aula_1 e 2

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aula_1 e 2

03-02-2011
MICROBIOLOGIA
INTRODUÇÃO
Arlete Mendes Faia
2010/2011
Licenciatura em enfermagem
Microbiologia
O QUE É A MICROBIOLOGIA?
Microbiologia é a Ciência que estuda os microrganismos.
Os microrganismos são as formas de vida que, por
serem demasiado pequenos, não são vísiveis com
detalhe a olho nú (auxílio do microscópio óptico e
microscópio electrónico). Incluem Bactérias, Fungos,
Vírus, Protozoários, Algas unicelulares, Viróides e
Prions.
A célula procariota vs eucariota
O tamanho de células procariotas, relativamente a outras células e biomoléculas
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A célula procariota vs eucariota
Some major
episodes in the
history of life.
Teoria endosimbiótica
(Lynn Margulis, 1970’s)
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Classificação dos Microrganismos
Linnaeus (1735) estabeleceu o sistema científico de nomenclatura: Animaliae e
Plantae
Haeckel (1866) propôs mais um reino: Protista (microrganismos)
Com o aparecimento do microscópio electrónico e
o avanço da Ciência
Robert Whittaker (1969) apresenta a classificação
em 5 Reinos:
Animalia (nutrição por ingestão)
Plantae (fotosíntese)
Protista (eucariotas unicelulares,
protozoários e algas)
Fungi (nutrição por absorção)
Monera ou Procaryotae
Não distingue Eubacteria de Archaebacteria
Carl Woese (1977) baseando-se na composição bioquímica das membranas e nos
estudos de rRNA
Três domínios
Eukarya – Eucariotas (animais,plantas, fungos,
protistas e stramenopila/chromista)
Bacteria – procariotas, bactérias
Archaea- procariotas,Archaeabacteria
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Nomenclatura
Cada espécie é identificada por 2 nomes:
O primeiro em maíscula _ género ;
O segundo em minúscula_ o epíteto da espécie.
Pode ser descritivo ou em honra do cientista
Exºs - Staphylococcus aureus
Descreve o agrupamento em cacho de
células (staphylo-) e a cor dourada das
colónias
Escherichia coli
Reconhecimento pela descoberta a Theodor Escherich, e descreve o habitat
da bactéria, no intestino ou cólon
Diversidade dos Microrganismos
Figure 1
Bacteria
Procariotas
Parede celular com peptidoglicano
Cisão binária
Obtêm energia, oxidando compostos
orgânicos, inorgânicos ou da luz
Figure 1.1a
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Formas básicas das bactérias
Bastão (bacilos)
bacilos)
Espirilos
Esféricas (cocos)
cocos)
Morfologia das bactérias
As três principais formas das Bactérias
1. Cocci
2. Bacilli (Rods)
3. Pleomorphic – bacteria that take more than one
shape (Grk pleon = many, morphe = form)
Mycoplasma
(walking pneumonia)
Yersinia pestis
(plague)
Corynebacterium diphtheriae
(diphtheria)
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coccus
diplococcus
(diplo = 2)
Streptococcus pneumoniae
pneumonia
streptococcus
(Streptos = Grk for
twisted, because
long chains tend to
twist)
staphylococcus
(Staphyle= Grk
For bunch of grapes)
Streptococcus mutans
cavities
Staphylococcus
epidermidis
Normal flora
do not memeorize the shape of these particular bacteria – they’re here
to convince you that the shapes are relevant to medical microbiology
E. coli
bacillus
Bordetella
pertussis
(whooping cough)
coccobacillus
Short bacilli
Vibrio cholera
(cholera)
vibrio
Curved rods
diphtheroids
Most often seen as
palisades –
Rods side by side or
in X, V or Y figures
Corynebacterium acnes
Normal flora
acne
spirillium
rigid spiral
Helicobacter pylori
ulcers
Campylobacter
jejunum
food poisoning
spirochete
Flexible,
undulating spiral
Borrelia
burgdorferi
Lyme Disease
Treponema
pallidum
syphilis
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Helicobacter pylori
Brucella
Legionella (doença dos legionários, Pneumonia)
Treponema pallidum (sífilis)
Borrelia burgdorferi
Archaea
Procariotas
Ausência de peptidoglicano
Prevalecem em ambientes
extremos
Incluem:
– Metanogénicas
– Halófilas extremas
– Termófilas extremas
– Psicrófilas extremas
Halobacteria sp.
