MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA

Transcrição

PROSPECÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DE
Lygodium venustum SW (LYGODIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS
BIOATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIEPIMASTIGOTA,
ANTIPROMASTIGOTA, CITOTÓXICA E ANTIMICROBIANA DE
EXTRATO E FRAÇÕES (in vitro).
Dissertação apresentada ao programa de Pós –
Graduação em Bioprospecção Molecular da
Universidade Regional do Cariri como requisito
para Defesa (Linha de pesquisa: Bioprospecção
de Produtos Naturais e Microbiologia).
Orientador:
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho
Co-Orientador:
Prof. Dr. Antonio Alamo Feitosa Saraiva
CRATO – CE
2012
1
Autorizo a reprodução ou divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que seja citada a fonte.
Braga, Maria Flaviana Bezerra Morais.
B813p Prospecção química do extrato etanólico das folhas de Lygodium
venustum SW (LYGODIACEAE) e avaliação das bioatividades antioxidante,
antiepimastigota, antipromastigota, citotóxica e antimicrobiana de extrato e
frações (in vitro)/ Maria Flaviana Bezerra Morais Braga. – Crato, 2012.
228p.; il.
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós – Graduação
em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri - URCA.
Orientador: Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho
Co-Orientador:Prof. Dr. Antonio Alamo Feitosa Saraiva
1. Lygodium venustum SW, Atividade antimicrobiana - 2. Plantas
medicinais. 3. Prospecção química I. Título.
CDD: 615.323
Ana Paula Saraiva CRB – 3/1000
2
PROSPECÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Lygodium
venustum SW (LYGODIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS BIOATIVIDADES
ANTIOXIDANTE, ANTIEPIMASTIGOTA, ANTIPROMASTIGOTA, CITOTÓXICA
E ANTIMICROBIANA DE EXTRATO E FRAÇÕES (in vitro).
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto sensu em
Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito
parcial para obtenção do titulo de Mestre em Bioprospecção Molecular. Área de
concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais.
Aprovada em 28 de fevereiro de 2012.
BANCA EXAMINADORA
CRATO – CE
2012
3
À Mariana... O amor da vida da mamãe.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela existência.
A meus pais Francisco Ivo Morais e Maria Socorro Bezerra Morais, a quem tanto amo, por
tudo o fizeram para que eu me tornasse o que hoje sou.
A meu irmão José Flávio Bezerra Morais, em quem me inspiro na tentativa de ser semelhante
em sensatez, equilíbrio e positividade. Obrigada pelo carinho, apoio e ombro amigo.
A meu esposo, Francisco Valdemiro Braga, “o escolhido”, pelo amor, carinho e
companheirismo e ainda por nossa amada princesinha Mariana.
A Maria Helena dos Santos Cordeiro (“mãe Nena”), a “mãe executiva” da Mariana, pelo
apoio, dedicação, zelo, honestidade e, sobretudo, pelo auxílio na educação da nossa pequena.
Pela presença constante, de inestimável valor.
Ao meu Orientador Professor Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho, pelos ensinamentos,
oportunidades, apoio, parceria, amizade e paciência. Minha vida acadêmica com certeza
deverá ser registrada em dois períodos: antes de HDM Coutinho e depois de HDM Coutinho.
Ao meu Co-Orientador Professor Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva, pelo auxílio na coleta e
identificação da planta e pela disponibilização de informações na área de pteridologia. Muito
grata pelo acolhimento e incentivo durante a realização desta etapa de vida.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação, em reconhecimento por sua luta pela valorização
e melhoria das condições de funcionamento do mestrado, nas pessoas do Coordenador o Prof.
Dr. Waltécio de Oliveira Almeida e Vice-Coordenador, o Prof. Dr. Allysson Pontes Pinheiro.
Ao Professor Dr. Irwin Rose Alencar Menezes, pelas contribuições com as análises
estatísticas, entre outras, e pela disponibilidade e constante apoio moral.
5
Ao Professor Dr. José Galberto Martins da Costa e a equipe do LPPN pelo auxílio nas etapas
iniciais da nossa pesquisa e, neste contexto, pela receptividade e zelo com o desenvolvimento
dos trabalhos.
À Dra. Maria Celeste Vega Gómez e equipe do CEDIC - Centro para el Desarrollo de la
Investigacion Científica da Universidad de Asuncion - Paraguai, pela parceria e contribuição
científica.
A todos os meus professores das disciplinas do mestrado, Henrique Douglas Melo Coutinho
Imeuda Peixoto Furtado, Irwin Rose Alencar Menezes, José Galberto Martins da Costa, Marta
Maria de Almeida Souza e Marta Regina Kerntopf Mendonça pela riqueza de seus
ensinamentos.
A Rogério de Aquino Saraiva e demais membros pesquisadores dos laboratórios de pesquisa
científica da Universidade Federal de Santa Maria, pela parceria na realização dos trabalhos.
Aos queridos amigos e colegas de mestrado Carlito Santos, Helenicy Veras, Heloísa Souza,
Jacqueline Andrade, Katiúcia Santos, Mariana Araruna, Morgana Delfino, Norma Fernandes,
Samara Brito, Renata Souza, Teógenes Souza e Tiago Leite pelo companheirismo,
aprendizado coletivo, carinho e partilha. Vocês são presentes valiosos que o mestrado me
trouxe.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Audilene Freitas, Cislânia
Araújo, Elba Souza, Glaucia Guedes, Katiúcia Santos, Nadghia Leite, Natália Leite, Teógenes
Souza e Saulo Tintino pela partilha de conhecimentos e experiências e pelo carinho recebido.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação, Maria Andecieli Rolim de Brito e Maria
Lenira Pereira, pelos todos os serviços prestados, receptividade e manifestações de apoio
durante o período de realização do curso.
Às agências brasileiras fomentadoras de pesquisa FUNCAP e CNPQ pelo auxilio financeiro
para o desenvolvimento das pesquisas.
6
A URCA pela oportunidade de crescimento e por ceder o espaço para a realização deste
trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
7
“Piensas en grande y tus hechos crecerán,
piensa em pequeño y quedarás atrás”
Christian Barnard (1922-2001)
8
RESUMO
A pesquisa com produtos naturais, muito intensificada na atualidade, tem apontado novos
caminhos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. Neste contexto, a biodiversidade
mundial tem contribuído como fonte inestimável de matéria prima para a composição de
fármacos, numa corrida frenética pelo combate à resistência de microrganismos e pela cura de
diversas enfermidades. Populações mundiais padecem de males como leishmaniose, doença
de Chagas, infecções bacterianas e fúngicas, além das doenças degenerativas causadas por
danos oxidativos que surgem numa incidência assustadora. Plantas medicinais têm se
destacado ao longo dos anos por suas propriedades terapêuticas e a ciência busca a
comprovação de sua eficácia, numa triagem intensiva de compostos para uma dada atividade.
Lygodium venustum SW é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente que tem sido
utilizada na terapêutica popular contra distúrbios gastrointestinais, infecções, dermatoses e
doenças parasitárias como a trichomoníase, entre outras. Neste estudo foram avaliadas suas
bioatividades antioxidante, antibacterianas, antifúngicas e moduladora de drogas, assim como
a atividade antiparasitária contra Trypanonoma cruzi (epimastigota) e Leishmania brasiliensis
(promastigota). Sua citotoxidade também foi verificada contra células de mamíferos. Todos os
ensaios foram realizados in vitro e para isto foi preparado o extrato etanólico, obtendo-se as
frações hexânica, diclometano, acetato de etila e metanólica. Os constituintes químicos foram
investigados qualitativamente quanto à presença de classes de metabólitos secundários no
extrato bruto, tendo sido detectada as presenças de fenóis, taninos, flavonóides e alcalóides.
Os testes antibacterianos e antifúngicos foram feitos em microdiluição em caldo e as amostras
foram testadas em concentrações variando de 1024-8 µg/mL. Foram utilizadas as linhagens
padrões fúngicas de Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis e as bacterianas
de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphyloccocus aureus e Pseudomonas
aeruginosa. A Concentração Inibitória Mínima de todos os microrganismos foi ≥1024 µg/mL,
não tendo sido demonstrada atividade clinicamente relevante. A atividade moduladora da
ação de drogas foi realizada em associação com aminoglicosídeos e antifúngicos tomando-se
uma concentração subinibitória (MIC/8) dos produtos contra as linhagens fúngicas padrões e
as multiresistentes S. aureus 358, P. aeruginosa 03 e E. coli 27. Extrato e frações não
modularam a ação dos antifúngicos, entretanto potencializaram o efeito dos aminoglicosídeos
contra E. coli e S. aureus. A fração acetato de etila potencializou todos os aminoglicosídeos.
Determinou-se o tipo de interação entre produto natural/droga pelo método checkerboard
onde se observou sinergismo e aditividade. A investigação das atividades tripanocida e
leishmanicida foi realizada em triplicata em diferentes concentrações, baseando-se na
citotoxicidade das amostras, que apresentaram toxicidade geralmente variando de elevada a
moderada em concentrações acima de 100 µg/mL. Os melhores resultados foram verificados
contra T. cruzi com percentuais (AE%) de 63%, nas concentrações de 1000 µg/mL e 500
µg/mL (frações hexânica e metanólica respectivamente), e contra L. brasiliensis com 68% de
atividade (fração metanólica). A avaliação da atividade antioxidante foi realizada pelo método
fotocolorimétrico do 2,2-difenil,1-picrilhidrazila (DPPH), onde extrato e frações foram
testados em concentrações de 1 a 500 µg/mL e as leituras das absorbâncias foram feitas em
espectofotômetro a 518 nm. Os resultados mostraram uma CE50 do extrato em 67,58 µg/mL e
entre as frações, o melhor resultado foi exibido pela fração acetato de etila, com CE 50 na
concentração de 82,70 µg/mL.
Palavras-chave: Lygodium venustum. Atividade antimicrobiana. Atividade antiparasitária.
Prospecção química. Citotoxicidade. Atividade Antioxidante
9
ABSTRACT
The research on natural products, greatly enhanced today, has pointed out new ways for the
development of therapeutic agents. In this context, the world's biodiversity has contributed as
an invaluable source of raw materials for the composition of drugs, in a frantic race to combat
the resistance of microorganisms and healing of various diseases. World population suffers
from illnesses such as leishmaniasis, Chagas disease, bacterial and fungal infections, and
degenerative diseases caused by oxidative damage that appear in a frightening incidence.
Medicinal plants have been out standing over the years for their therapeutic properties and
science seeks evidence of its effectiveness in an intensive screening of compounds for an
specific activity. Lygodium venustum SW is a fern with a cosmopolitan latescence habit that
has been used in popular therapy against gastrointestinal disorders, infections, skin diseases
and parasitic diseases such as trichomoniasis, among others. We evaluated their antioxidant,
antibacterial, antifungal and modulating drugs bioactivities as well as antiparasitic activity
against Trypanonoma cruzi (epimastigote) and Leishmania brasiliensis (promastigote). Their
cytotoxicity was also observed against mammalian cells. All assays were performed in vitro
and to do that the ethanolic extract was prepared, resulting in the hexane fraction,
diclometano, ethyl acetate and methanol. The chemical constituents were investigated
qualitatively on the presence of secondary classes of metabolites in crude extract, the presence
of phenols, tannins, flavonoids and alkaloids was detected. The antibacterial and antifungal
tests were made in broth microdilution and the samples were tested at concentrations ranging
from1024 - 8 μg/mL. We used the standard fungal strains of Candida albicans, Candida
krusei and Candida tropicalis and the bacterial Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The Minimum Inhibitory
Concentration of all microorganisms was ≥1024 μg/mL and it has not demonstrated clinically
relevant activity. The modulating activity of the action of drugs was performed in
combination with aminoglycosides and antifungal taking a subinhibitory concentration (MIC /
8) of the products against the fungal strains standards and the multiresistant S. aureus 358, P.
aeruginosa 03 and E. coli 27.Extract and fractions did not modulate the action of antifungals,
however potentiated the effect of aminoglycosides against E.coli and S.aureus. The ethyl
acetate fraction potentiated all aminoglycosides. The type of interaction was determined
between natural product/drug by the checkerboard method where synergy and additivity were
observed. The investigation of trypanocidal and leishmanicidal activities were performed in
triplicate at different concentrations, based on the cytotoxicity of the samples that showed
toxicity usually ranging from high to moderate concentrations above 100 μg/mL. The best
results were obtained against T. cruzi with percentage (AE %) of 63% at concentrations of
1000 μg/mL and 500 μg/mL (hexane and methanol fractions, respectively) and against L.
brasiliensis with 68% activity (methanol fraction). The evaluation of antioxidant activity was
carried out using the fotocolorimetric method 2, 2- diphenyl, 1 – picrilhidrazila (DPPH),
where extract and fractions were tested at concentrations of 1 - 500 µg/ml and the absorbance
readings were performed in a spectrophotometer at 518 nm. The results showed an EC50 of
extract 67.58 µg/mL and between fractions the best result was shown by the ethyl acetate
fraction, with the EC50 concentration of 82.70 µg/mL.
Keywords: Lygodium venustum. Antimicrobial. Antiparasitic activity. Chemical prospecting.
Cytotoxicity. Antioxidant activity.
10
LISTAS DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Samambaia Lygodium venustum Sw......................................................................27
Figura 2 – Diferenças estruturais entre as células bacterianas Gram positivas e Gramnegativas....................................................................................................................................34
Figura 3 – Microrganismos (bactérias): a. Staphylococcus aureus; b. Escherichia coli; c.
Pseudomonas aeruginosa; d. Klebsiella pneumoniae...............................................................36
Figura 4 – Microrganismos (leveduras): a. Candida albicans; b. Candida tropicalis e c.
Candida krusei..........................................................................................................................38
Figura 5 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi......................................................................40
Figura 6 – Distribuição de casos de infecção por Trypanosoma cruzi....................................41
Figura 7 – Ciclo de vida de Leishmania spp............................................................................42
Figura 8 – Distribuição de casos de leishmaniose cutânea......................................................43
Figura 9 – Distribuição de casos de leishmaniose visceral......................................................44
Figura 10 – Passos seguidos e todas as biatividades avaliadas durante o desenvolvimento da
pesquisa..............................................................................................................................49
Figura 11 - Localização da área de coleta de Lygodium venustum..........................................50
Figura 12 – Exsicata de Lygodium venustum depositada no Herbário Caririense Dárdano de
Andrade-Lima (HCDAL)..........................................................................................................51
Figura 13 – Identificação de compostos químicos (antocianinas, antocianidinas, flavonas,
flavonois,
xantonas,
chalconas,
auronas
e
flavonóis
através
de
método
colorimétrico......................................................................................................................53
Figura 14 – Identificação de leucoantocianidinas, catequinas e lavononas por método
colorimétrico......................................................................................................................54
Figura 15 – Origem das linhagens e perfil de resistência das bactérias a antibióticos............55
Figura 16 – Placa de microdiluição (a) e revelação de placas com resazurina (b)..................56
Figura17-Fibroblastos
de
mamíferos
NCTC-929
utilizados
no
teste
de
citotoxicidade............................................................................................................................59
Figura 18 – Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi......................................................59
Figura 19 – Forma promastigota de Leishmania spp...............................................................60
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%AE - Percentual de inibição de epimastigotas
%AP - Percentual de inibição de promastigotas
%C – Percentual de citotoxicidade
≥ - maior ou igual que
Ab - Antibiótico
Abs - Absorbância
AC – Grupo controle de absorbância
ACB – Branco de meio de cultura
AE – Absorbância do grupo experimental
AEB – Branco de compostos
ATCC - American Type Culture Collection
ATP – Adenosina trifosfato
BHI - Brain Heart Infusion (Caldo de coração e cérebro)
BHT - Butil-hidroxitolueno
CBM - Concentração bactericida mínima
CCl4 – Tetracloreto de Carbono
CE50 – Concentração efetiva
CEDIC - Centro para el Desarrollo de la Investigacion Científica
CIF – Concentração Inibitória Fracionada
CIM – Concentração inibitória mínima
CIM/8 – Concentração subinibitória
CO2 – Gás carbônico
COX – Ciclo-oxigenase
CPRG – Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosídeo
DAD - Diode-Array Detection
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA - deoxyribonucleic acid ou ADN: ácido desoxirribonucléico
DP – Desvio padrão
DPPH – 2,2-difenil,1- picrihidrazila
DSM – Diferença Significativa Mínima
EELV – Extrato etanólico de Lygodium vensutum
EEPC – Extrato etanólico de Pityrogramma calomelanos
12
EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
et al – e outros; e colaboradores (latim)
FAELV – Fração Acetato de Etila de Lygodium vensutum
FAEPC – Fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos
FBS – Fetal bovine serum (soro fetal bovino)
FCPC – Fração clorofórmica de Pityrogramma calomelanos
FDLV – Fração Diclorometano de Lygodium vensutum
FeCl3 – Percloreto de ferro
FHLV – Fração Hexânica de Lygodium vensutum
FHPC – Fração hexânica de Pityrogramma calomelanos
FMLV – Fração Metanólica de Lygodium vensutum
FMPC – Fração metanólica de Pityrogramma calomelanos
FRP – Ferric reducing Power
g - grama(s)
h - hora(s)
HCDAL – Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima
HCl – Ácido clorídrico
HIA – Heart infusion Agar
HIV – Human immunodeficiency vírus ou HIV: virus da imunodeficiência humana
HPLC - High performance liquid chromatography
IC50 - Half maximal inhibitory concentration (metade da concentração maxima inibitória)
LIT - Liver infusion tryptose (infusão de fígado triptose)
LMBM – Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular
Min – Minuto (s)
mM - milimol
mm/Hg – milímetros de mercúrio
MS – Ministério da Saúde
MTC - Medicina Tradicional Chinesa
MTCC - Culture Collection Microbial Tipo
NaOH – Hidóxido de sódio
NCCLS – National Comitee for Clinical Laboratory Standards
NH4OH – Hidróxido de amônia
nm - namômetro (s)
NO – Óxido nítrico
13
ºC - graus Celsius
OMS – Organização Mundial de saúde
pH - Potencial hidrogeniônico
PIV 3 – Parainflueza vírus 3
PTR1 - Pteridina-redutase 1
QR 2 – Redutase quinona 2
RMN – Ressonância magnética nuclear
RNA - Ribonucleic acid ou ARN: ácido ribonucléico
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
RSV – Vírus sincicial respiratório
SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida ou AIDS: Acquired immune deficiency
syndrome
TR – Tempo de retensão
TR – Transcriptase reversa
U/mL – Unidade por mililitro
UFC: Unidade formadora de colônia
UFPB – Universidade Federal da Paraíba
URCA – Universidade Regional do Cariri
UV - Ultravioleta
μg/mL - microgramas de soluto por mililitro de solvente
μL - microlitro(s)
μM - micromol
14
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................18
2. OBJETIVOS.........................................................................................................................22
2.1. OBJETIVO GERAL .........................................................................................................22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................22
3. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................24
3.1 ESPÉCIE BOTÂNICA EM ESTUDO...............................................................................24
3.1.1 Posição taxonômica da planta.......................................................................................24
3.1.2
Sinonímia.....................................................................................................................24
3.1.3 Caracterização botânica.............................................................................................24
3.1.3.1 A ordem Schizaeles.......................................................................................................25
3.1.3.2 A família Lygodiaceae M. Roe.....................................................................................26
3.1.3.4 O gênero Lygodium SW................................................................................................26
3.1.3.4 A espécie Lygodium vensutum SW...............................................................................27
3.1.4 Importância etnobotânica e farmacológica de L. venustum.......................................28
3.2
PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO Lygodium................................................29
3.3
PRODUTOS NATURAIS E USO TERAPÊUTICO.....................................................30
3.4
MICRORGANISMOS EM ESTUDO E IMPLICAÇÕES CLÍNICAS.........................32
3.4.1 Bactérias..........................................................................................................................32
3.4.1.1 Staphylococcus aureus..................................................................................................33
3.4.1.2 Escherichia coli.............................................................................................................34
3.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa.............................................................................................35
3.4.1.4 Klebsiella pneumoniae..................................................................................................35
3.4.2 Fungos.............................................................................................................................36
3.4.2.1 Candida albicans..........................................................................................................37
3.4.2.2 Candida tropicalis.........................................................................................................37
3.4.2.3 Candida krusei..............................................................................................................38
3.4.3 Protozoários.................................................................................................................38
3.4.3.2 Trypanosoma cruzi........................................................................................................39
3.4.3.2 Leishmania spp.............................................................................................................41
3.5 RESISTÊNCIA DE MICRORGANISMOS.......................................................................44
3.6 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO, RADICAIS LIVRES E SUBSTÂNCIAS
ANTIOXIDANTES..................................................................................................................46
15
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................49
4.1 SELEÇÃO E COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO....................................................49
4.2 OBTENÇÕES DE EXTRATO ALCOÓLICO E FRAÇÕES.............................................50
4.3 PROSPECÇÃO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO ETANÓLICO
(EELV): ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA....................................................51
4.3.1 Preparação do extrato e operações preliminares........................................................52
4.3.2 Teste para identificação de fenóis e taninos.................................................................52
4.3.3 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides...............................................52
4.3.4 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas..........................................52
4.3.5 Teste para alcalóides......................................................................................................53
4.4 TESTES DE SUSCETIBILIDADE DE MICRORGANISMOS PELO MÉTODO DA
MICRODILUIÇÃO EM CALDO.....................................................................................54
4.4.1 Preparo da solução inicial e das soluções de teste.......................................................54
4.4.2 Linhagens utilizadas......................................................................................................54
4.4.3 Drogas e reagentes.........................................................................................................55
4.4.4 Meios de cultura.............................................................................................................56
4.4.5 Teste Concentração Inibitória Mínima: execução e leitura.......................................56
4.4.6 Teste de modulação da ação de antibióticos e antifúngicos.......................................57
4.4.7 Teste para avaliação do tipo de interação droga/produto natural: método
checkerboard...................................................................................................................57
4.5 TESTE DE CITOTOXICIDADE E ANTIPARASITÁRIOS.............................................58
4.5.1 Reagentes e drogas.........................................................................................................58
4.5.2 Cultura de células...........................................................................................................58
4.5.3 Execução e leitura do ensaio de citotoxicidade............................................................60
4.5.4 Ensaio de suscetibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi......61
4.5.5 Ensaio de suscetibilidade para as formas promastigotas de Leishmania
brasiliensis.......................................................................................................................61
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................................62
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................62
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES......................................................................................64
5.1 ANTIMICROBIAL AND MODULATORY ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF
THE LEAVES FROM Lygodium venustum SW…...........................................................65
16
5.2 COMBATING THE MULTIRESISTANCE TO ANTIBIOTICS WITH NATURAL
PRODUCTS:
ADDITIVE
EFFECT
OF
Lygodium
venustum
SW.
WITH
GENTAMICIN………………………………………………...……………………….77
5.3 EVALUATION OF THE INTERACTION BETWEEN AMINOGLYCOSIDES AND
NATURAL PRODUCTS OF Lygodium Venustum SW. AGAINST Escherichia Coli
AND staphylococcus aureus CLINICALLY ISOLATED…………..............................85
5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE Lygodium
venustum SW...................................................................................................................94
5.5 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA, ANTIFÚNGICA E MODULADORA DE
FRAÇÕES OBTIDAS DE Lygodium venustum SW....................................................105
5.6 AVALIAÇÃO DA CITOTOCIXIDADE E ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DE
Lygodium
venustum
SW.
CONTRA
Trypanosoma
cruzi
E
Leishmania
brasiliensis.....................................................................................................................117
5.7 ANTI-LEISHMANIA, ANTI- TRYPANOSOMA AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF
NATURAL PRODUCTS FROM Lygodium venustum SW. (LYGODIACEAE)........130
5.8
PTERIDÓFITAS
EM
EVIDÊNCIA:
ETNOBOTÂNICA
E
BIOATIVIDADES
FARMACOLÓGICAS..................................................................................................142
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................186
REFERÊNCIAS....................................................................................................................189
APÊNDICE A: QUADRO COM LEVANTAMENTO DE PESQUISAS ENVOLVENDO O
GÊNERO Lygodium COMPREENDIDAS NO PERÍODO DE 1994 – 2011
(NOVEMBRO)..............................................................................................................199
ANEXO A: OUTRAS PRODUÇÕES CIENTÍFICAS VINCULADAS AO PROJETO.......225
ANEXO B – PRODUÇÕES CIENTÍFICAS NÃO VINCULADAS AO PROJETO............226
17
INTRODUÇÃO
18
1 INTRODUÇÃO
O uso intensivo e inadequado de medicamentos tem provocado um crescente
desenvolvimento de novos mecanismos de defesa nos microrganismos, acarretando um dos
grandes problemas da atualidade que é a resistência microbiana a fármacos comercialmente
utilizados (SEQUEIRA, 2004). Esta situação se estende a vários grupos de microrganismos,
com merecido destaque para bactérias, porém incluindo também fungos e protozoários.
Mesmo com a produção de novos antibióticos nas últimas três décadas, a resistência a
estes medicamentos aumentou. Em geral, bactérias têm a capacidade genética de adquirir e
transmitir resistência a medicamentos utilizados como agentes terapêuticos. Tal fato é motivo
de preocupação por causa do número de pacientes em hospitais com imunidade suprimida
expostos a novas cepas bacterianas multi-resistentes, podendo resultar em alta taxa de
mortalidade (NASCIMENTO, et al., 2000).
Infecções fúngicas invasivas constituem um problema significativo em pacientes
imunocomprometidos. É crescente o espectro de fungos causadores de infecções. Entretanto,
as opções terapêuticas disponíveis são bastante limitadas, principalmente para os patógenos
resistentes a mais de uma classe de antifúngicos (KANAFANI; PERFECT, 2007).
Doenças parasitárias de elevada incidência em países pobres, como leishmaniose e
doença de Chagas tem sido um grande desafio, no que diz respeito à sua terapêutica, pois
além de tais doenças não chamarem a atenção das indústrias farmacêuticas, as drogas
atualmente existentes para seus tratamentos apresentam elevada toxicidade (WHO, 2003; MS,
2010).
O aumento da expectativa de vida da população teve como consequência um crescente
interesse no estudo de doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, Huntington e
Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). Uma vertente destes estudos demonstra que o estresse
oxidativo tem um papel importante e pode até mesmo desencadear o processo de
neurodegeneração (BARBOSA et al., 2006). Substâncias antioxidantes exercem efeito
protetor sobre o organismo e podem ser encontradas em vegetais.
O processo de desenvolvimento de novos fármacos não tem conseguido acompanhar a
rápida evolução dos microrganismos e a ciência tem reunido esforços para busca de novas
substâncias que possam desarticular as defesas desenvolvidas por conta da exposição às
drogas em uso. Neste contexto, produtos naturais de origem vegetal e animal, entre outros,
têm sido o alvo de diversas pesquisas embasadas na existência de atividades biocidas,
naturalmente desenvolvidas por seres vivos, para garantia da sobrevivência entre as espécies e
19
em variados ambientes (SIMÕES et al., 2010). A presença de compostos químicos, oriundos
de uma via metabólica secundária, tem chamado a atenção para novas possibilidades de uso
terapêutico, porque se criou a expectativa de que estes também se apresentam como agentes
potencialmente promissores às aplicações terapêuticas diversas, entre elas a antimicrobiana e
a antioxidativa.
O interesse pela utilização de produtos naturais em favor do bem estar da humanidade
data de tempos remotos. O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza pelos
povos primitivos e pelos indígenas pode ser considerado fator fundamental para
descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo (VIEGAS JR.;
BOLZANI, 2006). Embora este conhecimento apresentado pelas populações seja processado
empiricamente, ao longo dos anos vem sendo elaborados diferentes métodos para
comprovação cientifica da eficácia de produtos naturais na cura de enfermidades. De maneira
indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos
envolvendo áreas multidisciplinares, como por exemplo, botânica, farmacologia e
fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal
natural: a flora mundial (LOPEZ, 2006).
Através de pesquisas etnobiológicas, as plantas têm sido apontadas como os produtos
naturais mais utilizados pelas populações em geral. Levantamentos etnobotânicos enaltecem
as angiospermas como principais fitoterápicos, entre os grandes grupos vegetais. E apesar de
serem bastante antigas, as pteridófitas têm tido pouco destaque no uso medicinal em diversas
culturas, quando comparadas às angiospermas, entretanto, seu uso medicinal é difundido entre
populações mundiais. De acordo com Singh et al. (2010), as pteridófitas, por sua utilidade
medicinal e terapêutica, desde tempos passados têm sido prescritas sob a forma de extrato
medicinal para a cura de várias doenças e hoje, por sua reconhecida importância, são tidas
como um recurso biológico que eleva a sociedade humana.
A Chapada do Araripe abriga um espaço com um bioma de características geológicas,
geomorfológicas, pedológicas, climáticas, hidrográficas/hidrológicas e de vegetação bem
diversificado. Faz parte dos condicionantes ecológicos de uma área com importância
fundamental, tanto para a identificação dos processos evolutivos da Terra, por seus sítios
paleontológicos, como para a sobrevivência das populações que dela tiram seu sustento e dos
que vivem em seu entorno. As formações florestais da Chapada do Araripe podem, de
maneira simplificada, ser estratificadas em mata úmida, cerradão, cerrado, carrasco e caatinga
(AUGUSTO; GÓES, 2007). Este ambiente tão diversificado abriga inúmeras espécies de
vegetais que apresentam além do potencial energético e madereiro, uma importância direta na
20
alimentação e na saúde das populações que lá vivem, por conta de seus frutos e outros
produtos usados como fontes nutritivas e medicinais.
Lygodium venustum, o objeto de estudo deste trabalho, é uma samambaia da família
Lygodiaceae, comumentemente encontrada na encosta da Chapada do Araripe, mais
precisamente no município do Crato, sul do Ceará, local em que foi coletada. Apresenta-se em
abundância especialmente revigorada nas épocas chuvosas, enroscada na vegetação escassa
das clareiras da zona de amortecimento da Floresta Nacional do Araripe-Apodi. Apesar de sua
ocorrência no Cariri Cearense, não se tem dados etnobotânicos que registre o seu uso pelas
populações locais. Entretanto seu uso tem sido muito difundido entre as populações Norte e
Sul Americanas que lhe atribuem tanto importância econômica quanto medicinal (FUNDECI,
2002; DUKE, 2008). Estudos farmacológicos sobre a planta ainda são escassos, tendo sido
investigadas apenas as atividades antibacteriana, anti-diarreica e tricomonicida.
Neste trabalho, procurou-se ampliar os conhecimentos sobre a planta, investigando-se
algumas de suas bioatividades farmacológicas, através de estudos pré-liminares in vitro das
atividades antimicrobiana, antiparasitária e antioxidante. Neste processo, conhecer
quimicamente o vegetal tornou-se algo indispensável e foi concretizado através de uma
análise química qualitativa de classes de metabólitos secundários de relevância, importantes
norteadores para atribuição das supostas bioatividades apresentadas pela samambaia. Outro
aspecto relevante abordado foi o conhecimento do potencial citotóxico da espécie, no qual foi
verificado se extrato e frações do vegetal apresentam reatividade em células de mamíferos,
um passo bem pré-liminar, mas essencial na pesquisa de produtos naturais que antecede testes
in vivo, que comprovam ou não a viabilidade e a segurança de seu uso na terapêutica com
humanos.
Estudos pteridológicos com esta abordagem não são tão comuns no contexto mundial,
sendo este, pioneiro para o gênero Lygodium. Dessa forma, o estudo aqui apresentado, é a
investigação mais abrangente sobre biatividades de uma pteridófita da família Lygodiaceae.
As descobertas contribuirão para o conhecimento específico da espécie L. venustum e
consequentemente da pteridoflora mundial, tendo em vista que os resultados obtidos servirão
para o fortalecimento e complementação das informações disponibilizadas sobre este antigo e
importante grupo vegetal.
21
OBJETIVOS
22
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
 Avaliar o perfil fitoquímico do extrato etanólico das folhas de Lygodium venustum
SW, e as bioatividades antioxidante, antiepimastigota, antipromastigota, citotóxica, e
antimicrobiana de extrato e frações (in vitro), verificando seu efeito modulador junto
a drogas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Realizar o fracionamento do extrato etanólico bruto de L. venustum nas frações
hexânica, acetato de etila, diclorometano e metanólica;
 Identificar por meio de prospecção fitoquímica preliminar das principais classes de
metabólitos secundários presentes no extrato.
 Avaliar o potencial antimicrobiano para cepas padrões de bactérias e fungos ;
 Analisar o potencial modulador frente a cepas bacterianas multirresistentes e cepas
fúngicas padrões, quando combinados a antibióticos aminoglicosídeos e antifúngicos.
 Determinar o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (método de associação –
checkerboard) dos produtos naturais com antibacterianos sintéticos.
 Identificar a citotoxidade in vitro frente à cultura de células de mamíferos.
 Avaliar a atividade tripanocida através de ensaios in vitro com a forma epimastigota
de Trypanosoma cruzi.
 Analisar o efeito leishmanicida in vitro frente à cepa promastigota de Leishmania
brasiliensis.
 Verificar a possibilidade de ação antioxidante.
23
REVISÃO DE LITERATURA
24
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 ESPÉCIE BOTÂNICA EM ESTUDO
3.1.1 Posição taxonômica da planta
Classe: Polypodiopsida
Ordem: Schizaeales
Família: Lygodiaceae
Gênero: Lygodium
Espécie: Lygodium venustum
3.1.2 Sinonímia
Lygodium commutatum C. Presl; L. mexicanum C. Presl; L. polymorphum (Cav.) Kunth.
3.1.3 Caracterização botânica
As pteridófitas constituem um grupo de plantas vasculares sem flores nem sementes
que se reproduzem por esporos. Seu ciclo de vida é heteromórfico com duas fases,
diferenciando-se em gametofítica e esporofítica (PRYER et al., 2004).
Ocupam uma grande diversidade de ambientes em variados ecossistemas,
apresentando diferentes formas biológicas, incluindo quase todas as formas de crescimento e
de adaptação das angiospermas (HOLTUM, 1938). Os ambientes de maior ocorrência das
pteridófitas são os tropicais bastante úmidos, que não apresentam longos períodos secos
durante o ano. Entretanto, podem ocorrer nos mais variados ecossistemas e microhabitats, em
condições bem distintas, de ambientes árticos e alpinos das elevadas altitudes e latitudes até
ambientes úmidos no interior das florestas tropicais; de condições subdesérticas até às
formações costeiras pantanosas (PAGE, 1979a). Fatores físicos podem limitar ou possibilitar
o desenvolvimento e o crescimento tanto do gametófito quanto do esporófito, dificultando ou
facilitando a amplitude ecológica de adaptação e sobrevivência de suas espécies (PAGE,
1979b).
O fato de compartilharem a alternância de gerações em seu ciclo lhe rendeu o
tratamento taxonômico em uma única divisão, a “Pteridophyta”, constituída por classes
25
evolutivamente distintas, formando um táxon parafilético (STEVENSON; LOCONTE, 1996;
PRYER et al., 2004; SMITH et al., 2006).
Estudos envolvendo análises cladísticas com dados morfológicos, ultraestrutura de
gametas e análises de seqüências de DNA, direcionaram as pteridófitas em duas linhagens
monofiléticas distintas: as licófitas e as monilófitas (PRYER et al., 2004).
Segundo Pryer et al. (2004), diferenciando-se da linhagem licófitas, as monilófitas
possuem megafilos e uma vascularização diferenciada, onde o protoxilema apresenta-se
confinado a lobos do cordão do xilema. A este grupo pertencem as classes Psilotopsida,
Equisetopsida, Marattiopsida e Polypodiopsida (SMITH, 2006).
De acordo com Smith (2006), a classe Polypodiopsida forma o maior grupo entre as
monilófitas atuais e são comumente conhecidas como samambaias ou feto, sendo o grupo das
pteridófitas leptosporangiadas, abrangendo cerca de 11.000 espécies distribuídas em 37
famílias.
3.1.3.1 A Ordem Schizaeales
Pertencendo à ordem Schizaeales, descrevem-se as plantas terrestres, rupículas e
raramente epífitas, com caule reptante ou ereto, que podem apresentar frondes eretas,
prostradas ou escandentes e as lâminas diversificam-se entre inteiras, dicotômicas ou
segmentadas. As nervuras observadas podem ser livres ou anastomosadas. Os espongióforos
são dispostos em pinas basais modificadas na margem da lâmina ou do segmento (SMITH et
al., 2008).
A esta ordem monofilética, com registros fósseis do início do Jurássico, e amplamente
distribuída nas regiões tropicais e sul temperadas (MORAN 1995a; COLLINSON, 1996),
classicamente pertencia apenas uma família, Schizaeaceae, caracterizada como uma família
de samambais leptosporangiadas basais, facilmente conhecida pelos esporângios sésseis e
com ânulo apical e constituída por cinco gêneros, Anemia, Lygodium, Actinostachys, Mohria
e Schizaea, apresentando cerca de 170 espécies (MICKEL, 1962; MORAN, 1995; SKOG et
al., 2002; ARANTES et al., 2008).
A partir de observação de caráter morfológico tais como hábito de crescimento e
aspecto geral (MORAN, 1995) que culminara em segregações e uniões entre seus
representantes, a ordem foi novamente redirecionada e dividida em três famílias distintas,
Lygodiaceae (Lygodium), Anemiaceae (Anemia e Mohria) e Schizaeaceae (Actinostachys e
Schizaea), que apresentam em comum as lâminas estéreis e férteis diferenciadas, a ausência
26
de soros bem definidos e o esporângio com ânulos transversais subapicais contínuos (SMITH
et al., 2006). Entretanto, o tratamento taxonômico ainda difere entre os autores e há ainda os
que consideram que os cinco gêneros pertencem a uma única família, Schizaeaceae, pelo fato
de compartilharem relevantes características como ânulo apical do esporângio.
