dureza de superfície (PDS) foi maior no grupo submetido à
exposição constante à sacarose (CS), e houve diferença estatisticamente
significante (p˂0,001) entre os demais grupos experimentais (Tabela 1).
Tabela 1. Dureza de superfície dentinária inicial, final e sua variação, de acordo com o grupo
experimental (n=12).
Grupos de
Tratamentos
Dureza de Superfície
%PDS
Inicial
Final
C
46,66 ± 5,76
38,81 ± 4,18
-16,10 ± 10,37A
0S
48,86 ± 4,49
27,49 ± 4,30
-46,14 ± 6,63 B*
3S
50,19 ± 5,00
21,87 ± 2,72
-55,94 ± 7,58 C
6S
50,03 ± 5,35
16,19 ± 2,61
-67,18 ± 6,90 D
CS
51,80 ± 4,22
12,72 ± 0,79
-75,29 ± 2,69 E
Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos de tratamentos (p<0,001).
*n=11, outlier removido.
A concentração de polissacarídeos extracelulares (solúveis e insolúveis) foi
maior no grupo de sacarose contínua (CS) do que nos demais grupos experimentais
(p˂0,001), os quais não apresentaram diferença significativa entre si (p>0,005),
(Tabela 2).
Tabela 2. Concentração de polissacarídeos (ug/mg de peso seco) de acordo com os
tratamentos.
Grupos de
Tratamentos
Polissacarídeo Extracelular
Polissacarídeo
Intracelular
Solúvel
Insolúvel
0S
18,30 ± 10,47 A
41,64 ± 34,13 A
15,08 ± 19,25 A
3S
26,29 ± 18,19 A
30,74 ± 11,70 A
24,58 ± 15,12 A
6S
17,36 ± 7,36 A
37,10 ± 24,94 A
27,35 ± 13,93 A
CS
78,54 ± 49,26 B
98,73 ± 82,31 B
96,68 ± 85,18 B
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística significativa (p<0,001).
34
a
b
c
d
Figura 2: MEV (100x vezes de aumento) da superfície da dentina: (a) dentina intertubular
planificada, com uma leve obliteração dos túbulos dentinários, sem grandes alterações na
superfície (controle); (b,c,d) maior quantidade dos túbulos dentinários abertos (0S,6S,CS).
35
DISCUSSÃO
Estudos que utilizam modelos de biofilme in vitro são estratégias relevantes
para avaliar a cárie e as mudanças causadas na superfície do substrato 9. Portanto,
o biofilme e o substrato utilizado devem ser o mais semelhante possível ao natural.
Modelos de biofilme microcosmo utilizam saliva humana e simulam a sua
microdiversidade 5,10,22. Por isso este modelo foi adotado neste estudo.
Embora a microrradiografia transversal seja o "padrão ouro" de técnicas de
avaliação de perda de mineral para tecidos duros, a dureza de superfície pode ser
utilizada para estimar a perda mineral em dentina, principalmente quando se
considera que essa tecnologia não está disponível em muitos centros de pesquisa
23
. Nosso estudo utilizou-se da perda de dureza da superfície, complementada por
imagens do microscopia eletrônica de varredura (MEV) para comparar o efeito das
diferentes suplementações de sacarose sobre a dentina em meio microcosmo.
Os resultados de perda de dureza de superfície confirmaram estudos
anteriores
7,13
que mostram que a placa dental formada com exposição à sacarose
tem alto poder cariogênico. Entretanto, os resultados foram produtos de estudos
com metodologia diferente, o que dificulta sua comparação. Uma limitação dos
estudos com biofilmes é a sua reprodutibilidade. Um conjunto padrão de protocolos
deveria ser adotado para estes experimentos 9.
Os grupos com exposição à sacarose apresentaram maior perda mineral
(3S, 6S, CS). A cariogenicidade da placa cujo meio foi enriquecido com esse
carboidrato seria resultado da capacidade dos microrganismos de produzir
polissacarídeos extracelulares (PEC), formando uma malha porosa que funciona
como estrutura de apoio para o crescimento das microcolônias. Deste modo, os
ácidos se difundem facilmente alcançando a interface de dente – biofilme
14
. A
existência, também, de polissacarídeos intracelulares (PIC) mantém o pH baixo
mesmo durante os períodos de privação de sacarose
13; 24
.
