Livro de Resumos em pdf - Faculdade de Medicina Veterinária

Transcrição

SOCIEDADE PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CONGRESSO CIÊNCIAS VETERINÁRIAS 2011
LIVRO DE RESUMOS
VETERINARY SCIENCES CONGRESS 2011
ABSTRACT BOOK
INRB IP / L-INIA Fonte Boa, Vale de Santarém
13, 14 e 15 de Outubro de 2011
Edição: Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias
Composição: Noz
Impressão: Peres-SocTip
Tiragem: 500 exemplares
Depósito Legal: 334319/11
ISBN: 978-989-20-2675-6
ii
Comissão de Honra
Sua Excelência O Presidente da República, Prof. Doutor Aníbal Cavaco Silva
Ministra da Agricultura, do Mar, do Ambiente e do Ordenamento do Território, Prof. Doutora Maria de Assunção
Oliveira Cristas Machado da Graça
Ministro da Educação e Ciência, Prof. Doutor Nuno Crato
Secretário Executivo da CPLP, Eng. Domingos Simões Pereira
Presidente da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Prof. Doutor João Sentieiro
Directora-Geral de Veterinária, Dr.ª Susana Guedes Pombo
Presidente do Instituto Nacional de Recursos Biológicos IP, Dr.ª Maria Rosa Tobias Sá
Director do LNIV/INRB IP, Prof. Doutor Nuno Figueira Boavida Canada
Directora do L-INIA/INRB IP, Doutora Maria de Fátima Sousa Calouro
Presidente do Instituto de Apoio ao Desenvolvimento, Prof. Doutor Augusto Manuel Nogueira Gomes Correia
Presidente da Câmara Municipal de Santarém, Dr. Francisco Maria Moita Flores
Bastonária da Ordem dos Médicos Veterinários e Directora da Faculdade de Medicina Veterinária - ULHT,
Prof. Doutora Laurentina Maria Rilhas Pedroso
Presidente da Faculdade de Medicina Veterinária - UTL, Prof. Doutor Luís Manuel Morgado Tavares
Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária - UTAD, Prof. Doutora Rita Maria Payan Martins Pinto Carreira
Coordenador do Curso de Medicina Veterinária - ICBAS-UP, Prof. Doutor António José Mira da Fonseca
Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária - U. Évora, Prof. Doutora Maria Cristina Calhau Queiroga
Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária - EUVG, Prof. Doutora Rosa Maria Lino Neto
Presidente da Assembleia Geral da Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias,
Prof. Doutor Luís Manuel dos Anjos Ferreira
Comissão Executiva
Prof. Doutor Carlos Manuel Lopes Vieira Martins (FMV - UTL)
Prof. Doutora Ana Cristina Gaspar Nunes Lobo Vilela (FMV - UTL)
Prof. Doutora Yolanda Vaz (FMV - UTL)
Dr. António Simões Monteiro (FPAS)
Prof. Doutora Luisa Maria Leal Mateus (FMV - UTL)
Prof. Doutor Fernando Costa Ferreira (FMV - UTL)
Doutor Alexandre Cameira Leitão (IICT)
Doutor Eng. José Santos Silva (INRB IP – INIA – Fonte Boa)
Comissão Científica
Dr. António Matos, Sociedade Científica de Suinicultura - SCS
Prof. Doutor Fernando Bernardo, Segurança Alimentar - FMV - UTL
Prof. Doutor Fernando Ferreira, Biologia Celular e Molecular - FMV - UTL
Doutor Francisco Ruano, Animais aquáticos – INRB IP - IPIMAR
Prof. Doutor João Cannas da Silva, Associação Portuguesa de Buiatria - APB
Dr. João Rebelo Cotta, Secção Portuguesa da Associação Mundial de Ciência Avícola - SPAMCA
Prof. Doutor José Henrique Duarte Correia, Associação Portuguesa de Médicos Veterinários Especialistas
em Animais de Companhia - APMVEAC
Doutor Eng. José Santos Silva, Sociedade Portuguesa de Ovinotecnia e Caprinotecnia - SPOC
Prof. Doutor Luís Telo da Gama, Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais - SPREGA
Prof.ª Doutora Helena Vala, Sociedade Portuguesa de Patologia Animal - SPPA
Dr. Nuno Bernardes, Associação de Médicos Veterinários de Equinos - AMVE
Doutor Ramiro Mascarenhas, Sociedade Portuguesa de Reprodução Animal - SPRA
Prof. Doutor Virgílio de Almeida, Sociedade Portuguesa Epidemiologia e Medicina Veterinária
Preventiva - SPEMVP
Prof. Doutora Yolanda Vaz, Editora da Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias - SPCV
iii
Apoios Institucionais
Food and Agriculture Organization (FAO)
Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)
Câmara Municipal de Santarém
Instituto Nacional de Recursos Biológicos IP / INIA Fonte Boa
Centro de Estudos em Ciências Animais e Veterinárias (CECAV – UTAD)
Faculdade de Medicina Veterinária (FMV – UTL)
Patrocínios
CEVA SAÚDE ANIMAL
MERIAL PORTUGUESA - SAÚDE ANIMAL, LDA
BAYER PORTUGAL S.A.
VIRBAC DE PORTUGAL LABORATÓRIOS, LDA.
ESTEVE FARMA
PFIZER SAÚDE ANIMAL - LABORATÓRIOS PFIZER, LDA
VETERINÁRIA ACTUAL
Secretariado
Anabela Almeida - Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias SPCV
FMV-UTL, Av. da Universidade Técnica, 1300-433 Lisboa, Tel + 351 21 358 0222, Fax + 351 21 358 0221
[email protected]
www.spcvet.pt/Congresso2011
iv
Editorial
A Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias (SPCV), alicerçada na sua história
centenária e na vontade de servir os mais altos interesses de todos quantos dedicam o seu
trabalho e esforço às diferentes áreas do conhecimento que constituem o campo de acção das
Ciências Veterinárias, irá levar a cabo a realização do seu V Congresso sob o tema “As Ciências
Veterinárias para uma só Saúde”.
O congresso tem lugar no Instituto Nacional de Recursos Biológicos, Estação Zootécnica
Nacional (INRB IP/ L-INIA), no Vale de Santarém, cuja colaboração tem sido fundamental para
a sua realização, em conjunto com Instituições de Ensino de Medicina Veterinária e de apoiantes
empresariais.
Para além da contribuição de especialistas de renome internacional que abordarão
diferentes aspectos relacionados com o tema seleccionado, estamos certos que também as
sessões programadas sobre temáticas relativas às diferentes espécies animais, novas tecnologias
e actividades profissionais, acolherão um elevado interesse dos participantes.
Na presente edição, a SPCV conta ainda com a colaboração da FAO, através da
participação de vários dos seus colaboradores que se disponibilizam a partilhar com a audiência
do Congresso a visão institucional e as actividades que se desenvolvem em países lusófonos,
num simpósio especialmente dedicado para o efeito.
A SPCV quer deixar claramente expressa a sua gratidão pelos apoios e incentivos que
recebeu de todas as organizações referidas e de outras individualidades, sem os quais não teria
sido possível a realização de um evento científico com o amplo espectro que caracteriza este
Congresso.
A SPCV deseja que o V Congresso de Ciências Veterinárias 2011 cumpra com as
expectativas de todos quantos contribuíram para a sua organização e de todos quantos nele
participam, numa clara demonstração do papel fundamental que os Profissionais, Técnicos,
Docentes e Investigadores desta área do conhecimento desempenham em prole do avanço
científico e técnico, contribuindo de forma decisiva para a economia global e para a saúde e o
bem estar das populações.
Pela Comissão Organizadora
Carlos Martins
Presidente da Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias
v
vi
Índice Geral
Comissão de Honra .......................................................................................................................................................................................... iii
Comissão Executiva ......................................................................................................................................................................................... iii
Comissão Científica ......................................................................................................................................................................................... iii
Apoios Institucionais ....................................................................................................................................................................................... iv
Patrocínios ........................................................................................................................................................................................................... iv
Secretariado ........................................................................................................................................................................................................ iv
Editorial................................................................................................................................................................................................................. v
FAO SYMPOSIUM ........................................................................................................................ 1
SESSÕES PLENÁRIAS ................................................................................................................. 9
COMUNICAÇÕES ORAIS .......................................................................................................... 13
Epidemiologia ............................................................................................................................ 14
Patologia ..................................................................................................................................... 30
Recursos Genéticos Animais ...................................................................................................... 40
Reprodução................................................................................................................................. 44
Avicultura ................................................................................................................................... 53
Alimentos – Segurança Sanitária ............................................................................................... 57
Alimentos – Tecnologia ............................................................................................................. 63
Pequenos ruminantes .................................................................................................................. 68
Suinicultura ................................................................................................................................ 77
Biologia Celular e Molecular ..................................................................................................... 81
Animais de companhia ............................................................................................................... 88
Buiatria ....................................................................................................................................... 98
Equinos ..................................................................................................................................... 104
Animais aquáticos .................................................................................................................... 111
POSTERS .................................................................................................................................... 119
Índice de Comunicações ……………………………………………………….……...…………….…. 244
vii
viii
FAO SYMPOSIUM
14 September 2011
FAO and One Health
Over the last several years and especially since the outbreaks of zoonotic H5N1 highly pathogenic avian
influenza in different continents the importance for addressing diseases at the animal-human ecosystem
interface has been recognized at technical, socio-economic as well as at political level. The Food and
Agriculture Organization‟s Animal Health Service is committed in assisting countries to reduce hunger
and poverty by addressing animal and zoonotic diseases that impact people‟s livelihoods, health, wellbeing and development. During this symposium FAO will present its overall vision as well as examples
of specific activities that FAO is presently implementing in lusophone countries and its neighbours.
FAO in One Health
Jan Slingenbergh
Head, Empress Animal Health, Food and Agriculture Organization (FAO)
FAO seeks to procure robustness and resilience in food and agriculture, both in social and agro-ecological terms.
This applies to the entire food chain, from the farming landscape to the farm itself, the off-farm processing,
distribution and marketing, and beyond. The FAO/WHO Codex Alimentarius contributes to consumer protection
and general public health. The FAO Animal Health Service works with the OIE to build adequate animal health and
veterinary public health systems. Within the House, the definition of safe food and agriculture resonates with the
efforts to attain sustainable intensification of crop and livestock production, sustainable management and use of
fisheries and aquaculture resources, improved quality and safety of food at all stages of the food chain, sustainable
management of forests and trees, of land, water and genetic resources and improved responses to global
environmental challenges affecting food and agriculture. One Health within FAO extends also to the creation of an
enabling environment for markets to improve livelihoods and rural development, improved food security and better
nutrition, improved preparedness for and effective response to, food and agricultural threats and emergencies,
gender equity in access to resources, goods, services and decision-making in the rural areas, and increased and more
effective public and private investment in agriculture and rural development. In functional terms, FAO procures
effective collaboration with Member States and stakeholders in these regards. In brief, FAO, working closely with
partners worldwide, is committed to turning One Health smart.
2
Education in Veterinary Public Health
Katinka de Balogh
Senior Officer, Veterinary Public Health, Food and Agriculture Organization (FAO)
Although diseases transmitted between animals and humans have been around for centuries, there had possibly
never been such a great interest and need to address diseases at the animal-human-ecosystems interface. The poor
availability of well-rounded animal health professionals to address the changing needs of society has led to the
recognition that “new” subjects need to be integrated into the curricula especially of graduate and post-graduate
veterinary (public health) education programs. Special emphasis needs to be paid to include practical/field
epidemiology, enhance communication skills, ability to engage in multidisciplinary teamwork, and in strategic
planning. The Food and Agriculture Organization of the United Nations is engaged with veterinary faculties and
veterinary associations to define new areas and strengthen conventional areas of work with a view of educating
veterinarians able to address diseases and safeguard public health in a rapid changing world.
3
SAPUVET network
Manuela Vilhena
Universidade de Évora, Projecto SAPUVET
Traditionally the High Education in Veterinary Public Health was limited to aspects of food security, focusing on
the Inspection of Animal Products.
At the first Alfa call (2000-2005) the Utrecht University, together with other two European Universities and five
Latin Americans, created the first group called SAPUVETNET and Titled “New Approaches in Veterinary Public
Health”. This group was continued in a second group that includes the participation of two more elements
Universidade de Évora Portugal and UMSS, Cochabamba, Bolivia). This New Group titled NEW APPROACHES
TO VETERINARY PUBLIC HEALTH (THE WAY FORWARD) SAPUVETNET II developed work through
2005-2007. This effort was re-structured in 2008, with a greater focus on SPV on the project SAPUVETNET III:
“Contributing to the Millennium Development Goals, through the One Health Concept”.
The progress of the projects allowed consolidating and strengthening the established SAPUVET network, which
include now a days, twenty eight different institutions. This has led to the exchange of experiences and approaches,
laying the basis for curriculum harmonization. This on-going process certainly can only take place by introducing
possible adaptations through regular curriculum revisions.
During the envisaged co-ordination meetings, partners had had the opportunity to meet face-to-face, to know each
other‟s and gain the necessary confidence to work together. The partners and collaborators jointly identified specific
needs and areas that needed to be addressed or expanded.
The process can be considered most valuable as the activities developed by the project have enabled the partners to
learn from each other‟s experiences, especially during the meetings, e-conferences and bi-lateral visits. We have an
efficient List-server that has proved to be very effective.
In addition to curriculum, the participants developed new teaching training modules in VPH, regarding the role of
veterinarians in food safety, in international trade of animals & animal products, in disasters/emergency situations,
in animal welfare, environmental health and others areas.
Partners also developed new teaching materials, specifically a Manual of Veterinary Public Health based in the
developed curriculum, videos on slaughter methodologies of poultry, rabbits and bovine (interactive video) and the
Journal One Health ISSN: 2027–8047, and also a web platform ( www.sapuvetnet.org) where new approaches and
teaching methodologies can be shared and jointly developed in Spanish, Portuguese and English language.
The walk makes the journey!!
[A rede SAPUVET]
Tradicionalmente, o Ensino em Saúde Pública Veterinária incidia em aspectos ligados à segurança alimentar, principalmente em
Inspeção de Produtos de Origem Animal.
No primeiro projeto Alfa (2000-2005) a Universidade de Utrecht, juntamente com outras duas Universidades Europeias e cinco
universidades latino-americanas deram início ao primeiro grupo de trabalho denominado SAPUVETNET sob o lema "Novas
Abordagens em Saúde Pública Veterinária". Este grupo foi seguido por um segundo grupo que contou com a participação de
mais dois países. Este novo grupo SAPUVETNET II , intitulado NOVAS ABORDAGENS PARA A SAÚDE PÚBLICA
VETERINÁRIA (O CAMINHO A SEGUIR) desenvolveu trabalho entre os anos 2005-2007. Este esforço teve continuidade em
2008, com um maior enfoque na SPV, projeto SAPUVETNET III: "Contribuir para os Objectivos de Desenvolvimento do
Milénio, através do Conceito de Uma Saúde".
A continuidade dos projetos permitiu consolidar e fortalecer a rede SAPUVET inicialmente estabelecida, constituída hoje por 28
diferentes instituições de ensino. A troca de experiências e pontos de vista permitiu estabelecer as bases para uma proposta de
harmonização curricular. Certamente que este processo só pode ser concluído após a introdução das possíveis adaptações e
revisões regulares do currículo.
Durante as reuniões de coordenação previstas, os parceiros tiveram a oportunidade de se conhecer, e ganhar a confiança
necessária para trabalharem juntos. Os parceiros e colaboradores puderam identificar em conjunto as áreas que precisavam ser
abordadas, bem como outras necessidades específicas.
As atividades desenvolvidas pelo projeto permitiram que os parceiros aprendessem com experiências uns dos outros,
especialmente durante as reuniões, as e-conferências e as visitas bi-laterais. A comunicação é facilitada por uma mailing-list, que
provou ser bastante eficaz.
Para além do currículo, os participantes desenvolveram novos módulos de ensino de formação em SPV, sobre o papel dos
veterinários na segurança alimentar, no comércio internacional de animais e produtos animais, em desastres e situações de
emergência, em bem-estar animal, saúde ambiental e outras áreas consideradas de interesse para o ensino na área.
Os parceiros no projeto também desenvolveram novos materiais de ensino, especificamente um Manual de Saúde Pública
Veterinária com base no currículo desenvolvido, vídeos sobre metodologias de abate de aves de capoeira, coelhos e bovinos
(vídeo interativo) e uma Revistal Uma Saúde ISSN: 2027-8047, bem como uma plataforma web (www.sapuvetnet.org), onde
novas abordagens e metodologias de ensino podem ser partilhadas e difundidas nas três línguas oficiais do projeto: Espanhol,
Português e Inglês.
O caminho faz-se caminhando!!
4
Reforço da capacidade dos Serviços de Veterinária em Angola
Projecto de Veterinária – Projecto “SANGA”
Silva Virgílio
Veterinário, Direcção Geral do Instituto dos Serviços Veterinários, Luanda, Angola
A imensidão do território angolano é tal que ainda existem áreas remotas, aonde os Serviços de Veterinária do
Governo ainda não conseguem chegar pela insuficiência de recursos materiais e humanos na actual fase e
consequentemente o exercício do papel dos Serviços de Veterinária ainda não é viável nessas zonas. Outros países
africanos já implementaram sistemas de organização que funcionam com Tratadores de Gado que trabalham por
conta própria para colmatar a insuficiência de recursos humanos do sector público, Esta abordagem ainda não existe
em Angola por causa da guerra que dilacerou o país por mais de 30 anos. No âmbito deste projecto, com
financiamento da União Europeia e cuja agência implementada é a FAO, o Sistema de Tratadores de Gado está a ser
fortalecido nas 5 Províncias que têm mais 85 porcento do gado no Sudoeste do País, trata-se de uma experiência
piloto que poderá ser estendida para outras zonas do País.
No âmbito do projecto, 120 Tratadores de Gado baseados nas comunidades em 15 Municípios. das 5 Províncias
abrangidas serão formados e irão trabalhar por conta própria o que os transformará em parceiros locais dos Serviços
de Veterinária do Estado e permitirá a extensão dos serviços para zonas mais longínquas. Os tratadores serão
capacitados e equipados com instrumentos de trabalho durante o projecto contribuindo para o exercício da
actividade com qualidade e com sustentabilidade. O projecto nos 15 municípios abrangidos é representado por 15
Técnicos Médios que estão a ser formados pelo projecto em matérias de sensibilização da população, técnicas de
veterinária, contabilidade básica e empreendedorismo. São estes 15 técnicos que exercerão a função de formadores
para os 120 tratadores de gado das comunidades.
Para garantir a disponibilidade de medicamentos de qualidade, Farmácias Veterinárias Municipais (comerciais)
estão a ser estabelecidas. A administração e venda de medicamentos pelos Tratadores vai dar dados muito úteis para
o sistema de vigilância de doenças de gado. A legalização das actividades dos Tratadores de Gado é também um
componente importante do Projecto.
Através dum estudo do Projecto ficou demonstrado, que a maior parte da mortalidade do gado é provocado por
doenças que podem ser preveníveis através das vacinações. Como a cadeia de frio ainda é precária, o Projecto
pretende introduzir geleiras a energia solar ao nível Municipal, completado com geleiras a gás e caixas térmicas
alimentadas com o isqueiro das viaturas para permitir a chegada de vacinas de qualidade até às mangas de
vacinação. Espera-se que a cobertura da vacinação vai ser maior com a intervenção dos Tratadores bem motivados,
capacitados e equipados. Assim, o Projecto pretende contribuir para à redução da pobreza, melhorar a saúde dos
animais e a saúde da população, aumento da produção animal e posteriormente estender o sistema para outras áreas
do País.
5
Animal Health Service in Timor Leste
Anthonino do Karmo
Department of Veterinary Services, National Directorate of Livestock and Veterinary Services, MAP, Timor Leste
Animal Health Service in Timor-Leste
Timor-Leste is the second youngest nation in the world that is trying to recover from the after effect of decades-long
independence struggle that damaged its infrastructure and displaced thousands of civilians. Various animal health
problems such as Newcastle Disease (ND), Classical Swine Fever (CSF), Hemorrhagic Septicaemia, Scabies etc
remains to be important affecting the livelihood of many rural famers who depend on livestock rearing. The
veterinary service of MAF is providing regular vaccination services to ND, CSF and Hemorrhagic Septicaemia. The
animal health service is however constrained by poor human resource and veterinary facilities. The MAF through
the support of various international organizations and donors is trying its level best to improve animal health
services in the country. In this regard, the technical and financial support provided by FAO to improving the human
resource and veterinary facilities of the country is indispensible. FAO through its various projects particularly
through AusAID funded Biosecurity Strengthening Project has established animal diseases investigation and
reporting system that operates all over the country and has constructed a Biosafety level II diagnostic laboratory and
postmortem room. It has also contributed to human resource capacity devolvement through provision of various
short and long-term training both in country and abroad. The Government of Timor-Leste has also initiated a three
year diploma programme in animal health (paravets) at University of Timor-Leste. This training is getting a constant
technical support from the Portuguese veterinarians. As a member of OIE which the country got admission this year,
much work and support is still needed to improve the veterinary services and maximize economic benefits from
livestock.
6
FAO’s role in dog population management
Katinka de Balogh
Senior Officer, Veterinary Public Health, Food and Agriculture Organization (FAO)
The Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) through its veterinary public health and animal
welfare activities has engaged in dog population management to address public health risks originating from dogs
such as rabies, echinococcosis and leihmanisasis and to ensure that control programmes take animal welfare aspects
in due consideration. In view of supporting countries in defining their dog population management strategies, FAO
with the support of other partner institutions has organized in 2010/2011 a dog population management econsultation and a technical meeting. Both events enabled a large number of scientists and practitioners to present
and discuss their experiences and insights as well as to exchange up to date information. The outcomes of both
activities are expected to serve as a guide to best practices for countries to design and implement their most
appropriate dog population management programmes.
7
O papel do IPAD na ajuda pública ao desenvolvimento
Augusto Manuel Correia
Instituto Português de Apoio ao Desenvolvimento
O IPAD é o órgão central de cooperação portuguesa e tem por missão propor e executar a política de cooperação
portuguesa e coordenar as actividades de cooperação desenvolvidas por outras entidades púbicas que participam na
execução daquelas políticas. Tem como objectivo ir ao encontro das prioridades definidas pelos seus parceiros e
naturalmente a prossecução dos objectivos do milénio. Dividindo a sua actividade pela cooperação multilateral e
bilateral a sua principal aposta é na área da capacitação e no desenvolvimento de capacidades por forma a
sustentabilizar as suas intervenções. Nesse sentido, e embora a educação seja a prioridade definida as questões de
saúde como um todo acabam por merecer naturalmente algum do destaque.
8
SESSÕES PLENÁRIAS
9
One Health: Why do we need a renovation of our health systems?
Jan Slingenbergh
FAO Food and Agriculture Organization, Roma
The global scale emergence of novel diseases at the human-animal-ecosystems interfaces, coupled also to the
persistent burden of the existing human and animal diseases, in much of the developing world and transition
economies, present a major challenge to the international public good agenda. Even when different definitions of
One Health continue to co-exist, most embrace the notion that today‟s health systems feature a number of
inadequacies requiring to be addressed, with some urgency.
Despite the collective efforts put in place by health professionals worldwide, pathogens continue to evolve,
emerging from natural ecosystems, resulting from wild meat trade and consumption, the rapid growth of animal
agricultural production, the global food animal chains, processing, trade and distribution, extending also to organic
waste disposal, sewage systems, and polluted surface waters, attracting a myriad of scavengers, including birds,
rodents, bats and insects.
Hence, FAO seeks to broaden the health management approaches and has defined four main priorities under the
FAO One Health Action Plan: i) long term solutions to redress the global encroachment of poultry and pig
production by Influenza A viruses; ii) the renovation of Risk Analysis and Risk Management, in particular in terms
of veterinary public health and food safety; iii) the clarification of the drivers of disease emergence, extending to
the instabilities in world agriculture and food supply, and natural resource management; plus iv) the pressing need
to develop health management capacities, staring in poor countries and regions, as per above.
Zoonoses - Past, Present and Future
Jim Scudamore
National Centre for Zoonoses Research, University of Liverpool.
The World Health Organisation defines zoonoses as 'diseases and infections which are transmitted naturally between
vertebrate animals and man'. A survey of infectious organisms showed that of the 1415 species known to be
pathogenic to humans, 61% are zoonotic, while 75% of diseases considered to be 'emerging' are also zoonotic.
In the past certain zoonoses were recognised as being important and control measures were introduced to protect
both animals and humans. Positive lessons can be learned from the way in zoonoses were controlled in the past and
also taking into account the deficiencies which need to be avoided in the future.
New and emerging zoonoses will continue to pose a problem. Many factors contribute to the emergence or reemergence of zoonoses. The many factors which could lead to changes in the emergence and distribution of
zoonotic pathogens need to be identified and evaluated. This is turn emphasises the importance of horizon scanning
and in ensuring integrated surveillance systems in the public health and veterinary areas. This is essential in order to
detect new and emerging zoonoses and also to identify changes in the distribution or incidence of existing zoonoses.
In the developing world the public health sector often focuses on the emergent diseases although endemic zoonoses
can be significant causes of ill health in defined localities. These endemic zoonoses or neglected zoonoses are not a
priority of either the public health or the veterinary sectors, even though their burden may be high to both animals
and humans. Underpinning research is needed to demonstrate the impact of the neglected zoonoses and to provide
information on the effectiveness of controls which can be implemented to reduce these.
The uncertainties of the 21st century require a “new culture of collaboration”. Public health is moving towards
global, systemic and ecologically sound approaches to natural resource management“. Success in the prevention and
control of major zoonoses will depend on the capacity to mobilise resources in different sectors and on coordination
and inter sectoral approaches, especially between national (or international) veterinary and public health services but
also with a range of other specialists such as ecologists, economists, environmental scientists etc.
The presentation will
• review the lessons learned from the past,
• consider present requirements with respect to emerging diseases and the neglected zoonoses in developing
countries and
• indicate changes which will be needed in the future.
10
Dioxins in Food EFSA’s risk assessments and related activities
Luisa R. Bordajandi1*, Stefan Fabiansson1, Claudia Heppner1, Josef Schlatter2
1 European Food Safety Authority (EFSA). Largo N. Palli 5/A. 43121 Parma, Italy. *E-mail: [email protected]
2 Swiss Federal Office of Public Health. Stauffacherstrasse 101. CH-8004 Zürich, Switzerland. Chair of the EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain.
The European Food Safety Authority (EFSA) was established in January 2002, following a series of food crises in
the late 1990s, as an independent body providing scientific advice and communication on risks associated with the
food chain [1]. EFSA‟s remit covers food and feed safety, nutrition, animal health and welfare, plant protection and
plant health. As a European Union risk assessment body, EFSA produces scientific opinions and advice to provide a
sound foundation for European policies and legislation and to support the European Commission, the European
Parliament and EU Member States in taking effective and timely risk management decisions.
Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and dibenzofurans (PCDFs) are two groups of tricyclic planar
compounds that often together are referred to as “dioxins”. These are widely distributed contaminants that are
formed as unwanted by-products in a number of anthropogenic activities.
Investigations of the different pathways have indicated that more than 80% of total dioxin exposure in the general
population is via food. Dioxins can be found in food products of animal origin, particularly in fatty tissues, because
of their lipophilic properties and the high accumulation potential. Generally, dioxins do not cause immediate health
risks, but long-term exposure to high levels of dioxins can cause a range of adverse effects, including cancer.
Comprehensive monitoring programs conducted worldwide during the past two decades to follow up legislative
measures showed that human exposure to dioxins has decreased significantly over time. These programs also
facilitate the detection of contamination incidents.
Since its establishment, EFSA and EFSAs Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM Panel)
have carried out risk assessments and related activities to assess the risks for public health due to the presence of
dioxins and related compounds, e.g. dioxin-like PCBs (DL-PCBs) in food and feed and to increase the knowledge
on the occurrence of these compounds in foodstuffs. In 2004, EFSA organised a scientific colloquium on
“methodologies and principles for setting tolerable intake levels for dioxins and DL-PCBs” aiming at achieving a
better understanding of the fundamental issues related to their presence in food and feed, and to provide an
opportunity for an interactive exchange of expert views [2]. In particular, the objectives were to analyse and discuss
the differences in approaches and principles for setting tolerable intake limits for dioxins and DL-PCBs, update the
state-of-the-science on the subject, and consider the possible impact of new developments, if any, on consumer
advice.
The EFSA CONTAM Panel has issued scientific opinions on the health risks related to human consumption of wild
and farmed fish and the presence of contaminants such as dioxins and PCBs in 2005 [3], and on the presence of high
levels of dioxins and DL-PCBs in liver of sheep and deer in 2011 [4]. In 2005 the CONTAM Panel concluded that
overall the limited data available indicated no consistent differences between wild and farmed fish both in terms of
nutrient and contaminant levels, and there was no difference with respect to safety for the consumer. However, the
CONTAM Panel noted that regional differences exist, e.g. increased contaminant concentrations in wild fish
originating from the Baltic Sea.
While consumption of fish, and in particular fatty fish due to its richness in long chain n-3 polyunsaturated fatty
acids, is beneficial to cardiovascular health and maybe also to foetal development, fish can contribute significantly
to the dietary exposure to some contaminants, such as dioxins and dioxinlike compounds. High level consumers of
fatty fish may exceed the tolerable weekly intake (TWI) of 14 pg WHO-TEQ/kg body weight for PCDD/Fs and DLPCBs [5], even without taking into account other sources of dietary exposure. Exposure to these contaminants may
counteract some of the beneficial effects.
On the risk to public health related to the presence of high levels of dioxins and DL-PCBs in liver from sheep and
deer [4], the CONTAM Panel concluded that regular consumption of sheep liver would result on average in an
approximate 20% increase of the median background exposure to dioxins and DL-PCBs for adults. On individual
occasions, consumption of sheep liver could result in high intakes exceeding the TWI of 14 pg WHO-TEQ/kg body
weight [5]. The CONTAM Panel concluded that the frequent consumption of sheep liver, particularly by women of
child-bearing age and children, may be a potential health concern.
In 2008 EFSA received from the European Commission an urgent request for scientific and technical assistance due
to the discovery of elevated levels of dioxins and dioxin-like PCBs (levels up to 200 pg WHO-TEQ/g fat) in some
Irish pork. EFSA was asked to assess within days public health risks due to the possible presence of dioxins in Irish
pork and products containing pork [6]. EFSA concluded that in the most likely scenario, if someone ate an average
amount of Irish pork each day (average consumer) throughout the period of the incident (90 days), 10% of which
was contaminated at the highest recorded concentration of dioxins, the body burden would increase by
approximately 10%. EFSA considered this increase to be of no concern for this single event. In a very extreme case,
if someone ate a large amount of Irish pork each day (high consumers) throughout the period of the incident, 100%
of which was contaminated at the highest recorded concentration of dioxins, it was concluded that the uncertainty
factor embedded in the TWI of 14 pg WHO-TEQ/kg body weight [5] would be considerably eroded. Given that the
TWI has a 10-fold built in safety margin, EFSA considered that this unlikely scenario would reduce protection, but
not necessarily lead to adverse health effects.
11
In 2002 the European Commission prescribed a list of actions to further reduce the presence of dioxins and dioxinlike PCBs and later introduced regular monitoring by Member States of food and feed. Data on the presence of
dioxins and DL-PCBs in food reported on a regular basis to the Commission were then handed to EFSA for
assessment. Therefore, EFSA published in 2010 the results of the monitoring of dioxin levels in food and feed [7]. A
total of 7,270 samples collected in the period 1999-2008 from 21 European countries were analysed in detail. Dioxin
and furan congeners comprised between 30% and 74% of the total concentrations depending on food or feed group,
while mono-ortho PCBs comprised between 15% and 45% of the DL-PCBs. Changing the basis for calculating
overall exposure by applying the new toxic equivalency factors established by WHO in 2005 will overall result in
14% lower values with the extent of the difference being highly variable across food and feed groups. EFSA has
recently received from the European Commission a mandate to collect on a continuous basis all available data on
occurrence of chemical contaminants in food and feed, including dioxins and DL-PCBs, that will serve for future
EFSA reports and risk assessments.
References
[1] Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the Council of 28 January2002
laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety
Authority and laying down procedures in matters of food safety. OJ L31, 01.02.2002, pp 1-24. http://eurlex.
europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2002:031:0001:0024:EN:PDF
[2] Dioxins: Methodologies and principles for setting tolerable intake levels for dioxins, furans and
dioxin-like PCBs. EFSA Scientific Colloquium Summary Report. European Food Safety Authority,
Parma, December 2004. Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/supporting/pub/124e.htm
[3] Scientific Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the
European parliament related to the safety assessment of wild and farmed fish. EFSA Journal (2005) 236,
1-118. Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/236.htm
[4] Scientific Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain on the risk to public
health related to the presence of high levels of dioxins and dioxin-like PCBs in liver from sheep and deer.
EFSA Journal 2011, 9(7), 2297. Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/2297.htm
[5] SCF (Scientific Committee on Food), 2001. Opinion of the Scientific Committee on Food on the risk
assessment of dioxins and dioxins-like PCBs in food (update based on the new scientific information
available since the adoption of the SCF opinion of 22 November 2000). Available at:
http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out90_en.pdf
[6] Statement of EFSA on the risks for public health due to the presence of dioxins in pork from Ireland
(Question No EFSA-Q-2008-777). Issued on 10 December 2008. Available at:
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/911.htm
[7] Scientific Report of EFSA. Results of the monitoring of dioxin levels in food and feed. EFSA Journal
2010; 8(3):1385. Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/1385.htm
Sustentabilidade na produção agrícola e animal
José Lima Santos
Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de Lisboa
Esta conferência visa discutir a natureza dos principais problemas de sustentabilidade associados ao uso do solo para
a produção agrícola e animal, bem como as soluções que têm vindo a ser propostas para esses problemas, tanto do
lado da produção como do consumo. Nesse sentido, começa por se apresentar duas narrativas possíveis do pico de
preços dos produtos alimentares em 2008: aquela que tem sido avançada pela FAO-OCDE e a narrativa proposta por
Lester Brown, do Earth Policy Institute. Discute-se o papel da tecnologia (uma nova revolução verde ecológica), da
demografia e dos padrões de consumo alimentar na génese e solução dos problemas de sustentabilidade com que nos
confrontamos. Conclui-se com uma análise do papel relativo do mercado e das políticas públicas na promoção da
sustentabilidade da produção agrícola e animal.
12
COMUNICAÇÕES ORAIS
13
Epidemiologia
Comunicação livre oral
Diferentes factores de risco para grupos de serovares de Salmonella em porcos reprodutores
Correia-Gomes, C.1,2, Mendonça, D.1,2, Vieira-Pinto, M.3, Niza-Ribeiro, J.1,2
1 Departamento de Estudos das Populações, Instituto de Ciências Biomédicas - ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
2 Instituto de Saúde Pública da Univeridade do Porto (ISPUP), Porto, Portugal
3 Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
Salmonella é uma das causas mais frequentes de doença veiculada por alimentos na União Europeia (EU). O
Regulamento Nº 2160/2003 da EU prevê uma redução da prevalência deste agente em porcos. A prevalência dos
diferentes serovares varia entre Estados Membros, e alguns factores de risco podem estar mais associados a certos
serovares. Os dados utilizados referem-se ao estudo base da prevalência de Salmonella em porcos reprodutores em
Portugal. Foram testadas 1670 amostras compostas de fezes de parques, pertencentes a 167 explorações. Das
amostras testadas 172 eram positivas para Salmonella. Os serovares encontrados foram agrupados em 2 grupos: 27%
positivos ao serovar Typhimurium ou serovar 4,5,12:i- , e 73% positivos aos restantes serovares. Foi realizado um
inquérito sobre factores de maneio e potenciais factores de risco para Salmonella na altura da colheita das amostras.
Devido à estrutura dos dados utilizou-se uma análise multinomial multinível recorrendo a modelos mistos
generalizados (GLMM) com estimação vai método de Monte Carlo baseado em cadeias de Markov. A variável
dependente tinha 3 categorias: i) “sem Salmonella”, ii) “serovar Typhimurium ou serovar 4,5,12:i-“ e iii) “outros
serovares”. No GLMM os factores associados com a exploração foram considerados no segundo nível e os factores
ligados aos parques foram considerados no primeiro nível. Utilizando a categoria “sem Salmonella” como classe de
referência as associações significativas (p>0,05) encontradas foram, para a categoria “Typhimurium ou 4.5.12:i-“:
mistura de marrãs e porcas nos parques, explorações com mais de 203 porcos reprodutores, parques com mais de 10
animais. Para a categoria “outros serovares” as associações significativas foram: explorações com controlo de
roedores, região da exploração, uso de sémen que não seja exclusivamente de centros de inseminação, maternidade
versus parques de cobrição, e alimento de origem externa ou mistura de alimentos de diferentes origens. Um plano
de controlo para reduzir a prevalência de Salmonella sp. deve ter em consideração estes resultados para melhorar a
sua eficácia.
[Differences in risk factors for Salmonella serotypes in breeding pigs in Portugal]
Salmonella is one of the major causes of food-borne disease in the European Union (EU). The EU Regulation No
2160/2003 imposes a reduction of the prevalence of this agent in pigs. The Member States prevalence of the
different serotypes varies, and some risk factors could be more associated with different serotypes. The data used in
this study refers to the baseline survey for the prevalence of Salmonella in breeding pigs in Portugal. A total of 1670
pen fecal samples, from 167 herds, were tested. Of these 172 samples were positive to Salmonella. The serotypes
found were grouped under two groups for the purpose of this study, as follows: 27% S. Typhimurium or serotype
4,5,12:i:-, 73% other serotypes. At the time of the collection of the samples a questionnaire about the herd
management and potential risk factors was applied. A multinomial multilevel analysis of the dataset was done using
generalized linear mixed models (GLMM) with Markov chain Monte Carlo methods. Three categories for the
outcome variable were specified: i) no Salmonella, ii) serotype Typhimurium or serotype 4,5,12:i:-, iii) other
serotypes. In the GLMM the factors associated with the pen fecal samples were considered the first level of the
explanatory variables and the factors associated with the herds were the second level. Comparing to “no
Salmonella” as reference the significant associations (p<0.05) found for “serotypes Typhimurium or serotype
4,5,12:i:-“ were: mixture of gilts and sows in the pen, herds with more than 203 breeding pigs, pen samples with
more than 10 animals/sample. For the “other serotypes”: control of rodents, region of the country, semen from
others sources than insemination centers, maternity pens versus mating pens, and feed from external or mixed
source. A control plan design to reduce the prevalence of Salmonella should take these results in consideration to
improve effectiveness.
14
Detecção e caracterização do vírus da hepatite E em porcos de Portugal
Berto, A.1, Mesquita, J.R.2,3, Nascimento, M.S.J.3, van der Poel, W.H.M.1
1 Central Veterinary Institute, Wageningen University and Research Centre. Emerging and Zoonotic Viruses, Department of Virology, Lelystad,
The Netherlands
2 Secção de Ciências Veterinárias, Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal
3 Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Portugal
Objectivos: O vírus da hepatite E (HEV) é actualmente visto como uma preocupação para a Saúde Pública sendo
considerado a principal causa de hepatite transmitida por via entérica em seres humanos em todo o mundo. Este
vírus é responsável por mais de 50% dos casos de hepatite vírica aguda em países endémicos. Nos países
industrializados a hepatite E ocorre esporadicamente e, principalmente, em visitantes provenientes de áreas
endémicas. No entanto, alguns dos casos evidenciaram-se como não estando relacionados com viagens, e portanto
considerados autóctones. As estirpes autóctones são geneticamente diferentes das estirpes de países endémicos e têm
sido relatadas nos EUA, Europa, Japão, Tailândia, Hong Kong e Austrália. Apesar do facto de que é praticamente
apatogénica para suínos, as estirpes de HEV suínas estão intimamente relacionadas com as estirpes humanas. O
objectivo do presente trabalho foi estudar se a população de suínos em Portugal está a excretar HEV, e portanto
contribuindo para uma análise dos perigos de origem alimentar para os consumidores de carne de porco de Portugal.
Este parece ser o primeiro estudo a descrever a presença de HEV em suínos de Portugal.
Metodologias: Um total de 200 amostras de fezes de porcos foram colhidas entre Dezembro de 2010 e Fevereiro
2011, de 5 explorações suinícolas industriais (40 amostras por exploração), situadas em 5 distritos diferentes em
Portugal, abrangendo várias fases da produção industrial de suínos (leitões, desmame, engorda e reprodutoras).
Amostras de fezes foram analisadas para a presença de RNA de HEV por real-time RT-PCR. Cinco amostras
positivas para HEV (1 de cada suinicultura) foram seleccionadas para sequenciação e comparadas com sequências
previamente conhecidas do banco de dados GenBank.
Resultados: No geral, 44 (22%) das 200 fezes de porco examinadas mostraram ser positivas para RNA de HEV.
Fezes positivas para HEV foram detectadas em todas as faixas etárias deste estudo, com uma taxa de detecção de
32% (16/50) em leitões e na engorda, seguido por 20% (10/50) no desmame e 4% (2/50) nas reprodutoras. Todas as
sequências obtidas foram caracterizadas como pertencentes ao genótipo 3, que parece ser endémico em suínos de
toda a Península Ibérica e pode causar hepatite E em humanos.
[Detection and characterization of hepatitis E virus in domestic pigs from Portugal]
Objectives: Hepatitis E virus (HEV) is an important public-health concern as a major cause of enterically
transmitted hepatitis in humans worldwide. The virus has been found to be responsible for over 50% of cases of
acute viral hepatitis in endemic countries. In industrialized countries Hepatitis E occurs sporadically and mainly in
visitors from endemic areas. However, some of the cases have been shown to be non-travel-related but
autochthonous. The autochthonous strains are genetically diverse compared to strains from HEV-endemic countries
and have been reported in USA, Europe, Japan, Taiwan, Hong Kong and Australia. Despite the fact that HEV is
virtually apathogenic in pigs, swine strains are closely related to human strains. The aim of the present work was to
study if the pig population in Portugal is shedding HEV, thus potentially contributing to HEV-related foodborne
hazards for Portuguese pork consumers. To the best of our knowledge this is the first study reporting the presence of
HEV in pigs in Portugal.
Methodologies: A total of 200 pig stool samples were collected between December 2010 and February 2011from 5
industrial pig farms (40 samples per farm) situated in 5 different Portuguese districts and covering all age groups of
industrial pig production (weaners, growers fatteners and sows). Stool samples were analyzed for the presence of
HEV RNA by real-time RT-PCR. Five HEV positive samples (1 from each farm) were selected for sequencing and
compared with previously known sequences from the GenBank sequence database.
Results: Overall, 44 (22%) of the 200 examined pig stools tested positive for HEV RNA. Stools positive for HEV
were detected across all age groups of this study, with a detection rate of 32% (16/50) in weaners and fatteners,
followed by 20% (10/50) in growers and 4% (2/50) in the sows. All sequences obtained were characterized as
genotype 3, which seems to be endemic in pigs throughout the Iberian Peninsula and may cause hepatitis E infection
in humans.
15
Evidência serológica e virológica da circulação de parvovirus em javalis em Portugal
Duarte, M., Henriques, A.M., Ramos, F., Fagulha, T., Barros, S.C., Luís, T., Fevereiro, M.
Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
O javali Europeu (Sus scrofa) é uma espécie indígena em muitos países podendo actuar como reservatório de
doenças infecciosas que afectam os suínos domésticos. O aumento da população de javalis observado em vários
países Europeus incluindo Portugal eleva o risco de transmissão de doenças entre esta espécie e o porco doméstico,
particularmente nas regiões onde se pratica e sistema extensivo de produção.
O objectivo deste trabalho consistiu na avaliação epidemiológica da infecção do javali Europeu pelo Parvovirus
porcino em Portugal, utilizando amostras de sangue e tecidos, recolhidas em montarias praticadas no âmbito dos
programas nacionais de vigilância para a Peste Suína Clássica e Africana, implementados pela Direcção Geral de
Veterinária.
Num pequeno ensaio realizado entre 2009 e 2010, foram testados 392 soros de javalis abatidos em cinco regiões de
Portugal, com uma ELISA de bloqueio comercial (Ingenasa) para a detecção de anticorpos (Ac) PPV. A taxa de
seroprevalência foi estimada em 30,9% tendo sido detectados Acs em animais provenientes de todas as regiões
estudadas.
A presença de DNA de PPV foi testada por PCR em tempo real desenhando-se para o efeito dois primers na região
codificante da proteína NS1, que amplificam um fragmento de 71 bp. Foi utilizada uma sonda TaqMAN descrita por
Chen et al. (2009). As preparações de DNA foram extraídas de homogenados de baço processados em grupos com
um máximo de 5 animais, provenientes da mesma montaria. Os resultados obtidos revelaram que pelo menos 30,9%
das amostras são positivas a PPV. A especificidade da detecção foi confirmada por sequenciação do amplicão após
clonagem em pCR2.1TOPO TA. Uma região parcial do gene vp2 foi também amplificada e sequenciada,
demonstrando assim inequivocamente a presença de PPV nas amostras analisadas. Curiosamente, 48,7% dos soros
positivos a Ac PPV foram positivos a PCR sugerindo que a virémia nos javalis seja mais prolongada do que nos
suínos domésticos. Os nossos resultados mostram claramente que a infecção por PPV é comum na população de
javalis de Portugal. Foi estimado que cerca de 40,3% dos animais sejam negativos à presença de Ac e de DNA de
PPV o que está em concordância com um cenário de infecção activa nestes animais, muito provavelmente com
maior incidência nos animais mais jovens.
Os javalis constituem por este motivo uma fonte de infecção de PPV para os suínos domésticos, particularmente em
áreas onde o sistema tradicional de produção de porco é praticado em regime extensivo no qual o contacto entre
indivíduos das duas espécies é observado.
[Serologic and virological evidence of parvovirus circulation in wild boars in Portugal]
Wild boars (Sus scrofa) are indigenous species in many countries and can act as reservoirs for important infectious
diseases in domestic pigs. The increase in wild boar population observed in several European Countries such as
Portugal, Spain, Italy and Germany higher the risk of transmission of diseases between these species particularly in
free-ranging production regions.
Our objective was to infer about the actual epidemiology of Porcine Parvovirus infection in the wild boar population
in Portugal, using tissue and blood samples collected from hunted wild boars for regular monitoring for the presence
of exotic notifiable diseases such as Classical Swine fever and African swine fever, in accordance to the national
surveillance programs implemented by the Portuguese Veterinary Authorities.
A small-scale serological survey using sera of 392 wild boars shot in five of the seven regional agriculture services
of Portugal between 2009 and 2010 were tested by a commercial blocking ELISA (Ingenasa) for the presence of
PPV antibodies. The overall seroprevalence rate was estimated in 30.9% and PPV antibodies were detected in
animals originating from the five regions studied.
The presence of Porcine Parvovirus DNA was tested by real time PCR using primers designed during this study on
the NS1 coding region which amplifies a 71 bp long fragment and a TaqMAN probe described by Chen et al.
(2009). PCR tests were performed using DNA extracted from pools of spleen homogenates of up to five animals
from the same hunt. The results showed that at least 30.9% of the samples were positive. The specificity of the
detection was further confirmed by sequencing analysis of the amplicons cloned into pCR2.1TOPO TA. Another
genomic region, within the VP2 coding sequence, was amplified and sequenced unequivocally demonstrating the
presence of Porcine Parvovirus in the tissues. Interestingly, 48.7% of the sera found positive for PPV antibodies
were also PPV PCR positive suggesting a longer time viremia in this specie compared to what is described for
domestic pigs. Our results clearly show that PPV infection is common in the wild boar population. We estimated
that less than 40.3% of the animals are negative to both PPV Ab and PPV DNA which corroborates the scenario of
an active infection, probably with higher incidence in younger animals. Wild boars constitute therefore a possible
PPV source of infection for domestic pigs, particularly in areas where the typical Portuguese extensive or semiintensive type of pig production is practiced in which close contact between the species is observed.
16
Será que existe um papel para a epidemiologia molecular no controlo activo das mastites?
Bexiga, R.1, Rato, M.G.2, Lemsaddek, A.1, Semedo-Lemsaddek, T.1, Pereira, H.3, Mellor, D.J.4, Ellis, K.A.4, Vilela,
C.L.1
1 CIISA - Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa
(TULisbon), Portugal
2 Centro de Recursos Microbiológicos, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
3 VetAgro Sup Campus Vétérinaire de Lyon, France
4 Scottish Centre for Production Animal Health and Food Safety, Large Animal Clinical Sciences and Public Health, School of Veterinary
Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, UK
O conhecimento da epidemiologia das mastites bovinas aumentou muito graças ao contributo da biologia molecular.
Devido a esta, sabemos hoje que mais de metade dos casos de mastite clínica nos primeiros 100 dias de lactação
podem resultar de infecções adquiridas no período seco; que E. coli pode actuar como um agente contagioso de
mastite e que Streptococcus uberis pode provocar infecções intra-mamárias de longa duração. Esta informação
resulta da combinação de dados gerados por DNA firgerprinting com a análise recorrendo a princípios
epidemiológicos. Os autores recorreram à epidemiologia molecular para tentar perceber quais as formas mais
prováveis de infecção intra-mamária para diferentes staphylococci coagulase-negativos (SCN) isolados a partir de
amostras de leite. Este estudo longitudinal observacional foi realizado em 4 vacarias, com amostras recolhidas a
cada 4 semanas, durante 12 visitas cada uma. Os quartos infectados com SCN foram seguidos ao longo do tempo
sendo as amostras de leite submetidas para bacteriologia e determinação das contagens de células somáticas. Foi
utilizada a amplificação por internal transcribed spacer region PCR para a definição da espécie, e a sequenciação
dos genes sodA e rpoB sempre que o PCR não era completamente informativo. Foi realizada electroforese em
campo pulsado para identificar as estirpes, permitindo assim avaliar a duração da infecção com cada estirpe. Foi
avaliada a diversidade das estirpes através do cálculo do índice de diversidade de Simpson. Este mostrou diferenças
significativas entre espécies quando todas as explorações eram consideradas, com S. epidermidis e S. simulans
mostrando menos diversidade que S. haemolyticus. Quando foi comparada a diversidade de S. epidermidis entre
duas explorações, foi também encontrada uma diferença significativa. Uma diversidade de estirpes diferente pode
reflectir diferentes modos de transmissão: contagioso para situações de baixa diversidade ou ambiental para
situações de elevada diversidade. Espécies diferentes e/ou procedimentos diferentes nas explorações podem levar a
mais mastites de origem contagiosa ou a mais mastites de origem ambiental. A epidemiologia molecular tem o
potencial de clarificar as vias de transmissão mais frequentes e as fontes de infecção mais prováveis, não apenas
para efeitos de investigação, mas tornando-se disponível e acessível aos clínicos, também no planeamento de
programas de controlo específicos para explorações.
[Is there a role for molecular epidemiology in active mastitis control?]
Knowledge of the epidemiology of bovine mastitis has expanded much through the contribution of molecular
biology techniques. We now know that over half of the clinical mastitis cases in the first 100 days of lactation can
result from infections acquired during the dry period; that E. coli can act as a contagious mastitis pathogen and that
Streptococcus uberis can cause long-lasting intramammary infections. All this information comes from the
combination of DNA fingerprinting data with analysis using epidemiological principles. The authors resorted to
molecular epidemiology to gain insight into the most likely form of intramammary infection for different coagulasenegative staphylococci (CNS) isolated from bovine milk samples. This longitudinal observational study was
performed in 4 farms, sampled at 4 week intervals for 12 visits each. Quarters infected with CNS were followed
through time with milk samples being submitted for bacteriology and somatic cell count determination. PCR
amplification of the internal transcribed spacer region was used for species allocation with sequencing of the sodA
and rpoB genes being used when the PCR was not completely informative. Pulsed-field gel electrophoresis was
performed to assess strain identity, allowing for duration of infection with the same strain to be assessed. Estimation
of strain diversity through calculation of the Simpson diversity index, showed significant differences between
species when all farms were considered, with S. epidermidis and S. simulans showing less diversity than S.
haemolyticus. When comparing S. epidermidis diversity between 2 of the farms a significant difference was also
found. Different strain diversity may reflect different modes of infection: contagious for low diversity or
environmental for high diversity situations. Different species and/or different farm management protocols may lead
more often to mastitis of contagious or environmental origin. Molecular epidemiology has the potential to clarify
most likely routes of transmission and most likely sources of infection, not just for research purposes, but if it
becomes widely available and accessible at practitioner level, also in the design of herd specific control
programmes.
17
Prevalência de claudicações e os factores de risco associados, em explorações de vacas leiteiras em
Portugal Continental
Stilwell, G.1, Carreira, M.1, Carolino, N.2
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
2 Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, Instituto Nacional de Recursos Biológicos - INRB IP / L-INIA, Fonte
Boa, Vale de Santarém, Portugal
As claudicações por patologia podal são consideradas como a terceira maior causa de perdas económicas para os
produtores de leite e o problema mais grave de bem-estar animal em vacas leiteiras. Estudos documentam que a
incidência de claudicação nos animais tem vindo a aumentar nos últimos quarenta anos em todo o mundo. Este
trabalho teve dois objectivos primordiais: primeiro, avaliar a prevalência de claudicações e lesões de curvilhão em
explorações leiteiras intensivas de Portugal Continental e em segundo, identificar os factores de risco que podem
influenciar a incidência destes problemas, nomeadamente: o tipo de cama, a espessura das camas, o tipo de limpeza
utilizado, o aspecto da limpeza, o piso escorregadio, as características do roço, a frequência do corte funcional da
úngulas, o uso de ou não de pedilúvios e a utilização ou não de parque exterior.
As vacas em lactação foram classificadas de 1 (não claudica) a 5 (claudicação severa), segundo sistema validado em
vários estudos, tendo-se considerado como vaca claudicante as classificadas com valor igual ou superior a 3. As
lesões do curvilhão foram classificadas de 0 (sem lesão) até 3 (lesão com ferida e inflamação).
A prevalência média de claudicação foi de 48% tendo mostrado variação entre os 23% e os 91%. Os factores que
tiveram maior influência foram: o material e espessura da cama; a baixa frequência de aparagem das úngulas; o tipo
de limpeza do piso; e a aderência do piso. As lesões de curvilhão eram de grau 3 em 3,6% dos animais, de grau 2 em
9,7% e de grau 1 (pelada) em 29,7%. Foi identificada uma correlação entre gravidade das lesões dos curvilhões e o
uso de cubículos, a espessura da cama e a presença de claudicação.
Em conclusão podemos dizer que os níveis de claudicações em explorações portuguesas são muito elevados e que
este valor parece estar muito relacionado com qualidade das instalações e falhas de maneio.
[Lameness prevalence and associated risk factors in Portuguese dairy farms]
Lameness due to claw disorders is the third cause of economic losses and the first welfare problem in dairy farms
worldwide. Lameness incidence has been increasing in the last forty years. The objectives of this study were: to
measure the prevalence of cow lameness and hook lesions in Portuguese dairy farms; and to evaluate the associated
risks factors, namely the type of bedding, claw trimming frequency, stall hygiene, type of floor, use of foot-baths
and exercise areas.
Lameness was scored in milking cows by a validated method from 1 (no lameness signs) to 5 (severe lameness).
Cows were considered lame if score was 3 or above. Hock lesions were graded from 0 (no lesion) to 3 (lesion with
open wound). Lameness prevalence in all farms was 48%, with variation between 23% and 91%. Factors which
influenced prevalence were bedding material and thickness; claw trimming frequency; slippery floor and hygiene.
Very severe hock lesions (3) were present in 3.6% of cows, severe lesions (2) in 9.7% and mild lesions (1) in 29.7%.
In conclusion we can say that dairy cow lameness is very frequent in Portuguese farms and this may be due to
husbandry and management faults. Housing and bedding is also responsible for hock lesions.
18
A tuberculose bovina em ungulados selvagens na margem esquerda do Guadiana
Santos, N.1, Moiane, I.1, Célio, P.2, Almeida, V.3, Correia-Neves, M.1
1 Instituto de Investigação em Ciências da Vida e da Saúde, Universidade do Minho, Portugal
2 Centro de Investigação em Biodiversidade, Universidade do Porto, Portugal
A ocorrência de tuberculose por Mycobacterium bovis em ungulados selvagens tem sido associada ao recente
aumento da incidência de tuberculose nos bovinos domésticos em Portugal. No entanto, a doença parece ocorrer nos
ungulados selvagens em zonas circunscritas do país. Neste estudo descrevemos a ocorrência de tuberculose em
ungulados selvagens na margem esquerda do Guadiana.
Foram colhidas amostras biológicas de vários tecidos em ungulados caçados entre 2009-10 e 2010-11. A presença
de M. bovis foi pesquisada por inspecção macroscópica e bacteriologia, por cultura em meio de Coletsos após
homogenização e descontaminação com 0,75% de cloreto de hexa-decil-piridinium. Posteriormente, os isolados
foram identificados por PCR para os genes 16SRNA, IS1561, Rv1510 e MPB70.
Foram incluídos na amostra 248 javalis (Sus scrofa), 157 veados (Cervus elaphus) e 5 muflões (Ovis ammon). A
infecção por M. bovis foi detectada em 42 javalis, 15 veados e 1 muflão. A prevalência aparente é superior em
machos de veado e em fêmeas de javali. Nesta última espécie a prevalência aparente quase duplicou nos últimos 5
anos. A doença apenas foi detectada numa pequena parte da área de estudo.
[Bovine tuberculosis in wild ungulates in the left margin of the Guadiana river]
The existence of wild hosts of Mycobacterium bovis as been associated with the recent increase of bovine
tuberculosis in Portugal. However, the cases of M. bovis in wild ungulates show a limited geographical distribution
in Portugal. In this study the occurrence of bovine tuberculosis in wild ungulates will be described at the left margin
of the Guadiana river.
Biological samples were collected from hunter-harvested wild boar in 2009-10 and 2010-11 hunting seasons. M.
bovis presence was detected by gross pathology and bacteriological culture on Coletsos medium after
homogenization and decontamination with 0.75% hexa-decyl-pyridinium chloride. Then the isolates were identified
by PCR for the 16SRNA, IS1561, Rv1510 and MPB70 genes.
248 wild boar (Sus scrofa), 157 red deer (Cervus elaphus) and 5 mufflon (Ovis ammon) were included in the
sample. Infection by M. bovis was detected in 42 wild boar, 15 red deer and 1 mufflon. Apparent prevalence was
highest in male red deer and in female wild boar. The apparent prevalence in wild boar almost doubled in the last 5
years. The infection was detected only in a small proportion of the study area.
19
Micobactérias patogénicas em carnívoros silvestres de Portugal Continental: análise sistemática
post-mortem baseada em bacteriologia, anatomopatologia, histopatologia e SIG
Monteiro, M.1, Albuquerque, T.1, Botelho, A.1, Carvalho, P.1, Mendonça, P.1, Basto, M.2, Rosalino, L.M.2, Bandeira,
V.3, Fonseca, C.3 e Cunha, M.V.1*
1 Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
2 Centro de Biologia Ambiental, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, Lisboa, Portugal
3 CESAM & Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Portugal
*autor correspondente
O recente relatório de vigilância epidemiológica de tuberculose (TB) bovina em Portugal sugere a possibilidade de
uma doença (re)emergente (aumento de prevalência em bovinos superior a três vezes, em 2009), reforçando a
necessidade de aumento da vigilância da TB na fauna silvestre, devido ao risco de disseminação de doença entre
espécies hospedeiras diversas.
Estudos anteriores identificaram duas regiões epidemiológicas de risco para a TB em ungulados silvestres, Idanha-aNova e Moura-Barrancos, evidenciando o papel do javali (Sus scrofa) e do veado (Cervus elaphus) como
reservatórios de Mycobacterium bovis e a possibilidade de infecções cruzadas envolvendo bovinos. A ocorrência de
TB noutras espécies animais abundantes no território continental está neste momento a ser investigada, com especial
enfoque para mesocarnívoros silvestres das famílias Mustelidae, Herpestidae, Viverridae, e Canidae, testando-se,
para o efeito, amostras de tecidos. A infecção por micobactérias foi analisada em mais de 100 animais, obtidos entre
2008 e Junho de 2011, das espécies raposa vermelha (Vulpes vulpes), sacarrabos (Herpestes ichneumon), fuinha
(Martes foina), geneta (Genetta genetta), doninha (Mustela nivalis) e texugo Euro-asiático (Meles meles). Os
animais foram recolhidos nas estradas nacionais após atropelamentos acidentais ou caçados durante acções legais de
controlo de densidades de predadores (sacarrabos e raposa). A infecção por micobactérias foi investigada em órgãos,
linfonodos e amostras de fezes por cultura bacteriológica, PCR, presença de lesões macroscópicas compatíveis com
TB e histopatologia. Embora durante a necrópsia não se tenham detectado lesões macroscópicas características de
TB, a análise histopatológica permitiu identificar a presença de granulomas suspeitos no fígado de algumas raposas.
No entanto, a pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes em cortes repetidos corados pelo método de Ziehl-Neelsen
resultou sempre negativa. Em contraste, a cultura de tecidos e fezes em meios selectivos levou ao isolamento de
bactérias do complexo M. tuberculosis, complexo M. avium, M. avium avium, M. intracellulare e Mycobacterium
spp. de raposas, texugos e sacarrabos. No seu conjunto, estes resultados sugerem que espécies animais abundantes,
de distribuição generalizada, que interagem com ungulados domésticos e selvagens potencialmente infectados e/ou
têm importantes redes sociais poderão estar envolvidas na disseminação das infecções por micobactérias. No
entanto, até ao momento, não se confirmou qualquer caso de TB causada por M. bovis nos mesocarnivoros em
estudo.
[Wild carnivores exposure to pathogenic mycobacteria in mainland Portugal: a systematic postmortem survey based on bacteriology, gross pathology, histopathology and GIS]
The last surveillance reports concerning bovine tuberculosis (bTB) in Portugal (three-fold increase in animal
incidence, in 2009) suggest the possibility of a (re)emergent disease, raising attention to tuberculosis (TB) infection
in free-ranging wildlife, due to the risk of disease spread among several host species. Previous work has identified
two regions of increased risk for TB in wildlife, Idanha-a-Nova and Moura-Barrancos counties, providing evidence
that wild boar (Sus scrofa) and red deer (Cervus elaphus) may be Mycobacterium bovis reservoirs and implicated in
a number of breakdowns in cattle. Disease interaction involving other animal species is currently being investigated
in the mainland territory, specifically in free-ranging wild carnivores from the Mustelidae, Herpestidae, Viverridae,
and Canidae families. Until the present moment, more than 100 animals, sampled from 2008 to June 2011, were
examined for mycobacterial infection and TB-compatible lesions, including red fox (Vulpes vulpes), Egyptian
mongoose (Herpestes ichneumon), stone marten (Martes foina), common genet (Genetta genetta), weasel (Mustela
nivalis) and Eurasian badger (Meles meles). Animals were collected from road-kills or hunting activities (mongoose
and red fox killed during legal predator control management actions). Surveillance targeted the majority of the
geographical regions of mainland Portugal, including known TB-affected areas. The presence of mycobacteria in
organs (lung, liver and spleen), lymph nodes (retropharyngeal, mediastinic and mesenteric) and faeces samples was
investigated by culture, PCR, gross pathology and histopathology. No gross lesions compatible with TB were found
at necropsy. Histopathological analysis revealed the presence of suspect granulomas in the liver of a number of
foxes, however Ziehl-Neelsen staining of repeated histological sections did not confirm the presence of acid-fast
bacilli. In contrast, bacteriological culture of tissues and faeces, seeded on selective egg-based media, led to the
isolation of M. tuberculosis complex, M. avium complex, M. avium avium, M. intracellulare and other
Mycobacterium spp. bacteria from foxes, badgers, and mongooses. Altogether, our results suggest that species that
are abundant and/or widely distributed, that interact with potentially infected wild and domestic ungulates, feed on
carrion and/or have important social networks may play a role in mycobacterial disease spread. However, no
confirmed cases of TB caused by M. bovis in the mesocarnivores surveyed so far have been detected.
20
EEB em Portugal no período 2002-2009 - caracterização dos sinais clínicos
Ramalho, M.L.G.1 e Almeida, V.S.2
1 Direcção-Geral de Veterinária, Lisboa, Portugal
Objectivos: Descrever os sinais clínicos encontrados em 435 casos de Encefalopatia Espongiforme Transmissível
dos Bovinos (EEB) em Portugal.
Metodologia: Análise retrospectiva dos sinais clínicos registados em 435 inquéritos epidemiológicos de Bovino
Positivo à EEB, realizados no período de 2002-2009, pelo Programa de Vigilância, Controlo e Erradicação da EEB.
Sinais clínicos investigados: excitação; hiperestesia à luz/ruído; tristeza; cegueira; apreensão; nervosismo; medo;
agressividade; actividades repetitivas; ataxia; tremores; quedas; decúbito; paralisias e alterações do posicionamento
da cabeça.
A análise de dados foi realizada em Excel® 2007 e Epi-Info®2000. Os dados populacionais e de movimentação dos
bovinos positivos foram obtidos por consultas ao SNIRA, através de programação SQL e transpostos para Excel®
2007 e Access® 2007.
Resultados: Nos 70 inquéritos epidemiológicos de Bovino Positivo à EEB, realizados na sequência de acções de
vigilância passiva, a média de sinais clínicos identificados por bovino suspeito foi de 5,5 sinais clínicos (mínimo 1;
máximo 12). Os sinais clínicos detectados com mais frequência foram os tremores (f=44), seguidos do medo (f=41)
e do nervosismo (f=41), da ataxia (f=38) e de quedas (f=38), e da hiperestasia à luz/ruído (f=37).
Realizaram-se 365 inquéritos epidemiológicos de Bovino Positivo à EEB, identificados na sequência de acções de
vigilância activa, dirigidas a vários grupos de bovinos. Assim, na categoria de “Animais de risco” (N=225) que
inclui: (i) os bovinos suspeitos de doença que não a EEB na inspecção ante-mortem; (ii) os bovinos sujeitos a abates
especiais de emergência/urgência e (iii) os bovinos mortos ou abatidos na exploração, no transporte ou na abegoaria
; observaram-se em média 1,4 sinais clínicos por caso (mínimo 0; máximo 12), sendo o sinal mais frequente o
decúbito (f=44) seguido de quedas (f=42) e de tremores (f=41). Na categoria de “Animais saudáveis abatidos para
consumo” (N=137), a média de sinais clínicos identificados por bovino suspeito foi de 0,3 sinais clínicos (mínimo 0;
máximo 5). Os sinais clínicos detectados com mais frequência foram o nervosismo (f=7) seguido do decúbito (f=5),
medo (f=5), tristeza (f=5) e ataxia (f=5).
Os Autores discutem os resultados à luz da necessidade de manter os dois tipos de vigilância epidemiológica,
antecipando o impacto de um cenário futuro em que a U.E. opte por reduzir as actuais medidas de vigilância e de
prevenção.
[BSE in Portugal – clinical findings in the period 2002-2009]
Objectives: The goal of this study was to describe the clinical findings in 435 cows with Bovine Spongiform
Encephalopathy (BSE) in Portugal.
Methods: A retrospective study was done based on the clinical findings recorded in 435 epidemiological inquiries of
“BSE Positive Bovine” made during the period 2002-2009 under the cover of the BSE Surveillance, Control and
Eradication Programme.
Clinical findings investigated were: disturbance; hyperesthesia to light/sound; sadness; blindness; apprehensive
behaviour; nervousness; fear; aggressiveness; repetitive activities; ataxia; tremors; falling; decubitus; paralysis and
abnormal posture of the head.
Data analysis was performed in Excel® 2007 and Epi-Info®2000. Population and bovine movement data were
obtained in the national database SNIRA through SQL programming.
Results: On the 70 outbreak investigations of “BSE Positive Bovine” carried out as a result of passive surveillance
operations, the average of clinical findings detected by suspicious animal was 5.5 (minimum 1; maximum 12). The
clinical findings mentioned more frequently were tremors (f=44) followed by fear (f=41) and nervousness (f=41),
ataxia (f=38) and falls (f=38) and hyperesthesia to light/sound (f=37).
365 outbreak investigations of “BSE Positive Bovine” were done following active surveillance activities targeted to
several risk categories. Thus at the category “Risk Animals” (N= 225) that includes: (i) bovines suspicious of disease
rather than BSE at ante mortem inspection; (ii) bovines submitted to emergency slaughter and (iii) fallen stock
(bovines found dead or culled on farm, transport or at the abattoir); ; 1.4 clinical findings were observed by animal
(minimum 0; maximum 12) being decubitus the clinical finding more frequent (f=44) followed by falls (f=42) and
tremors (f=41). In the category of “Healthy animals slaughtered for human consumption” (N=137) the average of
clinical findings detected by suspicious animal was 0.3 (minimum 0; maximum 5). Nervousness (f=7), decubitus
(f=5), fear (f=5), sadness (f=5) and ataxia (f=5) lead the clinical findings reported.
The Authors discuss the need to maintain both types of epidemiological surveillance in place, anticipating the
impact of a future scenario in the case the E.U. decides to reduce the present preventive and surveillance measures.
21
Influência do uso de enrofloxacina no desenvolvimento de resistência às quinolonas mediada por
plasmídeos em Escherichia coli de vitelos
Guerreiro, L.1,2, Couto, N.1,3, Centeno, M.1,3, Nunes, T.2,3, Cavaco, L.M.4, Pomba, C.1,3
1 Laboratório de Resistência aos Antibióticos e Biocidas, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
2 Mestrado de Segurança Alimentar da Faculdade de Medicina Veterinária (FMV), Universidade Técnica de Lisboa (UTL), Lisboa, Portugal
4 Research Group for Antimicrobial Resistance and Molecular Epidemiology, National Food Institute, Technical University of Denmark,
Lyngby, Denmark
O conhecimento sobre a presença e frequência de genes de Resistência às Quinolonas Mediada por Plasmídeos
(RQMP) em estirpes comensais de E. coli de origem bovina é escasso a nível mundial. O presente trabalho teve
como objectivos: i) avaliar a frequência de genes de RQMP, designadamente os genes qnr (A, B, C, D e S), o gene
aac(6’)-Ib-cr e o gene codificante da bomba de efluxo qepA; e ii) determinar a Concentração Inibitória Mínima
(CIM) dos antimicrobianos ácido nalidíxico AN, ciprofloxacina CIP e levofloxacina LEV, em isolados de E. coli de
vitelos. Foram estudadas um total de 237 amostras previamente isoladas após pressão selectiva in vivo de
enrofloxacina ENR e caracterizadas quanto à resistência aos antibióticos por Centeno, M. (2010): 101, 79 e 57
isolados relativos a T0, T1 (6 semanas após administração de ENR) e T2 (10 semanas após administração de ENR),
respectivamente. A caracterização fenotípica foi realizada por determinação das CIMs por microdiluição e os
resultados interpretados segundo a norma M100-S20 (CLSI, 2010). A caracterização genotípica da RQMP foi
determinada através de amplificação por PCR dos genes anteriormente mencionados e sequenciação. A proporção
de isolados de E. coli resistentes ao AN em T0, T1 e T2 foi de, respectivamente: 52,5% (n=53; CIM 64- >256
µg/ml), 100% (n=79; CIM 128- >256 µg/ml) e 82,5% (n=47; CIM 128- >256 µg/ml). A proporção de isolados de E.
coli resistentes à CIP e à LEV em T0, T1 e T2 foi de, respectivamente: 34,7% [n= 35; CIP (CIM 4- >256 µg/ml);
LEV (CIM 4-64 µg/ml)], 96,2% [n=76; CIP (CIM 4-128 µg/ml); LEV (CIM 4-64 µg/ml)] e 70,2% [n=40; CIP (CIM
4-64 µg/ml); LEV (CIM 4-32 µg/ml)]. No que respeita à frequência de genes de RQMP nos 237 isolados estudados
foram identificados: 11,8% (n=28) positivos para genes qnr (qnrB n=4, qnrD n=11, qnrS n=13); 0,8% (n=2)
isolados positivos para o gene aac(6’)-Ib-cr. Da análise da frequência dos genes de RQMP nos isolados de E. coli
observou-se: em T0, 3% de genes qnr (todos qnrS) e 2% do gene aac(6’)-Ib-cr; em T1, 15,2% de genes qnr (10,1%
qnrD e 5,1% qnrS); em T2, 22,8% de genes qnr (7% qnrB, 5,3% qnrD e 10,5% qnrS). Os dados obtidos
demonstram um aumento significativo da prevalência de isolados resistentes e da percentagem de RQMPs de T0
para T1 após pressão selectiva da ENR Embora não exista uma associação entre a presença de genes de RQMP e
valores de CIM, verifica-se um aumento da frequência destes genes ao longo do estudo longitudinal. Este é o
primeiro estudo que descreve a identificação de resistência às quinolonas por qnrD em isolados de E. coli de
bovinos.
[Selection of plasmid-mediated quinolone resistance in commensal E. coli by the use of enrofloxacin
in calves]
The current knowledge about the presence and frequency of pasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) genes
in commensal E. coli strains from cattle is scarce. This study aimed at: i) evaluate PMQR genes frequency, namely
qnr genes (A, B, C, D and S), aac(6’)-Ib-cr gene and qepA gene encoding an efflux pump; and ii) determine
Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) of nalidixic acid NA, ciprofloxacin CIP and levofloxacin LEV of E. coli
isolates from calves. 237 E. coli samples were studied after in vivo enrofloxacin ENR selective pressure and
previously characterized regarding antimicrobial susceptibility by Centeno, M. (2010) including: 101, 79 and 57
isolates from T0, T1 (six weeks after ENR administration) and T2 (10 weeks after ENR administration),
respectively. The phenotypic characterization was performed using MICs determined by the microdilution method
and interpreted according to CLSI M100-S20 standards (CLSI, 2010). The genotypic characterization of PMQR was
performed by PCR amplification and sequencing. NA resistant E. coli isolates in T0, T1 and T2 were, respectively:
52.5% (n=53; MICs from 64 to >256 µg/ml), 100% (n=79; MICs from 128 to >256 µg/ml) and 82.5% (n=47; MICs
from 128 to >256 µg/ml). Both CIP and LEV resistant isolates in T0, T1 and T2 were, respectively: 34.7% [n= 35;
CIP (MIC 4->256 µg/ml); LEV (MIC 4-64 µg/ml)], 96.2%[n=76; CIP (MIC 4-128 µg/ml); LEV (MIC 4-64 µg/ml)]
and 70.2% [n=40; CIP (MIC 4-64 µg/ml); LEV (MIC 4-32 µg/ml)]. From the 237 E. coli isolates tested: 11.8%
(n=28) harboured qnr genes (qnrB n=4, qnrD n=11 and qnrS n=13); 0.8% (n=2) were found positive for the aac(6’)Ib-cr gene. The analysis of PMQR genes in E.coli at the different sampling times showed that: at T0, qnr genes were
detected in 3% of the isolates (all found to be qnrS) and 2% carried the aac(6’)-Ib-cr gene; at T1, 15.2% of the
isolates carried qnr genes (10.1% qnrD and 5.1% qnrS); and at T2, 22.8% of the isolates were found positive for qnr
genes (7% qnrB, 5.3% qnrD and 10.5% qnrS). The results reveal a significant increase in the prevalence of resistant
isolates and resistant genes from T0 to T1 after ENR selective pressure. Despite no association was found between
the PMQR genes and MIC values, an increased frequency of PMQR genes along the longitudinal study was
observed. This is to our knowledge the first report on PMQR qnrD gene in E. coli isolates from cattle.
22
Uma Saúde Global: princípios da estratégia global de contenção de resistências a agentes
antimicrobianos – sua percepção e implementação pelos produtores de bovinos de carne do
Ribatejo Norte
Vieira, A.1,2, Vilela, C.1
2 Rafael e Filho, S.A., Portugal
A utilização de antimicrobianos na produção animal tem sido motivo de intenso debate, pelas preocupações sobre
possibilidade de transferência de bactérias a eles resistentes dos animais para o Homem. Foram desenvolvidos
programas de monitorização de resistências e consumo de antimicrobianos, que demonstram que o desenvolvimento
de resistências pode ser minimizado pela implementação de estratégias para uma utilização prudente e racional dos
antimicrobianos nas explorações pecuárias.
O presente estudo constitui uma primeira abordagem para avaliar diversos parâmetros importantes para a utilização
prudente e racional dos antimicrobianos, como os conhecimentos, grau de percepção e práticas dos produtores, para
o que foram realizados 185 questionários presenciais em explorações de bovinos de carne do Ribatejo Norte. Os
resultados alertam para a necessidade de formação nas áreas da Biossegurança/Biocontenção e de manutenção de
registos de utilização de antimicrobianos nas explorações. Os médicos veterinários têm um papel importante, por
serem a principal fonte de informação dos produtores.
A informação obtida não nos permitiu avaliar o consumo de antimicrobianos; apenas 11% dos produtores
mantinham registos, na sua maioria incompletos, das intervenções metafiláticas e terapêuticas. A alternativa de
análise das informações das receitas/requisições veterinárias, também não foi viável, pois apenas 82% das
aquisições era acompanhada de requisição/receita Médico-Veterinária.
As últimas questões do questionário elaborado procuravam conhecer a opinião dos responsáveis pelas explorações.
Deste total, 94% concordavam que a introdução de boas práticas podia reduzir a utilização de antimicrobianos,
tendo 52% considerado importante esta redução, demonstrando que existe espaço para a redução da utilização destes
medicamentos. Um total de 18% dos produtores não expressou a opinião sobre antibiorresistências, confirmando a
necessidade de aumentar o nível de formação nesta área.
[One Health: Global principles for the containment of antimicrobial resistance – perceived
importance and implementation by beef farmers at Ribatejo Norte]
The use of antimicrobial drugs in livestock farms has been at the center of many debates because of the possibility
of resistant bacteria transmission from animals to men. Resistance and antimicrobial consumption monitoring
programs have been developed, suggesting that the risks of development of resistant bacteria can be minimized
through a prudent and rational use of antimicrobials in livestock farms.
This study is a first approach to evaluate several parameters important to the prudent and rational use of
antimicrobials, such as farmers‟ knowledge, perceived degree of importance and management practices. A total of
185 in-person interviews were conducted in beef farms of Ribatejo Norte in Portugal. Results alert for the need to
further educate farmers in Biosecurity/Biocontainment and to keep registries of antimicrobials in the farms.
Veterinarians play an important role, for being the main source of information.
The information obtained did not allow for an evaluation of antimicrobial consumption; only 11% of the farmers
kept records, largely incomplete, of metaphylactic and therapeutic treatments. The alternative of collecting data on
veterinary prescriptions was also not viable, since only 82% of purchased drugs were sanctioned by a veterinarian.
The last two questions elicited the farm manager‟s opinions. From this total, 94% agreed that good management
practices could reduce the antimicrobial usage in their farms; furthermore, 52% agreed that this reduction was
important, showing that such reduction could be achieved. A total of 18% of the farmers did not have an opinion on
antimicrobial resistance, confirming the requirements for further education in this area.
23
Transmissão de MRSA entre animais de companhia e pacientes humanos
Pinto Ferreira, J.1,2, Anderson, K.L.1, Correa, M.T.1, Lyman, R.L.1, Ruffin, F.2, Barth Reller, L.2 e Fowler, V.G.2
1 North Carolina State University (NCSU) College of Veterinary Medicine, Department of Population Health and Pathobiology (PHP), Raleigh,
NC, USA
2 Duke University School of Medicine, Department of Infectious Diseases, Durham, NC, USA
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) é uma agente patogénico, importante quer em Medicina
Humana quer na Medicina Veterinária. A importância dos animais de companhia como reservatório de infecções
humanas é presentemente desconhecida. Foram recolhidas amostras dos animais de companhia de 49 pacientes
previamente diagnosticados como estando infectados com MRSA [casos]. Os isolados animais e humanos foram
comparados através de Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). A presença de MRSA entre estes animais de
companhia foi comparada com a presença de MRSA nos animais de companhia (e seus guardiões), clientes de uma
clinica de “bem-estar animal” [controlos]. MRSA foi isolado em pelo menos um dos animais de companhia de 4/49
(8,2%) dos pacientes previamente diagnósticos com MRSA. Não foi isolado MRSA em nenhum dos animais de
companhia apresentados na “clinica de bem estar animal” nem nos seus guardiões. A análise e comparação por
PFGE dos pares MRSA animais:humanos revelou três pares concordantes e um par discordante (p-value associado a
possível transmissão = 0,1175). Estes resultados sugerem que é possível isolar MRSA nos animais de companhia de
pacientes infectados com MRSA, representando assim um possível fonte de infecção ou re-infecção para humanos.
Mais estudos são necessários para um melhor entendimento da epidemiologia da transmissão de MRSA ente
animais de companhia e humanos. MRSA represnta um exemplo de um agente para cujo controlo é necessário uma
abordagem de “Uma Só Saúde”.
[Transmission of MRSA between companion animals and infected human patients presenting to
outpatient medical care facilities]
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a significant pathogen in both human and veterinary
medicine. The importance of companion animals as reservoirs of human infections is currently unknown. The
companion animals of 49 MRSA-infected outpatients (cases) were screened for MRSA carriage, and their bacterial
isolates were compared with those of the infected patients using Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Rates of
MRSA among the companion animals of MRSA-infected patients were compared to rates of MRSA among
companion animals of pet guardians attending a “veterinary wellness clinic” (controls). MRSA was isolated from at
least one companion animal in 4/49 (8.2%) households of MRSA-infected outpatients vs. none of the pets of the 50
uninfected human controls. Using PFGE, patient-pets MRSA isolates were identical for three pairs and discordant
for one pair (suggested MRSA trans-infection p-value= 0.1175). These results suggest that companion animals of
MRSA-infected patients can be culture-positive for MRSA, representing a potential source of infection or reinfection for humans. Further studies are required to better understand the epidemiology of MRSA human animal
trans-infection. MRSA is an example of an agent that requires a “One Health” approach for its control.
24
Infecção viral e informação clinica em gatos errantes, Moita, Setúbal, Portugal
Rodrigues, C.B.1, Martins, T.1, Duarte, A.1, Alves, A.C.2, Braz, B.S.1, Tavares, L.1
2 Hospital veterinário SOS Vet, Cova da Piedade, Almada, Portugal
Este trabalho teve por objectivo determinar a frequência dos principais virus felinos e o seu papel no aparecimento
de sintomatologia clínica concomitante. O grupo de estudo incluiu cinquenta gatos de uma associação particular
situada na freguesia de Alhos Vedros (Setúbal, Portugal). Após exame clinico e hemograma, os materiais biológicos
recolhidos incluiram sangue total para detecção de anticorpos contra o Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) e de
antigénio do Vírus da Leucémia Felina (FeLV) (Speed Duo FeLV/FIV, Virbac, Portugal), zaragatoa oral para
detecção de ácido nucleico do Herpesvírus Felino (FHV) e do Calicivírus Felino (FCV) e uma zaragatoa rectal para
detecção de ácido nucleico do Parvovírus Felino (FPV) e do Coronavírus Felino (FCoV).
Em relação ao FIV e FeLV, 22% (11/50) eram positivos para FIV, 10% (5/50) para FeLV. Relativamente ao FHV e
ao FCV detectou-se 62% (31/50) e 26% (13/50) de positividade, respectivamente. Nenhum animal excretava FPV,
mas 30% (15/50) da amostra foi positiva ao FCoV.
Dos sinais clínicos relacionados com FIV, a estomatite foi o mais frequente, em 7/11 animais, seguida de gengivite
moderada a severa e linfadenopatia (3/11). Nenhum dos animais apresentava anemia nem leucopénia, mas um
animal revelou leucocitose moderada. Dos cinco animais infectados com FeLV, apenas dois exibiam linfonodos
aumentados. Confirmou-se a presença de úlceras linguais e gengivite moderada a severa em 6/13 dos gatos
infectados com FCV e estomatite em 9 animais. Conjuntivite (n=1), Corrimento ocular (n=3) e corrimento nasal
(n=1) foram sinais clínicos raramente observados nos animais com FCV. Ao exame clínico, dos 31 animais
positivos a FHV, 9 apresentavam corrimento ocular, 2 conjuntivite e 6 tinham corrimento nasal. As úlceras linguais
foram observadas em 4 animais, 10 tinham estomatite e 8 apresentavam gengivite moderada a severa. Em relação ao
FCoV, apenas um animal estava desidratado e nenhum apresentava dispneia, alterações oculares, cutâneas nem
neurológicas.
A estomatite foi o sinal clínico mais observado, tanto nos animais infectados com os agentes em questão como nos
não infectados. Verificou-se ainda que a presença de FIV ou FeLV, como agentes infecciosos agressivos e indutores
de imunodeficiência grave, aumentou a manifestação de estomatite.
Em relação aos dados de frequência viral, devido ao tamanho da amostra, será necessária uma análise mais extensa
para formular uma correcta avaliação da prevalência destes agentes infecciosos em populações errantes felinas.
[Viral infection and clinical data in stray cats, Moita, Setúbal, Portugal]
To study the prevalence of the main feline viral infections and their role in the development of concomitant clinical
signs we conducted a virological survey in fifty stray cats, housed in a private animal shelter, Alhos Vedros
(Setúbal, Portugal). The animals were subjected to clinical examination and hemogram and the collected biological
samples included total blood for serological detection of Feline Leukemia Virus (FeLV) antigen and Feline
Immunodeficiency Virus (FIV) antibodies (Speed Duo FeLV/FIV, Virbac, Portugal), oral swabs for viral nucleic
acid detection of Feline Herpesvirus (FHV) and Feline Calicivirus (FCV) and rectal swabs also for viral nucleic acid
detection of Feline Parvovirus (FPV) and Feline Coronavirus (FCoV).
Regarding FIV and FeLV, 22% (11/50) FIV seropositive animals were found, 10% (5/50) FeLV. For FHV and
FCV, 62% (31/50) and 26% (13/50) respectively were excreting the virus. No animal was positive to FPV DNA but
30% (15/50) were positive to FCoV RNA.
The clinical data on FIV infected animals, revealed 7/11 animals with stomatitis and 3/11 with moderate/severe
gingivitis and lymphadenopathy. No animal presented anemia or leucopenia; but one animal had moderate
leukocytosis. Within the five FeLV positive animals, only two had increased lymph nodes. Tongue ulceration and
mild to severe gengivitis were observed in 6/13 of FCV positive animals and 9 had stomatitis. Conjunctivitis (n=1),
ocular discharge (n=3) and nasal discharge (n=1) were rarely observed in these animals. Within the 31 FHV positive
animals, 9 had ocular discharge, 6 nasal discharge and 2 exhibit conjunctivitis. Tongue ulcers were only observed in
4 animals, 10 had stomatitis and 8 had mild to severe gengivitis. The most commons signs described for FCoV
enteric infection were not detected. Only one cat showed dehydration, and none had dyspnoea, ocular, cutaneous or
neurologic alterations.
Stomatitis was the most observed clinical sign, both in infected and non-infected animals. The presence of FIV or
FeLV, as cause of severe immunodeficiency, increased stomatitis‟ manifestation.
Regarding the reported viral incidence, due to the sample number a more thorough analysis should be performed to
correctly evaluate the true prevalence of these infectious agents in stray feline population.
25
Ehrlichia spp, Anaplasma spp, Rickettsia spp, Leishmania spp e Mycoplasma haemofelis em gatos
errantes, Moita, Setúbal, Portugal
Martins, T.1, Rodrigues, C.B.1, Duarte, A.1, Alves, A.C.2, Braz, B.S.1, Tavares, L.1
2 Hospital Veterinário SOS Vet, Cova da Piedade, Almada, Portugal
Os ectoparasitas são vectores importantes na transmissão de variadas doenças que afectam o estado hígido dos
felídeos. Além da imunossupressão de que são causadores, estes agentes são também responsáveis pela transmissão
de determinados hemoparasitas como a Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Rickettsia spp., Leishmania infantum e
Mycoplasma haemofelis.
Para determinar a frequência dos principais hemoparasitas, cinquenta felídeos de uma associação de abrigo animal
particular da freguesia de Alhos Vedros, Portugal, foram avaliados para determinar a frequênicas destes agentes.
Após exame clinico foi colhido sangue total para diagnóstico molecular de Ehrlichia spp., Anaplasma spp. e
Rickettsia spp. por PCR convencional. A detecção de ácido nucleico de Leishmania e Mycoplasma haemofelis foi
efectuada por real time quantitative PCR.
As frequências encontradas foram de 16% (8/50) para Rickettsia spp., 4% (2/50) para Mycoplasma haemofelis, 2%
(1/50) para Leishmania infantum e 2% (1/50) de co-infecção com Ehrlichia spp. e Anaplasma spp..
O gato infectado com Leishmania infantum apenas revelou uma ligeira linfocitose, não apresentando qualquer tipo
de lesões cutâneas e oculares, aumento de linfonodos nem outros sinais clínicos actualmente associados à doença, o
que seria de esperar, devido ao papel destes animais enquanto reservatórios da Leishmania spp.
Corrimento ocular foi o único sinal clínico detectado pelo animal infectado com Ehrlichia spp. e/ou Anaplasma
spp. Os restantes sinais descritos na literatura tais como febre, perda de peso, vómitos e letargia não foram
facilmente observáveis devido às características da população avaliada. A Rickettsia spp. é um agente pouco
pesquisado em felinos e que normalmente não está associado à presença de sinais clínicos. As principais alterações
encontradas nos animais positivos foram a linfadenomegália (4/8), corrimento ocular (3/8) e conjuntivite (2/8), no
entanto estes sinais podem não estar directamente associados ao agente em questão.
Devido às caracteristicas da população em estudo, e às condições de alojamento, o controlo dos vectores
responsáveis pela transmissão das parasitoses acima descritas foi considerado insatisfatório, no entanto a sua
prevalência não se revelou tão alta como esperado. Considerando a localização geográfica deste abrigo, numa zona
com caracteristicas climáticas únicas e o baixo número de animais testados, seria de todo o interesse alargar este
estudo de forma a estimar a prevalência real destes agentes e avaliar o impacto destes animais enquanto
reservatórios/transmissores de alguns destes agentes parasitários.
[Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Rickettsia spp., Leishmania spp. and Mycoplasma haemofelis in
stray cats, Moita, Setúbal, Portugal]
Ectoparasites can induce immunosuppression but are also important vectors in the transmission of several diseases
with a direct impact on the animals‟ health status namely haemoparasites as Ehrlichia spp., Anaplasma spp.,
Rickettsia spp., Leishmania infantum and Mycoplasma haemofelis.
In order to evaluate the main haemoparasites frequency a fifty stray cat population was tested. The animals were
housed in group, in a private animal shelter in Alhos Vedros, Portugal. After clinical examination, total blood was
collected for molecular diagnosis of Ehrlichia spp., Anaplasma spp. and Rickettsia spp. by conventional PCR, and
Leishmania infantum e Mycoplasma haemofelis by real time quantitative PCR.
The survey revealed 16% (8/50) positive animals for Rickettsia spp., 4% (2/50) for Mycoplasma haemofelis, 2%
(1/50) for Leishmania infantum and 2% (1/50) of Ehrlichia spp. and/or Anaplasma spp..
The one animal infected with Leishmania infantum had a mild leukocytosis but no skin and ocular lesions, no
lymphadenopathy nor any clinical sign associated with the disease, which was expected due to the role of cats as
reservoir for this parasite. Ocular discharge was the only sign detected in the co-infected animal with Ehrlichia spp.
and Anaplasma spp. The usually described clinical signs, as fever, weight loss, vomiting and lethargy were not
easily observable, due to the population characteristics. Rickettsia felis is an uncommon researched agent in cats and
is not normally associated with the presence of clinical signs. The main changes found in positive animals were
lymphadenopathy (4 / 8), ocular discharge (3 / 8) and conjunctivitis (2 / 8), although these signs may not be directly
associated with the agent.
Due to the population characteristics and the housing facilities, the control of ectoparasites responsible for the above
described haemoparasites was not satisfactory; however the found frequency was not as high as expected. Due to the
geographical location of this animal shelter, with unique climatic features and the low number of tested animals, it
would be important to widen this study in order to correctly evaluate the real haemoparasites prevalence and the
potential impact of these animals‟ as reservoirs for their transmission.
26
Estudo sero-epidemiológico da infecção por Leishmania em cães da sub-região do Pinhal Interior
Sul
Pires, H.1, Nunes, T.2, Monteiro, F.3, Cardoso, L.4, Cortes, H.1
1 Escola de Ciências e Tecnologia. Laboratório de Parasitologia Victor Caeiro, ICAAM, Universidade de Évora, Portugal
3 Médico Veterinário Municipal de Monção, Portugal
4 Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
Nos seres humanos, a leishmaniose foi considerada predominantemente infantil, mas verifica-se uma tendência para
a diminuição do número de casos em crianças e o aumento relativo de casos da doença em adultos, principalmente
associada a VIH/SIDA. Em relação à leishmaniose canina, o número de casos tem vindo a aumentar, com
prevalências de infecção que podem atingir cerca de 20% em regiões em que a doença é endémica. A leishmaniose
canina tem sido incluída, desde 2002, no grupo das doenças alvo de notificação obrigatória. No presente trabalho, os
concelhos de Mação, Proença-a-Nova e Vila de Rei pertencentes à sub-região do Pinhal Interior Sul, constituíram as
áreas geográficas alvo de estudo sero-epidemiológico. Procedeu-se ao preenchimento de questionário
epidemiológico e à análise de amostras de soro de 282 animais por ELISA, durante o período de campanha de
vacinação anti-rábica. Observou-se que, quanto ao factor concelho, os cães de Proença-a-Nova tinham um risco de
seropositividade de 2,6 vezes maior do que os cães de Mação. Os cães de Vila do Rei tinham um risco de
seropositividade 6,9 vezes maior do que os cães de Mação. A análise de agregados espaciais (“clusters”) permitiu
detectar regiões geográficas cujo risco de existir doença é consideravelmente maior do que nas restantes áreas em
estudo. Através da análise geoespacial demonstrou-se a distribuição da seroprevalência de leishmaniose nos três
concelhos, concluindo-se que existem duas áreas com maior risco relativo de um canídeo estar seropositivo: Uma
área engloba-se na região norte do concelho de Vila de Rei e a sul do concelho da Sertã, e a outra na região sul da
freguesia de Proença-a-Nova. Demonstrou-se também, possível relação entre alguns tipos de ocupação do solo e o
nível de seroprevalência.
[Sero-epidemiological study of Leishmania infection in dogs from the sub-region Pinhal Interior
Sul]
In humans beings, leishmaniosis was considered mainly a disease of children, but there has been a tendency to a
decrease in the number of cases in children and to an increased in the relative number of disease cases in adults,
mainly associated with HIV/AIDS. In relation to canine leishmaniosis, the number of cases has increased, with
prevalence that can reach about 20% in regions where the disease is endemic. Canine leishmaniosis has been
included, since 2002, in the group of notifiable diseases. In this study the municipalities of Mação, Proença-a-Nova
and Vila de Rei, within the sub-region of Pinhal Interior Sul, were the geographic areas investigated by a seroepidemiological study. Both an epidemiological questionnaire and the screening of serum samples from animals by
ELISA with sera from 282 dogs took place during the vaccination campaign against rabies. Dogs from Proença-aNova had a 2.6 times risk higher than the dogs of Mação. Dogs from Vila de Rei had a seropositivity risk 6.9 times
higher than dogs of Mação. The spatial cluster analysis identified geographic areas where there is risk of
seropositivity considerably higher than in other areas of the study. Geospatial analysis showed that the distribution
of geospatial prevalence of leishmaniosis in the three counties, which may allow the conclusion that there are two
areas with higher relative risk of seropositivty in dogs: an area comprising in the northern municipality of Vila de
Rei and south the county of Serta and the another one in the southern parish of Proença-a-Nova. A potential
association between some types of land occupation and seroprevalence level has also been demonstrated.
27
Estudo epidemiológico da theileriose mediterrânica em Portugal
Gomes, J.1, Soares, R.3, Inácio, J.1, Amaro, A.1, Santos-Gomes, G.2, Botelho, A.1
2 Instituto de Higiene e Medicina Tropical - IHMT, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
3 Escola Superior de Saúde Egas Moniz, Portugal
A theileriose mediterrância bovina é uma doença causada pelo parasita Theileria annulata e representa uma forte
ameaça à produção pecuária e ao comércio internacional de bovinos, resultando em elevadas perdas económicas.
Em Portugal, a distribuição deste parasita assim como de outras espécies de Theileria é pouco conhecida. A
detecção e identificação de espécies de Theileria e Babesia em 1407 bovinos de Portugal continental, foi estudada
com recurso a técnicas de biologia molecular, nomeadamente PCR e testes de macroarrays (reverse line blot
hybridization). O fragmento codificante da região hipervariável V4 do gene de RNA ribossomal 18S foi amplificado
e os produtos da amplificação hibridados com uma membrana a que foram covalentemente ligadas sondas
específicas para diferentes espécies de Theileria e Babesia. Os parasitas dos géneros Theileria e/ou Babesia foram
detectados em 516 dos 1407 bovinos testados o que representa uma prevalência de piroplasmas de 36,7%. A espécie
Theileria annulata foi detectada em 21,4% dos bovinos, seguida da espécie Theileria buffeli/orientalis (10%) e da
espécie Babesia bigemina (7,9%). A ocorrência de infecções mistas é frequente e neste estudo a prevalência foi de
5,3%. A distribuição revelou uma prevalência crescente da direcção do sul do país com 51,6% no Alentejo, região
onde existem 47% dos bovinos de Portugal continental. As elevadas prevalências evidenciam um grande impacto na
produção animal e demonstram que estudos epidemiológicos são essenciais para um melhor conhecimento da
ocorrência destes parasitas em Portugal, permitindo delinear estratégias de controlo a nível nacional.
[Epidemiological surveillance of mediterranean theileriosis in Portugal]
Bovine mediterranean theileriosis is a parasitic disease caused by Theileria annulata and represents a major threat to
cattle production and international trade, resulting in high economic losses. In Portugal, the distribution of this
parasite as well as other Theileria species is poorly known. The detection and identification of Theileria and Babesia
species of cattle in 1407 samples from mainland Portugal was studied using molecular biology techniques, including
PCR and macroarrays tests (reverse line blot hybridization). The fragment encoding the hypervariable region V4 of
18S ribosomal RNA gene was amplified and the amplification products hybridized with a membrane to which
specific probes to different Theileria and Babesia species were covalently linked. The parasites of the genera
Theileria and/or Babesia were detected in 516 of 1407cattle tested which represents a prevalence of piroplasms of
36.7%. The species Theileria annulata was detected in 21.4, then the species Theileria buffeli/orientalis (10%) and
the species Babesia bigemina (7.9%). The occurrence of mixed infections in this study was common with a
prevalence of 5.3%. The distribution showed a prevalence increasing towards the south with 51.6% in the Alentejo,
a region with 47% of total bovines from mainland Portugal. The high prevalence shows a major impact on animal
production and demonstrated that epidemiological studies are essential to a better understanding of the occurrence of
these parasites in Portugal, allowing outlining control strategies at national level.
28
Teileriose em bovinos de carne na região do Ribatejo
Manhoso Fernandes, J.I.1, Pereira da Fonseca, I.2, Fragoso da Silva, L.A.3
1 Aluna do MIMV, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
3 ADS do Baixo Tejo, Apartado 307 - PC Povos, 2601 - 907 Vila Franca de Xira, Portugal
A Teileriose é uma doença parasitária causada por Theileria spp., transmitida por vectores da família IXODIDAE.
Esta hemoparasitose representa uma ameaça à produção de bovinos, em diferentes países, conduzindo a elevadas
perdas económicas. Em Portugal, o Ribatejo e o Alentejo são consideradas regiões endémicas de Teileriose
Mediterrânica, devido à elevada ocorrência de ixodídeos do género Hyalomma.
Os objectivos deste estudo foram: (i) avaliar a presença de Theileria spp. em bovinos de aptidão carne de uma
exploração da região do Ribatejo; (ii) estabelecer níveis de infecção para os géneros de hemoparasitas encontrados e
(iii) identificar uma amostra de ixodídeos, recolhidos da população em estudo.
Metodologia: Observação microscópica de esfregaços sanguíneos de 112 bovinos de aptidão carne provenientes de
uma exploração da região do Ribatejo.
Resultados: A prevalência de Theileria spp. foi de 100%. O género Anaplasma também foi identificado em todos os
bovinos estudados. Relativamente aos níveis de infecção de Theileria spp., concluiu-se que o nível I (1-10
merozoítos/10 campos) foi o mais prevalente, tanto nos bovinos reprodutores, com 87,5% (84/96), como nos vitelos,
com 37,5% (6/16) dos animais infectados. Estes dados sugerem que a maioria dos animais apresentava infecção
subclínica, constituindo um grupo de portadores assintomáticos. Os níveis de infecção II (11-20 merozoítos/10
campos) e III (> 20 merozoítos/10 campos) tiveram uma maior expressão nos vitelos, com 31,3% (5/16) em cada
nível, do que nos animais adultos, em que 12,5% (12/96) estavam infectados em nível II e nenhum animal se
encontrava infectado em nível III. Os níveis de infecção mais elevados nos vitelos estão de acordo com a maior
susceptibilidade destes animais a Theileria spp.. Quanto a Anaplasma spp., o nível de infecção I foi o mais
frequente, tanto nos animais reprodutores (60,4%), como nos vitelos (50%). Dos 92 ixodídeos identificados, 65%
(60/92) pertenciam ao género Hyalomma e 35% (32/92) eram Rhipicephalus spp., reconhecidos como vectores de
Theileria spp..
Os dados obtidos neste estudo realçam a importância da Teileriose em Portugal e a necessidade da continuação de
estudos sobre a epidemiologia e a patogenia da doença.
[Theileriosis in beef cattle in the Ribatejo region]
Theileriosis is a tick-borne disease caused by Theileria spp. protozoa and transmitted by vectors from IXODIDAE
family. This parasitic disease constitutes a threat to cattle production in different countries, leading to economic
losses.
In Portugal, Ribatejo and Alentejo regions are considered endemic for Mediterranean Theileriosis due to the high
incidence of ticks of the genus Hyalomma.
The aims of this study were: (i) to evaluate the presence of Theileira spp. in beef cattle from a farm located in
endemic region of Ribatejo; (ii) to establish blood infection levels and (iii) to identify the genus of the ticks
collected in the studied population.
Methods: Microscopic blood smears observation from 112 beef cattle from a farm located in endemic region of
Ribatejo
Results: Theileria spp. prevalence was 100% both in adults and in calves. The genus Anaplasma was also identified
in all the studied animals. Concerning Theileria spp. levels of infection, level I (1-10 merozoits/10 fields) was the
most prevalent, both in adult cattle and calves, with 87.5% (84/86) and 37.5% (6/16) respectively. These data
suggest that most of the animals had subclinical infection, constituting a group of asymptomatic carriers. Infection
levels II (11-20 merozoits/10 fields) and III (> 20 merozoits/10 fields) had a higher expression in calves with 31.3%
(5/16) in both, than in adult animals, in which 12.5% (12/96) were infected at level II and no adult animal was
infected in level III. The infection levels are highest in calves since these animals are more susceptible to Theileria
spp. infection. In relation to Anaplasma spp. infection, level I was the most frequent, in both breeding animals
(60.4%) and calves (50%). Of the 92 ticks identified, belonged to the genus Hyalomma 65% (60/96) and to
Rhipicephalus 35% (32/96), recognized as vectors of Theileria spp..
Data obtained in this study emphasizes the importance of theileriosis in Portugal. In this way, further investigation
on spreading and pathogenesis of theileriosis is needed.
29
Patologia
Comunicação por convite
Pathology of the most common diseases in psittacine birds
Gerry M. Dorrestein
Diagnostic Pathology Laboratory NOIVBD, Wintelresedijk 51 5507 PP Veldhoven, The Netherlands. www.noivbd.nl, [email protected]
Introduction: This presentation will start with a short introduction of the techniques related to performing a post
mortem examination on pet birds in general including preparation and macroscopic techniques in relation to birdspecific anatomic and physiologic differences compared to mammals. The importance of the use of direct wetmounts and cytology during the necropsy will be discussed and illustrated. Additional correct sample collection
important in many cases to come to the final diagnosis will be an important part of this discussion.
The major part of this lecture will include a summary of the most common psittacine diseases presented according to
the classical ranking as infectious and non-infectious diseases showing macroscopic findings, histopathology and
additional specific laboratory techniques leading to a final diagnosis.
Part 1 The post-mortem examination (PME): Doing the PME careless observation and sampling can result in
useless, and sometimes harmful, information. Changes in anatomic pathology will be the substrate of the disease and
understanding these changes will make it possible for the pathologist to “translate” these findings to clinical
symptoms. This information will give the clinicians an extra dimension in selecting the right diagnostic tool and
therapeutic approach for future patients. This lecture is intended to connect pathological changes to clinical and
laboratory findings and vice versa. It will guide the pathologist towards an understanding using pathological
findings and suggests additional test, where appropriate, to come to a diagnosis. On the other hand it will help the
pathologist to explain the practitioner to come to an understanding of the clinical symptoms. Much of the systematic
approaches are based on our daily dealing with veterinary students and clinicians where we experience every day the
frustration of understanding pathophysiology and interpretation of symptoms and pathological changes.
Make a detailed PME report and try to establish a relationship between the clinical history and the post mortem
findings. And realise: even a negative finding is significant, since it means that all the things you have been looking
for are not present.
Part 2 Selected cases of Psittacine pathology: A pathology of the most common diseases in psittacines will be
presented in a “classical” order, meaning that they will divided in infectious and non-infectious diseases. Especially
in breeding situations and in newly acquired pet birds infectious diseases can have a big impact. In (older) pet birds
nutritional problems and resulting secondary bacterial or fungal infections, and non-infectious diseases as
atherosclerosis, gout, amyloidosis, and neoplasitic changes are more common. Each disease will be presented with a
short disease history, the characteristics of the macroscopy and histopathology, and additional specific diagnostic
tests.
This lecture refers to viral infections (Pacheco‟s Disease Virus, Polyomavirus, Psittacine circovirus (PsCV),
Proventricular dilatation disease and avian bornavirus infection), bacterial infections (Psittacosis or Chlamydiosis,
Mycobacteriosis and other bacterial infections), fungal infections (Aspergillosis, Candidiasis, Macrorhabdus
ornithogaster), Parasitic infections (Sarcocystosis) and non-infectious diseases (Neoplasias, Hypocalcaemia
syndrome in African grey parrots, Vitamin A deficiency, Gout, Teflon® intoxication, Foreign-material inhalation,
Chronic pulmonary interstitial fibrosis or lung atrophy, Atherosclerosis).
Conclusion: This was not a complete survey of all pathological changes in psittacines. Pathology changes in birds
are basically identical to changes in mammals. Understanding the changes using pathophysiologal principles will at
least be a good start to explain the clinical findings. For me the most important part of a pathological exam is to
understand what is going on, to explain the clinical findings with a pathological base and to communicate this with
the clinician to make this a learning curve. An etiological diagnosis is optimal, but not always possible.
30
Caracterização de um sistema de classificação para avaliação histológica de congestão esplénica
Oliveira, A.L.1,2, Vala, H.1,2, Silva, A.3, Venâncio, C.3, Ferreira, D.3
1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal
2 Centro de Estudos em Educação, Tecnologias e Saúde, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal
3 CECAV - Centro de Estudos em Ciências Animais e Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
Introdução: Frequentemente, o baço pode ser afectado por hiperémia activa, ou congestão aguda ou activa, comum
em infecções sistémicas agudas e em alguns casos de intoxicação bacteriana, e também por congestão passiva, ou
congestão crónica, devido a distúrbios na circulação portal e sistémica e, mais comummente, devido à administração
de barbitúricos.
Um baço congestionado de forma aguda apresenta-se aumentado, moderadamente túrgido e cianótico, com a cápsula
de cor azulada a negra. A sua arquitectura normal não é discernível à superfície de corte e a polpa encontra-se com
coloração vermelha a negra, exsudando sangue. Microscopicamente, os sinusóides da polpa vermelha encontram-se
dilatados e preenchidos com aglomerados de células vermelhas, os centros germinativos encontram-se bastante
separados e as trabéculas de espessura diminuída. Com congestão crónica, o baço torna-se mais firme, a cápsula e
trabéculas mais finas, há atrofia linfóide, proliferação dos seios, com um aumento marcado nas células da polpa
vermelha, e marcada colonização dos seios por macrófagos e hemossiderina. A extensão da congestão aguda pode
tornar a análise histológica difícil. Em algumas espécies animais ainda existe alguma dificuldade na determinação da
severidade da congestão esplénica e em descartar outras condições, como lesões neoplásicas primárias, doença
metastática ou manifestação de envolvimento sistémico, devido ao seu sistema de circulação específico.
Objectivos: Os autores apresentam um sistema de classificação ilustrado, para avaliar a congestão esplénica, usando
o modelo porco.
Métodos: Amostras de baço de suínos Large White foram fixadas em formalina neutra tamponada a 10%, durante
um período máximo de 48 horas e processadas seguindo a técnica histopatológica de rotina.
Resultados: Neste estudo, catorze amostras de baço de suínos Large White foram observadas e classificadas. O
parâmetro semiquantitativo congestão foi avaliado por dois examinadores independentes e classificado numa escala
específica de 0 (ligeira) a 3 (severa e com dano extensivo), das quais imagens exemplificativas serão apresentadas,
para melhor caracterização do sistema de avaliação utilizado.
Conclusões: Com base na descrição e imagens apresentadas, os autores concluem que foi possível clarificar um
sistema de classificação para avaliação de congestão esplénica, usando o modelo porco, que pode ser usado para
avaliar congestão esplénica noutros animais domésticos, como cães e gatos, o que pode ser de grande importância
para caracterizar lesões em doenças e condições específicas.
[Characterization of a grading system to evaluate splenic congestion]
Background: Frequently, the spleen may be targeted by active hyperaemia, or acute or active congestion, common in
acute systemic infections and in some acute bacterial intoxications, and also by passive congestion, or chronic
congestion, due to disturbances in the systemic and portal circulation and, most commonly, due to the use of
barbiturate drugs. An acutely congested spleen is enlarged, moderately turgid and cyanotic, with the capsule blueblack. The normal architecture is not discernible on the cut surface and the pulp is red-black and exudes blood.
Microscopically, the red pulp sinusoids are dilated filled with packed red cells, the germinal centres are widely
separated and trabeculae are thinned. With chronic congestion, the spleen becomes firm, the capsule and trabeculae
thickened; there is lymphoid atrophy, sinus proliferation, with a marked increase in fixed cells in the red pulp and
heavy sinus colonization with macrophages and hemosiderin, following RBC destruction in dilated sinusoids.
Extend of the acute congestion may make histological examination difficult. In some species there is still some
difficulty on determine the severity of spleen congestion and rule out other conditions like primary neoplastic
lesions, metastatic disease or manifestation of systemic involvement, due to it specific circulation system.
Objectives: The authors present an illustrated system to evaluate splenic congestion, using the pig as a model.
Methods: Samples of the spleen of Large White Pigs were fixed in 10% neutral-buffered formalin, for a maximum
of 48 hours, embedded in paraffin wax, and 3µm sections were stained for routine histopathological diagnosis with
hematoxylin and eosine. All samples were examined by light microscopy, using a Microscope Zeiss Mod. Axioplan
2.
Results: In this study, fourteen spleen samples from Large White pigs were observed and classified. The semiquantitative parameter congestion was evaluated by two independent examiners and classified in a specific scale
from 0 (minimal) to 3 (severe and extensive damage), from which exemplificative pictures will be presented, in
order to better characterize the grading system used.
Conclusion: Based on the description and pictures presented, the authors conclude that it was possible to clarify a
classification grading system to evaluate splenic congestion, using the pig as a model, which can be used to evaluate
splenic congestion in other domestic animals, as dogs and cats, which can be of great importance to characterize
lesions in specific diseases and conditions.
31
Mortalidade perinatal em pequenos ruminantes em Trás-os-Montes
Mendonça1, A., Valentim2, R., Correia1, T., Quintas2, H., Grau3, A. e Monteiro4, M.
1 Centro de Investigação de Montanha (CIMO), ESA - Instituto Politécnico de Bragança, Portugal
2 Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agrária, Portugal
3 Consejería de Agricultura y Ganadería, Junta de Castilla y León, Valladolid, España
Nas explorações de Pequenos Ruminantes de Trás-os-Montes, a mortalidade perinatal é responsável por baixas
significativas na produtividade e na viabilidade económica das mesmas. Dadas as características edafoclimáticas
locais, a Produção Ovina e Caprina tem uma grande importância social, económica e ambiental, o que confere a
qualquer investigação neste sector uma importância vital.
Com este estudo pretendeu-se: a) determinar as causas de aborto no último terço da gestação e de morte das crias até
às 6 semanas; b) isolar, identificar e caracterizar os agentes responsáveis pela mortalidade/aborto; c) conservar os
agentes isolados; d) realizar estudos epidemiológicos que ajudem a identificar os factores de risco associados à
mortalidade/abortos; e) proceder, num futuro próximo, ao ensaio de vacinas de rebanho, utilizando os agentes
patogénicos considerados mais importantes e f) Divulgar os resultados, de modo que o conhecimento dos agentes
e/ou causas possa levar à implementação de regras de maneio adequadas e ao ajustamento dos programas
profiláticos das explorações, com vista ao aumento da produtividade das mesmas.
Este estudo foi realizado em colaboração com Associações de Criadores, OPPs, MV Municipais e criadores de gado.
Após solicitação do criador, procedeu-se à realização de necropsia dos fetos/crias, recolha e preparação de amostras
para posterior envio ao laboratório e preenchimento de um inquérito epidemiológico.
Os resultados revelam que a mortalidade é devida, maioritariamente, a doenças gastrointestinais (enterites catarrais e
hemorrágicas) e respiratórias (broncopneumonias e pneumonia intersticiais) ou a lesões múltiplas em vários órgãos,
com envolvimento dos dois sistemas (etiologia diversa). Nas primeiras 2-3 semanas de vida, ocorreu um predomínio
de lesões intestinais, enquanto nos animais mais velhos as mortes resultaram fundamentalmente de problemas
respiratórios. Os agentes microbianos mais frequentemente isolados foram: E. coli, Staphylococcus sp., Mannheimia
haemolytica, Streptococcus sp., Corynebacterium sp. e Pasteurella sp.. Estes resultados são consistentes com os
registados por outros autores, embora o número de infecções hepáticas, possivelmente com origem umbilical, tenha
apresentado uma incidência superior à esperada, o que indicia a necessidade de alteração as práticas de maneio nas
explorações.
Este trabalho foi financiado pelo Programa de Cooperação Transfronteiriça Espanha-Portugal 2007 – 2013 (POCTEP) 0108_OTSA_2_E.
[Small ruminant perinatal mortality in Trás-os-Montes (Portugal)]
In the Portuguese county of Trás-os-Montes e Alto Douro perinatal mortality among small ruminants is responsible
for reducing productivity and therefore lessening farms incomes. Sheep and goat productions have local high social,
economic and environmental relevance making any research effort absolutely vital.
The present study aimed to: a) assess the causes of abortion during late pregnancy and lamb or kid death under the
age of 6 months; b) isolate, identify and characterize the agents that originate abortion/death; c) preserve the isolated
agents; d) perform epidemiology studies to identify causes and risks factors associated to abortion/death; e) creation
of herd vaccines in a near future; f) public information and future implementation of more effective management
techniques and herd health programs to improve productivity.
Local Breeders Associations, OPPs, county veterinarians and individual breeders were involved in this work. At
breeders request fetus/lambs or kids were submitted to necropsy, samples were collected for afterward lab analysis
and an epidemiologic inquire was filed.
Perinatal mortality was mainly due to gastrointestinal (catarrh and hemorrhage enteritis) and respiratory diseases
(bronchopneumonia and interstitial pneumonia) or resulted from multiple injuries of several organs concerning both
systems (diversify etiology). Intestinal injuries prevailed for the first 2-3 weeks of age whether respiratory problems
were dominant among older lambs and kids. E. coli, Staphylococcus sp., Mannheimia haemolytica, Streptococcus
sp., Corynebacterium sp. and Pasteurella sp. were the most common isolated agents. Major macroscopic injuries
were observed in lungs, intestine, liver and stomach. Results are consistent with bibliography although the number
of hepatic infections (possibly of umbilical origin) was higher than expected determining the need to change
newborn traditional management techniques.
32
Pathology of the most common diseases in finches and pigeons
Gerry M. Dorrestein
Diagnostic Pathology Laboratory NOIVBD, Wintelresedijk 51 5507 PP Veldhoven, The Netherlands. www.noivbd.nl, [email protected]
Introduction: After a short introduction of the differences in basic anatomy and physiology compared to mammals,
the major part of this lecture will include a summary of the pathology of the most common diseases in finches
(passerines) and pigeons (Columba sp.) These diseases will be presented according to the classical ranking as
infectious and non-infectious diseases showing macroscopic findings, histopathology and, when relevant, additional
specific laboratory techniques leading to a final diagnosis.
Some basic anatomy and physiology: All birds have high basal metabolic rates (BMRs) and especially finches
having a low body weight will develop a hypoglycaemia very quickly when they stop eating. This will lead to a
haemorrhagic diathesis of the intestinal mucosa (intestines filled with blood), the most common dead cause in these
small birds. The challenge will be to find the cause of the anorexia.
The anatomy of the digestive tract varies depending on the species‟ feeding pattern. A bird‟s bill is its key
adaptation for feeding, and the size, shape and strength of the beak prescribe the potential diet. Details on particular
features will be addressed.
The diagnostic necropsy: Most finches and pigeons are kept in flocks. Therefore, a owner will ask you assistance in
case there is mortality. A necropsy should always be performed on birds that die from unknown causes, both so that
flaws in management can be rectified and to protect against a possible epidemic. The necropsy is also the ultimate
method of confirming a diagnosis. The following procedures can provide much additional information during the
necropsy: (i) direct wet preparations of the gut contents and of the coating of the serosae; (ii) scrapings from the
mucosa of the crop, proventriculus, duodenum and rectum, (iii) contact or impression smears from a freshly cut
surface of liver, spleen, lungs, and any altered tissues.
The smears are stained routinely with Romanowsky stains (e.g. Giemsa) or „Quick‟ stains (e.g. DiffQuick®) and
searched microscopically (cytology) under the oil immersion objective lens. Bacteriological, mycological,
virological, serological (e.g. from hydrops or pericardial fluid) and histopathological examinations and
immunodiagnostic techniques are special techniques to help determine a diagnosis.
Selected cases of pathology in finches and pigeons: this part will address viral infections in finches (Avipoxvirus in
canaries, Circovirus infections, Polyomavirus and polyoma-like virus infections, Papilloma virus infections,
Paramyxovirus infection, Herpesvirus and cytomegalovirus, Emerging virus infections, Other viral infections) and
pigeons (Paramyxovirosis, Adenovirus infections, Herpesvirus infections, Pox virus infections, Circovirosis, Avian
influenza); Bacterial infections in finches (E. coli (and other Enterobacteriaceae), Yersiniosis (pseudotuberculosis),
Salmonellosis (paratyphoid), Campylobacter fetus, Cocci infections, Pseudomonas spp. and Aeromonas spp.
Infections, Avian tuberculosis, Avian chlamydiosis, Mycoplasmosis and other); Bacterial infections in pigeons
(Salmonellosis, Streptococcosis, Escherichia coli septicaemia, Ornithosis (Chlamydophila psittaci) and respiratory
disease); mycotic infections (Candidiasis, Malassezia sp, Macrorhabdus ornithogaster); Parasitic infections in
finches (Protozoal infections (Atoxoplasmosis, Coccidiosis, Toxoplasmosis, Cryptosporidiosis, Trichomoniasis,
Cochlosomosis, Giardia spp.), Blood parasites (Haemoproteus spp., Leucocytozoon spp., Trypanosoma spp.,
Plasmodium spp. (malaria) and microfilaria), Helminth parasitism (Nematodes, Spiruroids, Cestoda, Trematodes),
Arthropods; Parasitic Infections in pigeons (Protozoal infections (Trichomoniasis, Hexamitiasis, Coccidiosis),
Worm infestations, Ectoparasite infestations). The presentation will also address non-infectious diseases as
metabolic and nutritional disorders, vitamin deficiencies, amyloidosis, fatty livers, haemorrhagic enteritis, toxicosis,
feather cysts, trauma, rupture of air sacs´, egg binding or dystocia and feather abnormalities.
Conclusion: This was not a complete survey of all pathological changes in finches and pigeons. Pathology changes
in birds are basically identical to changes in mammals. Understanding the changes using pathophysiologal principles
will at least be a good start to explain the clinical findings. For me the most important part of a pathological exam is
to understand what is going on, to explain the clinical findings with a pathological base and to communicate this
with the clinician to make this a learning curve. An etiological diagnosis is optimal, but not always possible.