3.1.3.2 A família Lygodiaceae M. Roe
Lygodiaceae M. Roe é tipicamente representada por plantas terrestres de hábito
lianescente, com distribuição pantropical, formada por apenas um gênero Lygodium e cerca de
25 espécies (SKOG et al., 2002).
As plantas possuem caule reptante delgado com tricomas e frondes escandentes com
crescimento contínuo, volúvel. A lâmina apresenta-se alternadamente pinada, com pinas
pseudodicotomicamente bifurcadas e uma gema dormente na axila. As nervuras podem ser
livres ou anastomosadas. Os soros estão dispostos no ápice dos segmentos, com esporângios
abaxiais, solitáriso, sendo 1 por soro, coberto por um falso-indúsio. Os esporos são
tetraédricos-globosos, triletes (SMITH, 2006).
3.1.3.3 O gênero Lygodium Sw.
Inclui as plantas lianescentes, com rizoma terrestre contendo tricomas aciculares,
pluricelulares, alaranjados e caule curto-reptante com tricomas. Possui características
incomuns como frondes volúveis e crescimento indeterminado, enrolando-se a partir da gema
apical da raque, monomorfas. A lâmina pode ser 1–3-pinado-pinatífida, papirácea, glabra ou
com tricomas pluricelulares alaranjados. Apresenta pinas alternas, pecioluladas; pínulas
divididas, palmado-lobadas a pinadas. As nervuras distribuem-se livremente ou de forma
anastomosadas. No ápice dos segmentos são encontrados os soros e nestes, os esporângios
abaxiais solitários, formados na margem da lâmina foliar (contendo apenas 1 soro) protegidos
pelo tecido laminar marginal, formando um falso-indúzio. Seus esporos são triletes (PRADO,
2005).
Distribui-se pantropicalmente, chegando a atingir até mesmo regiões temperadas ao
leste dos Estados Unidos, África do Sul, Japão e Nova Zelândia (MORAN, 1995).
27
3.1.3.4 A espécie Lygodium venustum SW.
Lygodium venustum (Figura 1) é uma planta terrestre com rizoma subterrâneo a partir
do qual são produzidas suas folhas, que possuem lâmina 2-3 pinado-pinatífida com
crescimento indeterminado e pinas alternas com cerca de 14 cm de comprimento,
pecioluladas. As pínulas, com 3-7,5 x 1,3 cm, podem ser de palmado-lobadas a pinadas,
articuladas, sendo cobertas por tricomas pluricelulares, diminuem de tamanho em direção ao
ápice da pina. A base do pedíolulo não apresenta dilatação e tem entre 1-3 mm de
comprimento. As frondes são subdimorfas, sendo a estéril mais larga que a fértil. Os
segmentos proximais são palmatilobados, com base hastada e margens dentadas. O ápice é
obtuso, a venação é aberta e as nervuras são livres, podendo ser simples ou furcadas
(PRADO, 2005).
Possui terminal de gemas dormentes, que podem se desenvolver em resposta à lesão
ou destruição da ponta da folha principal por herbívoros ou fungos em uma ramificação do
limbo foliar (MUELLER, 1983).
Figura 1. Samambaia Lygodium venustum Sw.
Fonte: autora
28
Apresenta-se amplamente distribuído na América Latina, do México ao Paraguai e
ilhas do Caribe, onde se desenvolve em até 1.100 m de altitude em relação ao nível do mar.
No Brasil, distribui-se em diversas zonas fitogeográficas, tendo sido registrada a sua
ocorrência em estados de regiões distintas (PRADO, 2005; ARANTES, 2008; COSTA, 2007;
SANTIAGO, 2003).
É normalmente observada crescendo em clareiras no interior da mata ou às margens de
caminhos, em áreas perturbadas. Em algumas localidades apresentou comportamento ruderal,
sendo observada em terrenos baldios da zona urbana. Por possuir raque volúvel, com forma
adaptativa de cipó, especializa-se no hábito lianescente, sendo, após atingir 50 cm de altura,
considerada uma exímia alpinista, apoiando-se geralmente em cipós, madeiras mortas ou
arbustos, chegando a atingir mais de 5 metros de altura (COSTA, 2007; MEHLTRETER,
2006; PRADO, 2005; TRYON STOLZE, 1989).
De acordo com Mehltreter (2006), esta espécie é capaz de manter uma reserva de vida
quando a iluminação não lhe é favorável, podendo revigorar em condições propícias.
Buscando condições de iluminação adequada e uma planta que lhe possibilite um suporte
perfeito. L. venustum muitas vezes pode se tornar invasora, tida como uma espécie difícil de
erradicar, uma vez que mesmo fragmentado o rizoma é capaz de se regenerar e produzir novas
folhas. Entretanto, não é considerada uma espécie de rápido desenvolvimento, uma vez que
seu ciclo de vida é lento.
Em seus estudos, Mehltreter (2006) ainda observou que a luz do sol é de fundamental
importância para a indução da fertilidade. A planta apresenta padrão de crescimento sazonal,
correlacionado com a precipitação, indicando que a água age como um fator limitante para
seu desenvolvimento.
Das espécies do gênero Lygodium, L. venustum mostra certa semelhança com outras
espécies, destacando-se a L. volubile, registrada também no Brasil (COSTA, 2007;
CASARINO, 2009). A diferença entre as mesmas consiste na caracterização das pínulas, que
na segunda apresenta-se aproximadamente do mesmo tamanho, sendo que as proximais não
são lobadas, enquanto que, na primeira, as pínulas têm tamanhos diferentes, já que as
proximais são lobadas e maiores que as demais (ROLIM, 2007).
3.1.4 Importância etnobotânica e farmacológica de L. venustum
A utilização de L. venustum como planta medicinal tem sido registrada na
Mesoamérica por populações indígenas, entre outras, possuindo atividades antiséptica,
29
fungicida e tricomonicida e sendo indicada para o tratamento de dermatoses, micoses e
infecções (DUKE, 2008). É também usada no tratamento de desordens gastrointestinais e
ginecobstétricas e como antiinflamatório pós-parto (ARGUETA, 1994). Tradicionalmente
tem destaque no preparo da bebida de efeito alucinógeno, ayahuasca, entre os Sharanahua e os
índios do alto do rio Purus na Amazônia Peruana (RIVIER et al., 1972). No Brasil, é utilizada
por afro-brasileiros em cultos místicos para banhos de limpeza (ALBUQUERQUE et
al.,1997) e ainda, segundo Rahman (2008) para nervosismo e instabilidade emocional.
Farmacologicamente, tem sido investigada diante do uso como planta medicinal. O
primeiro relato sobre sua bioatividade foi em 2005, através de uma triagem feita por Alanis et
al., onde investigando 26 plantas medicinais mexicanas sobre o potencial antibacteriano frente
a 8 linhagens, verificou que L. venustum apresentou percentual de inibição abaixo de 50%.
Neste estudo foram testados os extratos metanólico e aquoso (8 mg), usando o método da
difusão em disco e neste estudo a planta foi considerada pouco eficiente como inibidora do
crescimento bacteriano. Como é usada para o tratamento de desordens gastrointestinais, tais
como diarréia, L. venustum teve sua atividade anti-secretora testada em modelo in vivo,
induzido por toxina do cólera (VELÁZQUEZ et al., 2006), tendo sido utilizada a
concentração de 300 mg/kg dos extratos metanólico e aquoso, ficando constatado que apenas
o metanólico apresentou inibição (51,6%), mostrando uma interessante atividade
antidiarreica. Nesta mesma concentração, o extrato metanólico foi investigado quanto à
inibição do peristaltismo do trato intestinal em ratos, apresentando efeito moderado (42%)
superior ao da droga usada como controle positivo, a lorepamida - 34% em 10 mg/Kg
(CALZADA et al., 2010). Em 2007, Calzada et. al., avaliou a atividade tricomonicida de 22
plantas e constatou uma atividade moderada para L. venustum, apresentando uma IC50 de 60,9
µg/mL.
3.2 PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO Lygodium
Pesquisas envolvendo o gênero Lygodium em geral, são bastante diversificadas quanto
à temática. Entretanto, verifica-se que a maioria das pesquisas se reporta a tentativas de
erradicação de algumas espécies que têm se tornado um grande problema como invasoras,
especialmente nos Estados Unidos (Flórida) e China, de onde vem a maioria dos trabalhos
registrados. Uma estratégia interessante vem sendo utilizada pelos chineses, que é a de
conhecer a miúde as espécies (sua fitoquímica) e testar a sua bioatividade, tentando dar a elas
uma importância farmacológica. Ecologia, fenologia, registros de novas espécies e descrição
30
das mesmas e em alguns casos isolamentos de compostos vem sendo realizados com espécies
do gênero Lygodium. Porém, no contexto geral, poucos são os trabalhos relatando a atividade
biológica destas samambaias. Em um levantamento realizado no Annual Review of
Pteridological Research, entre outras fontes, sobre estudos envolvendo pteridófitas foram
encontrados 163 trabalhos, sendo que apenas 18 abordavam bioatividades do gênero
Lygodium. As biotividades testadas foram: antimicrobiana (05), antioxidante (04),
antiangiogênica (03), antiviral (01), antiandrogênica (01), antissecretora (01), tricomonicida
(01), antineoplásica (hepatoma) (01), antiepiléptica (01), antiansiolítica (01) e contra
distúrbios gastrintestinais (01), sendo que dos 18 trabalhos, dois destes abordavam até 02
atividades. As pesquisas realizadas sobre este gênero foram compiladas anualmente (1994 a
novembro de 2011) encontram-se no apêndice A.
3.3 PRODUTOS NATURAIS E USO TERAPÊUTICO
O homem tem utilizado produtos naturais para diversas finalidades desde os primeiros
indícios de sua existência, quando por experimentação e observação, descobria as
propriedades de plantas e animais, e transmitia seus conhecimentos às sucessivas gerações,
tradicionalizando e construindo uma cultura baseada na terapêutica experimental. Este uso
tem se mantido até os dias de hoje, onde diferentes e modernos processos biotecnológicos têm
facilitado a exploração e garantido a bioprospecção de produtos de interesse econômico e
farmacológico que propiciam um maior conforto e melhoria na expectativa da vida da espécie
humana.
A convivência e o aprendizado com os mais diferentes grupos étnicos trouxeram
valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, do
conhecimento da relação íntima entre a estrutura química de um determinado composto e suas
propriedades biológicas e da inter-relação animais/insetos-planta (VIEGAS JR; BOLZANI,
2006).
A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas
conhecidas. Dentre os diversos reinos na natureza, o reino vegetal é o que tem contribuído de
forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos deles de
grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos
e agroquímicos (PINTO et al., 2002).
Neste sentido, diante da esplêndida biodiversidade mundial, e, mais especificamente, a
brasileira, é um fato afirmar que o número de plantas contendo substâncias potencialmente
31
aplicáveis com propriedades biológicas, farmacológicas ou terapêutipas está longe de ser
computado, se justificando o desenvolvimento de constantes pesquisas. Portanto, na prática,
busca-se algumas características desejáveis das plantas medicinais que, de acordo com Toledo
et al. (2003) que sejam eficazes, tenham baixo risco de uso, assim como reprodutibilidade e
constância de sua qualidade.
De uma forma geral, as plantas apresentam diversas vias metabólicas secundárias que
culminam com a formação de compostos, os quais podem apresentar distribuição restrita a
algumas famílias e gêneros ou espécies (LOPES, 2006). De acordo com Matos (1997),
compostos terpênicos, alcalóides, glicosídicos, flavonóides e vários outros, oriundos de
processos vitais de biossíntese, resultantes de um metabolismo secundário, são objeto de
estudo da química de produtos naturais, que visa esclarecer e registrar os constituintes
resultantes deste metabolismo dos seres vivos, isolando e elucidando suas estruturas, por
conta de sua significância utilitária à alimentação e a saúde.
Compostos destas classes são necessários à sobrevivência e preservação das espécies,
garantindo vantagens para sua perpetuação (SIMÕES et al., 2010), mas também podem servir
como princípios ativos de interesse farmacológico, já que diversas classes de produtos
naturais estão sendo empregadas como matéria prima para a síntese de substâncias bioativas.
A busca por fitoconstituintes ativos para formulação de fitoterápicos sugere um
trabalho interdisciplinar. Neste sentido, Maciel et al. (2002) preconiza que as pesquisas com
plantas medicinais envolvem investigações da medicina tradicional e popular (etnobotânica);
isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos (química orgânica: fitoquímica);
investigação farmacológica de extratos e dos constituintes químicos isolados (farmacologia);
transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética); estudo da relação
estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e
farmacológia) e finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos. A
integração destas áreas na pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho promissor e
eficaz para descobertas de novos medicamentos. Um aspecto importante é abordado por
Simões et al. (2010), que chama a atenção para a toxicidade das plantas, pois, tendo seus
metabólitos secundários a função de defender a espécie de predadores, é natural que
acumulem substâncias de elevada toxicidade.
Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontrarão no reino vegetal
soluções, através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade
terapêutica, ou com aplicações na tecnologia farmacêutica ou no desenvolvimento de
fitoterápicos com maior eficiência de ação (SIMÕES et al., 2010).
32
3.4 MICRORGANISMOS EM ESTUDO E IMPLICAÇÕES CLÍNICAS
Os microrganismos são definidos, em princópio, como seres microscópicos,
individualmente invisíveis a olho nu. São seres vivos dotados de maior diversidade biológica
conhecida, tanto morfológica como fisiológica e ecológica. Podem apresentar formas
celulares as mais variadas, são metabolicamente capazes de realizar todos os tipos de reações
químicas conhecidas e podem ser encontrados em praticamente todos os ambientes, dos mais
simples aos mais extremos. De acordo com sua organização celular e estrutural, podem ser
classificados em procariotos e eucariotos. Os principais grupos microbianos conhecidos são
os vírus, as bactérias, as arqueas, as algas, os protozoários e os fungos (VERMELHO et al.,
2006).
Segundo Tortora et al. (2008), a microbiota normal tanto pode nos causar prejuízo,
quanto nos beneficiar. Por exemplo, determinadas microbiotas normais nos protegem contra
doenças impedindo o crescimento de micróbios nocivos, enquanto outras produzem
substâncias úteis como as vitaminas K e B. Infelizmene sob determinadas circunstâncias, a
microbiota normal pode nos fazer adoecer ou infectar pessoas com quem temos contato.
Neste trabalho iremos abordar três grupos microbianos de reconhecida importância
clínica: as bactérias, os fungos e os protozoários.
3.4.1 Bactérias
O domínio Bacteria (organismos com parede celular contendo peptoglicano) apresenta
uma grande variedade fisiológica e morfológica e diferentes tipos nutricionais quanto a fonte
de carbono, energia e fatores ambientais (oxigêncio, pH, temperatura e pressão hosmótica)
são encontrados (VERMELHO et al., 2007).
As bactérias são organismos relativamente simples, de uma única célula (unicelulares),
cujo material genético não está envolto por uma membrana nuclear especial, sendo por esta
razão denominadas procariotos. As milhares de espécies de bactérias são diferenciadas por
muitos fatores, incluindo a morfologia (forma), a composição química (frequentemente
detectada por reações de coloração), as necessidades nutricionais, as atividades bioquímicas e
a fonte de energia (luz solar ou química) (TORTORA et al., 2008).
A organização celular bacteriana é bastante simples, compreendendo uma parede
celular rígida, formada de peptoglicana, e uma membrana citoplasmática, composta
basicamente de fosfolipídeos e proteínas, entretanto gliceroglicolipídeos, hopanóides e outros
33
tipos de lipídios também podem ser encontrados. O DNA se encontra no citoplasma,
formando a região conhecida como nucleóide. Os ribossomos estão dispersos no citoplasma.
Externamente podem apresentar o glicocálice, formado por glicoproteínas e glicolipídeos.
Algumas espécies apresentam flagelos de locomoção, e outras ainda, podem possuir fímbrias
de adesão e pili. Em algumas espécies há presença de endósporos (VERMELHO et al., 2006).
A composição química da parede celular é usada para diferenciar os principais tipos de
bactérias. Na maioria das bactérias Gram-positivas (assim chamadas porque podem ser
coradas com a coloração de Gram), a parede celular consiste de muitas camadas de
peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Além disso, contém ácidos
teicóicos, que consistem principalmente em um álcool (como glicerol ou ribitol) e fosfato. Já
as bactérias Gram-negativas consistem de uma ou de poucas camadas de peptideoglicana e
uma membrana externa que fornece uma barreira para certos antibióticos (por exemplo,
penicilina). Não contém ácidos teicóicos e como contêm somente uma pequena quantidade de
peptideoglicana, são mais suscetíveis ao rompimento mecânico (TORTORA, et al., 2008). As
diferenças estruturais entre as células bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas
encontram-se evidenciadas na figura 2.
Bactérias de interesse clínico, em detrimento das demais, representam um dos focos
deste trabalho, por constituírem sob diversos aspectos sérios problemas de saúde pública.
3.4.1.1 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (Figura 3.a), bactéria Gram-positiva da família Micrococcae, é
um dos mais significantes agentes etiológicos de processos infecciosos adquiridos, sendo a
espécie mais virulenta dos Staphylococcus spp (KRUSZYNSKA et al., 1997). S. aureus são
descritos morfologicamente por Trabulsi et al. (2004), como sendo cocos que quando
observados por microscopia aparecem agrupados em cachos semelhantes a uva. São
geralmente não-encapsulados e apresentam colônias com coloração amarelo-ouro.
Esta espécie é frequentemente encontrada colonizando a microbiota natural,
principalmente da pele, e, com a quebra de barreiras cutâneas ou diminuição de imunidade
pode se tornar patogênica. É causadora de uma grande variedade de infecções, tais como
infecções na pele e no subcutâneo, infecções pós-cirúrgicas, osteomielites, pneumonias,
abscessos, endocardites e bacteremia (BARRAVIERA, 1994; FERREIRA, 1985; LOWY,
1998).
34
Figura 2: Diferenças estruturais entre células bacterianas Gram-negativas e Gram-positivas.
Fonte: http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html. Acesso
em 17 de novembro de 2011.
3.4.1.2 Escherichia coli
Escherichia coli (Figura 3.b) é uma bactéria Gram-negativa pertencente à família
Enterobacteriaceae normalmente encontrada no intestino grosso de seres endotérmicos,
tornando-se reconhecida como um comensal inofensivo e um patógeno versátil (VOGT, et al,
2005).
Espécies causadoras de patogenias são genericamente denominadas Escherichia coli
enterovirulenta, dividindo-se em quatro classes distintas: E. coli patogênica (gastroenterites
com diarréia aquosa e sanguinolenta, predominante em crianças com menos de um ano), E.
coli enterotoxigênica (doença diarréica em indivíduos de todas as idades), E. coli
enterohemorrágica (enterocolite hemorrágica em indivíduos de todas as idades) e E. coli
invasora (diarréia sanguinolenta ou não, com presença de leucócitos e muco) (TRABULSI et
al., 2004).
35
Diferentes cepas de E.coli estão associadas a quadros clínicos de colite hemorrágica,
disenteria, cistite, nefrite, infecção diferida cirúrgicas, septicemia e especialmente da
síndrome uremia–hemolítica (GERMANO P.; GERMANO M., 2011).
3.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa (Figura 3.c), um bacilo Gram-negativo aeróbio, comumente
habita o solo, água, vegetais e ambientes hospitalares (água, equipamentos, utensílios,
desinfetantes), e ainda faz parte da microbiota normal do ser humano, sendo encontrada na
pele, garganta e fezes de indivíduos sadios. Como apresenta poucas exigências para seu
crescimento, possui ampla distribuição ambiental (SILVA, 1999; MURRAY et al., 2000;
SOUZA, et al., 2007).
Pode estar frequentemente envolvida em infecções hospitalares, provocando infecções
localizadas em decorrência de contaminação oportunista, podendo infectar diversos locais do
corpo, com vias urinárias, respiratórias, causar pneumonias, meningites, endocardites além de
outros tipos de infecções e, além disso, tem sido relatada em eventos de resistência a
antibióticos (DELDEN; IGLEWSKI, 1998).
3.4.1.4 Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae (Figura 3.d) é um bacilo Gram-negativo presente no trato
gastrointestinal de indivíduos hígidos, sendo considerado um importante patógeno de
infecções hospitalares, causando surtos em unidades de internação de pacientes críticos, e são
descritas situações em que sua presença se tornou endêmica (DIPERSIO et al., 2005).
É conhecida por muitos médicos como causa de pneumonia comunitária, ocorrendo
principalmente em pacientes imunocomprometidos (PODSCHUN et al., 1998), dessa forma,
apresenta-se como um dos maiores problemas relacionados à contaminação em unidades
pediátricas com crianças imunodeprimidas (MENEZES, et al., 2007).
De acordo com Menezes et al. (2007), esta bactéria produz enzimas betalactamases de
espectro expandido (ESBLs) e estas são a principal causa de aumento da resistência às
cefalosporinas normalmente utilizadas para o tratamento de indivíduos.
36
Figura 3: Microrganismos (bactérias): a. Staphylococcus aureus; b. Escherichia coli;
c. Pseudomonas aeruginosa; d. Klebsiella pneumoniae.
a
b
c
d
.
Fontes:http://www.atlangram.com/resources;http://www.kimicontrol.com/edu-e.html; http://www.bioquell.com
b acesso em 18 de novembro de 2011.
/technology/microbiology/klebsiella-pneumoniae/;
3.4.2 Fungos
Os fungos são organismos eucariontes, ubíquos e heterotróficos. Possuem vários
cromossomos diferentes e uma membrana nuclear bem definida, além de mitocôndrias,
retículo endoplasmático, ribossomos e vacúolos. Suas membranas plasmáticas, formadas por
uma bicamada de fosfolipídeos, contêm esteróides, e, dessa forma eles assemelham-se mais às
células superiores do que às bactérias, sendo na maioria multicelulares, embora alguns
possam ser unicelulares. A membrana ainda possui ergosterol e microtúbulos compostos de
b
tubulina. Todos apresentam parede celular, pelo menos em algum estádio do seu ciclo de vida
(ALMEIDA, 2008). A parede celular é uma estrutura dinâmica, geralmente composta por
elementos microfibrilares insolúveis em água (quitina e glucanos), mergulhados em uma
matriz amorfa, constituída de polissacarídeos solúveis em água. Algumas espécies de fungos
apresentam melanina na parede celular (SIDRIN ROCHA, 2010). Os fungos podem ser
divididos em dois grandes grupos, os fungos filamentosos e as leveduras, unicelulares
(VERMELHO, et al., 2006).
Conforme Sidrin e Rocha (2010) fazem parte das leveduras os fungos cujas estruturas
unicelulares apresentam um único núcleo por célula e forma de divisão celular diferenciada,
por brotamento simples, brotamento por fissão, ou ainda por divisão binária. Muitas espécies
de leveduras constituem uma população residente da microbiota normal da superfície da pele
e de algumas mucosas. De acordo com Almeida (2008), por se tratar de um fungo oportunista,
a levedura aproveita-se quando as defesas do organismo estiverem comprometidas e, através
de mecanismos de partenogênese, rompe o equilíbrio entre parasita e hospedeiro, causando
infecção.
37
O gênero Candida é um dos que mais tem se destacado como causador de infecções
superficiais e invasivas, passando de comensal a importante agente de infecções do
organismo,
sendo
encontrado
geralmente
na
vagina
e
trato
gastrointestinal
(KANTARCIOGLU; YUCEL, 2002). Cerca de 20 espécies são reconhecidamente
patogênicas e entre estas se ressalta Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata
e Candida krusei (ZARDO MEZZARI, 2004; COLOMBO ;GUIMARÃES, 2003; MACEDO
et al., 2008).
A epidemiologia de Candida spp, varia de acordo com a região demográfica, com as
características do grupo de indivíduos estudado e com o sítio e causa da infecção (HAZEN,
1995; NGUYEN, et al., 1996).
3.4.2.1 Candida albicans
Candida albicans (Figura 4.a) vem sendo considerada como sendo o patógeno mais
comum nas candidíases cutâneas e da orofaringe (REX et al., 2000). Oportunista por
excelência pode implantar-se secundariamente no decurso do diabetes, de traumatismos
diversos, gravidez e, principalmente em indivíduos imunocomprometidos pelo HIV (ZHANG
et al., 2002).
Segundo Monge et al. (2006), esta levedura habita o corpo humano de forma comensal
e tem sido a maior causa de infecções fúngicas em humanos, sendo que as infecções tem
ocorrido normalmente como consequência de uma alteração imunológica e virulência da C.
albicans, que apresenta plasticidade morfológica.
Sidrin e Rocha (2010) preconizam que a doença pode se manifestar clinicamente tanto
em mucosas, principalmente a oral, a vaginal e a esofágica, quanto em diversos órgãos,
invadindo-os e produzindo um quadro sistêmico.
3.4.2.2 Candida tropicalis
Candida tropicalis (Figura 4.b) é geralmente encontrada na pele e no trato digestivo de
hospedeiros humanos saudáveis (ODDS, 1998). Foi a causa mais comum de fungemia em
estudo realizado com pacientes hematológicos, resultando em elevada mortalidade (LEUNG
et al. 2002). É um agente oportunista quando o hospedeiro encontra-se neutropênico, tem a
flora bacteriana suprimida pelo uso de antimicrobianos ou possui danos na mucosa
38
gastrointestinal ou ainda quando é um paciente com neoplasias, especialmente em leucemias
(WINGARD, 1995).
Em hospitais brasileiros, é registrada como a segunda espécie mais comumente isolada
e sua infecção acomete qualquer idade, predominantemente adultos e idosos (NUCCI
COLOMBO, 2007).
3.4.2.3 Candida krusei
Candida krusei (Figura 4.c) é uma levedura comensal em animais de sangue quente,
com muito baixa patogenicidade e prevalência. Os locais mais frequentemente colonizados
pela espécie em humanos é o trato gastrointestinal, seguido do trato respiratório superior e do
trato urinário. (HURLEY; WINNER, 1966; ODDS, 1988).
Tem o potencial de causar infecções graves em pacientes com doença
imunossupressora, leucemia, em pacientes neutropênicos expostos prolongadamente ao
fluconazol ou submetidos a transplante de medula óssea (MEUNIER-CARPENTIER et al.,
1981; IWEN et al., 1995; WINGARD, 1995).
Infecções focais por C. krusei incluem endoftalmia, artrite e endocardite, relacionadas
a procedimentos invasivos em sistemas de defesa comprometidos (SAMARANAYAKE Y.;
SAMARANAYAKE L., 1994).
Figura 4. Microrganismos (leveduras): Candida albicans (colônias verdes), b) C. tropicalis
(colônias azuis) e c) C. krusei (colônias rosas) em meio CHROMagar (CMA)
Fontes: Agarwal et al., 2011
.
3.4.3 Protozoários
Os protozoários englobam todos os organismos protistas, eucariotas, constituídos por
uma única célula. Apresentam as mais variadas formas, processos de alimentação, locomoção
39
e reprodução. É uma única célula que, para sobreviver, realiza todas as funções mantenedoras
da vida: alimentação, respiração, reprodução, excreção e locomoção (NEVES et al., 2004 ).
De acordo com Moraes et al. (2008) sua estrutura celular apresenta membrana celular
distensível ou rígida e o citoplasma é constituído pela porção do protoplasma delimitada
internamente pelo núcleo ou núcleos e externamente pela membrana plasmática. Encontramse no citoplasma inclusões alimentares e de reserva, várias organelas, além do núcleo ou
núcleos bem como áreas diferenciadas para determinadas funções.
Dentre mais de 65.000 espécies identificadas, cerca de 10.000 correspondem a
parasitos. Mas poucas interessam à patologia humana. Todas as espécies pertencentes à
família Trypanosomatidae são parasitas. Aí se encontram, nos gêneros Trypanosoma e
Leishmania, espécies extremamente importantes tanto na medicina humana como veterinária.
No homem causam a trypanossomíase americana ou doença de Chagas (Trypanosoma cruzi),
a tripanosomíase africana ou doença do sono (Trypanosoma grussei gambiense e T. b.
rhodiense), as leishmaníases tegumentares (Leishmania brasiliensis, L. mexicana, L.
peruviana, L. tropica) e o calazar (L. donovani e L, infantum) (REY, 2010).
3.4.3.1 Trypanosoma cruzi
Conforme descrito por Jansen et al. (2000), T. cruzi é um protozoário flagelado
pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, considerado um dos parasitas
de maior e mais bem sucedida distribuição na natureza, reconhecido como o agente etiológico
da doença de Chagas ou tripanossomíase americana. Possui um ciclo biológico complexo
(Figura 5), envolvendo três formas evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e
várias espécies de triatomíneos e de mamíferos, silvestres e domésticos, atuando
respectivamente, como vetores e reservatórios do parasito (BRENER, 2000). A transmissão
da Doença de Chagas é vetorial, se dá através das fezes dos vetores triatomíneos e tanto os
machos como as fêmeas são hematófagos. No ato de picar, em geral defecam após o repasto,
eliminando formas infectantes presentes em suas fezes que penetram pelo orifício da picada
(REY, 1991).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (2010), estima-se que mais de 10
milhões de pessoas estejam infectadas com o parasita em todo o mundo e a doença, que antes
encontrava-se confinada nas Américas, em especial na América do Sul, tem se difundido para
outros continentes (Figura 6 ).
A doença apresenta-se em duas fases (WHO, 2002):
40
a) Fase inicial aguda: dura cerca de dois meses após a infecção, quando um elevado
número de parasitas circula no sangue. Os sintomas são ausentes ou leves na mioria
dos casos, entretanto pode-se destacar febre, cefaléia, gânglios linfáticos aumentados,
palidez, dor muscular, dificuldade em respirar, inchaço e dor abdominal ou no peito.
b) Fase crônica: os parasitas encontram-se principalmente nos músculos causando
distúrbios cardíacos (até 30%) e digestivos, como alargamento do esôfago ou do cólon
(10%), além de alterações neurológicas ou mistas. Em anos posteriores, por conta da
destruição progressiva do músculo cardíaco, a infecção poderá levar à morte súbita ou
insuficiência cardíaca.
Figura 5: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi.
Fonte:
Centers
for
Disease
Control
and
Prevention
–
http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html; acesso em 17 de novembro de 2011.
disponível
em
Os dois medicamentos usados para o tratamentos são o benznidazol e o nifurtimox. As
principais contra-indicações para o tratamento são a gravidez e insuficiência renal. Nifurtimox
é contra-indicado para pacientes com antecedentes de distúrbios psiquiátricos e neurológicos
(WHO, 2010).
41
Figura 6: Distribuição de casos de infecção por Trypanosoma cruzi.
Fonte: Primeiro relatório da OMS sobre as doenças tropicais negligenciadas (2010).
3.4.3.2 Leishmania spp.
Protozoários deste gênero são parasitas unicelulares heteroxênicos que apresentam
duas formas morfológicas no seu ciclo de vida (Figura 7): promastigota (quando estão
infectando o inseto vetor) e amastigota (quando estão infectando o homem) (MICHALICK,
2003; MAGILL, 1995). Pertencem à ordem Kinetoplastida, que se caracteriza principalmente
pela presença de uma única mitocôndria diferenciada, rica em DNA, chamada cinetoplasto
(RODGERS et al., 1990). Estes protozoários são causadores de uma doença zoonótica
infecciosa denominada leishmaniose. A Leishmania é transmitida por hospedeiros
invertebrados flebotomíneos hematófagos do gênero Lutzomyia, no Novo Mundo, ou
Phlebotomus, no Velho Mundo (ROBERTS; JANOVY, 2000).
No que diz respeito às manifestações clínicas, as leishmanioses podem ser
classificadas em três manifestações principais (WHO, 2010; SOARES-BEZERRA et al.,
2004):
a) Visceral ou calazar, que se caracteriza por causar febre irregular, perda de peso,
hepatoesplenomegalia e anemia. Ataca os órgãos internos e é a forma mais grave da
42
doença. Geralmente é fatal dentro de dois anos. A mortalidade pode atingir
aproximadamente 100% dos infectados não tratados. Pode ser causada principalmente
por L. donovani, bem como por L. infantum e L. chagasi.
b) Mucocutânea, que se caracteriza por apresentar lesões que destroem parcial ou
totalmente as mucosas nasal e oral, causando grave mutilação, destruindo os tecidos
moles da boca, nariz e garganta. Pacientes sofrem discriminação e preconceito. L.
brasiliensis é a principal causadora deste tipo de manifestação.
c) Cutânea, é a forma mais comum e compreende o aparecimento de lesões ulcerativas
em áreas expostas (braços, pernas, entre outras) chegando a deixar cicatrizes
permanentes. Causa lesões crônicas que não cicatrizam espontaneamente. Geralmente
pode ser causada por L. mexicana, L. tropica e L. major.
Figura 7: Ciclo de vida de Leishmania spp.
Fonte: Centers for Disease Control and Prevention – disponível em www.cdc.gov/parasites/ leishmaniasis/
biology.html. Acesso em 17 de novembro de 2011.
43
Estima-se que a doença cause 1,6 milhões de novos casos, dos quais cerca de 500.000
é visceral e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea. Destes casos estimados apenas 600.000 são
relatados. A distribuição da leishmaniose tem se expandido ao longo dos anos, atingindo
países onde antes sua ocorrência não era registrada. As figuras 8 e 9 mostram a distribuição da
leishmaniose visceral e cutânea em todo o mundo. No Brasil, as crianças são mais
severamente afetadas e desde 1999 tem havido um aumento acentuado no número de casos de
leishmaniose visceral (WHO, 2010).
Figura 8: Distribuição de casos de leishmaniose cutânea.
As drogas utilizadas para o tratamento da leishmaniose visceral são os pentavalentes
antimoniais (estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina), anfotericina B,
paromomicina e miltefosina. Entretanto, como a leishmaniose visceral tem potencial para
desenvolvimento de resistência às drogas, a doença deve ser tratada com uma combinação de
medicamentos ao invés de se fazer monoterapia, dessa forma, ensaios com combinações de
drogas têm sido realizados (WHO, 2010).
44
Figura 9: Distribuição de casos de leishmaniose visceral.
3.5
RESISTÊNCIA DE MICRORGANISMOS
O advento dos quimioterápicos trouxe durante algum tempo conforto às populações
humanas, pois se acreditava que enfermidades existentes seriam curadas e que a qualidade de
vida seria primada e preservada. Desde os anos de 1940, o desenvolvimento de fármacos
efetivos e seguros para lidar com as infecções bacterianas e outras revolucionou o tratamento
médico, e a morbidade e a mortalidade associadas a estas doenças foram drasticamente
diminuídas (RANGE et al., 2007). Entretanto, a história tomou outro curso quando se
observou que as pessoas continuavam suscetíveis aos mais variados tipos de infecções, e que
esta condição vinha sendo alarmantemente ampliada em relação a um grande número de
microrganismos. O que ocorria é que em um curto espaço de tempo surgiam linhagens de
microrganismos resistentes à droga e capazes de sobreviver ao tratamento realizado
(VERMELHO et al., 2007).
A situação atual da resistência às drogas tem sua origem em muitos fatores, incluindo
a seleção de mutantes resistentes por exposição a agentes antimicrobianos, transferência de
45
determinantes genéticos de resistência entre cepas bacterianas e disseminação clonal de cepas
resistentes entre pacientes hospitalizados e entre instituições hospitalares (McGOWAN JR,
2004). De acordo com Vermelho et al. (2007), o aumento do número de viagens nacionais e
internacionais e a relativa facilidade com que bactérias resistentes a drogas cruzam barreiras
geográficas podem ser considerados fatores que contribuem para a disseminação de genes de
resistência. Este contexto tende a repercutir mundialmente trazendo como consequência o
aumento da morbidade e mortalidade entre pacientes, a redução do número de drogas
utilizáveis por futuras gerações de pacientes, além do impacto econômico trazido pelos custos
com infecções (McGOWAN JR, 2004).
Segundo Vermelho et al. (2007), os agentes microbianos são úteis porque geralmente
possuem como alvos de ação estruturas celulares, vias metabólicas ou enzimas que são
específicas para bactérias e não para o hospedeiro. Entretanto, uma variedade de mecanismos
acaba mediando a resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos:
 as alterações no alvo das drogas, de forma que a ligação da droga ou a inibição da
função não ocorrem;
 a redução da permeabilidade da célula bacteriana à droga, o que resulta na
incapacidade do agente alcançar o seu alvo em uma concentração crítica;
 o efluxo da droga da célula e a destruição ou a modificação do quimioterápico,
tornando o seu transporte para o interior da célula ou o reconhecimento do alvo
impossíveis de ocorrerem.
Dentre os diferentes mecanismos de resistência descritos para microrganismos,
aqueles mais importantes em bactérias Gram-positivas podem ser classificados em três grupos
distintos: destruição do antibiótico, efluxo contínuo do antibiótico e reprogramação e
modificação da estrutura-alvo (SILVEIRA et al., 2006).
A resistência aos quimioterápicos também pode se desenvolver em outros
microrganismos além das bactérias, como por exemplo, nos fungos (CASTRO et al., 2006) e
nos protozoários (OUELLETTE et al., 1994).
Um crescente número de cepas fúngicas vem se tornando resistente aos fármacos
antifúngicos atualmente comercializados. Kanafani e Perfect (2008) distinguem dois tipos de
resistência: a primária (ou intrínseca), encontrada naturalmente em certos fungos, sem
exposição prévia a drogas. E a secundária (ou adquirida), que se desenvolve em cepas após
exposição ao agente antifúngico, sendo dependente de expressão do gene alterado.
Nos fungos, dentre os principais mecanismos bioquímicos que contribuem para o
aparecimento do fenótipo de resistência à drogas estão a redução da captação ou o aumento do
46
efluxo celular, modificação ou degradação da droga dentro da célula, mudanças na interação
da droga com o seu sítio alvo ou ainda a interação com outras enzimas (SEGATO, 2008).
