Hibridación de sondas de DNA LIVe en cortes de tejidos

 Hibridación de sondas de DNA LIVe en cortes de
tejidos preservados en parafina
 Utilization protocol for LIVe DNA probes on
paraffin-embedded tissue sections
 Hibridação con Sondas LIVe para cortes de
tecidos preservados em parafina
1
PROTOCOLO DE UTILIZACIÓN
Hibridación para cortes de tejidos preservados en
parafina
Materiales Provistos:
 ADN marcado con moléculas fluorescentes (sonda).
 Buffer de Hibridación
 Reactivos para preparar solución de montaje (Antifade y DAPI)
 Sales para preparar 80ml de Buffer de Desparafinado*
 Sales para preparar 80ml de Buffer de Pretratamiento*
*ver protocolos de preparación mas abajo.
Materiales extras requeridos:
 2XSSC*
 Soluciones de etanol 70, 90 y 100%
 Acido clorhídrico 0.2N
 Agua destilada
 Pepsina 0.5%*
 Detergente no-iónico
 pH-metro o papel para medir pH
 Cubreobjetos
 Soluciones de enjuague (1 y 2)*
 Cemento de contacto removible
 Tubos 0,2 o 0,5ml
 Recipientes para enjuagues (Coplin)
 Aceite de inmersión
 Cámara húmeda
 Termómetro
*ver protocolos de preparación mas abajo.
Equipamientos requeridos:
 Microscopio
de
fluorescencia:
No
siempre
un
microscopio
utilizado en reacciones de inmunohistoquímica u otro tipo de
análisis con fluorescencia resulta adecuado. Los requerimientos
para observar correctamente una reacción de FISH son los
siguientes:
o Fuente de Excitación: Se recomienda una lámpara de
mercurio de 100 Watt con una vida útil de 200horas. Es
necesario que una vez colocada, la lámpara sea alineada
correctamente.
o Objetivos: Para la ubicación del blanco (interfases o
metafases) se recomiendan objetivos de 10, 20 y/o 40X.
Para el análisis de la reacción es necesario un objetivo
de inmersión especial para fluorescencia con una apertura
numérica ≥0,75.
o Filtros de excitación-emisión: Cada fluorocromo observado
requerirá de diferentes filtros. Los requerimientos para
nuestras sondas se muestran en el cuadro a continuación:
Fluorocromo
Verde
Rojo
DAPI
Excitación (nm)
501
550
350
2
Emisión (nm)
523
570
470







Micropipetas (1-10µl o similar)
Microcentrífuga
Vórtex
Timer
Baño de inmersión
Incubadora 37ºC)
Placa termostática o hibridizador
Preparación de soluciones extras:
Buffer de Deparafinado
Agregar las sales provistas en el tubo rotulado “Buffer de
Desparafinado” a 70ml de H2O ultrapura.
Agregar de 400ul de detergente no iónico (NP40, Tween o similar)
Llevar a pH 8 con HCl.
Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura.
 Luego de preparado mantener en heladera a 4ºC
Buffer de Pretratamiento:
Agregar las sales provistas en el tubo rotulado “Buffer de
Pretratamiento” a 50ml de H2O ultrapura.
Llevar a pH 8.5 con HCl.
Completar hasta volumen final (80ml) con H2O ultrapura.
 Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC
Pepsina
Solución Stock: 10% [0.1g/ml]
Diluir 0.1g de pepsina en 1ml de Agua Ultrapura
(Importante el pH debe ser = 2)
 Luego de preparado guardar a -20ºC
Solución de trabajo: 0.05% [0.5mg/ml]
Pepsina solución Stock:
0.4ml
HCl 12N (fumante):
0.66ml
H2O destilada:
79ml
(Importante el pH final debe ser = 2)
 Luego de utilizar, guardar a 4ºC hasta 30 días o 4 usos.
2XSSC:
Cloruro de Sodio (NaCl)
300mM
Citrato de Sodio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM
Ajustar a pH:7 con Acido clorhídrico (HCl) 1N
 Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC
Enjuagues 1 y 2:
En un coplin adecuado para 80ml, agregar 80ml de 2XSSC y 0,080ml
de detergente no-iónico.
 Luego de preparado, mantener en heladera a 4ºC
3
Precauciones y advertencias (Leer atentamente):
 Reactivo analítico. Para uso en investigación solamente. Este
producto NO está probado para uso diagnóstico o terapéutico.
 Las reacciones así como la interpretación de las mismas deben
ser realizadas por personal idóneo debidamente entrenado.
 Todas las muestras biológicas deberían ser tratadas como
posibles transmisores de agentes infecciosos.
 Se debe evitar la exposición de la muestra a ácidos o bases en
alta concentración así como también al calor extremo. Estos
factores dañan el DNA y pueden causar el fallo de la reacción de
FISH.
 Una vez extraída la alícuota a utilizar, la sonda debe ser
guardada nuevamente a -20ºC.
 La falla u omisión de cualquiera de los pasos del protocolo
detallado más abajo puede generar resultados erróneos o
inaceptables.
 Las soluciones de enjuague pos-hibridación (ver protocolo) deben
ser renovadas periódicamente debido a que son propensas de
contaminación.
 El buffer de hibridación contiene formamida, un teratógeno, por
lo que debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas.
 Se recomienda el uso de guantes y chaqueta de trabajo durante
todo el proceso.
 Es necesario controlar siempre la temperatura de las soluciones
que se utilizan calientes.
 Todos los materiales peligrosos deben ser descartados de acuerdo
a las normativas de su institución.
4
Protocolo de utilización
Desparafinado:
Pasos previos
 Preparar 1 recipiente (coplin) con Buffer de Desparafinado.
Por lo menos 30 minutos antes de comenzar el proceso de
desparafinado, colocar en un baño termostático a 90ºC.




