SOROLOGIA DAS RIQUETSIOSES Positivo Negativo

XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004.
SOROLOGIA DAS RIQUETSIOSES
Simone Berger Calic
Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG.
[email protected]
As doenças causadas por rickettsias têm uma ampla distribuição mundial, com focos endêmicos e alguns surtos epidêmicos,
estando associadas a artrópodes como vetores (carrapatos, pulgas e
piolhos e ácaros). As rickettsioses constituem um grupo de doenças
causadas por bactérias dos gêneros Rickettsia, Coxiella, Bartonella
(Rochalimaea pela nomenclatura anterior) e Ehrlichia, da família
Rickettsiaceae e ordem Rickettsiales, uma taxonomia de microorganismos gram-negativos intracelulares obrigatórios. O Homem é um
hospedeiro acidental e um elo terminal no ciclo destas bactérias.
O gênero Rickettsia é dividido em dois grupos: o grupo do
tifo, que inclui três espécies (Rickettsia prowazekii, o agente do tifo
epidêmico, a Rickettsia typhi agente causal do tifo murino, e a Rickettsia canada, isolada somente de carrapatos), e o grupo das febres
maculosas, que inclui hoje um grande número de sorotipos.
Recentemente a R. felis, cujo vetor é a pulga, foi implicada em casos de doença humana, através de métodos sorológicos, e
detectadas por biologia molecular neste artrópode e em carrapatos.
Pela análise filogenética esta rickettsia está incluída no biogrupo das
febres maculosas e ainda não foi isolada de humanos.
No Brasil temos o relato de casos de tifo murino em Minas Gerais e São Paulo, e de FMB, nos Estados de Minas Gerais, São
Paulo, Rio de Janeiro e Espírito Santo, e recentemente Santa Catarina. A patologia até pouco tempo reconhecida como rickettsiose em
humanos, era a FMB, tendo como agente etiológico a Rickettsia ricketsii.
Recentemente foram relatados casos de Rickettsia bellii, da R. Felis e de
Ehrlichiose Monocítica Humana (HME), aumentando o números riquetsioses relatadas no Brasil.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Desde que foi descoberta a reação de aglutinação dos soros
de pacientes com tifo epidémico com cepas de Proteus sp. por Weil e
Felix em 1921, até a recomendação da OMS da utilização do teste de
imunofluorescência indirecta com antigénios específicos em198719, o
diagnóstico
labora-
torial das rickettsioses tem por base provas sorológicas.
Teste de Weil e Felix: esta prova é de fácil execução e
baixo custo. A reação detecta os anticorpos aglutinantes no soro do
doente que reagem com diferentes cepas ou espécies de Proteus.
Cada espécie tem epitopos antigénicos semelhantes aos lipopolissacarídeos das membranas das rickettsias dos diferentes grupos. As
aglutininas, que são detectáveis de 5 a 10 dias após o início dos
sintomas, são as imunoglobulinas M. As rickettsias do grupo tifo têm
semelhanças com Proteus OX2, as rickettsias do grupo das febres
exantemáticas, com exceção de Rickettsia akari, são semelhantes a Proteus OX19. Os doentes com Brill-Zinsser por não produzirem IgM já não
são diagnosticados por este método. Muitas reações cruzadas estão descritas devido ao antígeno não ser específico, especialmente em soros de
pacientes que já tiveram algumas infecções por Proteus e com outras αproteobactérias com epitopos antigénicos semelhantes, casos da Legionella spp e Brucella spp. Devido a baixa sensibilidade e por não ser
um teste que utiliza antígenos específico para as riquetsioses não é
recomendado como diagnóstico.
A Fundação Ezequiel Dias (FUNED) de agosto de 1993 a
outubro de 1995 recebeu 671 amostras de soro humano, provenientes
de várias localidades de Minas Gerais, com suspeita clínica de FMB.
Estes soros foram testados para avaliar a eficiência do teste de Weil
Felix (WF) para triagem em FMB, frente a testes mais sensíveis e
específicos como a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o
ensaio imunoenzimático (EIE). A comprovação da eficiência do teste
de WF como triagem para febre maculosa, o que possibilitaria a
descentralização da técnica, uma vez que é de fácil execução e de
custo mais baixo, ficando a função comprobatória do diagnóstico
para a FUNED. Os resultados obtidos indicaram altos índices de
especificidade variando de 85% a 96%, e relativa sensibilidade 50%
e 59%. A análise estatística revelou resultado de qui-quadrado superiores ao valor crítico adotado de 10,38 (p<0,001) demonstrando que
há associação entre os testes tanto quando comparados com o EIE,
quanto com a RIFI. Estes resultados sugerem que o teste de WF seja
útil para triagem em FMB.
