Avaliação do efeito citotóxico e imunomodulador do - PPGCF

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA, FÍSICOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS IN VITRO DO
EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DE Struthanthus
marginatus Blume (erva-de-passarinho).
Karla Fabiana Pereira Barroso
BELÉM – PARÁ
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA, FÍSICOQUÍMICA E ENSAIOS BIOLÓGICOS IN VITRO DO
EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DE Struthanthus
marginatus Blume (erva-de-passarinho).
Autora: Karla Fabiana Pereira Barroso
Orientador: Prof. Dr. Francisco Martins Teixeira
Co-Orientador: Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito
para obtenção ao título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
BELÉM – PARÁ
2013
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde – UFPA
Barroso, Karla Fabiana Pereira, 1980Caracterização fármaco-gnóstica, físico-química e ensaios biológicos in vitro do extrato bruto e
Fabiana
frações
destruthanthusmarginatusblume
(erva-de-passarinho)/Karla
PereiraBarroso;orientador,Francisco Martins Teixeira, coorientador, Wagner Luiz Ramos Barbosa.—
2013.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde (ICS), Programa
de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2013.
Inclui bibliografias
1. Struthanthusmarginatus. 2. Plantas medicinais. 3.Citotoxicidade. 4. Imunomodulação.5.
Atividade antiinflamatória. I. Título.
CDD 22. ed. 615.321
DEDICATÓRIA
A DEUS por ser meu primeiro alicerce.
A minha mãe, Florene Barroso, pelo apoio incondicional e
motivação que me ajudaram a não olhar para as dificuldades,
mas sim seguir em frente, e por acreditar nas minhas capacidades
em superar os obstáculos.
A minha pequenina filha, Ana Carla, que me deu coragem a
seguir em frente todas as vezes que eu a olhava.
A minha avó Maria Naíde in memorian.
Agradecimentos
A Deus por sua infinita misericórdia e bênção concedida em minha vida.
A minha amada mãe que sempre foi meu braço direito e encorajou-me a
continuar na realização deste trabalho.
A Universidade Federal do Pará – Programa de Pós Graduação em Ciências
Farmacêuticas (PPGCF), pela oportunidade oferecida na realização deste
trabalho.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Francisco Martins Teixeira, pela paciência,
apoio e otimismo na realização desta árdua tarefa e força nos momentos
difíceis.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Wagner Ramos Barbosa, pela orientação
técnica e científica e oportunidade da realização dos processos fitoquímicos no
Laboratório de Fitoquímica.
A Profa. Dra Fani Dolabella pela ajuda ao ceder alguns materiais na realização
dos trabalhos laboratoriais.
Aos colegas e amigos da pós-graduação: Mayara Brito, Bianca, Érika,
Andressa, Adreanne e Myrtis pela amizade, companheirismo e grande ajuda
nos momentos de dificuldade.
Em especial à minha amiga Mayara pela força na técnica do MIC, pelo choro
consolado nos momentos de angústia e Andressa pela ajuda na técnica de
citotoxicidade.
Ao mestre Jailton pela paciência e ajuda na realização dos testes de
fitoquímica.
Aos colegas do Departamento de Química: Haroldo Silva e Ednaldo Andrade
pela ajuda na análise das estruturas químicas.
Aos amigos da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) de Macaé, Vitor
Hugo e Ingrid na realização da técnica de ELISA e pela especial atenção a mim
dada.
Aos amigos Ed Carlos Reis e Régia Cristiane pela colaboração, incentivo e
apoio em seguir em frente na conclusão deste trabalho.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
pelo auxílio financeiro concedido na forma de bolsa para a realização do
trabalho.
Ao estagiário Charles Alberto do Laboratório de Catálise e Oleoquímica do
Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Faculdade de Química, pela valiosa
contribuição na análise térmica.
Aos meus colegas do laboratório de microbiologia da faculdade de Farmácia
(não citei nomes para não cometer injustiça).
E a todos que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
A todos vocês de forma muito especial, muito obrigada!
Para ser sábio é preciso primeiro temer a Deus, o Senhor.
(Pv 9.10)
RESUMO
CARACTERIZAÇÃO FARMACOGNÓSTICA, FÍSICO-QUÍMICA E ENSAIOS
BIOLÓGICOS IN VITRO DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DE
Struthanthus marginatus Blume (erva-de-passarinho).
Estudos demonstram que diversos extratos de plantas medicinais têm
efeitos imunomoduladores e antimicrobianos justificados por seu uso popular.
Diante disso, este trabalho objetiva a caracterização farmacognóstica, físicaquímica e biológica in vitro de Struthanthus marginatus Blume. popularmente
utilizada no tratamento de inflamações. Para tanto, utilizou-se parâmetros de
controle de qualidade físico-químicos descritos na Farmacopéia Brasileira no
desenvolvimento do extrato bruto e frações. A droga vegetal foi classificada
como pó grosso, a perda por dessecação e teor de cinzas apresentaram
valores de 8,7% e 11,6% respectivamente. A análise térmica demonstrou
estabilidade do pó da droga vegetal até 180ºC. Os espectros na região do Infra
Vermelho apresentaram bandas que podem ter características de compostos
fenólicos confirmados pela prospecção fitoquímica. A avaliação da atividade
microbiana foi determinada pelo método da Concentração Inibitória Mínima
(CIM) no qual apresentou atividade bacteriana nas maiores concentrações:
1000 e 500 (µg/mL) contra cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis, Salmonella tiphy, mas não foi capaz de inibir a germinação de esporos
de Trichophyton mentagrophytes e nem de Candida albicans em nenhuma das
concentrações testadas. Nos ensaios de testes in vitro foram utilizadas células
de sangue periférico mononucleares humanas (PBMC) onde se demonstrou
baixa citotoxicidade nas maiores concentrações da droga vegetal e uma
pequena produção de Óxido Nítrico (10µmol/mL) na maior concentração
(1000µg/mL). A produção de TNF-α foi reduzida conforme as concentrações
mais elevadas. Através da análise dos resultados obtidos, pode-se sugerir que
a droga vegetal de S. marginatus Blume possui atividade antiinflamatória,
confirmando dessa forma seu uso popular.
Palavras-Chave: Struthanthus marginatus, Citotoxicidade, Imunomodulação,
Óxido Nítrico, Fator de Necrose Tumoral-α; Ação Antiiflamatória.
ABSTRACT
CHARACTERIZATION PHARMACOGNOSTIC, PHYSICAL AND CHEMICAL
AND BIOLOGICAL ASSAYS IN VITRO AND CRUDE EXTRACT OF
FRACTIONS Struthanthus marginatus Blume (wort-finch).
Studies show that many herbal extracts have antimicrobial and
immunomodulatory effects justified by its popular use. Thus, this study aims to
pharmacognostic characterization, physical-chemical and biological in vitro
Struthanthus
marginatus
Blume.
popularly
used
in
the
treatment
of
inflammation. For this, we used parameters of physico-chemical quality control
described in the Brazilian Pharmacopoeia in the development of the crude
extract and fractions. The plant drug was classified as coarse powder, loss on
drying and ash content showed values of 8.7% and 11.6% respectively.
Thermal analysis demonstrated stability of the plant drug powder to 180 ° C.
The spectra in the region presented Infra Red bands that may be characteristic
of
phenolic
compounds
confirmed
by
phytochemical
screening.
The
assessment of microbial activity was determined by the Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) method in which bacterial activity showed the highest
concentrations: 1000 and 500µg/mL against strains of Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Salmonella tiphy, but was not able to inhibit germination
Trichophyton mentagrophytes spores nor the Candida albicans in any of the
tested concentrations. In tests in vitro tests Mononuclear cells of human
peripheral blood (PBMC) where cytotoxicity was shown at higher concentrations
of the drug and a small plant production of nitric oxide (10µmol/mL) at the
highest concentration (1000µg/mL) were used. The production of TNF-α was
reduced as the higher concentrations. By analyzing the results, it can be
suggested that the plant drug of S. marginatus Blume has anti-inflammatory
activity, thus confirming its popular use.
Keywords:Struthanthus marginatus cytotoxicity, immunomodulation, Nitric
Oxide, Tumor Necrosis Factor-α; Antiiflamatória action.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Distribuição biogeográfica da família Loranthaceae.................
Figura 2 -
Estrutura dos metabólitos especiais isolados da espécie
21
Scurrula atropurpurea................................................................ 22
Figura 3 -
Struthanthus marginatus Blume................................................
26
Figura 4 -
Exsicata de Struthanthus marginatus Blume............................
47
Figura 5 -
Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas
de S. marginatus Blume............................................................
70
Figura 6 -
Curvas TG e DTG do pó das folhas de S. marginatus Blume..
72
Figura 7 -
Curva DSC do pó das folhas de S. marginatus Blume.............
73
Figura 8 -
Espectro na região do IV do Extrato Bruto (EB) liofilizado de
S. marginatus Blume.................................................................
Figura 9 -
Espectro na região do IV da Fração Hexânica (FH) liofilizada
de S. marginatus Blume............................................................
Figura10-
76
77
Espectro na região do IV da Fração Diclorometano (FD)
liofilizada de S. marginatus Blume............................................
78
Figura 11- Espectro na região do IV da Fração de Acetato de Etila (FAE)
79
Figura 12- Espectro na região do IV da Fração Acetona (FAC)
liofilizadas de S. marginatus Blume..........................................
80
Figura 13- Espectro na região do IV da Fração Metanólica (FM)
81
Figura 14- Atividade bactericida e bacteriostática do EB e frações de S.
marginatus Blume frente cepas de E. faecalis..........................
84
marginatus Blume frente cepas de S. aureus...........................
85
marginatus Blume frente cepas de S. tiphy..............................
86
Figura 17- Inibição da produção de NO em células PBMC e RAW 264.7.
do EB de S. marginatus Blume.................................................
Figura 18- Inibição da produção de NO em células PBMC e RAW 264.7
88
da FH de S. marginatus Blume................................................
88
Da FD de S. marginatus Blume................................................
89
Da FAE de S. marginatus Blume..............................................
89
Da FAC de S. marginatus Blume..............................................
90
Da FM de S. marginatus Blume................................................
91
Figura 23- Produção de TNF-α em células de PBMC................................
92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Determinação da perda por dessecação e do teor de cinzas
totais de S. marginatus Blume.................................................. 71
Tabela 2 -
Perfil termogravimétrico (TG) do pó das folhas de S.
marginatus Blume.....................................................................
Tabela 3 -
Entalpia apresentada por S. marginatus Blume através de
Calorimetria exploratória diferencial (DSC)..............................
Tabela 4 -
74
Prospecção fitoquímica do extrato bruto liofilizado de S.
marginatus Blume.....................................................................
Tabela 6 -
73
Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da
tintura de S. marginatus Blume................................................
Tabela 5 -
72
75
Comprimento de onda (nm) e ligações características no
espectro da região do infravermelho (IV) para extrato bruto
(EB) liofilizado de S. marginatus Blume...................................
Tabela 7 -
77
espectro da região do infravermelho (IV) para fração
hexânica (FH) liofilizada de S. marginatus Blume....................
Tabela 8 -
78
espectro da região de infravermelho (IV) para fração
diclorometano (FD) liofilizada de S. marginatus Blume............ 79
Tabela 9 -
espectro da região do infravermelho (IV) para fração acetato
de etila (FAE) liofilizada de S. marginatus Blume..................... 80
Tabela10-
espectro da região de infravermelho (IV) para fração acetona
(FAT) liofilizada de S. marginatus Blume.................................
Tabela11-
81
espectro da região de infravermelho (IV) para fração
metanólica (FM) liofilizada de S. marginatus Blume................. 82
Tabela12-
Avaliação da atividade antifúngica do Extrato Bruto, Frações
Hexânica e Diclorometano (EB; FH e FD) de S. marginatus
Blume........................................................................................ 82
Tabela13-
Avaliação da atividade antifúngica da fração Acetato de Etila
(FAE), Acetona (FAC) e Metanólica (FM) de S. marginatus
Blume........................................................................................ 83
Tabela14-
Avaliação da atividade antimicrobiana do Extrato Bruto,
Fração Hexânica (FH) e Fração Diclorometano (DC) de S.
marginatusBlume.....................................................................
Tabela15-
83
Avaliação da atividade antimicrobiana da Fração Acetato de
Etila (FAE), Fração Acetona (FAC) e Fração Metanólica (FM)
de S. marginatus Blume...........................................................
Tabela16-
84
Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto e frações de S.
marginatus Blume em células RAW264.7................................
87
LISTA DE ABREVEATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ATCC
American Type Culture Collection.
BHI
Brain Heart Infusion
CIM
Concentração Inibitória Mínima
ºC
Graus Celsius
CO2
Dióxido de Carbono
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
CSD
Caldo Saborround Dextrose
DO
Densidade Óptica
DSC
Calorimetria Diferencial de Varredura
DTA
Análise Térmica Diferencial
EB
Extrato Bruto
FH
Fração Hexânica
FD
Fração Diclorometano
FAE
Fração Acetato de Etila
FAC
Fração Acetona
FM
Fração Metanólica
FIOCRUZ
Instituto Oswaldo Cruz
ICEN
Instituto de Ciências Exatas e Naturais.
ICS
Instituto de Ciências da Saúde
IEC
Instituto Evandro Chagas.
LPS
Lipopolissacarídeo
MPEG
Museu Paraense Emílio Goeldi
MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
NO
Óxido Nítrico
PBS
Phosphate Buffer Saline
PBMC
Células Mononucleares de Sangue Periférico Humano
PNPMF
Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RPMI
Instituto Memorial Park Roswell
SUS
Sistema Único de Saúde
TG
Termogavimetria
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral alfa
UFPA
Universidade Federal do Pará
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO……………………………………………………….
16
2
REVISÃO DE LITERATURA……………………………………….
19
2.1
A importância do estudo de plantas medicinais......................
19
2.2
Família Lorantaceae....................................................................
20
2.3
Estudo Fitoquímico das ervas-de-passarinho.......................... 21
2.4
Gênero Struthanthus................................................................... 23
2.5
A espécie Struthanthus marginatus Blume..............................
2.6
A importância das plantas medicinais no tratamento de
24
doenças transmitidas por micro-organismos........................... 26
2.6.1
Staphylococcus aureus.................................................................. 27
2.6.2
Enterococcus faecalis.................................................................... 29
2.6.3
Salmonella tiphy............................................................................
30
2.6.4
Candida albicans...........................................................................
31
2.6.5
Trichophyton mentagrophytes.......................................................
33
2.7
Imunomodulação........................................................................
34
2.7.1
ÓXIDO NÍTRICO (NO)................................................................... 36
2.7.2
FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA (TNF-α)........................ 37
2.8
Técnicas analíticas utilizadas na avaliação de fitoterápicos
39
2.8.1
ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO (IV)...
39
2.8.2
ANÁLISE TÉRMICA......................................................................
40
2.8.3
ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TG)...................................... 41
2.8.4
ANÁLISE TÉRMICA DIFERENCIAL (DTA)...................................
41
2.8.5
CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)...........
42
3
OBJETIVOS..................................................................................
44
3.1
Objetivo geral..............................................................................
44
3.2
Objetivos Específicos.................................................................
44
4
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................
46
4.1
Material.........................................................................................
46
4.1.1
MATÉRIA-PRIMA VEGETAL......................................................... 46
4.1.2
REAGENTES E SOLUÇÕES........................................................
47
4.1.3
EQUIPAMENTOS.......................................................................... 48
4.1.4
MATERIAIS PLÁSTICOS E VIDRARIAS......................................
4.1.5
MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES........................................... 49
4.1.6
LINHAGENS BACTERIANAS E FÚNGICAS................................. 49
4.2
Métodos........................................................................................
4.2.1
PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL........................... 50
4.2.2
CARACTERIZAÇÃO FÍSICA E FÍSICO-QUÍMICA DO PÓ DAS
FOLHAS DE Struthanthus marginatus Blume...............................
48
49
51
4.2.2.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas
de Struthanthus marginatus Blume...............................................
4.2.2.2 Determinação de perda por dessecação do pó das folhas de 51
Struthanthus marginatus Blume....................................................
52
4.2.2.3 Determinação do teor de cinzas totais do pó das folhas de
Struthanthus marginatus Blume....................................................
52
4.2.2.4 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DTA e
DSC)
do
pó
das
folhas
de
Struthanthus
marginatus
Blume............................................................................................. 52
4.2.3
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FÍSICOQUÍMICA DA TINTURA DO PÓ DAS FOLHAS DE Struthanthus
marginatus BLUME........................................................................ 53
4.2.3.1 Obtenção da tintura.......................................................................
53
4.2.3.2 Determinação do pHda tintura.....................................................
53
4.2.3.3 Determinação da densidade aparente da tintura........................... 53
4.2.3.4 Determinação do teor de sólidos da tintura...................................
54
4.2.4
ABORDAGEM FITOQUÍMICA DA TINTURA................................
54
4.2.4.1 Obtenção do extrato seco a partir da tintura.................................
54
4.2.4.2 Obtenção do extrato seco liofilizado.............................................. 55
4.2.4.3 Prospecção fitoquímica do extrato seco liofilizado.......................
55
4.2.4.4 Fracionamento do extrato seco liofilizado.....................................
61
4.2.4.5 Obtenção do perfil espectroscópico na região do infravermelho 61
do extrato seco liofilizado..............................................................
4.3.1
61
ENSAIOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES
DE S. marginatus B.......................................................................
62
4.3.1.1 Micro-organismos testados............................................................ 62
4.3.1.2 Padronização do inóculo...............................................................
62
4.3.1.3 Avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto e frações de
S. marginatus B. capaz de inibir a germinação dos esporos de
Trichophyton mentagrophytes.......................................................
63
4.3.1.4 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato bruto e frações
de S. marginatus B. frente cepas bacterianas............................... 64
4.3.2
TESTES PARA AVALIAÇÃO DA IMUNOMODULAÇÃO..............
65
4.3.2.1 Coleta de células PBMC................................................................ 65
4.3.2.2 Teste de Citotoxicidade em células PBMC.................................... 66
4.3.2.3 Dosagem de Óxido Nítrico em células PBMC...............................
67
4.3.2.4 Teste de ELISA para dosagem de TNF- α....................................
67
4.4.1
ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................
68
5
RESULTADOS..............................................................................
70
5.1
Avaliação das características físicas e físico-químicas do
pó das folhas de S. marginatus Blume...................................... 70
5.1.1
DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA DO
PÓ DAS FOLHAS DE S. marginatus Blume.................................
5.1.2
70
DETERMINAÇÃO NA PERDA POR DESSECAÇÃO E DO
TEOR DE CINZAS TOTAIS DE DO PÓ DAS FOLHAS DE S.
marginatusBlume..........................................................................
5.1.3
71
ANÁLISE DO PERFIL TÉRMICO DO PÓ DAS FOLHAS DE S.
marginatus Blume.......................................................................... 71
5.1.3.1 Termogravimetria e análise térmica por TG do pó das folhas de
S. marginatus Blume.....................................................................
71
5.1.3.2 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)...................................
72
5.2
Caracterização química e físico-química do extrato bruto
liofilizado do pó das folhas de Struthanthus marginatus
Blume............................................................................................ 74
5.2.1
OBTENÇÃO DA TINTURA............................................................
5.2.2
DETERMINAÇÃO DO PH, DENSIDADE APARENTE E TEOR
5.2.3
74
DE SÓLIDOS DA TINTURA..........................................................
74
OBTENÇÃO DO EXTRATO SECO LIOFILIZADO........................
75
5.2.4
PROSPECÇÃO
FITOQUÍMICA
DO
EXTRATO
SECO
LIOFILIZADO................................................................................. 75
5.2.5
PERFIL ESPECTROSCÓPICO NA REGIÃO IV DO EXTRATO
BRUTO E FRAÇÕES LIOFILIZADAS DE S. marginatus
Blume............................................................................................. 76
5.3
Ensaios Microbiológicos............................................................
5.3.1
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO EXTRATO
82
BRUTO E FRAÇÕES LIOFILIZADAS DE S. marginatus
B.CAPAZ DE INIBIR GERMINAÇÃO DE ESPOROS DET.
mentagrophytes.............................................................................
5.3.2
82
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO
BRUTO E FRAÇÕES DE S. marginatus B. FRENTE CEPAS
BACTERIANAS.............................................................................
83
5.4
Ensaios Imunológicos................................................................
87
5.4.1
TESTE DE CITOTOXICIDADE...................................................... 87
5.4.2
DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO (NO).........................................
87
5.4.3
DOSAGEM DE TNF- α..................................................................
91
6
DISCUSSÃO.................................................................................
94
7
CONCLUSÕES.............................................................................
110
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................
113
15
1. Introdução
16
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é conhecido mundialmente por suas gigantescas dimensões e detém
uma das mais ricas floras com inúmeras espécies tropicais e vários ecossistemas,
além disso, é considerado como fonte de diversidade biológica detendo cerca de
20% das espécies vegetais e animais existentes no mundo (GUERRA, 2003;
CARNEIRO, 2008). Devido à riqueza da biodiversidade da flora, o Brasil é um
candidato promissor a grandes descobertas científicas no que se diz respeito ao
desenvolvimento de fitoterápicos chamando assim a atenção do mundo para a
floresta amazônica, mata atlântica e cerrado (CARLOS, 2007). A floresta amazônica,
com seu clima quente-úmido característico da região, ocupa territórios do Brasil,
Bolívia, Peru, Equador, Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname e Guiana Francesa,
com uma área de aproximadamente 6.000.000 km2 da América do Sul, onde abriga
uma diversidade florística e de animais silvestres, maior que os demais
ecossistemas florestais do mundo (LEITÃO FILHO, 1987; OLIVEIRA e BERRETA,
2007).