(Opcional) Incubar los preparados conteniendo los cortes de
tejido a 58ºC durante 30 minutos.
Sumergir los vidrios en Buffer de Desparafinado a 90ºC
durante 20-45 minutos.
Enjuagar 2 veces en Etanol 100% 3 minutos cada vez.
Dejar secar
Pretratamiento:
Pasos previos
 Preparar un recipiente (coplin) con Buffer de Pretratamiento.
Colocar en un baño termostático a 71ºC. Antes de utilizar
corroborar que la temperatura interna de la solución sea de
71ºC (±1ºC)
 Preparar un recipiente (coplin) con Solución de trabajo de
Pepsina en un baño termostático a 37ºC. Antes de utilizar
corroborar que la temperatura interna de la solución sea de
37ºC (±1ºC)



Sumergir 20 minutos los preparados en HCl 0.2N a temperatura
ambiente.
Enjuagar en Agua destilada 3 minutos 2 veces.
Sumergir los preparados en el Buffer de Pretratamiento a 71ºC
durante 30 minutos.

Sumergir los vidrios
minutos en cada uno.


Enjuagar brevemente en agua destilada.

Enjuagar la pepsina sumergiendo los preparados en 2 baches
sucesivos de H2O, 3 minutos en cada uno.
Deshidratar en Etanol 70, 90 y 100% 2 minutos en cada uno.
Dejar secar completamente.


en
2
baches
sucesivos
de
2XSSC,
5
Sumergir los preparados en la solución de Pepsina durante 7 a
15 minutos.
Co-desnaturalización:
Preparación de la sonda:
 Descongelar la sonda, homogeneizar en Vórtex
 Centrifugar brevemente
 Atemperar el buffer de hibridación
 En un tubo de PCR agregar:
7µl de Buffer de hibridación
1µl de sonda
 Homogeneizar en Vórtex
 Centrifugar brevemente
5
Co-desnaturalización:
 Sobre el reverso del portaobjetos marcar la región a hibridar
(los 8µl preparados hibridan una región aproximada de
22x22mm).
 Agregar la solución de sonda sobre la región marcada
 Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado
 Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de contacto
removible



