“Microarrays” Reais e Virtuais: Passo a Passo

“Microarrays” Reais e
Virtuais: Passo a Passo
Anastasios Koutsos
Alexandra Manaia
Julia Willingale-Theune
Versão 2.3
Versão
Portuguesa
ELLS – European Learning Laboratory for the Life Sciences
Anastasios Koutsos, Alexandra Manaia e Julia Willingale-Theune
“Microarrays” Reais e Virtuais: Passo a Passo
Versão 2.3
“ M i c r oarrays”
R e a i s e Virtuais
“Microarrays” reais: passo a passo
“Microarray” virtual: passo a passo
Produção dos fragmentos de ADN
O tapete
Para produzir os microarrays os cientistas:
Pode fabricar o seu próprio tapete ou pode
- usam a “PCR (polymerase chain reaction)”,
técnica de amplificação de ADN que produz
milhares de pequenos fragmentos de ADN em
cadeia dupla.
- ou, caso conheçam a sequência nucleotídica
escrever-nos ([email protected]) e encomendar a
versão do tapete em plástico (1x2.5 m),
especialmente concebida para ser utilizada na
sala de aula por 40 Euros (não incluindo custos
de envio).
do gene, podem encomendar a produção de
fragmentos em cadeia simples com idêntica
composição nucleotídica.
Impressão ou “spotting”
Impressão ou “spotting”
Os microarrays de ADN podem ser facilmente
No “Microarray Virtual”, um tapete de tecido
produzidos no laboratório usando lâminas de
representa a lâmina de vidro contendo 10 spots.
vidro, como as que são correntemente utilizadas
Cada “spot” contém fragmentos de ADN em
em microscopia. Imprimir 20 000 pequeníssimos
cadeia simples, específicos de um destes 10
“spots ” de ADN (cada “spot” contendo biliões
genes: Alexandre Fleming, Jacques Monod,
de cópias de ADN de um mesmo gene) numa
Thomas Morgan, Barbara Mcclintock, Leo
pequena superfície é uma tarefa muito difícil.
Szilárd, John Kendrew, Francis Crick, Rosalind
Os “spots” têm de ser exactamente da mesma
franklin, Maurice Wilkins e James Watson. As
forma e equidistantes uns dos outros. Estas
moléculas de ADN são representadas por Velcro
dificuldades conseguem ser ultrapassadas
colorido. Por exemplo, para o gene John
graças à utilização de robots no fabrico dos
Kendrew, os fragmentos de Velcro são
“microarrays”.
vermelhos. Terá que colocar os fragmentos
de Velcro correspondentes a cada gene, no
respectivo “spot” (círculo), no seu tapete de
“microarray”.
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O braço do robot transporta um conjunto
especial de 48 tubos capilares em ouro até
aos reservatórios, onde se encontram as várias
soluções de fragmentos de ADN que vão ser
impressos nas lâminas. Como estes capilares
são muito sofisticados, delicados e caros, o
robot está equipado com apenas 48, que são
utilizados inúmeras vezes. O braço do robot
mergulha os capilares nas amostras, retira-as e
posiciona-se sobre uma fila de lâminas de vidro
pré-tratadas. Então, pressiona ligeiramente os
capilares, de modo a que cada capilar deposite
200nl de amostra na lâmina de vidro. Quando
uma linha de “spots” fica impressa na primeira
lâmina, o braço move-se para a segunda lâmina
e assim sucessivamente, de modo a que
todas as lâminas possuam uma fila equivalente
de “spots”. Quando uma fila está completa em
todas as lâminas, o braço lava os capilares,
mergulhando-os depois num novo conjunto de
amostras. Regressa então à primeira lâmina
onde imprime uma nova fila de spots. O
processo é repetido muitas vezes até à produção
de uma série de lâminas- cada lâmina é um
“microarray” com 20,000 spots. Após impressão
as lâminas são aquecidas para fixar o ADN ao
vidro.
Extracção de mARN
Extracção de mARN
Para realizar uma experiência com microarrays,
O mARN é representado por lanternas de bolso.
os cientistas extraem mARN das células que
Cada lanterna corresponde a mARN de cadeia
querem estudar. A extracção é um processo
simples específico de um determinado gene (Velcro
relativamente simples.
vermelho para o mARN correspondente ao gene
Para cada experiência, é necessário utilizar
mARN proveniente de dois tipos de células:
John Kendrew). Cada lanterna tem também uma
etiqueta de identificação.
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células controlo e do tipo celular que se está a
O número exacto e os nomes das lanternas será
estudar. Por exemplo, cientistas interessados em
discutido adiante. Por agora basta saber que
estudar células cancerosas, utilizariam mARN de
existem umas lanternas correspondentes ao
células normais (não-cancerosas) como controlo
mARN das células controlo e outras
e mARN proveniente de células cancerosas do
correspondentes ao mARN das células em
mesmo tipo de tecido.
estudo.