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4 grupos
– Metanogénicas
– halofilas extremas
– Termófilas extremas
– Psicrófilas extremas
Archaea
Reino Fungi
Penicillium sp
Fusarium sp.
Mucor sp
Colónias de fungos
Aspergillus sp
Botrytis sp.
Rhizopus nigricans
Estima-se que existam mais de 1,5 milhão de espécies no mundo, embora apenas ~70.000 estão descritas
Reino Fungi
Microrganismos com células eucariotas
Multicelulares consistindo uma massa de
micélio (conjunto de hifas)
Fusarium sp.
Não fotossintéticos
Nutrição por absorção
Imóveis
Parede celular com quitina
Armazenam glicogénio
Leveduras são unicelulares
Penicillium sp
Mucor sp
Colónias de fungos
Aspergillus sp
Botrytis sp.
Rhizopus nigricans
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Penicillium, comum bolor do pão,
cresce em matéria orgânica em
decomposição.
Algumas espécies produzem antibióticos Penicillium
notatum produz a penicilina (Alexander Fleming, efeito
contra S. aureus).
Penicillium marneffei
P. marneffei no solo apresenta forma micelial e no interior das células forma unicelular (levedura).
Causa a mais frequente peniciliose, com infecção dos pulmões (pneumonia).
Outro fungo dimórfico
micelial (saprófita),
levedura (parasita)
Coccidioides immitis - fungo aparece no solo e poeiras
Penicillium glaucum usado no queijo Gorgonzola
Penicillium candida usado nos queijos Brie e Camembert
Penicillium roqueforti usado no queijo Roquefort
Penicillium camemberti usado nos queijos Brie e Camembert
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Leveduras
Fungos unicelulares
C. albicans
Protozoários
Organismos unicelulares, eucariotas (1 a 150 um)
São, na maioria, heterotróficos
Movimento por flagelos, cílios, pseudópodos ou
microtúbulos
Conhecem-se cerca de 65 000 espécies,10 000 espécies
parasitam animais vertebrados ou invertebrados
Balanditium
Protozoários
Possuem uma vida livre, algumas
espécies vivem como parasitas do
homem e de outros seres vivos
A reprodução dos protozoários
geralmente é assexuada, alguns
produzem esporos, alguns apresentam
reprodução sexuada
Paramecium sp- protozoário ciliado
Balanditium coli
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Protozoários
Entamoeba histolytica (diarreias
graves , amebíase)
Trypanosoma brucei (doença do sono)
Babesia sp
Balantidium coli
Ciliados simbiontes rúmen da vaca
www.nhc.ed.ac.uk/index.php?page=24.25.366
Microalgas
Eucariotas
Fotosintéticos
Responsáveis
pela
fixação
de
quantidades enormes de CO2,
produzindo o oxigénio atmosférico
Spirulina
Estima-se que existam cerca de 200 000 - 800 000 espécies , das quais apenas cerca de 35 000
espécies estão descritas
Microalgas
A maioria das microalgas produzem produtos únicos como os carotenos,
antioxidantes, ácidos gordos, enzimas, polímeros, peptídeos, toxinas e
esteróis.
badger.uvm.edu/dspace/handle/2051/4812
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Vírus
Acelular, parasitas intracelulares obrigatórios
Apenas contêm DNA ou RNA
Rodeado por proteína
Que pode estar rodeada por um envelope lipidico
Viroses só se replicam em células vivas
Replicação de um fago (vírus bactéria)
Os Vírus
Vírus da
Influenza
Vírus do mosaico do tabaco (montagem)
vírus HIV
Replicação do T4
Parasitologia
Ciência que estuda os parasitas, os seus hospedeiros e relações entre eles.
Engloba os protozoários, nemátodes, anelídeos, platelmintes, e artrópodes,
do reino Animal.
Os protozoários são unicelulares, enquanto os nemátodes, anelídeos,
platelmintes e artrópodes são organismos multicelulares
•
•
Formas parasíticas larvares
Alguns estádios do ciclo de vida, visível ao microscópio
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Microrganismos e Doenças
Doenças podem se espalhar em muitas maneiras diferentes:
Pessoa a pessoa - as bactérias e os vírus podem ser transmitidas de pessoa para
pessoa através do sangue, da saliva ou pela tosse ou espirro.
