Células-tronco mesênquimais de cães e gatos

Transcrição

REDVET Rev. Electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
2013 Volumen 14 Nº 9 - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090913.html
REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504
Células-tronco mesênquimais de cães e gatos – uma
revisão bibliográfica - Dogs and cats mesenchymal stem cells
– a literature Review
Machado Bertassoli, Bruno : Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo “FMVZ-USP”, Avenida Prof.
Dr. Orlando Marques de Paiva, CEP 05508-270, São Paulo – SP,
Brasil, email: [email protected] | Delys de Oliveira,
Franceliusa : Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo “FMVZ-USP”, Avenida Prof. Dr. Orlando
Marques de Paiva, CEP 05508-270, São Paulo – SP, Brasil | Morais
de Oliveira, Daniela : Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo “FMVZ-USP”, Avenida Prof.
Dr. Orlando Marques de Paiva, CEP 05508-270, São Paulo – SP,
Brasil | Nazaretian Rossi,Claudio : Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo “FMVZ-USP”,
Avenida Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, CEP 05508-270, São
Paulo – SP, Brasil
Resumo
Dentre as células-tronco, as mesênquimais (CTMs) são alvo de muito
interesse em pesquisas por não apresentarem barreiras éticas, pela
facilidade de obtenção e ainda por serem utilizadas em transplantes
autólogos, sendo a medula óssea a maior fonte para utilização. As
pesquisas relacionadas à fração de células mononucleares contendo
células-tronco têm apontado inúmeras possibilidades para a reparação
tecidual e melhoria na qualidade dos processos regenerativos. Inicialmente
as CTMs foram isoladas do baço e timo, e subsequentemente, aspirados da
medula óssea. Porém, atualmente, essas células vêm sendo isoladas de
vários locais do organismo humano e animal, principalmente cães e gatos,
incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial, músculos e
tendões. Também são citadas como fonte de CTMs tecidos fetais, placenta,
vasos sangüíneos e sangue do cordão umbilical, todavia, apresentam
pouca quantidade desse tipo celular comparado com a medula óssea. Em
cães e gatos, células-tronco podem ter sucesso de obtenção através da
medula óssea obtida na epífise dos ossos longos e nas regiões do íleo,
como crista ilíaca ou borda acetabular, cita-se a coleta na crista ilíaca de
cães pela facilidade de localização. Essas células em condições adequadas
de cultivo exibem morfologia fibroblastóide, adesão em substrato plástico,
auto renovação e diferenciação em tipos celulares distintos, incluindo
ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendões e músculos, após o seu
1
Células-tronco mesênquimais de cães e gatos – uma revisão bibliográfica
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090913/091301.pdf
isolamento in vitro. Logo, nota-se que as CTMs possuem potencial
reparador e podem ser obtidas, isoladas e expandidas a partir de diferentes
formas e condições, devido à diversidade dos protocolos de isolamento e
cultura existentes. Essa diversidade traz benefícios relacionados ao
desenvolvimento de procedimentos que fornecem alto rendimento e
viabilidade das células mesênquimais, aumentando assim o número de
células finais transplantadas.
Palavras chave: Animais domésticos | células-tronco | diferenciação
celular.
Abstract
Among stem cells, the mesenchymal stem cells (MSCs) are the target of
much interest in research because there are no ethical barriers and the
ease of obtaining and yet to be used in autologous transplants and the
bone marrow is the major source for use. The research related to the stem
cells have shown several possibilities for tissue repair and improve the
quality of regenerative processes. Initially MSCs were isolated from the
spleen and thymus, and subsequently the bone marrow aspirates.
However, currently these cells has been isolated from various human body
sites and animals, mainly in dogs and cats, including cartilage, periosteum,
synovium, synovial fluid, muscles and tendons. Are also cited as source of
MSCs the fetal tissue, placenta, blood vessels and umbilical cord blood,
however, these sites have little amount of this cell type compared to bone
marrow. In dogs and cats, stem cells can be collected through the bone
marrow obtained in the epiphysis of long bones and regions of the ileum,
as iliac crest or acetabular rim, is cited the attainment in the iliac crest of
dogs by ease of location. These cells in appropriate culture exhibit a
fibroblastoid morphology, adhesion to plastic substrate, self-renewal and
differentiation into distinct cell types, including bone, cartilage, adipose
tissue, tendons and muscles, after their isolation in vitro. Therefore, it is
noted that MSCs have reparative potential and can be obtained, isolated
and expanded from different shapes and conditions because of the
diversity of protocols exist for isolation and culture. This diversity brings
benefits related to the development of procedures that provide high
performance and viability of mesenchymal cells, thus increasing the final
number of cells transplanted.
Keywords: domestic animals, stem cells, cell differentiation
2
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (CTMs)
Considera-se como célula-tronco um tipo especial de célula que
apresenta capacidade de se renovar e originar diferentes tipos
celulares especializados, não possuindo nenhuma função específica
até que essa receba um sinal do ambiente, direcionando-a a
diferenciação em uma célula especializada (VALENTINI et al., 2010).