Positivo
700
617
Negativo
604
600
548
500
400
300
200
100
123
67
54
0
RIFI
OX2
OX19
Gráfico 1.Resultado dos testes de RIFI e WF, OX2 e OX19 em soros humanos enviados para diagnóstico de febre maculosa em Minas Gerais,
1995.
Imunofluorescência Indireta: esta prova é a recomendada pela OMS como a prova padrão a ser utilizado para o diagnóstico
das rickettsioses, utilizando como antígeno a espécie de rickettsia a
diagnosticar18. A detecção de IgM é uma forte evidência de uma
rickettsiose ativa, embora o diagnóstico possa ser obscurecido pelo
fenômeno de prozona, sendo afetada pelo fator reumatóide e pela
existência de auto-anticorpos. Além disso, existem reações cruzadas
entre os biogrupos tifo e febres exantemáticas. Os anticorpos IgG,
detectados cerca de uma semana após o início da doença, são específicos dentro do biogrupo e perduram até por quatro anos20 . Alguns
autores demonstram há influência da antibioticoterapia específica ou
não para rickettsioses nos resultados. Originando títulos de anticorpos baixos ou mesmo não detectáveis nas diluições utilizadas como
limiar de positividade, originando falsos negativos.
Esta prova não permite a identificação da espécie do agente dentro
Rev. Bras. Parasitol.Vet., v.13, suplemento 1, 2004
185
XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004.
do grupo tifo e das febres exantemáticas. O diagnóstico continua a
ser baseada em fatores epidemiológicos tais como seja a área geográfica, a época do ano e os vetores presentes.
Outras provas sorológicas
Muitos exames sorológicos foram aplicados para o diagnóstico de rickettsioses, sem que se tenham imposto como provas de
fácil reprodução.
Como exemplo cita-se as provas de aglutinação, ELISA e
de Western-blot. Todas necessitam durante a preparação do antígeno
de separar as rickettsias das células hospedeiras, recorrendo ao uso
de métodos de trabalho que muitas vezes alteram a antigenicidade do
microrganismo.
Segundo JONES et al (1993), o teste de EIE para detecção
de riquetsioses foi desenvolvido como um método alternativo à RIFI,
sendo mais rápido, menos complicado e mais objetivo. A mesma
reação cruzada encontrada na imunofluorescência era observada no
EIE, mas observou-se que a eliminação da proteina riquetsial e o uso
de lipopolissacarídeos remanescentes como antígeno poderia eliminar o problema.
O Western-blot é considerado mais sensível do que a imunofluorescência indireta, pois detecta anticorpos IgM mais cedo.
Teoricamente é mais específico, sendo aconselhado sua utilização em
inquéritos epidemiológicos, para eventualmente esclarecer qual o
verdadeiro agente envolvido na infecção. Apenas a quantidade e
pureza de antígeno que são necessários impedem que seja utilizado
mais frequentemente (Scola & Raoult,1997).
Testes que tem sido utilizados para diagnóstico de RMSF
em cães incluem o WF, FC, RIFI, HA, LA e o MA.
FISHBEIN (1992) cita que o WF não deve ser utilizado
por apresentar baixa sensibilidade e especificidade, citando ainda a
RIFI como teste mais sensível e específico, e o EIE como satisfatório.
GREENE,(1993) cita que a relativa alta sensibilidade
(58%) e especificidade (83%) do LA pode ter valor como teste de
triagem para diagnóstico de RMSF em cães.
O laboratório de saúde pública tem desenvolvido a vigilância laboratorial, e tem gerado informações imprescindíveis para a
tomada de decisões por parte das vigilâncias epidemiológicas.
Por serem locais de confirmação diagnóstica, constituem
recursos valiosos na área da investigação epidemiológica principalmente nos casos diagnóstico diferencial em patologias cuja sintomatologia podem se confundir, principalmente as de curso rápido e com
alto índice de mortalidade.
Na nova lógica do laboratório de saúde pública, os mesmo
não se atem somente as análises solicitadas, estando constantemente
em busca das indefinições diagnósticas. O envolvimento do profissional do laboratório no âmbito epidemilógico, quer sendo através de
busca de dados nas fichas de investigação que acompanham o material biológico a ser analisado, quer sendo em trabalhos de campo, em
treinamentos de pessoal, em pesquisas, tem se mostrado fundamental
nos planejamentos e ações de controle das doenças infecciosas.