Neste cenário, evidencia-se o conhecimento e uso da vegetação local pelas
comunidades quilombolas, ribeirinhas, rurais e indígenas, povos tradicionais tão
antigos quanto à própria história do homem, que utilizam a fitoterapia como recurso
terapêutico para cura de males e enfermidades levando em consideração o
conhecimento popular passado de geração em geração (MACEDO, 2004).
Acompanhando a evolução tecnológica humana, podemos observar os avanços da
fitoterapia ao longo dos anos e hoje, em todo o mundo, é objeto de interesse de
pesquisadores, da indústria e, claro, da sociedade moderna (REYES-GARCÍA,
2010).
Neste sentido, a investigação das plantas presentes nos biomas brasileiros
pode ser uma alternativa, uma vez que este território possui entre 25000 a 30000
espécies vegetais, sendo o primeiro no ranking dos países mais ricos em número de
espécies de plantas (CUNNINGHAM, 1996; NUNES, 2009), possuindo assim,
ambiente
propício
para
a
realização
de
levantamentos
etnobotânicos
e
etnofarmacológicos (BOTSARIS, 2010).
Atualmente, a utilização de plantas medicinais e produtos fitoterápicos estão
em expansão no Brasil e no mundo, o que tem impulsionado as indústrias
17
farmacêuticas e também o governo federal a investir em pesquisa, na forma de
incentivos através das políticas públicas para uso racional destes produtos
(CARLOS, 2007).
O governo brasileiro visando à importância desse segmento da economia
lançou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), uma ação
conjunta entre o governo (através de financiamentos), universidades (pesquisa e
desenvolvimento) e indústrias (fabricação) buscando o desenvolvimento fitoterápicos
destinados à população (BRASIL, 2006b). O Sistema Único de Saúde (SUS),
também foi foco de ação do governo através da Política de Práticas Integrativas e
Complementares, garantindo a população acesso seguro e racional ao uso de
medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2006a).
Desta forma, usuários de plantas medicinais mantêm a prática do consumo de
fitoterápicos,
tornando
válidas
informações
terapêuticas
que
foram
sendo
acumuladas durante séculos. Com isso, é possível desenvolver fitoterápicos
promissores no tratamento de diversas patologias, o que representa um grande
avanço para atender diversas necessidades de saúde pública no Brasil e no mundo,
melhorando assim a qualidade de vida da população (MENEZES et al. 2009;
ARAÚJO. 2010).
Nesse contexto, este trabalho pretendeu contribuir para estimular linhas de
pesquisas em fitoterapia e ainda promover desenvolvimento tecnológico, com base
no uso tradicional de plantas medicinais da região amazônica. A espécie em estudo
Struthanthus marginatus Blume., apresenta aspectos econômicos, acadêmicos e
farmacológicos que justificam sua escolha para investigação, pois é uma planta de
ocorrência na região amazônica de fácil acesso e muito utilizada na forma de chás
para tratamento de doenças bronco-pneumáticas, inflamatórias e hipertensivas
(ALVARÉZ, 2003; PÉREZ, 2004; VIEIRA, 2005; MARTINS, 2006; LORENZANAJIMÉNEZ, 2006).
Contudo,
é
necessário
confirmar
suas
propriedades
farmacológicas
justificadas pelo uso popular. Por isso, este trabalho propõe a caracterização
farmacognóstica, físico-química e ensaios biológicos in vitro do extrato bruto e
frações de S. marginatus Blume. pesquisando ainda a estimulação de citocinas próinflamatórias que caracterizam o início da inflamação.
18
2. Revisão de Literatura
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A importância do estudo de plantas medicinais
As plantas medicinais têm sido usadas pelo homem há muitos anos pelas
grandes civilizações antigas, como a chinesa, indiana e africana, conforme
evidenciam alguns documentos, para o tratamento de uma ampla variedade de
doenças (PHILLIPSON, 2001). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS)
planta medicinal é definida como sendo “todo e qualquer vegetal que possui
substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam
precursores de fármacos semissintéticos” (OMS, 2002). A medicina tradicional faz
uso da terapêutica que utiliza as plantas medicinais em tratamentos físicos, mentais
ou sociais, baseados exclusivamente na experiência e observação e transmitidos
verbalmente ou por escrito de uma geração a outra (PEREIRA et al. 2004). Sua
utilidade têm sido observada em todas as partes do mundo especialmente nos
países em desenvolvimento, onde o serviço de saúde é limitado e as plantas
representam o único tratamento acessível (AGRA et al. 2008).
No Brasil devido á riqueza de sua flora e ao conhecimento popular transmitido
através das gerações, as plantas medicinais são vendidas em feiras livres e
mercados populares, muitas delas sendo usadas para curar várias enfermidades da
população (DUARTE, 2006). Onde são utilizadas na forma de extratos brutos para
tratar infecções comuns embora, poucas evidências científicas sejam relatadas
comprovando a eficácia desse tratamento. Sob este aspecto, verifica-se que a
fitoterapia vem crescendo no país, tornando-se um setor econômico importante
devido a sua popularidade como alternativa nos cuidados com a saúde (LIMA et al.
2006). No entanto, as pesquisas com plantas medicinais ainda estão centradas no
âmbito das universidades e institutos de pesquisas onde se desenvolve
essencialmente a fitoquímica básica, embora existam vários grupos envolvidos na
busca de princípios ativos de plantas. Cerca de 85% das indústrias transnacionais
sediadas no Brasil praticam toda a pesquisa de descoberta e desenvolvimento de
fármacos em seus países de origem (PAREKH e CHANDA, 2007).
20
São várias as utilidades dos produtos naturais, principalmente os oriundos
das plantas, quer sejam como suplementos na alimentação, intermediários usados
nas indústrias ou medicamentos (YUNES, 2001), quer seja no uso in natura das
plantas medicinais como o único recurso terapêutico de muitas comunidades e
grupos étnicos (MACIEL et al. 2006).
2.2 Família Lorantaceae
A família Loranthaceae está contida na ordem das Santalales compreendendo
cinco famílias: Balanophoraceae, Eremolepdaceae, Olacaceae, Opiliaceae e
Viscaceae. São plantas categorizadas como hemiparasitas ou holoparasitas por
atuarem nos sistemas condutores de seiva da planta hospedeira: xilema e floema,
respectivamente (NICKRENT, 2001).
As plantas parasitas são conhecidas por possuírem uma estrutura chamada
haustorium (RIOPEL e TIMKO, 1995; CALVIN e WILSON 2006). O haustorium é
uma estrutura dilatada epicortical adquirida por estas plantas ao longo de sua
evolução que possui a capacidade de invadir o tecido vascular de outras espécies
de plantas hospedeiras e com isso, remover água e nutrientes necessários para sua
sobrevivência (LÓPEZ DE BUEN e ORNELAS, 2002). A invasão do sistema vascular
e o tempo de parasitismo de plantas hospedeiras por conta de plantas parasitas,
pode alterar seu crescimento, forma, reprodução, fisiologia reduzindo sua
performance, capacidade de fotossíntese, respiração e a inativação de sua
capacidade de sobrevivência (EHLERINGER, 1985; PRESS, 1999; HOEWLL
e
MATHIASEN, 2004).
Devido ao fato dos pássaros serem os agentes dispersores das sementes das
duas maiores famílias, Loranthaceae e Viscaceae, estas plantas são conhecidas
popularmente como ervas de passarinho. A maioria destas plantas possui em suas
sementes uma substância chamada de visco que a permite fixar-se na planta
hospedeira, após serem ingeridas e secretadas por pássaros (VIEIRA et al. 2005).
As famílias Loranthaceae, Viscaceae e Eremolepidaceae compreendem cerca
de 84 gêneros e 1.270 espécies distribuídas geograficamente tanto em regiões
21
tropicais quanto de clima temperado (RIZZINI, 1982; HEYWOOD et al, 1978). Na
Europa, o gênero Viscum e, na América do Norte, o gênero Phoradendron, ambos
da família Viscaceae, representam a maioria das plantas parasitas, enquanto que a
família Loranthaceae distribui-se pelos trópicos: Malásia, Austrália e América do Sul
(NICKRENT, 2001), revelando-se pouco abundante em regiões temperadas
(RIZZINI, 1968). No Brasil ocorrem cerca de 12 gêneros e 40 espécies (RIZZINI,
1956). São reconhecidas como portadoras de propriedades terapêuticas e uma
variedade de compostos bioativos (VENTURELLI et al. 1981; VIEIRA et a, 2005;
WONG et al, 2011) caracterizadas como arbustos eretos ou escandentes,
clorofilados, hemiparisitas de árvores ou arbustos de dicotiledôneas e de coníferas,
(BARROSO et al. 1984).
Figura 1. Distribuição biogeográfica da família Loranthaceae (PISSINATE, K.; 2006)
2.3 Estudo Fitoquímico das ervas-de-passarinho.
Na Europa diversos estudos fitoquímicos tiveram início com os extratos de
Viscum albuns (Viscaceae) amplamente usados na medicina popular para
tratamento do câncer, onde se observou a presença de componentes relacionados e
identificados com a redução de tumores. Dentre eles destacam-se: lectinas,
22
viscotoxinas,
proteínas,
peptídeos,
oligossacarídeos,
alcaloides,
compostos
polifenóis e flavonoides presentes nesta planta (ZEE CHENG, 1997).
A presença de flavonoides e proantocianidinas na família Loranthaceae
(FERNÁNDEZ et al. 1998) e outros metabólitos especiais como flavonas, lignanas e
monoterpenos glicosilados, despertou a atenção dos pesquisadores para o estudo
fitoquímico dos extratos e das frações de algumas espécies, desta família,
endêmicas e de uso medicinal local.
Na espécie Scurrula atropurpurea, uma planta parasita de Thea sinensis,
espécie de chá muito comum na Indonésia, foram isolados alguns ácidos graxos:
ácido linolênico e oléico; chantonas: cafeína e teobromina; flavonoides glicosilados:
quercitrina e rutina; monoterpeno glicosilado: icarisida B; lignana glicosilada:
aviculina e; flavonas: catequinas e epicatequinas. (Figura 2, pg. 22) (OHASHI et al.
2003).
Ácido linolênico
Ácido oléico
Cafeína R = CH3
Quercetina R = raminosil
Teobromina R = H
Rutina
Perseitol
R = rutinosil
Catequina
Epicatequina R = H
Figura 2. Estrutura dos metabólitos especiais isolados da espécie Scurrula atropurpurea.
23
A partir de outras espécies deste gênero, comuns na Indonésia como a
Scurrula fusca, cuja planta hospedeira é Fícus riedelii, pôde-se isolar de suas folhas
o perseitol (Figura 2, pg. 22) complexado com íons de potássio em uma razão molar
de 20:1, respectivamente (ISHIZU, 2001). Também foram isolados alguns
flavonóides glicosilados como a quercetina e a 4’’-O-acetilquercitrina (Figura 2,
pg.22), além da quercitrina, da fração de acetato de etila da espécie Scurrula
ferruginea (LOHÉZIC-LE-DÉVÉHAT, 2002).
Estudos com o extrato de caules e folhas da espécie Ligaria cuneifolia, na
Argentina, evidenciaram a presença de quercetina livre ou monoglicosilada com
xilose, raminose e arabinose na hidroxila da posição 3 do esqueleto flavonol. Além
da catequina, epicatequina e do catequinol, (Figura 2, pg. 22) (FERNÁNDEZ et al.
1998).
2.4 Gênero Struthanthus.
O gênero Struthanthus é considerado o mais importante dentre os 74 gêneros
que compõe a família Loranthaceae possuindo cerca de 60 espécies próprias da
América tropical em sua grande maioria localizadas na América do Sul e, em
particular, no Brasil representado 40 espécies de visgo parasita onde tem sido
estudada devido ao seu peculiar estilo de sobrevivência (RIZZINI, 1968; BARBOSA
e PROENÇA, 1999; KRAUS, 2002).
Em diferentes países que fazem uso da medicina popular, espécies do gênero
Struthanthus são usadas no tratamento de várias enfermidades como, por exemplo,
podemos citar a espécie S. cassythoide que é indicada na Nicarágua para dores em
geral, febre, desordens respiratórias e pulmonares, erupção e feridas na pele (COE
e ANDERSON, 1996). Na Colômbia, algumas ervas-de-passarinho, são usadas pela
população como antídoto nos casos de envenenamento por picada de cobra,
acidente muito freqüente. Estudo com a planta S. orbicularis demonstrou, in vitro,
que 25µg do extrato é capaz de neutralizar ou reduzir em 65% a formação de
edemas causados pelo veneno da espécie Bothrops asper, com um tempo de
coagulação inferior a 100 segundos (NÚÑEZ et al. 2004).
24
No Brasil e América Tropical a espécie originária é S. flexicaulis, muito
utilizada como energético e também para o tratamento de leucorréia, bronquite e
diversos tumores. Já a espécie S. vulgaris cujo extrato hidroalcóolico das folhas
secas tem apresentado atividade antimicrobiana frente amostras de bactérias Gram
positivas e Gram negativas também é utilizada na medicina popular nas infecções
das vias respiratórias (VIEIRA et al. 2005).
Diante do amplo uso etnofarmacológico das ervas de passarinho, e dos
estudos fitoquímicos citados na literatura, evidenciando alguns metabólitos
presentes nestas plantas hemiparasitas como relevantes agentes quimioterápicos
para o tratamento de várias doenças, como também a abundância da ocorrência do
gênero Struthanthus nas regiões tropicais, sobre tudo no Brasil, esta dissertação de
mestrado focou no estudo da espécie Struthanthus marginatus amplamente
disseminada no estado do Pará e pouco referenciada na literatura.
2.5 A espécie Struthanthus marginatus Blume.
A
espécie
Struthanthus
marginatus
Blume.
(Lorantaceae)
conhecida
popularmente como erva-de-passarinho é uma planta hemiparasita mais comumente
encontrada em regiões de mata pluvial, tropicais e subtropicais (VENTURELLI e
KRAUS, 1989; SALANTINO et al. 1993). No Brasil vem atraindo atenção de
pesquisadores para o estudo de sua anatomia, fisiologia e constituição fitoquímica
devido sua peculiar forma de sobrevivência (parasitismo) causando danos muitas
vezes irremediáveis em espécies hospedeiras ornamentais e frutíferas como
Anacardiceae (mangueira), Bignoniaceae (ipê), Oleacaceae (alfeneiro), Meliaceae
(cinamomo), Rubiaceae (cefeeiro), Aquiliaceae (mate) Malvaceae (espécies do
gênero malva) dentre outras, em várias partes do mundo (MARTINS, 2006).
Sua propagação é feita pelos pássaros ao se alimentarem de seus frutos
viscosos e suas sementes adocicadas dispersando-as através de suas fezes ou de
seus bicos em cuja superfície se adere passando desta forma a outras árvores onde
germinam (LORENZI,1991). Esses processos variam de acordo com a espécie
envolvida na disseminação de sementes tais como vento e a dispersão balística
25
onde o fruto explode e arremessa a semente (MOURÃO, 2009). Semelhante às
outras espécies deste gênero, principalmente a S. vulgaris, a hemiparasita S.
marginatus é uma planta que habita as partes aéreas de outros vegetais
hospedeiros e os parasitam parcialmente, através de uma ou mais raízes
modificadas fisiológica e morfologicamente chamadas de haustórios. Ou seja, as
raízes especiais desta espécie retiram água e sais minerais diretamente do
hospedeiro, embora esta planta seja capaz de realizar fotossíntese (NICKRENT,
2001).
Segundo Dias Silva (1926) a espécie Struthanthus marginatus foi incluída na
Farmacopéia Brasileira 1ª edição como detentora de atividade no combate de
infecções das vias respiratórias, descongestionante na tosse, bronquite e pneumonia
(MARTINS, 2006; LORENZANA-JIMÉNEZ, 2006). Atualmente estudos realizados
com a erva-de-passarinho, indicam novas propriedades terapêuticas como
antioxidante,
analgésica,
anti-inflamatória,
antiulcerogênica,
e
efeitos
vasodilatadores, hipontensores e atividade imunomoduladora (FREIRE, 2011;
QUEDRAOGO, 2011; OGECHUKWU, 2011).
Tais indicações terapêuticas podem ser atribuídas pela presença de
constituintes químicos presentes nas folhas desta espécie tais como alcaloides,
triterpenos, catequinas, taninos e flavonoides. Estes últimos compostos possuem
atividade antiinflamatória e antiulcerogênica confirmando assim, seu uso popular
(BAGGIO, 2007; GURBUZ, 2009; ZDUNÍC, 2009). De acordo com estudos clínicos,
dependendo da planta parasitada, a espécie S. marginatus pode desenvolver
constituintes químicos com atividades tóxicas similares aos princípios ativos
encontrados no hospedeiro (MARTINS, 2006).
O trabalho de Vieira et. al (2005), trata da atividade antimicrobiana da
espécie, atribuindo ás proantocianinas atividade antimicrobiana.
26
Figura 3. Struthanthus marginatus Blume (arquivo pessoal).
2.6 A importância das plantas medicinais no tratamento de doenças
transmitidas por micro-organismos.
O Brasil possui um número muito grande de espécies vegetais consideradas
medicinais as quais são muito utilizadas pela população para diversos problemas de
saúde. Porém, muitas destas plantas ainda não tiveram qualquer avaliação científica
do seu uso medicinal, o que é essencial para que possam continuar a serem
utilizadas com garantia de eficácia e segurança pela população (PELISSARI et al.
2010). Uma planta pode conter muitos metabólitos secundários, mas apenas os
compostos que estão em maior concentração são geralmente isolados e estudados
pela fitoquímica clássica, mas analisar os compostos ativos é uma tarefa mais
complexa e longa, pois geralmente os compostos minoritários estão entre os que
apresentam melhores efeitos biológicos. Por isso é indispensável analisar a potência
das frações e das substâncias puras em relação à sua concentração. A partir desta
avaliação podemos predizer se o principal componente químico responsável pela
atividade biológica foi realmente determinado (ANURADHA et al. 2010).
27
Contudo as doenças infecciosas representam uma importante causa de
morbidade
e
mortalidade
entre
humanos,
especialmente
nos
países
em
desenvolvimento. Assim, as indústrias farmacêuticas têm sido motivadas para o
desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas nos últimos anos, especialmente
em função da ocorrência de resistência microbiana a tais medicamentos. Em geral,
bactérias têm habilidade genética de transmitir e adquirir resistência a drogas
usadas como agentes terapêuticos (TACCONELLI et al. 2009), pois são frequentes
os relatos sobre isolamentos de bactérias que eram reconhecidamente sensíveis às
drogas de uso na rotina, mas que se tornam resistentes a todos, ou a quase todos,
fármacos disponíveis no mercado (SAKAGAMI E KAJAMURA, 2006). Segundo
NGOWKE et al. (2011), a epidemiologia da resistência aos antibióticos varia de
região e de país. Enquanto alguns países estão registrando um declínio, outros
estão experimentando um aumento da resistência bacteriana. No entanto, está
evidente que o aumento ou a diminuição tem sempre uma ligação direta com o uso
indiscriminado de antibióticos (TACCONELLI et al. 2009).
2.6.1 Staphylococcus aureus
O gênero Staphylococcus apresenta-se na forma de cocos Gram-positivos,
isolados ou agrupados em cachos que medem cerca de 1 µm. São anaeróbios
facultativos, não formadores de esporos, imóveis e catalase positivos, são bactérias
mesófilas, com temperatura de crescimento variando entre 7ºC a 47,8ºC, com
produção de enterotoxina entre 10ºC a 46ºC (ROSSI e ANDREAZZI, 2005). O gênero
Staphylococcus está subdividido em 40 espécies, que se dividem de acordo com a
síntese ou não da enzima coagulase, sendo a maioria, coagulase-negativa, com
exceção do S. aureus, S. schleiferi subsp. coagulans, S. intermedius, S. hyicus e S.
delphini (BANNERMAN et al. 2003). Dentre as espécies desse gênero, S. aureus é
considerada a mais importante em função da sua maior patogenicidade ao homem
(REYNOLDS, 2009). Praticamente qualquer sistema de órgãos é propensa à infecção
pelo S. aureus, as infecções mais importantes são a bacteremia, endocardites e
28
infecções do trato respiratório (KANAFANI, 2006). As bacteremias e endocardites
são frequentemente associadas a sérias complicações e alta taxa de morte (PETTI,
2003).
A eficiência da disseminação de S. aureus se deve, em parte, à grande
versatilidade desse microorganismo. A capacidade de se adaptar rapidamente a
diferentes ambientes, muitas vezes hostis devido ao pH, umidade, pressão osmótica
ou deficiência de nutrientes, possibilita não só a colonização do homem como do
ambiente ao seu redor, criando reservatórios de células aptas a colonizar outros
indivíduos (CEPEDA et al. 2005; KNIEHL et al. 2005). De fato, S. aureus é uma
bactéria comum na microbiota humana, colonizando de forma persistente as narinas
de cerca de 20% da população e de forma intermitente 30%. A maioria dos
portadores são assintomáticos e o processo de infecção normalmente está
associado a algum fator que diminui a resposta imunológica do indivíduo, como
doenças, tratamentos mais agressivos, ou procedimentos médicos invasivos, que
abrem uma via de acesso para os microorganismos (GUERRERO et al. 2011).
A patogenicidade de S. aureus é um processo que envolve uma grande
quantidade de componentes extra-celulares e da parede celular, que são
coordenadamente expressos durante os diferentes estágios da infecção. Esses
estágios podem ser definidos como: colonização, evasão das defesas do
hospedeiro, divisão celular e disseminação bacteriana (DANCER et al. 2008).
A capacidade de resistência do S. aureus pode ser classificados em dois
grupos principais: mutação em um gene no cromossomo bacteriano, ou aquisição de
um gene de resistência de outro microorganismo, através de transdução,
transformação
ou
conjugação (MENEGOTTO e PICOLI, 2007).