As lanternas precisam de ser marcadas com
Uma vez extraídas, as moléculas de mARNs
precisam de ser marcadas com moléculas
fluorescentes1, de modo a poderem ser
detectadas mais tarde, na superfície do
microarray. O mARN das células controlo é
papel transparente autocolante verde ou
vermelho representando o mARN dos tipos
celulares: vermelho para o mARN das células
cancerosas e verde para o mARN das células
controlo.
geralmente marcado com uma molécula
fluorescente verde e o mARN das células em
estudo é marcado com um marcador
fluorescente vermelho.
Hibridação
Hibridação
Neste passo, o mARN controlo (marcado a
Trata-se agora de hibridar os mARNs marcados
verde) é misturado com o mARN teste (marcado
com as moléculas fluorescentes (lanternas) com as
a vermelho). A mistura é vertida sobre a
moléculas de ADN (Velcro), presentes no
superfície da lâmina de vidro que é então
microarray (tapete). Coloca-se a mistura de
incubada a 42°C, de modo a que as cadeias
lanternas em contacto com o “microarray” (tapete).
simples mARN da mistura se liguem (hibridem)
Apenas as lanternas com Velcro de cores
ao ADN complementar no microarray. Após
apropriadas irão hibridar com as moléculas de
12 horas, o “microarray” é lavado de modo a
ADN em cadeia simples, presentes no
remover as moléculas de mARN que não tenham
“microarray”. Por exemplo: as lanternas com
encontrado alvos complementares nas lâminas.
Velcro vermelho vão hibridar com o Velcro
O “microarray” está então pronto a ser
vermelho no “microarray” e as lanternas com
digitalizado –“scanneado”.
Velcro amarelo hibridarão com o Velcro amarelo no
“microarray”.
As lanternas com uma cor de Velcro que não
exista no “microarray” (tapete) não se ligarão. As
moléculas de Velcro que apresentam mais do que
uma cor (ver na figura abaixo, a lanterna que está
1
As cores não são vísiveis à luz normal.
na mão), representam a situação em que apenas
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uma porção do mARN é complementar ao ADN
presente no “microarray”. Nestes casos, a
hibridação é muito fraca e as moléculas de
mARN fracamente ligadas, são eliminadas
durante a lavagem.
Colocar as lanternas no tapete, ligando-as ao
Velcro da mesma cor, no tapete. Neste ponto
deve ligar-se a luz das lanternas.
Scanning do “microarray”—aquisição de
Scanning do “microarray”—aquisição de
imagem
imagem
Chegou o momento de identificar quais os
Para fazer o “scanning” do microarray virtual, ligar
mARN que hibridaram com as moléculas alvo de
todas as lanternas que se encontram sobre o
ADN. Para tal, utiliza-se um “scanner laser”,
tapete do microarray, não as retirando dos seus
segundo um princípio semelhante ao “scanner”
lugares. Desligar então as luzes da sala e observar
que digitaliza as imagens para uso, num
o microarray. Ir analisando o microarray “spot” a
computador. O laser faz o “scanning” da lâmina
“spot” (círculo a círculo).
e combina as imagens, produzindo uma imagem
final que se assemelha à figura abaixo:
O que se pode dizer acerca da intensidade de
cores? É de notar que no “microarray” virtual não
é possível reproduzir os “spots” amarelos. No
entanto, os spots vermelhos e verdes são
fácilmente distinguíveis. Convém anotar o número
de lanternas vermelhas e verdes para cada gene.
Estes dados serão necessários para a análise dos
resultados.
Tal como para os microarrays reais, os círculos
mostram uma gradação de cores. Num círculo
Reparando atentamente na figura acima,
onde só há lanternas vermelhas, só o mARN de
notamos que não há só “spots” vermelhos e
células cancerosas hibridou com as moléculas de
verdes mas também “spots” amarelos e laranja.
ADN. Do mesmo modo, os círculos verdes
correspondem a uma hibridação exclusivamente
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Os spots vermelhos contêm apenas mARN de
de mRNA das células controlo. Os círculos
células cancerosas, e os “spots” verdes apenas
amarelos correspondem a igual quantidade de
mARN das células controlo, não cancerosas.
mARN nas células cancerosas e nas células
Mas o que acontece se quantidades idênticas de
controlo. Isto é uma simplificação, pois como
mARN das células controlo e das células
vemos, no “microarray” real pode observar-se
cancerosas hibridarem com o mesmo ADN alvo?
grande variação na cor dos “spots” (ver o “ícone”
Da sobreposição dos sinais verde e vermelho
para esta actividade na página Web!), que só
resulta um sinal amarelo! É preciso não esquecer
consegue ser decifrada com auxílio de um
que o mARN hibrida com o ADN no
“scanner laser” e de um programa de análise.