33
Neoplasia nasal maligna de células redondas em Koala, Phascolarctos cinereus adustus: estudo
imunohistoquímico
Correia, J.J.1, Bernardino, R.I.2, Cabeçadas, J.M.3 e Peleteiro, M.C.1
2 Jardim Zoológico e de Aclimação em Portugal SA, Lisboa, Portugal
3 Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil, Lisboa, Portugal
O koala (Phascolarctos cinereus adustus) era macho, 7 anos de idade, do JZL.
Os sinais clínicos observados foram: epistaxis unilateral intermitente, corrimento purulento, exoftalmia unilateral e
prostração. O hemograma e as análises bioquímicas não apresentaram alterações.
Com biópsia de massa ao nível da gengiva superior, observou-se em exame citológico elevada celularidade de
população muito monomórfica, sendo a anisocitose e anisocariose moderadas. As células possuíam citoplasma
abundante e muito pálido e núcleo central ou levemente excêntrico de cromatina em grânulos grosseiros. A presença
de chanfraduras nucleares era regular sem ser frequente. Ocasionalmente, identificaram-se células multinucleadas. O
diagnóstico citológico foi de neoplasia maligna de células redondas.
Dois meses após o aparecimento dos primeiros sinais clínicos o animal faleceu. Realizou-se necrópsia no
Laboratório de Anatomia Patológica da FMV-UTL, tendo-se identificado: massa sólida de aspecto lardáceo, em toda
a extensão da cavidade nasal direita, com destruição do tecido ósseo envolvente, invasão do tecido subcutâneo da
face, do fundo da cavidade orbitária e do lobo frontal direito do encéfalo, pulmões com zonas de densificação,
testículos de cor castanha escura e consistência friável e próstata com múltiplas lesões nodulares.
Colheram-se: massas nasal, retro-orbitária e facial, encéfalo, linfonodo mandibular direito, pulmão, estômago,
intestino, fígado, baço, rim, suprarrenal, testículos e próstata. O exame histopatológico identificou células
neoplásicas nas massas nasal, retro-orbitária, facial, porção anterior do encéfalo, linfonodo mandibular, suprarrenal e
próstata. O pulmão apresentava focos de pneumonia purulenta e o fígado degenerescência vacuolar disseminada.
A fenotipagem foi realizada na massa nasal por imunohistoquímica indirecta com os anticorpos primários:
Vimentina (Dako-M0725), CD3 (Dako-A0452), CD79αcy (Dako-M7051), Pax5 (Novocastra-NCL-L-PAX5),
Igkappa (Dako-A0191), Iglambda (Dako-A0193), CD138 (Dako M7228), Citoqueratina clone AE1/AE3 (DakoM3515) e Ki67 (Novocastra NCL-L-Ki67-MM1).
As células neoplásicas apresentaram marcação com vimentina e discreta expressão monotípica de cadeias leves de
Ig. A imunomarcação CD3 e Citoqueratina clone AE1/AE3 revelou reactividade cruzada para com esta espécie em
linfócitos maduros e células epiteliais da próstata respectivamente. Não houve reactividade com nenhum dos
restantes anticorpos.
A expressão de vimentina indica que se trata de neoplasia maligna de células redondas. É possível fenotipar células
linfóides e epiteliais de koala com os anticorpos CD3 e Citoqueratina clone AE1/AE3.
[Nasal malignant round cells neoplasia in Koala, Phascolarctos cinereus adustus: imunohistochemical study]
The studied koala (Phascolarctos cinereus adustus) was a 7 year old male from the JZL.
The clinical symptoms were: intermittent unilateral epistaxis, purulent discharge, unilateral exophthalmia and
prostration. Hemogram and biochemical blood analysis presented no changes.
A biopsy of a mass from the upper gum area showed on cytological examination an elevated cell count of a highly
monomorfic population, with moderate anisocytosis and anisocaryosis. The cells presented a pale and abundant
cytoplasm with a central or slightly off-center nucleus, with coarse chromatin granules. The presence of nuclear
indentations was regular, albeit infrequent. Occasionally multinucleated cells were identified. The cytological
diagnosis was that of a malignant round cells neoplasia.
Two months after the initial clinical signs the animal died. The necropsy was performed at the Pathological
Anatomy Laboratory of FMV-UTL and revealed: a solid mass of lardaceous appearance encompassing the right
nasal cavity and destruction of the surrounding bone tissue, invasion of the facial subcutaneous tissue, the bottom of
the orbital cavity and of the right encephalic frontal lobe, lungs with densification zones, testicles with dark brown
color and friable consistency and prostate with multiple nodular lesions.
We collected fragments of the nasal, retro-orbital and facial masses, of the brain, right mandibular lymphnode, lung,
stomach, intestine, liver, spleen, kidney, suprarenal, testicles and prostate tissues. Hispathological exam identified
neoplasic cells on the nasal, retro-orbital, facial, anterior area of the encephalus, mandibular lymphnode, suprarenal
and prostate samples. Lungs had purulent foci of pneumonia and the liver a disseminated vacuolar degeneracy.
Indirect immunohistochemical phenotyping of the nasal mass was done with the primary antibodies: Vimentin
(Dako-M0725), CD3 (Dako-A0452), CD79αcy (Dako-M7051), Pax5 (Novocastra-NCL-L-PAX5), Igkappa (DakoA0191), Iglambda (Dako-A0193), CD138 (Dako M7228), Cytokeratin clone AE1/AE3 (Dako-M3515) e Ki67
(Novocastra NCL-L-Ki67-MM1).
Neoplasic cells presented reactivity to vimentin and a discreet expression of monotypic Ig‟s light chains. The CD3
and cytokeratin immunostaining revealed a cross-reaction towards this species among the mature lymphocytes and
prostatic epithelial cells. There was no reactivity with any of the other antibodies.
The expression of vimentin is indicative that the lesion is a malignant round cells neoplasia. It is possible to
phenotype koala‟s lymph and epithelial cells with antibody CD3 and cytokeratin.
34
Colesteatoma aural num cão
Faísca, P.1, Mestrinho, L.A.1, Pereira, H.M.1, Diniz, S.2
1 CICV – Centro de Investigação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Lusófona de Humanidades e
Tecnologias, Lisboa, Portugal
2 Casvet - Hospital Veterinário, Parede, Portugal
Um Bouvier Bernois com 6 anos de idade foi observado no veterinário local devido a dor e incapacidade para abrir a
boca, no seguimento de uma otite externa com um mês de duração. Ao exame físico, o animal apresentava atrofia
dos músculos temporais bilateralmente, incapacidade para abrir a boca e dor à manipulação. O animal foi sedado e
sujeito a um exame tomográfico helicoidal computorizado. A abertura máxima da cavidade oral foi de 3 cm e o
exame imagiológico revelou uma massa expansiva na bolha timpânica preenchida com um conteúdo semi-sólido. A
articulação temporomandibular ipsilateral e o processo condilar apresentavam osteoesclerose e reacção do periósteo.
Foi realizada uma ablação total do conduto auditivo externo com osteotomia subtotal da bolha timpânica e
condilectomia mandibular. As amostras foram enviadas para exame histopatológico. Microscopicamente, observouse um quisto epidermóide revestido por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado contendo todas as camadas
da epiderme incluindo a camada granulosa, com o lúmen preenchido por restos de queratina. O quisto estava
suportado por tecido conjuntivo denso que apresentava um infiltrado inflamatório do tipo corpo estranho, composto
maioritariamente por macrófagos reactivos e células gigantes a envolver restos de queratina e fendas de colesterol.
As imagens histológica e imagiológica são compatíveis com um colesteatoma aural.
Os colesteatomas aurais consistem em invaginações epidérmicas de ocorrência no ouvido médio e tímpano,
frequentemente secundárias a otites crónicas e que se apresentam sob a forma de bolsas ou quistos epidermóides. Os
colesteatomas podem aumentar de tamanho levando à destruição das estruturas vizinhas do ouvido médio e interno.
A surdez, a paralisia facial e a erosão óssea são complicações comuns. Histologicamente os colesteatomas são
indistinguíveis de outros quistos epidermóides ou de quistos foliculares do tipo infundibular, O diagnóstico
histológico só é possível se o envio da amostra for acompanhado de informação clínica e/ou imagiológica
relativamente à sua localização anatómica.
[Canine aural cholesteatoma]
A 6 year old, female Bouvier Bernois dog presented for consultation with one month history of external otitis
clinically associated with severe oral pain and inability to open the jaw. On clinical examination the animal
presented bilateral temporal muscle atrophy, inability to open the jaw and obvious signs of pain during
manipulation. The animal was sedated and a tomography exam was performed. The maximum mouth opening was 3
cm and the tomography exam revealed an expansive growth of the tympanic bullae that was filled with a semi-solid
content. The ipsilateral temporomadibular joint and condylar process showed osteosclerosis and periosteal reaction.
A subtotal bulla osteotomy, total ear canal ablation and and mandibular condyle osteotomy was then performed and
the tissues were sent for histopathology. Histopathology revealed an epidermal cyst covered by stratified squamous
epithelium including the granular cell layer, filled with keratin content. The cyst lay on top of a dense connective
tissue of varied thickness that showed a severe foreign-body-type inflammatory reaction, composed mostly of
macrophages including several giant cells involving free keratin fragments and cholesterol clefs.
The histophatology and imaging findings were compatible with an aural cholesteatoma.
Aural cholesteatoma is a skin growth that occurs in the middle ear behind the tympanic membrane. It is usually due
to chronic infection, which causes an ingrowth of skin of the tympanic membrane. Cholesteatomas often take the
form of a cyst or pouch which sheds layers of old skin that builds up inside the ear. Over time, cholesteatomas can
increase in size and destroy the surrounding structures of the middle ear. Hearing loss, facial muscle paralysis and
bone erosion can result from continued cholesteatoma growth and due to the severe granulomatous inflammation.
Histologically, aural cholesteatoma is undistinguishable from epidermal or infundibular cysts of any site. The
histopathological diagnosis is only possible with clinical and/or imaging information about the anatomic location of
the lesion.
35
Estudo dos tumores mamários de cães e gatos considerando os aspectos relacionados com os graus
de malignidade histológica e com a permeação vascular por células neoplásicas
Costa, M.M., Correia, J.J.
CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Introdução: A determinação do grau de malignidade histológica tumoral bem como a existência de permeação
vascular por células neoplásicas ao nível do tumor primário e de metástases nos linfonodos regionais têm-se
revelado importantes em termos da avaliação do prognóstico da doença neoplásica.
Material e métodos: Foi realizado um estudo com base nas análises histopatológicas da glândula mamária efectuadas
em 588 animais (364 cães e 224 gatos) no período de tempo compreendido entre Janeiro de 2009 e Junho de 2010,
no Laboratório de Anatomia Patológica da FMV-UTL. Foi também efectuada a análise dos linfonodos regionais
extirpados.
Resultados: Na espécie canina observou-se um predomínio de tumores de grau II (148 casos; 45%), seguindo-se
consecutivamente o grau I (98 casos; 30%) e o grau III (83 casos; 25%). Nos felinos, o grau III (125 casos; 66%)
correspondia à maior parte dos tumores analisados, enquanto as percentagens mais baixas encontravam-se
associadas aos graus II (52 casos; 28%) e I (11 casos; 6%). Apenas uma proporção relativamente pequena de cães
apresentava metástases nos linfonodos analisados (18 casos; 10,5%), sendo que os restantes 89,5% (153 animais)
correspondiam a canídeos com tumores cujos linfonodos não demonstravam quaisquer sinais de metastização. Para
além disso, nem todas as situações que apresentavam metastáses nos linfonodos se encontravam associadas à
observação de permeação vascular, correspondendo estas a apenas metade do total de casos analisados (5,25%; 9
casos). Outro fenómeno constatado consistiu na existência de permeação vascular não associada à ocorrência de
metastização (3,5%; 6 casos). Nos felinos verificou-se que a maioria apresentava metástases nos linfonodos (60,2%;
53 casos). Também nesta espécie ocorriam situações em que a presença de metastização não se encontrava
associada à observação de permeação vascular, embora estas correspondessem a uma menor percentagem de casos
(22,7%; 20 casos) relativamente aos que apresentavam ambos os aspectos. No entanto, é de notar que nesta espécie
em todos os casos em que se observava permeação vascular havia simultaneamente metástases nos linfonodos.
Conclusões: No que diz respeito aos graus de malignidade, verificou-se que a maioria dos carcinomas mamários da
espécie felina correspondia ao grau III, enquanto nos canídeos o grau II foi o mais frequente. Atendendo à avaliação
da permeação vascular, no caso dos gatos e ao contrário do que sucedia nos cães, todos os casos em que esta foi
observada estavam associados à existência de metástases nos linfonodos analisados.
[Study of mammary tumors in dogs and cats considering the aspects related to the histological grade of
malignancy and vascular invasion by neoplastic cells]
Introduction: Determination of tumoral histological grade of malignancy as well as the existence of vascular
invasion by neoplastic cells in the primary tumor and metastasis in regional lymph nodes has been found to be
important predictors of prognostic in neoplastic disease.
Material and methods: A study was done based on histopathologic analysis related to the mammary glands of 588
animals (364 dogs and 224 cats) performed in the Laboratory of Anatomical Pathology from FMV-UTL between
January, 2009 and June, 2010. Analysis of the excised regional lymph nodes was also effectuated.
Results: In canine tumors, grade II was the most frequent one (198 cases; 45%), followed by grade I (98 cases;
30%). Grade III was the one that presented a lower incidence (83 cases; 25%). In feline neoplasms, grade III
corresponded to the majority of tumors (125 cases; 66%), with lower percentages belonging to grades II (52 cases;
28%) and I (11 cases; 6%). Only a small amount of dogs presented lymph node metastasis (18 cases; 10.5%). So the
remaining 89.5% (153 cases) didn´t demonstrate any sign of occurrence of metastasis. Also not all the situations in
which there were lymph node metastasis were accompanied by the observation of vascular invasion in the primary
tumor. This fact was only verified in half of the total cases studied (9 cases; 5.25%). Another relevant aspect is the
fact that there was also the presence of vascular invasion without the occurrence of metastasis in the analyzed
samples (6 cases; 3.5%). In feline species, the majority of the animals had lymph node metastasis (53 cases; 60.2%).
Also in cats there were situations in which the presence of metastasis was not related to the observation of vascular
invasion, although they corresponded to a lower percentage of cases (20 cases; 22.7%) when compared to the ones
presenting both aspects. It is also important to notice that in this species all cases with vascular invasion were
associated to the occurrence of lymph node metastasis.
Conclusions: Considering the histological grade of malignancy, in respect to the feline species there was an higher
incidence of grade III, while in dogs the grade II was the most frequent one. Regarding the vascular invasion, in the
cat and in opposition to the dog, all cases in which this parameter was verified were accompanied by lymph node
metastasis.
36
Carcinoma Mamário Felino (CMF) e HER2/neu - um novo instrumento de diagnóstico em
Oncologia Felina
Soares, M., Correia, J., Carvalho, S., Peleteiro, M.C., Ferreira, F.
Introdução: Este estudo teve como objectivo principal comparar a eficiência de quatro anticorpos na imunodetecção
da glicoproteína membranar HER2, em tecido mamário de gata. Estudos anteriores na mulher mostram que o nível
de expressão desta oncoproteína é determinante na evolução da patologia mamária, condicionando a abordagem
terapêutica e o prognóstico. Evidências recentes apontam para que também na gata a sobre-expressão de HER2 seja
um factor de mau prognóstico.
Material e Métodos: Foram analizadas 30 amostras de CMF provenientes do banco de tecidos da Faculdade de
Medicina Veterinária. A fixação em formol decorreu no tempo máximo de 72 horas e a recuperação antigénica foi
condicionada a 30 ou a 60 minutos, à excepção do TAB250, onde o antigénio foi recuperado por método
enzimático. Foram testados por imunohistoquímica três anticorpos monoclonais (TAB250 da Zymed ®, CB11 e SP3
da Zytomed®) e um anticorpo policlonal de coelho (A0485 da DAKO ®) recomendado pela American Society of
Clinical Oncology (ASCO). Os anticorpos TAB250 e SP3 foram utilizados pela primeira vez em medicina
veterinária.
Resultados: Os resultados mais promissores foram registados nas amostras submetidas a tempos de recuperação
antigénica maiores (60 minutos) e a anticorpos que reconhecem o domínio intracelular do HER2. Uma sobreexpressão da proteína HER2 em tecido mamário de gata foi identificada em 30,0% das amostras (clone A0485) e em
6,6% das amostras com o clone CB11. Estes resultados contrastam, em muito, com os valores obtidos com
anticorpos que reconhecem o domínio extracelular da proteína (SP3 e TAB250), onde todas as amostras foram
consideradas negativas.
Conclusões: À semelhança do que está descrito para a imunodetecção do HER2 nos tumores mamários da mulher, o
protocolo mais promissor em medicina felina parece ser o que associa o anticorpo A0485 com o maior tempo de
recuperação antigénica. A frequência de tumores mamários felinos com sobre-expressão de HER2 (30,0%) ronda a
percentagem descrita na mulher (25%-40%), valor inferior ao já publicado por outros autores e que poderá estar
subestimado em virtude da colheita e conservação das amostras não terem cumprido inteiramente as recomendações
sugeridas pela ASCO. Gostaríamos ainda de salientar a ausência de resultados com os anticorpos que reconhecem o
domínio extracelular do receptor HER2, facto que poderá dever-se à má fixação das amostras por utilização do
formol não tamponado ou ainda à menor homologia que o domínio extracelular apresenta entre a gata e a mulher
comparativamente ao domínio intracelular (93% vs. 94%).
Estudo suportado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (SFRH/BD/70720/2010) e Biotecnol, SA.
[Feline Mammary Carcinoma (FMC) and HER2/neu: a new diagnostic tool in Feline Oncology]
Introduction: The main objective of our study was to compare the efficiency of four antibodies in the
immunodetection of HER2, a transmembrane glycoprotein, in feline mammary tissue. Studies in woman reveal that
the status of this oncoprotein is determinant to mammary pathology and it will conduct the therapeutic approach and
the prognosis. Recent reports indicate that HER overexpression in cats is also a predictor of poor prognosis.
Material and Methods: 30 FMC samples from the archive of Faculty of Veterinary Medicine were analyzed. The
samples were fixed in formalin, for 72 hours in maximum and the antigen retrieval method was realized in two
times, 30 and 60 minutes, except for TAB250, where an enzymatic method was used. Immunohistochemical
detection was performed with 3 monoclonal antibodies (TAB250 from Zymed®, CB11 e SP3 from Zytomed®) and a
rabbit polyclonal antibody (A0485, DAKO®), that is recommended by the American Society of Clinical Oncology
(ASCO). The TAB250 and SP3‟s antibodies were used for the first time in Veterinary Medicine.
Results: The most promising results were registered in samples submitted to a longer antigen retrieval time (60
minutes) and to the antibodies that identify the intracellular domain of the HER-2. An HER2 overexpression in
feline mammary tissue was identified in 30,0% of the samples (clone A0485) and in 6.6% of the samples with the
clone CB11. These results diverge considerably with the ones obtained with the antibodies that recognize the
extracellular domain of the protein (SP3 and TAB250), where all samples were considered negative.
Conclusions: According to what is publish for HER2 immunodetection in women mammary tumors, the most
promising protocol in feline medicine resemble to be the one which associates the antibody A0485 with the longer
antigen retrieval. The frequency of feline mammary tumors with HER2 overexpression (30.0%) reach the
percentage described to women (25-40%), although lower than in other published reports and that could be
underestimated as a consequence of the tissue processing method of the samples, which don‟t respect entirely the
ASCO guidelines. We would like to emphasize the absence of results with the antibodies that recognizes the
extracellular domain of the HER2, fact that may be due to the use of formalin in the samples‟ fixation or to the
lower homology that the extracellular domain presents between the cat and the women when compared to the
intracellular domain (93% vs. 94%).
37
Adenocarcinomas Endometriais Felinos: estudo preliminar da morfologia e proliferação
Saraiva, A.L.1,2, Payan Carreira, R.1, Gärtner, F.3,4, Pires, M.A.1
1 CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. Email: [email protected]
2 Departamento de Medicina Veterinária, Escola Universitária Vasco da Gama - EUVG, Coimbra, Portugal
3 ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
4 IPATIMUP, Universidade do Porto, Portugal
Os adenocarcinomas do endométrio são considerados tumores raros nos animais domésticos, em parte devido ao seu
deficiente diagnóstico. Este estudo teve como objectivo determinar diferentes morfologias e variações no índice
proliferativo de 36 adenocarcinomas do endométrio felinos (AEF). Os AEF foram diagnosticados por um mínimo de
três patologistas, em secções coradas com hematoxilina e eosina. Os tumores foram classificados em carcinomas
papilares serosos, (n=24), carcinomas de células claras (n=3) e carcinomas in situ (n=9). A expressão do Ki67 (clone
MIB-1; 1:50) foi detectada por imunohistoquímica e a percentagem de núcleos positivos foi calculada através da
contagem de 1000 células tumorais, por campo de grande ampliação. A idade dos animais diagnosticados variou
entre os 2 e os 15 anos. A informação relativa à administração prévia de contraceptivos não foi referida na maioria
dos animais (n=23), o que limitou a avaliação de potencial influência de progestagénios na ocorrência de AEF.
Quando analisada a idade de ocorrência, 55,6% dos carcinomas papilares serosos foram encontrados em animais
com idades compreendidas entre os 5 e os 6 anos e 33,5% em animais com mais de 10 anos. Os carcinomas de
células claras ocorreram em gatas com 7 a 9 anos de idade e os carcinomas in situ em animais com 3 a 8 anos. O
índice proliferativo não se revelou um bom marcador na distinção dos três tipos histológicos encontrados (p=0,202).
Este resultado pode ser explicado pelo facto dos carcinomas papilares serosos e dos carcinomas in situ apresentarem
uma grande amplitude de expressão do Ki67 (0,9-58,8% e 13,7-69,7%) ou pelo reduzido número de amostras de
carcinomas de células claras e carcinomas in situ, uma vez que não foram encontradas variações estatisticamente
significativas entre os três tipos de tumores. Os carcinomas de células claras apresentaram consistentemente, os mais
baixos índices proliferativos (entre 13 e 29,3%). Novos estudos devem ser realizados com o objectivo de
caracterizar os AEF. O presente trabalho demonstrou que o índice proliferativo pode não ser um bom marcador para
distinguir, por si só, os AEF, sendo necessários marcadores adicionais, para caracterização dos tumores e
estabelecimento do prognóstico.
[Feline Endometrial Adenocarcinomas: a preliminary study on morphology and proliferation]
Endometrial adenocarcinomas are considered to be rare in domestic animals, in part because they are likely
underdiagnosed. The aim of this study was to define the different morphologies and variations in proliferative
activity of 36 feline endometrial adenocarcinomas (FEA). Endometrial adenocarcinomas were diagnosed by a
minimum of three pathologists, on conventional haematoxylin and eosin-stained sections. The tumours were
classified as papillary serous carcinoma (n=24), clear cell carcinoma (n=3) and carcinoma in situ (n=9). Ki67 (clone
MIB-1; 1:50) expression was detected by immunohistochemistry and the percentage of positive nuclei was
calculated by counting 1000 tumour cells per HPF. The age range for the animals diagnosed with FEA (n=13) was 2
to 15 years-old. Information on previous contraceptive treatment and its extent was impossible to obtain for most
animals (n=23), which limits the evaluation of putative influences of progestagen treatments on the occurrence of
FEA. When analysing the age at occurrence, 55.6% of the papillary serous carcinomas were found in animals aged
of 5-6 years, and 33.5% in animals more than 10 years old. Clear cell carcinoma was found in queens with 7 to 9
years-old, whilst in situ carcinoma was found in animals aged of 3 to 8 years-old. Proliferative index, measured
through the Ki67 expression, is not a good marker to distinguish between the 3 FEA morphological categories
(p=0.202). This may be explained either by the fact that both the papillary serous and in situ carcinomas showed a
wide range of Ki67 expression (respectively from 0.9-58.8% and 13.7-69.7%) or by the small number of samples for
clear cell and in situ tumours, as no differences in group variances were found between the 3 types of tumour. In
contrast, the clear cell carcinoma consistently showed lower Ki67 expression (between 13 and 29.3%). Further
studies should be performed in order to evaluate FEA. This work demonstrated that Ki67 may not be a good maker
to distinguish, by itself, the 3 types of FEA, and that additional markers need to be found to allow not only tumour
characterization but also to establish a prognosis.
38
Optimização da quimioterapia baseada em antraciclinas por associação com inibidores de mitose
em Oncologia Veterinária
Ferreira, F.1, Agostinho, M.2, Santos, V.2, Pinheiro, I.3, Costa, R. 2, Hay, R.M.4, Jaffray, E. 4, Ferreira, J.2
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal; 2 Instituto de Medicina Molecular,
Faculdade de Medicina, Lisboa Portugal; 3 Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética, Freiburg, Alemanhã; 4 Escola das Ciências da
Vida, Universidade de Dundee, Escócia, Reino Unido.
Introdução: As antraciclinas são um grupo de fármacos muito usado para tratar uma grande variedade de patologias
tumorais, desde leucemias e linfomas, ao cancro da mama e do pulmão. Ao inibirem selectivamente a topoisomerase
IIα (TOP IIα) que tem como função separar as cromátides-filhas durante a mitose, o uso das antraciclinas tem vindo
a tornar-se uma importante ferrramenta terapêutica na clínica oncológica. Ainda assim, pouco se sabe acerca da
localização e actividade enzimática da TOP IIα durante a mitose, particularmente, no que toca à formação de
conjugados SUMO-TOP IIα (SUMO-1; SUMO-2/3). De igual forma, os eventuais benefícios da redução das doses
terapêuticas de antraciclinas, por manipulação do ciclo celular e da via de SUMOilação permanecem desconhecidos.
Material e Métodos: A cultura celular, a purificação de células mitóticas e a técnica de silenciamento proteíco por
RNAi, foram realizadas conforme descrevemos anteriormente.
Para os ensaios de imunocitoquímica foram utilizados os seguintes anticorpos: monoclonal de rato anti-TOP IIα
(Chemicon), anti–β-actina (Sigma-Aldrich), soro policlonal de coelho específico anti-TOP I e IIβ, SUMO-1,
SUMO-2/3, SMC-2 e PIASy (AbCam). As drogas e os inibidores anti-TOP II ensaiados foram: ICRF-187 (Chiron
Laboratories), merbarona e etoposídeo (Calbiochem), doxorubicina, aclarubicina e roscovitina (Sigma-Aldrich). A
análise e quantificação da intensidade de fluorescência foram realizadas por microscopia confocal (Zeiss LSM 510
META).
Resultados: Este estudo permitiu obter evidências citológicas e bioquímicas da conjugação da TOP IIα com
proteínas SUMO-2/3 após a exposição de células tumorais às antraciclinas. Mostrámos que a acumulação destas
formas conjugadas é progressiva e que se relaciona com a incompleta decatenação das cromátides. Foi ainda
observado que a proteína PIASy, uma SUMO-E3 ligase, se colocaliza com as proteínas SUMO-2/3 no eixo
cromossómico e que é essencial para a correcta segregação das cromatídes.
Conclusões: Os resultados obtidos revelam o porquê da quimioterapia com antraciclinas dever ser associada a
inibidores de mitose (alcalóides de Vinca e Taxanos). Esta associação mostra-se vantajosa por aumentar o número
de células tumorais em mitose, fase celular em que a TOP IIα desempenha um papel biológico vital. A adição de
drogas que promovam a conjugação da TOP IIα ao SUMO-2/3 e/ou a inactivação da PIASy aos cocktails clássicos
deverá aumentar a eficiência das antraciclinas na Oncolgia Veterinária, ao mesmo tempo que se deverá assistir a
uma diminuição dos efeitos secundários indesejáveis.
[Why mitotic inhibitors can improve the efficiency of anthracycline-based chemotherapy in
Veterinary Oncology]
Introduction: Anthracyclines are a class of medical drugs (e.g. doxorubicin and daunorubicin) used to treat a wide
variety of cancers, from leukemias and lymphomas to breast, uterine, ovarian and lung cancers. Considering that
they specifically inhibit the topoisomerase IIα (TOP IIα), that plays a key role by untangling sister chromatids
during mitosis, the anthracyclines have become an important weapon in clinical oncology. Nevertheless, in
mammals, very little is known about the localization and the enzymatic activity of (TOP IIα) and the enrichment of
the SUMO-topoisomerase IIα conjugates (SUMO-1; SUMO-2/3) during mitosis. Additionally, the effects of cell
cycle/SUMO pathway manipulation on anthracycline‟s clinically effective dosis are also unknown.
Material and Methods: Cell cultures, purification of mitotic cells and RNAi procedures were performed, as
previously described by us. For immunocytochemical studies we used: mouse monoclonals anti-topoisomerase IIα
(Chemicon), anti–β-actin (Sigma-Aldrich); rabbit polyclonal antisera specific for topoisomerase I and IIβ, SUMO-1,
SUMO-2/3, SMC-2, and PIASy were all from Abcam. The following anti-topoisomerases II inhibitors and poisons
were employed: ICRF-187 (Chiron Laboratories), merbarone and etoposide (Calbiochem), doxorubicin, aclarubicin,
and roscovitine (Sigma-Aldrich). Confocal microscopy analysis and quantification of fluorescence intensities were
performed with a Zeiss LSM 510 META.
Results:This study provides cytological and biochemical evidences that topoisomerase IIα is conjugated with
SUMO-2/3 during mitosis, after cellular exposure to anthracyclines. The SUMO-2/3modified forms of
topoisomerase IIα colocalize to centromeres and chromosome cores/axes. Furthermore, formation of topoisomerase
IIα–SUMO-2/3 conjugates, within mitotic chromosomes, strongly correlate with incomplete chromatid decatenation
and progressively decrease as cells approach the metaphase-anaphase transition. We also found that the PIASy
protein, an E3 ligase for SUMO proteins, colocalizes with SUMO-2/3 at the mitotic chromosomal cores/axes and is
required for proper chromatid segregation.
Conclusions: The results show at cellular and molecular levels why anthracyclines-based chemotherapy should be
combined with mitotic inhibitors (vinca alkaloids or taxanes). These advances also allow us to infer that the addition
of drugs promoting SUMO-2/3 conjugation of topoisomerase IIα and/or inactivation of PIASy E3-ligase should
improve the efficiency of anthracyclines in Veterinary Oncology practice.
39
Recursos Genéticos Animais
Estrutura racial do cavalo Lusitano
Vicente, A.1,4,5, Carolino, N.2,3,5 e Gama, L.T.2,4,5
1 Escola Superior Agrária de Santarém, Portugal. Email: [email protected]
2 Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
3 Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal
5 Sociedade Portuguesa de Recursos Genéticos Animais (SPREGA), Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
O cavalo Puro-sangue Lusitano representa a principal raça equídea autóctone de Portugal, e tem um efectivo
registado de aproximadamente 5 mil fêmeas reprodutoras. A diversidade genética e a estrutura populacional foram
analisadas a partir da base de dados do Registo Nacional de Equinos gerido pela Fundação Alter Real que, após
edição e validação, resultou num ficheiro de genealogias com 53411 indivíduos, nascidos entre 1824 e 2009. O
coeficiente de consanguinidade médio estimado para a população de referência estudada (poldros Lusitanos
nascidos entre 2005 e 2009, n=9712) foi de 11,34 ± 7,48%. O aumento da taxa de consanguinidade por ano foi de
0,173 ± 0,070%, e o tamanho efectivo da população de cerca de 28. A totalidade de cavalos Lusitanos registados até
2009 resulta da contribuição genética de 796 fundadores (267 garanhões e 529 éguas), oriundos de 110 coudelarias
fundadoras, com 17487 ascendentes registados ao longo do período considerado. Para a população de referência, o
número efectivo estimado de fundadores, ascendentes e coudelarias foi de cerca de 27, 12 e 5, respectivamente. Os 2
principais ascendentes e fundadores contribuem, respectivamente, com cerca de 33 e 51% do património genético da
raça Lusitana. Nos últimos 30 anos as contribuições de ascendentes e fundadores representadas no pool genético do
Lusitano têm decrescido, com uma redução para cerca de metade no seu número efectivo.
[Breed structure in Lusitano horses]
Lusitano is the major native breed of equidae in Portugal, with a census of about 5000 breeding females. Genetic
diversity and population structure of this breed were analyzed based upon the National Stud Registry maintained
“Fundação Alter Real”. After editing and validation, the pedigree file had information on 53411 animals, born
between 1824 and 2009. The mean inbreeding coefficient estimated for the reference population studied (Lusitano
foals born between 2005 and 2009, n=9712) was 11.34 ± 7.48%. The rate of inbreeding per year was 0.173 ±
0.070%, and the effective population size was about 28. Lusitano horses born until 2009 result from the genetic
contributions of 796 founder animals (267 stallions and 529 mares) in 110 founding studs, with 17487 ancestors
registered throughout the period of time analyzed. For the reference population, the estimated effective number of
founders, ancestors and studs was about 27, 12 and 5, respectively. The 2 major ancestors and founders contributed
with, respectively, about 33 and 51% of the Lusitano genetic pool. Over the last 30 years, the contributions
represented in the genetic pool of the Lusitano breed have declined, with a reduction to about one-half in the
effective number of founders and ancestors.
40
Pesquisa de polimorfismos na região promotora do gene codificante para a proteína Doppel
(PRND) em caprinos e ovinos de raças Portuguesas
Mesquita, P.1, Marques, M.R.1, Garcia, V.1, Oliveira Sousa, M.C.1, Santos Silva, F.1, Carolino, I.1, Pimenta, J.1,2,
Marques, C.C.1, Gama, L.T.1,2, Fontes, C.M.2, Prates, J.A.M.2, Horta, A.E.M.1, Pereira, R.M.1
1 INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
Apesar de apresentar homologia com a proteína do prião, a proteina Doppel parece não estar relacionada com a
progressão da doença priónica mas sim envolvida na fertilidade masculina. Em trabalhos anteriores, o nosso grupo
identificou, recorrendo à técnica de SSCP (“Single-strand Conformation Polymorphism”), um polimorfismo na
região codificante do gene PRND em ovinos de raças Portuguesas e demonstrou a sua associação com a qualidade e
características de congelação do sémen. Neste trabalho pretendemos investigar polimorfismos na região promotora
do gene PRND passíveis de influenciar os níveis de expressão deste gene. Analisámos o ADN genómico extraído do
sangue de 90 caprinos pertencentes a quatro raças Portuguesas: Algarvia (23), Bravia (22), Serpentina (23) e Serrana
(22), e de 166 ovinos de três raças Portuguesas: Churra Badana (60), Churra Galega Mirandesa (59) e Saloia (47).
Amplificámos por PCR um fragmento da região promotora do gene PRND com 218 pb, usando oligonucleótidos
específicos sintetizados com base na sequência publicada para o gene PRND de ovino. Nos caprinos, obtiveram-se
três padrões diferentes nos géis de SSCP e a posterior sequenciação dos respectivos fragmentos permitiu a
identificação, pela primeira vez, do polimorfismo c.-2078G>A, com uma frequência do alelo A de 45%. Resultados
preliminares nos ovinos mostram que apenas 5% dos animais apresentam um padrão distinto de SSCP. Os
resultados obtidos nas raças Portuguesas permitem-nos concluir que a região promotora do gene PRND é mais
polimórfica nos caprinos do que nos ovinos, o que já tinha sido observado relativamente à região codificante deste
gene.
[Uncovering polymorphisms in Doppel gene (PRND) promoter in Portuguese goat and sheep]
Doppel is a prion-like protein probably not related to prion disease progression but to male fertility. In a previous
work we have identified, using SSCP (“Single-strand Conformation Polymorphism”) analysis, a polymorphism in
PRND coding region in Portuguese sheep breeds and shown it was associated to semen traits and freezability. Now,
we intend to investigate polymorphisms in PRND promoter regions, which can greatly influence PRND gene
expression levels. We have analyzed genomic DNA extracted from blood of 90 goats belonging to four Portuguese
breeds: Algarvia (23), Bravia (22), Serpentina (23) and Serrana (22), and 166 sheep from three Portuguese breeds:
Churra Badana (60), Churra Galega Mirandesa (59) and Saloia (47). A 218-bp fragment of the PRND promoter
region was amplified by PCR, using specific primers designed based on the published ovine PRND sequence. In
goats, three different SSCP patterns were obtained and subsequent sequencing allowed the identification, for the
first time, of c.-2078G>A polymorphism, with an allele A frequency of 45%. Preliminary results in sheep show that
only 5% of the animals have a distinct SSCP pattern. The results obtained in Portuguese breeds lead us to the
conclusion that the PRND promoter region is, similarly to what we have found in PRND coding region, more
polymorphic in goats than in sheep.
41
CATTLECON IKTA: Characterization of the Upper Egypt Baladi bovine breed
Molina-Flores, B.1, 2, Gama, L.3, Delgado, J.V.2, Galal, S.4
1 Animal Production and Health Division. FAO, Rome, Italy. Vialle delle Terme di Caracalla. 00153 [email protected]
2 Department of Genetics. University of Cordoba, Spain
3 Animal Genetic Resources, Reproduction and Improvement Unit. National Institute of Biological Resources I.P., Santarem, Portugal
4 Department of Genetics. University of Ain Shans, Cairo, Egypt
There is a very important historical parallelism among Mediterranean countries as a result of hundreds of years of
common history. A big part of our animal genetic resources have a common origin, firstly because of the postNeolithic dispersion of domestication in the Near East; and because of the migration of civilizations to the
Mediterranean area in later centuries. These facts are especially relevant regarding local cattle breeds, which in most
cases represent a significant livelihood added-value, strongly linked to the cultural heritage, for these countries in
general and the rural population in particular. These cattle breeds should be part of the endogenous rural
development compatible with the economical growth in a globalized world, with the conservation and use of the
traditions in the creation of richness. Whereas some countries have developed good infrastructures to characterize,
protect, improve and use the zoogenetic heritage, other countries are demanding formation and researches on their
own breeds, practically unknown by themselves and the rest of the world. In many of these countries, the influx of
exotic cattle breeds, particularly the high-input-high-output, is endangering the integrity of local cattle breeds.
Cross-breeding is often indiscriminate and if such trend continues the local cattle breeds will be endangered. FAO
(2007) has been clear in the recommendations pointed out in the Interlaken Conference memorandum. Firstly we
must stand out the relevance given to molecular tools in the characterization and management of Animal Genetic
resources (Part 4.The State of the World´s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture). Secondly, the
needs and challenges in animal genetic resources management in the same FAO report, pointed out the demand of
transfer of knowledge among countries. This article intends to introduce the FP7 EU funded project “CATTLECON
IKTA”, implemented by Portugal, Spain and Egypt, and particularly the objectives and preliminary results of one of
its linked research studies on the characterization of the Upper Egypt Baladi bovine breed. The project aims to
develop several formative actions involving the Molecular Genetic tools useful in the characterization, genetic
management, genetic improvement, food security and food sovereignty based on local cattle breeds.
42
Contributo das raças ibéricas para a formação das raças bovinas Crioulas do continente americano
Gama, L.T. 1, Martínez, A.M.2, Vega-Pla, J.L 2, Acosta, A.3, Álvarez, L.A.4, Camacho, E.2, Cañón, J.2, Cortés, O.2,
Delgado, J.V.2, Dunner, S.2, Ginja, C.1, Landi, V.2, Marques, J.R.5, Martín-Burriel, I.2, Martínez, O.R.6, Martínez,
R.D.7, Melucci, L.7, Martínez-Velázquez, G.8, Muñoz, J.E.4, Penedo, M.C.T.9, Postiglioni, A.10, Quiroz, J.8,
Rodellar, C.2, Sponenberg, P.9, Uffo, O.3, Villalobos, A.11, Zambrano, D.12 e Zaragoza, P.2
1
Portugal, 2Espanha, 3Cuba, 4Colombia, 5Brasil, 6Paraguai, 7Argentina, 8México, 9Estados Unidos da América, 10Uruguai, 11Panamá, 12Equador.
As raças Crioulas do Continente Americano constituem um importante património genético, que representa o que
resta das importações de bovinos a partir da Península Ibérica ao longo de todo o processo de colonização. Nos
últimos dois séculos, as populações Crioulas que existiam desde aquela época foram progressivamente substituídas
por raças centro-europeias e por populações zebuínas. Contudo, algumas das populações bovinas Crioulas subsistem
ainda em zonas marginais em vários países do continente Americano, geralmente com censos muito reduzidos. Este
trabalho visou caracterizar a diversidade genética de uma amostragem abrangente das raças Crioulas actualmente
existentes, e estudar a sua relação genética com as raças bovinas Ibéricas e outras que possam tê-las influenciado.
Utilizou-se um painel de 19 microssatélites numa amostra 3333 animais representativos de 81 raças (27 raças
Crioulas, 13 Portuguesas, 26 Espanholas, 4 Continentais, 5 Britânicas e 6 Zebuínas). Globalmente, as raças Crioulas
apresentam uma grande diversidade genética e uma maior proximidade às raças Ibéricas, particularmente as do Sul
da Península, do que às restantes raças estudadas. No conjunto das raças Crioulas, as raças Ibéricas contribuem com
cerca de 2/3 do pool genético, seguindo-se a influência de raças zebuínas e, em menor escala, de raças bovinas
Continentais e Britânicas. Contudo, observa-se uma enorme diversidade entre as raças conhecidas como Crioulas,
podendo identificar-se alguns grupos distintos, entre os quais o grupo de raças do Panamá, México, Estados Unidos,
Brasil, Argentina e Uruguai é o que apresenta maior influência Ibérica, também detectável em algumas raças
Colombianas. Por outro lado, as raças das Caraíbas e de outras regiões tropicais apresentam uma clara influência
zebuína. Estes resultados indicam que, vários séculos após a importação de bovinos da Península Ibérica para o
continente Americano, a influência Ibérica é ainda claramente identificável nas populações conhecidas como
Crioulas. Torna-se evidente a necessidade de reconhecer, diferenciar e proteger estas populações, promovendo o
desenvolvimento de programas de conservação e utilização sustentável.
[Contribution of Iberian breeds to the formation of Creole cattle breeds from the American
continent]
The Creole group of breeds in the American continent constitutes an important genetic resource, which represents
what remains from the importations of cattle from the Iberian Peninsula throughout the period of colonization. Over
the last two centuries, Creole populations which existed at that time were progressively replaced by center-european
and zebu breeds. However, a few Creole populations still subsist in marginal in several American countries,
generally with very reduced census. This work was carried out to characterize the genetic diversity existing in a
broad sample of the Creole breeds currently existing, and to study their genetic relationship with Iberian and other
breeds which may have influenced them. A panel of 19 microsatellites was used in a sample of 3333 animals
representing 81 breeds (27 Creole, 13 Portuguese, 26 Spanish, 4 Continental, 5 British and 6 of the Zebu-type).
Globally, Creole breeds present high levels of genetic diversity and a closer proximity with Iberian breeds
(especially those originating from southern Ibéria) than with the other breeds studied. For Creole breeds considered
together, Iberian breeds contribute with nearly 2/3 of the genetic pool, followed by the influence of zebu breeds and,
to a lesser extent, of Continental and British breeds. However, a large diversity among the breeds known as Creole
wqas observed, and a few clusters could be identified. Among these, the groups of breeds from Panamá, México,
United States, Brazil, Argentina and Uruguai are the ones showing a stronger Iberian influence, also detectable in
some of the Colombian breeds. On the other hand, breeds from the Caribbean and other tropical regions present a
clear zebu signature. These results indicate that, several centuries after the importation of cattle from the Iberian
Peninsula to the American continent, the Iberian influence is still clearly detectable in the populations known as
Creoles. Moreover, the need to recognize, differentiate and protect Creole breeds of cattle is clear, by promoting the
development of conservation and sustainable utilization programs.
43
Reprodução
Bacteriología en semen de porcino
Alfonso Bolarín
Director de Calidad e Investigación de AIM Ibérica S.A.U.
Se realizó un estudio retrospectivo de un período de tres años en seis Centros de Inseminación de AIM Ibérica en
España y Portugal. De cada eyaculado recogido en los centros, se analizó una muestra de dosis seminal para
longevidad y contenido bacteriano. La longevidad se analizó subjetivamente por técnicos experimentados, usando
un microscopio de contraste de fases con pletina termostatizada. Las muestras de dosis seminal fueron precalentadas
en un baño termostatizado durante 15-30 minutos a 34-35 ºC, y su motilidad chequeada a las 72-96 horas tras la
recolección. Las muestras de dosis seminal con más del 50% de motilidad subjetiva fueron consideradas normales.
En aquellos casos en los que la motilidad era menor, se realizó un cultivo bacteriológico. Los cultivos fueron
realizados en placas de agar sangre, usando torundas estériles; el cultivo se realizó durante 48 horas en una estufa
con temperatura controlada de 34-35 ºC. Aquellas placas que presentaron crecimiento bacteriano fueron enviadas a
un laboratorio externo para su identificación. Simultáneamente, los eyaculados eran aleatoriamente analizados de
forma rutinaria para detectar e identificar su contenido bacteriano. Antibiogramas fueron realizados aleatoriamente
sobre las muestras que presentaron crecimiento. Un total de 102 muestras de semen, y 26 eyaculados fueron
analizados, de los cuales 6,86% y 26,92% respectivamente mostraron dos cepas bacterianas diferentes en los
cultivos, mientras que el resto mostraron crecimiento de sólo un tipo de microorganismo. Un total de 31 bacterias
diferentes fueron encontradas en los cultivos de las muestras de semen y eyaculados. Las bacterias más
frecuentemente aisladas fueron Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Staphylococcus spp. y micrococcus spp.,
representando 26,1% (n=37), 12% (n=17), 5,6% (n=8) and 5,6% (n=8) respectivamente del total de las 142 bacterias
aisladas. En cuatro casos (2,8%), la bacteria no pudo ser identificada. Las diferentes especies de Serratia aisladas
representaron el 44,44% (n=64). Todas las bacterias aisladas resultaron ser resistentes a los Β-lactámicos
amoxicilina y ampicilina, así como a la cefalosporina cefuroxime. Por otra parte, más del 90% de las colonias
resultaron ser resistentes a otros antibióticos comúnmente presentes en diluyentes comerciales, tales como los
aminoglicosidos neomicina y espectinomicina, y el β-lactámico amoxililina-ácido clavulánico. Los antibióticos
presentes en el diluyente usado en todos los Centros de Inseminación en estudio fueron neomicina y penicilina.
Las bacterias se introducían en la línea de producción seminal procedentes de múltiples orígenes, incluyendo la piel
de los verracos, deficiente protocolo de extracción de semen, el agua destilada usada en limpieza y preparación de
diluyente, el personal del centro, y en numerosas ocasiones, el origen de la contaminación no consiguió ser definido.
Estos hallazgos estimularon la aplicación de un protocolo de monitorización bacteriológica adaptado a cada uno de
los seis Centros de Inseminación, para prevenir la contaminación microbiológica y disminuir la carga bacteriana en
todos los puntos críticos.
[Bacteriology in boar semen]
A 3-years retrospective study was made on six AI boar farms of Spain and Portugal. One extended semen sample of each boar
collection was routinely analyzed for longevity and bacteriology. Longevity was subjectively measured by an experienced
technician using a phase contrast microscope. Semen samples were pre-warmed in a water bath during 15-30 minutes at 34 ºC,
and then motility was checked once, at 72-96 hours after collection. Semen samples with more than 50% motility were
considered normal. For those samples that showed reduced motility, a bacteriological culture was performed. Cultures were made
in blood agar plates, using sterile swabs, and placed during 48h into a warm cabinet at 34-35 ºC. Blood agar plates with bacteria
growth were sent for bacteriological identification. Simultaneously, boar ejaculates were randomly and routinely analyzed for
bacteriology. Antibiogram was randomly performed. A total of 102 semen samples and 26 ejaculates were analyzed, from which
6.86% and 26.92% respectively showed two different bacteria in the cultures, whereas the rest of them showed growth of only
one type of microorganism. A total of 31 different bacteria were found in cultures of both extended semen samples and
ejaculates. The most common bacteria isolated were Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Staphylococcus spp. and
micrococcus spp, representing 26.1% (n=37), 12% (n=17), 5.6% (n=8) and 5.6% (n=8) respectively of all the 142 isolations. In 4
cases (2.8%), the bacteria could not be identified. The isolated Serratia different species represented the 45.1% (n=64). All
bacteria isolated were found to be resistant to the Beta-lactamics amoxiciline and ampiciline and to the cephalosporine
cefuroxime. Moreover, above 90% of the colonies were also resistant to other common antibiotics present in commercial
extenders, such as the aminoglycosides neomicine and espectinomicine, and the Beta-lactamic amoxiciline-clavulanic acid. The
antibiotics contained in the extender used in all AI boar studs of the study were neomicine and penicillin. To decrease or
eliminate bacteria load in doses, and gain time to identify the contamination sources, enrofloxacine was temporary added to
extender immediately after growth detection. In 123 cases out of 128, microbiological contamination was controlled and totally
eliminated, even if the bacteria were found to be resistant to enrofloxacine, neomicine and penicillin. Whenever bacterium was
not eliminated, ceftiofur was successfully applied to the extender. Bacteria were introduced in production line from multiple
sources, including animals, bad collection procedures, distillated water supply, personnel and several times, unknown sources.
These findings encouraged the application of a strict monitoring protocol, personally modeled for each of the six boar studs, to
prevent microbiological contamination, and decrease bacteria load in all critical points.
44
Regulação da angiogénese por citocinas no corpo lúteo da égua e a importância do VEGF para a
função secretora
Galvão, A.1,2, Skarzynski, D.2, Rebordão, M.R.3, Bravo, P.3, Mateus, L.1, Ferreira-Dias, G.1
2 Institute of Animal Reproduction and Food Research of PAS, Olsztyn, Poland
3 Escola Superior Agrária de Coimbra, Coimbra, Portugal
A complexidade da regulação da função lútea alicerça-se não apenas na acção conjunta de hormonas e citocinas,
entre outros factores, mas também em alterações vasculares. Angiogénese e inflamação são processos dependentes
em diversas situações fisiológicas e patológicas, no organismo. A sua interligação precisa, na regulação fisiológica
da proliferação, estabelecimento e regressão lútea merece ser investigada. Assim, o objectivo do presente trabalho
foi avaliar, no corpo lúteo (CL) da égua, o efeito das citocinas factor de necrose tumoral alpha (TNF), interferão
gama (IFN) e Fas Ligando (FasL) (i) na modulação da função angiogénica, ao longo da fase lútea (FL) e (ii) na
expressão proteica do factor de crescimento endotelial vascular A (VEGF), na FL média; e o efeito do VEGF na
função secretora na FL média (progesterona - P4 e prostaglandina E2 – PGE2) e na expressão de mRNA da 3 Beta
Hidroxiesteróide Desidrogenase - 3HSD e PGE Sintase - PGES. A actividade angiogénica, determinada
indirectamente através da avaliação da proliferação das células endoteliais da aorta de bovino (BAEC) (n=5/fase
lútea), foi aumentada por TNF na FL inicial e reduzida nas FL média e final pelo TNF, IFN e TNF+IFN+FasL
(p<0,05). Na FL média, a expressão proteica de VEGF foi aumentada por TNF (p<0,05), mas reduzida por FasL e
TNF+IFN+FasL (p<0,05). Incubação de células da FL média (n=6) com VEGF (50 ng/ml) causou um aumento in
vitro, quer na secreção de P4 e PGE2 (p<0,05), quer na expressão de mRNA de 3HSD e PGES (p<0,05).
Demonstrou-se, pela primeira vez no CL da égua, o papel das citocinas na regulação da expressão de factores
pro/anti-agiogénicos e ainda o papel do VEGF na capacidade secretora. Com o presente estudo evidenciou-se no CL
equino a importância do sistema imunitário na regulação da dinâmica vascular bem como a acção da angiogénese na
função secretora lútea.
[Angiogenesis modulation by cytokines in mare corpus luteum and VEGF role on luteal secretory
function]
Luteal function regulation is a complex process dependent on hormones and cytokines action, among others, as well
as vascular changes. Angiogenesis and inflammation are co-dependent processes in different physiologic and
pathogenic events, but their precise cross-talk on physiologic regulation of luteal establishment, function and
regression in the mare is yet to be known. Therefore, the goal of this study was to evaluate in the mare corpus
luteum (CL), the role of cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF), interferon gamma (IFN) and Fas ligand
(FasL) on (i) modulation of angiogenic activity, throughout the luteal phase (LP), and on (ii) protein expression of
vascular endothelial growth factor A (VEGF), in mid CL isolated cells; (iii) the effect of VEGF on secretory
capacity (progesterone - P4 and prostaglandin E2 – PGE2) and mRNA expression of 3 Beta hydroxysteroid
dehydrogenase - 3HSD, and PGE synthase - PGES. Angiogenic activity, assessed indirectly after measuring
bovine aortic endothelial cells (BAEC) proliferation (n=5/luteal stage), was increased in early LP by TNF (p<0.05)
and reduced in mid and late LP by TNF, IFN and TNF+IFN+FasL (p<0.05). In mid LP isolated cells, VEGF protein
expression was increased by TNF (p<0.05), but reduced by FasL and TNF+IFN+FasL (p<0.05). Incubation of mid
CL cells (n=6) with VEGF (50 ng/ml) caused an increase in in vitro P4 and PGE2 secretion (p<0.05) and in the
mRNA expression of both 3HSD and PGES (p<0.05). It was demonstrated for the first time in the equine CL, the
regulatory role of cytokines on angiogenic/antiangiogenic factors expression and also the role of VEGF on luteal
secretory capacity. The present study evidences in the equine CL the importance of the immune system on the
regulation of CL vascular dynamic, as well as the role of angiogenesis itself on luteal secretory function.
45
A co-cultura com células lúteas previamente criopreservadas estimula o desenvolvimento de
embriões bovinos em dois sistemas de cultura in vitro
Torres, A., Batista, M., Diniz, P., Mateus, L., Lopes da Costa, L.
CIISA, Reprodução e Obstetrícia, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
O embrião, útero e corpo lúteo (CL) estabelecem uma comunicação cruzada durante o desenvolvimento embrionário
precoce, que é fulcral para o estabelecimento da gestação. As células lúteas são conhecidas por serem fastidiosas e
exigentes em cultura in vitro, perdendo a sua capacidade esteroidogénica e sendo o estabelecimento da sua cultura
difícil após criopreservação. Em trabalhos anteriores desenvolvemos um sistema de cultura in vitro para células
lúteas previamente criopreservadas que é compatível com a cultura embrionária. Este estudo teve por objectivo
avaliar o efeito da co-cultura com células lúteas previamente criopreservadas sobre o desenvolvimento in vitro de
embriões bovinos. Populações enriquecidas de células lúteas foram obtidas de CLs bovinos jovens (Dias 1-6) e
criopreservadas em azoto líquido. Embriões bovinos no estádio de clivagem (Dia 2, Dia 0 = FIV) foram cultivados
in vitro em meio SOFaa + 5% soro bovino em atmosfera de 90% N2, 5% CO2 e 5% O2 até Dia 7.
Na experiência 1, os embriões (n = 900), em 4 sessões, foram aleatoriamente distribuídos por um de quatro grupos
de cultura in vitro, em placas de quatro poços: 1) embriões; 2) embriões co-cultivados com células lúteas; 3)
embriões, meio recoberto por óleo; 4) embriões co-cultivados com células lúteas, meio recoberto por óleo.
Comparados com a cultura isolada de embriões, a co-cultura com células lúteas e/ou a cobertura do meio por óleo
aumentou (P< 0,001) o total de blastocistos no Dia 7 (27-29% versus 13%) e a proporção de blastocistos de
qualidade I+II (80-92% versus 60%; P< 0,05). A cobertura do meio por óleo adiantou o desenvolvimento
embrionário (P< 0,05).
Na experiência 2, os embriões (n = 1000), em 8 sessões, foram aleatoriamente distribuídos por um de dois grupos de
cultura in vitro, em câmaras de lâmina: 1) embriões; 2) embriões co-cultivados com células lúteas. A co-cultura com
células lúteas aumentou o total de blastocistos no Dia 7 (28% versus 21%; P< 0,05) e a proporção de blastocistos de
qualidade I+II (88% versus 60%; P< 0,00001) mas não teve efeito sobre a velocidade de desenvolvimento nem
sobre o número médio de células embrionárias.
Em conclusão, células lúteas criopreservadas cultivadas em meio semi-definido próprio para a cultura in vitro de
embriões, mantiveram a sua viabilidade e exerceram um efeito embriotrófico. A co-cultura com estas células lúteas
e a cobertura do meio de cultura com óleo tiveram um efeito positivo não aditivo no desenvolvimento embrionário.
O sistema de cultura em câmara de lâmina mostrou-se adequado para cultura in vitro de embriões, o que poderá ser
de interesse para o estudo ulterior da produção de esteróides por embriões e células.
Estudo financiado pela FCT, projecto PTDC/CVT/65690/2006. Ana Torres é bolseira de doutoramento da FCT e Mariana Batista bolseira de
investigação do projecto mencionado
[Co-cultured frozen-thawed luteal cells stimulate early bovine embryonic development in two in
vitro culture systems]
The early embryo, the uterus and the corpus luteum (CL) establish a cross communication during embryonic
development that is pivotal for pregnancy establishment. Luteal cells are known to be fastidious and demanding
cells in in vitro culture systems, losing their steroidogenic capacity after short culture periods and being difficult to
establish in culture after freezing-thawing. We have previously established an in vitro culture system for frozenthawed luteal cells that is compatible with in vitro embryo culture. This study was designed to evaluate the effects of
criopreserved co-cultured luteal cells on embryo development. Enriched luteal cell populations were obtained from
early (Days 1-6) bovine CLs and frozen in liquid nitrogen. Day 2 (Day 0 = IVF) cleaved bovine embryos were in
vitro cultured in SOFaa + 5% serum in a atmosphere of 90% N 2, 5% CO2 and 5% O2 until Day 7.
In experiment 1, cleaved embryos (n = 900), in four replicate sessions, were randomly allocated to one of four in
vitro culture groups in 4-well dishes: 1) embryos; 2) embryos co-cultured with thawed luteal cells; 3) embryos, oil
overlay; 4) embryos co-cultured with thawed luteal cells, oil overlay. Compared to embryo culture alone, luteal cell
co-culture and/or oil overlay increased (P< 0.001) total blastocyst output on Day 7 (27-29% versus 13%,
respectively) and proportion of quality grade I+II blastocysts (80-92% versus 60%, respectively; P< 0.05). Oil
overlay advanced (P< 0.05) embryo development.
In experiment 2, cleaved embryos (n = 1000), in eight replicate sessions, were randomly allocated to two in vitro
culture groups in slide chambers: 1) embryos; 2) embryos co-cultured with thawed luteal cells. Luteal cell co-culture
increased total blastocyst output on Day 7 (28% versus 21%; P< 0.05) and proportion of quality grade I+II
blastocysts (88% versus 60%; P< 0.00001) but had no effect on rate of development and embryo mean cell number.
In conclusion, frozen-thawed luteal cells cultured in a semi-defined embryo culture system were able to maintain
viability and exert an embryotrophic effect. Co-culture and oil overlay had a non-additive positive effect on embryo
development. The slide chamber system is suitable for embryo culture without oil overlay, which can be of interest
for studying steroid production by embryos and cells.
46
Isolamento e cultura de células do endométrio canino num sistema tridimensional
Cruz, S.1, Diniz, P.2, Silva, E.2, Henriques, S.2, Ferreira-Dias, G.2, Lopes da Costa, L.2, Mateus, L.2
1 Estudante de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
A hiperplasia quística do endométrio é uma causa frequente de infertilidade em cadelas mais velhas. Apesar do
mecanismo que leva a esta alteração ainda não seja claro, pensa-se que a estimulação estrogénica seguida por um
período de dominância progestagénica possa estar envolvido. Deste modo, o objectivo deste trabalho foi estabelecer
in vitro um modelo tridimensional de endométrio canino que possibilite o estudo de factores de estimulação e de
inibição de crescimento e diferenciação celular.
Foram utilizadas 5 úteros de cadelas (2-5 anos de idade) submetidas a ovariohisterectomia de rotina (OVH).
Imediatamente após a OVH, a porção cranial e caudal de cada corno uterino e ambos os ovários foram fixadas em
formol tamponado a 4% até serem processadas histologicamente. O restante endométrio foi cortado em pequenos
pedaços que posteriormente foram incubados com DMEM-F12 (Gibco) suplementado com colagenase tipo A
(Roche), penicilina-estreptomicina (Sigma) e anfotericina (Gibco). Após o tratamento enzimático, procedeu-se a
uma primeira filtração, com remoção do tecido não digerido, contendo a restante solução as glândulas uterinas, o
epitélio e as células do estroma. Numa segunda etapa de filtração separaram-se os organóides das células do
estroma, sendo ambas as fracções recolhidas, centrifugadas e ressuspendidas em DMEM suplementado com 10% de
soro fetal e 0,1% de BSA. A co-cultura foi preparada a partir de organóides e células do estroma isolados do mesmo
animal. Os organóides isoladamente ou com células do estroma foram diluídos em Matrigel (BD Biosciences) e
colocados em inserts. Após gelificação, os inserts, foram transferidos para uma placa de cultura de tecidos de 24
poços, com ou sem células do estroma previamente plaqueadas, respectivamente. As culturas foram incubadas a 37
ºC durante 10 dias, sendo o meio renovado a cada dois dias. Após o período de incubação, os inserts foram incluídos
em OCT e seguidamente congelados em azoto líquido. A confirmação da origem epitelial e mesenquimal das células
foi feita por imunohistoquímica após marcação com citoqueratina e vimentina, respectivamente. Não foram
observadas alterações significativas na proliferação (Ki67, Dako) e na expressão dos receptors de estrogénio e de
progesterona (Zymed), após marcação por imunohistoquimica. Este sistema de co-cultura fornece um modelo para
investigar as interações celulares entre as células do estroma e do epitélio endometrial e compreender a base
molecular da regulação do crescimento e diferenciação normal das células do endométrio canino.
(Financiamento: POCTI/CVT/48773/2002 and CIISA 74.Endometrial Hyperplasia)
[Isolation and culture of canine endometrial cells in a three-dimensional culture system]
Cystic endometrial hyperplasia is a frequent cause of infertility in the elder bitches. The pathogenesis of this
alteration is still unclear, although stimulation with estrogen followed by prolonged intervals of progesterone
dominance is thought to be involved. Therefore, the aim of our study was to establish a three-dimensional in vitro
system of the canine endometrium suitable for experimental approaches. Canine endometrial tissue was obtained
from routine ovariohysterectomy of healthy female dogs (n=5) from 2 to 5 years of age. Samples of each uterus
were taken and fixed in 4% formaldehyde. The remaining tissue was cut into small pieces and incubated with
collagenase type A (Roche) in DMEM-F12 (Gibco), supplemented with penicillin–streptomycin solution (Sigma)
and amphotericine (Gibco). After enzymatic treatment, the non-dissociated tissue parts were filtered and removed.
The remaining solution contained uterine glands, surface epithelium, and stromal cells. In a second filtration step
organoids were separated from stromal cells. Both fractions were collected, centrifuged, and resuspended in DMEM
plus 10% fetal serum and 0,1% BSA. Organoid/stromal cell co-culture was prepared from freshly isolated epithelial
organoids and stromal cells from the same animal. Organoids alone or with stromal cells were suspended in
undiluted Matrigel basement membrane matrix (BD Biosciences) and pippeted into tissue culture inserts. After
gelling inserts were transferred to 24-well tissue culture plate with or without plated stromal cells, respectively. The
cultures were incubated at 37 ºC for 10 days, with medium renewed every 2 days. After the incubation period, the
inserts were embedded in OCT and frozen in liquid nitrogen. Confirmation of epithelial and mesenchymal origin of
the cells was done by immunohistochemical staining with cytokeratin and vimentin, respectively. No significant
changes of cultured glandular explants were observed concerning proliferation and steroid receptor (estrogen,
progesterone) expression when compared with the original uterine tissue as assessed by immunohistochemical
staining.
This co-culture system provides a model to investigate the cellular interactions between endometrial stromal and
epithelial cells and to understand the molecular basis for the regulation of normal growth and differentiation of cells
within the endometrium.
(Funding: POCTI/CVT/48773/2002 and CIISA 74.Endometrial Hyperplasia)
47
Produção de um novo anticorpo policlonal anti-Prt ovino e desenvolvimento de um método de
detecção desta proteína priónica no campo reprodutivo
Pimenta, J.1,3,5, Domingos, A.2, Santos, P.4, Marques, C.C.1, Barbas, J.P.1, Baptista, M.C.1, Horta, A.E.M. 1,
Mesquita, P. 1, Fontes, C.3, Prates, J.A.M.3, Pereira, R.M.L.N. 1,6*
2 Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
4 Hospital Universitário de Coimbra, Coimbra, Portugal
5 Direcção Geral de Veterinária, Lisboa, Portugal
* Email: [email protected]
Os priões provocam doenças neurodegenerativas fatais, tanto em humanos como em animais. A causa primária
reside na conversão da proteína priónica celular (PrPC), codificada pelo gene PRNP, numa isoforma anormal (PrP Sc),
que causa, entre outras doenças, a encefalopatia espongiforme bovina e o scrapie nos ovinos. O gene PRNP
contribui juntamente com o gene PRND (que codifica a proteína Doppel ou Dpl), com o gene PRNT (que codifica a
proteína específica do testículo, Prt) e com o gene SPRN (que codifica a proteína Shadoo ou Sho), para a “família de
genes priónicos”. Apesar de já ter sido confirmada a importância do gene PRND ao nível da fertilidade masculina, a
função do gene PRNT não é ainda conhecida, tendo sido sugerido que, nos ruminantes, este gene seria apenas
transcrito, sem ser posteriormente traduzido. O objectivo do presente trabalho foi pesquisar a expressão do gene
PRNT em tecidos e células do aparelho reprodutor de ovinos. Para tal, foram recolhidos em matadouro, testículos,
ovários, tronco cerebral e baço, os quais foram posteriormente macerados e fixados em lâmina para a imunolocalização do Prt. Foram igualmente recolhidos vários ejaculados, com auxílio de vaginal artificial, de carneiros
adultos da raça Churra Galega Mirandesa e os espermatozóides fixados em lâminas com metanol. Foi sintetizado o
péptido correspondente à sequência da proteína ovina Prt, que foi utilizado como antigénio para a imunização de
murganhos BALB/C. Após determinação por ELISA do título do anticorpo produzido, foi obtido o soro utilizado
nos ensaios subsequentes. A marcação com o anticorpo primário anti-Prt de ovino, produzido em rato, foi detectada
pelo método de imunofluorescência indirecta com o anticorpo IgC secundário anti-rato, produzido em caprino. Os
ensaios de imunofluorescência sugerem a presença da proteína Prt na região do acrossoma dos espermatozóides,
mas não foi identificada fluorescência no tecido do ovário, tronco cerebral e baço. A produção deste novo anticorpo
policlonal anti-Prt permitiu detectar esta proteína ao nível do acrossoma dos espermatozóides de carneiro,
demonstrando, pela primeira vez, a presença da proteína Prt em ruminantes e o seu importante papel na reprodução
masculina.
Os autores agradecem o financiamento do presente trabalho à Fundação para a Ciência e Tecnologia – projecto PTDC/CVT/
98607.
[Production of novel polyclonal antibody against the ovine Prt, and their application for the
detection of this prion protein in the reproductive field]
Prions are infectious pathogens that cause a group of invariably fatal neurodegenerative diseases in both humans and
animals. A hallmark of prion diseases or transmissible spongiform encefalopaties (TSE) is the conversion of the
cellular prion protein (PrPC), expressed by the prion protein gene (PRNP), into an abnormally folded isoform
(PrPSc), that cause the bovine spongiform encephalopathy and scrapie in ovine, among other diseases. PRNP
contributes together with PRND (which encodes a prion-like protein designated as Doppel or Dpl), with the recently
discovered PRNT (that encodes the prion protein testis specific - Prt) and with SPRN (shadow of prion protein gene,
that encodes Shadoo or Sho) genes, to the so called „„prion gene family”. Whereas a role for PRND in the proper
functioning of the male reproductive system has been confirmed, the function of the recently discovered prion
family gene, PRNT, comprises a conundrum, and led to the assumption that ruminant PRNT is a pseudogene, with
no protein expression. The main intention of this work was to detect the presence of Prt at the sheep reproductive
tract. For that purpose, ovine tissue specimens, including testis, ovary, brain stem and spleen, were collected in a
slaughterhouse. We also collected several semen ejaculates from ram belonging to the Churra Galega Mirandesa
breed. Smears from the previously mentioned specimens and semen, were fixed with methanol. Synthesized sheep
Prt was used to immunize a group of BALB/c mice. After antibody titer screening by ELISA, serum was chosen for
immunolocalization assays. Binding of mouse anti-sheep-Prt primary antibody was detected with indirect
immunofluorescence, with goat anti mouse IgC secondary antibody. Immunofluorescence assays suggest that Prt is
present at the spermatozoa acrosome, but not at the ovine ovary, brain stem and spleen. Production of the previously
described novel mouse polyclonal antibody, allowed for Prt immunolocalization at the ram spermatozoa acrosome,
demonstrating for the first time the presence of Prt in ruminants, pointing the importance of this protein in the
reproductive field.
48
Localização do Factor de Necrose Tumoral (TNF) no espermatozóide de Cão e de Porco
Siqueira, A.P.1, Santana, I.2*, Gonzalez Herrero, R.3, Ström-Holst, B. 3, Payan-Carreira, R.2**
1 Dept. of Clinical Sciences, UFMG, Brazil.
2 CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
3 Dept. of Clinical Sciences, Swedish University of Agricultural Sciences (SLU), Sweden
O Factor de Necrose Tumoral (TNF), uma citoquina pró-inflamatória, é actualmente considerado como um dos
constituintes regulares do plasma seminal de mamíferos, estando relacionado com a motilidade e a viabilidade do
espermatozóide (Spz) no genital feminino. Até agora não tinha ainda sido localizado no Spz. Neste trabalho procurase a localização da proteína de TNF em Spz de cão e de porco, e estudar a sua distribuição sub-celular recorrendo a
uma técnica de imunocitoquímica (ICC). Para cada uma das espécies estudadas, utilizaram-se 5 animais de
fertilidade comprovada. As citologias realizaram-se a partir de uma gota de ejaculado fresco, diluída em igual
volume de BTS (Beltsville Thawing Solution; IMV Technologies), fixadas em álcool a 95%. Utilizou-se na ICC
utilizada um método de estreptavidina-biotina-peroxidase com recurso a um polímero como sistema de detecção
(Novolink Polymer Detection System, Novocastra). Usou-se um anticorpo primário monoclonal (sc-80386; Santa
Cruz Biotechnology, Inc., Europe, Heidelberg, Germany) numa diluição de 1:50, com incubação de 16h a 4ºC.
Como controlo negativo recorreu-se à substituição do anticorpo primário por PBS. A quantificação da marcação fezse numa escala de intensidades de 0 a 3 pontos (marcação negativa a forte), em 10 campos de microscópio em
ampliação de 1000x, e foi registada ainda a localização celular do TNF. Encontrou-se marcação positiva para o TNF
tanto no Spz de cão como de porco. Todos os Spz do ejaculado a fresco evidenciaram de forma consistente uma
marcação forte para esta molécula, estando esta marcação limitada à peça intermédia do espermatozóide.
Este trabalho demonstra, pela primeira vez, a existência de TNF no espermatozóide, e dado ter sido encontrada em
duas espécies distintas sugere-se que a sua presença seja comum às demais espécies de mamíferos domésticos. A
sua localização sub-celular é sugestiva de que possa desempenhar um papel na motilidade do Spz.
Inês Santana foi financiada por uma Bolsa de Integração na Investigação da FCT (BII/UNI/0772/AGR/2009)
Rita Payan Carreira foi financiada por uma Bolsa de Licença Sabática, da FCT (SFRH/BSAB/938/2009)
[Tumour Necrosis Factor (TNF) localization in boar and dog spermatozoa]
Tumour necrosis factor (TNF) is a pro-inflammatory cytokine, now regarded as a natural component of the
mammalian seminal plasma and has been positively associated to spermatozoa (Spz) motility and viability,
particularly in the female genital tract. So far, TNF presence within the Spz was unknown. The aim of this study was
to assess whether or not TNF is present in boar and dog spermatozoa from fresh ejaculates and to evaluate its subcellular localization, by using an immunocytochemistry (ICC) approach. For each species, fresh ejaculates from 5
males of proven fertility were used. Cytological preparations for ICC were performed diluting one sample of fresh
semen with equal volume of BTS (Beltsville Thawing Solution; IMV Technologies), which were fixed in 95%
ethanol. We used a streptavidin-biotin-peroxidase method and a polymeric labelling methodology (Novolink
Polymer Detection System, Novocastra). A monoclonal primary antibody (sc-80386; Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Europe, Heidelberg, Germany) was used, at a 1:50 dilution, with an incubation time of 16h at 4ºC. For negative
controls, the primary antibody was replaced by PBS. Positive immunoreaction against TNF was scored according to
an intensity score from 0 to 3 (negative to strong), on 10 different fields at 1000x magnification. Sub-cellular
localization was also registered. Positive immunoreaction was observed in all fresh boar and dog ejaculates where
sperm cells consistently evidenced strong immunostaining for TNF. Immunoexpression was restricted to the cell
mid-piece. For the first time this work provides evidences of TNF presence in the spermatozoon. The intensity of
immunoreactions and the sub-cellular localization was similar between the species used in this study, suggesting that
TNF presence is expectable in the spermatozoa from other domestic mammals. Furthermore, its sub-cellular
localization suggests that this molecule may play a role in Spz motility.
49
Efeito de diferentes suplementações proteicas na maturação nuclear e fragmentação de DNA de
oócitos caninos após cultura in vitro
Lopes, G.1,2, Rocha, A.1,2
2 Centro de Estudos de Ciência Animal (CECA), Instituto de Ciências e Tecnologias Agrárias e Agro-Alimentares (ICETA), Universidade do
Porto, Portugal
O objectivo deste estudo foi o de investigar o efeito da utilização de diferentes suplementações proteicas, na
maturação nuclear e fragmentação do DNA em oócitos caninos após cultura in vitro. Para tal, os ovários de 7
cadelas, recolhidos após ovariohisterectomia de rotina, foram sujeitos a cortes repetidos no córtex com um bisturi de
forma a obter os complexos cumulus-oócito (COCs). De seguida, foram seleccionados para maturação in vitro
(IVM) os COCs que apresentavam um cumulus compacto com várias camadas e um citoplasma escuro, homogéneo
e com um diâmetro superior a 100m. Um número idêntico de COCs por cadela foi usado para IVM em cada um de
quatro grupos experimentais. Os grupos experimentais consistiram em TCM-199 suplementado com: 0,3% BSA
(BSA-grupo); 10% de plasma de cadela em cio inactivado pelo calor (OBP), recolhido antes do pico de LH (OBP1grupo); 10% de OBP recolhido entre o pico de LH e ovulação (OBP2 -group); 10% de OBP recolhido após a
ovulação (OBP3-grupo). Os COCs foram cultivados durante 72 horas a 39 ºC em atmosfera húmida com 5% de
CO2. Após cultura, os COCs foram lavados, as células cumulus removidas e os oócitos foram fixados num solução
de paraformaldeído 4%. De seguida, a fragmentação do DNA e a configuração nuclear dos oócitos foram avaliadas
utilizando o ensaio de TUNEL (Roche, Mannheim, Alemanha) e a coloração de Hoechst 33342, respectivamente. O
teste de Kruskal-Wallis foi usado para comparar as configurações nucleares e de fragmentação do DNA entre
grupos. As diferenças entre proporção de oócitos com fragmentação de DNA em cada uma das configurações
nucleares observadas foram avaliadas pelo teste de qui-quadrado. Diferenças com p<0.05 foram considerados
significativas. Apenas uma pequena percentagem dos oócitos (7,4-12,7%) apresentou DNA intacto após cultura e
nesta categoria não se observaram diferenças entre os grupos experimentais para cada estádio de configuração
nuclear. Não houve diferenças entre os grupos experimentais na percentagem de oócitos que atingiu metáfase II
(MII). Apenas 2% dos oócitos cultivados chegou MII, mas 85,7% destes tinham DNA intacto. Por outro lado, todas
as outras configurações nucleares apresentaram uma alta proporção de oócitos com fragmentação de DNA (vesícula
germinativa 79,8%; reinício de meiose 73,3%; não classificáveis 95,2%). Em conclusão, após cultura in vitro, uma
elevada percentagem dos oócitos caninos que não completam a maturação meiotica até MII estão degenerados,
enquanto uma alta proporção dos oócitos em MII têm DNA intacto, independentemente do suplemento proteico
utilizado.
[Nuclear maturation and DNA fragmentation in canine oocytes after in vitro culture with different
protein supplementations]
The aim of the present study was to investigate the effect of different protein supplementation on meiotic nuclear
configuration and DNA fragmentation of dog oocytes cultured in vitro. For that, ovaries of pubertal bitches (N=7),
obtained after routine ovariohysterectomy, were sliced repeatedly in a phosphate-buffered-saline solution
supplemented with bovine serum albumin (0.1% BSA) to release the cumulus-oocyte complexes (COCs). Under the
stereomicroscope, COCs presenting a multilayered compact cumulus and a dark, homogeneous cytoplasm, with a
diameter over 100 µm were selected for in vitro maturation (IVM). A similar number of COCs per bitch was used
for IVM in each of four experimental groups. Experimental groups consisted in TCM-199 supplemented either with
0.3% BSA (BSA-group) or with 10% bitch heat inactivated plasma (OBP) collected before the LH peak (OBP1group) or OBP collected between the LH peak and ovulation (OBP2-group) or OBP collected after ovulation
(OBP3-group). COCs were cultured for 72 hours at 39 ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. After
culture, COCs were washed and denuded of all cumulus-cells. Oocytes were then fixed in 4% paraformaldehyde
solution overnight. Subsequently, oocyte DNA fragmentation and nuclear configurations were assessed using the
TUNEL assay kit (Roche, Mannheim, Germany) and Hoechst 33342 staining, respectively. Kruskal-Wallis ANOVA
was used to compare oocyte chromatin configurations and DNA fragmentation between groups. Differences in the
proportion of intact DNA oocytes in each chromatin configurations were assessed by chi-square test. Differences at
p<0.05 were considered significant. Only a small percentage of the oocytes (7.4-12.7%) had intact DNA after
culture and within these, no differences were observed between groups in number of oocytes at each chromatin
configuration stage. No differences in the percentage of oocytes reaching metaphase II (MII) were observed between
experimental groups. Still, only 2% of cultured oocytes reached MII, but 85.7% of these had intact DNA.
Conversely, all other chromatin configurations presented a high proportion of fragmented DNA (germinal vesicle
79.8%; meiosis resumption 73.3%; unclassified 95.2%). In conclusion, a high percentage of canine oocytes that do
not complete meiotic maturation to MII are degenerated, whereas a high proportion of MII oocytes have intact
DNA, independently of the protein supplement used.
50
Suplementação de ovelhas Merino Branco com Lupinus albus: efeito sobre alguns indicadores
metabólicos e reprodutivos
Cavaco-Gonçalves, S.1*, Viana A, Fradinho, M.J.2, Cunha, T.P.1, Baptista, M.C.1, Barbas, J.P.1, Marques, C.C.1,
Vasques, M.I.1, Horta, A.E.M.1, Mascarenhas, R.1, Caldeira, R.M.2
*
correspondente: [email protected]
A suplementação de ovelhas durante 6 dias com semente de tremoço tem sido associada a aumentos significativos
da taxa de ovulação. Contudo, a justificação para esse acréscimo não é ainda conhecida, admitindo-se que possa ter
origem no aumento da ingestão de energia e/ou de proteína, ou em alguma especificidade do tremoço.
Estudou-se o efeito de dietas com e sem tremoço (Lupinus albus) sobre alguns indicadores metabólicos (ureia,
albumina, glucose, ácidos gordos não esterificados e insulina) e reprodutivos (fertilidade e prolificidade).
Utilizaram-se 45 ovelhas Merino Branco em condição corporal estável (2,5), sujeitas a um protocolo de
sincronização do estro pela aplicação de esponjas vaginais com progestagénio (D0-D6) e prostaglandina F2α (D5).
De D-18 a D-5 os animais receberam a mesma dieta: 1 kg de feno de azevém e 0,2 kg de alimento composto
animal/dia. Em D-4 formaram-se 3 grupos experimentais (n=15). De D-4 a D0 foi feita a introdução gradual das
dietas de ensaio, utilizadas entre D1 e D6 e que incluíram 1 kg de feno de azevém complementado com 0,48 kg de
cevada, 0,15 kg de bagaço de girassol e 0,341 kg de bagaço de soja (grupo GC); 0,2 kg de cevada e 0,4 kg de
tremoço (grupo GT400); e 0,2 kg de cevada e 0,6 kg de tremoço (grupo GT600). As dietas dos grupos GC e GT600
eram isoproteicas e isoenergéticas. Em D7 foram introduzidos os machos para a cobrição natural. As concentrações
séricas dos indicadores metabólicos (ureia, albumina, glucose, ácidos gordos não esterificados e insulina) foram
avaliadas em 10 animais/grupo, antes da primeira refeição, nos dias -5, 2, 4, 6 e 14.
Os valores dos indicadores metabólicos obtidos indicam que os animais se encontravam nutricionalmente
equilibrados. A concentração de ureia aumentou de D1 a D6 no grupo GC, mas não no grupo GT600, sugerindo que
o tremoço poderá ter uma melhor relação proteína/energia ou uma proteína com menor degradabilidade ruminal. A
concentração de glucose aumentou em D2 e em D4 em todos os grupos, não apresentando diferenças entre eles.
Contudo, em D2 a concentração de insulina do grupo GC foi superior à do grupo GT400 (p>0,05) e à do grupo
GT600 (p<0,05), o que poderá resultar do tipo de glúcidos presentes no tremoço. A ausência de diferenças
significativas nas taxas de ovulação e de fertilidade, entre animais utilizando dietas isoproteicas e isoenergéticas,
sugere que a maior taxa de ovulação após a suplementação com tremoço observada por outros autores, se poderá
dever ao aumento do fornecimento de energia e/ou de proteína e não a qualquer particularidade daquela semente.
[Supplementation of Merino Branco ewes with Lupinus albus: effect on some metabolic and
reproductive parameters]
Supplementation of ewes for 6 days with lupin seed has been associated to significant increases on ovulation rate.
However, the reason for that increment is not yet known, assuming that can be caused by the increase on energy
and/or protein given, or by any specificity of the lupin.
It was studied the effect of diets with and without lupin (Lupinus albus) on some metabolic (urea, albumin, glucose,
non-esterified fatty acids, and insulin) e reproductive (fertility and prolificacy) parameters. Forty-five Merino
Branco ewes with a stabilized body condition score of 2.5 were used. Oestrus was synchronized on all animals with
progestagen vaginal sponges (D0-D6) and PGF2α (D5). Between D-18 and D-5 animals were fed with the same diet:
1 kg of ray grass hay and 0.2 kg of concentrate animal/day. On D-4 three experimental groups were formed (n=15).
From D-4 to D0 experimental diets were gradually introduced to ewes. Experimental diets, which were given
between D1 and D6, consisted of 1 kg ray grass hay supplemented with 0.48 kg barley, 0.15 kg sunflower meal and
0.341 kg soybean meal (group GC); 0.2 kg barley and 0.4 kg lupin (group GT400); and 0.2 kg barley and 0.6 kg
lupin (group GT600). Diets of groups GC and GT600 had the same amount of protein and energy. On D7 males
were joined to ewes for mating. Serum concentrations of metabolic parameters (urea, glucose, albumin nonesterified fatty acids, and insulin) were evaluated on 10 animals of each group on samples collected before the
morning meal, on days -5, 2, 4, 6, and 14.
The values of metabolic parameters indicate that ewes were on a balanced nutritional status. Urea concentration
increased between D1 and D6 on group GC, but not on group GT600. This suggests that lupin might have a better
balance between protein and energy contents, or even a protein with lower ruminal degradability. Glucose
concentration was not different between groups, increasing between D2 and D4. However, on D2 insulin
concentration on group GC, was higher than the one of group GT400 (P>0.05) and than the one of group GT600
(P<0.05), which might be a consequence of the type of carbohydrates present in the lupin seed. The absence of
differences between ovulation and fertility rates when using diets with the same amount of protein and energy
suggests that increases on ovulation rate after lupin supplementation observed by others, is due to the increment in
energy or protein given and not to any particular component of lupin.
51
Efeito do tratamento de ejaculados de garanhão com Androcoll-E na qualidade dos
espermatozóides após a descongelação
Guimarães, T.1,2, Moreira, A.1,2, Lopes, G.1,2, Ferreira, P.1,2, Rocha, A.1,2
2 CECA-ICETA, Universidade do Porto, Portugal
Objectivo: Testar o efeito do tratamento Androcoll-E na congelabilidade de sémen de garanhão.
Metodologia: Foram recolhidos 6 ejaculados de 6 garanhões utilizando vagina artificial (VA). Imediatamente após a
colheita foi feita a avaliação computorizada do sémen utilizando o “Integrated Sperm Analisys System”, (ISAS)
tendo-se medido os seguintes parâmetros: motilidade progressiva (MP), motilidade total (MT), velocidade linear
(VSL), % de espermatozóides com velocidade alta (% spz rápidos) e velocidade média (VAP). Foi ainda avaliada a
motilidade progressiva subjectiva (MPS) ao microscópio óptico. Cada ejaculado foi dividido em duas amostras
iguais, sendo uma, não tratada (GC) centrifugado por 10 min a 900 g e a outra (GT) foi centrifugado com AndrocollE® (20 min, 500 g). Após a centrifugação, os pellets obtidos nos 2 grupos foram diluídos (200x10 6 spz/ml) no meio
de congelação, Botucrio® e 10 palhetas de 0,5 ml foram congeladas para cada grupo de acordo com protocolo
descrito por Alvarenga et al. (2005). Após descongelação (1 min a 37 ºC) o sémen de uma palheta de cada grupo foi
analisado para os parametros acima descritos. Para comparação dos parâmetros entre grupos foi utilizado o teste de
Mann-Whitney.
Resultados: Os valores obtidos (média ± erro padrão) para os parâmetros do sémen fresco foram: MPS-45±1,8%;
MP-38,0±4,1%; MT-74,4±5,4%; VSL-23,9±2,7µm/seg; VAP-41,4±4,4 µm/seg; % spz rápidos-21,6±4,6%. Não
houve diferenças (p>0,05) entre os dois grupos experimentais após descongelação: GC (MPS-33,3±3,8%; MP20,4±%; MT-43,7±5,3%; VSL-22,4±3,0 µm/seg; VAP-33,5±3,3 µm/seg; % spz rápidos-7,4±2,2%); GT (MPS35,8±10,4%, MP-23,4±9,8%, MT-44,3±12,5%, VSL-26,0±5,0 µm/seg, VAP-34,8±5,6 µm/seg, % spz rápidos6,8±3,3%). Os dados avaliados para os 6 ejaculados não evidenciaram um efeito positivo do Androcoll-E nos
parâmetros do sémen congelado/descongelado. Contudo, é de salientar que em 2 dos 6 ejaculados (33,3% da
amostra) obtiveram-se melhores resultados após a descongelação para o sémen tratado, em particular para MPS
(65% e 70% para GT vs 35% e 40% para GC) e para MP (47,6% e 59,0% para GT vs 21,3% e 33,8% para GC). Para
estes 2 ejaculados a MPS e a MP do sémen tratado foram mesmo superiores dos valores obtidos para o sémen fresco
(MPS 45% e 40% e MP 38,6% e 24,3%). Os dados são sugestivos de um efeito positivo do Androcoll-E® na
congelabilidade do sémen apenas para alguns garanhões.
Referencia: Alvarenga et al. (2005). Anim. Repro. Sci. 89:105-113.
[Effect of Androcoll-E treatment on the frozen/thawed characteristics of equine semen]
Objective: To test the effect of a single layer centrifugation treatment (Androcoll-E ), on the freezability of stallion
semen
Experimental method: Six ejaculates from 6 stallions were collected by artificial vagina (AV). Immediately after
collection ejaculates were evaluated with the Integrated Sperm Analysis System (ISAS) for the following
parameters: progressive motility (MP), total motility (MT), linear velocity (VSL), % of spermatozoa with high
velocity (% HVSPZ), and average velocity (VAP). Subjective progressive motility (MPS) was assessed by optical
microscopy. Ejaculates were split in two equal samples and the control sample (GC) was centrifuged for 10 min at
900 g and the Androcoll-E treated group (GT) was centrifuged for 20 min at 500 g. Afterwards the remaining
pellets in both groups were diluted (200x10 6 SPZ/mL) in Botucrio extender, and ten 0.5 mL straws were frozen
for each treatment, accordingly to Alvarenga et al. (2005). After thawing (1 min at 37ºC) the semen of one straw
from each treatment was evaluated for the above described parameters. The Mann-Whitney test was used to
compare parameters between the 2 treatments.
Results: The mean±standard error of the evaluated parameters for fresh semen was: MPS-45±1.8%; MP-38.0±4.1%;
MT-74.4±5.4%; VSL-23.9±2.7m/s; VAP-41.4±4.4m/s; % HVSPZ-21.6±4.6%. No differences (p>0,05) were
seen between the 2 experimental groups after thawing: GC (MPS-33.3±3.8%; MP-20.4±%; MT-43.7±5.3%; VSL22.4±3.0 µm/s; VAP-33.5±3.3 µm/s; % HVSPZ-7.4±2.2%); GT (MPS-35.8±10.4%, MP-23.4±9.8%, MT44.3±12.5%, VSL-26.0±5.0 µm/s, VAP-34.8±5.6 µm/s, % HVSPZ-6.8±3.3%). These data failed to show an
advantage of the Androcoll-E treatment in the frozen/thawed parameters of the 6 ejaculates. However, it should be
noted that in 2 ejaculates (33.3% of the sample) the post-thawing parameters were better for the GT samples, in
particular for MPS (GT 65% and 70% vs GC 35% and 40%) and for MP (GT 47.6% and 59.0% vs GC 21.3% and
33.8%). For these 2 ejaculates the MPS and MP percentages in the GT group were even higher than in the fresh
semen (MPS 45% and 40%; MP 38.6% and 24.3%). It is suggested that Androcoll-E treatment can enhance
freezability only in a stallion-dependent manner.
52
Avicultura
Avicultura = perigo???
José João Sousa Nunes
TNA Tecnologia e Nutrição Animal Lda.
O tema pode parecer polémico, face à informação que normalmente é veiculada à opinião pública, mas o objectivo
principal desta apresentação tem a ver com a correcta informação sobre o tema, e qual o importante papel do Médico
Veterinário no processo.
É feita uma pequena revisão sobre os eventuais riscos inerentes ao consumo de produtos avícolas, assim como quais
as medidas a implementar no sentido de obter um produto final de qualidade.
A produção avícola, como aliás toda a produção animal, não é uma ciência exacta. Não existem dois casos iguais, e
mesmo os que parecem iguais podem exigir soluções e modos de actuar diferentes. Tem de existir um
acompanhamento constante e correcto e uma adaptação precisa dos procedimentos a cada realidade.
[Poultry production = danger??]
The theme may seem controversial to the public, but the main purpose of this communication is related to the
correct information on the subject, and the role of the veterinarian in the process.
There is a short review on the possible risks associated with consumption of poultry products, as well as the
measures to be implemented in order to obtain a final product of quality.
Poultry production, like all animal production, is not an exact science. Two equal cases do not exist, and even those
that look alike, may need different solutions and may require different ways to proceed. There must be a constant,
correct and precise adaptation of procedures in each situation in the field.
53
Detecção de estirpes virulentas do vírus da doença de Gumboro em frangos vacinados
Fagulha, T.1, Henriques, A.M.1, Duarte, M. 1, Ramos, F.1, Barros, S.C.1, Luís, T.1, Duarte, I.2, Fevereiro, M.1
1 Departamento de Virologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
2 Ceva Saúde Animal, Lda, Miraflores, Algés, Portugal
A doença de Gumboro é uma doença aguda de frangos jovens, imunossupressora e altamente contagiosa. O agente
etiológico é o vírus da doença de Gumboro (IBD), um vírus sem envelope e icosaédrico da família Birnaviridae,
com um genoma bisegmentado de RNA de cadeia dupla. Os sintomas são geralmente observados entre 3 e 6
semanas e incluem diarreia esbranquiçada ou aquosa, anorexia, depressão, penas eriçadas, tremores e prostração
intensa. Também se observa necrose da bolsa de Fabricius e depleção de linfócitos B, responsável por
imunossupressão. A vacinação é utilizada no controlo da doença, mas é necessário que ocorra numa idade precoce,
antes do desaparecimento dos anticorpos maternos. Os vírus IBD podem ser agrupados em estirpes clássicas, muito
virulentas ou variantes. A morbilidade geralmente atinge 100%, enquanto a mortalidade depende da estirpe
envolvida, 30% a 60% para as estirpes clássicas e 70% a 100% para as muito virulentas. Normalmente não se
observa mortalidade em frangos infectados com estirpes variantes, embora a atrofia da bolsa seja evidente. A
proteína estrutural VP2 foi inicialmente identificada como responsável pela virulência, mas as proteínas VP1 e VP4
provaram estar também envolvidas. O principal epitopo neutralizante da proteína VP2 está localizado num
fragmento de 145 aminoácidos, a região hipervariável (HVR), e alterações de aminoácidos nesta região podem
originar variação antigénica.
Foi introduzido recentemente em Portugal um programa de vacinação in ovo com uma estirpe variante viva
atenuada. De modo a estudar a disseminação do vírus na bolsa de aves vacinadas, procedeu-se à detecção molecular
do genoma do vírus IBD em bolsas colhidas regularmente ao longo do tempo. Foi amplificado por RT-PCR um
fragmento de 491 pb do gene que codifica a região hipervariável da proteína VP2 e a sequência de nucleótidos do
fragmento obtido foi determinada. O vírus IBD foi detectado em quase todas as aves, mas principalmente a partir
dos 21 dias de idade. O alinhamento da sequência de aminoácidos prevista revelou a existência de duas populações
distintas. Numa população, a sequência de aminoácidos é semelhante à da estirpe vacinal, enquanto na outra
população foram observadas mutações características das estirpes muito virulentas. Além das alterações descritas,
P222A e V256I, foram também detectadas as mutações N299S, V242I e T270A.
A identificação de genótipos diferentes do vírus IBD nos isolados de campo permitiu a detecção de mutantes
emergentes com capacidade de escapar à imunidade conferida pelas vacinas comerciais.
[Detection of very virulent infectious bursal disease virus in vaccinated broilers]
Infectious bursal disease (IBD), usually referred as Gumboro disease, is an acute and highly contagious
immunosuppressive disease of young chickens. The etiological agent is infectious bursal disease virus (IBDV), a
nonenveloped, icosahedral virus of the Birnaviridae family with a bisegmented, double-stranded RNA genome. The
clinical signs are usually observed between 3 and 6 weeks and include whitish or watery diarrhea, anorexia,
depression, ruffled feathers, trembling, and severe prostration. Necrosis of the bursa of Fabricius and depletion of B
lymphocytes, resulting in immunosuppression is also observed. Vaccination is used by the poultry industry to
control IBD, but it is necessary to vaccinate poultry at an early age, before the disappearance of maternal antibodies.
IBDV can be grouped into classical, very virulent or variant strains. The morbidity usually reaches 100% for all
strains while the mortality varies widely with strain, 30% to 60% in classic strains and 70% to 100% in very virulent
strains. There is usually no mortality in chickens infected with variant strains, although bursal atrophy is severe. The
contribution to virulence was initially identified in the structural protein VP2 but VP1 and VP4 have proven to be
also involved. The major neutralizing epitope of VP2 is located within the 145 amino acid fragment known as the
hypervariable region (HVR) and certain amino acid changes in this site may cause antigenic variation.
A vaccination programme in ovo with a live attenuated variant strain was recently introduced in Portugal and in
order to monitor the spread of the virus in the bursa of vaccinated birds, the molecular detection of IBDV genome
was performed. The bursas collected regularly during time were used for RNA extraction. An amplicon of 491 bp of
the hypervariable region of VP2 encoding gene was amplified by RT-PCR and the nucleotide sequence of the
amplified fragment was determined. IBDV was detected in almost all birds, but mainly around the age of 21 days.
The alignment of the predicted amino acid sequence showed two distinct populations. In one population the amino
acid sequence is similar to that of the vaccine strain, but in the other population, the mutations characteristic of very
virulent strains were observed. Additionally to the described changes P222A, V256I, and N299S also mutations
V242I and T270A could be detected.
The identification of different IBDV genotypes in field isolates allowed the detection of emerging IBDV mutants
with the ability to break through the immunity to commercial IBDV vaccines.
54
Perfil parasitológico em frangos do campo
Baptista, A.1, Sousa Nunes, J.J., Pereira da Fonseca, I.1
2 TNA, Tecnologia e Nutrição Animal, Lda., Aveiras de Cima, Portugal
A prevalência da maior parte das doenças parasitárias em avicultura dita industrial, tem vindo a diminuir com o
passar dos anos. Uma das principais causas para este facto foi o avanço e evolução que esta actividade teve a nível
de maneio, higiene e sistema de produção. Contudo, em relação à criação de frangos de campo, devido ao modo
como é feita essa criação, ao ar livre a partir de certa idade, as aves podem ficar expostas a um grande número de
possíveis hospedeiros intermediários que veiculam potenciais parasitas, estando assim em teoria, mais predispostos
a desenvolver certas doenças parasitológicas em relação aos frangos criados de forma industrial. O principal
objectivo deste estudo foi caracterizar o perfil parasitológico do frango do campo através da utilização de diferentes
exames parasitológicos.
Diferentes técnicas de diagnóstico (análise fecal e de penas e observação de esfregaços sanguíneos) foram utilizadas
para identificar a fauna parasitológica em 270 amostras (90 de fezes, 90 de sangue e 90 de penas) colhidas em
frangos do campo divididos por três grupos etários: GE1, desde o dia em que os animais são libertos para o exterior
até aos 60 dias; GE2, desde os 61 dias até aos 75 dias; e GE3, desde os 76 dias até ao abate.
Os resultados obtidos permitem afirmar que os parasitas mais comuns em frangos do campo nos distritos de Viseu e
Guarda, em Portugal, são protozoários do género Eimeria, sendo a espécie E. mitis a mais identificada nos três
grupos etários; helmintas de ciclo directo tal como Ascaridia galli principalmente no GE1, Strongyloides avium e
Heterakis gallinarum e hemoparasitas do género Leucocytozoon e Plasmodium. O género Plasmodium foi o
hemoparasita mais frequentemente observado nos três grupos etários, especialmente no GE1 e GE2 e foi mais
frequente observado em frangas. Em relação aos ectoparasitas, a observação directa não permitiu a visualização de
nenhum parasita, quer nas penas quer na pele. No entanto, observaram-se várias penas que possuíam sinais da acção
das mandíbulas de piolhos malófagos.
Este trabalho, pioneiro na avicultura extensiva de frangos de campo em Portugal, pretendeu contribuir para o
conhecimento das parasitoses que afectam estes animais de produção e para a profilaxia das mesmas.
[Parasitological profile in free range chickens]
The prevalence of most parasitic diseases in poultry seems to have been reduced significantly in indoor poultry
production, due to improved housing, hygiene and management. However, parasitic diseases continue to be of great
importance in free-range systems mainly because of their production system. The theoretical probability of free
range chickens having parasites is high because of their relative freedom and exposure to intermediate hosts or
vectors which can carry parasites. The objective of this study was to characterize a parasitological profile in free
range chickens. In this study a number of different parasitological diagnostic techniques (e.g. fecal material
examination, feather examination, blood smears) were used to discover both the internal and external parasitological
burdens in a selection of 270 samples (90 of faecal material, 90 blood smears and 90 samples for feather
examination) from free range chickens divided into three age groups: GE1, from the day chickens are released to the
exterior park until 60 days of age; GE2, from 61 days to 75 days of age and GE3, from 76 days until slaughter.
The results show that the most common parasite to be found in free range chickens in Viseu and Guarda districts
(Portugal) is the protozoon Eimeria. E. mitis was the species most commonly found in all ages. Other commonly
found parasites are helminths with a direct cycle such as Ascaridia galli (especially in GE1), Strongyloides avium
and Heterakis gallinarum and hemoparasites such as Leucocytozoon and Plasmodium. Plasmodium spp was the
most frequently seen hemoparasite in all age groups, but was especially prevalent in GE1and GE2, and was also
more frequently seen in female chickens. No ectoparasites were seen upon direct examination of certain chickens,
and therefore no specific conclusion was reached in this regard. However, signs of chewing lice were noted on the
feather samples obtained for examination
This study, the first of its kind in free range chickens in Portugal, intended to contribute with a more specific
knowledge about their parasites and their prevention.
.
55
Protecção dos frangos nos locais de criação
Maria Jorge Antunes Correia
Direcção-Geral de Veterinária
A Directiva 2007/43/CE do Conselho, de 28 de Junho, a qual foi transposta para a ordem jurídica nacional através
do Decreto-Lei nº 79/2010, de 25 de Junho, vem estabelecer um conjunto de disposições relativas à protecção dos
frangos nos locais de criação. Assim sendo e consoante a densidade animal praticada nos pavilhões, vão ser
obrigatórios um conjunto de requisitos a nível dos pavilhões, nomeadamente no que se refere à alimentação,
controlo ambiental, registos, limpeza e desinfecção, etc.. Tendo em conta as densidades praticada nos pavilhões, os
requisitos a cumprir são os seguintes:
•
≤ 33 kg/m2 - requisitos básicos (alimentação, registos, limpeza e desinfecção, iluminação, etc..);
•
33 kg/m2 e 39 kg/m2 - requisitos extra em termos de controlo ambiental e aprovação prévia (notificação e
documentação);
•
39 kg/m2 e 42 kg/m2 - requisitos extra, controlo anual na exploração e avaliação sistemática no matadouro
(7 bandos seguidos).
Complementarmente, a presente legislação, estabelece o sistema de avaliação do Bem Estar dos frangos a nível do
matadouro, o qual consiste numa avaliação sistemática de parâmetros de Bem Estar, pelo Médico veterinário oficial
do matadouro.
Todos os bandos de frangos que se destinem ao matadouro tem que ser sujeitos a um sistema de avaliação de Bem
Estar no matadouro, sendo que os resultados desta avaliação terão impacto sobre a produção e muito em especial
sobre o maneio e condições dos pavilhões. Sempre que existir um resultado insatisfatório no matadouro, o detentor
dos animais terá que tomar as medidas adequadas para evitar que o problema se volte a verificar. Caso se trate de
uma situação excepcional o detentor poderá apresentar uma justificação para a sua ocorrência. No entanto caso a
situação persista cabe ao detentor elaborar um plano de acção que previna a ocorrência da anomalia detectada
Para além disso as explorações e os pavilhões com maus resultados no matadouro, serão sujeitas a um
acompanhamento mais frequente por parte dos técnicos da DGV.
Pretende-se assim, através de parâmetros de avaliação pré-definidos, obter um historial das explorações e muito em
particular do Bem Estar e saúde dos frangos a nível dos pavilhões, actuando-se a este nível, sempre que os
resultados no matadouro sejam repetidamente insatisfatórios.
56
Alimentos – Segurança Sanitária
O ciclo ambiental das resistências antimicrobianas
Paulo Martins da Costa1,2, Romeu Simões1,2, Liliana Martins1,3 e Augusto J.F. Matos1,3
2 CIIMAR - Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental, Universidade do Porto, Portugal
3 UMIB - Centro Multidisciplinar para a Investigação Biomédica, Universidade do Porto, Portugal
A resistência aos antimicrobianos é um efeito com muitas causas e uma causa com muitos efeitos. Este fenómeno,
assente na plasticidade genética das bactérias, emergiu em consequência da pressão selectiva resultante do uso de
antibióticos em medicina humana, medicina veterinária, produção pecuária, aquacultura, agricultura e tecnologia
alimentar; exacerbou-se pela densidade selectiva resultante da sobre-prescrição de antibióticos e da ampliação das
necessidades de prescrição em medicina humana consequente ao acréscimo dos procedimentos médicos invasivos e
ao aumento do número de pacientes imunocomprometidos ou com doenças crónicas debilitantes; globalizou-se pela
mobilidade crescente de pessoas e mercadorias (alimentos) e pela inexistência de barreiras ambientais entres as
diferentes comunidades vivas. Somente uma abordagem holística, capaz de identificar as inúmeras possibilidades de
transferência destes microrganismos resistentes entre nichos ecológicos interligados, possibilita a compreensão
plena dos efeitos selectivos dos antibióticos. Esta proposta de avaliação interdisciplinar - erigida sobre o lema “One
Health” - pretende encorajar a colaboração entre médicos, veterinários e ambientalistas com o intuito de
compreenderem este, e outros problemas, encontrando soluções multidisciplinares para proteger e promover a saúde
de todas as espécies.
[Environmental dissemination of drug-resistant bacteria between intermingled ecological niches]
Antimicrobial resistance is an effect with many causes and a cause with many effects. This phenomenon, based on
genetic plasticity of bacteria, has emerged as a consequence of the selective pressure exerted by the antimicrobial
usage in human medicine, veterinary medicine, animal production, fish production, agriculture and food technology.
Antimicrobial resistance has exacerbated due to antibiotics over-prescription and increased use in human medicine,
as a consequence of the growing number of invasive medical procedures and the enormous increase in the number
of immunocompromised individuals and patients with chronic debilitating diseases. The increasing mobility of
people and food products, as well as an absence of environmental barriers between different living communities,
raise the risk of the spread of resistance world-wide. Antimicrobials are essential to save lives. Because resistance is
becoming increasingly widespread without any plausible relationship with the use of antimicrobials, it is necessary
to seriously consider other strategies in order to prevent the emergence and dissemination of antimicrobial resistant
bacteria. These strategies require a more holistic and forward-looking approach that take the complex
interconnections among species into full account, recognizing the important link between human and animal health
in accordance with the Manhattan principles on “One World, One Health”.
57
Doenças Infecciosas Emergentes: uma solução global para um problema global
Malta Reis, A.1, Almeida, V.1, Batalha, A.2
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica (TULisbon), Portugal
2 Médica-Veterinária e Assessora em Questões SPS, em Bruxelas, Bélgica
O século XXI continua ensombrado por doenças como o HIV/Sida, a Malária, a Raiva, a vCJD, a Febre
Hemorrágica Ebola ou a Gripe Aviária (H5N1). Estas doenças têm em comum o facto de serem consideradas
Doenças Infecciosas Emergentes (DIEs). A maioria das Doenças Infecciosas Emergentes são zoonoses (60.3%)
sendo que 71,8% têm origem na fauna selvagem (Jones et al., 2010).
A maioria dos eventos de DIEs registados nas últimas décadas localizaram-se em países em desenvolvimento, com
impactos negativos sobretudo em populações com elevados índices de pobreza. Paradoxalmente, o volume de carne
e de leite produzidos nesses países ultrapassou a produção dos países desenvolvidos e prevê-se que nas próximas
duas décadas, a procura global de leite e carne aumente 55%, acompanhando o aumento da população mundial. A
maior quota deste aumento ocorrerá nos países em desenvolvimento, onde estão previstos aumentos na procura de
95% na carne e de 80% no leite, sendo estes os países com piores índices de aprovisionamento alimentar e os mais
afectados pelo fenómeno da fome e da pobreza (Delgado et al., 1999; Narrod, Tiongco e Scott, 2011).
Este aumento extraordinário de produção de proteína de origem animal tem sido obtido à custa da invasão
progressiva e inexorável de ecossistemas, nos quais o Homem, as espécies pecuárias e de companhia contactam com
animais selvagens e insectos vectores. Por sua vez, estes albergam agentes patogénicos que acedem, adaptam-se e
aumentam a sua virulência nestes hospedeiros persistindo e, eventualmente, disseminando-se a novas populações
(Antiga et al., 2003). Factores adicionais como a globalização do comércio internacional, as alterações climáticas, o
incremento das viagens intra e inter continentais, o insucesso das medidas de Saúde Pública e o bioterrorismo, têm
contribuído para uma dispersão geográfica das DIEs sem precedentes, com impactos devastadores na rentabilidade
dos sistemas de produção animal, agravando o bem-estar e a saúde das populações, e acentuando níveis de fome e
de pobreza.
Os Autores reavaliam o papel dos Serviços Veterinários e da OIE, e o potencial da abordagem Uma Saúde na luta
contra as DIE, na regulação do acesso aos mercados, na segurança alimentar dos países e no combate global contra a
fome.
Referências: Antia, R., Regoes, R.R., Koella, J.C. & Bergstrom, C.T. (2003). The role of evolution in the emergence of infec. diseases. Nature,
426, 658-661.; Delgado, C., Rosegrant, M., Steinfeld, H., Ehui, S. & Courbois, C. (1999). Livestock to 2020: the next food revolution. Food,
Agriculture and the Environment Discussion Paper, No 28. International Food Policy Research Institute, Washington, DC.; Jones, K.E., Patel,
N.G., Levy, M. A., Storeygard, A., Balk, D., Gittleman, J. L. & Daszak, P. (2008). Global trends in emerging infectious diseases. Nature, 451,
990-993.; Narrod, C., Tiongco, M. & Scott, R. (2011). Current and predicted trends in the production, consumption and trade of live animals and
their products. Revue Scientifique et Technique - Office International des Epizootics, 30(1), 31-49.
[Emerging Infectious Diseases: one global solution to a global problem]
In the XXI Century diseases such as HIV/AIDS, Malaria, Rabies, vCJD, Ebola Virus and Avian Influenza (H5N1)
persist. These diseases have in common the fact of being Emerging Infectious Diseases (IEDs).
EIDs events are dominated by zoonoses (60.3%) the majority of these originate in wildlife (71.8%) (Jones et al.,
2010).
During the last decades, the majority of IEDs recorded events were originated in developing countries, causing
negative impacts especially in the populations with high poverty rates.
In opposition, the volume of meat and milk produced in these countries outpaced the production of developed
countries and it is expected that in the next two decades the global demand for milk and meat will increase 55%, due
to world population growth. The largest share of this increase will occur in developing countries, where demand
increase are expected in 95% for meat and 80% for milk, which are the countries with higher levels of food
insecurity and the mainly affected by the phenomenon of hunger and poverty (Delgado et al., 1999; Narrod, Tiongco
& Scott, 2011).
This extraordinary increase in animal protein production has been achieved by the progressive and inexorable
invasion of ecosystems where humans and livestock and companion species contact with wild animal species and
insect vectors. Which harbor pathogens that access, adapt and increase their virulence in these host populations
persisting and eventually spreading to new populations (Antiga et al., 2003). Additional factors such as international
trade globalization, climate change, the increase in intra and inter continental travel, the breakdown of public health
measures and the bioterrorism, have contributed to an unprecedented geographical dispersion of DIE, with
devastating impacts on the efficiency of animal system production, worsening the well-being and health of
populations, and exacerbating levels of hunger and poverty. The authors reassess the role of Veterinary Services and
the OIE, and the potential of the One Health approach in the fight against the IED, in the regulation market access,
food security and global fight against hunger.
58
Segurança sanitária dos alimentos e listeriose – o que sabem as mulheres grávidas portuguesas?
Mateus, T.L.1,3, Maia, R.L.2, Teixeira, P.1
1 CBQF/ Escola Superior de Biotecnologia – Universidade Católica Portuguesa, Porto, Portugal
2 CECLICO - Centro de Estudos Culturais, da Linguagem e do Comportamento Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade
Fernando Pessoa, Porto, Portugal
3 Departamento de Medicina Veterinária, Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal. Email: [email protected]
O papel de Listeria monocytogenes como agente de toxi-infecção alimentar foi definitivamente reconhecido durante
a década de 1980, na sequência de uma série de surtos humanos devido ao consumo de alimentos contaminados na
América e na Europa. A listeriose é especialmente grave em indivíduos imunodeprimidos, tais como as mulheres
grávidas, tendo uma baixa incidência, mas uma alta taxa de mortalidade. Em mulheres grávidas pode causar a morte
e aborto. O objectivo deste estudo foi avaliar os conhecimentos, no que diz respeito a segurança sanitária dos
alimentos e a listeriose, de mulheres grávidas no último trimestre de gravidez ou com bebés de até 3 meses de idade.
Para o efeito, foram realizados 956 questionários a nível nacional em hospitais, centros de saúde e outros locais, nos
quais quisemos aquilatar os conhecimentos e práticas relacionadas com a segurança sanitária dos alimentos e a
listeriose, nomeadamente no tipo de alimentos a evitar e nas boas práticas de higiene e confecção alimentar a
praticar por estas mulheres. Também quisemos saber quais foram as fontes de informação sobre os cuidados de
segurança sanitária dos alimentos na gravidez, e de quem ou como as mulheres gostariam de receber essas
informações. Duzentas e vinte e nove (24%) inquiridas afirmaram não ter evitado qualquer tipo de alimento,
enquanto 306 (32%) admitiram não ter feito qualquer alteração especial aos seus hábitos alimentares relacionados
com a segurança sanitária dos alimentos na preparação e confecção das refeições. Quatrocentas e setenta e sete
(50%) mulheres consideraram que tinham recebido informação suficiente sobre os cuidados alimentares durante a
gravidez, informação esta adquirida através do médico assistente (46%), que era também a pessoa por elas
considerada a mais competente para dar essa informação (77%). Cento e dezassete (12%) mulheres afirmaram
conhecer a listeriose, embora apenas 58 (6%) destas terem sido capazes de descrever sintomas da doença. A maioria
das inquiridas (61%) mostrou bastante interesse em obter mais informação sobre a listeriose, e gostariam que fossem
os seus médicos assistentes (28%) a fornecê-la, bem como através de folhetos (26%) e do Boletim da Grávida
(23%). O estudo demonstra ser necessário sensibilizar os profissionais de saúde para a necessidade da educação para
a segurança sanitária do alimentos de mulheres grávidas. Os médicos veterinários podem ter um papel muito
importante na partilha de informação relevante sobre as zoonoses em geral e a listeriose em particular, contribuindo
activamente para o lema “As ciências veterinárias para uma só saúde”.
[Food safety and listeriosis – what do Portuguese pregnant women know?]
The role of Listeria monocytogenes as a foodborne pathogen was definitively recognized during the 1980s. This
recognition was the consequence of a number of epidemic human outbreaks due to the consumption of contaminated
foods, in Canada, the US and Europe. Listeriosis is especially severe in immunocompromised individuals such as
pregnant women. The disease has a low incidence of infection, although this is undeniably increasing, and a high
rate fatality rate amongst those infected. In pregnant women listeriosis may cause miscarriage and death. The aim of
this study was to evaluate the awareness, in terms of food safety and listeriosis, of pregnant women in the last
trimester of pregnancy or with babies up to 3 months old. For this purpose 956 women were questioned as to their
knowledge and practices relating to what foods to avoid, good hygiene and cooking practices. Also of interest were
the sources of information on Listeria spp. and listeriosis, and from whom and how women would like to receive
such information. Two hundred and twenty nine (24%) women said they had not avoided any kind of food, whilst
306 (32%) said they had not made any particular changes to their food safety related habits when they prepared and
cooked meals. Four hundred and seventy seven (50%) women considered that they had received enough information
about nutrition during pregnancy, and that this information had been acquired from their doctor (46%), who was
also the person considered the most competent to give this information (77%). A hundred and seventeen (12%)
women said they had heard about listeriosis, although only 58 (6%) of these had been able to describe listeriosis
symptoms. Women showed plenty of interest in new information (61%) about listeriosis, and they would like
doctors (28%) to provide it, as well as by brochures (26%) and in the pregnancy advice book (23%) provided by the
State Medical Service. It appears that plan is required, to raise awareness amongst health professionals for the need
for food safety education for pregnant women. Veterinarians may have an important role in sharing relevant
information on zoonoses in general and listeriosis in particular, actively contributing to the motto " Veterinary
sciences for one health”.
59
Salmonella multirresistente em suínos e manipuladores de carne
Gomes Neves, E.1,2, Antunes, P.3,4, Tavares, A.5, Themudo, P.6, Gärtner, M.F.1, Costa, J.M.C.2,7, Peixe, L.3
3 REQUIMTE, Laboratório de Microbiologia, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto, Portugal
4 Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação, Universidade do Porto, Portugal
5 Departamento de Bacteriologia, Sector de Diagnóstico Bacteriológico II, INRB IP / LNIV, Campus de Vairão, Portugal
6 Departamento de Bacteriologia, Sector de Diagnóstico Bacteriológico I, INRB IP / LNIV, Lisboa, Portugal
7 INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Porto, Portugal
Objectivos: Clones de Salmonella multirresistentes a drogas antimicrobianas (MDR), provenientes de produtos de
origem suína, como Salmonella 4,[5],12:i:-, S.Typhimurium DT104 ou S. Rissen, têm sido associados a infecções
humanas. O estudo da ocorrência destes clones em suínos abatidos para o consumo humano é escasso. Este trabalho
caracteriza prevalência, relações clonais, perfis de resistência aos antibióticos e respectivos determinantes genéticos
em amostras de suínos e manipuladores de carne de 8 matadouros portugueses. Métodos: As amostras foram
analisadas de acordo com a norma ISO 6579:2002. Os isolados foram serotipados no laboratório português de
referência para Salmonella, LNIV. A susceptibilidade às substâncias antimicrobianas foi determinada pelo método
de difusão em disco de acordo com as normas CLSI. Os métodos de PCR e sequenciação foram usados para
identificação de genes de resistência e integrões de classe 1. A relação genética entre isolados foi analisada através
de PFGE. Resultados: Obtiveram-se 60 isolados de suínos (gânglios linfáticos ileocecais, carcaça e carne) e
manipuladores de carne, entre Julho de 2007 e Agosto de 2008 (32 S.Typhimurium, 3 S.4,[5],12:i:- 11 S.Derby, 4
S.Rissen, 3 S.Mbandaka, 3 S.London, 2 S.Give, 1 S.Enteritidis e 1 S. Sandiego); 75% revelaram resistências, sendo
65% MDR. Os fenótipos mais frequentes foram tetraciclina (Tet) (70%, tet(A), tet(B) tet(G), sulfamethoxazol (Sul)
(62%, sul1, sul2, sul3), estreptomicina (S) (62%, aadA, strA, strB), ampicillina (A) (57%, blaPSE-1, blaTEM) e
cloranfenicol (C) (15%, floR, cmlA). Os isolados corresponderam a 17 perfis de PFGE, 30% apresentaram
integrões de classe 1 com uma região variável entre 400-2000 bp. O serótipo S.Typhimurium (9 perfis de PFGE), foi
observado em todos os tipos de amostras, tal como outros clones já isolados em amostras humanas em Portugal
(DT104 e S. Rissen). Isolados pertencentes a um clone de S.Rissen (1 perfil de PFGE) considerado emergente, com
um perfil variável (Tet; ASTet; ASSulTetT; ACSSulTetT; Tet associada a tet(A), A a blaTEM, Sul a sul1 e/ou sul3),
foram recuperados em suínos e manipuladores. A variante monofásica S.4,[5],12:i:-isolada em suínos associada à
S.Typhimurium num único perfil de PFGE, apresentou principalmente o tipo ASSuT (blaTEM strA-strB, sul2 e
tetB). Conclusões: Os suínos e o ambiente dos matadouros parecem contribuir para a circulação de Salmonella
MDR, bem como da variante monofásica S.4,[5],12:i: - emergente em humanos
[Multidrug-resistant Salmonella in swine and meat handlers]
Objectives:Multidrug-resistant (MDR) Salmonella clones mainly attributed to pork products have been increasingly
involved in human infections, as Salmonella 4,[5],12:i:-, S.Typhimurium DT104 or S. Rissen. Occurrence and
characterization of these clones at slaughtered swine is scarce. This study characterizes prevalence, clonal
relationships, antibiotic resistance profiles and associated genetic determinants of Salmonella isolates obtained from
slaughtered swine and meat handlers in eight abattoirs in Portugal. Methods: The samples were analyzed by
standard culture methods according to ISO norm 6579:2002. Isolates were serotyped in the Portuguese reference
laboratory for Salmonella, LNIV. Antimicrobial susceptibility was determined by the disc diffusion method
according to CLSI standards. PCR and sequencing were used to identify antimicrobial resistance genes and class 1
integrons. Genetic relatedness was analyzed by PFGE. Results: Sixty Salmonella isolates, from swine (ileoceacal
lymph nodes, carcass surface and meat) and meat handlers (hands) collected between July 2007 and August 2008
were obtained: 32 S.Typhimurium, 3 S.4,5,12:i:-, 11 S.Derby, 4 S.Rissen, 3 S.Mbandaka, 3 S.London, 2 S.Give, 1
S.Enteritidis, and 1 S. Sandiego. Resistance was found in 75% of Salmonella isolates, being 65% MDR. The most
common resistance phenotypes were to tetracycline (Tet) (70%, tet(A), tet(B) tet(G), sulfamethoxazole (Sul) (62%,
sul1, sul2, sul3), streptomycin (S) (62%, aadA, strA, strB), ampicillin(A) (57%, blaPSE-1, blaTEM) and
chloramphenicol (C) (15%, floR, cmlA). The isolates studied corresponded to 17 PFGE types, thirty percent were
positive for class 1 integrons, with a variable region between 400-2000 bp. S.Typhimurium (9 PFGE types) was
observed in swine samples and in meat handlers. The main human clones spread in Portugal (S.Typhimurium
DT104 and S. Rissen) were identified. Isolates belonging to the emerging S. Rissen (1 PFGE type), recovered in
both in swine and meat handlers differed in the resistance profile (Tet; ASTet; ASSulTetT; ACSSulTetT) being Tet
resistance associated to tet(A), A to blaTEM, Sul to sul1 and/or sul3. S.4,[5],12:i:- recovered from swine clustered
with S. Typhimurium isolates in one PFGE type was mostly associated to ASSuT type (blaTEM strA-strB, sul2 and
tetB). Conclusions: Swine and abattoir environment seems to contribute to the load of MDR Salmonella isolates and
to the emergence of monophasic variant S.4,[5],12:i:- in humans.