Infecção alimentar – as bactérias e os vírus podem ser transmitidas pelos alimentos
não armazenados correctamente, ou que o tenham sido por mais tempo do que se
deveria. Além disso, se uma pessoa infectada ou sem cuidados de higiene preparar o
alimento, a infecção pode passar para as pessoas que comem o alimento.
Infecção através da água - quando a água não é tratada adequadamente.
Infecção através do ar - Algumas doenças podem se espalhar pelo ar. Exemplo a
doença dos legionários, pode ser transmitida pelos sistemas de ar condicionado mal
conservados.
Infecção através insectos - Muitas doenças podem ser transmitidas por insectos
No início do Século XX as doenças infecciosas eram a principal causa de
morte………Hoje o nosso problema são os estilos de vida
Doenças provocadas por microorganismos
Doenças provocadas pelo estilo de vida
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Controlo dos microrganismos
Controlo das doenças infecciosas é o resultado de:
Avanço da Ciência – maior conhecimento dos processos da
doença
Melhoria das condições sanitárias
Descoberta dos antibióticos
…..
No entanto, ainda milhões morrem de doenças infecciosas como a
malária, tuberculose, cólera e diarreias graves
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Importância dos Microrganismos
• Mineralização da matéria orgânica
• Produção de vários produtos químicos industriais ( álcool etílico,
acetona,….)
• Produção de alimentos fermentados (pão, iogurte, vinagre, queijos,
bebidas alcoólicas…)
• Provocam doenças
• Relações mutualistícas – microbiota normal do intestino, por exemplo…
• Produzem enzimas (celulase, pectinases….) e fármacos (insulina)
Aplicações dos Microrganismos
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Bioremediação
•
Os microrganismos (bactérias)
degradam a matéria dos
efluentes
•
Os microrganismos (bactérias)
degradam poluentes como por
exemplo: crude, mercúrio,….
O conhecimento dos aspectos morfológicos, fisiológicos e
bioquímicos dos microrganismos
Permitiu:
Transformar e conservar alimentos
Prevenir e tratar doenças
Desenvolver técnicas de assépsia para evitar contaminação e infecção
na medicina e nos laboratórios de microbiologia
Marcos históricos na Microbiologia
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Em 1665, Robert Hooke reporta que todas as “coisas” vivas são
constituídas por pequenas “caixas” ou células
Marcos históricos da Microbiologia
•
1673-1723, Antoni van Leeuwenhoek
descreveu os microrganismos que
observou, utilizando um microscópio
rudimentar
Figure 1.2b
Controvérsia da geração espontânea
Abiogénese – Hipótese de que os organismos vivos se formam a partir de matéria não viva
(geração espontânea).
Biogénese – hipótese alternativa de que todos organismos aparecem de outros préexistentes.
Teoria celular todos os organismos vivos são constituídos por células
que aparecem de outras pré-existentes
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Opositores à teoria da geração espontânea:
Lazzaro Spallanzany (1765) demonstrou que as infusões de carne
permaneciam inalteradas, depois de fervidas e hermeticamente fechadas
Papel do O2 como força vital (Lavoisier, Cavendish…)
Louis Pasteur (1822-1885) demonstrou não existia geração espontânea, utilizando os balões com
colo de cisne
Tyndall (1820-1893) e a esterilização fraccionada para eliminar endósporos.
Em 1858, Teoria celular- Rudolf Virchow afirma que todas as células aparecem de outras pré-existentes
A Teoria da Biogénese
Louis Pasteur demonstrou que os microrganismos estão presentes no ar e que nos balões
com colo de cisne eles eram impedidos de entrar em contacto com o meio que assim
permanecia estéril.
Experiências de Pasteur –base das técnicas de
assépsia
Pasteur demonstrou ainda que:
As bactérias
(pasteurização)
podiam
ser
mortas
pelo
calor
A fermentação era levada a cabo por microrganismos
(vinho, cerveja…..)