“microarrray” que lhe é complementar, e que um
“spot” no microarray representa biliões de cópias
de ADN de UM único gene. Por outras palavras,
quando um “spot” é amarelo, quer dizer que
existem quantidades aproximadamente iguais de
mARN desse gene nas células cancerosas e nas
células controlo.
Quando um “spot” é laranja, quer dizer que
existe uma quantidade relativa maior de mARN
desse gene nas células cancerosas do que nas
células controlo (normais).
Os “spots” pretos correspondem a uma ausência
de mARN específico desses genes, quer nas
células controlo quer nas células cancerosas.
Normalização
Normalização
No “Microarray de ADN” nem sempre a
Segundo o que puderam ler quanto ao fabrico
intensidade do “spot” corresponde à quanti-
dos “microarrays” reais, os cientistas conseguem
dade real de mARN que hibridou. Isto porque o
estimar a quantidade de mARN, a partir da cor do
processo de marcação do mARN é influenciado
spot após scanning e análise do “microarray”. Em
pelo tamanho da cadeia do mARN e pelo tipo
paralelo, também podemos estimar o número de
de marcador utilizado. Um processo matemático
lanternas por círculo, através da intensidade da luz.
designado por normalização corrige as
Mas consideremos o seguinte exemplo: se
intensidades dos “spots”, de modo a que estas
existe uma lanterna num “spot”, e se noutro “spot”
reflictam a quantidade de mARN presente nas
existem duas lanternas, e se todas as lanternas
moléculas hibridadas. Depois da normalização a
tiverem o mesmo número de baterias, então será
análise dos dados pode prosseguir.
de esperar que a luz emitida por duas lanternas
seja duas vezes tão intensa quanto a de uma só
lanterna.
Mas o que acontecerá se as baterias das duas
lanternas possuírem apenas metade da
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intensidade? Nesse caso, as duas lanternas num
“spot” serão tão intensas quanto a única lanterna
no outro “spot”. Por outras palavras, a
quantidade de luz das lanternas no
“microarray” virtual não depende apenas do
número de lanternas, mas também do tipo de
baterias que existem em cada lanterna.
Análise e “Clustering”
Análise e “Clustering”
Se os cientistas analisassem os resultados “spot”
Este passo será explicado na secção: Exercícios
a “spot”, levariam anos a analisar um
de clustering para a sala de aula [PDF].
“microarray”. Assim, os cientistas desenvolveram
uma maneira de associarem os genes que têm
um comportamento semelhante em grupos- os
“clusters”. Existem programas de computador
que permitem executar estes passos
automaticamente.
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a todos os que contribuíram para a elaboração desta
actividade:
- Ao Udo Ringeisen e a toda a equipa do Departamento de Fotografia do EMBL (EMBL
Photolab), pela impressão dos tapetes do “microarray” em tecido, (para demonstração
em cursos ou festivais de ciência) e pela produção da versão em plástico, (para
utilização na sala de aula);
- Ao Thomas Sandmann, na altura estudante de doutoramento no EMBL-Heidelberg,
por várias discussões e sugestões muito úteis e também por nos ter chamado a
atenção para o excelente material sobre “microarrays” intitulado ‚Snapshots of Science
and Medicine‘, produzido pelo “NIH Office of Science Education”, em conjunto com o
“Office of Research on Women‘s Health”;
- Ao Russ Hodge, na altura, no Departamento de Comunicação e Relações Públicas
do EMBL-Heidelberg (“Office of Information and Public Affairs” [OIPA]), bem como a
toda equipa do “European Learning Laboratory for the Life Sciences” [ELLS], por muitas
discussões, sugestões e apoio;
- A Giovanni Frazzetto, Mehrnoosh Rayner e Vassiliki Koumandou por terem lido a
primeira versão desta actividade e por terem contribuído para melhorá-la com as suas
ideias e comentários.
- A vários amigos e colegas do EMBL-Heidelberg com quem partilhámos ideias,
entusiasmo e dúvidas;
- “Os Exercícios para a sala de aula” foram adaptados do material sobre “microarrays”
intitulado “Snapshots of Science and Medicine”, produzido pelo “NIH Office of Science
Education”. Pode ser encontrado no seguinte website:
science-education.nih.gov/snapshots;
Imagem de capa por André-Pierre Olivier;
Traduzido por Alexandra Manaia;
Editado por Corinne Kox e Sonia Furtado.
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