60
Condições higiénicas e práticas de produção em unidades de fabrico do queijo Serra da Estrela e
sua influência na segurança microbiológica do produto final
Guilherme, V.1, Sol, M.2, Nunes, T.1, Vaz, Y.1
2 UITA, INRB IP/L-INIA, Lisboa
Na tecnologia de fabrico do queijo podem estar presentes microrganismos indesejáveis e até mesmo patogénicos,
como é o caso de Listeria monocytogenes. Este microrganismo é considerado um agente patogénico emergente
como revelam os dados do último relatório da European Food Safety Authority (2009), que evidenciam um aumento
de 19,1% de casos humanos de listeriose, em relação a 2008, continuando a haver uma elevada taxa de mortalidade
(16,6%). Em Portugal, reporta-se a ocorrência de surtos de listeriose envolvendo a ingestão de alimentos
manipulados inadequadamente, crus ou mal cozinhados, entre os quais o queijo.
O queijo Serra da Estrela (QSE) é um produto tradicional importante pela sua qualidade gastronómica e pela
tradição que encerra. Existem registos da ocorrência de Listeria neste produto, importando estabelecer-se quais as
práticas de higiene e de confecção que podem ser melhoradas com vista a reduzir o risco microbiológico neste
alimento, no momento do fabrico.
Assim, o objectivo deste trabalho foi avaliar unidades de produção de QSE ao nível das suas características físicas,
práticas de limpeza e desinfecção, práticas de fabrico e higiene dos manipuladores. Para tal, entre Março e Maio de
2011, foram visitadas 25 unidades de produção, seleccionadas aleatoriamente a partir de uma lista fornecida pela
Direcção-Geral de Veterinária, e aplicados questionários de forma a proceder à avaliação dos parâmetros referidos.
Foram ainda colhidas amostras de leite e de queijos para verificar a ocorrência de Listeria monocytogenes.
No cômputo geral, nas queijarias visitadas foi demonstrado haver condições físicas e hábitos de higiene dos
manipuladores satisfatórios para o fabrico do queijo. Em relação às práticas de limpeza e desinfecção das
instalações, houve alguma discrepância entre queijarias, existindo ainda uma grande falta de conhecimento sobre
processos e produtos de limpeza e desinfecção específicos.
Quanto às práticas de fabrico também se verificaram diferenças substanciais no que toca a tempos, temperaturas e
humidades no processo de maturação do queijo. Por exemplo, observaram-se valores de temperaturas e humidades
bastante díspares, entre queijarias, que variaram entre os 4 oC aos 19,2 oC, e os 73% aos 99%, respectivamente, na
câmara de cura da 1ª fase de maturação. Os tempos de cura variaram entre 25 e 60 dias.
Das 19 amostras de leite colhidas nas unidades de produção, todas deram resultados negativos para a pesquisa de
Listeria monocytogenes. Relativamente aos 25 queijos recolhidos, apenas 1 deu resultado positivo para a mesma
espécie bacteriana.
Projecto financiado pela FCT – ERAFOOD/0003/2008 “Risk assessment of Listeria in traditional ready-to-eat food items (LisRisk)”
[Hygienic conditions and practices of production in manufacturing units of Serra da Estrela cheese
and its influence on the microbiological safety of the final product]
In the technology of cheese manufacture may be present undesirable and even pathogenic microorganisms, such as
Listeria monocytogenes. This organism is considered an emerging pathogen as data of the last report of the
European Food Safety Authority (2009) shows, with an increase of 19.1% of human cases of listeriosis, compared
with 2008, continuing to be a high mortality rate (16.6%).
In Portugal, reported outbreaks of listeriosis are associated with the ingestion of improperly handled, raw or
undercooked food, including cheese.
Serra da Estrela cheese (SEC) is an important artisanal product for its quality cuisine and tradition that contains.
There are records of the occurrence of Listeria in this product, caring to establish which hygiene and production
practices can be improved to reduce the microbiological risk in food, at time of manufacture.
Thus, the aim of this study was to evaluate SEC production units regarding facilities characteristics, cleaning and
disinfection practices, manufacturing practices and food handler‟s hygiene.
To this end, between March and May 2011, were visited 25 production units, selected randomly from a list provided
by the Directorate General of Veterinary Medicine, and used questionnaires in order to carry out the evaluation of
those parameters. There were also collected milk and cheese samples to verify the occurrence of Listeria
monocytogenes.
Overall, visited dairies showed to have facilities conditions and food handler‟s hygiene suitable for cheese
production. Regarding to cleaning and disinfection practices of premises, there was some discrepancy between
dairies, and it was seen a great lack of knowledge about specific processes and products of cleaning and disinfection.
As for the manufacturing practices, there were also noted substantial differences when it comes to time, temperature
and humidity in cheese ripening. For example, observed values of temperature and humidity were quite diverse
among dairies, ranging between 4 oC to 19.2 oC, and 73% to 99%, respectively, in the 1st maturation‟s stage
chamber. The curing times varied from 25 to 60 days.
Of the 19 milk samples taken in the production units, all were negative for the presence of Listeria monocytogenes.
Regarding to the 25 cheeses collected, only one was positive for the same bacterial species.
61
Avaliação do risco microbiológico associado à dieta vegetariana
Guimarães, M.1, Viegas, C.2 e Brandão, C.3
1 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Mestranda em Segurança e Qualidade Alimentar na Restauração, Portugal
2 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Curso de Produção Alimentar em Restauração, Portugal
3 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Area Científica de Ciências da Alimentação, Laboratório de Microbiologia Alimentar
Objectivos: O objectivo do trabalho foi a identificação dos riscos microbiológicos associados à cozinha vegetariana.
O estudo recaiu sobre um restaurante de cozinha vegetariana, tendo incidido sobre três vertentes: a análise
microbiológica de refeições, uma avaliação da superfície de alimentos e por fim um estudo à qualidade do ar da
cozinha e do expositor de alimentos prontos a consumir.
Metodologia: Foram recolhidas 34 amostras, entre o dia 4 de Maio e 10 Julho de 2010, todas elas contendo
ingredientes cozinhados e crus.
Os parâmetros microbiológicos realizados, recorrendo a técnicas clássicas e normalizadas foram: Contagens totais
de microrganismos a 30 ºC (CT), Coliformes, E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Enterococcus,
Clostridium perfringers e Salmonella.
A avaliação da eficácia das operações de higienização das tábuas de corte foi feita pela quantificação de CT e de
coliformes, e a colheita das 15 amostras com caixas de petri de contacto. A avaliação da qualidade do ar efectuou-se
por CT, a partir de 15 colheitas de 1m3 de ar, no espaço da cozinha e do expositor dos alimentos.
Resultados: No que respeita a CT podemos verificar que a maioria das amostras encontram-se entre 4,0 e 6,5 (Log
UFC/g), com uma mediana de 5,8 (Log UFC/g). Quanto aos Coliformes, os valores encontrados variam entre 3,5 e
5,5 (Log UFC/g) e uma mediana de 4,0 (Log UFC/g).
Verificou-se que em relação às CT, num total de 34 amostras; 41,2% são consideradas “Não satisfatórias”, 41,2%
são “Aceitáveis” e 17,6% são “Satisfatórias”. Em relação aos Coliformes, 52,9% são “Não Satisfatórias”, 41,2% das
amostras (14) são “Aceitáveis” e 5,9% (2) são “Satisfatórias”. Quanto à E. coli, 23,5% são “Não Satisfatórias” e
76,5% “Satisfatórias”. No que respeita a Bacillus cereus, verificou-se que apenas 2 amostras eram “Não
Satisfatórias” 5,9%, 20,6% “Aceitáveis” e 73,5% (25) “Satisfatórias”. Quanto a Enterococcus verificou-se que
apenas existe uma amostra, ou seja, 2,9% “Não Satisfatória” e 97,1% (33) “Satisfatórias”.
No que respeita à validação da operação de higienização das tábuas de corte e a CT, podemos observar que 56,5%
das amostras são “Não Satisfatórias” a meio do dia de laboração, e 31,25% no fim do dia. Em relação aos
Coliformes, observamos que 50% das amostras são “Não Satisfatórias” a meio do dia e 31,25% no fim do dia.
Quanto à avaliação da qualidade do ar; na vitrina podemos observar que 75% das amostras são “Satisfatórias”,
sendo apenas 12,5% “Não Satisfatórias”. No ambiente da cozinha as amostras “Satisfatórias” corresponderam a
56,3% e 37,5% “Não Satisfatórias”.
[Microbiological risk assessment concerning vegetarian food]
Objectives: The aim of this study was the identification of microbiological hazards associated with vegetarian
cuisine. The study came upon a vegetarian restaurant and has focused on three aspects: the microbiological analysis
of food, an evaluation of the cutting board of food and finally a study on air quality of the kitchen and food
expositor.
Methodology: 34 samples were collected, between May 4 and July 10, 2010, all containing raw and cooked
ingredients. Microbiological parameters whose carried out using classical and standard techniques: total colony
counts at 30 ºC (CT), coliforms, E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Enterococcus, Clostridium
perfringers and Salmonella.
Assessing the effectiveness of the operations in cleaning and disinfection of cutting boards was made by CT and
quantification of coliforms, and 15 samples whose collected with contact petri dishes. The air quality was assed by
CT, from 15 air samples of 1m3 from the kitchen and food display.
Results: With regard to CT most samples are between 4.0 and 6.5 (log CFU/g), with a median of 5.8 (log CFU/g).
Concerning coliforms, the values vary between 3.5 and 5.5 (log CFU/g) and a median of 4.0 (log CFU/g).
In a total of 34 samples, and regarding to CT, 41.2% are "not satisfactory", 41.2% are "Acceptable" and 17.6% are
"Satisfactory." With regard to coliforms, 52.9% are "not satisfactory", 41.2% of the samples are "acceptable" and
5.9% are "Satisfactory." As for E. Coli, 23.5% are "not satisfactory" and 76.5% "Satisfactory". In respect to Bacillus
cereus, it whose found that only two samples were "unsatisfactory" 5.9%, 20.6% "Acceptable" and 73.5%
"Satisfactory." Regarding Enterococcus was found that there is only one sample, ie, 2.9% "Not Satisfactory" and
97.1% (33) "Satisfactory".
Regarding the validation of disinfection of the cutting boards and CT, we observed that 56.5% of the samples are
"unsatisfactory" in the middle of the day, and 31.25% at the end of the day. With regard to coliforms, whe found
that 50% of the samples are "unsatisfactory" at mid-day and 31.25% at the end of the day.
As for the assessment of air quality, in the food expositor we can see that 75% of the samples are "Satisfactory" and
only 12.5% "unsatisfactory." In the kitchen environment, we found 56,3% "Satisfactory" and 37.5%
"unsatisfactory."
62
Alimentos – Tecnologia
Reducción del contenido de sodio en los productos cárnicos crudos curados
Jacint Arnau
IRTA-Monells. Finca Camps i Armet, 17121 Monells (Girona), Espanha
La reducción del consumo de sal (NaCl) es una de las recomendaciones dietéticas de la Organización Mundial de la
Salud. La ingesta de sodio es muy superior a las necesidades del organismo y se asocia con importantes problemas
sanitarios. Por esta razón se han impulsado acciones para disminuir el contenido de sodio de los alimentos
procesados, entre los cuales destacan, por su contenido, los productos cárnicos crudos curados. En estos productos,
la sal es un ingrediente muy importante, ya que tiene una función bacteriostática, reduce la actividad de algunos
enzimas proteolíticos y afecta a las propiedades sensoriales (apariencia, textura, sabor y aroma).
Para reducir el contenido de sodio de los embutidos crudos curados se ha planteado la reducción de la cantidad de
NaCl añadido, la substitución parcial o total por sales de potasio y la introducción de tecnologías emergentes como
la alta presión y el secado rápido de lonchas (Quick Dry Slice system). Para el caso del jamón curado se ha
planteado también la substitución parcial o total por sales de potasio y la introducción de tecnologías emergentes
como la alta presión, sin embargo, en este caso se considera que la reducción de la variabilidad del contenido de sal
absorvida debe ser el primer paso a dar para reducir el contenido de sal. Una vez logrado este objetivo se puede
plantear la reducción del contenido de sal. Para reducir los problemas de textura, apariencia y frenar el crecimiento
de microorganismos alterantes o patógenos se propone una selección apropiada de la materia prima por métodos no
destructivos (e.g. pH), adaptar la evolución de la temperatura de proceso para garantizar la seguridad alimentaria y
tratar el producto final para reducir los problemas derivados de la reducción del contenido de sal (e.g. tratamiento
térmico, altas presiones).
63
A qualidade nutricional da fração lipídica da carne de javali proveniente do Montado
Quaresma, M.A.G., Bessa, R.J.B.
Dezasseis javalis adultosforam utilizados no estudo. A preparação da amostra realizou-se no laboratório e consistiu
na remoção de todo o tecido adiposo e conjuntivo visível e dos coágulos de sangue, de seguida procedeu-se à
homogenização da amostra, embalamento a vácuo e congelação (-70ºC) todas as amostras, que assim permaneceram
até à análise. O teor de lípidos totais foi determinado por gravimetria, o teor de colesterol total e de vitamina E foi
quantificado por Cromatografia líquida de alta-pressão, enquanto os ácidos gordos foram analizados por
Cromatografia gasosa.
O lombinho de javali apresentou um teor de lípidos totais de 4,65 g/100 g de carne e um teor médio de colesterol de
57,5 mg/100 g de carne. Relativamente ao teor de lípidos totais, os valores são inferiores a 5 g/100 g de carne,
podendo por isso ser considerada uma carne magra. No que respeita ao teor de colesterol, este valor está dentro dos
valores anteriormente descritos para a carne de porco.
O perfil de ácidos gordos (AG) do lombinho de javali é composto principalmente por ácido oleico (38 g/100 g de
AG), ácido palmítico (21 g/100 g de AG), ácido linoleico (17,4 g/100 g de AG) e ácido esteárico (11 g/100 g de
AG), em conjunto estes 4 ácidos gordos são responsáveis por aproximadamente 88% dos AG. Consequentemente, a
gordura intramuscular do javali é dominada pelo grupo dos AG monoinsaturados (40,8% do total dos AG), os AG
saturados é o segundo grupo mais importante (34,5% do total dos AG), enquanto o grupo dos AG poliinsaturados é
o que menos contribui para a composição da gordura intramuscular do javali do Montado (24% do total dos AG).
Foram encontrados na carne de javali vários homólogos naturais da vitamina E (7 em 8 possíveis), os mais
representativos foram o α-tocoferol (18,65 µg/g de carne), o γ-tocoferol 1,68 µg/g de carne), e o γ-tocotrienol (0,075
µg/g de carne). Foi ainda detectado pequenas quantidades de outros homólogos naturais da vitamina E, mas apenas
em alguns dos animais, como o α-tocotrienol, o δ-tocotrienol, o β-tocoferol e o δ-tocopherol. Estes resultados
sugerem que o teor de vitamina E na carne de javali está acima dos valores considerados necessários para evitar a
oxidação lipidica.
A avaliação da qualidade nutricional da gordura dos alimentos é feita com o recurso a índices nutricionais, como os
rácios AG poliinsaturados/saturados e poliinsaturados n-6/n-3. A carne de javali está de acordo com as
recomendações nutricionais para o rácio poliinsaturados/saturados, mas em desacordo para o rácio poliinsaturados
n-6/n-3.
[The nutritional quality of Montado’s wild boar meat lipid fraction]
Sixteen adult wild boars were used in this study. The psoas major muscles (tenderloin) were collected immediately
after sanitary inspection and transported under refrigeration to the laboratory, where they were trimmed of
connective and adipose tissue and blood coagulum before blending in a food processor, vacuum packed and frozen
at -70 ºC until analysis. The total lipid content was measured gravimetrically, the cholesterol and vitamin E contents
were determined by normal-phase High-performance liquid chromatography, while the fatty acid composition was
analyzed by Gas chromatography.
The wild boar meat total lipid content was 4.65 g/100 g of meat, a value that is within the range of lean meat. The
total cholesterol content quantified in wild boar meat averaged 57.5 mg/100 g of meat, which is in the range of
values previously described for pork. Intramuscular fatty acid (FA) composition is comprised mainly by oleic acid
(38 g/100 g of FA), palmitic acid (21 g/100 g of FA), linoleic acid (17.4 g/100 g of FA) and stearic acid (11 g/100 g
of FA), together these 4 major fatty acids comprise almost 88% of total FA. Consequently, the monounsaturated FA
is the predominant fatty acid group in wild boar intramuscular fat (40.8% of total fatty acids), the saturated FA
group is the second most important group in wild boar intramuscular fat (34.5% of total fatty acids), while
polyunsaturated FA group is the third and least important group (24% of total FA).
The most important vitamin E homologues in wild boar meat were α-tocopherol (18.65 µg/g meat), γ-tocopherol
(1.68 µg/g meat) and γ-tocotrienol (0.075 µg/g meat). Minor amounts of other natural vitamin E homologues were
also detected just in some animals, as β-tocopherol, δ-tocopherol, α- tocotrienol, δ-tocotrienol. These results suggest
that vitamin E content in wild boar meat is above the values that are needed to prevent lipid oxidation.
The evaluation of fatty acids nutritional ratios, with values of 14.9 for the n-6/n-3 polyunsaturated FA and 0.7 for
polyunsaturated/saturated FA ratios, shows that wild boar meat is in agreement with common nutritional
recommendations, for the polyunsaturated/saturated FA ratio but in disagreement for the n-6/n-3 polyunsaturated FA
ratio.
64
Estudo para o estabelecimento de critérios microbiológicos para carcaças de lagomorfos
Ribeiro, R.C. 1,2, Nunes, T.2, Mendes, M.3, Mariano, M.G.3
1 Universidade de Évora, Largo dos Colegiais, Évora, Portugal
3 Autoridade de Segurança Alimentar e Económica - ASAE, Lisboa, Portugal
A carne de coelho, conhecida pelas suas qualidades nutricionais e dietéticas, constitui um item da dieta
mediterrânica e como tal, de Portugal.
Porém, não foram estipulados critérios de higiene pelo Regulamento (CE) Nº 2073/2005, a cumprir pelos
estabelecimentos de abate de lagomorfos. Além disso, existem poucos estudos acerca da qualidade microbiológica
de carcaças e carne de coelho os quais podem representar um potencial veículo de microrganismos patogénicos, de
origem alimentar, para o ser humano.
Neste contexto, este trabalho tem como objectivos estimar a prevalência de Salmonella em carcaças de lagomorfos,
aferir da sua contaminação microbiológica, quanto a mesofilos totais e Enterobacteriaceae e analisar os resultados
obtidos procurando encontrar valores de referência de aceitabilidade.
A amostra em estudo compreende 188 colheitas de músculo de coelho, uma colheita por carcaça, logo após
inspecção sanitária mas antes do processo de refrigeração.
A pesquisa de Salmonella e as contagens de mesofilos totais e Enterobacteriaceae foram executadas segundo os
respectivos métodos oficiais de referência.
Os dados obtidos foram sugeitos a uma análise estatística descritiva e inferencial. Para aferir da possibilidade de
diferenças significativas na contaminação por mesofilos totais e por Enterobacteriaceae entre os matadouros em
estudo foi realizado o teste ANOVA one-way, seguido pelo teste de Tukey no caso de existirem diferenças
significativas (p-value<0,05).
Na amostra em estudo não foi detectada Salmonella. No entanto, os resultados obtidos quanto aos parâmetros
mesofilos totais e Enterobacteriaceae evidenciam a possível contaminação cruzada das carcaças de coelho durante o
processo de abate. Foi estimada uma correlação linear de 0,724 (95% de IC [0,647;0,785] e p-value <0,01)) entre
estes dois parâmetros e verificada a existência de diferenças significativas de contaminação microbiológica entre
matadouros (F = 58,4 e p-value <2,2*10-16 quanto a mesofilos totais e F = 67,9 e p-value <2,2*10-16 quanto a
Enterobacteriaceae).
Assim, estes parâmetros deveriam ser incluídos nas análises de rotina efectuadas pelos estabelecimentos de abate de
lagomorfos, constituindo este trabalho o primeiro contributo para uma futura análise de risco, com o objectivo de
estabelecer critérios de higiene a cumprir pelos estabelecimentos de abate de lagomorfos, a nível nacional.
[Study for the establishment of microbiological criteria for lagomorphs carcasses]
Rabbit meat, appreciated for its high nutritional and dietetic properties, is a common item of the Mediterranean and
Portuguese diet.
However, Regulation (EC) No. 2073/2005 does not stipulate hygiene criteria to be performed by rabbit
slaughterhouses and, in addition, there are few studies about the microbiological quality of rabbit meat and
carcasses, which may represent a vehicle for foodborne pathogens.
In this context, this work aims to calculate the prevalence of Salmonella in lagomorphs carcasses, to evaluate their
microbiological contamination, regarding aerobic colonies and Enterobacteriaceae and to analyze the results to find
acceptable levels of contamination.
The study sample comprises 188 collections of rabbit muscular tissue, corresponding one tissue collection to one
carcass, sampled just after health inspection but before the cooling tunnel.
The research of Salmonella and the counts of aerobic colonies and Enterobacteriaceae were performed according
the respective international standard method.
The data were analyzed statistically. The one-way ANOVA were conducted to compare aerobic colonies and
Enterobacteriaceae levels between slaughterhouses. When analysis of variance showed significant difference
among slaughterhouses (p-value <0,05) it was performed the Tukey‟s test.
The study sample tested negative for Salmonella. However, the results obtained regarding aerobic colonies and
Enterobacteriaceae counts demonstrate that the cross-contamination of the rabbit carcasses during the slaughter
process is possible. The Pearson‟s correlation coefficient between these two parameters was 0.724 (95% IC [0.647;
0.785] and p-value <0,01)) and a significant difference in the microbiological contamination between
slaughterhouses (F = 58.4 and p-value <2.2*10-16 regarding aerobic colonies and F = 67.9 and p-value <2.2*10-16
regarding Enterobacteriaceae) was seen.
Thus, these indicators should be considered in routine analysis carried out by rabbit slaughterhouses, and this work
constitutes the first step for a risk analysis, with the objective of establishing hygiene criteria to be met by rabbit
slaughterhouses, at a national level.
65
Modelização do efeito de dois níveis de sal, da adição de uma cultura de arranque de L. sakei,
hidratos de carbono fermentáveis e duas temperaturas de armazenamento no comportamento de
Listeria monocytogenes em chouriço fatiado
García-Díez, J., Patarata, L.
CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
Objectivos: Determinação do efeito de dois níveis de sal, da adição de uma cultura de arranque de L. sakei, hidratos
de carbono fermentáveis e duas temperaturas de armazenamento (8ºC ou 22ºC) sob vácuo no comportamento de L
monocytogenes em chouriço fatiado
Metodologia: O chouriço foi preparado com carne e gordura de porco, 5% de vinho tinto (11°, pH 3.8), 0,25% de
NaNO2 5% mais KNO3 5% no sal de cura, e 1,5% ou 3% de, com ou sem adição de L. sakei (6 log ufc/g) e com ou
sem dextrose mais lactose (0,75% cada). A mistura repousou 24h a 4 ºC, foi cheia, enxugou durante 4h (4 ºC, 85%
HR) e foi fumada (3 h, madeira de faia; < 35 ºC) e seca (15 ºC, 85% HR, 4 semanas). As amostras foram fatiadas e
contaminadas com uma suspensão de L. monocytogenes (mistura de ATCC 7973 e 4 estirpes isoladas de chouriço ou
do seu ambiente fabril) para obter 10 a 100 ufc/g com uma gota de 0,1 ml na superfície. As fatias foram embaladas
sob vácuo e armazenadas a 4 ºC e a 22 ºC. Fizeram-se análises microbiológicas às 24h, 7, 15 e 30 dias.
A detecção foi feita conforme indicado na ISO 11290-1 (1996) e a confirmação com uma técnica de PCR específico
de espécie. O contributo de cada um dos efeitos para a sobrevivência de L. monocytogenes foi estabelecido por
análise de regressão logística.
Resultados: Nem a inoculação com L. sakei nem a adição de hidratos de carbono influenciaram a sobrevivência.
Pelo contrário, a utilização de um teor em sal mais elevado resultou numa redução significativa da sobrevivência de
L. monocytogenes e o armazenamento a uma temperatura mais elevada resultou num produto mais seguro. Após 7 d
de secagem L. monocytogenes não foi detectada em nenhuma amostra. Com o modelo de regressão logística
determinou-se que aumentando o teor em sal de 1,5% para 3% se reduz a probabilidade de sobrevivência de L.
monocytogenes a cerca de um quinto (OR=0,174). Preocupante é a redução significativa na probabilidade
(OR=0,028) de encontrar L. monocytogenes viável quando o chouriço é armazenado a 22 ºC, quando comparado
com 8ºC. A utilização generalizada e indiscriminada da refrigeração em produtos cárneos, mesmo quando isso não é
estritamente necessário, pode aumentar o risco de presença de L. monocytogenes. A vantagem competitiva que L.
monocytogenes tem a baixas temperaturas, assim como a potencial inibição da microflora láctica, são provavelmente
as responsáveis pelo comportamento observado.
[Modeling the effect of two salt levels, L. sakei starter culture, fermentable carbohydrates and two
storage temperatures on the behavior of Listeria monocytogenes in sliced chouriço]
Objectives: Determination of the effects of salt level, L. sakei starter culture and fermentable carbohydrates in of
chouriço, and storage temperature of sliced chouriço in vacuum package (8ºC or 22ºC) on the behaviour L.
monocytogenes.
Methods: Chouriço was prepared with lean and pork fat, 5% red wine (11°, pH 3.8), 0.25% of NaNO 2 5% plus
KNO3 5% in the curing salt, and 1.5% or 3% of salt, with or without L. sakei (6 log cfu/g) and with or without
dextrose plus lactose (0.75% each). The mixture was maintained 24 h at 4ºC, was stuffed, dipped for 4 hours (4ºC
with 85% HR) smoked (3 h, beech wood; < 35 ºC) and dried (15 ºC, 85% RH, 4 weeks). Samples were sliced and
contaminated with a suspension of L. monocytogenes (mixture of ATCC 7973 and 4 strains from chouriço or its
production environment) in NaCl 0.9% to obtain 10 to 100 cfu/g with 0.1 ml dropped in the surface. Slices were
vacuum packaged and stored at 4 ºC and 22 ºC. Microbial analysis was made after 24h, 7, 15 and 30 days. The
detection was carried out as described in ISO 11290-1 (1996) and confirmation by a species-specific PCR technique.
The contribution of the effects to the survival of L. monocytogenes was established through binary logistic
regression.
Results: Neither the inoculation with L. sakei, nor the addition of carbohydrates influenced the survival of the
pathogen. On the contrary, higher amount of salt resulted in a significant reduction of the survival of the pathogens
and the higher storage temperature resulted in a safer product. After 7 d L. monocytogenes was not detected in any
samples. To study the association of the factors contributing for L. monocytogenes survival a binary logistic
regression was performed, using the occurence of the pathogen as the predicted variable and the storage temperature
and salt level as predictor. It was observed that increasing the level of salt addition in the formulation of chouriço
from 1.5% to 3% reduces the odds of survival of L. monocytogenes to about the fifth part (0.174). Worthy of
preoccupation is the significant reduction in the odds (OR=0.028) of found viable L. monocytogenes when the
samples are stored at room temperature (22 ºC), when compared to low temperature (8 ºC, reference category). The
general and indiscriminate use of refrigeration in meat products, even when it is not necessary might increase the
risk of presence of L. monocytogenes. The competitive advantage that L. monocytogenes has at low temperatures, as
the potential inhibition of LAB activity, are probably the reason to the observed behavior.
66
Avaliação de factores de risco associados à Qualidade microbiológica em produtos de IV Gama, de
acordo com as condições de utilização
Morgado, C.1, Calvário, J.2 e Brandão, C.3
1 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Mestranda em Segurança e Qualidade Alimentar na Restauração, Lab. de Microbiologia
Alimentar, Portugal
2 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Mestrando em Segurança e Qualidade Alimentar na Restauração, Departamento de F&B,
Portugal
3 Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Área Científica de Ciências da Alimentação, Laboratório de Microbiologia Alimentar,
Portugal
Objectivos: Os produtos de IV Gama têm uma utilização cada vez mais enraizada na sociedade moderna. Contudo, e
apesar de serem colocados no mercado como produtos prontos a utilizar, em termos de higiene e segurança
alimentar, são produtos problemáticos, quer pelas ocorrências registadas de doenças de origem alimentar (DOA),
quer por estudos microbiológicos realizados. Torna-se assim importante perceber se estes problemas têm origem
aquando da sua produção ou, por utilização abusiva do produto. Com este trabalho pretende-se ainda inferir quanto à
aplicabilidade da Microbiologia Preditiva, a este tipo de produtos, para definir tempos de prateleira, e também
analisar matematicamente a evolução microbiológica dos produtos.
Metodologias: No trabalho a desenvolver acompanhar-se-ão, microbiologicamente, produtos vegetais de IV Gama,
procedendo-se à sua análise logo após a sua produção e após a utilização do produto. Estes serão analisados quanto à
sua qualidade microbiológica, para que se possa traçar um perfil microbiológico dos produtos durante o tempo de
armazenamento. Junto com as amostras destinadas ao circuito de distribuição, são colocados dataloggers para que se
registem as temperaturas ao que o produto é sujeito durante a distribuição e armazenamento. Estes produtos serão
ainda sujeitos à medição de aW e pH, cujos dados, juntamente com os dados das temperaturas do produto ao longo
do tempo de exposição, serão inseridos num programa de Microbiologia preditiva, sendo-nos assim possível prever
a curva de crescimento de microrganismos como Pseudomonas spp e Aeromonas hydrophila.
Serão estudados três tipos de produtos – salada, fruta laminada e cenoura ripada. Por cada amostra controlo (após
produção) serão analisadas quatro amostras, no mínimo, pertencentes ao mesmo lote da anterior, após o tempo de
armazenagem num serviço de restauração. Os parâmetros microbiológicos a analisar são. Contagens totais,
Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas spp, Enterococcus, Fungos e Coliformes totais.
Resultados: Foram analisadas, até agora, onze amostras – duas controlo e as restantes após o circuito de distribuição.
De modo geral, pois tratando-se de resultados preliminares, a Microbiologia Preditiva apresenta-nos curvas de
crescimento compatíveis com os resultados obtidos em laboratório, pela metodologia clássica.
Palavras chave; salada, fruta, microbiologia, preditiva
[Risk factors assessment associated with microbiological quality of ready-to-eat products,
according to the use conditions]
Objectives: Ready-to-eat products have taken an important role on our society. However, despite being market as
products ready to use, in terms of hygiene and food safety are still problematic products, either by recorded
occurrences of foodborne disease (FDB) or by microbiological studies carried out previously. It is therefore
important to realize if these problems have their origin at the production or, rather, are caused by misuse of the
product. Alongside these issues, we have the use of Predictive Microbiology. This work aims further infer the
reliability of predictive microbiology, applied to such products, to define shelf life, and the mathematical analysis of
the microbiological evolution of this kind of products.
Methodology: In follow up work, ready-to-eat products will be immediately analysed after production and after the
sale circuit of the product. These products will be analysed for their microbiological quality, so we can draw a
microbiological profile of the products during the time of storage. Along with the samples for the distribution
circuit, dataloggers are placed to register temperatures profiles during the utilization period. These products shall
also be subject to measurement of pH and aW, whose data along with data from the temperature of the product over
time of exposure, will be inserted in a program of predictive microbiology, and so we can predict the growth curve
of the microorganisms as Pseudomonas spp and Aeromonas hydrophila.
Three types of products will be studied – salad, fruit and carrot rolled rib. For each control sample (after production)
six samples will be analysed belonging to the same batch as the previous one, after a storage time catering service.
Microbiological parameters to consider are: Total counts, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas
spp, Enterococcus, Coliforms and Fungi.
Results: At the time, eleven samples have been analysed – two control samples and the remaining samples are from
the distribution circuit. In general, being these preliminary results, Predictive Microbiology presents growth curves
compatible with the results obtained in laboratory, by classical methodology.
67
Pequenos ruminantes
Situação e perspectivas do controlo da brucelose dos pequenos ruminantes na União Europeia
Yolanda Vaz
A ComissãoEuropeia decidiu em 1990, co-financiar a erradicação da brucelose dos pequenos ruminantes nos Estados Membros
(EM) da orla Mediterrânica (Decisão do Conselho 90/242/CE, 21 de Maio), pela sua importância como zoonose, por constituir
uma importante barreira ao livre movimentos de ovinos e caprinos e pelas perdas de produtividade, e consequentemente de
rendimento dos produtores, originadas pela doença. Esta Decisão indicava aspectos a incluír nas propostas de planos a submeter a
co-financiamento à Comissão, como: a estrutura de responsabilidades e os mecanismos de monitorização, os métodos de rastreio,
o abate sanitário e indemnização, o sequestro, limpeza e desinfecção das explorações infectadas e o controlo dos produtos de
origem animal. Legislação posterior definiu outros aspectos, com destaque para a Directiva 91/89/CE que estabelece as regras
para a classificação sanitária de efectivos e áreas, com vista à harmonização do comércio intracomunitário de ovinos e caprinos.
A renovação anual, ao longo de 20 anos, do co-financiamento destes planos, tem assegurado o seu cumprimento nos EM, com
diferentes graus de sucesso, em dependência dos sistemas de produção, das estratégias utilizadas e da intensidade e continuidade
da aplicação das mesmas. O co-financiamento atribuído situava-se abaixo dos 10.000 milhares de Euro anté 2010, subindo em
2011 para 13.560 milhares de Euro (~5,5% do total investido nos 12 programas de saúde animal). A Portugal está atribuído para
2011 cerca de 16% deste montante, contando o país com 9,6% do efectivo de pequenos ruminantes envolvido nos 4 países
actualmente co-financiados: Portugal, Espanha, Itália, Grécia e Chipre. Os primeiros 10 anos de implementação do plano
registaram as maiores descidas na prevalência de rebanhos infectados e a segunda década permitiu a erradicação da doença em
França (último foco em 2003; estratégia baseada num programa de teste e abate e vacinação contínua de animais jovens) e em
algumas regiões de Itália e Espanha. Em 2010 Chipre, que iniciou o plano em 2004, teve apenas um foco. A Grécia é o país que
apresenta a mais problemática situação, com a parte continental e algumas ilhas com vacinação de todos os animais e parte das
ilhas tentando a erradicação, com prevalência de explorações positivas superior a 3%. Itália apresenta apenas 8 das 18 regiões
com plano, tendo uma prevalência de 2,73%. Espanha apresenta 0,89% de prevalência e 6 das 17 regiões autónomas em fase de
erradicação; Valência apresenta a maior prevalência, 4,42%. Portugal tem em 2010 uma prevalência global de 1,27%, sendo o
Algarve a região em pior situação (5,4%). De acordo com o relatório “Zoonoses 2009” da ECDC-EFSA foram declarados 401
casos humanos na UE.
A presente fase dos planos requer dos EM uma crescente capacidade de avaliação epidemiológica e de controlo da população
animal e dos seus movimentos e a adaptação das estratégias à situação epidemiológica, no quadro das capacidades dos serviços
veterinários e das particularidades dos sistemas de produção. As estratégias devem ser fundamentadas em critérios técnicos e
documentados sendo importante a distinção entre positividade e infecção. Deve ser sempre mantido o clima de cooperação entre
os intervenientes, com mensagens claras de penalização aos que falham o cumprimento de regras sanitárias e de apoio aos que as
cumprem. A experiência acumulada permite uma perspectiva positiva em relação aos planos: é possivel atingir a erradicação.
[Present status and perspectives of small ruminant brucellosis eradication in the European Union]
The European Commission decided in 1990, to co-finance the eradication of brucellosis in small ruminants in the Member States
(MS) of the Mediterranean area (Decision of the Council 90/242/EC, 21 May), due to its importance as a zoonosis, because it
constitutes a trade barrier for the free movement of ovine and caprine animals and also due to the important productive and
economic losses related to the disease. This Decision indicated aspects to be included in the programme proposals to be
submitted to the Commission for co-financing, such as: the structure of responsibilities and monitoring mechanisms, the
diagnostic methods, the sanitary slaughter and indemnisation payment, the isolation, cleaning and disinfection of infected farms
and the control of products of animal origin.
Latter legislation defined other aspects, in special Directive 91/89/EC establishing the criteria for sanitary classification of flocks
and areas, aiming the harmonisation of intra-Community trade of sheep and goats. The annual renovation of co-financing of this
program assured the continuity of measures in MS with different degrees of success, depending on production systems, tools and
strategies, intensity and continuity of measures. The amount of co-financing is under 1,000 thousand Euro, raising in 2011 to
13.560 thousand Euro (~5,5% of the total investment in the 12 animal diseases programs). Portugal has around 16% of the cofinancing of small ruminants brucellosis eradication while having 9.6% of sheep and goats population, among the 4 countries
where the programme is applied: Portugal, Spain, Italy, Greece and Cyprus. In the first 10 years of the programme significant
decreases of flock prevalence were achieved and in the second decade eradication was achieved in France (last outbreak in
2003^; programme based on test and slaughter and a continued and intense vaccination of young replacements) and in several
regions of Italy and Spain. In 2010 Cyprus, that begin its plan in 2004, had only one outbreak. Greece presents a more difficult
situation with the continental area and some island under a mass vaccination programme and a test and slaughter program most
of the islands and a prevalence of over 3% in this area. Italy has 8 of the 18 regions with eradication plan and a global flock
prevalence of 2.73%. Spain has 0.89% prevalence and 6 of the 17 autonomous regions in the final eradication phase; Valencia
has the higher prevalence, 4.42%. Portugal had in 2010 a global prevalence of 1.27%, and Algarve is the region with poorer
results (5.4%). According with the EFSA-ECDC “Zoonosis Report 2009” 401 human confirmed cases were reported.
At present, brucellosis eradication require from the MS a growing capacity of epidemiological evaluation as well as animal
population and movements control and the adaptation of strategies to situations, under the capacities of the veterinary services
and the particularities of production systems. Strategies should be justified by technical criteria and documented. The ability to
distinguish between seropositivity and infection is fundamental. An environment of cooperation between entities should be
pursued with clear messages of penalties for non-compliance of sanitary rules. The experience achieved in the past years allows a
positive perspective in the relation of small ruminants brucellosis plans: eradication is possible.
68
Situação e perspectivas do controlo da brucelose dos ovinos e caprinos em Portugal
António Pina Fonseca
Direcção Geral Veterinária, Lisboa, Portugal
Nas últimas décadas, a brucelose dos ovinos e caprinos tem sido a zoonose mais importante do mundo rural em
Portugal. A importância da brucelose dos ovinos e caprinos tem a ver essencialmente com a sua agressividade para
os seres humanos, com as consequências económicas para as explorações pecuárias e para as empresas do sector
alimentar e com os prejuízos económicos e elevados custos financeiros para o país. Contudo, nos últimos anos, temse verificado uma diminuição sustentada dos casos confirmados de brucelose humana em Portugal, consequência da
implementação do programa de erradicação da brucelose dos pequenos ruminantes, cujos indicadores
epidemiológicos também têm apresentado evolução favorável. A brucelose transmite-se entre os animais
essencialmente através do contacto directo e dos materiais do aborto. Trata-se de uma doença do rebanho e em
especial da fêmea gestante.
A erradicação da brucelose consiste na aplicação de um conjunto sistematizado de medidas mais restritas,
executadas de forma continuada, com o objectivo de remover a infecção da população ovina e caprina numa
determinada região, sendo reconhecida como um significativo desafio que avalia as performances dos seus
executores.
As OPP, enquanto associações representativas dos produtores, colaboram com a DGV na execução dos programas
de erradicação, na vigilância sanitária das explorações e na prevenção das doenças dos ruminantes, tendo ainda um
papel importante na informação aos produtores, na movimentação animal e no apoio ao comércio. A baixa
participação dos produtores na erradicação e a baixa implementação de medidas de biossegurança, (conjunto de
medidas relacionadas com as instalações e com o maneio, orientadas para proteger os animais presentes na
exploração pecuária da entrada e difusão de doenças infecto-contagiosas), estão directamente relacionadas com a
persistência desta doença em determinadas regiões de Portugal.
O programa de erradicação da brucelose dos pequenos ruminantes tem como primeiro objectivo garantir a
manutenção do estatuto sanitário oficialmente indemne dos efectivos através da correcta identificação animal, da
testagem de todos os efectivos, do controlo dos movimentos dos animais e da implementação das medidas de
biossegurança por parte do produtor. Como segundo objectivo, garantir a redução dos níveis de infecção através da
realização das reinspecções, da decisão de abate sanitário dos animais positivos, da indemnização aos produtores
dos animais sujeitos a abate sanitário e da implementação da vacinação com Rev.1.
Os programas especiais de vacinação com Rev.1 são implementados nos casos em que a DGV entenda que factores
de ordem sanitária o justifiquem, como aconteceu em Trás-os-Montes em 2001 e no Algarve em 2005, assim como
em unidades epidemiológicas no Centro e no Alentejo. Actualmente a vacina Rev.1 é aplicada exclusivamente por
via conjuntival, sendo uma ferramenta chave do programa de erradicação, muito eficaz para proteger os ovinos e os
caprinos, principalmente em áreas epidemiológicas de risco. Previne ainda os abortos, reduzindo assim a
disseminação da brucelose nos efectivos de ovinos e caprinos e a brucelose humana.
Como factores de risco mais importantes refiro e existência de “rebanhos abertos”, a utilização de pastos comuns,
os contactos de risco e a contaminação das pastagens pelos materiais provenientes dos abortos.
A dificuldade do produtor em implementar as medidas de biossegurança (poucos produtores quantificam a análise
do custo-benefício das mais valias que resultam da manutenção do estatuto oficialmente indemne) é um ponto
crítico deste programa. Outros pontos críticos estão relacionados com as actuações de rotina e a falta de motivação
dos seus intervenientes nesta fase final de erradicação.
Os factores que contribuem positivamente para a erradicação estão directamente relacionados com, a identificação
electrónica de todos os efectivos infectados (B2.1), a execução da totalidade das intervenções sanitárias em todos os
efectivos a nível nacional, o cumprimento das datas de reinspecção (repetições), o saneamento dos efectivos não
aderentes das OPP, os abates totais e a atenção aos efectivos problema. Vacinar pelo menos 80% das fêmeas de
substituição nas áreas abrangidas pelos programas especiais de vacinação é também um factor que contribui em
muito para a erradicação desta doença.
O sucesso da erradicação depende, aplicável a todos os intervenientes, do nível de conhecimento, do grau de
participação, do envolvimento, da atenção dada aos pormenores e da tomada de consciência de que estamos perto da
erradicação.
Reconhecer a médio prazo, certas DIV no continente, como áreas oficialmente indemnes de brucelose dos ovinos e
caprinos, é um dos objectivos a atingir no programa.
Em conclusão, pretende-se transmitir a importância do envolvimento dos produtores no programa de erradicação
através do aumento da sua participação e responsabilização na erradicação ou seja transmitir que isto também é um
problema seu e não só da administração (principio da responsabilização).
69
A Tipificação Molecular no estudo epidemiológico de estirpes de Brucella melitensis isoladas de
Humanos e de Animais
Ferreira, A.C.1,2, Chambel, L.2, Tenreiro, R.2 e Corrêa de Sá, M.I.1
2 Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional (BioFIG), Portugal
A Brucelose é uma zoonose que afecta humanos e animais em todo o mundo. A ocorrência desta infecção em
humanos depende dos reservatórios animais e ocorre, quer por contacto directo com aqueles, quer pelo consumo de
leite cru ou produtos lácteos contaminados. Brucella melitensis (biovars 1,2 e 3) infecta sobretudo, ovinos e
caprinos. É também o principal agente da brucelose humana. As diferentes espécies e biovares de Brucella
distinguem-se usualmente através de métodos microbiológicos, serológicos e químicos, mas esta caracterização
fenotípica não permite a rastreabilidade da estirpe. Tandens Repeats são marcadores genéticos que permitem obter
grande informação em bactérias como as do género Brucella, com elevada homogeneidade genética (similaridade
DNA/DNA superior a 90%). Uma das aplicações destes marcadores genéticos polimórficos foi desenvolvida num
ensaio denominado “Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis” (MLVA) que tem sido utilizado
como uma abordagem molecular na tipificação de isolados para permitir a rastreabilidade da estirpe. No presente
trabalho estudaram-se 43 estirpes de B.melitensis isoladas de humanos e 78 isoladas de ovinos, caprinos, bovinos e
suínos de todas as Regiões Portuguesas. As estirpes de campo e de referência dos biovares 1,2 e 3 de B. melitensis
foram submetidos ao ensaio de MLVA, utilizando 16 marcadores genéticos, 8 mini satélites de fácil leitura (Painel
1) e oito microsatélites com um elevado poder discriminatório (Paneis 2A e 2 B). Os 121 isolados tipificaram em
todos os loci e agruparam-se em 61 genótipos. Os valores dos índices de diversidade de Simpson foram de 0.30 no
Painel 1, 0.41 no Painel 2A e 0.98 no Painel 2B. A maioria dos isolados de B.melitensis biovar 3 associa-se no
mesmo genótipo do Painel 1 e 2 A e com B. melitensis biovar 2 estirpe de referência que difere apenas num único
locus (bruce12). Estes isolados aparecem assim mais relacionados com a estirpe de referência biovar 2 do que com a
estirpe de referência do seu biovar. Algumas estirpes de Portugueses, isoladas em Hospitais Portugueses e em
França em 2005 têm o mesmo genótipo, o que indica que é o mesmo surto. Também, algumas estirpes humanas
estão associadas com estirpes de animais o que indica que têm a mesma origem. Estes elementos confirmam que o
MLVA pode contribuir significativamente para estudos epidemiológicos de rastreabilidade das infecções por
Brucella.
[Molecular typing of animal and human Brucella melitensis isolates for epidemiological purposes]
Brucellosis is a zoonosis affecting worldwide human and animals. The occurrence of this infection in humans is
large dependent on the animal reservoir and can occur by direct contact with infected animals or through the
consumption of contaminated dairy products. Brucella melitensis (biovars 1, 2 and 3) causes abortion and infertility
in their natural hosts, sheep and goats, and produces the most severe infection in humans. The species and biovars
are currently distinguished by microbiological, serological and chemical tests but this phenotypic characterization
does not allow tracing back the origin of the source for epidemiological application. In the last years, several
attempts have been made to develop molecular methods with epidemiological value but most of them showed a
limited capability to differentiate single Brucella strains. Tandem Repeats are a source of very informative markers
for bacterial pathogens with a high genetic homogeneity like Brucella (with more than 90% DNA/DNA similarity).
One of the applications of those highly polymorphic markers is the Multiple-Locus Variable-Number TandemRepeat Analysis (MLVA) developed by Le Fleche et al. (2006) that can be used as a molecular approach to
streamline strain typing, permitting to trace back strain origin. In the present work 43 human B. melitensis isolates
and 78 B. melitensis field isolates from bovine, swine, sheep and goats from all Portuguese Regions were evaluated
for trace-back investigations. The isolates and reference strains from biovars 1, 2 and 3 were subjected to MLVA
using 16 genetic markers comprising eight user–friendly minisatellite markers (Panel 1) and eight microsatellite
markers of higher discriminatory power (Panels 2A and 2B). All 121 isolates were typed at all loci and clustered in
64 genotypes. The Simpson‟s diversity index values were 0.39 in Panel 1, 0.41 in Panel 2A and 0.98 in Panel 2B.
Most of B. melitensis biovar 3 isolates clustered in the same genotype in Panel 1 and 2A with B. melitensis biovar 2
reference strain, that is different only in one locus (bruce12). These isolates are then more related with biovar 2
reference strain than with the reference strain from its own biovar. Some Portuguese human strains isolated in
Portugal and France in 2005 show the same genotype, indicating that they belong to the same outbreak. Also some
human strains cluster together with animal strains indicating the same source of infection. These data confirm that
MLVA can significantly contribute to epidemiological trace-back of Brucella infections.
70
O controlo da brucelose na Beira Interior na última década
Maria Eugénia Lemos
Direcção-Geral de Veterinária, Núcleo de Intervenção de Gouveia, Portugal
O Controlo da brucelose dos pequenos ruminantes na Beira Interior, zona de produção de leite para fabrico de
Queijo de leite cru – “Queijo Serra da Estrela”, zona de minifúndio, de partilha de pastagens e onde ainda se pratica
a transumância, baseou-se em:
1- Definição de áreas epidemiológicas de risco;
2- Implementação, numa primeira fase, de uma estratégia baseada no abate na totalidade dos efectivos infectados,
onde não era possível implementar as medidas de profilaxia e policia sanitária capazes de melhorar a situação,
nomeadamente, o isolamento dos animais suspeitos na exploração, interditação de movimento de espécies animais
sensíveis de e para a exploração. Após vazio sanitário o repovoamento destas explorações foi feito exclusivamente
com animais vacinados com Rev1;
3- Implementação, numa segunda fase de um programa continuado de vacinação dos animais jovens com Rev1 por
via conjuntival, em todos os efectivos das áreas epidemiológicas consideradas de risco.
Esta estratégia, aplicada ao longo de 10 anos na Beira Interior, resultou na diminuição da prevalência da brucelose
em efectivos de 20,5% para 0%, e na diminuição da prevalência em animais de 2,48% para 0%.
O sucesso no Controlo da brucelose dos pequenos ruminantes na Beira Interior, deve-se ao trabalho conjunto da
Direcção de Serviços de Veterinária da Região do Centro, da OPP - ANCOSE (Associação Nacional de Criadores
de Ovinos da Serra da Estrêla) e do Laboratório da União dos ADS de Viseu e seria obviamente impossível sem a
total adesão dos produtores ao programa de vacinação dos animais jovens com Rev1.
[The control of brucellosis in Beira Interior, in the last decade]
The control of brucellosis in small ruminant in Beira Interior, an area of milk production for cheese making using
raw milk – “Serra da Estrela” cheese, an area of smallholding farms, where pastures are shared and where
transhumance is still practiced, was based on:
1- Definition of epidemiological risk áreas;
2- Implementation of a strategy based, in a first phase, on the slaughter of infected flocks, where it was not possible
to implement the measures of prophylaxis and sanitary police, like the isolation of suspected animals and the
interdiction of movements of susceptible animal species from and to the farms. After stamping out, the restocking
was made exclusively with animals vaccinated with Rev1.
3- In a second phase of the brucellosis control, a continuing program of vaccination of the young replacement
animals with conjunctival Rev1 was applied, covering all herds of areas considered epidemiologically of risk.
This strategy, applied throughout 10 years in Beira Interior, resulted in the decreasing of prevalence of brucellosis in
herds, from 20.5% to 0%, and in the reduction of the prevalence in animals from 2.48% to 0%.
The success of small ruminants brucellosis control in Beira Interior, resulted from the joint efforts of the Direcção
de Serviços de Veterinária da Região do Centro, the OPP- Ancose and the Laboratory da União dos ADS de Viseu,
e would be obviously impossible without total adhesion of the producers to the program of vaccination of the young
animals with Rev1.
the definition of epidemiological risk areas, with application in those areas, of a disease control strategy, based
initially in the slaughter of all infected herds, and the simultaneous application of a non-stop program of vaccination
of young animals with Rev1.
This strategy was applied over 10 years in certain areas, resulting in the decreasing in prevalence of brucellosis in
herds to 0%. This success is due to the joint work of the DSVRC (Centre Region Veterinary Services), OPP
ANCOSE (Serra da Estrela Ewes Producers Organisation) and the diagnostic laboratory (ADS Union of Viseu), and
with the total commitment of farmers to the vaccination program of young animals with Rev1.
71
Qualidade da carne e do leite/queijo de ovinos e caprinos: factores de diferenciação
José António Mestre Prates
Os produtos edíveis (carne, leite e queijo) dos pequenos ruminantes (ovinos e caprinos) são, em geral, considerados
pelos consumidores como naturais, com características sensoriais específicas, isentas de substâncias tóxicas e
alimentos de “luxo” devido ao seu elevado preço. A imagem favorável deste tipo de alimentos junto dos
consumidores Portugueses contribuiu certamente para a certificação (DOP/IGP) das 8 carnes de borrego/cordeiro, 5
carnes de cabrito e 13 queijos ou produtos à base de leite actualmente existentes. Nesta comunicação é apresentada a
composição nutricional típica dos produtos edíveis dos pequenos ruminantes, dos principais factores que a
influenciam, bem como ainda das características distintivas de cada um destes alimentos.
De um modo geral, a carne caracteriza-se por apresentar uma elevada densidade e variedade de nutrientes, associada
a uma excelente biodisponibilidade dos mesmos. Apesar da sua composição química ser bastante variável,
principalmente no teor e na composição dos lípidos, a carne é uma excelente fonte de proteínas de elevado valor
biológico, de ferro de elevada biodisponibilidade (principalmente as carnes vermelhas) e de diversos
micronutrientes, tais como algumas vitaminas e minerais. A carne é, no entanto, muito pobre em vitaminas A e C, e
a dos ruminantes apresenta uma gordura relativamente saturada. Para além destes nutrientes clássicos, outros
componentes da carne têm sido considerados importantes para a saúde Humana, tais como a taurina, a L-carnitina, o
ácido linoleico conjugado (ruminantes) e os antioxidantes endógenos.
Por outro lado, o leite é uma excelente fonte alimentar de proteínas (apesar poucos aminoácidos sulfurados), cálcio
(elevada absorção), fósforo, riboflavina, vitamina B12, vitamina A, tiamina e magnésio, mas pobre em ferro. A
extracção da gordura do leite remove os seus lípidos relativamente saturados e aumenta o teor dos nutrientes
hidrossolúveis mas, por outro lado, provoca a perda da maioria das suas vitaminas liposolúveis (A, D e E). Para
além do cálcio, também os péptidos bioactivos derivados das proteínas do leite têm sido considerados protectores da
saúde Humana. O elevado teor do leite e produtos lácteos de ovelha em ácidos gordos de cadeia curta e média
parece ser de grande relevância nutricional, dado que estes compostos têm sido considerados benéficos para a saúde
Humana. Por último, alguns estudos indicam um efeito preventivo da deficiência em ferro do leite de cabra, o qual
pode ser devido à maior biodisponibilidade do seu ferro (também ocorre para o cálcio, fósforo e magnésio).
[Quality of ovine and caprine meat and milk/cheese: differentiation factors]
Edible products (meat, milk and cheese) from small ruminants origin (ovine and caprine) are, in general, view by the
consumers as natural products, with a characteristic flavor, which because of their high price, are regarded as luxury
products. The positive impression by the Portuguese consumers certainly contributed to the certification (PDO/PGI)
of the current 8 lamb meats, 5 kid meats, and 13 cheeses or milk-derived foods. In this communication, the typical
nutritional composition of edible products from small ruminants and its main influencing factors, as well as the
specific characteristics of each one, is described.
In general, meat is characterized by a high density and variety of nutrients, as well as by their excellent
bioavailability. In spite of the quite variable chemical composition, mainly concerning lipid content and
composition, meat is an excellent source of dietary proteins with high biological value, iron with high bioavailability
(mainly red meats) and several micronutrients, such as vitamins and minerals. However, meat is very poor in
vitamins A and C, and meat fat from ruminant origin is relatively saturated. In addition to these classical nutrients,
other meat components are considered important for Human health, such as taurine, L-carnitine, conjugated linoleic
acid (ruminants) and endogenous antioxidants (including ubiquinone, glutathione, lipoic acid, spermine, carnosine
and anserine).
Milk is an excellent dietary source of proteins of high biological value (although slightly deficient in the sulfur
amino acids, calcium (high absorption), phosphorus, riboflavin, vitamin B12, vitamin A, thiamine and magnesium,
although poor in iron. Extraction of fat from milk removes most of the fat-soluble vitamins (A, D and E) and fatty
acids originally present, which are relatively saturated, but the nutrient density of other nutrients is significantly
increased. In addition of calcium, also bioactive peptides derived from milk proteins have been considered
beneficial for Human health. The unique richness in short and medium chain fatty acids in sheep milk and its
derivatives is of high nutritional relevance due to their claimed beneficial effects to Human health. Finally, it has
been reported that goat milk protects from iron deficiency, which can be due to the higher bioavailability of its iron
(also occur for calcium, phosphorus and magnesium).
72
Valorização da composição lipídica da carne de borrego por via da alimentação
Eliana Jerónimo
Centro de Biotecnologia Agrícola e Agro-Alimentar do Baixo Alentejo e Litoral (CEBAL), Beja, Portugal
O consumo de produtos edíveis dos ruminantes tem sido associado ao aumento do risco de doenças
cardiovasculares, devido ao seu elevado conteúdo em ácidos gordos saturados (AGS) e ácidos gordos (AG) trans e
baixos níveis em ácidos gordos polinsaturados (AGPI). Este perfil de AG da gordura dos ruminantes deve-se ao
intenso metabolismo lipídico no retículo-rúmen, onde os lípidos da dieta são hidrolisados e os AG insaturados
libertados são bioidrogenados. No entanto as gorduras dos ruminantes também podem ser uma fonte alimentar de
alguns AG com efeitos benéficos, como de AGPI da série n-3 e de isómeros conjugados do ácido linoleico (CLA).
Vários estudos demonstram que existe oportunidade para melhorar o valor nutricional da gordura dos ruminantes
através da manipulação da dieta. Assim, o presente trabalho teve por objectivo explorar várias estratégias
nutricionais que possam melhorar o valor nutricional dos lípidos da carne de borrego. Em todos os ensaios foram
utilizados borregos machos da raça Merino Branco alimentados com uma dieta base composta por luzerna
desidratada.
A suplementação das dietas com 6% de óleos vegetais ricos em AGPI mostrou ser uma abordagem eficaz para
reduzir a saturação da carne de borrego e aumentar o seu conteúdo em AGPI. A utilização de misturas de óleos ricos
em ácido linoleico (óleo de girassol) e em ácido linolénico (óleo de linho) permitiu aumentar simultaneamente o
conteúdo em CLA e em AGPI n-3 de cadeia longa (≥ 20 carbonos) na carne, obtendo-se a maior soma destes dois
grupos de AG (CLA + AGPI n-3 de cadeia longa) nos borregos suplementados com uma mistura composta por óleo
de girassol e óleo de linho na proporão de 1:2 (v/v). A inclusão de 2% de bentonite sódica (argila) em dietas
suplementadas com óleo também permitiu melhorar a composição em AG na carne de borrego, prevenindo o
aumento característico do ácido 18:1 trans-10, que tem sido associado a efeitos prejudiciais. A incorporação de
Cistus ladanifer (esteva) na dieta parece ser uma estratégia nutricional promissora para melhorar o valor nutricional
da carne de borrego. Verificamos que a inclusão de 25% de C. ladanifer em dietas suplementadas com óleo aumenta
significativamente a deposição de CLA na carne (+41% que as outras dietas suplementadas com óleo). Além disso,
a inclusão de C. ladanifer na dieta permitiu aumentar a resistência da carne contra a oxidação lipídica sem
comprometer as propriedades sensoriais características da carne de borrego.
[Valorisation of the lipid composition of lamb meat through the diet]
The consumption of edible products of ruminant have been associated to an increase of the risk of cardiovascular
diseases, due to its high content in saturated fatty acids (SFA) and trans fatty acids (FA) and low content in
polyunsaturated fatty acids (PUFA). This FA profile of the ruminant fat is due to intense lipid metabolism in
reticulo-rumen, where the dietary lipids are hydrolysed and the unsaturated FA released are biohydrogenated.
However, ruminant edible products may also be a dietary source of some health benefit FA, such as n-3 PUFA and
conjugated linoleic acid isomers (CLA). Several studies have been show that there is an opportunity to improve the
nutritional value of ruminant fat through the changes in diet. So, present work aimed to explore some nutritional
strategies that allows improves the nutritional value of lipids from lamb meat. In all trials were used Merino Branco
ram lambs fed basal diet composed by dehydrated lucerne.
Supplementation of dehydrated lucerne with 6% of vegetable oils rich in PUFA showed to be an effective approach
to decrease the saturation of lamb meat and increase its content in PUFA. Utilization of blends of oils rich in linoleic
acid (sunflower oil) and in linolenic acid (linseed oil) allowed increase simultaneously meat content in CLA and n-3
long chain PUFA (≥ 20 carbons), obtaining the highest sum of these two group of FA (CLA + n-3 long chain
PUFA) in lambs supplemented with blend of sunflower oil and linseed oil in proportion of 1:2 (v/v). Inclusion of
2% of sodium bentonite (clay) in oil supplemented diets also allowed improve the FA composition of lamb meat,
preventing the characteristic increase of 18:1 trans-10, which has been associated to detrimental effects.
Incorporation of Cistus ladanifer (rockrose) in lamb diets seems to be a promising nutritional strategy to improve
the nutritional value of meat. We found that the inclusion of 25% of C. ladanifer in oil supplemented diets increase
significantly the CLA deposition in lamb meat (+41% than other oil supplemented diet). Moreover, inclusion of C.
ladanifer in diets increased the meat resistance against lipid oxidation without compromising the characteristic lamb
meat sensory properties.
73
Variação genética da composição caseínica do leite de ovelha – efeitos na produção e valor do leite
Maria do Rosário Marques e Ana Teresa Carmona Belo
INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal. Email: [email protected]
Os genes das caseínas do leite estão agrupados sequencialmente pela seguinte ordem: s1- (CSN1S1), s2(CSN1S2), - (CSN2) e -caseína (CSN3). As caseínas apresentam grande variabilidade tendo sido descritas
variantes com diferentes graus de fosforilação da proteína (detectadas por electroforese), variantes alélicas devidas a
polimorfismos genéticos que se traduzem pela substituição de um aminoacido por outro (detecção por técnicas de
biologia molecular) e variantes não alélicas resultantes do processamento diferencial do mRNA.
O leite de ovelha tem entre 4,5 e 7,3% de proteína, sendo que cerca de 80 a 85% da mesma é composta por caseínas:
CSN1S1 (33,9 a 39,9%), CSN1S2 (12,0 a 16,4%), CSN2 (37,0 a 42,3%) e CSN3 (9,1 a 10,8%). Esta variabilidade
ao nível da composição caseínica do leite explica-se por diferenças ao nível da expressão genéticas das diferentes
variantes caseínicas em função da raça, da fase de lactação e do regime alimentar dos animais. As variantes
caseínicas podem diferir entre si na carga eléctrica, no peso molecular e/ou nas suas características hidrofóbicas, o
que pode causar alterações das suas propriedades físico-químicas, tendo implicações na composição e qualidade do
leite e nas suas propriedades tecnológicas para o fabrico de queijo. Assim, as variantes caseínicas são marcadores
genéticos a considerar em programas de melhoramento de ovelhas leiteiras.
Neste trabalho far-se-á uma revisão sobre as mais recentes técnicas de identificação da variação genética da
composição caseínica do leite de ovelha e sobre os conhecimentos acerca do impacto das variantes caseínicas na
composição do leite e nas suas propriedades tecnológicas para o fabrico de queijo.
[Genetic variation of the casein composition of ewes’ milk – effects on milk production and
valorization]
Milk casein genes are organized within a cluster containing s1- (CSN1S1), s2- (CSN1S2), - (CSN2), and -casein
(CSN3) genes. The great variability in caseins is due to: differences at protein phosphorylation level, which can be
detected by electrophoresis; genetic polymorphisms causing non-synonymous substitution of aminoacids detected
by molecular methods at DNA level; or to differential transduction of mRNA causing non-allelic protein variants.
Protein content of ewes‟ milk ranges from 4.5 to 7.3%, from which 80 to 85% is casein: CSN1S1 (33.9 to 39.9%),
CSN1S2 (12.0 to 16.4%), CSN2 (37.0 to 42.3%), and CSN3 (9.1 to 10.8%). The variation on milk casein
composition may be explained by different expression levels of the casein variants related to ewes‟ breed, phase of
lactation, and/or feeding regime.
The casein variants may differ from each other in its electric charge, molecular weight and/or in its hydrophobicity,
which causes changes in their physico-chemical characteristics, with implication on milk composition and quality,
and on milk technological properties for cheese making as it has been described for several breeds. Thus, casein
genetic variants are possible markers to be used in breeding programmes of dairy ewes.
In this work a review will be made concerning the most recent techniques to identify the genetic variation of the
ewes‟ milk casein composition, and upon the impact of the casein variants on milk composition and its technological
properties for cheese making.
74
Efeito da espécie na resposta à suplementação lípidica e seu reflexo na composição em ácidos
gordos do leite
Rui J.B. Bessa, Rui M.H. Caldeira
A composição em ácidos gordos do leite das principais espécies de ruminantes é caracterizada pelo seu elevado teor
em ácidos gordos saturados e pela elevada concentração de ácidos gordos de cadeia curta e média. O elevado grau
de saturação dos ácidos gordos do leite dos ruminantes é determinada pela extensa bio-hidrogenação ruminal dos
ácidos gordos polinsaturados da dieta e só é atenuada pela acção da enzima delta-9 dessaturase presente na glândula
mamária. Esta enzima é responsável pela síntese endógena dos ácidos gordos mono-insaturados e do ácidos
ruménico (o principal isómero conjugado do ácido linoleico – CLA). Os ácidos gordos de cadeia curta e média são
de origem exclusivamente endógena, sendo sintetizados apenas na glândula mamária. Existem contudo diferenças
notáveis entre as principais espécies de ruminantes quanto ao seu metabolismo lipídico que determinam a
composição em ácidos gordos dos leites de caprino, ovino e bovino. O leite de caprinos é mais rico em ácidos
gordos saturados com 8 e 10 carbonos (C8:0 e C10) do que o leite bovino, que possui maior concentração de C4:0 e
C16:0. Estas diferenças indicam uma distinta regulação das vias de biossíntese dos ácidos gordos na glândula
mamária destas espécies.
A suplementação da dieta dos ruminantes leiteiros com o objectivo de melhorar a composição em ácidos gordos do
leite é uma prática amplamente explorada experimentalmente e já estendida à realidade produtiva. A resposta na
produção e composição do leite à suplementação lipídica apresenta, igualmente, diferenças marcadas entre espécies.
Nos caprinos a suplementação lípidica aumenta, de forma consistente o teor butiroso do leite, enquanto que nos
bovinos a resposta é muito variável, podendo ocorrer forte depressão do teor butiroso se a dieta base for muito rica
em carbohidratos fermentescíveis. A informação disponível sobre a resposta à suplementação lípidica na quantidade
e composição em ácidos gordos do leite, em ovinos, é muito mais escassa do que a para os bovinos e caprinos,
contudo, indica que terão um comportamento semelhante aos caprinos. As implicações destas diferenças
intraespecíficas no metabolismo lípidico e sua regulação, e em particular da actividade da enzima delta-9
dessaturase, no delineamento de estratégias nutricionais de modular a composição em ácidos gordos do leite serão
discutidas.
[Differential responses to lipid supplementation on ruminants’ species and their impact on fatty
acid composition of milk]
Fatty acid composition of milk from ruminants is characterized by high content of saturated fatty acids and of short
and medium chain fatty acids. The high content in saturated fatty acids is determined by the extensive
biohydrogenation of dietary polyunsaturated fatty acids conducted in the rumen microbial ecosystem. The activity of
delta-9-desaturase in mammary gland mitigate this by introducing a double bond in several saturated and trans fatty
acids, originating most of the monounsaturated fatty acids and the rumenic acid (the main conjugated linoleic isomer
– CLA). The short and medium chain fatty acids are almost exclusively from endogenous synthesis in mammary
gland of ruminants. However, notable differences in mammary lipid metabolism between ruminant species have
been described, determining differences in fatty acid composition of caprine, ovine and bovine milk. Goat milk is
richer in C8:0 and C10:0 fatty acids than cow´s milk, which is richer in C4:0 and C16:0, indicating that differences
in regulation of biosynthetic pathways in mammary gland in both species are present.
Dietary lipid supplementation of dairy ruminants have been largely explores experimentally and it is now applied in
some practical situations. The response to lipid supplementation on different ruminant species is also distinct. In
goats, lipid supplementation consistently increases the milk fat content, whereas in cows the response is highly
variable. Strong milk fat depression might occur in cows, after lipid supplementation, particularly if the basal diet
were rich in high fermentable carbohydrates. Much less information is available on effects to lipid supplementation
on milk fat content and composition in ewes. Nevertheless, the available information indicates that ewes display a
response pattern similar to goats. The implications of those intraspecific differences on mammary gland lipid
metabolism and its regulation on nutritional strategies for modulate fatty acid composition of milk, will be
discussed.
75
Efeito da suplementação lipídica na composição em ácidos gordos e dimetilacetais do conteúdo
ruminal de borregos alimentados à base de luzerna desidratada ou concentrado
Alves, S.P.1,2, Cabrita, A.R.J.3, Fonseca, A.J.M.2, Santos-Silva, J.1, Bessa, R.J.B.1,4
1 Unidade de Produção Animal, INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
2 REQUIMTE, ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
3 REQUIMTE, Departamento de Geociências, Ambiente e Ordenamento do Território, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto, Portugal
O metabolismo lipídico no rúmen é caracterizado pela intensa lipólise e biohidrogenação dos ácidos gordos (AG) e
síntese de novo pelos microrganismos. Este intenso metabolismo contribui muito para a composição lipídica dos
tecidos dos ruminantes e é modulado pelo tipo de dieta base. O objectivo deste trabalho é estudar a composição
detalhada em AG e dimetilacetais (DMA) do conteúdo ruminal de borregos alimentados a concentrado ou luzerna
suplementados com óleo de soja.
Trinta e dois borregos Merino Branco foram alocados aleatoriamente em 4 grupos alimentados ad libitum com uma
das quatro dietas: luzerna desidratada (L); luzerna desidratada com óleo de soja 10% (LO); concentrado (C);
concentrado com óleo de soja 10% (CO). O ensaio decorreu durante sete semanas e logo após o abate o conteúdo
ruminal foi recolhido, liofilizado e conservado a -80ºC até análise.
As amostras foram transesterificadas em meio básico/ácido de forma a extrair e esterificar os AG e simultaneamente
libertar os DMA dos plasmalogénios. De seguida as amostras foram fraccionadas por cromatografia em camada fina
obtendo-se os AG esterificados, assim como DMA, e AG com grupos oxo, hidroxilo e dimetilesteres. As fracções
foram analisadas por cromatografia gasosa com detecção por ionização de chama e identificados por espectrometria
de massa. O teor (mg/g MS) em AG foi maior nas dietas com óleo, enquanto os DMA, oxo, hidroxilos e
dimetilesteres não foram afectados pela interacção da dieta e suplementação com óleo. No entanto, mais de 65 AG
foram identificados demonstrando a complexidade do ecossistema ruminal. Cinco AG foram apenas identificados
nos animais alimentados à base luzerna e ausentes em C e CO. Vinte e sete DMA foram identificados, mas apenas
os DMA 16:0, 17:0 e 18:1c9 foram afectados pelas dietas, apresentando concentrações mais elevadas na dieta C do
que nas restantes dietas. Estes resultados sugerem que a composição microbiana em DMA não varia com a dieta e
com a suplementação. Os intermediários da biohidrogenação produzidos no rúmen foram afectados pela composição
da dieta, sendo mais elevados nas dietas à base de luzerna. A suplementação de luzerna com óleo aumentou o teor
em AG polinsaturados (AGPI) no rúmen incluindo os isómeros conjugados do ácido linoleico (CLA) que são
reconhecidos de serem benéficos para a saúde Humana. Desta forma com a dieta LO uma maior concentração destes
AG estará disponível para absorção e incorporação nos tecidos e consequentemente a sua concentração nos produtos
de ruminantes será enriquecida.
[Effect of lipid supplementation on the fatty acid and dimethylacetal composition of rumen content in lambs
fed dehydrated lucerne or concentrate]
Lipid metabolism in the rumen is characterized by intense lipolysis, fatty acid (FA) biohydrogenation and de novo
lipid synthesis by microorganisms. This intense metabolism contributes greatly to the lipid composition of ruminant
tissues which is also modulated by the basal diet. Thus, the objective of this work is to study the detailed FA and
dimethylacetals (DMA) composition of rumen contents from lambs fed concentrate or dehydrated lucerne
supplemented with soybean oil.
Thirty two Merino Branco lambs were randomly allocated into 4 groups that were fed ad libitum one of 4 diets:
ground and pelleted lucerne (L); ground and pelleted lucerne plus 10% soybean oil (LO); concentrate (C); and
concentrate plus 10% soybean oil (CO). Lambs stayed on trial for 7 wk and just after slaughter the total rumen
content was collected, lyophilized and stored at -80ºC until analysis.
Fatty acid methyl esters (FAME) from rumen samples were prepared by using a basic/acid transesterification
procedure, which also released DMA from plasmalogens. After transesterification, samples were fractionated by
thin-layer chromatography into purified FAME, DMA, and FA containing oxo, hydroxy and dimethylester groups.
The fractions were analysed separately by gas-liquid chromatography with flame ionization detection and identified
by mass spectrometry. The concentration (mg/g DM) of FAME was highest in oil supplemented diets, while DMA,
oxo plus hydroxy FAME and dimethylesters were not affected by the interaction of diet and oil supplementation.
However, more than 65 FAME were identified in rumen, demonstrating the complexity of the rumen ecosystem,
from them 5 were present in lucerne diets and absent in concentrate diets. Twenty seven DMA were identified in
rumen samples, but only the DMA 16:0, 17:0 and 18:1c9 showed greater concentrations in concentrated diet (C)
compared with CO, L and LO diets. These results suggest that microbial DMA composition does not differ with diet
and oil supplementation. The biohydrogenation intermediates produced in the rumen were affected by diet, with
lucerne producing more intermediates than concentrate diets. The supplementation of lucerne with oil increased the
content of polyunsaturated FA (PUFA) in the rumen, including the conjugated isomers of linoleic acid (CLA) which
are considered to be benefit to Human health. Therefore, with LO diet a high concentration of these FA will be
available for absorption and incorporation in tissues and consequentially their concentration in ruminant products
will be enriched.
76
Suinicultura
Plano Nacional de Resíduos: resultados suinicultura
Ana Isabel Gonçalves e Patrícia Inácio
Direcção Geral de Veterinária, Lisboa, Portugal
O Plano Nacional de Controlo de Resíduos (PNCR), dá cumprimento ao estabelecido no Decreto-Lei nº 148/1999,
de 4 de Maio e no Decreto-Lei nº 185/2005, de 4 de Novembro, e consiste num sistema de vigilância que visa
analisar e pôr em evidência perigos químicos nos géneros alimentícios de origem animal, esclarecer as razões da
presença desses resíduos nos alimentos, responsabilizando todos os intervenientes na cadeia da produção de animais
e de produtos de origem animal, pela segurança química dos produtos alimentares de origem animal destinados ao
consumo humano, bem como controlar os contaminantes ambientais.
A elaboração do plano, a sua implementação, avaliação de resultados e comunicação dos mesmos é da
responsabilidade da DGV. A colheita de amostras é efectuada pelas Direcções de Serviços Veterinários Regionais
da DGV, pela ASAE e pelas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira.
O PNCR engloba pesquisa de resíduos nos bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, aves (frangos, galinhas, perus
e patos), produtos de aquicultura, coelhos, caça de criação (codornizes), caça selvagem (javalis e veados), ovos, leite
e mel.
As pesquisas efectuadas incidem sobre dois grandes grupos de substâncias. O Grupo A refere-se a substâncias com
efeito anabolizante e substâncias não autorizadas, o Grupo B a medicamentos veterinários e contaminantes.
No ultimos três anos (2008-2010) foram colhidas 3273 amostras de suinos para pesquisa de substâncias do Grupo A
e 4296 amostras de suinos para pesquisa de substâncias do Grupo B. Da totalidade destas amostras obteve-se um
resultado positivo para substâncias do grupo A e dez resultados não conformes para o Grupo B. O número de
resultados não conformes anual registou uma descida acentuada no ultimo ano (2008 - 5; 2009 – 5; 2010 – 1).
[National Residues Control Plan: results on pigs]
The National Residue Control Plan (NRCP), gives effect to the provisions of Decree-Law No. 148/1999 of 4 May
and in Decree-Law No. 185/2005 of 4 November, and consists of a surveillance system aims to analyze and
highlight chemical hazards in food of animal origin, to clarify the reasons for the presence of such residues in food,
blaming all those involved in the production chain of animals and animal products, the chemical safety of food
products origin intended for human consumption, as well as controlling environmental contaminants.
The plan preparation, implementation, evaluation and communication of these results is the responsibility of the
DGV. Sampling is carried out by the Directorate of Veterinary Services Regional DGV, by ASAE and the
Autonomous Regions of Azores and Madeira.
The PNCR encompasses residue in cattle, sheep, goats, pigs, horses, poultry (chickens, hens, turkeys and ducks),
aquaculture products, rabbits, farmed game (quail), wild game (wild boar and deer), eggs milk and honey.
Research has focused on two main groups of substances. Group A refers to substances having anabolic effect and
unauthorized substances, the Group B to veterinary drugs and contaminants.
In the last three years (2008-2010) 3273 samples were collected from pigs to search for substances in Group A and
4296 samples of pigs for research on substances in Group B. Of all of these samples gave a positive result for Group
A substances and ten non-compliant results for Group B. The number of annual non-compliant results declined
sharply in the last year.
77
Ectoparasitoses dos suínos – sarna sarcóptica: impacto e controlo
José Miguel Lopes Jorge
Merial Portuguesa, Saúde Animal, Lda.
A sarna sarcóptica - agente causal: Sarcoptes sabiei var suis – é considerada a doença parasitária com maior
importância na suinicultura industrial e tem uma distribuição mundial. O impacto económico decorre da diminuição
da taxa de crescimento (entre -4,5% a -12%) e da redução da eficiência alimentar, podendo piorar a classificação das
carcaças ao abate e causar perdas na desmancha. Danos em instalações (divisórias, jaulas, etc.) podem resultar do
aumento do acto de coçar.
O impacto zoonótico do Sarcoptes sabiei var suis é limitado, podendo ocorrer infecções ocasionais e auto-limitadas
em seres humanos que contactem com animais infestados, com sintomas clínicos ligeiros, podendo ser exacerbados
em situações de depressão imunitária (ex: SIDA).
Clinicamente as zonas mais afectadas são a cabeça, as orelhas, o pescoço e o dorso dos porcos, ocorrendo sob duas
formas - hipersensível e escamosa.
Sendo muito comuns a formas ditas “subclínicas” da sarna, é vital um diagnóstico correcto. A detecção de ácaros
nos esfregaços de pele (ex: interior do pavilhão auricular) é muito específica, mas pouco sensível, podendo ser
complementada por outras abordagens (índice de prurido, índice de dermatite no matadouro e a avaliação de
anticorpos no soro sanguíneo).
A utilização de lactonas macrociclicas, nomeadamente da ivermectina (IVOMEC ®), ao “quebrar” o ciclo do parasita
(com duração de 10 a 28 dias), permite o controlo efectivo da doença e a sua erradicação. A disponibilização de
apresentações injectáveis e orais aumenta o leque de possibilidades de controlo.
O controlo pode ser efectuado com tratamentos estratégicos, baseados no conhecimento da epidemiologia da doença
– ex: desparasitação das reprodutoras antes do parto, que ao limitar a contaminação dos leitões, diminui a
mortalidade na maternidade, aumenta o peso ao desmame e melhora a eficiência alimentar. A desparasitação dos
porcos à entrada da engorda permite aumentar a taxa de crescimento e melhorar a eficiência alimentar.
O tratamento táctico, baseado na monotorização da doença – ex: avaliação do grau de infestação de sarna – e no
tratamento simultâneo de todo o efectivo com ivermectina (IVOMEC ®), injectável e/ou oral, ao erradicar a sarna,
possibilita a melhoria económica global da exploração, com melhores indicies reprodutivos (fertilidade, n.º de
leitões nados-vivos e n.º de leitões desmamados) e melhor eficiência alimentar (índice de conversão alimentar e
taxas de crescimento). O retorno do investimento da erradicação, dependendo das condições de mercado, pode ser
obtido em 3,7 meses.
[Swine Ectoparasites - Sarcoptic Mange - Impact and Control]
Sarcoptic mange - causal agent: Sarcoptes suis var suis - is considered the most important parasitic disease in the pig
industry and has a worldwide distribution. The economic impact results from a reduction in growth rate (between 4.5% to -12%) and reduced feed efficiency and may worsen carcasses‟ classification at slaughter and cause losses in
cutting. Facilities damage (dividing walls, cages, etc.) may result from the increase of scratching behavior.
Sarcoptes suis var suis zoonotic impact is limited, and there may be occasional self-limited infections in humans, in
contact with infected animals. Clinical symptoms are mild and may be exacerbated in situations of immune
depression (e.g. AIDS).
Clinically, the most affected areas are the head, ears, neck and backs, occurring in two forms - hypersensitive and
scaly.
Once that subclinical scabies is the most common form, a correct diagnosis is vital. Mites detection in skin smears
(eg, inside the ear) is very specific but with low sensitivity, can be complemented by other approaches (itching
index, dermatitis index at the slaughterhouse and evaluation of antibodies in blood serum).
The use of macrocyclic lactones, particularly of ivermectin (IVOMEC®), "breaks" the parasite life cycle (normal
length: 10 to 28 days), allows effective disease control and eradication. The availability of injectable and oral
presentations increases the range of control strategies.
Control can be performed with strategic treatments based on disease epidemiologic knowledge - eg sows deworming
before farrowing, which limit the contamination of the pigs, decreases farrowing crates mortality, increases weaning
weights and improves feed efficiency. Pigs deworming at the beginning of fattening will increase growth rate and
will improve feed efficiency.
Tactical treatment, based on disease monitoring - e.g., assessing the degree of scabies infestation - and in the
simultaneous treatment of all livestock with ivermectin (IVOMEC®), injection and / or oral, to eradicate scabies,
improves farmer‟s profit economic, with better reproductive indexes‟ (fertility, number of piglets born alive and
weaned piglets) and better feed efficiency (feed conversion ratio and growth rates). The return on investment of the
eradication implementation, depending on market conditions, can be obtained in 3.7 months.
78
Triquinose
Francisco Geraldes Neto
Câmara Municipal de Resende
De acordo com o relatório da EFSA “Comunity Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic
Agents and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008”, na Europa, a triquinelose tem sido descrita
como uma doença emergente e/ou reemergente nas últimas décadas, sendo a principal fonte de infecção para o
homem a carne de javali e a carne de porco não inspeccionada. Assim como em 2007, também em 2008, Trichinella
spp. foi mais frequentemente detectada em javalis selvagens do que em suínos. O maior número de porcos positivos
a Trichinella foi notificado pela Roménia, seguido da Espanha e Polónia, mas sempre com valores de prevalência
muito reduzidas (≤0,03). Portugal não notificou nenhum caso positive (EFSA, 2010).
O objectivo desta breve comunicação sobre esta importante zoonose, será abordar de uma forma sintética o ciclo
evolutivo da Trichinella spiralis, dando especial atenção aos principais aspectos epidemiológicos e numa segunda
vertente realçar o diagnóstico que actualmente se pratica em todos os matadouros de suínos, enfatizando em
particular a metodologia utilizada – método de digestão enzimática, como é exemplo o Matadouro Municipal de
Resende.
Por fim terminaremos a nossa apresentação focando as principais medidas de profilaxia nas suiniculturas,
matadouros e montarias ao javali focando em particular os seguintes aspectos:
- Promoção de medidas higienicas nas instalações das suiniculturas, matadouros e locais de caça ao javali;
- Despistagem da infestação dos potenciais animais portadores de larvas de Trichinella, em particular javali, cavalo
e suínos domésticos;
- Tratamento ou destruição das carnes contaminadas.
[Trichinosis]
According to the EFSA report "Comunity Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents
and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008", trichinellosis has been described as an emerging and/or
re-emerging disease, in recent decades, in Europe. Uninspected wild boar meat and pork are main sources of human
trichinellosis. As in 2007, Trichinella spp. was detected more often in non-farmed wild boar than in slaughter pigs.
The highest number of Trichinella-positive slaughter pigs was reported by Romania, followed by Spain and Poland,
although still at very low prevalence (≤0.03). Portugal did not report any positive cases (EFSA, 2010).
The purposes of this brief communication on this important zoonosis, are firstly to address shortly the evolutive
cycle of Trichinella spiralis, giving special attention to the main epidemiological aspect and secondly, to highlighted
the aspects of diagnosis that is currently practiced in all pig slaughterhouses, emphasizing in particular the
methodology - method of enzymatic digestion, as practiced at the Municipal Slaughterhouse of Resende.
Finally we end the presentation focusing on key measures of prevention and controlling trichinellosis in pig farms,
slaughterhouses and wild boar hunting campaigns, focusing in particular on the following aspects:
- Promotion of hygienic measures at the premises of pig farms, slaughterhouses and wild boar hunting campaigns;
- Screening of potential infestation of animals with Trichinella larvae, especially wild boar, horse and domestic pigs;
- Treatment or destruction of infected meat.
EFSA (2010). The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the
European Union in 2008, EFSA Journal; 2010 8(1):1496.
79
Estratégias para a redução da prevalência de Salmonella em suínos
Filipa Baptista
University of Copenhagen, Faculty of Life Sciences
A Salmonella é o segundo agente mais reportado de doenças zoonóticas de origem alimentar na União Europeia
(UE). A carne de porco é considerada uma importante fonte de Salmonella para os humanos, sendo responsável por
10-20% dos casos notificados.
Apesar de em alguns países já vigorarem programas de monitorização de Salmonella em suínos e carne de porco, na
maioria não estão implementadas medidas de controlo. Nesta perspectiva, foram avaliadas estratégias de vigilância,
designadamente opções custo-eficazes para mitigação do risco de Salmonella, tendo como objectivo a redução do
número de casos de salmonellose no Homem atribuídos ao consumo de carne de porco.
A vigilância com base no risco combina metodologias de análise de risco com metodologias clássicas de vigilância
epidemiológica, tendo como objectivo uma afectação custo-eficaz dos recursos de vigilância. Assim, foram
utilizados princípios de análise de risco para identificar factores de risco ao nível da exploração e do matadouro para
avaliar o efeito de diferentes intervenções na prevalência de Salmonella em carcaças. O impacto das intervenções na
exploração foi avaliado indirectamente através de simulações da redução da seroprevalência de Salmonella em
suínos enviados para abate. Foram também incluídas no modelo diferentes intervenções realizadas em matadouro,
designadamente o abate sanitário, o abate logístico e estratégias de descontaminação, tais como a descontaminação
por água quente, por vapor e ultrasons e por vapor e vácuo.
Em Portugal, poderá recorrer-se a uma abordagem indirecta para identificar explorações de alto risco de Salmonella.
Um modelo de classificação com base nas características da exploração, designadamente do seu nível de
biosseguranca, poderá representar uma alternativa ao recurso a esquemas de amostragem intensivos e dispendiosos,
como a vigilância serológica. Um maior rigor na execução de boas práticas no matadouro poderá resultar em
maiores reduções da prevalência de Salmonella em carcaças, comparativamente com intervenções na exploração.
Dependendo das metas Europeias a atingir, poderão ser necessárias outras intervenções, tais como a
descontaminação (ex. vapor e vácuo). As intervenções no matadouro em suínos provenientes de explorações de alto
risco poderão representar uma estratégia de vigilância custo-eficaz, acrescidas da redução do risco para a saúde
pública.
[Strategies for the reduction of Salmonella prevalence in pigs]
Salmonella is the second most frequent agent of reported foodborne zoonoses in the European Union (EU). Pork is
considered to be a significant source of Salmonella in humans, accounting for an estimated 10-20% of the cases.
Monitoring programmes for Salmonella in pigs and pork are in place in a few countries. However, surveillance programmes
for Salmonella in pigs and pork, including control measures, are lacking in most countries. Therefore, different surveillance
strategies need to be evaluated, including cost-effective risk-mitigation options for reducing the number of human
salmonellosis cases attributed to pork.
Risk-based surveillance combines risk assessment methodologies with traditional surveillance, aiming to obtain a costeffective allocation of surveillance resources. Risk-based principles were used to identify herd and abattoir risk factors and
to evaluate the effect of different interventions on the Salmonella carcass prevalence. Herd interventions were indirectly
measured by simulating a Salmonella seroprevalence reduction in slaughter pigs. Different abattoir interventions were
included in the model, including sanitary slaughter, logistic slaughter and decontamination strategies (hot-water
decontamination, steam ultrasound and steam vacuum).
In Portugal, an indirect approach might be used to identify Salmonella high-risk herds. A classification tool based on herdlevel information, particularly biosecurity practices, might be an alternative to intensive and relatively expensive sampling
schemes, such as the serological surveillance used in Denmark. Improvement of abattoir practices is likely to result in larger
reductions of the Salmonella carcass prevalence, compared to herd interventions. However, depending on the specific
reduction targets set, other interventions such as decontamination (e.g. by steam-vacuum) might be required. Targeted
abattoir interventions to high-risk herds might present a cost-effective surveillance strategy, further reducing the risk posed
to human health.
80
Biologia Celular e Molecular
Modulação dos mecanismos de reparação do ADN celular pelo Vírus da Peste Suína Africana
Simões, M.1, Martins, C.1, Ferreira, F.2
1 CIISA, Laboratório de Doenças Infecciosas e 2 CIISA, Departamento de Morfologia e Função, Faculdade de Medicina Veterinária,
Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Introdução: Os mecanismos de replicação genómica do Vírus da Peste Suína Africana (VPSA) continuam
desconhecidos e só muito recentemente, foram iniciados estudos para a compreensão da sua fase de replicação
intranuclear. As proteínas celulares que participam na detecção e na reparação do ADN danificado são responsáveis
pela manutenção da integridade genómica e restauro de funções da célula ou pela indução da apoptose. Sabendo que
alguns vírus utilizam estas proteínas para facilitar a sua replicação no núcleo, iniciámos o estudo da modulação da
resposta das vias de reparação de ADN induzidas pela infecção por VPSA.
Material e Métodos: Realizaram-se ensaios de pulso-caça com 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) e a respectiva
análise da localização subnuclear das proteínas envolvidas na reparação de ADN lesado por ImunoFluorescência
Indirecta (IFI). A expressão proteica de vários sensores, mediadores e efectores da via de reparação de ADN foi
analisada ao longo da infecção viral (1, 3, 6, 12, 24, 30 horas pós-infecção) pela técnica de Western Blot (WB) em
extractos totais de células Vero e de macrófagos de suíno, infectadas com as estirpes do VPSA Ba71V e L60,
respectivamente. Células expostas a UV serviram de controlo positivo e, células infectadas e tratadas com
hydroxiureia, arabinose C ou cycloheximida como controlos de actividade de replicação e de transcrição virais.
Resultados: Os ensaios de pulso-caça permitiram observar a incorporação de BrdU pelo ADN viral recémsintetizado, em locais específicos, adjacentes ao invólucro nuclear. Foi igualmente identificada uma acumulação de
proteínas de reparação (Nbs1) junto das fábricas virais. Na fase inicial da infecção foi observado um aumento da
expressão de PARP-1 (sensor), RPA32 (mediador) e da forma fosforilada p53. A forma fosforilada da proteína
Chkl, um efector dos mecanismos de reparação de ADN também apresenta níveis que aumentam ao longo da
infecção. O uso de fármacos inibidores da transcrição (CHX) em células infectadas mostrou uma supressão dos
níveis de RPA32 fosforilada.
Conclusões: A infecção celular por ASFV conduz a fenómenos de modulação das proteínas de reparação do ADN.
Algumas destas proteínas são activadas induzindo uma resposta celular natural à presença de quebras de cadeia de
ADN enquanto outras são recrutadas para junto da fábrica viral. Estes ensaios revelam pormenores dos mecanismos
de replicação e transcrição do VPSA no núcleo da célula hospedeira.
Estes trabalhos foram financiados pela Fundação para a Ciência e Tecnologia através do projecto (PTDC/CVT/105630/2008) e da bolsa de
doutoramento (SFRH/BD/65532/2009).
[Modulation of cellular DNA damage response by African Swine Fever Virus]
Background: African Swine Fever Virus (ASFV) replication mechanisms are poorly understood and its nuclear
phase is only now starting to be unraveled. Knowing that cellular DNA repair proteins are responsible to maintain
genomic integrity, recognizing DNA damage and then restoring functions or inducing apoptosis and, that some
viruses use the same enzymes to thrive, we addressed the modulation of these proteins induced by ASFV.
This study‟s aim is to show ASFV‟s ability to manipulate cellular DNA damage response (DDR) in order to succeed
eluding and using the host cell nucleus.
Methodology: Pulse-chase experiments and analysis by Indirect ImunoFluorescence (IIF) were performed to
identify specific nuclear DDR proteins and its mis/colocalization with viral replication foci. Western Blotting (WB)
was carried out both with Vero cells and swine macrophage whole cell extracts, infected with ASFV Ba71V and
L60 viral strains, respectively. Protein expression levels of several sensors, mediators and effectors of recognized
DDR pathways were analyzed through time course infection (1, 3, 6, 12, 24, 30 p.i. hours). UV treated cells served
as positive control and treatments with hydroxyurea, arabinoside C and cycloheximide (CHX) as replication and
transcription viral activity controls.
Main findings: The pulse-chase assay allowed us to check the incorporation of BrdU [5-bromo-2‟deoxyuridine] (in
newly synthesized viral DNA) at specific sites, adjacent to nuclear periphery. Furthermore, we also noted the
recruitment and accumulation, nearby the viral factory, of particular proteins (e.g. Nbs1, a DNA damage sensor).
Through protein detection by immunoblots (WB) we observed an increasing activation of PARP-1 (DNA damage
sensor), RPA32 (DNA damage mediator) and the phosphorylated form of p53 “the guardian of the genome”
accompanying the early viral post-infection period. Chk1, a DNA damage effector, also augments its
phosphorylation levels along the course of infection. The use of transcription inhibition drugs (CHX),
simultaneously with the viral infection, revealed a suppression of RPA32 phosphorylation levels.
Conclusions: The time course follow-up revealed several DNA repair proteins modulation throughout the infection‟s
progression (some are activated inducing the natural cellular response to DNA injury while others are secluded to
viral preferred locations) in order to prevent the activation of DNA damage response pathways. These experiments
reveal details on ASFV‟s replication and transcription mechanisms inside the host cell nucleus.
81
A proteina isomerase de disulfureto de Besnoitia besnoiti (BbPDI): inibição in vitro pela bacitracina
e estudos in silico de “docking”
Marcelino, E.1,2, Nolasco, S.1,3, Leitão, A.1, Novo, C.2
1 CVZ, Instituto de Investigação Cientifica Tropical, Lisboa e CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL (TULisbon), Portugal
2 UEI de Parasitologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
3 Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras e Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa, Portugal
Besnoitia besnoiti é o parasita apicomplexa responsável pela besnoitiose bovina, uma doença com elevada
prevalência em regiões tropicais e sub-tropicais que está a re-emergir na Europa. Apesar das enormes perdas
económicas associadas à besnoitiose, esta doença tem sido subestimada e pouco estudada, não existindo tratamento
disponível. A proteína isomerase de disulfureto (PDI) é uma enzima essencial para aquisição da estrutura
tridimensional das proteínas. Dados recentes sugerem que em Neospora caninum e Toxoplasma gondii, parasitas
filogeneticamente muito próximos de B. besnoiti, a PDI desempenha um papel importante na invasão da célula
hospedeira, apresentando-se como um alvo terapêutico promissor. A sequência completa do gene que codifica para
esta enzima em B. besnoiti foi por nós determinada (“accession number” DQ490130) e a sua forma recombinante
(recBbPDI) produzida em E. coli. Por imunofluorescência, usando soro de murganho anti-recBbPDI, verificou-se
que a BbPDI está principalmente associada com o retículo endoplasmático, tanto em taquizoítos como em
bradizoítos e por western blot, observou-se que a PDI é secretada pelos taquizoítos, o que sugere a sua participação
no processo de invasão. A recBbPDI é funcionalmente activa, como demonstrado pelo ensaio turbidimétrico
baseado na polimerização da insulina reduzida, e apresenta uma actividade dose dependente no intervalo de
concentração de 0,05 a 1,75 mM. O perfil de actividade é semelhante ao observado com a PDI de bovino (bovPDI),
usada como controlo, sendo ambas as enzimas sensíveis à bacitracina, um inibidor clássico da PDI. No entanto,
embora a recBbPDI apresente uma inibição dose dependente pela bacitracina entre as concentrações de enzima de
0,05 e 0,22 mM, a concentrações mais elevadas (de 0,44 a 1,75 mM), a recBbPDI não foi inibida ao contrário do
observado para a bovPDI. Na tentativa de perceber as diferenças de sensibilidade da recBbPDI e bovPDI à
bacitracina, foram realizados estudos de “docking” in silico com um modelo 3D teórico, construído por homologia
de comparação usando o software disponível no servidor Swiss-Model e tendo como modelo a estrutura
cristalográfica da Tapasina-ERp57 (código do PDB: 3F8U chain C). A análise efectuada aos modelos de interacção
construídos sugere que, devido a uma diferente orientação da bacitracina no local de ligação do substrato, esta
interage mais extensamente com o domínio b‟ na bovPDI do que na BbPDI. Estes estudos representam um primeiro
passo na exploração da BbPDI com potencial alvo terapêutico.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, projecto PTDC/CVT/65674/2006 e bolsa de doutoramento (Eduardo Marcelino)
SFRH/BD/31445/2006
[Besnoiti besnoiti protein disulfide isomerase (BbPDI): in vitro bacitracin inhibition and in silico
docking studies]
Besnoitia besnoiti is an apicomplexan parasite responsible for bovine besnoitiosis, a disease with a high prevalence
in tropical and subtropical regions and re-emerging in Europe. Despite the great economical losses associated with
besnoitiosis, this disease has been underestimated and poorly studied and has no effective therapy available. Protein
disulfide isomerase (PDI) is an essential enzyme for the acquisition of the correct three-dimensional structure of
proteins. Current evidence suggests that in Neospora caninum and Toxoplasma gondii, parasites closely related to B.
besnoiti, PDI plays an important role in host cell invasion and may represent a promising drug target. We have
previously determined the B. besnoiti PDI gene sequence (accession number DQ490130) and obtained a
recombinant B. besnoiti PDI (recBbPDI) expressed in E. coli. By indirect immunofluorescence using in-house
obtained mouse anti-recBbPDI sera, we observed that BbPDI is largely associated with the ER, both in the
tachyzoite and bradyzoite, and, by western blot, we observed that it is secreted by tachyzoites, suggesting a role in
invasion. The recBbPDI is functionally active, as measured by a turbidimetric assay based on the polymerization of
reduced insulin, and shows a dose dependent activity in the range of 0.05 mM to 1.75 mM. The activity profile is
similar to that observed for bovine PDI (bovPDI) used as control, and both enzymes are sensitive to bacitracin, a
classic PDI inhibitor. However, recBbPDI presents a dose dependent inhibition by bacitracin at enzyme
concentrations ranging from 0.05 mM to 0.22 mM, but at higher enzyme concentrations (0.44 to 1.75 mM),
recBbPDI activity was not inhibited in contrast with the bovPDI which was still inhibited. In an attempt to
understand differences in sensitivity of recBbPDI and bovPDI to bacitracin in silico docking studies were performed
using a 3D theoretical model that was built by comparative homology using the Swiss-Model server, and the
crystallographic deduced model of Tapasin-ERp57 (PDB code 3F8U chain C) as a template. The comparative
analysis suggests that bacitracin, due to a different orientation in the substrate pocket, interacts more extensively
with the b´ domain in bovPDI than in BbPDI. These studies form the basis for future investigations directed towards
the exploitation of BbPDI as a potential drug target.
82
Transcrição de receptores Toll-like e produção de prostaglandinas pelo endométrio canino durante
o ciclo éstrico
Silva, E., Brito, S., Henriques, S., Ferreira-Dias, G., Lopes da Costa, L., Mateus, L.
O útero de cadela é mais susceptível a infecções bacterianas, principalmente durante a fase do diestro (fase
progestagénica). Os receptores toll-like (TLR) desempenham um papel crucial na resposta imunitária inata a agentes
patogénicos. Contudo, a presença dos TLRs e sua activação no endométrio de cadela durante o ciclo éstrico não foi
ainda descrita. Neste trabalho, avaliou-se por RT-PCR (n=11) a presença de mRNA dos TLRs 1-7 e 9 e
quantificaram-se os transcritos dos TLR2 e 4 por PCR em tempo real (n=25). Os úteros foram obtidos durante
ovariohisterectomia de rotina e a fase do ciclo éstrico foi determinada através da observação macroscópica das
estruturas ováricas, citologia vaginal e doseamento da progesterona plasmática. Na análise dos resultados de PGF2α
e PGE2, utilizou-se a análise de variância múltipla (MANOVA, Statistica 5.0, StatSoft Inc., Tulsa, EUA, 1995),
com dois efeitos fixos: efeito fase do ciclo éstrico (n = 4) e efeito estímulo (n = 3). Os efeitos significativos foram
subsequentemente reavaliados post-hoc pelo teste das diferenças mínimas significativas (LSD). Todos os outros
dados foram avaliados utilizando o teste Mann–Whitney U-test. O nível de significância escolhido foi de 5%
(p<0,05). O mRNA dos TLRs 1-7 e 9 foram detectados em todas as fases do ciclo éstrico. A transcrição dos TLR2 e
4 no endometrio foi superior no final do diestro e anestro e inferior na fase folicular e início de diestro (p<0,05).
Desta forma, estes resultados podem justificar a maior susceptibilidade à infecção uterina no início de diestro. Com
o objectivo de simular in vivo a infecção bacteriana, avaliou-se a produção de prostaglandinas (PGE2 e PGF2α) pelos
explantes de endométrio estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA). A estimulação com
LPS e LTA resultou num aumento da produção de PGF 2α superior à de PGE2 (p<0,05). Esta observação poderá estar
relacionada com a regressão precoce do corpo lúteo que se verifica in vivo em cadelas com piómetra. Por outro lado,
a produção de prostaglandinas foi superior (p<0,05) no final do diestro quando comparado com as restantes fases do
ciclo éstrico. Os resultados obtidos demonstram que os TLRs são expressos no endométrio canino e que a sua
activação leva a um aumento da produção de mediadores (prostaglandinas) que podem posteriormente regular a
resposta inflamatória local.
(Trabalho financiado pelo projecto POCTI/CVT/48773/2002 e CIISA 74. Hiperplasia endometrial)
[Transcription of Toll-like receptors and prostaglandin production in the canine endometrium
during the oestrous cycle]
The canine endometrium is susceptible to bacterial infection, mainly during the diestrous (progesteronic) phase of
the oestrous cycle. Toll-like receptors (TLR) play a central role in the innate immune response to pathogens.
However, their presence and activation in the canine endometrium during the oestrous cycle was not described. In
this study, we have evaluated the mRNA presence of TLRs 1-7 and 9 by RT-PCR (n=11 uteri) and we quantified
TLR2 and TLR4 transcription by real-time quantitative PCR (n=25 uteri). Uteri were collected during routine
ovariohysterectomy and the stage of the oestrous cycle was determined by the observation of ovarian structures,
vaginal cytology and measurement of plasma progesterone concentrations. Prostaglandin concentration data were
analysed using the MANOVA procedures with two fixed effects (Statistica 5.0, StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA,
1995): phase of the oestrous cycle (n=4; follicular phase, including proestrus and oestrus, diestrus, end of diestrus,
anestrus) and type of stimulus (n=3; control, LPS, LTA). Significant effects were further analysed and means
compared by the LSD test. All other data were analysed using the non-parametric Mann-Whitney U Test.
Significance was determined at the 5% confidence level (p< 0.05). TLRs 1-7 and 9 mRNA were detected at all
oestrous cycle phases. Canine endometrial transcription of TLR2 and TLR4 was the highest in the late diestrus and
anestrus and was the lowest in the follicular phase and early diestrus (p< 0.05). This finding might explain the
higher susceptibility to endometrial infection that is known to occur at early diestrus. In order to in vivo simulate a
bacterial challenge to the uterus, we also evaluated the prostaglandin (PGE2 and PGF2α) production by endometrial
explants, after stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and lipoteichioc acid (LTA). Explant stimulation with LPS
and LTA induced a higher production of PGF than of PGE (p< 0.05). This might be related to the in vivo observed
early demise of the corpus luteum in canine pyometra cases. The prostaglandin production was higher (p<0.05) in
late diestrus than in all other stages of the oestrous cycle. Overall, these results show that TLRs are expressed in the
canine endometrium and their activation results in the production of mediators (prostaglandins) that may further
regulate the local inflammatory response.
83
Genes de virulência e clonalidade em isolados de Campylobacter jejuni de humanos e aves em
Portugal
Santos, J.1, Fernandes, H.1, Fernandes, M.J.1, Oleastro, M.2 e Fraqueza, M.J.1
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal. Email: [email protected]
2 Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Departamento de Doenças Infecciosas, Portugal. Email: [email protected]
Campylobacter jejuni é o principal agente causal de gastroenterite, sendo a carne de aves apontada como a principal
fonte de infecção. O último relatório da EFSA indicou que a notificação de campilobacteriose aumentou em 2009
continuando a ser a zoonose mais comum na UE. O objectivo deste estudo foi avaliar a presença de diversos genes
de virulência em Campylobacter jejuni, tais como os genes cdt, o gene cgtB e wlaN, envolvidos na biossíntese e
variação da estrutura LOS e implicados no aparecimento do síndrome Guillan Barré (SGB), o gene cadF, que
codifica uma proteína da membrana externa envolvida na adesão e o gene ciaB, envolvido na invasão celular. A
presença do gene flaA, relacionado com a codificação do aparelho flagelar também foi avaliada. As amostras
analisadas foram isoladas do ceco, pele do pescoço e peito de frangos (n = 37), de diferentes sistemas de produção
(intensivo, extensivo “indoor” e biológico), e de cinco bandos diferentes. Amostras isoladas de casos clínicos
humanos também foram estudados (n = 50). A detecção dos genes cdt (cdtABC), cgtB, wlaN, ciaB e cadF foi
realizada por PCR de acordo com Samosornsuk (2007) e Müller (2007). O gene flaA foi detectado por PCR, seguido
por RFLP com a enzima de restrição DdeI (Ertas, 2003) para avaliar a heterogeneidade genética entre os isolados.
Os resultados obtidos revelaram que os Campylobacter jejuni isolados de frango e de humanos foram todos
positivos para a presença de três genes cdt (cdtABC) e gene flaA. Por outro lado, o gene cgtB foi detectado em 8,3%
dos isolados de frango (n = 3) e em 2% de isolados de humanos (n = 1). O gene wlaN foi detectado em 14% de
todos os isolados analisados. Os genes ciaB e cadF foram detectados em 91% e 98% das amostras, respectivamente.
A presença dos três genes CDT em todos os isolados poderá indicar a capacidade de produção de toxina activa e,
consequentemente, o aparecimento de sintomatologia em humanos. Verificou-se a presença de perfis genéticos
semelhantes, por RFLP-flaA, entre isolados de origem humana e de aves. Embora a percentagem de isolados
positivos para genes cgtB e wlaN tenha sido baixa, continua a ser importante a avaliação da presença deste e de
outros genes do locus LOS, de forma a avaliar a prevalência de estirpes mais propensas ao desenvolvimento do SGB
em humanos.
[Virulence genes and clonality in Campylobacter jejuni isolates from human and poultry at
Portugal]
Campylobacter jejuni is the leading cause of gastro enteritis illnesses and poultry meat is pointed out as the principal
source of infection. The last EFSA report shows that the notification of campylobacteriosis has increased in 2009
and remains the most common zoonosis in the EU.
The aim of this study was to evaluate the presence of several virulent related genes in Campylobacter jejuni, such as
the CDT genes, the cgtB and the wlaN gene, related to the biosynthesis and variation of LOS structure and
implicated in Guillan Barré Sindrome (GBS), the cadF gene, which codes for a outer membrane protein concerned
to adhesion and the ciaB gene, involved in invasion. The presence of flaA gene connected to the codification of
flagellar apparatus was also assessed.
Samples analyzed were isolated from the cecum, carcass neck skin and breast of poultry (n=37) from different
production systems (intensive, extensive indoor and organic), and from five different flocks. Samples isolated from
human clinical cases were also studied (n=50). The detection of the cdt genes (cdtABC), cgtB, wlaN, ciaB and cadF
gene were performed by PCR according to Samosornsuk, (2007) and Müller, (2007). The flaA gene was detected by
PCR, followed by RFLP with restriction enzyme DdeI (Ertas, 2003) and performed in order to evaluate the genetic
heterogeneity among the isolates.
The results obtained revealed that both the isolates collected from poultry and humans were all positive for the
presence of three cdt genes (cdtABC) and flaA gene. On the other hand, the cgtB gene was detected in 8.3% of
isolates from poultry (n=3) and in 2% of isolates from humans (n=1). The wlaN gene was detected in 14% of all
isolates analyzed. The ciaB and cadF genes were detected in 91% and 98% of the samples, respectively.
The presence of the three cdt genes in all isolates might indicate potential capacity for production of a fully active
toxin and consequently appearance of symptoms in humans. Campylobacter jejuni strains with similar genetic
profiles by RFLP-flaA could be observed in isolates from human and poultry origin. Although the percentage of
positive isolates for cgtB and wlaN genes was low, it remains important to evaluate the presence of this and other
genes from the LOS locus, in order to understand the prevalence of possible GBS inducing strains.
84
Determinação do Resistoma bacteriano: Caracterização de vias de resistência aos antibióticos no
interface Ambiente/Animal
Meireles, C.1, da Costa, G.2, Carvalho, S.1, Guinote, I.B.1, Albuquerque, T.1, Cordeiro, C.2, Botelho, A.1, Freire, P.1
1 Laboratório de Bacteriologia, Unidade de Sanidade Animal, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa
2 Departamento de Química e Bioquímica, Centro de Química e Bioquímica, FCUL, Portugal
A utilização prolongada, muitas vezes inadequada, de agentes antimicrobianos em larga escala e de modo
transversal a vários sectores de actividade da sociedade exerce uma forte pressão selectiva sobre os microrganismos,
o que tem vindo a intensificar a emergência de resistências a antibióticos de “primeira linha”. A origem desses
mecanismos permanece no entanto pouco definida. Estudos recentes têm demonstrado que microrganismos
ambientais apresentam, não só uma capacidade de resistência aos antibióticos muito elevada, mas podem inclusive
usar antibióticos como fonte de carbono. Estes dados sugerem assim a existência prévia de mecanismos celulares
podendo causar resistência aos antibióticos em microrganismos ambientais, que poderão ser seleccionados por
pressão antropogénica, conduzindo à emergencia de resistências observada. Torna-se assim essencial identificar e
caracterizar o Resistoma, conjunto de mecanismos de resistência em reservatórios ambientais, rurais e urbanos,
estimando assim o potencial risco para a Saúde Pública.
Nesse sentido, foram isolados em amostras de solos urbanos poluídos industrialmente, assim como de solos de áreas
rurais contaminadas com fezes de animais, cerca de 450 microrganismos Gram-negativos, resistentes a diversos
antibióticos dos grupos de beta-lactâmicos e (fluoro)quinolonas. Foi assim possível detectar uma prevalência
generalizada de microrganismos resistentes nas diversas localizações, desde centros de produção animal onde foram
obtidos os valores de Concentração Mínima Inibitória (CMI) mais elevados, em concordância com a forte pressão
selectiva pela utilização de antibioticos como profilaxia; mas também em locais que, apesar de apresentarem níveis
de poluentes industriais altos, são menos susceptíveis de conterem resíduos antibióticos em concentração elevada.
Os mecanismos moleculares subjacentes a essa(s) resistência(s) foram analizados por PCR, tendo sido detectada a
presença de genes codificando a presença de várias beta-lactamases de largo espectro, assim como mutações
genéticas conhecidas por induzirem resistência a quinolonas. A comparação de perfis de expressão proteíca em
isolados seleccionados permitiu ainda uma melhor compreensão das variações dos mecanismos celulares que podem
estar na base das diferenças de perfis de resistência aos antibióticos. O aprofundamente dessa análise, permite inferir
sobre a origem e o processo de resposta bacteriana aos antibióticos, possibilitando ainda a detecção de novos bioalvos celulares passíveis de serem usados em abordagens complementares de combate à proliferação bacteriana.
[Resistome: Characterization of antibiotic resistance pathways at the Environment/Animal
interface]
The continuous use, often abuse, of antimicrobial agents on a large scale and transversally through society exerts a
strong selective pressure on microorganisms, leading to the emergence of resistance to “first line” antibiotics. These
resistances can be transmitted between strains of the same species or even different species by horizontal gene
transfer and rely on cellular mechanisms that have emerged in parallel to the evolution of bacterial populations.
However, the origin of these mechanisms remains poorly defined. Recent studies have demonstrated that
environmental microorganisms have not only a strong capacity for resistance to antibiotics, but antibiotics can even
be used as a carbon source by them. Thus, this data suggest a prior existence of cellular mechanisms that may cause
antibiotic resistance in environmental microorganisms, which may be furthermore selected by anthropogenic
pressure, leading to the emergence of resistance observed. It is therefore essential to identify and characterize the
Resistome, as the set of resistance mechanisms in environmental reservoirs, rural and urban, hence estimating the
potential risk to public health.
For that, around 450 Gram-negative bacteria were isolated from soil samples, resistant to various antibiotics of the
beta-lactam and (fluoro)quinolone groups from industrially polluted urban land, as well as rural soils crosscontaminated with animal feces. It was thus possible to determine an overall high prevalence of resistant
microorganisms in various locations, from animal production centers where higher values of minimum inhibitory
concentration (MIC) were reached, in line with the strong selective pressure by the use of antibiotics as prophylaxis,
but also in regions that, despite having high levels of industrial pollutants, are less likely to contain antibiotic
residues in high concentration, which was nevertheless possible to isolate bacteria resistant to the tested agents. The
molecular mechanisms that underlie resistance were analyzed by PCR, and the presence of genes encoding the
presence of several broad spectrum beta-lactamases was detected, as well as some genetic mutations known to
induce resistance to quinolones. The comparison of protein expression profiles in selected isolates has allowed a
better understanding of changes in cellular mechanisms that may underlie the differences in antibiotic resistance
profiles. The deepening of this analysis, infers on the origin and process of bacterial response to antibiotics, also
enabling the detection of new bio-cellular targets that can be used in complementary approaches to combat bacterial
growth.
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Mecanismos moleculares de imuno-modulação e imuno-resistencia na infecção por Mycobacterium
spp.
Elsa Anes
Unidade dos Retrovírus e das Infecções Associadas - Centro de Patogénese Molecular e Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Farmácia,
Universidade de Lisboa, Portugal
A saúde do gado tem impacto na eficiência da produção e na sustentabilidade da indústria pecuária, bem como na
segurança de gado e seus produtos. Algumas das doenças mais difíceis de tratar são causadas por patogénios
intracelulares pertencentes ao género Mycobacterium, em particular M. bovis e M. avium subsp. paratuberculosis
(MAP). Parte da razão da dificuldade em controlar a infecção resulta do facto destes patogénios “se esconderem”
dentro dos macrófagos, células que são essenciais para a defesa do hospedeiro contra micobactérias. Uma vez no
interior dos macrófagos, essas bactérias manipulam e subvertem a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro.
Porque Portugal apresenta uma elevada incidência de tuberculose bovina com risco associado de infecção humana,
no presente trabalho, comparamos a resposta bactericida de espécies distintas de macrófagos para Mycobacterium
bovis e MAP. A elucidação dos mecanismos moleculares, tais como a maturação do fagossoma, a produção de NO,
citocinas pró-inflamatórias IFN-gama, TNFalfa, IL1beta, que estão por trás do sucesso destes patogénios podem
fornecer novos alvos para desenho de drogas e uma utilização mais racional dos medicamentos disponíveis. Assim,
propomos apresentar uma visão geral dos factores do hospedeiro que podem ser manipuladas de modo a reverter o
bloqueio da maturação fagossoma, da resposta pró-inflamatória e, portanto, a forma de aumentar a resposta
bactericida macrófagos para micobactérias.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (PTDC/SAU-MII/098024/2008; PTDC/BIA-BCM/102123/2008; PIC/IC/82859/2007
[Molecular mechanisms for immunomodulation and immunoresistance in Mycobacterium spp
infection]
Health of cattle impacts on production efficiency and sustainability of the livestock industry, as well as the safety of
cattle and their products. Some of the most intractable diseases of cattle are caused by intracellular pathogens
belonging to the Mycobacterium genus, in particular M. bovis and M. avium subsp. paratuberculosis (MAP). Part of
the reason that they are difficult to control is that they hide within macrophages, which are essential for host defense
against Mycobacteria. Once inside macrophages, these bacteria manipulate and subvert the host innate and adaptive
response.
Because Portugal as a high incidence of bovine tuberculosis with associated risk of human infection, in the present
work, we compared the bactericidal response of distinct macrophage species to Mycobacterium bovis and MAP.
Elucidation of molecular mechanisms such as phagosome maturation, NO production, pro-inflammatory cytokines
IFN-gamma, TNFalpha, IL1beta, behind the success of these pathogens can provide new targets for drug design and
a more rational use of available drugs. So we propose to present an overview of host factors that may be
manipulated in order to reverse phagosome maturation arrest, pro-inflammatory response and therefore boosting the
macrophage killing abilities.
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Identificação de genes e sua expressão em embriões de mamífero: aplicações médicas e em
investigação
Luís Lopes da Costa
Reprodução e Obstetrícia, CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
As metodologias de análise génica permitem actualmente a identificação de genes e da sua expressão no embrião.
Para esta análise é necessária uma amostra embrionária (biópsia) que veicule uma quantidade de acidos nucleicos
suficiente para a análise, sem que seja contudo afectada significativamente a viabilidade do embrião. Nos estadios
pré-implantação isto significa a remoção máxima de cerca de 10% da massa embrionária (5 células na mórula e 10
células no blastocisto). Para a simples detecção de um ou de um pequeno número de genes são utilizadas as técnicas
de PCR ou FISH. Estas metodologias têm sido utilizadas para detecção do sexo embrionário (genes específicos do
cromossoma Y) e da presença de genes responsáveis por doenças genéticas. Em estudos de transgénese permitem a
identificação dos embriões transgénicos previamente à transferência para receptoras. Nesta palestra é apresentado o
exemplo da determinação do sexo de embriões bovinos obtidos in vitro e in vivo utilizando a técnica de PCR aliada
a dois métodos distintos de leitura da resposta – electroforese e fluorescência.
A simples detecção da presença de um gene não é informativa sobre a sua expressão nem sobre o momento e a
localização embrionária da expressão. Outras técnicas como a PCR em tempo real, hibridização in situ e
imunohistoquímica permitem avaliar aqueles eventos celulares. Contudo, quando é necessário avaliar muitos genes
em simultâneo, o tamanho requerido da amostra limita actualmente a utilização destas técnicas à investigação. No
nosso laboratório temos vindo a estudar a comunicação cruzada entre o embrião bovino, útero e corpo lúteo, a qual é
fulcral para o estabelecimento da gestação. Neste contexto foi feita a análise da expressão de genes das vias
esteroidogénica e da síntese de prostaglandinas, assim como da via do ácido lisofosfatídico (LPA) e seus receptores.
No entanto, a identificação de vias de regulação génica ou a descoberta do envolvimento de novos genes torna-se
pouco eficiente apenas através das metodologias acima descritas. A tecnologia microarray, ao permitir a detecção da
expressão simultânea de milhares de genes (em teoria de todo o genoma) em simultâneo, veio permitir avaliar as
relações de expressão (sobre-expressão, sub-expressão) entre diferentes famílias e vias de sinalização génica. No
âmbito da investigação de uma via de sinalização celular (Notch-Delta) no desenvolvimento embrionário de um
modelo mamífero (murganho), foi utilizada esta técnica para estudar a regulação génica da angiogénese.
Estudo financiado parcialmente pela FCT, projecto PTDC/CVT/65690/2006.