Dentre as células-tronco, as mesênquimais são alvo de muito
interesse em pesquisas por não apresentarem barreiras éticas, pela
facilidade de obtenção e ainda por serem utilizadas em transplantes
autólogos, sendo a medula óssea a maior fonte para utilização
(HUANG et al., 2004).
Células-tronco mesenquimais (CTMs) são definidas como
células-tronco multipotentes que podem se diferenciar em vários
tipos de células in vivo e in vitro em condições controladas
(VALENTINI et al., 2010), essas CTMs podem ser isoladas a partir de
vários órgãos do organismo, como por exemplo: medula óssea, tecido
adiposo, membrana sinovial, músculos, derme, dente decíduo, cordão
umbilical, placenta, fígado, baço e timo (MEIRELLES et al., 2006;
CAPLAN, 2007). Estas células foram descritas primeiramente por
FRIEDENSTEIN e colaboradores em 1975, que descobriu que as CTMs
aderem a placas de cultura, assemelham a fibroblastos “in vitro”, e
formam colônias.
As CTMs expressam um grande número de moléculas bioativas
como moléculas de adesão, proteínas de matriz extracelular, citocinas
e receptores de fatores de crescimento, permitindo interações com
demais células (HUSS, 2000; BOBIS et al., 2006). Essas moléculas
atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das
células envolvidas no processo de reparação tecidual (WAN et al.,
2008; CAPLAN, 2009).
As pesquisas relacionadas à fração de células mononucleares
contendo células-tronco têm apontado inúmeras possibilidades para a
reparação tecidual e melhoria na qualidade dos processos
regenerativos quando essas são transplantadas em número igual ou
superior a 2 x 106 (SUTER et al., 2004). Apesar desse número
limitado dessas células na cavidade medular óssea, a proliferação e
expansão das mesmas, sob condições adequadas, são facilmente
obtidas in vitro (KRAUS e KIRKER-HEAD, 2006). Após a
demonstração de que células derivadas da medula óssea apresentam
um número de linhagens celulares diferentes, incluindo algumas
células responsáveis pela osteocartilogênese, diversos tipos de
culturas e manutenção de tais elementos foram descritos (PEREIRA et
al., 2008). Esse novo avanço no cultivo de células permitiu a
3
formulação de uma variedade de meios de cultura, acrescidos de
substâncias responsáveis pelo melhor desenvolvimento celular in
vitro, possibilitando assim o cultivo de células originárias da maioria
dos tecidos e órgãos (ASSIS et. al., 2007)
OBTENÇÃO DE CTMs
BITTENCOURT et al. (2006) relatam que a existência de célulastronco não-hematopoiéticas na medula óssea (MO) foi inicialmente
sugerida há mais de 130 anos, com estudos de FRIEDENSTEIN et al.,
(1966) essa teoria foi comprovada.
Inicialmente as CTMs foram isoladas do baço e timo, e
subsequentemente, os aspirados da medula óssea. Atualmente, essas
células vêm sendo isoladas de vários locais do organismo humano e
animal, incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial,
músculos e tendões (FRIEDENSTEIN et. al., 1966). Também são
citadas como fonte de CTMs tecidos fetais, placenta, vasos
sangüíneos e sangue do cordão umbilical (HU et. al., 2003), todavia,
apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a
MO.
Segundo MEIRELLES et al., (2006) as células-tronco
mesênquimais já foram obtidas de diversas espécies de animais, tais
como, humanos, ratos, camundongos, cão, coelho, porco, cabras,
ovinos e babulínos. Essas CTMs podem ser isoladas a partir de vários
órgãos do organismo, como por exemplo: medula óssea, tecido
adiposo, membrana sinovial, músculos, derme, dente decíduo, cordão
umbilical e veias do cordão (ZUCCONI et al., 2010), placenta, fígado,
baço e timo (MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2007).
Pesquisas sobre o desenvolvimento das membranas fetais de
cães (WENCESLAU et al., 2010; MARTINS, et al., 2011) e gatos
pareceram apropriadas, uma vez que estas visam o estabelecimento
de culturas de células-tronco do âmnio ou a extração de
hemangioblastos (MIGLINO et al., 2006).
Historicamente, o cão tem sido um modelo útil para estudar
mecanismos e testar novas terapias de várias patologias humana
(ZUCCONI et al., 2010).
Em cães e gatos, células-tronco podem ter sucesso de obtenção
através da medula óssea pode obtida na epífise dos ossos longos e
nas regiões do íleo, como crista ilíaca ou borda acetabular (SLATTER,
1998), cita-se a coleta na crista ilíaca de cães pela facilidade de
localização. Diversos autores utilizaram a referida via de acesso para
coleta de medula óssea, tanto para obtenção de células
mononucleares, quanto para aquisição de células medulares, em
4
exames cito-histopatológicos (SAMOTO, 2006; ZAMPROGNO, 2007).