Colocar el portaobjetos así montado sobre una superficie
caliente (hibridizador, plancha termostática, etc.). En
ocasiones es conveniente colocar una gota de agua sobre la
placa calefactora y luego colocar sobre ésta el portaobjetos
montado, de esta forma se logra una película de agua entre el
portaobjetos
y
la
superficie
caliente
optimizando
la
transferencia de temperatura.
Calentar a 71ºC durante 8 a 15 minutos.
Colocar en cámara húmeda, incubar a 37ºC toda la noche.
Revelado
Pasos previos
 Por lo menos 30 minutos antes, calentar la solución de enjuague
1 a 71ºC (±1ºC) corroborando con un termómetro calibrado la
temperatura dentro del recipiente.
 Atemperar la solución de enjuague 2 a temperatura ambiente.
 Atemperar la solución de contracolorante previamente preparada
(ver protocolo adjunto) a temperatura ambiente.
Enjuague del exceso de sonda
 Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda.
 Quitar cuidadosamente el cemento de contacto.
 Sumergir el portaobjetos en una solución de 2XSSC a temperatura
ambiente hasta que el cubreobjetos se desprenda (2 a 5 minutos).
 Sumergir el portaobjetos en el enjuague 1 durante 2 minutos
exactamente.
 Sumergir el portaobjetos en el enjuague 2 un mínimo de 1 minuto.
 Drenar el exceso de líquido.
 Deshidratar en etanol 70, 90, 100% 1 minuto en cada uno.
 Dejar secar completamente
 Colocar sobre la región hibridada una gota (aprox. 10µl) de
contracolorante.
 Agregar un cubreobjetos de tamaño mayor a la región hibridada.
 Drenar el exceso de contracolorante presionando suave y
uniformemente con papel absorbente.
 Eliminar posibles burbujas de aire presionando suavemente con la
punta de un tip.
 La reacción está lista para ser analizada.
6
Protocolo Resumido:
Paso
Tiempo
Desparafinado
(Opcional) Incubación a 58ºC Mínimo 30’
Buffer Desparafinado 90º
20-45’
Etanol 100% x2
3’
Dejar secar
///
Pretratamiento
HCl 0.2N
20’
H2O
3’
Buffer Pretratamiento 71ºC
30’
2xSSC x2
5’
Enjuagar brevemente en agua
///
Pepsina 37ºC
7-15’
H2O X2
3’
Etanol 70, 90, 100%
2’
Dejar secar
///
Codesnaturalización-Hibridación
Co-desnat 71ºC
8-15’
Hibridación 37ºC
Aprox. 18hs
Revelado
Enjuague 1 71ºC
2’
Enjuague 2 Tº Amb
Mínimo 1’
Etanol 70, 90, 100%
1’
Dejar secar
///
Montado con Sn. Montaje
///
7
Fluorescent in situ Hybridization Protocol
(to perform on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue
sections)
Materials Provided:
•
•
•
•
•
fluorescently labeled DNA (probe).
Hybridization Buffer
Reagents for mounting solution (antifade and DAPI)#
Reagents to prepare 80ml Dewaxing buffer *
Reagents to prepare 80ml Pretreatment Buffer *
#
see attached protocol
* see preparation instructions below.
Materials required but not provided
 2XSSC*
 Ethanol solutions 70, 90 y 100%
 Hydrocloric Acid 0.2N
 Pepsin 0.5%*
 Non-ionic detergent
 pH-meter or pH indicator papers
 Coverslips
 Wash solutions (1 y 2)*
 Rubber cement
 0,2 or 0,5ml tubes
 Coplin jars
 Moist chamber
 Calibrated thermometer
*see prepatation instructions below.
Equipment Required:
 Fluorescence microscope: Not always a microscope used in
immunohistochemistry reactions or other fluorescent analysis is
appropriate. The requirements to properly observe FISH reactions
are as follows
o Excitation Source: a 100 Watts mercury lamp with a
lifespan of 200 hours is recommended. It is necessary that
once positioned, the lamp is correctly aligned.
o Objectives: To target location (interphases or metaphases)
objectives of 10, 20 and / or 40X are recommended. The
reaction
analysis
requires
a
special
fluorescence
immersion objective with a numerical aperture ≥ 0.75
o Excitation-emission filters: Each fluorochrome require
different filters. The requirements for our probes are
listed in the table below:
Fluorochrome
Green
Excitation(nm)
495
8
Emission (nm)
519
Red
DAPI