A resistência fúngica aos agentes terapeuticamente disponíveis vem aumentando
como conseqüência do crescimento da população imunocomprometida e do uso cada vez mais
frequente de profilaxia e auto-medicação (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).
De acordo com Vigo (2008) em parasitos protozoários, diferentes mecanismos são
responsáveis pelo aparecimento de resistência a quimioterápicos. Entre estes, elenca: a
inativação da droga, a diminuição da sua concentração intracelular e alterações dos alvos
moleculares. O bombeamento por efluxo também pode ser citado, sendo este realizado por
uma superfamília de proteínas transmembrana (ATP-binding cassette ou ABC). Outras
moléculas foram putativamente implicadas no fenótipo de resistência a drogas em T. cruzi
como, por exemplo, a pteridina-redutase 1 (PTR1) que está envolvida em várias reações de
óxido-redução e apresenta alta homologia com genes PTR1 de Leishmania.
O mecanismo de resistência em Leishmania pode estar associado a um decréscimo do
potencial da membrana mitocondrial com redução do acúmulo do fármaco em terapias
prolongadas (MUKHERJEE et al., 2006).
Hoje em dia, a quimioresistência apresentada pelos parasitos está muito presente em
alguns países onde o fármaco não é mais utilizado com eficiência. Mesmo com as
dificuldades, a falta de novos tripanocidas e o aumento da resistência conduziram os estudos
para melhor entendimento dos mecanismos de ação e compreensão da quimioresistência
frente aos tripanocidas (BOIBESSOT et al., 2002).
Uma estratégia racional para busca de novas moléculas antiparasitárias é a exploração
das diferenças bioquímicas entre parasito e a célula do mamífero hospedeiro. Outrossim, a
filogenética indica que os tripanossomatídeos apesar de eucariotos apresentam diferenças
consideráveis no que diz respeito à organização celular comparados a células de mamíferos.
Neste sentido e em observância à capacidade mutante destes parasitos, a idealização de
inibidores menos específicos pode ser mais vantajosa (GIL et al., 2007; DOERIG et al., 2002;
BARRET et al., 1999).
3.6 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO, RADICAIS LIVRES E SUBSTÂNCIAS
ANTIOXIDANTES
Espécies reativas de oxigênio (EROs) é o termo utilizado para a inclusão, não apenas
de radicais livres contendo oxigênio (O2.-), mas também para derivados de oxigênio não
47
radicais (HALLIWELL, 1994), tais como peróxido de hidrogênio (H2O2) e ozônio (O3). EROs
são naturalmente encontradas em todos os sistemas biológicos por força do metabolismo
normal, uma vez que, em condições fisiológicas aeróbicas, o O2 pode sofrer redução
tetravalente em sua estrutura, com aceitação de quatro elétrons, o que resulta na formação de
H2O. No decorrer do processo, são formados intermediários reativos, na forma de radical
superóxido (O2-.), radical hidroperoxila (HO2.), radical hidroxila (OH) e peróxido de
hidrogênio (H2O2), que é um agente oxidante (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Espécies reativas de oxigênio (ERO) e radicais livres podem provocar lesões celulares,
muitas vezes irreparáveis (GOUVÊA, 2004). O termo radical livre diz respeito a qualquer
espécie química capaz de existir independentemente de outras espécies, possuindo um ou
mais elétrons pareados (HALLIWELL, 1994).
Segundo Halliwell (1994), antioxidante é qualquer substância que, quando presente
em baixa concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne
significativamente a oxidação do mesmo.
A utilização de substâncias com capacidade antioxidante pode ser de grande relevância
na prevenção e terapêutica de doenças relacionadas com o aumento do estresse oxidativo, tais
como arteriosclerose, câncer, e doenças degenerativas (ZHOU, et al., 2007).
A atividade antioxidante de extratos de plantas vem sendo investigada ao longo dos
anos, uma vez que a toxicidade do oxigênio atmosférico tem se mostrado com o principal
desafio à sobrevivência de organismos vivos (GOUVÊA, 2004). Tem sido dado ênfase à
identificação e purificação de novos compostos com atividade antioxidante, oriundos de
fontes naturais, que possam agir sozinhos ou sinergicamente com outros aditivos, como uma
forma de prevenir a deterioração oxidativa de alimentos e restringir a utilização dos
antioxidantes sintéticos (SHAHIDI et al., 2007).
48
MATERIAL E MÉTODOS
49
4 MATERIAL E MÉTODOS
Na figura abaixo (10) é possível observar a sequência de operações para a execução do
trabalho.
Figura 10: Passos seguidos e todas as biatividades avaliadas durante o desenvolvimento da
pesquisa.
METODOLOGIA GERAL
FHLV: fração hexânica de Lygodium venustum; FDLV: fração diclorometano de L. venustum; FAELV: fração
acetato de etila de L. venustum; FMLV: fração metanólica de L. venustum; CIM: concentração inibitória mínima.
4.1 SELEÇÃO E COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO
Folhas de L. venustum foram colhidas em maio de 2010 entre 9:30 e 10:30 horas da
manhã na encosta da Chapada do Araripe em uma localidade chamada Grangeiro, no
município do Crato, sul do Ceará, Brasil (Figura 11). Do material coletado foi produzida uma
exsicata que foi depositada no Herbário Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) da
Universidade Regional do Cariri – URCA, sob o número 5569 (Figura 12), tendo sido
identificada pelo Professor Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva. A planta foi escolhida por se
50
tratar de uma pteridófita muito encontrada na localidade, com uso medicinal registrado por
algumas populações mundiais.
Figura 11: Localização da área de coleta de Lygodium venustum.
Fontes: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceara_Municip_Crato.svg; Centro de Processamento
Remoto – Brasília – DF;
4.2 OBTENÇÕES DE EXTRATO ALCOÓLICO E FRAÇÕES
Para obtenção das frações, 6 g do extrato foi misturado à sílicagel 60 (VETEC), sendo
depois colocados em um funil de Busting com papel de filtro acoplado a um kitassato e
bomba à vácuo para filtração. Solventes em escala crescente de polaridade foram vertidos
sobre a mistura um a um nesta ordem: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol para
enfim se obter as frações desejadas. Cada fração foi concentrada em evaporador rotativo e
levadas a banho-maria para retirada de todo o solvente. Foram obtidos os seguintes
rendimentos: fração hexânica de L.venustum (FHLV): 0,22 g; fração diclorometano de L.
venustum (FDLV): 0,39 g; fração ecetato de etila de L. venustum (FAELV): 0,52 g e fração
metanólica de L. venustum (FMLV): 3,01 g.
51
Figura 12: Exsicata de Lygodium venustum depositada no
Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL)
Fonte: Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL)
4.3. PROSPECÇÃO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO ETANÓLICO
(EELV): ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA
Os testes de identificação fitoquímica qualitativa foram realizados seguindo o método
desenvolvido por Matos (1997) que detecta a presença de fenóis, taninos pirogálicos e
flobabênicos, antocianinas, antocianidinas, flavonóides, leucoantocianidinas, catequinas,
flavononas, a partir da mudança de coloração nas reações, e de alcalóides, verificando-se a
formação de precipitado.
52
O resumo do procedimento para realização do teste encontra-se descrito a seguir.
4.3.1 Preparação do extrato e operações preliminares
Para o preparo das soluções foram utilizadas 300 mg de extrato bruto, solvente
hidrofílico etanol com 30% de água, sendo em seguida separadas seis porções de 3 mL em
frascos de número identificados numericamente (1,2,3,4,5 e 6).
4.3.2 Teste para identificação de fenóis e taninos
Ao frasco nº 1, adicionou-se três gostas de solução alcoólica de FeCl3. O conteúdo foi
agitado e foram observadas variações quanto a cor ou formação de precipitado abundante,
escuro. A solução foi comparada com um teste em branco, contendo apenas água e cloreto
férrico. Na análise dos resultados, a coloração variável entre azul e vermelho é indicativo da
presença de Fenóis; quando o teste for “branco” o resultado é negativo. O precipitado escuro
de tonalidade azul indica a presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolizáveis) e o verde, a
presença de taninos flobabênicos (taninos condensados ou catéquicos).
4.3.3 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides
Foram utilizados os frascos de nº 2, 3 e 4, sendo um deles foi acidulado a pH 3,
alcalinize, outro a pH 8,5 e o terceiro a pH 11. Serão observadas mudanças de coloração do
material. Para análise dos resultados será verificado o aparecimento de cores diversas
indicando a presença de vários constituintes, de acordo com a figura 13. A presença de um
constituinte pode mascarar a cor indicativa da presença de outro.
4.3.4 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas
Pra este teste foram utilizados os frascos nº 5 e 6, sendo o primeiro acidulado por
adição de HCl até pH 1-3 e o segundo alcalinizado com NaOH até pH 11. Os frascos foram
aquecidos com auxílio de uma lâmpada de álcool durante 2-3 min, cuidadosamente, devendo
ser observada qualquer modificação na cor, por comparação com os tubos correspondentes
usados no teste anterior. Análisando os resultados, o aparecimento ou intensificação de cor
53
indica a presença de constituintes especificados na figura 14. No caso da presença de ambos,
um constituinte pode mascarar a cor indicativa de outro.
4.3.5 Teste para alcalóides
Para identificação de alcalóides, inicialmente preparou-se uma solução diluiu-se 300
mg de extrato bruto em 30 mL de Ácido Acético a 5%. A solução foi então aquecida até a
fervura por alguns minutos, sendo em seguida transferida para um funil de separação. Logo
após, foi alcalinizada com Hidróxido de Amônia NH4OH 10% (aproximadamente 10 mL). A
variação do pH foi acompanhada com auxílio de papel indicador. Foi adicionado clorofórmio
(aproximadamente 15 mL), agitando-a e depois deixando-a em repouso. Caso haja a presença
de alcalóides, estes irão passar para a fase clorofórmica denominada Fração Alcaloídica‖. A
fase clorofórmica de verá então se coletada com auxílio de um béquer e o solventre deverá
evaporar, restando apenas um resíduo que deve conter alcalóide. Gotas de HCl 1% serão
adicionadas e a solução será homogeneizada. Deverá ser aplicada sobre uma lâmina de vidro
uma gota da solução clorídrica obtida ao lado de 1 gota de reagente Draggendorff e estas
deverão ser misturadas.
Durante a análise dos Resultados deverá ser observado o aparecimento de precipitado
e caso ocorra, será um indicativo da presença de alcalóides na planta.
Figura 13: Identificação de compostos químicos (antocianinas, antocianidinas, flavonas,
flavonois, xantonas, chalconas, auronas e flavonóis através de método colorimétrico.
Constituintes
Cor em meio
Ácido pH 3
Alcalino pH 8,5
Alcalino pH 11
Antocianinas e Antocianidinas
Vermelha
Lilás
Azul/púrpura
Chalconas e Auronas
Vermelha
-
Vermelho/Púrpura
-
Amarela
-
Vermelho/Laranja
Flavonas, Flavonóis e Xantonas
Flavononóis
-
54
Figura 14: Identificação de leucoantocianidinas, catequinas e lavononas por método
colorimétrico.
Cor em meio
Constituintes
Leucoantocianidinas
Ácido
Alcalino
Vermelho
-
Catequinas
Pardo/amarelada
-
Flavononas
-
Vermelho/Laranja
4.4 TESTES DE SUSCETIBILIDADE DE MICRORGANISMOS PELO MÉTODO DA
MICRODILUIÇÃO EM CALDO
4.4.1 Preparo da solução inicial e das soluções de teste.
O preparo da solução inicial das amostras foi efetuado em observância aos
rendimentos obtidos. As quantidades de 200 mg (EELV), 10 mg (FHLV), 19 mg (FDLV),
100 mg (FAELV) e 205 mg (FMLV) foram pesadas e solubizadas em 1 mL de
Dimetilsulfóxido (DMSO – Merck, Darmstadt, Alemanha), para obter uma concentração
inicial. A partir desta concentração, foi feito uma diluição em água destilada estéril para
atingir a concentração de 1024 µg/mL (solução teste). Para os cálculos foi utilizada a fórmula:
C1 x V1 = C2 x V2, onde C é a concentração e V é o volume.
4.4.2 Linhagens utilizadas
A escolha dos microrganismos para a avaliação da atividade antimicrobiana foi
efetuada levando em consideração a presença de pelo menos um representante dos seguintes
grupos de importância clínica: bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras de
Candida, devidamente mensionadas a seguir, de acordo com os testes realizados.
Teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM): linhagens bacterianas (padrão): E.
coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 15442 e K. pneumoniae
ATCC 4362. Linhagens fúngicas (padrão): Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC
2538 e C. tropicalis ATCC 40042.
Teste de modulação da ação de antibióticos: linhagens bacterianas (multirresistentes
55
de isolados clínicos) P. aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358, cujo perfil de resistência se
encontra descrito na figura 15. Linhagens fúngicas (padrão): Candida albicans ATCC 40006,
C. krusei ATCC 2538 e C. tropicalis ATCC 40042.
Avaliação pelo método checkerboard: linhagens bacterianas (multirresistentes de
isolados clínicos) E. coli 27 e S. aureus 358.
Todas as linhagens foram obtidas do Laboratório de Micologia Clínica da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
4.4.3 Drogas e reagentes
Para os testes de suscetibilidade bacteriana pelos produtos naturais em associação com
antibióticos, as drogas utilizadas foram os aminoglicosídeos canamicina, amicacina,
neomicina e gentamicina. No método checkerboard foram utilizados os aminoglicosídeos
disponíveis no laboratório amicacina, neomicina e gentamicina. As drogas utilizadas como
antifúngicos no teste de modulação foram o mebendazol, a anfotericina B, a neomicina e o
benzoilmetronidazol (Sigma Co., St. Louis, USA). Para testes antibacterianos e antifúngicos
as drogas foram preparadas em uma concentração inicial de 5.000 µg/mL e 1024 µg/mL,
respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água destilada e estéril.
O reagente resazurina sódica (Sigma) foi utilizado como indicador de crescimento
bacteriano. Resazurina sódica foi obtida a Sigma–Aldrich (St Louis, MO) e armazenada a 4°C
protegida da luz. Na leitura dos testes a mudança de coloração azul para rosa devido à redução
da resazurina indica o crescimento bacteriano (PALOMINO et al., 2002).
Figura 15: Origem das linhagens e perfil de resistência das bactérias a antibióticos
Bactéria
Escherichia coli 27
Origem
Ferida cirúrgica
Perfil de resistência
Ast,Ax,Ami,Amox,Ca,Cfc,Cf,
Caz,Cip,Clo,Im,Can,Szt,Tet,Tob
Staphhylococcus aureus 358
Ferida cirúrgica
Oxa,Gen,Tob,Ami,Can,Neo,Para,
But,Sis,Net
Pseudomonas Aeruginosa 03
Urocultura
Cpm,Ctz,Imi,Cip,Ptz,Lev,Mer,Ami
Ast-Aztreonan; Amx- Amoxacilina; Amp-Ampicilina; Ami-Amicilina; Amox-Amoxilina, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cefalotina; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-Clorafenicol; Imi-Imipenem; CanCanamicina; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetraciclina; Tob-Tobramicina; Oxa-Oxacilina; Gen-Gentamicina; NeoNeomicina; Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicina; Net-Netilmicina; Com-Cfepime; CtzCeftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem.
56
4.4.4 Meios de cultura
Foram utilizados nos ensaios biológicos os seguintes meios de cultura: Agar Heart
Infusion - HIA (Difco Laboratories ltda.), Caldo Brain Heart Infusion – BHI (concentração
indicada pelo fabricante e 10%) (Acumedia Manufacturers Inc.). Todos os meios de cultura
foram preparados segundo as especificações do fabricante. Culturas de fungos e bactérias
foram mantidas a 4ºC em Heart Infusion Agar (HIA). Antes dos testes, as linhagens foram
repassadas para o meio citado e incubadas a 35ºC por 24 horas. As linhagens repicadas a
serem testadas foram inoculadas em Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e incubadas na mesma
situação antes do teste. Suspensões com crescimento bacteriano foram diluídas até a obtenção
de 105 céls/ml (NCCLS, 2000).
4.4.5 Teste Concentração Inibitória Mínima: execução e leitura
Para distribuição na placa de microdiluição foram preparados tubos eppendorf
®
contendo cada um deles com 1 mL de solução contendo 900 µL de BHI 10% e 100 µL da
suspensão bacteriana ou fúngica. A placa foi preenchida no sentido numérico (Figura 16 a)
adicionando-se 100 µL desta solução em cada poço (placa de 96 poços) e em seguida
procededendo-se a microdiluição seriada com a solução de 100 µL do produto natural (extrato
ou frações), variando nas concentrações de 512 a 8 µg/mL. As placas foram levadas à
incubadora por 24 horas a 35º C (JAVADPOUR et al., 1996). A revelação da CIM bacteriana
foi feita utilizando-se a resazurina (Figura 16 b), enquanto para os fungos foi observada a
turbidez provocada pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual
nenhum crescimento foi observado.
Figura 16: Placa de microdiluição (a) e revelação das placas com resazurina (b)
a
b
Fonte: autora
57
4.4.6 Teste de modulação da ação de antibióticos e antifúngicos
Para verificar se o extrato modificaria a ação dos antibióticos frente às cepas testadas,
utilizou-se o método proposto por Coutinho, et al. (2008), onde a solução do extrato foi
testada em concentração sub-inibitória (CIM/8) de 128 µg/mL. Foram preparados tubos
eppendorf® contendo cada um deles 1,5 mL de solução com 1.162 µL de BHI 10%, 150 µL
da suspensão bacteriana ou fúngica e 188 µL do produto natural (extrato ou frações). Para o
controle foram preparados tubos eppendorf® com 1,5 mL de solução contendo 1.350 µL era
BHI (10%) e 150 µL de suspensão de microrganismos. A placa foi preenchida no sentido
alfabético adicionando-se 100 µL desta solução em cada poço. Em seguida, 100 µL de droga
(antibiótico ou antifúngico) foi misturada ao primeiro poço, procedendo a microdiluição em
série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de aminoglicosídeos
e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44 µg/mL e 1024 a 8 µg/mL,
respectivamente
4.4.7 Teste para avaliação do tipo de interação droga/produto natural: método
checkerboard
O método de titulação checkerboard foi usado para estudar os efeitos da combinação
entre o produto natural e os antibióticos. As suspensões bacterianas foram padronizadas como
citado anteriormente. As soluções dos produtos naturais (extrato, frações) e dos antibióticos
foram utilizadas em uma concentração inicial de 1024 µg/mL e 5000 µg/mL. Em cada
cavidade foi adicionado 100 µL do meio de cultura contendo 10% da suspensão bacteriana.
Volumes de 100 µL dos produtos naturais e dos antibióticos foram diluídos seriadamente 1:2
em caldo BHI 10%. A concentração dos produtos naturais variaram de 512 µg/mL a 4 µg/mL
e a dos antibióticos variaram de 2.500 µg/mL a 19,53 µg/mL. Cada microplaca estéril foi
preenchida no sentido vertical e horizontal com um extrato ou fração e um antibiótico por vez
para obtenção do índice de Concentração Inibitória Fracionada (Índice CIF) e o crescimento
bacteriano foi evidenciado pelo uso da resazurina. As placas preenchidas foram incubadas a
35ºC por 24 horas.
O Índice CIF foi calculado através da soma do CIFA + CIFB, onde A representa o
antibiótico e B o extrato em teste. O CIFA, por sua vez, é calculado através da relação CIMA
combinado/ CIMA sozinho, enquanto que o CIFB = CIMB combinado/ CIMB sozinho. Este
58
índice foi interpretado da seguinte forma: sinergismo (<0.5), aditividade (0.5–1.0),
indiferença (>1) ou antagonismo (>4.0) (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991).
4.5 TESTE DE CITOTOXICIDADE E ANTIPARASITÁRIOS
4.5.1 Reagentes e drogas
Resazurina sódica foi obtida a Sigma–Aldrich (St Louis, MO) e armazenada a 4°C
protegida da luz. A solução de resazurina foi preparada em solução de fosfato 1% (PBS), pH
7, filtrada e esterilizada antes do uso. Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosídeo (CPRG;
Roche, Indianápolis, IN) foi dissolvido em 0.9% Triton X- 100 (pH 7.4). Foram utilizados os
antibióticos penicilina G (Ern, S.A., Barcelona, Espanha) e estreptomicina (Reig Jofré S.A.,
Barcelona, Espanha).
4.5.2 Cultura de células
A linhagem de celulas utilizada no teste de citotoxicidade foi a de fibroblastos de
mamífero NCTC clone 929 (Figura 17). As células foram cultivadas em meio Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma) suplementado a 10% de soro fetal bovino (FBS)
inativado pelo calor (30 minutos a 56 º C), penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100
mg/mL). Para os experimentos, as células na fase pré-confluência foram colhidas com
tripsina. Culturas de células foram mantidas a 37 º C em uma atmosfera umidificada de 5% de
CO2.
Para estudos in vitro de T. cruzi, cepas de parasito CL-B5 (clone CL-B5) foram usados
(BUCKNER et al., 1996). Os parasitos estavelmente transfectados com o gene βgalactosidase de Escherichia coli (LacZ ) foram gentilmente cedidos pelo Dr. F. Buckner
através da Universidad Complutense de Madrid (España). Formas epimastigotas (Figura 18)
foram cultivadas a 28°C em infusão de fígado triptose (LIT) com 10% de soro fetal bovino
(FBS), penicilina e estreptomicina como descrito anteriormente (LE SENNE et al., 2002), e
colhidos durante a fase de crescimento exponencial.
Para o estudo da atividade leishmanicida in vitro, foi utilizado formas promastigotas
(Figura 19) de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) a 26°C em Schneider’s (meio para
inseto) suplementado a10% (v/v) de SBF inativado pelo calor, 2% de urina humana normal
(v/v) mais penicilina e estreptomicina.
59
Figura 17: Fibroblastos de mamíferos NCTC-929 utilizados
no teste de citotoxicidade
Fonte: Centro para el Desarrollo de la Investigación Científica
(Asunción, Paraguay).
Figura 18: Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi.
Fonte: Centro para el Desarrollo de la Investigacion Científica, Assuncion –
Paraguai
60
Figura 19: Forma promastigota de Leishmania spp.
Fonte: www.ufrgs.br/para-site/siteantigo/imagensatlas/protozoa/leishmania.htm;
acesso em 15 de novembro de 2011.
4.5.3 Execução e leitura do ensaio de citotoxicidade
O procedimento para a medição de viabilidade celular foi avaliada com resazurina por
um método colorimétrico descrito anteriormente (RÓLON et al., 2006). Células clones NCTC
929 foram semeadas (3 x 104 ) em placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços, com
100 µL de meio cultura RPMI 1640 por poço. As células foram cultivadas durante a noite a
37 º C e atmosfera de 5% de CO2. Posteriormente o meio foi substituído e o produto natural
(extrato ou frações) foi adicionado em diferentes concentrações em 200 µL do meio por 24
h. Controles de crescimento também foram incluídos. Após a incubação, 20µL de solução
resazurina a 2 mM foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 3 h para
permitir condições ótimas de oxidação-redução e a redução da resazurina foi determinada por
medida de absorbância do comprimento de onda a 490 e 595 nm em um leitor de microplacas.
Cada concentração foi testada três vezes. Percentagens de citotoxicidade (% C) dos produtos
naturais foram determinadas da maneira como segue:
% C = [(A570 x 117,216 - A595 x 80,586) de amostras de teste / (A570 x 117,216 - A595 x
80,586) de controle)] x 100, onde, A570 e A595 representam os valores de meios de densidade
61
óptica a 570 e 595 nm, respectivamente, registrados para poços com células contendo
diferentes doses do produto natural ou valor registrado para poços com células e sem produto
natural (controla o crescimento positivo). Os valores 80,586 e 11,216 representam
coeficientes de extinção molar para resazurina oxidada a 570 nm e 595 nm, respectivamente.
4.5.4 Ensaio de suscetibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi
O ensaio de rastreamento foi realizado em placas de microdiluição de 96 poços
(Sarstedt, Sarstedt, Inc.) com culturas que não atingiram a fase estacionária, como descrito por
Vega et al. (2005). Epimastigotas foram semeadas a 1 x 105 por mililitro em 200 µL e as
placas foram então incubadas com os produtos a 28°C por 72 horas, momento em que 50 µL
de solução de CPRG foram adicionados para dar a concentração final de 200 µM. As placas
foram incubadas a 37°C por mais 6h adicionais e então lidas a 595 nm em espectrofotômetro.
O nifurtimox foi utilizado como droga de referência. Cada concentração foi testada em
triplicata. Cada experimento foi realizado duas vezes separadamente. O percentual de inibição
(%AE) foi calculado como segue: %AE = [(AE _ AEB)/(AC _ ACB)] x 100, onde AE =
absorvância do grupo experimental; AEB = branco de compostos; AC = grupo controle de
absorvância; ACB = branco de meio de cultura. As soluções dos produtos naturais a serem
analisadas foram preparadas em dimetilsufóxido, com a concentração final uma mistura
água/DMSO jamais excedendo 0.2% do solvente final.
4.5.5 Ensaio de suscetibilidade para as formas promastigotas de Leishmania brasiliensis
O ensaio foi realizado usando o método desenvolvido por Mikus e Steverding (2000)
com modificações. Formas promastigotas (2.5 x 105 parasitas/poço) foram cultivadas em
placas de 96 poços de plástico. As amostras foram dissolvidas em dimetilsufóxido (DMSO).
Diferentes diluições dos compostos de até 200 mL de volume final são adicionados. Após 48
h a 26 °C, 20 µL de solução de resazurina foi adicionado e a oxidação-redução foi
quantificada a 570 a 595 nm Cada concentração foi testada em triplicata. Em cada ensaio foi
utilizado como controle drogas de referência. As porcentagens antipromastigotas (%AP)
formam calculadas. A eficácia de cada composto foi determinada.
62
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Para a avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o método fotocolorimétrico do
2,2-difenil,1- picrihidrazila (DPPH), segundo Choi et al.(2002). Foi utilizado o extrato bruto e
as frações nas concentrações de: 1 a 500 µg/mL em etanol (2,5 mL). A 2,5 mL de cada
amostra, foi adicionado 1 mL da solução de DPPH 0,3 Mm. As soluções permaneceram no
escuro em temperatura ambiente e após 30 minutos, foram feitas as leituras das absorbâncias
em espectrofotômetro (Shimadzu- UV-1201) a 518 nm, onde o radical DPPH apresenta o
máximo de absorção. Uma solução de DPPH (1 mL; 0,3 nM) em etanol (2,5 mL) foi usada
como controle negativo e uma preparação de ácido ascórbico como padrão (controle positivo),
em concentrações que variavam de 1 a 100 µg/mL. O etanol foi usado para zerar o
espectrofotômetro, tendo como brancos as soluções testes de cada amostra (sem adição do
DPPH), visando minimizar a interferência de componentes das amostras na leitura. O ensaio
foi realizado em triplicata e o cálculo da atividade antioxidante seguiu a equação:
%inibição = 100 – Abs amostra – Abs branco x 100
_____________________________
Abs controle
Onde: Abs amostra é a absorbância das frações e do extrato bruto; Abs branco é a absorbância das
frações e do extrato bruto sem adição do DPPH e Abs
controle
é a absorbância da solução de
DPPH em etanol. Os testes foram realizados em duplicata com três repetições. Foi calculada a
percentagem de inibição do radical DPPH e construído um gráfico de porcentagem de
inibição versus a concentração do extrato e das frações.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como média
± desvio padrão (DP). Diferenças foram estimadas por meio da análise de variância
(ANOVA) seguida por teste de diferença significativa mínima (DSM). Valores de
probabilidade inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
63
RESULTADOS E DISCUSSÕES
64
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
O estudo realizado sobre as atividades biológicas de L. venustum originou oito
trabalhos, entre estes, sete artigos e um capítulo de livro. Até o presente momento, dos sete
artigos produzidos, um foi aceito e cinco já foram submetidos em revistas indexadas. Um dos
sete artigos está em processo de tradução e logo será submetido. O capítulo do livro também
já foi aceito. Estas produções estão apresentadas nos itens 5.1 a 5.8, bem como os
comprovantes de aceite e submissão às referidas revistas e editora, aos quais foram
encaminhadas.
LISTA DE PRODUÇÕES
5.1 – Antimicrobial and Modulatory Activity of Ethanol Extract of the Leaves from
Lygodium venustum SW. – Artigo submetido e aceito: American Fern Journal.
5.2 – Combating the multiresistance to antibiotics with natural products: additive effect
of Lygodium venustum SW. with gentamicin – Artigo submetido: Clinical and Experimental
Medicine.
5.3 – Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of
Lygodium venustum SW. against Escherichia coli and Staphylococcus aureus clinically
isolated – Artigo submetido: Chemoterapy.
5.4 – Atividade Modificadora da Ação de Aminoglicosídeos pela Fração Acetato de Etila
de Lygodium venustum SW. – Artigo a ser submetido (em processo de tradução).
5.5 – Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de frações obtidas de
Lygodium venustum SW.– Artigo submetido: Revista Brasleira de Biociências.
5.6 – Avaliação da citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW
contra Trypanosoma cruzi e Leishmania brasiliensis.– Artigo submetido: Boletim
Latinoamericano Y Del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas.
5.7 – Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of natural products
from Lygodium venustum SW. (Lygodiaceae) – Artigo submetido: Journal of Biologically
Active Products From Nature.
5.8 – Pteridófitas em evidência: etnobotânica e bioatividades farmacológicas – Capítulo
de livro aceito e em processo de tradução. Será um dos capítulos da obra intitulada "Natural
Products: Structure, Bioactivity and Applications", a ser editado pela Nova Science
Publishers, Inc.
65
5.1 ANTIMICROBIAL AND MODULATORY ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF
THE LEAVES FROM Lygodium venustum Sw.
RESUMO
A evolução dos sistemas de defesa de microorganismos tem levado a uma busca intensa por
novos fármacos, sendo para isso testados vários produtos naturais. Lygodium venustum, uma
samambaia trepadeira, teve sua atividade contra bactérias e fungos avaliada neste estudo. Foi
realizada a prospecção química do extrato etanólico das folhas de L. venustum, detectando-se
a presença de taninos, flavonóides e alcalóides. Utilizando o método da microdiluição em
caldo, cepas bacterianas de Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Pseudomonas
aeruginosa e cepas fúngicas de Candida albicans, C. krusei e C. tropicalis tiveram sua
concentração inibitória mínima (CIM) avaliada, demonstrando ser ≥ 1024µg/mL. Utilizandose uma concentração sub-inibitória de 128µg/mL do EEFLV, seu potencial modulador de
antibióticos foi testado frente a isolados clínicos multirresistentes de E. coli, S. aureus e P.
aeruginosa, tendo sido observado um significante sinergismo quando combinado a
gentamicina, inclusive modificando o fenótipo da S. aureus de sensível para resistente. O
extrato também potencializou o efeito da canamicina quando usado frente a S. aureus. Nesta
concentração, não houve potencialização das drogas contra P. aeruginosa e cepas fúngicas
testadas. Este foi o primeiro relato de atividade moduladora de antibiótico de uma pteridófita
do gênero Lygodium.
Palavras-chave - Lygodium venustum, microdiluição, antimicrobiano, modulador.
66
Antimicrobial and Modulatory Activity of Ethanol Extract of the Leaves from Lygodium
venustum SW.
Maria F. B. Morais-Braga1, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Jacqueline C.
Andrade1, Gláucia M. M. Guedes1, Saulo R. Tintino1, Celestina E. Sobral-Souza1, José G. M.
Costa2, Irwin R. A. Menezes3, Antonio A. F. Saraiva4, Henrique D. M. Coutinho1
1
Laboratory of Microbiology and Molecular Biology,
Research,
3
2
Laboratory of Natural Products
Laboratory of Molecular Pharmacology and Chemistry,
4
Laboratory of
Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil.
* Corresponding author:
Maria Flaviana B. Morais-Braga
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica,
Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161,
Pimenta,
63105-000.
[email protected]
Fone:
+55(88)31021212;
Fax
+55(88)
31021291.
E-mail:
67
ABSTRACT
The evolution in microorganism defense systems has led to intensive searches for new drugs,
extracted from various natural products. This study evaluated the antibacterial and antifungal
activity of Lygodium venustum, a climbing fern. A phytochemical screening was performed
using ethanol extract from leaves of L. venustum, detecting the presence of tannins, flavonoids
and alkaloids. The minimal inhibitory concentration (MIC) of Escherichia coli,
Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. krusei and C.
tropicalis was evaluated using the microdilution method, resulting in concentrations ≥
1024µg/mL. Using a subinhibitory concentration of 128µg/mL of EELLV, the modulatory
potential of the extract was tested against multidrug-resistant clinical isolates, resulting in
synergism when combined with Gentamicin and actually altering the phenotype of S. aureus
from sensitive to resistant. The extract also potentiated the effect kanamycin against S.
aureus. This was the first report of modulatory antibiotic activity by a Lygodium genus fern.
Keywords – Lygodium venustum, microdilution, antimicrobial, modulator.
INTRODUCTION
Microbial infectious diseases have prompted the development of studies to understand
their drug resistance mechanisms and the creation of drugs to avoid these defenses. Infection
by Staphylococcus aureus is among the most common problems in hospitals due to its
resistance against several antibiotics. Pseudomonas aeruginosa is the cause of nosocomial
infections, particularly in people with cystic fibrosis. Escherichia coli is commonly found in
the intestinal tract, but certain strains have been closely linked to serious urinary tract
infections and diarrhea (Tortora et al., 2008). Klebsiella pneumonia, although confined to the
normal flora, has emerged as an important hospital pathogen capable of causing severe
morbidity and mortality in pediatric patients (Pfaller et al., 1998). Strains of Candida have
concerned the medical community due to their role in high-morbidity and mortality infections,
particularly in immunocompromised patients (Richardson and Lass-Florl, 2008; Coutinho,
2009).
Through natural selection plants have developed several mechanisms against
parasitism and herbivory. The production of defensive chemical compounds, such as
secondary metabolites, indicates evolutionary adaptive responses from the pressure caused by
68
these ecological relationships (Rhodes, 1994). Products derived from plants that feature
antimicrobial properties or the ability to improve the antimicrobial potential of existing drugs
play an important role in battling infectious diseases (Coutinho et al., 2009). They can serve
as alternative therapeutic agents with the ability to directly counter natural microbial
resistance to drugs.
Lygodium venustum is a fern with a pantropical distribution used as a bioindicator of
degraded environments (Mehltreter, 2006). This fern is used as a medicinal plant in Latin
America due to its antifungal, trichomonacidal, antidiarrheal, anti-inflammatory and analgesic
activity (Duke and Ottesen, 2009; Argueta et al., 1994). It is used in the Peruvian Amazon as
an adaptogen and as an ingredient of the sacred beverage “ayahuasca” (Rivier and Lidgren,
1972). Few studies have reported on the bioactivity of L. venustum in preclinical studies
(Alanis et al., 2005; Calzada et al., 2007; Calzada et al., 2010), as is true in others ferns
(Xavier, 2007).
In this work, a phytochemical screening was performed on the ethanol extract from
leaves of L. venustum; its antimicrobial activity was assayed against bacterial and fungal
strains, as well the modulatory potential against aminoglycosides and antifungal drugs.
MATERIAL AND METHODS
Plant Material
Leaves of L. venustum were collected in the city of Crato, Ceará, Brazil. The plant was
identified by Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva and voucher specimens were deposited at
the Herbarium Caririense Dárdano de Andrade-Lima of the Regional University of Cariri –
URCA, under number 5569 HCDAL.
Preparation of Ethanol Extract from Leaves of L. venustum (EELV)
The leaves were partially milled and 211.18 g of powdered material was extracted by
maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The mixture was
allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and concentrated
under vacuum in a rotary evaporator at 60 ºC and 760 mm/Hg, yielding 103.9 g (Brasileiro et
al., 2006).
69
Phytochemical characteristics
The phytochemical assays were used for the qualitative analysis of the presence of
secondary metabolites. The detection tests to evaluate the presence of heterosides, saponins,
phenols, tannins, flavonoids, steroids, triterpenes, coumarins, quinones, organic acids and
alkaloids were performed according to the method described by Matos (1997). The tests are
based on the visual observation of color modifications and formation of precipitate after the
addition of specific reagents.
Microbial strains
The bacteria used in the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) test were the
standard strains of E. coli ATCC25923, S. aureus ATCC10536, P. aeruginosa ATCC15442
and K. pneumonia ATCC4362. The antifungal assays used standard strains of Candida
albicans ATCC40006, C. krusei ATCC2538 and C. tropicalis ATCC40042. To evaluate the
modulatory activity of the extract, the following multi-resistant bacterial strains were used,
isolated from clinical environments: P. aeruginosa 03, E. coli 27 and S. aureus 358, with the
resistance profile demonstrated in Table 1 and the same fungal strains used in the MIC test.
All strains were obtained from the Laboratory of Clinical Mycology – UFPB.
Drugs
The drugs used in the tests were the aminoglycosides kanamycin, amikacin, neomycin
and gentamicin, and antifungals mebendazole, amphotericin B, nystatin and benzoyl
metronidazole (Sigma Co., St. Louis, USA). All drugs were diluted in sterile water.
Minimal Inhibitory Concentration
Broth microdilution was the method used. The EELV solution was dissolved using
DMSO and diluted to 1024 µg/mL using sterile distilled water. The bacterial inoculum was
diluted using BHI to a final concentration of 105 CFU/mL. A total of 100 µL of each
inoculum was distributed in each well of a microtiter plate with 96 wells, and then submitted
to a twofold serial dilution using 100 µL of the extract, with concentrations ranging between 8
and 512 µg/mL. The plates were incubated for 24 hours at 35 ºC (Javadpour et al., 1996).