Contudo, em cães de pequeno porte ou gatos, a coleta de amostras
medulares é facilitada na região trans-ilíaca ou porção proximal do
fêmur. Punções trans-ilíacas reduzem o risco de lesões provocadas
pelo deslizamento acidental da agulha pela crista ilíaca (SLATTER,
1998). Para cães obesos ou musculosos, a porção crânio-lateral da
tuberosidade maior do úmero é uma ótima opção para coleta de
material (SLATTER, 1998; ZAMPROGNO, 2007).
Para o procedimento de coleta e obtenção de células
progenitoras da MO de cães, o animal deverá ser submetido à
anestesia geral e posicionado conforme o local escolhido para a
coleta. Sugere-se o decúbito lateral (ZAMPROGNO, 2007) se a coleta
da medula óssea for realizada no osso femoral ou tibial, e o decúbito
ventral se a escolha for a crista ilíaca (TOGNOLI et al., 2009).
Entretanto, na prática dos autores, o posicionamento melhor é o
decúbito lateral onde é possível acessar todos os locais anatômicos
sugeridos anteriormente.
CULTIVO DE CTMs
O cultivo de CTMs é feito selecionando-se as células com
propriedade de adesão ao plástico, sendo que as células que
permanecem em suspensão são facilmente removidas. Os outros
tipos celulares “contaminantes” como os macrófagos, são eliminados
após um determinado número de passagens em cultura (JAVAZON et.
al., 2004).
Em culturas e em condições adequadas de cultivo, as CTMs
exibem morfologia fibroblastóide, adesão em substrato plástico, auto
renovação e diferenciação em tipos celulares distintos, incluindo
ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendões e músculos (MENDELOW
et al., 1980; PITTENGER et al., 1999; POUNTOS e GIANNOUDIS,
2005; NARDI e MEIRELLES, 2006). Podem ser expandidas por mais
de 40 gerações mantendo capacidade multipotente, embora reduzam
as taxas de mitose e haja uma grande probabilidade de acúmulo de
mutações, tornando desaconselhável seu uso clínico, nestas
condições (DEANS e MOSELEY, 2000).
Outra característica das CTMs é que quando cultivadas em
baixa densidade a adesão e a formação de colônias é rápida, onde se
presume que estas colônias sejam derivadas de uma única célula
precursora (DEANS e MOSELEY, 2000).
Depois de anos de investigação sobre a composição dos meios,
a seleção deste ainda permanece empírica (REINA, 2003). Alguns
meios de cultivo disponíveis comercialmente estão listados no quadro
5
1, e outros já são recomendados na literatura de acordo com espécie
em questão (Quadro 2).
QUADRO 1 – Principais meios disponíveis no mercado para cultivo de
células-tronco mesênquimais.
NOME COMERCIAL
DESCRIÇÃO
Meio Basal de Eagle (BME)
Meio contendo apenas aminoácidos
essenciais.
Necessita
ser
suplementado com soro fetal bovino a
10%.
Meio Mínimo Essencial de Contém mais aminoácidos e em maior
Eagle (MEM)
concentração que o BME. Requer
suplementação com SFB.
Meio MEM modificado por Contém quatro vezes a concentração
Dulbecco
de aminoácidos e vitaminas que o
(DMEM)
BME.
Meio DMEM modificado por Meio
completo
que
inclui
na
Iscove
formulação
albumina
bovina,
(IMDM)
transferrina, selênio, e outros. Requer
suplementação com SFB.
Meio F-10 de Ham
Meio que pode ser suplementado com
proteínas e hormônios. Contém metais
como o ferro, cobre e zinco.
Meio F-12 de Ham
Fornece suplementação protéica as
células. Pode ter seu uso combinado
ao IMDM
Fonte: REINA, 2003
6
QUADRO 2 – Protocolos de cultura de células-tronco mesenquimais
nas diferentes espécies.
AUTORES
ESPÉCIE
BRUDER et Canina
al.,
1998
FONTE PROTOCOLOS
MO
MO
HUANG
al.,
2004
et Humanos
TA
- Coleta de 9mL MO diluída em 1mL
solução
salina
heparinizada
(1000U/mL).
Adição
de
DMEM
(2:1)
suplementado
com
SFB
10%,
penicilina
G
(100U/mL),
estreptomicina
(0,1mg/mL),
anfotericina B (0,25μg/mL).
- Separação por gradiente percoll
(1,073g/mL), lavadas e plaqueadas
107 células/frasco.
- Incubadas em estufa 5% CO2 a
37ºC
- Troca do meio realizado no 4º dia
do cultivo, e após duas vezes por
semana. Passagens realizadas no 9º,
10º e 11º dias de cultivo, por
replaqueamento
de
8
x
103
células/cm2.
- Total de 3 x 107 células
transplantadas.
- Coleta 5 – 8mL MO diluída em
heparina (100U).
- Adição de DMEM suplementado com
SFB 10%, produzindo a suspensão
celular por centrifugação.
- Resuspenso em 5mL de DMEM e
SFB 10%.
- Separação por gradiente percoll
(70% de densidade inicial).