550
350
570
470
Microcentrifuge
Microliter pipettor for 1 to 10 μL volumes
Vórtex
Timer
Water bath
Incubator
thermostatic plate or hybridizer
Reagent preparation:
Dewaxing Buffer:
Add the salt provided in the tube labeled "Dewaxing Buffer" to
70 ml of ultrapure H2O. Incorporate 400ul of nonionic detergent
(NP40, Tween or similar)
Adjust to pH 8 with HCl.
Complete to 80ml with ultrapure H2O.
 Store at 4ºC
Pretreatment Buffer:
Add the salt provided in the tube labeled "Pretreatment Buffer"
to 50 ml of ultrapure H2O.
Adjust to pH 8 with HCl.
Complete to 80ml with ultrapure H2O.
 Store at 4ºC
Pepsin:
Stock solution: 10% [0.1g/ml]
Dilute 0.1 g of pepsin in 1 ml of Ultrapure Water (pH:2!!)
o Store at -20 ° C
Working solution: 0.05% [0.5mg/ml]
Pepsin Stock solution:
0.4ml
12N HCl (pure):
0.66ml
Distilled H2O:
79ml
o After use, store at 4 ° C for 30 days or 4 uses.
2XSSC:
Sodium chloride (NaCl)
300mM
Sodium citrate dihydrate (Na 3 C 6 H 5 O 7 )30mM
Adjust pH to 7.0 with drops of Hydrochloric acid (HCl) 1N
Wash solution 1 and 2:
In a coplin suitable for 80ml, add 80ml of 2XSSC and 0.80 ml of
non-ionic detergent.
Adjust pH to 7-7.5
Keep at 4ºC after use. Change after 1 week.
9
Cautions and warnings (Read carefully):








Analytical reagent. For research use only. This product is NOT
tested for diagnostic or therapeutic use.
The reactions and the interpretation of them must be performed
by qualified personnel properly trained.
All biological samples should be treated as potential carriers
of infectious agents.
Avoid exposure of sample to acid or alkali in high concentration
as well as extreme heat. These factors can damage DNA and cause
failure of the FISH reaction.
The failure or omission of any step of the protocol detailed
below can lead to erroneous or unacceptable results.
The hybridization buffer containing formamide, a teratogen and
therefore should avoid contact with skin and mucous membranes.
It is recommended the use of gloves and jacket work throughout
the process.
All hazardous materials should be discarded according to rules
of your institution.
10
Slide pretreatment
Dewaxing:
Previous steps
 Prepare 1 coplin jar with Dewaxing buffer. At least 30
minutes before beginning the process of dewaxing, place in a
water bath at 90° C.




(Optional) Incubate the slides containing the tissue sections
at 58°C for 30 minutes.
Dip slides in Dewaxing buffer at 90°C for 20-45 minutes.
Rinse 2 times in 100% ethanol for 3 minutes.
Allow to dry
Pretreatment:
Previous steps
 Prepare a coplin jar with Pretreatment buffer. Place in a
water bath at 71°C. Before using verify if the internal
temperature of the solution is 71ºC (± 1°C)
 Prepare a coplin jar with Pepsin working solution in a
thermostatic bath at 37°C. Before using verify if the
internal temperature of the solution is 37°C (± 1°C).









Immerse slides in HCl 0.2N at room temperature for 20
minutes.
Rinse in distilled water 3 minutes 2 times.
Immerse slides in the Pretreatment buffer at 71 ° C for 30
minutes.
Immerse in 2XSSC, 2 times, 5 minutes each.
Briefly rinse in distilled water.
Immerse slides in pepsin solution for 7 to 15 minutes.
Rinse the pepsin by immersing in H2O, 2 times, 3 minutes
each.
Ethanol Dehydrate in 70, 90 and 100% 2 minutes each.
Allow to dry completely.
Co-denaturation:
Probe preparation:
 Thaw the probe tube, mix on Vortex
 Centrifuge briefly
 Thaw the hybridization buffer
 In a PCR tube add:
7μl of hybridization buffer
1μl of probe
 Mix in vortex
 Centrifuge briefly
Co-Denaturation:
 On the back of the slide highlight the region to hybridize
(the 8μl prepared cover approximately a region of 22x22mm).
 Add the probe solution on the region to hybridize
 Place a coverslip of appropriate size.
11




Seal the edges with removable contact cement or place a sheet
of Parafilm® that exceeds the size of the coverslip.
Place the mounted slide on a hot surface (hybridizer,
thermostatic plate, etc.). Sometimes it is advisable to place
a drop of water on the hot plate to optimize the temperature
transfer.
Heat to 71°C for 8 to 15 minutes.
Place in a moist chamber and incubate at 37 ° C overnight
Washing:
Previous steps

At least 30 minutes before washing, heat the wash solution 1 to 71°C
(+/-1ºC). With a calibrated thermometer corroborate the temperature
inside the coplin.