70
Bacterial MIC was determined using resazurin, while the MIC of fungi was determined by
turbidity. The MIC was defined as the lowest concentration where no growth can be observed,
according to NCCLS (2008).
Drug Modulation Test
To observe whether the extract would alter the action of antimicrobial drugs against
the tested strain, the method proposed by Coutinho et al. (2008) was used. The EELV was
tested at a sub-inhibitory concentration (MIC/8 = 128 µg/mL). A 100 µL sample of a solution
containing BHI, the microbial inoculums and extract were placed in each well. After this, 100
µL of the antimicrobial drug was mixed with the first well, following the twofold dilution.
Concentrations of aminoglycosides and antifungals ranged between 2.44 and 2500 µg/mL and
2 to 512 µg/mL, respectively.
RESULTS
The phytochemical characterization showed the presence of phenols, tannins,
flavonoids and alkaloids, as shown in Table 2.
The antibacterial and antifungal assays of EELV did not demonstrate clinically
relevant results, with MICs ≥1024 µg/mL. However, when the modifying activity of EELV
against aminoglycosides was evaluated, the Gram-negative E. coli 27 and Gram-positive S.
aureus 358 strains showed synergistic activity when combined with gentamicin and
kanamycin (Table 3). The combination of the extract with antifungals did not show any
modulatory activity against strains of Candida.
DISCUSSION
Several plants used in the religious beverage “ayahuasca”, such as L. venustum,
contain alkaloids (Rivier and Lidgren, 1972). This fact is corroborated by the results of our
phytochemical screening. Other species from the genus Lygodium have been the subjects of
more detailed chemical studies, including the isolation of some compounds (Zhang et al.,
2005; Kurumatani et al., 2001; Achari et al., 1986). However, this is the first work to focus on
the chemical composition of L. venustum.
71
The lack of the antibiotic activity of L. venustum against strains of E. coli was verified
in another report (Alanis et al., 2005). The results demonstrate that the extracts were not
efficient inhibitors of bacterial growth, as their inhibition percentages were lower than 50%. A
relevant note regarding this research is the value of the extract concentration used in the test, 8
mg, which is considered high for clinical applications (Houghton et al., 2007), as
demonstrated in our work. Additionally, it is important to note that the microdilution method
used in present study is currently the preferred technique to evaluate antimicrobial activity,
compared to other methodologies using agar diffusion (Greger and Hadacek, 2000).
The methanol extracts of other plants from the genus Lygodium such as Lygodium
japonicum (Thumb.) SW. was tested against strains of P. aeruginosa, S. aureus, E. coli and C.
albicans using the disk diffusion method, impregnated with 40 µg of dried plant material/disk,
but no bioactivity was demonstrated (Taylor et al., 1995). Our results corroborate those
obtained in this work by Taylor et al. (1995).
Compared with the isolated action of drugs, EELV increased the antibiotic activity of
amikacin against S. aureus. When associated with gentamicin, it demonstrated a very
promising modulatory activity against E. coli and S. aureus, causing a reversal of the resistant
phenotype of this strain to sensitive according to the classification of NCCLS (2005). The
observed bioactivity of the extract in combination with the antibiotics may indicate that
secondary metabolites such as tannins, flavonoids and alkaloids –all secondary metabolites
with well-known antimicrobial activity and found in the EELV– could be acting in
association with the assayed drugs, enhancing the activity of these drugs at lower
concentrations (Scalbert, 1991; Bylka, et al., 2004; Zongo et al., 2009).
This is the first report on the modulatory activity against aminoglycosides by a fern.
This activity indicates the possibility of development of new drugs derived from the
association between natural products isolated from L. venustum with antibiotics, to be used in
antibiotic therapy against multi-drug resistant bacteria, as well as prevent the emergence of
drug resistant bacteria.
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Table 1. Bacterial source and antibiotic resistance profile.
Bacteria
Source
Antibiotic resistance
Escherichia coli 27
Surgical wound
Ast, Amx, Ami, Amox, Ca, Cfc,
Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt,
Tet, Tob
Surgical wound
Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo,
Para, But, Sis, Net
Urine culture
Cpm, Ctz, Imi, Cip, Ptz, Lev, Mer,
Ami
Ast-Aztreonam; Amx-Amoxacillin; Amp-Ampicillin; Ami-Amicilina; Amox-Amoxillin, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cephalothin; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-ChlorampKenicol; Imi-Imipenem; CanCanamycin; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetracycline; Tob-Tobramycin; Oxa-Oxacillin; Gen-Gentamicin; NeoNeomycin;
Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicin; Net-Netilmicin; Com-Cefepime; Ctz-
Ceftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem.
Table 2. Phytochemical characterization of Ethanol Extract of L. venustum.
METABOLITES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
+
-
+
-
-
+
+
+
+
-
+
-
-
+
+
1 – Phenols; 2 – Tannin pyrogallates; 3 – Tannin Phlobaphenes; 4 – Anthocyanidins; 5 – Anthocyanins; 6 –
Flavones; 7 – flavonols; 8 – Xanthones; 9 – Chalcones; 10 – Aurones; 11 – Flavononls; 12 –
Leucoanthocyanidins; 13 – Catechins; 14 – Flavonones; 15 – Alkaloids; (+) presence; (-) absence.
75
Table 3. Antibacterial activity modulating the ethanol extract from leaves of Lygodium
venustum (μg/mL).
Modulation of antibiotic for EELV
E. coli 27
S. aureus 358
Extract/ Antibiotic
MIC combined
MIC alone
MIC combined
MIC alone
EELV + Kanamycin
156.25
156.25
39.06
156.25
EELV + Amikacin
312.5
312.5
78.125
78.125
EELV + Neomycin
156.25
156.25
39.06
39.06
EELV + Gentamicin
39.06
1250
2.44
19.53
EELV: ethanol extract of L. venustum; MIC: Minimal
Inhibitory Concentration
76
CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO
O artigo foi submetido à revista American Fern Journal para apreciação e foi aceito
para publicação no ano de 2012 (volume 102).
Re: Response on the review of Article
DE: Geiger, Jennifer
PARA: Maria Flaviana Bezerra Morais Braga
Terça-feira, 31 de Janeiro de 2012 22:24
Dear Maria Flaviana Bezerra Morais ,
Thank you for your email. Your article has been accepted for publication in the American
Fern Journal and is scheduled to be published in the second issue of volume 102. Please
let me know if you need a letter that is more official than this email.
Best wishes,
Jennifer
Jennifer Geiger, Ph.D.
Editor in Chief, American Fern Journal.
Department of Natural Sciences.
Carroll College
Helena, MT 59625.
[email protected]; [email protected]
406-447-4461
77
5.2 COMBATING THE MULTIRESISTANCE TO ANTIBIOTICS WITH NATURAL
PRODUCTS: ADDITIVE EFFECT OF Lygodium venustum SW. WITH GENTAMICIN.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar as interações entre gentamicina e o extrato etanólico
(EELV) da samambaia Lygodium venustum SW. Foram identificados os fitoconstituintes do
extrato etanólico obtido de Lygodium venustum e o EELV foi analisado pelo método
checkerboard com gentamicina contra duas cepas de bactérias multirresistentes aos
antibióticos. A atividade antibiótica de gentamicina, quando associada ao extrato, foi
reforçada de uma forma aditiva contra ambas as linhagens. Os resultados indicaram que L.
venustum pode ser uma fonte de metabólitos secundários para serem usados em associação
com antibióticos como aminoglicosídeos na quimioterapia contra bactérias resistentes aos
antibióticos.
Palavras-chave: Lygodium venustum, extrato etanólico, método checkeboard, gentamicina.
78
Combating the multiresistance to antibiotics with natural products: additive effect of
Lygodium venustum SW. with gentamicin
Maria F. B. Morais-Bragaa, Teógenes M. Souzaa, Karla K. A. Santosa, Gláucia M. M.
Guedesa, Jaqueline C. Andradea, Saulo R. Tintinoa, Celestina E. Sobral-Souzaa, José G. M.
Costab, Antonio A. F. Saraivac, Henrique D. M. Coutinhoa*
a
Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, bLaboratory of Natural Products
Research, cLaboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil.
Running title: Lygodium venustum and gentamicin
Henrique Douglas Melo Coutinho
Pimenta,
63105-000.
[email protected]
Fone:
+55(88)31021212;
Fax
+55(88)
31021291.
E-mail:
79
Abstract
The aim of this work was evaluate the interactions between gentamicin and the ethanol extract
of the fern Lygodium venustum SW (EELV). The ethanol extract of Lygodium venustum was
obtained, the phytocompounds were identified and the EELV was assayed by the
checkerboard method with gentamicin against two bacterial strains multiresistant to
antibiotics. The antibiotic activity of gentamicin, when associated with the extract, was
enhanced in a additive manner against both strains. The results indicated that L. venustum can
be a source of secondary metabolites to be used in association with antibiotics as
aminoglycosides in the antibiotic chemotherapy against resistant bacteria.
Keywords: Lygodium venustum, ethanol extract, checkerboard method, gentamicin.
Introduction
Lygodium venustum SW. Is a fern that belongs to the Lygodiaceae family, commonly
found in the Latin America. This fern is used in the traditional medicine to the treatment of
dermatosis, infections, mycosis, thricomoniasis and other diseases [1,2]. This plant was
pharmacologically assayed against gastric diseases and antibacterial activity [3,4].
Recently, many natural products had been tested to verify not only the antibacterial
activity, but also the modulatory antibiotic activity as a strategy to combat bacterial pathogens
with drugs multiresistance [5]. Many researches about this topic had been developed because
the growing problems associated with the loss of the activity of drugs used in the bacterial
chemotherapy due the bacterial mechanisms of resistance [6-8].
The aim of this work was evaluate the interactions between the ethanol extract of L.
venustum (FAELV) with gentamicin by the checkerboard method.
Materials and Methods
Plant Material
Leaves of L. venustum were collected in the Crato county, Ceará, Brazil. The plant amterial
was identified by Dr. Álamo Feitosa Saraiva and a voucher specimen was deposited with the
number #5569 HCDAL in the “Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima”, at URCA.
80
Obtention of the Ethanol extract of Lygodium venustum (EELV)
211.18 g of leaves were dried and keeped at room temperature. The powdered material was
extracted by maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The mixture
was allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and
concentrated under vacuum in a rotary evaporator under 60ºC and 760mm/Hg of temperature
and pressure, respectively. 950 g of aerial parts yielded 50g of ethanol extract. The EELV was
dilluted using DMSO and sterile water to obtain a concentration of 1024 µg/mL.
Phytochemical prospection
The phytochemical assays were used for the qualitative analysis of the presence of secondary
metabolites. The detection tests to evaluate the presence of heterosides, saponines, tannins,
flavonoids, steroids, triterpens, cumarins, quinones, organics acids and alkaloids were
performed allowing the method described for Matos [9]. The tests are based in the visual
observation of color modifications and formation of precipitate after the addition of specific
reagents (Table 1).
Bacterial strains
The strains used in this work were the multiresistant clinical isolates Staphylococcus aureus
358 and Escherichia coli 27 (Table 2). The strains were obtained from the Clinical Mycology
Laboratory, UFPB, Brazil. All strains were maintained in Heart Infusion Agar slants (HIA;
Difco), and prior to the assays, the cells were grown for 24 h at 37°C in Brain Heart Infusion
(BHI, Difco).
Drugs
Gentamicin, amikacin and neomycin were obtained from SIGMA. All drugs were dissolved in
sterile water.
Checkerboard Method
The strains and the interactions between EELV and antibiotics were tested by the
microdilution checkerboard technique [10]. Suspensions of 105 CFU/mL of bacterial culture
were prepared and distributed into microtiter trays containing varying concentrations of the
different drugs. The inoculated trays were incubated at 37°C for a period of 24 h, and then
evaluated for bacterial growth. In order to evaluate the activity of combinations of drugs,
fractional inhibitory concentration (FIC) indices were calculated as FIC A + FICB, where FICA
81
and FICB represent the minimum concentrations that inhibited the bacterial growth for drugs
A and B, respectively: FICA = MICA combination/ MICA alone and FICB = MICB
combination/MICB alone. A mean FIC index was calculated based on the following equation:
FICA + FICB, and the interpretation made as follows: synergistic (< 0.5), additive (0.5-1.),
indifferent (> 1), or antagonistic (> 4).
Results and Discussion
When assayed alone, the EELV had not show any clinically relevant antibacterial
activity. However, when the extract was associetd with the gentamicin, was observed an
additive effect with FIC índex = 0.5 against both bacterial strains (tabela 3). This result
indicates that the EELV and gentamicin, using low concentrations and acting together against
the bacteria affected several and different targets in the same moment, affecting the resistance
mechanism against the antibiotic. This effect was identified in the Gram positive and negative
strains, indicating a putative similar target in both strains. Due this fact, a possible mechanism
involved in this additivity could be associated with the interaction of the non – polar
phytocompounds from EELV as flavonids, tannins and terpenes with the cell membrane,
enhancing the permeability to the antibiotic by alterations on the membrane fluidity. This
process is calle herbal shotgun or synergistic multi-target effects [11].
Some studies have demonstrated the synergism between several natural products
obtained from plants and animals when associetd with drugs used in the antibacterial
chemotherapy [12,13]. However, this is the first report about the use of natural products
isolated from ferns with this aim, demonstrating this activity.
These interesting results demonstrate that the Ethanol extract of L. Venustum is a
source of secondary metabollites with antimicrobial potential that could be used in the
antibacterial therapy against pathogenic microorganisms with multiresistance to antibiotics in
association with antibiotics, as gentamicin.
Conflict of interest statement
The authors declare that they have no conflict of interest related to the publication of this
manuscript.
82
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83
Tabela 1. Phytochemical prospection of the ethanol extract from Lygodium venustum SW.
METABOLLITES
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
+
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
+
+
1)phenols; 2) tannin pyrogallates; 3) tannin phlobaphenes; 4) anthocyanins; 5) anthocyanidins; 6) flavones; 7)
flavonols; 8) xanthones; 9) chalcones; 10) aurones; 11) flavononols; 12) leucoanthocyanidins; 13) catechins; 14)
flavonones; 15) alkaloids; 16) terpenes.
Table 2. Origin of bacterial strains and resistance to antibiotics.
Bacteria
Origin
Resistance
Escherichia coli 27
Surgical
Ast, Amx, Amp, Ami, Amox, Ca, Cfc,
wound
Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt, Tet,
Tob
Staphylococcus aureus 358
Surgical
Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo, Para,
wound
But, Sis, Net
Ast - Aztreonan; Amx - amoxicillin, Amp - ampicillin; Ami - Amikacin; Amox - Amoxicillin, Ca - Cefadroxil;
Cfc - Cefaclor; Cf - Cephalothin; Caz - Ceftazidime, CIP - Ciprofloxacin; Chl - Chloramphenicol; Im Imipenem; Can - Kanamycin; SZT - sulphametrim, Tet - tetracycline; Tob - tobramycin; Oxa - Oxacillin; Gen gentamicin; Neo - neomycin; To - Paramomicina; But - Butirosin; Sis - sisomicin; Net – Netilmicin.
Table 3. Minimal inhibitory concentration (MIC) of gentamicin and the combinatory effect of
ethanol extract of Lygodium venustum (EELV) against bacterial isolates multiresistant to
antibiotics.
Natural Product +
Escherichia coli 27
Antibiotics
MIC (µg/mL)
FIC índex
MIC (µg/mL)
FIC index
EELV
≥ 1024
-
≥ 1024
-
Gentamicin
39.06
-
39.06
-
4.88/19.53
0.5 (add)
4.88/19.53
0.5 (add)
EELV + Gentamicin
FIC – Fractional Inhibitory Concentration; Syn – Synergism; Add – Additivity.
84
O artigo foi submetido à revista Clinical and Experimental Medicine (CEM) para
apreciação e aguarda parecer.
---------- Forwarded message ---------From: Clinical and Experimental Medicine (CEM) <[email protected]>
Date: 2011/11/10
Subject: CEM: Submission Confirmation
To: Henrique Coutinho <[email protected]>
Dear Prof. Henrique Coutinho,
Thank you for submitting your manuscript, Combating the multiresistance to antibiotics
with natural products: additive effect of Lygodium venustum SW. with gentamicin, to
Clinical and Experimental Medicine.
During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by accessing
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With kind regards,
Springer Journals Editorial Office
Clinical and Experimental Medicine
85
5.3 EVALUATION OF THE INTERACTION BETWEEN AMINOGLYCOSIDES AND
NATURAL PRODUCTS OF Lygodium Venustum SW. AGAINST Escherichia Coli AND
staphylococcus aureus CLINICALLY ISOLATED
RESUMO
Contexto: O objetivo deste trabalho foi avaliar as interações entre aminoglicosídeos e a
fração acetato de etila (FAELV) da samambaia Lygodium venustum SW.. Método: A fração
acetato de etila foi obtida a partir do extrato etanólico da samambaia L. venustum SW e foi
ensaiado com aminoglicosídeos pelo método checkerboard contra duas cepas bacterianas
multirresistentes a antibióticos. Resultados: A atividade antibiótica de todos os antibióticos,
quando associados com a fração acetato de etila foram melhoradas de forma aditiva, exceto a
associação entre a fração e a amicacina que mostrou um sinergismo Escherichia coli.
Conclusão: Os resultados indicam que L. venustum pode ser uma fonte de metabólitos
secundários para serem usados em associação com antibióticos aminoglicosídeos na
quimioterapia contra bactérias resistente aos antibióticos.
Palavras-chave: Lygodium venustum, fração acetato de etila, método checkeboard.
86
Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of
isolated
M.F.B. Morais-Bragaa, T.M. Souzaa, K.K.A. Santosa, G.M.M. Guedesa, J.C. Andradea, S.R.
Tintinoa, C.E. Sobral-Souzaa, J.G.M. Costab, A. Nogarad, R. A. Saraivad, A.A.F. Saraivac,
H.D.M. Coutinhoa*
a
Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, bLaboratory of Natural Products
Research, cLaboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, CE, Brazil;
d
Laboratory of Biochemistry toxicological, Federal University of Santa Maria, RS, Brazil.
Running title: Lygodium venustum and aminoglycosides
Pimenta,
63105-000.
[email protected]
Fone:
+55(88)31021212;
Fax
+55(88)
31021291.
E-mail:
87
Abstract
Background: The aim of this work was evaluate the interactions between aminoglycosides
and the ethyl-acetate fraction of the fern Lygodium venustum SW (EAFLV) Methods: The
ethyl-acetate fraction was obtained from the ethanol extract of Lygodium venustum SW and
was assayed by the checkerboard method associated with aminoglycosides against two
bacterial strains multiresistant to antibiotics Results: The antibiotic activity of all antibiotics,
when associated with the ethyl-acetate fraction, were enhanced in a additive manner, except
the association between the fraction with amikacin, that showed a synergistic interaction
against the E. coli strain Conclusions: The results indicated that L. venustum can be a source
of secondary metabolites to be used in association with antibiotics as aminoglycosides in the
antibiotic chemotherapy against resistant bacteria.
Keywords:
Lygodium
venustum,
ethyl-acetate
fraction,
checkerboard
method,
aminoglycosides.
Introdução
Lygodium venustum SW. Is a fern that belongs to the Lygodiaceae family, commonly
found in the Latin America. This fern is used in the traditional medicine to the treatment of
dermatosis, infections, mycosis, thricomoniasis and other diseases [1-4]. This plant was
pharmacologically assayed against gastric diseases and antibacterial activity [5-7].
Recently, many natural products had been tested to verify not only the antibacterial
activity, but also the modulatory antibiotic activity as a strategy to combat bacterial pathogens
with drugs multiresistance [8-11]. Many researches about this topic had been developed
because the growing problems associated with the loss of the activity of drugs used in the
bacterial chemotherapy due the bacterial mechanisms of resistance [12-15].
The aim of this work was evaluate the interactions between the ethyl-acetate fraction
of L. venustum (FAELV) with aminoglycosides by the checkerboard method.
Materials and Methods
Plant Material
Leaves of L. venustum were collected in the Crato county, Ceará, Brazil. The plant
amterial was identified by Dr. Álamo Feitosa Saraiva and a voucher specimen was deposited
88
with the number #5569 HCDAL in the “Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima”, at
URCA.
Obtention of the Ethyl-acetate fraction of Lygodium venustum (EAFLV)
211.18 g of leaves were dried and keeped at room temperature. The powdered material
was extracted by maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The
mixture was allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and
concentrated under vacuum in a rotary evaporator under 60ºC and 760mm/Hg of temperature
and pressure, respectively. 950 g of aerial parts yielded 50g of ethanol extract. 40 g of the
ethanol extract was fractionated with ethyl-acetate producing 0,56 g of ethyl-acetate fraction
(EAFLV). The EAFLV was dilluted using DMSO and sterile water to obtain a concentration of
1024 µg/mL.
Bacterial strains
The strains used in this work were the multiresistant clinical isolates Staphylococcus
aureus 358 and Escherichia coli 27 (Table 1). The strains were obtained from the Clinical
Mycology Laboratory, UFPB, Brazil. All strains were maintained in Heart Infusion Agar
slants (HIA; Difco), and prior to the assays, the cells were grown for 24 h at 37°C in Brain
Heart Infusion (BHI, Difco)..
Drugs
Gentamicin, amikacin and neomycin were obtained from SIGMA. All drugs were
dissolved in sterile water.
Checkerboard Method
The strains and the interactions between EAFLV and antibiotics were tested by the
microdilution checkerboard technique [16]. Suspensions of 105 CFU/mL of bacterial culture
were prepared and distributed into microtiter trays containing varying concentrations of the
different drugs. The inoculated trays were incubated at 37°C for a period of 24 h, and then
evaluated for bacterial growth. In order to evaluate the activity of combinations of drugs,
fractional inhibitory concentration (FIC) indices were calculated as FICA + FICB, where
FICA and FICB represent the minimum concentrations that inhibited the bacterial growth for
drugs A and B, respectively: FICA = MICA combination/ MICA alone and FICB = MICB
combination/MICB alone. A mean FIC index was calculated based on the following equation:
89
FICA + FICB, and the interpretation made as follows: synergistic (< 0.5), additive (0.5-1.),
indifferent (> 1), or antagonistic (> 4).
Results and Discussion
The EAFLV modified the antibiotic activity of all antibiotics assayed against both
bacteria (Table 2), demonstrating an additive relation. However, when the EAFLV was
associated with amikacin against the E. coli 27, the FIC índex was 0,4, indicating na
synergistic interaction between the antibiotic and the natural product.
One of the main classes of secondary metabollites extracted in the EAFLV are the
flavonoids [17], that present several pharmacological properties, as antimicrobial [18]. This
activity can be related to this phytocompound due the capacity to Interact with soluble
proteins or with the plasmatic membrane, promoting the membrane disruption and enhancing
the antibiotic uptake [19,20].
The results of our study are significant to a future clinical usage, due the fact of the
assayed concentrations were low. The possibility of the use of natural products from L.
Venustum associatied with antibiotics in the chemotherapy is according with the
pharmaceutical industries necessities, being an alternative to combat the antibiotic bacterial
resistance. Combinations using natural products and antibiotics could be used in the future
against multiresistant microorganisms. This action could represent an interesting approach
against the severe public health problem caused by the nosocomial infections.
References
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Taylor & Francis group, 2008.
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5. Calzada F, Arista R, Pérez H: Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal
disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. J Ethnopharmacol 2010;
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90
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trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. J Ethnopharmacol 2007; 113: 248251.
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Rev Bras Cienc Farm 2006; 42: 195-202.
9. Vieira OMC, Santos MH, Silva GA, Siqueira AM: Atividade antimicrobiana de
Struthanthus vulgaris (erva-de-passarinho). Rev Bras Farmacogn 2005; 15:149-154.
10. Cardoso FL, Murakami C, MaywormAS, Marques LM: Análise sazonal do potencial
antimicrobiano e teores de flavonóides e quinonas de extratos foliares de Aloe arborescens
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11. Hemaiswarya SH, Kruthiventi AK, Doble M: Synergism between natural products and
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12. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Siqueira-Júnior JP: Additive effects of Hyptis
martiusii Benth with aminoglycosides against Escherichia coli. Indian J Med Res 2010;
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13. Coutinho HDM, Vasconcellos A, Lima MA, Almeida-Filho GG, Alves RRN: Termite
usage associated with antibiotic therapy: enhancement of aminoglycoside antibiotic activity
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14. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Junior JP: In vitro
interference of Momordica charantia in the resistance to aminoglycosides. Pharma Biol 2009;
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15. Eliopoulos GM, Moellering RC: Antimicrobial combinations. In: Lorian V, editor.
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16. Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR:
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da
UFRGS/Editora da UFSC, 2010.
17. Taleb-Contini SH, Salvador MJ, Watanabe E, Ito IY, Dionéia CRO: Atividade
antimicrobiana dos flavonóides e esteróides isolados de duas espécies de Chromolaena. Rev
Bras Ci Farm 2003; 30: 403-408.
18. Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T, Fuyiwara S, Ohyama M, Takasa T, Linuma M:
Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavones against methicillinresistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol 1996; 50: 27-34.
19. Cowan MM: Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 1999; 12: 564582.
91
Table 1. Origin of bacterial strains and resistance to antibiotics.
Bacteria
Origin
Resistance
Escherichia coli 27
Surgical
Ast, Amx, Amp, Ami, Amox, Ca, Cfc,
wound
Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt, Tet,
Tob
Surgical
Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo, Para,
wound
But, Sis, Net
Ast - Aztreonan; Amx - amoxicillin, Amp - ampicillin; Ami - Amikacin; Amox - Amoxicillin, Ca - Cefadroxil;
Cfc - Cefaclor; Cf - Cephalothin; Caz - Ceftazidime, CIP - Ciprofloxacin; Chl - Chloramphenicol; Im Imipenem; Can - Kanamycin; SZT - sulphametrim, Tet - tetracycline; Tob - tobramycin; Oxa - Oxacillin; Gen gentamicin; Neo - neomycin; To - Paramomicina; But - Butirosin; Sis - sisomicin; Net – Netilmicin.
Table 2. Minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics and the combinatory effect of
combinations with ethyl-acetate fraction of Lygodium venustum (EAFLV) against bacterial
isolates multiresistant to antibiotics.
Natural Product +
Escherichia coli 27
Antibiotics
MIC (µg/mL)
FIC index
MIC (µg/mL)
FIC index
EAFLV
≥ 1024
-
≥ 1024
-
Amikacin
156.25
-
39.06
-
Neomycin
39.06
-
39.06
-
Gentamicin
39.06
-
39.06
-
EAFLV + Amikacin
128/39.06
0.4 (syn)
4/19.53
0.5 (add)
EAFLV + Neomycin
4/19.53
0.5 (add)
4/19.53
0.5 (add)
EAFLV + Gentamicin
4/19.53
0.5 (add)
4/19.53
0.5 (add)
FIC – Fractional Inhibitory Concentration; Syn – Synergism; Add – Additivity.
92
O artigo foi submetido à revista Chemotherapy para apreciação e aguarda parecer.
---------- Forwarded message ---------From: <[email protected]>
Date: 2011/11/10
Subject: Ms. No. 201111003, Chemotherapy
To: [email protected]
Chemotherapy
Ms. No.: 201111003
Title: Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of
isolated
Dear Dr. Coutinho,
Thank you for submitting your manuscript to "Chemotherapy". It will now be forwarded to
our reviewers and we shall inform you as soon as possible of the decision reached by the
editorial board. The manuscript reference number is 201111003. Please use this number on all
correspondence about the manuscript, which should be sent to the "Chemotherapy" editorial
office at the address listed below.
For information regarding the status of your manuscript and for future submissions to
"Chemotherapy" you can access this system by logging into the journal's online peer review
system as follows:
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Logon Name: henriquecoutinho
Password: urca1998
With kind regards,
93
Esther Bettiol
Chemotherapy
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S. KARGER AG - Medical and Scientific Publishers
e: [email protected]
f: +4161 3061434
t: +4161 3061361
w: http://www.karger.com/che
94
5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE Lygodium
venustum SW
RESUMO
Diferentes tipos de produtos naturais, suas frações ou substâncias isoladas destes vêm sendo
investigados quanto ao potencial antimicrobiano. A utilização abusiva de medicamentos tem
causado o desenvolvimento da resistência de microorganismos. A busca por fármacos com
atividade antimicrobiana direta ou potencializadora da ação dos utilizados pelas populações
tem estimulado a pesquisa farmacológica com plantas. Lygodium venustum é uma samambaia
da família Lygodiaceae muito utilizada na medicina popular por Sul Americanos. Neste
estudo avaliou-se a atividade antimicrobiana e modificadora da ação de antifúngicos e
aminoglicosídeos pela fração acetato de etila obtida do extrato etanólico das folhas de L.
venustum. Os testes de Concentração Inibitória Mínima foram realizados pelo método da
diluição em caldo e as linhagens ensaiadas foram as fúngicas leveduriformes de Candida
albicans, Candida krusei e Candida tropicalis e as bacterianas de Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Staphyloccocus aureus e Pseudomonas aeruginosa, todas padrões, que tiveram
seu MIC avaliado sendo ≥1024µg/mL. A atividade moduladora de antibióticos foi verificada
frente a linhagens clinicamente isoladas de E. coli e S. aureus, em concentração subinibitória
(MIC/8). A fração acetato de etila conseguiu potencializar a ação de todos os
aminoglicosídeos testados, mostrando um potencial clinicamente relevante e promissor para o
desenvolvimento de fármacos associados.
Palavras-chave: Samambaia. Atividade antifúngica. Atividade antibacteriana. Atividade
moduladora.
95
Atividade Antimicrobiana da Fração Acetato de Etila de Lygodium venustum SW
Maria F. B. Morais-Braga1*, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Gláucia M. M.
Guedes1, Jaqueline C. Andrade 1, Samara A. Brito2, Irwin A. de Menezes4, José G. M. Costa2,
Antonio A. F. Saraiva3, Henrique D. M. Coutinho1, Aline Augusti Boligon5, Diones Caeran
Bueno6.
1
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular; 2Laboratório de Pesquisa com Produtos Naturais,
3
Laboratório de Paleontologia,4 Laboratório de Farmacologia e Química Molecular da Universidade Regional do
Cariri, Crato, CE, Brasil; 5Laboratório de Farmácia Industrial, 6Laboratório de Bioquímica Toxicológica da
Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil.
* Autor para correspondência:
Maria Flaviana B. Morais-Braga
Pimenta,
63105-000.
Fone:
[email protected]
+55(88)31021212;
Fax
+55(88)
31021291.
E-mail:
96
ABSTRACT
Different types of natural products, their fractions and their isolated substances have been
investigated as potential antimicrobial. The misuse of drugs has caused the development of
resistant microorganisms. The search for drugs with directly antimicrobial activity or
potentializer of the action of the used by populations has stimulated the pharmacological
research with plants. Lygodium venustum is a fern from the Lygodiaceae family widely used
in popular medicine by South Americans. This study evaluated the antimicrobial activity and
modifying the action of antifungal agents and aminoglycosides by the ethyl acetate fraction
obtained from the ethanol extract of the leaves of L. venustum. The Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) tests were performed by broth dilution method and the fungal strains
tested were they east Candida albicans, Candida krusei and Candida tropicalis and the
bacterial Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus and Pseudomonas
aeruginosa, all standards, which had their MIC being evaluated in ≥1024μg/mL. The
modulating activity of antibiotics was checked against clinically isolated strains of E. coli and
S.aureus in subinhibitory concentration (MIC / 8). The ethyl acetate fraction was able to
potentiate the action of all aminoglycosides tested, showing a potential clinically relevant and
promising for the development of associated drugs.
Keywords: Fern. Antifungal activity. Antibacterial activity.Modulating activity.
INTRODUÇÃO
Lygodium venustum é uma samambaia pertencente à família Lygodiaceae (Smith et
al., 2006), pesquisas em etnobotânica de populações da América Latina têm relatado a
utilização de suas partes aéreas seja em forma de chá ou de uso tópico no tratamento de
dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases (Duke, 2008). Na etnofarmacologia já foi
investigada quanto ao seu potencial antitricomonicida (Calzada et al., 2007), antibacteriano
(Calzada et al., 2010) e para o tratamento de distúrbios gastrointestinal (Alanis, et al., 2005).
Em geral, as Pteridófitas têm sido timidamente investigadas quanto a suas bioatividades,
apesar de serem bastante utilizadas na medicina popular (Barros e Andrade, 1997).
97
O aumento da prevalência de bactérias resistentes, em conseqüência do acentuado e
inadequado uso de antibióticos, vem indicando que estes são insuficientes para o tratamento
de muitas das infecções existentes. A indústria farmacêutica tem tido, apesar de seu constante
esforço, bastante dificuldade em encontrar ou desenvolver novas drogas efetivas com a
rapidez com que elas se fazem necessárias (Vermelho, et al., 2007).
Outro problema associado a microrganismos é o aumento de infecções fúngicas
oportunistas. Apesar do número de antimicóticos comercialmente disponíveis ter aumentado
nos últimos anos, estes ainda encontram-se em desvantagem, quando comparados às drogas
antibacterianas. Além disso, a resistência aos antifúngicos tem representado um grande
desafio para a clínica2 (Batista et al. 1999).
Extratos, frações e substâncias isoladas de produtos naturais têm sido intensamente
analisados com a finalidade de se comprovar a existência de ação antimicrobiana. Isto vem
ocorrendo com freqüência na atualidade, pois o uso abusivo destes agentes tem provocado o
desenvolvimento da resistência de microrganismos, tornando muito mais difícil o tratamento
de infecções nosocomiais (Tortora et al., 2008).
Neste trabalho avaliamos o potencial antimicrobiano e modulador de antibióticos da
fração acetato de etila obtida do extrato etanólico das folhas frescas de L. venustum.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
Folhas de L. venustum foram coletadas no município de Crato, Ceará, Brasil. O
material vegetal foi identificado pelo Dr. Álamo Feitosa Saraiva e uma exsicata foi depositada
sob o número 5569 HCDAL no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima da
Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato, Ceará, Brasil.
Preparação do Extrato Etanólico e fracionamento
As folhas foram parcialmente trituradas e 211,18g da massa foliar foi submersa em
etanol a 92% por um período de 72 horas. O extrato foi filtrado e em seguida concentrado em
rotaevaporador (Q-344B – Quimis – Brasil) e banho-maria (Q-214M2 –Quimis – Brasil). . O
fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto, obtendo-se a fração acetato
de etila com rendimento de 0,52g.
98
Material fúngico e bacteriano
Foram utilizados microorganismos catalogados em coleções (cepas especificadas) do
Laboratório de Micologia Clínica da Universidade Federal da Paraíba, conforme
especificados: bactérias (padrões): E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P.
aeruginosa ATCC 15442 e K. pneumoniae ATCC 4362; bactérias (multirresistentes):
P.aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358 e fungos (padrões): Candida albicans ATCC
40006, C. krusei ATCC 2538, C. tropicalis ATCC 40042.
Drogas
Foram utilizados os aminoglicosídeos canamicina, amicacina, neomicina e
gentamicina e antifúngicos mebendazol, anfotericina B, neomicina e benzoilmetronidazol
(Sigma Co., St. Louis, USA), a uma concentração inicial de 5000µg/mL e 1024µg/mL,
respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água esterilizada.
Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O método utilizado foi o da microdiluição em caldo. Para se chegar à concentração de
1024µg/mL a ser utilizada nos testes, inicialmente uma concentração de 100mg/mL da fração
acetato de etila foi diluída em 1mL de dimetilsufóxido (DMSO), que em seguida foi diluída
em água destilada e estéril. O inóculo foi diluído em BHI 10% chegando-se a uma
concentração de 105UFC/mL. Foram distribuídos 100µL do BHI e inóculo em cada poço de
uma placa de 96 poços e em seguida procedeu-se a microdiluição seriada com a solução de
100µL do extrato, variando nas concentrações de 512 a 8µg/mL. As placas foram levadas à
incubadora por 24 horas a 35º(Javadpour et al., 1996). A revelação da CIM bacteriana foi
feita utilizando-se a resazurina, enquanto para os fungos foi observado a turbidez provocada
pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum
crescimento foi observado de acordo com a NCCLS (2008).
Teste de Modulação de Drogas
Utilizou-se o método proposto por Coutinho (2008), onde a solução da fração acetato
de etila foi testada em concentração sub-inibitória (MIC/8). Foram distribuídos 100µL de uma
99
solução contendo BHI 10%, inóculo e extrato em cada poço no sentido alfabético da placa.
Em seguida, 100µL da droga foi misturado ao primeiro poço, procedendo a microdiluição em
série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de aminoglicosídeos
e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44µg/mL e 1024 a 8µg/mL,
respectivamente.
RESULTADOS
A fração acetato de etila do extrato etanólico de L. venustum não apresentou
atividade antimicrobiana de relevância clínica contra as cepas fúngicas e bacterianas padrões,
sendo a concentração inibitória mínima sempre maior ou igual a 1024µg/mL.
Quando combinando com as drogas antifúngicas, a fração acetato de etila não
modificou a concentração inibitória mínima das drogas testadas. O bacilo P. aeruginosa 03,
também não foi capaz de alterar a CIM dos antibióticos testados, apresentando inibição do
crescimento em uma concentração ≥ 1024 µg/mL.
Nos testes frente à cepa E. coli 27, todas as drogas testadas em combinação com a
fração acetato de etila apresentaram uma diminuição da concentração inibitória mínima,
sugerindo uma relação de sinergismo com o produto natural. Na verificação do potencial
modulador de antibiótico contra a bactéria S. aureus 358, pôde-se perceber que houve uma
interação sinérgica significativa com todos os aminoglicosídeos, mas novamente o resultado
com a gentamicina surpreendeu, pois teve como conseqüência a mudança fenotípica da
bactéria de resistente para sensível. Os resultados são expressos na tabela 1.