A presença constante de sacarose no meio (CS), mesmo em baixa
concentração, causou uma maior alteração na superfície dentinária se comparada
àquela causada nos grupos com banho de sacarose, seguidos de lavagem de
solução salina 0,9% (3S e 6S). O que era esperado, pois a oferta permanente de
36
sacarose possibilita uma maior seleção da microbiota e, por conseguinte,
permanência de baixo pH
11, 25
. Essa hipótese é corroborada por Pham et al. (2006)
26
, que concluíram que o meio microcosmo com suplemento de sacarose é menos
diverso e mais ácido do que o microcosmo sem sacarose.
Outro aspecto que confirma a maior cariogênicidade desta condição
experimental (SC) foram os maiores valores dos polissacarídeos em relação a todos
os outros (Tabela 2). Provavelmente, esta maior produção seja devido a uma
possível seleção de Streptococcus mutans neste meio. A importância das bactérias
na etiologia e patogenia da cárie dentária deve-se em parte a produção de ácido.
Porém, a importância da matriz da placa bacteriana não pode ser menosprezada. As
principais fontes de polissacarídeos na placa dentária são produtos da interação de
glucosiltransferases de Streptococcus mutans (GTFS) com a sacarose27. Estes
oferecem uma matriz insolúvel para a placa e para a colonização de outros
microrganismos orais 28.
O
grupo
experimental
(0S),
que
não
foi
exposto
à
sacarose,
surpreendentemente, gerou placa visível e mostrou perda significativa de dureza.
Estes resultados podem ser explicados pela presença de extrato de carne, extrato
de levedura, proteose peptona e mucina gástrica de porco no meio de saliva artificial
18, 8
. Estes ingredientes podem ter servido de alimento para as bactérias e reduzido o
pH. Neste caso, a saliva teria funcionado com única fonte de nutrição para as
bactérias. A mucina gástrica de porco tem sido utilizada como um substrato modelo
para a saliva por possuir ampla similaridade na estrutura de oligossacárideos com a
mucina da saliva humana e esta, por sua vez, está relacionada com o
desenvolvimento de cárie na ausência de outras fontes de nutrientes 29.
As microfotografias MEV da superfície dentinária modificada comprova a
capacidade do microcosmo em alterar a morfologia da superfície deste substrato
quando exposto à sacarose (Fig 2- b,c,d). Os túbulos dentinários dos grupos 0S, 6S
e CS estão mais amplos do que aqueles observados nos espécimes do grupo C (Fig
2 – a). No grupo controle (Fig 2 – a) o que se observa é a dentina intertubular
planificada, com uma leve obliteração dos tubos dentinários, que pode ser devido ao
preparo do espécime com a planificação com lixas de polimento da superfície. A sua
simples imersão em saliva artificial não promoveu alterações superficiais notáveis.
37
Em conclusão, o modelo in vitro desenvolvido foi capaz de provocar cárie
artificial em dentina radicular. A perda mineral foi modulada pelas diferentes formas
de exposição à sacarose. Os polissacarídeos foram indicadores da cariogenicidade
da microbiota, entretanto, há necessidade de estudos adicionais para caracterizar
qualitativamente os microrganismos do modelo.
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório da pós-graduação em Odontologia da Universidade Federal
do Ceará em nome da Profa. Monica Yamaulti, e em especial, a David Queiroz
técnico responsável.
À Central Analítica da Universidade Federal do Ceará que cedeu o
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) para realização das análises.
A pesquisa foi realizada com recursos próprios e não declara nenhum
conflito de interesse.
38
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http://www.pubmedcentral.nih.gov/3469885
42
APÊNDICE 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
PROGRAMA DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA- PPGO
Endereço: Campus Universitário Ministro Petrônio Portela, Bloco 5,
Bairro Ininga, Teresina- Piauí, 64049-550 Telefone: 3237 -1517
E‐mail: [email protected]
Título do projeto: Modelo de biofilme microcosmo para avaliar desmineralização
em dentina
Pesquisador responsável: Ana Clarissa Cavalcante Elvas Bohn (mestranda em
Odontologia), Prof. Dr. Raimundo Rosendo Prado Júnior (orientador); Glauber
Campos Vale (co-orientador)
Instituição:
Universidade Federal do Piauí-UFPI,
Centro de Ciências da Saúde,
Programa de Mestrado em Odontologia – PPGO.