- TA foi macerado e lavado duas
vezes em PBS.
Digestão
enzimática
com
colagenase 0,075% e centrifugação
para a obtenção da suspensão
celular.
- Plaqueadas 1 x 106 células/frasco.
Ambas
cultivadas
em
monocamadas na estufa 5% CO2 a
37ºC, até atingir confluência de
80%,
7
- Remoção das células aderentes
com tripsina
0,25%
IM et al., Coelhos
2001
MO
- Amostra de 2mL MO diluída em
0,1mL heparina (3000UI).
- Separação por gradiente ficoll
(0,7mL), 200g por 15 minutos.
- Lavagens tripla em meio Ham F-12
200g por 5 minutos.
- Cultivo em meio Ham F-12
suplementados
com
SFB
10%,
penicilina
G
(100U/mL),
estreptomicina
(0,1mg/mL),
anfotericina B (0,25μg/mL), estufa
5% CO2 em frascos de cultura de 25
cm2.
- Meio trocado a partir do 3º dia, e
após todos os dias até o 20ºdia.
- Remoção das células aderentes
com tripsina 0,25% e 0,001M EDTA,
3 lavagens em meio Ham F-12 e
contagem
das
células
em
hemocitômetro.
- O número médio de células foi de
3,4 (±1,5)x
106 antes e 2,3 (±0,6)x106 após a
cultura.
MO – Medula óssea, TA – Tecido adiposo, SFB – Soro fetal bovino,
PBS – solução salina tamponada
IDENTIFICAÇÃO DE CTMs
A microscopia de luz mostra que as células tronco
mesenquimais possuem formato fibroblastóides alongados, fusiformes
e potiagudas, com núcleos eucromáticos, ovais, grandes e centrais e
com citoplasma abundante (RINGE et al., 2002; COLLEONI et al.,
2005; TAGAMI et al., 2003).
Todas as células do organismo apresentam um conjunto de
marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e
a marca das células que os contêm. Essa imunofenotipagem é
realizada com a utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem
8
esses antígenos de superfície da membrana celular, conforme
demonstrado em estudos contemporâneos (MEIRELLES et al., 2006).
Como proposto pelo comitê de células-tronco mesênquima da
Sociedade Internacional de Terapia Celular, as células-tronco
mesênquimais humanas são definidas como CD105, CD73 e CD90
positivos (expressão em torno de 90%) e negativas para CD45,
CD34, CD14 ou CD11b, CD79a, ou CD19 e HLA. O marcador de
superfície celular STRO-1 é considerado o melhor marcador para
células-tronco mesênquimais, porém não é exclusiva para esse tipo
celular ainda, sua expressão não é mantido durante sucessivas
passagens em cultivo (KOLF et al., 2007; LACONO et al. 2010).
Embora já tenham sido identificados oito marcadores de
superfície para identificação de CTMs, a International Society for
Cellular Therapy concorda que apenas a identificação dos marcadores
CD105, CD73 e CD90, quando não estiverem expressos marcadores
hematopoiéticos, é suficiente para a imunofenotipagem dessas
células. Contudo, essa caracterização deve sempre estar
acompanhada da demonstração da aderência celular por longos
períodos em cultura e da diferenciação destas em pelo menos duas
linhagens celulares distintas (HORWITZ et al.,2005).
DIFERENCIAÇÃO IINDUZIDA DE CTMs
Após o seu isolamento in vitro, as células tronco mesênquimais
mostram uma capacidade de diferenciação em várias linhagens
mesênquimais (Tabela 1) (LEE et al., 2010) e em vários tecidos
quando induzidas após a utilização de culturas adequadas. As CTMs
podem se diferenciar em osteoblastos, adipócitos, condrócitos (RINGE
et al., 2002; KUMAR et al., 2007), tenócitos, células musculares,
cardiomiócitos e células do estroma de sustentação da hematopoiese,
(PITTENGER et al., 1999; CAPLAN ,2005). Sua plasticidade, No
entanto, não se limita aos derivados mesenquimais. Relatórios
sugerem que as CTMs podem se diferenciar em neurônios (MOORMAN
et al., 1999; KOHYAMA et al., 2001).
As CTMs demonstram resultados promissores em estudos préclínicos e clínicos, em doenças cardíacas, pulmonares, traumas
medulares e no sistema nervoso central e em defeitos ósseos
cartilaginosos (BEYER et al., 2006; LE BLANC, 2006).
A bioengenharia tecidual em associação a biomateriais tem
demonstrado resultados satisfatórios com utilização de células tronco
mesenquimais (ZHANG et al., 2007).
Autores como SCHAUWER e SOOM (2011) relatam que a
9
expansão de células-tronco mesenquimais (CTM) de diferentes
origens (celulas de medula ossea, sangue periférico, anexos
embrionários, entre outros), tem sido muito estudada pelo fato de se
diferenciarem em varias linhagens, e representam uma população
promissora para as terapias celulares com base em medicina
veterinária. Há ainda poucas informações sobre as origens das CTMs,
uma teoria é a origem neuroectodermal, a partir de células
neuroepiteliais SOX1 (TAKASHIMA et al., 2007).