DISCUSSÃO
Os metabólitos secundários, por serem fatores de interação entre os organismos,
frequentemente apresentam atividades biológicas interessantes (Simões et al., 2010). Testes
fitoquímicos anteriormente realizados foram realizados indicam que L. venustum apresenta
em sua composição metabólitos secundários como taninos flobabênicos, flavonas, xantonas,
chalconas, flavonóides, flavononas e alcalóides, muitos destes responsáveis por atividades
antimicrobianas.
Com polaridade intermediária, o acetato de etila permite recuperar as agliconas livres
pouco polares, tais como flavonas, flavonóis, flavanonas, di-hidroflavonóis, isoflavonas e
outras agliconas com alto grau de polarização. Os Flavonóides representam um dos grupos
100
fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem vegetal (Simões, et
al., 2010). Nos últimos anos o interesse pelas propriedades farmacológicas do grupo vem
crescendo, isto porque, estudos apontam que estes apresentam atividades relevantes e
diversificadas (Machado, et al, 2008), entre estas, a antimicrobiana (Taleb-Contini et al.,
2003). Esta atividade é provavelmente devido à sua habilidade de formar complexos com
proteínas solúveis extracelulares e com a parede celular ou ainda o caráter lipofílico dos
flavonóides ser responsável pela ruptura da membrana celular dos microorganismos
(TSUCHIYA et al., 1996; COWAN, 1999). Dessa forma, este fato pode nos levar a supor que
estes compostos fenólicos talvez sejam os responsáveis pela atividade modificadora de
antibióticos verificada frente às cepas S. aureus 358 e E. coli 27.
S. aureus e E. coli são microrganismos bastante diferentes bioquimicamente,
especialmente em seus envoltórios celulares. Na maioria das bactérias gram-positivas, aqui
representadas pela S. aureus, a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicana,
formando uma estrutura espessa e rígida. Em contraste, as paredes celulares de gramnegativas contêm somente uma camada fina de peptideoglicana1 (Tortora, et al.,2008). Isto
talvez possa explicar o fato de que os resultados de modulação com E. coli terem sido bem
mais significativos quando comparados com os da S. aureus, apesar de serem todos
clinicamente relevantes.
Os antibióticos aminoglicosídeos são parte importante do arsenal terapêutico
antibacteriano desde seu descobrimento, na década de 40. Todos os aminoglicosídeos agem
pelo mesmo mecanismo da ação, exercendo seu efeito bactericida ao se ligarem ao ribossomo
bacteriano. Desta forma, é necessário que penetrem no interior da célula bacteriana para que
possam agir. Isto ocorre por meio da interação do aminoglicosídeo com a superfície celular, o
seu transporte por meio da membrana e, finalmente, o acoplamento com o ribossomo
(Oliveira et al., 2006). Produtos naturais de origem vegetal podem alterar o efeito de
antibióticos, seja aumentando ou reduzindo a atividade antibiótica (Coutinho et al. 2008).
Vários trabalhos vêm demonstrando esta interação entre os fármacos e produtos vegetais,
evidenciando o potencial modulador (Sousa et al, 2011; Matias, et al., 2010, Coutinho, et al.,
2010).
A combinação de antibióticos de uso comum pelas populações e compostos extraídos
pela fração acetato de etila da pteridófita L. venustum, poderiam representar uma excelente
opção terapêutica no tratamento de infecções causadas por S. aureus e E. coli, sugerindo a
composição de um fármaco com multi-drogas. Entretanto, estudos fitoquímicos mais
aprofundados são necessários no sentido de isolar e identificar os metabólitos secundários
101
imediatamente responsáveis por esta potencialização do efeito dos aminoglicosídeos aqui
ensaiados.
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103
Tabela 1. Atividade moduladora antibacteriana da Fração Acetato de Etila do Extrato
Etanólico das Folhas de L. venustum (EEFLV) na concentração subinibitória de 128 µg/mL
(CIM/8).
Escherichia coli
Staphyloccocus aureus
Antibiótico
Efeito isolado
Efeito associado
Efeito isolado
Efeito associado
Canamicina
156,25
19,53
156,25
39,06
Amicacina
312,5
39,06
78,125
19,53
Neomicina
156,25
19,53
39,06
9,76
Gentamicina
1.250
9,76
19,53
2,44
CIM: Concentração inibitória mínima
104
O artigo ainda não foi submetido. Atualmente está sendo traduzido para a língua
inglesa, devendo ser posteriormente encaminhada para apreciação de editor e revisores de um
períodico internacional.
105
5.5 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA, ANTIFÚNGICA E MODULADORA DE
FRAÇÕES OBTIDAS DE Lygodium venustum SW.
RESUMO:
O tradicional uso das plantas na medicina popular vem indicando um caminho na busca de
agentes farmacológicos. A necessidade de novos fármacos é evidenciada pela acentuada
resistência dos microorganismos. A samambaia Lygodium venustum teve neste trabalho seu
potencial antimicrobiano avaliado através do método de microdiluição em caldo. Também foi
testada a sua capacidade de modular a ação de antibióticos. Foram ensaiadas suas frações
hexânica, diclorometano e metanólica obtidas a partir do extrato etanólico das folhas frescas.
A Concentração Inibitória Mínima foi avaliada frente às linhagens padrões de Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Candida
albicans, Candida krusei e Candida tropicalis. Na verificação da atividade moduladora de
antibióticos foram utilizadas linhagens multirresistentes de P. aeruginosa, E. coli e S. aureus
e as mesmas linhagens fúngicas utilizadas na CIM. As drogas usadas na modulação foram
antifúngicos e aminoglicosídeos. Todos os resultados da CIM demonstraram atividade ≥
1024µg/mL. As frações não potencializaram a ação dos antifúngicos contra as linhagens de
Candida, nem dos aminoglicosídeos frente à P. aeruginosa. Porém, interessantes resultados
potencializando a ação destes foram obtidos frente à E. coli e S. aureus. Tais resultados
sugerem que metabólitos secundários existentes no vegetal poderão ser utilizados para
constituição de novas drogas em associação com aminoglicosídeos. Este foi o primeiro relato
de atividade modificadora da ação de antibióticos por frações obtidas de uma pteridófita da
família Lygodiaceae.
Palavras-chave: Lygodium venustum, pteridófita, atividade antimicrobiana, atividade
moduladora da ação de antibióticos, frações.
106
Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de frações obtidas de Lygodium
venustum SW.
Maria Flaviana Bezerra Morais-Braga1, Teógenes Matias de Souza1, Karla Katiúcia. Alves
dos Santos1, Gláucia Morgana de Melo Guedes1, Jaqueline Cosme Andrade 1, Saulo Relisson
Tintino1, José Galberto Martins da Costa2, Irwin Rose Alencar de Menezes 3, Antonio Álamo
Feitosa Saraiva4, Henrique Douglas Melo Coutinho1*
1
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular; 2Laboratório de Pesquisa com Produtos Naturais,
3
Laboratório de Paleontologia,4 Laboratório de Farmacologia e Química Molecular da Universidade Regional do
Cariri, Crato, Brasil.
Título resumido: Atividade antimicrobiana de frações de Lygodium venustum SW.
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri – URCA,
Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212;
Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected]
107
ABSTRACT
The traditional use of plants in popular medicine has also indicated the way in the search for
pharmacological agents. The need for new drugs is evidenced by the strong resistance of
microorganisms. The fern Lygodium venustum had its antimicrobial potential measured, in
this work, by the broth microdilution method. Its ability to modulate the action of antibiotics
was also tested. Its hexane, dichloromethane and methanol fractions obtained from the
ethanolic extract of fresh leaves were assayed. The Minimum Inhibitory Concentration was
evaluated from the standard strains of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Candida tropicalis and Candida
krusei. To check the modulating activity of antibiotics were used multi-resistant strains of P.
aeruginosa, E. coli and S. aureus and the same yeast strains used in CIM. The drugs used in
modulating were antifungal and aminoglycosides. All results showed MIC ≥1024μg/mL
activity. The fractions neither enhanced the action of antifungal agents against strains of
Candida, nor the aminoglycosides against P. aeruginosa. However, interesting results
potentiating the action of these were obtained against the E. coli and S. aureus. Such results
suggest that secondary metabolites which are in this plant may be used to create new drugs in
combination with aminoglycosides. This was the first report of activity-modifying action of
antibiotics for fractions obtained from a fern family Lygodiaceae.
Key words: Fern, antimicrobial activity, modulation of antibiotics.
INTRODUÇÃO
Plantas utilizadas na medicina popular tem sido alvo de investigações científicas
devido as suas propriedades terapêuticas. Diversos estudos comprovam que a biodiversidade
vegetal possui um arsenal de compostos que se mostram promissores na produção de novos
fármacos. O tratamento de enfermidades com plantas é tão antigo quanto à espécie humana e
estas vêm sendo comercializadas em feiras livres e mercados populares (Maciel et al., 2002).
Devido ao rápido surgimento de resistência de microrganismos, a busca por novos
agentes terapêuticos eficazes tem se tornado constante. Dessa forma, a pesquisa tem
envolvido desde Briófitas até Angiospermas e suas diversas atividades farmacológicas têm se
tornado uma alternativa promissora no combate às infecções causadas por bactérias e fungos
108
(Morantes et al. 2007, Peres et al. 2009, Lee et al. 2008, Santos et al. 2010, Nascimento et al.
2000).
As leveduras de Candida, no homem, podem atingir superfícies cutâneas e mucosas,
causando a candidíase oral, vaginal, onicomicose, intertrigo, podendo em alguns casos ser
invasiva. O uso exacerbado de antibióticos de amplo espectro vem favorecendo o
desenvolvimento de infecções fúngicas (Almeida 2008). Bactérias Gram-positivas e Gramnegativas têm se tornado a causa de infecções que inclusive podem apresentar implicações
clínicas em ambientes hospitalares. Muitos patógenos estão se tornando resistentes a uma
variedade crescente de quimioterápicos, tornando o combate às infecções por eles causadas
extremamente difíceis (Vermelho et al. 2007).
No grupo das plantas vasculares, a samambaia lianescente Lygodium venustum, têm
sido tradicionalmente utilizada como um fitoterápico. Suas partes aéreas são utilizadas sob a
forma de chá ou tópica, no tratamento de infecções e dermatoses, entre outras enfermidades
(Duke 2008). Poucos estudos farmacológicos foram realizados, mas suas atividades
tricomonicida (Calzada et al. 2007), antibacteriana (Alanis et al. 2005) e ainda seu efeito no
tratamento de desordens gastrointestinais (Calzada et al. 2010) já foram investigados.
Devido aos problemas causados por esses microrganismos e o rápido surgimento de
resistência, as
propriedades
antibacterianas
e antifúngicas
das
frações
hexânica,
diclorometano e metanólica, obtidas de L. venustum serão analisadas.
MATERIAL E METODOS
Material vegetal
Folhas de L. venustum foram coletadas no município de Crato, estado do Ceará, Brasil.
A planta foi identificada pelo dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva e depositada no Herbário
Caririense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade regional do Cariri – URCA, sob o
número 5569 HCDAL.
Preparação do Extrato Etanólico das Folhas de L. venustum (EEFLV)
As folhas foram parcialmente trituradas e 211,18g da massa foliar foi submersa em
etanol a 92% por um período de 72 horas. O extrato foi filtrado e em seguida concentrado em
109
rotaevaporador (Q-344B – Quimis – Brasil) e banho-maria (Q-214M2 – Quimis – Brasil),
obtendo-se um rendimento de 49,2%. O fracionamento foi realizado tomando-se metade do
extrato bruto, seguindo a escala de polaridade, sendo obtidas as frações hexânica,
diclorometano e metanólica com rendimento de 0,22g, 0,38g e 3g, respectivamente .
Material fúngico e bacteriano
As bactérias utilizadas no teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram as
linhagens padrões de E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC
15442 e K. pneumoniae ATCC 4362. Nos ensaios com fungos foram testadas as linhagens
padrões de Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 2538, C. tropicalis ATCC
40042. Todas as linhagens foram obtidas do Laboratório de Micologia Clínica da
Universidade Federal da Paraíba. Para o teste de modulação foram usadas as linhagens
bacterianas multirresistentes de isolados clínicos P. aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358
com perfil de resistência apresentado na tabela 1 e as mesmas linhagens fúngicas utilizadas no
teste de CIM .
Drogas
As drogas utilizadas nos testes foram os aminoglicosídeos canamicina, amicacina,
neomicina e gentamicina e os antifúngicos mebendazol, anfotericina B, neomicina e
benzoilmetronidazol (Sigma Co., St. Louis, USA), a uma concentração inicial de 5.000µg/mL
e 1024µg/mL, respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água esterilizada.
Concentração Inibitória Mínima
O método utilizado foi o da microdiluição em caldo. Para se chegar à concentração de
1024µg/mL a ser utilizada nos testes, obteve-se inicialmente uma concentração de 200mg/mL
do extrato etanólico de L. venustum em 1mL de dimetilsulfóxido (DMSO), que em seguida foi
diluída em água destilada. O inóculo foi diluído em BHI 10% chegando-se a uma
concentração de 105 UFC/mL. Foram distribuídos 100µL do BHI e inóculo em cada poço de
uma placa de 96 poços e em seguida procedeu-se a microdiluição seriada com a solução de
100µL do extrato, variando nas concentrações de 512 a 8µg/mL. As placas foram levadas à
incubadora por 24 horas a 35º (Javadpour et al. 1996). A revelação da CIM bacteriana foi
110
feita utilizando-se a resazurina, enquanto para os fungos foi observado a turbidez provocada
pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum
crescimento foi observado de acordo com a NCCLS (2008).
Teste de Modulação de Drogas
Para verificar se o extrato modificaria a ação dos antibióticos frente às cepas testadas,
utilizou-se o método proposto por Coutinho et al. (2008), onde a solução do extrato foi
testada em concentração sub-inibitória (CIM/8) de 128µg/mL. Foram distribuídos 100µL de
uma solução contendo BHI, inóculo e extrato em cada poço no sentido alfabético da placa.
Em seguida, 100µL da droga foi misturado ao primeiro poço, procedendo-se a microdiluição
em série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de
aminoglicosídeos e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44µg/mL e 1024 a
8µg/mL, respectivamente.
RESULTADOS
Nos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM), realizados contra as linhagens
de Candida, nenhuma das frações testadas apresentou atividade de relevância clínica, sendo
todos os resultados ≥ 1024 μg/ml. Quanto ao teste de modulação, nenhuma alteração do CIM
foi verificada quando as frações foram associadas aos antifúngicos.
No teste de MIC com cepas bacterianas, todas as frações apresentaram crescimento ≥
1024 μg/ml. Contudo, na avaliação da atividade moduladora de antibióticos, a fração hexânica
associada à amicacina diminuiu dois pontos de CIM para a cepa E. coli 27, e sete pontos de
CIM para a gentamicina frente à mesma cepa. A fração diclorometano também reduziu
drasticamente o CIM de gentamicina frente à cepa E. coli 27. Todas as frações mostraram
uma diminuição da CIM para gentamicina frente às cepas E. coli 27 e S. aureus 358, os
resultados são mostrados na tabela 2. Nos testes usando o isolado clínico S. aureus 358, todas
as frações mostraram atividade quando associadas à canamicina e gentamicina, com redução
do MIC em dois pontos, os resultados podem ser visualizados na tabela 2. Nenhuma das
frações testadas mostrou efeito quando associadas aos aminoglicosídeos frente à cepa P.
aeruginosa 03.
111
DISCUSSÃO
A atividade antibacteriana dos extratos metanólico e aquoso de L. venustum foram
ensaiados frente a linhagens de E. coli (Alanis et al. 2005), porém os extratos não foram
considerados eficientes inibidores do crescimento bacteriano, uma vez que apresentaram
percentuais de inibição abaixo de 50%, além disso, a atividade do extrato foi apresentada
diante de uma concentração considerada muito elevada para aplicação clínica (Hougnton et al.
2007).
O extrato metanólico de outra planta do gênero, Lygodium japonicum, foi testado
contra linhagens de P. aeruginosa, S. aureus, E. coli e C. albicans no método de difusão em
disco, porém nenhuma atividade nas concentrações testadas foi apresentada (Taylor et al.
1995). No entanto, a metodologia utilizada apresenta desvantagens, pois é impossível medir a
quantidade de substância que se difundiu no Agar (Greger & Hadacek 2000).
Os nossos resultados permitiram perceber uma diferença de susceptibilidade entre as
bactérias Gram-positiva S. aureus e Gram-negativa E. coli, em relação às frações testadas. A
membrana externa das bactérias Gram-negativas apresenta uma barreira resistente à
penetração de vários agentes microbianos e estas possuem também um espaço periplasmático
com enzimas capazes de inativar alguns antibióticos (Vermelho et al. 2007), podendo esta ser
a explicação pela diferença na vulnerabilidade dos microrganismos.
Ao analisar o efeito potencializador de antimicrobianos pelas frações de L. venustum,
ficou evidente que as bactérias apresentaram maior susceptibilidade ao produto natural que os
fungos, isto talvez se justifique pela maior complexidade das células eucarióticas. Resultados
semelhantes aos nossos já foram evidenciados em outros trabalhos, apesar de outras
metodologias terem sido utilizadas (Khan et al. 2004, Al-Burtamani et al.2005).
A atuação de diferentes produtos naturais potencializando o efeito de antibióticos
frente a bactérias multirresistentes tem sido demonstrado em vários estudos (Coutinho et al
2009abcd, 2010abc). Esta estratégia é chamada “herbal shotgum” ou “synergistic multi-effect
targeting” e se refere à utilização de plantas e drogas em uma abordagem usando mono ou
multi extratos combinados afetando diversos alvos do microorganismo ao mesmo tempo, com
componentes terapêuticos colaborando de forma sinérgica-agonista. Isto tem sido
demonstrado não apenas a partir da combinação de extratos, mas também de produtos naturais
ou extratos e produtos sintéticos ou antibióticos (Coutinho 2008, Wagner 2009).
Este é o primeiro relato de atividade moduladora de antibióticos por frações obtidas do
extrato de uma planta da família Lygodiaceae. Nossos resultados indicam que L. venustum
112
poderia ser uma fonte de produtos naturais com atividade modificadora de antibióticos. Dessa
forma, devido a resultados tão relevantes novos ensaios de toxicidade devem ser realizados na
tentativa de desenvolver novas alternativas terapêuticas para o tratamento de doenças
infecciosas causadas por bactérias.
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Tabela 1 Perfil de resistência das bactérias a antibióticos
Bactéria
Escherichia coli 27
Origem
Ferida cirúrgica
Perfil de resistência
Ast,Amx,Ami,Amox,Ca,Cfc,Cf,
Caz,Cip,Clo,Im,Can,Szt,Tet,Tob
Ferida cirúrgica
Oxa,Gen,Tob,Ami,Can,Neo,Para,
But,Sis,Net
Urocultura
Cpm,Ctz,Imi,Cip,Ptz,Lev,Mer,Ami
Ast-Aztreonan; Amx- Amoxacilina; Amp-Ampicilina; Ami-Amicilina; Amox-Amoxilina, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cefalotina; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-Clorafenicol; Imi-Imipenem; CanCanamicina; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetraciclina; Tob-Tobramicina; Oxa-Oxacilina; Gen-Gentamicina; NeoNeomicina; Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicina; Net-Netilmicina; Com-Cfepime; CtzCeftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem.
115
Tabela 2. Atividade moduladora da ação de antibióticos por frações de Lygodium venustum.
Concentração subinibitória (CIM/8µg/mL).
Antib.
Escherichia coli 27
Ab.
Ab. +
Ab. +
Ab. +
Ab.
Ab.
Isol.
FHLV
FDLV
FMLV
Isol.
FHLV
Can
156,25
156,25
156,25
156,25
Neo
156,25
156,25
156,25
Ami
312,5
78,125
Gen
1250
9,76
+ Ab.
+ Ab +
FDLV
FMLV
156,25 39,06
39,06
39,06
156,25
39,06
9,76
39,06
312,5
312,5
78,125 78,125
78,125
78,125
9,76
39,06
19,53
2,44
2,44
9,76
2,44
Ab.: antibiótico; Ab. Isol.: antibiótico isolado; Can: canamicina; Neo: neomicina; Ami: amicacina; Gen:
gentamicina; FHLV: Fração hexânica de L. venustum; FDLV: Fração diclorometano de L. venustum; FMLV:
Fração metanólica de L. venustum.
116
O artigo foi submetido na Revista Brasileira de Biociências. Após avaliação, foram
sugeridas alterações para que pudesse ser aceito para publicação. Dessa forma, serão feitas as
modificações propostas e o artigo será resubmetido.
Em 6 de fevereiro de 2012 10:32, Patrícia Valente <[email protected]> escreveu:
Prezado Dr. Coutinho,
O artigo intitulado "Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de
frações obtidas de Lygodium venustum SW." foi avaliado por dois
especialistas na área, que mencionaram que o artigo necessita várias
alterações para publicação. Portanto, infelizmente, ele não poderá ser
aceito na atual forma para publicação na Revista Brasileira de
Biociências. Caso se interessem, fiquem à vontade para submetê-lo
novamente após as alterações.
Atenciosamente,
Patricia Valente
Editora Assistente
117
5.6 AVALIAÇÃO DA CITOTOCIXIDADE E ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DE
Lygodium venustum SW. CONTRA Trypanosoma cruzi E Leishmania brasiliensis
RESUMO
Doenças parasitárias infecciosas como leishmaniose e doença de Chagas tem se difundido nas
últimas décadas a locais onde antes não se observava sua ocorrência. São consideradas
negligenciadas por assolarem países pobres e serem marginalizadas farmacologicamente. O
tratamento não apresenta muitas opções de fármacos e estes demonstram relevante toxicidade
contribuindo para o aparecimento de diversos efeitos colaterais. A pesquisa com produtos
naturais tem se mostrado uma interessante alternativa para a procura por novos fármacos.
Lygodium venustum é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente encontrada na
encosta na Chapada do Araripe, considerada por algumas populações americanas como planta
medicinal para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases. Neste estudo
foi avaliada sua atividade antiparasitária contra Leishmania brasiliensis e Trypanosoma cruzi,
bem como sua citotoxicidade através de ensaios in vitro. Foram testadas a fração hexânica e o
extrato etanólico obtido das folhas de Lygodium venustum em diferentes concentrações. Para
os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 e para Leishmania brasiliensis foram
utilizadas formas promastigotas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com linhagens de
fibroblastos. L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na
forma de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração
hexânica apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de
efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica.
Entretanto, a citoxicicidade apresentada poderá ser útil em pesquisas sobre atividade
antineoplásica em células tumorais.
Palavras-chave: Lygodium venustum, atividade antiparasitária, citotoxicidade, extrato, fração
hexânica.
118
Avaliação da citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW. contra
Trypanosoma cruzi e Leishmania brasiliensis
[Evaluation of citotocixity and antiparasitic activity of Lygodium venustum SW against
Trypanosoma cruzi and Leishmania brasisliensis]
Maria F.B. MORAIS-BRAGA1*, Teógenes M. SOUZA1, Karla K.A. SANTOS1, Jaqueline C.
ANDRADE1, Glaucia M.M. GUEDES1, Saulo R. TINTINO1, Celestina E.S. SOUZA1,
Celeste VEGA4, Miriam ROLÓN4, Antonieta R. ARIAS4 José G.M. COSTA2, Antonio A.F.
SARAIVA3; Henrique D.M. COUTINHO1,
1
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, 2Laboratório de Pesquisa em Produtos
Naturais, 3Laboratório de Paleontologia da Universidade Regional do Cariri, Crato, Brasil.
4
Centre for the Development of Scientific la Investigación (CEDIC), Fundación Moisés
Bertoni/Laboratorios Diaz Gill. Asuncion-Paraguay
Título resumido: Atividade antiparasitária e citotoxicidade de Lygoudium venustum
*Autor para correspondência:
Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail:
[email protected]
119
ABSTRACT
Infectious and parasitic diseases like leishmaniasis and Chagas disease have spreading recent
decades to places where there were not observed their occurrence before. They are considered
neglected by desolating poor countries and marginalized pharmacologically. There are not
many options for the treatment and these drugs have shown significant toxicity contributing to
the appearance of several side effects. Research on natural products has been shown to be an
interesting alternative to the search for new drugs. Lygodium venustum is a cosmopolitan fern
with latescence habit foundon the Chapada do Araripe, considered by some American
populations as a medicinal plant for the treatment of skin diseases, infections, fungal
infections and trichomoniasis. This study evaluated its antiparasitic activity against
Trypanosoma cruzi and Leishmania brasiliensis, as well as its cytotoxicity through trials in
vitro. We tested the ethanolic extract and hexane fraction obtained from the leaves of L.
venustum at different concentrations. For in vitro tests of T. cruzi, we used the clone CL-B5
and for L. brasiliensis we used promastigotes. The cytotoxicity assay was performed with
strains of fibroblasts. L.venustums howed no antiparasitic activity clinically relevant in the
form of crude ethanolic extractor as the hexane fraction against Leishmania. The hexane
fraction showed an intermediate activity against T.cruzi, but the concentration of moderate
effect has maximum cytotoxicity becoming unfeasible for clinical application. However, the
cytotoxicity presented may be useful in research on antineoplastic activity in tumor cells.
Keywords: Fern; leishmanicidal activity; trypanocidal activity; extract; hexane fraction.
INTRODUÇÃO
Doenças infecciosas que acometem primordialmente os países em desenvolvimento
tem sido a causa de morte de milhões de pessoas em todo o mundo. Estas doenças são
negligenciadas e têm afligido a humanidade há muitos anos, afetando principalmente
comunidades marginalizadas, sem influência política, em áreas remotas, zonas de conflitos ou
favelas urbanas onde há pouco ou nenhum acesso à saúde ou outros serviços. A alta
morbidade das doenças afeta a freqüência escolar, o desenvolvimento cognitivo, o
120
crescimento e a produtividade em geral (WHO, 2003). Entre as doenças consideradas
negligenciadas podemos citar a Doença de Chagas e Leishmaniose.
Ações vêm sendo realizadas no sentido de estabelecer metas por tempo limitado para o
controle de algumas destas doenças mesmo diante de dificuldades como recursos financeiros
limitados, falta de pessoal treinado e fraqueza ou carência de infra-estruturas de saúde para
alcançar as populações afetadas (WHO, 2003). Além das dificuldades impostas por estas
situações, ainda há uma grande desafio que é chamar a atenção da indústria farmacêutica,
diante do reduzido potencial de retorno lucrativo. Dessa forma, o conhecimento produzido
pelas pesquisas não se reverte em avanços terapêuticos, como, por exemplo, novos fármacos,
métodos diagnósticos e vacinas (Brasil MS, 2010). Portanto, além de estigmatizadas
socialmente, as pessoas afetadas por estas doenças se vêem também marginalizadas
farmacologicamente.
A leishmaniose é uma doença prevalente em 88 países, em 4 continentes, estimando-se
que cause 1,6 milhões de novos casos anualmente, dos quais cerca de 500.000 sejam visceral
e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea (WHO, 2010). Os agentes causadores dessa doença
são parasitas unicelulares heteroxênicos do gênero Leishmania que apresentam duas formas
morfológicas no seu ciclo de vida: promastigota, quando estão infectando o inseto vetor e
amastigota quando estão infectando o homem (Michalick, 2005; Magill, 1995).
Apresenta diversos tipos de manifestações clínicas e se dividem em dois grupos
principais: a forma tegumentar, que pode ser cutânea localizada, que se caracteriza por lesões
únicas ou múltiplas na pele, geralmente no rosto, braços e pernas; cutânea difusa, com lesões
nodulares persistentes, no corpo inteiro; e mucocutânea ou cutâneo mucosa, que afeta de
maneira preponderante as mucosas da face, como fossas nasais e o palato; e as formas
viscerais, que se caracteriza pelo aumento no volume do fígado e baço, anemia, perda de peso
e febre, e que, se não tratada a tempo, pode ser fatal (Hepburn, 2000; Herwaldt, 1999;
Grevelink and Lerner,1996).
Apesar de sua alta toxicidade, os antimoniais pentavalentes têm sido utilizados como
drogas de primeira escolha para tratamento da Leishmaniose. A anfotericina B lipossomal,
pentamidina, paramomicina e miltefosine são drogas de interesse por representarem novas
alternativas terapêuticas, porém apresentam grandes problemas como efeitos colaterais, preço
do produto e produção da formulação (Pereira et al., 2011) . A Organização Mundial de Saúde
(WHO, 2010) recomenda que a leishmaniose visceral – que tem potencial de desenvolver
resistência a drogas – seja tratada com combinação de medicamentos ao invés de
121
monoterapia. Porém, desde 2009 foi recomendado que anfotericina B lipossomal seja
utilizada como estratégia provisória até que as combinações possam ser implementadas.
A doença de Chagas é uma zoonose causada por Trypanosoma cruzi, que continua a
persistir na Região das Américas, entretanto com a introdução de medidas de controle de
vetores e transfusão de sangue mais segura, diminuiu-se o risco de transmissão e com isto, o
número estimado de pessoas infectadas caiu de aproximadamente 20 milhões em 1981 para
cerca de 10 milhões em 2009. Porém, devido à mobilidade da população ser cada vez maior,
tem ocorrido o movimento da doença para áreas antes consideradas não-endêmicas,
representando um desafio sério de saúde pública (WHO, 2010).
As formas de transmissão de maior importância epidemiológica são a vetorial através
de insetos hematófagos, os triatomíneos (barbeiros), a transfusional, a congênita e a oral
(Coura et al., 2007). O T. cruzi possui um ciclo biológico complexo, envolvendo três formas
evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e várias espécies de triatomíneos e de
mamíferos, silvestres e domésticos, que atuam respectivamente, como vetores e reservatórios
do parasito (Lana and Tafuri, 2005).
As doenças endêmicas parasitárias representam um grave problema médico, social e
humano e sua prevenção, controle e tratamento representam um grande desafio mundial (Dias
et. al., 2009). Atualmente, os dois medicamentos usados para o tratamento são benzonidazol e
nifurtimox, sendo que este último é contra-indicado em pacientes com antecedentes
psiquiátricos ou distúrbios neurológicos (WHO, 2010), tendo sido abolido em alguns países.
Portanto, pesquisas por novos fármacos antiparasitários para o combate da leishmaniose e da
doença de Chagas são urgentes e necessárias.
Neste trabalho, iremos verificar o potencial leishmanicida e tripanocida, bem como a
citotoxicidade de uma samambaia lianescente, Lygodium venustum, cujo uso popular tem sido
relatado para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases (Duke, 2008).
MATERIAIS E MÉTODOS
Material vegetal
Folhas de L. venustum foram coletadas em Crato, estado do Ceará, Brasil em maio de
2010. O material vegetal foi identificado pelo Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva e
depositado no Herbário Cariense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade Regional do
Cariri URCA, com o número 5569 HCDAL.
122
Preparação do Extrato Etanólico e Fração Hexânica das folhas de L. venustum.
Folhas frescas de L. venustum (211,18g) foram submersas em etanol 92% em
temperatura ambiente durante 72h. O extrato obtido foi filtrado e concentrado à vácuo em
rotaevaporador a 60ºC e 760mm/Hg de temperatura e pressão, respectivamente, obtendo-se
12,42g de extrato bruto. O fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto,
obtendo-se a fração hexânica com rendimento de 0,22g. Foram diluídos 0,01mg do extrato e
da fração em dimetilsulfóxido (DMSO) para realização dos testes.
Linhagens celulares utilizadas
Para estudos in vitro de T. cruzi, cepas de parasito CL-B5 (clone CL-B5) foram
usados. Os parasitos estavelmente transfectados com o gene β -galactosidase de Escherichia
coli (LacZ ) foram cedidos pelo Dr. F. Buckner por meio do Instituto Comemorativo Gorgas
(Panamá). Os epimastigotas foram cultivados a 28°C em infusão de fígado triptose (LIT) com
10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina e estreptomicina como descrito anteriormente e
colhidas durante a fase de crescimento exponencial.
Para o estudo da atividade leishmanicida in vitro, foi utilizado formas promastigotas
de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) a 26°C em Schneider’s (meio para inseto)
suplementado à 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor, 2% de urina humana
normal (v/v) mais penicilina e estreptomicina.
A linhagem de celulas utilizada no teste de citotoxicidade foi a de fibroblastos de
mamífero NCTC clone 929. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma)
suplementado a 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (30 minutos a 56 º C),
penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). Para os experimentos, as células na
fase pré-confluência foram colhidas com tripsina. Culturas de células foram mantidas a 37 º C
em uma atmosfera de 5% umidificado CO2.
Ensaio de susceptibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi
O ensaio de rastreamento foi realizado em placas de microdiluição de 96 poços
(Sarstedt, Inc.) com culturas que não atingiram a fase estacionária, como descrito por Vega e
colaboradores (2005). Epimastigotas foram semeadas a 1 x 105 por mililitro em 200 μl, as
123
placas foram então incubadas com os extratos a 28°C por 72 horas, momento em que 50 μl de
solução CPRG foram adicionados para dar a concentração final de 200 μM, as placas foram
incubadas a 37°C por mais 6 h adicionais e então lidas a 595 nm em espectrofotômetro. O
Nifurtimox foi utilizado como droga de referência. Cada concentração foi testada em
triplicata. Cada experimento foi realizado duas vezes separadamente. O percentual de inibição
(%AE) foi calculado como segue: %AE = [(AE _AEB)/(AC _ACB)] x 100, onde AE =
absorbância do grupo experimental; AEB = branco de compostos; AC = grupo controle de
absorbância; ACB = branco de meio de cultura. As soluções dos extratos a ser analisado
foram preparados em dimetilsufóxido, com a concentração final uma mistura água/DMSO
jamais excedendo 0.2% do solvente final.
Ensaio de suscetibilidade para formas promastigotas de Leishmania brasiliensis
O ensaio foi realizado seguindo um método anteriormente descrito (Mikus and
Steverding , 2000) com modificações. Formas promastigotas (2.5 x 105 parasitas/poço) foram
cultivadas em placas de 96 poços de plástico. As amostras foram dissolvidas em
dimetilsufóxido (DMSO). Diferentes diluições dos compostos de até 200 mL de volume final
são adicionados. Após 48 h a 26 °C, 20 mL de solução de resazurina foi adicionado e a
oxidação-redução foi quantificada a 570 a 595 nm Cada concentração foi testada em
triplicata. Em cada ensaio foi utilizado como controle drogas de referência. As porcentagens
antipromastigotas (%AP) formam calculadas. A eficácia de cada composto foi determinada.
Ensaio de citotoxicidade
O procedimento para a medição de viabilidade celular foi avaliada com resarzurina por
método colorimétrico descrito anteriormente (Rólon et al., 2006). Fibroblastos NCTC929
foram semeados (5 x 104 células/ poço) em placas de microdiluição de fundo chato de 96
poços com 100 μl de meio RPMI 1640. Deixou-se que as células pavimentassem as placas por
24h a 37oC e atmosfera de 5% de CO2. O meio foi substituído por diferentes concentrações
das drogas em 200 μl de meio e, em seguida, foram incubados por mais 24h. Controles de
crescimento também foram incluídos. Posteriormente, um volume de 20 μl da solução 2mM
de resazurina foi adicionado e as placas foram devolvidas à incubadora por outras 3h para
avaliar a viabilidade celular. A redução da resazurina foi determinada por medida de
absorbância do comprimento de onda a 490nm e 595nm. Cada concentração foi testada três
124
vezes. Meio e drogas controle foram 32 usados em cada teste como brancos. A citotoxicidade
de cada composto foi estimada através do cálculo do percentual de citotoxicidade (C%).
A atividade tripanocida e a citotoxicidade foram testadas paralelamente, enquanto que
a atividade leishmanicida foi testada somente nas concentrações em que não foram tóxicas às
células de mamíferos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo foram avaliadas a citotoxicidade de Lygodium venustum utilizando
fibroblastos de mamíferos e a bioatividade antiparasitária contra as formas epimastigota de T.
cruzi e promastigota de L. brasiliensis.
A forma epimastigota de T. cruzi apresenta-se de forma alongada, com cinetoplasto
justanuclear e anterior ao núcleo e flagelo livre na porção anterior. Podemos identificá-la
como sendo a forma de replicação que se observa no hospedeiro invertebrado (triatomíneo)
localizada na porção posterior do intestino e em cultura em meio líquido (Chagas, 1909; Rey,
2001; Lana and Tafuri, 2005;). A forma promastigota de Leishmania possui flagelo único,
núcleo no terço médio da célula e cinetoplasto em posição anterior. Estas formas presentes no
hospedeiro invertebrado são englobadas por macrófagos de hospedeiros vertebrados
(Michalick, 2005).
De acordo com Castilhos (2008), estudos envolvendo Leishmania spp apresentam o
foco na forma extracelular do parasito, conhecido como promastigota, ao invés da forma
amastigota, devido à facilidade de cultura in vitro e de não envolver outra cultura de células
de células como macrófagos, por exemplo. Dessa forma, entende-se que o mesmo se pode
dizer do T. cruzi e a forma epimastigota, ensaiada nesta pesquisa.
Fibroblastos são células encontradas no tecido conjuntivo de mamíferos. Estas células
têm sido geralmente escolhidas para realização de testes de citotoxicidade porque são de fácil
manutenção e produzem resultados que apresentam alta correlação com os biológicos e ainda
por estarem presentes em ferimentos, sendo o principal tipo de célula presente na regeneração
(Ratner et al., 2004).
Os testes de toxicidade são elaborados com os objetivos de avaliar ou prever os efeitos
tóxicos nos sistemas biológicos e dimensionar a toxicidade relativa das substâncias (Forbes
and Forbes, 1994), nesse sentido, os resultados podem fornecer informações valiosas para a
triagem de produtos naturais que apresentem condições de serem considerados como
prováveis candidatos a fármacos.