Telefone para contato (inclusive a cobrar): 9432-0860, 9929-3720.
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário, em uma
pesquisa. Você precisa decidir se quer participar ou não. Por favor, não se apresse
em tomar a decisão. Leia cuidadosamente o que se segue e pergunte ao
responsável pelo estudo qualquer dúvida que você tiver. Após ser esclarecido(a)
sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao
final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do
pesquisador responsável. Em caso de recusa você não será penalizado(a) de forma
alguma.
Este projeto é uma pesquisa experimental que tem o objetivo de validar um
modelo de biolfilme microcosmo para estudo de desmineralização da dentina
radicular.
Será necessário elaborar um meio semelhante ao ambiente oral e para
isso será coletada saliva de dois doadores. Os experimentos em seguida serão
feitos em laboratório. O doador necessitará ficar 24 horas sem realizar higiene oral,
no momento da coleta mastigar goma de mascar para estimular a salivação e, em
43
seguida, cuspir a saliva em recipiente adequado e cedido pelo pesquisador. A saliva
será coletada em um único momento. Não haverá nenhum risco nem benefício
direto para o participante, pois trata- se de estudo experimental.
O colaborador terá garantia de acesso, pois em qualquer etapa do estudo,
terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de
eventuais dúvidas. Terá, também, garantia de sigilo, pois se concordar em participar
do estudo, seu nome e identidade serão mantidos em sigilo. A menos que requerido
por lei ou por sua solicitação, somente o pesquisador, a equipe do estudo,
representantes do patrocinador, Comitê de Ética independente e inspetores de
agências regulamentadoras do governo (quando necessário) terão acesso a suas
informações para verificar as informações do estudo. E poderá retirar o
consentimento a qualquer tempo.
Após a leitura dos termos acima e esclarecimento por parte do
pesquisador, caso concorde em participar da pesquisa, preencha e assine a
declaração a seguir em duas vias:
Eu, _________________________________________________________, RG
______________ CPF ________________, abaixo assinado, concordo em participar
deste estudo, como sujeito. Fui suficientemente informado a respeito das
informações que li ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo ―Modelo de
biofilme microcosmo para avaliar desmineralização em dentina‖. Eu discuti com o
pesquisador sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para
mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus
desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos
permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas.
Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu
consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades
ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido.
Teresina,___ de__________ de ______
________________________________________
Assinatura do sujeito
44
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa e
aceite do sujeito em participar
Testemunhas:
Nome:__________________________________________________________
RG_______________Assinatura:_____________________________________
Nome:__________________________________________________________
RG:______________Assinatura:_____________________________________
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e
Esclarecido deste sujeito de pesquisa para a participação neste estudo.
Teresina,___ de__________ de ______
________________________________________
Assinatura do pesquisador responsável

Observações complementares:
Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em
contato:
Comitê de Ética em Pesquisa – UFPI
Campus Universitário Ministro Petrônio Portella - Bairro Ininga
Centro de Convivência L09 e 10 - CEP: 64.049-550 -Teresina - PI
tel.: (86) 3215-5734 - email: [email protected]
web: www.ufpi.br/cep
45
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European Journal of Oral Sciences gives priority to analytical articles, investigating
why and how something occurred rather than reporting empirical observations.
Review Articles: May be invited by the Editors. Proposals for such articles should be
discussed with the appropriate Editor prior to preparation and submission. Review
articles comprise attempts to synthesize the existing literature pertaining to a specific
scientific question using methods and principles of reasoning that are as transparent
as possible. It follows that systematic reviews are preferred over more narrative
reviews.
Review
articles
will
be
subjected
to
peer
review.