Thaw wash solution 2 to room temperature.

Temper the counterstain solution previously prepared (see attached
protocol) at room temperature.













Remove the slide from moist chamber.
Carefully remove the rubber cement or Parafilm® sheet.
Immerse the slide in a 2XSSC solution at room temperature
until the coverslip falls off.
Immerse the slide in the wash solution 1 for exactly 2
minutes.
Immerse the slide in the wash solution 2 for at least 1
minute.
Take off the slide and drain excess liquid.
Ethanol Dehydrate in 70, 90 and 100% 1 minute each.
Allow to dry completely.
Place on a drop of mounting solution on the hybridized region
(aprox. 10µl).
Place a coverslip of appropriate size
Drain excess mounting solution by pressing gently and evenly
with paper towels.
Remove any air bubbles by pressing gently with a tip.
The reaction is ready for analysis
12
Summary protocol:
Step
Time
Dewaxing
(Optional) Incubation at 58ºC Minimum 30’
Dewaxing Buffer 90º
20-45’
Ethanol 100% x2
3’
Allow to dry
///
Pretreatment
HCl 0.2N
20’
H2O
3’
Pretreatment Buffer 71ºC
30’
2xSSC x2
5’
Rinse briefly in water
///
Pepsin 37ºC
7-15’
H2O X2
3’
Ethanol 70, 90, 100%
2’
Allow to dry
///
Co-denaturation/Hybridization
Co-denaturation 71ºC
8-15’
Hybridization 37ºC
Aprox. 18hs
Washing
Wash solution 1 71ºC
2’
Wash solution 2 Room Tº
Minimum 1’
Ethanol 70, 90, 100%
1’
Allow to dry
///
Mounting
///
13
PROTOCOLO DE UTILIZAÇAO
Hibridação para cortes de tecidos preservados em
parafina
Materiais fornecidos:
 DNA marcado com moléculas fluorescentes (sonda).
 Buffer(tampão) de Hibridação
 Reativos para preparar solução de montagem (Antifade e DAPI)
 Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Desparafinado*
 Sais para preparar 80ml de Buffer(tampão) de Pré-tratamento*
*ver protocolos de preparação abaixo.
Materiais extras necessários:
 2XSSC*
 Soluções de etanol 70, 90 y 100%
 Ácido clorídrico 0.2N
 Água destilada
 Pepsina 0.5%*
 Detergente não-iônico
 pH-metro ou papel para medir pH
 coverslip/lamínula
 Soluções de enxague (1 y 2)*
 Adesivo de contato removível
 Tubos 0,2 o 0,5ml
 Recipientes para enxagues (Coplin)
 Azeite de imersão
 Câmara úmida
 Termômetro
*ver protocolos de preparação abaixo.
Equipamentos requeridos:
 Microscópio
de
fluorescência:
Nem
sempre
um
microscópio
utilizado em reações de imunoistoquímica ou outro tipo de
análise com fluorescência resulta adequado. Os requerimentos
para observar corretamente uma reação de FISH são os seguintes:
o
o
o
Fonte de Excitação: Recomenda-se uma lâmpada de mercúrio
de 100 Watt com vida útil de 200horas. É necessário que
uma vez colocada, a lâmpada seja alinhada corretamente.
Objetivos: Para a localização do alvo (interfases ou
metafases) se recomenda objetivas de 10, 20 y/o 40X. Para
a análise da reação é necessário um objetiva de imersão
especial para fluorescência com una apertura numérica
≥0,75.
Filtros de excitação-emissão Cada fluorocromo observado
precisará de diferentes filtros. Os requerimentos para
nossas sondas podem ser vistas no quadro a continuação:
14
Fluorocromo
Verde
Vermelho
DAPI