125
Leishmaniose e doença de Chagas são doenças cujo tratamento é feito com
medicamentos considerados tóxicos, além disso, este tratamento tem sido dificultado pelo
desenvolvimento da resistência pelos parasitos. A quimioresistência está muito presente em
alguns países onde o fármaco não é mais utilizado com eficiência e novos estudos tiveram que
ser conduzidos para o entendimento dos mecanismos de ação e compreensão da
quimioresistência (Boibessot et al., 2002). Em busca de novos fármacos, pesquisas de
produtos naturais com bioatividade antiparasitária e ausência ou uma baixa citotoxicidade
vem sendo realizadas (Rojas et al., 2010; Mesquita et al., 2005; Luize, et al., 2005).
Nos testes realizados, a citotoxicidade e a atividade tripanocida foram realizadas
concomitantemente, observando-se o efeito do produto natural na medida em que se diminuía
a sua toxicidade em fibroblastos (tabela 1). De uma maneira geral, tanto o extrato como a
fração foram extremamente tóxicos na concentração mais elevada do produto (1000µg/mL),
sendo que a fração hexânica continuou demonstrando toxicidade máxima até a concentração
de 250µg/mL. Na concentração em que não houve citotoxicidade, o efeito antiepimastigota
foi irrelevante. O extrato demonstrou mesma toxicidade que a fração na concentração de
500µg/mL e em ambos, o efeito sobre formas epimastigotas foi abaixo de 50%.
Diante dos resultados da citotoxicidade é que foram realizados os testes de
suscetibilidade para a forma promastigota. Nenhuma atividade foi demonstrada pelo extrato e
a fração hexânica demonstrou um efeito extremamente baixo (tabela 2).
Segundo hipóteses mais recentes, metabólitos secundários de plantas seriam formados
com a função de defender a espécie de predadores. Por isso, não é surpreendente que muitas
plantas acumulem substâncias de elevada toxicidade. As substâncias tóxicas em uma planta
podem estar limitadas a uma estação do ano ou a certas condições ambientais, ou ainda a
certas variedades ou cultivares (Simões et al., 2010). Estudos mostram que o mecanismo de
ação da citotoxicidade está relacionado à capacidade destas plantas de induzir apoptopse
celular (Block et al., 2004).
Este foi o primeiro relato sobre a citotoxicidade da samambaia Lygodium venustum. A
avaliação de sua bioatividade antiparasitária contra T. cruzi e L. brasiliensis também é
pioneira na família Lygodiaceae.
CONCLUSÕES
L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma
de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração hexânica
126
apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de efeito
moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica. Os
compostos químicos presentes no produto natural foram incapazes de afetar as formas de
protozoários em concentrações de baixa toxicidade. Portanto, para o caso do T. cruzi, as
concentrações em que demonstraram atividade moderada foram tóxicas sobre as células
fibroblásticas e para o caso da L. brasiliensis os produtos naturais não foram ativos nas
concentrações não tóxicas. Entretanto, a citotoxicicidade apresentada poderá ser útil em
pesquisas sobre atividade antineoplásica em células tumorais, pois a planta pode ser
potencialmente
considerada
como
fonte
promissora
de
metabólitos
secundários
anticancerígenos.
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Tabela 1: Citotoxicidade e atividade antiepimastigota de extrato e fração de Lygodium
venustum.
Produto natural Conc. µg/mL %C
± %DS
Conc.(µg/mL) %AE
± %DS
EELV
FHLV
1000
100
0,04
1000
25,45
2,98
500
100
14,88
500
33,94
11,88
1000
100
1,78
1000
63,14
2,93
500
100
11,19
500
42,04
8,05
250
100
10,84
62,5
5,01
9,05
125
74,1
2,94
31,25
5,72
5,68
62,5
0
4,66
15,62
2,87
3,71
Conc.: concentração; EELV: Extrato etanólico de Lygodium venustum; FHLV: Fração hexânica de L. venustum;
%C: percentual de citotoxicidade; %AE: percentual de atividade antiepimastigota; ± %DS: Desvio Padrão.
Tabela 2: Atividade antipromastigota de extrato e fração de Lygodium venustum.
Produto natural
Conc. µg/Ml
%AP
± %DS
EELV
500
0,00
0,65
FHLV
62,5
2,61
1,86
Conc.: concentração; EELV: Extrato etanólico de Lygodium venustum; FHLV: Fração hexânica de L. venustum;
%AP percentual de atividade antipromastigot
129
O artigo foi submetido ao Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas
Medicinales y Aromaticas, tendo sido rejeitado. Após a alterações propostas pelos revisores
deverá ser ressubmetido.
---------- Forwarded message ---------From: Jose Luis Martinez <[email protected]>
Date: 2012/1/31
Subject: Desde BLACPMA
To: Henrique DM Coutinho <[email protected]>
Estimado Dr. Coutinho:
Adjunto encontrara las pautas de evaluación de su articulo BLACPMA Nº 447. Debido a los
fundamentos dados por los dos evaluadores, queda RECHAZADO.
Si usted hace las correcciones dados por ambos evaluadores y decide nuevamente enviarlo,
este articulo ingresara como articulo nuevo, volviendo a ser evaluado.
Lamentando esta noticia, le saluda
Jose Luis Martinez
Editor Jefe
130
5.7 ANTI-LEISHMANIA, ANTI- TRYPANOSOMA AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF
NATURAL PRODUCTS FROM Lygodium venustum SW. (LYGODIACEAE)
RESUMO
A busca por novos agentes terapêuticos tem sido uma constante para o tratamento de doenças
como leishmaniose e doença de Chagas. A grande maioria dos fármacos utilizados tem
causado efeitos colaterais múltiplos e relevantes, justificando-se a necessidade da avaliação da
citotoxicidade dos produtos testados, candidatos a novos fármacos. Neste estudo sobre
bioatividade de Lygodium venustum, uma samambaia cosmopolita da família Lygodiaceae,
avaliou-se o seu potencial leishmanicida e tripanocida, obtendo-se comparativamente,
melhores resultados contra as formas epimastigotas. A fração que apresentou melhor
atividade foi a metanólica, com percentual de inibição de 63% e 68% para as formas
epimastigotas e promastigotas respectivamente, na concentração de 500µg/mL. A
citotoxidade apresentou percentual relevante para as frações acetato de etila e metanólica.
Este foi o primeiro relato da atividade leishmanicida, tripanocida e citotóxica de uma
pteridófita da família Lygodiaceae.
Palavras-chave: Lygodium venustum, atividade leishmanicida, atividade tripanocida,
citotoxicidade.
131
Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of natural products from
Lygodium venustum SW. (Lygodiaceae)
Maria F. B. Morais-Braga1, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Gláucia M. M.
Guedes1, Jaqueline C. Andrade 1, Celeste Vega4, Miriam Rolón4, Antonieta R. Arias4, José G.
M. Costa2, Antonio A. F. Saraiva3, Henrique D. M. Coutinho1*
1
Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, 2 Laboratory of Natural Products Research, 3 Laboratory of
Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil, 4Centre for the Development of Scientific la
Investigación (CEDIC), Fundación Moisés Bertoni/Laboratorios Diaz Gill. Asuncion-Paraguay.
Henrique D. M. Coutinho.
Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE,
Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax
+55(88) 31021291. E-mail: [email protected]
132
ABSTRACT
The search for new therapeutic agents has been a constant for the treatment of diseases such
as leishmaniasis and Chagas disease. Most drugs used have side effects, justifying the need to
evaluate the cytotoxicity of the tested products for candidates to new drugs. In this study, the
bioactivity of Lygodium venustum, a cosmopolitan fern of Lygodiaceae, was assessed about
their leishmanicidal and trypanocidal potential. The better activity was observed using
methanol fraction, with inhibition percentage of 63 and 68% for promastigotes and
epimastigotes, respectively, at a concentration of 500μg/mL. The ethyl acetate and methanol
fractions demonstrated a higher cytotoxic potential. This was the first report of
leishmanicidal, trypanocidal and cytotoxic activities to L. venustum.
Keywords: Lygodium venustum, leishmanicidal activity, trypanocidal activity, cytotoxicity.
INTRODUCTION
The Leishmaniasis is a polymorphic group of diseases caused by protozoan parasites
of the genus Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae), which are transmitted to
humans and other mammals through the bite of the female insect Lutzomyia spp. The disease
has diverse clinical presentations and can affect the skin, mucous membranes and internal
organs. The parasite Leishmania brasiliensis is one of those responsible for the cutaneous
form (CL) and mucocutaneous (LMC) of the disease, being understood as American
Cutaneous Leishmaniasis (Genaro & Michalick, 2005; Genaro & Reis, 2005). For the
treatment of Leishmaniasis are used pentavalent antimonials, amphotericin B, pentamidine
and miltefosine, all demonstrating high toxicity, high cost and problems during the use, beside
the possibility to cause resistance of parasite (Rath et al., 2003; Croft & Coombs, 2003).
Chagas disease or American trypanosomiasis is a disease caused by Trypanosoma
cruzi, transmited by haematophagous insects from the genus Triatoma, (Reduviidae) (Lana &
Tafuri, 2005). Several tests were performed seeking a therapeutic solution against this
infectious disease. Benzonidazole and nifurtimox are the main compounds used as
antiparasitic drugs for American trypanosomiasis, bu these drugs are not consistently effective
and have serious side effects, including cardiac and renal toxicity (Veloso et al., 2001; Ruiz et
al., 2004).
133
Due the difficulty to discover drugs effective in the therapy and non toxic to humans,
natural products have been tested. Many species of plants has been investigated for their
antileishmanial and trypanocidal activities (Mesquita et al., 2005; Coro et al., 2005). Isolated
semi-synthetic or synthetic compounds are also studied to discover new therapeutic agents
against these diseases (Roldos et al., 2008; Saraiva, 2007; Moran, 1995).
Lygodium venustum (Lygodiaceae) is a fern with worldwide distribution and
lianescent habit (Mehltreter, 2006). This fern is used as a bioindicator of environmental
degradation and as a remedie in the folk medicine by south American populations (Duke,
2008; Argueta et al., 1994; Brasileiro et al., 2006).
The objective of this study was evaluate, through in vitro assays, the trypanocidal and
leishmanicidal and cytotoxic activity of ethanol extract and dichloromethane, ethyl acetate
and methanol fractions of leaves from L. venustum.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Leaves of L. venustum were collected in may 2010 in the city of Crato, Ceará State,
Brazil. The plant material was identified by Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva, and voucher
specimen have been deposited with the identification number 5569 HCDAL at the Herbarium
Caririense Dárdano de Andrade-Lima, of the University of the Region of Cariri – URCA.
Preparation of ethanol Extract (EELV) and dichloromethane, ethil acetate and methanol
fractions (DFLV, EAFLV, MFLV) of L. venustum
Leaves were collected and 211,18g were weightened, dried and keeped at room
temperature. These material was powdered and extracted by maceration using 1L of 95%
ethanol solvent at room temperature. The mixture was allowed to stand for 72h at room
temperature. The extract was filtered and concentrated under vacuum in rotary evaporator at
60ºC and 760mm/Hg temperature and pressure, respectively (Buckner et al., 1996), obtaining
12,42g of ethanol extract. Fractionation was performed using the ethanol extract, resulting in
the fractions used in the tests (dichloromethane, ethyl acetate and methanol to yield 0.39g,
0.52g and 3g respectively). The extract and fractions were diluted to 0.01mg each using
DMSO before the assays.
134
Cell strains used
For in vitro studies of T. cruzi, the clone CL-B5 was used (Le Senne et al., 2002). The
stably parasites was transfected with the Escherichia coli β-galactosidase gene (lacZ), were
kindly provided by Dr F. Buckner through Instituto Conmemorativo Gorgas (Panama).
Epimastigotes were grown at 28ºC in liver infusion tryptose broth (Difco, Detroit, MI) with
10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA), penicillin (Ern, S.A., Barcelona, Spain)
and streptomycin (Reig Jofré S.A., Barcelona, Spain), as described previously (Roldos et al.,
2008), and harvested during the exponential growth phase.
Culture of Leishmania was obtained from the Instituto de Investigaciones en Ciencias
de la Salud, Asunción, Paraguay - IICS. The maintenance of strain, the form of cultivation
and isolation shape promatigota followed the procedures described by Roldos et al. (2008).
The inhibition assays of promastigotes were performed using the strain of L. braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903), grown at 22ºC in Schneider's Drosophila medium supplemented
with 20% FBS.
The cytotoxicity assays used strain of fibroblasts NCTC929 grown in Minimal
Essential Medium (Sigma). The culture medium was supplemented with heat-inactivated FBS
(10%), penicillin G (100U/ml) and streptomycin (100mg/mL). Cultures were maintained at
37ºC in humid atmosphere with 5% CO2. The viability of these strains was assessed according
to Roldos, et al. (2008), through the use of resazurin as a colorimetric method.
Reagents
Resazurin sodium salt was obtained from Sigma-Aldrich (St Louis, MO) and stored at
4 °C protected from light. A solution of resazurin was prepared in 1% phosphate buffer, pH 7,
and filter sterilized prior to use. Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside (CPRG; Roche,
Indianapolis, IN) was dissolved in 0.9% Triton X- 100 (pH 7.4). Penicillin G (Ern, S.A.,
Barcelona, Spain), streptomycin (Reig Jofré S.A., Barcelona, Spain) and dimethylsulfate were
also used.
In vitro Epimastigote susceptibility assay
The screening assay was performed in 96-well microplates with cultures that had not
reached the stationary phase (Vega et al., 2005). Briefly, epimastigotes were seeded at 1 x 105
135
mL-1 in 200µL of liver tryptose broth medium. The plates were then incubated with the drugs
(0.1-50µg/mL) at 28°C for 72 h, at which time 50 µL of CPRG solution was added to give a
final concentration of 200µM. the plates were incubated at 37°C for an additional 6 h and
were then read at 595 nm. Each experiment was performed twice and independently, each
concentration was tested in triplicate in each experiment. The efficacy of each compound was
estimated by calculating the antiepimatigote percentual (AE%).
In vitro leishmanicidal assay
The assay was performed using a modification of a previous method. Cultures of
promastigotes of L. brasiliensis were grown to a concentration of 106 cells/mL and then
transferred to the test. The compounds were dissolved in DMSO to the concentrations to be
tested and were transferred to microplates. Each test was performed in triplicate. The activity
of compounds was evaluated after 72h bydirect counting of cells after serial dilutions and
compared with an untreated control.
Cytotoxicity assays
NCTC929 fibroblasts were plated in 96-well microplates at a final concentration of 3 x
4
10 cells/well. The cells were grown at 37ºC in an atmosphere of 5% CO2. After that, the
culture medium was removed and the compounds were added to 200µL, and performed a new
culture for 24h. After this incubation, 20µL of a 2mM solution of resazurin was added to each
well. The plates were incubated for 3 hours and the reduction of resazurin was measured
using dual absorbance at wavelengths of 490 and 595nm. The value of the control (blank) was
subtracted. Each concentration was tested in triplicate.
RESULTS AND DISCUSSION
Cytotoxic in vitro assay is the first test to evaluate the biocompatibility of any material
for use in biomedical devices (International Standard, 1992). In most cases, the results are not
extrapolated directly to the animals, because if a product causes damage to cells in vitro, may
also affect animals exposed (Carvalho, 1996).
136
The most widely used parameter to assess cytotoxic activity is the cell viability, which
can be detected by the use of dyes as neutral red, which allows the distinction between living
cells and damaged or dead (Ciapetti et al., 1996).
Different products has been tested to evaluate the cytotoxic potential, allowing the
possibility of discovering new drug candidates, whose side effects are lower. Among plants,
the angiosperms are the most studied. Different cells can be used in these assays, as
astrocytes, macrophages and human or murine fibroblasts, or brine shrimp as Artemia salina
(Martins et al., 2009; Nakamura et al., 2006; Hughes et al., 2006; Lima et al., 2009).
A qualitative chemical screening using the methodology de Matos (1997) showed that
the ethanol extract of L. venustum presents in its composition of secondary metabolites (data
not shown), such as flobabenic tannins, flavones, xanthones, chalcones, flavonoids, alkaloids
and flavonones and some of these compounds have already demonstrated antiparasitic
potential (Torres-Santos et al., 1999; Kam et al., 1999; Leite et al., 2010).
Dichloromethane Fraction did not show any activity against the parasites at a
concentration of 100μg/mL, but showed low activity when the concentration in creased to
500µg/mL (table 1). This fact suggest a dose-dependent effect, however, the required dose
would be clinically irrelevant. The cytotoxic test of this fraction indicates that polar
compounds extracted by the solvent did not cause high toxicity in fibroblasts in all tested
concentrations.
The ethyl acetate fraction had no effect on L. brasiliensis in the tested concentrations,
but inhibited 45% of the epimatigote forms in the both concentrations. The cytotoxic effect
increased with the concentration, killing 67% of fibroblasts in a concentration of 500µg/mL.
One of the main types of secondary metabolites prospected by ethyl acetate solvent are
flavonoids (Simões et al., 2010). In Argentina, flavonoids isolated from several plants were
tested against Leishmania and Trypanosoma, achieving significant results (Sülsen et al.,
2007). These results demonstrate that these metabolites could have significant potential
against these parasites. However, other compounds present in the ethyl acetate fraction may
have antagonist effect against the flavonoids of L. venustum, explaining the low activity in the
same concentrations to Leishmania.
The best results against the promastigote forms of L. brasiliensis and epimastigote T.
Cruzi were obtained from the methanol that showed antiparasitic activity of 68% and 63%
respectively at a concentration of 500µg/mL. However, this same concentration, the fraction
showed 53% cytotoxicity. The use of methanol permit the extraction of glycosides and
alkaloids (Simões et al., 2010). Studies have shown that these secondary metabolites showed
137
antiparasitic activity against Leishmania and Trypanosoma relevant (Bravo et al., 2001;
Batista et al., 2007; Fournet et al., 2007).
The analysis of biochemical factors involved in Leishmania- and Trypanosoma-host
interactions shows that these parasites have metabolic pathways similar to those found in host
cells. This condition makes the treatment of the diseases caused by these protozoa is difficult
(Soares-Bezerra et al., 2004). So, the research of new drugs with antiparasitic activity and low
toxicity is very important, mainly to be used as therapeutic alternatives against thes neglected
diseases.
Until this study, no species of the family Lygodiaceae had been tested against parasites
of the genus Leishmania and Trypanosoma, as well as never before had their cytotoxic effects
observed. So, this is the first report on bioactivity and cytotoxicity against parasites by a
species of this pteridophytes group. This fact indicates the necessity of study these plants as a
future source of natural products with antiparasitic and other activities.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to the Brazilian research agencies FUNCAP and CNPq.
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Table 1: In vitro activity of fractions of ethanol extract of leaves of Lygodium venustum
against Leishmania brasiliensis and Trypanosoma cruzi and cytotoxicity.
Fractions
Dichloromethane
Ethyl acetate
Methanol
Concentrations (µg/mL)
(%C)
Antiparasitic activity
(%EA)
(%PA)
500
0
34
6
100
0
0
0
500
67
45
0
100
30
45
0
500
53
63
68
100
0
28
31
%C: Percentage of dead fibroblasts; %EA: Percentage of dead epimastigotes of T. cruzi; %PA: Percentage of
dead promastigotes of L. braziliensis.
141
O artigo foi submetido ao Journal of Essential Oil Bearing Plants, que, após ser
revisado, retornou para alterações. O artigo deverá sofrer algumas modificações para em
seguida ser reencaminhado à citada revista.
---------- Forwarded message ---------From: arvinder bhalla <[email protected]>
Date: 2012/2/11
Subject: Re: informations about an article
To: Henrique Douglas Coutinho <[email protected]>
Dear Dr. HENRIQUE DOUGLAS MELO COUTINHO,
Your article entitle "Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of
natural products from Lygodium venustumSW. (Lygodiaceae)" has been reviewed. Some
comments are given by learned referee to improve the quality of your research (See attach
file).
When you submit your revised paper, please could you also enclose a covering letters in
which you indicate the actions that you have taken with respect to each of the point raised by
the referees.
Please send me revise manuscript at your earliest or within one week
best regards
Arvinder Singh Bhalla
Managing Editor
Journal of Essential Oil Bearing Plants (JEOBP)
7/1/2C, Prem Nagar
Dehradun - 248007
India
website : www.jeobp.com (J. Essential Oil Bearing Plants)
website : www.anachemletters.org (Analytical Chemistry Letters)New Publication
website : www.jbappn.com (J. Biologically Active Products from Nature)New Publication
Mobile : +91-9219506760
142
5.8
PTERIDÓFITAS
EM
EVIDÊNCIA:
ETNOBOTÂNICA
E
BIOATIVIDADES
FARMACOLÓGICAS
Maria Flaviana Bezerra Morais-Braga1, Teógenes Matias de Souza2, Irwin Rose Alencar de
Menezes2, José Galberto Martins da Costa2, João Batista Teixeira da Rocha4, Margareth Linde
Athayde3, Antonio Álamo Feitosa Saraiva1, Henrique Douglas Melo Coutinho2.
1
Departamento de Ciências Biológicas e
2
Departamento de Química Biológica da
Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil; 3Departamento de Farmácia Industrial e
Departamento de Química4 da Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil.
Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri –
URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone:
+55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected]
143
Pteridófitas em evidência: Etnobotânica e Bioatividades Farmacológicas
RESUMO
As pteridófitas são um dos grandes grupos de
vegetais vasculares existentes em diversos lugares do
planeta terra. Neste sentido, este capítulo discorrerá a
respeito de sua utilidade para o bem-estar e melhoria
da qualidade de vida das populações humanas.
Previamente, é necessário que este grupo de plantas
seja primeiramente apresentado e caracterizado para
facilitar o entendimento da relação entre as espécies
deste grupo e o homem. Em seguida, antes de
consignar diferentes relatos sobre bioatividades,
torna-se necessário destacar o uso medicinal de
plantas para a cura de diversos tipos de enfermidades,
através de abordagens etnobotânicas com expressões
do uso (partes da planta, espécies utilizadas e
serventia) em diferentes tipos de culturas. Dessa
forma, será possível deleitar-se com as diversas
potencialidades farmacológicas deste grupo que há
milhões de anos habita o planeta, confirmando o
conhecimento empírico e tradicional que expressa o
poder da medicina fitoterápica. Para enriquecer o
discurso sobre as potencialidades de pteridófitas, um
interessante estudo de caso será demonstrado sobre a
investigação
de
atividade
antioxidante
em
samambaias de diferentes famílias. Nesta abordagem
será
dado
ênfase
a
compostos
fenólicos,
fitoconstituíntes encontrados nas plantas, e sua interrelação com a capacidade de sequestrar radicais
livres.
144
1. INTRODUÇÃO
Pteridófitas são criptógamas vasculares e formam um grupo negligenciado rico em
biodiversidade. Seus valores alimentício e medicinal não são muito bem conhecidos pela
população mundial, embora sejam difundidos amplamente na literatura científica.
A utilização destas plantas como agente terapêutico por sociedades antigas e
contemporâneas, entre outras serventias, tem instigado a curiosidade em se conhecer um
pouco mais sobre a prática medicinal popular, comprovando este hábito com dados
cientificamente elucidados. Desta forma, as pteridófitas adquirem função de protagonistas na
história humana no que se refere à utilização de plantas sem prejuízos a saúde.
Relações entre pteridófitas e o homem tem sido registrada ao longo de muitos anos. O
uso das pteridófitas é relatado no sistema de medicina Ayurvedic elaborado por Sushruta (ca
100 AD) e Charka (ca 100 AD) que recomendava o uso de algumas samambaias em suas
Samhitas, a literatura médica tradicional.
Pammel [1] compilou um manual de plantas
venenosas do leste da América do Norte com breves citações sobre os valores medicinais e
econômicos de várias plantas, incluindo algumas pteridófitas. Samambaias também são
usadas pelos médicos no sistema de medicina Unani [2]. No sistema de medicina chinesa,
muitas samambaias são prescritas por médicos locais [3]. Mais tarde, modernos estudos
biológicos e farmacêuticos foram realizados em pteridófitas por diferentes pesquisadores.
Benerjee e Sem [4] conduziram uma extensiva pesquisa para a atividade antibiótica de
inúmeras samambaias, relatando sobre uma centena de espécies com tal propriedade. Dixit e
Vohra [5] reportaram que importantes espécies de pteridófitas da Índia são usadas na
alimentação e medicina popular. Kaushik [6] enfatizou a importância etnobotânica de
samambaias de Rajasthan, India. Estudos importantes sobre o valor alimentar e medicinal de
pteridófitas foram conduzidos por Nayar [7], Hodge [8], e Dixit [9]. Em 2004 Gosh et al. [10]
reportou o uso de pteridofitas como plantas alimentícias e medicinais.
O uso etnobotânico desse grupo é de imensa importância e isto é claramente
entendido por pesquisadores como substrato necessário para a descoberta de princípios ativos
capazes de promoverem o bem-estar e a saúde humana.
2. PTERIDÓFITAS: CARACTERIZAÇÃO E ASPECTOS ECOLÓGICOS
Pteridófitas são plantas vasculares sem flores e sementes, que se reproduzem por
esporos, cujo ciclo de vida heteromórfico é apresentado em duas fases, a gametofítica e a
145
esporofítica, compartilhando dessa forma uma alternância de gerações [11]. Por um longo
tempo, estas plantas foram tratadas como um único grupo sendo classificado como
pertencendo a uma divisão chamada pteridophyta [12], constituída por classes evolutivamente
distintas, formando um táxon parafilético [13,14].
A partir da década de 90, novos estudos envolvendo análises cladísticas com dados
morfológicos, ultraestrutura de gametas e análises de seqüências de DNA com uso de
marcadores moleculares de genes plastidiais, mitocondriais e nucleares culminaram com o
direcionamento das pteridófitas em duas linhagens monofiléticas distintas: as licófitas e as
monilófitas (samambaias) [14,15,16].
Na nova classificação, o termo “pteridófitas”, designado para representar um grupo
parafilético começa a cair em desuso e o que antes conhecíamos como “pteridófitas”, de
acordo com Prado e Sylvestre [11] corresponde hoje às linhagens monofiléticas licófitas e
samambaias. Apesar das semelhanças no ciclo de vida, estes grupos diferem
filogeneticamente, e as samambaias são mais relacionadas com as plantas com semente do
que as licófitas.
As samambaias possuem megafilos e uma vascularização diferenciada, onde o
protoxilema apresenta-se confinado a lobos do cordão do xilema. As raízes laterais são
formadas a partir da endoderme, o protoxilema é mesarco (primeiras células do xilema em
posição mediana, com maturação radial) nos brotos e os anterozoides possuem de 30 a 1.000
flagelos. A este grupo pertencem às classes Psilotopsida, Equisetopsida, Marattiopsida e
Polypodiopsida e são reconhecidas 37 famílias e aproximadamente 12.240 espécies
[13,14,17].
As licófitas caracterizam-se por apresentarem folhas do tipo microfilo (com apenas
uma nervura central), arranjo dos microfilos helicoidal ou oposto, microfilos ligulados ou sem
lígulas, esporângios nascidos na axila do microfilo (lado adaxial) ou esporângios geralmente
organizados em estróbilos no ápice dos ramos [14,18] estima que hoje as licófitas representam
menos de 1% de todas as plantas vasculares, sendo compostas pelas famílias Lycopodiaceae,
Selaginellaceae e Isoetaceae [19, 20], com cerca de 1.300 espécies descritas [17].
Licófitas e samambaias ocupam uma grande diversidade de ambientes em variados
ecossistemas, apresentando diferentes formas biológicas, incluindo quase todas as formas de
crescimento e de adaptação das angiospermas [21] e são representadas por plantas terrestres,
epífitas, hemiepífitas, rupículas ou aquáticas [11]. Segundo Moram [17], o número de
espécies aumenta em ambos os hemisférios quando se aproxima da linha do equador,
atingindo aproximadamente um total de 13.600 espécies, distribuídas em quatro centros de
146
maior diversidade: Sudeste Asiático com 4.500 spp., América do Sul com 3.500 spp.,
Mesoamérica com 1.800 spp. e a região das Antilhas com 1.200 spp.
Ambientes tropicais úmidos e montanhosos com diferentes formas de disponibilidade
híbrida, como precipitação, condensação e neblina, são locais de maior prevalência deste
grupo de vegetais. Ocorrência em áreas de estação seca ou em clima semi-árido também é
registrada; entretanto, como é de se esperar, isto ocorre em menor proporção. Informações
contidas no Catálogo de Plantas e Fungos do Brasil [11] apontam que este país, por exemplo,
com área territorial de 8.514.880 Km2, provavelmente possui a maior flora do mundo,
perfazendo de 8,8 a 12,8%. Deste percentual, 9,2 a 13,1% de sua diversidade florística é
distribuída entre samambaias e licóficas, sendo a ocorrência maior verificada nos Domínios
Fitogeográficos Mata Atlântica, seguida pela Amazônia, Cerrado, Caatinga, Pampa e
Pantanal.
Portanto, para finalidade didática, neste capítulo será utilizado o termo pteridófita,
uma vez que nem todas as plantas mencionadas, encontram-se apropriadamente classificadas
em licófitas e monilófitas por seus pesquisadores.
3. ASPECTOS ETNOBOTÂNICOS: A IMPORTÂNCIA SÓCIO-ECONOMICA DO
SEGUNDO MAIOR GRUPO DE PLANTAS VASCULARES.
Com uma grande riqueza de espécies, era de se esperar que o homem se beneficiasse
delas com o objetivo de melhorar sua qualidade de vida. Ao longo dos anos as pteridófitas
vêm sendo amplamente utilizadas de diversas formas pelas populações humanas e a
importância do grupo abrange aspectos econômicos diversificados, embora não sejam tão
reconhecidos mundialmente. Como exemplo, pode-se destacar o uso etnobotânico como
plantas ornamentais, como matéria prima para a fabricação de artesanatos, utensílios
domésticos e cosméticos, em rituais místicos, na alimentação e na medicina popular.
A utilização como planta ornamental, viva ou desidratada, tem despertado desde muito
tempo o interesse das populações, e tem sido considerada uma das principais atividades
econômicas deste grupo de plantas vasculares. Como exemplo disto, cita-se a espécie
Rumohra adiantiformis (G. Forst) Ching a samambaia-preta ou verdes, que, através de sua
extração direta do ambiente natural, tem sido a fonte de renda para cerca de três mil
agricultores da Encosta Atlântica do rio Grande do Sul, Brasil (Ribas e Miguel, 2003) [22].
Outras espécies são citadas por Santos e Sylvestre (2006) [23] como plantas ornamentais,
sendo estas Polypodium catharinae Langsd. & Fisch., Polypodium triseriale Sw., Adiantopsis
147
radiata (L.) Fée, Adiantum raddianum C. Presl., Pityrogramma calomelanos (L.) Link,
Anemia collina Raddi, Thelypteris dentata (Forssk.) E.P. St. John, muito utilizadas na
ornamentação de ambientes ou no preparo de arranjos de flores.
Dicksonia sellowiana Hook, o xaxim, apesar da iminente ameaça de esgotamento
como recurso natural não renovável e mesmo constando na lista oficial de plantas ameaçadas
de extinção, tem sido extraída em atividade exploratória no estado do Paraná – Brasil, para a
fabricação de vasos, placas, palito e pó [24].
Na Nicarágua, a samambaia de hábito lianescente Lygodium venustum SW., chamada
localmente de crespillo é extraída para fabricação de cestas, sendo de grande importância para
as famílias que sobrevivem desta atividade econômica. Esta mesma espécie é também
utilizada no preparo da bebida sagrada ayashuasca pelas tribos indígenas Sharanahua e Culina
na Amazônia Peruana [25, 26].
O uso místico de algumas espécies também é relatado. Selaginella bryopteris (L.) Bak.
é fumada juntamente com o tabaco em rituais místicos causando alucinações, enquanto
Trichomanes vittaria e Selaginella amazônica são empregadas em banhos para acalmar e
atrair felicidade. Asplenium formosum e Microgramma vaccinifolia são usadas em banhos
mediúnicos [27].
Pteridófitas são também apreciadas na alimentação, sendo que a grande maioria só é
consumida depois de cozida, para que perca o sabor amargo. Como exemplo citam-se
espécies como Maratta salicina (Sm.), Diplazium esculentum (Retz.) Sw., Máxima diplazium
(D. Don) C. Chr., Dicranopteris linearis (Burm. f.) Und., Angiopteris evecta (Hoffm.) e
Pteridium aquilinum (L.) Kuhn var. arachnoideum (Kaulf.) Brade, sendo que esta última pode
desenvolver tumores no trato gastrointestinal em ratos e por causa deste efeito e da ação
carcinogênica e mutagênica demonstrada por outras variedades desta espécie, aconselha-se
que seja cessado o seu uso na alimentação [23, 28, 29, 30].
Entretanto, o uso secundário mais comum das pteridófitas é como planta medicinal.
Nos últimos anos, diversos trabalhos vêm sendo realizados em inúmeras localidades e
listagens contendo nome científico e popular, partes utilizadas e formas de uso pelas
populações, além da sua serventia são divulgados no meio científico. Na realidade, os
levantamentos etnobotânicos são muito importantes, pois fornecem informações valiosas
sobre a terapêutica popular e, além disso, norteiam pesquisas sobre atividades farmacológicas
de espécies mencionadas como medicinais, na busca incessante por compostos clinicamente
utilizáveis.
148
4. ETNOMEDICINA DE PTERIDÓFITAS: SABEDORIA POPULAR E SAÚDE.
Ao longo dos anos, experiências com plantas medicinais vêm sendo repassadas de
geração em geração. O uso contínuo de pteridófitas por povos de todo o mundo ainda tem tido
pouco destaque em relação ao grupo das angiospermas. Mesmo assim, espécies de diversas
famílias são utilizadas em tratamentos fitoterápicos tradicionais, nos quais são utilizadas
folhas, pinas, rizomas, raízes ou esporos, sob a forma de chá, decocto, pó, pomada ou xarope,
entre outros, no combate a diversos tipos de enfermidades.
Na literatura científica constam levantamentos etnofarmacológicos realizados em
diferentes partes do mundo, mas a Índia tem se destacado como um dos países de maior
divulgação do uso medicinal de pteridófitas. Diversas pesquisas etnofarmacológicas têm sido
desenvolvidas registrando um número considerável de plantas. Pesquisadores como Karthik
[31], Kumari [32], Upreti [28], Srivastava [29] e Benjamim e Manickam [33] realizaram
levantamentos etnobotânicos sobre a fitoterapia popular deste país, nos quais foram
totalizadas 91 espécies diferentes, sendo que apenas a espécie Angiopteris evecta (Forst.)
Hoff. da família Marattiaceae foi citada em comum em todos os trabalhos. Tais pesquisas,
apesar de sua grande relevância, não chegam a exprimir nem representar a etnofarmacologia
mundial de pteridófitas. Muitas espécies utilizadas como fitoterápicos em diferentes regiões
mundiais não chegaram a ser citadas, ou por não fazerem parte da biodiversidade indiana ou
simplesmente por não terem esta finalidade nas localidades pesquisadas. Uma pequena
amostra da medicina popular da pteridoflora indiana é aqui demonstrada, em uma seleção de
sete espécies citadas comumente em pelo menos quatro trabalhos (quadro 01). As
informações disponibilizadas podem ser consideradas um interessante guia para a busca de
produtos naturais bioativos.
Quadro 1. Uso medicinal de algumas pteridófitas
Nome Botânico
Adiantum capillus-veneris Linn.
Uso Etnomedicinal
O decocto das folhas é usado contra bronquite aguda e
febre. A fronde contra tosse, gripe, contra mau hálito e
como colírio. A planta é ainda usada como demulcente,
espectorante, diurético, emenagogo, tônico, adstringente,
depurativo, emético.
A planta inteira é usada em um gel misturada com babosa
e aplicada em cortes, feridas e como tônico capilar.
O chá ou suco é usado contra tosse, bronquite e infecções
de garganta. Internamente, é usada também contra
alcoolismo e contra vermes. Externamente, é usada
149
contra picada de cobra e de abelhas. Para esta planta
ainda são relatadas atividades anticancerígenas,
hipoglicemiante,
afrodisíacas,
antimicrobianas
e
antivirais.
Angiopteris evecta Hoffm.
O rizoma pulverizado é utilizado misturado com água
contra diarréia. È usada como alimento e contra fraturas.
Ainda é utilizada na medicina tradicional como calmante
e contra dor, febre e contra piolhos. O óleo essencial é
utilizado na perfumaria local. O decocto das folhas é
ingerido junto ao suco de limão para tratamento de dores
de estômagos e úlcera. O extrato das folhas é utilizado no
tratamento de disenteria. Os esporos são eficazes no
tratamento de hanseníase e outras doenças de pele.
Blechnum orientale Linn.
O rizoma tem ação antihelmíntica e contra S.
typhimurium. O suco das folhas é usado para curar
úlceras intestinais e a pasta do rizoma é utilizada para
tratar problemas na bexiga.
Dicranopteris linearis (Burm. f.) Os brotos são consumidos como alimentos e as frondes
Und.
são utilizadas com cobertura de telhado e de paredes. O
decocto é utilizado como laxante. Frondes também são
utilizadas contra asma e apresentam ação antibacteriana e
antihelmíntica. Na medicina tradicional, ainda é utilizada
para curar a esterilidade feminina misturado com leite de
vaca.
Helminthostachys zeylanica (L.) Esta planta é utilizada contra processos de intoxicação e
Hook.,
utilizada contra dores no nervo ciático. As fronds são
usadas como afrodisíaco. O decocto do rizoma é utilizado
contra impotência. As folhas jovens são cozinhadas como
verduras. O rizoma pulverizado misturado com leite de
vaca é usado como tônico estimulante e cerebral e
aperiente. Na medicina tradicional, esta planta é utilizada
como anestésico e no tratamento de bolhas, úlceras e
disenteria.