Atualmente
verificamos cepas resistentes a vários antimicrobianos tais como: penicilinas,
metacicilinas e vancomicina dentre outras que envolve diversos mecanismos de
resistência como a inativação do anel β-lactâmico encontrado nas moléculas de
penicilina, mutação no sítio alvo da enzima PBP e por último, alteração da afinidade
com a vancomicina pela mutação do gene que produz a parede celular bacteriana
(LYER et al. 2011).
29
2.6.2 Enterococcus faecalis
O gênero Enterococcus consiste em bactérias Gram-positivas, anaeróbios
facultativos, que apresentam uma forma ovóide, podendo aparecer como pequenas
cadeias, aos pares ou como células únicas (CAUWERTS et al. 2007). Fazem parte
da microflora intestinal humana, mas também foram descritos como fazendo parte
da mucosa oral e do extrato vaginal (KENSE et al. 2011). Os enterococos são
capazes de crescer entre 10ºC e 45 ºC, até 6.5% de NaCl (sendo este um dos
melhores parâmetros para a sua identificação) e a pH 9.6, são também capazes de
resistir a 60ºC durante 30 minutos (ZOU et al. 2011). Sua capacidade de
crescimento em condições adversas permite a sua distinção de outras bactérias, e
consequente isolamento, estando descritos como resistentes a vários antibióticos
(DUNAVANT et al. 2006). Os enterococos são responsáveis por infecções
nosocomiais graves, sendo a terceira causa nos EUA e a quarta na Europa, sendo
considerados patogénicos emergentes. Mais especificamente, os enterococos são a
segunda causa de infecções urinárias tanto nos EUA como na Europa, e são
responsáveis de entre 5 a 20% das endocardites86. A taxa de mortalidade de
infecções por enterococos ronda os 20 a 30% (STUART et al. 2006).
O interesse pela espécie E. faecalis surgiu pelo facto de esta possuir vários
plasmídeos, podendo alguns desses ser transferidos por conjugação a outras
bactérias. Foi em E. faecalis que se descobriram dois novos sistemas genéticos em
Enterococcus, os transposões conjugativos e plasmídeos que respondem a
feromonas sexuais (CAMPOS et al. 3013). A existência de plasmídeos conjugativos
não só em E. faecalis mas também em E. faecium, levou a que estas espécies
fossem consideradas como reservatórios de plasmídeos para outros géneros de
bactérias (CRUZ et al. 2013).
Nos últimos anos uma grande atenção tem sido dada aos enterococos, não
só pelo aumento de doenças nosocomiais por eles causadas, mas também pelo
aumento do número de antibióticos aos quais são resistentes. Estes dois factores
reforçam-se mutuamente, visto que a resistência permite que os enterococcus
sobrevivam num ambiente em que os antibióticos são fortemente utilizados. Por
outro lado, o ambiente hospitalar contém antibióticos que eliminam bactérias
30
susceptíveis, contribuindo assim para uma vantagem seletiva dos organismos
resistentes, providenciando também a disseminação destes agentes pelo meio
hospitalar (BARNES et al. 2012). A resistência a antibióticos pode ser dividida em
duas classes: a intrínseca e a adquirida. Algumas bactérias são intrinsecamente
resistentes a antibióticos, ou porque não possuem o local alvo para o antibiótico ou
porque este não é capaz de atravessar a parede celular, de modo a chegar ao local
alvo. A resistência adquirida é normalmente dependente de transposões ou
plasmídeos, podendo também ser resultado de mutações pontuais (WILLEMS et al.
2009).
2.6.3 Salmonella tiphy
A Salmonella é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae,
conhecida mundialmente como o agente causador de toxi-infecções alimentares em
seres humanos (LAN et al. 2009). O gênero Salmonella compreende bacilos Gramnegativos com diâmetro em torno de 0,7 - 1,5 x 2,0 – 2,5 µm, não esporulados; em
geral móveis com flagelos peritríquios, com exceção dos sorovares S. Gallinarum e
S. Pullorum; possuem temperatura ótima de crescimento em torno de 37 °C; são
anaeróbios facultativos; formam colônias que medem cerca de 2 a 4 mm de
diâmetro; apresentam os testes da oxidase e Voges-ProsKauer negativos; reduzem
nitrato a nitrito; fermentam glicose e outros carboidratos com produção de ácidos,
produzem sulfeto de hidrogênio (H2S); utilizam o citrato como única fonte de carbono
e, geralmente, são lisina e ornitina descarboxilase positivas (WINN JR et al, 2008).
A Salmonella Typhi se diferencia dos demais sorovares por meio de
características bioquímicas e sorológicas (EWING, 1986). A S. Typhi fermenta
glicose sem produção de gás, é citrato negativo, produz H2S em pequena
quantidade em comparação aos demais sorovares, bem como, apresenta o teste da
ornitina descarboxilase negativo (BRENNER et al. 2005).
A caracterização sorológica do gênero Salmonella tem como base a
identificação dos antígenos “O” (somáticos), “H” (flagelares) e “Vi” (capsular),
levando em consideração ao esquema de White-Kauffmann-Le Minor, cujas
31
fórmulas antigênicas são identificadas com letras e números. O antígeno O reflete a
variação do polissacarídeo e o antígeno H, reflete a variação da flagelina, que possui
natureza protéica (PARRY et al. 2002). O componente LPS da membrana externa
possui
uma
porção
polissacarídica
composta
de
açúcares,
denominados
polissacarídeos O, que atuam como antígenos. No lócus rfb do cromossomo da
Salmonella, são encontrados genes responsáveis pela síntese e variabilidade do
antígeno O (FIERER E GUINEY, 2001).
A salmonelose é transmitida de pessoa a pessoa, sem um hospedeiro
intermediário, por meio da contaminação da água e alimentos crus ou mal cozidos,
como: carne bovina, suíno, aves, ovos, leite e derivados, e frutos do mar.
Veterinários e trabalhadores de granjas e fazendas que possuem maior contato com
animais infectados, também podem adquirir a doença; e em hospitais pode ocorrer a
transmissão interpessoal (SHINOHARA et al. 2008). Os sorovares que causam a
febre tifóide e paratifóide destacam-se dentro do gênero como importantes
problemas de saúde pública, principalmente, nos países em desenvolvimento onde a
assistência à saúde e as condições socioeconômicas são limitadas (KANUNGO et
al. 2008).
A febre tifóide é uma doença infecciosa e sistêmica causada pela S. Typhi,
que se caracteriza por febre alta e sintomas gastrointestinais. Apresenta distribuição
mundial, sendo os países em desenvolvimento os mais acometidos pela doença,
que está associada ao saneamento básico e condições de higiene pessoal e
ambiental precários. No Brasil, a doença é de notificação compulsória, ocorre de
forma endêmica, e acomete principalmente as regiões Norte e Nordeste (BRASIL,
2007).
2.6.4 Candida albicans
Durante as últimas décadas, as infecções por Candida têm aumentado não
somente em ocorrência, mas também na gravidade da doença (PAPPAS et al.
2004). O aumento das infecções, com lesões graves têm levado a um alto índice de
mortalidade, principalmente em pacientes imunocomprometidos (TORTORA et al.
32
2003). Embora C. albicans permaneça o agente etiológico mais comum associado à
candidíase, verifica-se que outras espécies não albicans como C. tropicalis, C.
guilliermondii, C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. krusei e C. glabrata estão também
envolvidas como importantes patógenos destas infecções fúngicas oportunísticas
(PFALLER E DIEKEMA, 2007).
As espécies de Candida existem como comensais, fazendo parte da
microbiota humana e animal, sendo encontradas na cavidade bucal, no trato
gastrointestinal
e
no
sistema
genitourinário,
podendo
em
determinadas
circunstâncias causar infecções, que são comuns principalmente nos indivíduos com
alterações no sistema imune (KUMAR et al. 2006). Desta forma, acredita-se que a
candidíase tenha a maioria das vezes origem endógena, sendo que a capacidade
que as leveduras do gênero Candida têm de colonizar, penetrar e fazer danos ao
tecido do hospedeiro depende de um equilíbrio entre fatores de virulência deste
microrganismo e de fatores específicos ligados ao hospedeiro (LEVINSON e
JAWETZ, 2005).
A capacidade que o microrganismo tem de aderir à superfície das células do
hospedeiro, representa o primeiro estágio de patogênese. Os mecanismos usados
por espécies de Candida para aderir são múltiplos e não têm sido definidos
precisamente (VIDOTTO et al. 2003). A parede das leveduras do gênero Candida,
constituída de glucano, manoproteína e quitina não possui apenas a propriedade de
dar a forma estrutural à célula, mas também é o local onde se inicia a interação
entre o microrganismo e o meio ambiente. As proteínasrepresentam cerca de 6 a
25% do peso da parede celular, sendo que algumas manoproteínas demassa
molecular de 60, 68, 200 e >200 kDa, denominadas adesinas, permitem a sua
aderência a receptores extracelulares, como fibrinogênio, fibronectina e laminina
presentes nos tecidos humanos (VARDAR-ÜNLÜ, 1998). O fungo ao penetrar na
célula do hospedeiro, é reconhecido pelo sistema imune e a instalação ou progresso
da infecção pode ser dificultado restringindo o foco de infecção, já em casos de
infecções disseminadas, as leveduras penetram aderindo à superfície de tecidos de
órgãos internos e sanguíneo podendo algumas vezes levar o indivíduo à morte
(GHANNOUM e ABU-ELTEEN 2004).
Fluconazol, voriconazol, itraconazol e anfotericina B são os fármacos mais
33
frequentemente empregados para tratamento das infecções causadas por Candida
(GUALCO et al. 2007).
Os antifúngicos triazólicos são considerados bastantes
efetivos para o tratamento de candidíases e são menos tóxicos que a anfotericina B,
podendo ser administrados por via oral (BURGESS et al. 2000). São conhecidos três
mecanismos de resistência aos azólicos. 1- Redução do acúmulo intracelular do
fármaco resultante da utilização reduzida deste agente antifúngico ou do aumento da
excreção do fármaco devido à ação de produtos de genes de resistência aos
antifúngicos, 2- Alteração estrutural da enzima 14-α-demetilase, resultando em uma
diminuição na sua ligação aos azólicos, 3- Síntese aumentada de 14-α-demetilase,
devido à amplificação do gene (transformação de lanosterol em ergosterol não é
totalmente impedida quando sob a ação do derivado azólico. As espécies de
Candida podem ser resistentes a agentes antifúngicos usados para proposta
terapêutica e profilática. Por essa razão, é importante a identificação do agente
etiológico e a descrição de dados laboratoriais sobre a sua suscetibilidade, para
direcionamento da clínica, selecionando o antifúngico apropriado para terapia
(NAGLIK et al. 2004).
2.6.5 Trichophyton mentagrophytes
Os dermatófitos são um grupo de fungos relacionados entre si que
apresentam a capacidade de invadir os tecidos queratinizados (pele, pêlo, unhas) do
homem e dos animais, produzindo uma enfermidade denominada dermatofitose, ou
mais comumente, “tinha” ou tinea. A infecção é geralmente cutânea, restrita à
camada córnea, devido à incapacidade do fungo de penetrar em tecidos profundos
ou órgãos de indivíduos imunocompetentes (PARKA et al. 2009).
Dentre os dermatófitos mais comuns em infecções está o Trichophyton
mentagrophytes cuja espécie é responsável no homem pela segunda ou terceira
causa de dermatofitose, causando quadros de epidermofitíases, onicomicoses,
lesões no couro cabeludo e interdigitoplantares. Apresenta duas principais
variedades,
sendo
a
primeira
conhecida
como
T.
mentagrophytes
var.
mentagrophytes, e a segunda conhecida como T. mentagrophytes var. interdigitale.
34
O que diferencia as duas, é o fato de o T. mentagrophytes var. mentagrophytes ser
uma espécie particularmente zoofílica e o T. mentagrophytes var. interdigitale ser
uma
espécie por excelência antropofílica. Além disso, essas duas variedades
podem apresentar diferenças nas características fenotípicas, assim, o T.
mentagrophytes var. mentagrophytes em ágar Sabouraud, apresenta uma textura
pulverulenta, sem relevo acentuando, formando às vezes círculos concêntricos, de
coloração que varia do branco – amarelado ao castanho – avermelhado e o reverso
da colônia apresenta um pigmento castanho, que pode tender para o vinho. O T.
mentagrophytes var. interdigitale apresenta em ágar Sabouraud, colônias com
textura aveludada ou cotonosa, de coloração branco – amarelada e com reverso
pouco pigmentado, de tom castanho ou avermelhado (GHNNOUM et al. 2004).
A prevalência dos dermatófitos é variável nas diversas regiões do mundo e
dentro de um mesmo país, devido a fatores como clima, condições socioeconômicas
e higiênicas da população, urbanização, sistema imunológico do hospedeiro,
características fúngicas e ações terapêuticas (DROUOT et al. 2009). Possuem
elevada prevalência na América Latina e atingem tanto o homem quanto os animais
domésticos. Existem relatos e dados epidemiológicos que indicam que estas
micoses estão entre as zoonoses mais comuns do mundo, sendo considerado o
terceiro distúrbio de pele mais comumente encontrado em crianças menores de 12
anos e o segundo da população adulta. Também há relatos de ocorrência da
enfermidade entre cães e gatos no meio urbano (INOUYE, 2006).
2.7 Imunomodulação
O sistema imunológico pode ser comparado a uma orquestra muito bem
articulada na qual mantêm a homeostase corporal em equilíbrio ativando sua
habilidade de modular resposta imune quando necessária (OGECHUKWU, 2011).
Esta resposta precipita uma forte defesa contra patógenos que freqüentemente
agridem a integridade do sistema imunológico propagando o distúrbio no organismo
hospedeiro ativando mecanismos reguladores para o retorno da homeostase,
35
mostrando que o próprio sistema imune se autoregula através da liberação de
substâncias imunomoduladoras (HOLLAND & VIZI, 2002; KOKO, 2008).
A imunomodulação é um mecanismo de ação no qual o sistema imunológico
pode ter sua resposta estimulada ou suprimida por uma variedade de substâncias
com ação farmacológicas sintéticas, produtos advindos de microorganismos e até de
plantas medicinais (BLECHA, 2001). Estas substâncias que modulam o mecanismo
de defesa têm sido reconhecidas como um modo de inibir a propagação de doenças
em humanos sem causar efeitos nocivos ao organismo demonstrando que a
imunomodulação pode ser uma alternativa ao tratamento convencional de
quimioterápicos para diversas doenças (MILLER et al. 2009; TAYLOR et al. 2009).
O termo imunomodulação passou a ser utilizado durante a campanha mundial
de erradicação da varíola através da vacinação com vírus atenuado, descoberta por
Edward Jenner, no século XVIII. Após a vacinação a população passou a
desenvolver reações positivas e efeitos colaterais sendo, portanto apropriado o uso
do termo para intitular as reações apresentadas pela vacina, pois estas poderiam
estar relacionadas ao aumentando dos mecanismos de defesa do hospedeiro
(imunoestimulação) ou sua diminuição (imunossupressão) (TRACEY, 2009).
Tradicionalmente os imunomoduladores modificam a resposta imune
restaurando-a ao estado normal podem também estimulá-la ao combate a agentes
invasores e fatores ambientais como também suprimir células de defesa (TRACEY,
2008). Dependendo do tipo de imunoestimulação causado, células do sistema imune
são ativadas e outras suprimidas como exemplo podemos citar a estimulação da
resposta imune humoral que envolve a secreção de anticorpos por linfócitos B
aumentando sua titulação no organismo ou a imunossupressão causada pela
inibição de citocinas TNF-α, interferon-γ, IL-13, IL-15, IL-4, IL-5 e IL-10, moléculas
importantes no controle da resposta inflamatória e das respostas mediadas por
células T e B (JANEWAY et al. 2002; FINCKH et al. 2008).
Com a descoberta dos imunomoduladores tornou-se possível a manipulação
do sistema imune a favor de um estado saudável, na tentativa de reduzir os efeitos
associados ou não à quimioterapia, à rejeição de enxertos, doenças alérgicas,
doenças cancerígenas dentre outras (MEHROTRA et al. 2002; DUTRA et al. 2002).
É sabido que fármacos com propriedades quimioterápicas exercem danos
graves ao sistema imunológico de indivíduos sobre tratamento (HAROON et al.
36
2009). No entanto, o uso de plantas como fonte de substâncias imunomoduladoras é
significante na medicina moderna, pois é sabido que diversas substâncias como
polissacarídeos, lecitinas, peptídeos, saponinas, óleos e outras oriundas de plantas
apresentam atividade imunomoduladora, validando desta forma sua utilização na
medicina popular e moderna (DAVIS e KUTTAN, 2000; COSTA et al. 2008).
2.7.1 ÓXIDO NÍTRICO (NO)
Na década de 80, a descoberta do óxido nítrico (NO) como um mensageiro
molecular para os vários sistemas do organismo de mamíferos revolucionou as
pesquisas acerca da extensão de sua atividade biológica (VANIN, 1998; FLORA
FILHO & ZILBERSTEIN, 2002). Desde então, um crescente número de pesquisas
acerca da molécula NO, na fisiopatologia humana e animal, são desenvolvidas
(MEDZHITOV, 2008). O NO participa de muitos processos fisiológicos relacionados
aos sistemas nervosos central e periférico (MACDONALD et al. 2011). Tem um
importante papel no controle de muitas infecções, apresentando atividade
antibacteriana, antiparasitária e antiviral apresentando também ação anti-tumoral
(WEBER et al. 2010). Todavia, o descontrole na síntese de NO está implicado na
patogênese de doenças cardiovasculares, autoimunidade, rejeição de transplantes,
sépsis, doenças cerebrais degenerativas, indução de câncer, genotoxicidade e na
inflamação (COUTINHO et al. 2009).
Sua produção é feita por uma família de isoenzimas expressas em uma
grande variedade de células de mamíferos, através da catálise enzimática do
aminoácido essencial L-arginina (GOMES et al. 2009). A catálise enzimática da
reação do aminoácido L-arginina e oxigênio, que resulta na formação de L-citrulina e
Óxido Nítrico, é feita por enzimas que são constitutivas (cONS) ou induzidas (iONS).
As cONS são enzimas que estão presentes em muitas células; sua liberação
depende da concentração intracelular de cálcio/calmodulina e, uma vez liberadas,
sintetizam ON por curtos períodos. O NO formado por esta via participa de muitos
processos homeostáticos. Por outro lado, as iONS independem da concentração
37
intracelular de cálcio, e são liberadas por macrófagos poucas horas após sua
ativação e também por outras células sob ação de citocinas (DUMMER et al. 2007).
Durante a resposta imune mediada por células, a maioria das células adquire
a capacidade de expressar a forma de NO induzida (BORGES et al. 2009). Sua
ação depende da célula T reconhecer um antígeno específico, embora não seja uma
resposta específica (AGUIAR et al. 2010). A expressão dos antígenos por
macrófagos murinos torna-se crucial para que haja a interação com linfócitos T e
conseqüente secreção de IFN-γ, um importante co-indutor da síntese de (ROCK et
al. 2010). Entretanto, SICHER et al. (1994) propuseram que o ON sirva como um
mecanismo de feedback, prevenindo a excessiva ativação das células T e produção
de ON. Neste contexto, possivelmente o ON possa ser visto como um modulador
imune (CHEN et al. 2010).
2.7.2 FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA (TNF-α)
Fator de necrose tumoral alfa é uma citocina proinflamatória, pleiotrópica,
sintetizada principalmente por macrófagos. Entretanto, após a estimulação com LPS,
monócitos, neutrófilos, linfócitos T e células NK também a sintetizam. Além disso, a
produção do TNF-α também pode ser estimulada por IFN, IL-1, IL-2, GM-CSF,
substância P, bradicinina, imunocomplexos, inibidores da cicloxigenase e fator
ativador plaquetário (PAF). Por outro lado, a produção pode ser inibida por
ciclosporina, dexametasona, prostaglandina E2 (PGE2), IL-6 e antagonistas do PAF
(Clark, 2007). As alterações endoteliais, principalmente a perda do controle na
coagulação, a atividade quimiotática e estímulo ao metabolismo oxidativo de
fagócitos são ações do TNF-α compartilhadas com a IL-1β. Igualmente o TNF-α,
possui atividade de pirógeno endógeno, aumenta a reabsorção óssea, a atividade de
adipócitos e a expressão de MHC-I e II. Estimula ainda, a produção de IL-6 fazendo
com que os hepatócitos produzam proteínas da fase aguda da inflamação. Além
disso, TNF-α é o principal mediador na caquexia das neoplasias malignas
(VARELLA e Forte, 2001).
38
O fator de necrose tumoral α é uma proteína de membrana de 26 kDa, um
importante regulador da imunidade e inflamação, bem como da diferenciação e da
morte celular (PARAMESWARAN, 2010). É sintetizado em resposta à inflamação,
infecção ou injúria e subsequentemente clivado por uma metaloproteinase, a TNF-α
convertase (TACE) que libera o peptídeo solúvel de 17 kDa (YAMAOKA et al.,
2008). TNF-α possui dois receptores expressos constitutivamente, TNFR1 e TNFR2.
O do tipo 1 se faz predominante na maioria das células, possuindo um domínio de
morte intracelular, contribuindo principalmente para a morte neuronal, ao passo que
o TNFR2 contribui para a neuroproteção (BERNARDINO et al., 2008). A interação
do receptor com proteínas adaptadoras deflagra uma complexa cascata de
sinalização, dentre as proteínas ativadas destacam-se a p38, JNK e MAP kinases
(Mathew et al., 2009). Os receptores da superfamília de TNF possuem um domínio
de morte em sua cauda citoplasmática, a qual recruta proteínas adaptadoras
(TRADD) por dimerização. Um complexo de proteínas sinalizadoras com TRADD e
TRAF-2 é recrutado quando TNF se liga a o TNFR1 o que leva a uma cascata de
eventos, como regulação do NF-ƙB, JNK e caspases que, por sua vez, influenciam
decisões de morte celular ou sobrevivência (KASSARDJIAN e KREYDIYYEH, 2008).