Focus Articles: May be invited by the Editors. Proposals for such articles should be
discussed with the appropriate Editor prior to preparation and submission. Focus
articles may build on the same principles as the Review article, but are usually
shorter and aim at stimulating a broader scientific discussion by ‗contesting
conventional wisdom‘ and allowing the author(s) to argue a specific point pertaining
to a matter of current scientific importance. Focus articles will be subjected to peer
review.
Short Communications: Short communications should aim at being no longer than
two printed pages. They should contain important, new, definitive information of
sufficient significance to warrant publication. Short communications need not follow
the usual division into Material and methods etc. but should have a short Abstract.
Extra issues: Congress proceedings, larger papers or monographs may be
published as Supplements or Part II issues, the full cost being paid by the congress
organizer or similar. A condition is that the proposed extra issue is deemed to have a
significant scientific value. In some cases, the Journal will partly fund extra issues;
this is at the discretion of the Editor-in-Chief. Further information may be obtained
from the Editor-in-Chief.
MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE
It is expected that all manuscripts submitted to the European Journal of Oral
Sciences should follow journal format as described in the Author Guidelines and as
displayed in recent issues of the Journal. Failure to do so reflects negatively on the
work itself and may be a cause for immediate revision or even rejection of a
manuscript.
48
FORMAT
Language: The language of publication is English. Authors whose native language is
not English are strongly advised to obtain assistance from someone proficient in
scientific English.Manuscripts not submitted in the proper format or in poor English
may be returned without review. A list of independent suppliers of editing services
can be found at http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp. All
services are paid for and arranged by the author, and use of one of these services
does not guarantee acceptance or preference for publication.
Abbreviations, Symbols and Nomenclature: Correct unit abbreviations should be
used. Examples include ‗‗yr‘‘, ‗‗wk‘‘, ‗‗d‘‘, ‗‗h‘‘, ‗‗min‘‘, ‗‗s‘‘ and ‗‗µm‘‘ rather than ‗‗years‘‘,
‗‗weeks‘‘, ‗‗days‘‘, ‗‗hrs‘‘, ‗‗minutes‘‘, ‗‗sec‘‘ and ‗‗µ‘‘, respectively. For abbreviations of
physical and chemical units and symbols, designation of isotopically labelled
compounds, abbreviations which may be used without definition etc., the Biochemical
Journal web site is a valuable resource. Scientific names of bacteria, binomials in
italics, must be given in full when first mentioned. Subsequent mention may
abbreviate genus, taking care that this abbreviation is unambiguous (Staph. or Strep.
instead of S.).
STRUCTURE
All manuscripts submitted to the European Journal of Oral Sciences should include:
Title page, Abstract Page, Introduction, Material and Methods, Results, Discussion,
Acknowledgments, References, Figure Legends, Tables, and Figures, arranged in
that order. Authors are urged to consult a recent issue of the Journal to be familiar
with style and format. The whole manuscript should be double-spaced, paginated,
and submitted in correct English. The beginning of paragraphs should be properly
marked with an indent. Avoid end-of-line hyphens.
Title Page: The title page should contain the following information in the order given:
1) the article title; 2) authors‘ full names without degrees or titles; 3) authors‘
institutional affiliations including city and country; 4) a running title, not exceeding 40
letters and spaces; 5) name, address, telephone, telefax and e-mail address of the
author responsible for correspondence. The title should be concise but informative,
include animal species used (if appropriate) and should not include any non-standard
acronyms or abbreviations. The Journal does not favour titles of an affirmative
character.
Abstract: A separate abstract page should contain the following: 1) authors‘
surnames and initials; 2) title of manuscript; 3) the abbreviation Eur J Oral Sci; 4) the
word Abstract followed by a summary of the complete manuscript; 5) up to five key
words according to Index Medicus; 6) name, address, telefax and e-mail address of
the author to whom requests for reprints should be sent. This contact information
should refer to a professional rather than to a residential/private address.
49
The Abstract should give a condensed overview of the study, summarizing its
background, aim, methodology and results with only few but relevant details, and the
authors‘ principal conclusions. It should be short and concise, without headings and
not divided into paragraphs, and with a maximum of 200 words. It should not contain
any non-standard acronyms or abbreviations.
MAIN TEXT OF ORIGINAL ARTICLES
Material and Methods: Procedures should be described in such a detail as to make
it possible to repeat the work. Subheadings may be used to improve clarity.