[Gene expression in mammalian embryos: medical and research applications]
Present genetic analysis methodologies allow for the identification of genes and their expression at the embryonic
level. For this analysis we need to obtain embryonic material (biopsy) good and well enough for analysis, though
without significantly affecting embryonic viability. In pre-implantation embryos this means removing a maximum
of about 10% of the embryonic mass (5 cells in morula stage and 10 cells in blastocyst stage embryos). For the
detection of one or a few genes, the techniques of PCR and FISH are currently used. These methodologies have
been used to determine the sex of embryos (cromossome Y specific genes) and the presence of genes responsible for
genetic diseases. In transgenic studies it is a very rewarding tool for the identification of transgenic embryos prior to
transfer to recipients. In this conference it is presented work on sexing of in-vitro and in-vivo produced bovine
embryos, using the PCR technique and two different methods – electrophoresis and fluorescence - for the evaluation
of results.
The simple detection of the presence of a gene does not give information regarding either its expression or the
moment and cellular localization inside the embryo of the expression. Other techniques such as real-time PCR, in
situ hybridization and immunochemistry allow the evaluation of those cellular events. However, when it becomes
necessary to evaluate the simultaneous expression of several genes, the required size of the embryonic biopsy limits
the use of these techniques only to research goals. In our lab, we have been studying the cross-talk between the early
bovine embryo, the uterus and the corpus luteum, which is pivotal for the establishment of pregnancy. In this regard,
we have evaluated the expression of genes directing the steroidogenic and prostaglandin synthesis pathways, as well
as the expression of lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors.
The above mentioned techniques are only of limited use for the study of the gene regulatory pathways and the
involvement of yet unknown genes in the developmental processes. The microarray technology, allowing the
simultaneous detection of the expression of thousands of genes (in theory of the whole genome), provides the
ultimate tool for the evaluation of gene expression relationships between different genetic families and signaling
pathways. We have used this technique in the evaluation of the role of a cell signaling pathway (Notch-Delta) in the
genetic regulation of angiogenesis during embryonic development in the mice model.
87
Animais de companhia
Medicina Regenerativa
Ana Lúcia Luís1,4, Ana Colette Maurício1,4, Paulo Armada-da-Silva2, Sandra Amado2, Tiago Pereira1,4, Andrea
Gärtner1,4, Nuno Alexandre1,5, Jorge Ribeiro1,4, Stefano Geuna3
2 Faculdade de Motricidade Humana (FMH), Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
3 Department of Clinical and Biological Sciences, University of Turin, Italy
5 Departamento de Zootecnia, Universidade de Évora, Portugal
A Medicina Regenerativa/Regeneração de Tecidos Guiada (RTG) baseia-se no conceito de scaffold 3D. Trata-se de uma matriz
que fornece uma arquitectura temporária capaz de fornecer suporte para o crescimento celular bem como a deposição de matriz
extracelular, isto é, que sirva de reservatório de água, nutrientes, factores de crescimento e ainda capaz de suportar a
sobrevivência, crescimento, propagação e reorganização de um tecido em regeneração.
Dado o grande impacto de lesões desta natureza em medicina humana, recentemente têm-se verificado grandes avanços sobre
assunto e em vários tecidos em particular, nomeadamente em tecido ósseo, nervoso, muscular e vascular. Para isso é
imprescindível existirem equipas multidisciplinares nas quais só o contributo de cada área profissional poderá desenvolver um
trabalho consistente.
O nosso trabalho tem sido baseado na criação e testagem de biomaterias (próteses/ enxertos/membranas) e no desenvolvimento
de um sistema celular proveniente de células estaminais mesenquimatosas.
As células estaminais mesenquimatosas (MSCs) compreendem uma população rara de progenitores multipotentes capazes de
uma diferenciação em várias linhagens (osteogénicas, neurogénicas, miogénicas, endoteliais e outras). Estas células são por isso
uma ferramenta muito atractiva dentro do contexto da Engenharia de Tecidos e na Terapia Celular. O modelo em que estamos
neste momento a trabalhar, utiliza MSCs de origem humana provenientes da geleia de wharton do cordão umbilical, que são
criopreservadas em azoto liquido para posterior utilização, indiferenciadas ou diferenciadas.
A nossa equipa multidisciplinar, onde trabalham Médicos Veterinários, Médicos Humanos, Engenheiros, Biólogos,
Microbiologistas, Químicos e outros, tem sido crucial para o desenvolvimento de biomaterias associados a sistemas celulares e
para a sua testagem quer in vitro quer in vivo. Os testes in vivo, implicam a aplicação destes biomateriais em associação com
algumas técnicas cirúrgicas em modelos animais. Os modelos animais por norma iniciam-se em animais de laboratório e mais
tarde avançam para outros modelos animais filogeneticamente superiores como ovelhas, equinos e por fim, em casos clínicos em
equinos e em cães, cujo objectivo é sempre a sua extensão ao homem. Todos os procedimentos estão devidamente aprovados
pelas Autoridades Veterinárias de Portugal (Direcção Geral de Veterinária – DGV), de acordo a Directiva da Comunidade
Europeia de 24 de Novembro 1986 (86/609/EEC) e ainda aprovados pela comissão de Ética do ICBAS. Alguns destes projectos
viram aprovados os seus financiamentos pela FCT, nomeadamente de regeneração de tecido nervoso, ósseo e muscular, e alguns
ainda, que se encontram em fase de avaliação, especialmente no que diz respeito ao tecido vascular.
O nosso trabalho iniciou-se em regeneração do tecido nervoso, com especial interesse no desenvolvimento de tubos-guia a
utilizar como enxertos de nervo periférico em associação com células estaminais. Para isso desenvolvemos e testámos vários
biomaterias como: PLGA composto por dois polímeros numa nova proporção de 90:10 respectivamente, poli (L-lactico) e poli
(glicolico), quitosano híbrido e por fim PVA (polivinil álcool hidrogel), que foram usados sozinhos ou em associação com um
sistema celular de células neuronais diferenciadas in vitro. Os diferentes tubos-guia/ membranas associados a este sistema celular
foram testados em lesões de secção do nervo ciático de rato. O sistema celular utilizado pré-diferenciado in vitro, é capaz de
libertar factores de crescimento no local da lesão do nervo, durante o processo de regeneração, bem como servir de matriz celular
à edificação de um novo tecido. Após a reconstrução do nervo ciático, é avaliada a recuperação funcional destes animais através
de uma bateria de testes especialmente concebidos para o efeito e internacionalmente utilizados nesta área de investigação, bem
como finalmente é realizada a sua avaliação morfológica através de microscopia óptica, electrónica e estereologia.
No âmbito da regeneração do tecido muscular esquelético estamos nesta fase a trabalhar no desenvolvimento de uma linhagem
primária de células musculares esqueléticas provenientes de células estaminais mesenquimatosas especialmente desenvolvidas
para utilização em lesões musculares agudas e crónicas, bem como em lesões/comportamento musculares provenientes de
desinervação/reinervação. Em lesões musculares numa fase inicial reproduzimos uma lesão perfeitamente padronizada no
músculo tibial anterior do rato, após o qual introduzimos células estaminais diferenciadas e indiferenciadas. No entanto, será
nosso objectivo estender esta abordagem a casos clínicos nomeadamente em lesões de miopatia fibrótica que afecta os músculos
semimembranoso /semitendinoso de equinos.
Por fim, no âmbito do tecido vascular estamos neste momento a trabalhar no desenvolvimento de uma prótese vascular de PVA,
capaz de poder vir a ser utilizada em cirurgia vascular e vir a ser uma alternativa aos já existentes no mercado (Teflon®,
Dacron®). São produzidos tubos de PVA com cerca de 4 mm de diâmetro interno e comprimento superior a 20 mm (20, 50 e 75
mm), que são utilizados como enxertos com os mesmos comprimentos em carótida de ovelha, utilizados sozinhos ou
incorporados em MSCs. A avaliação funcional é realizada através de vários testes nomeadamente doppler, durante um período de
cerca de 24 semanas e no final do período experimental realiza-se a análise histológica dos tecidos vascular e tecidos vizinhos.
88
Caracterização do perfil de proteínas de fase aguda em cães infectados naturalmente por
Leishmania infantum
Villa de Brito, M.T.1, Alexandre-Pires, G.1, Santos-Gomes, G. 2, Pereira da Fonseca, I.1
2 Unidade de Ensino e Investigação de Parasitologia Médica, Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais, Instituto de Higiene e Medicina
Tropical (IHMT), Universidade Nova de Lisboa, Portugal
Objectivos: As proteínas de fase aguda (PFAs) são marcadores importantes de infecção, mais sensíveis que o
leucograma na detecção de infecções clínicas e subclínicas. Neste estudo avaliou-se a importância do perfil das
PFAs no diagnóstico/ prognóstico da leishmaniose canina (LCan) em cães infectados naturalmente por L. infantum
em diferentes fases e após tratamento..
Metodologia: Avaliaram-se as concentrações séricas de proteína C reactiva (PCR), haptoglobina (Hp) e albumina
(Alb) em 40 cães adultos de ambos os sexos divididos em 4 grupos: controlo (GC n=10), sintomático (GS n=10),
assintomático (GA n=10) e grupo tratado (GT n=10) com antimoniato de meglumina e alopurinol (AMA). A
concentração destas PFA foi determinada através dos testes Canine CRP ELISA, Canine haptoglobin ELISA e
Canine Albumin ELISA; Immunological Consultants Laboratory, Inc, Newberg, OR, USA. A comparação dos
níveis de PFA entre os diferentes grupos foi realizada através do teste não paramétrico de Mann-Whitney U e
valores de p<0,05 foram considerados significativos.
Resultados: O GS apresentou aumento significativo da concentração da PCR (p<0,001) e da Hp (p=0,011) quando
comparado com o GC. Também existiu um aumento significativo desta PFA no GA (p=0,011) quando comparado
com o GC. A concentração de Hp do GS foi significativamente maior (p=0,028) que a concentração de Hp do GT. O
GT também apresentou aumento significativo (p=0,004) da concentração de PCR quando comparado com GC. Por
outro lado, as concentrações de Alb foram idênticas em todos os grupos.
Todos os cães infectados com Leishmania apresentavam valores elevados de PCR, a qual atingiu valores máximos
nos cães sintomáticos e diminuiu após o tratamento. Estes resultados indicam que a PCR é um bom marcador clínico
para avaliar o estado de infecção.A concentração de Hp surgiu aumentada em todos os cães infectados por
Leishmania, incluindo os cães do grupo GA, o que mostra que esta PFA é também um marcador a ser considerado
na avaliação da infecção subclínica. O tratamento com AMA não induziu o aumento da Hp no GT.
Os dados obtidos demonstram que a PCR e a Hp podem ser utilizadas como indicadores complementares de
diagnóstico da LCan e na monitorização do tratamento. Em zonas endémicas de LCan o aumento destas PFA num
cão aparentemente saudável deve ser considerado como indicador de uma possível infecção subclínica ou de uma
futura LCan. Adicionalmente, a diminuição destas proteínas em cães tratados deve ser interpretado como um bom
prognóstico. Após padronização, estas PFAs podem ser utilizadas como marcadores clínicos.
Financiamento: FCT no âmbito de Projecto PTDC/CVT/113121/2009 e co-financiado pelo FEDER através do COMPETE - POFC.
[Characterization of acute phase proteins profile in dogs naturally infected by Leishmania infantum]
Objective: Acute phase proteins (APPs) are important markers of infection because they are more sensitive than the
white blood cell counts in detecting clinical and subclinical infections. This study aims to evaluate the importance of
APPs profile in the diagnosis/ prognosis of canine leishmaniosis (CanL) in dogs naturally infected by L. infantum in
different developmental phases and after treatment.
Methodology: Serum concentrations of C-reactive protein (CRP), haptoglobin (Hp) and albumin (Alb) were
measured in 40 adult dogs of both genders divided into four groups: control (CG n=10), symptomatic (SG n=10),
asymptomatic (AG n=10) and treated (TG n=10) with meglumine antimoniate and allopurinol (MAA). The
concentration of these APP was measured using kits Canine CRP ELISA, Canine Haptoglobin ELISA and Canine
Albumin ELISA, Immunological Laboratory Consultants, Inc, Newberg, OR, USA. The comparison of APPs levels
between different groups was performed using the nonparametric Mann-Whitney U test and p <0.05 were
considered significant.
Results: SG showed significant increases in CRP concentration (p <0.001) and Hp (p = 0.011) when compared with
the CG. There was also a significant increase of this APP in AG (p= 0.011) when compared with the CG. Hp
concentration in SG was significantly higher (p = 0.028) than in TG. TG also showed a significant increase of CRP
concentration (p = 0.004) when compared with the CG. On the other hand, Alb concentrations were similar in all
groups. All dogs infected by Leishmania revealed high levels of CRP that reach the maximum values in
symptomatic dogs, decreasing in treated dogs. These results point out CRP as good clinical marker to assess the
infection status. The concentration of Hp was increased in all dogs infected by CanL, including asymptomatic dogs
being an important marker of subclinical infection. Treatment with MAA did not induce an increase of Hp in TG.
Our data suggests that CRP and Hp should be considered as complementary indicators for the diagnosis of CanL and
can be used to monitoring the treatment of infected dogs. In CanL endemic areas the increase of APPs in apparently
healthy dogs may indicate a subclinical infection or support a future development of CanL. Additionally, the
reduction of these proteins in treated dogs should be interpreted as a good prognosis. After further standardization
these APPs may be used as clinical scores.
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Leishmaniose – o que sabem os proprietários de cães algarvios sobre esta zoonose?
Brito, H.1, Rauterberg, H.2, Mateus, T.L.1
1 Escola Superior Agrária de Ponte de Lima, Instituto Politécnico de Viana do Castelo, Portugal. Email: [email protected]
2 Clínica Veterinária do Ferrel, Espiche, Lagos, Portugal
A leishmaniose é uma zoonose de evolução crónica e que tem sido crescentemente reportada em co-infecções
Leishmania/HIV no Sudoeste Europeu e concretamente em Portugal. No nosso país é uma zoonose endémica em
algumas regiões, nomeadamente no Algarve. O objectivo geral deste estudo foi identificar os conhecimentos sobre a
leishmaniose dos proprietários de cães nesta região, através da realização de 106 inquéritos por questionário
constituídos por questões de escolha múltipla, durante o ano de 2010. Quando questionados sobre se conheciam a
leishmaniose, 29 proprietários afirmam que não. Para estes 29 inquiridos o questionário terminou aqui. Dos 77 que
dizem conhecer, 66 reconhecem que a doença é transmitida pela picada de um insecto, e 38 identificam os
problemas cutâneos como principal sintomatologia. Contudo, 28 dos proprietários que dizem conhecer a
leishmaniose referem a sintomatologia cardíaca como a mais característica e 2 não sabem/não respondem. Quando
questionados sobre as formas de prevenção da doença, 29 inquiridos elegem a vacinação (à data da realização do
inquérito ainda não disponível em Portugal), 27 optam pela utilização de repelentes de insectos, 8 não sabem/não
respondem e 7 afirmam não haver prevenção possível. Finalmente, quando perguntamos se a doença pode afectar o
Homem, 55 (71,4%) inquiridos não sabem (32 afirmam que não e 23 admitem não saber) e 22 acreditam que sim.
Os resultados deste estudo mostram o muito que ainda há a fazer na sensibilização, informação e sobretudo na
comunicação sobre a leishmaniose, com os proprietários de cães em particular, e com a comunidade em geral.
[Leishmaniasis - what do the dogs owners from Algarve know about this zoonosis?]
Leishmaniasis is a zoonotic disease of chronic evolution that is being increasingly reported in co-infections
Leishmania/HIV in Southeast Europe, including Portugal. In our country is an endemic zoonosis in some regions,
particularly in Algarve. The aim of this study was to identify the knowledge of the dog owners about leishmaniasis
in this region by performing 106 questionnaire surveys made of multiple choice questions. When asked whether
they knew leishmaniasis, 29 owners say they do not. For these 29 interviewed owners, the questionnaire ended here.
From the 77 who say they know leishmaniasis, 66 recognize that the disease is transmitted by the bite of an insect,
and 38 identify the skin problems as the main symptom. However, 28 of the dog owners who said they know
leishmaniasis, relate the heart symptoms as the most characteristic and 2 of them do not know / not answer. When
asked about ways to prevent this disease, vaccination was elect by 29 owners (at the time of the survey not yet
available in Portugal), 27 refer the use insect repellents, 8 of them don't know / don't answer and 7 say there is no
possible prevention. Finally, when we asked if the disease can affect humans, 55 (71.4%) respondents didn't know
(32 declare no as an answer and 23 admit that they don't know) and 22 believe that leishmaniasis can affect humans.
The results of this study show that there is still much to do in raising awareness, information and especially in
communication about leishmaniasis, with dog owners in particular, and with the community overall.
90
Estudo clínico e laboratorial de casos de Leishmaniose canina na Zona da Arrábida
Monteiro, A.R.1, Martins, A.2, Gomes, J.3
1 Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Lisboa, Portugal
2 Vetarrábida – Hospital Veterinário da Arrábida, Portugal
A Leishmaniose canina é uma doença parasitária de reconhecida importância em Portugal e que ocorre de forma
endémica na zona da Serra da Arrábida, distrito de Setúbal. O diagnóstico precoce da doença assim como medidas
profiláticas têm contribuído para uma diminuição do número de casos de Leishmaniose clínica. No entanto, os
estudos epidemiológicos indicam que a prevalência da infecção ainda é elevada. Com este estudo, pretendeu-se
verificar se os quadros clínicos mantêm um padrão semelhante ao descrito na literatura, nomeadamente em termos
hematológico, bioquímico e clínico. O estudo incidiu sobre 60 cães de ambos os sexos e de várias idades e raças que
se apresentaram no hospital veterinário por razões diversas, aos quais foi feita a colheita de sangue total para a
realização de hemograma, análises bioquímicas e análises serológicas de para pesquisa de anticorpos antiLeishmania infantum. No diagnóstico serológico da Leishmaniose canina foram utilizadas 2 técnicas, a
Imunofluorescência Indirecta (IFI) e o Teste de Aglutinação Directa (DAT). Os resultados das análises serológicas
evidenciaram uma ocorrência da infecção em 34 animais (57%), dos quais 21 com sintomatologia compatível com
Leishmaniose e 13 portadores assintomáticos. Verificou-se que a média de idades dos animais afectados foi de 8
anos e que ocorreu numa maior proporção em cães machos e de raça indeterminada. Os sinais clínicos mais
frequentes foram as alterações cutâneas, caquéxia, prostração, epistáxis, diarreia e vómito. Menos frequentes foram
a onicogrifose, linfadenomegália, anorexia e poliúria/polidipsia. No perfil hematológico, a anemia normocitica
normocrómica, trombocitopénia e leucocitose esteve presente em 65%, 32% e 15% dos animais. O perfil bioquímico
incluiu análises à ureia, creatinina, albuminas, proteínas totais e alanina aminotransferase que se apresentaram
aumentadas em 32%, 21%, 24%, 21% e 9% respectivamente. Este estudo permitiu observar que os quadros clínicos
mantêm um padrão semelhante ao descrito e que ainda existe um número significativo de cães assintomáticos e
reservatórios da doença.
[Study of clinical and laboratory-confirmed cases of canine leishmaniasis in Arrábida]
Canine Leishmaniasis is a parasitic disease of major importance in Portugal and it is endemic in Arrábida, Setúbal
district. Early diagnosis and prophylactic measures have contributed to a decrease in the number of cases of
symptomatic Leishmaniasis. However, epidemiological studies indicate that prevalence of infection is still high.
This study aimed to verify that the clinical pattern of this disease is still similar to that described in the literature,
particularly in terms hematologic, biochemical and clinical signs. The study focused on 60 dogs of both sexes and
various ages and breeds that were presented at the hospital for various reasons, which had whole blood collected to
perform CBC, biochemical and serological tests for sreening of anti-Leishmania infantum antibodies. For the
serological diagnosis of Canine leishmaniasis were used two techniques, the Indirect immunofluorescent assay (IFA)
and Direct Agglutination Test (DAT). The results of serological tests showed an occurrence of infection in 34
animals (57%), of which 21 with symptoms compatible with leishmaniasis and 13 asymptomatic carriers. It was
found that the average age of affected animals was 8 years and occurred at a higher ratio in male dogs and crossbred. Clinical signs most frequently seen were skin problems, cachexia, malaise, epistaxis, diarrhea and vomiting.
Less frequent were onychogryphosis, lymphadenopathy, anorexia and polyuria/polydipsia. The hematological
profile showed normochromic normocytic anemia, thrombocytopenia and leukocytosis present respectively in 65%,
32% and 15% of the. The biochemical profile included analysis of urea, creatinine, albumin, total protein and
alanine aminotransferase which were increased in 32%, 21%, 24%, 21% and 9% of infected animals. This study
showed that the clinical pattern of the disease is similar to that described and that there are still a significant number
of asymptomatic and reservoir dogs‟ of this disease.
91
Avaliação da ocorrência de Giardia spp por diferentes métodos coprológicos
Serrano, S.1, Bernardino, R.2, Fernandes, T. 2, Waap, H.3, Gomes, J.3
1 Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Lisboa, Portugal
2 Jardim Zoológico de Lisboa, Portugal
O género Giardia inclui espécies com potencial zoonótico e com uma distribuição mundial, sendo que alguns
genótipos de Giardia duodenalis são responsáveis anualmente, por milhares de novos casos em humanos. Existem
vários ciclos de transmissão, sendo que a água de consumo, por contaminação fecal de origem animal é uma das
principais fontes de infecção humana. Neste estudo foram colhidas 158 amostras fecais de animais de quatro origens
diferentes (Zoológico = 55; Produção = 21; Doméstico = 5; Canil = 77) que foram testadas por duas técnicas
coprológicas diferentes, a técnica de flutuação com sacarose e a técnica de sedimentação com formol-acetato de
etilo, sendo que ambas foram realizadas concomitantemente em 129 amostras. Este trabalho permitiu determinar a
ocorrência de Giardia spp em 13 animais de diferentes origens e verificar que o número de animais de canil
positivos não foi o esperadas de acordo com o descrito na literatura que refere ser este o grupo com maior
prevalência. Este estudo também permitiu uma comparação entre os dois métodos de concentração de quistos de
Giardia spp. com maior recuperação utilizando a técnica de flutuação com sacarose.
[Evaluation of occurrence of Giardia spp with different coprological methods]
The genus Giardia includes species with zoonotic potential and with a worldwide distribution. Some genotypes of
Giardia duodenalis are responsible for thousands of human cases each year. There are several transmission cycles,
and water consumption with fecal contamination of animal origin is a major source of human infection. In this study
158 fecal samples from animals with four different origins (zoo = 55; farm = 21; companion = 5; kennel = 77) were
tested by two different techniques, the sucrose flotation method and the formalin-ethyl acetate sedimentation
method, both that were held simultaneously in 129 samples. This work allowed us to determine the occurrence of
Giardia spp in 13 animals from different sources and to verify that the number of positive animals from kennels
were not the expected according to the described in literature that refers this group the one with the highest
prevalence. This study also allowed a comparison between two methods of Giardia spp. cyst concentration with
sucrose flotation method with the highest cyst recovery.
92
Prevalência da dirofilariose felina na região do Sado
Almeida, C.1, São Braz, B.1, Pomba, C.1, Duarte-Correia, J.H.1, Caninhas, M.3, Félix, N.1, Henriques, J.2, LourençoMartins, A.M.1
2 Oncovet, Lisboa, Portugal
3 Mvet, Moita, Portugal
Introdução: A Dirofilariose é uma doença parasitária causada pelo nemátode da espécie Dirofilaria immitis do qual
o cão é o hospedeiro definitivo. A ocorrência desta parasitose tem sido relatada, também no gato doméstico embora
com uma prevalência bastante mais baixa.
No entanto, e apesar de se tratar de uma doença emergente bem conhecida da população Médico-Veterinária e
proprietários de canídeos, esta encontra-se provavelmente sub-diagnosticada na população felina. Para tal contribui
a limitação dos testes de diagnóstico e o facto de a doença apresentar, nesta espécie animal, sinais clínicos
inespecíficos, muitas vezes transitórios, e que se caracterizam por um quadro tipicamente respiratório e não cardíaco
como no cão. Por vezes pode mesmo culminar em casos de morte súbita. Na espécie felina é ainda frequente os
animais apresentarem-se amicrofilarémicos e com alterações laboratoriais e radiográficas transitórias ou mesmo
ausentes. Sabe-se, pelo estudos epidemiológicos já realizados noutros países, que em qualquer área onde existam
cães infectados com o parasita, a doença pode ocorrer na população felina, sendo no entanto a prevalência menor,
cerca de 5 a 10% da observada em cães na mesma área geográfica.
Objectivo: Pretendeu-se avaliar a prevalência de dirofilariose felina numa zona endémica para a dirofilariose canina.
Material e métodos: Foi realizado um rastreio dessa doença na região do Sado, mais propriamente na Península de
Setúbal. A detecção do antigénio foi realizada por um novo testes, utilizado pela primeira vez em Portugal, que
permite a detecção de antigénio D.immitis “SNAP® Feline Triple®” (IDDEX) com uma elevada sensibilidade
(89,3%) e especificidade (99,5%). Os testes para cão, os únicos disponíveis até recentemente, não são adequeados à
detecção da doença no gato, resultando num número inaceitável de falsos negativos. Foi igualmente armazenado
soro para a detecção de anticorpos face a este parasita.
Resultados: Na amostra populacional estudada - 86 gatos com mais de 6 meses de idade independentemente da raça,
sexo, habitat e plano de desparasitação - apenas foi diagnosticada a dirofilariose felina num dos animais. Este foi
então submetido a exame clínico completo. Das alterações observadas refere-se anemia ligeira, aumento de
neutrófilos segmentados e diminuição de linfócitos ligeira e ainda tortuosidade e presença de uma dirofilaria na
artéria pulmonar direita.
Conclusões: Face ao resultado obtido a prevalência de dirofilariose felina observada neste estudo, pioneiro em
Portugal, foi de 1,2% (1/86) e veio documentar pela primeira vez a existência da infecção felina, por Dirofilaria
imitis, na região do Sado. É possível que futura pesquisa de anticorpos venha a revelar que um número superior de
animais contactou com a doença, mas consegui eliminar espontaneamente a infecção. Os donos de gatos devem ser
informados da possibilidade de realizar prevenção para esta doença.
[Prevalence rate of feline heartworm in the Sado region]
Introduction: Heartworm is a parasitic disease caused by Dirofilaria immitis, a nematode. The dog is the definitive
host of this parasite, although cats can also be affected in more discrete numbers. Even though it‟s an emerging
disease, well known by the Veterinarian population and dog owners, it‟s frequently under diagnosed in the feline
population. Possibly, limitations regarding the availability of appropriate diagnostic tests and the unspecific signs ranging from transient symptoms to sudden death - presented by the disease in the feline specie, concur to the lack
of knowledge about the feline infection. Also, it is likely that veterinarians are prone to link this disease with heart
conditions and not respiratory signs; the latest are the ones showed by most cats. In addition, the amicrofilaremic
state and the transient or absent laboratory and radiology changes are common aspects in feline heartworm disease.
It is current knowledge, provided by epidemiological studies, that in any area where dogs are infected with the
parasite, the disease may occur in cats although with a lower prevalence rate (5 to 10% of prevalence rate in dogs).
Objective: The present study aimed to perform a screening on the feline heartworm in an endemic area of canine
heartworm, the Sado region.
Material and methods: Private owned and kennel cats were screened using, for the first time in Portugal, the SNAP®
Feline Triple®” (IDDEX) D. immitis screening test. This test was used because of it high sensitivity (89,3%) and
specificity (99,5%) for the infection in this specie. Tests available for dogs result in unacceptable numbers of false
negative reactions. Serum samples were stored for further detection of D. immitis antibodies.
Results: A sample population of 86 cats over 6 months of age was analysed. One private owned cat was found to be
positive for the antigen and was submitted to a complete clinical examination.
Conclusion: Prevalence of feline heartworm obtained in this study was 1, 2% (1/86) documenting for the first time
the existence of feline infection in the Sado region. It is likely that some cats have been infected but spontaneously
resolved the infection. Cat owners should be advised about the possibility of performing D. immitis prevention.
93
Detecção de Aelurostrongylus abstrusus e Ollulanus tricuspis em gatos da cidade de Lisboa
Waap, H., Gomes, J.
Aelurostrongylus abstrusus e Ollulanus tricuspis são parasitas de distribuição mundial, que afectam o gato
doméstico. Apesar de relativamente comuns, estes parasitas são frequentemente sub-diagnosticados, devido à
inespecificidade dos sinais clínicos. A severidade dos sintomas está associada à quantidade de parasitas envolvidos.
Nos gatos, a infecção gástrica por O. tricuspis pode provocar vómitos, anorexia, diarreia e perda de peso. As
manifestações clínicas decorrentes da infecção pulmonar por A. abstrusus variam desde sinais clínicos inaparentes,
tosse crónica e perda de peso, a dispneia e polipneia, por vezes com morte do animal. O presente trabalho teve como
objectivo determinar a prevalência destes parasitas em gatos da cidade de Lisboa. Para a pesquisa de A. abstrusus
procedeu-se à colheita de conteúdo intestinal e pulmões de 153 gatos (73 fêmeas e 80 machos) e para a pesquisa de
O. tricuspis à colheita de estômago de 131 gatos (67 fêmeas e 64 machos), recolhidos pela Câmara Municipal de
Lisboa e necropsiados no LNIV. A observação microscópica de raspagens do parênquima pulmonar e árvore
brônquica permitiu identificar A. abstrusus em 18 animais (11,8%), enquanto que a análise coprológica (Willis e
Sedimentação) detectou larvas em 7 animais (4,6%). O. tricuspis foi diagnosticado em 42 animais (32,1%) por
raspagem da totalidade da parede gástrica, seguido de lavagem e tamisação. A carga parasitária determinada em 28
animais variou entre 16 e 2877 parasitas (formas adultas e larvares). Não se observaram diferenças estatisticamente
significativas nas taxas de infecção entre machos e fêmeas para ambos os parasitas.
[Detection of Aelurostrongylus abstrusus and Ollulanus tricuspis in cats from the city of Lisbon]
Aelurostrongylus abstrusus and Ollulanus tricuspis are parasites of domestic cats with a worldwide distribution.
Though relatively common, these parasites are frequently under-diagnosed, due to the unspecificity of clinical signs.
The severity of symptoms is related to the amount of parasites involved. In cats, gastric infection with O. tricuspis
may cause vomiting, anorexia, diarrhoea and weight loss. The clinical manifestations associated to pulmonary
infection by A. abstrusus vary from clinically inapparent signs, chronic cough and weight loss, to dyspnoea and
polypnoea, and eventually death occurs. The aim of the present work was to determine the prevalence of these
parasites in cats from the city of Lisbon. For the diagnosis of A. abstrusus and O. tricuspis we collected,
respectively, intestinal contents and lungs from 73 female and 80 male cats (n= 153) and stomachs from 67 female
and 64 male cats (n=131), captured by the municipal services of Lisbon and necropsied at LNIV. The microscopic
examination of scrapings prepared from the pulmonary parenchyma and bronchial tree allowed identifying A.
abstrusus in 18 animals (11.8%), while the coprological analysis (Willis and Sedimentation) detected larvae in 7
animals (4.6%). O tricuspis was diagnosed in 42 cats (32.1%) by scraping of the entire gastric wall, followed by
washing and sieving. The parasite load determined in 28 cats varied between 16 and 2877 parasites (adult and larval
stages). No statistically significant differences were observed between infection rates in male and female cats
concerning both parasites.
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Imunoterapia específica para alergénios como terapêutica da dermatite atópica canina – O
conhecimentos dos médicos veterinários e dos proprietários
Silva, C., Lourenço Martins, A.M., São Braz, B.
Introdução: A imunoterapia específica para alergénios (ITEA) é uma forma de tratamento da dermatite atópica
canina (cDA) na qual se procede à administração de quantidades gradualmente crescentes, de um ou vários
alergénios, com o intuito de atenuar os sinais clínicos de cDA. A escolha dos alergénios a incluir na “vacina”, e a
adaptação do protocolo ao paciente em questão é fundamental de forma a obter uma maior eficácia e melhores
resultados clínicos, mas depende da aquisição de um conhecimento especifico desta forma terapêutica.
Objectivos: Pretendeu-se avaliar a utilização da ITEA por parte dos Médicos Veterinários (MV); o grau de
conhecimento e disponibilidade para a realização desta forma terapêutica por parte de proprietários de cães atópicos;
e, adicionalmente, no caso dos proprietários de animais que já tinham realizado ITEA durante um período mínimo
de 6 meses, pretendeu-se avaliar o seu grau de satisfação face a vários aspectos desta terapêutica.
Material e métodos: Assim foram elaborados 3 inquéritos diferentes com perguntas fechadas. Todos os proprietários
cujos cães se encontravam a realizar ITEA há mais de 6 meses provieram da consulta de dermatologia do Hospital
Escolar da Faculdade de Medicina Veterinária da UTL (HE-FMV).
Resultados: Os dados dos inquéritos - 50 MV, 30 proprietários de animais com cDA mas que não contactaram com
esta terapêutica e 16 proprietários de animais alérgicos que tinham realizado, ou estavam a realizar, tratamento com
ITAE - foram recolhidos em papel durante o Congresso Anual da APMVEAC e no HE-FMV, em 2010. Face aos
resultados dos inquéritos pode concluir-se que o conceito de ajustamento da ITAE a cada paciente não se encontra
ainda bem esclarecido na classe Médico Veterinária. De facto, 49% dos MV inquiridos não optou por ajustar o
protocolo de administração mesmo em casos em que tal seria necessário ou aconselhado, 24% dos inquiridos se
baseou apenas nos resultados positivos das provas alergológica para a a escolha dos alergénios a incluir no
tratamento. Somente 2% dos MV compararam os sinais clínicos com a potencial exposição aos alergénios a que
estão sujeitos os pacientes alérgicos, o que idealmente deve ser sempre realizado. Em relação aos proprietários de
pacientes com cDA, estes têm uma opinião positiva sobre a ITEA (66%) e estão dispostos a aderir a esta face à
perspectiva de melhoria clínica, ao custo, à via de administração e à duração deste tratamento. O nível de
informação e de satisfação dos proprietários cujos animais que já foram submetidos a ITAE, na consulta de
dermatologia, é elevado, sendo que 62% dos inquiridos, voltaria a submeter o seu animal a ITAE se tivesse que
voltar a decidir quanto à terapêutica a instituir.
Conclusões: A ITAE é bem aceite pelos proprietários e alcança taxas de sucesso muito significativas com poucos
efeitos secundários quando realizada adequadamente o que justifica que a classe veterinária investia na formação
relativamente a esta forma terapeútica.
[Allergen specific immunotherapy as a treatment of canine atopic dermatitis –Veterinarian´s and
owner´s knowledge on the subject]
Introduction: Allergen specific immunotherapy (ASIT) is based on the administration of gradually increasing doses
of allergens, with the purpose of alleviating the clinical signs of canine atopic dermatitis. In order to achieve a
greater effectiveness, this treatment should be tailored individually to each patient.
Objective: Our aim was to assess how ASIT was performed by the general practitioners, in particular to see if
treatment was tailored to the patient in every day clinical practice; the level of knowledge of allergic dogs‟ owners
about this treatment and how willing they were to adhere to it; and, additionally, to evaluate the degree of
satisfaction of owners of dogs submitted to immunotherapy for a period of at least six months with this form of
treatment.
Material and methods: Therefore, surveys were carried out to Veterinarians, to owners of dogs which suffer from
atopic dermatitis and to owners of dogs which have undergone specific immunotherapy. All questions were closed.
Results: From the results obtained it can be conclude that immunotherapy is not being individualized to each patient
by most clinicians. In most cases the choice of the allergens is based on the positive titles of the serum-based tests,
regardless of seasonality of clinical signs. The owners of dogs with atopic dermatitis have a good opinion of
immunotherapy and are willing to adhere to it. Also the owners of dogs that have done this treatment in the
dermatologic service demonstrated high levels of information and satisfaction.
Conclusion: ASIT is a well acceptable form of treatment for canine atopic dermatitis and owners report a high level
of response to this form of treatment when performed by someone able to adjust the therapy. We think everyone
performing this form of treatment should acquire specific knowledge in order to be able to obtain higher levels of
success and less side-effects.
95
Relação entre apresentação clínica, carga viral e titulação de anticorpos na Peritonite Infecciosa
Felina
Mota, A., Duarte, A., Almeida, V., Tavares, L.
A Peritonite Infecciosa Felina (PIF) é uma doença sistémica, mais frequente em animais jovens e gatos provenientes
de gatis, provocada pelo Coronavírus Felino (FCoV), um vírus RNA cadeia simples sentido positivo com envelope.
A proteína S viral permite a diferenciação entre os dois subtipos do FCoV. O vírus é transmitido por via fecal-oral,
atinge os enterócitos, onde se multiplica. O modo peculiar de replicação viral facilita o surgimento da mutação
essencial, que cria a forma virulenta do FCoV, o vírus da Peritonite Infecciosa Felina (FIPV). A resposta imunitária
celular é a única eficaz contra o FIPV. A resposta humoral não o é, podendo mesmo contribuir para o
desenvolvimento da doença. A presença de derrames é característica da forma exsudativa da PIF, manifestando-se
por dilatação abdominal e dispneia.
Os objectivos deste estudo foram aferir a existência de uma relação entre a carga viral presente nas amostras
biológicas e o título de anticorpos dos animais positivos à presença de Coronavírus Felino; comparar esses
resultados com a apresentação clínica dos animais com PIF e por fim subtipificar os isolados do Coronavírus Felino.
Para tal analisaram-se amostras provenientes de uma população que se dividiu nestes 2 grupos (positivos ao FCoV
com PIF [n=5] provenientes do Hospital Escolar da FMV, positivos ao FCoV sem a doença [n=31] do HEFMV e do
Canil Municipal de Monsanto). Para tal recorreu-se às técnicas de Real Time RT-PCR para detecção e determinação
da carga viral, ELISA indirecto para determinação do título de anti-corpos e PCR seguido de nested PCR para a
subtipificação do FCoV.
Verificou-se uma tendência para gatos com PIF e com uma maior diversidade de sinais clínicos apresentarem cargas
virais mais elevadas, quer nas fezes quer no líquido de derrame. No entanto não se verificou qualquer relação destes
dados com a titulação de anticorpos.
O FCoV subtipo I foi o mais encontrado nos gatos doentes, isolado ou em co-infecção com o subtipo II.
[Association between clinical presentation, viral load and antibody titre in Feline Infectious
Peritonitis]
Feline Infectious Peritonitis (FIP) is a systemic disease, more common in young animals and cats from multi-cat
households. The implicated agent is the Feline Coronavirus (FCoV), a positive sense single strand RNA enveloped
virus. The S protein allows for the differentiation between the two virus serotypes. The FCoV is transmitted by
faecal-oral route. Then the virus reaches the enterocytes where it replicates. The FCoV peculiar way to replicate
facilitates the mutation which turns FCoV into its virulent form, the Virus of Feline Infectious Peritonitis (FIPV).
The only way to defeat the virus effectively is through the cellular immune response. The humoral response can
even contribute to the disease pathogenesis. The leakage of plasma leads to abdominal, thoracic and/or pericardial
effusion, which are typical features of the FIP‟s wet form. The effusions may result in abdominal distension and/or
dyspnoea.
The goals for this study were to identify an association between the viral load within the biological samples and the
antibody titre in FCoV positive cats; compare those results with the clinical presentation of FIP positive cats and
also subtypify the FCoV isolates. For that we collected samples from animals FCoV positive, FIP positive (n=5) and
FCoV healthy carriers (n=31), in FMV School Hospital and Monsanto´s kennel.
For those purposes with used Real Time RT-PCR to detect and determine de viral load, indirect ELISA for antibody
titre determination and PCR plus nested PCR for FCoV subtypifying.
We verified that PIF positive cats tend to have higher viral loads not only in faecal samples but also in effusion. We
couldn´t find any relationship between those data and antibody titre.
The FCoV serotype I was the most frequently serotype found in cats with this disease, alone or associated with the
FCoV serotype II.
96
Qual a importância da colonização por Staphylococcus meticilina-resistente em animais de
companhia?
Couto, N., Pomba, C.
Laboratório de Resistência aos Antibióticos e Biocidas, CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon),
Portugal
Staphylococci meticilina-resistente (MRS) constituem um problema de saúde pública humana global devido à
resistência antimicrobiana e às elevadas taxas de mortalidade e morbilidade. Este estudo investigou a prevalência de
colonização por Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA) e Staphylococcus pseudintermedius
meticilina-resistente (MRSP) em cães e gatos internados no Hospital Escolar da FMV-UTL. De Abril de 2008 a
Maio de 2010, obtiveram-se zaragatoas nasais de 141 gatos e 146 cães até duas horas após a admissão ao hospital.
As zaragatoas foram enriquecidas e após incubação durante a noite, as suspensões bacterianas foram plaqueadas em
chromID MRSA (bioMérieux). As colónias suspeitas de MRS foram confirmadas por detecção do gene mecA por
PCR. MRS foram isoladas a partir de 10 cães (7,1%) e dois gatos (1,4%). Nove isolados foram identificados como
MRSP e os restantes três isolados como MRSA. MRSP foi detectado apenas em cães (6,2%, intervalo de confiança
de 95% [IC] 2,9-11,4%), resultando numa diferença estatisticamente significativa entre cães e gatos (teste exacto de
Fisher, p = 0,004). Identificaram-se duas linhagens genéticas distintas entre os nove isolados de MRSP: PFGE tipo
A-spa tipo t06-SCCmec V-Luk-I-negativo- toxina esfoliativa Staphylococcus intermedius (SIET)-positivo (1
isolado) e PFGE tipo B-spa tipo t02 -SCCmec III-Luk-I-positivo-SIET-positivo (8 isolados). MRSA foi encontrado
em dois gatos (1,4%, 95% IC 0,2-5,0%) e um cão (0,7%, 95% IC 0,02-3,8%). Não foi observada nenhuma diferença
estatisticamente significativa entre as duas espécies em relação à colonização por MRSA. Os três isolados de MRSA
pertenciam ao spa tipo t032, SCCmec tipo IV, eram PVL-negativas e exibiram um padrão único de PFGE
correspondente ao clone EMRSA-15 (sequência tipo ST22). Os isolados de MRSP foram resistentes a um maior
número de antibióticos (fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, inibidores dos canais de folato, macrólidos,
lincosamidas) do que os isolados de MRSA, que foram consistentemente co-resistentes às fluoroquinolonas. O
nosso estudo demonstra que os animais de companhia são reservatórios de estirpes importantes de MRS,
nomeadamente do clone EMRSA-15, clone mais prevalente nos hospitais portugueses humanos. Para além do
referido, o estado portador dos animais de companhia de MRSP constitui um risco para a colonização e infecção
tanto de animais como do homem. A colonização por MRS nos animais de companhia é um problema emergente e
importante em saúde pública em Portugal e no mundo.
[Is colonization with methicillin-resistant staphylococci important in small animals?]
Methicillin-resistant staphylococci (MRS) are a human recognized global public health problem due to antimicrobial
resistance and high associated mortality and morbidity rates. This study investigated the prevalence of methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) and methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)
carriers among animals presenting at the teaching hospital of the FMV-UTL. From April 2008 to May 2010, nasal
swabs were obtained from 141 cats and 146 dogs within two hours after admission to the hospital. The swabs were
enriched and after overnight incubation, the bacterial suspension was plated on to ChromID MRSA (bioMérieux).
Suspected MRS colonies were confirmed by PCR detection of mecA. MRS were isolated from 10 dogs (7.1%) and
two cats (1.4%). Nine isolates were identified as MRSP and the remaining three isolates were determined to be
MRSA. MRSP was detected only in dogs (6.2%, 95% confidence interval [CI] 2.9 to 11.4%), resulting in a
statistically significant difference between dogs and cats (Fisher‟s exact test, p=0.004). Two distinct genetic lineages
were identified among the nine MRSP isolates: PFGE type A-spa type t06-SCCmec V-Luk-I-negativeStaphylococcus intermedius exfoliative toxin (SIET)-positive (one isolate) and PFGE type B-spa type t02-SCCmec
III-Luk-I-positive-SIET-positive (eight isolates). MRSA was found in two cats (1.4%, 95% CI 0.2 to 5.0%) and one
dog (0.7%, 95% CI 0.02 to 3.8%). No statistically significant difference was observed between the two host species
in relation to MRSA carriage. The three MRSA isolates belonged to spa type t032, harbored SCCmec type IV, were
PVL-negative and displayed a unique pattern on PFGE corresponding to EMRSA-15 (sequence type ST22). MRSP
isolates were resistant to a larger number of antibiotics (fluoroquinolones, aminoglycosides, folate pathway
inhibitors, macrolides, lincosamides) than the MRSA isolates, which were consistently co-resistant to
fluoroquinolones. Our study demonstrates that pets can act as a reservoir of important MRS strains, namely the
EMRSA-15 clone, which is the most prevalent clone in Portuguese human hospitals. Additionally, MRSP carriage
by pets is a risk for infection and colonization both in animals and humans. Colonization with MRS in small animals
is an emerging and important public health problem in Portugal and worldwide.
97
Buiatria
Leptospirose bovina na Região Autónoma dos Açores e seu impacte na saúde pública
Borrego, S.1, Flor, L.2, Mota-Vieira, L.3, Vieira, M.L.4, Santos, C.1, Collares-Pereira, M.4
1 Direcção de Serviços de Agricultura e Pecuária, Direcção Regional do Desenvolvimento Agrário (DRDA), Secretaria Regional de Agricultura e
Florestas (SRAF), São Miguel, R.A. Açores, Portugal
2 Laboratório Regional de Veterinária, Direcção de Serviços de Veterinária – DRDA, SRAF, Terceira, R.A. Açores, Portugal
3 Unidade de Genética e Patologia Moleculares, Hospital do Divino Espírito Santo de Ponta Delgada, EPE, São Miguel, R A. Açores, Portugal
4 Unidade de Microbiologia Médica, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Portugal
Nos Açores, a taxa de incidência média anual da leptospirose humana (11,1 casos/100.000 habitantes) é cerca de 10
vezes superior à de Portugal continental (1,7 casos). De 1993 a Junho de 2011 (inclusive), foram confirmados
laboratorialmente 500 casos de leptospirose, 15 dos quais fatais; os adultos em idade activa (25-44 anos) e com
profissões relacionadas com actividades agrícolas e/ou pecuárias são dos mais infectados. Os principais serogrupos
presuntivos responsáveis pela infecção humana têm sido Icterohaemorrhagiae (≈54%) e Ballum (≈33%), cujos
reservatórios dominantes são os roedores (murinos), e Sejroe (≈10%), que tem, nos bovinos, o principal reservatório
para o serovar Hardjo. No âmbito do Projecto “Epidemiologia e Controlo da Leptospirose nos Açores (2003-2008)”,
desenvolvido por uma equipa multidisciplinar ao abrigo do Acordo de Cooperação e Defesa entre Portugal e os
EUA (No. 58-40001-3-F185), realizou-se um estudo em bovinos das ilhas Terceira (T) e São Miguel (SM), com o
objectivo de: i) identificar as leptospiras transmitidas por estes animais (após isolamento por cultura de rim); e ii)
determinar a seroprevalência da infecção por Leptospira (pela técnica de aglutinação microscópica - TAM) em
explorações leiteiras, não vacinadas. As explorações com, pelo menos, um animal positivo foram incluídas no
cálculo da respectiva taxa global ao nível da exploração. No primeiro trimestre de 2008, 365 bovinos adultos, para
abate, foram seleccionados, com vista ao isolamento de leptospiras; obteve-se um total de 11 isolados - 8+/245
(3,3%) na T e 3+/120 (2,5%) em SM - todos pertencentes à espécie genómica Leptospira borgpetersenii, serovar
Hardjo, tipo Hardjo-bovis. As serologias foram efectuadas em 5438 animais (nT=1477 e nSM=3961),
desenvolvendo a TAM contra 13 serovares pertencentes a 10 serogrupos do complexo L. interrogans sensu lato,
num total de 63 e 93 explorações da T (Julho-Dezembro/2007) e SM (Janeiro-Julho/2008), respectivamente. A
seroprevalência, ao nível das explorações, foi de 66,7% na T e 70,9% em SM; em termos individuais, a taxa foi de
6,8% (T) e 7,5% (SM). Em ambas as ilhas, o serogrupo Sejroe foi o mais reactivo na TAM, o que, aliado ao
isolamento da espécie L. borgpetersenii serovar Hardjo, confirma o papel relevante dos bovinos na transmissão
endémica destas bactérias, responsáveis por uma forma mais benigna da doença nos humanos. Paralelamente, a
detecção de anticorpos contra leptospiras dos serogrupos Icterohaemorrhagiae e Ballum indica que estes animais
podem também ter importância na infecção antropozoonótica por estes agentes.
98
Declínio da fertilidade em bovinos leiteiros - alguma solução?
António Rocha
ICBAS e CECA-ICETA, Universidade do Porto, Portugal
Nas últimas décadas tem-se assistido a uma degradação generalizada dos índices de eficiência reprodutiva de
bovinos de leite. Numa análise dos registos da Coo.p Agrícola de Vila do Conde 1 das vacas em produção entre 1980
e 1998, com uma produção média de 6941 kg de leite em 305 dias, constatou-se a existência de elevada fertilidade à
inseminação (51% de partos à 1ª IA; n=17713) resultando num reduzido número de inseminação por gestação (1,43;
n=4542), mas um intervalo médio parto-prenhez (IPP) muito prolongado (148 a 177 dias; n=3961), em parte devido
à ineficiente detecção de cios (38%; n=3868). Uma nova avaliação dos dados de efectivos da mesma Cooperativa 2,
desta feita referentes a vacas nascidas entre 1996 e 2002, com uma produção média de 8590 kg de leite em 305 dias,
evidenciou uma pequena mas constante e significativa (P<0.05) detriorização de todos os parâmetros de fertilidade
analisados, com excepção da idade ao 1º parto (28.8±0.14 meses; n=24,184). Em particular, a percentagem de
partos à 1ª IA diminuiu 0.3%/trimestre (47,2%±14,1%; n=25829), com um aumento de 0,04 1ª IA/parto/ano
(1,8±1,2; n=21094) e um aumento do IPP de 0.7 dias/ano. Houve uma taxa de refugo elevada com apenas 1816 de
12130 vacas a atingirem a 4º lactação (15%). Concluiu-se que na área estudada os índices de fertilidade das vacas de
leite estão a deteriorar-se, de uma forma pouco acentuada, mas persistente. O stress fisiológico de elevadas produção
de leite tem sido considerado o principal responsável pela diminuição dos índices de fertilidade, já que a fertilidade
das novilhas se tem mantido estável. No entanto, factores como modificações ambientais drásticas dos sistemas de
produção de bovinos de leite, enviesamento de análise provocado pela tendência de insistir na reprodução de vacas
de alta produção enquanto se eliminam rapidamente animais menos produtivos, elações feitas a nível do indivíduo
(vaca) em base a dados de manada/população, e a utilização de métodos estatísticos menos adequados, levam alguns
autores3 a questionarem a relação entre produção de leite e fertilidade. Vários métodos para estabilizar/reverter a
diminuição dos índices reprodutivos têm sido propostos. Entre eles, uma assistência veterinária integrada, específica
para cada exploração, com definição de objectivos, é fundamental. Utilizações de cruzamentos, espaçamento dos
partos com consequente prolongamento das lactações têm sido outras propostas exploradas, assim como utilização
de variadíssimas técnicas de reprodução assistida. A fisiologia reprodutiva da vaca de alta produção tem sido
escrutinada em detalhe, e estão identificadas as áreas de maior potencial para futuras intervenções 4.
Bibliografia: 1 Rocha et al. 2001. Repro Dom Anim 36:319; 2 Rocha et al. 2010. Repro Dom Anim 45:896 ; 3 LeBlanc & Campbell. 2010. XXVI
World Buiatrics Cong: 103-113; 4 Walsh et al. Anim Repro Sci. 2011. 123:127.
[Decrease fertility in dairy cows – is there a solution?]
A widespread decrease in fertility of dairy cows has been noted in the last decades. A study1 based on data from
1980 to 1998 of dairy cows with an average production of 6941 kg of milk in 305 d, registered in the Dairy Coop of
Vila do Conde, indicated a high calving rate at first AI (51%; n=17713), resulting in a low number of AIs per
pregnancy (1.43; n=4542), but associated with a delayed calving to conception interval (IPP – 148 to 177 d;
n=3961), at least in part due to a low estrus detection rate (38%, n=3868). A subsequent study 2 from data of the
same coop for cows born from 1996 to 2002, with a mean milk production of 8590 kg in 305, showed a slight but
persistent and significant (p<0.05) deterioration of all reproductive parameters, with the sole exception of age at first
calving (28.8±0.14 months; n=25829). Calving rate at 1st AI decreased 0.3% per trimester (47.2%±14.1%;
n=24184), a 0.04% decrease of calving at 1 st AI per year was noted, resulting in higher number of 1 st AI/calving
(1.8±1.2 ; n=21094) and an increase of 0.7 d/year for IIP. The culling rate was high, with only 1816 cows out of
12130 (14%) producing a 4rth lactation. It was concluded that in the studied area the reproductive parameters have
been deteriorating slowly, but steadily. Generally, physiological stress due to high milk production has been
considered the main reason for the lowered fertility rates, as conception rates of heifers have kept rather constant
over time. However, the effect of drastic changes in production systems that may not have take into account the
needs of present day high producing cows, coupled with the utilization of inadequate statistical methods and the use
of biased fertility indexes, led some authors3 to question the relationship between high levels of milk production and
lowered fertility. Several strategies to interrupt or revert the downward trend of fertility have been proposed. Chiefly
among them is an integrated, farm-specific veterinary intervention, with clearly defined targets. The use of
crossbreeding and of extended lactation curves associated with longer intercalving intervals have also been
suggested, as well as the utilization of a considerable number of assisted reproduction techniques. The reproductive
physiology of the high producing dairy cow has been scrutinized in detail, and areas with potential for further
intervention have been identified4.
99
Importância clínica, económica e riscos para a saúde publica da Criptosporidiose em bovinos
Mendonça, C.1,2, Soares, S.2,3, Neves, J.F.4, Ventura, J.5, Correia da Costa, J.M.2,3, Canada, N.2,3
2 CECA, Universidade do porto, Vairão, Portugal
3 Centro de Imunologia e Biologia Parasitária, Instituto Nacional de Saúde INSA, Porto, Portugal
4 Clinica Privada, Tocha, Figueira da Foz, Portugal
5 Cooperativa Agricola de Vila do Conde, Vila do Conde, Portugal
Cryptosporidium spp. e Giardia duodenalis, são parasitas protozoários, cujo principal quadro clínico, nos
hospedeiros Homem e animais domésticos, é a enterite. As infecções por estes protozoários nos bovinos, podem ser
abordadas sob duas perspectivas: No âmbito da Medicina Veterinária – onde assumem especial relevância em
termos económicos, uma vez que são responsáveis por consideráveis perdas económicas resultantes da elevada
morbilidade em animais jovens e da diminuição dos índices produtivos em novilhas e adultos. No âmbito da Saúde
Publica – onde assumem um potencial zoonótico considerável, através da sua transmissão à população humana a
partir de água ou alimentos contaminados. Os bovinos podem albergar quatro espécies de Cryptosporidium: 1)
Cryptosporidium parvum, o genótipo zoonótico, é responsável por quadros de enterite em vitelos, com elevada
morbilidade. 2) Cryptosporidium bovis - infecta os jovens entre os 2 aos 11 meses de idade. 3) Cryptosporidium
andersoni - infecta o abomaso de bovinos jovens e adultos. 4) Cryptosporidium ryanae - infecta vitelos e novilhos
até aos 11 meses de idade e bovinos adultos, os animais são assintomáticos. Os bovinos são susceptíveis à infecção
por dois genótipos de Giardia duodenalis: o genótipo zoonótico, Assemblage A e o genótipo dos animais ungulados
Assemblage E. As infecções por Giardia em bovinos são na sua maioria assintomáticas nos adultos, estando
relacionada com ocorrência de enterite em vitelos.
Os animais infectados excretam elevado numero de oo(cistos) por grama de fezes, contaminando o ambiente. Os
oo(cistos) destes protozoários são muito resistentes no meio ambiente e os métodos convencionais utilizados para o
tratamento das águas não são eficientes na sua neutralização.
No contexto da produção leiteira intensiva, em que, elevada quantidade de água é necessária á produção, a
utilização de água potável para fins produtivos é economicamente inviável e a elevada quantidade de efluentes
provenientes e a sua manipulação incorrecta, são factores determinantes para a contaminação ambiental. Os
fármacos utilizados para o tratamento de Criptosporidiose e Giardíase, não eliminam definitivamente as infecções da
exploração, não existe profilaxia vacinal disponível para bovinos, os métodos de maneio empregues nestas
explorações parecem assumir uma considerável importância para a perpetuação das infecções nos efectivos; torna-se
assim premente a identificação e caracterização dos focos de infecção, pois esta parece ser a única forma de se poder
definir medidas e estratégias de controlo.
100
Aspectos clínicos da Theileriose bovina na região do Alentejo
Jaime Ribeiro
Vet+, Serviços Veterinários Lda, Montemor-o-Novo, Portugal
Introdução: A Theileriose resulta da infecção por protozoário do género Theileria, da ordem Piroplasmida. A
Theileriose tropical dos bovinos, causada pela espécie T. annulata, é uma doença com alta morbilidade e
mortalidade e constitui uma série de limitações à produção pecuária por todo o mundo (Glass et al., 2003). A doença
ocorre no sul da Europa, estendendo-se ao sul da Rússia, Médio Oriente, Ásia Central, China, Índia, Norte de África
e Sudão, Eritreia e Mauritânia, onde se estima que um total de 250 milhões de bovinos esteja em risco (Mohammad
Al-Saeed et al., 2010). Em Portugal a doenças é relativamente familiar aos clínicos mas pouco diagnosticada e de
resolução clínica algo complicada. Devido a esse facto interessante sintetizar todos os aspectos clínicos da doença,
tal como a temos observado na zona do Alentejo.
Transmissão: A principal forma de transmissão é através do hospedeiro invertebrado específico (carraças do género
Hyalomma) A transmissão transovárica não ocorre em parasitas pertencentes ao género Theileria (CFSPH - Center
for Food Security and Public Health, 2009). A transmissão da Theileriose pelos ixodídeos ocorre de forma
transtadial, isto é, se o artrópode ingere o parasita como larva, transmite-o como ninfa, se o ingere como ninfa,
transmite-o em adulto. Em Portugal, estão presentes ixodídeos do género Hyalomma, responsáveis pela transmissão
da Theileriose tropical. Estes vectores são encontrados em especial na região do Ribatejo e Alentejo, onde foram
identificadas as espécies Hyalomma lusitanicum e Hyalomma marginatum marginatum (Caeiro, 1999).
Sinais Clínicos: Os sinais clínicos mais comuns em animais infectados por T. annulata são: perda de peso, anorexia,
fraqueza, hipertermia, petéquias na mucosa conjuntival, linfodenopatia, anemia e tosse. No inicio da infecção,
quando se formam um determinado número de macroesquizontes, aparece febre (40-41oC) que permanece constante
durante 7-8 dias, adenomegália dos linfonodos superficiais, aumento do pulso e frequência respiratória (Navarrete et
al., 2002, Pipano & Shkap, 2004). A anorexia e diminuição da motilidade ruminal são precedidas por desidratação e
constipação. Em animais jovens os sinais clínicos são: lesões nodulares cutâneas multifocais (nódulos subcutâneos
com 0,5 a 3 centímetros de diâmetro), emagrecimento, anemia, exoftalmia, petéquias nas mucosas e
linfadenomegália. A taxa de mortalidade associada à Theileriose tropical varia entre 20 e 90% nas diferentes áreas
geográficas, devido à susceptibilidade dos bovinos afectados e à virulência dos parasitas envolvidos. Os bovinos
adultos, que aparentemente recuperaram da infecção, podem morrer 2 a 3 semanas após o desaparecimento dos
esquizontes como resultado de complicações, como a disfunção hepática. Os vitelos recuperados podem evidenciar
défice de crescimento.
Diagnóstico: Sintomatologia clínica, observação microscópica de esfregaços de sangue periférico e/ou de biópsia de
linfonodos, Serologia, PCR.
Tratamento: Oxitetraciclina, Buparvoquona, Diaminazina, Imidocarb.
Controlo: Como na maioria das doenças transmitidas por ixodídeos, o controlo da Theileriose tropical, é realizado
essencialmente através de medidas de maneio, controlo de vectores, imunização e criação de raças ou linhas
genéticas resistentes.
Realidade No Alentejo: 96,7% das explorações estudadas na região do Alentejo apresentaram positividade a
anticorpos de Theileria annulata (n=27).
Bibliografia: Glass, E. J., Craigmile, S. C., Springbett, A., Preston, P. M., Kirvar, E., Wilkie, G. M., Eckersall, P. D., Hall, F. R.,
& Brown, C. G. (2003). The protozoan parasite, Theileria annulata, induces a distinct acute phase protein response in cattle that
is associated with pathology. Int. J. Parasitol. 33, 1409-1418, doi:S0020751903001668 [pii]; Mohammad Al-Saeed, A. T., Omer,
L. T., Abdo, J., Habibi, G., Salih, D. A., Seitzer, U., & Ahmed, J. (2010). Epidemiological studies on tropical theileriosis
(Theileria annulata infection of cattle) in Kurdistan Region, Iraq. Parasitol. Res. 106, 403-407, doi:10.1007/s00436-009-1675-7
[doi]; CFSPH - Center for Food Security and Public Health, C. o. V. M. I. U. E. (2009). Theileriosis pp. 1-4; Caeiro, V. (1999).
General review of tick species present in Portugal. Parassitologia 41 Suppl 1, 11-15; Navarrete, I., Serrano, F. J., & Reina, D.
(2002).Parasitología Veterinaria 3 ed., edited by M. C. Campillo & F. A. R. Vásquez, pp. 294-302. Madrid: McGRAW-HILL
Interamericana de España, S.A.U.
101
Abordagem cirúrgica da dilatação e deslocamento cecal em bovinos
Dário Guerreiro
SERBUVET. Email: [email protected]
Quando falamos em resolução cirúrgica dos compartimentos gastro-instestinais dos bovinos, a mais prevalente é
sem dúvida a resolução cirúrgica do deslocamento do abomaso. No entanto, outras são as patologias que requerem
resolução cirúrgica e que são muitas vezes sub-diagnosticadas. É o que sucede com a dilatação e deslocamento cecal
que numa parte dos casos é acompanhada de retroflexão ou, mais raramente de torção, não só do ceco mas também
da porção proximal do cólon.
Perante este tipo de patologia é fundamental fazer um exame clínico minucioso, com particular atenção ao exame
das estruturas anatómicas em questão, por palpação rectal. É igualmente importante avaliar o estado geral do animal,
particularmente o aumento da frequência cardíaca e outros indicadores de dor, e a redução da produção leiteira, e
quão abrupta foi essa redução. Fruto de um bom diagnóstico clínico, surge a decisão do médico veterinário:
tratamento clínico ou resolução cirúrgica. É essa a grande questão, uma vez que no caso destas patologias agudas e
hiper-agudas o tempo que medeia o aparecimento dos sintomas e a resolução da patologia é o principal
condicionante do sucesso da actuação.
No caso da resolução cirúrgica, e de acordo com as referências bibliográficas disponíveis, preconizo o acesso à
cavidade abdominal pela fossa paralombar direita, com exteriorização do ceco, tiflotomia com eliminação do
conteúdo cecal e do gás acumulado no ceco e nos compartimentos intestinais adjacentes, seguida de sutura da
incisão e recolocação dos compartimentos intestinais na sua posição anatómica. Após este procedimento segue-se a
sutura da parece abdominal; habitualmente acompanho este último procedimento de omentopexia e piloropexia.
Com este tipo de cirurgia, feita precocemente, tenho conseguido uma boa taxa de sucesso na resolução do problema,
o que significa, não só salvar a vida do animal, mas também em cerca de 24-36 horas (duas a três ordenhas),
conseguir um retorno à produção leiteira normal.
Referências: Meylan M. Surgery of the bovine large intestine. Vet Clin North Am Food Anim Pract 2008; 24: 479-496.
102
Conselho Português de Saúde do Úbere: a génese
Bexiga, R., Salvado, T., Roque, E.
CPSU - FMV Laboratório de Microbiologia, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa, Portugal
O objectivo desta comunicação é despertar a atenção dos colegas para um novo grupo de trabalho criado
recentemente, denominado Conselho Português de Saúde do Úbere. É uma associação sem fins lucrativos,
constituída por um grupo de médicos veterinários com interesse na compilação e partilha de conhecimentos técnicos
e científicos sobre a temática das mastites em ruminantes. Estamos crentes que, dada a relevância da área da Saúde
do Úbere, assim como da associação agora criada, existe um interesse comum para serem encontradas formas de
colaboração com os médicos veterinários, produtores e indústria em geral, para ajudar a desenvolver de forma
sustentada e credível o sector da qualidade do leite no mercado nacional. Encontram-se no seu âmbito as disciplinas
da microbiologia, epidemiologia, farmacologia, economia, avaliação de salas de ordenha e outras que contribuam
decisivamente para a evolução da qualidade de leite em território nacional.
Serão também apresentados vários projectos já iniciados pelo conselho, nomeadamente a apresentação pública do
conselho que deverá acontecer no início de Setembro de 2011. Está também já a decorrer a preparação de um
workshop na área da qualidade do leite para o Congresso Mundial de Buiatria a realizar em Lisboa no próximo ano
(Junho 2012). A área de interesse deste workshop será a máquina de ordenha, sendo dividido em dois níveis; um
nível inicial para dar a conhecer os principais problemas que podemos identificar numa primeira abordagem na
avaliação da máquina de ordenha; e um nível mais avançado, que pretende que profissionais da qualidade do leite
tenham um contacto mais próximo com um sistema de avaliação de máquinas de ordenha - Lactocorder®.
Acreditamos que este Conselho contribuirá para um pleno intercâmbio de informação científica e técnica na área da
Saúde do Úbere bem como para salientar temáticas novas e de interesse para esta área. Envolver os colegas neste
trabalho, assim como sensibilizá-los para a temática e importância da saúde do úbere é o principal interesse desta
apresentação.
[Udder Health Portuguese Council: the genesis]
The purpose of this communication is to raise attention of colleagues to a new working group, created recently,
called the Udder Health Portuguese Council. It is a nonprofit association, formed by a group of veterinarians with an
interest in the collection and sharing of technical and scientific knowledge on the subject of mastitis in dairy cattle.
We believe that given the relevance of this area of udder health, as well as the association now created, there is a
common interest to found ways of working with veterinarians, producers and industry in general, to help develop a
sustained and credible sector of milk quality in the portuguese market. Are within its scope the disciplines of
microbiology, epidemiology, pharmacology, economics, evaluation of milking parlors and other that can contribute
decisively to the evolution of the quality of milk in the country.
We will also present various projects launched by the council, including the public presentation of the council that
should happen in early September 2011. We are also preparing a workshop in the area of milk quality for the World
Buiatrics Congress in Lisbon next year (June 2012). The area of interest of this workshop will be the milking
machine, being divided into two levels; an initial level to get to know the main problems that we can identify in a
first approach evaluating the milking machine; and a more advanced level, where the professionals of milk quality
can have a close contact with an evaluation system for milking machines - Lactocorder®.
We believe that this Council will contribute to a full exchange of scientific and technical information in the area of
udder health and to highlight new issues and interest in this area. Involve colleagues in this work, as well as make
them aware of the issue and importance of udder health is the main interest of this presentation.
103
Equinos
Equitação com fins terapêuticos… Juntos na mesma sintonia
Patrícia Pinote Martins
Centro de Equitação Terapêutica da Associação de Paralisia Cerebral de Lisboa e Escola Nacional de Equitação
A Equitação com Fins Terapêuticos traduz-se numa abordagem cujos contributos se reflectem a nível motor,
cognitivo e psicossocial, aliando os conceitos base da Equitação Clássica com os fundamentos teóricos da
Reabilitação. Segundo a FRDI (Federação Internacional de Equitação para Deficientes), a Equitação com Fins
Terapêuticos engloba três valências: a Hipoterapia, a Equitação Terapêutica/ Educacional e volteio e a Equitação
Desportiva Adaptada, cada com objectivos de intervenção distintos.
O cavalo torna-se um aliado precioso neste processo de intervenção uma vez que o seu movimento a passo é
semelhante à marcha humana neurofisiologicamente normal, produzindo movimentos tridimensionais que irão
influenciar e auxiliar na reeducação do Sistema Nervoso Central dos cavaleiros com necessidades especiais,
nomeadamente com patologia neuromotora. A própria fisionomia do seu dorso permite um correcto posicionamento
sentado e, juntamente com o meio envolvente, torna-se um promotor de vivências fundamentais para o
desenvolvimento de competências Motoras, Cognitivas, Comunicativas e Psicossociais.
104
Evolução do peso vivo e da condição corporal ao longo da gestação em éguas Puro Sangue Lusitano
Fradinho, M.J.1, Correia, M.J.2, Beja, F.2, Rosa, A.3, Perestrello, F.4, Bessa, R.J.B.1, Ferreira Dias, G.1, Caldeira,
R.M.1
2 Fundação Alter Real, Alter-do-Chão, Portugal
3 Qta. da Lagoalva de Cima, Alpiarça, Portugal
4 Companhia das Lezírias, Samora Correia, Portugal
O presente estudo teve como principal objectivo a caracterização da evolução do peso vivo (PV) e da condição
corporal (CC) ao longo da gestação na égua Lusitana, em dois sistemas de maneio alimentar: pastagem mais
suplementação diária (P+S) e apenas pastagem (P). Para o efeito, o PV e a CC (0-5 pontos) foram avaliados
mensalmente, em 60 éguas Lusitanas, desde o primeiro mês de gestação (1G) até ao primeiro mês pós parto (1L),
durante duas épocas reprodutivas no sistema (P+S) e três épocas reprodutivas no sistema (P). Os dados foram
agrupados de acordo com a época de parto: Fev-Mar e Abr-Mai. Utilizou-se um modelo linear misto para medidas
repetidas para avaliar o efeito da época de parto, do mês de gestação e a da respectiva interacção no PV e na CC. Ao
longo da gestação foram observadas variações no PV e na CC. No sistema P+S, o PV variou entre 521,6±9,4 kg
(1G) e 568,9±9,5 kg (11G) nas éguas que pariram em Fev-Mar e entre 567,7±10,8 kg (1G) e 623,0±10,8 kg (11G)
nas éguas que pariram em Abr-Mai. No sistema P, o PV variou entre 503,4±6,7 e 546,9±6,2 kg e entre 505,3±11,4 e
587,5±12,5 kg, respectivamente No último trimestre de gestação verificaram-se aumentos significativos de PV,
embora com um menor acréscimo nas éguas de Fev-Mar, em ambos os sistemas. Ao longo do estudo, observaram-se
pequenas variações na CC das éguas, com amplitudes máximas de 0,22 pontos no sistema P+S e 0,46 pontos no
sistema P. As notas de CC mais elevadas registaram-se nas éguas do sistema P+S, nas duas épocas de parto. A CC
variou entre 3,07±0,07 (1G) e 3,08±0,07 (11G) nas éguas paridas em Fev-Mar e entre 3,27±0,08 (1G) e 3,35±0,08
(11G) nas éguas paridas em Abr-Mai. Nas éguas do sistema P, a CC variou entre 2,9±0,07 (1G) e 2,83±0,07 (11G) e
entre 2,88±0,13 e 3,16±0,13, respectivamente. Nos dois sistemas, verificou-se uma diminuição da CC no último
trimestre de gestação até ao 1L, nas éguas que pariram na época de Fev-Mar. O maior aumento de PV e de CC ao
longo da gestação foi verificado nas éguas que pariram em Abr-Mai. Os resultados obtidos sugerem que as variações
de PV e de CC ao longo da gestação, nas éguas Lusitanas conduzidas em sistemas extensivos, são influenciadas pelo
ciclo de produção da pastagem, independentemente de algumas diferenças nos regimes alimentares. Esta informação
associada a um melhor conhecimento da fertilidade das éguas e do crescimento dos poldros até ao desmame poderá
contribuir para a escolha de planos alimentares e de épocas de parto mais adequados, no sentido de atingir uma
maior eficiência do sistema de produção.
[Changes on body weight and body condition in the Lusitano broodmare]
The main objective of this study was to characterize body weight (BW) and body condition (BC) changes along
pregnancy in the Lusitano broodmare under two feeding systems: pasture plus daily supplementation (P+S) and
pasture only (P). BW and BC (0-5 points scale) were monthly assessed from the first month of gestation (1G) to the
first month after foaling (1L) in 60 Lusitano mares over two (P+S) and three (P) breeding seasons. For both systems,
data were grouped according to foaling season: Feb-Mar and Apr-May. A mixed linear model allowing for repeated
measures was used to assess the effect of foaling season, effect of gestation month and their interaction on BW and
BC. Throughout pregnancy, BW and BC changes were observed. On P+S system, BW varied from 521.6±9.4 (1G)
to 568.9±9.5 kg (11G) for Feb-Mar mares, and from 567.7±10.8 (1G) to 623.0±10.8 kg (11G) for Apr-May mares.
Likewise, for P system BW changed from 503.4±6.7 to 546.9±6.2 kg and from 505.3±11.4 to 587.5±12.5 kg,
respectively. Significant increases of BW were found on the last trimester of gestation although with a smaller
accrual in Feb-Mar mares on both systems. Along the study, small changes of BC were observed with maximal
amplitudes of 0.22 points in P+S and 0.46 points on P. Higher BC values were registered on P+S mares for both
foaling seasons. BC ranged from 3.07±0.07 (1G) to 3.08±0.07 (11G) for Feb-Mar mares and from 3.27±0.08 (1G) to
3.35±0.08 (11G) for Apr-May mares. For P system, BC ranged from 2.9±0.07 (1G) to 2.83±0.07 (11G) and from
2.88±0.13 to 3.16±0.13, respectively. On both systems, BC of Feb-Mar mares decreased on the last trimester of
gestation until 1L. The largest increase in BW and BC, between 1G and 11G, was shown by Apr-May mares.
Obtained results suggest that changes in BW and BC in the Lusitano broodmare, managed on grazing systems, are
influenced by pasture production cycle, regardless of some differences in feeding regimes. These data associated
with knowledge on mares‟ fertility and foals' growth until weaning will contribute for better decisions about the
more appropriate feeding plan and foaling season, in order to achieve the higher efficiency of the production system.
105
Estudo do parasitológico de três populações de equídeos na coudelaria de Alter Chão*
Girão Osório, F.1, Gomes, L.2, Correia, M.J.3, Oom, M.M.4, Madeira de Carvalho, L.M.2
1 Mestrado Integrado em Engenharia Zootécnica, ISA-FMV, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
2 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal . Email: [email protected]
3 Fundação Alter Real, Couldelaria de Alter do Chão, Portugal . Email: [email protected]
4 Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, Centro de Biologia Ambiental, Portugal. Email: [email protected]
A crescente procura de equídeos como animais de desporto e companhia, torna necessário o conhecimento de
factores condicionantes da sua produção. Neste estudo foram abordados animais criados em regime extensivo na
Coudelaria de Alter do Chão, com o objectivo de caracterizar o seu parasitismo gastrointestinal de acordo com
factores que a possam condicionar como a raça/espécie, idade do indivíduo, a consanguinidade das populações, a
disponibilidade de erva e a sua evolução sazonal.
Foram estudados equídeos de duas espécies: Equus ferus spp. przewalskii e E. caballus (raças Sorraia e Lusitana).
Procedeu-se a colheitas mensais de fezes ao longo de um ano, totalizando 20 amostras fecais por mês dos seguintes
animais: 10 Lusitanos, 7 Sorraias e 3 Przewalskii. Efectuaram-se exames coprológicos qualitativos (flutuação e
sedimentação) e quantitativos (câmara de McMaster), para a identificação e contagem de ovos de helmintes, e
coproculturas (Roberts O‟Sullivan), para identificação de larvas L3 e cálculo da prevalência e abundância
proporcional dos géneros/espécies.
Todos os indivíduos estudados encontravam-se parasitados por nemátodes da família Strongylidae, com picos
sazonais na Primavera e Outono. As oscilações mais marcadas foram detectadas nos cavalos de Przewalski,
atingindo valores iguais a zero no mês de Agosto. Nas coproculturas, as L3 pertenceram a dois grupos de larvas,
Strongylus vulgaris e Cyathostomum sensum latum, com prevalências de 100%, e abundâncias proporcionais de
20% e 80% do total de L3, respectivamente. Nas contagens de larvas por ml de coprocultura, obtivemos médias
relativamente constantes ao longo do ano exceptuando na população de Cavalos de Przewalski, onde a variação foi
bastante acentuada levando a considerar maior susceptibilidade ao factor àgua em relação às outras populações. Os
estrongilídeos intestinais constituíram o único grupo de parasitas que foi assinalado, com particular destaque para os
géneros Cyathostomum e Strongylus. Observaram-se diferenças relativamente à raça e à época do ano, sugerindo
mecanismos diferentes para fazer face ao parasitismo gastrointestinal.
* Trabalho financiado pelo CIISA/FMV/UTL.
[Parasitological Study of three Populations of Equids in the Horse Stud Farm of Alter do Chão]
As the search for equids as animals for both sport and companionship increases it becomes necessary to better know
the conditions inherent to their production. For this study we used animals raised in extensive regime in the Horse
Stud Farm of Alter do Chão, with the objective of characterizing their gastrointestinal parasitism according to an
array of factors such as race/species, the age of the animal, the consanguinity of the population, the availability of
grass and its seasonal development.
The study included 2 species, Equus ferus spp. przewalskii and E. caballus (races Sorraia e Lusitana). We then
proceeded to monthly collections throughout the year, adding up to 20 faecal samples a month distributed as
follows: 10 Lusitanos, 7 Sorraias e 3 Przewalskii. At the laboratory, coprological exams were performed, both
qualitative (flotation and sedimentation) and quantitative (McMaster slide), for egg identification and counts, and
fecal cultures (Roberts O‟Sullivan), to identify L3 larvae. Calculation of prevalence and proportional abundance of
genera/species was performed too.
All of the individuals present in this study were infected by nematodes of the Strongilidae family, with seasonal
peaks in Spring and Autumn. The more marked oscillations were detected in the Przewalski horse group, obtaining
near zero counts in August. In fecal cultures, the L3 larvae belonged to two groups, Strongylus vulgaris e
Cyathostomum sensum latum, with prevalences of 100% and proportional abundances of 20% and 80% of the total
identified L3, respectively.
In the count of L3 larval stages by ml, we obtained means relatively constant along the year except in the case of the
Przewalski horses, that showed a marked variation, indicating greater susceptibility to water as a limiting factor than
in the other populations.
Intestinal strongyles were the only group of parasites found, with particular interest to Cyathostomum and
Strongylus. Differences were observed pertaining to race/species and season, suggesting different mechanisms to
face gastrointestinal parasitism.
106
Parasitismo intestinal numa população de asininos de Raça Asinina de Miranda regularmente
desparasitada entre 2005 e 2011 – Efeito da desparasitação semestral estratégica vs. desparasitação
trimestral selectiva
Sousa, S.1,4, Mora, S.2, Nóvoa, M.2, Paz Silva, A.3, Madeira de Carvalho, L.M.4
1 Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal. Email: [email protected]
2 Associação para o Estudo e Protecção do Gado Asinino (AEPGA), Atenor, Miranda do Douro, Portugal
3 Facultad de Veterinária, Departamento de Patoloxia Animal, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, España
Introdução: A biodiversidade parasitária em burros diminui com o controlo anti-parasitário, no entanto, são
observados níveis de infecção parasitária (NIP) preocupantes em equídeos regularmente desparasitados 1.
Considerando uma população de asininos regularmente desparasitada desde 2005, este estudo teve como objectivos
observar a variação da taxa de positividade, o NIP e a biodiversidade de estrongilídeos parasitas gastrintestinais.
Materiais e Métodos: Asininos adultos dos centros da Associação para o Estudo e Protecção do Gado Asinino
(AEPGA), Concelho de Miranda do Douro, foram sujeitos a controlo parasitário semestral entre Julho 2005 e
Fevereiro 2010 e trimestral, dirigido a animais com NIP ≥ 500 ovos por grama de fezes (OPG), entre Fevereiro 2010
e Fevereiro 2011. O estudo da taxa de positividade, do NIP e da biodiversidade foi realizado segundo métodos
referidos por Madeira de Carvalho (2001).
Resultados: Entre Julho 2005 e Fevereiro 2010, observou-se diminuição da taxa de positividade (87% para 32%),
diminuição do NIP [Em 2005, 70,4% dos animais positivos apresentavam NIP Forte (>1000OPG), 18,5% NIP
Médio (>500-1000OPG) e 11,1% NIP Fraco (<500OPG). Em 2010, 25% NIP Médio e 75% Fraco] e diminuição da
biodiversidade parasitária (15 géneros diferentes observados em 2005 para apenas Cyathostomum sensu lato em
2010).
Entre Fevereiro 2010 e Fevereiro 2011 ocorreu um aumento da taxa de positividade (32% para 77%), aumento do
NIP (25% Médio e 75% Fraco para 25% Forte, 19% Médio e 56% Fraco) e aumento da biodiversidade
(Cyathostomum sensu lato em 2010 para 11 géneros em 2011).
Conclusões: O controlo parasitário semestral diminuiu o número de asininos parasitados assim como o NIP e a
biodiversidade parasitária. O controlo parasitário trimestral dirigido a animais com NIP ≥ 500 OPG, parece
aumentar os valores dos parâmetros estudados.
Referências: 1- Madeira de Carvalho, L.M. (2001) - Epidemiologia e controlo da estrongilidose em diferentes sistemas de produção equina em
Portugal. Tese de Dissertação de Doutoramento, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa. 445 + xxii pp.
[Intestinal parasitism in a population of Mirandês donkey dewormed on a regular basis between
2005 and 2011 - Effect of biannual strategic deworming vs. quarterly selective deworming]
Introduction: The biodiversity of parasites in donkeys decreases with the anti-parasitic control, however the level of
parasitic infection (LPI) observed in equids regularly dewormed, is worrying 1. Considering a population of donkeys
regularly dewormed since 2005, the aim of this study was to evaluate the variation of the positivity rate, the LIP and
the biodiversity of strongylids gastrointestinal parasites.
Materials and Methods: Between July 2005 and February 2010, adult donkeys, living in centers of the Associação
para o Estudo e Protecção do Gado Asinino (AEPGA), at the municipality of Miranda do Douro, were submitted to
a biannual anti-parasitic control. Between February 2010 and February 2011, the anti-parasitic control was carried
out, quarterly, only in those animals with a LPI≥ 500 eggs per gram of feces (EPG). The study of the positivity rate,
the LPI and the parasitic biodiversity was conducted following the methodology described by Madeira de Carvalho
(2001).
Results: Between July 2005 and February 2010, the positivity rate decreased (87% to 32%), the LPI decreased [In
2005, 70,4% of the positive animals presented a strong LPI (>1000EPG), 18.5% medium LPI (>500-1000EPG) and
11.1% weak LPI (<500EPG). In 2010, 25% medium LPI and 75% weak LPI] and the parasitic biodiversity
decreased (15 different genus observed in 2005 to just one genus, Cyathostomum sensu lato, observed in 2010).
In the second period of study, between February 2010 and February 2011, the positivity rate increased (32% to
77%), LPI increased (25% medium LPI and 75% weak LPI to 25% strong LPI, 19% medium LPI and 56% weak
LPI) and the parasitic biodiversity increased (Cyathostomum sensu lato in 2010 to 11 different genus in 2011).
Conclusions: Biannual anti-parasitic control decreased the positivity rate as well as the LPI and the parasitic
biodiversity. Quarterly anti-parasitic control focused on infected animals with a LPI ≥ 500 OPG seems to increase
the values of the studied parameters.
107
Resultados serológicos que demonstram a ocorrência de infecções pelo vírus do Nilo Ocidental
(WNV) em equinos e aves em Portugal (2004-2011)
Miguel Fevereiro
O vírus West Nile (WNV) foi originalmente identificado no distrito West Nile no Uganda, tendo sido isolado pela
primeira vez em 1937. No ciclo biológico deste flavivírus estão envolvidos mosquitos e aves que servem de
multiplicadores e reservatório de vírus. Os humanos e equinos são hospedeiros acidentais e finais. Os primeiros
surtos epidémicos de encefalite provocados pelo WNV em humanos e equinos registaram-se nos anos 50 e 60 do
século passado em Israel e França. Em consequência dos casos de doença e morte registados em humanos, aves e
equinos, particularmente nos deltas dos rios Danúbio e Volga e após emergência do vírus em 1999 nos EUA, o
WNV passou a ser considerado um problema de saúde pública e animal. Nos últimos anos (2004-2010) registaramse numerosos surtos da doença nos países da bacia mediterrânica. Em Portugal, o vírus foi isolado pela primeira vez
em 1971, em mosquitos, pelo Prof. Armindo Filipe. Para o rastreio desta virose, o LNIV utiliza testes ELISA e de
seroneutralização para detecção e confirmação de anticorpos WNV, respectivamente. A pesquisa de vírus é
efectuada com recurso ao isolamento do vírus em cultura de células e a técnicas moleculares de diagnóstico (RTPCR). Os rastreios serológicos realizados entre 2004 e 2011 em equinos e aves, revelaram a presença de anticorpos
para o WNV em ambas as espécies. Das 116 aves estudadas, 23 (19,8%) foram positivas, com títulos de anticorpos
neutralizantes relativamente baixos (20-40). Entre as espécies de aves seropositivas encontram-se águias, corujas,
cegonhas, flamingos, avestruzes, nandus e íbis. Em cavalos, das 1509 amostras testadas, 44 (2,9%) foram positivas a
anticorpos neutralizantes com títulos que variaram entre 16 e 2560. Todas as amostras analisadas foram colhidas de
animais aparentemente saudáveis, com excepção de duas provenientes de éguas pertencentes a uma exploração
situada na região de Setúbal. Estes dois animais apresentavam sintomas neurológicos e no exame serológico foram
detectados anticorpos IgM para o WNV, indicando uma infecção recente. Uma égua morreu e a outra recuperou,
registando-se nesta uma subida muito significativa do título de anticorpos neutralizantes. O WNV não foi detectado
por RT-PCR nas amostras de sangue de equinos (n=558) e aves (n=886) incluídas neste estudo. Contudo, os dados
serológicos obtidos demonstram a presença e circulação do WNV no nosso país.
[Serological results demonstrate the occurrence of infections by West Nile virus (WNV) in horses
and birds in Portugal (2004-2011)]
The West Nile virus (WNV) was originally identified in the West Nile district in Uganda, and was first isolated in
1937. Its natural transmission cycle involves mosquitoes and birds as reservoirs and amplifying hosts of the virus.
Humans and horses are accidental hosts. The first epidemic outbreaks of encephalitis caused by WNV in humans
and horses were reported in the 50s and 60s of last century in Israel and France. As a result of the numerous cases of
illness and death in humans, birds and horses, particularly in the deltas of the rivers Danube and Volga, and after
emergence of the virus in the U.S. in 1999, WNV is now considered a threat to public and animal health. In the
Mediterranean basin, several outbreaks of WNV infection have been reported in recent years (2004-2010). In
Portugal, the virus was first isolated in 1971 in mosquitoes, by Prof. Armindo Filipe. The surveillance of WNV in
animals is carried out by LNIV and is based upon ELISA and serum neutralization tests for detection and
confirmation of WNV antibodies, respectively. The virus surveillance is carried out using virus isolation in cell
culture and molecular diagnostic techniques (RT-PCR). The serological surveys conducted between 2004 and 2011
in horses and birds revealed the presence of antibodies to WNV in both species. Of the 116 birds studied, 23
(19.8%) had neutralizing antibodies with titers ranging between 20 and 40. Among the bird species tested positive
are eagles, owls, storks, flamingos, ostriches, rheas and ibises. In horses, 44 (2.9%) of 1509 serum samples were
positive for WNV neutralizing antibodies with titers that ranged from 16 to 2560. With the exception of two samples
from mares belonging to a farm situated in the Setúbal region, which had neurological symptoms, all other samples
were collected from apparently healthy animals. Both mares tested positive for IgM antibodies indicating a recent
contact with WNV. One of the horses died and was buried before a second blood sample or CNS tissue could be
taken, while the other horse recovered and seroconvert with a significant increase in neutralizing antibody titers.
WNV was not detected by RT-PCR in blood samples from horses (n = 558) and birds (n = 886) included in this
study. However, the serological data obtained demonstrate the presence and circulation of WNV in our country.
108
Desenvolvimento de ELISAs baseadas nas proteínas virais E e NS1 para detecção de anticorpos
contra o vírus do Nilo Ocidental em equinos
Barros, S.C., Ramos, F., Fagulha, T., Duarte, M., Henriques, M., Luís, T., Fevereiro, M.
O vírus do Nilo Ocidental (WNV) é um Flavivirus cuja transmissão acidental a humanos e equinos ocorre durante
períodos de intensa amplificação viral no ciclo enzoótico entre aves e mosquitos. Mosquitos do género Culex são os
principais vectores do WNV. Um estudo anterior demonstrou que WNV circula em Portugal pelo menos desde 2004
e no Verão de 2010 foram identificados e notificados à OIE dois casos de infecção em equinos. Desde então, o
aumento do número de amostras recebidas no laboratório tornou necessário o desenvolvimento de métodos de
diagnóstico serológicos simples e específicos em substituição dos kits comerciais de elevado preço e dos testes de
seroneutralização, muito laboriosos e demorados. O principal objectivo do presente trabalho é o desenvolvimento de
testes ELISA específicos para detecção de anticorpos WNV em equinos. Apresentamos os resultados preliminares
de dois testes ELISA indirectos que utilizam como antigénios proteínas recombinantes do envelope (rE) e da
proteína não estrutural 1 (rNS1) do vírus. O desempenho dos métodos foi comparado com uma ELISA comercial e
com o teste de seroneutralização (VNT) padrão.
Produção de proteínas recombinantes E e NS1: Os genes E e NS1 da estirpe WNV Eg101 foram clonados no vector
de expressão Champion pET100 (Invitrogen). A expressão das proteínas recombinantes rE e rNS1 com caudas de
histidinas foi confirmada por immunoblot, utilizando um anticorpo monoclonal anti-histidina e a um soro de equino
anti-WNV de referência.
Detecção de anticorpos contra as proteínas recombinantes rE e rNS1 do WNV: Para avaliar o desempenho dos testes
ELISA desenvolvidos foram utilizados 1.313 soros de equinos, previamente testados para anticorpos anti-WNV por
uma ELISA comercial (ID-VET, França) e pelo VNT. Os soros diluídos em tampão de bloqueio (PBS, 3% lisado E.
coli, 5% de leite) foram adicionados a placas ELISA revestidas com a proteína rE ou rNS1. O complexo antigénioanticorpo foi revelado nas etapas seguintes com um soro de anti-IgG de equino marcado com a peroxidase e adição
da solução substrato/ cromogénio. A sensibilidade e a especificidade dos testes ELISA-rE e ELISA-rNS1 foram
determinadas em relação ao teste de referência VNT.
Resultados: Os testes ELISA desenvolvidos com base nas proteínas recombinantes do WNV foram concordantes
com o teste VNT e revelaram elevados níveis de sensibilidade e especificidade, sugerindo que estes testes poderão
ser aplicados no rastreio serológico de infecção por WNV em cavalos.
[Detection of antibodies to West Nile virus in equine sera using recombinant envelope (rE) and
nonstructural 1 (rNS1) viral proteins]
Objectives: West Nile virus (WNV) is a vector-borne Flavivirus that is transmitted in an enzootic cycle between
birds and by mosquitoes; incidental transmission to humans and horses occurs during periods of intense viral
amplification. Mosquitoes of the genus Culex are the main vectors of WNV. A Previous study demonstrated that
WNV circulates in Portugal at least since 2004. In the last summer, 2 horse cases were identified and notified to
OIE. The increase in diagnostic activity leads to the need for simple and specific serological methods that could be
use in replacement of expensive commercial kits, and time-consuming and labour intensive virus neutralization test
(VNT). The main goal of the present study was to establish specific diagnostic tests for WNV antibodies detection.
We describe the preliminary results on the development of two indirect ELISAs that uses recombinant nonstructural
NS1 and envelope (E) proteins as antigens for the detection of WNV antibodies in horses. The performance of the
methods was compared with a commercial competitive ELISA and VNT.
Production of recombinant E and NS1 proteins for development of indirect ELISAs: To investigate the applicability
of viral recombinant proteins in ELISA tests, the E and NS1 genes of WNV strain Eg101 were cloned into vector
Champion pET100 (Invitrogen), creating a His-tagged recombinant proteins, confirmed in the Western blot analysis
by anti-His-tag monoclonal antibody as well as by WNV positive serum. The expressed proteins were used as
antigen for developing indirect ELISAs.
Indirect ELISA for detection of WNV E and NS1 antibodies in horse sera: A total of 1313 equine field sera,
previously tested for antibodies to WNV by a commercial competitive ELISA (ID-VET, France) and VNT were
used. ELISA plates were coated with purified E or NS1 recombinant proteins. Sera diluted in PBS-blocking buffer
(3% E. coli lisate and 5% of milk), were added to wells and incubated for 1 h at 37°C. After a washing step,
peroxidase-conjugated goat anti-horse antiserum diluted 1/5000 in PBS-blocking buffer was added and incubated as
above. The antigen –antibody complex was revealed with TMB-H2O2 solution. The sensitivity and specificity of the
E and NS1 ELISAs were evaluated using VNT as reference assay.
Results: In relation to VNT, preliminary results indicate that in-house ELISAs presented high concordance with high
levels of sensitivity and specificity, suggesting that in-house assays are valuable tools for use used in serological
surveillance of WNV infection in horses.
109
Herpesvirus dos Equinos: Isolamento de uma estirpe de EHV-1 não neuropatogénica
Fevereiro, M.1, Ramos, F.1, Fagulha, T.1, Usón, M.2, Barros, S.C.1, Henriques, A.M.1, Luís, T.1 e Duarte, M.1
2 Usón Olaso, Lda
Os Herpesvirus 1 e 4 dos equinos (EHV-1 e EHV-4) estão associados a várias patologias, incluindo rinopneumonia,
abortos e ocasionalmente mieloencefalopatias. Estes dois vírus são enzoóticos na população de equinos como o
demonstram as elevadas taxas de seropositividade. A imunidade resultante da infecção é de curta duração e os
animais convalescentes são susceptíveis a reinfecção após alguns meses. O diagnóstico diferencial de EHV-1 e
EHV-4 só é possível com o auxílio de testes laboratoriais. Embora a seroprevalência a herpesvírus seja elevada nos
equinos nacionais, tanto quanto sabemos, estes vírus nunca foram isolados no país. No presente trabalho descreve-se
o isolamento e identificação de um EHV-1 após o aborto de uma égua.
Isolamento do EHV-1: Inocularam-se culturas celulares RK13 e MDBK com uma suspensão de células
mononucleadas do sangue da égua e homogeneizados de pulmão, fígado e baço do feto abortado. As culturas foram
mantidas a 37 ºC e 5% CO2 até ao aparecimento do efeito citopático (CPE).
Detecção do EHV-1 por PCR: O DNA extraído do sangue da égua e dos homogeneizados de órgãos do feto foi
utilizado para a amplificação parcial por PCR das ORFs 16, 30 e 68 do EHV-1. As sequências nucleotídicas dos
fragmentos obtidos foram determinadas e comparadas com as sequências de herpesvirus dos equinos disponíveis no
GenBank.
Exames serológicos: Colheram-se três amostras de sangue da égua suspeita, a primeira após ter abortado e as
seguintes 15 e 35 dias mais tarde. Os soros foram testados para anticorpos EHV-1/4 com um kit ELISA comercial
(Ingenasa). A titulação de anticorpos neutralizantes foi efectuada pelo método standard (OIE) de seroneutralização,
utilizando-se diluições seriadas dos soros e 100 TCID50 de EHV-1. O título neutralizante dos soros foi calculado
pelo método de Spearman-Kaber.
Resultados: Os testes serológicos demonstraram uma clara seroconversão ao EHV-1, com os títulos de anticorpos
neutralizantes a subirem mais de 4 log2 entre a primeira colheita de sangue e as colheitas subsequentes. Nas culturas
de células o CPE ocorreu após cinco dias de incubação, observando-se células multinucleadas, refringentes e com
numerosos vacúolos. As amostras de DNA obtidas do sangue, macerado fetal e cultura de células com CPE, testadas
por PCR foram positivas a EHV-1 mas negativas a EHV-4. A especificidade dos fragmentos EHV-1 amplificados
por PCR foi confirmada por sequenciação. A presença de uma asparagina na posição 752 da polimerase de DNA,
sugere que o vírus isolado seja uma estirpe de EHV-1 não neuropatogénica.
[Equine herpesvirus: Isolation of a nonneuropathogenic strain of EHV-1]
Equine herpesviruses 1 and 4 (EHV-1 and EHV-4) are associated with various ailments, including rinopneumonia,
abortion and occasionally myeloencephalopatia. These two viruses are enzootic in the equine population as
evidenced by high rates of seropositivity. The immunity resulting from infection is of short duration and
convalescent animals are susceptible to reinfection after a few months. The differential diagnosis of EHV-1 and
EHV-4 is only possible with the help of laboratory tests. The seroprevalence is high in the national equine
population, but to our knowledge, these viruses have never been isolated in the country. In this paper we describe
the isolation and identification of an EHV-1 after a mare has aborted.
Isolation of EHV-1: RK13 and MDBK cell cultures were inoculated with a suspension of blood mononuclear cells
of the mare and homogenates of the lung, liver and spleen from the aborted fetus. Cultures were maintained at 37 °C
and 5% CO2, until the appearance of cytopathic effect (CPE).
Detection of EHV-1 by PCR: DNA extracted from the blood of the mare and organ homogenate of the fetus was
used for partial amplification by PCR of ORFs 16, 30 and 68 of EHV-1. The nucleotide sequences of the fragments
obtained were determined and compared with the equine herpesvirus sequences available in GenBank.
Serological tests: The suspected mare was bleed three times; one sample was collected on the day of abortion and
the two others 15 and 35 days later. The sera were tested for antibodies to EHV-1/4 with a commercial ELISA kit
(Ingenasa). The neutralizing antibody titer was determined by a standard neutralization test (OIE), using serial
dilutions of the sera and 100 TCID50 of EHV-1. The neutralizing titer was calculated by Spearman-Kaber method.
Results: The serological tests revealed a clear seroconversion to EHV-1 with neutralizing antibody titers rising more
than 4 log2 between the first blood sample and the followings samples. In cell cultures the CPE occurred after five
days of incubation with the appearance of polykaryocytosis, round and refringent cells, and extensive vacuolation.
DNA samples obtained from blood, fetal homogenates and cell cultures with CPE, tested PCR positive to EHV-1
and negative to EHV-4. The specificity of EHV-1 fragments amplified by PCR was confirmed by sequencing
analysis. The presence of an asparagine at position 752 of viral DNA polymerase suggests that the virus isolated is a
nonneuropathogenic strain of EHV-1.
110
Animais aquáticos
Panorama da Aquacultura portuguesa
Francisco Ruano1 e Fernando Afonso2
1 Instituto de Investigação das Pescas e do Mar (INRB IP / L-IPIMAR), Lisboa, Portugal
A aquacultura é o sector de produção de alimentos que mais rapidamente tem crescido a nível mundial e o nosso
país não foi alheio a esta transformação. Diversas Instituições desenvolveram projectos de investigação
determinantes na formação e na capacitação de novos técnicos e investigadores, na consolidação e difusão do saber
em áreas da reprodução, nutrição, sanidade e de alimento vivo.
O tecido empresarial na área da piscicultura é constituído por pequenas e médias empresas de carácter individual ou
familiar com uma reduzida dimensão fundiária, 10 a 12 ha de área útil, explorados em regime semi-intensivo. Têm
uma baixa componente tecnológica e empregam um reduzido número de trabalhadores com carácter permanente.
Existem também alguns grupos nacionais e estrangeiros de maior dimensão, com investimentos avultados em
unidades de produção intensiva e em maternidades. Recorrem a tecnologias avançadas no campo da captação,
vigilância e controle da qualidade da água dos circuitos hidráulicos, no campo da sanidade, e da nutrição.
É importante e desejável a diversificação de novas espécies para aquacultura. Em Portugal, de entre as espécies
aquáticas, existe um grande número já domesticadas e muitas outras com boas características para poderem vir a sêlo.
Na aquacultura em mar aberto, o planeamento de novas unidades passa pela necessidade de proceder, para cada
zona, à correcta caracterização das áreas, das espécies a utilizar, do regímen e métodos de exploração mais
adequados. O conhecimento das condições ambientais através da avaliação das capacidades de carga e de suporte do
ecossistema, do regímen de ventos, correntes, ondulação e natureza dos fundos, são determinantes para o sucesso
desta actividade.
O sector aquícola necessita de aumentar a sua eficácia produtiva, impondo-se o aproveitamento cabal da capacidade
já instalada. Por outro lado importa promover institucionalmente o produto aquícola, centrando essa acção na sua
excelência, segurança alimentar e preço. Para a salvaguarda e estabilidade do sector é determinante que seja
elaborado um Plano Sectorial que promova um ordenamento territorial das áreas com aptidão aquícola, sobretudo as
localizadas em zonas ecologicamente sensíveis, de forma a clarificar e balizar esta actividade, preservando o
ambiente e harmonizando-a com outros interesses como a pesca, a agricultura, a indústria salineira, e o turismo.
[Portuguese Aquaculture Overview]
Aquaculture is the most growing sector of food production in the world, and our country has been following this
change. Several Institutions developed research projects that were important on the education and competency of
new technicians and researchers, on the consolidation and diffusion of the knowledge in several areas like
reproduction, nutrition, sanity and live food.
In the fish farm field, the company sector is mainly composed of small and medium enterprises of individual and
familiar features with a small dimension, 10 to 12 ha of used area, raised in semi-intensive culture systems. They
have a low technologic component and hire a small number of permanent workers. There are also some national and
international groups with large dimension and investments in intensive production units and hatcheries. Advanced
technologies are used to pump, to survey and to control the water quality of the hydraulic circuits, in sanitary and
nutritional fields.
It is important and it is necessary the diversification of new species for aquaculture. In Portugal, among aquatic
species, there are a big group of domesticated ones and many others have good features to become also part of it.
In open sea aquaculture, the planning of new units needs the correct characterization of the different areas, of the
species used and of the systems and methods that are more convenient. The knowledge of the environmental
conditions through the evaluation of the carrying and holding capacities of the ecosystem, wind regime, currents,
waves and bottom nature, are essential for the success of this activity.
The aquaculture sector needs to improve their productive efficiency, taking full advantage of the capacity already
installed. On other hand, it is important to promote institutionally the products of aquatic production, highlighting
their excellent quality as fresh food and their price. To the safeguard and stability of this sector it is a priority to
elaborate a Sector Plan to promote the landscape management of the areas with aquatic productive conditions,
mainly those that are located in ecologic sensitive areas, to clarify and to manage this activity, preserving the
environment and harmonizing it with other important areas, as fishing, salt industry and tourism.
111
Lesões provocadas pela utilização de sulfato de cobre no controlo de ectoparasitas em peixes
marinhos
Vaz, C.1, Afonso, F.1, Soares, F.2, Barata, M.2, Pousão-Ferreira, P.2
2 INRB IP / IPIMAR, Estação Piloto de Piscicultura de Olhão, Portugal
O sargo (Diplodus sargus,Linnaeus 1758), é uma espécie Mediterrânica com alto valor comercial, o qual tem atraído
um elevado interesse por parte dos piscicultores desde a década de 1980, devido a ser considerado um potencial alvo
para a diversificação da aquacultura. O recente crescimento desta indústria, juntamente com a introdução de novas
espécies de peixes em sistemas de produção intensivos, levou a um aumento da ocorrência e diversidade de agentes
patogénicos. O sulfato de cobre tem sido amplamente utilizado para a prevenção e controlo de ectoparasitas,
contudo, pode tornar-se tóxico a altas concentrações, comprometendo a integridade fisiológica dos peixes. Ainda
que os efeitos toxicológicos do cobre em peixes estejam amplamente documentados, a variabilidade dos resultados
apresentados é grande. O principal objectivo deste estudo foi analisar os efeitos de tratamentos com diferentes
concentrações de cobre nas brânquias e no fígado de juvenis de sargo (Diplodus sargus). Neste ensaio foram
distribuídos aleatoriamente 180 indivíduos (48,07 ± 16,4 g e 12,8 ± 1,49 cm) por 9 tanques, e expostos a 0,2 mg L-1
(tratamento 1) e 1 mg L-1 (tratamento 2) de cobre, durante um período de 23 dias.
Os exames histopatológicos revelaram alterações ao nível da estrutura do tecido branquial e hepático, entre os
indivíduos expostos a diferentes tratamentos. Este estudo demonstrou alterações mínimas nos peixes submetidos a
0,2 mg/L de cobre. Nas brânquias foi possível observar edema e hiperplasia ligeira. No fígado observou-se um
aumento celular dos hepatócitos com degenerescência hidrópica. Os peixes expostos a uma concentração de 1 mg/L
de cobre demonstraram alterações intensas do tecido branquial, nomeadamente, hiperplasia, edema e necrose. No
fígado as alterações mais comuns foram a congestão, edema e a necrose celular. O grau de alterações morfológicas
observadas diferiu de acordo com o período de exposição e com o tratamento experimental. No entanto, também
foram detectadas alterações de intensidade variável entre indivíduos expostos ao mesmo tratamento. Estas serão,
possivelmente, devido a diferentes mecanismos de adaptação às diferentes concentrações.
Este trabalho pretende contribuir para um melhor conhecimento sobre a utilização do cobre no controlo de doenças
parasitárias, assim como o seu impacto ao nível do metabolismo dos peixes.
[Lesions caused by the use of copper sulphate to control ectoparasites in marine fish]
The white sea bream (Diplodus sargus, Linnaeus 1758) is a Mediterranean species with high commercial value, and
has been attracting great interest of fish farmers since the 1980s, once it is considered a good potential for
diversifying aquaculture production. The recent growth of this industry, along with the introduction of new
species of fish in intensive production systems, led to an increase of the occurrence of pathogenic agents. Copper
sulphate has been widely used for the prevention and control of parasites. However, it can become toxic at
high concentrations, compromising the physiologic integrity of the fish. Although the toxicological effects of copper
in fish are well documented, the variability of published results is great. The main objective of this study was to
analyze the effects of different concentrations of copper in the gills and the liver of juveniles (Diplodus sargus).
In the present study, white sea bream juveniles (n=180) of 48.07 ± 16.4 g and 12.8 ± 1.49 cm were randomly
distributed in nine tanks. Fish were kept in the tanks during acclimation for 7 days. The fish were exposed to 0.2 mg
L-1 (treatment 1) and 1 mg L-1 (treatment 2) of copper during a period of 23 days.
Histopathologic exam showed changes in the structure of gill and liver tissues, among individuals exposed to the
different treatments. This study showed minimal change in fish submitted to 0.2 mg/L. In the gills it was observed
edema and light hyperplasia. In the liver, the hepatocytes presented cell swelling with hydropic degeneration. Fish
submitted to a concentration of 1 mg/L showed in the gills extensive changes, namely, hyperplasia, edema and
necrosis. In the liver, congestion, cell swelling and necrosis were the most common visible changes. The degree of
morphologic changes observed was different according to the period of treatment and concentration used. However,
it was also observed different degrees of changes between individuals exposed to the same treatment. These are
possibly due to the mechanisms of adaption to different concentrations of copper.
This study will contribute to a better knowledge about the use of copper in the control of parasitic diseases as well as
its impact on the metabolism of fish.
112
Mortalidade massiva de polvos (Octopus vulgaris) na costa norte de Portugal
Ruano, F.
Laboratório de Patologia da U.I. de Aquicultura, Instituto de Investigação das Pescas e do Mar (INRB IP/L IPIMAR), Lisboa, Portugal. Email:
[email protected].
A 2 de Janeiro de 2010 foram arrojados nas praias de V.N. de Gaia, cerca de 1200 polvos, Octopus vulgaris., tendo
nos dois dias seguintes diminuído par apenas 50 polvos, pelo que se julgou tratar-se de um surto de mortalidade
brusca e massiva daquela espécie. Uma amostra de 20 indivíduos foi recolhida, refrigerada e enviada para o
IPIMAR. Para um estudo comparativo foram comprados exemplares sãos, da mesma espécie, em mercados locais e
em Lisboa. Os resultados negativos à presença de poluentes, as lesões macroscópicas no hábito externo, órgãos
internos e a história pregressa deste caso, apontavam para um factor ambiental como causa provável da morte. A
necrópsia revelou uma intensa turgidez e tumefacção generalizada, em contraste com a flacidez normal do período
«post-mortem» observada nos animais sãos. A histopatologia revelou quantidades excessivas de exsudado em todos
os órgãos, originando um forte desarranjo dos elementos estruturantes e celulares nos diversos tecidos. As lesões são
compatíveis com as de um edema de características hiper-agudas, consequência do colapso da função
osmoreguladora, que levou à morte dos animais.
A proximidade do estuário do Douro e as extremas condições meteorológicas verificadas foram consideradas
determinantes para a compreensão deste caso, tendo em conta as fortes alterações de salinidade na coluna de água
no interior do estuário e em toda a zona litoral envolvente. Devido à precipitação quatro vezes superiores à média
mensal, o caudal do rio passou de 173,1 milhões de m3 em Novembro, caudal biológico em período de estiagem,
para 924,2 em Janeiro. Estes factos e a configuração peculiar da barra terão provocado a retenção dos polvos numa
zona de alimentação no interior do estuário, vedando a sua fuga.
[The cause of a massive kills of Octopus (Octopus vulgaris) in north coast of Portugal]
At January 2nd 2011 more than one thousand octopus (Octopus vulgaris), were stranded to the seashore of Vila Nova
de Gaia, in the day after the number of animals slows down to 50 and stops. Apparently a sudden and sever
mortality hits that specie. A sample of 20 fresh octopuses was collected and sent refrigerated to IPIMAR. For
comparative study we also bought healthy octopus in local markets and in Lisbon. The negative results of a
pollutants, the anamnesis of mortalities, the gross lesions observed both on internal and external organs, indicated
that a key environmental factor for the deaths should be present.
Necropsy reveals swelling bodies with a turgid consistence in all specimens, in contrast with the normal flaccid
bodies shown by healthy animals on the «post-mortem» period. The histopathology reveals extensive exudates areas
in most organs with a disruption of both structural and cellular elements, corresponding to a lesional frame of a
hyper acute oedema, which causes the failure on the osmotic regulatory mechanisms and death.
The proximity of Douro River estuary and the extreme weather conditions, previously to that massive kills, indicate
that a severe and quick alteration occurred in the salinity of the water column in the estuary and in the littoral
adjacent areas. The rain fall, four times higher than in the same period of 2009, raised the river flow from 173.1
millions of m3/month in November to 924.2 millions in January 2010. Those facts and the peculiar morphology of
Douro estuary mouth, could be suddenly trapped the octopus in their ground feeding areas inside the estuary without
capacity to escape.
113
Aquacultura em mar aberto na costa Algarvia
Pedro Pousão-Ferreira
INRB IP / IPIMAR, Estação Piloto de Piscicultura de Olhão, Portugal. Email: [email protected]
A aquacultura em Mar Aberto começou nos últimos anos a despertar grande interesse em várias partes do mundo e
mais concretamente no Sul da Europa.
O grande desenvolvimento de jaulas e long-lines capazes de suportar condições adversas de mar, nomeadamente no
que se refere à resistência a forte ondulação e a correntes de velocidades significativas, veio permitir a instalação de
estruturas de produção em locais até agora inacessíveis a esta actividade.
Em Março de 2008 foi criada a Área Piloto de Produção Aquícola da Armona (APPA), uma zona de lotes, que vem
possibilitar a instalação de sistemas de produção de peixes em jaulas e de bivalves em cordas (long-lines) por parte
dos produtores.
Nesta comunicação apresentam-se alguns aspectos sobre os critérios de selecção e dimensionamento de jaulas e
embarcações, sobre os meios e equipamentos necessários e as estruturas de apoio necessárias em terra e a gestão da
produção. Apresenta-se também, a tipo de exemplo, um modelo de piscicultura para produção de dourada para
instalar em lotes da APPA.
[Offshore aquaculture at the Algarvian coast]
Recently offshore aquaculture started to catch the eye of investors in different parts of the Globe and Southern
Europe is not an exception.
The rapid progress in the development of submerged netcages and long-lines that are able to stand adverse offshore
conditions like strong waves and sea currents permitted the installation of production structures in places that were
inaccessible for this kind of activity until now.
In March 2008 the Portuguese government established an Área Piloto de Produção Aquícola da Armona (APPA), a
zone of sea plots to be leased to corporations for fish farming in netcages and molluscs in long-lines.
This talk will refer some aspects of the criteria used to select the kind of cages and support boats and their
dimensions, about the means, equipment and support structures needed in land and the growth production model for
gilthead sea-bream.
114
Influência da frequência alimentar e da luminosidade no comportamento alimentar de juvenis de
corvina, Argyrosomus regius
Ribeiro, L.1, Molenaar, P.1, Barata, M.1, Aragão, C.2, Serpa, D.1, Pousão-Ferreira, P.1
2 CCMAR-CIMAR, Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, Faro, Portugal
Devido às elevadas taxas de crescimento e atractivo valor de mercado, a corvina tem sido apontada como uma
espécie com potencial para revitalizar a aquacultura mediterrânica. No âmbito do projecto AQUACOR (programa
PROMAR) têm sido realizados ensaios de forma a optimizar o cultivo desta espécie. Uma alimentação correcta
pode contribuir para melhorar o crescimento por melhorar a eficiência de conversão do alimento e minimizar perdas
de ração para o meio, entre outros factores. Este trabalho pretendeu avaliar o crescimento e o comportamento de
juvenis de corvina, utilizando diferentes frequências alimentares a diferentes intensidades luminosas.
Juvenis de corvina com 1 ± 0,1 g foram colocados em 12 tanques (300 L) a uma densidade de 0,5 peixes.l-1.
Analisou-se a influência de 2 factores, frequência alimentar (Contínuo; Refeições) e intensidade luminosa (Baixa;
Normal) no crescimento e no comportamento de juvenis de corvina, obtendo-se 4 tratamentos: ContínuoBaixa,
RefeiçõesBaixa, ContínuoNormal e RefeiçõesNormal.
O ensaio decorreu por um período de 3 semanas, ao longo do qual se monitorizou o crescimento e o conteúdo de
proteína (N x 6,25). Observou-se o comportamento alimentar da corvina perante um alimento que permanece menos
(Contínuo) ou mais tempo (Refeição) em contacto com a água, comparando a quantidade de alimento ingerido
quando o alimento é ou não previamente demolhado em água salgada. Recolheram-se amostras de água após os
períodos de imersão a dieta em água para analisar os aminoácidos resultantes da lixiviação do alimento. O
comportamento da corvina na coluna de água face à intensidade luminosa foi ainda analisado.
No final do ensaio observou-se que o alimento distribuído em Refeições proporcionou maior crescimento ponderal,
enquanto corvinas mantidas a Baixa intensidade luminosa apresentaram melhores índice de condição. No entanto,
não se observaram diferenças significativas na taxa de crescimento específico (cerca de 7% G.dia-1), nem no
conteúdo proteico (65 a 67% peso seco) das corvinas dos diferentes tratamentos. O alimento mantido em água por
180 minutos apresentou uma perda 5 vezes maior em aminoácidos quanto comparado com o período de 5 minutos.
No entanto, este facto não afectou o comportamento alimentar das corvinas, as quais ingeriram idênticas
quantidades de alimento, independentemente do tempo imerso em água. A intensidade luminosa condicionou a
distribuição das corvinas na coluna de água, observando-se que a Baixa intensidade luminosa (< 200 lux) as
corvinas tendem a distribuir-se por toda água, ao contrário da Normal em que as corvinas se mantêm
preferencialmente no fundo dos tanques.
[The influence of feeding frequency and light intensity on the feeding behaviour of meagre
juveniles, Argyrosomus regius]
Meagre has been considered a species with potential for Mediterranean aquaculture due to the observed high growth
rates and attractive market value.
Several trials have been developed within AQUACOR project to optimize meagre production. An adequate feeding
plan might provide a better growth by increasing meagre food conversion efficiency and minimize food looses to
environment, among other factors. This trial aimed to assess the growth and behaviour of meagre juveniles, when
fed at different feeding frequencies under different light intensity.
Meagre juveniles with 1 ± 0.1 g were placed in 12 tanks (300 L) at 0.5 fish.l-1 density.
The effect of two factors was studied, feeding frequency (Continuous; Meals) and light intensity (Low; Normal) on
the growth and behavior of meagre juveniles, resulting in four treatments: ContinuousLow, Meals Low,
ContinuousNormal and MealsNormal.
Trial lasted for 3 weeks and during that period fish was sampled for growth evaluation and protein content
determination (N x 6.25). Meagre feeding behavior was assessed by comparing food ingestion rate of fish fed with
food maintained by short (Continuous) or longer (Meals) periods of time in water. Water samples were collected for
amino acids analysis, after maintaining diet immersed in water for different periods of time, to evaluate diet
leaching. Meagre behavior in the water column under the influence of light intensity was assessed.
At the end of the trial Two-Way ANOVA analysis indicated that Meals provided higher growth in weight, whereas
meagre maintained at Low light intensity exhibited better condition indices. However, no significant differences
were observed between treatments for specific growth rate (7%G.day-1), neither for protein content (65 to 67% dry
weight).
Amino acids leaching was 5 times higher for diet maintained immersed in water for 180 minutes than for 5 minutes.
Nonetheless, leaching did not affect meagre feeding behaviour since similar feeding rates were observed regardless
diet immersion period in water. Meagre behaviour was influenced by light intensity, since at Low light intensity (<
200 lux) meagre were distributed homogeneously in the water column, whereas at Normal fish where preferentially
located in the bottom of the tank.
115
Avanços no estudo e cultivo da corvina no IPIMAR
Pousão-Ferreira, P.1, Ribeiro, L.1, Soares, F.1, Castanho, S.1, Mendes, A.C.1, Barata, M.1, Ferreira, H.Q.1, Bandarra,
N.1, Coutinho, J.2, Gonçalves, A.2, Nunes, M.L.2, Mendes, R.2 Cunha, E.1
2 Unidade de Investigação de Valorização e Transformação de Produtos da Pesca e de Aquicultura, INRB IP/L-IPIMAR, Lisboa, Portugal
O interesse pelo cultivo da corvina (Argyrosomus regius) aumentou nos últimos anos face à necessidade de
diversificar a aquacultura mediterrânica. Com efeito entre 2008 e 2010 estima-se que a produção de corvina tenha
aumentado na Europa de 4000 para 10000 TON. A facilidade do cultivo larvar, as elevadas taxas de crescimento e
um valor comercial competitivo, são algumas das características que levam os produtores a apostar nesta espécie.
A produção sustentada de uma espécie implica deter um conhecimento integrado de vários aspectos da biologia, da
fisiologia, nutricionais, comportamento, entre outros, das diferentes fases do ciclo biológico (reprodução, larvas e
juvenis e engorda).
Ciente da importância deste conhecimento o INRB, IP/L-IPIMAR, tem desenvolvido ao longo dos últimos dois anos
trabalhos, no âmbito dos projectos AQUACOR e ECOAQUA, cujo objectivo é o de melhorar as condições de
cultivo da corvina. Assim, nesta comunicação pretende-se apresentar o trabalho desenvolvido no acondicionamento
de reprodutores a cativeiro e da indução hormonal da postura; na optimização de protocolos de cultivo de larvas e
juvenis, avaliando potenciais impactos na capacidade digestiva, nos requisitos nutricionais em lípidos, no
comportamento alimentar, malformações e microflora bacteriana; na avaliação do crescimento na fase da engorda
em diferentes sistemas de cultivo; e na avaliação das características organolépticas e bioquímicas da corvina.
[Advances on research and production of meagre at IPIMAR]
During last decade the interest on meagre production increased considering the importance to diversify
Mediterranean aquaculture. In fact, between 2008 and 2010 meagre production was expected to increase from 4000
to 10000 TON. Producers invested in this species due to meagre characteristics such as easily to reared with other
species protocols, high growth rates and promising market value.
However the sustainable production of a species is only viable when an integrated knowledge on several aspects of
biology, physiology, nutrition, behaviour, among others, is achieved for the different periods of the biological cycle
(reproduction, larval and juvenile period and ongrowing).
Aware of the importance of this knowledge INRB, IP / L-IPIMAR has developed over the past two year‟s studies
within projects AQUACOR and ECOAQUA, whose aim is to improve the cultivation of meagre.