As funções do TNF-α mais bem caracterizadas estão relacionadas à apoptose e à
inflamação. Altas concentrações desta citocina no sangue de pacientes com
septicemias correlacionam-se com a piora do prognóstico.
Injeções de TNF-α em animais de laboratório, mesmo na ausência de
bactérias, levam a um quadro semelhante ao choque séptico, sugerindo uma
importante ação deletéria quando presente em quantidades excessivas. Porém em
pequenas concentrações (nM), já foi demonstrado que o TNF-α induz a proliferação
celular, promovendo neurogênese em cultura de células da zona subventricular de
ratos (BERNARDINO et al. 2008). Além disso, já são conhecidos os efeitos desta
citocina durante o desenvolvimento, em processos relacionados ao controle do
movimento e do formato celular, através das ações relacionadas ao citoesqueleto
(MATHEW et al. 2009). Desta forma, o TNF-α pode apresentar um papel central na
promoção de neurogênese e reparo cerebral em resposta à injúria e infecção.
Assim, da mesma forma que a IL-1β, o TNF-α pode regular tanto respostas tróficas,
quanto de diferenciação (KAKIASHVILI et al. 2009).
39
2.8 Técnicas analíticas utilizadas na avaliação de fitoterápicos
2.8.1 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO (IV)
O termo espectroscopia designa métodos analíticos, em que se estuda a
interacção de radiações electromagnéticas com as moléculas. A ligação de dois
átomos em moléculas envolve diferentes tipos de energia, tais como energia
translacional, vibracional e eletrônica. No caso da espectroscopia de infravermelho,
esta tem por base os movimentos relativos dos átomos numa molécula, isto é, as
suas vibrações (ALCÁCER, 2007). Assim, esta espectroscopia detecta a radiação
que é absorvida pelas ligações vibracionais moleculares. Para que ocorra absorção
por parte de uma molécula é necessário que a radiação incidente na molécula
provoque a excitação dos modos vibracionais de modo que sua energia corresponda
à diferença de dois níveis energéticos vibracionais. Assim, as absorções ocorrem a
um determinado comprimento de onda, que corresponda à energia que permite a
transição (SIESLER et al. 2002). Logo, o espectro na região do IV de uma
substância orgânica corresponde ao conjunto de bandas de absorção apresentadas
pela amostra submetida à radiação infravermelha e estas bandas correspondem às
mudanças na energia vibracional dos compostos orgânicos. A energia absorvida da
radiação IV provoca alterações transitórias nas ligações interatômicas, que podem
sofrer estiramentos ou deformações nos ângulos de ligação. As frequências em que
ocorrem as vibrações dependem da natureza das ligações em particular, mas são
também afetadas pela vizinhança química e pela molécula como um todo. A
presença de insaturações (conjugadas ou não), sistemas aromáticos e grupos
funcionais específicos podem ser verificados através da presença de bandas
características que têm grande importância na análise estrutural. Se o espectro IV
da substância desconhecida é superponível com o espectro IV de uma amostra
autêntica conhecida, então isso pode servir como uma prova de identidade, a qual é
muitas vezes preconizada para ideniticação de fármacos pelas farmacopeias
(FALKENBERG et al. 2001).
O potencial desta técnica foi evoluindo tornando-se hoje em dia numa
ferramenta bastante utilizada industrialmente, no controlo de qualidade e processo
40
(SIESLER ET AL. 2002). Apresentando como vantagens, a não destruição da
amostra, precisão de resultado, simplicidade e rapidez de leitura e não necessitando
de pessoal qualificado para a realização da mesma, pode assim ser utilizado
directamente no local de produção. Esta metodologia tem por isso aplicação em
diversos tipos de indústria, tais como alimentar, agrícola, farmacêutica, têxtil,
petrolífera, cosmética entre outras (NAES et al., 2002).
2.8.2 ANÁLISE TÉRMICA
A análise térmica constitui um conjunto de técnicas cada uma com a
propriedade de acompanhar uma propriedade específica. O conhecimento das
propriedades térmicas pode levar a melhora dos processos de moldagem,
transporte, conservação e até melhorar as aplicações de determinados compostos e
materiais. No caso da decomposição é útil saber quais são os produtos voláteis e os
resíduos gerados em relação a sua ação biológica ou ambiental. Quando uma
amostra é aquecida podem ocorrer mudanças químicas ou físicas em sua estrutura,
dependendo se o calor térmico é maior ou menor que a força de energia de suas
ligações. Essas mudanças podem ser úteis e industrialmente importantes, assim
como, podem provocar a deteriorização e queima, não sendo desejável em outros
casos. Por isso é importante estudar as mudanças térmicas de determinados
compostos, assim como os limites de temperatura nos quais podem ser submetidos
sem que se comprometa as suas propriedades (NUNES, 2009).
As técnicas termoanalíticas adquiriram importância crescente em todas as
áreas de conhecimento na química básica e aplicada. A utilização dessa
metodologia, dotada de grande potencialidade, foi favorecida pela disponibilidade de
instrumentos controlados por microprocessadores, capazes de fornecer informações
quanto ao comportamento térmico dos materiais de forma precisa e num tempo
relativamente curto. Tais métodos estão sendo largamente utilizados no controle de
qualidade de drogas naturais ou sintéticas, pois fornecem, com rapidez, dados sobre
a estabilidade do material analisado, em relação ao seu comportamento térmico.
Além de que dados preliminares sobre o material analisado levam a pensar que se
conhecendo o comportamento térmico do componente majoritário de uma planta,
41
pode-se identificar a autenticidade de um extrato bruto (GIOLITO e IONASHIRO,
1988).
2.8.3 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TG)
A análise termogravimética é uma técnica termoanalítica que acompanha a
variação de massa (perda e ou ganho) da amostra em função da variação de
temperatura. Pode-se dizer que o equipamento da análise termogravimétrica é
composto pela termobalança que permite a pesagem contínua da amostra em
função da temperatura á medida em que ela é aquecida ou resfriada. A razão de
aquecimento pode atingir 1ºC mim
-1
até 100ºC podendo chegar até 2000ºC. a
sensibilidade é de 1µg com capacidade de até 1g (ARAÚJO, 2006).
As curvas geradas possibilitam a obtenção de informações quanto à
estabilidade térmica da amostra, composição e estabilidade dos compostos
intermediários e do produto final (ALVES, 2008). Nas curvas termogravimétricas
convencional ou dinâmica são registradas as massa da amostra (m) em função da
temperatura (T) ou tempo (t). Nessas curvas, os degraus em relação ao eixo das
ordenadas correspondem às variações de massa sofrida pela amostra e permitem a
obtenção de dados que podem ser utilizados com finalidades quantitativas
(BANNACH, 2010).
2.8.4 ANÁLISE TÉRMICA DIFERENCIAL (DTA)
Técnica calorimétrica que determina continuamente as diferenças entre as
temperaturas da amostra e de um material de referência termicamente inerte, a
medida que ambos são aquecidos em um forno. A temperatura é medida por
termopares conectados aos suportes metálicos das cápsulas de amostra e do
material de referência, ambos contidos no mesmo forno. As variações de
temperatura na amostra são devidas às transições entálpicas ou reações
endotérmicas ou exotérmicas. As curvas DTA representam os registros de ∆T em
42
função da temperatura (T) ou do tempo (t), de modo que os eventos são
apresentados na forma de picos. Os picos ascendentes caracterizam os eventos
exotérmicos e os descendentes os endotérmicos (WENDLANDT, 1986; MACHADO
e MATOS, 2004).
2.8.5 CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)
Técnica calorimétrica termo analítica na qual as variações de entalpia (∆H)
são monitoradas em relação a um material de referência termicamente inerte
enquanto ambas são submetidas a uma programação controlada de temperatura.
De acordo com o método de medida utilizado, há duas modalidades: calorimetria
exploratória diferencial com compensação de potência e a calorimetria exploratória
diferencial com fluxo de calor. Na DSC com compensação de potência, a amostra e
a referência são aquecidas em compartimentos distintos, assim é possível mantê-las
em condições isotérmicas. Neste caso, a amostra sofre variações de temperatura
devido a eventos endotérmicos ou exotérmico em função do aquecimento ou
resfriamento,
ocorre
uma
modificação
na
potência
de
entrada
do
forno
correspondente, proporcionando a anulação desta diferença (WENDTLENDT, 1986).
Na DSC com fluxo de calor, a amostra e a referência contidas em seus
respectivos suportes de amostra, são colocados sobre um disco de metal
termoelétrico e aquecidos por uma única fonte de calor. Assim, o calor é transferido
através do disco para amostra e referência, sendo que o fluxo de calor diferencial
entre ambas é monitorado por termopares localizados abaixo dos suportes. Dessa
forma, a diferença no fluxo de calor da amostra e da referência é diretamente
proporcional à diferença de potência das junções dos termopares (SKOOG et al.
2002).
43
3. Objetivos
44
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
•
Contribuir para o estudo da espécie Struthanthus marginatus Blume através da
caracterização farmacognóstica, física-química e ensaios biológicos in vitro de
seu extrato bruto e frações.
3.2 Objetivos Específicos
•
Caracterizar através de parâmetros farmacognósticos e físico-químico a droga
vegetal (pó) da espécie Struthanthus marginatus Blume.
•
Avaliar a atividade antimicrobiana e antifúngica do extrato seco da tintura e
frações da espécie Struthanthus marginatus Blume.
•
Testar citotoxicidade do extrato seco da tintura e frações da espécie
Struthanthus marginatus Blume em células humanas mononucleares de
sangue periférico (PBMC).
•
Avaliar a produção das citocinas Óxido Nítrico e TNF-α, em células humanas
mononucleares de sangue periférico (PBMC).
45
4. Materiais e Métodos
46
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 MATÉRIA-PRIMA VEGETAL
Espécie:Struthanthus marginatus Blume.
Família: Loranthaceae
Parte Utilizada: Folhas
Quantidade utilizada: 5,9 kg
O material vegetal foi adquirido junto à Feira do Ver-o-Peso, procedente da
região metropolitana de Belém-PA, distrito de Icoaraci (latitude 1º 17’ 46” S e
longitude 48º 27’ 58.02” O). Cerca de 5,9 kg folhas foram coletadas no dia 30 de
Maio de 2011 às 08:00 horas. Houve o cuidado em separar uma amostra das partes
aéreas do vegetal (folhas) e posteriormente a secagem, foi confeccionada a exsicata
deste material. A exsicata foi submetida à identificação botânica, confirmando,
assim, a espécie de estudo: Struthanthus marginatus Blume, pertencente à família
Loranthaceae (Fig.4, p.47). Três exsicatas encontram-se depositadas no herbário do
Museu Paraense Emílio Goeldi, sob o número de registro MG 136939; MG 89015:
MG 89906. A identificação botânica foi realizada pela Coordenação de Botânica do
Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG), sob os cuidados técnicos do Prof. Dr. Mário
Augusto Gonçalves Jardim.
47
Figura 4 - Exsicata de Struthanthus marginatus Blume. (Arquivo pessoal).
4.1.2 REAGENTES E SOLUÇÕES
Reativo de Pascová, reativo de Fehling A, reativo de Fehling B, ácido
clorídrico (HCl) P.A, solução de ácido clorídrico (HCl) a 5%, ácido sulfúrico (H2SO4)
P.A, lugol, solução aquosa de ninhidrina a 1%, solução alcoólica de cloreto férrico
(FeCl3 a 1%), metanol P.A, raspas de magnésio, reativo de Bouchardat, reativo de
Dragendorff, reativo de Mayer, solução de ácido clorídrico (HCl) 6N, peróxido de
hidrogênio (H2O2) concentrado a 30%, solução de hidróxido de amônio (NH4OH) 6N,
reativo de Kedde, solução aquosa de vanilina a 1%, solução alcoólica de cloridrato
de hidroxilamina a 10%, solução metanólica de hidróxido de potássio (KOH) a 10%,
solução de HCl a 1 N, clorofórmio P.A, anidrido acético P.A, reativo para azuleno,
éter de petróleo, ácido trifluoracético, éter etílico, solução de hidróxido de sódio
(NaOH) a 1N, tolueno, solução de NH4OH a 10%, solução tampão fosfato pH 4,0 e
pH 7,0, Sulfato de sódio anidro, Dimetilsulfóxido DMSO, água ultra pura, água
destilada, Metanol, Etanol, Acetato de etila, acetonitrila P.A., Ácido clorídrico (HCl) 5
%, Álcool etílico absoluto 99,8 P.A, Álcool etílico a 70 %, azul de toluidina 1 %,
Clorofórmio, Éter etílico, Hexano, hidroxietilcelulose - Natrozol® 250 HHRP,
48
propilenoglicol PA-ACS – Química especializada Erich LDTA, metilparabeno –
mapric.
4.1.3 EQUIPAMENTOS
Estufa termoestatizada Quimis Q-314M222, Estufa modelo S805T (BIOPAR),
Moinho de facas, Agitador eletromagnético para peneiras (Bertel), Balança analítica
modelo BK 500 (GEHAKA), Forno mufla modelo 355l (ENGRO), Alcoômetro de Gay
Lussac, Potenciômetro modelo pHS3B (pHTek), Evaporador rotativo com banhomaria modelo 802 série 72025 (Fisatom), Bomba de vácuo modelo TE-058, Banho
de ultra-som Ultrasonic Cleaner modelo 1450 Unique (MaxiClean), Balança analítica
FA2104N (Bioprecisa), Câmara de luz ultravioleta 254-365 nm, Liofilizador modelo
MicroMicroModulyo/115 série 1K470021-1B freqüência 60 Hz 20 Aº acoplado a
bomba de vácuo modelo VLP-200 e ao filtro de óleo VPOF-110 (Thermo Savent);
Capela de fluxo laminar (TROX SVL), Centrifuga (), Chapa de aquecimento –
Quimis, Chapa aquecedora e agitadora (Nova Ética), Corning, Dessecadores de
vidros, Destilador de água, Estufa ventilada para secagem de material vegetal
Fanem, mod. 501ª, Evaporador rotatório, Büchi, modelo B 480, Geladeira, Cônsul,
Sistema de filtração de água Millipores, Milli-Q Plus, Micropipetas Ependorff, vol.
ajustável de 100 µL - 1 mL, Micropipetas Ependorff, vol. ajustável de 2 µL - 20 µL.
4.1.4 MATERIAIS PLÁSTICOS E VIDRARIAS
Balões de fundo redondo de 100, 250 e 500 mL, bastão de vidro, béqueres de
10, 50, 100, 500 e 1000 mL, condensador de bolas, cuba cromatográfica,
erlenmeyers de 50, 100, 250 e 500 mL, espátulas de metal, frascos eppendorf Sigma Chemical Company, funis de separação de 250 mL e 2000 mL, manta
aquecedora, membranas filtrantes Millipore - Millex F6 0,2 mm, Papel alumínio
49
comercial, Papel de filtro MN 618, Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL, Pipetas de
Pasteur de vidro, VWR, Pipetas volumétricas de 10 e 20 mL, Placas com 96 poços
de fundo chato, TPP, Placas de petri 90x15- PROLAB, Placas cromatográficas de
vidro10 x 5 e 10 x 10cm, Ponteiras de 10 a 1000µl e de 20 a 200µl, Provetas 5, 20,
50, 100, 500 e 1000 mL;
4.1.5 MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES
Ágar Muller-Hington, Ágar Saubouroud dextrose com cloranfenicol, Ágar SS
(Salmonella
Shigella),
Ágar
Nutriente
(Marca),
Caldo
Saubourroud,
Caldo
Tioglicolato, Caldo Tetrationato, Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)
sem NaHCO3 e com L- glutamina, Soro de bezerro (SIGMA-ALDRICH), Solução
tampão (PBS).
4.1.6 LINHAGENS BACTERIANAS E FÚNGICAS
Foram utilizadas cepas dos seguintes microorganismos: Staphylococcus
aureus ATCC 00577; Salmonella typhi ATCC 00259; Enterococcus faecalis ATCC
29212; Candida albicans ATCC 0175; Trichopyton mentagrophytes ATCC 9533. As
cepas dos microoganismos foram provenientes do Instituto Oswaldo Cruz – RJ
(FIOCRUZ) e Instituto Evandro Chagas – PA (IEC).
4.2 Métodos
As análises descritas a seguir foram realizadas por etapas nos seguintes
locais: Museu Parence Emílio Goeldi (MPEG), nos laboratórios de Processamento
50
de
Matrial
Vegetal,
Fitoquímica,
Controle
de
Qualidade
Físico-Químico,
Microbiológico e Farmacotécnica da Faculdade de Farmácia do Instituto de Ciências
da Saúde (ICS), e no Laboratório de Pesquisa e Análise de Combustível, Laboratório
de Química-Pesquisa do Instituto de Ciências Exatas e Naturais (ICEN) da
Universidade Federal do Pará (UFPA).
4.2.1 PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL
A planta fresca foi higienizada mediante lavagem em água potável e corrente
para remoção de terra, insetos e outras impurezas. O material vegetal foi imerso em
uma solução alcoólica a 70% v/v, com a finalidade de remover microorganismos
presentes e interromper o metabolismo do vegetal, evitando a alteração dos
compostos químicos originalmente presentes. Posteriormente o material vegetal foi
selecionado, separando-se as folhas, sementes e pecíolos. As partes do vegetal
utilizada neste estudo foram: folhas jovens e maduras de Struthanthus Marginatus
Blume.
As folhas foram secas em temperatura ambiente (por 48 horas) sobre
bancadas do laboratório de processamento de material vegetal da Faculdade de
Farmácia (UFPA), as quais se encontravam previamente limpas, sanitizadas e
revestidas com papel absorvente. A secagem das folhas foi realizada em estufa de
circulação forçada de ar mantida a temperatura de 40°C, durante quatro dias, tendo
a massa de uma amostra das folhas rigorosamente monitorada até peso constante.
Após a retirada das folhas já secas da estufa, estas foram pulverizadas em
um moinho de facas inoxidável a fim de reduzir o material vegetal a fragmentos de
pequenas dimensões (pó).
51
4.2.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA E FÍSICO-QUÍMICA DO PÓ DAS FOLHAS DE
Struthanthus marginatus Blume.
4.2.2.1 Determinação da distribuição granulométrica do pó de Struthanthus
marginatus Blume
O
procedimento
foi
desenvolvido
usando
um
agitador
de
tamises
eletromagnético que produziu movimentos horizontais e verticais e utilizando-se
tamises padronizados superpostos, partindo-se de maior ao menor diâmetro.
Exatamente 25g da droga seca e pulverizada foram submetidos à série de
tamises com abertura de malha de 1700 µm, 710 µm, 355 µm, 250 µm, 180 µm, 125
µm; durante 30 minutos. O tamanho das partículas foi avaliado pela quantificação
percentual de retenção de pó em triplicata de S. Marginatus Blume., em cada tamis
(FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
4.2.2.2 Determinação de perda por dessecação do pó Struthanthus marginatus
Blume
Exatamente 3 g da droga seca e pulverizada foram transferidas para
pesafiltro. A amostra foi submetida a aquecimento em estufa a 105°C durante 2
horas, seguida de resfriamento em dissecador e pesagem. Repetiu-se a operação
até obtenção de peso constante. Os resultados de três determinações foram
avaliados em termos de porcentagem ponderal sobre a quantidade da amostra,
utilizando a seguinte equação: (FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
% perda = Pu– Ps/Pa x 100
Onde:
Pa = peso da amostra (g)
52
Pu = peso do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação (g)
Ps = peso do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação(g)
4.2.2.3 Determinação do teor de cinzas totais do pó Struthanthus marginatus Blume
Aproximadamente 3g do pó foram transferidos a cadinhos de porcelana
previamente calcinados, resfriados e pesados. As amostras foram aquecidas
gradualmente até chegar a 450 º C e então carbonizadas em mufla por 2h. Após
resfriamento em dissecador sob vácuo, as mesmas foram pesadas em balança
analítica, repetindo-se o procedimento até a obtenção de peso constante. A
porcentagem de cinzas foi calculada em relação à droga seca (FARMACOPEIA
BRASILEIRA V, 2010).
4.2.2.4 Obtenção do perfil térmico por termogravimetria (TG, DTA e DSC) do pó
Struthanthus marginatus Blume.
As análises termogravimétricas do pó de S. marginatus B. foram realizadas
por TG, DTA e DSC. Tais análises foram obtidas nas seguintes condições: utilizouse uma massa de aproximadamente 8 mg de cada amostra e as transferiu para um
cadinho de platina, logo após, foram submetidas a uma faixa de temperatura entre
25 °C a 600 ºC, sob atmosfera dinâmica de nitrogêni o (25 mL/min) e razão de
aquecimento de 5 ºC/min. Os cálculos de perda de massa foram realizados com
auxílio do programa TA-60W da Shimadzu® (SILVA JUNIOR et al. 2006; ALVES et
al. 2008, NUNES et al. 2009).
A determinação da curva DSC do extrato foi analisado na faixa de
temperatura de 25 °C até 300 °C. Para todos os outr os parâmetros seguiram-se os
mesmos critérios adotados para TG e DTA.
53
4.2.3 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E FÍSICO-QUÍMICA DA
TINTURA DO PÓ DAS FOLHAS DE Struthanthus marginatus Blume..
4.2.3.1 Obtenção da tintura.
Para obtenção da tintura de S. marginatus utilizou-se o processo extrativo
chamado maceração preconizado pela FARMACOPEIA BRASILEIRA V (2010).