Outro mecanismo de diferenciação celular proposto é a fusão,
onde se acredita que as CTMs podem fusionar-se a uma célula
adulta-alvo, assumindo o padrão de expressão gênica da célula
adulta a qual se uniu. A fusão celular é um fenômeno biológico
amplamente conhecido, ocorrendo principalmente nas células cuja
poliploidia (dois ou mais conjuntos de cromossomos) é comumente
vista, como em hepatócitos e células musculares esqueléticas
(HERZOG et al., 2003; MEIRELLES et al., 2006).
Além disso, as CTMs secretam uma grande variedade de
quimiocinas, além de expressar receptores para citocinas e fatores de
crescimento. Dessa forma, as CTMs interagem com as células
residentes (nicho) e podem induzi-las, por mecanismo parácrino, a se
diferenciar em linhagens celulares distintas, de acordo com essa
sinalização (TAKASHIMA et al., 2007).
Tabela 1 - Origem e tipos celulares derivadas das células-tronco
mesênquimais (Fonte: Adpt de POUNTOS e GIANNOUDIS, 2005)
ISOLAMENTO
MEDULA ÓSSEA
OSSO TRABECULAR
PERÓSTEO
CARTILAGEM
ARTICULAR
SINÓVIA
LIQUIDO SINOVIAL
MÚSCULOS
TECIDO ADIPOSO
TENDÕES
SANGUE
VASOS SANGUÍNEOS
CORDÃO UMBILICAL
PELE
BAÇO E TIMO
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
DIFERENCIAÇÃO
OSTEOBLASTOS
CONDRÓCITOS
ADIPÓCITOS
MIÓCITOS CARDÍACOS
FIBROBLASTOS
MIOFIBROBLASTOS
MIÓCITOS ESQUELÉTICOS
TENÓCITOS
CÉLULAS DA RETINA
CÉLULAS NEURAIS
ASTRÓCITOS
HEPATÓCITOS
ESTROMA DE SUPORTE
CÉLULAS PANCREÁTICAS
10
ISOLAMENTO CELULAR
Em testes de histocompatibilidade, imunoensaios celulares in
vitro, protocolos de cultivo celular e outros procedimentos em geral,
têm sido utilizados diversos gradientes de densidade de alto peso
molecular. Dentre eles estão o Ficoll-Hypaque®, Histopaque®,
Isolymph® e Nycomed®, os quais apresentam a função de isolar
linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da medula
óssea (ISLAM, 1994).
As principais soluções para a diluição da MO são: solução salina
tamponada (PBS) (OLIVEIRA, 2009) e meios de cultivo modificados,
podendo este último ser suplementado com soro fetal bovino (SFB) a
10% (BITTENCOURT et al., 2006).
Existem diversos protocolos de isolamento recomendados pela
literatura. Esses dados foram compilados em uma tabela (Tabela 2).
Tabela 2 – Protocolos de isolamento celular e fonte de obtenção das
CTMs.
AUTORES
OLIVEIRA, 2009
ESPÉCIE FONTE
Coelhos
Medula
Óssea
PROTOCOLOS
- Colheita de 2mL de MO diluído
em 0,1mL
de solução fisiológica heparinizada
(5000UI),
diluído em PBS (1:1).
- Centrifugação em gradiente Ficoll
1,077g/mL (diluição 2:1) a 495g,
durante 30
min a 15ºC.
- Lavagens com PBS e DMEM baixa
glucose suplementado com soro
fetal bovino 10%,
493g durante 10 minutos a 4ºC.
Rendimento:
6,25
x
106
células/mL
11
OLSSON
2009
PEREIRA
2008
et
et
BITTENCOURT
al.,2006
al., Canina
al., Coelhos
et Ratos
Medula
Óssea
- Colheita de 10ml/kg MO em
bolsas de coleta contendo 0,1mL
de heparina (10000UI).
- Centrifugação a 440g, na diluição
1:1 com gradiente Histopaque
1,077g/mL, temperatura entre 1826ºC.
- Lavagens celulares com solução
salina
0,9%,
DMEM
e
soro
sanguíneo autólogo estéril, a 440g
durante 5 minutos.
Rendimento:
2,57
x
106
células/mL
- Gordura subcutânea fragmentada
e lavada
Tecido
com PBS 2%.
Adiposo Digestão
enzimática
com
colagenase (2mg/mL), DMEM, BSA
(20mg/mL)
penicilina
e
estreptomicina,
durante
50
minutos a 37ºC.
- Bloqueio enzimático com SFB
- Pellet diluído em DMEM e SFB a
10%
Medula
Óssea
- Lavagem para colheita da MO
com 10mL de meio Knockout
DMEM e DMEM-alta concentração
de glucose.
- Centrifugação a 1200rpm por 10
minutos.