Therefore, this communication aims to present the work developed at IPIMAR facilities regarding: adaptation of
meagre broodstock to captivity and hormonal induction of spawning; optimization of larval and juvenile rearing
protocols, assessing the impacts on the digestive capacity, on lipids nutritional requirements, on feeding behaviour,
on malformations and bacteria microflora; evaluate growth performance during ongrowing in different rearing
systems; and evaluation of organoleptic and biochemical characteristics of meagre.
116
Performance de crescimento e composição proximal de covina, Argyrosomus regius, alimentada
com diferentes alimentos
Ribeiro, L.1, Barata, M.1, Gonçalves, A.2, Coutinho, J.2, Bandarra, N.2, Pousão-Ferreira, P.1
2 Unidade de Investigação de Valorização e Transformação de Produtos da Pesca e de Aquicultura, INRB IP/L-IPIMAR, Lisboa, Portugal
A necessidade de diversificar a aquacultura mediterrânica levou à procura de novas espécies com potencial de
cultivo, tal como a corvina (Argyrosomus regius), devido à facilidade do cultivo larvar, elevadas taxas de
crescimento e um valor comercial competitivo. No âmbito do projecto AQUACOR têm sido desenvolvidos estudos
para optimizar o cultivo desta espécie. Por ser uma espécie nova a oferta de alimento dedicado no mercado é menor,
tendo os produtores de recorrer a alimento disponível para outras espécies, nomeadamente robalo e dourada. Com
este trabalho pretendemos avaliar o impacto na performance de crescimento e na composição proximal de corvinas
alimentadas com alimentos comerciais para outras espécies.
O ensaio decorreu por um período de 4 meses, onde um total de 3537 corvinas com um peso médio de 121 ± 47g,
foram cultivadas em 4 tanques de fibra de vidro com 18m3 localizados no exterior. Os parâmetros da água variaram
de acordo com as condições ambientais, em que a temperatura variou entre os 18.2 ± 0.9 e os 27.0 ± 1.0 ºC e o
oxigénio entre os 6.6 ± 0.8 e os 4.8 ± 0.5 mg.l -1. Foram testadas duas rações comerciais para dourada e robalo, com
as seguintes composições: Dieta A - 41% proteína + 15% lípidos; Dieta B - 40% proteína + 16% lípidos. O alimento
não ingerido foi recolhido e quantificado para avaliar a taxa de conversão alimentar. O crescimento foi avaliado
através de amostragens periódicas, enquanto a composição proximal das corvinas e o perfil de ácidos gordos foram
determinados no início e no final do ensaio.
O crescimento da corvina foi mais acentuado após os 22 ºC. Em ambos os tratamentos as corvinas apresentaram
uma grande dispersão de tamanhos, embora as corvinas alimentadas com o alimento A tenham apresentado um
crescimento médio superior. Os índices de conversão foram melhores nas corvinas alimentadas com o alimento A
(1.3), quando comparado com as corvinas alimentadas com o alimento B (1.6). Não se observaram diferenças
significativas na composição corporal das corvinas alimentadas com diferentes dietas. O perfil de ácidos gordos foi
semelhante para ambos os tratamentos, com excepção do ácido gordo 18:2n6 e da relação DHA/EPA, os quais
apresentaram maiores níveis nas corvinas alimentadas com a dieta B. O alimento específico para outras espécies,
dourada e robalo, permitiu um bom crescimento das corvinas. Apesar disso estão em curso abordagens clássicas
para determinar os requisitos nutricionais das corvinas de formas a melhorar a performance de crescimento.
[Growth performance and proximal composition of meagre, Argyrosomus regius, fed with different
diets]
Diversification of Mediterranean aquaculture is associated to new species production. Meagre (Argyrosomus
regius), has been pointed out as a potential candidate since it is easily reared, has high growth rates and has a
competitive market value. Several studies have been carried out under AQUACOR project to optimize the national
production of this species. Diets produced exclusively for meagre are still low, therefore producers has to rely on
diets formulated for other species, such sea bream and seabass. This study aimed to assess the impact on meagre
growth performance and proximal composition of meagre when feeding on diets for other fish species.
Trial lasted for 4 months, and a total of 3537 meagre with and average body weight of 121 ± 47g, were distributed
and produced in 4 fiber glass tanks of 18m3. Water parameters varied according to environmental conditions, with
water temperature ranging between 18.2 ± 0.9 and 27.0 ± 1.0 ºC, whereas oxygen ranged between 6.6 ± 0.8 and 4.8
± 0.5 mg.l-1. Two commercial diets for seabream and seabass were tested, with the following composition: Diet A 41% protein + 15% lipids; Diet B - 40% protein + 16% lipids. In order to quantify food conversion rate, non
ingested food was collect and quantified. Growth was monitored through periodical samplings, whereas proximal
composition and fatty acids content were determined in the beginning and end of the trial.
Meagre growth increased faster at temperatures above 22ºC. Meagre from both treatments exhibited significant
growth dispersion, but meagre fed diet A presented an average higher weight by the end of the trial. Better food
conversion values were obtained by meagre fed diet A (1.3), when compared to meagre fed diet B (1.6).
Meagre proximal composition was identical between treatments. Fatty acid profile was also similar between
treatments, except for 18:2n6 and DHA/EPA ratio that were higher on meagre fed diet B.
Commercial diets for other species, like sea bass and seabream, were able to support meagre growth. Nonetheless
classic nutritional studies are been carried out to determine meagre requirements in order to optimize growth
performance.
117
118
POSTERS
119
Poster 1
Revisão: Esgana e parvovirus em lobo Ibérico (Canis lupus signatus) em Portugal
Müller, A.1,2 e Santos, N.3
1 Departamento de Clínica Veterinária, ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
2 Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica (UMIB), Universidade do Porto, Portugal
3 Pygargus Lda, Rua de Goa, 108, 4830-589 Póvoa de Lanhoso, Portugal
Portugal alberga cerca de 60 alcateias de lobo. A maioria reside a norte do rio Douro e está conectada à maior
população Ibérica. A sul do rio Douro existem 6-9 alcateias, que se pensa estarem isoladas há décadas. Declínios
causados por doenças infecciosas em populações de carnívoros selvagens estão documentados. Pequenas populações
isoladas são consideradas especialmente vulneráveis. Aqui revemos os conhecimentos actuais sobre a esgana e
parvovirose em lobos de vida livre em Portugal. A infecção pelo vírus da esgana (CDV) aparenta ser epidémica em
lobos silvestres. Anticorpos neutralizantes contra CDV foram detectados em 3/27 lobos entre 1995 e 2002. Dois
destes foram obtidos da população a norte e um da população a sul do rio Douro. Dados recentes do Parque
Nacional da Peneda-Gerês (projecto Natura Xurés-Gerês, POCTEP) mostram 7/27 lobos seropositivos nesta
subpopulação. CDV de campo foi obtido de dois lobos mortos, um em 1998 a norte e o outro em 2008 a sul do rio
Douro. Foi caracterizado o gene da hemaglutinina viral (H) e comparada à sequência de um cão doméstico obtida
em 2007 perto de Famalicão. As três sequências agruparam no genogrupo “Europa”. Foi observada uma elevada
semelhança entre as sequências obtidas de lobo em 2002 e de cão, provavelmente devido à proximidade geográfica e
temporal. A emergência de CDV em hospedeiros não domésticos tem sido associada a substituições amino-acídicas
da região parcial do receptor SLAM. Tais substituições não foram encontradas, sugerindo que os vírus obtidos de
lobos poderão ter origem em cães. Evidência para a circulação de vírus semelhantes ao parvovirus canino (CPV)
obtida através de sorologia existe - por enquanto - somente para as alcateias a Norte do rio Douro. Anticorpos
inibidores da hemaglutinação contra CPV foram detectados em 9/20 lobos da população nortenha entre 1995 e 2002.
No estudo recente da subpopulação Peneda-Gerês, 5/29 foram seropositivos para CPV. Não foram encontrados
anticorpos nas 7 amostras de Sul do rio Douro. Esta população provavelmente tem baixa variabilidade genética, pelo
que se poderia especular que infecções por CPV resultem numa elevada taxa de fatalidade. Concluímos que ambos
os vírus circulam em lobos silvestres em Portugal. Estudos mais detalhados são necessários para compreender
melhor a epidemiologia das doenças infecciosas em lobos e outros carnívoros de vida livre.
[Review: Distemper and parvovirus in the Iberian wolf (Canis lupus signatus) in Portugal]
Portugal is inhabited by approximately 60 wolf packs. Most of these are located in the north of the river Douro, and
are connected to the larger Iberian population. South of the river Douro, there are 6-9 packs, which are thought to
have been isolated for decades. Infectious disease-driven declines of carnivore populations have been documented.
Small isolated populations are considered especially vulnerable. Here we review current knowledge on distemper
and parvovirus in free-ranging wolves in Portugal. Canine distemper virus (CDV) infection seems to be epidemic in
free-ranging wolves. Neutralising antibodies to CDV were detected in 3/27 wolves between 1995 and 2002. Two of
these were obtained from the northern and one from the southern wolf population. Recent data by the Parque
Nacional da Peneda-Gerês showed that 7/27 wolves were seropositive for CDV (project Natura Xurés-Gerês,
POCTEP) in this subpopulation. Wild-type CDV was obtained from two dead wolves in 1998 from the northern and
in 2008 from the southern population. The viral haemagglutinin (H) gene was characterized and compared to the
sequence from a domestic dog obtained in 2007. All three sequences clustered within the genogroup “Europe”. High
sequence similarity was observed between the wolf taken in 2002 and the dog, probably due to geographical and
temporal proximity. The emergence of CDV in non-dog hosts has been associated to amino acid substitutions of the
partial SLAM-receptor binding region. No such substitutions were found, suggesting that the wolf viruses could
have had domestic dog origin. Evidence for the circulation of canine parvovirus-like viruses (CPV) has been
gathered by serology in packs of the northern, but not yet in the southern wolf population. Haemagglutination
inhibiting antibodies to CPV were detected in 9/20 wolves of the Northern population between 1995 and 2002. In
the recent study on the Peneda-Gerês subpopulation 5/29 were seropositive for CPV. No CPV antibodies were
detected in the 7 samples from southern packs. The wolf population south of Douro River probably has low genetic
variability, so it may be speculated that CPV infection induces a high case-fatality rate. We conclude that both
viruses circulate in free-ranging wolves in Portugal. Further work is required to assess the epidemiology of
infectious diseases in free-ranging wolves and sympatric carnivores.
120
Poster 2
Rastreio Virológico de Carnivoros Silvestres em Portugal
Duarte, M.D.1, Henriques, A.M.1, Barros, S.C.1, Fagulha, T.1, Mendonça, P.1, Carvalho, P.1, Monteiro, M.1, Basto,
M.2, Rosalino, L.M.2, Barros, T.3, Fonseca, C.3 e Cunha, M.V.1
2 Centro de Biologia Ambiental, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, Ed. 11 12 C2, 1749-016 Lisboa, Portugal
3 CESAM & Departamento de Biologia, Universidade de Aveiro, Portugal.
Embora existam numerosos estudos que relatam infecções de várias espécies de carnívoros silvestres por
Parvovirus, Coronavirus e pelo vírus da Esgana dos cães, a informação disponível sobre a prevalência destas
infecções em Portugal é limitada. Em 2009, Santos et al. reportaram a presença de anticorpos específicos para
Parvovirus em raposa vermelha, fuinha e geneta. Contudo, os dados referentes à detecção directa destes agentes em
espécies silvestres distribuídas em Portugal são escassos, quer pelo número de espécies analisadas quer pelo tipo de
amostra utilizada (fezes).
Neste trabalho, avaliámos a exposição de carnívoros silvestres abundantes em Portugal Continental a Parvovirus,
Coronavirus e a Esgana, testando, para o efeito, amostras de órgãos. Foram analisados trinta e quatro animais
obtidos entre 2008 e 2010 das espécies raposa-vermelha (Vulpes vulpes, n=4), sacarrabos (Herpestes ichneumon,
n=28), fuinha (Martes foina, n=1), e texugo Euro-Asiático (Meles meles, n=1). Os animais foram recolhidos após
atropelamento ou abate durante acções legais de controlo de densidades de predadores (sacarrabos e raposavermelha) e congelados até à necrópsia. A vigilância incidiu sobre seis regiões geográficas do País, abrangendo oito
distritos. Não foram observadas lesões macroscópicas em qualquer dos animais sujeitos a necrópsia para colheita de
amostras de pulmão, gânglio mesentérico, baço e intestino. As amostras de tecidos foram processadas para extracção
de ácidos nucleícos num extractor automático (Biosprint 96 Workstation, Qiagen). A presença de Parvovirus foi
testada por PCR e de Coronavirus e Esgana por RT-PCR.
Detectou-se Parvovirus em três espécies dos carnívoros testados, especificamente sacarrabos (incidência de 50%),
raposa vermelha (100%) e fuínha (100%), correspondendo a 19 animais, e Coronavirus em apenas um sacarrabos.
Não se detectou Esgana em qualquer dos animais testados.
A análise da sequência completa do gene vp2 amplificado a partir de uma amostra positiva para Parvovirus de um
sacarrabos oriundo do Distrito de Castelo Branco revelou a presença de uma estirpe pertencente ao subgrupo
Parvovirus Felino.
A susceptibilidade da fuinha e da raposa vermelha a Parvovirus, anteriormente sugerida por evidências serológicas,
é confirmada neste estudo. Acresce que se reporta, pela primeira vez, a presença de Parvovirus e de Coronavirus em
sacarrabos. A elevada incidência de Parvovirus observada em regiões geográficas como Ribatejo, Beira Alta e Beira
Baixa deverá ser tomada em consideração se espécies animais susceptíveis a estes agentes forem intencionalmente
introduzidas no ambiente.
[Virological survey of wild carnivores in Portugal]
Although Parvovirus, Coronavirus and Canine Distemper Virus (CDV) are known to infect a wide variety of wild
carnivore species worldwide, little information is presently available in Portugal. In 2009, Santos et al. reported the
presence of antibodies against Parvovirus in red fox, stone marten and common genet, however reliable virological
data is still scarce or unavailable.
In the present work, we assessed the exposure of wild carnivores from mainland Portugal to Parvovirus, Coronavirus
and CDV using tissue samples obtained directly from animal specimens. Thirty-four wild carnivores sampled from
2008 to 2010 were examined, including red fox (Vulpes vulpes, n=4), Egyptian mongoose (Herpestes ichneumon,
n=28), stone marten (Martes foina, n=1), and Eurasian badger (Meles meles, n=1). The surveillance targeted six
geographical regions of the Country, encompassing eight districts. Animals were collected from road-kills or during
legal predator control management actions (mongoose and red fox) and were frozen until necropsy. No gross lesions
were found at necropsy. Lung, mesenteric lymph node, spleen and small intestine samples were collected and
processed for nucleic acid extraction in a Biosprint 96 Workstation from Qiagen. The presence of viral nucleic acid
was tested by PCR (Parvovirus) and reverse transcription PCR (Coronavirus and CDV).
Positive results for Parvovirus were obtained for three carnivore species, specifically mongoose (incidence of 50%),
red fox (100%) and stone marten (100%) corresponding to 19 animals. Only one mongoose tested positive for
Coronavirus. All animal specimens were negative for CDV.
Sequence analysis of the complete vp2 sequence of one positive sample from a mongoose hunted in Castelo Branco
district revealed that the strain belongs to the Feline Parvovirus subgroup.
The susceptibility of stone marten and red fox to Parvovirus, previously suggested by serological data, is confirmed
in this study. Furthermore, we report for the first time the presence of Parvovirus and Coronavirus in Egyptian
mongoose. In particular, the high incidence of Parvovirus registered in geographical regions such as Ribatejo, Beira
Alta and Beira Baixa should be taken into consideration if susceptible species are intentionally introduced in the
wild.
121
Poster 3
A sarna sarcóptica em canídeos selvagens e domésticos no Parque Nacional da Peneda-Gerês
Santos, N.1,4, Carvalho, H.2, Álvares, F.3, Rio-Maior, H.3, Nakamura, M.3, Carvalho, H.4
1 Pygargus Lda, Portugal
2 Cedivet Lda – Centro de Diagnóstico Veterinário, Portugal
3 CIBIO - Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Universidade do Porto, Portugal
4 Parque Nacional da Peneda-Gerês, Instituto de Conservação da Natureza e da Biodiversidade IP, Portugal
Introdução: A sarna sarcóptica é uma doença parasitária importante na dinâmica populacional de várias espécies
selvagens, incluindo canídeos. Em Portugal têm sido detectados casos em várias espécies de carnívoros selvagens,
mas desconhece-se se a doença ocorre de forma epizoótica ou enzoótica. Com este estudo retrospectivo pretende-se
descrever os padrões espaciais e temporais da sarna sarcóptica em carnívoros selvagens e domésticos no PNPG e
zonas limítrofes.
Métodos: Foi efectuado um rastreio sorológico para Sarcoptes scabiei em canídeos selvagens e domésticos no
PNPG e zonas limítrofes. As amostras de soro ou extracto de pulmão de canídeos selvagens foram colhidas de
forma oportunística, em animais encontrados mortos ou capturados para fins científicos entre 1997 e 2010, enquanto
as amostras de soro de cães foram recolhidas durante a campanha de vacinação antirábica em 2010. Foi efectuado
um teste de ELISA utilizando antigénios de Sarcoptes scabiei var. canis e conjugado de IgG anti-cão com
peroxidase. Nos canídeos selvagens com alopécia foi efectuada a detecção de Sarcoptes scabiei por digestão de
8cm2 de pele, centrifugação e observação do depósito ao microscópio.
Resultados: Foi detectada uma taxa de seroprevalência de 66,7% em lobo (n=24), 57,1% em raposa (n=14) e 75,0%
em cão (n=24). A seroprevalência apresentou uma tendência crescente ao longo do tempo, sobretudo na metade
oeste da zona de estudo, onde parece ter ocorrido uma epizootia em 2008-09. Foram detectados 6 lobos e 4 raposas
infectados por Sarcoptes scabiei, sendo que em 2 raposas esta foi a causa de morte.
[Sarcoptic mange in wild and domestic canids in Peneda- Gerês National Park]
Introduction: Sarcoptic mange is a parasitic disease of major importance in the population dynamics of several
wildlife species. In Portugal cases have been detected in several wildlife species, including canids, but the epizootic
or enzootic pattern of disease occurrence is not known. The aim of this retrospective study is to describe the spatial
and temporal patterns of sarcoptic mange in wild and domestic carnivores in the PNPG and surrounding areas.
Methods: A serological survey for Sarcoptes scabiei in wild and domestic carnivores was carried out in PNPG and
surrounding areas. Serum or lung extract samples were obtained opportunistically from wolves or foxes found dead
or captured for scientific purposes from 1997-2010, while dog sera were obtained by venipuncture from animals
presented to the annual rabies vaccination campaign. An ELISA test using Sarcoptes scabiei var. canis antigens and
anti-dog IgG-peroxidase conjugate. In wild canids showing alopecia, Sarcoptes scabiei was detected by digestion of
8cm2 of skin, centrifugation and microsocppic observation of the pellet.
Results: Seroprevalence rates were 66.7% in wolf (n=24), 57.1% in fox (n=14) and 75.0% in dog (n=24).
Seroprevalence showed an increasing tendency over time, strongest on the western part of the study area, where a
localized epizootic seems to have occurred in 2008-09. 6 wolves and 4 foxes were diagnosed with Sarcoptes scabiei
mange, in 2 foxes as cause of death.
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Poster 4
Detecção molecular de hemoparasitas em carnívoros silvestres no Norte de Portugal
Rosa, G.M.1,2, Duarte, A.3, Cartaxeiro, C.3, Pereira da Fonseca, I.3, Santos, N.4, Tavares, L.3
1 Departamento de Biologia Animal, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Portugal
2 Department of Anthropology, Durrell Institute of Conservation and Ecology, University of Kent, Canterbury, Kent, UK
4 Instituto da Conservação da Natureza e da Biodiversidade IP, Portugal
Os dados disponíveis sobre a frequência de hemoparasitas em carnívoros silvestres são escassos em Portugal.
Considerando o impacto que estes agentes têm na saúde animal, por induzirem anemia e imunosupressão, e o papel
potencial destes animais como reservatórios silvestres para animais domésticos e homem, efectuámos um rastreio
molecular para detecção de Leishmania spp, Ehrlichia spp, Anaplasma spp e Rickettsia spp em diferentes tecidos de
lobos e raposas, disponíveis através do Banco de Tecidos do ICNB.
A detecção de ácido nucleico dos hemoparasitas foi efectuada por PCR convencional a partir do DNA genómico
extraido de baço, figado, linfonodo, pele e osso recolhidos de lobos (n=44) e raposas (n=3) no Norte de Portugal
entre 2005 e 2011. As colheitas foram realizadas ao longo do ano em animais mortos, embora maioritariamente
durante os meses de Outono e Inverno e o seu estado de conservação foi avaliado como bom em 24 amostras de
lobo e 1 de raposa, regular em 8 amostras de lobo e mau em 12 amostras de lobo. Em duas das amostras colhidas em
raposa não havia informação quanto ao estado de conservação.
Em duas amostras de lobo, uma de pele e outra de baço, foi detectado ácido nucleico de Leishmania spp. (2/44), e
num lobo (1/44) e numa raposa (1/3), as amostras de figado foram positivas para Ehrlichia spp/Anaplasma spp..
Todas as amostras foram negativas para Rickettsia spp.
A detecção de DNA de Leishmania spp, em pele e em baço de lobo, confirma a infecção por este agente nestes
animais no Norte de Portugal. A infecção cutânea é especialmente importante devido à maior facilidade de
transmissão do parasita a outros carnívoros domésticos e silvestres, e ao homem. Considerando que Ehrlichia,
Anaplasma e Rickettsia são agentes transmitidos por ixodideos e as colheitas destes materiais biológicos incidiram
maioritariamente nos meses mais frios, é possivel que os dados obtidos estejam subestimados, justificando um
estudo mais alargado destas infecções.
[Molecular detection of hemoparasites in free-ranging carnivores in northern Portugal]
Available data on prevalence of haemoparasites in free-ranging carnivores are scarce in Portugal. Considering the
impact of these pathogens on animal health, inducing anemia and immunosuppression, and the potential role of freeranging animals acting as reservoirs for domestic animals and even Man, we have made a molecular screening for
the detection of Leishmania spp., Ehrlichia spp., Anaplasma spp. and Rickettsia spp., in different tissues of wolves
and foxes, made available through the ICNB tissue bank.
Detection of haemoparasites’ nucleic acid was performed using conventional PCR from genomic DNA extracted
from spleen, liver, lymph node, skin and bone collected from wolves (n = 44) and foxes (n = 3) in northern Portugal
between 2005 and 2011. Tissue samples were collected over the year from dead animals, with a higher incidence in
autumn and winter months. Sample conservation status was assessed as good in 24 samples of wolf and fox, fair in
8 samples of wolf, and poor in 12 samples of wolf. No information was available on the conservation status for two
samples of fox.
Leishmania spp. nucleic acid was detected in two samples of wolf (skin and spleen) (2/44), and Ehrlichia
spp./Anaplasma spp. were positive in liver samples of another wolf (1/44) and a fox (1/3). All samples were
negative for Rickettsia spp.
Detection of Leishmania spp. DNA in wolf skin and spleen, confirms the infection in these animals by this pathogen
in northern Portugal. Skin infection is particularly important due to the ease of transmission of the parasite to other
domestic and free-ranging carnivores, and to man. Bearing in mind that Ehrlichia Anaplasma, and Rickettsia are
transmitted by ixodid ticks and sampling of these biological materials was mainly carried out in the colder months, it
is possible that the data are underestimated, justifying a larger study of these infections.
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Poster 5
Tuberculose em animais de companhia e de zoo: abordagem para uma só saúde
Botelho, A.1, Canto, A.1, Albuquerque, T.1, Cunha, M.V.1 e Leal, N.2
1 Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
2 Hospital Veterinário do Oeste, Portugal.
Um cão Yorkshire de 18 meses de idade e com sintomas de perca de peso, tosse ocasional, letargia e diarreia no
último mês e hipertermia (40 ºC) foi observado no Hospital Veterinário do Oeste. O animal foi tratado com
metronidazol e cefixime sem registo de melhoria. A observação clínica detectou dois nódulos cutâneos na escápula e
membro posterior esquerdo, de que se retirou exsudado para análise bacteriológica e sangue para análise bioquímica
e PCR. A análise de sangue revelou anemia, neutrofilia, hipoalbuminemia, valores elevados da actividade de gamaglutamiltransferase e de fosfatase alcalina serica. Radiografia torácica e abdominal e ecografia abdominal revelou
hepatomegalia, aumento ligeiro dos linfonodos mediastinicos cranianos e mesentéricos e efusão abdominal. Suspeita
de tuberculose ocorreu após observação citológica dos linfonodos com presença de inflamação piogranulomatosa e
abundantes bacilos de coloração negativa no citoplasma dos macrófagos.
A análise por PCR directamente do sangue, para detecção de Mycobacterium spp, foi positiva e isolou-se
Mycobacterium tuberculosis do exsudado cuja identificação foi confirmada por PCR in-house usando como alvo o
gene gyr B. Foi executada eutanásia dois meses após o aparecimento dos primeiros sintomas. Dado que os donos
não apresentavam sinais de tuberculose e o cão era de interior, sem contacto com outros animais, a infecção pode
provavelmente ter ocorrido nos primeiros meses após o nascimento enquanto o animal ainda estava com o criador.
Contudo não foi possível confirmar esta hipótese.
Em 2006, reportámos um caso de tuberculose pulmonar em dois mandris do jardim Zoológico de Lisboa também
causada por Mycobacterium tuberculosis (1). Também neste caso a fonte de contaminação e vias de infecção não
foram identificadas, mas estas situações representam um alerta para o risco de contaminação da tuberculose dos
animais para o homem e vice-versa. A spoligotipagem dos isolados de M. tuberculosis dos mandris e do cão revelou
que pertencem a duas famílias distintas: U ou H3 e Beijing, respectivamente, que apresentam predominância
diferente no Mundo
Casos de animais de companhia e do zoo com tuberculose são raramente referidos em Portugal e o verdadeiro
impacto destas situações na saúde pública é ainda desconhecido. O conceito de uma só saúde requer novas
abordagens e a integração de dados da parte humana e animal. Este estudo mostra o poder deste sinergismo usando a
análise de 24 loci MIRU e de bases de dados de genotipagem em benefício da saúde pública
(1) Amado, A., Albuquerque, T., Gonçalves, A., Duarte, E., Botelho, A., Fernandes, T., Bernardino, R., Lapão, N. 2006. Tuberculosis in
mandrills at the Lisbon zoo. Vet Rec, Nov 6: 643
[Tuberculosis in pets and zoo animals: a One Health approach]
A 18 months old Yorkshire male dog with symptoms of weight loss, occasional cough, prostration and diarrheic for
one month and hyperthermia (40 ºC) was observed at the Oeste Veterinary Hospital. The dog was treated with
metronidazole and cefixime without improvement. Clinical inspection detected two cutaneous nodules in the right
hindlimb and in the right scapula, from which exudates were collected, for bacteriological analysis, along with blood
samples. Blood chemistry tests revealed anemia, neutrophilia, hypoalbuminemia, high gamma-glutamyltransferase
and high activity of serum alkaline phosphatase. Thoracic and abdominal radiographs and abdominal ultrasound
showed hepatomegaly, slight enlargement of cranial mediastinal and mesenteric lymph nodes and abdominal
effusion. Suspicion of tuberculosis occurred after observation of lymph node citology, and presence of
pyogranulomatous inflammation with abundant negative-staining rods in the macrophages cytoplasm. Direct blood
PCR analysis, detected Mycobacterium spp. while Mycobacterium tuberculosis was isolated from the exudates, and
identification confirmed by an in-house PCR system targeting gyr B gene. Euthanasia was performed two months
after the first symptoms. Since the owners had no signs of tuberculosis and the pet was kept mostly in house, with
no contact with other animals, the infection could possibly have occurred in the first few months after birth while the
animal was still with the breeder. However, this hypothesis could not be confirmed.
In 2006, we reported a case of pulmonary tuberculosis in two mandrills at the Lisbon zoo also caused by M.
tuberculosis (1). Also in this case the source of infection was not detected but it represented an alert for the risk of
contagious tuberculosis from animals to humans and vice-versa. Spoligotyping of mandrills and dog isolates
revealed that the M. tuberculosis strains belong to two distinct families: U or H3 and Beijing, respectively that have
different predominance around the world.
Cases of pets and zoo tuberculosis are scarcely reported in Portugal so the true impact of these situations in public
health is yet unknown. However, the interface human/animal occurs permanently in different scenarios and the
implementation of one health concept requires new approaches and integrated data from human and animal
counterparts. This study shows the power of this synergism using high throughput 24 VNTR loci analysis and
genotyping database for the benefit of public health.
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Poster 6
Estrutura genética da população de isolados de Mycobacterium bovis: reavaliação da filogenia dos
genótipos prevalentes em Portugal
Cunha, M.V.1, Albuquerque, T.1, Canto, A.1, Vieira-Pinto, M.2, Botelho, A.1
2 Laboratório de Inspecção Sanitária - Dept. Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
A tuberculose bovina (TB), causada por Mycobacterium bovis e, mais raramente, por Mycobacterium caprae, é uma
importante doença zoonótica que afecta espécies domésticas e selvagens, e que representa um importante problema
de Saúde Pública.
Estudos epidemiológicos realizados em vários países sugerem que as políticas de teste e abate tendem a reduzir a
diversidade molecular das estirpes de Mycobacterium bovis, favorecendo a expansão clonal em resultado de um
estrangulamento da população bovina. Os resultados da primeira análise epidemiológica realizada em Portugal,
relativa ao período de 2002 a 2007, constituiu uma excepção notável a estas observações, uma vez que se detectou
uma elevada diversidade de genótipos de M. bovis com base em spoligotyping, possivelmente devido à baixa taxa de
prevalência observada no país e à ausência de grandes epidemias favorecendo a transmissão em cadeia da(s) mesma
estirpe(s). A tipagem molecular de isolados de animais selvagens afectados por tuberculose [javali (Sus scrofa) e
veados (Cervus elaphus)] salientou ainda mais a aparente diversidade genotípica de M. bovis e confirmou o
envolvimento destas espécies silvestres no ciclo epidemiológico da tuberculose em bovinos.
Neste trabalho, reavaliou-se a estrutura genética da população de isolados de M. bovis do território continental
obtidos até 2010, comparando a região Direct repeat (spoligotyping) de 439 isolados de espécies domésticas e 185
isolados de hospedeiros silvestres. Identificaram-se quarenta e nove spoligotipos, sendo dois deles (SB0121 e
SB0119) marcadamente predominantes na população estudada e de distribuição geográfica generalizada. Quase
setenta por cento dos padrões obtidos apresentavam a eliminação do espaçador 21. O estudo molecular aprofundado
dos mesmos isolados baseado na análise da região mycobacterial interspersed repetitive-unit–variable-number
tandem-repeats (MIRU-VNTR), da região de diferença RDEu1 e da presença de polimorfismos em nucleótidos
únicos (SNPs), sugere fortemente que a maioria dos spoligotipos isolados em Portugal representam, de facto, um
grupo de estirpes intimamente relacionados, do ponto de vista filogenetico. Os nossos resultados apontam para a
presença de um clone dominante, exibindo especificidades biogeográficas, possivelmente em resposta a barreiras
para a expansão ou adaptação a novos nichos ecológicos e a novas espécies hospedeiras.
[The genetic landscape of Mycobacterium bovis strains from Portugal: a new twist for an old story]
Zoonotic animal tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium bovis and, more rarely, by Mycobacterium caprae, is
an important disease of livestock, also known to affect more than 40 free-ranging wild species, and representing an
important public health issue.
Epidemiological surveys carried out in several countries suggest that test-and-slaughter policies may reduce
Mycobacterium bovis strain diversity, favoring clonal expansion as a result of a bovine population bottleneck. A
remarkable exception to this observation was the first epidemiological analysis carried out in Portugal, concerning
the period 2002 to 2007, which highlighted the apparent high genotype diversity of Mycobacterium bovis based on
spoligotyping, possibly due to the low prevalence rates observed in the country and the absence of major epidemics
favoring ongoing transmission of the same strain(s). Molecular typing of isolates from tuberculosis infection
affecting local free-ranging wild animals [wild boar (Sus scrofa) and red deer (Cervus elaphus)] further emphasized
M. bovis genotype diversity and implicated wild species in the epidemiological cycle of TB in cattle.
In this work, we re-examine the genetic landscape of M. bovis isolates from the mainland territory obtained up to
2010 by comparing the direct repeat region (spoligotyping) of 439 isolates from domestic species and 185 isolates
from wild hosts. Forty-nine spoligotypes have been identified, two of them (SB0121 and SB0119) being markedly
prevalent and geographically widespread. Almost seventy percent of the patterns obtained were marked by the
deletion of spacer 21. Complementary molecular profiling, based on the analysis of mycobacterial interspersed
repetitive-unit–variable-number tandem-repeats (MIRU-VNTR), the chromosomal region RDEu1 and single
nucleotide polymorphisms, provides cumulative evidence that most of the spoligotypes obtained in Portugal
represent, in fact, a group of very closely related strains. Our results support the presence of a dominant and locally
evolved clone, exhibiting biogeographical specificities, possibly in response to barriers for expansion or adaptation
to new ecological niches and new host species.
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Poster 7
Diversidade parasitária em roedores do Jardim Zoológico de Lisboa. Dados preliminares
Crespo, A.P.M.1, Vaz, Y.1, Lapão, N.2, Madeira de Carvalho, L.M.1
2 Jardim Zoológico de Lisboa, Estrada de Benfica, 158-160, 1549-004 Lisboa, Portugal
Integrado num estudo sobre controlo de pragas no Jardim Zoológico de Lisboa, efectuou-se um levantamento
parasitológico em roedores capturados por armadilhas mecânicas, com o objectivo de identificar os parasitas
presentes e a sua transmissibilidade aos outros animais e ao Homem.
Assim, entre Abril e Junho de 2011, realizaram-se necrópsias parasitárias a 35 roedores: 11 Rattus norvegicus e 24
Mus musculus. Fizeram-se esfregaços por aposição do fígado (coloração pelo Giemsa) e esfregaços de fezes por
extensão (coloração pelo Ziehl-Neelsen), para pesquisa, respectivamente, de ovos de Calodium hepaticum e oocistos
de Cryptosporidium sp. Sempre que possível, os conteúdos gastrintestinais foram sujeitos a decantações sucessivas
para recolha de espécimes adultos. Efectuaram-se também análises coprológicas pelas técnicas de Willis e de
sedimentação espontânea. Os espécimes adultos foram fixados em álcool a 70%, esclarecidos pelo Lactofenol de
Amman e a sua identificação foi realizada com base em microscopia óptica.
Dos 35 roedores observados, com as técnicas referidas, 24 (77,14%) apresentaram formas imaturas ou maturas de
parasitas, com as seguintes prevalências: R. norvegicus (100,00%) e M. musculus (66,67%).
Por necrópsia, escarificação e esfregaços a fresco identificaram-se espécimes adultos de Heterakis spumosa,
Nippostrongylus brasiliensis, Syphacia obvelata e Calodium hepaticum. Observou-se ainda Cysticercus fasciolaris,
forma larvar de Taenia taeniformis. Através de coprologia por método de flutuação e esfregaços fecais corados pelo
Ziehl-Neelsen, observaram-se ovos de Hymenolepis diminuta, Heterakis sp., Syphacia sp., Trichuris sp. e oocistos
de Eimeria sp. e Cryptosporidium sp.
Das espécies identificadas Calodium hepaticum e Cryptosporidium sp. podem ser transmissíveis directamente a
primatas, incluindo o Homem e Cysticercus fasciolaris e Hymenolepis diminuta indirectamente aos mesmos
hospedeiros.
Estes primeiros dados salientam a importância e o interesse deste estudo, no sentido de se conhecerem as interrelações que estes parasitas estabelecem com o meio ambiente, com os animais residentes no Zoo de Lisboa, e com
o próprio Homem, assim como a necessidade do controlo dos roedores em zoos e parque naturais, visto assumirem o
papel de reservatórios de parasitas potencialmente transmissíveis aos outros animais e ao Homem
[Parasitic diversity in rodents of the Zoological Garden of Lisbon. Preliminary data]
Integrated in a pest control study in the Zoological Garden of Lisbon, a parasitic survey in rodents captured by
mechanical traps was carried out, with the goal to identify parasites and its transmissibility to other animals and
Man. Between April and June of 2011, parasitic necropsies were performed on 35 rodents: 11 Rattus norvegicus and
24 Mus musculus.
Smears by liver apposition (Giemsa staining) and extension faeces (Ziehl-Neelsen staining) were done to identify
respectively Calodium hepaticum eggs and Cryptosporidium sp. oocysts. Whenever possible, the gastrointestinal
contents were subjected to successive decanting process to collect adult specimens. Coprological exams were also
done by Willis and spontaneous sedimentation techniques. The adult specimens were fixed in 70% alcohol, clarified
by lactophenol of Amman and its identification was based on light microscopy.
From the 35 rodents observed, 24 (77.14%) had immature or mature parasites, with the following prevalence: R.
norvegicus (100.00%) and M. musculus (66.67%).
After necropsy, adult specimens of Heterakis spumosa, Nippostrongylus brasiliensis and Syphacia obvelata were
isolated and identified and Calodium hepaticum through liver scraping. Using flotation coprological methods and
faecal smears stained with Ziehl-Neelsen method, eggs of Hymenolepis diminuta, Heterakis sp., Syphacia sp.,
Trichuris sp. and oocysts of Eimeria sp. and Cryptosporidium sp. were observed. Cysticercus fasciolaris, larval
form of Taenia taeniformis, was also evidenced.
Among the species identified, Calodium hepaticum and Cryptosporidium sp. may be transmitted directly to
primates, including humans and Cysticercus fasciolaris and Hymenolepis diminuta indirectly to the same hosts.
These preliminary findings highlight the importance and interest of this study, in order to know the relationships that
these parasites establish with the environment, with animals living in the Lisbon Zoo, and Man himself, as well as
the need for control of rodents in zoos and natural parks, considering its role as reservoirs of parasites potentially
transmissible to other animals and humans.
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Poster 8
Epidemiologia e potencial zoonótico de estirpes de Escherichia coli produtoras de β-lactamase
CTX-M-15 em Portugal
Caniça, M.1, Clemente, L.2, Jones-Dias, D.1, Manageiro, V.1, Themudo, P.2, Albuquerque, T.2, Francisco, A.P.1,
Louro, D.2, Ferreira, E.1
1INSA-Instituto de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Unidade de Referência de Resistência aos Antibióticos, Lisboa
2 Unidade de Sanidade Animal, Laboratório de Bacteriologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa,
Portugal
Introdução: A recente disseminação plasmídica de genes codificadores de β-lactamases de espectro estendido CTXM, constitui uma séria ameaça à eficácia clínica das cefalosporinas de 3ªgeração. Este estudo propõe identificar a
epidemiologia dos genes plasmídicos CTX-M, entre uma estirpe de Escherichia coli isolada de um golfinho e várias
estirpes de E. coli de origem humana e, explicar o mecanismo e os principais reservatórios que contribuem para a
propagação das enzimas CTX-M entre estirpes de origem humana e animal.
Materiais e Métodos: Sessenta e duas estirpes clínicas de E. coli produtoras de β-lactamases de espectro alargado
isoladas de diferentes amostras em sete hospitais (2004-2009) de quatro diferentes regiões geográficas do país,
foram testadas para a presença de genes plasmídicos codificadores de enzimas do grupo CTX-M. Uma estirpe de E.
coli isolada de um exsudado respiratório de golfinho em 2009, no Laboratório Nacional de Investigação Veterinária
(LNIV) e caracterizada como produtora de enzima CTX-M foi igualmente incluída neste estudo. A susceptibilidade
antimicrobiana foi efectuada através da técnica de microdiluição. As técnicas de PCR e sequenciação foram
utilizadas para detecção e identificação dos genes bla. Os perfis genotípicos das várias estirpes foram analisados por
electroforese em campo pulsado (Pulse field gel electrophoresis-PFGE), utilizando a enzima XbaI. A técnica de
multilocus sequence typing (MLST) foi igualmente utilizada para verificação da similaridade clonal entre as estirpes
clínicas humanas e a estirpe isolada do golfinho.
Resultados: Quarenta e oito estirpes clínicas (77%) foram identificadas como produtoras de β-lactamase CTX-M. O
ensaio fenotípico de susceptibilidade com todos os compostos β-lactâmicos, confirmou que as estirpes eram
produtoras de β-lactamases de espectro alargado e sugerindo serem produtoras de enzimas CTX-M. Foram
detectados os genes blaCTX-M-15 (n=34), blaCTX-M-1 (n=4), blaCTX-M-3 (n=3), blaCTX-M-32 (n=3), blaCTX-M-14 (n=4),
blaTEM-1 (n=39) e blaSHV-12 (n=8); na estirpe isolada do golfinho foi identificado o gene blaCTX-M-15, que codifica a
enzima CTX-M-15. A análise por PFGE revelou a existência de um grupo maior correspondendo a um clone
epidémico A, que incluia 22 (35%) de todas as estirpes humanas e a estirpe isolada do golfinho. A técnica de MLST
revelou a mesma combinação alélica, correspondendo ao clone ST131. Vinte e uma estirpes clínicas identificadas
como pertencentes ao clone A e produtoras de enzima CTX-M-15, foram consideradas multiresistentes, tal como a
estirpe isolada do golfinho.
Conclusões: Este estudo demonstra a similaridade clonal entre estirpes de E. coli produtoras de enzima CTX-M-15
de origem humana e animal, salientando o seu potencial zoonótico, a disseminação recente e alargada de enzimas do
grupo CTX-M entre as diferentes espécies e a importância da identificação dos reservatórios de resistência
antimicrobiana.
[Epidemiology and zoonotic potential of Escherichia coli CTX-M-15-producing isolates in Portugal]
Background: The recent spread of plasmid-located CTX-M-ESBL-encoding genes is a serious threat to the clinical efficacy of
expanded-spectrum cephalosporins. This study proposes to identify the epidemiology of plasmid-mediated CTX-M-encoding
genes between an Escherichia coli strain isolated from a dolphin and several E. coli strains of human origin and, explain the
responsible mechanism and reservoirs of current spread of CTX-M-type enzymes. Molecular typing of these strains establishes
the linkage of dissemination between human and animal isolates.
Methods: Sixty two ESBL-positive E. coli strains isolated from different clinical specimens in seven hospitals (2004 to 2009),
from four different geographic regions, were screened for the presence of CTX-M encoding genes. An E. coli isolated from a
respiratory exsudate in a dolphin in 2009, at the National Laboratory of Veterinary Research (LNIV) and characterized as CTXM-producer, was also included in this study. Antimicrobial susceptibility was performed by broth-microdilution method. PCR
and sequencing were used to screen and identify bla genes. Genetic relatedness among all isolates was examined by PFGE using
XbaI enzyme. MLST was performed among the clinical epidemic human isolates clustering together and the isolate from the
dolphin, according to the MLST database.
Results: Forty eight human clinical isolates (77%) were CTX-M producers. Susceptibility towards beta-lactams confirmed all
isolates as ESBL producers and also suggesting CTX-M enzymes expression. We detected blaCTX-M-15 (n=34), blaCTX-M-1 (n=4),
blaCTX-M-3 (n=3), blaCTX-M-32 (n=3), blaCTX-M-14 (n=4), blaTEM-1 (n=39), and blaSHV-12 (n=8) genes; the dolphin isolate presented
the blaCTX-M-15 gene. Genetic relatedness analysis by PFGE revealed one major cluster corresponding to a single epidemic clone
A, which included 22 (35%) of all human isolates and the dolphin isolate, which clustered together with this clone A and,
exhibited the same combination of MLST alleles across the seven sequenced loci, corresponding to the ST131. Twenty-one
clinical isolates corresponding to the CTX-M-15-positive clone A were multidrug-resistant (95%), as well as the dolphin isolate.
Conclusions: This study illustrated that genetic relatedness between human and animal E. coli CTX-M-15-producing clone
strengthens its zoonotic potential. It may also explain the current spread of CTX-M-type enzymes worldwide among species from
different origins and highlights the importance to identify antimicrobial resistance reservoirs, contributing to a single health for
all.
127
Poster 9
Estudo epidemiológico de casos de tuberculose bovina em animais domésticos e silváticos na região
de Portalegre, Alentejo (2005-2009)
Raposo, A.1, Caetano, M.C.2 e Boinas, F.1
2 DGV, Direcção de Serviços Veterinários da Região do Alentejo, Portugal
A tuberculose bovina é uma doença contagiosa que atinge espécies domésticas, silváticas e o Homem, constituindo
um problema para as entidades sanitárias veterinárias, devido ao seu potencial zoonótico, impacto económico e
entrave causado à movimentação de animais e produtos. Apesar de Portugal se encontrar numa fase de préerradicação da tuberculose bovina, tem existido uma reemergência da doença em explorações e animais, com maior
expressão na Região do Alentejo.
Realizou-se um estudo retrospectivo por avaliação de inquéritos epidemiológicos realizados nos focos de
tuberculose em bovinos, ocorridos entre 2005 e 2009 na zona de acção da Divisão de Intervenção Veterinária de
Portalegre. Também se acompanharam os procedimentos de inspecção de uma montaria realizada em 2009 nessa
região, tendo-se recolhido material de lesões suspeitas desta doença em espécies de caça grossa.
Avaliou-se a hipótese de transmissão da doença por animais silváticos em 35 focos de tuberculose bovina,
concluindo-se que a origem da infecção pode ter resultado de contactos entre javalis e bovinos domésticos em 100%
dos casos. Os veados, embora tenham uma distribuição mais limitada, apresentaram contactos com os bovinos em
cerca de 45% das explorações em análise. Na montaria identificaram-se lesões macroscópicas compatíveis com
tuberculose em 33,3% dos veados e 11,8% dos javalis abatidos, confirmando-se posteriormente em laboratório por
histopatologia e/ou isolamento de M. bovis a existência de infecção em todos os casos.
Tendo em conta que os resultados obtidos confirmam a existência de tuberculose em veados e javalis de vida livre e
o seu contacto com bovinos domésticos em certas regiões, a transmissão da doença entre as diferentes espécies é um
risco epidemiológico.
Recomenda-se a utilização de técnicas de tipificação molecular dos isolados para avaliar os eventuais elos
epidemiológicos, assim como a intensificação da vigilância sanitária continuada destas espécies silváticas,
integrando as boas práticas sanitárias e o acompanhamento médico-veterinário nos procedimentos de inspecção às
peças de caça. Devem, ainda, ser implementadas medidas preventivas como a existência de planos de gestão
cinegética que contemplem o controlo do tamanho das populações e um maior confinamento dos bovinos em áreas
de risco.
[Epidemiological study of bovine tuberculosis cases in domestic animals and wildlife in Portalegre,
Alentejo (2005-2009)]
Bovine tuberculosis is a contagious disease that affects domestic animals, wildlife and Humans, and it remains a
problem for veterinary health authorities due to its zoonotic potential, economic impact and obstacles to animal and
products movements. Although Portugal is considered to be in a status of pre eradication of bovine tuberculosis,
there has been a resurgence of the disease in farms and animals, with higher expression in the Alentejo region.
It was performed a retrospective study analyzing the epidemiological surveys carried out in each outbreak of
tuberculosis in cattle occurred between 2005 and 2009 in the Portalegre area. It was also accompanied the inspection
procedures of a big game hunt held in 2009 in this region, where some samples were collected from animals with
tuberculosis-like lesions.
It was evaluated the possibility of transmission of this disease by wildlife in 35 outbreaks of bovine tuberculosis. We
concluded that the source of infection may have resulted from contact between wild boars and cattle in 100% of
cases. Red deers, although having a more limited distribution, had contacts with cattle in about 45% of the farms
studied. During the hunting journey, gross tuberculosis lesions were identified in 33.3% of the red deers and 11.8%
of the wild boars killed, being all of these cases confirmed later by histopathology and /or isolation of M. bovis as
tuberculosis infections.
Given that the results obtained confirm the existence of tuberculosis in free ranging red deer and wild boar and their
contact with domestic animals in certain regions, disease transmission between species is an epidemiological risk.
It is recommended the use of molecular typing techniques of isolates to assess the possible epidemiological links, as
well as a surveillance system for big game, integrating good health practices and veterinary supervision during game
meat inspection schemes. Preventive measures such as the creation of game management plans to control population
size and a higher confinement of cattle in risk areas should also be implemented.
128
Poster 10
Febre Q em bovinos de leite dos Concelhos de Mira e Vagos
Anastácio, S.1,2, Pessoa, D.1, Matos, A.3, Silva, G.4
1 Departamento de Medicina Veterinária, Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal; 2 Laboratório de Medicina Veterinária,
Almoster, Santarém, Portugal; 3 Médico Veterinário, CALCOB, Portugal; 4 Centro de Estudos Farmacêuticos, Faculdade de FarmáciaUniversidade de Coimbra, Departamento de Microbiologia, Coimbra, Portugal
Introdução: A Febre Q é uma zoonose causada por Coxiella burnetii, uma bactéria intracelular obrigatória1, que infecta diversas
espécies animais2. A sua ocorrência é mundial e apresenta um enorme impacte na saúde animal e na saúde pública 3. Os animais
infectados eliminam a bactéria pelas secreções e excreções, sendo o parto um momento privilegiado para a eliminação de grandes
concentrações de bactérias, em fêmeas infectadas4.
No homem, a maioria dos surtos ocorridos tem sido relacionada com ruminantes domésticos, que representam o principal
reservatório de infecção para humanos4,5. A infecção ocorre com maior frequência por inalação de aerossóis contaminados2,5,
mas tem sido também considerada a infecção por ingestão de leite ou produtos lácteos 4.
Nos últimos anos, em alguns países da Europa tem-se verificado um aumento do número de surtos de Febre Q 6,7,8. Em Portugal,
a Febre Q é uma doença de notificação obrigatória em humanos desde 1999 9 e a taxa de incidência entre 1999 e 2008 variou de
0,06 a 0,18 casos por 100 000 habitantes10,11. No entanto, as informações relativas à ocorrência de Febre Q em animais em
Portugal são escassas.
O presente estudo teve como objectivo detectar a infecção por Coxiella burnetii em explorações de bovinos nos Concelhos de
Mira e Vagos por pesquisa de anticorpos anti-Coxiella burnetii em amostras de leite de tanque associada à detecção da bactéria
por qPCR.
Materiais e Métodos: Entre Novembro de 2010 e Abril de 2011, foram colhidas amostras de leite de tanque em 20 explorações de
bovinos de leite, dos Concelhos de Mira e Vagos. As amostras colhidas foram conservadas a -20ºC até à sua análise. A pesquisa
de anticorpos foi efectuada pela técnica de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), utilizando o kit comercial Chekit Q
Fever ELISA Test kit® (Idexx – Bern, Switzerland) e seguindo as instruções do fabricante. A detecção de Coxiella burnetii foi
efectuada por qPCR em todas as amostras com um resultado não negativo à pesquisa de anticorpos, utilizando o kit TaqVet
Coxiella burnetii® (Laboratoire Service International, Lissieu, France), seguindo as instruções do fabricante.
Resultados: Relativamente à pesquisa de anticorpos, do total de amostras analisadas, não se obtiveram resultados positivos mas
em 3 (15%) amostras o resultado foi considerado duvidoso. Estas amostras evidenciaram um resultado positivo na detecção de
Coxiella burnetii por qPCR.
Conclusões: Os resultados obtidos revelam a presença de uma infecção por Coxiella burnetii nas 3 explorações correspondentes,
traduzindo-se numa taxa de infecção ao nível da exploração de 15%.
[Q Fever in dairy cattle from Mira and Vagos Councils]
Introduction: Q Fever is a zoonosis caused by Coxiella burnetii, an obligate intracellular bacterium1, that infects several animal
species. This disease presents a worldwide distribution and a great impact in animal and in public health3. Shedding of bacteria
occurs by secretions and excreta from infected animals. At parturition, infected females shed a large number of bacteria in birth
products4.
Human outbreaks have been related with domestic ruminants, which represent the main reservoirs to humans4,5. Infection occurs
more frequently by inhalation of contaminated aerosols2,5, but the infection by ingestion of raw milk should be considered too 4.
Recently, in some European countries, the number of reported cases in humans has increased7,8. In Portugal, Q Fever is a notified
disease since 19999 and the incidence rate between 1999 and 2008 ranged from 0.06 to 0.18 cases per 100 000 inhabitants 10,11.
Information about the occurrence of this disease in animals is scarce.
The aim of our study was to detect infection caused by Coxiella burnetii in dairy farms from Mira and Vagos Councils by testing
antibodies anti-Coxiella burnetii in bulk tank milk samples in association with qPCR for bacteria detection.
Materials and Methods: Between November 2010 and April 2011, bulk tank milk samples were collected from 20 dairy herds
from Mira and Vagos Councils. Samples were keeped at -20ºC until their analysis. Antibody testing was performed, by the
technique of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), using the comercial Chekit Q Fever ELISA Test kit® (Idexx – Bern,
Switzerland), following manufacturer‟s instructions. Coxiella burnetii detection was performed in all of the non negative samples
to antibody testing, using the comercial kit TaqVet Coxiella burnetii® (Laboratoire Service International, Lissieu, France),
following manufacturer‟s instructions.
Results: Considering the antibody testing, no positive results were obtained in all the tested samples, but in 3 (15%) samples an
intermediate result was obtained. These 3 samples showed a positive result to qPCR for detection of Coxiella burnetii.
Conclusions: Our results showed the presence of infection by Coxiella burnetii in the 3 corresponding herds, which means that
the infection rate in a herd level was 15%.
References: 1 Maurin, M., Raoult, D. (1999). Q Fever. Clinical Microbiology Reviews, 12 (4), 518-553; 2 Arricau-Bouvery, N., Rodolakis, A.
(2005). Is Q Fever an emerging or re-emerging zoonosis? Veterinary Research, 36, 327-349; 3. Guatteo, R., Seegers, H., Taurel, A. F., Joly, A.,
Beaudeau, F. (2011). Prevalence of Coxiella burnetii in domestic ruminants: a critical review. Veterinary Microbiology, 149, 1-16; 4. Rodolaskis,
A. (2006). Q Fever, state of art: Epidemiology, diagnosis and prophylaxis. Small ruminant research, 62, 121-124; 5. Angelaskis, E., Raoult, D.
(2010). Q Fever. Veterinary Micorbiology, 140, 297-309; 6. Bosjnak, E., Hvass, A. M. S. W., Villumsen, S., Nielsen, H. (2010). Emerging
evidence for Q fever in humans in Denmark: role of contact with dairy cattle. Clinical Microbiology and Infection, 16 (8), 1285-1288; 7. van der
Hoek, W., Dijkstra, F., Schimmer, B., Schneeberger, P. M., Vellema, P., Wijkmans, C., ter Schegget, R., Hackert, V., van Duynhoven, Y. (2010).
Q fever in the Netherlands: an update on the epidemiology and control measures. Eurosurveillance, 15 (12), pii 19520; 8. Wallensten, A., Moore,
P., Webster, H., Johnson, C., van der Burgt, G., Pritchard, G., Ellis-Iversen, J., Oliver, I. (2010). Q fever outbreak in Cheltenham, United
Kingdom, in 2007 and the use of dispersion modelling to investigate the possibility of airborne spread. Eurosurveillance,15(12), pii=19521; 9.
Portugal: Portaria 1071/98 de 31 de Dezembro; 10. D.G.S. (2004). Doenças de Declaração Obrigatória, 1999-2003. Direcção-Geral da Saúde.
Direcção de Serviços de Informação e Análise. Divisão de Epidemiologia. - Lisboa: DGS. 38 pp; 11. D.G.S. (2010). Doenças de Declaração
Obrigatória, 2004-2008. Direcção-Geral da Saúde. Direcção de Serviços de Informação e Análise. Div. de Epidemiologia. - Lisboa: DGS. 88 pp.
129
Poster 11
Neosporose bovina na freguesia de Arazede, concelho de Montemor-o-Velho
Sousa, S.1, Anastácio, S.1, Almeida, A.1, Carvalho, M.N.1, Luís, J.F.2, Madeira de Carvalho, L.3
1 Departamento de Medicina Veterinária, Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal
2 Médico Veterinário da Cooperativa Agrícola do Bebedouro, Concelho de Montemor-o-Velho, Portugal
Introdução: A neosporose é considerada uma doença emergente em todo o mundo. O agente etiológico é Neospora
caninum, um protozoário parasita, responsável pela ocorrência de aborto e mortalidade neonatal em bovinos.1
O presente estudo teve como objectivo determinar a presença de infecção por Neospora caninum pela pesquisa de
anticorpos em soros de bovinos da Freguesia de Arazede, Concelho de Montemor-o-Velho.
Materiais e Métodos: Entre Novembro de 2009 e Março de 2010, foram colhidas 63 amostras de sangue em bovinos
de 4 explorações com história clínica de aborto. As amostras foram analisadas, em duplicado, no Laboratório de
Parasitologia da Escola Universitária Vasco da Gama (EUVG), mediante a técnica de Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay (ELISA), com a utilização do Neospora caninum Antibody Test Kit, cELISA, comercializado
pela VMRD®, e de acordo com as instruções do fabricante.
Resultados: Verificou-se que ao nível das explorações a taxa de positividade foi de 100%, tendo-se obtido pelo
menos um resultado positivo em cada exploração. Ao nível individual, a taxa de positividade foi de 27% com um
resultado positivo em 17 das 63 amostras analisadas. Em 3 amostras o resultado foi considerado duvidoso (4,8%).
Conclusões: Este estudo permitiu verificar a presença de infecção por Neospora caninum nas explorações de
bovinos da freguesia de Arazede. A taxa de positividade individual obtida apresenta um valor semelhante aos
valores de prevalência obtidos em estudos anteriores realizados em Portugal.2
[Bovine neosporosis in Arazede, municipality of Montemor-o-Velho]
Introduction: Neosporosis is considered an emergent disease worldwide. The causative agent is Neospora caninum,
a protozoan parasite, responsible for the occurrence of abortion and neonatal mortality in cattle.1
The present study aimed to detect the presence of antibodies anti- Neospora caninum in sera of cattle from Arazede,
in the Municipality of Montemor-o-Velho.
Materials and Methods: Between November 2009 and March 2010, 63 blood samples were collected from cattle in 4
herds with previous reports of abortion. Serum samples were tested, in duplicate, at the Parasitology Laboratory Escola Universitária Vasco da Gama (EUVG), by the technique of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),
using Neospora caninum Antibody Test Kit, cELISA, from VMRD®, and following manufacturer‟s instructions.
Results: At herd level, the positivity rate was 100% since at least one positive result was obtained in each herd. At
individual level, the positivity rate was 27% with a positive result in 17 of the 63 tested
samples. In three samples the result was considered intermediate (4.8%).
Conclusions: This study allowed confirming the presence of infection caused by Neospora caninum in cattle herds
from Arazede. The value of positivity rate, at individual level, is similar to results obtained in previous studies
developed in our country.2
Referências:
1- Dubey, J.P.; Schares, G.; Ortega-Mora, L.M. (2007) – Epidemiology and Control of Neosporosis and Neospora caninum. Clinical
Microbiology Reviews. 20 (2): 323-367.
2- Canada, N.; Carvalheira, J., Meireles, C.S., Correia da Costa, J.M., Rocha, A. (2004). Prevalence of Neospora caninum infection in dairy cows
and its consequences for reproductive management. Theriogenology, 62, 1229-1235.
130
Poster 12
Modelo determinístico para avaliar o impacto do tratamento de mastites subclínicas por
staphylococci coagulase-negativos durante a lactação
Bexiga, R.1, Ellis, K.A.2, Vilela, C.L.1, Mellor, D. J.2
2 Scottish Centre for Production Animal Health and Food Safety, Large Animal Clinical Sciences and Public Health, School of Veterinary
Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow
Os staphylococci coagulase-negativos (SCN) são as bactérias mais frequentemente isoladas a partir de amostras de
leite bovino em vários estudos, de diversas partes do globo. Apesar da relativa frequência das mastites provocadas
por estes agentes, as medidas específicas dirigidas ao seu controlo não estão bem estabelecidas. Uma medida
possível a incluir num programa de controlo seria a realização de tratamento antimicrobiano durante a lactação. A
decisão de realizar este tipo de tratamento, tal como outras acções na exploração, deve basear-se na probabilidade de
retorno financeiro. Neste estudo, foi utilizado um modelo determinístico para avaliar se a realização de um
tratamento antimicrobiano durante a lactação para quartos infectados com SCN era finaceiramente justificável. As
variáveis de entrada para o impacto dos SCN na saúde do úbere basearam-se num estudo anterior realizado pelos
mesmos autores e em literatura disponível sobre este assunto. Os preços incluídos no modelo basearam-se em
condições Portuguesas em 2009/2010. O resultado médio por quarto tratado com antimicrobiano foi uma perda
líquida de €38.74. A realização de uma análise de sensibilidade para avaliar de que forma a variação sistemática das
variáveis de entrada do modelo poderia levar a alterações no resultado, mostrou que esta levava quase sempre a
resultados negativos, com a maior variação nas perdas a ser observada para alterações na duração do período de
tratamento e do intervalo de segurança (- €46.26 a - €28.49). As situações para as quais um benefício líquido seria
expectável incluiam a redução da contagem de células somáticas do leite de tanque, para um nível em que eram
evitadas penalizações ou eram atribuídas bonificações pela indústria que recolhe o leite, ou a prevenção da
transmissão de SCN na sala de ordenha quando a possibilidade de transmissão estava no seu nível mais elevado.
Para a maior parte das situações, no entanto, o tratamento de mastites subclínicas por SCN durante a lactação não
era financeiramente justificável.
[Deterministic model to evaluate the impact of lactational treatment of subclinical mastitis due to
coagulase-negative staphylococci]
Coagulase-negative staphylococci (CNS) are the most frequently isolated bacteria from milk samples in several
studies worldwide. Despite their relative frequency, specific measures aiming at their control are not well
established. One possible measure to include in a control programme is lactational antimicrobial treatment. The
decision to perform such treatment, as well as other actions on farm, should be based on the likelihood of financial
return. A deterministic model was used to evaluate whether performing an antimicrobial treatment during the
lactation for quarters infected with CNS was financially justifiable. Input variables for the impact of CNS on udder
health were based on a previous study by the same authors and on available literature on the subject. Prices included
in the model were based on 2009/2010 conditions in Portugal. The average result per antimicrobial treated quarter
was a net loss of €38.74. Performing a sensitivity analysis to evaluate how systematic variation of the input variables
to the model would lead to outcome changes, showed that variation in input variables nearly always led to a negative
outcome, with the greatest variation in losses observed for variation in the length of treatment and milk withdrawal
period (- €46.26 to - €28.49). The situations in which a net benefit was to be expected included the bulk tank
somatic cell count decreasing to a level corresponding to a premium payment or to penalties being avoided, and the
prevention of transmission of CNS in the milking parlour when the possibility of transmission was at its highest
level. For most situations, lactational treatment of CNS subclinical mastitis was not financially justifiable.
131
Poster 13
Utilização dum modelo SIR e uma abordagem Bayesiana para estimar a taxa de transmissão da
Salmonella Typhimurium em porcos
Correia-Gomes, C.1,2, Brazdil, P.3, Alban, L.4, Niza-Ribeiro, J.1,2
1 Departamento de Estudos das Populações, ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
2 Instituto de Saúde Pública da Univerisade do Porto (ISPUP), Portugal
3 LIAAD - INESC Porto L.A., Universidade do Porto, Portugal
4 DMA - Danish Agriculture and Food Council, Copenhaga, Dinamarca
Para modelar a transmissão de Salmonella Typhimurium em explorações de suínos é preciso estimar previamente a
sua taxa de transmissão (β). Neste estudo utilizaram-se os dados de um estudo longitudinal em três explorações
dinamarquesas infectadas pelo agente para estimar o valor de β. O objectivo foi avaliar qual o melhor modelo para
este propósito. Com base nos resultados da bacteriologia e da serologia, cada animal foi classificado como
susceptível, infeccioso ou resistente. Foram utilizados modelos bayesianos SIR. Dois eram modelos de Poisson o
primeiro com transmissão dependente da frequência, o segundo com transmissão dependente da densidade. O
terceiro foi um modelo Binomial. No modelo foram incorporados dois tipos de efeitos aleatórios: relativamente aos
grupos (dois grupos por exploração) e para corrigir a sobredispersão. Foi considerado no modelo o uso em paralelo
de ambos os testes (bacteriologia e serologia). Implementaram-se os modelos em WinBUGS utilizando métodos de
Monte Carlo baseados em cadeias de Markov. A média da distribuição a posteriori para o β foi de 0.5 para o modelo
de Poisson com transmissão dependente da frequência, 0.017 para o modelo de Poisson com transmissão dependente
da densidade e 0.38 para o modelo Binomial. O modelo Binomial tinha menos valores atípicos que os modelos de
Poisson, por isso foi considerado a melhor opção para estimar o β.
[Transmission parameter estimated for Salmonella Typhimurium in swine using a SIR-model and a
Bayesian approach]
Disease transmission models need the previous estimation of the transmission parameter ratio (β). Observational
data from a longitudinal study of three Danish farrow-to-finish swine herds known to be infected were used to
model the infection spread of Salmonella Typhimurium in swine. Each animal was categorized as susceptible,
infectious or resistant based in the bacteriologic and serologic results. The purpose of this study was to assess the
best model to estimate β. To estimate the β, we used three Bayesian SIR-models for the transmission of Salmonella
spp. between pigs. Two Poisson distributions: frequency-dependent transmission, density-dependent transmission
and one Binomial model. Random effects were incorporated into the model for the cohort effect and to correct for
overdispersion. It was also taken in consideration in the models the parallel used of both tests (bacteriology and
serology). The model fitting was implemented using Markov-chain Monte Carlo (MCMC) sampling procedures in
WinBUGS. The mean posterior distribution for β was 0.5 for Poisson frequency-dependent model, 0.017 for Poisson
density-transmission model and 0.38 for Binomial model. The Binomial model has less outliers than both the
Poisson models. So it was considered the Binomial model as the best option to estimate the β.
132
Poster 14
Seroprevalência do norovirus canino em cães da Europa e da América do Norte
Mesquita, J.R.1,2, Delgado, I.1, Costantini, V.3, Saliki, J.4, Seh-ching, L.3, Vahlenkamp, T.5, Nascimento, M.S.J.1,
Vinjé, J.3
1 Laboratorio de Microbiologoa, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto, Portugal
2 Secçãod e Ciências Veterinárias, Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal
3 Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA
4 College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA, USA
5 Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig, Leipzig, Germany
Objetivos: Os norovírus humanos são a causa mais frequente de gastroenterite epidémica e aguda esporádica em
todo o mundo e entre humanos de todas as idades. Em 2010, descobrimos e caracterizamos um novo norovírus em
cães portugueses com diarreia que era geneticamente distinto de qualquer outro norovírus animal ou humano. A
descoberta desta estirpe canina levanta a questão se este novo agente patogénico entérico está amplamente
distribuído, circulando na população canina. Assim, para determinar a prevalência de norovírus canino testamos
amostras de soro de cães provenientes de 14 países na Europa e da América do Norte.
Metodologias: Um total de 780 amostras de soro de cães foi recolhido entre Setembro de 2009 e Janeiro de 2010.
Estas incluíam 309 amostras de Portugal, 61 amostras provenientes dos Estados Unidos da América, 50 amostras da
Alemanha, 50 amostras de cães da França, 50 amostras de cães da Dinamarca, 50 amostras da Polónia, 50 amostras
da Holanda, 50 amostras da Noruega, 50 amostras do Reino Unido, 10 amostras da Hungria, 10 amostras de Itália,
10 amostras da Irlanda, 10 amostras da Suíça, 10 amostras da Suécia e 10 amostras da Finlândia. Os soros foram
testados com por um sistema de ELISA in-house para anticorpos IgG anti-norovírus canino baseado em Virus Like
Particles (VLPs). As VLPs foram produzidas por infecção oral de larvas de Trichoplusia ni e purificadas por
ultracentrifugação em CsCl.
Resultados: Das 780 amostras, 598 (76,7%) revelaram ser positivas para IgG anti-norovírus canino. A taxa de
positividade para cada um dos países foi de 84% na Dinamarca, 80% na Finlândia, 82% na França, 78% na
Alemanha, 40% na Hungria, 30% na Irlanda, 90% na Itália, 76% nos Países Baixos, 78% na Noruega, 92% na
Polónia, 73% em Portugal, 100% na Suécia, 70% na Suíça, 94% no Reino Unido e 66% nos Estados Unidos da
América. A presença de anticorpos IgG anti-norovírus caninos em cães de vários países da Europa e América do
Norte sugere a circulação generalizada do norovírus canino na população de cães.
[Seroprevalence of canine norovirus in dogs from Europe and North America]
Objectives: Human noroviruses are the most frequent cause of epidemic and sporadic acute gastroenteritis
worldwide among humans of all ages. In 2010, we discovered and characterized a novel norovirus genetically
unrelated with any other animal or human norovirus in Portuguese dogs with diarrhea. The discovery of this novel
canine NoV strain raises the question whether this new enteric pathogen is widely circulating in the dog population.
Hence, to determine the prevalence of canine norovirus we tested serum samples from dogs from 14 countries in
Europe and North America.
Methodologies: A total of 780 serum samples from dogs were collected between September 2009 and January 2010.
These included 309 samples from Portugal, 61 samples from the United States of America, 50 samples from
Germany, 50 samples from France, 50 samples from Denmark, 50 samples from Poland, 50 samples from the
Netherlands, 50 samples from Norway, 50 samples from the United Kingdom, 10 samples from Hungary, 10
samples from Italy, 10 samples from Ireland, 10 samples from Switzerland, 10 samples from Sweden and 10
samples from Finland. Sera were tested with a VLP-based ELISA for canine norovirus IgG antibodies. VLPs were
produced by oral infection of synchronous Trichoplusia ni larvae and purified by CsCl ultracentrifugation.
Results: Of the 780 samples, 598 (76.7%) tested positive for IgG anti-canine norovirus. The positivity rate for the
individual countries was 84% in Denmark, 80% in Finland, 82% in France, 78% in Germany, 40% in Hungary, 30%
in Ireland, 90% in Italy, 76% in Netherlands, 78% in Norway, 92% in Poland, 73% in Portugal, 100% in Sweden,
70% in Switzerland, 94% in the United Kingdom and 66% in the United States of America. The presence of canine
NoV – specific IgG antibodies in dogs throughout the European countries and North America suggests widespread
circulation of canine norovirus in the dog population.
133
Poster 15
Detecção de leveduras na cavidade oral de gatos errantes, Setúbal, Portugal
Rodrigues, C.1, Martins, T.1, Martins, M.2, Duarte, A.3, Braz, B.S.3, Alves, A.C.4, Tavares, L.3
1 Mestrado Integrado em Med. Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
4 Hospital Veterinário SOS Vet, Cova da Piedade, Almada, Portugal
Este trabalho teve por objectivo analisar a microbiota micológica da boca dos felídeos domésticos e avaliar a sua
relação com a sintomatologia clínica manifestada ao nível da cavidade oral e a infecção com o Vírus da
Imunodeficiência Felina (FIV) e com o Vírus da Leucémia Felina (FeLV), ambos capazes de induzir
imunodeficiência. O grupo de estudo incluiu cinquenta gatos de uma associação particular situada na freguesia de
Alhos Vedros (Setúbal, Portugal). Após exame clínico, os materiais biológicos recolhidos incluiram sangue total
para detecção de anticorpos contra o FIV e de antigénio de FeLV (Speed Duo FeLV/FIV, Virbac, Portugal) e uma
zaragatoa oral para cultura micológica em meio Sabouraud dextrose agar. As colónias obtidas neste meio foram
observadas ao microscópio óptico, após coloração com azul de algodão, para diferenciação entre bactérias e
leveduras, tendo as placas com leveduras sido repicadas para uma nova placa em meio de corn meal agar, para
realização de provas de filamentação. As culturas de leveduras foram identificadas quanto ao género e espécie,
utilizando o API 32C® (bioMérieux).
Em cinco animais foi detectada a presença de Candida spp. na cavidade oral, dos quais dois estavam infectados com
FIV e um com FeLV. As espécies identificadas foram C. silvicola (n=3), C. valida (n=1) e C. parapsilosis (n=1).
Clinicamente, os animais nos quais foram detectadas leveduras, apresentavam gengivite ligeira (n=5), estomatite
(n=2) e úlceras linguais (n=1). O animal que apresentava os três sinais clínicos estava infectado com FIV, e o animal
positivo a FeLV exibia gengivite ligeira e estomatite.
Dada a reduzida dimensão da amostra em estudo, não foi possível obter uma correlação significativa entre a
infecção por retrovírus e a presença ou ausência de sinais clínicos, no entanto 60% (3/5) dos animais nos quais
foram detectadas leveduras, encontravam-se infectados com FIV ou FeLV. Considerando que a informação sobre a
microbiota micológica da cavidade oral dos felinos é escassa, a detecção de leveduras, em particular do género
Candida, contribui por um lado para um melhor conhecimento nesta área, mas também para a compreensão do papel
potencial do FIV e FeLV enquanto vírus imunosupressores capazes de interferir na modulação da microbiota
comensal destes animais.
[Yeasts detection in the oral cavity of stray cats, Setúbal, Portugal]
The aim of this study was to analyse the mycological microbiota of cats‟ mouth and its relationship with the clinical
symptoms (presence of gingivitis/stomatitis) and infection with Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline
Leukaemia Virus (FeLV), both able to induce immunodeficiency. The test group included fifty cats from a private
shelter in Alhos Vedros (Setúbal, Portugal). After the clinical examination, total blood was collected for antibody
detection of FIV and FeLV‟s antigen (Speed Duo FeLV/FIV, Virbac, Portugal) and oral swab for mycological
culture in Sabouraud dextrose agar medium. The obtained colonies were observed under optical microscope, after
cotton blue staining, in order to differentiate bacteria from yeasts. After isolation, yeasts‟ cultures were identified to
genus and species using API 32C® (bioMérieux) system. Yeats cultures were re-isolated to corn meal agar plates in
order to realize filamentation‟s proofs.
Within our sample five animals revealed the presence of Candida spp. in the oral cavity, of which two were infected
with FIV and one with FeLV. The identified species were C. silvicola (n=3), C. valida (n=1) and C. parapsilosis
(n=1). Clinically, the animals with oral yeasts, presented mild gingivitis (n=5), stomatitis (n=2) and tongue
ulceration (n=1). The only animal presenting the three clinical signs was infected with FIV and the FeLV positive
animal showed gingivitis and stomatitis.
A significative correlation could not be found between retrovirus infection and the presence/absence of clinical sign,
due to the sample size. However 60% (3/5) animals positive to oral yeasts were infected by FIV or FeLV.
Considering that information regarding the mycological microbiota of the feline oral cavity is scarce, the
identification in our samples of yeasts included in the Candida genus, this will certainly prove helpful. Furthermore
it will also contribute for a better understanding of the potential role of immunosuppressive viruses, as FIV and
FeLV, in interfering with commensal microbiota modulation in these animals.
134
Poster 16
Infecção por Leptospira patogénica em cães do Concelho de Coimbra
Duarte, S.C.1, Anastácio, S.1, Miranda, L.1, Lino, J.1, Portugal, M.2, Ramalho, F.2, Collares-Pereira, M.M.3
2 Centro Municipal de Recolha Oficial de Animais de Companhia de Coimbra (CMROACC), Câmara Municipal de Coimbra, Portugal
3 Unidade de Leptospirose e Borreliose de Lyme, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Lisboa, Portugal
Introdução: A leptospirose, considerada a zoonose de maior dispersão mundial, atinge mamíferos domésticos e
silváticos.1 Esta doença é reconhecida nos cães desde 1898, sendo estes animais considerados hospedeiros de
manutenção para o serovar Canicola e a segunda fonte de infecção para o Homem 2 O seu diagnóstico só pode ser
confirmado com recurso a análises laboratoriais, para comprovar a presença do agente ou de anticorpos antiLeptospira.3
O objectivo do nosso trabalho foi avaliar a presença de infecção por Leptospira em cães pela pesquisa de anticorpos
e pela pesquisa de leptospiras em tecido renal.
Materiais e Métodos: Entre Fevereiro e Junho de 2006, foram colhidas 271 amostras de sangue e 45 amostras de rim
em cães. Os soros foram analisados, na Unidade de Leptospirose e Borreliose de Lyme (ULBL) do Instituto de
Higiene e Medicina Tropical (IHMT), pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM), o método de referência
segundo a OMS, utilizando 13 antigénios.
A detecção do DNA leptospírico foi efectuada no Laboratório de Microbiologia, Escola Universitária Vasco da
Gama (EUVG). Numa primeira fase, os rins foram submetidos à extracção de DNA, utilizando o QIamp DNA Mini
Kit® (Qiagen Iberia, S.L. Madrid, Spain). Seguiu-se a PCR que foi efectuada utilizando o kit para detecção de
Leptospira Patogénica (Leptospira Pathogenic®, Genekam Biotechnology AG, Duisburg – Germany).
Resultados: Do total de 271 soros analisados, obteve-se um resultado positivo à TAM em 33 (12%) amostras. O
resultado foi duvidoso, com título de 80, em 48 (18%) amostras e em 190 (70%) amostras o resultado foi negativo.
Relativamente ao sexo, verificou-se uma taxa de seropositividade superior nos machos (14,6%) do que nas fêmeas
(10,2%). Os serogrupos Icterohaemorrhagiae, Autumnalis, Grippotyphosa, Sejroe, Canicola e Australis foram
considerados, por ordem decrescente de frequência, os serogrupos presumíveis infectantes em 54,5% dos soros
positivos.
Relativamente, à detecção de DNA leptospírico o resultado foi negativo na totalidade das amostras testadas, sendo
que apenas 2 dos rins testados correspondiam a animais seropositivos. (título 320 em ambos).
Conclusões: Os resultados obtidos permitiram concluir que a leptospirose canina está presente no concelho de
Coimbra, tendo-se obtido uma taxa de infecção não negligenciável. Sugerem ainda que os roedores assumem um
papel importante na origem da infecção canina uma vez que os serogrupos de que são hospedeiros de manutenção,
Icterohaemorrhagiae e Autumnalis, foram os mais prevalentes.
[Infection by pathogenic Leptospira in dogs from Coimbra Council]
Introduction: Leptospirosis, a zoonosis with worldwide occurrence, affects domestic and wild mammals. 1 This disease is
recognized in dogs since 1898. These animals are considered the maintenance hosts to serovar Canicola and the second most
important source of infection to humans.2 Diagnosis must include laboratory tests to confirm the presence of the causative agent
or to evaluate the presence of antibodies anti-Leptospira.3
Materials and Methods: The aim of our study was to evaluate the presence of Leptospira infection in dogs by antibody testing
and by detecting Leptospira DNA in kidney tissue.
Between February and June 2006, 271 blood samples and 45 kidneys were collected from killed dogs. Serum samples were tested
at the Unidade de Leptospirose e Borreliose de Lyme (ULBL), Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT), using
Microscopic Aglutination Test (MAT), the reference test according to WHO, using 13 antigens.
Leptospiric DNA detection was performed at the Microbiologia, Escola Universitária Vasco da Gama (EUVG). Firstly, kidneys
were submitted to a DNA isolation, using QIamp DNA Mini Kit® (Qiagen Iberia, S.L. Madrid, Spain). Nextly, PCR was
performed using a PCR kit for detection of pathogenic Leptospira (Leptospira Pathogenic®, Genekam Biotechnology AG,
Duisburg – Germany).
Results: From the 271 tested serum samples, a positive result to MAT was obtained in 33 (12%) samples. Results were
considered intermediate in 48 (18%) samples and in 190 (70%) results were negative. According to gender, the positivity rate
was higher in males (14.6%) than in females (10.2%). Serogroups Icterohaemorrhagiae, Autumnalis, Grippotyphosa, Sejroe,
Canicola and Australis were considered, by decreasing order of frequency, the presumptive infecting serogroups in 54.5% of
positive samples. Considering, the leptospiric DNA detection results were negative in all of tested samples, but only 2 kidneys
belonged to seropositive animals.
Conclusions: Our results allowed concluding that canine leptospirosis is present in Coimbra Council and the positivity rate
cannot be ignored. Our results also suggest that rodents may play an important role as a source of infection to dogs because they
are maintenance host of Icterohaemorrhagiae and Autumnalis serogroups, which were the most prevalent in our study.
Referências: 1. Batista, C.S.A.; Alves, C.J.; Azevedo, S.S.; Vasconcellos, S.A., Morais, Z.M.; Clementino, I.J.; Alves, F.A.L.; Lima, F.S.; Neto,
J.O.A. (2005).Soroprevalência e fatores de risco para a leptospirose em cães de Campina Grande, Paraíba, Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 57 (2):
179-185. 2. Brod, C.S.; Aleixo, J.A.G.; Jouglard, S.D.D.;Fernandes, C.P. H.;Teieira, J.L.R.; Dellagostin, O.A. (2005). Evidência do cão como
reservatório da leptospirose humana: isolamento de um sorovar, caracterização molecular e utilização em inquérito sorológico, Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 38 (4): 294-300. 3. OIE. (2009). Leptospirosis. Publicado em www.oie.com (acedido em Outubro
2010).
135
Poster 17
Parasitismo em canídeos do Concelho de Óbidos
Crespo, M.V.1, Rosa, F.2, Almeida, J.P.3
1 Escola Superior Agrária/Instituto Politécnico de Santarém, Portugal. Email: [email protected]
2 Instituto de Investigação Científica Tropical/DES, Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
3 Gabinete de Veterinária - Câmara Municipal de Óbidos, Portugal. Email: [email protected]
O grande interesse manifestado pelos Serviços Veterinários Municipais do Concelho de Óbidos na implementação
de medidas preventivas para minimizar os riscos de contaminação ambiental e de Saúde Pública, levou à realização
dum estudo, durante o ano de 2009, nos canídeos deste concelho com vista à identificação do parasitismo e
determinação dos períodos e áreas de maior risco de contaminação.
Nas nove freguesias, recolheu-se um total de 548 amostras de fezes de canídeos (5,00% do efectivo canino).
Realizaram-se análises coprológicas qualitativas (métodos de Willis e sedimentação espontânea) e quantitativas
(método de McMaster). Efectuaram-se ainda colheitas de ixodídeos em cerca de 10% da população de cães, durante
o período de Vacinação anti-rábica e o seu estudo taxonómico baseou-se em Travassos Dias (1994) e Walker et al.
(2000).
Das amostras de fezes observadas, 274 (50%00%) apresentaram formas de eliminação parasitária. Nas amostras
positivas identificaram-se ovos de Ancylostomatidae (79,92%), (Ascarididae - Toxocara canis e Toxascaris leonina)
(12,04%), Trichuris sp. (40,15%), Strongyloides sp. (18,98%), oocistos de Isospora sp. (2,55%) e Sarcocystis sp.
(0,37%) e proglótides grávidos de Dipylidium caninum (0,74%).
A prevalência variou consoante a freguesia em estudo (mínimo - 15,63%, em Sobral da Lagoa; máximo – 73,86%,
no Vau). Predominarem as infecções simples na maioria das freguesias (55,56%), no entanto, quatro delas (44,44%),
apresentaram superioridade de associações mistas (A-dos-Negros, Olho Marinho, Usseira e Vau).
O estudo estacional permitiu evidenciar um aumento do número de amostras positivas, ao longo do ano: Inverno 9,67%; Primavera - 11,86%; Verão - 13,50%; Outono - 14,96%. Com excepção do Inverno, onde se registou maior
gravidade das infecções com superioridade de associações (50,94%), nas restantes estações, predominaram as
infecções simples.
No estudo dos ixodídeos, a carga parasitária média por animal foi de 5 exemplares. Predominaram os exemplares
adultos (98,80%) relativamente às formas imaturas (1,21%). Verificou-se uma maior preponderância de machos (90
exemplares, 54,22%), relativamente às fêmeas (74 espécimes, 27,82%). Nos 166 exemplares colhidos identificaramse duas espécies: Rhipicephalus sanguineus, com 150 exemplares, o que corresponde a 90,36%, e Rhipicephalus
pusillus, com um total de 16 espécimes (10 machos e 6 fêmeas), equivalente a 9,64%.
[Parasitism in dogs from Obidos Council]
The great interest showed by the Veterinary County Offices on the implementation of prophylactic measures to
minimize the risks of parasitic environmental contamination by dog faeces and its impact on Public Health, led to a
study, to understand the existing parasitism and to assess the period and area of major risk of transmission.
A total of 548 dog faeces samples (5% of the local canine population) was collected from public spaces, pavements,
gardens and abandoned fields in nine sites. Coprological exams were performed by qualitative (Willis and
spontaneous sedimentation methods) and quantitative techniques (McMaster method). Ixodid specimens were also
collected from 10% of the local canine population, during the anti-rabic vaccination, and identified based on
Travassos Dias (1994) and Walker et al. (2000) criteria.
Egg output was registered in a total of 274 (50%) samples. Ancylostomatidae (79.92%), (Ascarididae - Toxocara
canis and Toxascaris leonina) (12.04%), Trichuris sp. (40.15%) and Strongyloides sp. (18.98%) eggs, and Isospora
sp. (2.55%) and Sarcocystis sp. (0.37%) oocysts were observed. Gravid proglotids of Dipylidium caninum (0.74%)
was also evidenced.
In the study area the overall prevalence varied from 15.63%, in Sobral da Lagoa to 73.86%, in Vau. Simple infection
was predominant in the great majority of the studied areas, although four of them showed higher co-infections (Ados-Negros, Olho Marinho, Usseira and Vau).
Seasonal study enhanced an increase in the number of positive samples along the year (Winter – 9.67%; Spring –
11.86%; Summer – 13.50%; Autumn – 14.96%), excluding the Winter period, when more severe infections related
to co-infections were noticed (50.94%), simple infections prevailed.
In ixodid studies, the average of parasitic load was 5 specimens for dog. Adults were predominant (98.80%) in
relation to immature (1.21%) and the number of males (90 specimens, 54.22%) was higher than females (74,
27.82%). In a sample of 166 ixodids two species were identified: Rhipicephalus sanguineus, (150 individuals,
90.36%), and Rhipicephalus pusillus, (16 specimens, 9.,64%).
136
Poster 18
Estudo de hemoparasitas transmitidos por vectores, em cães de canil em Setúbal (Portugal)
Castanheira da Silva, I.P.1, Fachada, A.P.2, Meireles, J.A.F.S.3
1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa
2 Clinica Veterinária Linda-a-Vet
3 CIISA, Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
As doenças transmitidas por vectores são causadas por parasitas, bactérias ou vírus e são veiculadas pela mordedura
de artrópodes (principalmente ixodídeos e mosquitos). Estas doenças afectam cães a nível mundial e a maioria delas
têm potencial zoonótico. Nestas estão incluídas as doenças sob estudo: Ehrlichiose, Babesiose, Rickettsiose,
Anaplasmose e Leishmaniose.
A patogénese das doenças sob estudo, baseia-se fundamentalmente na resposta humoral exagerada e não protectora
desenvolvida pelo hospedeiro, que provoca sintomas semelhantes à de uma doença auto-imune. Isto é, ao contrário
do que se podia pensar, não é o parasita em si que é responsável por todos os sintomas da doença, mas sim a
resposta imunológica do hospedeiro à sua presença.
No que respeita ao diagnóstico, os médicos veterinários podem ter a sua tarefa complicada devido à ausência de
sintomas específicos e à presença de co-infecções (infecção por mais do que um parasita). A compreensão por parte
do clínico, da patogenia e imunologia das doenças transmitidas por vectores, é uma ferramenta essencial para o
diagnóstico rápido e preciso.
Sob o ponto de vista zoonótico, se por um lado os canídeos actuam como sentinelas de doenças, por outro, são
reservatórios de parasitas e importantes hospedeiros de transporte de vectores. Devido a isto um dos pontos fulcrais
da prevenção destas hemoparasitoses tanto nos nossos animais como em nós, passa pelo controlo de vectores.
Neste estudo foi realizado o rastreio de cinco doenças transmitidas por vectores, causadas pelos agentes: Ehrlichia
canis, Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia conorii, Babesia canis e Leishmania infantum. Este estudo incidiu
sobre uma população de um canil de Setúbal, no qual foram testados 80 cães (29 machos e 51 fêmeas) escolhidos
aleatoriamente. Os testes utilizados foram testes comerciais de imunofluorescência indirecta (IFI). Dos animais
testados 58,75% dos animais encontravam-se infectados (20% co-infectados e os 38,75% infecções únicas). As
prevalências de infectados pelas diferentes doenças foram: Rickettsia conorii (23,75%), Babesia canis (20%),
Ehrlichia canis (16,25%), Leishmania infantum (16,25%) e Anaplasma phagocytophilum (12,5%).
[Vector-born diseases in kennel dogs, a study in Setúbal (Portugal)]
Vector-borne diseases are caused by parasites, virus and bacteria, and transmitted through the bite of arthropods.
These diseases have a great zoonotic potential and affect dogs worldwide. The five diseases studied (Ehrlichiosis,
Babesiosis, Rickettsiosis, Anaplasmosis and Leishmaniasis) are included in this category of illness.
The pathogenesis, it‟s based mainly on the humoral response developed by the host, that being exaggerated and not
protective, causes symptoms similar to an autoimmune disease. Meaning, on the contrary to what might be thought,
is not the parasite itself that is responsible for all the symptoms, but the host‟s immune response to their presence.
Concerning the diagnosis, veterinarians can have their task complicated by the absence of specific symptoms and
the presence of co-infection (infection for more than a parasite). The understanding of the clinical, the pathogenesis
and immunology of vector-borne diseases, is an essential tool for rapid and accurate diagnosis.
From the zoonotic point of view, dogs act as sentinels of disease, and are important reservoirs of parasites and carry
vectors. Due to this, one of the key points for prevention of vector-borne diseases in animals and humans is vector
control.
In this study was performed the screening of five vector-borne diseases caused by the agents: Ehrlichia canis,
Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia conorii, Babesia canis and Leishmania infantum. This study focused on a
population of a kennel of Setúbal, in which 80 dogs (29 males and 51 females), randomly chosen, were tested. The
tests used were indirect fluorescence antibody (IFA) commercial. 58.75% of the animals tested animals were
infected (20% co-infected and 38.75% single infections). The point prevalence for different pathogens was:
Rickettsia conorii (23.75%), Babesia canis (20%), Ehrlichia canis (16.25%), Leishmania infantum (16.25%) and
Anaplasma phagocytophilum (12.5%).
137
Poster 19
Produção de ruminantes na região de Bafatá e Gabú - Guiné-Bissau
Vaz, Y.1, Nunes, T.1, Coté, M.2, Rosa, F.3
2 Direcção de Pecuária, Ministério da Agricultura e Pescas, República da Guiné-Bissau
3 Instituto de Investigação Científica Tropical/GeoDes, Lisboa, Portugal
Foi realizado um estudo sobre as condições de criação de bovinos e pequenos ruminantes em 20 tabancas (aldeias) da bacia do
rio Geba – Guiné Bissau, em 2010, com base em entrevistas aos criadores e da observação local.
A criação de bovinos tem como principal objectivo a disponibilidade de capital facilmente realizável para a resolução de
problemas familiares, em especial de saúde e a escassez de alimentos. A propriedade destes animais é em geral do chefe de
família, sendo que em alguns casos, foram indicados vários membros da família (incluindo mulheres), mas a decisão de venda ou
abate cabe, em última palavra, ao chefe de família.
Os animais são alimentados à base de pastoreio livre. Na época das chuvas (Maio a Outubro) os animais são mantidos nos matos
ao redor das tabancas ou em bolanhas (planícies alagadiças na margem de cursos de água) marginais não aproveitadas para
agricultura, sendo o pastoreio de pelo menos 8 horas, guardados por homens e por jovens. O abeberamento é feito em poças ou
lagoas naturais. Nos meses secos os bovinos e pequenos ruminantes aproveitam os restos agrícolas (em especial da cultura de
arroz) pastando nas bolanhas, sendo guardados por crianças e jovens. O abeberamento é feito em rio ou pelo fornecimento de
água do furo aos animais. Nesta época há algumas manadas que procuram novos pastos, a cerca de 2 dias de distância, sendo os
animais acompanhados pela família que se estabelece durante alguns meses na zona de pastoreio. Apenas 5 das tabancas visitadas
não apresentavam contactos entre os seus animais e de outras tabancas devido a movimentos transumantes.
O nascimento de animais acontece ao longo de todo o ano. A ordemha é realizada pelas mulheres, talvez com menos incidência
na época seca. O leite destina-se ao consumo familiar, após a ordenha ou fermentado e o excedente é comercializado. Os vitelos
são desmamados de forma natural, entre 1 a 2 anos de idade. A idade da fêmea ao primeiro parto é de 3 anos ou mais. Os machos
reprodutores são em geral criados na manada. 60% dos produtores compram fêmeas para criar.
Apenas 5 produtores abatem de bovinos para consumo. Os restantes abatem apenas em ocasiões festivas (casamentos, funerais,
festas religiosas, etc.). Todos os produtores vendem animais mas de forma ocasional e através de intermediários e os animais
vendidos são preferencialmente vacas velhas. Se for necessário, os machos podem ser vendidos também. O couro dos animais é
aproveitado só em 6 casos mas o estrume um subproduto valioso. A tracção animal é utilizada por 15 produtores; 6 também
alugam os animais e 3 emprestam às famílias que necessitam.
Questionados sobre os principais problemas da criação de gado, 7 indicaram mais do que um. Os mais frequentes foram: em 10 a
doença, 7 a falta de água, 5 a falta de alimentação, 5 o roubo de gado e 2 os conflitos com agricultores. O tratamento dos animais
é realizado com recurso plantas e a métodos tradicionais, sendo limitado o acesso a assistência veterinária. É praticada a
vacinação contra os carbúnculos hemático e sintomático, a pedido do produtor.
O sistema de produção de ruminantes nesta região da Guiné-Bissau é adaptado às condições ambientais e influenciado pela
sazonalidade e pelos ciclos de produção agrícolas.
Projecto financiado por FCT PTDC/SAU-ESA/72146/2006 “Dinâmica das doenças parasitárias emergentes de ecossistemas dulçaquícolas na
Bacia do Rio Geba (República da Guiné-Bissau) e suas repercussões em Saúde Pública”
[Ruminant production in the Bafatá and Gabú regions - Guinea-Bissau]
A study was carried out on the breeding conditions of bovines and small ruminants in 20 tabancas (villages) the Geba river basin
– Guinea-Bissau in 2010, based on interviews with the producers and locally collected data.
The main objective of bovine breeding is to assure the availability of capital to solve familiar problems, mainly health related,
and to secure food provision. The ownership of these animals is usually of the head of the family, but in some cases several other
members were mentioned (including women), but the decision to sell or cull is made by the head of the family.
The animals are feed on a free range system. In the rainy season (May to October), animals are kept in the bush areas surrounding
the tabancas or in marginal bolanhas (flooded areas in the river margins) not used for agriculture. Duration of grazing is of at
least 8 hours and animals are shepherded by man and teenagers. Watering is done in puddles or natural lagoons.
In the dry months, animal feeding is done mainly on stubble in the bolanhas (mainly from rice culture) being shepherded by
children and young man. Watering is done in the river or with water provided from a borehole. In this season some herds look for
new grazing areas, usually about 2 days distance, and animals are escorted by the family that establishes themselves in the
grazing area. Only 5 of the studied tabancas didn‟t had animal contact with other tabancas resulting from this transhumance.
Parturitions occurs all around the year. Milking is carried out by women, less in the dry season. Milk is used for family
consumption, right after milking or fermented. The remaining milk is marketed. Calves are weaned in a natural way between 1
and 2 years of age. The age of cows at the first calving is 3 years or more. Male breeding animals are kept from those born at the
herd; 60% of the producers buy females to breed.
Only 5 producers cull bovines for consumption. The remaining only cull in festive ocasions (marriages, burrials, religious
celebrations, etc). All the producers sell animals, but only seldom, and through intermediaries, and mostly old cows. If necessary
males might be sold too. The leather was used only by 6 farmers but the manure is a valuable byproduct. Animal traction is used
by 15 farmers; 6 of which also rent and 3 borrow them to other families.
When asked for the main animal breeding problems, 7 of them have mentioned more than one problem. The most frequent were:
disease (10), water provision (7), feeding (5), stealing of cattle (5) and conflict with farmers (2).
Treatment of sick animal is done with traditional methods and plants, being the access to veterinary assistance very limited.
Vaccination against Anthrax and Blackleg is applied sporadically, on farmers demand.
Ruminants production system in this region of Guinea-Bissau is well adapted to the environmental conditions and strongly
infuenced by seasonality and the agriculture production cycles.
138
Poster 20
Doenças por trematódeos emergentes de biótopos aquáticos na Bacia do Rio Geba (Guiné-Bissau)
Rosa, F.1, Crespo, M.V.2
1 Instituto de Investigação Científica Tropical/SocDes, Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
2 Escola Superior Agrária/Instituto Politécnico de Santarém, Portugal. Email: [email protected]
A localização geográfica e as características climáticas e geográficas da Guiné-Bissau permitem a instalação de
diversas populações de trematódeos, especialmente aqueles que estão dependentes de ambientes dulçaquícolas, onde
o ciclo de vida intramolusco e a transmissão aos hospedeiros vertebrados se processa, provocando infecções mais ou
menos severas no homem e nos animais.
Considerando os bovinos e as crianças, como bons indicadores da infecção por trematódeos, a pesquisa dos parasitas
incidiu em 482 amostras de fezes de bovinos, provenientes de 28 locais, e em 260 amostras de fezes e urina de
crianças de 10 povoações das regiões do Gabú e Bafatá, A eliminação parasitária foi evidenciada nas fezes a fresco
ou conservadas em formol a 5% por métodos quantitativos (técnica de McMaster) e qualitativos (técnicas de Willis
e sedimentação espontânea) e na urina após esforço das crianças por sedimentação espontânea.
Nos bovinos estudados, identificaram-se Dicrocoelium hospes, Fasciola gigantica, Paramphistomatidae,
Schistosoma bovis e Schistosoma sp., dos quais apenas o primeiro não depende de biótopos aquáticos. As
prevalências apresentaram uma grande variabilidade inter-anual e estacional, sendo superiores para os
paranfistomatídeos.
Nas crianças apenas se identificou Schistosoma haematobium, cujas prevalências foram superiores em crianças com
uma faixa etária superior a 10 anos de idade. De igual modo, observou-se uma grande variabilidade espacial na
distribuição da infecção por S. haematobium.
Os dados obtidos sobre os exames parasitológicos e o prévio conhecimento sobre os biótopos dos moluscos
dulçaquícolas, sugerem a existência de 20 focos de infecção para Paramphistomatidae, sete para S. haematobium,
dois para Fasciola gigantica e S. bovis, dos quais os primeiros são os que apresentam a maior distribuição nas
regiões de Bafatá e de Gabú e os que não estão directamente associados a colecções de água com escoamento
permanente.
Estes resultados apontam para uma grande disseminação destes parasitas relacionados com biótopos aquáticos nesta
área da Guiné-Bissau, e salientam a importância para a consciencialização da população, entidades sanitárias e
decisores para esta temática, considerando que as doenças provocadas por trematódeos sensum latum são
consideradas negligenciadas e o seu impacto em saúde humana e produção animal está sobrestimado, uma vez que
ocorrem em países em desenvolvimento, onde o acesso aos cuidados médicos e veterinários é muito difícil.
[Water related Trematoda diseases in River Geba basin (Guinea-Bissau)]
The geographic location, climatic and hydrographic characteristics of Guinea-Bissau allow the existence of diverse
trematoda parasites, specifically those dependent on freshwater environments, where the intra-mollusc life-cycle and
the transmission to vertebrate populations occur, causing more or less severe diseases in man and animals.
Considering cattle and children as a good biological indicatores of trematoda infections, parasites investigation was
performed in 438 cattle faeces samples, from 28 localities, and in 260 children faeces and urine samples, from 10
villages. The egg output was evidenced in faeces (fresh or preserved in 5% formaldehyde) by quantitative
(MacMaster techniques) and qualitative (Willis and spontaneous sedimentation techniques) and in children urine
after a physical effort by spontaneous sedimentation.
In the cattle studied, Dicrocoelium hospes, Fasciola gigantica, Paramphistomatidae, Schistosoma bovis and
Schistosoma sp., were identified, and just the first one is not related with freshwater habitats. The observed
prevalences showed a great inter-annual and seasonal variability, always higher for amphistoma infection.
Schistosoma haematobium was identified in children, with higher prevalence in children over 10 years old. A high
spatial variability of S. haematobium infection was also identified.
The available data on parasitological exams and previous knowledge on freshwater snail habitats in the study area
suggest the existence of 20 infection focus of Paramphistomatidae, seven of S. haematobium, two of Fasciola
gigantica and S. bovis. Paramphistomatidae is the most scattered throughout Bafatá and Gabú and not related with
permanent flowing water.
These results indicate a vast dissemination of these parasites related with freshwater habitats in this specific area of
Guinea-Bissau, and highlight the importance to raise awareness of population, health entities and decision makers
on this issue. Diseases caused by trematoda sensum latum are still neglected and their impact on human and animal
health is underestimated because they prevail in underdeveloped areas where access to medical and veterinary
services is difficult.
139
Poster 21
Identificação de espécies de Culicoides (DIPTERA:CERATOPOGONIDAE) referidas pela
primeira vez em Portugal Continental e no Arquipélago dos Açores por caracterização morfológica
no âmbito do Programa Entomológico Nacional de Língua Azul
Ramilo, D.1, Diaz, S.1, Pereira da Fonseca, I.1, Delécolle, J.-C.2, Wilson, A.3, Marques, C.1, Meireles, J.1,
Lucientes, J.4, Boinas, F.1
2 Laboratoire d‟Entomologie, Institut de Parasitologie et de Pathologie Tropicale, Faculté de Médecine, Strasbourg, France
3 Institute for Animal Health, Pirbright, Woking, Surrey, GU24 0NF, United Kingdom
4 Parasitología y Enfermedades Parasitarias, Departamento de Patología Animal (Sanidad Animal), Facultad de Veterinaria, Zaragoza, España
Objectivo: A Língua Azul é uma doença epizoótica com grande impacto económico e que ocorreu pela primeira vez
em Portugal Continental em 1956, tendo reemergido em 2004. O conhecimento das espécies de Culicoides
(DIPTERA:CERATOPOGONIDAE) presentes em Portugal é necessário para estabelecer medidas profiláticas
contra a propagação daquela doença e para avaliação do seu interesse epidemiológico. Neste trabalho é feita a
identificação de nove espécies de Culicoides observadas pela primeira vez em Portugal Continental e de quatro
espécies no Arquipélago dos Açores, num total de mais de 6000 colheitas.
Metodologias: No âmbito dum programa de vigilância entomológica, iniciado em 2005, utilizou-se armadilhas
luminosas (modelo CDC light trap miniatura, New Jersey) para a captura de insectos, em várias explorações com
gado bovino, ovino e caprino. Após triagem dos insectos do Género Culicoides com o auxílio de um microscópio
estereoscópico, foi feita a identificação das espécies, recorrendo à microscopia óptica composta, com base em
características morfológicas, tendo sido utilizadas várias chaves dicotómicas [Delécolle (1985), Rawlings (1996) e
Pena (2003)].
Resultados: Com base na morfologia e morfometria de várias estruturas corporais (asas, palpos, antenas,
espermatecas, entre outras), nove espécies de Culicoides foram identificadas pela primeira vez em Portugal
Continental (C. alazanicus Dzhafarov, 1961, C. bahrainensis Boorman, 1989, C. deltus Edwards, 1939, C. lupicaris
Downes & Kettle, 1952, C. picturatus Kremer & Déduit, 1961, C. santonicus Callot, Kremer, Rault & Bach, 1968,
C. semimaculatus Clastrier, 1958, C. simulator Edwards, 1939 e C. subfagineus Delécolle & Ortega, 1998) e quatro
espécies no Arquipélago dos Açores (C. newsteadi Austen, 1921, C. circumscriptus Kieffer, 1918, C. obsoletus
Meigen, 1818 e C. scoticus Downes & Kettle, 1952).
Este estudo contribui para um conhecimento mais completo deste vector e da fauna DIPTERA em Portugal. A
primeira identificação destas 13 espécies mostra que a sua dispersão para outras regiões de Portugal pode constituir
uma nova realidade epidemiológica e a sua adaptação ao nosso clima está relacionada com as mudanças climáticas
e/ou com o transporte pelo vento, entre outros factores.
Agradecimentos: Projecto “Vigilância Entomológica para o estudo da presença de insectos culicóides, vectores do vírus da Língua Azul em
Portugal” (DGV-FMV/UTL).
[First report of Culicoides (DIPTERA:CERATOPOGONIDAE) species in mainland Portugal and Azores
archipelago by morphological characterization within the scope of Bluetongue National Entomological
Program]
Objective: Bluetongue is an epizootic disease with a huge economical impact, which occurred for the first time in
mainland
Portugal
in
1956
and
re-emerged
in
2004.
The
knowledge
of
Culicoides
(DIPTERA:CERATOPOGONIDAE) species present in Portugal is necessary for the establishment of prophylactic
measures against the dispersion of Bluetongue and also for evaluation of their epidemiologic interest. In this work,
the identification of nine Culicoides species reported for the first time in mainland Portugal and four species in
Azores archipelago is made, in a total of more than 6000 collected samples.
Methods: Within the scope of a program of entomological surveillance, which started in 2005, miniature CDC light
trap, New Jersey model, were used for the capture of insects in different farms with cattle, sheep and goat. After
screening the insects belonging to the Culicoides Genus with stereoscope microscopy, species identification was
made with composed optical microscopy, using different identification keys [Delécolle (1985), Rawlings (1996) and
Pena (2003)].
Results: Based on morphology and morphometry of different body structures (wings, palps, antennae, spermathecae,
among others), nine species of Culicoides were identified for the first time in mainland Portugal (C. alazanicus
Dzhafarov, 1961, C. bahrainensis Boorman, 1989, C. deltus Edwards, 1939, C. lupicaris Downes & Kettle, 1952, C.
picturatus Kremer & Déduit, 1961, C. santonicus Callot, Kremer, Rault & Bach, 1968, C. semimaculatus Clastrier,
1958, C. simulator Edwards, 1939 and C. subfagineus Delécolle & Ortega, 1998) and four species in Azores
Archipelago (C. newsteadi Austen, 1921, C. circumscriptus Kieffer, 1918, C. obsoletus Meigen, 1818 and C.
scoticus Downes & Kettle, 1952).
This study has contributed for a more complete knowledge about this vector and the DIPTERA fauna in Portugal.
The first identification of these 13 species shows that their dispersion for other regions of Portugal can constitute a
new epidemiologic reality and their adaptation to our climate is related to climate changes and/or wind
transportation, among other factors.
140
Poster 22
Ocorrência de casos múltiplos de Tremor Epizoótico Atípico em rebanhos portugueses
Orge, L.1, Oliveira, A.2, Guedes Machado, C.1, Carvalho, R.1, Silva, J.1, Almeida, P.1, Tavares, P.1, Ochoa, C.1,
Lima, C.1, Tavares Santos, P.2 e Marques Pinto, M.J.2
2 Direcção Geral de Veterinária
De carácter endémico em muitas partes do mundo, o Tremor Epizoótico (TE), cujos primeiros relatos remontam a
meados do século XVIII, é considerado como o arquétipo das Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EETs).
Apesar de estudada desde o início do século XX, muitas questões referentes a esta doença permanecem por
esclarecer, nomeadamente no que concerne à sua forma atípica identificada pela primeira vez na Noruega e
designada por NOR98. Desde então, o TE Atípico foi encontrado em vários países europeus, nomeadamente em
Portugal cujo primeiro caso foi detectado em 2003. Esta afecção caracteriza-se por uma menor resistência à digestão
proteolítica dos seus isolados, os quais apresentam um perfil electroforético e lesional diferente do TE Clássico.
Além disso, observam-se também diferenças a nível epidemiológico, sendo ainda desconhecidos os seus métodos de
transmissão natural e a sua infecciosidade em condições de campo.
Na grande maioria dos países onde tem sido diagnosticado, o TE Atípico atinge, em regra, um animal por rebanho e
as medidas de controlo impostas variam muito, podendo incluir o abate compulsivo dos efectivos. Os dados
referentes à detecção de casos secundários desta doença são, até agora, muito limitados. Estudos franceses e alemães
demonstraram que, relativamente ao TE Clássico, mais de metade dos efectivos atingidos apresentam múltiplos
casos, enquanto que a forma atípica normalmente afecta apenas um animal por rebanho. No que se refere ao TE,
Portugal apresenta uma situação muito peculiar pois, ao contrário do que acontece no resto da Europa, verifica-se a
predominância da forma atípica sobre a clássica num elevado número de rebanhos. Por outro lado, vários efectivos
apresentam casos secundários de TE Atípico e foi também identificada a coexistência das duas formas desta EET
em dois rebanhos. Deste modo, entre 2008 e Junho de 2011, foram detectados no nosso país 46 casos secundários de
TE Atípico pertencentes a explorações com 1-4 animais afectados. Neste trabalho, será feita a caracterização (área
geográfica, dimensão, aptidão, raça, idade) dos rebanhos afectados com apenas um caso bem como dos que
apresentam casos múltiplos sendo também indicada a prevalência média desta doença. Uma vez que, em Portugal o
TE atípico é enzoótico, o conhecimento dos factores envolvidos no aparecimento de vários casos num mesmo
rebanho é importante a fim de permitir a adopção das medidas de controlo mais adequadas.
[Occurrence of multiple atypical scrapie cases within Portuguese flocks]
Scrapie, the archetypal TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathy) endemic in many parts of the world, is
known for more than 250 years and has been extensively studied since the beginning of the 20 th century. However,
several questions regarding this disease remain unanswered particularly those referring to the atypical form
identified for the first time in Norway and also known as NOR98. Since then, Atypical Scrapie has been found in
several European countries including Portugal. Atypical Scrapie shows some distinct characteristics when compared
to the classical form of this disease: its PrP res is less resistant to digestion by proteolytic enzymes and the
biochemical and lesional profiles are different. There are also differences regarding the epidemiological pattern
presented by Atypical Scrapie and its origin, degree of infectivity and methods of natural transmission are unknown.
Based on data from other countries with confirmed Atypical Scrapie cases, the most common situation is the
presence of one case per flock. The control measures enforced vary between countries, including stamping out.
However, data referring the detection of secondary cases are very limited. German and French studies have
demonstrated that, more than one case of Classical Scrapie was identified in over 50% of the affected flocks while
just one case of Atypical Scrapie was identified in more than 90% of the atypical positive flocks.
Regarding Scrapie, Portugal presents a particular situation, namely the predominance of the atypical form over the
classical in a large number of flocks. As a result of intensive surveillance of affected flocks between 2008 and June
2011, Atypical Scrapie was detected in 46 cohabitants with 1-4 cases per flock and the coexistence of the two forms
of the disease was observed in two flocks. The mean prevalence of Atypical Scrapie in both abattoir and fallen stock
streams of the active surveillance plan will be presented. Portuguese flocks with one and multiple Atypical Scrapie
cases will be characterized by the geographical distribution, size, type of production, breed and age.
As our studies revealed that Atypical Scrapie is enzootic and affects a high proportion of flocks, underscoring its
importance and understanding the factors for occurrence of multiple cases within a flock becomes a major goal in
order to choose the most adequate control measures.
141
Poster 23
Tipo e grau de parasitismo gastrointestinal em pequenos ruminantes do Concelho de Ponte de Lima
– dados preliminares
Silva, C.1, Dantas, M.2, Mateus, T.L.1
1 Escola Superior Agrária de Ponte de Lima, Instituto Politécnico de Viana do Castelo; [email protected]
2 Organização de Produtores Pecuários de Ponte de Lima, COOPALIMA
As parasitoses gastrointestinais constituem um factor limitante à produção de pequenos ruminantes na medida em
que geram perdas produtivas elevadas. Com este estudo pretendemos identificar o tipo e grau de parasitismo
gastrointestinal em pequenos ruminantes do Concelho de Ponte de Lima. No Concelho de Ponte de Lima existem
cerca de 800 explorações de pequenos ruminantes distribuídas por 49 freguesias. Entre Março e Junho de 2011
recolhemos amostras directas de fezes em 30 freguesias do Concelho. Optamos por colher uma amostra por cada 10
explorações existentes em cada freguesia, e no total, até à data, recolhemos 49 amostras. Para a pesquisa de parasitas
gastrointestinais, todas as amostras foram sujeitas a análises coprológicas qualitativas (método de Willis) e, por
indisponibilidade de equipamento, apenas a 9 amostras foram efectuadas análises quantitativas (método de Mac
Master). Em 40 (81,63%) das 49 amostras analisadas foram encontradas formas parasitárias, das quais 17 (42,50%)
constituíam infecções simples, 12 (30,00%) infecções duplas, e 11 (27,50%) infecções triplas. A frequência de
helmintes foi de 85%, tendo sido identificados ovos do tipo estrongilídeo, ovos dos géneros Nematodirus, Moniezia
e Capillaria. Em 25 (62,50%) das 40 amostras parasitadas foram identificados oocistos do género Eimeiria. Em
relação à intensidade da infecção (número de ovos por grama de fezes), e considerando Soulsby (1982), todas as
amostras apresentam infecções fracas já que o número de ovos por grama é inferior a 400, o que poderá estar
relacionado com as práticas profilácticas implementadas nas explorações. A realização deste estudo permitiu obter
uma informação importante sobre a actual situação de infecção parasitária intestinal dos pequenos ruminantes deste
Concelho, nomeadamente sobre o tipo de parasitas e de infecções predominantes.
[Type and degree of gastrointestinal parasitism in small ruminants from Ponte de Lima –
preliminary data]
Gastrointestinal parasites are a limiting factor of small ruminant productions because of the high production losses
they cause. The aim of this study is to identify the type and degree of gastrointestinal parasitism in small ruminants
from Ponte de Lima. In the municipality of Ponte de Lima, there are about 800 small ruminants farms spread over
49 places. Between March and June 2011 direct fecal samples were collected in 30 different places. We chose to
take a sample for every 10 existing farms in each place, and in total, to date, we collected 49 samples. For the study
of gastrointestinal parasites, all samples were analysed with a qualitative method (Willis method), and because of
equipment unavailability, only 9 samples were carried out quantitative analysis (Mac Master method). In 40
(81.63%) of the 49 samples were found parasite forms, from which 17 (42.50%) were single infections, 12 (30.00%)
double infections, and 11 (27.50%) triple infections . The helminths frequency was 85%, and they have been
identified strongyle-type eggs, Nematodirus, Capillaria and Moniezia eggs. In 25 (62.50%) of the 40 positive
samples we have identified Eimeiria oocysts. In relation to the intensity of infection (number of eggs per gram of
feces), and considering Soulsby (1982), all samples show weak infections since the number of eggs per gram is less
than 400, perhaps due to the efficiency of prophylactic programs ongoing This study allowed to obtain important
information on the current status of intestinal parasitic infection in small ruminants of this County, such as the type
of parasites and infections prevalent.
142
Poster 24
Estudo epidemiológico da hidatidose humana no Alentejo, Portugal, entre 2003 e 2009
Ribeiro, R.C.1,2, Nunes, T. P.2,3, Mira, G.3,4, Fontes, I.3,4, Pacheco, A.3,4, Cortes, H.1,3
1 Universidade de Évora, Largo dos Colegiais, Évora, Portugal
3 Grupo de Luta contra a Echinococcose/Hidatidose de Elvas e Alandroal
4 Hospital de Santa Luzia de Elvas
A hidatidose é uma zoonose causada pela forma larvar do cestode Echinococcus granulosus com importância em
zonas rurais onde factores de ordem económica, ocupacional e comportamental potenciam a manutenção do ciclo de
vida do parasita.
Portugal tem sido incluído entre os países hiperendémicos em hidatidose, mas este critério só é correcto para a
região do Alentejo. Este trabalho surge no curso de actividades efectuadas pelo grupo de luta contra a equinococosehidatidose dos concelhos de Elvas e Alandroal e tem como objectivos o cálculo da prevalência da hidatidose na
amostra em estudo e a avaliação de factores de risco para a doença.
Analizaram-se 451 inquéritos epidemiológicos e 799 resultados de dois testes serológicos usados, procedentes dos
trabalhos efectuados pelo grupo entre os anos de 2003 e 2009.
Os dados foram sujeitos a uma análise estatística descritiva e inferencial. Foram estimados dois valores de
prevalência aparente, um associado à testagem em paralelo dos três testes de diagnóstico usados (imagiologia e
serologia) e outro relativo ao diagnóstico serológico. Finalmente, foi avaliada a concordância entre os testes de
diagnóstico.
O valor estimado para a prevalência da hidatidose relativa à testagem em paralelo foi de 2,4% (95% de IC [0,99%;
3,81%]) e de 1% (95% de IC [0,31%; 1,69%]) quanto ao valor para a prevalência serológica, tendo em consideração
os critérios assumidos para a sua análise.
Os factores de risco foram “ter cães não desparasitados”, “ter ovinos”, “beber água de furo e poço”, “ser idoso” e
“ter cães no passado”.
Os resultados obtidos foram estatisticamente significativos. Assim, poderia ser considerado o retorno do programa
de controlo terminado em 1990. Para além de campanhas de educação sanitária, este programa teria como bases,
entre outros, a desparasitação gratuita dos cães domésticos e campanhas de controlo de populações de cães errantes.
[Epidemiological study of human cystic hydatid disease in Alentejo, Portugal, between 2003 and
2009]
Cystic hydatid disease is a zoonosis caused by the larval form of the cestode Echinococcus granulosus that have
great importance in rural areas where a whole range of economic, occupational and behavioral factors potentiate the
maintenance of the cycle of the parasite.
Portugal has been included among the countries hyper endemic in cystic hydatid disease, but this criteria is only
correct for the Alentejo region. This work arises in the course of the study undertaken by the group against
echinococcosis-hydatidosis of the counties of Elvas and Alandroal and aims to calculate the prevalence of cystic
hydatid disease and evaluating risk factors for this disease.
A total of 451 epidemiological surveys and 799 results of both serological tests used, originated from work carried
out by the group between the years 2003 and 2009, were analyzed.
The data were analyzed statistically. Two values of prevalence were estimated, one related with the parallel testing
of the three diagnostic tests (imaging and serology) and the other related only with serodiagnosis. Finally, it was
evaluated the agreement of the diagnostic tests.
The estimated value for the prevalence of cystic hydatid disease in parallel testing and the serological prevalence
were 2.4% (95% CI [0.99%, 3.81]) and 1% (95% CI [0.31%, 1.69%]) respectively, taking in consideration the
criteria assumed in the analysis.
Risk factors were “have not dewormed dogs”, “have sheep”, “drinking water of borehole and well”, “being old” and
“having had dogs”.
The results were statistically significant. So the return of the control program, which ended in 1990, should be
considered. The bases of the program would be free deworming of domestic dogs and control of stay dogs, in
addition to health education campaigns.
143
Poster 25
Adenocarcinoma Enzoótico Nasal dos Caprinos: Identificação do agente em Portugal
Luís, T., Carvalho, P., Monteiro, M., Mendonça, P., Martins, R.A., Ramos, F., Fagulha, T., Barros, S.C., Henriques,
M., Duarte, M., Fevereiro, M.
Laboratório de Patologia e Laboratório de Virologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
O adenocarcinoma nasal enzoótico (ENA) dos pequenos ruminantes é uma neoplasia contagiosa que tem como
agentes etiológicos os vírus do Tumor Nasal Enzoótico 1 e 2 respectivamente nos ovinos e nos caprinos (ENTV-1 e
ENTV-2). Estes vírus são facilmente transmitidos por contacto directo entre os animais e estão intimamente
relacionados com o retrovírus Jaagsiekte dos ovinos (JSRV). O ENA tem uma distribuição mundial e é responsável
por sérias perdas económicas, em grande parte associadas adificuldades respiratórias.
Neste trabalho, os autores descrevem um caso de ENA num rebanho de cabras em que alguns animais apresentavam
intolerância ao exercício, corrimento nasal e deformação dos ossos nasais. As cabeças de duas cabras com
deformação evidente dos ossos nasais foram submetidas a exame. A cavidade nasal e seios paranasais exibiam uma
massa branca neoplásica multilobulada gelatinosa que comprimia e destruía o tecido ósseo envolvente. O exame
histopatológico revelou um adenocarcinoma com proliferação das glândulas nasais com padrão tubular e / ou
papilar. As células apresentavam um formato colunar com material eosinofílico no seu pólo apical; os núcleos eram
redondos ou ovais e localizados na posição basal. O índice mitótico observado era baixo. A pesquisa de DNA
proviral de ENTV-2 no DNA extraído da massa tumoral foi realizada por PCR convencional e PCR em tempo real.