Lygodium flexuosum (L.) Sw.
O rizoma pulverizado é usado contra herpes, doenças de
pele, como expectorante, contra reumatismo, piolhos,
eczemas, cortes e feridas. As raízes frescas misturadas
com óleo de mostrda são utilizadas contra reumatismo,
carbúnculos, úlceras. O extrato aquoso do rizoma é
utilizado contra gonorréia. A planta ainda é usada como
espectorante. Osuco da planta combate a febre e a
ovulação.
Pteris vittata Linn.
Folhas são utilizadas para a prevenção de doenças. O
extrato da planta é utilizado como demulcente,
hipotensor, tônico, antiviral e antibacteriano. A planta
inteira é utilizada como pasta e aplicada sobre as áreas
afetadas por feridas. A pasta é misturada com pimenta e
ingerida para combater gripe, tosse e febre.
150
Caso os dados descritos nos trabalhos citados forem cruzados com outros
levantamentos etnobotânicos, seria perceptível que algumas espécies são de fato utilizadas
para os mesmos fins em diferentes culturas. O uso em comum de algumas espécies por
diferentes populações tem despertado a atenção e a curiosidade de pesquisadores quanto à
investigação sobre a eficácia de bioatividades tão referenciadas pela tradição popular em
testes de pré-triagem quanto à utilidade terapêutica, aplicada continuamente ao longo de
várias gerações. Dessa forma, diversos questionamentos surgem a respeito, como por
exemplo: o que há de tão especial neste grupo de vegetal que justifique seu uso desde culturas
primitivas a contemporâneas? Existem, de fato, componentes bioativos que atuam em
sistemas corpóreos reequilibrando suas funções? Que parte da quimiodiversidade destas
plantas é responsável pela cura de enfermidades? Que quantidade do produto é efetivamente
necessária para um efeito desejado? Em que tipo de célula age melhor e de que forma? Que
conseqüências o uso contínuo de pteridófitas poderão trazer à saúde humana? De fato, a busca
pelas respostas a estes questionamentos fomenta as pesquisas mundiais sobre as bioatividades
deste antigo grupo de plantas vasculares e cada vez mais, porém não com tanto alarde, os
mistérios da etnomedicina da pteridoflora são desvendados em laboratórios de todo o mundo.
Fitoconstituíntes são identificados e comparados em suas propriedades biológicas com os
existentes em plantas de outros grupos vegetais de reconhecida importância, e ensaios são
realizados in vitro e in vivo desvendando bioatividades terapêuticas quer sejam orientadas
pelas pesquisas etnobotânicas, quer pela intuição dos cientistas a despeito dos metabólitos
secundários encontrados nas plantas.
5. COMPROVANDO BIOATIVIDADES: A ELUCIDAÇÃO DE MISTÉRIOS DA
ETNOMEDICINA
Ensaios biológicos realizados a fim de se comprovarem a eficácia de pteridófitas como
fitoterápicos foram mais frequentemente desenvolvidos a partir do final do século XX.
Diversas bioatividades foram então exploradas, sendo confirmada ou contestada a sua
eventual possibilidade de aplicação clínico-terapêutica, indicando interessantes alternativas
para a criação de novos fármacos ou classificando as plantas como ineficazes quanto à
finalidade terapêutica.
Como exemplos destas possibilidades, elencou-se alguns estudos realizados que
comprovam algumas das atividades biológicas demonstradas pelas pteridófitas. É importante
ressaltar que a grande maioria das pesquisas aborda atividades antimicrobianas
151
(antibacterianas, principalmente), onde produtos naturais na forma de extrato, frações ou
substâncias isoladas de pteridófitas são ensaiados frente a diferentes tipos de microrganismos
de relevância patológica. Entretanto, outras atividades também serão aqui abordadas, tais
como o potencial antifúngico, antiviral e antiparasitário de algumas espécies além da
atividade anticarcinogênica e antioxidante que poderão ser úteis na identificação de matériasprimas para a síntese de substâncias bioativas potencialmente viáveis na utilização como
novos fármacos.
Atividade antibacteriana
O desenvolvimento de resistência bacteriana tem levado a uma crescente procura por
novos fármacos que possam de alguma forma eliminar ou neutralizar as defesas microbianas.
Nas últimas décadas, os antibióticos sintéticos tiveram sua eficácia reduzida frente a
versatilidade das bactérias, e os produtos naturais representam hoje, uma alternativa a ser
explorada em suas propriedades farmacológicas. Neste contexto, diversos representantes da
pteridoflora foram avaliados para sua potencialidade antimicrobiana e mostraram resultados
muito promissores.
Osmunda regalis foi avaliada em seu potencial antimicrobiano por ser uma pteridófita
conhecida nos sistemas tradicionais de medicina. Thomas [34] pelo método de difusão em
disco testou extratos de diferentes polaridades contra cepas de bactérias patogênicas.
Atividade antibacteriana foi confirmada pela concentração inibitória mínima (CIM) e
concentração bactericida mínima (CBM). O extrato acetônico exibiu melhores resultados com
MIC e CBM de 12.5 mg/ml e 25 mg/ml respectivamente frente a Pseudomonas aeruginosa,
enquanto valores de MIC e CBM de 25 mg/ml e 50mg/ml foram observados para Shigella
sonnei. Os compostos ativos de O. regalis, portanto, são solúveis em acetona e apresentam a
capacidade de dificultarem o crescimento e a multiplicação de algumas cepas de bactérias
multiresistentes.
Parihar et al. [35] desenvolveu um estudo bastante abrangente envolvendo 12 espécies
de pteridófitas: Adiantum capillus-veneris L., Adiantum incisum Forsk., Adiantum lunulatum
Burm. F., Actiniopteris radiata (Swartz.), Link, Araiostegia pseudocystopteris Copel.,
Athyrium pectinatum (Wall Mett ex.) T. Moore, Chelienthes albomarginata Clarke,
Cyclosorus dentatus (Forsk.) Ching, Dryopteris cochleata (Don.) C. Chr., Hypodematium
crenatum (Forsk.) Kuhn, Marsilea minuta L. e Tectaria coadunata (J. Smith) C. Chr. frente a
bactérias gram-negativas, gram-positivas e fitopatogênicas: Escherichia coli MTCC 443,
152
Salmonella arizonae MTCC 660, Salmonella typhi MTCC 734, Staphylococcus aureus
MTCC 96 e Agrobacterium tumefaciens MTCC 431. Utilizando o método da difusão em
disco, testou extratos aquosos e alcoólicos (metanol) das folhas, obtendo resultados que
mostraram, com poucas exceções, que todos os produtos naturais mostraram-se eficazes na
inibição bacteriana e assim passaram a constituir um excelente acervo para a busca de
substâncias ativas com potencial para a constituição de novos fármacos antibacterianos.
Algumas espécies do gênero Adiantum, foram testadas frente a 11 bactérias pelo
método da microdiluição por Singh et al. [36]. Os extratos metanólicos das espécies Adiantum
capillus-veneris, Adiantum peruvianum e Adiantum venustum inibiram o crescimento de todas
as linhagens bacterianas gram-positivas ensaiadas em Concentrações Inibitórias Mínimas que
variaram entre 3,90 e 62,50 µg/mL. Das espécies utilizadas no estudo, Adiantum venustum foi
a única que demonstrou atividade contra todas as linhagens gram-negativas. Merece destaque,
a inibição de E. coli por A. capillus-veneris na concentração de 0,48 µg/mL. Todas as
espécies de Adiantum ensaiados demonstraram notável atividade antibacteriana, atribuída
pelos autores à presença de compostos fenólicos encontrados nas espécies.
Outro screening de agentes antibacterianos que merece ser mencionado em razão do
grande número de espécies investigadas e resultados obtidos foi realizado por Banerjee e Sen
em 1980 [4]. Neste primoroso estudo, 114 espécies foram investigadas. De diferentes partes
das plantas (rizoma, estipe e folhas estéreis e férteis) foram obtidos extratos aquoso e orgânico
(metanol, etanol 70%, éter e acetona) e os ensaios foram realizados pelo agar cup method
contra as linhagens de Staphylococcus aureus (sensível e resistente a penicilina), Sarcina
lutea, Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae e Vibrio cholerae. Um total de 73 espécies (64%)
apresentaram atividade antibiótica, sendo que 33 inibiram bactérias gram-positivas, 9 inibiram
gram-negativas e 15 espécies inibiram ambos os tipos de bactérias. Algumas espécies se
destacaram
quanto
ao
potencial antimicrobiano como
Microsorium alternifolium,
Leptodecurrens chillus, Polypodium irioides, Pyrrosia mannii e Phymatodes ebenipês, as dos
gêneros Dryopteris e Adiantum, entre outras.
Com a grande quantidade de relatos sobre atividade antibacterianas de pteridófitas
evidenciados nestes e em outros tantos trabalhos, podemos vislumbrar que este representa
realmente o grande foco das pesquisas por bioatividades. Fitoconstituintes ativos existentes
em extratos e frações têm demonstrado grande capacidade para desarticular mecanismos de
defesa desenvolvidos por bactérias. Isto é muito importante, ao considerarmos a expectativa
de serem utilizados como fontes de novos fármacos, pois apesar de termos diversos tipos de
153
antibióticos lançados no mercado, infelizmente estes não tem conseguido acompanhar o ritmo
de desenvolvimento da resistência microbiana, tornando-se clinicamente ineficazes.
Atividade antifúngica
Estudos abordando o potencial antifúngico de pteridófitas são mais escassos quando
comparados às pesquisas por antibacterianos. Dessa forma, a maioria dos relatos encontrados
sobre esta atividade é oriunda de pesquisas na qual se busca também uma atividade
antibacteriana nas espécies estudadas e não apenas antifúngica. Entretanto, é importante
esclarecer que estas plantas também têm demonstrado capacidade de inibir o crescimento de
diversos tipos de fungos e por este motivo deve lhe ser dada maior atenção neste aspecto.
Como
exemplo
de
pesquisas
que
buscam
concomitantemente
atividades
antibacteriana e antifúngica, citam-se os estudos desenvolvidos por Singh et al. [36] e
Banerjee e Sem [4] mencionados anteriormente. No primeiro estudo, espécies de Adiantum
foram ensaiadas contra oito linhagens fúngicas (Candida albicans, Cryptococcus albidus,
Trichophyton rubrum, Aspergillus Níger, Aspergillus flavus, Aspergillus spinulosus,
Aspergillus terreus e Aspergillus nidulans) e os autores verificaram que o extrato metanólico
de A. capillus veneris, A. peruvianum, A. venustum e A. caudatum foram eficazes na inibição
de C. albicans e os três últimos também foram ativos contra Aspergillus terreus. No estudo
feito por Banerjee e Sen, de 114 plantas pesquisadas apenas três mostraram potencial contra
os fungos fitopatógenos Curvularia lunata, Aspergillus Níger e Helminthosporium oryzae,
sendo estas das espécies Dryopteris cochleata, Pteris biaurita e Gleichenia glauca .
De maneira geral, as pteridófitas crescem em locais úmidos, onde ocasionalmente há
presença de água devido às suas limitações de condições reprodutivas. Comumente isto ocorre
junto a fungos e assim, ambos passam a compartilhar o mesmo hábitat. Dessa forma, é natural
que fungos tenham desenvolvido diferentes mecanismos de defesa como forma de adaptação
e sobrevivência a metabólitos secundários produzidos e liberados pelas plantas, quando estas
também buscavam melhores condições de existência livres de fitopatógenos.
Os compostos formados pelas vias secundárias metabólicas das plantas exercem um
importante papel na perpetuação das espécies. A prospecção química das espécies Psilotum
nudum, biserrata Nephrolepis e cordifolia Nephrolepis feita por Hani et al. [37], revelou a
presença de flavonóides, taninos, alcalóides, açúcares redutores, triterpenóides e esteróides e a
atividade antimicrobiana demonstrada por estas espécies pode ser atribuída a estes
fitoconstituintes que inclusive já tem demonstrado efeito inibidor de microrganismos. Neste
154
estudo, foram realizados ensaios antimicrobianos utilizando extratos aquosos e não aquosos
de partes aéreas das espécies pelo método da difusão em disco contra nove tipos de bactérias e
três importantes fungos dermatófitos (Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes e
Trichophyton rubrum). O extrato aquoso das três espécies exibiu diferentes graus de inibição
dos fungos. Psilotum nudum foi a única espécie cuja maioria dos tipos de extrato (aquoso,
clorofórmio e etanólico) foi ativo contra todos os fungos testados. Os resultados mostraram
que estas espécies apresentam substâncias ativas com propriedades antifúngicas e
antibacterianas, já que também inibiram bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
O gênero Adiantum além de ser uma das melhores indicações entre as samambaias
contra bactérias, também demonstrou potencial antifúngico. Ghosh et al. [38] analisou o
efeito contra Aspergillus niger e Rhizopus stolonifer pelas espécies Adiantum capillus-veneris
L. e Adiantum lunulatum. Foram testados o extrato bruto e fenóis (fenóis totais, carboidratos e
aminoácidos) extraídos tanto de gametófitos quanto de diferentes partes dos esporófitos. Os
testes foram feitos em três métodos distintos: agar disc method, liquid culture method e
suspension culture médium, com objetivo de minimizar o erro e ambos os extratos exibiram
atividade antifúngica, mas os gametófitos se destacaram com os melhores resultados. Este
caráter pode ser atribuído, de acordo com os autores, ao grande acúmulo de metabólitos, em
especial compostos fenólicos existentes no gametófito que, sendo precursor do zigoto, deve se
manter metabolicamente mais ativo para que possa conferir resistência a agentes patógenos.
Outras pesquisas ainda podem ser sucintamente relatadas como a realizada por Dalli et
al. [39] que constatou que a espécie Pteris biaurita possui uma forte atividade antimicrobiana,
principalmente antifúngica e antibacteriana, supostamente devido a presença de eicosanóides
e heptadecanos em suas folhas; e por Lee et al. [40] demonstrando que Selaginella
tamariscina possui o biflavonoide isocryptomerin, bastante usado na medicina tradicional e
que este composto apresenta forte ação antifúngica por causar despolarização da membrana
plasmática. Ruiz-Bustos [41] demonstrou que o extrato metanólico da samambaia Jatropha
cuneata na concentração de 90 μg/mL exibe forte atividade antifúngica frente a Fusarium
verticillioides e Aspergillus niger.
A evolução natural dos fungos é algo que preocupa muito a comunidade científica.
Suas células são semelhantes às humanas, pois são todos eucariontes, e por este motivo
existem dificuldades em encontrar fármacos eficazes que agridam apenas alvos específicos.
Caso sejam desenvolvidos novos mecanismos de defesa (o que é absolutamente natural que
ocorra), fármacos comercialmente utilizados se tornarão obsoletos dificultando o tratamento
de infecções fúngicas. Estas pesquisas com produtos naturais, neste caso, as pteridófitas, em
155
triagens experimentais, apontam um caminho para a descoberta de novos princípios ativos
extremamente necessários no contexto atual para suprir a carência de substâncias
quimioterápicas. Verifica-se que estas plantas contêm fitoconstituíntes promissores do
gametófito até o esporófito e estes poderão ser usados para salvaguadar organismos humanos
debilitados pelas infecções oportunistas causadas por fungos.
Atividade anticancerígena
O câncer tem abalado muitas famílias em todo o mundo. O grande sofrimento causado
por esta doença, bem como sua grande incidência na população mundial, tem levado a uma
crescente busca por princípios ativos com capacidade de inibir a proliferação de células
tumorais. Neste contexto, a ciência tem investigado diversas possibilidades em relação a
produtos naturais. As plantas, partindo de briófitas a angiospermas, têm sido testadas quanto
ao potencial antineoplásico em investigações preliminares e diante de resultados que
sinalizam a existência desta bioatividade, é dada uma atenção especial procedendo ao
isolamento de compostos e realizando testes in vitro e in vivo, até que seja finalmente
verificada a eficácia de seu efeito em sistemas corporais humanos. Neste caso, uma grande
preocupação aponta no sentido de que a ação do produto natural sobre células saudáveis e
neoplásicas a fim de que só haja comprometimento das células alteradas e que também os
efeitos colaterais quimioterápicos sejam nulos ou minimizados.
Alguns pesquisadores têm realizado pesquisas antineoplásicas em tumores vegetais
causados por Agrobacterium tumefaciens baseados na existência de semelhança entre
mecanismos de formação de tumor em animais pelas bactérias Bartonella henselae e
Helicobacter pylori. É uma triagem bastante singular que pode ou não ter um efeito promissor
em humanos, mas é antes de tudo um indicativo para que se possa ir mais longe passando a
novas fases investigativas. Sarker et al. [42] testou partes aéreas de Selaginella ciliaris
(Retz.), Marsilea minuta (L.) e Thelypteris prolifera (Retz.) em bioensaio com disco de batata
exibindo crown-gall tumors. Antes, porém, verificaram se as espécies demonstravam efeito
antibacteriano (250.000 ppm) contra A. tumefaciens, e após constararem nenhuma atividade,
deram continuidade aos testes onde verificaram que as mesmas inibiram o tumor com
percentuais de 80%, 82,32% e 75,68%, respectivamente, em 1.000 ppm. Os estudos revelam
que existem fitoconstituintes ativos nas plantas capazes de interromper o ciclo da divisão
celular; entretanto, ainda há um longo percurso até se saber quais são os metabólitos
responsáveis por esta ação antitumoral.
156
Porém, em estudos mais específicos in vitro realizado por Lai et al. [43], linhagens
celulares de adenocarcinoma humano do cólon HT-29, carcinoma humano do cólon HCT116, adenocarcinoma de mama MCF-7, leucemia humana K562 e de fígado Chang foram
usadas em ensaios de citotoxicidade, nos quais foram testadas frações obtidas do extrato
metanólico da samambaia Blechnum orientale Linn. Uma interessante atividade citotóxica foi
demonstrada pelas frações acetato de etila, butanólica e aquosa contra o adenocarcinoma de
células do cólon HT-29. A curcumina foi usada como controle positivo por ser amplamente
empregada em ensaios clínicos para quimioprevenção do câncer de cólon, e células Chang
foram utilizados em estudos de citotoxicidade para testar os efeitos de drogas/agentes sobre as
células normais. A fração butanólica não exibiu efeito citotóxico contra as células normais, o
que significa que compostos presentes nesta fração poderão ser utilizados em quimioterapias
de câncer de cólon. Uma triagem por compostos fenólicos registrou a presença de terpenóides,
flavonóides e taninos, estes últimos em maior abundância nas frações butanólica e aquosa. O
isolamento de componentes da fração butanólica desta samambaia em testes complementares
poderá levar à elucidação de substâncias ativas contra as células tumorais, algo de extrema
importância na luta contra o câncer do cólon.
Compostos isolados têm sido investigados quanto à atividade quimiopreventiva do
câncer. De raízes secas da samambaia ornamental Neocheiropteris palmatopedata (Baker)
foram isolados seis glicosídeos kaempferol (palmatosideos A, B e C, multiflorinas A e B e
afzelina) e estes foram ensaiados quanto à capacidade de inibir o TNF-α induzido por
atividade NF-kB, o óxido nítrico (NO), produção de aromatase, redutase quinona 2 (QR-2) e a
atividade de COX-1/-2, fatores importantes para o desencadeamento de processos
cancerígenos. Os palmatosideos A e B apresentaram inibição de TNF-α induzida por
atividade de NF-kB, com valores de IC50 de 15,7 e 24,1 µM, respectivamente e apenas a
multiflorina B apresentou percentuais acima de 50% de inibição da produção de óxido nítrico.
O palmatosídeo A foi o único composto que mostrou inibição das enzimas COX acima de
50% a 10 µg/mL. Na inibição da aromatase, a multiflorina A foi mais ativo com um valor de
IC50 de 15,5 µM e o melhor desempenho na inibição da enzima QR2 foi demonstrada por
afzelina na concentração de 11,5 µg/mL. Neste estudo realizado por Yang et al. [44] foi
avaliada também a citotoxicidade em cultura de células Hepa1c1c7 de hepatoma e MCF-7 de
carcinoma da glândula mamária e os compostos não apresentaram efeito inibitório
significativo no crescimento celular. Os resultados sugerem que a samambaia exerce efeito
quimiopreventivo através de seus compostos e isto deve ser investigado com maior
157
profundidade por conta da habilidade demonstrada de atingir alvos específicos sem causar
efeitos citotóxicos.
Além do kaempferol, outros constituintes da classe dos flavonóides têm apresentado
atividade quimiopreventiva e anticarcinogênica. A samambaia Thelypteris torresiana tem
sido exaustivamente estudada pelo fato de ter apresentado atividade anticancerígena quando
testada sob a forma de extrato. Desde então, pesquisadores tem continuamente isolado e
testado seus compostos na busca do fitoconstituinte responsável pelo efeito. O alvo principal
das pesquisas tem sido os flavonóides, isto porque têm apresentado potencial
quimiopreventivo e quimioterápico em tratamentos antineoplásicos com atividades que
variam de antiproliferativas, interrupção do ciclo celular a indução de apoptose. O flavonóide
protoapigenona foi testado por Chang et al. [45] em células de câncer de próstata (linhagem
LNCaP) e conseguiu inibir a proliferação celular, induzir a apoptose por anexina V-FITC
(labeling phosphatidylserine) e a progressão do ciclo celular, além de também inibir a
ativação da p38 MAPK e JNK1 / 2 que regulam os processos de crescimento, proliferação e
diferenciação celular. Protoapigenone suprimiu o crescimento de células cancerígenas da
próstata tanto in vitro como in vivo, sem hepatotoxicidade significativa, nefrotoxicidade e
toxicidade hematológica. Este composto já havia sido foi testado por Lin et al. [46], em
células neoplásicas hepáticas e da mama (Hep G2, Hep 3B, MCF-7, A549, e MDA-MB-231)
exibindo considerável atividade anti-tumoral. Em face disto, este flavonóide isolado de
samambaia poderá vir uma grande alternativa para tratamentos quimioterápicos contra
neoplasias.
Atividade antiviral
A pesquisa de novas substâncias com potencial antimicrobiano nos dias atuais é
crescente e necessária, sobretudo, devido ao desenvolvimento da resistência de agentes
infecciosos a drogas sintéticas amplamente utilizadas. Neste sentido, os compostos naturais,
principalmente flavonóides, têm sido muito importantes para a descoberta de agentes
antivirais.
De acordo com a literatura, o gênero Selaginella apresenta inúmeras propriedades
medicinais, contendo vários metabólitos secundários tais como: alcalóides, terpenóides e
fenóis. Além destes, possui também, uma grande variedade de diflavonoides, uma forma
dimérica de flavonóides, ainda bastante pouco estudados. Os diflavonóideis, apresentam
diversas propriedades medicinais, principalmente antioxidante, anti-câncer, anti-inflamatória
158
e antimicrobiana (antiviral, antibacteriana, antifúngica, antiprotozoária). O gênero Selaginella
é usado amplamente na medicina tradicional Chinesa (MTC) como forma complementar e
alternativa aos medicamentos sintéticos tradicionais, sendo a espécie S. tamariscina a espécie
mais utilizada. O gênero Selaginella possui 13 compostos bioativos estudados até o momento,
especialmente, amentoflavona e ginkgetina [47]. Esse metabólito foi obtido pela primeira vez
a partir da espécie Selaginella sinensis e estudado isoladamente por Ma et al. [48]. Em 2009 o
pesquisador Hafidh et al. [49] divulgou que a amentoflavona apresenta atividade antiviral
potente contra o vírus sincicial respiratório (VSR), exibindo uma IC50 de 5,5 µg/mL. Neste
estudo, a quantidade de amentoflavona de nove espécies de Selaginella foi determinada por
HPLC de fase reversa, e a espécie S. sinensis foi a que apresentou o maior teor possuindo
1,13% de amentoflavona.
Em outro estudo sobre o gênero Selaginella, Maly [50] isolou cinco compostos da
espécie Selaginella uncinata. Dois destes compostos são novos glicosídeos Chromona,
nomeados 5-hidroxi-2,6,8-trimetilchromona 7-O-beta-D-glucopiranosideo (uncinoside A) e 5acetoxil-2,6,8-trimethilchromona
7-O-beta-D-glucopiranosideo
(uncinoside
B).
Suas
estruturas foram elucidadas por métodos espectroscópicos incluindo técnicas tridimensionais
como RMN. Os outros três compostos foram identificados como 8-metil eugenitol,
amentoflavona e hinokiflavona. Os glicosídeos, Uncinosideo A e B, mostraram potente
atividade antiviral frente ao vírus sincicial respiratório (VSR) exibindo uma IC50 de 6.9 e 1.3
µg/mL e atividade antiviral moderada frente ao vírus tipo 3 parainfluenza (PIV 3), exibindo
uma IC50 de 13,8 e 20,8 µg/mL, respectivamente.
Alguns trabalhos têm focado a descoberta de produtos naturais contra o vírus HIV.
Este vírus é o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), e tem
causado graves problemas de saúde pública, pois a cada dia o número de pessoas infectadas
pelo HIV e doentes de SIDA continua aumentando na população mundial, especialmente nos
países em desenvolvimento. Pesquisas recentes têm observado que a enzima Transcriptase
Reversa (TR) do HIV tem demonstrado ser muito importante para a replicação viral, pois cada
função catalítica da RT interfere na produção do vírus. Esta enzima exibe atividade RNAdependente DNA polimerase, DNA dependente DNA polimerase e ribonucleases H [51].
Até o momento, duas classes de drogas inibidoras, análogas e não-análogas de
nucleotídeos, têm sido desenvolvidas; porém, sua utilização para o tratamento de pacientes
com AIDS é limitada devido sua toxicidade e surgimento de vírus cada vez mais resistentes.
O desenvolvimento e produção de medicamentos inibidores seletivos para o HIV RT é
pertinente ao contexto e com este objetivo, Min et al. [51], realizou uma triagem in vitro de
159
50 espécies de plantas medicinais coreanas e chinesas na busca de potencial antiviral, sendo
descoberto neste que o rizoma de Dryopteris crassirhizoma Nakai (Aspidiaceae) inibia
sensivelmente a atividade RNase H de HIV-1 RT, tendo o extrato metanólico exibido uma
IC50 de 25 µg/mL. Segundo Min, este rizoma é conhecido na medicina chinesa por sua ação
taenicida. As espécies do gênero Dryopteris são geralmente caracterizadas pela presença de
derivados de floroglucinol, tais como ácidos flavaspicos, ácidos triflavaspidicos,
dryocrassinos e albaspidinos e ácidos filixicos e além disso, glicosídeos e kaempferol foram
isolados a partir das espécies do gênero Dryopteris.
Atividade antiparasitária
A Leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por protozoários do
gênero Leishmania, que apresenta três tipos de manifestações. Estima-se que a doença cause
1,6 milhões de novos casos, dos quais cerca de 500.000 é visceral e 1,1 milhões cutânea ou
mucocutânea, de acordo com informações disponibilizadas pela Organização Mundial de
Saúde [52]. A distribuição da leishmaniose tem se expandido ao longo dos anos, atingindo
países onde antes sua ocorrência não era registrada, o que é muito preocupante tendo em vista
as poucas opções de agentes terapêuticos e ainda o fato de ter sido observado Leishmania um
potencial de resistência à drogas.
Os trabalhos científicos envolvendo pesquisa de atividade leishmanicida de
pteridófitas, entretanto, ainda são bastante escassos. Um dos poucos estudos produzidos nesta
área é o do pesquisador El-On [53] que em 2009 divulgou que o extrato metanólico de Pteris
vittata possui atividade leishmanicidal moderada (25%-50%).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde [52], estima-se que mais de 10
milhões de pessoas estejam infectadas com o parasita Trypanosoma cruzi em todo o mundo.
Este protozoário é o causador da doença de Chagas que na fase inicial apresenta
sintomatologia de inexistente a leve, até que se passe à fase crônica causando distúrbios
sistêmicos, culminado com o comprometimento progressivo do músculo cardíaco, o que pode
levar à morte.
Nos últimos anos, a atividade contra protozoários tem sido avaliada para diversos
produtos naturais, sendo o gênero Selaginella muito estudado para este fim. Atualmente é
conhecido que mais de 60 espécies de Selaginella ocorrem na Índia, sendo pouco usadas na
medicina popular. Segundo a literatura, este gênero é rico em diflavonóides, uma forma
dimérica de flavonóides.
160
Em um estudo realizado por Olaf et al., [54], espécies de Selaginella foram avaliadas
para atividade antiprotozoária. Neste trabalho, extrato etanólico e frações de Selaginella
bryopteris de diferentes polaridades foram obtidos usando tolueno, acetato de etila, e butanol
por partição líquido-líquido. Estes produtos naturais foram testados frente a Trypanosoma
brucei, Trypanosoma rhodesiense STIB 900, Trypanosoma cruzi cepa tulahuen C2C4,
Leishmania donovani cepa MHOM-ET-67 e Plasmodium falciparum K1. A fração acetato de
etila mostrou elevada atividade e foi selecionada para isolamento de 11 compostos puros. De
acordo com o trabalho, foi encontrada uma elevada atividade antimalarial para o composto
7’4’7-tri-O-metilamentoflavona que exibiu uma IC50 de 0,26 µM. Este composto não mostrou
atividade citotóxica significante (IC50 ˃ 150 µM) frente a células L-6. Para avaliar a atividade
in vivo frente ao protozoário Plasmodium berghei, foi realizada uma síntese parcial a partir da
amentoflavona (diflavonóide) para produção do 7’4’7-tri-O-metilamentoflavona. Este semisintético foi testado na concentração de 50 mg/Kg e não apresentou aticidade frente ao
Plasmodium berghei. Uma forte atividade leishmanicida foi detectada no composto 2,3
dihidronokiflavona, apresentando uma (IC50 de 1,6 µM), enquanto que para o Trypanosoma
nenhuma atividade significante foi observada (IC50 ˃ 12,5 µg/mL para o extrato).
A pesquisadora Esther del Olmo [55], em um ensaio preliminar na busca por novos
compostos de origem natural, constatou que o ácido isonotholaenic, um estilbenóide, foi o
componente principal do extrato diclorometano da samambaia Notholaena nívea. Este extrato
obteve resultados bastante promissores frente a formas epimastigotas de T. cruzi, exibindo
uma IC50 de 30 µg/mL sendo semelhante ao benznidazole que possui IC50 de 7,4 µg/mL.
Curiosamente, a transformação do ácido isonotholaenic em piperidide dobrou sua potência em
relação ao benznidazole. Com base em outros ensaios desta pesquisa, foi visto que estes
compostos não são citotóxicos para células humanas normais. Portanto, eles representam
estruturas importantes para o desenvolvimento de novos agentes contra a doença de chagas.
Atividade antioxidante
O equilíbrio de sistemas orgânicos pode ser caracterizado pela produção constante de
radicais livres, que por sua vez, são neutralizados por mecanismos de defesa antioxidantes
enzimáticos e não enzimáticos. Quando por alguma razão este equilíbrio é rompido e a
produção de radicais livres supera a capacidade antioxidante, espécies altamente instáveis e
reativas de oxigênio, nitrogênio ou enxofre, entre outras, poderão se ligar a moléculas
orgânicas essenciais à vida como DNA, proteínas e lipídios, gerando conseqüências como
161
mutações e outros tipos de danos estruturais e funcionais que podem induzir à morte celular.
Doenças degenerativas como a de Parkinson, Alzheimer e esclerose múltipla, além de
diversos tipos de doenças pulmonares e do sistema imune diabetes, cardiopatias, asteroclerose
e também cânceres, são enfermidades que podem surgir em decorrência de danos causados
por estresse oxidativo [56].
Substâncias antioxidantes são aquelas que, presentes em baixas concentrações, porém
em concentrações superiores às oxidáveis, retardam ou inibem a ação destas, prevenindo ou
reduzindo a extensão do dano oxidativo [57]. É sabido que produtos naturais possuem
compostos que exibem esta capacidade e por este motivo, alimentos, temperos e plantas
medicinais têm sido alvos de estudos sobre suas propriedades protetoras. Não obstante,
diversas pesquisas têm mostrado o potencial antioxidante de pteridófitas como uma
importante bioatividade deste grupo.
As samambaias medicinais Blechnum orientale L., Dicranopteris linearis (Burm.),
Cibotium barometz (L.) J. Sam, Acrostichum Aureum L. e Asplenium nidus L. foram
investigadas por Lai et al. [58] e todas demonstraram potencial antioxidante. Nos métodos de
redução do radical livre 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila (DPPH) e capacidade de reduzir íons
férricos (FRP) as espécies demonstraram atividade seguindo a ordem em potencial
decrescente: B. orientale ≥ D. linearis > C. barometz > A. aureum > A. nidus. Esta mesma
ordem foi também observada quanto à presença de compostos fenólicos, e a estes foi atribuída
a capacidade antioxidante, já comprovada em tantos outros estudos. Na avaliação pelo método
de branqueamento do ß-caroteno (BCB), D. linearis se destacou com 99% de inibição da
peroxidação lipídica. Em contradição à tendência observada nos demais ensaios, ao se avaliar
a atividade quelante de íons ferrosos (FIC), as espécies mostraram baixa atividade, com
exceção de A. aureum que exibiu um percentual de 58% (6,7 mg/mL). Os resultados
evidenciam que estas plantas revelam um notável potencial protetor que poderá auxiliar
sistemas orgânicos na defesa contra radicais livres.
Recentemente, um estudo realizado por Lai e Lim [59] rastreou quinze samambaias na
busca de fontes antioxidantes naturais utilizando métodos como potencial de redução de ferro
(FRP), redução (branqueamento) do ß-caroteno (BCB) e redução do radical DPPH, conseguiu
prospectar cinco espécies cujos extratos metanólicos exibiram forte capacidade de seqüestrar
radicais livres. Das espécies Cyathea latebrosa (Wall. ex Hook) Copel, Cibotium barometez
(L.) J. Sm., Drynaria quercifolia (L.) J. Sm., Blechnum orientale L. e Dicranopteris linearis
(Burm.), esta última demonstrou o potencial antioxidante mais alto sendo de 61% em 0,1
mg/mL e 99% em 0,7 mg/mL. Estes dados confirmam, portanto, o expressivo potencial de
162
Blechnum orientale e Dicranopteris linearis anteriormente investigadas. Na pesquisa por
compostos, fenólicos as cinco espécies foram as que se destacaram por apresentar altos teores,
sinalizando, como no estudo anterior, que o efeito antioxidante das espécies provavelmente
está relacionado à presença e à ação destes fitoconstituíntes.
Na procura por substâncias ativas capazes de se ligarem a espécies de radicais livres,
alguns trabalhos têm ido um pouco mais além de ensaios com extratos, e assim, compostos
isolados de espécies como Cheilanthes anceps Swartz e Salvinia natans L. foram avaliados
quanto ao potencial antioxidante. Chowdhar [60] isolou seis flavonóides de C. anceps a partir
da fração butanólica oriunda do extrato etanólico de folhas: (1) Kampferol-3-O- δ-Lramnopiranosil (1→2)-ß- D-glucopiranosideo-7-O-ß -D-glucopiranosideo, (2) Quercetina 3O-
δ-L-ramnopiranosil
(1→2)-ß-D-glucopiranosideo-7-O-ß-D-glucopiranosideo,
(3)
Quercetina-3-O-ß-D-glucosil (1→2)-ß -D-glactosideo-7-O- ß -D-glucosideo, (4) Quercetina3-metil éter-5-O-glucosideo, (5) Kampferol-3-O-glucosideo e (6) Quercetina-3-O-glucosideo.
Pelo ensaio de bioautografia em camada delgada e DPPH foi verificado que o potencial
antioxidante seguia a seguinte ordem: 6 > 3 > 2> 4, mostrando que glicosídeos de quercetina
eram ativos, enquanto glicosídeos de kaempferol não exibiram atividade.
O efeito antioxidante de S. natans, uma samambaia aquática, foi observado por
Srilaxmi [61] através de um ensaio in vivo utilizando ratos albinos Wistar com lesão hepática
induzida por tetracloreto de carbono CCl4. Esta substância é um solvente industrial conhecido
por sua hepatotoxicidade, causando estresse oxidativo e degeneração celular. Utilizando
sistema de cromatografia em coluna, foi isolado o composto natansnin glicosídeo benzoílo,
que em seguida foi ensaiado pelo método do DPPH, demonstrando um alto potencial
antioxidante (60,6%) quando comparado ao controle positivo BHT (63,6%). Nos testes in
vivo, os ratos foram intoxicados com CCl4 e em seguida foram tratados com natansnin (20
mg/Kg de peso corporal). A leitura dos parâmetros demonstrou que ambas as doses
diminuíram os danos causados pelo estresse oxidativo induzido e inibiu a expressão de
proteínas inflamatórias, além da apoptose celular. O efeito protetor verificado pode estar
relacionado à atividade antioxidante do flavonóide natansnin. Dessa forma, o fato deste
composto ter sido isolado de uma samambaia só reforça a importância das atividades
biológicas deste grupo, como fontes de quimioconstituíntes de interesse clínico.
163
6. UM ESTUDO DE CASO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E
CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE Lygodium venustum SW.
E Pityrogramma calomelanos (L.) LINK.
Introdução
Lygodium venustum (Figura 1) é uma samambaia da família Lygodiaceae que
normalmente é vista crescendo em clareiras no interior da mata ou às margens de caminhos,
em áreas perturbadas, podendo apresentar comportamento ruderal, sendo observada em
terrenos baldios da zona urbana. A espécie caracteriza-se por apresentar pínulas com
tamanhos diferentes, onde as proximais são lobadas e maiores que as demais Por possuir
raque volúvel, com forma adaptativa de cipó, especializa-se no hábito lianescente, sendo
considerada, após atingir 50 cm de altura, uma exímia alpinista, enroscando-se e apoiando-se
geralmente em cipós, madeiras mortas ou arbustos, chegando a tingir mais de 5 m de altura
[61].