Excitação (nm)
501
550
350
Emissão (nm)
523
570
470
Micropipetas (1-10µl ou similar)
Microcentrífuga
Vórtex
Timer
Banho-maria
Incubadora 37ºC)
Placa termostática ou hibridizador
Preparação de soluções extras:
Buffer(tampão) de Deparafinado
Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado “Buffer de
Desparafinado” a 70ml de H2O ultra pura.
Adicionar 400ul de detergente não iônico (NP40, Tween ou
similar)
Levar o pH a 8 com HCl.
Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura.
 Depois de preparado manter na geladeira a 4ºC
Buffer(tampão) de Pré tratamento:
Adicionar as sais fornecidas no tubo rotulado “Buffer de Pretratamento” a 70ml de H2O ultra pura.
Levar o pH 8.5 com HCl.
Completar até volume final (80ml) com H2O ultra pura.
 Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC
Pepsina
Solução estoque: 10% [0.1g/ml]
Diluir 0,1 g de pepsina em 1 ml de água ultrapura
(Note-se a pH deve ser = 2)
• Após a preparação armazenar a -20 ° C
Solução de trabalho: 0,05% [0.5mg/ml]
Pepsina solução stock: 0,4 ml
HCl 12N (puro): 0.66ml
H2O destilada: 79ml
(Observe o pH final deve ser = 2)
• Após a utilização, armazenar a 4 ° C durante 30 dias ou 4
utilizações.
2XSSC:
Cloreto de Sódio (NaCl)
300mM
Citrato de Sódio (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 30mM
Ajustar o pH a 7 com Ácido clorídrico (HCl) 1N
 Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC
Enxagues 1 e 2:
Em um coplin adequado para 80ml, adicionar 80ml de 2XSSC e
0,080ml de detergente não-iônico.
 Depois de preparado, manter na geladeira a 4ºC
15
Precauções e advertências (Ler com atençao):
 Reagente analítico. Para uso em investigação somente. Este
produto Não está provado para uso diagnóstico ou terapêutico.
 As reações como a interpretação das mesmas devem ser realizadas
por pessoal idôneo devidamente treinado.
 Todas as amostras biológicas deveriam ser tratadas como
possíveis transmissores de agentes infecciosos.
 Deve-se evitar a exposição da amostra a ácidos ou bases em alta
concentração como também ao calor extremo. Estes fatores
danificam o DNA e podem causar a falha da reação de FISH.
 Uma vez extraída a quantidade a ser utilizada, a sonda deve ser
guardada novamente a -20ºC.
 A falha ou omissão de qualquer dos passos do protocolo detalhado
abaixo pode gerar resultados errôneos ou inaceitáveis.
 As soluções de enxague pós-hibridação (ver protocolo) devem ser
renovadas
periodicamente
devido
a
que
são
propensas
de
contaminação.
 O buffer de hibridação contém formamida, um teratógeno, por isso
se deve evitar o contato com a pele e as mucosas.
 Recomenda-se o uso de luvas e avental de trabalho durante todo o
processo.
 É necessário controlar sempre a temperatura das soluções que se
utilizam quentes.
 Todos os materiais perigosos devem ser descartados de acordo com
as normativas da sua instituição.
16
Protocolo de utilização
Desparafinado:
Passos prévios
 Preparar 1 recipientes (coplin) com Buffer (tampão) de
Desparafinado. Pelo menos 30 minutos antes de começar o
processo de desparafinado, em um banho termostático a 90ºC.




(Opcional)Incubar as preparações contendo os cortes de tecido
a 58ºC durante 30 minutos como mínimo.
Mergulhar os vidros no Buffer de Desparafinado a 90ºC durante
20-45 minutos.
Enxaguar 2 vezes em Etanol 100% 3 minutos cada vez.
Deixar secar
Pré-tratamento:
Passos prévios
 Preparar um recipiente (coplin) com Buffer de Pré-tratamento.
Colocar em um banho termostático a 71ºC. Antes de utilizar
conferir que a temperatura interna da solução seja de 71ºC
(±1ºC)
 Preparar um recipiente (coplin) com Pepsina Solução de
trabalho. Colocar em um banho termostático a 37ºC. Antes de
utilizar conferir que a temperatura interna da solução seja
de 37ºC (±1ºC)



Mergulhar 20 minutos as preparações em HCl 0.2N a temperatura
ambiente.
Enxaguar em Água destilada 3 minutos 2 vezes.
Mergulhar as preparações no Buffer(tampão) de Pré-tratamento
a 71ºC durante 60 minutos.

