Aspectos Laboratoriais - Protocolos LILAC e PLACES

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


Por aproximadamente 100 anos vem
se utilizando a coleta de amostra
biológica em papel-filtro
A detecção de anticorpos anti-HIV em
amostras de sangue seco (DBS) foi
descrita pela primeira vez em 19871
O diagnóstico utilizando DBS foi
regulamentado no Brasil a partir da
publicação da Portaria SVS/MS No.
151 (2009)
O uso do DBS permite expandir o
diagnóstico da infecção pelo HIV
1Farzadegan
H, Quinn T, Polk BF. Detecting antibodies to human immunodeficiency virus in dried blood on filter papers. J Infect Dis.
1987;155(5):1073-1074.
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

Durante a caracterização de um
painel de amostras com resultado
conhecido, identificou-se um
elevado número de resultados
falso-positivos
Atualmente, o conjunto
diagnóstico utilizado é a única
opção comercialmente disponível
no Brasil.
Decidiu-se fazer um estudo para
avaliar a possibilidade de ajuste
do ponto de corte (cut-off) do
ensaio.
1Centers
for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, EUA.
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
Ensaio indireto para a detecção de
anticorpos anti-HIV-1/2 (2° ger)
Antígenos
HIV-1: gp160, gp41, p24
 HIV-2: gp36


Amostra
Soro ou Plasma: 5 µL
 Sangue em DBS: Picote de 3 mm




288 determinações
Testagem em duplicata
Lotes avaliados

1212224, 1311223, 1404209, 1407219
Lavadora Automática
SUMA MW-2001
Software para Lectores de Tiras
SRS 9.0
Leitora de Microplacas
SUMA PR-621
REGRAS DE VALIDAÇÃO DA CORRIDA ANALÍTICA
B < 10 UF
60 UF > 𝑥 CP < 180 UF
𝑥𝑪𝑵−𝑥𝑩
< 0,1
↓𝑪𝑷−𝑥𝑩
(𝑥 B + 10 UF) < 𝑥 CN
CÁLCULO DO RESULTADO DA AMOSTRA
𝑺−𝑥𝑩
↓𝑪𝑷−𝑥𝑩
PONTO DE CORTE FIXO
0,300
u = 0,255 – 0,300
LEGENDA
B
S
Branco
Amostra
CN
CP
Controle Negativo
Controle Positivo
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Fluorescência
Negativo
Borderline
Positivo
Negativo
Positivo
Repetir
0,300
0,255
A
B
C
D
E
F
Resultados

Ensaios de referência

Amostras clínicas

Ensaio inicial


Ensaio complementar


Q-Preven HIV 1+2 - DBS (Symbiosis Diagnóstica, Leme, Brazil)
DAVIH-Blot (Laboratorios DAVIH, Mayabeque, Cuba)
Amostras provenientes do Quality Assurance Program for Anti-HIV-1
in DBS

Resultados dos ensaios de referência empregados pelo programa de
proficiência


Ensaio inicial
 Avioq HIV-1 Microelisa (Research Triangle Park, NC, USA)
Ensaio complementar
 Genetic Systems™ HIV-1 WB (Bio-Rad, Redmond, WA, USA)
 Laboratório reconhecido pela
Norma ABNT NBR ISO/IEC
17025:2005 (desde Dez/2011)
 Participação em Programas de
Ensaio de Proficiência em DBS
ENSAIOS DE REFERÊNCIA
POS
NEG
TOTAL
UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT
POS
125
19
144
CUT-OFF = 0,300
NEG
0
105
105
TOTAL
125
124
249
ENSAIOS DE REFERÊNCIA
POS
NEG
TOTAL
UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT
POS
125
5
130
CUT-OFF = 0,325
NEG
0
119
105
TOTAL
125
124
249
ENSAIOS DE REFERÊNCIA
POS
NEG
TOTAL
UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT
POS
125
1
126
CUT-OFF = 0,350
NEG
0
123
123
TOTAL
125
124
249
ENSAIOS DE REFERÊNCIA
POS
NEG
TOTAL
UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT
POS
125
0
125
CUT-OFF = 0,375
NEG
0
124
124
TOTAL
125
124
249
ENSAIOS DE REFERÊNCIA
POS
NEG
TOTAL
UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT
POS
124
0
124
CUT-OFF = 0,400
NEG
1
124
125
TOTAL
125
124
249
PONTO DE
CORTE
SENSIBILIDADE
ESPECIFICIDADE
ACURÁCIA
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
0,300
100% (96.8 – 100.0)
84.7% (81.4 – 84.7)
92.4% (89.1 – 92.4)
0,325
100% (97.2 – 100.0)
96.0% (93.1 – 96.0)
98.0% (95.2 – 98.0)
0,350
100% (97.6 – 100.0)
99.2% (96.7 – 99.2)
99.6% (97.2 – 99.6)
0,375
100% (97.8 – 100.0)
100% (97.8 – 100.0)
100% (97.8 – 100.0)
0,400
99.2% (96.8 – 99.2)
100% (97.5 – 100.0)
99.6% (97.2 – 99.6)


As instruções de uso do conjunto diagnóstico afirmam que o ensaio foi
desenvolvido para obter máxima sensibilidade, mesmo que
ocasionalmente, ocorram reações inespecíficas levando a resultados
borderline ou positivos, requerendo confirmação por outros métodos.
Outros estudos:
ANO
LOCAL
POPULAÇÃO
n
BORDERLINE
FALSO
POSITIVOS
Toledo et al.
2005
Brasil
Gestantes
24.905
7
-
Morales-Rodriguez et al.
2004
Cuba
318
2
-
Rodriguez et al.
1995
Cuba
Doadores
de sangue e
painel de
referência
2.000
-
10
RENAPREN1
2008
Brasil
4
8
AUTOR
1 Dados
CTA
não publicados. RENAPREN - Avaliação Clínica do Uso de Amostras de Sangue Seco como Estratégia Inovadora para o Aumento do
Diagnóstico Laboratorial das Infecções Perinatais em Áreas Remotas. 2006-2008.


Recentemente, identificou-se uma redução na especificidade do conjunto
diagnóstico, levando a necessidade de confirmação do resultado por
Western Blot.
O ajuste do cut-off permitiu a elevação da especificidade do conjunto
diagnóstico, sem impactar na sua sensibilidade.

LOCAL REMOTO
RESIDÊNCIA
UNIDADE DE SAÚDE


COLETA DE
SANGUE
ENVIO
LABORATÓRIO
RESULTADO
VANTAGENS
LIMITAÇÕES
Não requer profissional especializado
Tempo de secagem
Coleta indolor e pouco invasiva
Ausência de conjuntos diagnósticos
Baixo risco biológico
Sensível a umidade
Não requer centrifugação e separação de
amostras
Reduzido número de laboratórios que
realizam análises em DBS
Estabilidade da amostra
Não requer transporte especializado
Fácil armazenamento
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
Representa a relação,
normalmente antagônica, entre a
sensibilidade e a especificidade
de um teste diagnóstico
quantitativo, ao longo de um
contínuo de valores de ponto de
corte (cut-off).
Um determinado valor na escala
contínua que discrimine um
resultado entre reagente ou não
reagente denominado ponto de
corte.