Nesse processo, a tintura foi preparada em solução hidroalcoólica a 70º GL com teor
de 20% da droga (p/v), onde permaneceu por 10 dias em recipiente de aço
inoxidável, hermeticamente fechado, periodicamente agitado. Durante todo o
processo, o material esteve ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. Após a
maceração, a tintura foi filtrada, armazenada em recipientes escuros e colocada sob
refrigeração.
4.2.3.2 Determinação do pH da tintura.
A determinação do pH da tintura de S. marginatus B. foi da realizada em
potenciômetro previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e os
resultados correspondem à média de três determinações (FARMACOPEIA
BRASILEIRA V, 2010).
.
4.2.3.3 Determinação da densidade aparente da tintura.
Um picnômetro com capacidade para 5mL, previamente tarado, foi
preenchido com o líquido padrão (água recém destilada e fervida) e pesado. Em
seguida o picnômetro foi preenchido com 5mL da amostra (tintura) e pesado. A
relação, em triplicata, entre o peso da amostra e do líquido padrão, em um volume
54
fixo à temperatura de 20 ºC forneceu o valor da densidade relativa da tintura de
Struthanthus marginatus B., à média de três determinações independentes
(FARMACOPEIA BRASILEIRA V, 2010).
4.2.3.4 Determinação do teor de sólidos da tintura.
Cerca de 1 mL da tintura foi pipetado e transferido para pesa-filtro
previamente tarado nas condições empregadas durante a análise propriamente dita.
Posteriormente, o pesa-filtro foi levado à secura em placa aquecedora, não
excedendo a 40 ºC e dessecado em estufa sob temperatura 105 ºC por 2 h até peso
constante. Após este período, o pesa-filtro foi resfriado em dissecador e pesado em
balança analítica. O teor de sólidos foi calculado pela média de três determinações
do resíduo seco (MACIEL et al. 2006).
4.2.4 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DA TINTURA
4.2.4.1 Obtenção do extrato seco a partir da tintura
Um volume da tintura foi concentrado em evaporador rotativo a baixa pressão,
para remoção do solvente orgânico tendo o cuidado para que a temperatura de
aquecimento não excedesse 40°C.
Após a evaporação do solvente o extrato foi levado à estufa a 40°C, até total
evaporação do resíduo de solvente e para obtenção do extrato seco de S.
marginatus Blume.
55
4.2.4.2 Obtenção do extrato seco liofilizado
O extrato seco liofilizado de S. marginatus Blume., foi obtido após a
evaporação do solvente em evaporador rotativo sob baixa pressão e o extrato
aquoso resultante foi resfriado a -70°C e liofiliza do.
4.2.4.3 Prospecção fitoquímica do extrato seco liofilizado
A prospecção fitoquímica do extrato bruto liofilizado foi realizada com a
finalidade de identificar a presença de classes de metabólitos secundários na
espécie em estudo. Dessa forma, realizaram-se testes para: saponinas, ácidos
orgânicos, açúcares redutores, polisssacarídeos, fenóis e taninos, proteínas e
aminoáciodos, flavonóides gerais, glicosídeos cardíacos, catequinas, derivados de
benzoquinonas, naftoquionas, fenantroquinonas, lactonas sesquiterpênicas e outras
lactonas, alcalóides, purinas, esteróides, triterpenóides, azulenos, carotenóides,
depsídios, depsidonas, derivados da cumarina e antraquinonas. Os testes foram
realizados em triplicata e seguiram as condições estabelecidas no Manual para
Análise Fitoquímica e Cromatográfia de Extratos Vegetais (BARBOSA et al. 2001). O
procedimento experimental segue dscrito:
a. Testes que utilizam água como solvente:
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de S. marginatus Blume.
para realizar os testes que utilizam água destilada como solvente. Para isso, foram
pesados 140 mg de EB e dissolvidos em 28 mL de água destilada. Em seguida esta
solução foi levada ao banho de ultrassom a fim de dissolver todo soluto.
Posteriormente, a solução foi filtrada em papel de filtro Whatman qualitativo,
reservando o filtrado e obtendo-se a solução-mãe.
56
Saponinas espumídicas:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio (triplicata),
sendo diluída em 15 mL. Em seguida, a solução foi agitada vigorosamente por 2
minutos em tubo fechado. Se a camada de espuma permanece estável por mais de
meia hora, o resultado é considerado positivo.
Ácidos orgânicos:
Foram transferidos 2 mL da solução-mãe já filtrada para uma placa escavada.
À solução foi adicionada gotas do reativo de Pascová. Se houver descoloração do
reativo, a reação é positiva.
Açúcares redutores:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio. Em seguida,
foram adicionados 2 mL do reativo de Fehling A e 2 mL do reativo de Fehling B e
levados ao aquecimento em banho maria até ebulição por 5 minutos. O
aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presença de açúcares
redutores.
Polissacarídeos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado de
2 gotas de lugol. O aparecimento de coloração azul indica resultado positivo.
Fenóis e Taninos:
57
2 gotas de solução alcoólica de FeCl3 a 1%. Qualquer mudança na coloração ou
formação de precipitado indica reação positiva, quando comparado com o teste em
branco (solvente+reativo). Uma coloração inicial entre o azul e o vermelho é
indicativa da presença de fenóis. Precipitado escuro de tonalidade azul indica
presença de taninos pirogálicos, e verde, presença de taninos catéquicos.
Proteínas e aminoácidos:
0,5 mL de solução aquosa de nihidrina a 1% e aquecido em banho maria até
ebulição. O aparecimento de coloração violeta persistente indica reação positiva.
b. Testes que utilizam como solvente metanol:
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de S. marginatus Blume
para realização dos testes que utilizam metanol como solvente. Para isso, foram
pesados 120 mg de EB e dissolvidos em 24 mL de metanol. Em seguida esta
Flavonóides:
Foram transferidos 10 mL da solução-mãe para tubo de ensaio (triplicata), em
seguida foram adicionadas 5 gotas de HCl concentrado e raspas de magnésio. O
surgimento de uma coloração rósea indica reação positiva.
58
Glicosídeos cardíacos:
Foram transferidos 5 mL da solução-mãe para tubo de ensaio. Esta foi
separada em duas porções de 2 mL cada e adicionada gotas do reativo de Kedde. O
aparecimento de coloração azul ou violeta indica reação positiva.
Catequinas:
Foram transferidos 3 mL da solução-mãe para tubo de ensaio, adicionado 1
mL de solução aquosa de vanilina a 1% e 1 mL de HCl concentrado. O surgimento
de coloração vermelha intensa indica reação positiva.
Derivados de benzoquinonas, naftoquinonas e fenantraquinonas:
gotas de Na2CO3 a 25%, 2 gotas de formaldeido a 4% e 2 gotas de odinitrobenzeno
a 5%. Em seguida, a solução foi aquecida em banho maria. O aparecimento de uma
coloração violeta indica reação positiva.
Sesquiterpenolactonas e outras lactonas:
gotas de solução alcoólica de cloridrato de hidroxilamina a 10% e 2 gotas de solução
metanólica de KOH a 10%. A solução foi aquecida em banho Maria durante 2
minutos. Em seguida, resfriada e acidulada com solução de HCl a 1N, por fim foi
adicionado 1 gotas de FeCl3 1%. O surgimento de uma coloração violeta indica
reação positiva.
59
c. Testes que utilizam como solvente clorofórmio:
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de S. marginatus Blume.
para realizar os testes que utilizam clorofórmio como solvente. Para isso, foram
pesados 75 mg de EB e dissolvidos em 15 mL de clorofórmio. Em seguida esta
Esteróides e triterpenóides:
10 ml da solução-mãe foram filtrados sobre carvão ativado (triplicata). O
filtrado foi transferido para um tubo de ensaio completamente seco, adicionado 1 mL
de anidrido acético e agitado suavemente. Em seguida, foram adicionadas 3 gotas
de H2SO4 concentrado e novamente agitado. O rápido desenvolvimento de cores
que vão do azul evanescente ao verde persistente indicam resultado positivo.
Azulenos:
2 mL da solução-mãe foram transferidos para tubo de ensaio. Esta foi
concentrada até 0,5 mL em banho maria e adicionada 2,5mL da solução de reativo
de azuleno. Em seguida, a solução foi aquecida em banho maria durante 5 minutos.
Após resfriar, o conteúdo do tubo de ensaio foi transferiu para um funil de
decantação e adicionado 10 mL de éter de petróleo. Este foi agitado e quando as
duas fases estavam distintas, a fase aquosa foi observada. Quando há presença de
proazulenos, a fase aquosa adquire coloração azul, porém, quando estes estão em
pequena quantidade, a coloração observada é esverdeada.Carotenóides:
60
3 ml da solução-mãe foram transferidas para tubo de ensaio, no qual foram
adicionadas gotas de ácido trifluoracético. O desenvolvimento de coloração azul
indica reação positiva.
d. Testes que utilizam como solvente éter etílico:
Foi preparada uma solução-mãe com extrato bruto de S.marginatus Blume.
para realizar os testes que utilizam éter etílico como solvente. Para isso, foram
pesados 50 mg de EB e dissolvidos em 10 mL de éter etílico. Em seguida esta
solução foi levada ao banho de ultra-som a fim de dissolver todo soluto.
Depisídios e depsidonas:
5 mL da solução-mãe foram transferidos para um tubo de ensaio (triplicata) e
evaporado em banho maria. Posteriormente, 3 mL de metanol foram adicionados ao
resíduo e agitado. Após agitação, foram adicionadas 3 gotas da solução de FeCl3
1%. O aparecimento de coloração verde, azul ou cinza indica reação positiva.
Derivados da cumarina:
5 mL da solução-mãe foram transferidas para um tubo de ensaio (triplicata),
o solvente foi concentrado em banho maria até 0,5 mL. Em seguida, foi aplicada em
um papel de filtro gotas da solução etérea, de modo que se formou duas manchas
de aproximadamente 1 cm de diâmetro cada. A uma destas manchas foi adicionada
1 gota de solução de NaOH 1N e a metade dela foi coberta com papel escuro,
61
expondo a outra metade à luz ultravioleta. Para leitura do resultado as manchas
foram descobertas e comparadas. O aparecimento de fluorescência azul na parte
exposta da mancha indica reação positiva.
e. Demais testes:
Alcalóides:
25 mg do extrato bruto de S. marginatus Blume foram dissolvidos em 5 mL de
solução de HCl 5% e filtrados. Foram separadas quatro porções de 1 mL em cada
cavidade de uma placa escavada e 1 mL do branco e adicionado em cada cavidade
gotas dos reativos de Bouchard, Dragendorff, Mayer e Bertrand. Precipitação ou
turvação em pelo menos uma cavidade é indicativa de resultado positivo.
4.2.4.4 Fracionamento do extrato seco liofilizado
Para o fracionamento do extrato seco empregou-se o método de partição
sólido-líquido utilizando solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano,
acetato de etila, acetona e metanol).
Pesaram-se aproximadamente 20g do extrato bruto de S. marginatus B. os
quais foram adicionados alíquotas de 100 mL de cada um dos solventes citados na
ordem apresentada anteriormente até o esgotamento do extrato.
As soluções provenientes do fracionamento foram concentradas em
evaporador rotativo, fornecendo as frações hexânica, diclorometano, acetato de
etila, acetona e metanólica.
4.2.4.5 Obtenção do perfil espectroscópico na região do infravermelho do extrato
seco liofilizado.
62
O extrato liofilizado foi submetido à análise por espectroscopia de absorção
na região do IV. As leituras foram realizadas na faixa de absorção de número de
onda de 4000 cm-1 a 500 cm-1, com quantidade apropriada da amostra comprimida
em cristal de seleneto de zinco (SILVA JUNIOR, 2006, ALVES, 2008, NUNES,
2009).
4.3.1 ENSAIOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DE S.
marginatus B.
4.3.1.1 Micro-organismos testados:
Os micro-organismos testados foram cepas padrão ATCC (American Type
Culture Colection) recomendadas para testes de suscetibilidade aos antimicrobianos
(CLSI, 2003). As cepas foram mantidas em freezer a - 20°C em caldo BHI com 15%
de glicerol até a sua utilização. Para uso nos testes, as bactérias foram inicialmente
semeadas em caldo Mueller Hinton para cepa de Staphylococcus aureus, caldo
Lactose para cepas de Salmonella thiphy e caldo Sabouraud dextrose com
Cloranfenicol para cepas de Candida albicans e Trichophyton mentagrophytes e
incubadas a 35 ºC por 24 horas para seu crescimento.
4.3.1.2 Padronização do inóculo
A padronização do inóculo foi feita pelo método de suspensão direta das
cepas ATCC, que consiste em fazer uma suspensão direta em solução salina. A
suspensão foi ajustada para que sua turbidez coincidisse com a da solução padrão
de McFarland 0,5, aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL, usando o Densichek
plus (Densitômetro) (CLSI, 2009).
63
4.3.1.3 Avaliação da atividade antifúngica do extrato seco liofilizado e frações
liofilizadas de S. marginatus B. capaz de inibir a germinação dos esporos de
Trichophyton mentagrophytes.
Para a realização preliminar da atividade antifúngica do extrato seco e frações
liofilizadas de S. marginatus B. frente a cepas de T. mentagrophytes empregou-se a
técnica de microdiluição em caldo, de acordo com ELOFF, (1998). Esta técnica
baseia-se na obtenção da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato capaz de
inibir a germinação dos esporos.
O inóculo consistiu na preparação de uma suspensão de esporos em solução
salina em seguida transferida para um novo tubo de ensaio passando por um funil
contendo gazes estéreis, para retenção das hifas. A contagem e visualização dos
esporos foram feitos em câmara de Neubauer e microscópio óptico, o resultado
obteve-se através da soma dos quadrantes multiplicado pelo fator de correção da
câmara 104.
Após ajuste da concentração de esporos no inóculo, adicionaram-se 100 µL
do Caldo Saboround Dextrose (CSD) em uma placa de 96 poços de fundo chato nas
linhas A, B, C, D, E, F, G e H e colunas de 1 a 10 da placa. Em seguida, foram
colocados 10 µL do extrato bruto e frações de S. marginatus em duplicata (colunas 1
a 10). Foi realizada uma diluição seriada 1 : 2 do extrato bruto e frações desde o
poço A até o poço H onde se desprezou os 100 µL restantes. Por fim, colocaram-se
30 µL da amostra de Trichophyton mentagrophytes nos poços onde estavam
presentes os meios de cultura, o extrato bruto e frações de S. marginatus B. O
controle positivo foi constituído de meio de cultura caldo Saboround (100µL), solução
contendo esporos de Trichophyton mentagrophytes (30µL); O controle negativo foi
constituído com meio de cultura caldo Saboround (100µL), solução contendo
esporos de Trichophyton mentagrophytes (30 µL) e de anfotericina B na
concentração de 1µg/mL (10 µL). A placa foi mantida em estufa à temperatura de
25ºC no tempo de 24 e 72 horas. No tempo de 24 horas, determinou-se se o extrato
bruto e frações de S. marginatus B. foram capazes de inibir a germinação dos
esporos e em 72 horas determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM).
64
A leitura da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada em microscópio
invertido com aumento de 100x, no qual, após 24 horas, foi determinado se o extrato
bruto e frações de S. marginatus B. eram capazes de inibir a germinação dos
esporos. Após 72 horas, foi determinado o ponto final das leituras visualmente,
baseando-se na comparação do crescimento dos esporos nos poços contendo os
compostos com aqueles do controle de crescimento (controle positivo). A CIM foi
definida como a menor concentração que inibiu completamente o crescimento visível
dos fungos, após 3 dias de incubação.
4.3.1.4 Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato seco e frações liofilizadas
de S. marginatus B. frente cepas bacterianas.
As cepas bacterianas das espécies Salmonella typhi ATCC 00259,
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 00577 foram
transferidos para três tubos falcon de 15 mL contendo cerca de 3 mL de caldo
lactose e caldo Mueller Hinton respectivamente. Os tubos foram identificados e
incubados conforme sua exigência de crescimento para bactérias (24h a 35 ºC ± 5%
de CO2).
Quatro tubos de ensaio foram preenchidos com solução salina a 0,9% onde
foi gotejado caldo contendo as cepas até turvação (0,5 Escala Mac Farland). A
escala nefelométrica de Mc Farland é o padrão de turvação mais frequentemente
utilizado nos laboratórios de microbiologia, para determinar a intensidade da
multiplicação em meios de cultivo líquidos. Esta multiplicação se manifesta nos
meios líquidos por um aumento das partículas (bactérias) que se opõem a livre
passagem da luz, provocando turvação ou opacidade no meio. Quanto maior o
número de bactérias, maior será a opacidade do meio de cultura. A turvação
bacteriana corresponde a cerca de 0,5 da escala de McFarland. Isto significa que há
aproximadamente 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. O inóculo
bacteriano pode ser obtido por meio do método de crescimento ou da suspensão
direta da colônia. Independentemente do método de preparação do inóculo, antes da
65
inoculação das placas, a turbidez da suspensão bacteriana deve ser mensurada
com o auxílio de um turbidímetro.
Após a obtenção da escala de McFarland foi adicionado cerca de 100 µL de
caldo na placa de 96 poços. Fez diluição (1:2) do extrato bruto e frações partindo da
concentração inicial de 1000µg; 500 µg; 250 µg; 125 µg; 62,5 µg; 31,25 µg; 15,625
µg; respectivamente. O ultimo poço foi utilizado para controle contendo apenas caldo
de cultura e cepas dos micro-organismos ajustados pela escala de McFarland. A
placa foi incubada a 35º C por 24 h. Após incubação, observou o crescimento
bacteriano (turvação) nos respectivos poços contendo o cultivo bacteriano
juntamente com extrato bruto e frações. Fez-se o cultivo em placa de Agar (triplicata)
dos poços e observou-se o crescimento das colônias bacterianas (HOLETZ et al.
2002).
4.3.2 TESTES PARA AVALIAÇÃO DA IMUNOMODULAÇÃO
4.3.2.1 Coleta de células PBMC.
Foram coletados através de punção venosa, em tubos heparinizados,
aproximadamente 40mL de sangue de cada paciente e indivíduo não infectado. A
coleta foi efetuada por um profissional capacitado. Após a coleta o sangue total foi
adicionado à solução de Ficoll-Hypaque e levado para centrifugação, (20 minutos a
24°C). Ao término da centrifugação formou-se um ane l celular o qual foi coletado e
transferido para tubos contendo meio de cultura – RPMI-1640 para ser lavado por
três vezes por centrifugação (10 minutos a 4°C), ao final desta seqüência de
lavagens, o “pellet” de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) formado
foi suspenso em RPMI (meio de cultura) e contado em câmara de Neubauer para
ser ajustado para a concentração 5x106/mL (GAZZINELLI, 1983). As células foram
cultivadas em placas de microtitulação de 96 well com fundo chato (NUNC), com o
estímulo do extrato bruto e frações de S. marginatus B nas concentrações de: 1000;
500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62 e 7,81µg/mL respectivamente ou na ausência de
66
qualquer estímulo, para um volume final de 200µL/well. O controle positivo
constituiu-se de células + meio RPMI completo + LPS. O controle negativo
constituiu-se meio RPMI completo. As células foram então incubadas a 37ºC em
estufa contendo 5% de CO2. Após 24 horas de incubação, foram coletados os
sobrenadantes para dosagem de TNF-α e Óxido Nítrico.
4.3.2.2 Teste de Citotoxicidade em células PBMC.
O experimento foi realizado utilizando a técnica de MTT (MOSMANN, 1983).
Em uma placa de 96 cavidades, foram incubadas suspensões de células PBMC
(100µL por cavidade), na concentração de 5x106 células/mL, por 3 horas para a
aderência. Após o período de incubação e aderência das células nos poços da
placa, o sobrenadante foi removido e acrescentado 100 µL da concentração do
extrato liofilizado e frações. O teste foi realizado em triplicata, com isso cada grupo
celular tratado foi composto por 12 amostras de cada diluição. O controle positivo
constituiu-se de suspensão celular (5x106) e anfotericina B nas seguintes diluições:
100; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,62 µg/mL respectivamente. O controle negativo
constitui-se de suspensão celular (5x106) e meio de cultura RPMI. A placa de cultura
foi incubada durante 24 h, 25 ºC em estufa de CO2. Após o período de incubação,
adicionou-se
cerca
de
10
µLr
de
MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide) em todos os poços incluindo os controles e banco.
Incubou-se por 4 horas e fez leitura em leitor de Elisa de comprimento de onda a
490 nm. As densidades ópticas (DO) foram convertidas em porcentagem de
viabilidade celular (Ferreira, 2010) empregando-se a seguinte fórmula:
% Viabilidade = (DO Grupo Tratado x 100) / Média DO Grupo Controle
A solução de MTT foi preparada a partir da suspensão de 0,5 mg do pó de MTT
(Sigma Aldrich Co., Alemanha) em 1 mL de Phosphate Buffer Saline (PBS) (Cultilab,
Brasil) esterilizado.
67
4.3.2.3 Dosagem de Óxido Nítrico em células PBMC.
O Óxido Nítrico, quantificado pelo acúmulo de nitrito em meio de cultura, foi
medido espectrofotometricamente usando reagente de Griess com nitrito de sódio
(NaNO2) como padrão (GREEN et al. 1982).