O crescimento microbiano podia causar alteração dos
alimentos (vinagre)
As suas descobertas incluem ainda a relação dos micróbios com a doença, a imunidade
e drogas antimicrobianas
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Os microrganismos e a etiologia da doença
Berkeley (1845) demonstrou que o emurchecimento da batateira era provocado por um fungo
Robert Koch (1876) demonstrou que o carbúnculo hemático era provocado por Bacillus anthracis
Postulados de Koch
Joseph Lister (1840) assépsia dos equipamentos, instrumentos e ar das salas de operações
evitam infecções pós-operatórias
Ignaz Semmelweis (1840) advogou que lavar as mãos evitava a transmissão da febre
puerperal de umas parturientes para outras
Agostino Bassi (1835) demonstrou que a doença do bicho-da-seda era causada por um fungo
Postulados de Koch
Limitações aos Postulados de Koch:
Nem sempre é possível isolar os microrganismos agentes
da doença porque: Há microrganismos não cultiváveis em
meios de cultura em laboratório
Exºs: Treponema pallidum (sífilis)
Mycobacterium leprae (lepra)
Há microrganismos em que não se conhece outro
hospedeiro susceptível a não ser o Homem
Exºs: vírus da hepatite C
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Vacinas
Edward Jenner (1796) inoculou uma pessoa com o
vírus da varíola. A pessoa ficou vacinada e protegida
contra o vírus
Processo denominado vacinação da palavra vaca
A protecção é denominada imunidade
Louis Pasteur (1881) desenvolveu vacinas contra a cólera das galinhas, o
carbúnculo e a raiva
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA PRÁTICA
1-NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL UTILIZADO
Manual das aulas práticas de Microbiologia
1-NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
- Lavar as mãos com água e sabão
-Ligar a camâra de fluxo laminar 15 min antes de iniciar o trabalho
- Limpar a área de trabalho com álcool (70%)
- Manter o bico de Bunsen aceso sempre que se esteja a transferir culturas
- Manter as placas e os frascos abertos por pouco tempo
- Não passar o braço ou a mão sobre a área de trabalho
- Não conversar
- Desligar o bico de Bunsen ao terminar, identificar os frascos, limpar e desligar a camâra de
fluxo laminar
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Microscópio- amplifica e ilumina objectos tal como bactérias e outros microrganismos que de
outro modo seriam invisíveis;
Autoclave- equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em
Microbiologia, por vapor de água sob pressão;
Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas
máximas até 180-200°C; para incubações, 5°C acima da temperatura ambiente, com
temperaturas máximas de 70-100°C;
Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos;
Jarra de anaerobiose- câmara que permite remover o oxigénio do ar, substituindo-o por outro gás,
para crescimento de microrganismos anaeróbios;
Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura sólidos
(Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos;
Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios líquidos e sólidos;
Tubos Durham- tubos de vidro de dimensões reduzidas utilizados para o aprisionamento do gás
produzido pelos microrganismos, em meios líquidos;
Pipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, etc. Devem ter um tampão de
algodão na extremidade superior;
Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem volumes
muito reduzidos;
Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio;
Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem
de microrganismos totais numa suspensão;
Ansas e agulhas – instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizável à chama antes
e após utilização, usado para transferir culturas de microrganismos;
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Para além deste material, há outro tipo de equipamento que é necessário ter num laboratório de
Microbiologia nomeadamente – frigorífico, balança, aparelho de destilação e desionização de água,
banho-maria, centrífuga, agitadores magnéticos, filtros de esterilização.
O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente
A bancada de trabalho - convenientemente desinfectada com álcool a 70% antes e após utilização;
Todo o material contaminado tem que ser esterilizado por autoclave (121°C durante 20-25 min.) antes da
lavagem ou antes de ser descartado , incluindo o plástico descartável.
As lâminas e lamelas utilizadas nas observações ao microscópio são colocadas numa solução com
detergente
LAVAGEM E DESINFECÇÃO DE MATERIAL
Pipetas – máquina automática de lavagem de pipetas. Algumas são ligadas directamente a pontos de água
quente e fria. Depois de secas, coloca-se um rolhão de algodão na extremidade superior (apesar de não se
pipetar com a boca) são embrulhadas e esterilizadas como o restante material de vidro
Fluxograma de lavagem de material de vidro:
enxaguamento;
detergente;
enxaguamento várias vezes, no final com água destilada
Secagem em estufa, embrulhar em papel, esterilizar
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Meios de cultura e material de laboratório
http://www.netpath.net/~billbsr/Page26.htm
http://www.frilabo.pt/fcms/images/stories/Imagem1.jpg
MEIOS DE CULTURA
Meio de cultura - solução de nutrientes indispensáveis à biosíntese de material
celular e à obtenção de energia, com composição variável com as exigências
nutricionais de cada espécie
Os meios de cultura podem ser líquidos (caldo), semi-sólidos ou sólidos (1,5 a 2% de
Agar).
Para além de nutrientes é igualmente necessário que as condições de oxigénio
(presença ou ausência), pH e pressão osmótica sejam adequadas ao crescimento
desses microrganismos.
PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
•Formulações em pó - pré-misturas às quais apenas se adiciona água pura e estéril
• Soluções stock: soluções concentradas (10x, 50x, 100x) dos produtos químicos, preparadas no laboratório:
• produto isolado
• mistura de produtos
• meio de cultura completo
Objectivos:
- facilitar o trabalho
- evitar erros de pesagem dos produtos
- dissolver sais em água pura e estéril
- Verificar a solubilidade dos ingredientes (alguns têm que ser dissolvidos em água pura e estéril
com KOH outros com HCl)
•Meios já preparados:
Economia de tempo, …….
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•Após pesagem rigorosa de todos os ingredientes, acertar o pH antes da esterilização
Tampas: Evitar desidratação, evitar contaminação, permitir
troca gasosas entre o meio de cultura e o ambiente
Algodão
Alumínio
Plástico
Película aderente
Película de parafina ("parafilm")
Esterilização e assépsia
•Métodos de esterilização
- calor seco (estufa:180°C pelo menos 2 h
- calor húmido (autoclave, 121ºC durante 15 - 20 min)
- filtração esterilizante: produtos termolábeis
Meios de cultura
- Autoclave: calor húmido (121°C durante 15 - 20 min)
- Filtração esterilizante por membranas de acetato de celulose (0,22 µ m)
Esterilização de tubos, caixas e outro material de vidro
calor seco (estufa:180°C) pelo menos 2 h
calor húmido (autoclave) seguida de secagem em estufa
Esterilização - autoclave
Modelos de autoclaves
Funcionamento
Acessórios
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Esterilização por filtração
Funil
Membrana
Mola de suporte
Vácuo
Kitassato
Processo de transferência da membrana, do suporte para a caixa de
Petri com o meio de cultura apropriado
Distribuição dos meios de cultura
- antes da esterilização: frascos e tubos de ensaio
- após esterilização : caixas de Petri (placas de Petri)
• Armazenamento dos meios de cultura
-À temperatura ambiente: 2 semanas
evaporação
degradação de componentes
contaminação
- No frigorífico: 4- 8°C
- Congelador: meios líquidos/soluções stock)
Técnicas de assépsia
Flamejar o semeador, deixar arrefecer antes de
espalhar a cultura na placa
Contagens de microrganismos
http://ohs.uvic.ca/biosafety/biosafetycabinets.html
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Técnicas de assépsia
Sementeira e transferência de microrganismos
Técnica de sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento
e obtenção de cultura pura
• Procedimento
Gota de cultura
Flamejar e arrefecer
S&S
TÉCNICA DE ASSÉPSIA
℃
Inverter a placa e incubar durante 24h a 37
Cultura pura - A pure culture may originate from a
single cell or single organism
Metallic green E. coli on EMB agar
science.kukuchew.com/tag/streaking/
Myrothecium roridum
Cultura de Bacillus anthracis
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Trabalho prático 1
Diversidade e Ubiquidade dos Microrganismos
Os microrganismos existem no ar, na água e principalmente no solo. Do solo podem ser
arrastados pelo vento através das partículas de poeira. Desenvolvem-se logo que as
condições ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favoráveis à sua
sobrevivência e crescimento. Cada organismo aparece pelo menos num habitat natural
específico no qual pode ser normalmente encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado.
Objectivos:
Comprovar a diversidade e ubiquidade dos microrganismos
Material necessário
-Placas de Petri com meio de Agar nutritivo
-Pipetas
-Estufa
-Zaragatoas
Trabalho prático 1
Procedimento experimental
2.1- Pesquisa de microrganismos do ar
Retirar a tampa de várias placas de Petri com Agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15
minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante
3 dias.
2.2- Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas
Passar um cotonete estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua desinfecção
com álcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfície do meio de cultura.
Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias.
2.3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes
Passar um cotonete estéril entre os dedos, antes e após a lavagem das mãos. Passar o cotonete
sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data.
Incubar as placas a 37°C durante 3 dias.
Trabalho prático 1
2.4- Pesquisa de microrganismos do solo
Pipetar 100ul da solução de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura. Espalhar
a solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. Identificar a placa com o nome do
operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias.
Análise de Resultados:
-Examinar as placas e contar o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em
cada placa;
-Descrever o tipo de colónias;
-Registar os resultados.
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Aspecto das colónias
Características das colónias
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