Este último método foi desenvolvido em nosso laboratório e tal como o primeiro é específico para ENTV-2
exógenos. As amostras testadas foram positivas a ENTV-2 pelos dois métodos. A especificidade do fragmento
amplificado correspondente à região da LTR foi confirmada por sequenciação. Para estudos filogenéticos, o gene
env foi amplificado e sequenciado. A análise da sequência nucleotídica deste gene revelou que a estirpe nacional
apresenta uma estreita relação com uma estirpe ENTV-2 de Espanha e em menor grau com outra de origem chinesa.
As lesões macroscópicas e histopatológicas assim como a análise das sequências nucleotídicas obtidas por PCR
confirmam a presença de ENTV-2 no tumor nasal dos caprinos submetido para estudo.
[Enzootic Nasal Adenocarcinoma of Goats: Identification of the agent in Portugal]
Enzootic nasal adenocarcinoma (ENA) is a contagious nasal neoplasm of sheep and goats caused by the Enzootic
Nasal Tumor Virus 1 and 2 (ENTV-1 and ENTV-2) respectively. These viruses are easily transmitted by direct
contact among animals in a flock and are closely related to the Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV). ENA has a
nearly world wide distribution and is responsible for serious economic losses mainly due to respiratory distress.
In this work, the authors report the detection of ENA in a flock of goats showing some exercise intolerance, nasal
discharge and nasal bone deformities. The head of two goats showing severe deformation of the nasal bone were
submitted for examination. The nasal cavity and paranasal sinus exhibited multilobulated gelatinous white neoplasic
mass that compressed and destroyed the surrounding bones. The histopathological examination revealed an
adenocarcinoma with proliferation of the nasal glands in a tubular and/or papillary pattern. The cells presented a
columnar shape with an eosinophilic material in their apical pole; their nuclei were round to oval and located in the
basal position. A low mitotic index was observed. The neoplasic tissue was supported by a scarce stroma.
Genomic DNA extracted from the tumor mass was examined for the presence of proviral ENTV-2 by hemi-nested
PCR described previously and by a real time PCR assay developed in our laboratory. These assays are specific for
the LTR of exogenous ENTV-2. Samples were PCR positive for ENTV-2, both by conventional and real time PCR.
The specificity of amplicons for exogenous ENTV-2 LTR and env gene was further confirmed by sequence
analysis. For phylogenetic studies a fragment of ENTV-2 env gene was amplified and sequenced. The nucleotide
sequence of the env gene revealed that the national strain is closely related to a ENTV-2 from Spain and more
distantly related to a Chinese strain.
The macroscopic and histopathological lesions observed confirm the clinical suspicion of ENA. The PCR results
and the sequence data confirm the presence of ENTV-2 in the tumor.
144
Poster 26
Estudo de caso: Surto de doença hemorrágica vírica (RHD) por variante antigénica em coelhos de
carne
Müller, A.1,2, Silva, E.1,3, Capucci, L.4 e Thompson, G.1,3
1 Departamento de Clínicas Veterinárias, ICBAS, Universidade do Porto, Portugal
2 Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica (UMIB), Universidade do Porto, Portugal
3 CIBIO, Universidade do Porto
4 OIE RHD Reference Laboratory Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardai ed Emilia Romagna – Brescia - Italy
Mortalidade súbita foi observada em Janeiro 2007 numa exploração cunícula comercial perto de Viseu no Norte de
Portugal. As fêmeas reprodutoras eram mantidas separadas em lotes de 200 animais e todas eram vacinadas contra a
doença hemorrágica viral (RHD) duas vezes por ano com uma vacina comercial inactivada. Inicialmente, a
mortalidade foi observada na secção de desmame, levando a que todos os animais de engorda fossem vacinados
imediatamente. No entanto, mortalidade continuou a afectar animais de todas as idades. Oito coelhos de engorda
foram submetidos a necrópsia e diagnóstico de RHD. Amostras de fígado obtidas mediante técnica asséptica e
processadas para RT-PCR e sequenciação parcial do gene da cápside maior VP60, hemaglutinação e caracterização
antigénica. Macroscopicamente todos os animais apresentavam lesões compatíveis com RHD. Foram obtidos
resultados positivos por RT-PCR em todas amostras. Duas amostras foram seleccionadas para sequenciação
nucleotídica. As sequências eram idênticas e foram denominadas “Viseu 2007” (Genbank HM450410). Na árvore
filogenética obtida por neighbor-joining, a sequência “Viseu 2007” agrupou com outras variantes antigénicas
(RHDVa). O alinhamento das sequências amino-acídicas deduzidas demonstrou 100% de identidade com sete
RHDVa descritas previamente em outros países, apesar de pelo menos 7 polimorfismos nucleotídicos silenciosos.
No teste da inibição da hemaglutinação segundo o protocolo da OIE, ambas as amostras apresentaram um título >
2560. A caracterização antigénica mediante um painel de anticorpos monoclonais produzidos contra RHDV e
RHDVa confirmaram que “Viseu 2007” é antigenicamente idêntico aos RHDVa. RHDV consiste em um serotipo
dividido em dois subtipos, RHDV e variantes antigénicas. Estes últimos foram detectados pela primeira vez em
1996 em Itália e Alemanha, mas sequências genéticas semelhantes foram detectadas na China já em 1985. Isolados
de RHDVa foram descritos a nível mundial. Aqui, que seja do nosso conhecimento, descrevemos a sua ocorrência
pela primeira vez em Portugal, relacionado a um surto de doença em cunicultura comercial. A origem do vírus
permanece desconhecida. É provável que tenha sido introduzido por fomites e movimentos animais e/ou humanos.
O coelho-bravo é considerado menos provável, já que variantes antigénicas ainda não foram detectadas nestes.
Vacinas convencionais são consideradas protectoras contra variantes antigénicas. A aplicação da vacina nas
unidades de engorda foi, provavelmente, demasiado tardia para induzir protecção.
[Case Report: Outbreak of rabbit haemorrhagic disease (RHD) caused by an antigenic variant in
meat rabbits]
Sudden mortality was observed in January 2007 in a commercial meat rabbit farm near Viseu in the North of
Portugal. The breeding does were kept separated in three lots of 200 animals. All females were vaccinated twice
yearly with a commercial inactivated vaccine against rabbit haemorrhagic disease (RHD). Mortality started in
weaned rabbits and RHD vaccination was immediately applied in all fattening units. However, mortality continued
affecting animals of all ages during the following days. Eight rabbits of the fattening unit were submitted for
necropsy and RHDV diagnosis. Liver samples were taken aseptically and further processed for RT-PCR and
sequencing of the partial major capsid gene VP60, haemagglutination and antigenic characterisation.
Macroscopically all animals presented hepatic and respiratory tract lesions compatible with RHD. Positive RT-PCR
results were observed in all samples. Two samples were selected for nucleotide sequencing. The obtained sequences
were identical and denominated “Viseu 2007” (Genbank HM450410). In the phylogenetic tree obtained by
neighbor-joining the sequence of “Viseu 2007” clustered together with other antigenic variants (RHDVa). The
alignment of the deduced amino acid sequence of “Viseu 2007” showed 100% identity with seven previously
described RHDVa from other countries, despite at least 7 silent nucleotide polymorphisms. In the haemagglutination
inhibition test according to the OIE protocol, both samples had a titer of > 2560. The antigenic characterisation
performed using a MAb panel produced towards RHDV and RHDVa confirmed that “Viseu 2007” is antigenically
identical to the RHDVa. To date, pathogenic RHDV are considered to pertain to one serotype, containing two
subtypes, RHDV and the antigenic variants. The latter were first detected in 1996 simultaneously in Italy and
Germany but similar genetic sequence were detected in China already in 1985. Up to now RHDVa isolates have
been described worldwide. Here, to our knowledge, we describe their occurrence for the first time in Portugal,
related to a disease outbreak in a commercial rabbitry. The origin of this virus remains unknown. Most likely it was
introduced by fomites or human and/or animal movements. Wild rabbits are considered less likely as variants were
not yet detected. Conventional vaccines are considered protective against antigenic variants. The application of the
vaccine in the fattening units was probably too late to induce protection.
145
Poster 27
Identificação morfométrica de larvas infectantes em cultura pura de estrongilídeos de equídeos
(Nematoda: Strongylidae)
Vila-Viçosa, M.J.1, Silva, L.2, Reis, A.2, Oliveira, M.3, Cortes, H.2
1 Escola de Ciências e Tecnologia. Laboratório de Parasitologia Victor Caeiro, Universidade de Évora
2 Escola de Ciências e Tecnologia. Laboratório de Parasitologia Victor Caeiro, ICAAM, Universidade de Évora
3 Escola de Ciências e Tecnologia. Departamento de Matemática, CIMA, Universidade de Évora
A identificação com caracteres morfométricos de larvas infectantes (L3) parasitas de equídeos das subfamílias
Cyathostominae e Strongylinae é essencial para o estudo da biologia, da patologia e conhecimento da resistência aos
antiparasitários de nemátodos responsáveis por infecções nos cavalos. As fêmeas dos parasitas em estudo foram
obtidas por desparasitação ou necrópsia e procedeu-se à sua identificação. Os ovos extraídos de cada uma das
fêmeas foram cultivados pela técnica de Mönning modificada, obtendo-se as larvas L3 ao fim de oito dias a
temperaturas entre 26 ºC a 28 ºC.
Para este estudo consideraram-se fêmeas das espécies: Craterostomum acuticaudatum, Poteriostomum
imparidentatum, Poteriostomum ratzii, Strongylus edentatus, Strongylus vulgaris, Triodontophorus brevicauda,
Triodontophorus serratus e Triodontophorus tenuicollis. Foi objectivo do presente trabalho determinar parâmetros
morfológicos a considerar na identificação morfométrica das espécies de Strongylidae de equínos supra-referidas.
Foram anotados os parâmetros morfológicos das larvas L3 como o comprimento total da larva (distância da
extremidade anterior até à extremidade da bainha), o comprimento do esófago, o poro excretor (distância do poro
excretor à extremidade anterior), a largura máxima (larva com bainha), o comprimento da cauda da larva (distância
do ânus à extremidade da caudada larva), o comprimento da cauda da bainha (distância do ânus à extremidade da
bainha) e a porção distal (distância da extremidade da cauda da larva à extremidade da cauda da bainha).
Testes não paramétricos e de comparação múltipla permitiram concluir que existem diferenças significativas entre
as espécies relativamente aos parâmetros morfométricos das mesmas. Recorrendo à regressão multinomial foi
possível identificar os parâmetros mais relevantes para a identificação morfométrica da espécie. O modelo que
melhor se ajustou considera como estatisticamente significativos os parâmetros: poro excretor, comprimento da
cauda da bainha, largura, esófago e porção distal. Contudo poderá ser necessário recorrer aos parâmetros menos
explicativos para uma identificação morfométrica mais ampla.
Os resultados obtidos permitem um maior conhecimento de larvas infectantes de estrongilídeos, melhorando o
trabalho laboratorial na identificação e controlo do parasitismo em equinos.
[Morphometric identification of infective larvae in pure culture of equine strongyles (Nematoda:
Strongylidae)]
Morphometric characters for the identification of infective larvae (L3) from Cyathostominae and Strongylinae
subfamilies, parasites of equine, are essential for the study of biology, pathology and antihelminthics resistance of
nematode parasites responsible for infections in horses. Females of the parasites in study were obtained by
deworming or necropsy. After parasitic identification eggs were collected from each female and were cultured by
modified Mönning technique, resulting in L3 larvae after eight days at temperatures between 26 ºC to 28 °C.
For the present work females from the following species were considered: Craterostomum acuticaudatum,
Poteriostomum imparidentatum, Poteriostomum ratzii, Strongylus edentatus, Strongylus vulgaris, Triodontophorus
brevicauda, Triodontophorus serratus and Triodontophorus tenuicollis. The objective of the present work was to
define morphological parameters to be considered in morphometric identification of Strongylidae of horses. L 3
larvae morphological parameters as, total length of the larvae (with sheath), length of esophagus, excretory pore
(distance from excretory pore to anterior end), maximum width (larvae with seath), sheath tail length (distance from
the anus to the sheath posterior end), larvae tail length (distance from the anus to the larvae posterior end)) and distal
portion (distance from tail end to sheath tail end) were registered.
Non parametric and multiple comparison tests allowed concluding that there are significant differences between
species relating to theirs morphometric parameters. Multinomial regression analyses permitted to identify the most
relevant parameters to specific identification. The most suitable model considers as statistically significant the
parameters: excretory pore, sheath tail length, body breadth, length of esophagus and distal portion. However it may
be necessary to refer to less representative parameters to accomplish wider morphometric identification.
These results allow a better knowledge of equine strongyles infective larvae and a better laboratory work to the
identification and control of parasitism in horses.
146
Poster 28
Principais boenças diagnosticadas no efectivo apícola nacional no último triénio
Valério, M.J. e Alvim, G.
Laboratório de Patologia, Serviço de Patologia Apícola, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
Email: [email protected] e [email protected]
As autoras pretendem com o trabalho realizado determinar a prevalência das principais doenças que afectaram o
efectivo apícola no último triénio a nível nacional, exceptuando o arquipélago da Madeira. Para tal, foram realizadas
6355 análises distribuídas pelos anos em causa do seguinte modo: 1543 em 2008, 2770 em 2009 e 2042 em 2010.
As amostras enviadas ao Laboratório Nacional de Investigação Veterinária incluíram abelhas adultas, favos de
criação e cartolinas que foram enviadas por várias entidades privadas e públicas e em alguns casos directamente
pelo apicultor.
As análises efectuadas pelo Serviço de Patologia Apícola do LNIV têm como base o Manual De Práticas da OIE e
alguns procedimentos internos tendo o estudo realizado concluído que a Varroose continua a ser a doença com
maior incidência e aquela que maiores danos causa ao apicultor seguindo-se a Nosemose.
É de extrema importância o diagnóstico precoce das doenças das abelhas, pois para além destas serem
frequentemente assintomáticas, provocam grandes perdas nas colónias estando assim directamente relacionadas com
potenciais impactos negativos sobre a polinização e o equilíbrio do meio ambiente.
[Bee Diseases in Portugal between 2009-2011]
The authors aim to determine the prevalence of the major diseases affecting bee hives in the last three years in
Portugal, except for the Madeira archipelago. Between 2008 and 2010 a total of 6355 analysis were performed: 1543
in 2008, 2770 in 2009 and 2042 in 2010. The samples included adult bees, honeycombs, creation and cardboards
which were sent to LNIV by various private and public entities and in some cases directly by the beekeeper.
At the Bee Pathology Service of the Pathology Laboratory from LNIV the analytical assays are carried out
accordingly to the OIE Manual and to internal operative procedures.
In the period 2009-2010, Varrosis remained the disease with higher incidence and thus responsible for most of the
damages inflicted to the beekeeper followed by Nosemosis.
An early diagnosis of bees‟s diseases is extremely important, because these are often asymptomatic and capable of
causing notable losses in the colonies that are directly related to a potential negative impact on pollination and
environmental balance.
147
Poster 29
Tuberculose bovina – a importância do exame histopatológico no diagnóstico diferencial em abates
de rotina
Carvalho, P., Mendonça, P., Monteiro, M.
Serviço de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
Os médicos veterinários deparam-se, no decorrer da inspecção sanitária de bovinos, com lesões
necróticas/necropurulentas localizadas sobretudo nos linfonodos da cabeça e da cadeia pulmonar. A determinação da
etiologia destas lesões é importante não só para o critério de inspecção como também para a detecção de animais
infectados provenientes de explorações ainda não assinaladas como tal.
No biénio 2009-2010 foram realizados 242 exames histopatológicos a amostras provenientes de vários matadouros e
enviadas ao Laboratório de Patologia do LNIV/INRB.
A observação microscópica revelou lesões de tuberculose em 58,67% das amostras. As restantes correspondiam, na
sua maioria, a lesões granulomatosas de etiologia diversa. Neste grupo destacam-se as lesões de
actinogranulomatose, os granulomas parasitários e as linfadenites necrotico-purulentas inespecíficas.
A coloração pelo método de Ziehl-Neelsen revelou-se um bom auxiliar no diagnóstico diferencial.
[The importance of the histopathological examination on the bovine tuberculosis differential
diagnosis in routine slaughter]
During meat inspection routine procedures veterinarians may find necrotic or necroticopurulent lesions on head or
pulmonary lymph nodes. A precise knowledge regarding etiology of these lesions is fundamental in order to assure a
correct sanitary decision as well as an adequate epidemiological control of bovine tuberculosis.
During 2009 and 2010 a total of 242 samples showing the above described lesions were submitted to
histopathological examination at LNIV. 58.67% of these exhibit characteristic Tuberculosis lesions while the
remaining showed other granulomatous lesions. The latter group included actinogranulomatosis, parasitic
granulomas and other non specified necropurulent lesions.
The Ziehl-Neelsen stain method was found to be a useful tool for the differential diagnosis.
148
Poster 30
Tuberculose em veados – Caracterização das lesões microscópicas
Mendonça, P., Carvalho, P., Albuquerque, T., Monteiro, M.
Serviço de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
A tuberculose nos veados é hoje uma realidade impossível de dissociar da tuberculose bovina.
Nos últimos anos a tuberculose provocada pelo Mycobacterium bovis tem sido diagnosticada em elevado número de
veados, os quais actuam como reservatórios para as outras espécies nomeadamente para os bovinos.
No período compreendido entre 2002-2010 foram recebidas 438 amostras de órgãos de veados no Laboratório de
Patologia do LINV/INRB, dos quais 251 (57,3%) apresentavam lesões microscópicas de tuberculose que eram
coincidentes com o isolamento de Mycobacterium bovis. Os órgãos mais afectados eram os linfonodos
mediastínicos, mesentéricos e o pulmão.
As lesões observadas nos linfonodos correspondiam tanto a granulomas idênticos aos da tuberculose bovina como a
abcessos de várias dimensões. As lesões pulmonares eram muito variáveis; no entanto, destacavam-se os
granulomas idênticos aos dos bovinos e uma forma difusa de pneumonia em que predominavam os macrófagos e as
células gigantes multinucleadas. É de realçar a existência de lesões nos brônquios e bronquíolos correspondentes a
formas abertas de tuberculose, as quais serão responsáveis pela disseminação do Mycobacterium bovis a outros
animais.
[Red deer tuberculosis - Description of microscopic features]
In the last few years tuberculosis caused by Mycobacterium bovis has been diagnosed in a high number of red deer
which can act as a reservoir to other species namely bovine.
From 2002 to 2010, 438 samples from red deer were received at Laboratory of Pathology of LNIV/INRB for the
confirmation of tuberculosis. 251 (57.3%) showed tuberculosis lesions and in most of them Mycobacterium bovis
was isolated. The most affected organs were the mediastinical lymph nodes, mesenteric lymph nodes and lungs.
The lymph node lesions were granulomas resembling those observed in bovine tuberculosis and different size
abscesses. The different aspects of lesions observed in lungs ranged from granuloma similar from those observed in
bovine tuberculosis to a diffuse form with predominance of macrophages and multinucleated giant cells. Some
granulomas observed in the lungs were adjacent to the bronquioles causing erosion of the wall and allowing the
passage of the necrotic material in to the lumen and by this way spreading Mycobacterium bovis to other animals.
149
Poster 31
Um caso de infestação parasitária intensa e múltipla num pombo selvagem (Columbia livia)
Coelho, C.1, Nóbrega, C.1, Santos, C.1, Cruz, R.1, Mesquita, J.1, Vala, H.1,2
1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal
Introdução: A prevalência da maioria das doenças parasitárias em aves parece ter reduzido significativamente
devido ao sistema de produção no interior de pavilhões e à melhoria das condições de higiene e gestão praticadas.
Contudo, as doenças parasitárias continuam a ter grande importância nos sistemas de produção tradicionais e ao ar
livre. O pombo (Columbia livia) é uma espécie produzida com acesso ao ar livre, encontrando-se desta forma mais
susceptível a infestações. O crescimento da população de pombos selvagens nos meios urbanos pode ser
determinante na infestação dos pombos domésticos, uma vez que, partilham os mesmos locais e o seu controlo
sanitário é mais difícil.
Objectivos: Com este trabalho pretende-se descrever um caso de um pombo que apresentava intensa infestação
parasitária, tendo sido esta a causa da morte, que incluía espécies parasitárias comuns e outras menos comuns.
Material e Métodos: Um cadáver de um pombo foi submetido ao serviço de necropsias do Laboratório de Anatomia
Patológica da Escola Superior Agrária de Viseu, tendo sido efectuado um exame post mortem detalhado,
procedendo-se à recolha minuciosa de várias amostras. Todas as amostras foram fixadas em solução de formol
neutro tamponado a 10%, durante um período máximo de 48 horas e processadas seguindo a técnica histopatológica
de rotina.
Resultados: No exame macroscópico foram observadas lesões arredondadas de cor vermelha na serosa do
proventrículo e congestão no pulmão.
No exame microscópico foi confirmada a congestão severa no pulmão, bem como a presença de numerosos
nemátodes, discutindo-se a hipótese de se estar perante um caso de Cyathostoma bronchialis (Muehlig 1884), tendo
em conta a localização. Os ovos observados nesta localização apresentavam casca grossa, formato oval, alguns
embrionados e 35-40 μm por 20-25 μm.
No lúmen das glândulas do proventrículo observaram-se nemátodes em corte transversal, numerosos ovos em forma
de barril, com pólos ovais, embrionados e 55 μm por 25 μm, aparentemente do género Tetrameres.
Conclusão: A elevada infestação parasitária no exemplar de pombo selvagem submetido à necropsia, com várias
espécies de parasitas, comuns e incomuns, a gravidade das lesões que conduziram à morte do animal, bem como o
facto de pombos selvagens parasitados favorecerem a dispersão do parasita para os pombos domésticos e outras aves
de produção, consistindo uma das maiores preocupações dos produtores, justifica o estudo de casos, ainda que
isolados, constituindo um alerta epidemiológico para as regiões onde surgem.
[A case of intense and multiple parasitic infestation in a wild pigeon (Columbia livia)]
Introduction: The prevalence of parasitic diseases in poultry seems to have significantly reduced due not only to the
intensive production system but also to the improving conditions of hygiene and management practiced. However,
parasitic diseases continue to have great importance in traditional production systems and production systems in the
outdoors, contributing significantly to productivity decline of these farms. The pigeon (Columbia livia), a specie
produced with outdoors access is more susceptible to infestations. The growing population of wild pigeons in urban
areas can be decisive in the infestation of domestic pigeons, since they share the same places and their sanitary
control is more difficult.
Objectives: The aim of this work is to describe a case of a pigeon (Columbia livia) with an intense parasitic
infestation, this being the cause of death, with common parasitic species and other less frequent.
Material and Methods: A cadaver of a pigeon was submitted to the necropsy of Anatomic Pathology Laboratory of
the Agrarian Superior School of Viseu, a detailed post mortem examination was carried out and samples were taken.
All samples were fixed in 10% neutral-buffered formalin, for a maximum of 48 hours and processed following the
routine histopathological technique.
Results: Gross examination lesions revealed rounded red lesions in the proventriculus serosa and lung congestion.
Microscopic examination confirmed severe lung congestion, with hemosiderosis and the presence of numerous
nematodes in cross section, discussing the hypothesis that it might be a case of Cyathostoma bronchialis (Muehlig
1884), taking into account the location or, less likely, an erratic parasite in histotropic migration phase. Eggs
observed at this location had thick shell, oval shape, some were embryonated and 35-40 μm in length by 20-25 μm
in width. In the lumen of the proventriculus glands, nematodes in cross section were also observed, noting numerous
barrel-shaped eggs, embryonated larvae, oval poles and 55 mm in length by 25 mm in width, apparently compatible
with parasites of the genus Tetrameres.
Conclusion: The high parasitic infestation of the wild pigeon specimen subjected to necropsy, with several, common
and uncommon, species of parasites, the severity of lesions, leading to death of the animal, as well as the fact that
infected wild birds favoring the spread of the parasite to the domestic pigeons and other poultry production,
consisting of a major concern for producers, justifies the study of isolated cases, even constituting an
epidemiological alert for the regions where they appear.
150
Poster 32
Nefrite intersticial em patologia aviária
Nóbrega, C.1, Coelho, C.1, Oliveira, A.L.1, Mega, A.C.1, Esteves, F.1, Vala, H.1,2
1 Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécnico de Viseu, Portugal;
Introdução: A nefrite intersticial ocorre frequentemente em aves, associada às mais diversas etiologias, de origem
infecciosa e não infecciosa. Nas nefrites de origem infecciosa, podemos destacar as de origem vírica, como o caso
da nefrite vírica aviária, doença de Newcastle, bronquite infecciosa e doença de Marek mas também nefrites de
origem bacteriana e parasitária. Como causas não infecciosas, podemos apontar a deposição de proteínas
inflamatórias no espaço glomerular que conduz a glomerulonefrite.
Para além disso, o pombo é uma ave que se encontra em franco crescimento nos meios urbanos e que pode ser
determinante na propagação de doenças a outras aves, incluindo as de produção. No entanto os estudos disponíveis
sobre o seu estado sanitário e a eventual interacção com outras espécies domésticas são actualmente muito escassos,
justificando cada vez mais o aprofundamento do estudo de casos nesta espécie.
Objectivos: Este trabalho pretende efectuar uma revisão actualizada do tema, usando como exemplos dois casos de
nefrite intersticial em aves, concomitantes com outras doenças comuns.
Material e Métodos: Dois pombos, com sintomatologia inespecífica de apatia e morte em poucas horas, foram
enviados ao Laboratório de Anatomia Patológica da Escola Superior Agrária de Viseu, para determinação da causa
da morte. Foi realizado o exame post mortem detalhado, tendo-se procedido à recolha minuciosa de várias amostras,
as quais foram processadas seguindo a técnica histopatológica de rotina.
Resultados: No exame macroscópico, apenas num dos casos foi observada ligeira congestão no rim. No exame
microscópico foi observada a presença de infiltrado inflamatório mononucleado no interstício renal num dos casos e
infiltrado inflamatório misto no outro. Concomitantemente, as aves apresentavam outras doenças comuns, distintas
em cada caso, discutindo-se o significado da presença de nefrite intersticial em aves como lesão inespecífica
secundária, associada a outras patologias ou específica e primária.
Conclusão: A presença da nefrite intersticial nas mais variadas patologias aviárias, levanta algumas questões,
nomeadamente a razão pela qual o rim é um órgão tão constantemente afectado. Em mamíferos, existem várias
alterações urinárias que afectam apenas o sistema urinário mas em aves a maior parte das patologias urinárias fazem
parte de processos multissistémicos.
Por outro lado, os casos de pombos com estados multisistémicos, e dado o seu papel de transmissores de doenças a
outras aves, constituem um elemento de estudo a valorizar na actualidade.
[Interstitial nephritis in avian pathology]
Introduction: Interstitial nephritis often occurs in birds, associated with diverse aetiologies, including infectious and
non-infectious ones. In the nephritis of infectious origin, we can highlight the viral origin, mainly avian nephritis
virus (AVN), but also Newcastle disease, infectious bronchitis and Marek's disease and also nephritis of bacterial
and parasitic origin. As non-infectious causes, we can point to the deposition of inflammatory proteins in the
glomerular space that leads to glomerulonephritis.
Moreover, pigeon are a growing specie in urban areas and their proximity with other birds, including poultry,
favours propagation of diseases, however available studies on its health status and its possible interaction with other
domestic specie are scarce, justifying increasingly deepening of cases in this species.
Aim: This work intends to make an update theme, using as examples two cases of interstitial nephritis in poultry,
concomitantly with other common diseases.
Material and methods: Two birds with unspecific signs of lethargy and death occurring few hours later, were sent to
the Laboratory of Pathology, Agrarian School of Viseu, to determine the cause of death. A detailed post-mortem
examination was carried out, samples were taken and processed following the routine histopathological technique.
Results: No remarkable gross lesions were observed unless a slight congestion in one kidney. Microscopic
examination revealed the presence of mononuclear cell infiltration in renal interstitium in one case and mixed
inflammatory infiltrate in the other. Concomitantly, the birds had other common diseases, different in each case,
discussing the significance of the presence of interstitial nephritis in birds as nonspecific secondary injury associated
with other pathologies or specific and primary.
Conclusion: The presence of interstitial nephritis in a variety of avian diseases raises some questions, including why
the kidney is so consistently affected. In mammals, there are several urinary pathologies that affect only the urinary
system, but in birds, although this situation also exists, most urinary disorders are part of multi-systemic conditions.
On the other hand, cases of pigeons with multisystem conditions, and given their role as transmitters of disease to
other birds, represent an element of value to study nowadays.
151
Poster 33
Comparação dos ritmos circadianos de pressão arterial e de frequência cardíaca em Rattus
norvegicus normotensos e espontaneamente hipertensos utilizando telemetria: influências
autonómicas em repouso
Gonçalves-Rosa, N., Geraldes, V., Tavares, C., Amaro-Leal, A., Cunha-Reis, D., Carvalho, M., Rocha, I.
Instituto de Fisiologia & Unidade de Sistema Nervoso Autónomo, Faculdade de Medicina e Instituto de Medicina Molecular, Lisboa, Portugal
Objectivos: Caracterização e comparação dos ritmos circadianos de Pressão Arterial (PA) e Frequência Cardíaca
(FC) de ratos normotensos (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). Determinação das influências do sistema
nervoso autónomo (SNA) sobre o controlo da PA e da FC com utilização de métodos espectrais de análise de sinal.
Métodos: Foram utilizados ratos WKY (n=7) e SHR (n=10) machos com 13 semanas mantidos a 25±1ºC e com 12
horas de luz diárias. Foram efectuadas microcirurgias de implantação dos sensores telemétricos na artéria aorta
abdominal. Após recobro completo, foram registados e analisados os sinais de PA e FC correspondentes a 72 horas.
Amostras obtidas em repouso (3 minutos das 13:00h do 8.º dia pós-cirurgia) foram analisadas através de Fast
Fourier Transform para quantificação das bandas LF (influência simpática) e HF (influência parassimpática).
Resultados: Observaram-se ritmos circadianos bem marcados da PA e da FC nas duas populações. Os maiores
valores de PA média foram registados nos períodos nocturnos quer nos WKY (111±3mmHg) quer nos SHR
(147±9mmHg). Os SHR apresentaram um padrão nocturno distinto dos WKY, com dois picos de PA média e de FC
ao invés de apenas um. A variação entre a PA média máxima (nocturna) e a PA média mínima (diurna) foi
significativamente superior (p<0,05) nos SHR (22±5,9mmHg) comparativamente com os WKY (16±4,7mmHg). Os
valores de LF, HF e relação LF/HF foram semelhantes dentro das respectivas populações. No entanto, os WKY
apresentaram valores de LF (6,47±2,59), HF (1,83±1,30) e relação LF/HF (4,23±1,42) significativamente superiores
aos valores obtidos nos SHR (LF=1,44±0,93; HF=0,74±0,30; LF/HF=2,12±1,08) para o mesmo período de tempo
analisado.
Conclusão: Foram determinados distintos ritmos circadianos de PA e FC em ratos WKY e SHR. Os valores mais
elevados de PA e FC foram verificados no período nocturno, o período de maior actividade física. Foi encontrada
uma variação significativamente maior entre a PA média mínima (diurna) e a PA máxima (nocturna) nos SHR
relativamente aos WKY. A relação LF/HF mais elevada em repouso nos WKY sugere que estes animais apresentam
uma maior influência do SNA simpático que os SHR no mesmo período. Os valores de potência espectral foram
diferentes para ambas as populações o que demonstra, tal como esperado, um diferente comportamento autonómico
para o sistema cardiovascular nas duas estirpes de ratos. Esta diferença evidencia a grande capacidade plástica do
SNA ao ser capaz de se remodelar de forma a garantir a homeostasia e a sobrevivência dos indivíduos.
[Comparison of circadian rhythms of blood pressure and heart rate between normotensive and
spontaneously hypertensive rats using telemetry: autonomic influences at rest]
Objectives: Characterization and comparison of circadian rhythms of blood pressure (BP) and heart rate (HR)
between normotensive rats (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR). Determination of the autonomic nervous
system (ANS) influences on the control of BP and HR, using spectral methods of signal analysis.
Methods: WKY rats (n=7) and SHR (n=10) males with 13 weeks were housed at 25±1ºC with 12 hours of light
daily. A microsurgery for the insertion of a telemetric sensor was performed in the abdominal aorta. After
completely recover, BP and HR signals corresponding to 72 hours were recorded and circadian rhythms
analyzed. Samples obtained at rest (3 minutes from 1pm, 8 days post-surgery) were analyzed using Fast Fourier
Transform to quantify the LF band (sympathetic) and HF band (parasympathetic).
Results: We observed well-defined circadian rhythms of BP and HR in both groups. The highest values of mean BP
were recorded at night for both WKY (111±3mmHg) and SHR (147±9mmHg). During night periods, SHR showed a
pattern distinct from WKY, with two peaks of mean BP and HR rather than just one. The variation between the
maximum mean BP (night) and minimum mean BP (daytime) was significantly higher (p<0.05) in SHR (22±5.9
mmHg) compared with WKY (16±4.7mmHg). The values of LF, HF and LF/HF ratio were similar within their
respective populations. However, WKY had values of LF (6.47±2.59), HF (1.83±1.30) and LF/HF ratio (4.23±1.42)
significantly higher than the values obtained in SHR (LF=1.44±0.93, HF=0.74±0.30, LF/HF=2.12±1.08) at rest.
Conclusion: We determined distinct circadian rhythms of BP and HR in WKY and SHR. The highest values of BP
and HR were observed during the night, period of increased physical activity. There was a significantly higher
variation between the minimum mean BP (daytime) and maximum BP (night) in relation to WKY SHR. The LF/HF
ratio at rest was higher in WKY suggesting that these animals have a greater influence of the sympathetic ANS than
in SHR at the same period. The spectral power values, different for both populations, show, as expected, a different
behavior for the Autonomic cardiovascular system in the two strains of rats. These differences highlight the great
plasticity of the ANS, which is able to reshape itself in order to ensure homeostasis and survival.
152
Poster 34
Modificação genética de regiões neurais simpáticas para o controlo crónico da hipertensão arterial
Geraldes, V.1, Gonçalves-Rosa, N.1, Paton, J.F.R.2, Rocha, I.1
1 Instituto de Fisiologia & Unidade de Sistema Nervoso Autónomo, Faculdade de Medicina e Instituto de Medicina Molecular, Lisboa, Portugal
2 School of Physiology & Pharmacology, Bristol Heart Institute, School of Medical Sciences, University Walk, University of Bristol, Bristol,
BS8 1TD, UK
Introdução: A actividade simpática é controlada por várias áreas do sistema nervoso central. As regiões simpatoexcitatórias mais referidas são o Núcleo Paraventricular do Hipotálamo (PVN) e a Face Rostroventrolateral do
Bulbo (RVLM). Dados anteriores demonstraram um aumento da actividade do PVN em hipertensos.
Objectivo: Deprimir cronicamente a actividade das regiões simpato-excitatórias (PVN ou RVLM) para controlar a
pressão arterial (PA) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR).
Métodos: Foram inseridos sensores telemétricos de PA na artéria aorta abdominal de ratos normotensos (WKY) e
SHR. Um vector viral (mistura de LV-TREtigh-Kir-cIRES-GFP 5,4x10E9 e LV-Syn-Eff-G4BS-Syn-Tetoff
6,2x10E9 numa proporção de 1:4), que promove a sobre-expressão de canais de potássio, foi microinjectado
(0,05μL) utilizando coordenadas estereotáxicas para ambos os locais nos dois grupos de ratos. A PA e a frequência
cardíaca (FC) foram avaliadas.
Resultados: Nos SHR, os valores basais para a PA sistólica, PA diastólica e PA média foram 159±17mmHg,
127±14mmHg, 137±14mmHg, respectivamente. A microinjecção do lentivirus em SHR no RVLM (n=3) e no PVN
(n=4) provocou uma diminuição na PA sistólica (9%, p=0,038; 13%, p=0,217), diastólica (12%, p=0,008; 17%,
p=0,113) e média (11%, p=0,013; 15%, p=0,136) entre 15 a 30 dias após a injecção.
Nos ratos WKY (n=3), a microinjecção do lentivirus no PVN provocou uma diminuição na PA sistólica (4%;
p>0,05), diastólica (7%; p=0,029) e média (6%; p=0,05) no mesmo período. A FC e o ganho do barorreflexo não se
alteraram significativamente nestes grupos de ratos (p>0,05).
Conclusão: Esses dados demonstram, pela primeira vez, que o PVN e a RVLM desempenham um papel importante
na determinação dos níveis de longo prazo da pressão arterial em ratos conscientes e, portanto, torna-os alvos
genéticos apropriados para controlar a PA.
[Genetic modification of the neural sympathetic regions to control hypertension chronically]
Introduction: Sympathetic activity is controlled by several areas of the central nervous system. The most referred
sympatho-excitatory regions are the Paraventricular Nucleus of the Hypothalamus (PVN) and the
Rostroventrolateral Medulla (RVLM). Previous data have shown an increase of PVN output on hypertension.
Objective: The aim of this study was to depress the activity of these sympatho-excitatory regions chronically (PVN
or RVLM) in order to control Blood Pressure (BP) in Spontaneously Hypertensive Rats (SHR).
Methods: In telemetry instrumented SHR and normotensive Wistar rats, a viral vector (mix of LV-TREtigh-KircIRES-GFP 5.4x10E9 and LV-Syn-Eff-G4BS-Syn-Tetoff 6.2x10E9 in a ratio 1:4) was microinjected (0.05µL) using
stereotaxic coordinates for both locations. BP and Heart Rate (HR) were evaluated.
Results: In SHR the basal values for systolic, diastolic and mean BP were 159±17mmHg, 127±14mmHg,
137±14mmHg, respectively. Microinjected SHR in RVLM (n=3) and in PVN (n=4) showed a decrease in systolic
(9% p=0.038; 13% p=0.217), diastolic (12% p=0.008; 17% p=0.113) and mean BP (11% p=0.013; 15% p=0.136)
between 15 to 30 days post-injection.
In Wistar rats (n=3) the lentiviral microinjection in PVN leads to a decrease in systolic (4%; p>0.05), diastolic (7%;
p=0.029) and mean BP (6%; p=0.05) in the same recording period.
The HR and baroreflex gain did not change significantly in these groups of rats (p>0.05).
Conclusion: These data show for the first time that the PVN and RVLM play a role in determining the long term
levels of BP in conscious rats and hence make them appropriate targets for genetic targeting to control BP.
153
Poster 35
Expressão das Citoqueratinas 7 e 20 em endométrio cíclico e na placenta de gata
Pires, M.A. 1, Santana, I.1, Saraiva, A.L.1,2, Cunha, M.1, Payan Carreira, R.1
1 CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. Email: [email protected]
2 Departamento de Ciências Veterinárias, Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal
A CK 7 é uma citoqueratina de 54kD que se encontra na maior parte dos epitélios ductais, glandulares e de transição
mas não no epitélio escamoso estratificado. A CK 20 é uma citoqueratina de baixo peso molecular (46kD) que é
apenas expressa no epitélio gastrointestinal, urotelial e células de Merkel. No endométrio da mulher foi descrita a
presença da CK7 mas não a da CK 20; a pesquisa combinada destas duas CK é usada para caracterizar neoplasias
com origem em distintos epitélios. O objectivo deste trabalho foi estudar a expressão das CK 7 e 20 no endométrio
cíclico e na placenta da gata e definir o padrão normal para estudos futuros em lesões uterinas. Usaram-se vinte
úteros de gata fixados em formol a 10% (10 em fase folicular-FF- e 10 em fase lútea-FL) e 6 amostras de placenta
com menos de 25 dias para marcação pela técnica de imuno-histoquimica indirecta da estreptavidina-biotina
peroxidase, tendo-se usado anticorpos anti-CK7 (policlonal, Eurodiagnostica®, diluído a 1:100) e anti-CK 20
(monoclonal, Biotech®, diluído a 1:100). Os níveis de intensidade (negativo, fraco, moderado e forte), foram
avaliados para cada estrutura epitelial do endométrio (epitélio superficial – SE; epitélio glandular superficial – SGE;
e epitélio glandular profundo – DGE). A placenta foi avaliada no trofoblasto (T), na interface materno-fetal (IMF),
nos cordões sinciciais (CS) e no epitélio glandular profundo.
Durante a fase folicular, o endométrio cíclico mostra uma imunoreactividade membranar forte para a CK7 em todas
as estruturas epiteliais, com reforço apical, enquanto que em FL o SE apresentou uma marcação membranar forte
com reforço apical e “blebbing”, apresentando o SGE e DGE uma positividade moderada. Em contraste, a CK20
apresentou uma intensidade de marcação sempre fraca no SE independente da fase do ciclo éstrico. O SGE
apresentou uma positividade fraca em FF e uma intensidade moderada em FL. O DGE apresentou um ligeiro
aumento de intensidade de marcação em ambos os estadios, mas sem ser uma intensidade tão marcada como o SGE.
Na placenta, a CK7 apresentou forte intensidade de marcação, expresso uniformemente na IMF e no DGE, enquanto
os CS mostraram uma positividade fraca, encontrada em apenas cerca de 25% das células presentes. O trofoblasto
apresentou reacção fraca para a CK7 e forte para a CK 20. A positividade para a CK20 foi moderada na IMF e DGE,
enquanto que os CS apresentaram fraca positividade.
Este estudo demonstrou que o útero da gata, em contraste com as observações realizadas em humanos, apresenta
expressão molecular de CK7 e de CK20, apresentando ligeiras modificações ao longo do ciclo. A expressão destas
moléculas é mantida no endométrio péri-implantação e ainda no trofoblasto em particular no que respeita à CK20.
[Expression of Cytokeratin 7 and 20 in cyclic feline endometrium and placenta]
CK 7 is a 54kD cytokeratin found in many normal ductal, glandular and transitional epithelia but not in the stratified
squamous. The CK 20 is a low molecular weight cytokeratin (46kD) that in normal tissues is only expressed in
gastrointestinal epithelium, urothelium and Merkel cells. CK7 has been reported in women endometrium but not
CK20. However, the combined detection of these CK has been used to characterize neoplastic lesions from different
epithelial types. This study aim to document the expression of CK 7 and 20 in healthy feline endometrium and
placenta that may be used in future studies on diseased endometrium. Twenty formalin-fixed feline uterus (10 each
for the follicular and luteal stages) and 6 pregnancy samples were used in a immunohistochemistry approach with
antibodies against CK7 (polyclonal antibody, Biotech®, diluted at 1:100) and CK 20 (monoclonal antibody,
Eurodiagnostica®, diluted at 1:100), using an indirect streptavidin-biotin peroxidase technique. Scoring intensity
(negative, weak, moderate or strong) was recorded for each epithelial structure on the normal endometrium (surface
epithelium - SE; superficial glandular epithelium - SGE; and deep glandular epithelium – DGE). The placenta was
scored at the trophoblast, the embryo–maternal interface, the syncytium cords and at the basal glandular epithelium.
In the cyclic endometrium, CK 7 showed similar strong membranar intensity in all epithelial structures, during the
follicular stage, with apical reinforcement, whilst in the luteal stage, the SE presented a stronger membrane labelling
with apical reinforcement and blebbing, with the glandular epithelia showing moderate membranar intensity of
staining. In contrast, CK 20 was found to present a weak immunostaining in the SE, regardless of the stage of the
oestrous cycle. In addition, SGE showed weak positivity during the follicular stage. However, this epithelium
showed moderate intensity in the luteal stage, although the DGE tend to show a slight decrease in the intensity of
immunolabelling during both stages.
In the placenta, CK 7 present strongest positivity, uniformly expressed in the embryo–maternal interface and in
DGE, while the syncytium cords showed a weak reaction, which was only found in only 25% of the cells. The
trophoblast cells showed weak and a strong reaction against CK7 and CK20, respectively. Positivity to CK 20 was
found to be moderate at embryo–maternal interface and DGE, whereas the syncytium cords showed weak intensity
scores. This study showed the expression of CK 7 and 20 in cat endometrium, in contrast to the described in woman,
with slight variations with the cycle stage. This CK expression is maintained in the peri-implantation endometrium
and in trophoblast, in particular on what concerns CK20.
154
Poster 36
Caracterização do sarcoma do timo em juvenis de corvina (Argyrosomus regius) produzidos em
cativeiro
Soares, F., Ribeiro, L., Barata, M., Pousão-Ferreira, P.
INRB IP / IPIMAR, Estação Piloto de Piscicultura de Olhão, Portugal. Email:[email protected]
A corvina (Argyrosomus regius) é uma espécie produzida recentemente em aquacultura em Portugal, com produções
ainda pouco significas que rondaram as 44 toneladas em 2010. A produção desta espécie encontra-se longe de estar
optimizada, assim no IPIMAR, no âmbito do projecto AQUACOR (Programa Promar), têm sido realizados ensaios
que visam o melhoramento da sua produção. Num dos ensaios efectuados com juvenis de corvina, cerca de 3,6% da
população desenvolveu proliferações sarcomatosas a nível do timo. Com este trabalho pretende-se caracterizar em
termos morfológicos e histólogicos esta estrutura.
Os juvenis de corvina apresentavam um peso médio de 75,9 ± 2,9 g e foram produzidos em tanques de 1 m3 a uma
temperatura média de 18 ± 0,8 °C, a uma densidade de 5,5 kg/m3, tendo sido alimentados duas vezes por dia ad
libidum.
Foram amostrados e sacrificados 10 exemplares de corvina com esta proliferação sarcomatosa, aos quais foi extraído
e amostrado o sarcoma. Para caracterização histológica as amostras foram fixadas em Bouin, tendo sido
posteriormente efectuados cortes de 4 µm de espessura que foram corados com Hematoxilina-Eosina.
A formação sarcomatosa observada a nível do timo cresce a partir do quadrante superior do arco branquial, forçando
a abertura do opérculo. Caracteriza-se por ter forma circular, lateral ou bilateral, denso e avermelhado, com diâmetro
variável, entre 0,8 ± 0,4 cm e 1,1 ± 0,3 cm. Em termos histológicos, são observadas áreas de necrose discreta,
compatível com proliferação sarcomatosa, possivelmente associadas a um processo inflamatório.
Desde que foi diagnosticado este problema a nível do timo não se registou mortalidade associada a este quadro
sintomatológico. No entanto o crescimento dos juvenis reduziu-se ligeiramente sugerindo que a presença do
sarcoma pode afectar a condição dos peixes.
[Chracterization of thymus sarcoma observed in meagre juveniles (Argyrosomus regius) produced
in captivity]
Meagre (Argyrosomus regius) is a species already produced in Portugal but low production values still obtained (44
TON in 2010). In order to optimize and increase the production of this species it is important to conduct
multidisciplinary research, in order to achieve knowledge on meagre, which is the purpose of AQUACOR project
(Promar). During a trial with meagre juveniles under experimental conditions, 3.6% developed a sarcomatous
proliferation in the operculum area. This work aims to characterize morphologically and histologically this structure.
Meagre juveniles (75.9 ± 2.9 g average individual weight) developed a sarcomatous proliferation in the operculum
area. Fish were maintained in 1m3 tanks at 18 ± 0.8 °C, at a density of 5.5 kg/m3 and being fed twice a day ad
libidum.
Ten juveniles were sacrificed and sarcoma was sampled for morphological and histological analysis. Sarcoma was
collected, photographed, measured, fixed in Bouin and routinely processed for light microscopy. Transversal 4 µm
thick sections were stained with Haematoxylin-Eosin.
The sarcoma was located in the upper quadrant of each branquial chamber just under the operculum. From the 10
fish 8 exhibited a bilateral sarcoma, dense and reddish. Sarcoma diameter ranged from 0.8 ± 0.4 cm to 1.1 ± 0.3 cm.
The histological sections showed areas of discrete necrosis, compatible with a sarcomatous proliferation, associated
to a secondary inflammation.
No mortality was associated to sarcoma in this study. Although not significantly, growth was slightly depressed
suggesting that sarcoma was affecting fish condition.
155
Poster 37
Expressão génica de enzimas reguladoras do metabolismo intermediário de ovinos submetidos a
restrição alimentar
van Harten, S.1, Brito, R.1, Almeida, A.M.1, Scanlon, T.2, Kilminster, T.2, Milton, J.3, Greeff, J.C.2, Oldham, C.2 e
Cardoso, L.A.1
1 Instituto de Investigação Científica Tropical, Lisboa e CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
2 DAFWA - Department of Agriculture and Food Western Australia, Perth, WA, Australia
3 University of Western Australia, Perth, WA, Australia
O efeito da restrição alimentar sobre a expressão génica de enzimas reguladoras do metabolismo intermediário foi
estudada em duas raças de ovinos machos (Merino Australiano e Dorper) submetido a dois tratamentos nutricionais:
restrição alimentar (80% das necessidades diárias de manutenção) e controlo (alimentação ad libitum), durante 42
dias. Os animais experimentais foram divididos em quatro grupos, n = 12 (Merino Australiano controlo, Merino
Australiano Restrito, Dorper controlo e Dorper restrito). Após o ensaio, os animais foram submetidos a eutanasia e
as amostras foram retiradas do fígado para quantificar os níveis de glicose e expressão génica de enzimas relevantes
do metabolismo intermediário (Fosfofrutocinase, Piruvato cinase, Carboxicinase fosfoenolpiruvato, Frutose 1,6bisfosfatase, Glicose-6-fosfatase, Glicogénio sintase, Sintase de ácidos gordos, Glutamato desidrogenase e
Carbamoíl-fosfato sintase), por meio de PCR em Tempo Real. Os Merinos australianos mostraram
comparativamente aos Dorper uma maior redução de peso corporal no grupo restrito (15,3% para o Merino
Australiano e 7,5% para Dorper). Os animais Dorper restritos revelaram uma diminuição significativa sobre o grupo
controlo na transcrição da Fosfofrutocinase (1,95 vezes) e do Piruvato cinase (2,26 vezes). A gluconeogénese não
mostrou nenhuma alteração nos animais em restrição alimentar em ambas as raças. A alimentação restrita não
induziu nenhuma alteração na expressão do glicogénio sintase nos ovinos Merino e produziu uma diminuição neste
parâmetro (0,39 vezes) em animais Dorper, mostrando nestes últimos uma homeostase facilitada da glicémia no
grupo de restrição alimentar. A expressão da Sintase de ácidos gordos respondeu de igual forma, em ambas as raças
experimentais, à condição restrita (redução). A expressão do Glutamato desidrogenase diminuíu apenas nos animais
Dorper restritos (1,84 vezes), indicando uma redução do catabolismo de aminoácidos nesses animais. A Carbamoíl
fosfato sintase mostrou uma diferença significativa nas raça dos animais experimentais com valores mais elevados
nos ovinos Dorper, indicando uma síntese de ureia facilitada nesta raça. A restrição alimentar induziu uma
diminuição no nível de glicose hepática em ovinos Merino, enquanto que este parâmetro foi mantido nos animais
Dorper.
Estes resultados mostram uma melhor adaptação metabólica de enzimas reguladoras do metabolismo intermediário e
produção de glicose hepática dos ovinos Dorper à restrição alimentar, o que está de acordo com os resultados de
peso corporal nos grupos experimentais
[Gene expression of regulatory enzymes involved in the intermediate metabolism of sheep subjected
to food restriction]
The effect of food restriction on gene expression of regulatory enzymes of intermediary metabolism was studied in
two breeds of male sheep (Australian Merino and Dorper) subjected to two nutritional treatments: food restriction
(80% of daily maintenance requirements) and control (ad libitum feeding), during 42 days. The experimental
animals were divided into four groups, n=12 (Australian Merino Control, Australian Merino Restriction, Dorper
Control and Dorper Restriction). After the trial, the animals were euthanized and samples were taken from liver
tissue to quantify glucose levels and gene expression of relevant intermediary metabolism enzymes
(Phosphofrutokinase, Pyruvate kinase, Phosphoenolpyruvate carboxykinase, Fructose 1,6-bisphosphatase, Glucose6-phosphatase, Glycogen synthase, Fatty acid synthase, Glutamate dehydrogenase e Carbamoyl phosphate
synthase), through Real Time PCR. Australian Merino showed over Dorper sheep an increased body weight
reduction in the food restricted group (15.3% for the Australian Merino and 7.5% for Dorper). Dorper restricted
food animals revealed a significant decrease over controls in the transcription of Phosphofrutokinase (1.95 fold) and
of Pyruvate kinase (2.26 fold), glycolytic enzymes. The gluconeogenesis showed no change in the food restricted
animals in both breeds. Restricted feed did not induced a Glycogen synthase expression change in Merino sheep and
produced a decrease in this parameter (0.39 fold) in Dorper animals, showing in the latter animals a facilitated
glycemia homeostasis in the food restricted group. In both experimental breeds, Fatty acid synthase expression
responded equally in the restricted condition (decrease). Glutamate dehydrogenase expression was decreased only in
the Dorper restricted animals (1.84 fold) indicating a reduced catabolism of aminoacids in these animals. Carbamoyl
phosphate synthase showed a breed difference in the experimental animals with higher values in the Dorper sheep,
indicating a facilitated urea synthesis in this breed. Food restriction induced a decrease in the hepatic glucose level
in the Merino sheep, whereas this parameter was maintained in the Dorper animals.
These results show a better adaptation of metabolic intermediate regulatory enzymes and hepatic glucose production
of Dorper sheep to food restriction which agrees with the body weight results in the experimental groups.
156
Poster 38
Efeito do isómero conjugado trans-10, cis-12 do ácido linóleico na maturação in vitro de oócitos
bovinos e na sobrevivência dos embriões produzidos à criopreservação
Sousa, C.1,3, Marques, C.C. 1, Vasques, M.I.1, Baptista, M.C.1, Horta, A.E.M.1, Pereira, R.M.L.N.1,2*
1 Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal. *Email:
[email protected]
3 Escola Superior Agrária de Coimbra, Intituto Politécnico de Coimbra, Portugal
O objectivo deste trabalho, foi avaliar o efeito da suplementação de isómero conjugado trans-10 cis-12 do ácido
linoleico (CLA) durante a maturação in vitro de oócitos bovinos, na maturação oocitária e no desenvolvimento e
resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Foram realizadas 15 sessões de produção in vitro de
embriões bovinos. Em cada sessão, os oócitos foram cultivados durante 22-24h com 100 µM CLA (grupo CLA,
n=1162) ou sem suplementação (grupo controlo, n=1187) e avaliados o conteúdo lipídico e as taxas de maturação
aparente e nuclear. Em ambos os grupos, 22h após a inseminação, os zigotos foram transferidos para monocamadas
de células da granulosa onde permaneceram em co-cultura até aos 7-8 dias (D7/D8). Alguns embriões transferíveis
foram vitrificados e descongelados para avaliação das taxas de re-expansão e de eclosão. As taxas de maturação dos
oócitos e de produção de embriões não diferiram (P>0,05) entre grupos. Os oócitos do grupo CLA caracterizaram-se
por um menor (P=0,0001) conteúdo lipídico, apesar de apresentarem gotículas lipídicas de maiores dimensões
(P<0,0001), originando embriões D7-D8 de qualidade superior (P=0,05). A taxa de re-expansão dos embriões após
congelação/descongelação foi de 100% em ambos os grupos. Após 24h de cultura, os embriões do grupo CLA
continuavam todos expandidos, enquanto que os do grupo controlo apresentavam uma taxa de expansão de apenas
50%. A taxa de eclosão às 72h foi 33,3% para os embriões do grupo CLA e 0% do controlo. Em conclusão, o CLA
diminui a deposição lipídica no citoplasma de oócitos bovinos, não interfere nas taxas de maturação ou de produção
de embriões, mas parece melhorar a qualidade e resistência dos embriões à criopreservação.
[Effect of trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid isomer on bovine oocyte in vitro maturation and
embryo cryosurvival]
The objective of the present study was to evaluate the effect of trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid isomer
(CLA) culture medium supplementation on in vitro bovine oocyte maturation, embryonic development, their quality
and resistance to cryopreservation. Fifteen sessions of in vitro embryo production were performed. In each session,
oocytes were cultured for 22-24h with 100 µM CLA (CLA group, n=1162) or without supplementation (Control
group, n=1187). Samples of oocytes were used for apparent and nuclear maturation rates and lipid content
evaluation. In both groups, 22h after insemination zygotes were transferred to a granulosa cells monolayer where
they developed in co-culture until day 7-8 (D7/D8). Some transferable embryos were vitrified and warmed. The rate
of re-expansion and hatching of frozen/warmed embryos were assessed. There were no differences (P>0.05) in the
rates of oocyte maturation between groups. Oocytes cultured in CLA supplemented medium had a lower (P=0.0001)
lipid content although presenting larger lipid droplets (P<0.0001). Equally, there were no differences in embryo
production rates between groups, but the quality of D7-D8 embryos was higher in CLA group (P=0.05). The reexpansion rate of frozen/warmed embryos was 100% in both groups, but after 24h of culture, all CLA embryos
remained expanded while only 50% were expanded in Control group. At 72h post warming, the hatching rate was
33.3% in CLA group, whereas in Control no one hatched. In conclusion, CLA decreases lipid deposition in bovine
oocyte cytoplasm, has no effect in maturation or embryo production rates, but seems to improve embryo quality and
resistance to cryopreservation.
157
Poster 39
Métodos naturais para uma produção limpa e verde de pequenos ruminantes
Cavaco-Gonçalves, S.*, Baptista, M.C., Barbas, J.P., Mascarenhas, R.
Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
*
Email: [email protected]
Por todo o mundo os consumidores exigem cada vez mais os chamados produtos clean, green and ethical, o que se
traduz pelo recurso a práticas produtivas que minimizem ou evitem a utilização de químicos ou hormonas e que não
comprometam o bem-estar dos animais. Em muitos países estas exigências têm sido convertidas em imposições
legais. A nível nacional, o Dec-Lei nº 185/2005 de 4/Nov, transpôs para a ordem jurídica nacional as Directivas
Europeias n.º 96/22/CE de 29/Abr e nº 2003/74/CE de 22/Set, relativas à proibição de utilização de certas
substâncias com efeitos hormonais ou tireostáticos e de substâncias beta-agonistas em produção animal. Assim, face
às novas exigências, é necessário que a produção animal seja suportada por programas de I&D que aprofundem o
conhecimento da fisiologia e do comportamento animal, permitindo que as novas práticas aumentem a
produtividade dos sistemas de produção.
A nossa actividade tem-se focado nos sistemas naturais de controlo que os animais utilizam em resposta às
alterações ambientais de forma a assegurarem o sucesso reprodutivo. No nosso país, a actividade reprodutiva dos
pequenos ruminantes está tão intimamente relacionada com a disponibilidade alimentar, quanto com o fotoperíodo,
podendo ser ainda complementada através de estímulos sócio-sexuais. A utilização destes estímulos (efeito macho),
associada ou não à manipulação do fotoperíodo, permite o controle reprodutivo pela indução de ovulações
sincronizadas. A suplementação alimentar durante períodos precisos do ciclo reprodutivo permite controlar eventos
particulares, nomeadamente a fecundidade, através de um efeito directo sobre o ovário.
Actualmente, participamos num projecto de I&D (FLOCK-REPROD) apoiado pela UE, que tem como objectivo
desenvolver tecnologia inovadora, economicamente viável e amiga do ambiente (sem hormonas), que permita o
controlo da reprodução e da IA em caprinos e a produção de leite e queijo durante todo o ano. Assim, o efeito macho
está a ser utilizado combinado quer com tratamentos luminosos (dias longos e curtos artificiais), quer com a
suplementação nutricional em momentos determinados do ciclo reprodutivo, com o objectivo de obter um elevado
nível de sincronização do estro, optimizando as condições da IA. Os primeiros resultados mostram que o efeito
macho é uma técnica não-farmacológica promissora, alternativa ao uso de hormonas, para a indução e sincronização
do estro em algumas raças de cabras. Dependendo da raça e da época do ano, poderá ser necessária a utilização de
tratamentos luminosos para optimizar a resposta ao efeito macho.
[Natural methods for a clean and green production of small ruminants]
Consumers worldwide are demanding for the so called “clean, green and ethical” products, which require production
systems that minimize or completely avoid chemical or hormones, and respect animal welfare. In many countries,
these demanding are now legal impositions. Council directives concerning the prohibition on the use in
stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action, and of beta-agonists (96/22/CE,
29/April; 2003/74/CE, 22/Sep), were already transposed into Portuguese legislation (Law 185/2005, 4/Nov). To
improve the productivity of animal production systems by these new practices, R&D programs deepening the
understanding of animal physiology and behaviour are needed.
Our R&D activity has been focused on the natural control systems that animals use to cope with environmental
changes to ensure reproductive success. In Portugal, reproductive activity of small ruminants is related to food
availability as much as to seasonal changes in photoperiod, being social-sexual interactions able to manipulate it too.
The use of these interactions (male effect), associated or not to the photoperiod manipulation, allows the control of
the time of reproduction by the induction of synchronized ovulations. With the use of strategic nutritional
supplements -focus feeding- particular reproductive events can be controlled, namely fecundity through a direct
effect on ovary.
In the present moment we participate on a European R&D project (FLOCK-REPROD) that is trying to develop an
innovative and sustainable technology to ensure the hormone-free production of goats‟ milk and related products, all
year round. The male effect is being used, in association to light treatments (short and long days) or to focus feeding
on particular timings of reproductive cycle, trying to obtain a high level of oestrus synchronization, and optimizing
AI. The first results show that the male effect is a very promising non-pharmacological alternative to the use of
hormones for inducing and synchronising oestrus in some breeds of goats. Depending on the breed and/or the time
of the year, a photoperiodic treatment of the females and/or the males might be necessary to optimize the response to
the male effect.
158
Poster 40
Caracterização da inseminação artificial em ovinos de raça saloia
Barbas, J.P.*, Marques, C.C., Baptista, M.C., Mascarenhas, R.M., Pereira, R.M., Cavaco Gonçalves, S., Vasques,
M.I., Horta, A.E.M.
Unidade de Recursos Genéticos, Reprodução e Melhoramento Animal, INRB IP / L-INIA, Fonte Boa, Vale de Santarém, Portugal
*Email: [email protected]
Este trabalho realizado com ovinos de raça Saloia pretendeu determinar a fertilidade (FERT) individual e respectivo
coeficiente de variação (CV) em carneiros utilizados na inseminação artificial (IA) avaliando-se: 1) efeito da época
de IA com sémen refrigerado (SR), 2) efeito da época de congelação de sémen (SC), 3) efeito do tipo de sémen (SR
vs SC) utilizando os mesmos carneiros e 4) FERT de todos os carneiros utilizados na IA com SR e SC. A FERT
individual de cada carneiro foi determinada através dos partos registados. Nestes estudos todas as ovelhas foram
sincronizadas com esponjas vaginais (30 mg FGA) durante 12 dias e no momento da sua retirada (Rev) foram
administradas 500 UI de eCG. As IA foram realizadas por via cervical sem prévia detecção de estro, 54 horas após
Rev. No 1º estudo utilizaram-se 5 carneiros como dadores de sémen nas épocas de Primavera e Outono. Os
ejaculados seleccionados foram refrigerados a 15 ºC sendo inseminadas 302 ovelhas na Primavera e 67 no Outono.
No 2º estudo, realizado com 3 carneiros, foi avaliado o efeito de duas épocas de congelação de sémen, Outono
(n=144) e Inverno (n=220) sobre a FERT dos carneiros após IA realizadas em Maio. O 3º estudo foi realizado com 4
carneiros (comuns a SR e SC) independentemente da época de IA e tipo de sémen tendo sido efectuadas 172 IA com
SR e 326 com SC. No 4º estudo foi avaliada a FERT individual dos 16 carneiros utilizados na IA com SR (n=696) e
dos 5 carneiros com SC (n=420). No 1 º estudo não foram encontradas diferenças significativas entre a FERT de
Primavera (44,95%) e Outono (36,46%). No 2º estudo não foram observadas diferenças significativas na fertilidade
com SC tanto no Outono (15,03%) como no Inverno (13,17%). No 3º estudo as fertilidades de 4 carneiros foram
significativamente superiores com SR (51,28%) comparativamente ao SC (13,65%). O CV da fertilidade com SC
(41,3%) foi maior do que com SR (13,1%). No 4º estudo, as fertilidades com SR (48,51%) foram significativamente
superiores às do SC (13,04%) sendo os CV da fertilidade superiores (P<0,05) com SC (38,9%) comparativamente ao
SR (19,5%). Conclui-se que os carneiros de raça Saloia podem ser utilizados nos programas de IA
independentemente da época de congelação do sémen e de IA sem afectar a fertilidade. A fertilidade das IA com SC
é significativamente inferior à do SR e apresenta um CV significativamente superior, evidenciando susceptibilidades
individuais dos carneiros à congelação do sémen.
[Artificial insemination in saloia sheep breed]
This work accomplished with Saloia sheep breed intended to calculate fertility (FERT) and respective coefficient of
variation (CV) of rams used in artificial insemination (AI), with the evaluation of: 1) AI season effect with
refrigerated semen (RS), 2) effect of semen freezing season (FS), 3) semen type (RS vs FS) effect employing the
same rams and 4) FERT evaluation in all rams used in AI with RS and FS. Ram individual FERT was determined
from registered lambings of inseminated ewes. Oestrus synchronization of inseminated ewes was accomplished
through vaginal sponges (30 mg FGA) during 12 days and 500 UI eCG injected at sponge removal (REV). AI was
performed by cervical route without previous oestrous detection, 54 hours after rev. In the first study, 5 rams were
used in spring and autumn AI seasons. Selected ejaculates were refrigerated to 15ºC and 302 ewes were inseminated
in spring and 67 in autumn. In the second study, fertility after autumn (n=144) and winter (n=220) semen freezing
periods was compared using three rams, AI being performed in May. Third study was done with 4 rams (RS and FS)
independently of AI season and semen freezing season by artificially inseminating 172 ewes with RS and 326 with
FS. In the fourth study, individual fertility from 16 rams used in AI with RS (n=696) and 5 rams with FS (n=420)
was measured. In the first study, fertility was not different between spring (44.95%) and autumn (36.46%)
insemination seasons. In the second study, fertility was not significantly different between semen frozen either in the
autumn (15.03) or winter (13.17%). In the third study, FERT from 4 rams were significantly higher with RS
(51.28%) than FS (13.65%). Fertility CV with FS (41.3%) was higher than with RS (13.1%). In the fourth study,
fertility with RS (48.51%) was significantly higher than with FS (13.04%) and FERT CV was higher (P<0.05) with
FS (38.9%) than with RS (19.5%). We conclude that rams of Saloia breed can be employed in AI schedules without
affecting fertility independently of semen freezing season and AI season. Fertility after AI with FS is significantly
lower than with RS, but with higher CV, denoting individual rams susceptibility to semen freezing.
159
Poster 41
Interrupção do anestro sazonal em ovelhas da Raça Churra Galega Bragançana
Correia, T.1, Azevedo, J.2, Mendonça, A.1, Fontes, P.2, Velasco, H.3, Simões, J.2, Maurício, R.3, Cardoso, M.3,
Barbosa, L.4 e Valentim, R.3
1 Centro de Investigação de Montanha (CIMO). ESA - Instituto Politécnico de Bragança, Portugal
2 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro – Departamento de Zootecnia, Vila Real, Portugal
3 Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agrária, Bragança, Portugal
4 UFRB/Campos Cruz das Almas – Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas, Cruz das Almas, Bahia, Brasil
Este ensaio foi realizado com o intuito de comparar a eficácia de dois tratamentos hormonais distintos na
interrupção do anestro sazonal – FGA + eCG (Grupo Controlo) vs. Melatonina + FGA + eCG (Grupo Melatonina) –,
em ovelhas da raça Churra Galega Bragançana. Adicionalmente, procurou-se avaliar os efeitos da administração de
duas doses diferentes de eCG – 500 UI ou 750 UI.
Foram utilizadas 40 ovelhas da raça Churra Galega Bragançana do rebanho experimental do IPB-ESA (Bragança,
Portugal), com idades compreendidas entre os 2-6 anos. A 24 de Março, estas ovelhas foram aleatoriamente
divididas em dois grupos – Controlo (n = 20) e Melatonina (n = 20). Às ovelhas do grupo Melatonina foi colocado
um implante subcutâneo de melatonina (18 mg). Quarenta e quatro dias mais tarde, as ovelhas dos dois grupos –
Controlo e Melatonina – foram tratadas com esponjas vaginais impregnadas com 20 mg de FGA. O tratamento
progestagénico teve uma duração de 12 dias. Quando da remoção das esponjas vaginais, as ovelhas de ambos os
grupos foram aleatoriamente divididas em dois sub-grupos: metade foi tratada com 500 UI de eCG/ovelha e a outra
metade com 750 UI de eCG/ovelha. Nessa altura, foram introduzidos no rebanho 3 carneiros adultos munidos de
arneses marcadores (cobrição e detecção de cios). A actividade ovárica das ovelhas foi avaliada através do
doseamento dos níveis plasmáticos de progesterona. O diagnóstico de gestação realizou-se 41 dias após a
administração de eCG, por ultrasonografia em tempo real.
Em meados de Março, 80,0% das ovelhas estudadas estavam em anestro sazonal. Nos finais de Abril - inícios de
Maio, esta percentagem era de 55,0%. Os tratamentos FGA + eCG determinaram uma excelente resposta
reprodutiva. A administração prévia de melatonina exógena não produziu qualquer efeito reprodutivo significativo.
A dose de eCG empregue também não afectou significativamente os vários parâmetros reprodutivos avaliados.
[Seasonal anoestrous disruption in Churra Galega Bragançana ewes]
This study aimed to compare the efficiency of two different hormonal treatments to disrupt seasonal anoestrous in
Portuguese Churra Galega Bragançana ewes – FGA + eCG vs. melatonin + FGA + eCG. Additionally the effects of
two different doses of eCG were assessed (500 UI vs. 750 UI).
This experiment took place at Bragança (latitude 41° 49' N, longitude 6° 40' W and altitude 720 meters) between
March 10th to June 29th. Forty Churra Galega Bragançana ewes, aging 2-6 years, were randomly divided in two
groups: Control (n = 20) and Melatonin (n = 20). On March 24th, the second group ewes received a melatonin
subcutaneous implant (18 mg). Forty-four days later a 20 mg FGA sponge was inserted in all ewes from both
groups. Progestagen treatment lasted for 12 days. At sponge removal half ewes of both groups were randomly
injected with 500 UI and the other half with 750 UI of eCG. Simultaneously three intact adult rams were introduced
in the herd. They were equipped with harness markers for breeding and estrous onset identification. Ovarian activity
was assessed by progesterone plasmatic levels. Pregnancy diagnosis was performed 41 days after eCG
administration by real time ultrasonography.
At mid March 80.0% of all Churra Galega Bragançana ewes were in seasonal anoestrous. By late April-early May,
this percent has fallen to 55.0%. FGA and eCG treatments were very effective disrupting seasonal anoestrous.
Previous administration of melatonin had no significant effect on sexual behavior, ovarian activity and fertility rate.
Similarly, eCG dose had no significant effect in reproduction performance of Churra Galega Bragançana ewes.
160
Poster 42
Utilização de um tratamento progestagénico longo e de diferentes doses de eCG no controlo da
actividade reprodutiva em ovelhas da raça Churra Galega Bragançana
Valentim, R.1, Azevedo, J.2, Mendonça, A.3, Fontes, P.2, Velasco, H.1, Simões, J.2, Maurício, R.1, Cardoso, M.1,
Barbosa, L.4 e Correia, T.3
1 Instituto Politécnico de Bragança, Escola Superior Agrária, Bragança, Portugal
2 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro – Departamento de Zootecnia, Vila Real, Portugal
3 Centro de Investigação de Montanha (CIMO). ESA - Instituto Politécnico de Bragança, Portugal
4 UFRB/Campos Cruz das Almas – Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas, Cruz das Almas, Bahia, Brasil
Este ensaio foi realizado com o intuito de avaliar os efeitos da administração de um tratamento progestagénico
longo, associado a duas doses diferentes de eCG – 500 UI ou 750 UI –, no controlo da actividade ovárica, em
ovelhas da raça Churra Galega Bragançana.
Foram utilizadas 39 ovelhas da raça Churra Galega Bragançana do rebanho comercial do IPB-ESA (Bragança,
Portugal), com idades compreendidas entre os 1-7 anos. A 8 de Maio, todas as ovelhas foram tratadas com esponjas
vaginais impregnadas com 20 mg de FGA. O tratamento progestagénico teve uma duração de 12 dias. Quando da
remoção das esponjas vaginais, as ovelhas foram aleatoriamente injectadas com: 500 UI (n = 18) ou 750 UI (n = 21)
de eCG. Nessa altura, foram introduzidos no rebanho 3 carneiros adultos munidos de arneses marcadores (cobrição e
detecção de cios). A actividade ovárica das ovelhas foi avaliada através do doseamento dos níveis plasmáticos de
progesterona. O diagnóstico de gestação realizou-se 41 dias após a administração de eCG, por ultrasonografia em
tempo real.
Em meados de Maio, os tratamentos aplicados resultaram numa excelente resposta comportamental (97,4% das
ovelhas apresentaram cio). Contudo, apenas 41,0% das ovelhas apresentou níveis plasmáticos de progesterona
superiores a 0,5 ng/ml, ou seja, 59,0% delas não produziu um único CL no primeiro ciclo ovárico pós-tratamento.
Consequentemente, 41 dias após a administração de eCG, somente 33,3% das ovelhas estavam gestantes. Nem a
idade nem a dose de eCG utilizada afectaram significativamente a resposta reprodutiva das ovelhas Churras
Bragançanas.
[Long-term progestagen treatment associated with different doses of eCG to control the
reproductive activity of Churra Galega Bragançana ewes]
This study aimed to compare the efficiency of a long-term FGA treatment associated with different doses of eCG –
500 UI vs. 750 UI – to control the reproductive activity of Portuguese Churra Galega Bragançana ewes.
This experiment took place at Bragança (latitude 41° 49' N, longitude 6° 40' W and altitude 720 meters) between
May 8th to June 29th. Thirty-nine Churra Galega Bragançana ewes, aging 1-7 years, received a 20 mg FGA intravaginal sponge. Progestagen treatment lasted for 12 days. At sponge removal ewes were randomly injected with 500
UI (n = 18) or 750 UI (n = 21) of eCG. Simultaneously three intact adult rams with harness markers were introduced
in the herd for breeding and estrous onset identification. Ovarian activity was assessed by progesterone plasmatic
levels. Pregnancy diagnosis was performed 41 days after eCG administration by real time ultrasonography.
Both treatments promoted an excellent sexual behavior response (97.4% of all ewes showed heat). However only
41.0% of all ewes presented plasmatic levels of progesterone higher than 0.5 ng/ml (59.0% originated no CL at the
first ovarian cycle post-treatment). Consequently, 41 days after eCG administration just 33.3% of all ewes were
pregnant. Age and eCG dose had no significant effect in reproduction performance of Churra Galega Bragançana
ewes.
161
Poster 43
A elevada concentração de espermatozóides e o baixo volume de ejaculado afectam a criosobrevivência e a qualidade espermáticas no varrasco? Resultados preliminares.
Prates, E.G.1,2, Charneca, R.M.C.1, Pereira, R.M.2,3, Nunes, J.T.1
1 Universidade de Évora, Portugal
A raça suína Alentejana (AL) é elegível para aplicação da criopreservação espermática e inseminação artificial,
devido ao reduzido efectivo. O macho afecta a variabilidade da crio-sobrevivência espermática entre ejaculados,
sendo a variação entre machos mais importante do que dentro do macho. Os ejaculados dos varrascos AL contêm
elevada concentração de espermatozóides e baixo volume comparativamente a outras raças suínas. Este trabalho
investigou se estas características afectam a sobrevivência e qualidade espermáticas após criopreservação de sémen
suíno. As frações-ricas do sémen de 3 machos adultos (3 ejaculados cada), AL, Duroc (DU) e Large White (LW)
foram recolhidas. Avaliaram-se o volume e a concentração (em fresco), a motilidade progressiva e os acrossomas
normais (NAR) de espermatozóides (em fresco e pós-descongelação, 3 palhinhas/ ejaculado). O sémen foi diluído
em BTS e nos diluidores de gema de ovo e lactose (LEY) e de LEY, glicerol e Orvus ES PASTE (1x109 spz/mL). A
congelação (palhinhas de 0,5 mL) fez-se em vapores de azoto e o armazenamento em azoto líquido. Os dados
analisaram-se pelo procedimento MISTO sendo o macho efeito fixo e o nível de significância P<0,05. A
variabilidade intramacho foi estimada pelo Coeficiente de Variação (CV). O volume espermático do AL (40,7±9,4
mL) foi inferior ao do DU (129,3±9,4 mL, P=0,002) e LW (193,0±9,4 mL, P=0,001), mas a concentração foi
superior (1495,7±159,6 x 106 spz/mL) ao DU (581,7±159,6 x 106 spz/mL, P=0,020) ou LW (454,2±159,6 x 106
spz/mL, P=0,011). A motilidade em fresco ou após criopreservação não apresentou diferenças entre machos. A
NAR dos espermatozóides em fresco não teve diferenças entre machos, mas após criopreservação foi maior no DU
(62,9±6,0%) que no LW (23,3±6,0%, P=0,010) ou AL (22,9±6,0%, P=0,010). Os CV‟s do volume (AL, 65.5%, DU,
5.0% e LW, 3.2%) e NAR pós-descongelação (AL, 65.9%, LW, 41.7% e DU, 0.6%) foram superiores no AL e da
concentração (LW, 47.7%, AL, 28.2% e DU, 11.7%) no LW. Os dados sugerem que a variabilidade na qualidade
dos ejaculados criopreservados não foi afectada pelas diferenças de volume e concentração. Para melhorar a
eficiência da criopreservação, particularmente na raça AL, deverão ser avaliados mais ejaculados e varrascos.
[Does high spermatozoa concentration and low ejaculate volume affect boar sperm cryosurvival
and quality? Preliminary results]
Alentejano swine (AL) is an eligible breed for sperm cryopreservation and artificial insemination due to the small
size of populations. Sperm sensitivity to cryopreservation is affected by the boar being the cryosurvival variability
among ejaculates more important between males than intramale. Ejaculates from AL boars present high sperm
concentration and low volume compared to other swine breeds. This study determines whether these characteristics
affect boar sperm postthawing survival and quality. Sperm-rich fractions from 3 adult boars (3 ejaculates each), AL,
Duroc (DU) and Large White (LW) were collected. Sperm volume and concentration were assessed (in fresh).
Progressive motile spermatozoa and normal apical ridges (NAR) were also evaluated (in fresh and postthawing, 3
straws per ejaculate). Sperm was extended in BTS, then in lactose-egg yolk (LEY) and LEY-Glycerol-Orvus ES
PASTE extenders to obtain a 1x109 spz/mL concentration in 0.5 mL straws. Freezing was performed in nitrogen
vapours before straws were plunged in liquid nitrogen. Data were analysed using the MIXED procedure, the boar as
fixed effect and the threshold of significance as P<0,05. Intraboar variability was estimated by the coefficient of
variation (CV). AL boar sperm volume (40.7±9.4 mL) was lower than DU (129.3±9.4 mL, P=0.002) and LW
(193.0±9.4 mL, P=0.001), but AL showed higher concentration (1495.7±159.6 x 10 6 spz/mL) than DU (581.7±159.6
x 106 spz/mL, P=0.020) or LW (454.2±159.6 x 10 6 spz/mL, P=0.011). Progressive motility, both in fresh or postthawed sperm was not different among males. Fresh spermatozoa NAR presented no differences among boars,
although DU postthawed NAR was higher (62.9±6.0%) than LW (23.3±6.0%, P=0.010) or AL (22.9±6.0%,
P=0.010). Volume CV‟s (AL, 65.5%, DU, 5.0%, LW, 3.2%) and postthawed NAR (AL, 65.9%, LW, 41.7%, DU,
0.6%) were higher in AL and concentration (LW, 47.7%, AL 28.2%, DU, 11.7%) was greater in LW. Data suggest
that the variability in postthawed sperm quality was not affected by the differences of volume and concentration. To
improve the cryopreservation efficiency, particularly in AL breed, more ejaculates and boars should be further
evaluated.
162
Poster 44
Recolha de embriões em canídeos: uma opção a considerar
Miranda, S.1,2,3*, Payan Carreira, R.2, Pinto, P.1,3, Pereira, R.M.L.N.1,4
1 Departamento de Medicina Veterinária, Escola Universitária Vasco da Gama, Coimbra, Portugal. *Email: [email protected]
2 Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás os Montes e Alto Douro, Portugal
3 HVBV-Hospital Veterinário do Baixo Vouga, Águeda, Portugal
A importância social do cão como animal de companhia ou como animal de trabalho é cada vez maior, existindo
uma necessidade crescente do domínio da tecnologia de reprodução assistida nesta espécie, o que poderá permitir
uma maior disseminação e conservação de informação genética, especialmente importante em cães-guia de cegos,
onde as fêmeas são obrigatoriamente ovariohisterectomizadas. O domínio gerado nesta área de conhecimento poderá
ser também aplicado na conservação de canídeos selvagens. No entanto, as técnicas de recolha de embriões em
cadelas apresentam uma grande variação metodológica e baixas taxas de recuperação. Os animais utilizados neste
estudo foram fêmeas cujos proprietários pretendiam a ovariohisterectomia (OVH) como método de contracepção
definitivo, e nas quais, através da monitorização da concentração de progesterona sérica e da visualização da
citologia vaginal até ao primeiro dia do diestro, se procedeu à monitorização do ciclo para determinar o momento do
pico de LH. As OVHs foram programadas para serem realizadas ao 10º-12º dia ou ao 16º-18º dia pós pico de LH.
Imediatamente após a exteriorização e excisão do útero, procedeu-se à avaliação dos ovários, para contagem do
número de corpos lúteos, e recolha dos embriões, por lavagem tubárica e uterina no primeiro período, e apenas do
útero, no segundo período. Para a recolha utilizou-se um catéter e uma solução de lavagem (phosphate buffered
solution com 5% de BSA e antibióticos). Os embriões recolhidos foram avaliados quanto ao número, à qualidade e
ao estadio de desenvolvimento e congelados em azoto líquido. Os resultados preliminares mostraram ser possível
obter embriões caninos de boa qualidade, no estadio de 2-4 células em recolhas realizadas precocemente, no 10º12ºdia após o pico de LH. Esta técnica pode assim ser utilizada com sucesso para obter embriões caninos para
trabalhos de investigação ou mesmo para transferência para receptoras. No entanto, e tal como encontrado por
outros autores, continua difícil a realização da técnica de lavagem uterina ou tubárica sem recorrer à excisão destes
órgãos, devido à morfologia da espécie, o que limita a difusão desta técnica enquanto ferramenta de melhoramento
genético.
[Collection of embryos in the dog: an option to consider]
A large numbers of dogs is produced and used as working dogs as well as companion animals all over the world. It
seems likely that there will be an increasing need in the field of assisted reproductive technology for this species,
which would allow the dissemination and conservation of genetic information, especially important for working
dogs, such as guide dogs, where females must be sterilized. The knowledge gathered in this area can also be used in
genetic conservation of wild carnivores. However embryo production techniques in dogs present a vast
methodological variation and low recovery rates. In this study we used bitches whose owners intended to perform an
ovariohysterectomy as definitive contraceptive method. Staging of the oestrus cycle was performed through the use
of vaginal cytology and blood progesterone measurements, for detection of the day of LH surge. OVH were
performed on days 10-12 or 16-18 after the LH surge, immediately after genital tract excision, the ovaries were
evaluated for counting the corpora lutea. The uterine tubes or the uterus (respectively for days 10-12 and 16-18)
were flushed for embryo collection using a catheter and phosphate buffered solution with 5% BSA and antibiotics
solution. Recovered embryos were evaluated for number, quality and classification of the developmental stage, prior
to preservation in liquid nitrogen for posterior histological and biochemical studies. Preliminary results showed that
on days 10-12 after LH surge it is possible to collect good quality (2-4 cell embryos). This technique may be applied
to obtain canine embryos for research or in the future, even for embryo transfer. However, due to species
morphological particularities, embryo recovery remains difficult to perform without the uterus/oviducts excision,
which limits the spreading of the technique as a genetic improvement tool.
163
Poster 45
Redistribuição da HSP70 no espermatozóide canino após refrigeração ou congelação
Borges, P.1, Mir, F.2, Fontbonne, A.2, Payan-Carreira, R.3
1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
2 CERCA (Centre d'Etudes en Reproduction des Carnivores), Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, France
As proteínas de choque térmico (HSP) são um grupo de proteínas, altamente conservadas, que se dividem por várias
famílias. São chaperoninas associadas ao enrolamento das proteínas e à protecção contra o choque químico ou
térmico. A HSP 70, uma proteína de membrana associada ao stress térmico, foi encontrada na superfície do
espermatozóide (Spz) de várias espécies, mostrando uma redistribuição celular quando o Spz sofre capacitação (do
acrosoma para o segmento equatorial ou para a cauda ou do folheto interno ao externo da membrana plasmática). O
sémen de cão é muito sensível à congelação. Este trabalho procura avaliar a expressão de HSP70 no Spz de cão em
ejaculados frescos, e avaliar a redistribuição após refrigeração ou congelação, recorrendo à imunocitoquímica (ICC).
Fizeram-se citologias de sémen fresco de cão (controlos-CTR; n=5), utilizando 7l de sémen não diluído, e fixadas
em álcool a 95%. Após avaliação do sémen, prepararam-se doses seminais para refrigeração e congelação de rotina
(REF and FROZ groups, com 5 amostras cada). Destas doses, fizeram-se citologias às 24h de refrigeração e após
descongelamento, que foram fixadas de igual modo. Utilizou-se um anticorpo policlonal contra a HSP70 (Ab31010;AbCam, UK), diluído a 1:150, incubado por 16h a 4ºC. Nos controlos negativos o anticorpo primário foi
trocado por PBS. A intensidade da coloração foi classificada numa escala de 0 a 3 (negativo a forte), em 10 campos
ou num máximo de 200 Spz (ampliação de 1000x). A distribuição celular da marcação foi ainda anotada. Nos CTRs
84,7% dos SPZ revelaram uma marcação acrosómica moderada para a HSp70, com reforço da marcação na
periferia, e13,7% mostraram marcações mais fracas. Só 10,5% dos Spz tinham marcação na cauda. A peça
intermédia é sempre negativa. No grupo REF a intensidade global para HSP70 é similar aos CTRs, com 88,2% dos
Spz mostrando intensidade acrosómica moderada e 95% foram negativos no flagelo. No grupo FROZ encontrou-se
uma redução da intensidade de marcação acrosómica (63,6%), com deslocação da marcação para a peça intermédia
e terminal do Spz (<54% Spz negativos na cauda). Não houve grandes diferenças individuais entre machos, tendo
todos respondido com uma redução da marcação acrosómica e redistribuição da HSP70 na cauda do Spz nos FROZ
quando comparados com CTRs e REF. Os machos com pior parâmetro de CASA eram também os que tinham maior
redução nas marcações para HSP. Este trabalho mostra a presença de HSP70 no Spz de cão e reporta as alterações
de intensidade e localização celular durante a congelação.
[HSP70 redistribution in dog sperm following refrigeration or freezing]
Heat shock proteins are a group of highly conserved proteins, which are divided into several families. They are
molecular chaperones involved in protein folding and in chemical or temperature stress. HSP 70, a membrane bound
protein associated with thermal stress, has been found in surface of mammalian spermatozoa (SPZ), showing a.
relocation as the sperm undergoes capacitation (from the acrosome to the equatorial segment and the tail or from the
inner to the outer leaflet of the plasma membrane). Dog semen responds badly to cryopreservation. The present
study aims to characterize HSP70 expression by dog Spz and to study eventual redistribution pattern after
refrigeration or freezing, by immunocytochemistry. Cytological specimens were obtained from undiluted fresh
ejaculates (Controls-CTRs; n= 5), which were fixed in 95% ethanol. The semen was evaluated and seminal doses
were prepared as for routine refrigeration and freezing (REF and FROZ groups, with 5 samples each). Cytological
specimens were obtained at 24h of refrigeration and from frozen/thawed samples, and fixed in 95% ethanol. A
polyclonal primary antibody (Ab-31010;AbCam, UK) was used at a 1:150 dilution, incubated for 16h at 4ºC. For
negative controls, the primary antibody was replaced by PBS. Intensity of the reaction was scored from 0 to 3
(negative to strong), on 10 different fields at 1000x magnification or in a maximum of 200 Spz; the sub-cellular
distribution of the labelling was also recorded. In CTRs, 84.7% of SPZ showed moderate HSp70 positivity in the
acrosomic region, with a staining reinforcement at the periphery, with only 10.5% of Spz displayed labeling at the
tail excepting for the midpiece area. 13,7% of the Spz showed lower scores. In REF group, the overall intensity for
HSP70 was similar to CTRs, with 88.2% of the cells showing moderate acrosomal intensity for HSP70 and 95%
found negative in the tail. In FROZ group, a marked decrease in the acrosomal intensity was found (63,6%), with
dislocation of the labeling to the Spz tail, at the level of the principal and end piece (<54% Spz being tail-negative).
Little individual differences were found between males, all of them showing a decrease in the acrosomal intensity of
labeling in FROZ when compared to CTRs and REF. The males with poor CASA parameters were also those
displaying the lower acrosome and higher tail scores. This work showed the presence of HSP70 in dog Spz and the
changes that exists on the intensity and sub-celular localization during cryopreservation.
164
Poster 46
Proliferação e apoptose celular no endométrio durante o ciclo éstrico da cadela
Henriques, S.2, Cruz, S.1,2, Silva, E.2, Ferreira-Dias, G.2, Lopes da Costa, L.2, Mateus, L.2
1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
Durante o ciclo éstrico, o endométrio da cadela sofre alterações morfológicas e bioquímicas que estão associadas
com a proliferação, a apoptose e a diferenciação celular. O conhecimento destes padrões é importante para o estudo
dos mecanismos envolvidos no estabelecimento da gestação e nas alterações patológicas como o complexo
piómetra-hiperplasia quística do endométrio que é comum em cadelas nulíparas.
O objectivo deste estudo foi avaliar a proliferação e apoptose celular no endométrio durante o ciclo éstrico da
cadela. O tecido uterino foi obtido a partir de ovariohisterectomias de rotina realizadas em cadelas saudáveis (n =
34) no Hospital da Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa e na Clinica Veterinária da Liga Portuguesa dos
Direitos dos Animais. A fase do ciclo éstrico foi determinada com base na citologia vaginal, na concentração de
progesterona sérica e na avaliação macroscópica e histológica do útero e ovários. A proliferação e a apoptose foram
avaliadas por imunohistoquímica usando o antigénio Ki67 (Dako) e o TUNEL (Milipore), respectivamente. Os
resultados de proliferação foram obtidos através da análise de 500 células de cada uma das estruturas (epitélio
superficial, criptas, vasos sanguíneos, estroma e glândulas basais). Os índices de apoptose foram determinados
através da contagem do número médio de células positivas, sendo classificados em 5 níveis. Os dados foram
avaliados utilizando o teste Mann–Whitney U-test. O nível de significância escolhido foi de 5% (p<0,05). Ao longo
do ciclo éstrico, foram observados dois picos de proliferação que envolvem diferentes grupos celulares. No epitélio
luminal, no estroma, nos vasos sanguíneos e nas criptas, foram observados maiores índices de proliferação no
proestro (p<0,05), enquanto que nas glândulas basais foram observados tanto no proestro como no início do diestro
(p<0,05). O maior índice apoptótico verificou-se ao nível das glândulas basais durante o diestro (p<0,05). O final do
diestro e o início de anestro foi caracterizado por um aumento do índice de apoptose nas células do estroma e dos
vasos (p<0,05), e ainda por uma marcada degenerescência das células do epitélio luminal. Os resultados obtidos
sugerem que a regulação da proliferação ocorre sob acção estrogénica ao nível do epitélio luminal, do estroma, dos
vasos sanguíneos e das criptas e, sob acção progestagénica nas glândulas basais. A regressão do epitélio glandular
basal ocorre no diestro e está associada a mecanismos apoptóticos. Pelo contrário, a degenerescência do epitélio
luminal observada no fim do diestro e início de anestro não está associada a esses mecanismos.
(Financiamento: POCTI/CVT/48773/2002 and CIISA 74.Endometrial Hyperplasia)
[Proliferation and apoptosis in the canine endometrium during the oestrous cycle]
During the oestrous cycle, the canine endometrium undergoes morphological and biochemical changes, associated
with proliferation, apoptosis and differentiation. The knowledge of these patterns is relevant for the understanding of
the mechanisms involved in establishment of pregnancy and in pathological conditions such as the pyometra-cystic
endometrial hyperplasia complex, a common disease in older nulliparous dogs. The aim of this study was to
evaluate endometrial proliferation and apoptosis in the canine uterus during the oestrous cycle. Canine uteri was
obtained from healthy female dogs (n=34) after routine ovariohysterectomy at the hospital of the Faculty of
Veterinary Medicine in Lisbon and at the Veterinary Clinic of Liga Portuguesa dos Direitos dos Animais. The stage
of the oestrous cycle was determined through vaginal cytology, serum progesterone concentrations and the
macroscopical and histological evaluation of the uterus and ovaries. Samples of each uterus were taken and fixed in
4% formaldehyde. Proliferation and apoptosis were detected by immunohistochemistry using Ki67 antigen (Dako)
and TUNEL (Millipore), respectively. Ki67 expression was evaluated in 500 cells of each structure (surface
epithelium, crypts, blood vessels, stroma and basal glands). The apoptotic indices were determined by counting the
average number of cells showing apoptosis and classified in 5 levels. Data were analyzed using the non-parametric
Mann-Whitney U Test. Significance was determined at the 5% confidence level (p< 0.05). Two proliferation peaks
involving different structures were observed. In the surface epithelium, the stroma, the blood vessels and the crypts,
the highest proliferation indexes were observed during proestrus (p< 0.05). In basal glands, the proliferation index
was the highest at proestrus and early diestrus (p< 0.05). The highest apoptotic index was observed in the basal
glandular epithelium cells during diestrus (p< 0.05). At late diestrus and the beginning of anestrus, there was an
increase in the apoptotic index in the endothelial and stromal cells (p< 0.05). Marked degeneration of the luminal
epithelium was seen at late diestrus and beginning of anestrus.
In conclusion, the regulatory pathway of proliferation occurs under oestrogen dominance in the surface epithelium,
the stroma, the blood vessels and the crypts and, under progesterone dominance in the basal glands. Regression of
the basal glandular epithelium occurs in diestrus, associated to apoptosis. In contrast, degeneration of the luminal
epithelium in late diestrus and beginning of anestrus is not associated with apoptosis.
165
Poster 47
Estudo comparativo das características de sémen fresco de gatos domésticos, recolhido por
cateterização uretral e a partir do epidídimo, utilizando dois protocolos anestésicos diferentes
Florindo, J.1,2, Mateus, L.1, Miranda, S.2,3
2 Hospital Veterinário do Baixo Vouga, Portugal
A colheita de sémen permite a aquisição de material genético para uso na clínica reprodutiva, na biotecnologia da
reprodução e na investigação e constitui uma das principais dificuldades na espécie felina. A recolha de sémen a
partir da cauda do epidídimo (EP) representa uma alternativa prática à recolha por vagina artificial ou por
electroejaculação. Recentemente, foi descrita uma técnica de colheita de sémen em gatos por cateterização uretral
(CT), sem recurso à estimulação eléctrica, após administração de medetomidina.
Foi objectivo deste estudo, comparar as características do sémen fresco de gatos domésticos obtido por CT e a partir
do EP e verificar qual a influência de dois protocolos anestésicos nos parâmetros de qualidade dos espermatozóides
(spz): mobilidade total, mobilidade progressiva e morfologia. Os protocolos consistiram na administração de
medetomidina (Medetor® 100 µg/kg p.v. IM) ou na associação de medetomidina (Medetor® 80 µg/kg p.v. IM) com
cetamina (Clorketam® 5 mg/kg p.v. IM)
Para a recolha de sémen por CT, um catéter urinário para gatos foi inserido cerca de 9cm na uretra, de modo a
atingir a uretra prostática e com cuidado para não atingir a bexiga. Ao catéter acoplou-se uma seringa de 2mL e
realizaram-se sucessivas retracções do êmbolo da mesma, à medida que se ia retirando o catéter da uretra de modo a
recolher o sémen aí libertado. Após a colheita, a amostra de sémen foi transferida para um eppendorf pré-aquecido
com 300µL de Tris-citrato. Após a orquiectomia, os testículos juntamente com o EP foram recolhidos, lavados com
NaCL a 0,9% a 37 ºC. Cada EP foi separado do respectivo testículo e a cauda do EP foi repetidamente seccionada e
colocada num eppendorf pré-aquecido com 300 µL de Tris-citrato, durante 10 minutos, para permitir a saída dos spz
para o meio circundante. Os resultados obtidos foram avaliados por análise de variância múltipla, com dois efeitos
fixos: técnica de colheita (n=2) e protocolo anestésico (n=2).
Independentemente da técnica de colheita ou do protocolo anestésico utilizado, os valores obtidos para a mobilidade
total, mobilidade progressiva e morfologia foram semelhantes, não tendo sido significativas as diferenças
observadas.
A colheita por CT apresenta vantagens sobre a obtenção de sémen a partir do EP porque pode ser repetida várias
vezes no mesmo animal, é menos complicada a sua realização e requer menor tempo para a preparação da amostra.
A colheita de sémen a partir do EP permite a recolha de sémen em animais domésticos ou silvestres, de grande
estima ou elevado valor genético, após morte ou orquiectomia.
[Comparative study of the characteristics of fresh semen of domestic cats, collected by urethral
catheterization and from the epididymis, using two different anesthetic protocols]
The collection of semen allows the acquisition of genetic material for use in reproductive clinic, breeding
biotechnologies and research. This procedure constitutes one of the main difficulties in felines. The retrieval of
semen from the cauda epididymis (EP) represents a practical alternative to the collection by artificial vagina or
electroejaculation. Recently, there was a new technique described for semen collection in cats through urethral
catheterization (CT), without resorting to electrical stimulation and following the administration of medetomidine.
The objective of this study was to compare the characteristics of domestic cat‟s fresh semen obtained by CT and
from the EP, as well as to analyze the influence of two anesthetic protocols, medetomidine alone (Medetor® 100
µg/kg p.v. IM) or a combination of medetomidine (Medetor® 80 µg/kg p.v. IM) and ketamine (Clorketam® 5
mg/kg p.v. IM), in the following parameters: total mobility, progressive mobility and morphology.
For the collection of semen by CT, a cat urinary catheter was inserted approximately 9cm into the urethra, in order
to reach the prostatic urethra. This procedure was made carefully not to reach the bladder. A 2 ml syringe was then
coupled to the catheter and successive retractions of the plunger were performed while removing the catheter from
the urethra in order to collect the semen release there. After collection, the semen sample was transferred to an
eppendorf pre-warmed with 300 µL of Tris-citrate.
After orchiectomy, the testicles and the EP were collected, washed with a NaCL solution at 0.9%, warmed to a
temperature around 37 ºC. Each EP was separated from the respective testicle and the tail of EP was repeatedly cut
and placed in a pre-warmed eppendorf with 300µL of Tris-citrate during 10 minutes to allow the dispersion of the
spermatozoa to the surrounding medium. Data were analysed by MANOVA with two fixed effects: technique (n=2)
e anesthetic protocol (n=2).
It was concluded that regardless the technique or the anesthetic protocol used, the results for total mobility,
progressive mobility and morphology were similar, and no significant differences were observed.
When compared with EP, collection of semen by CT can be done several times in the same animal, is less
complicated and less time consuming. In the other hand, semen collection from EP can be done in domestic and
wild animals, with high genetic background, after dead or orquiectomy.
166
Poster 48
Efeito da admnistração de ocitocina nas sintases das prostaglandinas e nos receptores de Ocitocina
e de estrogénios no endométrio equino
Rebordão, M.R.1,2, Pinto Bravo, P.1,2, Galvão, A.2, Pinheiro, J.1, Ferreira-Dias, G.2
1 Escola Superior Agrária de Coimbra, Portugal
2 CIISA., Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Embora a ocitocina tenha sido utilizada para prolongar a fase lútea na égua, desconhece-se o seu mecanismo exacto
de acção. Assim, o objectivo deste estudo consistiu na avaliação do efeito da administração de ocitocina exógena na
(i) função lútea e na expressão no endomét
PGFS, PGES e PGIS, respectivamente) e dos receptores de ocitocina (OTR) e de estrogénios 1 e 2 (ER1 e ER2).
Foi utilizado um delineamento experimental do tipo “change over”. Das onze unidades experimentais (éguas
cíclicas), cinco do grupo controlo (grupo C) receberam 6mL de soro fisiológico, enquanto que às outras (n=6; grupo
OT) administrou-se ocitocina (60 IU/égua), por via intramuscular, de 12 em 12h, do Dia 7 ao Dia 14 após ovulação.
Foram realizados exames ecográficos da genitália interna e colheitas de sangue em dias alternados. Recolheram-se
biópsias do endométrio no Dia 10 após ovulação no grupo C e no Dia 24 no grupo OT. As concentrações
plasmáticas de progesterona (P4) foram determinadas por RIA. Por Real Time PCR avaliou-se a transcrição dos
genes da COX2, PGES, PGFS, PGIS, OTR, ER1 e ER2 no endométrio. Os resultados foram analisados por
ANOVA a um factor. Ocorreu luteólise 3 e 6 dias após a biópsia nos grupos C e OT, respectivamente. A função
lútea foi prolongada em 67% das éguas OT que mantiveram o corpo lúteo durante 30 dias. No dia da biopsia, a
transcrição dos genes PGES (p<0,05), PGIS (p<0,01), ER1(p<0,05) e ER2(p<0,05) diminuiu no grupo OT; COX2 e
PGFS foram semelhantes entre grupos; enquanto que o OTR aumentou nas éguas OT (p<0,05). Estes resultados
sugerem que tanto a PGE2, com uma possível acção luteotrófica sugerida na vaca (Arosh et al., 2004), como a
PGI2, não parecem estar envolvidas no mecanismo de manutenção da função lútea pela administração exógena de
OT. Além disso, a prevenção da luteólise parece não depender da regulação dos receptores de OT. A diminuição
da expressão dos ER sugere que o mecanismo pelo qual a OT provoca a manutenção da função lútea seja uma
flutuação dos níveis de estrogénios no ambiente uterino.
[Effect of oxytocin administration on prostaglandin synthases, oxytocin and estrogen receptors in
equine endometrium]
Oxytocin has been used to prolong luteal phase in the mare. However, the exact mechanism involved in this action
is unknown. Therefore, the goal was to evaluate the effect of exogenous oxytocin administration on (i) luteal
function and on the expression of (ii) prostaglandin H2, F2 , E2 e I2 (COX2, PGFS, PGES and PGIS,
respectively) synthases, oxytocin (OTR), estrogen 1 and 2 (ER1 and ER2) receptors in the mare´s endometrium. A
“change over” design was used. Eleven cyclic mares were used. Control mares (n=5; C group) received 6mL of
saline solution intramuscular (im), while oxytocin (60 IU/mare) was administered im to another group (n=6; OT
group), every 12h, from Day 7 to Day 14 after ovulation. Internal genitalia ultrasonography and blood samples were
performed every other day. Plasma progesterone (P4) concentrations were determined by RIA. Endometrial biopsies
were carried out on Day 10 post ovulation in C group, and on Day 24 in OT group. Further on, COX2, PGES,
PGFS, PGIS, OTR, ER1 and ER2 transcription in the endometrium was accomplished by Real Time PCR. Data
were analyzed by “one way” ANOVA. Luteolysis occurred 3 and 6 days after biopsy in C and OT groups,
respectively. Prolonged luteal function occurred in 67% of OT mares and maintained corpus luteus for 30 days. P4
in C group was higher (13.7 1.5ng/mL) than in OT group (8.33 1.8ng/mL) on the biopsy day (p=0.05). PGES
(p<0.05), PGIS (p<0.01), ER1(p<0.05) e ER2(p<0.05) gene transcription was reduced in OT group; COX2 and
PGFS was similar between groups; while OTR was increased in OT mares (p<0.05). These results suggest that
PGE2 , with a possible luteotrophic action as suggested for the the cow (Arosh et al., 2004), and PGI2 are not
involved in oxytocin prolonged luteal function. Besides, prevention of luteolysis does not appear to depend on OT
receptors regulation. The reduction of ER expression suggests that a fluctuation in estrogen levels in uterine
environment may be involved in the mechanism of OT luteal function maintenance in the mare.
167
Poster 49
Genótipo QX-like do vírus da bronquite infecciosa detectado em Portugal
Fagulha, T.1, Henriques, A.M.1, Duarte, M.1, Ramos, F.1, Barros, S.C.1, Luís, T.1, Carvalho, P.2, Mendonça, P.2,
Monteiro, M.2, Fevereiro, M.1
2 Departamento de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
O vírus da bronquite infecciosa (IB) pertence ao género Gammacoronavirus da família Coronaviridae e é o agente
etiológico da bronquite infecciosa, uma doença aguda e altamente contagiosa dos tractos respiratório superior e
urogenital de galinhas de todas as idades, responsável por perdas económicas consideráveis dentro da indústria
avícola. Os sintomas incluem desconforto respiratório, estertores traqueais, espirros, tosse, redução de peso, redução
da produção de ovos, aumento da frequência de ovos deformados e aumento das taxas de mortalidade. O genoma do
vírus IB consiste numa cadeia simples linear de RNA de sentido positivo. Foram identificados vários genótipos
diferentes do vírus IB, incluindo novas variantes emergentes como a QX-like, isolada pela primeira vez num bando
de galinhas com proventriculite mas posteriormente relacionada com casos de nefrite e falso síndrome de queda da
postura. Este genótipo tende a disseminar-se rapidamente em bandos susceptíveis, registando-se alta mortalidade,
principalmente em frangos jovens com patologia renal. As vacinas são essenciais para controlar a doença, mas
nenhuma vacina específica para o vírus IB QX-like está ainda disponível. O principal problema no controle do IB é
a capacidade do vírus para gerar variantes antigénicas, devido à ocorrência de mutações ou recombinações no gene
S1.
Seis frangos de carne de 40 dias de idade foram enviados para nosso laboratório com suspeita de bronquite
infecciosa. A análise anatomopatológica revelou hipertrofia renal ligeira em todas as aves e, ocasionalmente,
esplenomegália ligeira e congestão pulmonar bilateral. A análise histopatológica da traqueia e dos rins revelou a
presença de necrose, fenómenos congestivos e infiltração de células mononucleares em ambos os tecidos. Foi
utilizada para a extração de RNA viral uma mistura de órgãos, incluindo a traqueia, pulmões e rins. Um fragmento
de cerca de 600 pb do gene que codifica a glicoproteína S1 foi amplificado por RT-PCR, confirmando a presença do
genoma do vírus IB. O isolamento do vírus foi efectuado em ovos de galinha SPF embrionados com 11 dias de
idade, tendo sido detectado RNA viral no líquido alantóico por RT-PCR a partir da segunda passagem. Foram
observadas no embrião lesões características do vírus IB a partir da quarta passagem, nomeadamente atraso de
crescimento e enrolamento. A sequência de nucleótidos do fragmento amplificado foi determinada, revelando que o
vírus detectado pertence ao genótipo QX-like. Este constitui o primeiro caso do referido genótipo descrito em
Portugal.
[First report of IBV QX-like genotype in Portugal]
Infectious bronchitis virus (IBV), a member of genus Gammacoronavirus of the Coronaviridae family is the
etiological agent of infectious bronchitis (IB), an acute and highly contagious disease of the upper respiratory and
urogenital tracts of chickens of all ages. The disease affects the performance of both meat-type and egg-laying birds,
thereby causing considerable economic loss within the poultry industry. The symptoms include respiratory distress,
tracheal rales, sneezing, coughing, reduced weight, reduced egg production, increased frequency of abnormal eggs
and increased rates of mortality. The genome of IBV consists on a linear, non-segmented, positive sense and single
stranded RNA. Several different genotypes of IBVs have been identified and new variants are still emerging, such as
QX-like, first isolated from a flock of chickens suffering with proventriculitis but also related to cases of nephritis
and false layer syndrome. This genotype tends to spread rapidly among susceptible flocks and high mortality
sometimes occurs in young chickens as a result of renal pathology. Vaccination strategies are essential to control the
disease but no vaccines specific for IB QX-like viruses are yet available. The main problem in the control of IB is
the ability of the virus to generate antigenic variants, due to mutation or sometimes recombination of the S1 spike
gene.
Six broilers of 40 days-old were sent to our laboratory suspected of infectious bronchitis disease.
Anatomopathological analysis revealed mild renal hypertrophy in all birds and occasionally mild splenomegaly and
bilateral pulmonary congestion. The trachea and kidneys were submitted to histopathological analysis and lesions
were observed in both, namely necrosis, congestive phenomena and infiltration by mononuclear cells. A pool of
tissues including trachea, lungs and kidneys was used for RNA extraction and an amplicon of about 600 bp of the
spike glycoprotein S1 encoding gene was amplified by RT-PCR, confirming the presence of IBV genome. Virus
isolation was performed in 11 day-old embryonated SPF chicken eggs and IBV viral RNA was detected by RT-PCR
in the allantoic fluid from the second passage. IBV characteristic embryo lesions including winding and growth
retardation were observed from the fourth passage. The nucleotide sequence of the amplified fragment was
determined, revealing that the IBV detected is of the emerging QX-like genotype. This constitutes the first report of
the referred genotype in Portugal.
168
Poster 50
Infecção por Aspergillus flavus em patinhos e avaliação da respectiva capacidade de produção de
aflatoxinas “in vitro"
Martins, H.M.1, Monteiro, M.1, Carvalho, P.1, Mendonça, P.1 e Mesquita, R.2
1 Serviço de Micologia/Serviço de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal
Email: [email protected]
2 Marinhave Sociedade Agro-Avícola S.A., Santo Estevão – Benavente, Portugal. Email: [email protected]
A aspergilose é uma infecção do tracto respiratório de frangos, perus e, menos frequentemente, de patos, gansos,
pombos e muitas outras aves selvagens, ornamentais e de estimação. Em patos, esta doença pode ser recorrente em
algumas explorações, atingindo aves com 7 a 40 dias de idade. Aspergillus fumigatus é a causa mais comum desta
doença. Contudo, muitas outras espécies de Aspergillus têm também sido incriminadas. Os esporos de Aspergillus
podem disseminar-se facilmente por via aerógena a vastas áreas de alojamento dos animais, sendo saprófitas
omnipresentes no ar e com ampla distribuição cosmopolita. Os esporos de Aspergillus podem ser introduzidos no
ambiente da exploração através dos alimentos, das condutas de ar da ventilação ou dos materiais usados como
camas. Os patos podem ser infectados no momento da eclosão, como resultado da inalação de esporos presentes nas
incubadoras ou nas eclosoras ou ainda nas caixas de transporte para o aviário de criação. Nas aves mais idosas a via
de infecção principal é a inalação de esporos a partir das poeiras das camas contaminadas ou das rações. O presente
estudo diz respeito infecções naturais de Aspergilose detectadas num bando de patinhoss oriundos de uma
exploração intensiva (N=2456 patos). A necrópsia dos patinhos revelou múltiplas lesões nodulares esbranquiçadas
dispersas tanto pelos sacos aéreos como pelos pulmões. O exame micológico efectuado a 10 macerados de material
clínico (granulomas), foi realizado por sementeira em Agar Sabouraud suplementado com cloranfenicol e
gentamicina (BD Diagnostic ref: 254041) seguido de incubação a 30 ºC, durante 5 dias. A. flavus foi
sistematicamente isolado em grande abundância em todas as culturas. Três dos isolados de A. flavus foram
recolhidos e conservados para subsequentes pesquisas de actividade toxigénica. Para isso foi utilizado um modelo de
cultura em matriz biológica natural (farinha de milho) submetido a incubação a 28 ºC durante 8 dias. A pesquisa e
quantificação das aflatoxinas produzidas foram efectuadas por HPLC. Os resultados desta pesquisa revelaram que
todas as estirpes tinham capacidade para produzir níveis elevados de aflatoxinas. Os achados poderão permitir
concluir que, eventualmente, as aflatoxinas desempenham um papel importante na fisiopatogenia da doença, à
semelhança, aliás do que sucede com as toxinas de A. fumigatus, mas são necessários mais estudos.
[Aspergillus flavus infection in ducklings and its aflatoxins production - an “in vitro” assay]
Aspergillosis is an infectious disease of the respiratory tract of chickens, turkeys and, less frequently, ducks, geese,
pigeons and many other wild and ornamental pet birds. The disease may be recurrent in some duck farms, being
more frequently found in 7-40 days old birds.
Aspergillus fumigatus is the most common cause of this disease. However, several other Aspergillus species have
also been involved. Being one of the most ubiquitous airborne moulds, it may be introduced in flocks through
contaminated feed, air conduits or litter material. Ducks may become infected during hatching as a result of inhaling
large numbers of spores in heavily contaminated hatching machines or from contaminated transport containers. In
older birds, infection is primarily caused by inhalation of spores present in contaminated litter, feed or dusty range
areas. The present study describes the finding of natural aspergillosis infection of the respiratory tract of 10
ducklings coming from a suspected flocks of an intensive farm (N=2456 ducks). On necropsy examination of the
affected ducks, showed multiple nodular 1-2 mm wide white formations in the thoracic air sacs and lungs.
Mycological culture of typical nodules was undertaken using Sabouraud agar supplemented with chloramphenicol
and with gentamycin (BD Diagnostic ref: 254041). The cultures were incubated at 30º C, for five days and A. flavus
was systematically isolated from them. Three of the A. flavus isolates were collected and stored in order to allow the
detection of aflatoxins production. To achieve this, a natural corn meal matrix submitted to 8 days of incubation
period at 28 ºC was used. The detection and quantification of aflatoxins was done by high performance liquid
chromatography (HPLC). Results of this assay revealed that all strains produced high levels of aflatoxins. As in A.
fumigates infection, our results suggest that aflatoxins may play a relevant role on pathogenisis of the A. flavus
infection although further studies are need.
169
Poster 51
Infecção de um flamingo do Zoo de Lisboa pelo vírus pox aviário
Henriques, A.M.1, Fagulha, T.1, Duarte, M.1, Ramos, F.1, Barros, S.C.1, Luís, T.1, Bernardino, R.2, Fernandes, T.L.2,
Lapão, N.2, Silva, J.F.3, Fevereiro, M.1
2 Jardim Zoológico de Lisboa, Lisboa, Portugal
3 CIISA, Departamento de Morfologia e Função, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Os vírus pox aviários (AP) são membros do género Avipoxvirus da família Poxviridae que encontram espalhados
pelo mundo numa variedade de hospedeiros. São vírus muito grandes, encapsulados, ovais ou em forma de tijolo
que contêm um genoma de DNA linear em cadeia dupla. Os vírus AP são responsáveis por uma doença vulgarmente
conhecida como varíola, caracterizada por duas formas principais (respiratória e cutânea), dependendo da via de
infecção. A forma cutânea, geralmente associada a baixa mortalidade, ocorre após a infecção por mordida de
artrópode e é caracterizada pelo aparecimento de lesões nodulares em regiões do corpo livres de penas. A doença
pode ser responsável por perdas económicas significativas associadas à diminuição da produção de ovos e redução
do crescimento. Foram desenvolvidas vacinas de vírus vivos modificados para impedir a manifestação da doença em
frangos, perús, pombos, canários e codornizes. Embora os vírus AP tenham sido bem estudados em aves, existe
pouca informação disponível sobre estirpes pox em aves selvagens.
Um flamingo americano (Phoenicopterus ruber ruber) do Jardim Zoológico de Lisboa desenvolveu uma lesão
nodular no pé direito característica de poxvírus. O nódulo foi retirado cirurgicamente e até à data não recidivou. Um
pedaço do nódulo foi enviado para análise histopatológica e isolamento do vírus. Macroscopicamente, o nódulo
apresenta-se como uma massa branca de forma irregular e textura micronodular e a observação histológica de
hiperplasia epidérmica e corpos de inclusão intracitoplasmáticos foi consistente com um diagnóstico de infecção por
poxvírus aviário.
O isolamento do vírus foi realizado em ovos de galinha SPF embrionados de 12 dias de idade, via inoculação da
membrana corioalantóide (CAM). Observou-se um espessamento da membrana e a presença de pústulas brancas
opacas na CAM, característicos do crescimento do vírus AP. Um fragmento de 581 pb do gene que codifica a
proteína P4b foi amplificado por PCR, confirmando a presença do vírus. A sequência nucleotídica do fragmento foi
determinada e analisada, revelando uma grande divergência com as sequências de outros vírus presentes na base de
dados. Na extremidade 5 ' do fragmento analisado foi detectada a inserção de cinco nucleótidos e uma delecção de
três nucleótidos. Além de um isolado de pombo, nenhuma outra sequência presente na base de dados exibiu tais
modificações. A análise filogenética efectuada por análise bayesiana também revelou uma estreita relação entre o
flamingo e o isolado de pombo, sugerindo uma possível transmissão entre espécies.
[Avian poxvirus infection in a flamingo of the Lisbon Zoo]
Avian poxviruses (APV) are members of the genus Avipoxvirus in the family Poxviridae spread worldwide in a
variety of hosts. They are very large, oval or brick-shaped enveloped viruses that contain a double stranded DNA
genome in linear configuration. APVs are responsible for a disease usually referred to as pox, characterised by two
main forms (respiratory and cutaneous) as a result of different routes of infection. The cutaneous form, usually
associated with low mortality, occurs following infection by biting arthropods and is characterised by the
appearance of nodular lesions on feather-free regions of the body. The disease can cause significant economic losses
associated with decreased egg production and reduced growth. Live modified virus vaccines have been developed to
prevent disease manifestations in chickens, turkeys, pigeons, canaries and quails. Cross-protection has been
observed in some but not all bird species. Although APVs have been well studied in fowl, little information is
available about pox strains in wild birds.
An American flamingo (Phoenicopterus ruber ruber) of the Lisbon Zoo developed a poxvirus characteristic nodular
lesion on the right foot. The nodule was surgically removed and to date has not yet relapsed. A piece of Flamingo‟s
foot nodule was sent to histopathological analysis and virus isolation. Macroscopically, the nodule appeared as a
white mass of irregular shape and micronodular texture and the histological observation of epidermal hyperplasia
and intracytoplasmic inclusion bodies was consistent with a diagnosis of avian poxvirus infection.
Virus isolation was performed in 12-day-old SPF embryonated chicken eggs, via chorioallantoic membrane (CAM)
inoculation. A thickening of the membrane and the presence of white opaque pocks in the CAM, characteristic of
APV growth were observed. A fragment of 581 bp of the P4b encoding gene was amplified by PCR confirming the
presence of APV. The nucleotide sequence of the amplicon was determined and analysed, showing a high
divergence with the other sequences present in database. A five nucleotides insertion and a three nucleotides
deletion were found in the 5‟ end of the fragment analysed. Apart from an APV pigeon isolate, no other sequence in
the database exhibited these modifications. The phylogenetic analysis performed by Bayesian analysis also revealed
a close relationship between the flamingo and pigeon APV isolates, suggesting a possible interspecies transmission.
170
Poster 52
Enriquecimento de carne de frango com ácidos gordos polinsaturados n-3 através da
suplementação da dieta com semente de linho extrudida e DHA gold™: efeitos no perfil de ácidos
gordos da carne nos níveis de colesterol, tocoferois e tocotrienois
Ribeiro, T.1, Lordelo, M.M.2, Alves, S.P.1, Ferreira, L.M.A.1, Bessa, R.J.B.1, Fontes, C.M.G A.1, Prates, J.A.M.1
2 Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.
Dietas ricas em ácidos gordos ómega 3 (n-3), especialmente em ácidos gordos polinsaturados n-3 de cadeia longa
(n-3 LC-PUFA) tal com o ácido eicopentaenóico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), têm um impacto
positivo na saúde por reduzirem a incidência de doenças cardiovasculares e o risco de outros problemas de saúde.