Em cada orifício de uma placa de 96 cavidades foram adicionados 100µL de
uma suspensão celular ajustada na concentração de 5x106 células/mL. Após a
aderência das células, a placa foi incubada com 100µL das preparações obtidas a
partir da droga vegetal ou somente meio de cultura RPMI-1640 (controle negativo),
por 24 h a 37 ºC em estufa com tensão constante de 7,5% de CO2. Como controle
positivo, foi utilizado 100µL de uma solução de LPS a 1µg/mL. Após a incubação,
alíquotas de 100µL do sobrenadante da cultura foram misturadas com 100µL do
reagente de Griess (sulfanilamida 0,1%; N-naftil-etilenodiamino 0,1% e ácido
fosfórico a 3%). Após 10 minutos a temperatura ambiente, a absorbância foi lida a
540 nm em leitor de ELISA (Multiskan, Labsystem, Finlândia). Os dados foram
expressos como µmols/5x105 células através da curva padrão obtida anteriormente
com concentrações molares conhecidas de NaNO2 (Merk) em meio RPMI-1640.
4.3.2.4 Teste de ELISA para dosagem de TNF- α.
Neste ensaio foi utilizado a técnica de ELISA sanduiche no qual foi usada
uma microplaca de 96 poços já revestidos com um anticorpo monoclonal específico
para TNF-α. Foram efetuadas diluições da solução padrão de TNF-α para posterior
elaboração da curva padrão. Tanto as diluições padrão como as amostras em
estudo foram colocadas nos poços da microplaca e o TNF-α presente em cada uma
ligou-se ao anticorpo monoclonal específico para TNF-α. Após incubação de 2 horas
à temperatura ambiente foram efetuadas 4 lavagens com o tampão de lavagem
apropriado de modo a retirar as substâncias não ligadas. Seguiu-se a adição do
conjugado (anticorpo policlonal específico para TNF-α ligado a uma enzima) e após
1 hora de incubação à temperatura ambiente foram efetuadas mais 4 lavagens com
68
tampão de lavagem. Para realização desta técnica, foi usada uma micropipeta de 96
poços já revestida com anticorpo monoclonal específico para TNF-α. A curva padrão
foi elaborada com diluições da solução de TNF-α. Tanto as diluições padrão como
as amostras em estudo foram colocadas nos poços da microplaca e o TNF-α
presente ligou-se ao anticorpo monoclonal específico. Após incubação em
temperatura ambiente foi feito 4 lavagens de modo a retirar as substâncias não
ligadas. Seguiu-se a adição do conjugado (anticorpo policlonal ligado a uma enzima)
e após 1 hora de incubação foram efetuadas 4 lavagens de forma a remover o
conjugado não ligado. Em seguida foi adicionado o substrato e incubou-se a placa
20 minutos, no escuro e à temperatura ambiente. Neste passo ocorre o
desenvolvimento de coloração, a qual é proporcional à quantidade de TNF-α ligado
no passo inicial. O desenvolvimento de coloração foi parado pela adição da solução
stop e a intensidade da cor medida a 450 e 570 nm no aparelho Infinite M200
(TECAN).
4.4.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada através de análise de variância (ANOVA)
utilizando o pós-teste de Dunnet de acordo com o programa Graphpad Instat versão
3.05. O nível de significância foi de 5%, ou seja, as diferenças foram consideradas
significativas quando p<0,05.
69
5. Resultados
70
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação das características físicas e físico-químicas do pó das folhas de
S. marginatus Blume.
5.1.1 DETERMINAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA DO PÓ DAS
FOLHAS DE S. marginatus Blume.
Pela avaliação granulométrica do pó das folhas de Struthanthus marginatus
Blume. observou-se que as partículas passaram em sua totalidade pelo tamis com
abertura nominal de malha 1700 µm e menos de 40% das partículas do pó passou
pelo tamis com abertura nominal de malha de 355 µm, o que caracteriza o pó como
grosso, segundo a Farmacopéia Brasileira 5ª Ed. (2010), (Figura 5).
Distribuição Granulométrica
60,00%
50,00%
47,62%
40,00%
38,77%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
5,62% 3,79%
2,49%
1,54%
0,17%
1700 710
355
250
180
125 Fundo
Abertura da malha do Tamis (µm)
Figura 5 - Determinação da distribuição granulométrica do pó das folhas de S. marginatus Blume.
71
5.1.2 DETERMINAÇÃO NA PERDA POR DESSECAÇÃO E DO TEOR DE CINZAS
TOTAIS DE DO PÓ DAS FOLHAS DE S. marginatus B.
Tabela 1 - Determinação da perda por dessecação e determinação do teor de cinzas totais de S.
marginatus Blume.
ƞ
X (%) ± DPR
Perda por dessecação
3
8,7 ± 0,472
Teor de cinzas totais
3
11,6 ± 0,465
Testes
Ƞ = nº de amostras
X = Média dos desvios independentes
DPR = Desvio padrão relativo
5.1.3 ANÁLISE DO PERFIL TÉRMICO DO PÓ DAS FOLHAS DE S. marginatus
Blume
5.1.3.1 Termogravimetria e análise térmica por TG e DTG do pó das folhas de S.
marginatus B.
As curvas termogravimétricas (TG e DTG) do pó das folhas de S. marginatus,
mostram que houveram três eventos térmicos. O primeiro evento foi registrado na
faixa de temperatura de 49°C a 95,96°C com perda in icial de massa de 8,369%. No
segundo evento a temperatura a partir de 213,58°C a té 338 °C sofreu perda de
massa de 38,64% e de 438 °C até 518 °C a perda de m assa foi de 29,102% (terceiro
evento). Foi possível verificar uma perda total de massa de 76,12% na faixa de
temperatura analisada a partir de 45 °C a 600 °C, c om resíduo de 23,88%
confirmados pelos eventos endotérmicos e exotérmicos registrados na curva DTG
(Figura 6; Tabela 2).
72
1
1
2
3
3
2
Figura 6 - Curvas TG e DTG do pó das folhas de S. marginatus Blume. obtidas a 5°C/min. sob
atmosfera: N2, fluxo: 25,00 mL/min.
Tabela 2 - Perfil termogravimétrico (TG) do pó das folhas de S. marginatus B. com suas respectivas
perdas de massa, em cada intervalo de temperatura (°C).
Temperatura ºC
∆Perda de massa (%)
49 - 95,96
8,369
213,58 – 338
38,64
438 - 518
29,102
5.1.3.2 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
A curva DSC do pó das folhas de S. marginatus Blume vegetal mostra um
evento endotérmico na faixa de temperatura de 64,39°C a 93,89°C, com um
consumo de energia de 123,28 J⁄g. O processo de decomposição tem início na
temperatura de 200 °C, sendo evidenciado por dois e ventos exotérmicos
consecutivos. O primeiro ocorre na faixa de temperatura de 249,27°C a 369,87°C
73
(∆H= 222,97 J/g) e o segundo ocorre na faixa de temperatura de 425,98°C a 586,53
°C ( ∆H= 6,35 J/g) (Figura 7; Tabela 3).
Figura 7 - Curva DSC do pó das folhas de S. marginatus B. obtida 5 ºC/min, sob atmosfera: N2, fluxo:
25,00 mL/min.
Tabela 3 - Valores das entalpias apresentadas pelo pó das folhas de S. marginatus B. em diferentes
temperaturas, analisadas por DSC.
∆ Temperatura
Entalpia ∆H (J/g)
Eventos
64,39 - 93,89
123,28
Endotérmico
249,27 - 369,87
- 222,97
Exotérmico
425,98 - 586,53
- 6,35
Exotérmico
74
5.2 Caracterização química e físico-química do extrato bruto liofilizado do pó
das folhas de Struthanthus marginatus Blume.
5.2.1 OBTENÇÃO DA TINTURA
A tintura foi preparada por maceração segundo a FARMACOPEIA
BRASILEIRA V 2010, onde forneceu 30,5g de extrato mole, representando um
rendimento de 5.083% em relação ao pó da droga utilizada (600g).
5.2.2 DETERMINAÇÃO DO PH, DENSIDADE APARENTE E TEOR DE SÓLIDOS
DA TINTURA.
Os valores do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de S.
marginatus Blume. estão descritos na tabela 4.
Tabela 4 - Determinação do pH, densidade aparente e resíduo seco da tintura de S. marginatus
Blume.
Determinações
Resultados / Desvio Padrão
pH
5.16 ± 0,005
Densidade
0.886 ± 0,005
Resíduo seco
7.2% ± 0,057
75
5.2.3 OBTENÇÃO DO EXTRATO SECO LIOFILIZADO
A liofilização do extrato bruto do pó das folhas de Struthanthus marginatus B.
teve rendimento de cerca 9,53 g, representando 31,245% do extrato bruto obtido.
5.2.4 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA DO EXTRATO SECO LIOFILIZADO.
O resultado do screening fitoquímico pode ser visualizado na tabela 5.
Tabela 5 - Prospecção fitoquímica do extrato bruto liofilizado de S. marginatus Blume.
Metabólitos Secundários
Saponinas
Ácidos orgânicos
Açúcares redutores
Polissacarídeos
Proteínas e aminoácidos
Fenóis
Taninos catéquicos
Flavonóides
Alcalóides
Glicosídeos cardíacos
Catequinas
Derivados benzaquinonas;
Naftoquinonas e Fenantraquinonas
Sesquiterpenolactonas
Esteróides e triterpenóides
Azulenos
Carotenóides
Depsídeos e depsidonas
Derivados da cumarina
Antraquinonas
Resultado
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
76
5.2.5 PERFIL ESPECTROSCÓPICO NA REGIÃO IV DO EXTRATO BRUTO E
FRAÇÕES LIOFILIZADAS DE S. marginatus Blume.
Na figura 8 visualizamos uma banda próxima do comprimento de onda 2350
nm, característico de nitrilas (C Ξ N) ou tripla ligação entre carbonos (C Ξ C). No
comprimento entre 1800-2000 nm indica presença de anel aromático. Absorção
próxima de 3500 nm indica presença de grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou
fenol; 2900 nm ligações de C-H de carbonos sp3; 1600 nm duas bandas que podem
ser referentes a ligações C=C de anel aromático ou ainda de C=O; 1250 nm indica
presença de C-O de fenol; 750 nm deformação angular fora do plano de C-H de anel
aromático (sp2). Duas bandas na região próxima de 1000 nm que podem ser
referentes à deformação de C-O de álcool primário.
Extrato Bruto (EB)
Figura 8 - Espectro na região do IV do extrato bruto (EB) liofilizado de S. marginatus Blume.
77
Tabela 6 - Comprimento de onda (nm) e ligações características no espectro da região do
infravermelho (IV) para extrato bruto (EB) liofilizado de S. marginatus Blume.
Região de absorção (nm)
2350
1800 - 2000
3500 – 3200
2900
1600
1250
750
1000
Tipo de ligação
CΞN
Anel aromático
O–H
C – H (sp3)
C = C ou C = O
C - O de fenol
C - H de anel aromático (sp2)
C - O de álcool primário
Na figura 9 visualizamos uma banda larga próxima do comprimento de onda
de 3500 nm indicando a presença do grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou
fenol. Região próxima de 2900 nm ligações de C-H de carbono sp3; 2375 nm
Deformação axial de nitrilas (C Ξ N) ou deformação de ligação tripla entre carbonos
(C Ξ C); 1750 nm indica banda de carbonila (C=O) de aldeído ou cetona; 1450 nm
estiramento de C-H ligado à carbonila; 1250 nm deformação axial assimétrica C-O-C
de éter. Na região entre 1800-2000 nm indício da presença de anel aromático.
Fração Hexânica (FH)
Figura 9 - Espectro na região do IV da fração hexânica (FH) liofilizada de S. marginatus Blume.
78
Tabela 7- Comprimento de onda (nm) e ligações características no espectro da região de
infravermelho (IV) para fração hexânica (FH) liofilizada de S. marginatus Blume.
3500 – 3200
2900
2375 - 2375
1750
1450
1250
1800 – 2000
Tipo de ligação
O–H
C - H (sp3)
C Ξ N ou C Ξ C
C=O
Estiramento de C-H
Deformação axial assimétrica C-O-C
Anel aromático
Na figura 10 visualizamos uma banda larga próxima do comprimento de onda
de 3500 nm, indicando a presença do grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou
fenol. O comprimento de onda próximo de 2350 nm indica deformação axial de
nitrilas (C Ξ N) ou tripla ligação entre carbonos (C Ξ C); 2900 nm deformação axial
de ligações de C-H de carbonos sp3.
Fração Diclorometano (FD)
Figura 10 - Espectro na região do IV da fração diclorometano (FD) liofilizada de S. marginatus Blume.
79
Tabela 8 - Comprimento de onda (nm) e ligações características no espectro da região de
infravermelho (IV) para fração diclorometano (FD) liofilizada de S. marginatus Blume.
Tipo de ligação
3500 – 3200
2350 - 2375
2900
O–H
C Ξ N ou C Ξ C
C - H (sp3)
Na figura 11 visualizamos uma banda larga próxima ao comprimento de onda
de 3500 nm, indicando a presença do grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou
fenol. Próximo de 2900 nm deformação axial de ligações de C-H de carbonos sp3. O
comprimento de onda próximo de 2350 nm indica deformação axial de nitrilas (C Ξ
N) ou tripla ligação entre carbonos (C Ξ C); No comprimento entre 1800 - 2000 nm
indica presença de anel aromático; 1600 nm duas bandas que podem ser referentes
a ligações C=C de anel aromático ou ainda de C=O; 1250 nm indica ser de uma
deformação axial de C-O de fenol; 750 nm indica ser uma deformação angular fora
do plano de C-H de anel aromático (sp2); 1000 nm que podem ser referentes a C-O
de álcoois primários.
Fração Acetato Etila (FAE)
Figura 11 - Espectro na região do IV da fração de acetato de etila (FAE) liofilizada de S. marginatus
Blume.
80
Tabela 9 - Comprimento de onda (nm) e ligações características no espectro da região do
infravermelho (IV) para fração acetato de etila (FAE) liofilizada de S. marginatus Blume.
Tipo de ligação
3500 – 3200
2900
2350 - 2375
1800 – 2000
1600
1250
1000
750
O–H
Deformação axial C - H (sp3)
C Ξ N ou C Ξ C
Anel aromático
C = C ou C = O
Deformação axial de C - O de fenol
C - O álcool primário
Deformação angular anel aromático(sp2)
Na figura 12 visualizamos uma banda na região de comprimento de onda
2375 nm indicando deformação axial de nitrilas (C Ξ N) ou deformação axial entre
tripla ligação de carbonos (C Ξ C). Esta banda está presente nas amostras anterior
Fração Acetona (FAT)
Figura 12 - Espectro na região do IV da fração acetona (FAT) liofilizadas de S. marginatus Blume.
81
infravermelho (IV) para fração acetona (FAT) liofilizada de S. marginatus Blume.
Tipo de ligação
2350 – 2375
C Ξ N ou C Ξ C
Na figura 13 visualizamos uma banda larga próxima de 3500 nm, indicando a
presença do grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou fenol; 2350 nm indica
deformação axial de nitrilas (C Ξ N) ou tripla ligação entre carbonos (C Ξ C); 1600
nm duas bandas que podem ser referentes a ligações C=C de anel aromático ou
ainda de C=O; Próximo de 2900 nm deformação axial de ligações de C-H de
carbonos sp3.
Fração Metanólica (FM)
Figura 13 - Espectro na região do IV da fração metanólica (FM) liofilizada de S. marginatus Blume.
82
infravermelho (IV) para fração metanólica (FM) liofilizada de S. marginatus Blume.
Tipo de ligação
3500 – 3200
2900
2350 - 2375
1600
O–H
Deformação axial C - H (sp3)
C Ξ N ou C Ξ C
C = C ou C = O
5.3 Ensaios Microbiológicos
5.3.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO EXTRATO BRUTO E
FRAÇÕES LIOFILIZADAS DE S. marginatus B. CAPAZ DE INIBIR GERMINAÇÃO
DE ESPOROS DE Trichophyton mentagrophytes.
A avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto e frações liofilizadas de
S. marginatus B., procurou obter a concentração inibitória mínima (CIM) capaz de
inibir a germinação dos esporos. As concentrações testadas: 1000µg; 500µg; 250µg
não foram capazes de inibir a germinação dos esporos das cepas de Trichophyton
mentagrophytes . Os resultados estão expressos na tabela 12 e 13.
Tabela 12 - Avaliação da atividade antifúngica do Extrato Bruto (EB), fração Hexânica (FH) e
Fração Diclorometano (FD) de S. marginatus B., nas concentrações: 1000; 500 e 250 (µg/mL).
Droga vegetal (µg/mL)
Cepa
T. mentagrophytes
SI: Sem inibição fúngica.
EB
FH
1000
500
250
SI
SI
SI
1000 500
SI
SI
FD
250
1000
500
250
SI
SI
SI
SI
83
Tabela 13 - Avaliação da atividade antifúngica da fração Acetato de Etila (FAE), Acetona (FAC)
e Metanólica (FM) de S. marginatus B., nas concentrações:1000; 500 e 250 (µg/mL).
Cepa
FAE
1000 500
T. mentagrophytes
SI
FAC
FM
250
1000
500
250
1000
500
250
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI: Sem inibição fúngica.
5.3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIFÚNGICA DO
EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DE S. marginatus B. FRENTE CEPAS
BACTERIANAS E FUNGICAS.
A avaliação da atividade antimicrobiana e antifúngica através da técnica do
MIC determinou três ações do extrato bruto e frações de S. marginatus Blume:
bactericida, bacteriostática e sem atividade antimicrobiana. Os resultados estão
expressos nas tabelas 13 e 14 e também podem ser vistos na figura 14; 15 e 16
(p.59).
Tabela 14 - Avaliação da atividade antimicrobiana do Extrato Bruto, Fração Hexânica (FH) e
Fração Diclorometano (FD) de S. marginatus Blume. nas concentrações de: 1000; 500 e 250 (µg/mL).
Cepas
EB
1000 500
FH
250
1000 500
FD
250
1000 500
250
Staphylococus aureus
BC
BC
BC
BC
BC
SA
BC
BC
SA
Enterococcus faecalis
BC
BC
SA
BC
BC
BC
BC
BC
BC
Salmonela tiphy
BC
BC
BC
BC
BC
SA
BC
BC
BT
Cândida albicans
SA
SA
SA
SA
SA
SA
SA
SA
SA
BC: Bactericida; BT: Bacteriostática; SA: Sem atividade antimicrobiana.
84
Tabela 15 - Avaliação da atividade antimicrobiana das Frações: Acetato de Etila (FAE), Acetona
(FAC) e Metanólica (FM) de S. marginatus B., nas concentrações de: 1000; 500 e 250 (µg/mL).
Cepas
FAE
1000 500
FAC
250
1000 500
FM
250
1000 500
250
Staphylococus aureus
BC
SA
SA
BC
BC
SA
BC
BT
SA
Enterococcus faecalis
BC
BT
SA
BC
BC
BC
BC
BC
BT
Salmonela tiphy
BC
BT
SA
BC
BC
BT
BC
BC
BT
Cândida albicans
SA
SA
SA
AS
AS
SA
SA
SA
SA
BC: Bactericida; BT: Bacteriostática; SA: Sem atividade antimicrobiana.
BC
Figuras 14 - Placas mostrando atividade bacteriostática (BT) e bactericida (BC) do extrato bruto (EB)
e frações de S. marginatus em diferentes concentrações frente a cepas bacterianas de Enterococus
faecalis (arquivo pessoal).
85
Figura 15 – Placas mostrando atividade bacteriostática (BT) e bactericida (BC) do extrato bruto (EB) e
frações de S. marginatus em diferentes concentrações frente a cepas bacterianas de Staphylococcus
aureus.
BC
BT
86
BT
Figura 16 – Placas mostrando atividade bacteriostática (BT) e bactericida (BC) do extrato bruto (EB) e
frações de S. marginatus em diferentes concentrações frente a cepas bacterianas de Salmonella
enterica Tiphy. BC
87
5.4 Ensaios Imunológicos
5.4.1 TESTE DE CITOTOXICIDADE
Observamos que os extratos e as frações não foram citotóxicos para os
macrófagos murinos RAW 264.7 nas concentrações utilizadas (100; 500; 250; 125;
62,5; 31,25 e 15,62 µg/mL) respectivamente.
Tabela 16 – Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto (EB), fração hexânica (FH), fração
diclorometano (FD), fração acetato de etila (FAE), fração acetona (FAC) e fração metanólica (FMT) de
Struthantus marginatus Blume. em células RAW 264.7 pelo ensaio de MTT.
Extrato/Frações
Células Viáveis
Absorbância
EB
100,0 ± 1,10
1,07 ± 0,01
FH
100,0 ± 1,49
1,20 ± 0,15
FDC
100,0 ± 4,56
0, 69 ± 0,04
FACE
100,0 ± 1,03
0,86 ± 0,10
FACT
100,0 ± 3,86
0,70 ± 0,04
FMT
100,0 ± 4,66
1,49 ± 0,05
Controle Triton x-100
26,5 ± 1,72
0,16 ± 0,02
Controle célula
100,0 ± 2,63
0,68 ± 0,03
5.4.2 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO (NO)
A produção de óxido nítrico (NO) foi inibida tanto em cultura de células PBMC
(figura 17a) quanto em cultura de macrófagos murinos RAW 264.7 (figura 17b)
estimulados com LPS (1 µg/ml) e tratados com extrato bruto liofilizado e frações de
S. marginatus B.
88
30
300
a
250
*
10
7
*
*
*
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
b
200
**
*
*
*
40
8
0.4
150
6
100
LPS
125
62
31
16
8
LPS
S. marginatus
Extrato Bruto (µ
µg/mL)
100
S. marginatus
Extrato bruto (µ
µg/mL)
Figura 17. Inibição da produção de NO por extrato bruto de S. marginatus Blume. * - p < 0,001
quando comparado com controle LPS; * * - p < 0,01 quando comparado com controle LPS.
A fração hexânica também foi capaz de inibir a produção de óxido nítrico (NO)
em células PBMC (figura 18a) e macrófagos (figura 18b), sendo que em macrófagos
murinos RAW 264.7 embora tenhamos observado inibição em todas as
concentrações utilizadas a inibição foi maior na concentração de 100 µg/ml da
fração.