It is assumed that authors have considered the ethical aspects of their research and
ensured that the work was approved by an appropriate Ethical Committee. This
should be stated. In human experimentation, informed consent from individuals must
have been given. (See above under 2.2) Sources of supply of commercial products
should be given with the address (town, state and country) in parenthesis. For an
improved quality and transparency, reports of randomized trials must conform to the
CONSORT guidelines and will be evaluated in light of the recommendations in this
statement. (See above under 2.3) Since many investigations rely on statistical
treatment, authors are advised to consult a person with in-depth statistical
knowledge. If a manuscript describes original nucleotide/amino acid sequence data,
these should be submitted to GenBank by the authors and the accession numbers
included in the manuscript. (See above under 2.4) Authors of papers published in the
Journal are obliged to honor any reasonable request by qualified investigators for
unique propagative materials, such as cell lines, hybridomas, DNA clones and
antibodies that are described in the paper.
Results and Discussion: The Results section should clearly and concisely report
findings, as a rule in the past tense, without subjective comments and reference to
previous literature. Double documentation of data in text, tables or figures is not
acceptable. Tables/figures should not include data that can be given in the text in one
or two sentences. The Discussion section presents the interpretation of the findings;
this is the only proper section for subjective comments. Authors are strongly urged to
avoid undue repetition of what has already been reported in Results. For the sake of
clarity, the Results section may have subheadings; this is usually not the case with
the Discussion.
Acknowledgements: Under acknowledgements please specify contributors to the
article other than the authors accredited. This may include recognition of e.g.
financial support, gifts of research material, assistance with statistics and language.
Please also include specifications of any potential conflict of interests if appropriate.
Short Communications need not follow the usual division into Material and methods
etc. but should have a short abstract.
50
Review and Focus Articles should include a Title page, an Abstract page and a
Reference list as regular Original Research Articles. Although a Review article
(particularly following a systematic review) may adhere to the format of the Original
Research Article, Review and Focus articles need not contain Materials and
Methods, Results or Discussion sections, and may instead employ other headings as
relevant for the topic addressed.
REFERENCES
Number references consecutively in the order in which they are first mentioned in the
text. Identify references in texts, tables, and legends by Arabic numerals (within
parenthesis). Check to ensure that all listed references are cited in the text. If an
author‘s name is mentioned in the text, small capital letters should be used.
Non-refereed material and, if possible, non-English publications should be avoided.
Congress abstracts, unaccepted papers, unpublished observations, and personal
communications may not be placed in the Reference list. References to ‗unpublished
findings‘ and to ‗personal communication‘ (provided explicit consent has been given
by the sources) may be inserted in parentheses in the text. Unpublished articles
should be referred to only if proof can be given that they are accepted for publication.
Copies of such articles may be requested for evaluation of the manuscript submitted.
Authors are urged to study the examples of correct reference formats given below.
For abbreviations of journals, consult the List of the Journals Indexed in
Index Medicus. List all authors; do not use et al. in the Reference list. Avoid issue
numbers in journal articles. Give first and last page of references in full.
TABLES, FIGURES AND FIGURE LEGENDS
Tables: Tables should be numbered consecutively with Arabic numerals. Each table
should include a compulsory, concise explanatory title and an explanatory legend. A
table should be organized with due regard for the proportion of the printed
column/page. Specifically, tables which are too wide must be avoided, as these have
to be printed vertically.
Figure Legends: Include Figure Legends after the reference section of the Main
Text.
Figures: Articles will not be published unless the Figures fulfill journal quality criteria
in terms of scientific information, general style, legibility of text and numbers, as well
as electronic format and resolution. Double documentation of data in text, tables or
figures is not acceptable. Always consider whether data might be better given in the
text or in a table. All graphs, drawings, and photographs are considered Figures and
should be numbered in sequence with Arabic numerals. Each figure should have a
legend (number and list legends after the reference section of the main text). Figures
should be planned to fit the proportions of the printed page or one column‘s width.
Authors are encouraged to arrange micrographs into multipane.
51

Ana Clarissa Cavalcante Elvas Bohn

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