- Rendimento: 6 x 106 células/mL
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nesta revisão nota-se que as células-tronco mesênquimais
(CTMs) possuem potencial reparador e podem ser obtidas, isoladas e
expandidas a partir de diferentes formas e condições, devido à
diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa
diversidade traz benefícios relacionados ao desenvolvimento de
12
procedimentos que forneçam alto rendimento e viabilidade das
células mesênquimais, aumentando assim o número de células finais
transplantadas.
A medula óssea é uma fonte autóloga facilmente acessível de
obtenção desse material e pode ser adquirida do interior dos ossos
longos, como trocanter maior do fêmur e tuberosidade maior do
úmero, e os avanços nas pesquisas com células-tronco mesênquimais
(CTMs) da medula óssea, em cães e gatos, desperta a necessidade de
aumentar os conhecimentos básicos a respeito de sua origem, sua
aquisição e seu processamento.
REFERENCIAS
ASSIS, M. F. L.; SANTOS, E. C. O.; JESUS, I. M.; JESUS, M. I; PINTO,
W. V. M.; MEDEIROS, R.L.F.; SILVA, D.F.L. Uso da cultura de células
em testes diagnósticos laboratoriais em medicina e biologia. Caderno
de Saúde Pública. 2007; 15(3):425-432.
BEYER, N. N.; DA SILVA MEIRELLES, L. Mesenchymal stem cells:
Isolation, in vitro expansion and characterization. Handbook
Experimental Stem Cell. 2006;174:249-282.
BITTENCOURT, R. A. C.; PEREIRA, H. R.; FELISBINO, S. L.;
MURADOR, P.; OLIVEIRA, A.P.E.; DEFFUNE, E. Isolamento de célulastronco mesênquimais da medula óssea. Acta Ortopédica Brasileira.
2006; 14(1):22-24.
BOBIS, S.; JAROCHA, D.; MAJKA, M. Mesenchymal stem cells:
characteristics and clinical applications. Folia Histochemica et
Cytobiological. 2006; 44:215-230.
BRUDER, S. P.; JAISWAL, N.; RICLTN, N. S.; MOSCA, J.D.; KRAUS, K.
H.; KADIYALA, S. Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied
bone regeneration. Clinical Orthopaedics and Related Research.
1998; 355:247-256.
CAPLAN, A. I. Mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive
therapy in orthopaedics. Tissue engineering. 2005; 11:1198-1211.
CAPLAN, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering
versus regenerative medicine. Jounal of Cellular Physiology.
2007; 213:341–347.
CAPLAN, A. I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.
Journal of Pathology. 2009; 217:318-324.
COLLEONI, S.; DONOFRIO, G.; LAGUTINA, I.; DUCHI, R.; GALLI, C.;
LAZZARI, G. Establishment, differentiation, electroporation, viral
transduction, and nuclear transfer of bovine and porcine
mesenchymal stem cells. Cloning Stem Cells. 2005; 7:154-166.
DEANS, R. J.; MOSELEY, A. B. mesenchymal stem cells: biology and
potential clinical uses.
Experimental Hematology. 2000;
28(8):875-884.
13
FRIEDENSTEIN, A. J.; DERIGLAZOVA, U. F.; KULAGINA, N. N.;
PANASUK, A. F.; RUDAKOWA, S. F.; LURIA, E. A.; RUADKOW, I. A.
Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic
cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental
Hematology. 1975; 2:83-92.
FRIEDENSTEIN, A. J.; PIATETZKY-SHAPIRO, I. I.; PETRAKOVA, K. V.
Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Journal of
Embryology and Experimental Morphology. 1966; 16(3):381390.
HERZOG, E. L.; CHAI, L.; KRAUSE, D. S. Plasticity of marrow-derived
stem cells. Blood. 2003; 102:3483-3493.
HU, Y.; LIAO, L.; WANG, Q.; MA, L.; MA, G.; JIANG, X.; ZHAO, R.C.
Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human
fetal pancreas. Journal of Laboratory and Clinical Medicine.
2003; 141(5):342-349.
HUANG, C.; KRISTEN, L.H.; FROST, L.E.; SUN, Y.; CHEUNG, H. S.
Effects of cyclic compressive loading on chondrogenesis of rabbit
bone-marrow derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2004;
22(3):313-323.
HUSS, R. Cells from various sources isolation of primary and
immortalized CD34– hematopoietic and mesenchymal stem. Stem
Cells. 2000; 18(1):1-9.
JAVAZON, E. H.; BEGGS, K. J.; FLAKE, A. W. Mesenchymal stem cells:
paradoxes of passaging. Experimental Hematology. 2004;
32(5):414-425.
KOHYAMA, J.; ABE, H.; SHIMAZAKI, T.; KOIZUMI, A.; NAKASHIMA,
K.; GOJO, S.; TAGA, T.; OKANO, H.; HATA, J.; UMEZAWA, A. Brain
from bone: efficient ‘‘metadifferentiation’’ of marrow stroma-derived
mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent.
Differentiation. 2001; 68:235–244.