No entanto, as dietas ocidentais apresentam um desequilíbrio entre os ácidos gordos n-3 e os n-6 devido à reduzida
ingestão de peixe, rico em n-3PUFA em detrimento do aumento da ingestão de carne e de óleos vegetais ricos em n6 PUFA. Contudo, os consumidores estão cada vez mais preocupados com a saúde e nutrição saudável e estão cada
vez mais exigentes, tendo-se verificado um aumento no consumo de carnes brancas. A carne de frango é
caracterizada por um alto conteúdo em PUFA comparativamente com outras carnes e a modulação da qualidade
lipídica da carne em frangos é possível através da alteração das dietas das aves. Esta experiência teve como
objectivo estudar o efeito de duas diferentes fontes de ácidos gordos n-3 (semente de linho extrudida, LS, e DHA
gold™, um produto derivado duma microalga, DHA) no perfil de ácidos gordos e na eficiência de conversão dos
LC-PUFA na carne de peito e da coxa de frangos. Um total de 120 pintos machos Ross 308 foi sujeito a 4 dietas
diferentes (n=10) entre os dias 21 e 35 de idade: um grupo controlo com dieta à base de milho e 3 grupos
suplementados com 7,4% de DHA gold™ (rica em DHA), 15,4% de LS (rica em ácido α-linolenico, percursor dos
n-3 LC-PUFA) ou 3,7% de DHA gold™ juntamente com 7,7% de LS. As dietas dos tratamentos foram formuladas
com o objectivo de conterem 8% de gordura bruta com 2% de n-3 PUFA total no caso dos 3 tratamentos
suplementados. A suplementação com LS resultou numa conversão reduzida do ácido α-linolénico em LC-PUFA,
sugerindo que a metabolização do LNA in vivo não é suficiente para melhorar a qualidade da carne em n-3 LCPUFA. A carne das aves suplementadas com DHA goldTM apresentou os maiores níveis de DHA e do total de n-3
LC-PUFA, revelando que a suplementação directa é a melhor alternativa para modular e melhorar a carne de frango
em ácidos gordos benéficos para a saúde.
[Enrichment of poultry meat with n-3 polyunsaturated fatty acids by dietary supplementation with
extruded linseed and DHA gold™: effects on meat fatty acid]
Diets rich in omega 3 (n-3) fatty acids, especially in n-3 long chain-polyunsaturated fatty acids (n-3 LC-PUFA) such
as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), improve health by reducing the incidence of
cardiovascular diseases and the risk of several other disorders. However, Western diets display an imbalance
between n-6 and n-3 fatty acids due to a reduced intake of fish, rich in n-3 PUFA, in favor to an increase in the
intake in meat and vegetable oils rich in n-6 fatty acids. Nevertheless, consumers are becoming more concerned with
a variety of health issues and, thus, start demanding higher quality foods and in particular white meats. Broiler meat
is characterized by a high PUFA content comparative to other meats. Modulation of lipid meat quality in broilers is
possible through the direct change of the bird‟s diets. This experiment was conducted to study the effect of
introducing two different n-3 fatty acid sources (extruded linseed, LS, and DHA gold™, a DHA-based marine
microalgae product) on the fatty acid profile and in the conversion efficiency of LC-PUFA in breast and thigh meats
of broilers. A total of 120 Ross 308 broilers were subjected to 4 different diets (n=10 for each treatment) between
days 21 and 35 of age: a control group with a corn-based diet and 3 supplemented groups with 7.4% of DHA gold™
(rich in DHA), 15.4% of LS (rich in α-linolenic acid, the precursor of n-3 LC-PUFA) or 3.7% of DHA gold™ plus
7.7% of LS. The 4 dietary treatments were formulated to obtain 8% of fat with 2% of total n-3 PUFA. The data
revealed a direct improvement in the fatty acid nutritional value of meat from birds supplemented with DHA gold TM.
LS supplementation resulted in a poor conversion of α-linolenic acid into LC-PUFA, suggesting that metabolization
of LNA in vivo is not sufficient to improve meat quality in n-3 LC-PUFA. In contrast, meat from birds submitted to
the DHA goldTM treatment had the highest contents of DHA and total n-3 LC-PUFA in muscles, revealing that
direct supplementation is the best alternative to modulate and improve broiler meat in beneficial fatty acids.
171
Poster 53
Caracterização bioquímica e aplicação duma -1,3-1,4-glucanase do Clostridium thermocellum
numa dieta à base de cevada para frangos de carne
Ribeiro, T.1, Lordelo, M.M.S.2, Prates, J.A.M.1, Falcão, L.2, Freire, J.P.B.2, Ferreira, L.M.A.1, Fontes, C.M.G A.1
2 Instituto Superior de Agronomia, 1349-017 Lisboa, Portugal.
Os polissacáridos não-amiláceos (PNAs), tal como os arabinoxilanos e os β-glucanos aumentam a viscosidade da
digesta em aves, levando a uma diminuição da digestão e da absorção dos nutrientes, e do trânsito digestivo. As β1,3-1-4-glucanases reduzem o grau de polimerização dos polissacáridos solúveis resultando em oligossacáridos que
não influenciam a viscosidade da digesta.
As hidrolases glicosidicas (GHs) pertencentes ao celulossoma do C. thermocellum são bastante estáveis e com
afinidade para vários polissacáridos. As subunidades catalíticas do celulossoma contêm também módulos não
catalíticos – os módulos de ligação a carbohidratos (CBMs) que direccionam os substratos para estas enzimas.
Existe uma necessidade de descobrir celulases e hemicelulases eficazes e estáveis e informação sobre a importância
dos CBMs na função das enzimas exógenas usadas na suplementação de dietas à base de cereais para
monogástricos. Neste trabalho, foi caracterizado uma enzima celulossomal do C. thermocellum - GH16, com o
intuito de estudar o seu potencial para suplementação de uma dieta à base de cevada para frangos de carne. Os
estudos bioquímicos da GH16 mostraram que esta enzima é especifica para β-1,3-1,4-glucanos, tal como o
liquenano e -glucanos da cevada., tendo temperatura óptima de actuação de 70ºC e apresentando uma actividade
significativa num grande intervalo de pH, com o máximo de actividade a pH 8.0. A enzima mostrou ser
completamente resistente à inactivação proteolitica num ensaio de 180 minutos.
Esta GH foi testada numa dieta à base de cevada que não foi suplementada com enzimas (C0) ou suplementada com
CtGlc16A ou CtGlc16A-CBM11 ou com uma mistura comercial (C+). 160 pintos machos do dia foram divididos
em 40 gaiolas, com 4 animais cada. O peso vivo final das aves suplementadas com as 3 enzimas exógenas foi
significativamente maior que as aves não suplementadas (C0). Os resultados mostram a capacidade de ambas as
enzimas recombinantes para melhorar o valor nutritivo da dieta à base de cevada. A inclusão do CBM11 na enzima
não teve influência na eficácia da enzima in vivo, na dose de incorporação utilizada. Os resultados sugerem que o
polissacárido está bastante acessível ao ataque enzimático, fazendo com que a presença do CBM11 seja irrelevante
para a função da enzima.A adição de enzimas exógenas têm um efeito importante nas propriedades físicas dos
conteúdos gastrointestinais, apresentando viscosidade e tamanhos mais reduzidos quando comparados com os do
controlo negativo (C0). CtGlc16A mostrou ser activa, termostável e efectiva no aumento do valor nutritivo duma
dieta à base de cevada com elevada viscosidade para frangos de carne.
[Biochemical characterization and application of a thermostable -1,3-1,4-glucanase from Clostridium
thermocellum in improving the nutritive value of an highly viscous barley-based diets for broilers]
Dietary soluble Non-Starch Polysaccharides (NSP), such as arabinoxylans and β-glucans, are known to increase
digesta viscosity leading, in poultry, to a lower efficiency of nutrient digestion and absorption (Smith and Annison,
1996) and to reduce feed passage rates (Van der Klis et al. 1993). β-1,3-1-4-glucanases act by reducing the degree of
polymerization of soluble polysaccharides resulting in oligosaccharide products that have no influence in digesta
viscosity.
C. thermocellum cellulosomal Glycoside Hydrolases (GH) are remarkably stable and active enzymes with several
different targets of polysaccharides. The catalytic cellulosomal subunits also contain non-catalytic Carbohydrate
Binding Modules (CBMs) that target substrates for these enzymes. There are need to discovery effective and stable
cellulases and hemicellulases, and information about the importance of non-catalytic CBMs in the function of
exogenous enzymes used to supplement cereal-based diets for monogastrics.
In this work was characterized the GH16 cellulosomal enzyme from C. thermocellum in view of its potential to
supplement barley-based diets for poultry. Biochemical studies of CtGlc16A shows that the enzyme is specific for
β-1,3-1,4-glucans, such as lichenan and barley -glucan. The optimal temperature of CtGlc16A is 70°C, and with
maximal activity at pH 8.0. The enzyme was completely resistant to proteolytic inactivation in a 180 minute
experiment.
This GH was tested in a barley-based diet that was supplemented with no enzyme (C0) or with CtGlc16A or
CtGlc16A-CBM11, or with a commercial enzyme cocktail (C+). 160 1-day-old chicks were divided into 40 pens,
with 4 animals each. Final body weight of birds supplemented with the 3 exogenous enzyme mixtures was
significantly higher than birds of C0 group. Results demonstrate the ability of both recombinant enzymes to improve
the nutritive value of the barley-based diet. Inclusion of CBM11 in the Clostridial -glucanase had no influence in
the efficacy of the enzyme in vivo, at least at this rate of enzyme incorporation. The data suggest that the
polysaccharide is quite accessible to enzyme attack being the presence of a CBM less important to enzyme function.
Addition of exogenous enzymes had a dramatic effect in the physical properties of GI contents which displayed a
reduced viscosity and showed to be smaller when compared with C0 animals group. CtGlc16A shows to be highly
active, thermostable and effective in rescuing the nutritive value of a highly viscous barley-based diet for broilers.
172
Poster 54
Efeito da substituição dos oligoelementos inorgânicos por levedura orgânica de selénio e
oligoelementos quelatados na qualidade da carcaça e da carne de frango industrial
Tavares, T.1, Mourão, J.L.1, Kay, Z.2, Spring, P.3, Vieira, J.4, Gomes, A.4, Vieira-Pinto, M.1*
1 CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. *Email: [email protected]
2 Solutions Deployment Team, Alltech Biotechnology Centre, Dunboyne, Ireland
3 Swiss College of Agriculture, Zollikofen, Switzerland
4 Sorgal, Ovar, Portugal
O objectivo deste estudo consistiu em comparar a qualidade da carcaça e da carne de frango industrial alimentado
com uma pré-mistura comercial de oligoelementos inorgânicos (controlo) com a de frangos alimentados com
recurso aos mesmos oligoelementos sob a sua forma orgânica (OTM). O tratamento OTM incluiu o uso de uma
levedura orgânica de selénio (Se) e de quelatos (proteinatos) de cobre (Cu), zinco (Zn), manganésio (Mn) e ferro
(Fe). Foram usados 4 pavilhões com condições idênticas, onde foram alojados 119.500 não sexados, em densidades
de alojamento igualmente semelhantes (2 tratamentos × 2 réplicas). Todas as aves foram alimentadas com recurso a
um mesmo alimento à base de milho e soja, que diferia apenas entre os tratamentos em relação à pré-mistura mineral
utilizada. O tratamento controlo continha Zn, Fe, Mn e Se nas doses de 8, 40, 50, 60 e 0.18 ppm, respectivamente,
enquanto o tratamento OTM continha 5, 20, 5, 20 e 0.3 ppm dos mesmos oligoelementos, respectivamente. As aves utilizadas
para este estudo foram abatidas aos 31 dias de idade, tendo sido determinados ao abate o rendimento de carcaça (n=4), e as
frequências de lacerações de pele (n=2400) e de ampolas de peito (n=2400), de forma a avaliar a qualidade da carcaça.
Durante o período de conservação da carne, a sua qualidade foi avaliada com recurso às medições do seu pH (n=80),
exsudação (n=80) e cor (n=80). Nas carcaças do grupo OTM não foram registados efeitos quanto ao seu rendimento ou
ocorrência de ampolas de peito, tendo sido registada uma diminuição na frequência das lacerações de pele nas carcaças deste
grupo (P <0,05). Em relação ao pH e exsudação da carne não foram obtidas diferenças entre os tratamentos. As aves
alimentadas com a fonte orgânica dos oligoelementos referidos apresentaram maiores valores de a* (P <0,05) da sua carne
nos dias 3 e 5 após o abate, isto é, uma carne mais avermelhada, revelando maior estabilidade oxidativa da mesma durante a
sua conservação. Estes resultados mostram que o uso da forma orgânica dos oligoelementos referidos permite melhorias na
qualidade da carcaça e da carne durante o seu período de armazenamento, que poderão levar a uma melhor aceitação por
parte do consumidor e a um prolongamento da sua vida útil.
[The effect of replacing inorganic trace minerals with selenium yeast and organic mineral chelates
on broiler carcass and meat quality]
The aim of the study was to compare the carcass and meat quality profiles of broilers fed with a commercial inorganic
mineral premix (control) with the ones obtained using the same minerals under their organic form (OTM). OTM treatment
included selenium yeast and organic mineral chelates of copper (Cu), zinc (Zn), manganese (Mn) and iron (Fe). Four identical
houses with a total of 119.500 mixed-sex broiler chickens were used with similar stocking densities (2 treatments × 2
replicates). Birds fed the same corn/soybean based rations differing only in mineral premix. The control treatment provided
Cu, Zn, Fe, Mn and Se at 8, 40, 50, 60 and 0.18 ppm, respectively. The OTM contained 5, 20, 5, 20 and 0.3 ppm,
respectively. The birds used in this trial were slaughtered at 31 days of age, when carcass yield (n=4) and the frequency of
skin tearing (n=2400) and breast blisters (n=2400) were calculated, in order to evaluate carcass quality. During the period of
conservation of the meat its quality was evaluated through the determination of pH (n=80), drip loss (n=80) and meat colour
(n=80). OTM carcasses showed no effect on carcass yield and breast blisters, but less carcass skin tearing (P <0.05). About
meat pH and drip loss, no differences were obtained among treatments. Birds fed with organic minerals showed higher a*
values (P<0.05) on days 3 and 5 after slaughter or, in other words, redder breast meat, what indicated better oxidative stability
of the meat. The results show OTM treatment allows an improvement on carcass and meat quality during its storage, possibly
leading to its better acceptance by the consumers and to a larger poultry meat shelf-life.
173
Poster 55
Influência da época de abate e do região muscular na composição em ácidos gordos e valor
nutricional da gordura intramuscular da vitela Mirandesa-DOP
Pestana, J.1,2*, Costa, A.1, Alves, S.3,4, Martins, S.1, Alfaia, C.1, Bessa, R.J.B.1, Prates, J.A.M.1
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária (TULisbon), Universidade Técnica de Lisboa, Portugal
2 GIRM-Instituto Politécnico de Leiria, Portugal
3 INRB-Unidade de Investigação em Produção Animal, Portugal
4 REQUIMTE, ICBAS, Universidade do Porto, Portugal. Email: *[email protected]
A gordura e a composição em ácidos gordos da carne são critérios importantes na sua avaliação nutricional e com
possíveis repercussões na saúde do consumidor. Neste trabalho avaliou-se a influência da estação do ano (final da
Primavera e início do Outono), do tipo de músculo (longissimus lumborum, LL and semitendinosus, ST) sobre a
composição em ácidos gordos e no valor nutricional da carne de vitela Mirandesa-DOP. Bezerros da raça Mirandesa
(n=29) foram criados em produção tradicional baseada nas especificações técnicas da carne Mirandesa-DOP
(Regulamento nº 1263/96 de 01/07 da UE). A carne Mirandesa-DOP combina as características genéticas da raça e
da alimentação baseada nos recursos naturais do Nordeste de Portugal. O teor de lípidos totais foi obtido
gravimetricamente, depois da gordura intramuscular ter sido extraída com diclorometano:metanol (2:1, v/v). Os
ácidos gordos foram convertidos em metil-ésteres através de transesterificação com solução de NaOH (0.5M),
seguida da adição de solução de HCl:metanol (1:1, v/v). A separação e quantificação dos ácidos gordos foi obtida
por GC-FID. O teor de lípidos totais foi maior (P <0.001) no músculo LL, do que no músculo ST, mas não foi
influenciado pela estação do ano. Quanto aos lípidos totais e aos somatórios parciais dos ácidos gordos (SFA,
MUFA, TFA, BCFA, PUFA, n-3 e n-6 PUFA) e aos índices n-3/n-6 e PUFA/SFA, todos eles foram afectados pelo
tipo de músculo. Relativamente à estação do ano, foi encontrado para os n-3 PUFA, maiores valores percentuais na
carne de início da Primavera. Além disso, observaram-se interacções significativas entre a estação do ano e o tipo de
músculo no BCFA (P<0.05) e no índice n-3/n-6 (P<0.001). Do ponto de vista nutricional, a gordura intramuscular
da Mirandesa-DOP, apresenta um elevado valor nutricional ao longo do ano, com um índice n-3/n-6 e uma
percentagem de n-3 PUFA favoráveis para a saúde do consumidor, resultante do efeito benéfico do consumo de erva
pelos animais.
Individual fellowships to José Pestana (SFRH/PROTEC/2009/50138) doctorate fellowship (SFRH/BD/2007/37793 and
SFRH/BD/2009/61068 to Susana Alves and Ana Costa, respectively) and financial support by projects (PTDC/CVT/2006/66114)
are acknowledged.
[Influence of slaughter season and muscle type on fatty acid composition and nutritional value of
intramuscular fat of Mirandesa-PDO veal]
Meat fat and its fatty acid composition are important criteria for nutritional evaluation and human health concern.
The purpose of this work was to assess the influence of slaughter season (late spring and early autumn) and muscle
type (longissimus lumborum, LL and semitendinosus, ST) on fatty acid composition and nutritional value of
Mirandesa-PDO beef. Mirandesa purebred calves (n=29) were maintained according to the traditional production
pasture-based system under the Mirandesa-PDO product specification (Commission Regulation nº. 1263/96 of
01/07, EEC). Mirandesa-PDO meat combines the specific genetic features of Mirandesa calves with the use of
extensive natural resources in the northeastern area of Portugal. Total lipids were measured gravimetrically after
intramuscular fat extraction with dichloromethane/methanol (2:1 v/v). Fatty acids was converted to methyl esters by
a sequential transesterification reaction with NaOH in anhydrous methanol (0.5M), followed by HCl:methanol (1:1
v/v). The separation and quantification of fatty acids were obtained by GC-FID. Total lipid content was higher
(P<0.001) in LL muscle, compared with ST muscle, but was not affected by the slaughter season. Their partial sums
(SFA, MUFA, TFA, BCFA, PUFA, n-3 and n-6 PUFA) and n-3/n-6 and PUFA/SFA ratios were also affected by
muscle type. Relatively, a seasonal variation was found for n-3 PUFA, which showed higher percentages in beef
from late spring. In addition, significant interactions between slaughter season and muscle type were found for
BCFA (P<0.05) and n-6/n-3 ratio (P<0.001). From a human health standpoint, intramuscular fat in Mirandesa-PDO
veal has a high nutritional value throughout the year, with favorable ratios of n-6/n-3 and n-3 PUFA contents, as a
result of the beneficial effect of grass feeding.
174
Poster 56
Variabilidade da textura das carnes de bovino Carnalentejana-DOP, nacional indiferenciada e
importada do Brasil existentes no mercado Português
Monteiro, A.C.G.*, Fontes, M.A., Prates, J.A.M., Costa, P. e Lemos, J.P.C.
* Email: [email protected]
A medição instrumental de textura é feita por um dinamómetro que fornece energia mecânica a uma velocidade
constante. O resultado é uma curva de força vs tempo onde a variação da textura do material é registada. Os testes
mais frequentemente utilizados são testes de corte ou compressão, os quais medem um único parâmetro, e nenhum
imita a complexidade do processo de mastigação. Além disso, os seres humanos medem e integram as percepções
sensoriais do material durante a sua contínua transformação no processo de mastigação.
O teste “texture profile analysis” (TPA) tem a vantagem de poder avaliar várias variáveis, como dureza,
adesividade, coesividade, elasticidade, resiliência e mastigabilidade, num só teste.
O estudo foi desenvolvido em quinze amostras do músculo longissimus lumborum de três tipos de carne:
Carnalentejana-DOP, nacional indiferenciada e importada do Brasil. Foram utilizados três bifes com 25 mm cada:
um para a força de corte (WBSF), um para o TPA e um para a análise sensorial.
A carne nacional indiferenciada apresentou o coeficiente de variação (CV) mais baixo na WBSF (36% and 23%
inferior à Carnalentejana-DOP e à carne Brasileira) e o CV mais elevado na dureza e mastigabilidade (50% e 24%
superior à Carnalentejana-DOP assim como, 24% e 52% superior à carne Brasileira, respectivamente). O CV mais
elevado no parâmetro adesividade foi apresentado pela carne Brasileira, o qual foi 22% e 34% mais elevado do que
os valores apresentados pelas Carnalentejana-DOP e carne nacional indiferenciada, respectivamente. A
Carnalentejana-DOP apresentou CV inferiores na coesividade e resiliência do que as carnes Brasileira (32% e 54%,
respectivamente) e nacional indiferenciada (26% e 59%, respectivamente).
A adesividade apresentou o valor mais elevado, enquanto a elasticidade apresentou o valor mais baixo de CV de
todos os parâmetros de TPA medidos.
Nos atributos sensoriais todas as carnes apresentaram valores similares de CV, com excepção dos off-flavours, nos
quais a Carnalentejana-DOP e a carne nacional indiferenciada apresentaram valores muito elevados, em resultado de
apenas em algumas amostras terem sido detectados off-flavours.
Na generalidade dos parâmetros estudados a carne nacional indiferenciada foi a que apresentou maior variabilidade.
[Textural properties variability of Carnalentejana-PDO, national undifferentiated and Brazilian
beef from Portuguese market]
The instrumental measurement of texture is made by a dynamometer that provides mechanical energy at constant
speed. The result is a force versus time curve where, according to the geometry used in the test, the texture variation
of the material is registered. The most commonly used, shear force and compression tests, rely on measuring a
single parameter, and none fully imitate the complexity of the chewing motion. Moreover, humans measure and
integrate sensory perceptions on a material that undergoes continuous transformation during chewing. Texture
profile analysis (TPA) test has the advantage that one test can assess many variables with the double compression
cycle, like hardness, adhesiveness, cohesiveness, springiness, resilience and chewiness.
The study was performed with fifteen samples of longissimus lumborum from each of the beef types,
Carnalentejana-PDO, national undifferentiated and Brazilian beef. Three 25 mm steaks were cut, one for WarnerBratzler shear force (WBSF), one for TPA and one for sensory panel.
National undifferentiated beef showed the lowest coefficient of variation (CV) in WBSF, (36% and 23% lower than
in Carnalentejana-PDO and Brazilian beef) and the highest CV in hardness and chewiness. The hardness and
chewiness CVs of national undifferentiated beef were 50% and 24% higher than the value presented by PDO, as
well as 24% and 52% higher than the value presented Brazilian beef, respectively.
The highest adhesiveness CV was showed by Brazilian beef, which was 22% and 34% higher than the one presented
by PDO and national undifferentiated beef, respectively.
Carnalentejana-PDO beef presented cohesiveness and resilience CV values lower than Brazilian (32% and 54%,
respectively) and national undifferentiated (26% and 59%, respectively) beef.
The adhesiveness parameter presented the highest, whilst springiness presented the lowest CV of the six TPA
parameters assessed.
All beef types had similar CV values in attributes evaluated by sensory analysis. Off-flavour parameter was the
exception due to the fact that only a few samples of Carnalentejana-PDO and national undifferentiated beef
presented off-flavours. In the majority of beef samples from these two beef types, off-flavours were not detected.
Overall, national undifferentiated was the most variable beef type in textural parameters measured.
175
Poster 57
Segurança da carne de bovino: preocupações comuns para a ciência e os consumidores
Viegas, I.1, Santos, J.L.2, Barreto, A.1 e Aguiar Fontes, M.1
1 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal. Email: [email protected];
[email protected]
2 Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
As preocupações dos consumidores Europeus com os alimentos evoluíram da disponibilidade para a segurança, não
só devido à evolução das sociedades em termos de fornecimento de alimentos, mas também devido à ocorrência de
crises de segurança alimentar. Estas crises têm tido proporções inéditas, tanto no número de afectados e na área
geográfica envolvida, como também em termos de impacto mediático. Neste contexto, qualquer que seja a atitude
dos consumidores em relação à segurança alimentar, pode ter influência sobre as suas opções de consumo, com
possíveis consequências nos mercados.
Embora a maioria dos consumidores confie na segurança dos alimentos disponíveis, e nem sequer considere que o
que consome possa ter efeitos deletérios, são relatadas algumas preocupações com a segurança de carne bovina
(BSE, resíduos de agentes anti-bacterianos e de hormonas, Organismos Geneticamente Modificados).
Estas preocupações são muitas vezes díspares das evidências científicas ou das imposições legais. Há no entanto
uma questão em relação à qual as preocupações expressas pela comunidade científica podem ser relacionadas com
as preocupações dos consumidores: a presença de resíduos de agentes anti-bacterianos na carne. Esta preocupação
dos consumidores é uma questão científica em aberto que a literatura aponta como um problema, embora o
verdadeiro motivo científico esteja além dos conhecimentos da maioria dos consumidores. Além disso, este pode ser
um campo onde o enquadramento jurídico europeu não supriu completamente as preocupações dos consumidores,
seja por razões técnicas, legais ou de comunicação.
Resumindo, esta parece ser uma área onde as preocupações dos consumidores, a ciência e o enquadramento jurídico
parecem partilhar uma base comum de necessidade de novas estratégias. No entanto, no campo científico esta
questão provavelmente permanecerá aberta por algum tempo, devido à sua complexidade e à dificuldade em
estabelecer relações causais. Além disso, o enquadramento jurídico para a produção de carne é já extenso, pelo que
nova legislação sobre questões sem consenso científico iria provavelmente dar origem a conflitos.
Neste contexto, pode-se propor uma solução de mercado, na forma de uma estratégia de qualidade dirigida a
segmentos de consumidores dispostos a pagar mais por carne com garantias adicionais em matéria de controlo de
resíduos de agentes anti-bacterianos. Embora a segurança dos alimentos esteja sempre garantida pelos níveis de
protecção definidos pela legislação comunitária, alguns consumidores podem estar dispostos a pagar mais por este
tipo de produto. Deste modo, esta estratégia poderia representar um apoio para sectores específicos de produção de
carne bovina
[Beef Safety: concerns common to Science and Consumers]
European consumers‟ concerns about food have slowly shifted from food security to food safety, induced not only
by societies‟ evolution in terms of food availability, but also more recently by some food scares of previously
unseen dimensions, both for the number of people affected and geographical area involved, but also for the media
coverage. In such context, whatever the attitudes consumers have towards food safety, they might have major
influence over their consumption options, with possible consequences for products‟ market shares.
Although most of the time consumers trust their food won‟t make them ill, and don‟t even consider the possibility
that food available can have deleterious effects, there are reported concerns about beef safety (BSE, antibacterials
and hormones‟ residues, GMOs).
These concerns are often discordant in subject and proportion with scientific evidence or legal impositions. There is,
however, an issue where evidences and worries expressed by the scientific community may be more closely related
with consumers‟ concerns: antibacterials‟ residues in beef. This concern consumers state about beef safety is
actually an open scientific question that the literature points out as a real problem, even if the real scientific
reasoning on this issue is beyond the knowledge of most consumers. Moreover, the safety guarantees on
antibacterials‟ residues control may be a field where also the European legal framework hasn‟t met consumers‟
concerns, either by technical, legal or communicational reasons.
Summarizing, antibacterials‟ residues in beef seem to be an area where consumers‟ concerns, scientific evidence and
legal framework seem to share common grounds in the need to establish new strategies. However, it can be
suggested that the unsolved questions around this issue will probably remain open for some time, as it represents a
complex scientific issue due to difficulties in establishing causal relationships. Moreover, the legal framework on
beef production is already very extensive, and new legislation on issues still to gather scientific consensus would
probably raise conflicts.
Within this context, a market solution could be proposed, in the shape of a user-oriented quality differentiating
strategy for beef aiming at consumer segments willing to pay premiums for beef with increased guarantees
concerning antibacterials‟ residues control. Although food safety is always guaranteed by the levels defined by
European law, some consumers may be willing to pay more for such beef products, which may therefore provide
some support to specific beef production sectors.
176
Poster 58
Influência do tipo de embalagem e temperatura de armazenamento na conservação de
hambúrgueres de bovino
Abraão, A., Silva, J.A., Leite, A., Borges, F., Martins, C. e Saraiva, C.*
ECAV, DCV-CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. *Email: [email protected]
A carne picada é um produto muito apreciado pelo consumidor, contudo a sua vida útil é limitada, devido à grande
manipulação e área de superfície exposta, o que facilita a deterioração, levando a perdas económicas do produto. A
embalagem em atmosfera modificada é utilizada pela indústria para reduzir a deterioração de carne picada, contudo,
os efeitos benéficos induzidos por esta são bastante reduzidos quando o armazenamento é realizado a temperaturas
abusivas.
Este trabalho teve como objectivos determinar o efeito de três tipos de embalagem (atmosfera modificada com 70%
de O2, 20% de CO2 e 10% de N2, vácuo normal e vácuo retráctil) e três temperaturas de armazenamento (2, 5 e 8ºC)
na conservação de hambúrgueres de bovino. Para tal, procedeu-se à avaliação de parâmetros microbiológicos:
bactérias do ácido láctico (BAL); Brochothrix termosphacta; Enterobacteriaceae; Pseudomonas spp.; fungos;
microrganismos mesófilos e psicrotróficos); parâmetros físico-químicos: pH; Eh; ABVT; TBArs; coordenadas de
cor L*a*b* e análise sensorial por um painel de 10 pessoas, para avaliação da cor (vermelha, castanha e púrpura) e
apreciação global de frescura antes e após a abertura da embalagem e ainda o cheiro a deteriorado após a abertura da
embalagem. Estes parâmetros foram analisados após obtenção das amostras num talho local (dia 0) e nos dias 1, 3,
6, 9 e 12 de armazenamento. Foram analisados 4 lotes de amostras.
A multiplicação dos microrganismos em estudo foi claramente influenciada pela temperatura de armazenamento e,
no caso de Pseudomonas spp., fungos e Brochotrix thermosphacta em alguns tempos pelo tipo de embalagem, bem
como pela sua interacção no caso de Brochotrix thermosphacta no tempo 12.
Os teores de TBArs foram marcadamente influenciados pelo tipo de embalagem, com as amostras embaladas em
atmosfera modificada a exibir valores superiores aos dois tipos de vácuo.
Os parâmetros a* e a cor avaliada pelo painel foram nitidamente influenciados pela temperatura e pelo tipo de
embalagem, bem como pela interacção de ambos os efeitos. Observou-se uma diminuição da cor vermelha e
aumento da cor castanha ao longo do tempo de armazenamento nas amostras embaladas em atmosfera modificada,
mais evidente com o aumento da temperatura.
A apreciação global de frescura foi particularmente influenciada pela cor na carne embalada e pelo cheiro a
deteriorado depois da abertura da embalagem.
No geral, o vácuo retráctil mostrou ser a melhor solução de embalagem para comercialização de hambúrgueres
frescos de bovino.
[Effect of type of packaging and storage temperature on conservation of hamburgers’ beef]
Minced meat is very appreciated by consumers, but its shelf life is limited due to the extensive handling and exposed
surface area, which facilitates the deterioration, leading to economic losses of the product. The modified atmosphere
packaging is recognized as one the most effective methods for extending the shelf life of fresh meat, and is used by
the industry to reduce minced meat spoilage, however, its beneficial effects are reduced when the storage is held at
inadequate temperatures.
The aim of this study was to determine the effects of three types of packaging (MAP with 70% O 2/ 20% CO2/ 10%
N2, normal vaccum and shrink vaccum) and three storage temperatures (2, 5 and 8ºC). For such, we proceeded to the
evaluation of microbiological parameters: LAB, Brochotrix termosphacta, Enterobacteriaceae Pseudomonas spp.,
fungi and TVC; physicochemical parameters: pH, Eh, TVB-N, TBArs, L*a*b* coordinates and sensory attributes by
10 panelists, which evaluated color (red, brown and purple) and global freshness assessment before and after
opening the package and spoilage odour after opening the package. These parameters were analyzed after the
collection of the samples from a local butcher shop (day 0) and on days 1, 3, 6, 9 and 12 of storage. Four batches of
samples were analyzed.
The development of the studied microorganisms was clearly influenced by storage temperature, and in the cases of
Pseudomonas spp., fungi and Brochotrix thermosphacta was influenced by the packaging type too, as well as the
interaction of both factors in this last case.
The levels of TBArs were markedly influenced by the packaging type, with the samples packed in modified
atmospheres exhibiting higher values than the both vacuum types.
The a* parameter and the color evaluated by the panel were significantly influenced by temperature, type of
packaging as well as the interaction of both effects. It was observed a decrease in red color with subsequent brown
color increase on the samples packed under modified atmosphere. This is more evident with temperature increase.
The global assessment of freshness was particularly influenced by the color of packed meat and by the spoilage
odour after the package opening.
Overall, the shrink vacuum proved to be the best packaging solution for the fresh burgers sale.
177
Poster 59
Mecanismos de resistência a antibióticos e factores de virulência em isolados de Escherichia coli de
ovinos recuperados durante o abate
Ramos, S. 1,4*, Igrejas, G.3,4, Radhouani, H.1,4, Gonçalves, A. 1,4, Pacheco, R.1, 4, Capelo-Martinez, J.L.5,6, Poeta, P.1,2
1 Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
3 Centro de Genómica e Biotecnologia, Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real,
Portugal
4 Departamento de Genética e Biotecnologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
5 REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, FCT, Universidade Nova de Lisboa, Caparica, Portugal
6 Grupo BIOSCOPE, Departamento de Química e Física, Faculdade de Ciências, Universidade de Vigo no Campo de Ourense, Ourense, Espanha
O uso de antibióticos na produção de animais de consumo levou ao frequente isolamento de estirpes de Echerichia
coli multirresistentes. O presente estudo teve como finalidade analisar a susceptibilidade a antibióticos, respectivos
mecanismos de resistência implicados e factores de virulência em 54 isolados de E. coli recuperados de fezes de
ovinos. Cada isolado foi estudado quanto á susceptibilidade a 16 antibióticos pelo método de Kirby-Bauer segundo
as normas CLSI. A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) foi usada para detectar os seguintes genes que
codificam resistência a antibióticos: blaTEM, blaSHV, blaOXA, tet(A), tet(B), aadA, strA/B, aac(3)-II/IV, cmlA, floR,
sul1/2/3, intI1, intI2 e qacE1. A região variável dos integrões foi analisada em todos os isolados resistentes ao
trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT). Os principais grupos filogenéticos (A, B1, B2 e D) e os genes codificadores
dos factores de virulência (fimA, papC, aer, stx, papGIII e cnf1) foram também estudados pela técnica de PCR.
Foram obtidas percentagens de resistência de 70,4%, 53,7%, e 57,4% para os antibióticos tetraciclina,
estreptomocina e amoxicilina-ácido clavulânico, respectivamente. Obtivemos ainda, percentagens intermédias para
o SXT e a ampicilina (33,3%, e 37% respectivamente) e percentagens baixas de resistência para os antibióticos
(entre 5,5 e 1,9%) cloranfenicol, ácido naladixico, ciprofloxacina, amicacina, gentamicina e tobramicina. Os
seguintes genes de resistência foram detectados: blaTEM (em 15 dos 20 isolados resistentes á ampicilina), tet(A) e/ou
tet(B) (em 21 dos 38 isolados resistentes á tetraciclina), aadA ou strA/B (em 23 dos 29 isolados resistentes á
estreptomicina), cmlA (em 2 dos 3 isolados resistentes ao cloranfenicol), aac(3)-II (nos 2 isolados resistentes á
gentamicina), e sul1 e/ou sul2 e/ou sul3 (nos 18 isolados resistentes ao SXT). O gene intI1 foi detectado em 9 dos
isolados resistentes ao SXT e o gene intI2 em 2 dos isolados; identificamos 2 genes cassetes entre os integrões de
classe 1 (aadA1 e dfrA1+aadA1) e 1 entre os integrões de casse 2 (dfrA1+sat2+aadA1). A maior parte dos isolados
foi incluída nos grupos filogenéticos A ou B1. Dois isolados foram incluídos no grupo B2 e outros 2 no grupo D.
Quase todos os isolados apresentaram factores de virulência (42 fimA, 6 fimA+aer e 4 fimA+papC).
[Mechanisms of antibiotic resistance and virulence factors in Escherichia coli isolates from sheep at
slaughter]
The use of antimicrobial agents in food animal production leads to frequently isolation of antimicrobial-resistant
Escherichia coli from animals. In the present study we analysed the antibiotic susceptibility, the mechanisms of
resistance implicated and the virulence factors in 54 E. coli isolates recovered from sheep. Antimicrobial
susceptibility was performed by agar disk diffusion method as recommended by the CLSI using 16 antimicrobial
agents. Genes encoding for antibiotic resistance blaTEM, blaSHV and blaOXA tet(A), tet(B), aadA, strA/B, aac(3)-II/IV,
cmlA, floR, sul1/2/3, intI1, intI2 and qacE1 were studied by PCR. The variable region of integrons was analyzed in
all trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT) resistant isolates. The main phylogenetic groups (A, B1, B2 and D) and
the virulence factors genes (fimA, papC, aer, stx, papGIII and cnf1) were also studied. Resistance percentages of
70.4%, 53.7%, and 57.4% were obtained to tetracycline, streptomycin and amoxicillin-clavulanic acid, respectively.
Intermediate percentages to SXT and ampicillin (33.3%, and 37% respectively) and low percentages (5.5 to 1.9%)
were obtained to chloramphenicol, nalidixic acid, ciprofloxacin, amikacin, gentamycin and tobramycin. The
following resistance genes were detected: blaTEM (15 of 20 ampicillin-resistant isolates), tet(A) and/or tet(B) (21 of
38 tetracycline-resistant isolates), aadA or strA/B (23 of 29 streptomycin-resistant isolates), cmlA (2 of 3
chloramphenicol-resistant isolates), aac(3)-II (all 2 gentamicin resistant isolates), and sul1 and/or sul2 and/or sul3
(all 18 SXT-resistant isolates). The intI1 gene was detected in 9 SXT-resistant isolates and the intI2 gene in 2
isolates; 2 different gene cassette arrangements were identified among class 1 integrons (aadA1 and dfrA1+aadA1)
and one among the class 2 integrons (dfrA1+sat2+aadA1). Most of the isolates were included in the A or B1
phylogenetic groups. Two isolates were classified as B2 and other 2 into the D group. The majority of the resistant
isolates harbored virulence factors (42 fimA, 6 fimA+aer and 4 fimA+papC).
178
Poster 60
Detecção e identificação molecular de micobactérias de gânglios linfáticos de suínos abatidos para
consumo
Miranda, C.1, Matos, M.2, Álvares, S.1, Ribeiro, P.3, Pires, I.1, Vieira-Pinto, M.1,*, Coelho, A.C.1
1 Departamento de Ciências Veterinárias, CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
2 Departamento de Genética e Biotecnologia, Instituto de Biotecnologia e Bioengenharia, Centro de Genómica e Biotecnologia, Universidade de
Trás-os-Montes e Alto Douro (IBB/CGB-UTAD), Vila Real, Portugal
3 Direcção de Serviços Veterinários da Região Norte, Divisão de Intervenção Veterinária de Vila Real – Núcleo do Corgo, Vila Real, Portugal
*Email: [email protected]
As micobacterioses dos suínos são infecções crónicas provocadas por bactérias do género Mycobacterium,
caracterizadas por lesões de linfadenite do tipo granulomatosa, localizadas, principalmente, nos gânglios linfáticos
mesentéricos e submaxilares. Nos últimos anos observou-se um aumento da incidência desta infecção, detectada no
exame post mortem em matadouros. As micobactérias pertencentes ao Complexo Mycobacterium avium são as
principais responsáveis pelas linfadenites granulomatosas de suínos, detectadas em matadouro, e as oportunistas
mais comuns, detectadas nas infecções bacterianas em humanos, principalmente, imunodeprimidos.
Neste estudo pretendeu-se detectar Mycobacterium spp. em gânglios linfáticos com linfadenite granulomatosa em
suínos abatidos para consumo. Utilizaram-se 50 gânglios linfáticos de suínos com lesões compatíveis por
Mycobacterium spp., recolhidos durante o exame post mortem em quatro matadouros situados na região norte de
Portugal. Todas as amostras foram congeladas a -20 ºC, e posteriormente realizou-se a extracção de DNA, através
de um Kit comercial. As amostras foram inicialmente testadas por uma técnica de PCR 16S rDNA que permite a
identificação do género Mycobacterium e a distinção entre M. avium e M. intracellulare. Posteriormente, efectuouse o ensaio de PCR “multiplex”, que permite a diferenciação das subespécies de M. avium. Identificou-se por PCR,
o género Mycobacterium em 41 (82%) amostras, das quais 30 (60%) eram Mycobacterium avium. Destas últimas,
identificou-se M. avium avium em 16 (32%) amostras.
Este estudo permitiu confirmar a ocorrência de infecção por Mycobacterium em suínos abatidos para consumo em
Portugal, o que reforça a importância de análise microbiológica de gânglios linfáticos em matadouros como medida
de vigilância das doenças. A PCR directamente de tecidos facilita esta tarefa, fornecendo um diagnóstico definitivo
num espaço de tempo curto.
[Detection and molecular identification of mycobacteria from lymph nodes of slaughtered pigs for
consumption]
Swine mycobacteriosis is a chronic infection caused by bacteria belonging to the genus Mycobacterium
characterized by granulomatous lymphadenitis in the submaxillary and mesenteric lymph nodes. In recent years the
incidence of this infection, detected by post mortem examination at slaughterhouses, had increased. Mycobacterium
avium complex members are frequently associated the granulomatous lymphadenitis in swine. Opportunistic human
infections have been reported, especially in immunocompromised patients.
The aim of this study was to detect Micobacterium spp. of in the lymph nodes of pigs slaughtered for consumption.
During the post mortem inspection of slaughtered pigs in 4 slaughterhouses in northern Portugal, lymph nodes
(submaxillary and mesenteric) in 50 animals were collected. All samples were frozen at -20 °C and subsequently
held the extraction of DNA, using a commercial kit. Samples were initially tested by a 16S rDNA PCR technique
that allows the identification of the genus Mycobacterium and the distinction between M. avium and M.
intracellulare. Subsequently, the test is performed PCR multiplex, which allows the differentiation of subspecies of
M. avium. Of the latter, we detected M. avium avium in 16 (32%) samples.
This study confirmed the occurrence of Mycobacterium infection in pigs slaughtered for consumption in Portugal,
which reinforces the importance of microbiological examination of lymph nodes in slaughterhouses as a measure of
disease surveillance. PCR directly from tissues make this task easier by providing a definitive diagnosis in a short
time.
179
Poster 61
Salmonella sp. em fígado e lingua de suíno
Vieira, M.J.1, Oliveira, M.2, Fontes, M.C.1, Themudo, P.3, Semedo-Lemsaddek, T.2 e Vieira-Pinto, M.1
1 Departamento de Ciências Veterinárias, CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
3 Laboratório de Bacteriologia, Unidade de Sanidade Animal, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa,
Portugal
Nos últimos anos, a importância da carne de porco como veículo de salmonelose humana tem sido enfatizada. O
principal objectivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de Salmonella sp. nas duas principais miudezas de suínos
(língua e fígado). Para tal recolheram-se 120 amostras (zaragatoa da língua, n= 40; zaragatoa de fígado, n = 40;
parênquima hepático, n= 40) num matadouro, em 8 dias de amostragem durante cinco meses. Salmonella sp. foi
isolada pelo método convencional (ISO 6579:2002) e os isolados foram analisados por serotipagem (Método de
Kauffmann-White no LNIV), por testes de avaliação do perfil de resistência a antimicrobianos (ARP), e por
genotipagem (RFLP-PFGE), para identificar as relações clonais e potenciais fontes de contaminação. A maior taxa
de ocorrência de Salmonella sp. foi observada nas amostras da língua (10/40, 25%), seguida pelas amostras de
zaragatoa do fígado (5/40; 12,5%) e pelo parênquima hepático (4/40; 10%). O perfil de macrorestrição (MRP) pela
Xba I permitiu definir oito genótipos entre os três sorótipos identificados: S. Rissen (5), S. Typhimurium (2) e S.
4,5,12: i: - (1). Estirpes de S. Rissen com o mesmo MRP / ARP foram obtidos a partir de zaragatoas de língua de
dias diferentes, sugerindo fontes de contaminação comum e a persistência de clones ao longo do processo de abate
ou na abegoaria. Os resultados observados nas amostras de parênquima de fígado (10%), foram muito semelhantes
aos observados nos linfonodos íleo-cecais (10,3%) do estudo base de prevalência de Salmonella sp. em suínos ao
abate na União Europeia (EFSA, 2008). A presença de Salmonella sp. nos gânglios mesentéricos, que são removidos
e não são consumidos, representa um risco limitado, enquanto que um fígado contaminado com Salmonella sp. pode
constituir um maior risco devido à disseminação através da cadeia alimentar. Entre as amostras positivas, a presença
de S. Typhimurium (16%) e de S. 4, [5], 12: i: - (5%) deve ser enfatizada uma vez que constituem importantes
serótipos isolados de casos humanos notificados na UE (EFSA, 2010). Os resultados sublinham a importância de
Salmonella sp. em amostras de língua e de fígado de suínos ao abate, disponíveis, directa ou indirecta (através de
produtos de carne) para consumo humano, sugerindo que medidas adicionais deveriam ser tomadas para melhorar as
condições de higiene no sentido de minimizar a disseminação de Salmonella sp. durante o processo de abate, por
exemplo durante a evisceração, a extracção das amígdalas ou durante a inspecção sanitária, assim como ao longo da
cadeia de processamento e de venda.
[Salmonella sp. in liver and tongue from pigs]
In recent years, the importance of pork as a source of human Salmonellosis has been highlighted. The main aim of
the survey was to estimate the occurrence of Salmonella sp. on the two most important pig edible offal (tongue and
liver). During this study, 120 samples from slaughtered pigs (tongue swabs, n=40; liver swabs, n=40; liver
parenchyma, n=40) were collected in a slaughterhouse along 8 sampling days during 5 months. Salmonella sp. was
isolated using the conventional microbiological method (ISO 6579:2002). Isolated strains were analyzed using
serotyping (Kauffmann-White scheme in the LNIV), antimicrobial resistance testing (ARP) and genotyping (RFLPPFGE), to identify clonal relationships and potential contamination sources. The highest occurrence of Salmonella
sp. was observed in tongue samples (10/40; 25%), followed by the liver swab (5/40; 12.5%) and the liver
parenchyma samples (4/40; 10%). XbaI macrorestriction allowed defining 8 genotypes (MRP) among the 3 analyzed
serotypes: S. Rissen (5), S. Typhimurium (2) and S. 4,[5],12:i:- (1). Strains of S. Rissen with the same MRP/ARP
were obtained from tongue swabs of different days, suggesting common contamination sources and the persistence
of clones along the slaughter process or in the lairage. Results from the liver parenchyma (10%), were very similar
to the observed on the ileo-caecal lymph nodes (10.3%) reported on the baseline survey on the prevalence of
Salmonella in slaughter pigs, in the EU (EFSA, 2008). The presence of Salmonella sp. in the intestinal lymph nodes,
which are removed and are not consumed, may only represent a limited public health threat, whilst a contaminated
liver is likely to be a greater risk due to dissemination via the food chain. Among the positive samples the presence
(16%) of S. Typhimurium and S. 4,[5],12:i:- (5%) should be emphasised, as they are important serotypes isolated
from reported human salmonellosis in the EU (EFSA, 2010). The results underline the significance of Salmonella
sp. contamination in pork tongue and liver that will become available for direct or indirect (through meat products)
human consumption, suggesting that that measures should be taken in order to improve hygienic conditions to
minimize Salmonella sp. contamination during slaughter process, for instance during evisceration, tonsils extraction
or during meat inspection, and along liver and tongue processing and selling chain.
180
Poster 62
Lesões melanocíticas em suínos abatidos para consumo
Teixeira, C., Pires, I., Ferreira, S., Vieira-Pinto, M.
Departamento de Ciências Veterinárias, CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
O presente estudo teve como principal objectivo conhecer a taxa de ocorrência de lesões melanocíticas (melanose,
melanocitomas e melanomas) em suínos abatidos para consumo e identificar possíveis padrões de distinção e de
classificação macroscópica destas lesões. Para tal, procedeu-se à recolha de lesões melanocíticas em matadouro
durante 8 meses, e à sua avaliação macroscópica e microscópica. Os resultados deste estudo demonstraram que as
melanoses foram as lesões melanocíticas mais frequentemente encontradas (74,04%) e que, relativamente às lesões
tumorais, os melanomas (malignos) foram os mais frequentes (21,15%) comparativamente com os melanocitomas
(benignos) (4,81%). Pela análise comparativa das características macroscópicas e microscópicas verificamos que,
nem sempre, por uma avaliação macroscópica, é possível a distinção entre estas lesões (melanoses, melanocitomas e
melanomas). No entanto, identificaram-se neste estudo, algumas características sugestivas da malignidade como: o
tamanho superior a 2,5cm, a presença de ulceração, a libertação de pigmento negro e a presença de coloração negra
do gânglio linfático regional. É assim de extrema importância a observação criteriosa e sistemática destas lesões,
para a avaliação das suas características, uma vez que, a decisão sanitária é diferente consoante se trate de uma
melanose, de um tumor maligno ou de um tumor benigno.
[Melanocytic lesions in pigs slaughtered for consumption]
The present study had as main objective to know the rate of occurrence of melanocytic lesions (melanosis,
melanocytoma and melanoma) in pigs slaughtered for consumption and to identify possible patterns of
differentiation and a macroscopic classification of these lesions. To this end, we proceeded to the collection of
melanocytic lesions in a slaughterhouse during 8 months, and its macroscopic and microscopic evaluation. The
results of this study demonstrated that melanosis were the melanocytic lesions found more often (74.04%) and that,
for tumors, melanomas (malignant) were the most frequent (21.15%) compared with melanocytomas (benign)
(4.81%). By comparative analysis of macroscopic and microscopic characteristics we found that, not always, with a
macroscopic evaluation, is possible to distinguish between these lesions (melanosis, melanocytoma and melanoma).
However, we identified in this study, some features suggestive of malignancy such as: the size exceeding 2,5cm, the
presence of ulceration, the release of black pigment and the presence of a black coloration of the regional lymph
node. It is therefore extremely important to take a careful and systematic observation of these lesions, with the
evaluation of their characteristics, since the decision health is different according if they are melanosis, malignant
tumor or benign tumor.
181
Poster 63
Contribuição para o estudo de sarna sarcóptica em suínos batidos para consumo
Ferreira, S., Teixeira, C., Coutinho, T., Rodrigues, M., Vieira-Pinto, M.
Departamento de Ciências Veterinárias, CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
Os suínos abatidos para consumo apresentam frequentemente lesões compatíveis com dermatites parasitárias, das
quais se destaca a provocada pelo agente da sarna sarcóptica, o ácaro Sarcoptes scabiei var. suis. Esta é, para vários
autores, a mais importante ectoparasitose suína em todo o mundo, graças à sua ampla difusão e efeitos negativos
sobre o desenvolvimento, conformação corporal dos animais afectados e rejeição das peles com lesões compatíveis
com sarna sarcóptica. Tendo em conta esta realidade, o presente estudo procurou analisar a prevalência e as
alterações observadas na inspecção post mortem que podem ser associadas a esta patologia. Assim, para a pesquisa
de sarna sarcóptica, foram colhidas amostras de cerúmen do pavilhão auricular em suínos abatidos para consumo.
Laboratorialmente, as amostras foram processadas através de dois métodos - directo e indirecto -, obtendo-se, a
nível de matadouro, uma prevalência da doença de 26,9%. Considerando as duas explorações de origem dos animais
amostrados, verificaram-se 2,5% de animais positivos para uma delas, enquanto na outra 57,3% de animais
positivos. Para além da colheita de cerúmen, procedeu-se igualmente à colheita de pele lesionada (antes e após o
escaldão) para avaliação histopatológica, tendo-se observado lesões compatíveis com sarna, mas sem ocorrer
visualização do ácaro. Foram ainda alvo de registo as quantidades de cerúmen, a presença de eritema nos pavilhões
auriculares, a existência de lesões cutâneas (segundo Pointon et al. (1992)) e o peso das carcaças. Estes parâmetros
foram estatisticamente analisados considerando a sua associação com a presença do ácaro, verificando-se uma
relação de dependência entre as variáveis apresentadas e a presença do ácaro, isto é, constatou-se que os animais
positivos à sarna sarcóptica apresentavam maior quantidade de cerúmen, eritema mais intenso e lesões cutâneas
mais significativas. Relativamente ao peso da carcaça, apurou-se que os animais positivos à doença possuíam uma
média de peso inferior à dos animais negativos à doença.
[Contribution to the study of sarcoptic mange in pigs slaughtered for consumption]
Pigs slaughtered for consumption often have lesions consistent with parasitic dermatitis, of which stands the one
caused by the agent of scabies, the mite Sarcoptes scabiei var. suis. This is, according to several authors, the most
important parasitic skin disease in swine throughout the world thanks to their widespread and negative effects on
development, body conformation of the affected animals and rejection of skin with lesions compatible with sarcoptic
mange. Given this reality, this study tried to analyze the prevalence and the changes observed in post mortem
inspection that may be associated with this pathology. Thus, researching for sarcoptic scabies, samples were taken
from the ear cerumen in pigs slaughtered for consumption. In laboratory tests, samples were processed by two
methods - direct and indirect -, resulting in the level of slaughter, a disease prevalence of 26.9%. Considering the
two farms of origin of animal sampled, there were 2.5% of positive animals for one of them, while the other 57.3%
of positive animals. In addition to the collection of cerumen, it was proceeded as well as to the collection of
damaged skin (before and after scald) and there were lesions consistent with scabies, but without being possible to
visualize the mite. Were still subjected to the record amounts of cerumen, the presence of erythema in the ears, the
existence of skin lesions (second Pointon et al. (1992)) and carcass weight. These parameters were statistically
analyzed considering its association with the presence of mite. There was a relationship of dependency between the
variables presented, and the presence of the mite, in other words, it was found that animals positive for sarcoptic
scabies had a greater amount of cerumen, more intense erythema and more significant skin lesions. Regarding to
carcass weight, it was found that animals positive for the disease had an average of weight lower than that of
animals negative for the disease.
182
Poster 64
Análise molecular sistemática de isolados de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli obtidos do
estudo nacional de monitorização de Campylobacter em frangos de abate
Carreira, A.C., Rocha, T., Tavares, A., Geraldes, M., Barahona, M.J., Clemente, L., Botelho, A. e Cunha, M.V.
A Campilobacteriose é a doença (da via) alimentar mais notificada em países desenvolvidos, sendo Campylobacter
jejuni o agente etiológico mais frequente. A infecção com C. jejuni tem sido associada, em alguns casos, ao
desenvolvimento de distúrbios neurológicos, nomeadamente as síndromes de Guillain-Barré e Miller-Fisher, estando
também descrita a possibilidade de ocorrência da síndrome urémico-hemolítica.
Apesar de C. jejuni e C. coli estarem amplamente distribuídos na Natureza, os principais reservatórios são os tractos
intestinais de espécies selvagens e domésticas, incluindo animais produtores de alimentos, tais como aves, bovinos e
suínos. A primeira monitorização nacional de Campylobacter em frangos de abate foi realizada em 2008, no âmbito
da Directiva Europeia 2007/516/EC. Os conteúdos cecais de frangos pertencentes a mais de 200 explorações foram
amostrados em 14 matadouros de aves distribuídos pelo País. A detecção e identificação das espécies de
Campylobacter spp. foram realizadas de acordo com a Norma ISO10272-1: 2006 e, também, por PCR. Detectou-se
Campylobacter spp. em 82% das amostras analisadas, sendo C. coli a mais prevalente (61%). Cento e setenta e sete
isolados de C. coli (n = 111) e C. jejuni (n = 66) foram caracterizados a nível molecular pela análise de
polimorfismos dos fragmentos de restrição do gene flaA (flaA-RFLP), que codifica uma sub-unidade do flagelo
polar, usando DdeI ou HinfI como enzimas de restrição. A análise molecular dos isolados com a enzima HinfI gerou
11 perfis, revelando um poder discriminatório moderado (h = 0,62). Registou-se a prevalência de três perfis,
presentes em 91% dos isolados testados, sendo o mais frequente comum a 56% dos isolados. A restrição do gene
flaA dos mesmos isolados com DdeI gerou 48 perfis complexos, aumentando substancialmente o poder
discriminatório (h = 0,89). Vários perfis eram comuns a isolados das espécies C. coli e C. jejuni. O padrão mais
frequente foi originado por 28% dos isolados, tendo-se registado 31 perfis únicos. A análise filogenética dos
isolados de Campylobacter em estudo, tendo como base os perfis obtidos pelos dois métodos, evidenciou a sua
elevada variabilidade genética, o que está de acordo com os resultados obtidos noutros países. Verificou-se uma
distribuição generalizada dos genótipos mais frequentes nas regiões amostradas, enquanto que os perfis menos
frequentes se encontravam circunscritos geograficamente. De acordo com os dados publicados, esta é a primeira
caracterização molecular de isolados de C. jejuni e C. coli realizada à escala nacional.
[Comparative genotypic analysis of zoonotic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli field
isolates from a nationwide survey conducted on broilers]
Campylobacteriosis is the most commonly reported gastrointestinal disease in developed countries, Campylobacter
jejuni being the most frequent etiological agent. In some cases, C. jejuni has been associated with neurological
disorders such as Guillain-Barré and Miller-Fisher syndromes and, more rarely, with hemolytic uremic syndrome.
C. jejuni and C. coli are ubiquitous and the gastrointestinal tracts of wild and domestic species, including foodproducing animals such as poultry, cattle and swine, are important reservoirs of zoonotic pathogenic strains. In
Portugal, until recently, the information concerning the prevalence of Campylobacter strains in food-producing
animals was scarce. The first nationwide study of Campylobacter prevalence in broilers at slaughter was performed
in 2008, in the framework of the Commission Decision 2007/516/EC. Samples from broilers belonging to more than
200 farms were collected at 14 approved poultry abattoirs widespread throughout the country. Detection of
Campylobacter spp. and species identification were performed according to ISO10272-1:2006; multiplex PCR was
also performed for confirmation of species identification. Campylobacter species were recovered from 82% of fecal
samples, being C. coli the most prevalent (61%). One-hundred and seventy seven isolates of C. coli (n=111) and C.
jejuni (n= 66) were genotyped based on the restriction fragment length polymorphism analysis of the flaA gene
(flaA-RFLP), which encodes a sub-unit of the polar flagellum, using DdeI or HinfI as restriction enzymes.
Genotyping with HinfI yielded 11 flaA-RFLP patterns, revealing a relatively low discriminatory power (Hunter
index, h=0.62). Three profiles were obtained from the majority of the isolates (91%), the most prevalent one being
present in 56% of surveyed isolates. Restriction of the flaA gene of the same isolates with DdeI generated 48
complex multi-banded patterns, substantially increasing the discriminatory power of the technique (h=0.89). The
most common pattern was prevalent in 28% of the isolates, whereas 31 isolates yielded unique profiles. Several
profiles were common to both C. coli and C. jejuni. Clustering analysis using UPGMA revealed the high genetic
variability of Campylobacter isolates under study based on the flaA gene, which is in agreement with results
obtained in other countries. The most frequent genotypes were widespread throughout the sampled regions,
contrasting with the less frequent profiles that were geographically localised. To our knowledge, this is the first
report on the molecular analysis of C. jejuni and C. coli field isolates from broilers on a national scale.
183
Poster 65
Desafiando Salmonella quando presente em fiambre fatiado e embalado a vácuo nas lojas de
hipermercados: estudo de caso
Fraqueza, M.J., Fernandes, H., Fernandes, M.J., Barreto, A.S.
CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal. Email:[email protected]
Alguns hipermercados nas suas lojas fazem fatiados de fiambre e embalam em aerobiose ou vácuo, colocando estes
produtos em expositores abertos com temperaturas entre 0 ºC e 5 ºC, a fim de evitar que os consumidores esperem
enquanto estão a fazer compras. Neste fiambre cortado em lojas e embalado em aerobiose ou vácuo podem ocorrer
contaminações cruzadas com Salmonella. Assim, considerando a presença do potencial perigo Salmonella spp. em
fiambre fatiado embalado a vácuo em lojas de hipermercado, o nosso objectivo foi desafiar este patogénico quando
presente em fatias de fiambre embalado a vácuo em refrigeração (de 0 ºC e 7 ºC) e submetido a uma temperatura
abusiva (20 ºC). Fiambre em fatias foi comprado num hipermercado e imediatamente transportado (a <7 ºC) para o
laboratório. Amostras de aproximadamente 25g foram inoculadas com 1 ml de uma diluição contendo 10 3 bactérias
de Salmonella enterica ssp. enterica serovar Enteritidis CECT 4300. As amostras inoculadas foram embaladas sob
vácuo e aerobiose e subdivididas para armazenagem em três temperaturas diferentes: 20 ºC, 7 ºC e 0 ºC. Realizaramse contagens de Salmonella spp., Brochothrix thermosphacta e Pseudomonas spp. nas amostras em estudo após
períodos de armazenamento diferentes (1, 2, 7, 12 e 16 dias). O aumento da Brochothrix thermosphacta e
Pseudomonas em fiambre fatiado em aerobiose não interferiu com o crescimento de Salmonella. Brochothrix
thermosphacta e Pseudomonas spp. foram inibidos pelas condições de vácuo. A inibição da Salmonella no fiambre
embalado a vácuo foi assegurada somente quando as amostras foram armazenadas a 7 ºC e 0 ºC. Assim, o controlo
de temperatura é obrigatório para minimizar o crescimento de Salmonella em fatias de fiambre embalado em
aerobiose ou a vácuo.
[Challenging Salmonella present on cooked ham sliced and vacuum packaged under hypermarket shop
conditions: a study case]
Some hypermarkets make sliced cooked ham under aerobic and vacuum packages which are placed into open
refrigerated exposure equipment at temperatures between 0 ºC and 5 ºC, in order to avoid consumers long waiting
while they are shopping. To this cooked ham sliced and packaged under aerobiosis or vacuum at shops places a
cross contamination with Salmonella could occur. Considering the presence of the potential hazard Salmonella spp.
on vacuum packaged cooked ham sliced at hypermarket shop, our objective was to challenge this pathogen in sliced
cooked ham under vacuum, refrigerated (at 0 ºC and 7 ºC) and submitted to a high abuse temperature (20 ºC). Sliced
cooked ham were purchased at a hypermarket and immediately transported (at <7 ºC) to the laboratory. Samples of
approximately 25g were inoculated with 1ml of a dilution containing 10 3 bacteria of Salmonella enterica ssp.
enterica serovar Enteritidis CECT 4300. Inoculated samples were packaged under aerobiosis and vacuum and
subdivided for storage at three different temperatures 20 ºC, 7 ºC and 0 ºC. Salmonella spp., Brochothrix
thermosphacta and Pseudomonas spp. plate counts were performed on samples after different storage periods (1, 2,
7, 12, and 16 days). The increase of Brochothrix thermosphacta and Pseudomonas in sliced ham under aerobiosis
did not interfered with Salmonella growth. Brochothrix thermosphacta and Pseudomonas spp. were inhibited by
vacuum conditions. The inhibition of Salmonella under vacuum conditions was assured only when samples were
stored at 7 ºC and 0 ºC. Thus, temperature control is mandatory to minimize the growth of Salmonella in sliced
cooked ham under aerobiosis or vacuum packages.
184
Poster 66
Efeito de óleos essenciais de alho, orégão e casca de laranja na sobrevivência de três patogénicos em
tripa natural de porco marinada para fabrico de salpicão
Fernandes, M.P., Patarata, L.
Objectivo: Determinação do efeito dos óleos essenciais (OE) de alho (A), orégão (O) e casca de laranja (L) na
sobrevivência de Escherichia coli O157: H7, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes em tripa de porco natural
numa marinada usada no tempero de salpicão.
Metodologia: A tripa de porco foi lavada e cortada em porções de cerca de 7 cm de diâmetro. Os pedaços de tripa
foram colocados em anéis de polietileno (d = 27mm, a = 5mm), presos com uma abraçadeira de forma a mantê-la
esticada e cortado o excesso de tripa. A tripa foi contaminada por imersão em BHI inoculado com 0,1 ml de uma
mistura de 5 estirpes de cada patogénico, constituída por uma de referência, E. coli O157: H7 ATCC 35150,
Salmonella sp. CECT 4155 e L. monocytogenes ATCC 7973, e quatro isoladas de chouriço e ambiente fabril.
Incubadas a (37 ºC, 30 ºC e L. monocytogenes, durante 5 h). A tripa contaminada foi transferida para diferentes
marinadas (vinho e água 50:50, 1,5% de sal), suplementadas com os respectivos OE / nível (nível alto 0,4% e nível
baixo 0,05%). Foram mantidas em marinada durante 3 dias, seguiu-se a fumagem (3 h, madeira de faia; <35 ºC) e
secagem (15 ºC, HR 85%, 3 dias). A contagem de sobreviventes foi efectuada às 24h, após fumagem e após 3 dias
de secagem em CT-SMAC, XLD e Oxford agar, respectivamente. O ensaio foi conduzido em triplicado. As
contagens foram analisadas por ANOVA simples; diferenças entre médias: teste de Tukey HSD.
Resultados: A contaminação inicial da tripa variou entre 4 e 5 log ufc/g. Após 24 h de marinada, o efeito dos OE de
O e L foi significativo (p <0,001) para os 3 patogénicos. O efeito do A não foi detectado para Salmonella sp. às 24
h. Apenas o nível mais elevado resultou numa menor sobrevivência. Após a fumagem, observou-se um ligeiro
aumento na contagem da tripa de controlo. Pelo contrário, todas as amostras tratadas com OE demonstraram uma
redução considerável de patogénicos, determinando diferenças significativas (p <0,05); o efeito do nível tornou-se
insignificante para os OE de A e O, mas significativo no OE de L. Após a secagem as contagens nas amostras de
controlo foram ainda dignas de preocupação (± 2 log ufc/g). Os OE de A e L foram responsáveis pela inibição
completa dos 3 patogénicos usando apenas o nível mais baixo; em marinadas suplementadas com OE de O, foi
necessário usar o nível mais alto para garantir a inibição de E. coli O157:H7 e L. monocytogenes. O uso de OE
extraídos de plantas usadas para temperar a tripa para produzir salpicão revelou ser uma excelente estratégia no
controlo dos patogénicos presentes.
[Effect of essential oils from garlic, oregano and orange peel on the survival of three pathogens in
natural pork casing marinated for salpicão stuffing]
Objectives: Determination of effect of essential oils (EO) from garlic (G), oregano (O) and orange peel (OP) on the
survival of Escherichia coli O157:H7, Salmonella sp. and Listeria monocytogenes in natural pork casing marinated
to stuffing salpicão.
Methods: Natural pork gut obtained in a local abattoir washed and scrapped, and portions of about 7 cm diameter
were cut. They were mounted in polyethylene rings (d=27mm, h=5mm) and fasten with a clamp to maintain it
stretched. The excess of casing was cut out. Casing were then contaminated with each pathogen by immersing in
BHI inoculated with 0.1 ml of a mixture (5 strains) of overnight growth in BHI (E. coli O157:H7 ATCC 35150,
Salmonella sp. CECT 4155 and L. monocytogenes ATCC 7973 and 4 strains of each from chouriço or its production
environment) and incubation (37 ºC; 30 ºC- L. monocytogenes; 5 h). Contaminated casings were transferred to
marinades (wine and water 50:50, 1.5% salt) supplemented with the respective EO/level (high level 0.4% and low
level 0.05%). Casings were maintained in marinade during 3 days, were then smoked (3 h, beech wood; < 35 ºC)
and dried (15 ºC, 85% RH, 3 days). Counts of survivors (24h, after smoking, 3 d. drying) were made in CT-SMAC,
XLD and Oxford Agar, respectively. Experiments were made in triplicate. Counts were analyzed by one way
ANOVA; differences between means: Tukey HSD test
Results: The initial contamination of casings was between 4 and 5 log cfu/g of casing. After 24 h in marinade, the
effect of the O and OP EOs was significative (p<0.001) for the 3 pathogens. The effect of G was not detected on
Salmonella sp. at 24 h. Generally, only the higher level resulted in lower survival. After smoking, it was observed a
slightly increase in the counts on the control casings. On the contrary, all casings treated with EO experimented a
considerable reduction of pathogens, determining significative differences (p<0.05) between control and treated
samples; the effect of level became negligible for G and O EO, but was significative for OP EO. After drying the
counts in control samples were still worthy of preoccupation (±2 log cfu/g). Both G and OP EOs were responsible
for the complete inhibition of the 3 pathogens using the lower level; When marinades were supplemented with O
EO, it was necessary to use the higher level to assure the inhibition of E. coli O157:H7and L. monocytogenes.
The use of EO from plants commonly used to season the casings to produce salpicão revealed to be an excellent
strategy to control the pathogens that might be present.
185
Poster 67
Efeito do momento da contaminação e da fumagem na sobrevivência de E. coli O157:H7 em carne
de porco salmourada para fabrico de salpicão
Martins, M-R. Patarata, L.
Objectivo: Determinação do efeito do momento da contaminação – antes ou após a salmoura - e da fumagem – antes
ou após tratamento térmico- na sobrevivência de E. coli O157:H7 em carne de porco para fabrico de salpicão.
Metodologia: Uma peça de lombo de porco foi seccionada em porções de ±20g. A contaminação foi feita aplicando
em cada porção 0,1 mL de uma suspensão bacteriana (mistura de 5 estirpes: uma de referência, E. coli O157 ATCC
35150 e quatro isoladas de enchidos secos crus ou seu ambiente fabril) para obter ±2 log ufc/g; após a contaminação
as amostras repousaram 15 min.
Um grupo de amostras foi contaminado antes da salmoura (20% de vinho, 2% de sal e 0,5% de alho; relativa ao
peso de carne; 24h, 4 ºC)e o segundo após esta etapa; de seguida amostras foram fumadas (3 h, madeira de faia; <35
ºC), antes ou após o tratamento térmico (TT) (55 ºC-5‟, 60 ºC-5‟ ou 65 ºC-1‟). A contagem de sobreviventes foi
efectuada às 24h após fumagem/tratamento térmico em CT-SMAC. O ensaio foi conduzido em triplicado. As
contagens foram analisadas por ANOVA factorial com interacção.
Resultados: A contaminação posterior à salmoura conduziu sempre a contagens superiores às da contaminação
anterior. No controlo, que não teve qualquer TT, a contagem média de E. coli O157:H7 foi de 1,83 log (ufc/g) e na
situação em que a contaminação foi posterior ascendeu a 4,80 log (ufc/g). Com o TT de 55ºC-5‟ verificou-se que o
efeito do momento da contaminação foi significativo (p<0,01): 1,08±1,73 log (ufc/g) e 3,50±0,45 log (ufc/g) para
contaminações antes e depois, respectivamente.. No que se refere ao momento da fumagem, não foram encontradas
diferenças significativas (p<0,05) no caso de se aplicar o fumo antes ou depois do tratamento térmico, sendo os
valores médios de E. coli O157:H7 de 2,67±1,40 log (ufc/g) e 1,91±2,10 log (ufc/g), respectivamente. Já a
interacção entre o momento da contaminação e o momento da fumagem mostrou-se significativa (p<0.05), em que
as contagens médias mais elevadas correspondem às amostras cuja contaminação foi posterior à salmoura. Com os
tratamentos térmicos de 60 ºC-5‟ ou 65 ºC-1‟não se detectou qualquer efeito do momento da fumagem, nem
directamente, nem por interacção com o momento da contaminação. O momento em que uma potencial
contaminação ocorre tem consequências importantes ao nível da segurança final do produto, sendo que se ocorrer
antes da salmoura as contagens finais são significativamente mais baixas. O momento ideal para realizar a fumagem
é após o tratamento térmico, pois é desta forma que se consegue uma maior redução de E. coli O157:H7.
[Effect of the moment of contamination and smoking on the survival of E. coli O157:H7 in
marinated pork to produce salpicão]
Objectives: Determination of the effect of the moment of contamination – before or after marinade - and smoking –
before or after heat treatment- on the survival of E. coli O157:H7 in marinated pork to produce salpicão
Methods: One pork loin was cut (±20g). The contamination was performed by application of 0.1 mL of a bacteria
suspension (mixture of 5 strains: E. coli O157:H7 ATCC 35150 and 4 strains from dry raw sausages or its
production environment) to obtain a level of contamination ±2 log cfu/g. After contamination samples rested during
15 min. One group of samples was contaminated before marinade (20% wine, 2% salt e 0.5% garlic; expressed as
meat weight percentage; 24h, 4 ºC) and other group after that operation; samples were then smoked (3 h, beech
wood; < 35 ºC) before or after the heat treatment (HT) (55 ºC-5‟, 60 ºC-5‟ or 65 ºC-1‟). Counts of survivors (24h
after smoking) were made in CT-SMAC; Experiments were made in triplicate. Counts were analyzed by factorial
ANOVA.
Results: The contamination after the marinade resulted always in higher counts. In control samples, without any HT
the mean count of de E. coli O157:H7 was 1.83 log (cfu/g) while in samples contaminated after marinade it was
4.80 log (cfu/g). With the HT of 55 ºC-5‟ it was observed that the effect of the contamination moment was
significative (p<0.01): 1.08±1.73 log (cfu/g) and 3.50±0.45 log (cfu/g) for contamination before or after,
respectively.
para contaminações antes e depois, respectivamente. The effect of the moment of smoking, in relation to HT was not
significant (p>0.05), presenting mean counts of E. coli O157:H7 de 2.67±1.40 log (cfu/g) and 1.91±2.10 log (cfu/g),
respectively. However, the interaction between the two effects was significant (p<0.05), determining higher mean
counts in samples contaminated after marinade. When the HT applied were 60 ºC-5‟ or 65 ºC-1‟ no effect (p>0.05)
of the moment of the smoking was observed, nor its interaction with the contamination moment.
The moment when a potential contamination occurs have important consequences for the safety of the product. If it
happens before the marinade the counts are significantly lower. The ideal moment to smoke salpicão is after the HT,
resulting in higher inhibition of E. coli O157:H7.
186
Poster 68
Aflatoxina M1 em leite comercializado em Portugal: avaliação da exposição humana e animal
Duarte, S.C.1,2, Almeida, A.M.1,3, Teixeira, A.S.1, Pereira, A.L.1, Falcão, A.C.3, Lino, C.M.2, Pena, A.2
2 Group of Health Surveillance – Centro de Estudos Farmacêuticos, Universidade de Coimbra, Portugal
3 Centro de Neurociências e Biologia Celular, Universidade de Coimbra, Portugal
As aflatoxinas (AFs) são as micotoxinas com maior impacto em saúde pública e significado agro-económico. Após
exposição dos animais à micotoxina carcinogénica aflatoxina B1 (AFB1) através do consumo de alimentos
contaminados, o respectivo leite é contaminado com o hidroxi-metabolito aflatoxina M1 (AFM1). Uma vez que este
metabolito apresenta propriedades toxicológicas comparáveis à AFB1, apesar de menor potência carcinogénica,
foram estabelecidos níveis máximos para a AFM1 no leite, para redução da exposição humana.
O presente trabalho consistiu na determinação da ocorrência de AFM1 no leite comercializado em Portugal e
avaliação da exposição humana decorrente do seu consumo. Foi igualmente estimada a concentração correspondente
de AFB1 nos alimentos consumidos pelos animais produtores.
Foram analisadas quarenta amostras de leite pasteurizado e leite UHT, representativas da totalidade de marcas de
leite meio-gordo comercializadas no país. As embalagens de leite foram adquiridas em supermercados entre Março e
Abril de 2011.
A determinação de AFM1 foi efectuada através do kit comercial de ELISA de competição RIDASCREEN® (RBiopharm, Alemanha) de acordo com as respectivas instruções (limite de detecção 5 ng/L).
Onze amostras (27,5%) apresentaram um teor acima do limite de detecção (média 23,4±24,0 ng/L). Apesar da
incidência de contaminação determinada ter sido inferior à registada em estudos anteriores, a concentração média de
AFM1 foi superior à detectada previamente em Espanha e Marrocos.
Duas amostras de leite (5%) apresentaram valores de AFM1 superiores ao limite máximo legal (50 ng/L), ambas
produzidas nos Açores. Uma terceira amostra proveniente dos Açores apresentou igualmente um valor elevado (49,8
ng/L).
Este é um resultado curioso porquanto neste arquipélago a produção leiteira é baseada num sistema de pastagens,
considerado como de baixo risco no que diz respeito à contaminação por AFs.
A exposição alimentar média de um adulto à toxina através do consumo de leite foi calculada como 0,08 ng/kg peso
corporal/dia, sendo inevitavelmente superior em crianças, consideradas como o principal grupo de risco.
Com base na contaminação média de AFM1 foi adicionalmente possível estimar a concentração de AFB1 nos
alimentos consumidos pelos animais, estimada em 1,46 µg/kg.
Os resultados apontam a necessidade de estudos adicionais na tentativa de identificar e desta forma controlar
potenciais factores determinantes na única região na qual amostras de leite contaminadas acima do limite máximo
permitido foram produzidas.
[Aflatoxin M1 in marketed milk in Portugal: assessment of human and animal exposure]
From all the currently known mycotoxins, aflatoxins (AFs) present the greatest public health and agro-economic significance.
Following exposure of lactating dairy cattle to carcinogenic aflatoxin B1 (AFB1) present in feedstuffs, milk is contaminated with
the hydroxy-metabolite aflatoxin M1 (AFM1). As the latter metabolite has toxicological properties comparable to those of AFB1,
albeit a lower carcinogenic potency, maximum levels for AFM1 have been set for consumable milk, aiming to reduce human
exposure to the lowest achievable level.
The occurrence of AFM1 in milk marketed in Portugal and the evaluation of the exposure degree to the toxin through its
consumption in an average citizen were studied. Estimation of the corresponding concentration of AFB1 in feedstuffs was also
aimed.
Forty samples representing the totality of the pasteurised and UHT half-skimmed milk brands marketed in the country were
surveyed. The milk packages were purchased in markets and supermarkets between March and April 2011.
Determination of AFM1 was carried out by means of the RIDASCREEN® test kit (R-Biopharm, Germany), a commercial
competitive ELISA (detection limit of 5 ng/L), performed in accordance with the enclosed instructions.
Eleven samples (27.5%) featured a contamination above the detection limit (mean 23.4±24.0 ng/L). Though incidence of
contamination was lower than previous studies, mean AFM1 concentration was higher than the ones recently reported in Spain
and Morocco.
Two milk samples (5%) both produced in Azores presented AFM1 values that surpassed the legal maximum limit (50 ng/L). A
third sample, also from the Azores Islands, presented a very high value of contamination (49.8 ng/L).
These results are interesting given that dairy production in Azores is traditionally pasture-based which is considered as low risk
system regarding AFs contamination.
Adult average dietary exposure to the fungal toxin through milk consumption was estimated at 0.08 ng/kg bw/day, which is
inevitably higher for infants, considered the main risk group. Based on the AFM1 contamination of milk, it was further possible
to calculate the concentration of AFB1 in feeds consumed by the producing cows as 1.46µg/kg.
The results call for further studies in an attempt to identify and thus control potential influencing factors in the only region where
milk samples contaminated above the legal limit were produced.
187
Poster 69
Evolução de populações de Listeria monocytogenes em alimentos prontos para consumo (Portugal)
Castro, J.L., Lança, A., Bernardo, F.
A listeriose é uma infeção bacteriana zoonótica de elevada severidade transmissível pelo consumo de alimentos
contaminados com Listeria monocytogenes. Nos últimos anos tem aumentado o número de casos de doença em
Portugal, registando-se mortalidades significativas em populações de risco (grávidas, recém nascidos, crianças,
idosos e imunocomprometidos por medicação ou doença crónica).
Listeria monocytogenes é uma bactéria telúrica, ubíqua que sobrevém em biótopos agrícolas e no ambiente agroindustrial; surge com frequência em muitas matrizes alimentares especificamente produtos lácteos curados,
alimentos prontos para consumo, pré-embalados e dependentes de acondicionamento sob refrigeração. A legislação
Europeia estabelece limites máximos de contaminação específicos nestes alimentos.
Neste trabalho, procurou-se avaliar a adequação das metodologias disponíveis para estudar a evolução das
populações de L. monocytogenes em alimentos prontos para consumo, baseada na técnica oficial (ISO 11290-2) com
adaptações específicas aos fins deste estudo.
O rastreio preliminar realizado em 26 amostras, adquiridas no comércio, obteve sistematicamente resultados
negativos. Procedeu-se, numa segunda fase, à avaliação da evolução de uma quantidade fixa de Listeria
monocytogenes (aproximadamente 2 UFC/g) nas amostras durante um prazo compatível com a vida comercial útil
do produto. Para isso, utilizaram-se alimentos prontos para consumo já colocados no mercado que foram
artificialmente contaminados com Listeria monocytogenes Scott A e mantidos nas condições recomendadas pela
respectiva rotulagem.
Os resultados obtidos revelaram que a evolução de populações de Listeria monocytogenes em alimentos prontos
para consumo é condicionada por diversos factores ecológicos nomeadamente determinados aditivos alimentares. A
evolução das contaminações foi comparada com a evolução expectável referida em modelos preditivos disponíveis,
não se verificando uma correlação inequívoca. Foi assim possível concluir que os critérios microbiológicos de
segurança para os géneros alimentícios estipulados no regulamento (CE) nº 2073/2005, no caso de Listeria
monocytogenes, são de difícil aplicação e apontam para a necessidade urgente de desenvolvimento de modelos de
estudo adequados da evolução do agente patogénico em alimentos prontos para consumo.
[Evolution of Listeria monocytogenes populations in ready-to-eat food (Portugal)]
Listeriosis is a highly severe bacterial zoonotic disease that can be transmitted by eating food contaminated with
Listeria monocytogenes. In recent years, the number of cases of disease has increased in Portugal, registering
significant mortalities in at risk populations (pregnant women, newborns, children, elderly and
immunocompromised by medication or chronic illness). Listeria monocytogenes is a telluric, ubiquitous bacterium,
which biotopes occur on agricultural and agro-industrial environment, and often found in many cured food matrices
specifically dairy products, in pre-packed and refrigerated containers food dependent for distribution effects. The
EU legislation on health safety of food provides maximum contamination of food by this bacterium. This work
concerns to the evaluation of the appropriateness of the methodologies available to study the evolution of Listeria
monocytogenes populations in ready to eat foods, based on the official techniques (ISO 11290-2) with specific
adaptations. Following a preliminary screening, performed with 26 samples of ready-to-eat food, acquired in trade,
having been obtained consistently negative results in all samples. Subsequently, a search was conduce to assess the
progression of a fixed amount of Listeria monocytogenes (average = 2 CFU/g) using samples in a period consistent
with the commercial life span of the product. For this propose, ready to eat foods, already placed on the market,
were used, artificially contaminated with a strain of Listeria monocytogenes Scott A and kept under the conditions
recommended by the labeling. The results revealed that the evolution of Listeria monocytogenes populations in
ready to eat foods is conditioned by several ecological factors including specific food additives.
The evolution of the contaminations was compared with the expected developments in available predictive models,
not revealing a clear correlation. The results showed that the safety microbiological criteria for foodstuffs stated in
Regulation (EC) nº 2073/2005, in case of Listeria monocytogenes, are difficult to apply and indicate the urgent need
to develop appropriate models to study the evolution of that pathogen in ready to eat foods.
188
Poster 70
Sushi e sashimi versus Anisakis simplex: tendências alimentares com risco zoonótico
Ramos, P.
INRB IP / L-IPIMAR, Lisboa, Portugal. E-mail: [email protected]
Com a crescente popularidade da cozinha tradicional japonesa, os restaurantes e fast food especializados na sua
confecção, proliferaram por todo o país e a sua preparação domiciliária tornou-se motivo de convívio. Tendo como
ingrediente base o peixe cru, a confecção destes pratos exige algum conhecimento por parte de quem confecciona,
nomeadamente no reconhecimento de larvas de anisaquídeos. O parasita Anisakis simplex é responsável por
anisaquiose, zoonose resultante da ingestão acidental de larvas viáveis em produtos da pesca crus ou praticamente
crus. Com a introdução de hábitos de consumo de peixe cru, aumenta a probabilidade de sensibilização ao parasita.
Embora não haja casos notificados de anisaquiose, têm sido identificadas larvas de anisaquídeos em peixe com valor
comercial proveniente da Costa Portuguesa.
Este estudo teve como objectivo registar a ocorrência de larvas de anisaquídeos em refeições de sushi e sashimi,
bem como em bacalhau, uma das espécies de peixe com maior valor comercial e mais apreciada na gastronomia
portuguesa.
Analisaram-se 14 amostras de bacalhau salgado seco inteiro, 13 amostras de bacalhau demolhado ultracongelado em
posta, com marcas comerciais distintas, bem como 18 refeições de sushi e sashimi obtidas em diversos postos de
venda. Pesquisou-se a ocorrência de larvas de anisaquídeos combinando os métodos de inspecção visual,
transiluminação e dissecção dos tecidos.
No bacalhau salgado seco, 13 (92,9%) amostras estavam parasitadas por Anisakis spp. (62,7%) e 1,3% por
Pseudoterranova spp. No bacalhau demolhado ultracongelado todas apresentavam parasitas: Anisakis spp. (57,1%)
e Pseudoterranova spp. (11,4%). A abundância parasitária variou de 1 a 30 no bacalhau salgado seco e de 1 a 7 no
bacalhau demolhado ultracongelado. Todos os parasitas estavam inviáveis.
Apesar de não terem sido observados anisaquídeos nas refeições japonesas, é importante a implementação de acções
de informação do consumidor, como medida de prevenção da infecção por Anisakis simplex e assim diminuir o risco
de alergia a produtos da pesca contaminados, como as amostras de bacalhau analisadas.
[Sushi and sashimi versus Anisakis simplex: food trends with zoonotic risk]
In the last years a growing preference for traditional Japanese food has been observed. Restaurants and specialized
fast food in Japanese food proliferated throughout the country and home preparation has become a way for friends
have fun. Having as a base ingredient raw fish, the making of these dishes requires some knowledge by the person
who manufactures, particularly in recognition of larval anisakids. Anisakis simplex is responsible for anisakiosis, a
zoonotic disease. Humans may acquire accidental infection by eating raw or undercooked fish with viable anisakids
larvae. The introduction of food consumption of raw or undercooked fish increase the risk of infection and
sensitisation to parasite. In Portugal, although clinical cases of the disease are not known, Anisakis larvae have been
recovered from commercial fish.
This study aimed to record the occurrence of anisakid larvae in sushi and sashimi meals, as well as cod, species of
fish with high commercial value and choice in Portuguese cuisine.
Fourteen samples of dried salted cod, 13 samples of frozen codfish from different commercial brands and 18 meals
of sushi and sashimi obtained at different points of sale were analysed. The occurrence of anisakid larvae was
recorded combining the methods of visual inspection, candling and destructive slicing.
Thirteen samples (92.9%) of dried salted cod were parasitized, 62.7% being by Anisakis spp. larvae and 1.3% by
Pseudoterranova spp. larvae. All samples of frozen codfish were parasitized: 57.1% by Anisakis spp. larvae and
11.4 by Pseudoterranova spp.. Anisakid larvae abundance ranged from 1 to 30 in dried salted cod and 1-7 in frozen
codfish. All the collected parasites were not viable.
Although no anisakids larvae were observed in Japanese meals, home cooking process and the lack of general public
recognition of the larvae, justifies the implementation of training on this subject. These measures may contribute to
avoid allergy throughout contaminated fish products ingestion like the analysed dried salted and frozen codfish.
189
Poster 71
Síndrome Ulcerativa do Bacalhau (Cod Ulcus Syndrome): importância comercial e impacto na
Saúde Pública
Ramos, P.
INRB IP / L-IPIMAR, Lisboa, Portugal. E-mail: [email protected]
Nos peixes marinhos e de água doce é frequente observar úlceras na pele. A sua etiologia é aparentemente complexa
e pode envolver diferentes grupos taxonómicos. As bactérias Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum,
Aeromonas salmonicida atípica e Mycobacteria foram isolados em peixes com úlceras. Na Síndrome Ulcerativa do
Bacalhau (Cod Ulcus Syndrome) foi também sugerida etiologia viral, tendo sido isolado o vírus da Septicémia
Hemorrágica Viral (VHSV). As lesões mecânicas resultantes da retenção temporária dos peixes em redes de pesca
foram igualmente apontadas como factores etiológicos primários de quadros ulcerativos, com infecção bacteriana
secundária.
Num lote com 10 toneladas de bacalhau do Pacífico (Gadus macrocephalus) congelado, cerca de 20% apresentava
alterações na superfície externa.
Recolheu-se uma amostra de 5 exemplares inteiros (47,4cm ± 4,81; 991,7g ± 130,12) que foram observados
macroscopicamente. As alterações da pele foram fotografadas e procedeu-se à descrição do quadro lesional. O
estado de conservação do bacalhau inviabilizou a realização de exames complementares de diagnóstico.
Todos os exemplares apresentavam múltiplas lesões ulcerativas na pele, no tronco, pedúnculo caudal e barbatana
caudal. As úlceras apresentavam um desenvolvimento sequencial: vesículas com cerca de 3mm de diâmetro e
consistência firme (estádio pápulo-vesicular); zonas de erosão, com cerca de 1cm, de cor branca com laivos rosa
(estádio de erosão); úlceras vermelhas com cerca de 1cm de diâmetro e com o centro necrótico, de cor cinzentopálido (estádio ulcerativo inicial); úlceras de cor vermelha e contornos irregulares, com 0,7 a 1cm de diâmetro e
profundidade variável (estádio de ulceração) e manchas brancas na pele, correspondendo a áreas de cicatrização
(estádio de cicatrização). A descrição do quadro lesional é compatível com a Síndrome Ulcerativa do Bacalhau.
Num único exemplar foi possível observar diferentes estádios da doença. Um exemplar de bacalhau apresentava
extensas hemorragias subdérmicas no tronco bem como abrasões, eventualmente resultantes de lesões traumáticas
durante a captura.
Em virtude das lesões observadas depreciarem o valor comercial do peixe e pela sua etiologia incerta, com eventual
comprometimento de agentes patogénicos para o homem, primários (Síndrome Ulcerativa do Bacalhau) ou
secundários (lesões traumáticas), os exemplares afectados foram retirados do circuito comercial. Esta medida de
prevenção da Saúde Pública traduziu-se em perdas económicas significativas, pela importância comercial da
espécie.
[Cod Ulcus Syndrome: economic and human health impact]
Skin ulceration is a common disease sign affecting fish of different species both in freshwater and marine
environments. Although the aetiology of skin ulcers is apparently complex and may involve different taxonomic
groups, bacteriological infections by Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, atypical A. salmonicida e
Mycobacteria appear to be most commonly associated with ulcers. Additionally, Viral Haemorrhagic Septicaemia
Virus (VHSV) has been suggested for the Cod Ulcus Syndrome aetiology. The possibility that fishing gear induced
skin ulcerations in cod has been considerate.
Five frozen Pacific cod (Gadus macrocephalus) were sampled from a stock (1 ton) were 20% exhibit skin lesions.
The mean lengths and weight of the sample was recorded (47.4cm ± 4.81; ± SD and 991.7g ± 130.12; ± SD). All
fish were macroscopically examined and skin ulcers photographed and described. Freezing prevented additional
diagnostic tests.
Various skin ulcerations were observed all over the body, the caudal peduncle and caudal fin. A sequential
development of the ulcerations was apparent: multiple vesicula with a diameter of 3mm and a firm consistency
(papulo-vesicular stage); grey crater-shaped holes with a pinkish touch bottom and a diameter of 1cm (erosive
stage); red ulcer with a central pale-greyish necrosis and a diameter of 1cm (early ulcerative stage); hyperaemic
ulcer with irregular edges and various depths, measuring 0.7 to 1cm in diameter (late ulcerative stage) and white
paches in the skin (healing stage). The sequential development of skin ulcers in cod shows similarities with the
Ulcus Syndrome. Various stages of the Ulcus Syndrome were observed in a single cod. One cod exhibited extensive
subdermal haemorrhages and skin abrasions on the trunk, suggesting the primary aetiology of cod ulcers was
traumatic injury, caused by capture methods.
Once skin lesions decreased flesh quality and the aetiology was dubious, eventually caused by bacterial agents issue
of public concern, affected cod were not commercialized. The affected fish is commercially valuable marine species,
so the implemented measure has resulted in significant economic losses.
190
Poster 72
Determinação de Cobre e Cádmio em amostras de mel por Espectrometria de Absorção Atómica:
resultados preliminares
Pereira, A.F., Belas, A., Carrapiço, B., Vaz, Y.
O mel é constituído por hidratos de carbono, proteínas, aminoácidos, água, vitaminas e minerais. É um alimento
nutritivo, com conhecidas propriedades antivirais, antimicrobianas e antioxidantes e consumido por crianças, adultos
e idosos. A produção de mel ocorre em meio natural, estando o produto sujeito à contaminação por diversos
poluentes ambientais.
Uma das principais preocupações relativas à contaminação do mel é a presença de metais pesados de origem natural
ou antropogénica, sendo esta última a mais importante. As principais fontes destes contaminantes são as emissões
industriais, sobretudo da indústria metalúrgica e incineração de resíduos, bem como a aplicação de fertilizantes
agrícolas.
O objectivo deste trabalho consistiu na determinação de metais pesados (Cu, Cd) em amostras de mel nacional de
diferentes origens geográficas por espectrometria de absorção atómica.
A determinação foi realizada em espectrofotómetro de absorção atómica (Perkin Elmer Analyst 700) com
queimador de chama ar/acetileno (17/2 mL/min) e com lâmpadas de cátodo ôco como fonte de emissão. Para
validação da metodologia analítica avaliaram-se os seguintes parâmetros: linearidade, repetibilidade, recuperação,
limite de detecção e limite de quantificação. Na validação do método foram obtidas recuperações superiores a 80%,
repetibilidade acima de 85%, linearidade de R2=0,99, limites de quantificação e de detecção para Cd de 0,1 e 0,05
ppm e para Cu de 0,2 e 0,1 ppm.
Analisaram-se 21 amostras de 7 distritos de Portugal Continental (3 amostras distintas por distrito). As
concentrações médias para Cu e para o Cd foram, respectivamente: distrito de Castelo Branco, 0,65±0,44 ppm e
0,23±0,06 ppm; distrito de Setúbal, 1,22±0,24 ppm e 0,19±0,04 ppm; distrito de Coimbra, 0,73±0,28 ppm e
0,14±0,13 ppm; distrito de Faro, 0,34±0,28 ppm e valores abaixo do limite de detecção para Cd; distrito de Beja,
0,55±0,19 ppm e 0,07±0,06 ppm; distrito de Évora, 0,58±0,35 ppm e 0,14±0,15 ppm; distrito de Santarém,
0,71±0,89 ppm e para Cd valores abaixo do limite de detecção. Estatisticamente não existem diferenças
significativas (p>0,05) entre os resultados.
O Regulamento (CE) nº1881/2006 estabelece teores máximos de Cd em diferentes géneros alimentícios, sem definir
limites para o mel. Os valores médios permitidos encontram-se entre 0,05 e 1,0 mg/kg. Para Cu não existem teores
máximos permitidos em mel, ou qualquer outro género alimentício, sendo que a dose máxima diária recomendada
de Cu num adulto é de 5 mg. Os resultados obtidos neste trabalho não ultrapassam os limites estabelecidos.
[Determination of Copper and Cadmium in honey by Atomic Absorption Spectrometry:
preliminary results]
Honey is a food product composed mainly by carbohydrates, proteins, amino acids, water, vitamins and minerals. It
is a nutritive product known by its antiviral, antimicrobial and antioxidant properties, and it is consumed by
children, adults and elderly people. Honey production occurs in a natural environment, therefore the product is
exposed to the contamination by several environmental pollutants.
Heavy metal contamination of honey, from natural and especially from anthropogenic sources, is one of the most
important concerns. The main sources of these pollutants are industrial emissions, mostly from industries
(metallurgies) and residue incineration, and agricultural fertilizers.
The purpose of this study is the determination of heavy metals (copper and cadmium) in Portuguese honey samples,
from different regions, by atomic absorption spectrometry.
Measurements were made using an atomic absorption spectrometer (Perkin Elmer Analyst 700) equipped with an
air-acetilene flame (17/2 mL/min) and hollow cathode lamps as emission sources. In the validation of the analytical
procedure were determined the next validation parameters: linearity, repeatability, recovery, detection limit and
quantitation limit. The validation parameters obtained were: recovery over 80%, repeatability over 85%, linearity of
R2=0.99, quantitation limit and detection for Cd 0.1 ppm and 0.05 ppm and for Cu 0.2 and 0.1 ppm.
Twenty one honey samples from seven Portuguese mainland regions (3 different samples per region) were collected
and analyzed. The obtained results for Cu and Cd are: in Castelo Branco region, 0.65±0.44 ppm and 0.23±0.06 ppm;
Setubal region, 1.22±0.24 ppm and 0.19±0.04 ppm; Coimbra region, 0.73±0.28 ppm and 0.14±0.13 ppm; Faro
region, 0.34±0.28 ppm and values below the detection limit for Cd; Beja region, 0.55±0.19 ppm and 0.07±0.06 ppm;
Évora region, 0.58±0.35 ppm e 0.14±0.15 ppm; Santarém region, 0.71±0.89 ppm and for Cd values below the
detection limit. Statistically there are no differences between the results (p>0.05).
The Commission Regulation (EC) No.1881/2006 establishes Cd maximum levels in different foodstuffs, although
honey is not included. The mean values allowed are between 0.05 and 1.0 mg/kg. There are no established
maximum Cu levels in honey, or in any other food product, but the tolerable upper level intake for Cu in an adult is
5 mg/day. The results of this study do not exceed any of the established limits.
191
Poster 73
Rastreio de substâncias farmacológicas em mel de abelha Apis mellifera. Resultados preliminares
Belas, A., Carrapiço, B., Vaz, Y., São Braz, B.
Na Apicultura o uso de antibióticos e de acaricidas sintéticos é uma prática corrente, para o tratamento de doenças
bacterianas e parasitárias, da qual pode resultar a presença de resíduos no mel. A nível nacional a capacidade de
avaliação da presença dessas substâncias no mel, é praticamente nula. Face à necessidade de garantir o controlo
daquele produto é essencial a disponibilidade de metodologias analíticas específicas, sensíveis, rápidas e
relativamente baratas para fornecer aos apicultores garantias da qualidade do mel a ser comercializado, uma vez que
o uso excessivo daquelas substâncias, ou a sua má utilização, podem afectar a qualidade do mel e condicionar a sua
exportação. Este trabalho teve como objectivo o desenvolvimento de metodologias de rastreio para determinação de
acaricidas sintéticos (cumafos, tau-fluvalinato e flumetrina) e de antibióticos pertencentes aos grupos das sulfamidas
e das tetraciclinas em mel.
As metodologias analíticas desenvolvidas envolveram uma fase inicial de extracção em fase sólida (cartuchos C18
Sep Pak), seguida de análise por cromatografia de camada fina em placas ou cromotofolhas de sílica gel F 254 nm
utilizando diferentes sistemas de eluição e reagentes de visualização para cada grupo químico.
Para separação de sulfamidas utilizou-se uma fase móvel de clorofórmio/ metanol (45:5 (v/v)). Já para a separação
de tetraciclinas realizou-se pré tratamento das placas com EDTA 0,27 M, pH 9, seguida de secagem e activação a
110 ºC, antes de utilização. Neste caso a fase móvel utilizada consistiu em clorofórmio, metanol e EDTA na
proporção de 65:20:5 (v/v/v). Para separação dos acaricidas sintéticos utilizou-se, fase móvel de n - hexano e
acetona na proporção 80:20 (v/v).
A detecção foi realizada com luz UV (254/366 nm) e posterior confirmação por pulverização das placas com os
seguintes reagentes: solução de 20% KOH em metanol e solução de INT/PMS (10:2, v/v) para revelação dos
acaricidas, solução de p – Anisaldeído para revelação de flumetrina e tetraciclinas e fluorescamina para revelação de
sulfamidas.
As metodologias referidas permitiram detectar os antibióticos e os acaricidas estudados no intervalo de
concentrações de 8 – 50 ng e 0,1 – 0,3 µg. Estes limites de detecção, juntamente com os Rfs e cor obtidos, permitem
que o procedimento analítico proposto possa ser utilizado para rastreio de resíduos de substâncias
farmacologicamente activas de medicamentos veterinários em mel.
[Pharmacological substances screening in honey Apis mellifera bee. Preliminary results]
The use of antibiotics and synthetic acaricides (as Veterinary Medicine Products – VMPs) in Apiculture is a
common practice for the treatment of bacterial and parasitic diseases, which could result in the presence of residues
in honey. The supply of analytical methodologies for the evaluation of these substances is practically absente in
Portugal. To ensure product control and to provide quality assurance of honey to be marketed the availability of
specific, sensitive, rapid and relatively inexpensive analytical methods is essential, excessive use of those substances
or their misuse can affect honey quality, and restrict exports. The aim of this work was the development of screening
methods for determination in honey of synthetic acaricides (coumaphos, tau-fluvalinate and flumethrin) and
antibiotics like sulphonamides and tetracyclines.
Analytical methodologies developed include a solid phase extraction (Sep Pak C18 cartridges) and thin layer
chromatography analysis in silica gel F 254 nm plates, using different elution systems and visualization reagents for
each chemical group.
For sulphonamides separation a mobile phase of chloroform / methanol (45:5 (v / v)) was used. Previous to
tetracyclines separation a pre-treatment of plates with 0.27 M EDTA pH 9, followed by drying and activation at 110
ºC, was done. In this case the mobile phase includes chloroform, methanol and EDTA (65:20:5 (v/v/v)). For
separation of synthetic acaricides the mobile phase was n-hexane and acetone (80:20 (v/v)).
Detection was performed by UV light (254/366 nm) and confirmation by spraying plates with the following
reagents: 20% KOH in methanol solution and INT / PMS (10:2, v / v) for acaricides visualization, solution of p Anisaldehye for flumethrin and tetracyclines visualization and Fluorescamine solution for sulfonamides
visualization.
These methodologies allows the detection of antibiotics and acaricides studied in the range of 8 - 50 ng and 0.1 - 0.3
µg. The detection limits obtained with the RfS and color obtained, allows the use of this proposed analytical
procedure on screening of pharmacologically active substances residues of VMPs in honey.
192
Poster 74
Micobiota de alimentos prontos a consumir: estudo de caso em leitão assado
Bernardo, F.1, Camilo, P.2 e Lança, A.1
2 Médica Veterinária, Controlo de Qualidade de Alimentos, HMCaneira, Lda, Sintra, Portugal
Nas sociedades fortemente urbanizadas é cada vez mais usual o recurso a géneros alimentícios prontos consumir
como forma de abastecimento das famílias que, devido às suas ocupações laborais, não dispõem de tempo para
confeccionar as suas próprias refeições. A praticabilidade desta solução para um problema quotidiano faz aumentar
a procura de refeições prontas a consumir nas cadeias de distribuição alimentar, crescendo também a diversidade da
oferta. A gastronomia tradicional portuguesa tem sido adaptada, na medida do possível, as estas práticas de
abastecimento alimentar características das sociedades mais avançadas. As adaptações tecnológicas que foram
necessariamente adoptadas carecem de algum estudo técnico, não só nos aspectos organolépticos e nutricionais mas
também sobre a durabilidade comercial dos produtos e os recursos tecnológicos mais adequados ao prolongamento
da respectiva vida comercial útil.
Neste estudo apresenta-se o caso de um prato típico português “leitão assado” pronto a consumir, e as consequências
das contaminações por fungos durante o ciclo comercial do produto. Procedeu-se a uma semi-quantificação e
identificação dos principais agentes fúngicos presentes em peças de “leitão assado” retiradas do mercado devido a
sinais evidentes de decomposição fúngica e procurou-se averiguar as potenciais fontes da contaminação original do
produto. O teor estimado das contaminações originais variou entre 10 e 100 ufcf / cm2 de superfície da peça de
leitão assado. Os fungos predominantes foram: Penicillium spp., Alternaria spp., Cladosporium clamidosporioides e
leveduras diversas (géneros Rodotorula, Geotrichum e Pychia).
No ambiente de produção, utilizou uma técnica de exposição natural de caixas de Petri de 14 cm θ, contendo
Agarose de Sabouraud, em cinco ponto das zonas de fabrico e acondicionamento do produto. O tempo de exposição
das referidas caixas foi o equivalente aos tempos de permanência dos produtos nas mesmas áreas de produção. As
caixas foram incubadas durante 5 dias a 25 ºC. Os teores da contaminação anemófila foram cerca de 99% inferiores
aos registados na superfície do produto. Os fungos predominantes foram Cladosporium spp., Aspergillus spp.,
Phoma spp., Rhizopus nigricans, Trichoderma spp., Rhizoctonia spp., Saccharomyces spp. e Aureobasidium spp..
As discrepâncias dos resultados registados na superfície das peças de leitão assado e no micobiota predominante no
ambiente fabril, suscitam uma série questões que devem ser tidas em consideração pelos agentes económicos, nas
suas decisões no momento da atribuição dos prazos de validade para consumo deste tipo de géneros alimentícios.
[Mycobiota of ready to eat meals: a case study in “roasted piglet”]
The market of ready-to-eat food is increasing in urbanized societies. The way of supplying needed domestic food is
changing due to life style modifications, enhancing fewer time to cook own family meals. The practicality of this
solution, to an everyday problem, increases the demand for ready-to-eat meals in the food distribution chains, and
also claims for more diversity. Many traditional Portuguese dishes have been adapted, as far as possible, to these
practices of food supplying features in the most advanced societies. Changes in the adopted technological were
found necessary, including many technical studies; not only for the organoleptic and nutritional aspects but also
concerning to the durability of commercial products and more accuracy of technological resources to adequate shelf
life of those products to people needs.
This study presents the case of a typical Portuguese dish, ready-to-eat "roasted piglet", and the consequences of the
fungal contamination during the shelf life of the product. A semi-quantification of dominant fungi and identification
of fungal agents were performed in samples of the ready-to-eat food recalled from the market, due to obvious signs
of fungal decay, and an attempt to identify potential sources of contamination was also tried. The original level of
contamination varied between 10 and 100 fufc/ cm2 of piece of the “roasted piglet”. The predominant found fungi
were: Penicillium spp., Alternaria spp., Cladosporium clamidosporioides and several yeasts (Rodotorula,
Geotrichum and Pychia).
In the plant environment, a technique of natural exposure of Petri dishes of 14 cm θ, containing Sabouraud Dextrose
Agar was used, in five points of the manufacture and packaging of the product. The exposure time of the boxes was
the equivalent of the residence times of products, in the same areas of production. The boxes were incubated for 5
days at 25 ° C. The levels the airborne contamination were about 99% lower than those on the product surface. The
predominant fungi were: Cladosporium spp., Aspergillus spp., Phoma spp., Rhizopus nigricans, Trichoderma spp.,
Rhizoctonia spp., Saccharomyces spp. and Aureobasidium spp.. Non compliance in the recorded results on the
surface of the pieces of “roasted piglet” and the mycobiota found in the manufacturing environment, raises a number
of technical issues that must be taken into consideration by economic agents in their decisions at the time of award
of the shelf life of such foodstuffs.
193
Poster 75
Avaliação das características microbiológicas de refeições servidas em restaurante asiático
Villa de Brito, J., Brandão, C., Gonçalves, C.
Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Portugal
Introdução: A produção de alimentos com adequada qualidade é imprescindível, para garantir a salubridade e
inocuidade dos géneros alimentícios, respeitar as normas legais e satisfazer as exigências dos consumidores.
Actualmente, com a globalização à escala mundial, é inevitável o aparecimento de determinadas preparações
culinárias ou produtos alimentares oriundos de países com tradições alimentares ancestrais e completamente
distintas da tradição e dos hábitos gastronómicos dos países que os recebem. No entanto, os hábitos tradicionais de
concepção deste tipo de gastronomias deverão ser adaptados, para o correcto cumprimento de procedimentos de
segurança alimentar e de normas e regulamentos sanitários em vigor, nas comunidades ou países onde estarão
inseridos. Assim, deverão ser estudadas e aplicadas metodologias de segurança alimentar para a garantia de
fornecimento deste tipo de produtos e preparações culinárias.
Objectivos: O objectivo geral deste trabalho consistiu na obtenção de informações sobre a qualidade microbiológica
de um produto alimentar representativo da gastronomia milenar Chinesa (“dim-sum”), através de um estudo
experimental laboratorial. O objectivo principal foi a avaliação laboratorial deste produto e a implementação de
metodologias de segurança alimentar para assegurar a qualidade e segurança sanitária dos mesmos.
Metodologia: A metodologia utilizada foi seleccionar um restaurante chinês com produção de “dim-sum” e analisar,
dentro das ofertas destes produtos constantes em menu, alguns que pudessem apresentar risco para a segurança
alimentar dos consumidores, devido aos seus ingredientes e métodos de preparação. Várias amostras de “dim-sum”
foram analisadas em 2 fases distintas, designadamente imediatamente antes da confecção culinária (tratamento
térmico) e logo após a sua confecção. As análises foram efectuadas de acordo com os seguintes parâmetros
microbiológicos: Staphilococcus aureus, E. coli, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Salmonella spp.,
coliformes totais e fecais.
Resultados e conclusões: Os resultados que temos até ao momento permitem concluir que existe uma elevada carga
microbiológica inicial nos produtos analisados, relacionado com a presença de microrganismos mesofilos e
coliformes, assim como uma elevada destruição microbiológica logo após o tratamento térmico dos “dim-sum”, pelo
que este trabalho demonstra o aspecto relevante do parâmetro tempo/temperatura na preparação deste tipo de
produtos, assim como a importância do controlo higiénico na preparação e manipulação dos géneros alimentícios.
[Evaluation of microbiological characteristic of meals served in Asian Restaurant]
Introduction: The production of food with adequate quality is essential to ensure the health and food safety, respect
the laws and satisfy the requirements of consumers. Today, with worldwide globalization, it is inevitable the
appearance of certain food preparations and food products from countries with ancient food traditions and
completely different tradition and gastronomic habits of their host countries. However, traditional ways of producing
this type of gastronomy should be adapted to the proper performance of food safety procedures and health
regulations, in the communities or countries where they will be inserted. It should, therefore, be studied and applied
methodologies for food safety for ensuring the production of such products and food preparations.
Objectives: The general objective of this work was to obtain information on the microbiological quality of a food
product representative of the ancient Chinese cuisine ("dim sum"), with an experimental study in laboratory. The
main objective was the laboratory evaluation of this product and the implementation of food safety methods to
ensure quality and safety of same.
Methodology: The methodology used was to select a Chinese restaurant with a production of "dim sum" and
analyze, within the offerings of these products listed in the menu, those who could present some risk to food safety
for consumers, due to its ingredients and preparation methods. Several samples of "dim sum" were analyzed in two
distinct phases: immediately before cooking (heat treatment) and immediately after its preparation. Analyses were
performed according the following microbiological parameters: Staphylococcus aureus, E. coli, Bacillus cereus,
Clostridium perfringens, Salmonella spp., total and fecal coliforms.
Results and conclusions: The results that we have until now, allow us to conclude that there is a high initial
microbial charge in the products analyzed, associated with the presence of mesophilic and coliform bacteria, as well
as a high microbiological destruction after the heat treatment of the "dim-sum ". So that, this work demonstrates the
relevant aspect of the parameter time / temperature in the preparation of such products, as well as the importance of
hygiene control in preparing and handling this kind of food products.
194
Poster 76
Avaliação da qualidade microbiológica de refeições à base de fruta, vegetais crus e pasta de atum
Gonçalves, S., Brandão, C.
Laboratório de Microbiologia Alimentar da Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Portugal
Objectivos: Nos últimos vinte e cinco anos tem-se assistido a mudanças nos hábitos alimentares dos consumidores.
Verificou-se assim um aumento na procura de serviços que disponibilizem refeições prontas a comer. Esta tendência
pode contudo, trazer problemas a nível da segurança e qualidade dos alimentos, pois a maioria dos produtos não são
submetidos a tratamento térmico, potenciando o desenvolvimento microbiano.
Metodologias: Neste trabalho realizou-se um estudo microbiológico de produtos destinados a ser consumidos no dia.
Os três tipos produtos escolhidos foram os seguintes: sandes de pasta de atum, ovo cozido, e vegetais crus; salada de
vegetais e tomate, requeijão e orégãos; e fruta laminada. De cada um destes produtos foram realizadas quinze
colheitas.
Na realização das análises microbiológicas foram utilizadas metodologias clássicas na pesquisa de sete parâmetros:
Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, coliformes totais, Escherichia coli, mesófilos, Pseudomonas spp., e
Staphylococcus aureus.
Resultados: No total das quarenta e cinco amostras analisadas obteve-se, como não satisfatório 97,8% das amostras
para Aeromonas hydrophila (>102 ufc/g), 52,3% para coliformes totais (>10 2 para sandes e >104 para saladas e
fruta), 37,8% para Escherichia coli (>10 para sandes e >102 para saladas e fruta), 60,0% para mesófilos (>10 4 para
sandes e >106 para saladas e fruta), e 93,3% para Pseudomonas spp. (>102 para sandes e >104 para saladas e fruta).
As amostras de sandes, saladas e fruta, quando testadas para Aeromonas hydrophila e Pseudomonas spp.
apresentaram resultados considerados não satisfatórios semelhantes, entre 26,7% e 33,3%.
No total das amostras, 57,8% apresentou resultados satisfatórios para Escherichia coli, dos quais 22,2% e 28,9% são
respectivamente para saladas e fruta. Contrariamente, as sandes apresentam apenas 6,7% de amostras de resultado
satisfatório, e 24,4% não satisfatório.
Na pesquisa de coliformes totais e mesófilos o produto que se destaca com maior percentagem de amostras com
resultado não satisfatório foi as sandes, 31,8% e 28,9%, respectivamente.
Nas análises realizadas para Staphylococcus aureus, 4,4% dos resultados foram não satisfatórios, correspondendo a
uma amostra de salada e uma de fruta laminada, com valores superiores ou iguais a 10 2.
Relativamente a Bacillus cereus apenas 2,2% das amostras mostraram resultados superiores a 102 e iguais ou
inferiores a 103, valor considerado aceitável, e que correspondeu a uma amostra da sandes de pasta de atum.
[Assessment of microbiological quality of meals based on raw fruit,vegetables and tuna spread]
Objective: For the past twenty-five years consumers have changed their eating habits resulting in an increase of
services that provide ready to eat products. However, this demand may result in severe infringements in safety and
quality as most of these products are not submitted to thermal treatment allowing for microorganisms to reproduce
and increase.
Methodologies: This study focused on a microbiological assessment of products with very low shelf life. The chosen
products were: tuna filled baguettes with boiled eggs, canned corn and raw goods (lettuce, tomato and carrot);
lettuce, tomato, cottage cheese and oregano; assorted sliced fruit (from this point onwards referred as baguette, salad
and fruit). From each one of these categories fifteen samples were taken.
Results: All samples were analyzed using standard plating techniques testing for: Aeromonas hydrophila, Bacillus
cereus, coliforms, Escherichia coli, aerobic plate count, Pseudomonas spp. and Staphylococcus aureus.
The analysis showed as non satisfactory: 97.8% of the samples for Aeromonas hydrophila (>102 CFU/g), 52.3% for
coliforms (>102 for baguettes and 104 for salad and fruit), 37.8% for Escherichia coli (>10 for baguettes and 102 for
salad and fruit), 60.0% for aerobic plate count (>10 4 for baguettes and 106 for salad and fruit), 93.3% for
Pseudomonas spp. (>102 for baguettes and 104 for salad and fruit).
Both Aeromonas hydrophila and Pseudomonas spp. showed similar results in all categories of products analyzed
(between 26.7% and 33.3%).
Considering Escherichia coli, 57.8% of the samples were satisfactory from which 22.2% represented salad and
28.9% represented fruit. However, baguettes had only 6.7% of satisfactory results and 24.4% non satisfactory from
the 37.8% of non satisfactory.
For coliforms and aerobic plate count, baguettes represented the majority of non satisfactory results (31.8% and
28.9%).
Staphylococcus aureus showed 4.4% of non satisfactory results this number corresponds to one salad and one fruit.
The rest of the results were negative.
Regarding Bacillus cereus only 2.2% of the samples demonstrated results superior to 10 2 and equal or inferior to
103, which is considered acceptable (this value correspond to a baguette). The rest of the samples were negative.
195
Poster 77
Avaliação da qualidade microbiológica do ar em cozinhas e zonas de buffet
Lemos, M. e Brandão, C.
Laboratório de Microbiologia Alimentar da Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Portugal
Objectivos: Tem sido constatada a importância da contaminação do ar de ambientes internos. No caso de ambientes
de manipulação de alimentos, além de poder causar doenças aos ocupantes, pode também interferir na qualidade
final do produto. No entanto poucos estudos sobre o monitoramento microbiológico do ar em ambientes de
manipulação de alimentos tem sido observados na literatura. Os microrganismos podem estar na forma de aerossóis,
dispersos no ar agregados em partículas sólidas ou líquidas, e depositar-se sobre os alimentos e equipamentos
durante o processamento, sendo as bactérias e fungos os contaminantes mais comumente encontrados. O objetivo
deste estudo foi avaliar a qualidade microbiológica do ar em 3 áreas de preparação e manipulação de alimentos e na
área de exposição do buffet de pequeno almoço de um hotel de cinco estrelas na Região do Algarve.
Metodologia: Dentre os diversos métodos de amostragem, foi selecionado o de impactação em meio sólido, que
permite coletas pontuais, rápidas e com volume conhecido de ar, possibilitando a quantificação por m 3. Quanto aos
meios de cultura foram selecionados para bactérias o PCA (Plate Count Agar) e para fungos o RB (Rose Bengal).
Durante 15 dias consecutivos amostras de ar da; cafetaria, pastelaria, gard manger e a zona do buffet de pequenoalmoço no restaurante foram analisados quanto a quantificação de fungos e bactérias.
Resultados: Todos os ambientes estavam de acordo com os limites estabelecidos na legislação portuguesa, de 500
UFC/m3 tanto para fungos como bactérias. Não foi possível estabelecer uma relação direta entre os resultados e as
condições climáticas nem com o número de pessoas nas cozinhas nos dias de amostragem. Apenas no restaurante foi
observada variação de acordo com os números de comensais no momento da coleta das amostras. Alterações
pontuais nos resultados foram observadas na cafetaria, podendo estar relacionada atividades realizadas no momento,
nomeadamente o abastecimento das arcas. Apesar de todos os ambientes analisados estarem de acordo com a
legislação vigente, sugere-se um maior aprofundamento em estudos que procurem avaliar se estes valores estão
adequados para ambientes de preparação e manipulação de alimentos, uma vez que os existentes não são específicos
para o setor de alimentação.
[Assessment of microbiological quality of air in the kitchen and buffet areas]
Objectives: It has been found the import of contaminated indoor air. In the case of food handling environment can
cause illness to occupants, but can also interfere with the final product quality too. However few studies on the
microbial air monitoring in food handling environments has been reported in the literature. Microorganisms can be
in the form of aerosols dispersed aggregates in the air in solid or liquid, and settle on food and equipment during
processing, and bacteria and fungi are the most commonly found contaminants. The aim of this study was to
evaluate the microbiological quality of air in three areas of preparation and food handling and display area for the
breakfast buffet in a five-star hotel in the Algarve.
Methodology: Among the various methods of sampling, we selected an agar plate impactor on solid medium, which
allows collection point, faster and known volume of air, trough quantification by m 3. As for culture media for
bacteria were selected PCA (Plate Count Agar) and fungi RB (Rose Bengal). For 15 consecutive days of air samples
cafeteria, pastries, garde manger and the breakfast buffet in the restaurant were analyzed for the concentration of
fungi and bacteria.
Results: All areas were in compliance with the limits established by Portuguese law, 500 CFU/m3 for both fungi and
bacteria. Unable to establish a direct relationship between the results and the weather conditions and the number of
people in the kitchens in the days of sampling. Only in the restaurant, was observed variations according to the
number of guests at the time of sample collection. Specific changes in results were observed in the cafeteria, which
may be related to activity performed at the time, the supply of kitchen freezers inside and in the pastries. Despite all
the environments are analyzed in accordance with current legislation, it is suggested a further deepening in studies
that seek to assess whether they are appropriate values for environments of food preparation and handling, since
existing ones are not specific to the sector supply.
196
Poster 78
Avaliação do risco na distribuição domiciliária de refeições
Bernardino, F.1 e Brandão, C.2
1 Produção e Qualidade Alimentar no CCD da Segurança Social de Lisboa e Vale do Tejo
2 Laboratório de Microbiologia Alimentar da Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril
Objectivos: O presente trabalho de investigação tem como objectivo, incidir na avaliação e percepção do risco na
distribuição domiciliária de refeições a idosos, na região de Lisboa e Vale do Tejo, levada a cabo pelas instituições
de restauração colectiva social, através de estudo diagnóstico e metodológico que se baseou na obtenção de dados
científicos.