O Instituto Octávio Magalhães/IOM da Fundação Ezequiel Dias -FUNED, do Estado de Minas Gerais, é o Laboratório Central
- LACEM de referência no Estado MG, de referência regional ES e
BA na área para doenças riquetsiais, e sempre teve a preocupação de
elucidar os casos recebidos para confirmação diagnóstica laboratorial, tendo como principio, o diagnóstico diferencial das patologias em
que a suspeita inicial não era confirmada, tramitando no laboratório
todas as possibilidades de conclusão diagnóstica. Realiza exames
laboratoriais sorológicos em pacientes com suspeita clínica de FMB,
provenientes de várias localidades do Estado, aliadas a ocorrência de
surtos epidêmicos. Realiza também pesquisas de isolamento e identificação de microorganismos através da biologia molecular como
ferramenta epidemilógica, abrindo um novo campo a epidemiologia
molecular. Possui importantes parcerias com Instituições internacionais como o CEVDI-Portugal.
No período entre 1995 a 2003, 2223 amostras de soros
humanos provenientes do Estado de Minas Gerais com suspeita
clínica de FMB foram analisadas pela RIFI na FUNED sendo confirmados 112 casos.
Casos positivos e óbitos por Febre Maculosa de casos clínicos suspeitos recebidos
para confirmação laboratorial pela Funed no período de 1995 a 2003- Minas Gerais
Nº Amostras Amostras
Ano
Positivas
%
Óbitos
%
1995
121
9
7,4
2
20
1996
92
8
8,7
1
12,,5
1997
166
22
13,2
1
4,8
1998
116
9
8,4
1
11
1999
288
14
4,8
0
0
2000
524
20
3,8
1
5,0
2001
375
11
2,9
1
9,0
2002
179
10
5,5
0
0
2003
362
09
2,5
1
11,0
TOTAL
2223
112
5,0
8
7,1
Foram enviados pelo Estado do Espírito Santo, casos suspeitos de FMB para análise laboratorial na FUNED.114 casos suspeitos no ano de
2000 e 19 casos suspeitos no ano 2003.
Casos positivos e óbitos por Febre Maculosa de casos clínico suspeitos recebidos
para confirmação laboratorial pela Funed no ano de 2000 em Espírito Santo
No ano de 2000Ano Nº Amostras Amostras
%
Óbitos
%
Positivas
2000( até 3/11)
114
02
1,76
2003
19
Com a descrição de uma nova Rickettsiose Humana descrita por Walker e colaboradores causada pela Rickettsia felis em
Yucatan-México 1996, passível de ser transmitida pela pulga Ctenocephalides felis, a UFOP e a FUNED optaram por uma reavaliação laboratorial de casos diagnosticados como febre maculosa (FM)
em Minas Gerais. No ano de 2000, ?soros de pacientes com diagnóstico de FM no ano de 1999 foram enviados para a Universidade de
Marselha -França, na época único local no mundo em que é produzido antígeno para detecção de R. felis em reação de imunofluo-
rescência indireta (RIFI). Estes soros foram selecionados a partir de
verificação pelo laboratório da FUNED, de soros com títulos baixos
pela RIFI para FMB, e que permaneciam com aumentos não significativos em amostras recebidas em intervalos de tempo diferentes. 3
amostras apresentaram soroconversão para R. felis com título superior ao apresentado para R. rickettsii ,e somente 1 deles para R.
thyphi. Os soros restantes tiveram soroconversão significativa para
R. rickettsii confirmando o diagnóstico de febre maculosa. Esses
dados demonstram que além da Rickettsia rickettsii e Rickettsia
Rev. Bras. Parasitol.Vet., v.13, suplemento 1, 2004
186
XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária & I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004.
thyphi, anteriormente já descritas no Brasil, temos também a Rickettsia felis circulando em nosso meio.
Os primeiros casos de ehrlichiose monocítica humana
(HME), foram encaminhados para FUNED no ano de 2001, com
suspeita de FMB, oriundos de duas localidades do Estado de Minas
Gerais. Utilizando a RIFI com antígeno específico para de Ehrlichia
chaffeensis foi possível diagnosticar dois casos suspeitos de HME.