HORWITZ, E. M.; BLANC, K. L.; DOMINICI .M.; MUELLER, I.; SLAPERCORTENBACH, I.; MARINI, F. C.; DEANS, R. J.; KRAUSE, D. S.;
KEATING, A. Clarification of the nomenclature for MSC: the
international society for cellular therapy position statement.
Cytotherapy, 2005; 7(5):393-395.
IM, G. I.; KIM, D. Y., SHIN, J. H.; HYUN, C. W.; CHO, W. H. Repair of
cartilage
defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone
marrow. The Journal of Bone and Joint Surgery. 2001; 83B(2):289-294.
ISLAM, A. A new, fast and convenient method for layering blood or
bone marrow over density gradient medium. Journal of Clinical
Pathology. 1995; 48(7):686-688.
KOLF, C. M.; CHO, E.; TUAN, R. S. Mesenchymal Stromal cells.
Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, selfrenewal and differentiation. Arthritis Research Therapy, 2007;
9:1-10.
14
KRAUS, K. H.; KIRKER-HEAD, C. Mesenchymal stem cells and bone
regeneration. Veterinary Surgery. 2006; 35(3):232-242.
KUMAR, B. M., JIN, H. F., KIM, J. G., OCK, S. A., HONG, Y.,
ALASUBRAMANIAN, S., CHOE, S. Y., RHO, G. J. Differential gene
expression
patterns
in
porcine
nuclear
transfer
embryos
reconstructed with fetal fibroblasts and mesenchymal stem cells.
Developmental Dynamics. 2007; 236(2):435-446.
LACONO, E.; MERLO, B.; SAPADARI, A.; MARI, G.; RICCI, F.;
TAZZARI, P. Isolation, diferentiation, and immunophenotypic
characterization of mesenchymal stem cells derived from equine
adipose tissue and bone marrow. Reproduction, Fertility and
Development. 2010; 23:250-251.
LE BLANC, K. Mesenchymal stromal cells: tissue repair and immune
modulation. Cytotherapy, 2006; 8:559-561.
LEE, Y. M.; KUMAR, B. M.; KIM, S. W.; LEE, S. L.; RHO, G. J.
Characterization and differentiation into oocyte-like cell masses of
porcine mesenchymal stem cells derived from ovarian theca cells.
Reproduction, Fertility and Development. 2010; 23(1):186-187.
MARTINS, D. S.; AMBRÓSIO, C. E.; SARAIVA, N. Z.; WENCESLAU, C.
V.; MORINI, A. C.; KERKIS, I.; GARCIA, J. M.; MIGLINO, M. A. Early
Development and Putative Primordial Germ Cells Characterization in
Dogs. Reproduction in domestic animalls, 2011; 46:62–66.
MEIRELLES, L. S.; CHAGASTELLES, P. C.; NARDI, N. B. Mesenchymal
stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues.
Journal of Cell Science. 2006; 119:2204-2213.
MENDELOW B. D., GROBICKI, D., LA HUNT, M., KATZ, J., METZ, J.
Characterization of bone marrow stromal cells in suspension and
monolayer cultures. British Journal of Haematology. 1980; 46:1522.
MIGLINO, M. A.; AMBRÓSIO, C. E.; MARTINS, D. S.; WENCESLAU, C.
V.; PFARRER, C.; LEISER, L. The carnivore pregnancy: The
development
of
the
embryo
and
fetal
membranes.
Theriogenology,2006; 66:1699–1702.
MOORMAN, M. A., SIMONETTI, D. W.; CRAIG, S., MARSHAK, D. R.
Multilineage, potential of adult human mesenchymal stem cells.
Science 1999; 284:143–147.
NARDI, N. B; MEIRELLES, L. S. Mesenchymal stem cells: isolation, in
vitro expansion and characterization. Handbook of Experimental
Pharmacology. 2006; 174:249-282.
OLIVEIRA, B. J. N. A.; STEFANES, S. A.; JACOBINA, G. C.; FARIAS,
A.; ALMEIDA, R. M. Auto-enxerto percutâneo de medula óssea no
processo de consolidação de fraturas de fêmur. Anais do III
Concevepa, Brasília; 2009; 88-90.
OLSSON, D. C.; PIPPI, N. L.; MARTINS, D. B.; TOGNOLI, G. K.;
SANTOS-JÚNIOR, E. B.; MULLER, D. C.; LOPES, S. T. A.;
MARCONATO, F.; MÖRCHBÄCHER, P. D.; TEIXEIRA, L. V. Colheita de
medula óssea em cães: modelo para obtenção da fração total de
15
células mononucleares. Ciência Rural. 2009; 39(1):141-147.
PEREIRA, I. S. O.; PONTES, P.; EÇA, L. P.; FERREIRA, A. T.;
MAZZETTI, P. M. V.; SILVA, L.; SOUZA, F. C. Protocolo piloto de
separação e quantificação de células tronco de tecido adiposo de
coelhos para posterior uso em laringe. Acta ORL. 2008; 26(3):1116.