30
300
a
250
10
7
*
*
*
*
6
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
b
200
#
**
150
**
**
5
100
LPS
125
62
31
16
8
S. marginatus
Fração hexânica (µ
µg/mL)
LPS
100
40
8
0,4
S. marginatus
Fração hexânica (µ
µg/mL)
Figura 18. Inibição da produção de NO – fração hexânica de S. marginatus Blume. * - p < 0,001
quando comparado com controle LPS; * * - p < 0,01 quando comparado com controle LPS; # - p <
0,05 quando comparado com controle LPS.
89
A fração diclorometano inibiu a produção de óxido nítrico (NO) em células
PBMC (figura 19a) e macrófagos (figura 19b).
30
300
a
250
10
7
*
*
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
b
6
*
*
16
8
200
#
**
150
5
*
**
100
LPS
125
62
31
LPS
S. marginatus
Fração diclorometano (µ
µg/mL)
100
40
8
0.4
S. marginatus
Fração diclorometano (µ
µg/mL)
Figura 19. Inibição da produção de NO – fração diclorometano de S. marginatus Blume. * - p < 0,001
quando comparado com controle LPS; * * - p < 0,01 quando comparado com controle LPS; # - p <
0,05 quando comparado com controle LPS.
A fração acetato de etila inibiu a produção de óxido nítrico (NO) em células
PBMC (figura 20a) e macrófagos (figura 20b).
30
300
a
250
10
10
*
8
*
*
125
62
*
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
b
200
150
6
#
#
**
**
40
8
100
LPS
31
16
8
LPS
S. marginatus
Fração acetato de etila (µ
µg/mL)
100
0.4
S. marginatus
Fração acetato de etila (µ
µg/mL)
Figura 20. Inibição da produção de NO – fração acetato de etila de S. marginatus Blume. * - p <
0,001 quando comparado com controle LPS; * * - p < 0,01 quando comparado com controle
LPS; # - p < 0,05 quando comparado com controle LPS.
90
A fração acetona foi capaz de inibir a produção de óxido nítrico (NO) em
células PBMC (figura 21a), porém esta inibição, embora tenha sido aparente em
macrófagos murinos, não foi significativa quando comparado à produção de óxido
nítrico no sobrenadante das células estimuladas com LPS e não tratadas (figura
21b).
30
300
a
b
250
10
8
*
7
*
*
*
125
62
31
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
200
150
6
5
100
LPS
16
S. marginatus
Fração acetona (µ
µg/mL)
8
LPS
100
40
8
0.4
S. marginatus
Fração acetona (µ
µg/mL)
Figura 21. Inibição da produção de NO – fração acetona de S. marginatus Blume. * - p < 0,001
quando comparado com controle LPS.
A fração metanólica foi capaz de inibir a produção de óxido nítrico (NO) em
células PBMC (figura 22a), porém esta inibição, embora tenha sido aparente em
macrófagos murinos, não foi significativa quando comparado à produção de óxido
nítrico no sobrenadante das células estimuladas com LPS e não tratadas (figura
22b). Cada barra representa a média ± desvio padrão dos experimentos realizados
em triplicata. A análise estatística foi realizada através da análise de variância
(ANOVA).
91
30
300
a
250
*
10
8
7
*
*
*
*
[NO] µ M
[NO] µ M
20
b
200
150
6
5
100
LPS
125
62
31
16
8
S. marginatus
Fração metanólica (µ
µg/mL)
LPS
100
40
8
0.4
S. marginatus
Fração metanólica (µ
µg/mL)
Figura 22. Inibição da produção de NO – fração acetona de S. marginatus Blume. * - p < 0,001
quando comparado com controle LPS.
5.4.3 DOSAGEM DE TNF- α
Células PBMC foram cultivadas em meio RPMI com adição do extrato bruto e
frações de S. marginatus B., nas concentrações: 1000 µg/mL e 0,78 µg/mL e
estimuladas com LPS (1µg/mL) a fim de avaliar se a droga vegetal era capaz de
inibir ou estimular a produção da citocina TNF- α. Verificou-se que as células PBMC
cultivadas com extrato bruto e frações na maior concentração (1000 µg/mL)
apresentaram baixos níveis na produção de TNF-α quando comparados com a
menor concentração (0,79 µg/mL) do extrato bruto e frações que apresentaram o
aumento da produção desta citocina.
92
175
*
150
125
TNF-α [pg/ml]
*
#
100
75
50
*
25
*
*
*
*
*
EB
LP
S
1
EB
m
0, g/m
78
l
m
g
FH
/m
FH 1m l
0, g/m
78
l
FD mg
/m
FD C 1
l
m
C
g
0,
/m
7
FA 8m l
g/
C
m
FA E
l
1
C
m
E
g
0,
/m
7
FA 8m l
g/
m
F A CT
l
1
C
m
T
g
0,
/
78 ml
m
FM
g/
m
FM T 1
l
m
T
0, g/m
78
l
m
g/
m
l
0
Figura 23 – Produção de TNF- α em cultura de células mononucleares de sangue periférico humano
(PBMC) na presença de duas diferentes concentrações do extrato bruto e frações de S. marginatus
Blume. Controle positivo (CP) constituiu-se de células cultivadas com RPMI completo e LPS
(1µg/mL). Cada barra representa a média ± desvio padrão dos experimentos realizados em triplicata.
A análise estatística foi realizada através da análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de
Tukey. * - p < 0,001 quando comparado com controle LPS; # - p < 0,05 quando comparado com
controle LPS.
93
6. Discussão
94
6. DISCUSSÃO
De acordo com a proposta deste trabalho objetivou-se avaliar a atividade
imunomoduladora do extrato bruto e frações da espécie Struthanthus marginatus
Blume em células de sangue periférico humano. Para tanto, foi analisada a produção
de citocinas NO e TNF- α por células PBMC quando estimuladas com LPS.
As células envolvidas nas respostas imunes possuem função reguladora, em
que podem claramente promover ou suprimir as respostas imunológicas. Esse
mecanismo regulador assegura que as respostas sejam apropriadas tanto
qualitativamente quanto quantitativamente (TIZARD, 1998), mostrando que o próprio
sistema
imune
se
autoregula
através
da
liberação
de
substâncias
imunomoduladoras (STITES e TERR, 1995; HOLLAND e VIZI, 2002). Estas
substâncias também são conhecidas como citocinas, proteínas de baixo peso
molecular que atuam na comunicação entre células, promovendo a indução ou
regulação da resposta imune (LYER, 2011). São capazes de restaurar o sistema
imunológico dos indivíduos susceptíveis a invasões por agentes agressores e a
fatores ambientais (DUTRA, 2002) promovendo proteção aos tecidos, restringindo
os danos no local da infecção ou causando injúria quando produzida de forma
exacerbada pelo sistema imune (ROCHA, 2007).
Atualmente a medicina moderna procura identificar compostos com atividades
farmacológicas capazes de inibir ou estimular os efeitos causados pelas citocinas
envolvidas no processo imune regulador (NUNES-PINHEIRO, 2003). Dentre as
alternativas de pesquisa as plantas medicinais vêm sendo utilizadas ao longo dos
anos no tratamento de enfermidades, porém o desenvolvimento tecnológico de
medicamentos fitoterápicos no país ainda é incipiente, tornando-se essencial que o
medicamento fitoterápico passe por processos de avaliação como eficácia,
toxicidade e testes microbiológicos, garantindo um eficaz controle de qualidade para
ser comercializado como produto terapêutico (SIMÕES et al. 2007; PORTAL DA
SAÚDE, 2013). Assim, para o desenvolvimento de um fitoterápico é preciso planejar
e obter preparações intermediárias para transformação da matéria-prima vegetal em
um produto acabado. Tal processo é importante porque o material inicial para estudo
deverá ser estável de modo que garanta sua reprodutibilidade e suficientemente
95
seco e pulverizado para que se consiga um bom rendimento no processo de
extração dos constituintes químicos de interesse farmacêuticos (SILVA JÚNIOR,
2006; DESMICHELLE, 1987; BARNI, 2009;). Os parâmetros de qualidade para fins
farmacêuticos são, a priori, estabelecidos nas Farmacopeias e Códigos Oficiais, no
entanto, ainda há escassez de monografias para matérias primas de diversas
espécies vegetais nativas, como é o caso da espécie Struthanthus marginatus
Blume (MICHELIN et al. 2010).
Para a elaboração do extrato bruto e frações de S. marginatus Blume foi
inicialmente realizado o processo de caracterização física e físico-química da droga
vegetal e da solução extrativa (tintura) em virtude da importância que estas
determinações proporcionam na montagem de métodos para controle de qualidade
desde o processo da coleta do material vegetal até a obtenção do produto
intermediário e final. A coleta do material vegetal foi feita em meados do mês de
Maio de 2011, realizou-se a identificação botânica da espécie cuja exsicata (Figura
4, p.47) encontra-se depositada no herbário do Museu Emílio Goeldi, garantindo sua
confirmação taxonômica e evitando a ocorrência de qualquer equívoco quanto à
utilização errônea de outras espécies. É importante observar a época de coleta do
material vegetal, pois as espécies apresentam épocas específicas em que contêm
maior quantidade de princípios ativos no seu tecido, essas variações podem levar a
desconfiança na pureza do produto e alterações nas respostas biológicas quando
testadas (MARTINS et al. 1995).
Após a confirmação da espécie, as folhas previamente selecionadas foram
lavadas com etanol 70 ºGL, para controlar a carga microbiológica que possivelmente
poderia estar presente no material vegetal; após essa fase as folhas foram secas em
temperatura ambiente seguida de secagem em estuda de ar circulante a 40 ± 2 ºC,
desta forma, houve eliminação de maior parte do conteúdo de água favorecendo a
eliminação e inativação de microorganismos (CUNHA, 2005).
Logo após a secagem do material vegetal este foi pulverizado em moinho de
facas até a obtenção de um pó, o qual sofreu caracterização física de sua
constituição através da granulometria. A granulometria é um parâmetro da eficiência
da extração, já que partículas muito finas ou com grande superfície de contato
impedem a absorção do líquido extrator e diminuem a eficiência da extração
(PÉRTILE, 2007).
96
Segundo a FARMACOPEIA BRASILEIRA V (2010), a classificação dos pós é
feita de acordo com sua granulometria ou grau de divisão, classificando-os como
grosso, moderadamente grosso, semifino, fino e finíssimo. Esse dado é expresso
pela referência à abertura nominal da malha do tamis utilizado no qual o pó é
coletado após o processo de pulverização. Quando se avaliou a determinação da
distribuição granulométrica do pó das folhas de S. marginatus B. verificou-se que as
partículas passaram em sua totalidade pelo tamis com abertura de malha 710 µm e
menos de 40% das partículas do pó passou pelo tamis com abertura de malha de
355 µm, o que caracteriza o pó como sendo grosso. Pós de tamanho maior, como os
desta classificação, favorecem as extrações, pois partículas muito finas podem
aderir umas às outras criando uma barreira que impede a penetração de solventes
diminuindo a eficiência da extração (VOIGT e BORNSCHEIN, 1982).
A perda por dessecação expressa o percentual de umidade residual da droga
vegetal e é um indicativo do teor de material volátil do vegetal (COSTA, 1982). A
perda por dessecação da droga vegetal em estudo é de cerca de 8,7% (Tabela 1,
p.71), logo está dentro do parâmetro (8-14%) estabelecido pela FARMACOPEIA
BRASILEIRA V (2010). Portanto, torna-se importante o conhecimento sobre a perda
por dessecação do material vegetal uma vez que aliado a um armazenamento
adequado, a qualidade, estabilidade e preservação das propriedades terapêuticas
serão mantidas (BRAGA et al. 2007). A importância da determinação da perda por
dessecação está ligada também à estabilidade microbiológica da matéria-prima
vegetal, uma vez que, teores de umidade acima do especificado possibilitam o
desenvolvimento de fungos e bactérias, representando riscos devido à produção de
substâncias tóxicas, hidrólise e atividade enzimática com consequente deterioração
de constituintes químicos tornando o material impróprio ao consumo (COUTO, 2009;
AMARAL et al. 2003).
O teor de cinzas totais estabelece a quantidade de substâncias residuais não
voláteis, obtidas por incineração, representando a soma de material inorgânico
integrante da espécie (cinzas intrínsecas, derivadas dos componentes minerais da
própria planta) com as substâncias aderentes de origem terrosa (cinzas extrínsecas,
como solo, areia que se adere à superfície da droga vegetal) (BRAGA, 2007;
SIMÕES, 2007). Quando estas cinzas apresentam um teor superior ao indicado pela
monografia, geralmente são referentes a procedimentos de colheita e pós-colheita
97
inadequados (SHARAPIN, 2000). O resultado da determinação de cinzas totais para
o pó das folhas de S. marginatus B. foi de 11,6%, (Tabela 1, p.71) de acordo com os
limites estabelecidos nas monografias de diversas drogas vegetais descritas na
Farmacopeia Brasileira indicando que as mesmas não possuem excesso de terra
e/ou areia. Este método pode avaliar a pureza do material, detectando a presença
excessiva de substâncias aderentes e adulterações no material vegetal (AMARAL,
2003).
O
presente
trabalho
utilizou
metodologias
clássicas
contidas
nas
farmacopéias para a caracterização preliminar da matéria-prima vegetal como
também outras metodologias que vem se destacando por seu aprimoramento. A
análise térmica possui a capacidade de observar e quantificar as mudanças que
ocorrem na amostra de acordo com a variação de sua massa, que está sujeita ao
aquecimento a uma velocidade constante (TG) e a qualificação e quantificação da
variedade de gases liberados, que são continuamente medidos e analisados
(CG/MS). O sistema TG/CG e MS oferece um completo entendimento do estudo do
mecanismo da decomposição térmica, através da curva TG e de dados moleculares
(DOLLIMORE, 1984; WENDLANDT, 1986; SZEKELY, 1992). Essa metodologia
analítica pode ser utilizada em associação aos atuais métodos clássicos utilizados
no controle de qualidade de produtos naturais, entre outros fatores por ser uma
metodologia confiável e de rápida execução (ARAGÃO, 2002). As técnicas
termoanalíticas também são usadas na área de fármacos e medicamentos para a
aplicação e estudos de estabilidade térmica, compatibilidade fármaco-excipiente e
para determinação da pureza (RODRIGUES, 2005; ALVES, 2006).
Ressalta-se, ainda, que os resultados obtidos conduzem a parâmetros
relevantes no processamento industrial de fármacos e de medicamentos. E uma das
potencialidades analíticas da termogravimetria é determinar o teor de umidade do
material analisado, por isso, é utilizada no controle biológico para armazenamento.
Pode ser utilizada, também, para determinação do teor de cinzas como indicador da
qualidade de sais minerais e possíveis adulterações do material com compostos
inorgânicos (FELSNER e MATOS, 1998).
As curvas termogravimétricas (TG, DTG e DSC) obtidas em atmosferas de
nitrogênio mostram perdas de massa e variação de entalpia caracterizada pelos
eventos de decomposição do material analisado em função da temperatura
98
controlada em até 600 ºC. Analisando as curvas TG/DTG do pó da planta (Figura 6,
p.72) podemos ver três estágios de decomposição térmica. O primeiro estágio ocorre
no intervalo de temperatura de 49 - 95,96ºC, caracterizando uma pequena perda na
porcentagem de massa inicial coincidindo com o evento endotérmico ocorrido pela
curva DSC da droga (Figura 7, p.73 e Tabela 3, p.73). Essa perda de massa inicial
pode ser atribuída à desidratação do pó da planta por perda de umidade e/ou
evaporação de constituintes voláteis como os óleos essenciais (WESOLOWSKI et al.
2003). Os gráficos TG/DTG também nos mostram que o pó da planta é estável até
cerca de 180ºC e a partir daí, iniciam-se os processos térmicos de oxidação e fusão
até a completa decomposição do material vegetal.
O segundo estágio de decomposição, após a desidratação do material, se
inicia por volta de 213,58 ºC a 338 ºC (Figura 6, p.72; Tabela 2, p.72), registrando
uma possível oxidação dos componentes orgânicos presentes no pó da planta, e ao
início da carbonização do material vegetal (WESOLOWSKI, 2003; ARAÚJO, 2006)
que é refletida pelas curvas TG/DTG e está em correspondência com a curva
exotérmica do gráfico DSC (Figura 7, p. 73). A partir de 438 °C a 518 ºC observa-se
a terceira etapa de decomposição do material vegetal, referente à queima de restos
carbonizados da matéria orgânica culminando na obtenção de suas cinzas (Figura 6;
Tabela 2, p. 72) (FARIA, 2002). Foi possível verificar uma perda total de massa de
76,12% na faixa de temperatura analisada a partir de 45 °C a 600 °C, com resíduo
de 23,88% confirmados pelos eventos endotérmicos e exotérmicos registrados na
curva DTA (Figura 6; Tabela 2, p. 72).
A curva DSC do pó da planta (Figura 7; p. 73) demonstrou inicialmente um
evento endotérmico consumindo uma energia de 123,28 J⁄g, característico dos
processos de liberação de água e umidade. Os processos de decomposição térmica
do pó da planta tiveram início à temperatura de 200 ºC, sendo evidenciado por dois
eventos exotérmicos na faixa de temperatura de 249,27°C a 369,87°C e liberação de
energia de ∆H= 222,97 J/g e o segundo na faixa de temperatura de 425,98°C a
586,53 °C e liberação de energia de ∆H= 6,35 J/g (Figura 7; Tabela 3, p.73). A
origem dos picos endo e exotérmico são provocadas por fenômenos físicos ou
químicos. Com isso, qualquer fenômeno físico ou químico que por ocasião de sua
ocorrência provoque variações de entalpia pode ser detectado através destas
curvas, e à medida que a sensibilidade destes instrumentos vai sendo aumentada, a
99
aplicabilidade do método também é ampliada consideravelmente (FERNANDEZ,
2006). Entretanto, as curvas obtidas através de qualquer instrumento moderno são
perfeitamente reprodutíveis, de modo que se utilizando várias substâncias padrões,
as áreas dos picos das curvas TG/DTG podem ser relacionadas com os calores de
reação, transição, fusão, polimerização das curvas do gráfico DSC. Reciprocamente,
caso o calor da reação seja conhecido, pode-se determinar a quantidade de
substância que reagiu.
Desta forma, os resultados dos perfis térmicos através da termogravimetria
(TG), da análise térmica diferencial (DTG) e da calorimetria exploratória diferencial
(DSC) quando comparados aos métodos convencionais: determinação da perda por
dessecação e teor de cinzas totais, preconizados pela FARMACOPEIA BRASILEIRA
V. (2010) mostram-se satisfatórios através de resultados semelhantes fornecendo
estimativas do conteúdo de água residual e eventos físico-químicos presente no
material após sua análise em um curto período de tempo (SILVA JÚNIOR, 2006).
Estes resultados corroboram para certificação científica de tais métodos analíticos
que aliados ao controle de qualidade são utilizados no desenvolvimento de novas
formas de preparo e administração de produtos fitoterápicos, ajudando desta forma
no conhecimento físico e físico-químico das drogas vegetais e seus derivados (DI
STASI, 1996; CANIGUERAL, 2003; VIEIRA, 2001).
Quando se fala em controle de qualidade de um fitoterápico, inicialmente,
deve ser feita análise da matéria prima da tintura, atentando-se principalmente para
a identificação botânica ou zoológica (DESMICHELLE, 1987). Após o processo de
produção, as tinturas devem passar por vários ensaios dentre eles: identificação,
características organolépticas, densidade, resíduo seco, determinação do teor
alcoólico. Todos estes ensaios são importantes para assegurar o padrão de
qualidade, atendendo a uma especificação pré-estabelecida (FONSECA e
LIBRANDI, 2008). Desta forma a tintura foi obtida a partir do pó de suas folhas,
utilizando como líquido extrator um solvente geral: o álcool etílico e sua mistura com
água, formando uma solução hidroalcóolica a 70ºGL. A caracterização dessa tintura
foi baseada na determinação de seu pH, densidade e teor de sólidos. Verificou-se
que o valor da densidade aparente foi de 0,886 g/cm3 o que se manteve dentro do
limite preconizado para tinturas fitoterápicas entre 0,87 a 0,98 g/cm3 utilizando o
picnômetro como método de avaliação (PRISTA, 1990).
100
A determinação do teor de sólidos implica na quantificação das substâncias
extraídas da planta através da eliminação do solvente extrator, e é um indicativo da
concentração da tintura no qual apresentou valor de 7,2% (m/m) a 105ºC (OLIVEIRA
e BERRETTA, 2007). Este parâmetro fornece dados a cerca do rendimento da
extração já que a secagem influi no estado de integridade das estruturas celulares,
expondo-as mais ou menos ao contato com os solventes (HARBONE, 1986). O pH
da tintura foi de 5,16 caracterizando-a como ácida (Tabela 4, p.74) este valor pode
ser atribuído à possível presença de ácidos orgânicos e de fenóis na tintura.
A prospecção fitoquímica pode determinar qualitativamente os principais
grupos de constituintes químicos da espécie vegetal, através de simples testes de
reação de cor e precipitação (SHARAPIN, 2000). Quando se testou o extrato bruto
de S. marginatus B. verificou a presença dos seguintes metabólicos secundários:
saponinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, taninos catéquicos, flavonoides,
alcalóides, esteroides, triterpenóides, depsidíos e depsonas. (Tabela 5, p. 75). Estes
mesmos resultados foram encontrados no trabalho de Freire (2011) quando estudou
a espécie e suas frações.