Através da análise das fichas epidemiológicas remetidas a FUNED
foram obtidos os dados clínicos. O diagnóstico de HME foi feito nos
dois casos baseando-se nos aspectos clínicos e no diagnóstico sorológico, e no caso número 01 também pelo tratamento específico que
foi eficaz. Devido a possíveis reações sorológica cruzada interespécies, não se pode afirmar tratar-se de Ehrlichia chaffeensis, espécie
utilizada como antígeno ou uma outra Ehrlichia similar. Como no
Brasil não foi até o momento identificada a bactéria, nem em humanos, nem no vetor, há a necessidade de aprofundar os estudos através
de outras técnicas para verificar quais os agentes circulantes em
nosso meio.
A sorologia juntamente com a análise das fichas epidemiológicas torna-se uma ferramenta eficaz no primeiro passo na identificação de novos agentes, reafirmando a importância de pesquisar
novas riquetsioses circulantes em nosso meio.
Para o diagnóstico sorológico, a utilização de cepas isoladas localmente aumenta a especificidade da técnica. Até o momento
não temos produção própria de antígenos, sendo o maior entrave no
diagnóstico sorológico das riquetsioses. O MS está em processo de
implementação de 12 laboratórios de nível de biossegurança 3 (NB3)
no país, e investindo na capacitação dos laboratórios oficias para que
num futuro próximo possamos estar auto-suficientes na produção de
antígenos genuinamente brasileiros.
Apesar de muitas técnicas poderem ser utilizadas no diagnóstico laboratorial de rickettsioses, ainda a técnicas sorológica de
RIFI continua sendo a preconizada, devido a facilidade, aos custos e
tempo. Outras técnicas, como técnicas moleculares, implicam na
utilização de amostras colhidas com os maiores cuidados, além de
fatores deletérios associados à colheita e preservação das amostras, e
as técnicas de isolamento além dos fatores citados acima têm como
agravante o tempo para resposta gira em torno de 15 dias são
determinantes serem utilizadas como pesquisas complementares, na
identificação dos agentes circulantes, sendo instrumento essencial na
prática
da
epidemiologia
molecular.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BACELLAR, F. Rickettsias Isoladas em Portugal- Contribuição para
a identificação e classificação de estirpes. Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia- Universidade de Évora,1996.
CALIC,S.B. Comparação do Teste de Weil Felix com as provas de
Imunofluorêscencia Indireta (RIFI) E Ensaio Imunoenzimático (EIE)
como método de triagem para febre maculosa. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, para obtenção do grau
de Mestre em Medicina Veterinária Preventiva,UFMG-1996.
FISHBEIN, D.B. Rickettsial Infections. Textbook of Intern Med ,
New York, Kelly Willian N. , c.298, p.1462-1466, 1992
FOURNIER, PE, MARRIE TJ, RAOULT, D.- Diagnosis of Q fever.
JCM. 1998;36(7):1823-34.
GALVÃO,M A M, CALIC, S B, CHAMONE, C B ,MAFRA,
C.L.;FILHO, G.C.; OLANO, JUAN,P.O; WALKER, D.;H.. Rickettsiose
do grupo das Febres Maculosas na cidade de Coronel Fabriciano, Estado
de Minas Gerais, Ver.Soc. Med. Trop. .vol.36 nº4 Uberaba July Aug
2003.
GALVÃO, M A M, MAFRA, C , CHAMONE, C B , CALIC,S.B;
ZAVALA-VELASQUEZ,J.E.;WALKER, D.;H..Clinical and Laboratorial evidence of Rickettsia felis infection in latim America ,
GREENE, C.E.; M. AMANDA MARKS; LAPPIN, M.R. et al. Comparison of latex agglutination, indirect immunofluorescent antibody,
and enzyme immunoassay methods for serodiagnosis of Rocky
Mountain Spotted Fever in dogs. Am. J. Vet. Res. , V.54, N.1, P.2028, 1993.
JONES, D. ; ANDERSON, B. ; OLSON, J. ; GREENE, C. Enzimelinked immunosorbent assay for detection of human immunoglobulin
G to lipopolysaccharide of spotted fever group rickettsiae. Journal of
Clinical Microbiology , v.31, n.1, p.138-141, 1993.
SCOLA, B; RAOULT,R -Laboratory diagnosis of rickettsioses:
current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases.
J.C.M 1997,35(11):2715-2727
WEIL, E. ; FELIX, A. Wein. Klin. Wsch. , v.29, p.974, 1916.
ZAVALA-VELAZQUEZ JE, YU X-J, WALKER DH. Unrecognized
spotted fever group riketsiosis masquerading as dengue fever in
Mexico. Am J Trop Med Hyg 1996; 55: 157-59.
Rev. Bras. Parasitol.Vet., v.13, suplemento 1, 2004
187