Mergulhar os vidros
minutos em cada um.

Enxaguar em Água destilada brevemente.
Mergulhar as preparações em Pepsina solução de trabalho a
37ºC durante 7 a 15 minutos.




em
2
espaços
sucessivos
de
2XSSC,
5
Enxaguar a pepsina mergulhando as preparações em 2 espaço
sucessivos de H2O destilada, 3 minutos em cada um.
Desidratar em Etanol 70, 90 e 100% 2 minutos em cada um.
Deixar secar completamente.
Co-desnaturalização:
Preparação da sonda:
 Descongelar a sonda, homogeneizar em Vórtex
 Centrifugar rapidamente
 Descongele o buffer(tampão) hibridização
 Em um tubo de PCR adicionar:
7µl de Buffer de hibridação
1µl de sonda
 Homogeneizar em Vórtex
 Centrifugar rapidamente
17
Co-desnaturalização:
 Na parte de trás da lâmina marcar a região a hibridar (os 8µl
preparados hibridam uma região aproximada de 22x22mm).
 Adicionar a solução de sonda sobre a região marcada
 Colocar um coverslip/lamínula de tamanho adequado
 Selar as bordas do coverslip/lamínula com adesivo de contato
removível



Colocar a lâmina montada sobre uma superfície quente
(hibridizador, prancha termostática, etc.). Em ocasiões é
conveniente colocar uma gota de água sobre a chapa aquecedora
e depois colocar sobre esta a lâmina montada, desta forma se
consegue uma película de água entre a lâmina e a superfície
quente melhorando a transferência de temperatura.
Esquentar a 71ºC durante 5-15 minutos.
Colocar em câmara úmida, incubar a 37ºC toda a noite.
Revelado
Passos prévios
 Pelo menos 30 minutos antes, aquecer a solução de enxague 1 a
71ºC (±1ºC) conferindo com um termômetro calibrado a temperatura
dentro do recipiente.
 Moderar a solução de enxague 2 a temperatura ambiente.
 Moderar a solução de contra-corante previamente preparada (ver
protocolo em anexo) à temperatura ambiente.
Enxague do excesso da sonda
 Extrair a lâmina da câmara úmida.
 Tirar cuidadosamente o adesivo de contato.
 Mergulhar a lâmina em uma solução de 2XSSC a temperatura
ambiente até que o coverslip/lamínula se solte (2 a 5 minutos).
 Mergulhar a lâmina no enxague 1 durante 2 minutos exatamente.
 Mergulhar a lâmina no enxague 2 um mínimo de 1 minuto.
 Drenar o excesso de líquido.
 Desidratar em etanol 70, 90 e 100% 2 minutos cada um.
 Esperar que seque completamente.
 Colocar sobre a região hibridada uma gota (aprox. 10µl) de
contra colorante.
 Adicionar um coverslip/lamínula de um tamanho maior que a região
hibridada.
 Drenar o excesso de contra colorante pressionando suave e
uniformemente com papel absorvente.
 Eliminar possíveis bolhas de ar pressionando suavemente com a
ponta de um clips.
 A reação está pronta para ser analisada.
18
Protocolo Resumido:
Passo
Tempo
Desparafinado
(Opcional)Incubação a 58ºC
Mínimo 30’
Buffer(tampão) Desparafinado 90º
20-45’
Etanol 100% x2
3’
Deixar secar
///
Pré-tratamento
HCl 0.2N
20’
H2O x2
3’
Buffer(tampão) Pré-tratamento 71ºC
30’
2xSSC x2
5’
H2O brevemente
///
Pepsina 37ºC
7-15’
H2O X2
3’
Etanol 70, 90, 100%
2’
Deixar secar
///
Co-desnaturalização-Hibridação
Co-desnat 71ºC
8-15’
Hibridação 37ºC
Aprox. 18hs
Revelado
Enxague 1 71ºC
2’
Enxague 2 Tº Amb
Mínimo 1’
Etanol 70, 90, 100%
1’
Deixar secar
///
Montado com Sn. Montagem
///
19