Metodologia: Para alcançar os objectivos propostos realizou-se uma análise exploratória do tipo de estudo de caso,
seleccionando aleatoriamente uma amostra de 30 instituições, de um universo de 289, da região em estudo.
Procedeu-se a uma divisão e caracterização por grupos, tendo em conta a sua dimensão e natureza.
Elaborou-se uma listagem de verificação, com base na observação, com o intuito de identificar e avaliar as
condições higiénico-sanitárias das instituições e respectiva percepção, por parte dos intervenientes no processo.
Resultados: Embora existam, segundo Carta Social (2011) na região de Lisboa, 289 instituições sociais, com
capacidade de 14126 respostas diárias de refeições domiciliárias a idosos, no entanto segundo amostragem realizada
no estudo, 80% das instituições não reúnem algumas condições básicas de funcionamento, ao nível das instalações e
equipamentos, confecção e embalamento dos alimentos, cumprimento de boas práticas e distribuição da refeição.
Constata-se ainda que existe um défice na formação e conhecimento sobre o que são boas práticas de higiene e
fabrico e sobre o que são alimentos de alto risco, sendo que 95% dos colaboradores questionados no estudo nunca
tiveram formação na área de qualidade, higiene e segurança alimentar.
Verifica-se ainda que 48% dos utentes idosos questionados, afirmam já se terem sentido mal dispostos depois de
terem consumido a refeição do fim-de-semana, sendo que estas, maioritariamente em 95% das instituições, da
amostra analisada, são distribuídas juntamente com o almoço de sexta-feira, o que aumenta o período de exposição
do alimento a temperaturas desadequadas que originam um maior risco alimentar para o consumidor.
Conclui-se ainda que apesar da oferta em termos de instituições sociais, que prestam serviço de apoio domiciliário
de refeições a idosos ser suficiente na região em apreço, para os 12299 total de utentes que usufruem destes serviços
diariamente, existe uma concentração geográfica, provocando uma elevada densidade espacial e um incipiente
planeamento integrado e dinâmico que, optimize a qualidade e segurança alimentar dos produtos e serviços,
originando uma insustentabilidade generalizada e um elevado risco alimentar na distribuição domiciliária das
refeições a idosos.
[Risk assessment in the home delivery of meals]
Objectives: This research work is focusing on the assessment and risk perception of the meals delivery service to the
elderly in the region of Lisbon and Tagus Valley, carried out by social catering institutions, through a diagnostic and
methodological study was based on scientific data collection.
Methodology: To achieve the proposed objectives it was held an exploratory analysis of the type of case study by
selecting a random sample of 30 institutions, from a universe of 289 in the region studied. There has been a division
and characterization of groups, taking into account the size and nature.
We developed a checklist based on the observation, in order to identify and evaluate the sanitary conditions of the
institutions and their perception, by stakeholders in the process.
Results: Even though, according to the Social Charter (2011) in the Lisbon area, 289 social institutions, with a
capacity of 14,126 meals for daily home visits for elderly, according with the sampling performed in the study, 80%
of institutions do not meet some basic conditions of operation, such as the facilities and equipment, clothing and
food packaging, fulfillment and distribution of good practices of the meal.
We also understand that there is a deficit in training and knowledge about what are good hygiene and manufacturing
practices and the foods that are high risk, with 95% of employees questioned in the study had never had training in
quality, hygiene and food security.
It was also found that 48% of the elderly questioned, stated that they had already felt sick after having consumed a
meal of the week-end, and these mostly in 95% of the institutions, of the sample, are distributed along with lunch on
Friday, which increases the exposure time for the food to temperatures that cause inappropriate eating a greater risk
to the consumer.
It is also concluded that despite the offer of social institutions that provide home care service of meals to the elderly
be sufficient in the region in question, to 12,299 total users who had received these services on a daily basis, there is
a geographic concentration, causing a high spatial density and an emerging integrated and dynamic planning,
optimized the quality and food safety of products and services, resulting in a widespread and unsustainable food in a
high risk home delivery of meals to the elderly.
197
Poster 79
Tipificação do consumidor de queijo Serra da Estrela e seu papel na segurança do produto
alimentar
Guilherme, V., Vaz, Y., Nunes, T.
A preocupação manifestada pelos consumidores, relativamente à inocuidade dos alimentos é cada vez maior. Esta
evolução, no entanto, nem sempre se traduz em boas práticas de manipulação, confecção e conservação dos
produtos em casa, antes do seu consumo. Estas, não sendo cumpridas, devido a desconhecimento ou a hábitos
adquiridos, estão na origem de toxinfecções alimentares e são da responsabilidade do consumidor.
Pretende-se, com este trabalho, caracterizar as condições de conservação e consumo do queijo Serra da Estrela de
forma a caracterizar o tipo de consumidor e a verificar se existem práticas de risco que possam ser corrigidas. Os
principais parâmetros a avaliar são: temperatura de conservação; padrão familiar de consumo e acondicionamento.
Para tal, foram abordados, em superfícies comerciais da Grande Lisboa e do Grande Porto, durante o período de
Maio a Julho de 2011, consumidores que adquirissem queijo Serra da Estrela ou semelhante. Estes foram
convidados a levar consigo um kit que incluía um registador de temperatura (Thermochron® 1921G), que iria ficar
em contacto com o mesmo queijo, e um questionário a ser preenchido em casa. Ao fim de uma semana de
permanência em casa do consumidor, aqueles são devolvidos em envelope de porte pago, para posterior análise de
dados. Espera-se obter cerca de 100 questionários e leituras de temperaturas até ao final do trabalho que se encontra
a decorrer.
Os resultados preliminares obtidos de 15 questionários indicam que o frigorífico é o local de acondicionamento
preferido nos meses quentes (60% dos inquiridos). Nos meses mais frios, o queijo é deixado à temperatura ambiente
(40% dos inquiridos deixa na bancada de cozinha e 13.3% no armário de cozinha). As diferenças no local de
armazenamento do queijo influenciam também as temperaturas a que o queijo fica sujeito, tendo-se obtido um
intervalo de temperaturas que vai desde os -0,5 ᴼC (temperatura mínima registada) até aos 34,5 ᴼC (temperatura
máxima registada), sendo que a média de temperaturas médias registadas situou-se no 17 ᴼC. Relativamente ao
padrão familiar de consumo, verificou-se que a grande maioria dos consumidores de queijo Serra da Estrela (76.5%)
se situa numa faixa etária que vai dos 15-59 anos, enquanto, para as faixas etárias de maior risco (≤ 4anos e ≥60
anos), a percentagem de consumidores é menor (2.9% e 17.6%, respectivamente). Nos restantes grupos de risco,
grávidas e imunodeprimidos, não houve registo de consumo até á data.
Projecto financiado pela FCT – ERAFOOD/0003/2008 “Risk assessment of Listeria in traditional ready-to-eat food items (LisRisk)”
[Typifying Serra da Estrela cheese consumer and his role on the product safety]
The concern expressed by consumers regarding food safety is increasing. However, this isn‟t always reflected in
good handling practices, cooking and storage of products at home before consumption. These, not being fulfilled
due to lack of knowledge or acquired habits, are the cause of food toxinfections and are the responsibility of the
consumer.
It is intended with this work, characterize the conditions of conservation and consumption of Serra da Estrela cheese
in order to characterize the type of consumer and see if there are risk practices that can be corrected. The main
parameters to evaluate are: storage temperature; familiar pattern of consumption and storage.
To this end, they were approached in shopping areas of Lisbon and Oporto, during the period May to July 2011,
consumers buying the Serra da Estrela cheese or similar.
They were asked to carry a kit that included a temperature recorder (Thermochron ® 1921G), which would be in
contact with the same cheese, and a questionnaire to be completed at home. After a week spent at consumer's home,
those are returned in postage-paid envelope for later data analysis. It is expected around 100 questionnaires and
temperature readings by the end of the work that‟s in progress.
Preliminary results of 15 questionnaires indicate that the refrigerator is the preferred storage location in the warmer
months (60% of respondents). In colder months, the cheese is left at room temperature (40% of respondents left in
the kitchen countertop and 13.3% in the kitchen closet).The differences in the storage location of the cheese also
influence the temperature that the cheese is subject, having been obtained a range of temperatures ranging from -0.5
ᴼC (minimum temperature recorded) up to 34.5 ᴼC (maximum temperature recorded), and the average mean
temperatures stood at 17.0 ᴼC.
For the familiar pattern of consumption, it was found that the vast majority of consumers of Serra da Estrela cheese
(76.5%) lies in an age range of 15-59 years, while for the age groups most at risk (≤ 4 years and ≥ 60 years), the
percentage of consumers is lower (2.9% and 17.6%, respectively). In other risk groups, pregnant women and
immunocompromised, there was no record of consumption to date.
198
Poster 80
Fungos em alimentos compostos para suínos: dados recentes
Martins, H.M.1, Almeida, I.2, Camacho, C.1, Santos, S.1, Guerra, M.3,4, Costa, J.M.2, Bernardo, F.4
1 Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa; 2 Direcção Geral de Veterinária, Lisboa; 3 Escola Superior de
Hotelaria e Turismo do Estoril; 4 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
A contaminação fúngica dos alimentos compostos para animais interfere indirectamente com o estado de
conservação e de nutritividade desses produtos, podendo desencadear também perdas económicas e perturbações na
saúde dos animais. As medidas preventivas que podem limitar a contaminação das matérias-primas por fungos e o
respectivo desenvolvimento nos processamentos subsequentes à colheita são vectores estratégicos muito relevantes
para atenuar os impactos resultantes daqueles prejuízos. Neste estudo pretendeu-se avaliar os níveis de
contaminação fúngica que ocorreram nos alimentos compostos para suínos produzidos durante o ano de 2010. Para
isso, analisaram-se 114 amostras de rações para suínos obtidas em fábricas nacionais. Para efectuar a contagem dos
fungos utilizou-se um método de diluição em placa com agar de acordo com um método convencional (ISO 215272); Os solutos com suspensões decimais foram inoculados nas caixas de 14 mm θ (4 por cada suspensão; 0,25
ml/placa) e incubadas a 25ºC durante 5 dias. A identificação das espécies fúngicas foi realizada através da
observação morfológica usando chaves dicotómicas, baseada em aspectos macroscópicos e microscópicos. Três das
amostras revelaram-se negativas (2,6%). Nas 111 amostras positivas (97,4%) foram detectados diversos agentes
fúngicos. Os teores de bolores e leveduras totais variaram entre 1,9 × 10 2 a 4,5 × 105 ufc/g, com um valor médio de
2,9 × 104 ufc/g; As leveduras estavam presentes em 71,9% das amostras positivas; entre os bolores, as espécies mais
frequentes pertenciam aos géneros Aspergillus (84,2%, 5 espécies), seguido de Fusarium (75,4%), Penicillium
(54,4%), Mucor (46,5%), Absidia (36,0%), Cladosporium (24,6%), Paecillomyces (18,4%), Rhizopus (14,0%),
Phoma (13,2%), Trichoderma (3,5%), Scopulariopsis (1,8%) e Aureobasidium (0,9%). As contagens totais de
Aspergillus spp. variaram entre 10 e 2,4 × 104 ufc/g, enquanto as contagens de Fusarium verticilliodes variaram
entre 10 e 2,8 × 105 ufc/g. Apesar da elevada frequência de Aspergillus nas amostras, este género não foi o que
revelou teores mais elevados. Fusarium verticilliodes apresentou o teor de contaminação mais elevado. As leveduras
apresentaram teores variáveis sendo o máximo detectado de 4,0 × 10 5ufc/g. Entre as contaminações por Penicillium
spp. a que revelou um teor máximo cifrou-se em 2,8 × 104 ufc/g. As amostras apresentaram um valor médio de
contaminação superior ao detectado em estudos equivalentes anteriores (Almeida et al. 2007). A elevada frequência
das contaminações fúngicas detectadas em alimentos compostos para suínos em Portugal em 2010, reflecte um
problema que deve ser sistematicamente equacionado pelos fabricantes de rações, devendo estes ter implementados
planos sistemáticos de monitorização destas contaminações de modo a obstar aos impactos negativos da respectiva
evolução.
Referências: Almeida, I., Marques, M., Torrado, E. and Martins, H.M. (2007). Occurrence of mycobiota in swine feed. In Antonio Mendez-Vilas
(Ed.) Current Research Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology (pp.407-411). World Scientific Congress. Sevilha, Spain.
[Moulds in swine feed: an update]
Fungal contamination of feeding stuffs indirectly interferes with the preservation status of these products and its
nutritious content, and in addition, can cause economic loss and also animal health disorders. Preventive measures
limiting the contamination of raw materials by fungi and its growth in the post harvest processing are very important
strategic focus to diminish impacts resulting from those damages. The aim of this study was to evaluate the levels of
fungal contamination that occurred in swine feeds produced during the year 2010. So, 114 samples of granulate
swine feed taken in national factories were analyzed. The dilution-plate method was used for enumeration of moulds
according to a conventional method (ISO 21527-2); The solutes were inoculated with decimal suspensions in 14 mm
θ plates (4 for each suspension; 0 25 ml/plate) and incubated at 25 ºC for 5 days. The identification of fungal species
was performed by morphological observation using dichotomous keys based on macroscopic and microscopic
aspects. Three out of the samples revealed to be negative (2.6%). In the 111 positive samples (97.4%) several fungal
agents were detected. The levels of total molds and yeasts ranged from 1.9 × 10 2 to 4.5 × 105 cfu/g with a mean
value of 2.9 × 104 cfu/g. Yeasts were present in 71.9% of the positive samples and among the molds, the most
frequent species belonging to the genera Aspergillus (84.2%, 5 species), followed by Fusarium (75.4%), Penicillium
(54.4%), Mucor (46.5%), Absidia (36.0%), Cladosporium (24.6%), Paecillomyces (18.4%), Rhizopus (14.0%),
Phoma (13.2%), Trichoderma (3.5%), Scopulariopsis (1.8%) and Aureobasidium (0.9%). Total counts of
Aspergillus spp. ranged from 10 to 2.4 × 10 4 cfu/g, while the counts of Fusarium verticilliodes ranged from 10 to
2.8 × 105 cfu/ g. Despite the high frequency of Aspergillus in the analyzed samples, this genus didn‟t reveal to have
the highest levels of contamination, fact that was observed with Fusarium verticilliodes. Yeasts showed variable
levels of contamination with a maximum level of 4.0 × 105 cfu/g. With respect to the contaminations by Penicillium
spp. the maximum detected level was 2.8 × 10 4 cfu/g. Overall, the samples showed an average contamination higher
than observed in previous similar studies (Almeida et al. 2007). The high frequency of fungal contamination
detected in feeds for pigs in Portugal in 2010, reflects a problem that must be systematically considered by feed
manufacturers, who must implement systematic monitoring plans for these contaminants in order to overcome the
negative impacts of their presence and evolution in these materials.
199
Poster 81
Ocorrência de micotoxinas em alimentos para animais produzidos e comercializados em Portugal
durante o ano de 2010
Martins, H.M.1, Costa, J.M.2
1 Serviço de Micologia, Laboratório Nac. de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa. Email: [email protected]
2 Direcção Geral de Veterinária, Direcção de Serviços de Produção Animal, Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
As micotoxinas, tais como Aflatoxina B1 (AFB1), Ocratoxina A (OTA), Zearalenona (ZEA), Deoxinivalenol
(DON) e Fumonisinas B1 e B2 (FBs) são esporadicamente encontradas em alimentos para animais e matériasprimas numa vasta gama de concentrações, dependendo das condições de pré-colheita e armazenamento. O objetivo
deste estudo foi determinar a ocorrência de AFB1, OTA, ZEA, DON e FBs em 931 amostras de alimentos para as
vacas leiteiras (426), pequenos ruminantes leiteiros (85), ovinos de engorda/acabamento (24), galinhas poedeiras
(75), suínos (286), cavalos (35) e em 41 amostras de matérias-primas, colhidas aleatoriamente em fábricas de rações
em Portugal. Nas determinações das micotoxinas, o método utilizado foi HPLC. AFBs e ZEA foram determinadas
em amostras para gado leiteiro; AFB1 foi encontrada em 15 amostras (2,9%); ZEA foi mais frequente, sendo
detectada em 48 amostras (44,9%) com um nível máximo de contaminação de 136,9 µg/kg. A co-ocorrência entre
AFB1 e ZEA foi confirmada em três amostras. DON foi determinada em 24 amostras de alimentos ovinos de
acabamento; Oito amostras foram positivas (33,3%) com nível máximo de 900 µg/kg. FBs e ZEA foram
pesquisadas em 85 amostras de alimentos para leitões; ZEA foi encontrado em 37 amostras (43,5%) e FB1 em 28
amostras (32,9%) com níveis máximos 68,6 µg/kg e 3815,5 µg/kg, respectivamente. A co-ocorrência de ambas as
micotoxinas foi observada em 9 amostras (10,59%). DON, ZEA e OTA foram pesquisadas 201 amostras de rações
para suínos de crescimento e engorda; ZEA foi encontrado em 63 amostras (31,3%) com níveis de 5 a 402,0 µg/kg.
DON foi detectada em 32 amostras (15,9%). OTA apresentou baixa frequência; 10 amostras positivas (5,0%) e os
níveis foram de 2 a 130,5 µg/kg. Nestas amostras verificou-se a co-ocorrência de DON e OTA em uma amostra;
DON e ZEA em 9 amostras; OTA e ZEA em 6 amostras. A co-ocorrência das três micotoxinas não foi detectada.
OTA foi determinada em todas as amostras de rações para galinhas poedeiras, das quais 6 foram positivas (8,0%);
Os níveis de contaminação variaram de 2 a 10,90 µg/kg. Nas rações para equídeos foram pesquisadas apenas FBs
com baixa positividade - uma amostra positiva (2,86%) com 76,6 µg/kg de FB1 e 138,8 µg/kg de FB2.
Relativamente às matérias-primas, foram analisadas 41 amostras. FB1 foi detectada em 15 (36,6%); ZEA foi
encontrada em 9 (22,0%); DON em 7 (17,1%); AFB1 em 6 (14,6%) e OTA apresentou menor frequência de
contaminação - 3 amostras positivas (7,3%). Os resultados mostraram níveis de contaminação por micotoxinas em
alimentos compostos e matérias-primas sistematicamente abaixo dos valores de referência oficial. No entanto,
devido à frequência de positividade permanece como uma boa prática a realização de uma vigilância ativa e
sistemática destas micotoxinas com a finalidade de proporcionar segurança dos alimentos bem como à saúde e bemestar animal.
[Ocurrence of mycotoxins in feeds manufactured and marketed in Portugal during 2010]
Mycotoxins such as Aflatoxin B1 (AFB1), Ochratoxin A (OTA), Zearalenone (ZEA), Deoxinivalenol (DON) and
Fumonisins B1 e B2 (FBs) are sporadically found in feed and feedstuffs in a wide range of concentrations,
depending on the environmental pre-harvest and storage conditions. The aim of this study was to determine the
occurrence of AFB1, OTA, ZEA, DON or FBs in 931 samples of feeds for dairy cows (426), small dairy ruminants
(85), finishing sheep (24) laying hens (75), pigs (286), horses (35) and in 41 samples of feedstuffs randomly
collected from feed factories in Portugal. The mycotoxin determination was performed by HPLC method. AF1 and
ZEA were determined in dairy cattle feed samples; AFB1 were found in 15 samples (2.9%); ZEA occurrence was
more frequent, being detected in 48 samples (44.9%) with a maximum level of contamination of 136.9 µg/kg. AFB1
and ZEA co-occurrence was confirmed in 3 samples. DON was determined in 24 samples feed samples for finishing
sheep; Eight samples were positives (33.3%) with maximum level of 900 µg/kg. FBs and ZEA were determined in
85 samples piglet feed; ZEA was found in 37 samples (43.5%) and FB1 in 28 samples (32.9%) with maximum
levels 68.6 µg/kg and 3815.5 µg/kg, respectively. The co-occurrence of both mycotoxins was observed in 9 samples
(10.59%). DON, OTA and ZEA were determined 201 feed samples for growing and fattening pigs; ZEA was found
in 63 samples (31.3%) with levels ranging from 5 to 402.0 µg/kg. DON was found in 32 samples (15.9%). OTA had
lower frequency, 10 positive samples (5.0%) and levels from 2 to 130.45 µg/kg. In these samples, co-occurrence of
DON and OTA was verified in 1 sample; DON and ZEA in 9 samples; OTA and ZEA in 6 samples. The cooccurrence of the 3 mycotoxins was not found in any sample. OTA has been search in all feed samples for laying
hens, 6 of which were positive (8.0%); The levels of contamination ranged from 2 to 10.90 µg/kg. All samples from
horse feed were analysed for FBs search; one of them revealed positivity (2.86%) with 76.6 µg of FB1/kg and 138.8
µg of FB2/kg. In crops for feed 41 samples were analyzed, FB1 has been detected in 15 (36.6%); ZEA was found in
9 (22.0%); DON in 7 (17.1%); AFB1 in 6 (14.6%) and OTA was the inferior frequency of contamination - 3
positive samples (7.3%). Results showed low levels of mycotoxins contaminations in feed and feedstuffs,
systematically below the official reference values. However, due to the frequency of positivity‟s remains as a good
practice to accomplish an active vigilance of these mycotoxins in order to provide safety to animals feed and
protection to animal health and welfare.
200
Poster 82
Efeito da raça e da dieta, com diferentes níveis de proteína e lisina, no colesterol total e nas
vitaminas antioxidantes lipossolúveis
Madeira M.S.*, Alfaia C.M., Bessa R.J.B., Prates J.A.M.
CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal. *Email: [email protected]
Em Portugal e na Europa, a carne de porco é das mais consumidas e uma importante fonte de gordura na dieta. O
teor de gordura intramuscular nos suínos pode ser aumentado com a incorporação de dietas de baixo teor de proteína
e lisina durante a fase de acabamento. A hipótese, neste estudo é que dietas com proteína reduzida (com ou sem
correcção de lisina) aumentam o colesterol total e as vitaminas antioxidantes lipossolúveis (tocoferóis e β-caroteno)
presentes no músculo, comparativamente com dietas com teor de proteína normal. Para além disso, também se
pretendeu estudar se o efeito da raça no colesterol total e nas vitaminas lipossolúveis, seria diferente consoante o
nível proteico da dieta (normal versus reduzido). Deste modo, utilizaram-se sessenta suínos machos inteiros (30 da
raça Alentejana e 30 cruzados Large White x Landrace x Peitran), com peso inicial de 60 ± 2 kg, os quais foram
submetidos a uma das três dietas (proteína normal equilibrada com lisina (NP), proteína reduzida corrigida com
lisina (RP) e proteína reduzida não corrigida (RL)). Os animais foram abatidos com 93 ± 2 kg de peso vivo e foram
recolhidas amostras do músculo longissimus dorsi. A gordura intramuscular foi extraída de acordo com o método
Soxhlet com hidrólise ácida prévia. A determinação simultânea de colesterol total e vitaminas lipossolúveis incluiu a
saponificação directa, com uma extracção única de n-hexano e análise por HPLC de fase normal, usando o detector
de fluorescência (tocoferóis) e UV-Vis fotodiodo (colesterol e β-caroteno). Obteve-se uma interacção significativa
(P<0,05) para o teor de gordura intramuscular com valores entre 2,2-5,8 g/100 g, não se tendo observado efeito da
dieta na raça Alentejana, enquanto que nos suínos cruzados a dieta RL aumentou a gordura intramuscular. Foram
também observadas interacções significativas entre a raça e a dieta (P<0,05) para os teores de colesterol total (0,320,36 mg/g) e α-tocoferol (0,94-2,07 µg/g), sem se observar efeito da dieta para a raça Alentejana, enquanto que nos
suínos cruzados a dieta RL reduziu estes teores. Para o γ-tocoferol, a raça Alentejana teve valores mais elevados
relativamente aos suínos cruzados (P<0,01). Como esperado, os níveis de tocoferois no músculo de suíno foram
baixos e não se detectou β-caroteno em nenhuma das amostras analisadas. Este estudo realça os níveis de colesterol
total e vitaminas antioxidantes lipossolúveis no valor nutricional de porcos comerciais e autóctones na fase de
acabamento, alimentados com dietas de teores normais e reduzido de proteína e lisina.
[Effect of breed, dietary protein and lysine levels on total cholesterol and lipid-soluble antioxidant
vitamins]
Pork is the most consumed meat in Portugal and Europe and an important source of dietary fat. Intramuscular fat
(IMF) content can be increased with the incorporation of low protein or low lysine in the diet of finishing pigs. In
this study, it was hypothesised that reduced protein diet (with or without correction for lysine) would increase total
cholesterol and lipid-soluble antioxidant vitamins (tocopherols and β-carotene) in muscle comparing to a normal
protein diet. Moreover, we also intended to study if the effect of breed on total cholesterol and lipid-soluble
antioxidant vitamins would differ according to the level of dietary protein (normal vs. reduced). For this purpose,
sixty intact male pigs (30 Alentejano breed and 30 Large White × Landrace × Pietran crossbred), with an initial
weight of 60±2 kg were submitted to one of the three diets (normal protein equilibrated for lysine (NP), reduced
protein corrected for lysine (RP) and reduced protein not corrected for lysine (RL)). The animals were slaughtered at
live weight of 93±2 kg and samples of longissimus dorsi muscle were collected. Intramuscular fat was extracted
according to the Soxhlet method with previous acid hydrolysis. The simultaneous determination of cholesterol and
lipid-soluble vitamins involved a direct saponification, with a single n-hexane extraction, and the analysis by
normal-phase HPLC, using fluorescence (tocopherols) and UV-Vis photodiode array (cholesterol and β-carotene)
detections in tandem. A significant interaction (P<0.05) was found for IMF content, ranged from 2.2-5.8 g/100 g, in
which no dietary effect was observed for Alentejano breed, whereas in crossbred pigs the RL diet increase the
intramuscular fat. The contents of total cholesterol and α-tocopherol ranged from 0.32-0.36 mg/g and from 0.942.07 µg/g, respectively. Significant interactions (P<0.05) between breed and diet were also observed for total
cholesterol and α-tocopherol, where no dietary effect was observed for Alentejano breed while in crossbred pigs the
RL diet reduced the cholesterol and α-tocopherol contents. For γ-tocopherol, Alentejano breed had higher values
than crossbred (P<0.01). As expected, the levels of tocopherols in pig muscle were low and β-carotene was not
detected in any of the samples analysed. This research highlights the cholesterol and lipid-soluble antioxidant
vitamins levels on the nutritional value of commercial and autochthonous finishing pigs subjected to normal and
reduced protein and lysine diets.
Individual fellowship (SFRH/BD/48240/2008 to MSM) and financial support (grant PTDC/CVT/2008/99210) are acknowledged.
201
Poster 83
Avaliação de métodos moleculares para tipificação de estirpes de Brucella suis
Ferreira, A.C.1,2, Dias, R.2, Chambel, L.2, Tenreiro, R.2 e Corrêa de Sá, M.I.1
2 Centro de Biodiversidade, Genómica Integrativa e Funcional, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, Portugal
A Brucella suis é constituída actualmente por 5 biovares dos quais apenas os biovares 1, 2 e 3 infectam suídeos. O
biovar 4 infecta sobretudo renas e subespécies e o biovar 5 roedores. Os biovares 1 e 3 originam doença grave no
Homem e é endémica na América Central e do Sul e Sudeste Asiático. O biovar 2 existe na Europa e parece não
Zoonótico. O aumento do número de surtos em suínos por toda a Europa e a elevada prevalência de B. suis biovar 2
em javalis (Sus scrofa) e em Lebres (Lepus europaeus) reservatórios naturais deste biovar e fontes de transmissão
aos porcos explorados em regime extensivo e intensivo ao ar livre, sugerem que a brucelose suína poderá vir a ser
um problema emergente em muitos países. Os actuais métodos de diagnóstico laboratorial não são totalmente
satisfatórios e, até à data, nenhum dos testes convencionais tem mostrado ser totalmente seguro no diagnóstico
individual em diferentes aspectos. A identificação dos biovares de B. suis utilizando os métodos bacteriológicos
clássicos é particularmente difícil uma vez que a identificação dos biovares 1 e 2 assenta exclusivamente na
produção de H2S, um teste largamente subjectivo. As estirpes do biovar 1 produzem H 2S e é aceite que as do biovar
2 não produzem. Contudo, muitos dos isolados de biovar 2 também produzem pequenas quantidades de H 2S o que
torna este teste pouco específico para fins diferenciais. Também os biovares 2 e 3 só se distinguem de acordo com a
resistência à fucsina básica, no entanto, algumas estirpes biovar 3 apresentam também sensibilidade a este corante, o
que limita a especificidade deste teste na tipificação de estirpes. Neste trabalho utilizaram-se diferentes métodos
moleculares para avaliar os biovares, definir os diferentes haplótipos e verificar a relação epidemiológica entre
estirpes. Cento e setenta e dois isolados de B. suis (5 biovar 1, 160 biovar 2, 3 biovar 3 and 4 biovar 4) e as estirpes
tipo das 5 biovariedades foram analisadas por PCR Multiplex, PCR-RFLP dos genes omp2a, omp2b and omp31 e
por MLVA-16. O PCR Multiplex permitiu a diferenciação das estirpes ao nível de biovar. No PCR-RFLP os
produtos amplificados foram digeridos com as enzimas, NcoI, StyI, EcoRI, KpnI, AvaII, HaeIII, tendo as estirpes
Ibéricas do biovar 2 apresentado diferentes haplotipos, distinguindo-se das restantes estirpes Europeias. O MLVA16 baseia-se na análise, por PCR, de um conjunto de “Tandem Repeats” o que permite a tipificação dos isolados e a
rastreabilidade de estirpes. Este ensaio mostrou um elevado poder discriminatório na tipificação dos isolados de B.
suis.
[Evaluation of PCR-based assays for molecular typing of Brucella suis isolates ]
Brucella suis is currently divided into five biovars of which only biovars 1, 2 and 3 infect Suidae. Biovar 4 infects
reindeer and caribou and biovar 5 infects rodents. Biovars 1 and 3 cause severe disease in humans and are mainly
prevalent in South America, South and South-East Asia. Biovar 2 prevails in Europe and seems unable to infect
humans. The increasing number of outbreaks in pig farms all over Europe, and the high prevalence of B. suis biovar
2 in wild boars (Sus scrofa) and European hares (Lepus europaeus), which are the natural reservoirs of biovar 2 and
the sources of transmission to pigs reared outdoor, suggest that swine brucellosis is being an emergent problem in
many countries. Actually, the established methods for laboratory diagnosis of porcine brucellosis are unsatisfactory
and to date none of the conventional tests has been shown to be entirely reliable for individual diagnosis in several
aspects. Identification of B. suis biovars using the classical bacteriological methods is particularly difficult since the
distinction of biovars 1 and 2 relies solely on H2S production, a largely subjective test. Biovar 1 strains produce H2S
while it has been accepted that biovar 2 strains do not. However, many B. suis biovar 2 isolates also produce small
amounts of H2S, making this test less reliable. Similarly, biovars 2 and 3 are only distinguished according a
sensitivity test to basic fuchsine, but some strains of B. suis biovar 3 show sensitivity limiting the specificity of this
test for biotyping. To assess the biovar, the different haplotypes and the epidemiological relationship between
strains, molecular methods reported suitable for Brucella typing were applied in this work. One hundred seventy two
B. suis field isolates (5 from biovar 1, 160 from biovar 2, 3 from biovar 3 and 4 from biovar 4) and reference strains
from all biovars were analyzed with a Multiplex PCR, PCR-RFLP of omp2a, omp2b and omp31 genes and MLVA16. The Multiplex PCR permitted the allocation at biovar level. In PCR-RFLP the amplified products were
processed with NcoI, StyI, EcoRI, KpnI, AvaII and HaeIII restriction endonucleases to track nucleotide changes and
define haplotypes. The Iberian strains presented different haplotypes and could be distinguished from other
European strains. The MLVA analysis, a fingerprinting approach based on a PCR method for Variable Number of
Tandem Repeats (VNTR), showed a high discriminatory power for typing purposes.
202
Poster 84
Estudo parasitológico em explorações intensivas de suínos no concelho de Leiria
Carreira, L.1, Sabino Serra, J.2, Madeira de Carvalho, L.M.1
2 Promor, Leiria, Portugal
A carne de porco é uma das carnes mais consumidas do mundo, com evidências de pecuária suína que datam de
5000 a.C.. Na União Europeia produz-se 17,8 milhões de toneladas de carne de porco por ano, detendo o segundo
lugar a nível mundial, depois da China. Os sistemas de gestão agrícola dominantes baseiam-se na produção intensiva
e numa alimentação constituída por rações industriais. A maior produção de suínos em Portugal encontra-se na
região de Lisboa e Vale do Tejo.
A sanidade e a saúde são pilares de sustentação da produção intensiva de suínos, uma vez que tem como objectivo a
diminuição dos riscos e dos custos, e portanto, exige medidas, entre outras, de biossegurança, programas de
vacinação, medicações profilácticas, programas de limpeza e desinfecção. As doenças causadas por endoparasitas e
ectoparasitas merecem grande atenção, pois são responsáveis por grandes perdas anuais em suiniculturas.
Neste trabalho foram estudados suínos criados em regime intensivo em várias explorações do concelho de Leiria,
durante um período de seis meses consecutivos compreendidos entre Setembro de 2010 e Fevereiro de 2011. Os
principais objectivos deste trabalho consistiram no(a): conhecimento da realidade actual das explorações suinícolas
do concelho de Leiria; elaboração de uma lista das parasitoses mais prevalentes no concelho de Leiria através de
exames coprológicos; elaboração de inquéritos epidemiológicos a fim de compreender a realidade das explorações
suinícolas em termos de desparasitação.
O trabalho iniciou-se com uma aprendizagem das técnicas de maneio e com a entrega de um inquérito
epidemiológico com o objectivo de compreender a realidade das explorações suinícolas em termos de
desparasitação. Posteriormente, foram desenvolvidas várias colheitas e processamentos laboratoriais de amostras de
fezes de suínos nas várias fases de produção, mediante o método qualitativo de flutuação (Willis) e quantitativo
(McMaster). Os objectivos do trabalho incluíram a identificação e quantificação das formas parasitárias mais
frequentes nas explorações em estudo.
Os resultados obtidos, tanto no inquérito como no processamento das amostras, durante revelaram que as parasitoses
mais frequentemente encontradas foram as provocadas por Ascaris suum e Oesophagostomum spp.com 13% e 89%
respectivamente.O programa de controlo anti-helmíntico mais utilizado resulta da combinação de uma ivermectina
injectável (Ivomec®) com febendazol (Panacur®) na alimentação (43% das explorações) e este tratamento é
aplicado 2x/ano (67% das explorações). A eficácia desta desparasitação nunca é avaliada a nível laboratorial, mas
apenas de forma visual, observando-se a condição corporal dos animais e a existência ou não de formas parasitárias
nas fezes. Estes resultados demonstram a necessidade da implementação mais frequente de programas de
desparasitação, em simultâneo com um seguimento laboratorial também mais frequente.
[Parasitological research in intensive pig farms in the municipality of Leiria]
Pork meat is one of the most consumed in the world, with evidence of swine farming dating back to 5000 BC. In the
European Union are produced 17,8 million tons of pork per year, holding second place worldwide, after China. The
dominant agricultural management systems are based on intensive system and feeding consisting of industrial ration.
The largest pig production in Portugal is located in Lisbon and Tagus Valley.
The intensive system is based on good breeding, good environment and good management techniques. The sanity
and animal health are pillars of intensive swine production, since that aims the reduction of risks and costs, and
therefore requires biosecurity measures, vaccination programs, prophylactic medications, cleaning and disinfection
programs, among others. The diseases caused by ectoparasites and endoparasites deserve great attention as they are
responsible for large annual losses in pig farms.
This work studied pigs reared in intensive system in several farms in the municipality of Leiria, during a period of 6
consecutive months between September 2010 and February 2011. The main objectives of this work were:
knowledge of the current situation of pig farms in the district of Leiria; development of a list of the most
prevalent parasitic diseases in the district of Leiria through fecal tests; development of epidemiological surveys in
order to understand the reality of pig farms, namely in what concerns deworming practices.
The work began with a learning of the management techniques, and developed various collection techniques and
laboratory processing of fecal samples from pigs in various stages of production, by the flotation (Willis) method
and quantitative (McMaster) method. The objectives of the work included the identification and the quantification of
parasites more common on the studied farms.
The results obtained during these 6 months revealed that the most prevalent parasitic diseases that were often found
included the ones by Ascaris suum and Oesophagostomum spp., with 13% and 89%, respectively. The most used
anthelmintic program, included a combination of injectable ivermectin (Ivomec®) and febendazol (Panacur ®) in
the diet (43% of farms) and this treatment was applied 2x/year (67% of farms). The effectiveness of deworming was
never evaluated at laboratory level, but only visually, by observing the animal‟s body condition and whether or
not worms were present in the fecal samples. These results demonstrate the need to implement more frequent
deworming programs, along with a follow-up laboratory also more frequent.
203
Poster 85
Migração de macrófagos perivasculares autofluorescentes no decurso de processos de retinopatia
Mendes-Jorge, L.1,2, Ramos, D.1,2,3, López-Luppo, M.1,2,3, Nacher, V.1,2,3, Navarro, M.1,2,3, Carretero, A.1,2,3,
Rodriguez-Baeza, A.4, Esperança-Pina, J.A.5 e Ruberte, J.1,2,3
1 CBATEG, Universidade Autónoma de Barcelona, E-08193-Bellaterra, Espanha.
2 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal.
3 Departamento de Saúde Animal e Anatomia, Faculdade de Veterinária, Universidade Autónoma de Barcelona, E-08193-Bellaterra, Espanha.
4 Faculdade Medicina, Universidade Autónoma de Barcelona, E-08193-Bellaterra, Espanha.
5 Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa, Portugal.
Objectivos: Os macrófagos perivasculares autofluorescentes (MAP) da retina, células Mato retinianas, constituem
uma pequena população de macrófagos residentes, distintos das células da microglia, que expressam
constitutivamente receptores scavenger da classe A. O objectivo deste trabalho consistiu em determinar o
envolvimento dos MAPs no decurso de processos de retinopatia.
Material e métodos: Neste estudo foram utilizadas retinas humanas e de murganhos ICR. Foi realizada a injecção
endovenosa de peroxidase de rábano (HRP) tipo II, 15 mg/mL em solução salina fisiológica (SSF) num grupo de
murganhos. Seis horas após, os murganhos foram eutanasiados e as retinas obtidas. Num outro grupo de murganhos,
foi realizada a injecção de 0,5% bisbenzimida, 250 μL, seguida da injecção de HRP tipo II, 15 mg/mL em SSF. Uma
hora após, os murganhos foram eutanasiados e as retinas obtidas. A HRP foi revelada com 3‟3‟-diaminobenzidina.
Foram utilizados murganhos de um modelo de rotura de barreira hemato-retiniana (BHR) e de um modelo de
degenerescência de fotorreceptores, obtidos pela injecção de 250 μL de manitol a 25% em SSF e pela injecção
de100 mg/kg de iodato de sódio (NaIO3), respectivamente. As retinas fixadas em formaldeído foram estudadas por
meio de técnicas imunohistoquímicas. As imagens foram obtidas com um microscópio de epifluorescência com
câmara fotográfica e com um microscópio confocal.
Resultados: Não foi observada saída de HRP ou de bisbenzimida dos vasos sanguíneos após a respectiva injecção.
Contrariamente, seis horas após a injecção endovenosa de HRP, os MAPs apresentaram inclusões acastanhadas de
HRP no seu citoplasma. Como esperado, os MAPs carregados de HRP não apresentaram coloração nuclear de
bisbenzimida. Nas retinas com rotura da BHR, foi observada a saída de HRP para o parênquima retiniano e, nessas
áreas, os núcleos das células estavam marcados pela bisbenzimida, associada a migração de células
autofluorescentes para essas áreas. Algumas destas não estavam marcadas pela bisbenzimida e apresentavam
múltiplas inclusões de HRP no seu citoplasma, sugerindo que MAPs tinham migrado para o local das lesões. Na
retinopatia experimental e humana, foram detectados MAPs na camada nuclear externa, confirmando que estes
tinham migrado da sua localização perivascular. No conjunto, estes resultados sugerem que os MAPs estão
envolvidos na manutenção e funcionamento da BHR. Para além disso, a sua migração para o local das lesões, na
rotura da BHR e na retinopatia experimental e humana, sugere um papel importante destas células nos processos de
retinopatia.
[Migration of retinal autofluorescent perivascular macrophages during retinopathy]
Objectives: Retinal autofluorescent perivascular macrophages (APM), the retinal Mato cells, are a small population
of resident macrophages different from microglia that constitutively expressed the scavenger receptor class A. The
aim of this work was to better understand the role of APM during experimental and human retinopathy.
Material and methods: Human and ICR mice retinas were used. Intravenous injection experiments were performed
with horseradish peroxidase (HRP) type II, 15 mg/mL in physiological saline solution (PSS). Six hours after HRP
injection, mice were euthanized and the retinas were obtained and fixed in formalin. HRP was revealed with 3‟3‟diaminobenzidine. A combination of 0.5% Bis-benzimide, 250 μL, and HRP type II, 15 mg/mL, in PSS injection
was made. Ten minutes after the tail injection of Bis-benzimide, HRP injection was performed. One hour after mice
were euthanized and retinas obtained. Two murine models of blood-retinal barrier breakdown and photoreceptor
degeneration were used. The blood-retinal barrier (BRB) was disrupted by the injection of 250 μL of a 25% solution
of mannitol dissolved in PSS. The photoreceptor degeneration was induced by the intraperitoneal injection of 100
mg/kg of sodium iodate (NaIO3). Retinas were analysed by means of immunohistochemistry. Images were acquired
with an epifluorescence microscope with a digital camera and with a laser confocal microscope.
Results: No HRP or Bis-benzimide leakage from blood vessels was found in healthy retinas. However, 6 hours after
intravenous injection of HRP, APMs presented multiple HRP brownish inclusions in their cytoplasm. No Bisbenzimide nuclear staining of HRP loaded APMs was observed. In mannitol-induced BRB breakdown, as expected,
HRP was seen to leak from the blood vessels to the retinal parenchyma and cellular nuclei in the leakage area were
marked with Bis-benzimide. Autofluorescent cells migrate to the leakage area. Some of them were not marked by
Bis-benzimide, and presented multiple HRP brownish inclusions in their cytoplasm, suggesting AMPs migrated to
the lesion site. During retinopathy, AMPs were detected within the outer nuclear layer, confirming they migrated
from their perivascular localization. All together, these results suggest that APMs may contribute to the BRB
function, scavenging and accumulating blood-borne proteins. Furthermore, their migration to the lesion site in BRB
breakdown and in experimental and human retinopathy may suggest a key role during retinopathy.
204
Poster 86
Propriedades imunomoduladoras de formulações recombinantes derivadas da parede celular
bacteriana baseadas em OprI
Basto, A.P.1, Almeida, S.C.1, Cartaxeiro, C.1, Badenes, M.2,3, Silva, L.2,3, Duarte, A.2,3, Martins, C.1, Leitão, A.4
1 Laboratório de Doenças Infecciosas, CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
3 Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras, Portugal
A modulação de imunidade específica por conjugação de antigénios com ligandos de receptores de reconhecimento
de padrão (PRR) tem emergido nos últimos anos como uma das estratégias mais promissoras para o
desenvolvimento de vacinas subunitárias. Recentemente, desenvolvemos um novo sistema de clonagem em
Escherichia coli para expressão de antigénios em fusão com a lipoproteína OprI, um ligando TLR da membrana
externa de Pseudomonas aeruginosa. Confirmou-se o processamento, a translocação para a membrana externa e a
triacilação da lipoproteína e desenvolveram-se protocolos para a produção de outras formulações recombinantes
derivadas da parede bacteriana (fragmentos e vesículas de membrana externa) com potencial distinto para activação
PRR. Neste trabalho é reportada a caracterização preliminar das propriedades imunomoduladoras daquelas
formulações em modelo murino. Para esse estudo, clonou-se o antigénio modelo ovalbumina num dos vectores do
sistema e obtiveram-se as três formulações recombinantes de acordo com os protocolos previamente estabelecidos.
Após imunização e reforço vacinal, avaliou-se a magnitude e o perfil da resposta humoral e o desencadeamento de
respostas por linfócitos T CD8+ específicos. Avaliou-se ainda o perfil de citocinas e quimiocinas induzidas em
células dendríticas estimuladas in vitro utilizando as três formulações base. Os resultados observados demonstram
capacidade adjuvante das três formulações e validam o sistema para a obtenção de formulações imunogénicas com
aplicação no desenvolvimento de vacinas subunitárias experimentais e em estudos de modulação de resposta
adaptativa.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, projecto POCI/CVT/59122/2004 e bolsa de doutoramento (Afonso Basto)
SFRH/BD/23486/2005. Comissão Europeia, Sétimo Programa-Quadro, no âmbito do projecto KBBE-2007-1-05, #211691 (ASFRISK).
[Immunomodulatory properties of recombinant bacterial cell wall-derived formulations based on
OprI]
The modulation of specific immunity through the conjugation of antigens with ligands of pattern recognition
receptors (PRR) has emerged in the last years as one of the most promising strategies for the development of subunit
vaccines. Recently, we developed a new Escherichia coli cloning system for the expression of antigens in fusion
with the OprI lipoprotein, a TLR ligand from the Pseudomonas aeruginosa outer membrane. Lipoprotein
processing, translocation to the outer membrane and triacylation were confirmed and protocols for the productions
of other recombinant bacterial cell wall-derived formulations (outer membrane fragments and vesicles) with distinct
potential for PRR activation were developed. Here, we report a preliminary characterization of the
immunomodulatory properties of those formulations in a murine model. For that purpose, the model antigen
ovalbumin was cloned into a vector of the new system and the three recombinant formulations were obtained
following the protocols previously established. After a prime-boost immunization scheme, we evaluated the
magnitude and profile of humoral immune response and the induction of specific CD8+ T cells responses. The
cytokine and chemokine profile induced in dendritic cells stimulated in vitro was also addressed using the three
formulations without ovalbumin. The results observed demonstrate the adjuvant capacity of the three formulations
and validate the system for the production of immunogenic formulations suitable for the development of
experimental subunit vaccines and for studies on the modulation of adaptive immunity.
205
Poster 87
Padrão de expressão da via Notch no tracto reprodutor masculino do murganho
Murta, D.1, Batista, M.1, Silva, E.1, Trindade, A.1,2, Henrique, D.3, Duarte, A.1,2 e Lopes da Costa, L.1
2 Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras, Portugal
3 Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Portugal
O tracto reprodutor masculino mantém uma constante proliferação e diferenciação celular. Dois dos principais
eventos celulares que ocorrem a este nível consistem no desenvolvimento dos gâmetas masculinos, no testículo, e na
sua maturação, no epidídimo. Os factores moleculares que intervêm nestes acontecimentos celulares permanecem
pouco esclarecidos. A via de sinalização Notch é fundamental em diversos fenómenos fisiológicos, desde o
desenvolvimento embrionário a decisões de destino celular no adulto. Esta via é composta por 4 receptores
(Notch1,2,3,4) e 5 ligandos (Jagged1 e 2, e Delta1, 3 e 4). Neste trabalho analisamos a expressão do receptor Notch1
e dos ligandos Jagged1 (Jag1) e Delta4 (Dll4) no tracto reprodutivo masculino (testículo, epidídimo e canal
deferente). Foram utilizados 4 murganhos machos, CD1 estirpe selvagem, com 10 semanas de idade, aos quais foi
recolhido o tracto reprodutivo para processamento por imunohistoquímica.
Nos tubos seminíferos toda a linha germinativa, desde as espermatogónias às espermátides, apresenta forte marcação
pelo anticorpo anti-Dll4. Em contraste, a marcação por anti-Jag1 é apenas evidente na fase final de diferenciação
(espermátides) e não é encontrada a expressão de Notch1. As células intersticiais do testículo são fortemente
marcadas por anti-Jag1 e apenas pontualmente por anti-Dll4 e anti-Notch1. No entanto, a expressão intersticial de
Dll4 e Notch1 é sempre associada a divisões celulares nas espermatogónias dos túbulos seminíferos adjacentes.
Estas espermatogónias em divisão não são marcadas por anti-Dll4. No epidídimo a expressão da via Notch é
alternante. O sinal anti-Dll4 é forte nas células epiteliais do início da cabeça do epidídimo, diminuindo e
desaparecendo no final da cabeça do epidídimo e voltando a ser encontrado no início do ducto deferente. A
marcação por anti-Jag1 e anti-Notch1 mantém-se fraca a ausente. O sinal anti-Dll4 e anti-Jag1 está presente nos
espermatozóides. No caso destas células, o sinal de Dll4 surge de forma crescente ao longo da cabeça do epidídimo,
forte no corpo, decrescente na cauda e fraco no ducto deferente. O sinal anti-Jag1 é encontrado de forma crescente
desde o final da cabeça do epidídimo até ao ducto deferente.
Estes resultados evidenciam um possível papel da via Notch nos eventos reprodutivos no macho. A expressão destes
genes nas células da linha germinativa sugere um papel na diferenciação dos espermatozóides, enquanto a sua
expressão no epidídimo aponta para um envolvimento na maturação espermática. De futuro pretendemos criar linhas
de murganhos com perda de função destes genes para avaliar o seu fenótipo reprodutivo.
Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projecto PTDC/CVT/105022/2008, financiado pela FCT. Daniel Murta é bolseiro de doutoramento
(SFRH/BD/64416/2009) da FCT e Marta Batista é bolseira de investigação associada ao referido projecto.
[Notch pathway expression in the male mouse reproductive tract]
The male reproductive tract is continuously undergoing cellular proliferation and differentiation. Two of the key
cellular events that take place in this system are the production of sperm cells in the testis and, their maturation in
the epididymis. The molecular factors that drive these events are still poorly understood.
The Notch signaling pathway is a central regulator in several physiological phenomena, from embryo development
to cellular differentiation in the adult. This pathway comprises four receptors (Notch1,2,3,4) and five ligands
(Jagged1, 2, Delta-like 1, 3, 4). In this study we analyzed the expression profiles of Notch1, Jagged1 (Jag1) and
Delta-like 4 (Dll4) through immunohistochemistry, in order to determine their presence in the male reproductive
tract. Four CD1 wild type male mice were humanely sacrificed at ten weeks of age, and their reproductive tracts
were collected and processed for immunostaining.
In the seminiferous tubules all germline cells (spermatogonia to spermatids) were stained by anti-Dll4 antibody,
showing the cellular presence of the protein. In contrast, Jag1 was only found in the final stage of sperm
differentiation (spermatids) and Notch1 was not expressed. The testis interstitial cells were strongly stained by antiJag1 and only in some cells by anti-Dll4 and anti-Notch1. However, expression of Dll4 and Notch1 was always
associated with cellular divisions in the adjacent spermatogonial cells. These dividing spermatogonial cells are not
stained by anti-Dll4. Expression of Notch pathway genes was not continuous along the epididymis. The anti-Dll4
staining was strong in the epithelial cells of the beginning of the head, but diminished until disappeared before the
end of the head and then slowly reappeared at the beginning of the deferens duct. Epydidimal expression of Jag1 and
Notch1 was weak to absent.
The spermatozoa stained positive for Dll4 and Jag1. In sperm cells, Dll4 expression increased through the head of
the epididymis and remained strong in the body, started to decrease in the tail region and was weak in the deferens
duct. Jag1 expression appeared in the end of the head and increased throughout the epididymis.
These results propose a role for Notch signaling in the male reproductive events. The expression of these genes in
the male germline indicates a possible function in sperm differentiation, while expression in the epididymis point
out to a involvement in sperm maturation.
In the future we intend to create new mice lines with loss-of-function for these ligands in the male reproductive tract
to get an insight into the physiological function (phenotype) of these genes.
206
Poster 88
Clonagem do promotor do gene da mucina MUC1 de bovino
Garcia, V.1, Marques, M.R.1, Oliveira Sousa, M.C.1, Carolino, I.1, Santos Silva, M.F.1, Pereira, R.M.1, Gama, L.T.1,
Almeida, R.2, Santos Silva, F.2, David, L.2, Mesquita, P.1
2 IPATIMUP, Porto, Portugal
A mucina MUC1 desempenha um papel importante na protecção do endométrio face às infecções microbianas, mas
deve desaparecer para permitir a implantação do embrião. Nalgumas espécies, este processo é facilitado pelo facto
da diminuição da MUC1 por acção da progesterona, coincidir com a implantação. Noutras espécies, pelo menos na
mulher e na coelha, a MUC1 aumenta na fase receptiva, sendo regulada negativamente ou clivada, aparentemente
como resultado da interacção directa com o embrião. O mecanismo subjacente a este tipo de regulação permanece
desconhecido, principalmente no que diz respeito ao efeito do embrião. O nosso objectivo principal é o estudo da
regulação transcricional do gene MUC1 em células epiteliais de endométrio bovino, investigando em particular a
influência de tratamentos com progesterona e estrogénio e/ou co-cultura com embriões bovinos em diferentes fases
de desenvolvimento. Para tal, teremos que previamente isolar a região promotora do gene MUC1de bovino, o que
constitui o objectivo específico deste trabalho. Assim, amplificámos por PCR (“Polymerase chain reaction”) 1722
pb da região flanqueadora a 5‟ do gene MUC1 de bovino, usando DNA genómico extraído de sangue de bovino e
oligonucleótidos sintetizados com base numa sequência publicada e contendo locais de restrição específicos nas
extremidades. A localização de locais de ligação para factores de transcrição no promotor do MUC1 foi tida em
conta para gerar produtos com diferentes tamanhos. Todos os produtos de PCR foram digeridos, purificados e
clonados no vector pGL3b (Promega), o qual não contém região promotora. Estando agora na posse das ferramentas
necessárias ao estudo do promotor do MUC1 bovino, esperamos identificar regiões regulatórias que respondam às
hormonas maternas e/ou à presença do embrião, o que permitirá reconhecer factores de transcrição envolvidos na
regulação do gene MUC1 no endométrio de bovino. O conhecimento de como o MUC1 é regulado no epitélio
uterino pode beneficiar protocolos de transferência de embriões, permitindo diminuir a expressão da MUC1 e
aumentar a disponibilidade das células da superfície do útero para o embrião, melhorando taxas de gestação e
eficiência reprodutiva, em animais domésticos e no Homem.
[Cloning of the bovine MUC1 mucin gene promoter]
MUC1 protein plays a role in protecting the endometrium from microbial attack, but must be lost in order for
embryo implantation to occur. This is facilitated in some species by progesterone down-regulation of endometrial
MUC1 to coincide with the implantation phase of the reproductive cycle. In others, at least human and rabbit,
characterized by increased MUC1 expression in the receptive phase, MUC1 is down-regulated/cleavaged locally,
apparently as a result of a direct interaction with the embryo. The mechanism of this type of regulation remains to be
established, mainly in what concerns embryonic effect. Our main goal is therefore to study the unknown
transcriptional regulation of MUC1 in bovine endometrium epithelial cells, specifically investigating how is it
influenced by treatments with progesterone and oestrogen and/or co-culture with differentially-staged embryos. In
order to accomplish this, we have to first isolate the promoter region of the bovine MUC1 and this constitutes the
specific aim of this work. Thus, we have amplified 1722 bp of the 5‟-flanking region of the bovine MUC1 gene by
polymerase chain reaction (PCR), using genomic DNA extracted from bovine blood and primers bearing specific
restriction sites at their ends, designed based on a published sequence. The location of putative transcription factor
binding sites on MUC1 promoter has been taken in account to generate MUC1 promoter internal deletion mutants
with different sizes. All PCR products were digested, gel-purified, and cloned into the promoterless pGL3-basic
vector (Promega). Having now the tools to study bovine MUC1 promoter, we expect to identify regulatory regions
that respond to either maternal hormones or the presence of the embryo, which subsequently will allow the
recognition of transcription factors involved in MUC1 regulation in bovine uterus. Knowledge of how MUC1
expression can be regulated in uterine epithelium may aid in vitro fertilization protocols by decreasing MUC1 and
increasing the availability of the uterine cell surface to the embryo, thereby improving pregnancy rates and
reproductive efficiency, in domestic animals as well as in humans.
207
Poster 89
Variação cíclica da immuno-expressão de MUC1 e Osteopontina no endométrio de cadela
Santana, I.1, Pires, M.A., Ström-Holst, B.2, Payan-Carreira, R.1
2 Dept. of Clinical Sciences, Swedish University of Agricultural Sciences (SLU), Sweden
A MUC1 é uma proteina transmembranar localizada na superfície apical de epitélios polarizados. No útero a MUC1
actua como barreira contra patogénicos e confere propriedades não-adesivas ao epitélio de superfície (SE); em
simultâneo, deve permitir a interacção embrio-materna na implantação. A Osteopontina (OTP), uma glicoproteina
da matriz extra-celular, é também expressa no epitélio uterino, modulando a adesão celular e a migração; foi ainda
detectada no fluído uterino próximo da janela de implantação. Crê-se que a OTP participe nas interações embriomaternas. É possível que a MUC1 encontrada na superfície do endométrio prejudique a interacção de moléculas de
adesão como a OTP e o trofoblasto, no momento da implantação. Neste trabalho propomo-nos avaliar a expressão
temporal e especial de MUC1 e OTP no endométrio de cadela utilizando uma técnica de imunohistoquímica. Para
isso utilizaram-se 45 amostras de útero fixadas em formalina (9 por cada fase: anestro, proestro, estro, diestro inicial
e diestro), e anticorpos policlonais (MUC1= MH1-CT2, AbCam, 1:200; OTP=AB1870, Chemicon, 1:750). Para
avaliar a marcação usou-s uma escala de intensidade (fraca, moderada ou forte) para cada uma das estruturas
epiteliais (SE, epitélio glandular superficial –SGE, e profundo- DGE). Observou-se reactividade endometrial contra
a MUC1 e OTP em todas as fases do ciclo; não se encontraram diferenças de marcação nos dois tipos de epitélio
glandular para a MUC1. Globalmente, encontraram-se intensidades superiores de marcação no SE do que nos outros
tipo epiteliais para a MUC1, e tanto no SE como no SGE em relação ao DGE, no caso da OTP. O MUC1 mostrou
maior intensidade de marcação no anestro, proestro e estro, do que nas fases de diestro, sem que se encontrassem
diferenças entre o diestro inicial e o diestro. Para a OTP, encontraram-se maiores intensidades de marcação no SE e
SGE no diestro inicial do que nas restantes fases do ciclo. Este trabalho evidenciou a existência de variações cíclicas
de MUC1 e OTP no endométrio da cadela, similares aos descritos noutras espécies, tendo-se em consideração as
características particulares do ciclo éstrico de cada uma delas. Foi ainda demonstrado que, na fase de diestro inicial,
na qual ocorre a implantação na cadela, se verifica uma redução na quantidade de MUC1 presente à superfície do
endométrio, que favorece a exposição de moléculas de adesão como a OTP, cuja expressão se encontra aumentada
também nesta fase. Esta relação favorece a interacção embrio-materna na implantação.
Inês Santana foi financiada por uma Bolsa de Integração na Investigação da FCT (BII/UNI/0772/AGR/2009)
Rita Payan Carreira foi financiada por uma Bolsa de Licença Sabática, da FCT (SFRH/BSAB/938/2009)
[Cyclic changes in MUC1 and Osteopontin immunoexpression in the canine endometrium]
MUC1 is a transmembrane protein localized at the apical surface of polarized epithelial cells. In the uterus, MUC1
acts as a barrier against pathogen threats and confers nonadhesive properties to the surface epithelium (SE), whilst it
should allow embryo invasion at implantation. Osteopontin (OTP), an extracellular matrix glycoprotein, is expressed
in the endometrial epithelia, where it promotes cell adhesion and migration. It was also found in uterine fluids
around the window of implantation. It has been suggested that OTP may participate in embryo-maternal
interactions. At the endometrial surface, MUC1 may impair interactions between adhesive glycoproteins (like OTP)
and trophoblast. In this work we aimed to study the temporal and spatial expression of MUC1 and OTP proteins in
the bitch endometrium by an immunohistochemistry approach. 45 samples of canine endometrium from formalin
fixed specimens were used (9 samples each for anoestrus, proestrus, estrus, early diestrus and diestrus). Polyclonal
primary antibodies (MUC1- MH1-CT2, AbCam, 1:200; OTP=AB1870, Chemicon, 1:750). Scoring intensity (weak,
moderate or strong) was obtained for each epithelial type (SE, superficial glandular epithelium –SGE, and deep
glandular epithelium- DGE). Reactivity against MUC-1 and OTP was present at all stages of the canine estrous
cycle. MUC1 scores showed no differences between SGE and DGE. Regardless of the stage of the cycle, stronger
MUC-1 positivity was found in SE when compared to the other epithelia. In contrast, lower OTP scores were found
in SE and SGE than in DGE. Highest intensities of immunostaining against MUC1 were recorded during anestrus,
proestrus and estrus, in particular in SE, whilst the lowest intensities were found in both diestrus stages, with no
differences between early and late diestrus. Immunoreactivity against OTP was higher in early diestrus stage in both
the SE and SGE than in diestrus and oestrogen related stages. This study demonstrated the existence of cyclic
changes in MUC-1 and OTP immunoexpression in the canine uterus, similar to those already reported for other
mammalian species, taken in consideration the peculiarities of the oestrous cycles. Furthermore, it clearly showed
that in early dioestus, the peri-implantation stage in the dog, a decrease in MUC1 will favour exposition of other
molecules like OTP, which also showed an increase in expression in this particular stage. These related changes
favour the embryo-maternal interactions at implantation.
208
Poster 90
Modulação de mecanismos envolvidos na resposta inflamatória e imuno-celular do Suíno, por
macrófagos infectados pelo vírus da peste suína africana Lisboa 60 (VPSA/L60)
Gil, S., Cartaxeiro, C., Martins, C.
CIISA, Laboratório de Doenças Infecciosas, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
O vírus da peste suína Africana (VPSA), membro único da família Asfarviridae, é um agente causal de doença nos
suínos domésticos que pode evoluir sob formas clínicas fatais agudas e subagudas, formas crónicas e assintomáticas.
O papel preponderante de mecanismos celulares e de mecanismos mediados por células na protecção do Suíno
contra a infecção é fortemente sugerido pelo facto dos suínos sobreviventes à doença ou à inoculação com vírus
atenuados resistirem a contraprova com isolados virulentos homólogos, na ausência de anticorpos neutralizantes.
Independentemente da sua virulência, todos os isolados de VPSA multiplicam-se preferencialmente nos macrófagos
do Suíno que como em outras espécies, desempenham um papel primordial no desencadeamento de respostas
protectoras contra infecção, pelo que a interacção entre o VPSA e estas células pode determinar consequências
importantes na patogenia da infecção e no desencadeamento de respostas imunitárias do hospedeiro. Na sequência
de estudos realizados anteriormente e, com o objectivo de aprofundar conhecimentos sobre os mecanismos
imunomoduladores envolvidos na infecção por VPSA, quantificámos pela técnica de PCR em tempo real (qRTPCR) a expressão de mRNA de citocinas relevantes (IFN, IFNβ, TNF, IL12p40, TGFβ), de quimiocinas
(RANTES, MCP1, MIP1α), de factores relacionados com a expressão de IFN (IRF3, IRF7, IRF9), de transdutores
de sinal (STAT1, STAT2) e de cinases (Tyk2 and Jak1), em macrófagos a diferentes tempos de infecção com o
isolado virulento VPSA Lisboa 60 (VPSA/L60). Os resultados expressos como o ratio entre valores obtidos em
macrófagos infectados e macrófagos não infectados (controlo) sugerem um aumento da expressão de mRNA de
IFNβ (2 horas após infecção), de TNFα, das quimiocinas analisadas e de Tyk2 (entre as 4 e as 6 horas após
infecção), de IFNα e dos transdutores de sinal referidos (às 6 horas após infecção). De forma oposta, verificou-se
que a expressão de IL12p40 potencialmente envolvida no desencadeamento de respostas celulares de protecção
apresenta-se reduzida durante a infecção pelo VPSA/60. No seu conjunto, os resultados obtidos reforçam a utilidade
do modelo de estudo em culturas de macrófagos de Suíno, para a caracterização de modulação de mecanismos
inflamatórios e imunitários suscitados pelo VPSA e potencialmente relacionados com a sua virulência.
Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto ASFRISK (KBBE-2007-1-3-05, Grant Agreement nº 211691) e do projecto
FCT/PTDC/CVT/105630/2008. Solange Gil é Investigadora Auxiliar no âmbito do Programa Ciência 2007.
[Modulation of porcine macrophage mechanisms involved in inflammatory and cellular immunemediated responses by African swine fever virus Lisbon 60 (ASFV/L60)]
African swine fever virus (ASFV) the only member of the Asfarviridae family induces from fatal hyperacute, acute
and sub-acute to chronic or unapparent forms of disease. A relevant role for cellular and cellular based immune
mechanisms in protection against ASFV is strongly supported because pigs survive infection or challenge
inoculation with different viral isolates in the absence of virus neutralizing antibodies. Independently of their
virulence, all ASFV isolates replicate in porcine macrophages that as in other animal species play an essential role in
the development of protective animal responses against infection. Therefore it is expected that interactions between
ASFV and macrophages determine relevant consequences on the viral pathogenesis and in the host immune
responses. In this work we have extended previous studies towards a better understanding on the imunomodulatory
mechanisms on ASF infection through the quantification by Real Time PCR (qRT-PCR) of mRNA quantification of
relevant cytokines (IFN, IFNβ, TNF, IL12p40, TGFβ), chemokines (RANTES, MCP1, MIP1α), IFN relating
factors (IRF3, IRF7, IRF9), signal transducers (STAT1, STAT2) and kinases (Tyk2 and Jak1) in macrophages
infected with the highly virulent ASFV/L60. Results obtained as the ratio between levels of mRNA expression
between L60 infected and control (non-infected) macrophages reveal an increase of the mRNA expression levels of
IFNβ (2 hours after infection), TNFα, chemokines and Tyk2 (from 4 to 6 hours after infection), IFNα and signal
transducers (STAT1 and STAT2) (6 hours after infection). In opposition, mRNA expression levels of IL12p40,
potentially involved in the induction of cellular immune responses seem to be reduced in L60 in vitro infection. Our
results reinforce the use of porcine macrophage cultures to characterize modulation of inflammatory and protective
mechanisms triggered by ASFV, potentially related to their virulence.
.
209
Poster 91
Clonagem, expressão e análise filogenética da topoisomerase de tipo II do Virus da Peste Suína
Africana
Coelho, J.1; Almeida, S.1; Martins, C.1; Ferreira, F.2; Leitão, A.3
1 CIISA, Laboratório de Doenças Infecciosas e Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
As topoisomerases de tipo II são enzimas que resolvem problemas topológicos no DNA, ao transportarem uma
dupla-hélice do DNA através de uma quebra de dupla-cadeia que elas criam temporariamente. Este mecanismo
permite que estas enzimas relaxem, enrolem-desenrolem e atem-desatem moléculas de DNA, tornando-as assim
essenciais na replicação do DNA. Uma putativa topoisomerase de tipo II (ASFV-TopoII) é codificada pela ORF
P1192R no genoma do Vírus da Peste Suína Africana (VPSA), facto único em vírus que infectam células de
mamífero. O nosso objectivo foi o de confirmar a expressão da ASFV-TopoII durante a infecção em células Vero,
utilizando o isolado VPSA Ba71V, adaptado a células Vero. Para isto, clonámos a ORF P1192R no vector de
expressão bacteriana pET24a, expressámos a ASFV-TopoII em células Rosetta e imunizámos ratinhos com a
proteína recombinante purificada de forma a produzir um soro anti-ASFV-TopoII. Posteriormente, utilizando
imunofluorescência indirecta, confirmámos a expressão da ASFV-TopoII e observámos que esta se co-localiza com
as fábricas virais. Utilizando a sequência aminoacídica deduzida da ORF P1192R, e sequência de outras
topoisomerases de tipo II já descritas, quer virais quer celulares, efectuámos análises filogenéticas pelo método da
verosimilhança máxima. Observámos que a ASFV-TopoII é distinta de topoisomerases de tipo II eucariotas,
procariotas e de outros vírus, embora motivos e domínios essenciais à sua actividade enzimática sejam altamente
conservados entre as sequências comparadas. Esta singularidade da ASFV-TopoII estende-se a outros componentes
das maquinarias de replicação e de transcrição, nomeadamente as polimerases de DNA e RNA, a ligase de DNA,
helicase e a cinase de timidina, sugerindo uma origem distinta do VPSA.
Financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, através do projecto PTTC/CVT/105630/2008 e da bolsa de Doutoramento
SFRH/BD/48654/2008.
[Cloning, expression and phylogenetic analysis of ASFV’s type II topoisomerase]
Type II topoisomerases are enzymes that resolve topological problems in DNA, by transporting one DNA doublehelix backbone through a double-stranded break that they transiently create. This mechanism allows these enzymes
to relax, catenate-decatenate and knot-unknot DNA molecules, making them essential in DNA replication. A
putative type II topoisomerase (ASFV-TopoII) is encoded by ORF P1192R in the genome of African Swine Fever
Virus (ASFV), which is unique among known mammalian cell-infecting virus. We sought out to confirm the
expression of ASFV-TopoII during infection in Vero cells, using the Vero-adapted ASFV isolate Ba71V. For this,
we cloned P1192R in the bacterial expression vector pET24a, expressed ASFV-TopoII in Rosetta cells and
immunized mice with the purified recombinant protein in order to produce an anti-ASFV-TopoII serum. Then, using
indirect immunofluorescence we confirmed that ASFV-TopoII is expressed and co-localizes with viral factories.
Using the aminoacid sequence deduced from ORF P1192R and sequences from other known type II topoisomerases,
either viral or cellular, we performed a maximum likelihood phylogenetic analysis. We observed that ASFV-TopoII
is distinct from eukaryotic, prokaryotic and other viral type II topoisomerases but, nevertheless, motifs and domains
essential for its enzymatic activity are highly conserved across the compared sequences. This uniqueness of ASFVTopoII extends to other components of the replication and transcriptional machinery, like DNA and RNA
polymerases, DNA ligase, helicase and thymidine kinase, hinting for a distinct origin of ASFV.
210
Poster 92
Um novo alvo molecular para controlo da infecção pelo vírus da Peste Suína Africana – estudos in
vitro
Mottola, C.1, Simões, M.1, Martins, C.1, Leitão, A.2, Ferreira, F.3
1 CIISA, Laboratório de Doenças Infecciosas, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Introdução: A Peste Suína Africana (PSA) é uma das doenças mais temidas pelo sector da suinicultura, contra a qual
não existe qualquer vacina ou tratamento. O vírus da PSA (VPSA) é o único vírus conhecido que infecta células de
mamífero e que codifica para uma topoisomerase de tipo II (gene P1192R), cuja função é, ainda, desconhecida. A
elevada homologia que se verifica entre a topoisomerase II do VPSA e, a topoisomerase IV e a girase A das
bactérias, promoveu o desenvolvimento de estudos em que antibióticos que bloqueiam a replicação do ADN
bacteriano (por inibirem estas proteínas) são usados para inibir a replicação do VPSA devido à inibição da
topoisomerase viral.
Materiais e metodos: Testamos o efeito inibitório de 30 quinolonas na replicação do VPSA, em células Vero e em
macrófagos infectados com as estirpes VPSA/Ba71V e VPSA/L60 respectivamente. O efeito inibitório destes
fármacos foi confirmado por PCR (gene viral A238L) após 10 dias de tratamento. A electroforese em gel de campo
pulsado foi realizada para verificar se ocorre uma fragmentação do ADN viral e justificar uma possível acção
„viricida‟ das quinolonas. A citotoxicidade do tratamento foi analisado através dos ensaios de viabilidade celular
(ensaios MTT e TUNEL) e por Western Blot (fracções clivadas de três Caspases e PARP-1).
Resultados: Os resultados revelaram que várias combinações de fluoroquinolonas inibem por completo o curso da
infecção pelo VPSA, numa relação dose-dependente. Doses efectivas menores foram determinadas em culturas de
macrófagos de Suíno. Efeitos inibitórios adicionais foram observados quando as drogas foram administradas antes
da infecção, sugerindo que as quinolonas possam ter um potencial profilático.
Conclusão: Os resultados obtidos após o tratamento profilático e após infecção são muito promissores e abrem
novas perspectivas para a possível utilizaçao das quinolonas nos novos focos emergentes da doença, podendo vir a
participar como medidas complementares para o controle da Peste Suína Africana.
Este trabalho foi suportado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (Projecto PTDC/CVT/105630/2008 e pelas bolsas de doutoramento
SFRH/BD/72872/2010 e SFRH/BD/65532/2009).
[A new molecular target to control African Swine Fever Virus’s infection - in vitro studies]
Introduction: African Swine Fever Virus (ASFV) is one of the most threatening disease for pig husbandry, against
which no vaccine or treatment is available. ASFV is the only known virus that infects mammalian cells and codes
for a topoisomerase type II (gene P1192R), whose function has not been addressed although we consider that this
protein constitutes a new window to interfere with ASFV‟s replication.
Knowing that ASFV topoisomerase II shares a high homology sequence with the bacterial topoisomerase IV and
gyrase A, it is of particular interest the study of Quinolones action during ASFV‟s infection. These antibiotics are
used to block DNA replication by inhibiting topoisomerase‟s IV/gyrase‟s enzymatic activity and so we designed
experiments that aimed to measure the viral DNA replication blockage undergoing quinolones treatment.
Materials and Methods We have performed the screening of 30 quinolones in VERO cells infected with ASFV
Ba71V strain and in swine macrophages infected with ASFV L60 strain with a multiplicity of infection = 0,1. The
inhibitory effect of these drugs was confirmed by PCR analysis (A238L ASFV gene) after 10 days of treatment.
Pulsed field gel electrophoresis was completed to verify viral DNA fragmentation and confirm the possibility of
quinolones‟ viricide action. Treatment cytotoxicity was analyzed through cell viability assays (MTT/TUNEL
assays) and by Western Blot (detection of cleaved fractions of three caspases and PARP protein).
Results Our results revealed that combinations of some fluoroquinolones tested abrogate ASFVs course of infection,
in a dosis-dependent manner. Lower efficient quinolone concentration was determined in ASFV infected swine
macrophages cultures. Additional inhibitory effects were observed when the drugs were administered both preinfection and post-infection, suggesting that these drugs have prophylactic and therapeutic potential.
Conclusion The results of prophylactic and therapeutic treatment in ASFV in vitro infection with quinolones are
promising and open new perspectives for their use as complementary measures for ASFV disease control,
particularly within disease outbreaks scenarios.
211
Poster 93
Diagnóstico molecular de tuberculose bovina em secções histológicas
Soares, R., Inácio, J., Monteiro, M., Carvalho, P., Mendonça, P., Gomes, J., Ferronha, H., Amaro, A.
Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
A tuberculose bovina é uma doença infecciosa causada por Mycobacterium bovis, espécie pertencente ao complexo
Mycobacterium tuberculosis (MTC). Esta doença constitui um problema grave para as autoridades sanitárias não só
pelo seu carácter zoonótico, mas também pelos elevados prejuízos económicos que acarreta na produção animal e
nas restrições impostas ao comércio dos animais e produtos deles derivados. O diagnóstico laboratorial de rotina da
tuberculose bovina é usualmente executado recorrendo a dois exames, o histopatológico e o bacteriológico,
realizados no INRB, I.P.\LNIV segundo procedimentos elaborados e optimizados com base nas recomendações da
Organização Mundial de Saúde Animal (OIE). Contudo este diagnóstico apresenta-se difícil e moroso,
fundamentalmente em consequência do crescimento fastidioso desta micobactéria.
Este estudo teve como objectivo implementar uma técnica molecular, baseada em PCR, para detectar a presença de
espécies do MTC em secções histológicas de tecidos de bovinos com suspeita de tuberculose. Esta técnica foi
validada num estudo retrospectivo com 48 blocos de parafina de amostras de tecidos de bovinos com suspeita de
tuberculose provenientes do repositório do INRB, I.P.\LNIV. Foram utilizados tecidos caracterizados previamente
em ambas as técnicas histopatológicas e bacteriológicas: 36 amostras consideradas positivas para tuberculose
(Grupo I) e 12 amostras consideradas negativas (Grupo II). A extracção de DNA micobacteriano a partir destas
amostras foi optimizada recorrendo a dois métodos. As soluções de DNA extraído foram utilizadas como molde em
reacções de PCR convencional, recorrendo-se à amplificação da sequência de inserção IS6110, específica das
espécies do MTC. Como controlo interno da amplificação por PCR foi realizada a amplificação do gene constitutivo
da -actina bovina.
A detecção de M. bovis por PCR-IS6110 nas amostras do Grupo I revelou uma sensibilidade de 69%. É de realçar
que a utilização de um método de extracção de DNA muito simples, baseado apenas em ciclos de fervura e
congelação, sem necessidade de desparafinização prévia das secções histológicas, revelou um desempenho razoável.
O método de PCR desenvolvido mostra-se útil para complementar o diagnóstico histopatológico da tuberculose
bovina, contribuindo para encurtar o tempo de resposta laboratorial e representando um contributo fulcral para o
controlo e erradicação desta importante doença zoonótica.
[Molecular diagnosis of bovine tuberculosis in paraffin embedded tissues]
Bovine tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium bovis, a species belonging to the
Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). This disease is a serious problem for health authorities not only for its
zoonotic nature, but also by the high economic losses in animal production and to restrictions imposed on the trade
of animals and their products. The routine laboratory diagnosis of bovine tuberculosis is usually performed using
two exams, histopathological and bacteriological, made in the INRB, I.P.\LNIV according to procedures developed
and optimized based on the recommendations of the World Organization for Animal Health (OIE). However, this
diagnosis is difficult and time consuming, primarily by fastidious growth of the mycobacteria.
The aim of this study was to implement a molecular technique based on PCR to detect the presence of MTC species
in histological sections of tissues from cattle with suspected tuberculosis. This technique was validated in a
retrospective study of 48 paraffin blocks of tissue samples from the repository of INRB, IP\LNIV. The paraffin
embedded tissues used were previously characterized in both histopathological and bacteriological techniques: 36
samples were considered positive for tuberculosis (Group I) and 12 negative samples (Group II). Extraction of
mycobacterial DNA from these samples was optimized using two methods. The extracted DNA solutions were used
as template in conventional PCR reactions to the amplification of the insertion sequence IS6110, specific of MTC
species. The PCR amplification of the bovine constitutive gene of -actin was performed as internal control
amplification.
The detection of M. bovis IS6110-PCR in samples of Group I revealed a sensitivity of 69%. It should be noted that
the use of a very simple DNA extraction method, based only on boiling and freezing cycles, without prior
deparaffinization of histological sections showed a reasonable performance. The PCR method developed proves to
be useful to complement histopathological diagnosis of bovine tuberculosis, contributing to shorten the laboratory
diagnosis and representing a key contribution to the control and eradication of this important zoonotic disease.
212
Poster 94
Detecção e identificação de Mycobacterium bovis e de outros membros do complexo M. tuberculosis
por PCR em tempo real
Costa, P.1,2, Ferreira, A.1,3, Amaro, A.1, Botelho, A.1, Inácio, J.1
2 Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal
3 ICBAS, Universidade do Porto, Portugal. Email: [email protected]
O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) engloba diversas espécies patogénicas filogeneticamente muito
próximas, nomeadamente M. tuberculosis, o principal agente da tuberculose humana, e M. bovis e M. caprae,
agentes da tuberculose bovina e caprina, respectivamente. Mycobacterium bovis e M. caprae representam um
elevado potencial de transmissão zoonótica. Os métodos de diagnóstico convencionais da tuberculose não
diferenciam entre as várias espécies do MTC. O objectivo deste estudo foi desenvolver um sistema baseado na
técnica de PCR em tempo real capaz de detectar e discriminar os principais membros deste complexo relacionados
com a tuberculose animal. Foram desenhados primers e respectivas sondas TaqMan com base nas regiões
genómicas 16S rDNA (para o género Mycobacterium), sequência de inserção IS6110 (sonda específica do MTC) e
Regiões de Diferença RD1, RD4 e RD9. O padrão de presença ou ausência destas regiões permite a discriminação
dos membros do MTC mais relevantes. A eficiência das reacções de PCR em tempo real foi optimizada testando
individualmente cada conjunto de sonda e respectivos iniciadores usando DNA genómico de estirpes de referência,
isolados clínicos do MTC e amostras biológicas de bovinos artificialmente infectadas. Encontra-se em curso a
optimização dos ensaios de PCR em tempo real para detectar e discriminar as principais espécies do MTC em
formato multiplex, directamente em amostras de bovino naturalmente infectadas.
P. Costa e A. Ferreira auferem de bolsas de doutoramento da “Fundação para a Ciência e a Tecnologia”, com as referências
SFRH/BD/64136/2009 e SFRH/BD/62317/2009, respectivamente. Este trabalho é financiado pelo projecto PTDC/CVT/111634/2009.
[Rapid detection and identification of Mycobacterium bovis and other M. tuberculosis complex
members using a TaqMan-based real-time PCR approach]
The Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) encompasses several closely-related pathogenic species, namely
M. tuberculosis, the main agent of human tuberculosis, M. bovis and M. caprae, agents of bovine and caprine
tuberculosis, respectively. Mycobacterium bovis and M. caprae also represent a high potential of zoonotic
transmission. Conventional diagnostic methods for tuberculosis do not routinely differentiate between these species.
In this study the aim was to develop improved real-time PCR-based assays able to detect and discriminate the most
relevant MTC members related to animal tuberculosis. Novel sets of TaqMan probes, and respective flanking
primers, were designed “in silico” with complementary target sequences in the 16S rRNA gene (Mycobacterium
genus catch all probe), insertion sequence IS6110 (MTC specific probe) and MTC Regions of Difference RD1, RD4
and RD9. The pattern of presence or absence of these regions allows the discrimination of the most relevant MTC
members. Real-time PCR assays efficiency was optimized using each probe/primers set individually. Genomic DNA
from reference strains, MTC field isolates and bovine spiked biological samples were used as template. Efforts
towards the implementation of real-time PCR assays in a “one-tube” multiplex format for the detection and
discrimination of MTC members, in naturally infected bovine samples, are currently underway.
213
Poster 95
Detecção e discriminação de espécies genéticas de Leptospira por PCR em tempo real
Ferreira, A.1,2, Costa, P.1,3, Amaro, A.1, Rocha, T.1, Thompson, G.2,4, Inácio, J.1
3 Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal
4 CIBIO-ICETA, Universidade do Porto, Porto, Portugal; Email: [email protected]
A leptospirose é uma doença zoonótica emergente e subestimada causada por espécies patogénicas de Leptospira.
Nos animais, a leptospirose apresenta repercussões económicas relevantes, podendo estes desenvolver infecções
renais crónicas e tornar-se portadores de leptospiras que são eliminadas pela urina. O diagnóstico laboratorial da
leptospirose em animais infectados baseia-se principalmente em técnicas sorológicas. O isolamento de Leptospira a
partir dos animais suspeitos de infecção constitui o diagnóstico definitivo, sendo a detecção do agente bacteriano
nos rins necessária para identificar os animais portadores. A cultura dos agentes é laboriosa, pouco sensível, passível
de contaminação por outras bactérias e de resposta lenta, face ao crescimento extremamente fastidioso das
leptospiras. O objectivo deste estudo foi desenvolver um sistema baseado na técnica de PCR em tempo real para a
detecção e discriminação das espécies genéticas mais relevantes de Leptospira em amostras biológicas de animais,
particularmente, rim de bovino. O desenho in silico de oligonucleótidos iniciadores e sondas TaqMan foi feito com
base nas regiões genómicas 16S rDNA, Ompl1, RpoB e SecY. O DNA genómico foi extraído de estirpes de
referência de Leptospira através do método envolvendo a digestão com proteinase K seguida de extracção fenólica e
com a utilização de kits comercialmente disponíveis. Culturas de Leptospira interrogans (estirpe Autumnalis), L.
kirschneri (estirpe Portugal 1990), L. borgpetersenii (estirpe Mitis Johnson) e L. noguchii (estirpe CZ 214 K) foram
usadas para infectar artificialmente rim de bovino. O tecido foi infectado com diferentes concentrações de suspensão
bacteriana, tendo-se realizado diluições seriadas de base 10 para o efeito (desde 1 × 10 8 até 100 leptospiras/ml). As
reacções de PCR em tempo real foram optimizadas para as variáveis críticas, nomeadamente, as concentrações do
DNA-alvo, oligonucleótidos iniciadores e sondas TaqMan. Os sistemas de oligonucleótidos iniciadores e sondas
TaqMan desenvolvidos neste estudo revelaram-se específicos para as espécies genéticas patogénicas mais relevantes
de Leptospira, nomeadamente, L. interrogans sensu stricto, L. borgpetersenii, L. kirschneri e L. noguchii, sendo
capazes de, numa reacção única, detectar e discriminar as diferentes espécies. Encontra-se em curso a optimização
dos ensaios para detectar estas espécies em amostras de bovino naturalmente infectadas.
A. Ferreira e P. Costa auferem de bolsas de doutoramento da “Fundação para a Ciência e a Tecnologia”, com as referências
SFRH/BD/62317/2009 e SFRH/BD/64136/2009, respectivamente.
[Detection and discrimination of pathogenic Leptospira genomospecies in single-tube multiplex realtime PCR assays]
Leptospirosis is an underestimated zoonotic disease caused by pathogenic species of Leptospira. Serological
approaches are commonly used for diagnosing the disease in affected animals. Isolation of Leptospira from
suspected hosts constitutes the definitive diagnosis and the detection of the bacterial agent in kidney or urine
samples is necessary to identify animal carriers. However, these culture-based procedures are technically demanding
and highly susceptible to failure. The aim of this study was to develop improved real-time PCR-based assays able to
detect and discriminate the most relevant pathogenic species of Leptospira in animal biological samples, particularly
in bovine kidney homogenates. Improved sets of species-specific TaqMan probes, and respective flanking primers,
were designed “in silico” with complementary target sequences in 16S rRNA, Ompl1, RpoB and SecY genes.
Genomic DNA was extracted from reference Leptospira strains using both commercially available kit and an “in
house” phenol chloroform extraction. On week-old cultures of Leptospira interrogans (strain Autumnalis), L.
kirschneri (strain Portugal 1990), L. borgpetersenii (strain Mitis Johnson) and L. noguchii (strain CZ 214 K) in
EMJH medium were used for artificially infecting bovine kidney samples. The tissue was spiked with 1 × 10 8
leptospires/ml stock and serial 10-fold dilutions until 100 leptospires/ml were made. Real-time PCR assays were
optimized for critical variables such as template DNA and primer/probe concentrations and standard curves were
analyzed. The assays developed could efficiently detect and identify the most relevant pathogenic genetic species of
Leptospira, L. interrogans sensu stricto, L. borgpetersenii, L. kirschneri and L. noguchii in a single-tube multiplex
real-time PCR format. Efforts towards the implementation and validation of the real-time PCR assays to detect these
species in naturally infected bovine samples are currently underway.
214
Poster 96
Detecção de infecções de Theileria annulata em bovinos com tecnologias de PCR em tempo real e
amplificação isotérmica de ácidos nucleicos
Santos, M., Soares, R., Costa, P., Amaro, A., Inácio, J., Gomes, J.
Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (INRB IP / LNIV), Lisboa, Portugal. Email: [email protected]
A theileriose tropical ou mediterrânica é uma doença de bovinos, transmitida por carraças, e que representa uma
forte ameaça à produção pecuária e ao comércio internacional de bovinos, resultando em elevadas perdas
económicas. O agente da doença é o parasita Theileria annulata, que ocorre na bacia Mediterrânica, médio oriente e
sul da Ásia. A detecção destes agentes nos animais infectados é realizada normalmente através do exame
microscópico de esfregaços de sangue, o que apresenta uma baixa sensibilidade para a detecção de animais
portadores, em que apenas um número diminuto de eritrócitos se mantém infectado. O objectivo deste estudo foi
desenvolver métodos para detectar Theileria annulata em amostras de sangue de bovino, baseados nas tecnologias
de PCR em tempo real e de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos, nomeadamente na tecnologia conhecida
por Loop-Mediated Isothermal DNA Amplification (LAMP). A tecnologia LAMP revela-se particularmente útil para
ser usada em laboratórios de diagnóstico com menores recursos uma vez que não requer a utilização de
equipamentos dispendiosos e sofisticados, como os termocicladores. Foram desenhados novos oligonucleótidos
iniciadores com alvos complementares no gene da proteína Tams1, específica de T. annulata. O ADN foi extraído a
partir de amostras de sangue de bovino, usando um método comercial robotizado, e foi usado como molde nas
reacções de PCR em tempo real (com SYBR green) e LAMP. Estas amostras de ADN foram previamente testadas
para a presença de parasitas dos géneros Theileria e Babesia, usando um método estandardizado de hibridação
reversa com sondas de ADN específicas (Reverse Line Blotting – RLB). A detecção de T. annulata por PCR em
tempo real nestas amostras revelou uma especificidade e sensibilidade de 100% e 80%, respectivamente, usando o
RLB para comparação. As amostras falso-negativas corresponderam a parasitémias extremamente baixas de T.
annulata e a infecções mistas deste parasita com outras espécies. A tecnologia LAMP possibilitou também a
detecção deste agente em amostras de sangue de bovino. Os nossos resultados são ainda preliminares, mas mostramse promissores no sentido do desenvolvimento de novos métodos moleculares mais sensíveis, específicos, rápidos e
de fácil utilização, capazes de detectar T. annulata, e outros agentes patogénicos, directamente em amostras
biológicas animais.
M.Santos aufere de uma bolsa de estudo financiada pelo programa de bolsas 2010/2011 do deputado Europeu Rui Tavares; P. Costa aufere de
uma bolsa de doutoramento da “Fundação para a Ciência e a Tecnologia” (SFRH/BD/64136/2009).
[Assessment of Theileria annulata infection in bovines using real time PCR and isothermal DNA
amplification approaches]
Tropical theileriosis is a tick-borne hemoprotozoan disease which poses important health problems in cattle. The
agent is Theileria annulata, occurring around Mediterranean basin, Middle East and Southern Asia. Traditionally,
detection of Theileria pathogens in infected animals is accomplished by microscopic examination of stained-blood
smears, which has low sensitivity for the assessment of carrier animals, in which low numbers of erythrocytes
remain infected. The aim of this study was to develop real time PCR and Loop-Mediated Isothermal DNA
Amplification (LAMP) assays able to be used for the detection of T. annulata in bovine blood samples in wellequipped laboratories and in low-resource settings, respectively. Novel primers for PCR and LAMP were designed
targeting the T. annulata species-specific Tams1-encoding gene. Genomic DNA was extracted from blood samples,
using a robotized commercial method, and used as template for SYBR green chemistry real time PCR and LAMP
reactions. These samples were previously characterized for the presence of Theileria/Babesia parasites using a
standardized reverse line hybridization (RLB) assay. The developed real time PCR assay presented 100% specificity
and nearly 80% sensitivity for the detection of T. annulata in blood samples, using the RLB assay as gold-standard.
False negatives samples usually corresponded to extremely low levels of T. annulata parasitemia and mixed
infections with other Theileria/Babesia species. Similarly, the LAMP approach allowed the molecular detection of
the parasite nucleic acids in blood samples, avoiding the use of sophisticated and expensive equipments such as
thermocyclers. Our preliminary results shows promising towards the development of novel specific, sensitive, fast
and user-friendly nucleic acid testing assays able to detected T. annulata, and other animal pathogens, directly in
biological samples.
215
Poster 97
Besnoitia besnoiti e Toxplasma gondii interagem de forma diferente com o centrossoma da célula
hospedeira, mas ambos precisam do aparelho de Golgi durante a invasão
Cardoso, R.2, 4, Nolasco, S.2, 3, 4, Tavares, A.J.1, 2, Melo, L.V.6, Cortes, H.C.5, Leitão, A.4, Soares, H.A.1, 2, 3
1 Centro de Química e Biquímica, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa; 2 Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras; 3 Escola Superior
de Tecnologia da Saúde de Lisboa; 4 CVZ, Instituto de Investigação Cientifica Tropical, Lisboa e CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária,
UTL (TULisbon), Portugal; 5 Laboratório de Parasitologia Victor Caeiro, Núcleo da Mitra, ICAAM, Universidade de Évora; 6 Departamento de
Física, Instituto Superior Técnico, Universidade Técnica de Lisboa, Portugal.
A besnoitiose bovina é uma doença parasitária de bovinos caracterizada por manifestações cutâneas graves. Esta
patologia causa perdas económicas significativas na indústria de bovinos em África e Médio Oriente, tendo sido
considerada pela AESA uma doença emergente na EU devido ao aumento da sua prevalência e expansão geográfica.
O agente etiológico, Besnoitia besnoiti, é um parasita apicomplexa filogeneticamente próximo de Toxoplasma
gondii, tendo como hospedeiros intermediários bovinos selvagens e domésticos. O parasita intracelular obrigatório
Toxoplasma gondii infecta vertebrados de sangue quente, incluindo humanos. A maioria das infecções provoca
pouca ou nenhuma sintomatologia, mas infecções agudas são uma preocupação na medicina humana,
principalmente durante a gravidez e em indivíduos imunocomprometidos.
Nos nossos estudos, durante a invasão da célula hospedeira, Besnoitia besnoiti e Toxoplasma gondii interagem com
o citosqueleto de microtúbulos da célula hospedeira. Observámos que em estados mais avançados de infecção,
Toxoplasma gondii recruta o centrossoma da célula hospedeira, o maior centro organizador de microtúbulos, para
próximo do seu vacúolo parasitóforo. Contrariamente, o parasita Besnoitia besnoiti não parece precisar de uma
deslocalização do centrossoma da célula hospedeira. Uma vez que tem sido descrito que a reorientação do
centrossoma é fundamental na migração celular, investigámos se células invadidas por estes parasitas têm alterações
de migração no ensaio de fecho de ferida. Desta forma foi interessante observar que células invadidas por
Toxoplasma gondii, mas não aquelas invadidas por Besnoitia besnoit, apresentam um atraso no fecho de ferida
quando comparadas a células não invadidas, o que está provavelmente relacionado com as diferenças observadas no
recrutamento do centrossoma. Como o aparelho de Golgi se organiza à volta do centrossoma, fomos investigar a sua
posição 18h após infecção por estes dois parasitas. Neste caso, e em oposto ao que foi observado para o
centrossoma, ambos os parasitas parecem recrutar o aparelho de Golgi, estando este consistentemente posicionado à
volta do vacúolo parasitóforo. Para além disso, quando células em sobrexpressão de TBCCD1 (proteína envolvida
na conexão núcleo-centrossoma) são invadidas, a dificuldade de recrutamento do centrossoma aumenta para
Toxoplasma gondii, mas nenhuma diferença é observada em termos de recrutamento do Golgi em ambos os prasitas.
Estes dados sugerem que a relocalização do centrossoma em células invadidas por Toxoplasma gondii não parece
estar relacionada com o recrutamento do Golgi, tendo os dois parasitas diferentes estratégias de interacção com o
centrossoma durante a invasão.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, projecto PTDC/CVT/71630/2006 e bolsa de doutoramento (Rita Cardoso)
SFRH/BD/38122/2007
[Besnoitia besnoiti and Toxoplasma gondii interact differently with the host cell centrosome but
both require Golgi apparatus during invasion]
Bovine besnoitiosis is a parasitic disease of cattle characterized by severe cutaneous manifestations. This pathology
causes significant economic losses in the cattle industry of Africa and Middle East, having been considered by
EFSA an emerging disease in the EU due to its increased prevalence and geographic expansion. The etiological
agent, Besnoitia besnoiti, is an apicomplexan parasite, closely related to Toxoplasma gondii, with both domestic and
wild cattle as intermediate hosts. The obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii infects warm-blooded
vertebrates, including humans. Most infections generate few or no symptoms, but acute infections are a concern in
human medicine, particularly during pregnancy and in immunocompromised individuals.
Our studies show that during invasion of the host cell, Besnoitia besnoiti and Toxoplasma gondii demonstrate a
cross-talk with the host cell microtubule cytoskeleton. We observed that in advanced stages of infection,
Toxoplasma gondii recruits the host cell centrosome, the major microtubule organizing center, to near its
parasitophorus vacuole. In contrast, Besnoitia besnoiti parasites do not seem to require relocalization of host
centrosome. Since it has been described that centrosome reorientation is required for direct cell migration, we have
investigated if invaded cells have affected migration in a wound-healing assay. Interestingly, we observed that cells
invaded with Toxoplasma gondii, but not those invaded by Besnoitia besnoit, present a delay in wound closure in
comparison to non-invaded cells, which is probably related to the observed differences in centrosome recruitment.
Since Golgi apparatus is organized around the centrosome, we have also assessed Golgi apparatus positioning 18h
after infection by both parasites being established. In this case, and contrary to what was observed for the
centrosome, both parasites recruit the host cell Golgi apparatus, which is consistently around the parasitophorus
vacuole. Moreover, when host cells overexpressing TBCCD1 (a protein involved in nucleus-centrosome connection)
are invaded, the difficulty in recruiting the centrosome increases for Toxoplasma gondii, but no difference is
observed in terms of Golgi recruitment in both parasites. These data suggest that the relocalization of the centrosome
in cells invaded with Toxoplasma gondii doesn´t seem to be related with Golgi recruitment, having the two parasites
different strategies of interaction with the centrosome during invasion.
216
Poster 98
Isolamento de Toxoplasma gondii a partir de cérebro e músculo de gatos serologicamente positivos
utilizando culturas celulares
Waap, H.1, Ângelo, H.2, Vilares, A.2, Cortes, H.3, Meireles, J.4, Leitão, A.5
2 Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Lisboa, Portugal
3 Laboratório de Parasitologia Victor Caeiro (ICAAM), Universidade de Évora
O isolamento de Toxoplasma gondii é imprescindível quer para efeitos de diagnóstico definitivo da infecção, quer
para estudos visando a genotipagem de estirpes circulantes, tanto nos animais como no ser humano. O bioensaio é
presentemente considerado o método de eleição para isolamento de T. gondii de amostras biológicas, no entanto,
para além de eticamente questionável, a inoculação em ratinho é dispendiosa e laboriosa. O ensaio in vitro
utilizando culturas celulares é frequentemente mencionado como alternativa, contudo o investimento nesta área tem
sido diminuto, sendo raros os trabalhos que referem o recurso a este método para isolamento de T. gondii a partir de
tecidos animais. Este estudo teve como objectivo testar diferentes métodos de isolamento de T. gondii em culturas
de células. Para a preparação dos inóculos, colhemos amostras de tecido cerebral e muscular (coração e membros)
de 16 gatos serologicamente positivos, durante a necrópsia. O tecido cerebral foi homogeneizado com agulha e
seringa em meio de cultura e o tecido muscular digerido numa solução de ácido clorídrico e pepsina. A inoculação
dos homogeneizados de cérebro e músculo em culturas de células Vero resultou, respectivamente, numa taxa de
isolamento de 37,5% (6/16) e 62,5% (10/16). A visualização microscópica de taquizoítos nas culturas celulares foi
possível 5-14 dias pós-inoculação, utilizando homogeneizados de cérebro e 7-32 dias pós-inoculação, utilizando
homogeneizados de tecido muscular. Todos os isolados foram confirmados por n-PCR visando a região ITS1 do
rDNA de T. gondii.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, projecto FCT – PTDC/SAL/ESA/70388/2006.
[Isolation of Toxoplasma gondii from brain and muscle of seropositive cats using cell cultures]
Isolation of Toxoplasma gondii is essential for definitive diagnosis of infection as well as for studies aiming
genotyping of circulating strains, both in animals and humans. Bioassay is presently considered the most sensitive
method for isolating T. gondii from biological samples, however, besides ethically questionable, mice inoculation is
expensive and time consuming. In vitro assay using cell cultures is frequently mentioned as an alternative, but
investments made in this field have been diminute and there are only a few studies employing in vitro methods for
the isolation of T. gondii from animal tissues. The aim of the present work was to test different methods of T. gondii
isolation in cell cultures. Samples of brain and muscle tissue (heart and limb muscle) were collected from 16
seropositive cats, during necropsy. Inocula were prepared by syringing of brain tissue in cell culture medium and
artificial digestion of muscle samples in acid peptic solution. Isolation rates obtained with brain and muscle
homogenates were 37.5% (6/16) and 62.5% (10/16), respectively. Time to microscopic detection of tachyzoites
ranged between 5-14 days post-inoculation, when using brain tissue and 7-32 days post-inoculation, when using
muscle homogenates. Confirmation of isolates was carried out by n-PCR amplification targeting the rDNA ITS1
region of T. gondii.
217
Poster 99
Abordagem genotípica e fenotípica do mecanismo subjacente à resistência ao macrólido
eritromicina em estirpes de Campylobacter spp. isoladas de frangos criados em diferentes sistemas
de produção: biológico e extensivo indoor
Martins, A., Fraqueza, M.J., Fernandes, H., Fernandes, M.J., Semedo-Lemsaddek, T., Barreto, A.S.
Campylobacter jejuni e Campylobacter coli estão actualmente descritos como dois dos principais agentes de
infecção intestinal a nível mundial (EFSA, 2009; WHO, 2010). Estas bactérias gram-negativas infectam a maioria
dos frangos, destinados ao consumo humano, durante as primeiras 4 semanas de vida e logo a ingestão de carne de
frango crua ou incorrectamente cozinhada constitui, para o Homem, uma via directa de exposição a este agente
patogénico. Tipicamente a síndrome resultante de infecção por Campylobacter spp. (campilobacteriose) é autolimitante e logo não há necessidade de recorrer a agentes antimicrobianos salvo quando a infecção é particularmente
grave ou se o individuo afectado é imunocomprometido. Nesses casos as fluoroquinolonas, como a ciprofloxacina,
ou macrólidos, como a eritromicina, são os antibióticos de eleição. O grupo de estirpes em estudo foi isolado de
amostras de ceco, pele do pescoço e peito de frangos de sistemas de produção biológico e extensivo indoor num
matadouro Português. A pesquisa de Campylobacter foi realizada respeitando a EN/ISO 10272-1:2006 e a
identificação dos isolados foi realizada por multiplex-PCR. Foram no presente estudo analisadas 110 estirpes
(n=110) de C. jejuni e C. coli. Relativamente aos mecanismos moleculares subjacentes ao estudo da resistência à
eritromicina realizou-se à técnica de PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR), que permitiu a
detecção da mutação pontual A2075G que ocorre no gene 23S rRNA responsabilizada pela ocorrência de elevados
níveis de resistência a este antibiótico. Paralelamente procedeu-se à realização de testes de difusão em disco para 6
antibióticos diferentes, de acordo com CA-SFM, 2010, dando especial ênfase aos resultados obtidos para a
eritromicina. Observou-se então que 25% das estirpes de origem biológica eram resistentes à eritromicina enquanto
as de origem extensive indoor apresentavam 74% de susceptibilidade a este. A partir desta selecção inicial foi então
possível escolher 14 estirpes com origem em cada um dos sistema produtivos em estudo, de acordo com o seu
fenótipo eritromicina resistente, sujeitando mais tarde as estirpes à técnica de concentrações mínima inibitórias que
revelaram 100% de resistência para estirpes orgânicas resistindo a concentrações de eritromicina de 123mg.L
enquanto as estirpes de origem extensivo indoor revelaram precisamente o contrário com 0% de resistências
observadas.
[Phenotypic and genotypic approach to erythromycin resistance in Campylobacter spp. isolates
from organic and extensive indoor broiler production systems]
Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are described as the leading cause of zoonotic enteric infections in
most developed and developing nations (EFSA, 2009; WHO, 2010). This gram-negative bacteria, infects most
broilers by the time they reach 4 weeks of age thus making the consumption of fresh or undercooked chicken a
major pathway for human exposure to this pathogenic agent. Due to the often self-limiting diarrhoea that occurs in
infected humans, also known as campylobacteriosis, antibiotic treatment is normally not required being nevertheless
indicated for either extra intestinal or prolonged enteritis and for immune-compromised patients. Nowadays the
most common antimicrobial agents for treating Campylobacter spp. infections are fluoroquinolones, such as
ciprofloxacin, and macrolides, such as erythromycin. Considering flocks‟ traceability from organic and extensive
indoor, sampling was performed for caecum, carcass (neck skin) and breast meat at a poultry slaughterhouse in
different work days. Detection of Campylobacter was performed according to EN/ISO 10272-1:2006 and isolates
were identified by multiplex PCR. A collection of 110 C. coli and C. jejuni strains were evaluated (n=110). The
presence of the point mutation A2075G present in the 23S rRNA gene, attributed to high-level erythromycin
resistance was screened for, using PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) according to
Kurinčič et al., 2007. Susceptibility testing was performed for 6 antimicrobial agents (disk diffusion method)
according to the recommendations of the Comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie,
2010. Particular consideration was given to the macrolide erythromycin. The phenotypic and genotypic data were
compared. Results revealed that 25% of organic production system strains were resistant to erythromycin while 74%
extensive indoor representatives were susceptible. From this initial results 14 strains (n=14) of each production
systems were selected due to their particular resistant phenotype not only to erythromycin but also as multidrug
resistant strains. Minimum inhibitory concentrations (MIC) were performed later on. Organic strains had a 100%
resistance to erythromycin, still surviving at the staggering concentration of 123mg.L while, unexpectedly, extensive
indoor strains revealed a 0% resistance to the very same antibiotic.
218
Poster 100
Análise transcripcional em enterococos alimentares após crescimento em ambientes de colonização
e infecção
Nóbrega, C.1, Santos, S.C.1, Barreto, A.S.1 e Semedo-Lemsaddek, T.1
Os enterococos são microrganismos ubíquos, frequentemente presentes em produtos fermentados onde contribuem
para melhorar a textura e o sabor. Contudo, o aumento das infecções causadas por esta bactéria é cada vez mais
preocupante, especialmente devido à sua gravidade e dificuldade de tratamento. Assim, a capacidade que os
enterococos possuem de modular a expressão génica de forma a alterar o seu comportamento, conduzindo-os a
assumir o papel de microrganismos comensais ou patogénicos, constitui alvo de interesse crescente.
No presente estudo, com o objectivo de identificar genes diferencialmente expressos em ambientes que simulam
colonização ambiental/comensal e locais de infecção, utilizámos uma abordagem transcriptómica baseada em RAPPCR (RNA arbitrarily primed PCR). Esta técnica utiliza primers aleatórios e baixas temperaturas de restringência
para a síntese da primeira e segunda cadeias de cDNA. As reduzidas temperaturas de hibridação permitem que os
primers se liguem aleatoriamente em vários locais da cadeia molde, originando perfis de RNA com um elevado
número de amplicões, posteriormente separados em geis de poliacrilamida. Para este estudo analisámos a resposta
transcripcional de um Enterococcus sp. isolado de leite após crescimento em ambientes que simulam colonização
ambiental (leite com concentrações de NaCl entre 0% e 6,5%) e infecção (BHI, sangue e urina). Após extracção do
RNA, RAP-PCR e separação em poliacrilamida, os perfis de RNA obtidos para cada uma das condições em análise,
foram comparados com o respectivo controlo e os amplicões diferencialmente expressos, i.e., os produtos de
amplificação presentes na condição ambiental mas ausentes na condição controlo, foram excisados dos géis,
reamplificados, clonados e sequenciados. A utilização de cinco primers aleatórios em reacções independentes,
nomeadamente M13, (GTG)5, OPC15, OPC19 e pH, levou à obtenção de resultados distintos. Em média foram
recolhidas 21 bandas diferenciais para cada primer mas o OPC19 revelou-se o mais promissor, pois permitiu
identificar um número muito superior de fragmentos diferenciais, um total de 45 distribuídos pelas várias condições
ambientais. Após sequenciação das bandas diferenciais, as sequências nucleotídicas obtidas serão comparadas com
bases de dados disponíveis online, de forma identificar os genes diferencialmente expressos nas condições em
análise, o que permitirá perceber de que forma os estímulos ambientais influenciam a expressão génica e modulam o
comportamento, como comensais ou patogénicos, dos enterococos presentes nos alimentos.
[Transcriptional analysis of dairy enterococci after growth in colonization and infection-related
settings]
Enterococci are ubiquitous microorganisms, frequently present in fermented foods, where they are known to
improve texture and flavor. However, the increasing number of infections caused by these bacteria is becoming a
major concern, especially due to their severity and resilience to treatment. Therefore, how enterococci modulate
gene expression and switch from a commensal to a pathogenic lifestyle and which environmental cues trigger those
mechanisms, becomes an important subject of research.
In the present investigation, with the goal of analyzing genes being differentially expressed in environments related
to commensal/environmental colonization and infection sites, we applied a transcriptional approach based on RAPPCR (RNA arbitrarily primed PCR). This technique uses an arbitrary primer at a low annealing temperature for both
the first- and second-strand cDNA synthesis reactions. At such low-stringency temperatures the arbitrary primer is
able to bind at random sites within the template, leading to an RNA-fingerprinting profile with a large number of
amplicons that are subsequently resolved in polyacrylamide gels.
For this study we analyzed the transcriptional response of a dairy isolate after growth in settings simulating
environmental colonization (milk with NaCl concentrations between 0% and 6.5%) and infection (BHI, blood and
urine). After RNA isolation, RAP-PCR and polyacrylamide gels, the RNA-fingerprinting profile obtained for each
growth condition was compared to its corresponding control and differentially expressed amplicons, i.e.,
amplification products present in the environmental condition but absent in the control condition, were excised from
the gels, reamplified, cloned and sequenced. Using five distinct arbitrary primers in independent reactions, namely
M13, (GTG)5, OPC15, OPC19 and pH, distinct outcomes were observed. The average number of differential bands
collected for each primer was 21 but primer OPC19 showed to be the most promising, since it led to a much higher
number of differential fragments, a total of 45 distributed for all the settings analyzed. By comparing the obtained
sequences with databases available online we aim to identify genes being differentially expressed on the growth
conditions under analysis, lead to a better understanding of how those settings influence the lifestyle adopted by
enterococci and further contribute to reliably assess for the potential pathogenicity of food isolates.
219
Poster 101
Será que enterococos isolados de produtos cárneos fermentados Portugueses possuem factores de
virulência?
Santos, S.C.1, Nóbrega, C.1, Fraqueza, M.J.1, Elias, M.2, Barreto, A.S.1 e Semedo-Lemsaddek, T.1
2 Universidade de Évora, Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterrânicas, Évora, Portugal
Os enterococos são comummente isolados de inúmeros produtos fermentados lácteos ou cárneos, mas actualmente
estes microrganismos estão no grupo dos patogénios emergentes. Embora ainda não tenham sido descritas
toxinfecções atribuídas a este género, este assunto causa apreensão relativamente aos produtos alimentares em que
os enterococos estão presentes.
Neste estudo foram analisados produtos tais como Catalão, Chouriço Preto, Linguiça, Paio e Salsichão. Das
amostras testadas foram isolados 159 enterococos que foram primeiramente identificados ao nível de género após
crescimento em meios selectivos, a diferentes temperaturas, valores de pH, concentrações de NaCl, coloração de
Gram, testes da catalase e oxidase. Subsequentemente, procedeu-se à tipificação dos isolados por PCRfingerprinting com os primers OPC-19 e (GTG)5, seguida do cálculo do indice de diversidade de Simpson
(D=0,927). A análise do dendrograma obtido permitiu a selecção de 78 enterococos, representantes da diversidade
existente na colecção. Esses isolados foram identificados por PCR como membros das espécies Enterococcus
faecalis (n=45), E. faecium (n=14) e E. durans (n=9), não tendo sido possível identificar 12 deles.
Posteriormente procedeu-se à pesquisa de factores de virulência por PCR e ensaios em placa. Analisou-se a presença
dos genes que codificam para a substância de agregação -agg-, uma proteína de superfície -esp-, uma adesina efaAfs-, pili associados a endocardite/formação de biofilmes -ebpABC-, um antigénio polissacarídico -epa-, uma
hemolisina/bacteriocina -cyl- e a enzima hidrolítica gelatinase -gelE-. Os resultados obtidos foram os seguintes:
ebpA 8,97% (7/78), ebpB 21.79% (17/78), ebpC 29,49% (23/78), efaAfs 23,08% (18/78), epa 28,21% (22/78), fsrB
(incluído no operão da gelatinase) 25,54% (20/78) e gelE 74,64% (59/78); os genes agg, esp e cylA não foram
detectados em nenhum dos isolados em estudo. Relativamente aos ensaios em placa, 10 dos isolados produziram
gelatinase e nenhum foi considerado β-hemolítico.
Em conclusão, devido ao reduzido número de factores de virulência que foi observado, o consumo de produtos
cárneos fermentados Portugueses parece estar associado a um baixo nível de risco.
[Do enterococci from Portuguese fermented meat products carry virulence determinants?]
Enterococci are usually isolated from different types of fermented foods, like dairy and meat products but nowadays
they are considered emerging pathogens. Although enterococcal food-borne infections have not been described so
far, this combination of factors raises special awareness regarding the food safety of products harboring enterococci.
The present investigation studied Portuguese traditional fermented meat products namely, Catalão, Chouriço Preto,
Linguiça, Paio and Salsichão, for the presence of Enterococcus spp. 159 enterococci were presumptively identified
at genus level by growth in selective media, at different temperatures, pH values, NaCl concentrations and
assessment of Gram staining, catalase and oxidase activities. Subsequently, the diversity of the bacterial collection
was assessed by PCR-fingerprinting with primers OPC-19 and (GTG)5 and calculation of Simpson‟s diversity index
(D=0.927). Analysis of the dendrogram obtained led to the selection of 78 meat-enterococci, representative isolates
of all enterococcal groups, for further studies. Then, the selected strains were identified by PCR amplification as
members of the species Enterococcus faecalis (n=45), E. faecium (n=14) and E. durans (n=9); 12 isolates remained
unidentified.
The meat-enterococci were subsequently evaluated for the presence of virulence factors, by PCR-amplification and
plate assays. We screened for the coding genes of aggregation substance -agg-, the enterococcal surface protein esp-, the adhesin-like E. faecalis endocarditis antigen -efaAfs-, the endocarditis/biofilm-associated pilus -ebpABC-,
the enterococcal polysaccharide antigen gene -epa-, a hemolysin/bacteriocin -cyl- and the hydrolytic enzyme
gelatinase -gelE-. The results obtained for the PCR-screening were as follows: 8.97% (7/78) for ebpA, 21.79%
(17/78) for ebpB, 29.49% (23/78) for ebpC, 23.08% (18/78) for efaAfs, 28.21% (22/78) for epa, 25.54% (20/78) for
fsrB (part of the gelatinase coding operon) and 74.64% (59/78) for gelE; the genes agg, esp and cylA were absent
amongst the meat-enterococci under analysis. As for the plate assays, 10 of the isolates produced gelatinase
(12.82%) and none was found to be β-hemolytic.
Overall, since a low number of virulence factors was observed, a low risk seems to be associated with the presence
of enterococci in these long-established traditional meat fermented products.
220
Poster 102
Avaliação morfométrica do fémur proximal na raça Cão da Serra da Estrela em animais com
elevada lassidão articular ou sinais de displasia da anca
Martins, J.1, Ferreira, A.J.2, Ginja, M.M.D.1
1 Departamento de Ciências Veterinárias, CITAB, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal
2 Departamento de Cínica, CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Objectivos: A extremidade proximal do fémur e o acetábulo formam uma unidade funcional dependendo
reciprocamente um do outro para a sua forma e crescimento sincronizado. Qualquer alteração no desenvolvimento
normal do fémur proximal pode resultar em alterações biomecânicas com interferência directa na adequada
transmissão de cargas entre as superfícies articulares, resultando na sobrecarga articular e desenvolvimento da
osteoartrite. Os principais objectivos deste trabalho conhecer a conformação do fémur proximal na raça Cão da
Serra da Estrela em animais jovens com lassidão articular e adultos com displasia da anca (ângulos de inclinação e
anteversão e comprimento e espessura do colo do fémur).
Metedologia: Neste trabalho foram utilizadas as radiografias ventrodorsais da bacia de 121 animais jovens, com
idades entre os 4 e 12 meses (5,4±1,8 meses), e 192 animais adultos, com idades entre os 12 e 118 meses (29,3±18
meses), recomendadas para despiste de displasia da anca. Foram ainda usadas as radiografias mediolaterais dos
fémures de 169 destes animais. Os animais jovens foram radiografados pela técnica PennHIP e tinham um lassidão
articular com o índice de distracção igual ou superior a 0,45 e os animais adultos evidenciavam sinais de displasia da
anca, sendo avaliados segundo os critérios da Federação Cinológica internacional. Neste trabalho foram medidos nas
projecções radiográficas mencionadas os ângulos de inclinação (AI) e anteversão (AA) do colo femoral, bem como
o índice de comprimento (ICCF) e de espessamento do colo femoral (IECF). Na análise estatística utilizou-se o
programa SPSS versão 19.0.
Resultados: A média e o intervalo de confiança (IC) de 95% para o AI foram de 129,4º (95% IC 129,1º-129,7º).
Verificaram-se variações significativas desta variável com a idade (jovens 130.1º; adultos 129.0º) e sexo (fêmeas
128,8º; machos 130,4º). A média e o IC de 95% para o AA foram de 29,3º (95% IC 28,7º-29,9º). Verificaram-se
variações significativas no AA com a idade (jovens 32,6º; adultos 27,7º). A média e o IC de 95% para o ICCF foram
de 1,51 (95% IC 1,50-1,51). Verificaram-se variações significativas no ICCF com idade (jovens 1,47; adultos 1,53)
e sexo (fêmeas 1,50; machos 1,52). A média e o IC de 95% para o IECF foram de 0,58 (95% IC 0,58-0,59).
Verificaram-se variações significativas no ICCF só com a idade (jovens 0,57; adultos 0,59).
[Morphometric assessment of the proximal femur in Estrela Mountain dog breed in dogs with high
passive hip laxity or signs of hip dysplasia]
Objectives: The proximal end of the femur and acetabulum form one functional unit, depending on each other their
synchronized growth and shape. Any changes in biomechanical balance can result in an abnormal growth, reduction
of the articular weight bearing surface, cartilage overload and development of osteoarthritis. The main purpose of
this work was to study these radiographic projected hip parameters in the Estrela Mountain Dog (EMD) breed in
young and adult with high passive hip laxity or signs of hip dysplasia the femoral neck length and width and femoral
angles of anteversion and inclination.
Methods: Standard hip-extended ventrodorsal radiographic views recommended to screening hip dysplasia of 121
young EMD ages between 4 and 12 months (5.4±1.8 months) and 192 adult animals, age between 12 e 118 months
(29.3±18 months). The faux-profile views of the right and left femur of 169 of these animals were also studied.
Young dogs were also evaluated using the PennHIP distraction view and their passive hip laxity was equal or bigger
to distraction index of 0.45. Hips of adult animals were assessed and classified according to the Fédération
Cynologique Internationale‟s scoring system, and all dogs were classified as dysplastic. In our research were
measured in the mentioned radiographic views the femoral neck length (FNLi) and width and (FNWi), and femoral
angles of anteversion (FAA) and inclination (FAI). Statistical calculations were performed using standard computer
software (SPSS Version 19.0).
Results: The mean and 95% confidence interval (CI) for the mean for FAI was 129.4º (95% CI 129.1º-129.7º).
There was a significant difference of this variable with age (young 130.1º; adults 129.0º) and gender (females
128.8º; males 130.4º). The mean and the 95% CI for FAA was of 29.3º (95% CI 28.7º-29.9º). We only found
significant difference of this variable with age (young 32.6º; adults 27.7º). The mean and the 95% CI for FNLi was
of 1.51 (95% IC 1.50-1.51). There was a significant difference of this variable with age (young 1.47; adults 1.53)
and gender (females 1.50; males 1.52). The mean and the 95% CI for FNWi was of 0.58 (95% IC 0.58-0.59). We
only found significant difference of this variable with age (young 0.57; adults 0.59).
221
Poster 103
Avaliação morfométrica do acetábulo na raça Cão da Serra da Estrela em animais com elevada
lassidão articular ou sinais de displasia da anca
Martins, J.1, Ferreira, A.J.2, Ginja, M.M.D.1
1 Departamento de Ciências Veterinárias, CITAB, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal
2 Departamento de Cínica, CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon), Portugal
Objectivos: A extremidade proximal do fémur e o acetábulo formam uma unidade funcional dependendo
reciprocamente um do outro para a sua forma e crescimento sincronizado. Qualquer alteração no desenvolvimento
normal do fémur proximal pode resultar em alterações biomecânicas com interferência directa na adequada
transmissão de cargas entre as superfícies articulares, resultando na sobrecarga articular e desenvolvimento da
osteoartrite. Os principais objectivos deste trabalho conhecer a conformação do acetábulo na raça Cão da Serra da
Estrela em animais jovens com lassidão articular e adultos com displasia da anca (ângulos de retrotorção e
profund

Livro de Resumos em pdf - Faculdade de Medicina Veterinária

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