PITTENGER, M. F.; MACKAY, A. M.; BECK, S. C.; JAISWAL, R. K.;
DOUGLAS, R.; MOSCA, J. D.; MOORMAN, M. A.; SIMONETTI, D. W.;
CRAIG, S.; MARSHAK, D. R. Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284(5411):143-147.
POUNTOS, I.; GIANNOUDIS, P.V. Biology of mesenchymal stem cells.
Injury. 2005; 36(3):8-12.
SLATTER, D. Manual de cirurgia de pequenos animais. São Paulo:
Manole, 1998. p.1135-1142.
REINA, M. Técnicas de estudio de líneas celulares. Proceedings of
the Society for Experimental Biology and Medicine. 2003;
122:478.
RINGE, J.; KAPS, C.; SCHMITT, B.; BUSCHER, K.; BARTEL, J.;
SMOLIAN, H.; SCHULTZ, O.; BURMESTER, G. R.; HAUPL, T.;
SITTINGER, M. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct
mesenchymal cell lineages. Cell and Tissue Research. 2002;
307(3):321-327.
SAMOTO, V. Y. Terapia celular cardíaca: vias de infusão de
células mononucleares em cães e gatos srd. Dissertação inédita,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo, 2006. 105f.
SCHAUWER DE C.; SOOM, A. V. Markers of stemness in equine
mesenchymal stem cells: a plea for uniformity. Theriogenology.
2011; 75(8): 1431-1443.
SUTER, S. E.; GOUTHRO, T. A.; MCSWEENEY, P. A.; NASH, R. A.;
HASKINS, M. E.; FELSBURG, P. J.; HENTHORN, P. S. Isolation and
characterization of pediatric canine bone marrow CD34+ cells.
Veterinary
Immunology
and
Immunopathology.
2004;
101(1):31-47.
TAKASHIMA, Y.; ERA, T.; NAKAO, K. Neuroepithelial cells supply an
initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 2007; 129:13771388.
TAGAMI, M.; ICHINOSE, S.; YAMAGATA, K.; FUJINO, H.; SHOJI, S.;
HIRAOKA,
M.;
KAWANO,
S.
Genetic
and
ultrastructural
demonstrations of strong reversibility in human mesenchymal stem
cell. Cell tissue Research. 2003; 312, p.31-40, 2003.
TOGNOLI, G. K.; OLSSON, D. C.; MARTINS D. B.; SANTOS –JÚNIOR,
E. B.; SALBEGO, F. Z.; OLIVEIRA, G. K.; BRAGA, F. V. A.; RAISER, A.
G.; DEZENGRINI, R.; CRUZ, F. S. F.; CASTRO, M. B.; ROSA, M. C.;
CARREGARO, A. B.; PIPPI, N. L. Transplante autólogo de células
mononucleares da medula óssea em úlcera de córnea experimental
em cães. Ciência Rural. 2009; 39(1):148-155.
16
VALENTINI, L.; URANIO, M. F.; CONSIGLIO, A. L.; GUARICCI, A. C.;
CAIRA, M.; VENTURA, M.; L’ABBATE, M.; CREMONESI, F.;
DELL’AQUILA, M. E. Isolation, proliferation, and characterization of
mesenchymal stem cells from amniotic fluid, aminion, and umbilical
cord matrix in the dog. Reproduction, fertility and Development,
2010; 23(1):252-253.
WAN, C.D.; CHENG, R.; WANG, H. B.; LIU, T. Immunomodulatory
effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a
rat orthotopic liver transplantation model. Hepatobiliary &
Pancreatic Diseases International. 2008; 7(1):29-33.
WENCESLAU, C. V.; MIGLINO, M. A.; MARTINS, D. S.; AMBRÓSIO, C.
E.; LIZIER, N. F.; PIGNATARI, G. C..; KERKIS, I.
Mesenchymal
progenitor cells from canine fetal tissues: yolk sac, liver and bone
marrow. Tissue engineering. Part A. 2010; 4:1-35.
ZAMPROGNO, H. Células-tronco esqueléticas para o tratamento da
não união de fraturas. Acta Scientiae Veterinariae. 2007;
35(2):289-290.
ZHANG, M.; MAL, N.; KIEDROWSKI, M.; CHACKO, M.; ASKARI, A. T.;
POPOVIVIC, Z. B.; KOC, O. N.; PENN, M. S. SDF-1 expression by
mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac
myocytes after myocardial infarction. FASEB journal. 2007;
21:3197-3207.
ZUCCONI, E.; VIEIRA, N. M.; BUENO, D. F.; SECCO, M.; JAZEDJE, T.;
AMBROSIO, C. E.; PASSOS-BUENO, M. R.; MIGLINO, M. A.; ZATZ, M.
Mesenchymal Stem Cells Derived From Canine Umbilical Cord Vein—A
Novel Source for Cell Therapy Studies. Stem cells and
development. 2010; 19(3):395-402.
REDVET: 2013, Vol. 14 Nº 9
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Células-tronco mesênquimais de cães e gatos

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