A classe dos flavonoides e taninos possuem atividade gastroprotetora, antiulcerogênica e antioxidante que pode conferir a espécie vegetal uma possível
atividade imunoprotetora contra agentes agressores (BAGGIO, 2007; GURBUZ,
2009; FREIRE, 2011). Para tanto, foi realizado ensaios de absorção de espectros na
região do infravermelho (IV) com objetivos de adquirir mais informações sobre a
presença de constituintes químicos presentes na droga vegetal e assim fornecer
dados sobre bandas de absorção (Figuras 8, 9, 10, 11, 12 e 13; p. 76 até p. 81).
Esta é uma técnica muito utilizada na análise orgânica qualitativa, sendo
amplamente utilizada nas áreas de química de produtos naturais, síntese e
transformações orgânicas. O espectro obtido no infravermelho foi muito valioso, pois
forneceu um agregado de bandas características de determinados grupos funcionais
que juntamente com sua análise em tabelas de dados forneceu uma preliminar
sobre os grupos funcionais presentes na estrutura molecular da amostra
(BARBETTA e MAGINI, 2006). Entretanto, o espectro na região do IV não diferencia
normalmente uma amostra pura de outra não pura. Logo, uma amostra pura
apresenta bandas de absorção bem agudas e resolvidas, já o espectro de um
produto bruto que contém muitos tipos diferentes de moléculas pode apresentar
101
bandas de absorção arredondadas e mal resolvidas devido às diversas absorções
presentes (DYER, 1965). Ao se analisar os espectros na região do infravermelho
para droga vegetal de seu extrato bruto liofilizado (EB) e respectivas frações
liofilizadas: Hexânica (FH); Diclorometano (FD); Acetato de Etila (FAE); Acetona
(FAC) e Metanol (FM), notou-se que as regiões de absorção são bastante
semelhantes entre elas (Figuras 8, 9, 10, 11, 12 e 13; p. 68 até p. 73). Pelos
espectros é possível verificar uma banda larga próxima ao comprimento de onda de
3500 nm indicando a presença do grupo funcional hidroxila (O-H) de álcool ou fenol;
deformação axial de ligações de C-H de carbonos sp3 próximo ao comprimento de
onda de 2900 nm; comprimento de onda próximo de 2350 nm indica deformação
axial de nitrilas (C Ξ N) ou tripla ligação entre carbonos (C Ξ C); No comprimento
entre 1800 - 2000 nm indica presença de anel aromático; 1600 nm duas bandas que
podem ser referentes a ligações C=C de anel aromático ou ainda de C=O; 1250 nm
indica ser de uma deformação axial de C - O de fenol; 750 nm indica ser uma
deformação angular fora do plano de C-H de anel aromático (sp2); 1000 nm que
podem ser referentes a C-O de álcoois primários (SILVERSTEIN et al. 2007).
Provavelmente a substância em questão apresenta-se formada por hidroxilas
provenientes de alcoóis ou fenóis, carbonilas e compostos aromáticos, identificados
por suas regiões de absorção correspondentes a deformação axial de vários tipos de
ligação sugerindo a presença de uma ampla classe de metabólitos tais como:
flavonóides, cumarinas, antraquinonas, alcaloides quinolínicos e quinolônicos e
outros fenil propanóides confirmando desta forma a análise feita prospecção
fitoquímica preliminar.
Os metabólicos secundários presentes em espécies vegetais possuem
funções de extrema necessidade ao vegetal garantindo vantagens à sua
sobrevivência tais como funções adaptativas, de defesa e atração que juntas
garantem ao vegetal a perpetuação da espécie em um ecossistema (CROTEAU,
2000; PINTO, 2002). Embora os metabólicos secundários possuam uma variedade
de funções nas plantas, é provável que sua importância ecológica tenha alguma
relação com potencial efeito medicinal para os seres humanos. Por exemplo,
metabólitos secundários envolvidos na defesa contra herbívoros através de atividade
neurotóxica poderia ter efeitos benéficos em seres humanos (ou seja, como
antidepressivos, sedativos, relaxantes musculares ou anestésicos) através de sua
102
ação no sistema nervoso central. Da mesma forma, metabólitos secundários
envolvidos na defesa das plantas através de citotoxicidade para patógenos
microbianos podem ser úteis como medicamentos antimicrobianos em humanos, se
não forem demasiado tóxicos, com isso, garantem matéria prima para o
desenvolvimento de drogas de valor comercial ao combate de doenças (KAUFMAN,
1999).
Com base nesta ideia, foram realizados ensaios para testar atividade
antimicrobiana da droga vegetal e suas frações em cepas de micro-organismos
gram-positivos e gram-negativos além de cepas dos fungos Candida albicans e
Thichophyton mentagrophytes através da técnica da concentração inibitória mínima
(CIM).
Os ensaios de atividade antimicrobiana mostraram que o extrato bruto
liofilizado e frações liofilizadas foram bactericidas (BC) nas maiores concentrações
(1000 e 500 µg/mL) para cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e
Salmonella tiphy, o mesmo extrato e frações também apresentaram atividade
bacteriostática (BT) e ausência atividade (AA) à medida que as concentrações
diminuíam (Tabelas 14 e 15, p.83 e 84). Quanto as cepas de Candida albicans e
Thichophyton mentagrophytes o extrato e frações não apresentoram atividade em
nenhuma das concentrações testadas (Tabelas 12 e 13; p. 82), já que o crescimento
destes micro-organismos foram observados através da turvação do caldo, formação
de hifas e brotamento de esporos quando as lâminas foram coradas e lidas em
microscópio óptico.
A atividade bactericida da droga vegetal pode ser atribuída pela presença de
flavonóides detectados na prospecção fitoquímica. Os flavonóides representam um
dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os metabólitos de
origem natural (SIMÕES, 2007).
As modificações no anel central dessas
substâncias levam à diferenciação em subclasses distintas, tais como: chalconas,
flavanonas,
flavanonóis,
flavonas,
flavonóis,
isoflavonas
e
antocianidinas
(PRESCOTT, 2013). A presença de flavonóides e proantocianidinas na família
Lorantaceae foi descrita por Fernandez em 1998. Estudos demonstraram algumas
ações farmacológicas de algumas Lorantaceae como atividade anti-hipertensiva,
antibacteriana, antiviral, diurética, e antihepatotóxica (ZEE CHENG, 1997;
KONTIOKARI; 2001). Dentre as subclasses de flavonoides as proantocianidinas têm
recebido considerável atenção devido a sua provável ação antioxidante, na
103
prevenção de doenças cardiovasculares e também como agentes de proteção na
prevenção de infecções do trato urinário inibindo a adesão fimbrial da bactéria E. coli
e outras bactérias Gram-negativas de colonizar as células uroepteliais causadoras
das infecções no trato urinário (MARLES, 2003; VIEIRA, 2005 ).
A importância do extrato seco e frações de S. marginatus B. em apresentar
atividade bactericida em cocos gram-positivos e gram-negativos reside no fato de
que estas bactérias possuem diferentes constituintes em sua parede celular e graus
diferentes de virulência. As bactérias Gram-negativas, por exemplo, possuem uma
endotoxina denominada LPS (lipopolissacarídeo) altamente tóxica responsável pela
virulência bacteriana e um importante ativador da resposta imunológica. Já as
bactérias Gram-positivas possuem a exotoxina rica em ácido lipoprotéico que
confere aderência à bactéria (BRENNAN, 2006). S. aureus e E. faecalis são
bactérias Gram-positivas frequentemente encontradas na pele, fossas nasais,
vagina, e trato gastrintestinal respectivamente e podem provocar desde uma simples
infecção
(furúnculos)
até infecções mais graves (trato urinário, endocardite e
septcemia) (SANTOS, 2007). Mais de 90% destes cocos gram-positivos contêm
plasmídeos que codificam
β-lactamase, uma enzima que degrada penicilinas
disponíveis para tratamento (LEVINSON e JAWETZ, 2005; CONCEIÇÃO, 2008).
Hughes (1976) e Mason (1991), citado por Carlos (2007) ao encontrar apenas 15%
de cepas sensíveis, considerou inadequado a terapia com penicilinas para este
micro-organismo. Zavadinack-Netto e col. (2001) concluíram que o S. aureus é
resistente às penicilinas in vitro, por isso estas não devem ser utilizadas como
alternativas terapêuticas. O mesmo ocorre com S. typhi agente etiológico da febre
tifoide, é uma bactéria Gram-negativa que está associada a precárias condições de
saneamento básico, higiene pessoal e ambiental sua distribuição está estreitamente
relacionada com o desenvolvimento socioeconômico de cada região (BASTOS,
2008). No trabalho de Schimidt (2003) verificou-se que diversos sorotipos de S. typhi
eram resistentes a um grande número de antibióticos testados. A emergência da
resistência bacteriana aos antibióticos disponíveis pode ainda ser um fator agravante
dessa salmonelose, já que o tratamento de indivíduos com febre tifóide consiste
basicamente em antibióticos e reidratação (KUBOTA, 2005)
Os resultados referentes à atividade antimicrobiana do extrato e frações de S.
marginatus Blume refrente às cepas de S. aureus, E. faecalis e S. typhi demonstram,
104
portanto, que a espécie em estudo apresenta atividade antimicrobiana corroborando
com os resultados obtidos nos estudos de Vieira e colaboradores (2005).
Após a constatação da CIM nas cepas de S. aureus, S. typhi e E. faecalis,
partiu-se para avaliação da atividade citotóxica e imunomoduladora da droga vegetal
em células humanas mononucleadas de sangue periférico humano (PBMC) e
macrófagos murinho RAW 264.7.
Para a realização do teste da atividade citotóxica da droga vegetal foi utilizado
análise da atividade mitocondrial das células viáveis pelo método de redução do
brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-yl)2,5-difeniltetrazólio (MTT) em formazina. Devido a
sua facilidade operacional, agilidade na obtenção dos resultados e por verificar o
percentual de células viáveis, em relação a sua atividade metabólica após período
de exposição às concentrações da droga vegetal. Esta atividade metabólica ocorre
nas mitocôndrias de células viáveis, sob ação de desidrogenases mitocondriais que
degradam o anel tetrazólio do MTT, produzindo cristais insolúveis de formazina
(MOSSMAN, 1983). Este método é comumente utilizado para verificação da
citotoxicidade de produtos (SCHMALZ et al. 2002; KIM et al. 2008; YANG et al.
2009; GUERRERO et al. 2011). Os dados obtidos em espectrofotometria,
diretamente proporcionais à concentração de células sobreviventes, foram
convertidos em percentuais de viabilidade celular, em comparação ao grupo controle
considerado 100% viável (FERREIRA et al. 2010), desta forma, os dados foram
apresentados em relação aos percentuais de células sobreviventes após o período
de exposição.
Nos grupos celulares tratados com a maior concentração (1000 µg/ml) da
droga vegetal foi observado alto percentual de células sobreviventes, demonstrando
que os extratos e frações não apresentaram potencial citotóxico nas condições
utilizadas neste estudo (Tab.16, pag.87).
O próximo passo foi avaliar a atividade imunomoduladora da droga vegetal
através dos testes da produção das citocinas Óxido Nítrico (NO) e Fator de necrose
Tumoral (TNF- α). O sistema imunológico é um mecanismo complexo de defesa do
organismo, pesquisas mais recentes que envolvem o doseamento de NO e TNF-α
vem sendo realizadas com intuito de testar a produção destas citocinas e avaliar de
que forma elas atuam na imunomodulação (WILLIAMS, 2001). A atividade
imunomoduladora induz o aumento ou diminuição da produção de citocinas pró-
105
inflamatórias para o meio extracelular. O Óxido Nítrico tem um duplo papel no
processo inflamatório, quando secretado em altas doses por macrófagos ativados é
importante na defesa contra vírus, bactérias, fungos e células tumorais, por esta
razão é considerado como principal mediador citotóxico de células imunes efetoras
ativadas e constitui a mais importante molécula reguladora do sistema imune
(CROEN, 1993; MacMICKING, 1997). Por outro lado, os efeitos pró-inflamatórios do
NO parecem ser mediados por sua produção exagerada e estão relacionados a
várias doenças como o choque séptico, doenças auto-imunes e arteriosclerose
(MONCADA, 1991). Por este motivo a molécula de NO é conhecida como “faca de
dois gumes”, pois pode exercer efeitos benéficos ou prejudiciais dependendo do
contexto patológico (CIRINO, 2002).
Nossos resultados mostraram que o extrato liofilizado e frações de S.
marginatus Blume apresentou potencial imunomodulador, pois houve inibição na
produção NO em todas as frações testadas inclusive o extrato bruto, quando
comparadas com o controle positivo (cultura celular suplementada com RPMI e LPS)
(Fig.17 a 21; Pg. 88 a 91). Quando utilizado o método de ELISA de captura, foi
observado que a produção de TNF-α foi inibida com a utilização dos extratos e
frações em altas concentrações.
De acordo com Kwon & George (1999), existe uma inter-relação entre a
produção de IL-1, TNF-α e a síntese de NO. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
é estimulado pela presença de LPS e sua produção ativa diretamente a célula T e
consequentemente a produção de INF-γ, considerado o principal indutor da síntese
de iNOS (óxido nítrico sintetase) para a produção de NO. Na produção de NO, o
interferon- γ (IFN- γ) pode ser requerido como um primeiro sinal, antes que estas
células sejam deflagradas por um segundo sinal, como por exemplo, o LPS, ésteres
de forbol ou TNF- α (KIM et al. 1996; CHING-CHOW et al. 2001; KOKO et al. 2008).
O TNF- α é uma citocina multifuncional que possui funções centrais na inflamação
aguda e crônica, na resposta anti-tumoral e infecções. Essa molécula ainda possui a
capacidade de induzir a expressão de outras citocinas pró-inflamatórias, como a
interleucina - 1 (IL-1) e várias outras citocinas (PALLADINO, 2003). Dependendo das
condições experimentais ou do modelo de doença, o efeito do TNF- α pode ser
benéfico ou prejudicial, pois está envolvido tanto em atividades pró-inflamatórias
como também na resistência as várias infecções (VOS et al. 2011).
106
Desta forma, quando analisamos os resultados do experimento, vemos que a
o extrato liofilizado e frações de S. marginatus Blume inibe a produção de NO.
Várias plantas utilizadas na medicina tradicional demonstraram modular a resposta
imunológica (AGARWAL & SINGH; 1999), sendo que os princípios ativos destas
plantas foram isolados e caracterizados (YAMAGUCHI, 1992; GRAHAM, 2000).
Muitas plantas medicinais e medicamentos derivados de plantas tem demonstrado
possuir efeitos via Óxido Nítrico. A via de sinalização do NO tem se tornado nestes
últimos anos, um alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos. Acredita-se
que o alto teor de flavonoides, catequinas, taninos e outros compostos fenólicos
presentes nos vegetais e frutas contribuam para os efeitos benéficos à saúde.
Alguns desses compostos induzem a formação de NO nas células endoteliais,
melhorando a circulação, enquanto que outros suprimem a indução da iNOS nas
inflamações e infecções (ACHINE e KWAN, 2003).
Os efeitos de um polissacarídeo isolado de Panax ginseng foram examinados
com a utilização de macrófagos peritoneais murinos. A atividade citotóxica contra
células de melanoma B16 foi significantemente induzida. Os níveis de TNF-α, IL-1β,
IL-6, IFN-γ, NO e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram aumentados. A atividade
fagocítica e a expressão de CD14 nos macrófagos foram potencializados. Os
autores sugerem que o Ginseng possui efeitos immunoestimulantes em macrófagos
e essa capacidade poderia ser utilizada clinicamente no tratamento de doenças,
como câncer (SHIN, 2004)
Mehrotra
e
Col
(2003)
demonstraram
potencial
proliferativo
e
imunossupressor in vitro do extrato etanólico do rizoma de Acorus calamus. Neste
trabalho houve inibição da produção de NO, IL-2 e TNF-α, mas o IFN-γ não sofreu
alteração. No Brasil, Santos & Col. (1999) estudaram a atividade imunomoduladora
do extrato aquoso da macela (Achyrocline satureioides) onde se observou que o
extrato possui uma leve atividade imunossupresora.
No trabalho de Freire e Col (2011) foi demonstrado que o extrato da planta
Struthanthus marginatus ofereceu proteção gástrica contra agentes necrosantes em
camundongos e reduziu ainda o volume e acidez do suco gátrico aumentando a
produção de muco pelo estômago apresentando ainda atividade antioxidante.
Através de análises fitoquímicas, observou-se a presença de flavonóis , flavanonas e
taninos na composição do extrato.
107
Esses exemplos mostram o imenso potencial dos compostos de plantas na
descoberta de novos fármacos. Por outro lado, também é importante a realização de
estudos complementares visando o esclarecimento dos mecanismos de ação de
compostos naturais, fator essencial que permite avaliar o potencial destes no
processo de descoberta de novos medicamentos (YUNES et al. 2001).
Os resultados obtidos neste trabalho mostram que o extrato liofilizado e
frações apresentaram redução na produção de TNF-α e esta redução foi dependente
da concentração da droga vegetal (Fig.23, p.92). A inibição da produção destes
compostos pode indicar que o extrato possui potencial immunomodulador, pois a
cascata de mediadores pró-inflamatórios produzidos pelas células do sistema imune
se inicia com produção de TNF e IL-1. Por outro lado, o NO detectado em altos
níveis na presença do extrato liofilizado e frações também funcionaram como
regulador da produção destas citocinas, ou seja, em altos níveis o NO pode diminuir
a produção de TNF-α (THOMASSEN, 1997).
Há alguns anos pesquisadores concluíram que era de suma importância que
a regulação da citocina TNF-α deveria ser controlada. Devido ao equilíbrio do
sistema
imunológico
ser
monitorado
por
citocinas
pró-inflamatórias
e
antiinflamatórias, sua atividade não regulada pode levar ao desenvolvimento de
doenças inflamatórias sérias. A inibição da atividade de TNF-α nessas doenças tem
sido de grande valia (PALLADINO et al. 2003). Em um estudo feito por Sandoval e
col. (2002) observou-se que o extrato de unha de gato (Uncaria tomentosa) é um
potente inibidor de TNF-α. Os pesquisadores acreditam que o mecanismo primário
de ação deva ser a imunomodulação via supressão da síntese de TNF-α.
A síntese de TNF-α em monócitos/macrófagos é ativa por LPS e outros
estímulos. O LPS estimula a liberação do IκB do NF-κB citoplasmático, resultando no
deslocamento do NF-κB do citoplasma para o núcleo (COHEN, 1996). Baseado em
estudos, pesquisadores descobriram que inúmeros compostos naturais derivados de
plantas parecem interferir na cascata que leva na à ativação do NF-κB. O efeito de
drogas vegetais pode ser agora baseados no fato de que estas plantas contêm
agentes
reguladores
do
NF-κB,
como
os
diterpenóides
e
as
lactonas
sesquiterpênicas. A sinalização envolvida na inibição da síntese de citocinas é
complexa e existem muitas abordagens que podem afetivamente regular a
expressão de TNF-α (PALLADINO et al. 2003)
108
Modulação da resposta imune por produtos derivados de plantas pode ser
uma medida terapêutica valiosa e tem se tornado o assunto de investigações
científicas recentes (MEROTA, 2003). Apesar de apresentarem um campo de
estudos relativamente novo, os produtos naturais obtidos de plantas constituem uma
rica e promissora fonte de novas moléculas com propriedades imunomodulatórias
(WILLIAMS, 2001). Através da análise dos resultados obtidos, é possível sugerir que
o extrato bruto e frações de Struthanthus marginatus Blume, podem apresentar
atividade imunomoduladora, o que justifica o uso popular desta espécie oferecendo
uma base racional para seu uso.
109
7 – Conclusão
110
7. CONCLUSÕES
•
O material vegetal passou por procedimentos de colheita e pós-colheita
adequados, garantindo a reprodutibilidade do processo e manutenção de sua
estabilidade química.
•
A droga vegetal foi classificada como pó grosso, pois a maior quantidade de
massa retida foi encontrada no tamis com abertura de malha 1700µm.
•
A droga vegetal apresentou teor de perda por dessecação dentro dos
parâmetros estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira, indicando que os
procedimentos de colheita e pós-colheita foram adequados e garantiram boa
conservação e secagem eficiente da matéria-prima vegetal.
•
O resultado da determinação do teor de cinzas totais do pó das folhas de
Struthanthus marginatus B. corrobora com os valores encontrados na literatura
para material vegetal.
•
Pela análise térmica foi possível constatar que a droga vegetal e o extrato
liofilizado apresentaram boa estabilidade física até 180°C e revelaram valores de
perda de umidade muito próximos ao valor obtido pelo método gravimétrico de
perda por dessecação.
•
A abordagem fitoquímica do extrato bruto mostrou reação positiva para as
principais classes de metabólicos secundários (alcalóides, flavonóides, taninos e
triterpenos).
•
O perfil espectroscópico na região do IV traçados para a matéria-prima vegetal
(em pó) foi de relevância para a caracterização e controle de qualidade,
fornecendo dados acerca dos possíveis grupos funcionais presentes nas
amostras.
111
•
O extrato bruto e frações de S. marginatus B. apresentaram atividade bactericida
nas maiores concentrações para cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis e Salmonella tiphy, mas não demonstraram atividade antifúngica para as
cepas de Candida albicans e Thichophyton mentagrophytes.
•
Não observamos citotoxicidade do extrato bruto e frações de S. marginatus B.
em macrófagos murinos RAW 264.7.
•
A produção de Óxido Nítrico e TNF-α foi inibida com a presença do extrato bruto
e frações de Struthanthus marginatus Blume em células mononucleares de
sangue periférico humano (PBMC) e macrófagos murinos RAW 264.7
estimuladas com LPS.
•
O extrato bruto e frações de Struthanthus marginatus Blume podem apresentar
atividade imunomoduladora no sistema imunológico.
112
8. Referências Bibliográficas
113
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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