Figura 1: Fotografia da samambaia Lygodium venustum.
Fonte: autora
A utilização de L. venustum como planta medicinal tem sido registrada na
Mesoamérica por populações indígenas, entre outras, possuindo atividades antiséptica,
164
fungicida e tricomonicida, sendo indicada para o tratamento de dermatoses, micoses e
infecçõe [62]. É também usada no tratamento de desordens gastrointestinais e ginecobstétricas
e como antiinflamatório pós-parto [63]. É utilizada como um dos componentes para o preparo
tradicional da bebida de efeito alucinógeno, ayahuasca, entre os Sharanahua e os índios do
alto do rio Purus na Amazônia Peruana [26]. No Brasil, é utilizada por afro-brasileiros em
cultos místicos para banhos de limpeza, além de ser indicada na medicina popular para
nervosismo e instabilidade emocional [64, 65].
Pityrogramma calomelanos (Figura 2) pertence à família Pteridaceae e apresenta
distribuição subcosmopolita, sendo muito comum ser encontrada nos trópicos. Normalmente
cresce em solo areno-argiloso de barrancos; como terrícola em solos muito encharcados,
freqüentemente próxima da margem dos regatos ou do açude, exposta ao sol e com poucos
indivíduos. P. calomelanos é conhecida pelos nomes populares de feto-branco, avenca-branca
ou avenca-preta. A espécie se diferencia das outras da família por apresentar pinas
equilaterais; pínulas ascendentes e pela presença de indumento farináceo branco, amarelo ou
rosado na superfície abaxial da lâmina foliar [66,67, 68].
Figura 2: Fotografia da samambaia Pityrogramma calomelanos.
Fonte: autora
165
Na medicina popular é utilizada como planta ornamental e medicinal, sendo indicada
como adstringente, analgésica, anti-hemorrágica, peitoral, depurativa, emenagoga, antigripal,
anti-hipertensiva, antitérmico, antitussígeno e estimulante da circulação sangüínea, além de
ser indicada para tratamento de distúrbios renais [69, 70, 71].
Este estudo tem como objetivo avaliar o potencial antioxidante de extratos e frações
das pteridófitas L. venustum e P. calomelanos e investigar a existência de compostos fenólicos
(ácidos fenólicos e flavonóides), determinando o seu percentual.
Material e métodos
Material vegetal
L. venustum e P. calomelanos foram coletadas no município de Crato, Ceará – Brasil,
na encosta da Chapada do Araripe em uma localidade chamada Grangeiro (Figuras 3 e 4).
Foram produzidos extratos etanólicos e a partir destes foram obtidas as frações
hexânica, diclorometano, acetato de etila e metanólica para L. venustum e hexânica,
clorofórmica, acetato de etila e metanólica para P. calomelanos.
Prospecção química qualitativa
A análise fitoquímica qualitativa preliminar para detectar as presenças de classes de
metabólitos secundários como taninos, flavonóides e alcalóides foi realizada seguindo um
método de prospecção fitoquímica já descrito anteriormente [72].
Quantificação de compostos fenólicos por HPLC-DAD
As análises cromatográficas de fase reversa foram realizadas sob condições de
gradiente usando coluna C18 (4.6 mm x 250 mm) empacotada com partículas de diâmetro de
5μm; como fase móvel foi usada água contendo 2% ácido acético (A) e metanol (B), e a
composição do gradiente foi: 5% de B até 2 minutos com mudança para 25%, 40%, 50%,
60%, 70% e 100% B, 10, 20, 30, 40, 50 e 80 minutos, respectivamente, seguindo o método
descrito por Laghari [73] com pequenas modificações.
166
Figura 3: Mapas com localização da área de coleta de Lygodium venustum e Pityrogramma
calomelanos
Fontes: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceara_Municip_Crato.svg , acesso em 15 de novembro de
2011; Centro de Processamento Remoto – Brasília – DF;
Figura 4: Fotografia da área de coleta: Encosta da Chapada do Araripe-Apodi, no município
do Crato, Ceará, Brasil.
Fonte: autora
167
As amostras (extratos e frações) foram analisadas, dissolvendo em etanol a uma
concentração de 3 mg/mL. A presença de seis compostos fenólicos foi investigada: ácidos
gálico, clorogênico e caféico e os flavonóides quercetina, rutina e kampferol. A identificação
destes compostos foi realizada comparando seu tempo de retenção e espectro de absorção UV
com padrões de referência. A vazão foi de 0.6 mL/min, volume de injeção 40 μL e o
comprimento de onda 254 nm para ácido gálico, 325 nm para ácido caféico e clorogênicos, e
365 nm para quercetina, rutina e kampferol. Todas as amostras e a fase móvel foram filtradas
com filtro de membrana 0.45 μm (Millipore) e então, desgaseificado por banho ultra-sônico
antes do uso. Soluções estoque de padrões de referência formam preparadas na fase móvel na
HPLC em uma faixa de concentração de 0.020 – 0.200 mg/mL para kampferol, quercetina e
rutina; e 0.050 – 0.250 mg/ml para ácidos gálico, caféico e clorogênico. Os picos foram
confirmados por cromatograma, comparando o seu tempo de retenção com padrões de
referência e espectros DAD (200 para 400 nm). Curva de calibração para ácido gálico: Y =
10523x + 1478.8 (r = 0.9999); ácido caféico: Y = 12765x + 1381.7 (r = 0.9995); rutina: Y =
12691 – 1165.0 (r = 0.9998); quercetina: Y = 13495x – 1092.6 (r =0.9999) e kampferol: Y =
15692x – 1218.1 (r = 0.9997). Todas as operações cromatográficas foram realizadas à
temperatura ambiente e em triplicata.
Avaliação da atividade antioxidante – DPPH
Para a avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o método fotocolorimétrico do
2,2-difenil,1- picrilhidrazila (DPPH), segundo Choi et al. [74]. Foi utilizado o extrato bruto e
as frações nas concentrações de: 1 a 500 µg/mL em etanol (2,5 mL). A 2,5 mL de cada
amostra, foi adicionado 1 mL da solução de DPPH 0,3 Mm. As soluções permaneceram no
escuro em temperatura ambiente e após 30 minutos, foram feitas as leituras das absorbâncias
em espectrofotômetro (Shimadzu- UV-1201) a 518 nm, onde o radical DPPH apresenta o
máximo de absorção. Uma solução de DPPH (1 mL; 0,3 nM) em etanol (2,5 mL) foi usada
como controle negativo e uma preparação de ácido ascórbico como padrão (controle positivo),
em concentrações que variavam de 1 a 100 µg/mL. O etanol foi usado para zerar o
espectrofotômetro, tendo como brancos as soluções testes de cada amostra (sem adição do
DPPH), visando minimizar a interferência de componentes das amostras na leitura. O ensaio
foi realizado em triplicata e o cálculo da atividade antioxidante seguiu a equação:
168
%inibição = 100 – Abs amostra – Abs branco x 100
_____________________________
Abs controle
Onde: Abs amostra é a absorbância das frações e do extrato bruto; Abs branco é a absorbância das
frações e do extrato bruto sem adição do DPPH e Abs
controle
é a absorbância da solução de
DPPH em etanol. Os testes foram realizados em duplicata com três repetições. Foi calculada a
percentagem de inibição do radical DPPH e construído um gráfico de porcentagem de
inibição versus a concentração do extrato e das frações.
Análise estatística
Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como média
± desvio padrão (DP). Diferenças foram estimadas por meio da análise de variância
(ANOVA) seguida por teste de diferença significativa mínima (DSM). Valores de
probabilidade inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados e Discussão
A Avaliação fitoquímica preliminar (screening) de L. venustum indicou a presença de
fenóis, taninos, flavonóides e alcalóides. Para Pityrogramma calomelanos o screening do
extrato revelou a presença de alcalóides, catequinas, chalconas, sapononas, flavonóides e
fenóis. Estes compostos exercem importantes funções na defesa e conservação das espécies
no meio ambiente.
Pelo método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi possível
detectar e quantificar a presença de conteúdos fenólicos das espécies. Extrato e frações das
samambaias revelaram a presença do ácido gálico
A1
(tR =17,83 min; pico 1), ácido
clorogênicoA2 (tR = 28,14 min; pico 2), ácido caféicoA3 (tR = 34,09 min; pico 3), rutinaF (tR =
42,11 min; pico 4), quercetinaF (tR = 49,78 min; pico 5) e kaempferolF (tR = 58,96 min; pico
de 6) (Figuras 5 e 6), demonstrando portanto, que os produtos naturais em análise contêm
flavonóides do grupo dos flavonóisF e compostos fenólicos ácidos (derivado do ácido
benzóicoA1, derivado do ácido fenilacrílicoA2 e derivado do ácido cinâmicoA3, cujos
percentuais estão dispostos nas tabelas 2 e 3.
169
Figura 5 – Perfil representativo de cromatografia liquida de alta eficiência da fração acetato
de etila de Lygodium venustum FAELV (a); fração diclorometane de L. venustum FDMLV
(b); extrato etanol de L. venustum EELV (c); fração metanólica de L. venustum FMLV (d) e
fração hexânica de L. venustum FHLV (e). A detecção UV foi feita a 327nm. para ácido
gálico (pico 1), ácido clorogênico (pico 2), ácido cafeico (pico 3), rutina (pico 4), quercetina
(pico 5) e kampferol (pico 6).
170
Figura 6 – Perfil representativo de cromatografia liquida de alta eficiência da fração acetato
de etila de Pityrogramma calomelanos FAEPC (a); fração clorofórmica de P. calomelanos
FCPC (b); extrato etanol de P. calomelanos EEPC (c); fração metanólica de P. calomelanos
FMPC (d) e fração hexânica de P. calomelanos FHPC (e). A detecção UV foi a 327nm. para
ácido gálico (pico 1), ácido clorogênico (pico 2), ácido cafeico (pico 3), rutina (pico 4),
quercetina (pico 5) e kampferol (pico 6).
171
Tabela 2. Composição de compostos fenólicos e flavonóides em Lygodium venustum SW
Produto natural
Ácido gálico
Ácido clorogênico
Ácido cafèico
Rutina
Quercetina
Kampferol
FAELV mg/g
3.07 ± 0.01a
6.65 ± 0.03b
13.02 ± 0.04c
10.74 ± 0.02d
59.83 ± 0.01e
11.09 ± 0.01cd
FAELV %
0.30
0.66
1.30
1.07
5.98
1.10
FDCMLV mg/g
0.62 ± 0.03a
0.57 ± 0.01b
0.71 ± 0.01ab
-
0.80 ± 0.02b
3.93 ± 0.01c
FDCMLV %
0.06
0.05
0.07
-
0.08
0.39
EELV mg/g
1.76 ± 0.01a
6.12 ± 0.01b
2.95 ± 0.03c
3.28 ± 0.01c
6.05 ± 0.05b
-
EELV %
0.17
0.51
0.29
0.32
0.60
-
FMLV mg/g
2.02 ± 0.03a
11.39 ± 0.02b
3.91 ± 0.03c
6.16 ± 0.01c
1.88 ± 0.01a
-
FMLV %
0.20
1.13
0.39
0.61
0.18
-
FHLV mg/g
1.53 ± 0.02a
0.70 ± 0.03b
0.64 ± 0.07b
0.44 ± 0.01c
0.75 ± 0.01b
0.86 ± 0.03d
FHLV %
0.15
0.07
0.06
0.04
0.08
0.09
Os resultados são expresssos com media ± desvio padrão (DP) de três determinações médias, seguidas de letras
diferentes de acordo com o teste de Tukey p < 0.005. FAELV: fração acetato de etila de L. venustum; FDCMLV:
fração diclorometano de L. venustum; EELV: extrato etanólico de L. venustum; FMLV: fração metanólica de L.
venustum; FHLV: fração hexânica de L. venustum.
Tabela 3. Composição de compostos fenólicos e flavonóides em Pityrogramma calomelanos
(L.) Link.
Produto natural
Ácido gálico
Ácido clorogênico
Ácido cafèico
Rutina
Quercetina
Kampferol
FCPC mg/g
2.65 ± 0.01a
18.09 ± 0.04b
11.48 ± 0.09c
5.73 ± 0.01a
9.38 ± 0.05c
22.52 ± 0.01d
FCPC %
0.26
1.70
1.14
0.57
0.93
2.25
FAEPC mg/g
2.08 ± 0.03a
36.49 ± 0.11b
27.13 ± 0.02c
9.22 ± 0.01d
36.89 ± 0.03b
48.03 ± 0.03e
FAEPC %
0.20
3.64
2.71
0.92
3.68
4.80
EEPC mg/g
10.07 ± 0.03a
33.52 ± 0.01b
8.19 ± 0.04a
28.03 ± 0.01c
5.44 ± 0.02d
12.75 ± 0.09a
EEPC %
1.00
3.35
0.81
2.80
0.54
1.27
FMPC mg/g
9.37 ± 0.05a
30.15 ± 0.02b
6.84 ± 0.01c
20.63 ± 0.01d
1.19 ± 0.03e
9.96 ± 0.01a
FMPC %
0.93
3.01
0.68
2.06
0.11
0.99
FHPC mg/g
-
1.05 ± 0.01a
4.59 ± 0.03b
-
1.14 ± 0.02a
0.93 ± 0.01a
FHPC %
-
0.10
0.45
-
0.11
0.09
Os resultados são expresssos com media ± desvio padrão (DP) de três determinações médias, seguidas de letras
diferentes de acordo com o teste de Tukey p < 0.005. FAEPC: fração acetato de etila de P. calomelanos; FCPC:
fração clorofórmica de P. calomelanos; EEPC: extrato etanólico de P. calomelanos; FMPC: fração metanólica
de P. calomelanos; FHPC: fração hexânica de P. calomelanos.
172
Os ácidos clorogênico e caféico, bem como o flavonóide quercetina tiveram sua
presença registrada tanto nos extratos quanto nas frações de ambas as plantas. O ácido gálico
e a rutina, entretanto, não foram encontrados na fração hexânica de P. calomelanos e a rutina
estava ausente na fração diclorometano de L. venustum. O kaempferol também não constava
na fração metanólica, nem no extrato etanólico desta espécie.
Compostos fenólicos e alguns de seus derivados são considerados agentes eficazes na
prevenção da oxidação, inibindo ou eliminando radicais livres que comprometem os sistemas
orgânicos. São muito reativos quimicamente e a maior parte destes encontra-se sob a forma de
ésteres ou de heterosídeos, sendo solúveis em água e em solventes orgânicos polares [75].
Conforme os dados obtidos, observou-se que o teor de compostos fenólicos totais
presentes em P. calomelanos foi mais alto do que o encontrado em L. venustum. A quercetina,
o flavonóide encontrado em maior quantidade em L. venustum apresentou maior afinidade
com o solvente acetato de etila, o mesmo ocorrendo com o flavonóide kaemferol, composto
majoritário de P. calomelanos. A fração acetato de etila foi, entre todos os produtos naturais
testados, a que mais se destacou em conteúdo fenólico e os mais baixos teores foram
verificados na fração hexânica em ambas as plantas. A ocorrência está de acordo com que foi
o preconizado por Simões et al. [75], ao afirmar que flavonóides são preferencialmente
extraídos pelo solvente acetato de etila.
No screening por atividade antioxidante e compostos fenólicos realizado por Lai e
Lim [59], P. calomelanos constou entre as quinze espécies avaliadas e seus dados mostraram
que esta apresentou uma quantidade moderada de compostos fenólicos no extrato metanólico,
porém os autores não chegaram a especificar quais e em que percentuais estavam presentes.
Vale ressaltar que estes ensaios foram realizados utilizando extrato metanólico, enquanto
nosso estudo avaliou, além do extrato (etanólico), frações com polaridades diferentes.
Esta foi a primeira triagem para compostos fenólicos em L. venustum. Jeetendra e
Manish [76] analisaram diferentes tipos de extrato de outra espécie do mesmo gênero, L.
flexuosum, e encontraram quantidades consideráveis dos compostos que variavam de acordo
com o extrator utilizado, encontrando-se mais elevados quando extraídos pelo solvente
metanol. Em L. venustum e P. calomelanos, a fração metanólica foi a segunda melhor fração
extratora, só perdendo para acetato de etila, esta também considerada polar.
A capacidade de inibir a formação de radicais livres pode ser medida, entre outros
métodos, pela descoloração da solução etanólica pelo DPPH. Segundo o método descrito por
Choi, [74] A solução de DPPH absorve na banda de 518 nm que mede a intensidade da
173
coloração violeta. Na presença de boa atividade contra radicais livres ocorre descoloração
[77].
A atuação do ácido ascórbico (conhecida substância antioxidante) ligando-se ao
radical livre 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila (DPPH) é usada muitas vezes como parâmetro
para avaliar o poder antioxidante de extratos e frações de plantas in vitro [78].
O IC50 de extratos etanólicos e frações foram obtidos através da equação das retas y =
- 0,7104x + 98,01 n = 6 (R = 0,9953) e y = - 16,51ln(x) + 112,25 n = 6 (R2 = 0,8764),
respectivamente (Figuras 7 e 9). Foram considerados os quatro primeiros pontos da curva,
resultando no IC50 de ambas as pteridófitas. Para o ácido ascórbico o IC50 foi estimado
matematicamente a partir da primeira concentração utilizada (7,81µg/mL), que demonstrou
atividade antioxidante próxima ou superior a 50%. Para o ácido ascórbico não foi possível
demonstrar linearidade nas demais concentrações testadas. O ácido ascórbico, cuja atividade
antioxidante é bastante documentada, apresentou um IC50 de 17,64 e 8,47 µg/mL.
Figura 7. Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico
de Pityrogramma calomelanos (EEPC); fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos
(FAEPC); fração clorofórmica de P. calomelanos (FCPC); fração metanólica de P.
calomelanos (MFPC) e fração hexânica de P. calomelanos (FHPC).
Em nosso estudo verificou-se que entre todos os produtos analisados, os extratos
etanólicos de P. calomelanos e L. venustum exibiram os melhores resultados para atividade
antioxidante, apresentando respectivamente IC50 nas concentrações de 43,4 µg/mL e 67,58
µg/mL (Figuras 8 e 10). Já no que dizem respeito às frações, as plantas divergiram em
potencial de atividade uma vez que aquela que apresentou melhor desempenho em P.
174
calomelanos foi a metanólica, enquanto a acetato de etila foi a que mais se destacou quanto a
capacidade de seqüestrar radicais livres, entre todas as frações de L. venustum.
Este comportamento pode ser justificado devido à presença de compostos com
propriedades polares nos extratos, como é o caso dos ácidos fenólicos e flavonóides, os quais
possuem comprovada atividade antioxidante.
Figura 8. Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do ácido ascórbico (padrão);
extrato etanólico de Pityrogramma calomelanos (EEPC); fração acetato de etila de
Pityrogramma calomelanos (FAEPC); fração clorofórmica de P. calomelanos (FCPC); fração
metanólica de P. calomelanos (MFPC) e fração hexânica de P. calomelanos (FHPC), bem
como seus respectivos valores de EC50.
Figura 9. Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico
de Lygodium venustum (EELV); fração acetato de etila de Lygodium venustum (FAELV);
fração diclorometano de L. venustum (FDMLV); fração metanólica de L. venustum (FMLV) e
fração hexânica de L. venustum (FHLV).
175
Diversas pesquisas têm evidenciado a presença de quercetina e kaempferol em
samambaias e algumas delas inclusive têm demonstrado que estes compostos, alguns já
isolados e apropriadamente descritos, contribuem efetivamente na captação de radicais livres
e auxiliam na proteção de moléculas essenciais à vida, como foi o caso do estudo realizado
por Chowdhary, anteriormente descrito.
Figura 10. Gráficos do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do ácido ascórbico
(padrão); extrato etanólico de Lygodium venustum (EELV); fração acetato de etila de
Lygodium venustum (FAELV); fração diclorometano de L. venustum (FDMLV); fração
metanólica de L. venustum (FMLV) e fração hexânica de L. venustum FHLV, bem como seus
respectivos valores de EC50.
O potencial antioxidante de ácidos fenólicos caféico e clorogênico já é conhecido [79],
possuindo boa atividade antioxidante em sistemas lipídicos e na inibição da peroxidação
celular.
Os resultados obtidos a partir deste estudo indicam que as espécies analisadas possuem
compostos químicos capazes de capturarem radicais livres, e estas substâncias podem ser
consideradas promissoras na busca de fármacos antioxidantes que previnem doenças
decorrentes do estresse oxidativo.
Vale ressaltar que o teste do DPPH não permite uma
definição precisa dos efeitos antioxidantes por se tratar de uma metodologia in vitro [80]. É
sabido que a atividade de extratos e frações de plantas não podem ser avaliadas apenas por um
método [74]; portanto, torna-se necessário um estudo in vivo para determinar se estas espécies
medicinais poderão ser utilizadas em escala industrial.
176
CONCLUSÃO
As pesquisas etnobiológicas têm demonstrado ao longo dos anos que diversas espécies
de plantas são os produtos naturais mais utilizados pelas populações humanas. Sem duvida
alguma, a ampla biodiversidade da pteridoflora mundial fornece variedades de espécies ricas
em compostos biologicamente ativos, que por sua vez, são capazes de restabelecerem a
homeostase afetada por microrganismos, vírus e estresse oxidativo, entre outros fatores.
A relativa fragilidade dos sistemas orgânicos nos coloca diante de emergentes e
reemergentes ameaças à saúde. Com isso, novos desafios surgem a cada vez que somos
expostos a elas. A luta incessante pela vida, nossa e de outros seres, é uma guerra onde ambos
os lados lançam mão dos mais variados artifícios e mecanismos de sobrevivência. Em cada
batalha, os produtos naturais com suas estratégias de defesa, são colocados propositalmente a
nosso favor, e a partir destes, “fórmulas mágicas”, os fármacos, são criadas com o objetivo de
desarticularem as defesas dos agressores ou reequilibrarem moléculas e sistemas avariados,
numa tentativa constante para o restabelecimento do bem-estar humano.
O estudo realizado para composição deste capítulo permitiu reconhecer o quanto as
pteridófitas são necessárias às populações, contribuindo de forma efetiva para a cura ou
tratamento de enfermidades em localidades onde os sistemas de saúde são precários ou
inexistentes. Porém, constatou-se também, que as potencialidades deste grupo de vegetal
estão ainda muito longe de serem plenamente conhecidas. O conhecimento empírico de fato
tem sido o principal contribuinte na elucidação das propriedades biológicas das pteridófitas,
entretanto, o conhecimento racional e científico, sem dúvida alguma, é um aspecto decisivo
para a segurança de seu uso em terapias.
Em suma, diante de tantas atividades biológicas exibidas por diferentes e numerosas
espécies de pteridófitas, uma quantidade maior de estudos ainda se faz necessário. Um olhar
especial e criterioso deve ser dado a este grupo em investigações mais aprofundadas e
também mais abrangentes, tendo em vista a sua abundância em biodiversidade, ampla
distribuição mundial em regiões propícias e, evidentemente, seu uso pelas populações desde
tempos antigos onde apenas se poderia contar com a riqueza do seu extrato bruto.
177
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183
AGRADECIMENTOS
Aos membros dos Laboratórios de Bioquímica Toxicológica e Farmácia Industrial da
Universidade Federal de Santa Maria – RS, Brasil, com menção especial a Rogério de Aquino
Saraiva, Diones Caeran Bueno e Pablo Andrei Nogara e Aline Augusto Boligon pela
realização dos ensaios laboratoriais.
184
O capítulo foi aceito pela Nova Science Publishers para compor a obra intitulada
"Natural Products: Structure, Bioactivity and Applications".
---------- Forwarded message ---------From: <[email protected]>
Date: 2011/11/22
Subject: Publication Cooperation
To: [email protected]
Dear Dr. Coutinho,
Good day. Thank you for your email message. I am pleased to confirm preliminary
acceptance of your chapter based on the abstract received. Please send the final version by
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listed below. If the file(s) for the chapter exceeds 10MB in size, please contact Nova at the
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opportunity, we invite you to visit our website at novapublishers.com. We will be sending
electronic page proofs. As soon as a book is listed, the codes in the status field on the Nova
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A copyright transfer form must accompany the full chapter. It is specifically stipulated that no
permission is required of the publisher by the author to republish or reuse any tables or
graphics contained in the article in other published works or research or oral presentations.
We look forward to working together.
Sincerely yours,
Nadya Gotsiridze-Columbus
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Fax: 631-231-8175
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P.S. Should you have any proposals now or in the future for a separate book under your
authorship or editorship please see our Publication Idea Form in the attachment to this email
for your perusal.
Date: Sun, 20 Nov 2011 19:52:19 -0300
Subject: Proposal of chapter
Dear sir, attached to this e - mail I´m sending the abstract proposal of a chapter for the book
entitled "Natural Products: Structure, Bioactivity and Applications".
Sincerely yours.
185
CONCLUSÕES
186
6 CONCLUSÕES
 A análise fitoquímica do extrato etanólico de L. venustum revelou a presença de
importantes classes de metabólitos secundários, sendo eles taninos, flavonóides e
alcalóides.
 L. venustum não apresentou atividades antibacteriana e antifúngica isoladamente nas
concentrações testadas.
 Extrato e frações não modularam o efeito das drogas utilizadas como antifúngicas
contra os fungos do gênero Candida.
 L. venustum potencializou a ação dos aminoglicosídeos amicacina, canamicina,
neomicina e gentamicina contra Escherichia coli 27 e Staphylococcus aureus 358.
 A fração acetato de etila potencializou o efeito de todos os aminoglicosídeos.
 Nenhum efeito modulatório foi observado contra Pseudomonas aeruginosa 03.
 Extrato e fração acetato de etila contribuíram de forma aditiva para a inibição dos
microrganismos quando associado a drogas.
 A fração acetato de etila apresentou interação sinérgica associada à amicacina contra
E. coli 27.
 Apenas a fração diclorometano não exibiu citotoxicidade. O extrato e as demais
frações apresentaram variações de alta a nenhuma citotoxicidade em 100 µg/mL.
 As frações metanólica e hexânica demonstraram moderada atividade tripanocida.
 A atividade antileishmania revelou-se insignificante para extrato e frações de L.
venustum, exceto para a fração metanólica que exibiu efeito moderado.
187
 De todos os produtos testados, o extrato etanólico e a fração acetato de etila exibiram o
potencial antioxidante mais expressivo, destacando-se entre os demais.
 A fração acetato de etila contém compostos químicos de grande relevância para as
atividades biológicas apresentadas pela samambaia, tais como atividade antioxidante e
moduladora de antibióticos.
 A fração metanólica apresenta fitoconstuíntes importantes para a ação antiparasitária e
não apresenta citoxicidade.
 L. venustum poderá ser fonte de agentes antimicrobianos em compostos multidrogas.
188
REFERÊNCIAS
189
REFERÊNCIAS
Aquí estarão disponibilizadas as referências da introdução, da revisão de literatura e da
metodología. As referências da parte dos resultados e discussão encontram-se apresentadas no
final dos artigos e do capítulo do livro.
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Internal
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-
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Pemberton,
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a Biocontrol Science and Technology 19:
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the
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climbing
weed,
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Old
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Lygodium
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samambaias
em 24 (2): 13-20.
remanescente de Floresta Atlântica
Nordestina, Paraíba, Brasil
Ultrasonic-assisted
Extraction
of Zheng, N.; Zhang, S.; Wang, T.; Lin, J.
Total Polyphenol from Seeds of Chinese
Syzygium
jambos
by
of
of
Experimental
Response Traditional Medical Formulae. 2011-
Surface Methodology.
Enhancement
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antioxidant
and Gou, J.; Zou, Y.; Ahn, J. Food Science
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superbus,
Polygonum
aviculare,
Sophora flavescens, and Lygodium
japonicum by pressure-assisted water
extraction.
222
Control
of
Invasive
Japanese Bohn, K.K.; Minogue, P.J.; Pieterson,
Climbing Fern (Lygodium japonicum) E.C.
Ecological
Restoration.
29
and Response of Native Ground (4):346-356.
Cover
During
Restoration
of
a
Disturbed Longleaf Pine Ecosystem.
Laboratory
hostrange
Austromusotim
of Boughton, A.J.; Buckingham, G.R.;
acamptozonale Bennett,
C.A.;
(Lepidoptera: Crambidae), a potential Goolsby, J.A.;
Zonneveld,
R.;
Pemberton, R.W. ;
biological control agent of Old World Center, T. D. Biocontrol Science and
climbing
fern,
Lygodium Technology. 21 (6): 643-676.
Impact of climatic factors on leaf roll- Muthuraj,
inducing
mite,
perrepae (Acari:
B.
;Jesudasan,
R.W.A.
Floracarus International Journal of Acarology. 37
Eriophyidae) (4): 325-330.
feeding on the Old World climbing
fern, Lygodium
microphyllum
(Pteridophyta: Lygodiaceae).
Identification and Research Ad
vance on Pharmaceutical Science of Zhao P et al. Journal of Anhui
Lygodium Sw. Plants.
Agricultural Sciences. 2011-14.
Experimental Study of Lygodium's Chen L. China Pharmaceuticals. 2011Liposoluble Constituent for Treating 4.
Scald in Mouse.
Invasion of a Southeastern Pine Leichty, E.R.; Carmichael, B.J.; Platt,
Savanna by Japanese Climbing Fern.
W.J. Castanea 76(3):293-299.
Studies on antimicrobial activities of Mandal, A.; Mondal, A.K. African
223
some selected ferns and lycophytes in Journal of Plant Science Vol. 5(7), pp.
Eastern India with special emphasis 412-420.
on ethno-medicinal uses
224
ANEXOS
225
ANEXO A – OUTRAS PRODUÇÕES CIENTÍFICAS VINCULADAS AO PROJETO
Resumos publicados em anais de congressos
BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.; SANTOS, K. K.A.; GUEDES, G.M.M ; SOUZA,
E.S.S; COSTAS, J.G.M.; MENEZES, I.R.A ; SARAIVA, A.A.F; COUTINHO, H.D.M.
Potentiation of aminoglycosides antibiotic activity by Lygodium venustum (SW) against mrsa.
In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM 2011. Foz do Iguaçu.
2011.
BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.; SANTOS, K.K.A. ; GUEDES,G.M.M ; TINTINO,S.R ;
TAVARES.C.C.A ; LEITE, N.F. ; COSTAS, J.G.M. ; SARAIVA, A.A.F ; COUTINHO, H.
D.M . In vitro interference of Lygodium venustum in the Escherichia coli resistance to
aminoglycosides. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM 2011,
2011, Foz do Iguaçu. 2011.
BUENO, D.C.; NOGARA, P.A.I.; SARAIVA, R.A.; BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.S.;
BOLIGON, A.A.; ATHAYDE, M.L.; SARAIVA, A.A.F.; ROCHA, J.B.T. “Identificação de
polifenóis e atividade antioxidante de extratos e frações das folhas de Pityrogramma
calomelanos L. (Pteridaceae) e Lygodium venustum SW. (Schizaeaceae). III SIMPÓSIO DE
BIODIVERSIDADE – Filosofia da Ciência e a Prática Científica. Santa Maria, RS, 2011.
226
ANEXO B – PRODUÇÕES CIENTÍFICAS NÃO VINCULADAS AO PROJETO
Resumos publicados em anais de congressos
SOUZA, T.M.; BRAGA, M.F.B.M.; COUTINHO, H.D.M.; SARAIVA, A.A.F ; MENEZES,
I.R.A.;
COSTA,
J.G.M.;
TINTINO,S.R.
Enhancement
of
antibiotic
activity
of
aminoglycosides by natural products from Pityrogramma calomelanos against Escherichia
coli. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu
2011. 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu. 2011.
SOUZA, T.M.; BRAGA, M.F.B.M.; COUTINHO, H.D.M.; SARAIVA, A.A.F.; MENEZES,
I.R. A.; COSTA, J.G.M.; SOBRAL-SOUZA, C.E, GUEDES, G.M.M Modifying-antibiotic
activity of natural products from Pityrogramma calomelanos associated with aminoglycosides
against MRSA. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do
Iguaçu. 2011. 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do
Iguaçu. 2011.
TINTINO, S.R ; SANTOS, K.K.A. ; BRAGA, M.F.B.M. ; VEGA, C. ; COUTINHO, H.D.M
Atividade citotóxica e tripanocida de extrato etanólico e fraçoes de Piper arboreum. In: XX
ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011, Fortaleza. XX
ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011
BARRETO, H.M.; LIMA.S.I. ; BRAGA, M. F. B. M.; TAVARES, C.C.A ; TINTINO,S.R.;
COUTINHO, H.D.M. Modulation of antibiotic resistance on multirresistant bacterial strains
by essential oil of Rosimarinus officinales L.. In: XX ITALO-LATINAMERICAN
CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011, Fortaleza. XX ITALO-LATINAMERICAN
CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011.
227
Artigos publicados
HENRIQUE D.M. COUTINHO, EDINARDO F.F. MATIAS, KARLA K.A. SANTOS,
FRANCISCO A.V. SANTOS, MARIA FLAVIANA B. MORAIS-BRAGA, TEÓGENES
M. SOUZA, JACQUELINE COSMO ANDRADE, CELESTINA E.S. SOUZA, SAULO R.
TINTINO, GLÁUCIA M.M. GUEDES, VIVYANNE S. FALCÃO-SILVA, JOSÉ P.
SIQUEIRA-JÚNIOR, JOSÉ G.M. COSTA. Modulation of the norfloxacin resistance in
Staphylococcus aureus by Croton campestris A. and Ocimum gratissimum L. Biomédica
2011, 31: 608-612.
SANTOS, KARLA K.A. DOS; MATIAS, EDINARDO F.F.; TINTINO, SAULO R.;
SOUZA, CELESTINA E.S.; BRAGA, MARIA F.B.M.; GUEDES, GLÁUCIA M.M.;
ROLÓN, MIRIAM; VEGA, CELESTE; DE ARIAS, ANTONIETA ROJAS; COSTA, JOSÉ
G.M.; MENEZES, IRWIN A.; COUTINHO, HENRIQUE D.M.. Cytotoxic, Trypanocidal,
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SANTOS, ISRAEL J.M.; MATIAS, EDINARDO F.F.; SANTOS, KARLA K.A.; BRAGA,
MARIA F.B.M.; ANDRADE, JACQUELINE C.; SOUZA, TEÓGENES M.; SANTOS,
FRANCISCO A.V.; SOUSA, ANA CARLA A.; COSTA, JOSÉ G.M.; MENEZES, IRWIN
R.A.; ALVES, RÔMULO R.N.; ALMEIDA, WALTECIO O.; COUTINHO, HENRIQUE
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(Spix, 1825) and Tropidurus semitaeniatus (Spix, 1825) Used by the Traditional Medicine.
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (Print), v. 2012, p. 1-6, 2012.
SANTOS, K.K.A.; MATIAS, E.F.F ; SOUZA, E.S.S ; TINTINO, S.R ; MORAIS-BRAGA,
M.F.B.; GUEDES, G.M.M ; ROLÓN M.; VEGA C.; ROJAS DE ARIAS A ; COSTAS,
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SANTOS, K.K.A.; MATIAS,E.F.F; SOUZA,E.S.S; TINTINO,S.R; MORAIS-BRAGA,
M.F.B.; GUEDES, G.M.M.; NOGUEIRA, L.F.; MORAIS, E.C.; COSTA, J.G.M.;
MENEZES, I.R.A.; COUTINHO, H.D.M.. Anti-Candida activity of Mentha arvensis and
Turnera ulmifolia. Journal of Medicinal Food, 2011.
228
Artigos aceitos para publicação
GUERRA, F.Q.S ; MENDES, J.M. ; SOUSA, J.P ; BRAGA, M. F. B. M.; SANTOS, B.H.C.;
COUTINHO, H.D.M; LIMA, E. O. . Increasing of the Antibiotic Activity against a Multidrug
Resistant Acinetobacter spp by essential oil of Citrus limon and Cinnamomum zeylanicum.
Natural Product Research (Print), 2012.
ARARUNA, M.K.A.; MORAIS-BRAGA, M.F.B.; SOUZA, T.M.; BRITO, S.A.; SANTOS,
K.K.A.; Leite, T.R.; COSTAS, J.G.M.; COUTINHO, H.D.M . Evaluation of antibiotic and
antibiotic modifying activity of pilocarpine and rutin. Indian Journal of Medical Research,
2011.
MATIAS, E.F.F ; SANTOS.F.V.A ; SOUZA,E.S.S ; SANTOS, K. K. A. ; TINTINO,S.R ;
MORAIS BRAGA, M.F.B. ; ALMEIDA, T. S. ; COSTA, J. G. M. ; MENEZES, I..R.A ;
COUTINHO, H. D. M . Screening the in vitro modulation of antibiotic activity of the extracts
and Fractions of Ocimum gratissimum L. Afr J Microbiol RES, 2011.
KARLA K.A. SANTOS, EDINARDO F.F. MATIAS, CELESTINA E. SOBRAL-SOUZA,
SAULO R. TINTINO, MARIA F.B. MORAIS-BRAGA, GLAUCIA M.M. GUEDES,
MIRIAM ROLÓN, CELESTE VEGA, ANTONIETA ROJAS DE ARIAS, JOSÉ G.M.
COSTA, IRWIN R.A. MENEZES, HENRIQUE D.M. COUTINHO. Evaluation of the antiTrypanosoma and anti-Leishmania activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia. Boletin
Latino Americano de PLantas Medicinales Y aromáticas, 2012.
SOUZA, T. M. ; MORAIS-BRAGA, M.F.B. ; COSTAS, J.G.M. ; SARAIVA, A.A.F ;
COUTINHO, H.D.M. Enhancement of antimicrobial activity of antibiotics and antifungals by
the use of natural products from Pityrogramma calomelanos (L.). Archives Of Biological
Sciences, 2012.

MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA

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