Efeito da Inibição da Ativação do NF-KB sobre o - PPGBAIP

Transcrição

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES
INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO
NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO
Plasmodium berghei
MICHELLI ERICA SOUZA FERREIRA
Belém-PA
2014
2
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE
OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL
CAUSADA PELO Plasmodium berghei
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Biologia
de
Agentes Infecciosos e Parasitários do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará como
requisito para a obtenção do grau de
Doutora
em Biologia
de
Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Sandro Percário
Belém-PA
2014
Agentes
1
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO
NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO
Plasmodium berghei
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Biologia
de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador:
Prof. Livre-Docente Sandro Percário
Lab. de Pesquisa em Estresse Oxidativo, ICB-UFPA
Banca examinadora:
Prof. Dr. Jose Luiz Fernandes Vieira
Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA
Profa Dra. Maria Fâni Dolabela
Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA
Profa. Livre-Docente Dorotéia Rossi Silva Souza
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto/FAMERP
Prof. Dr. Evonnildo Costa Goncalves
Instituto de Ciências Biológicas/ ICB-UFPA
Belém, 10 de fevereiro de 2014
2
EPÍGRAFE
“A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero
quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue
realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais
notável” (Galileu Galilei).
“A Ciência sem Religião é manca, a Religião sem a Ciência é cega” (Albert Einstein).
“Entendo por razão, não a faculdade de raciocinar, que pode ser bem ou mal utilizada,
mas o encadeamento das verdades que só pode produzir verdades, e uma verdade não
pode ser contrária a outra.”(Leibniz)
3
DEDICATÓRIA
Ao meu pai Pedro Rosildo e minha mãe Marizete por quem tenho amor, respeito,
admiração, pessoas especiais que são minha fonte de dedicação, inspiração, grande
exemplo de determinação, de caráter, de coragem e de vida.
Ao meu noivo Manoel Soares, amigo, companheiro e grande incentivador, alguém por
quem tenho profunda admiração, respeito e amor.
Aos meus irmão Marcelle e Michel que foram sempre companheiros e amigos em minha
vida profissional e pessoal.
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por iluminar meus caminhos traçados.
Ao meu orientador Sandro Percário, minha fonte de inspiração e sabedoria, que me
orientou e ensinou de forma paciente e clara como fazer pesquisa e desempenhar o
papel de docente.
Ao meu pai, minha mãe e meus irmãos que sempre incentivaram e acreditaram em
minha atuação profissional.
Ao meu meu noivo que com muito carinho e paciência acompanhou e incentivou minha
jornada acadêmica.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo (LAPEO), que formam
uma grande equipe e sempre estão prontos a ajudar uns aos outros. Em especial,
agradeço a Paula Laurindo, Ana Carolina Musa, Danilo Moreira, Marcela Figueira,
Amanda Vasconcelos, Rafael Quadros, Lângela, João, Aline e a todos os estagiários
que dedicaram seu tempo na realização dos procedimentos experimentais desse
trabalho.
Ao Laboratório de Neurociências da UFPA por ter fornecido a cepa de Plasmodium
berghei.
Ao Programa de Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários e seus docentes pela
inestimável contribuição científica.
Ao Instituto Evandro Chagas (IEC) pelo fornecimento dos animais de experimentação.
Ao Biotério UFPA, especialmente ao Sr. Amarildo e seus companheiros de trabalho pela
ajuda com os camundongos, pela amizade e carinho com que sempre me recebeu.
A todos os animais que precisaram sofrer eutanásia para a execução desse trabalho
científico.
Ao CNPQ pelo apoio financeiro por meio da bolsa e pelo incentivo a pesquisa.
5
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
10
LISTA DE QUADROS E TABELAS
13
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
15
RESUMO
17
ABSTRACT
18
1. INTRODUÇÃO
19
2. MALÁRIA
23
2.1. EPIDEMIOLOGIA
23
2.2. BIOLOGIA DO PARASITA
25
2.3. PATOGENIA
27
2.4. MALÁRIA GRAVE
29
2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL
33
3. ESTRESSE OXIDATIVO
34
3.1. ESTRESSE OXIDATIVO E MECANISMOS DE DEFESA
ANTIOXIDANTE
36
4. MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO
38
5. FATOR NUCLEAR-KAPPA B
40
5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO
(ERON) NA ATIVAÇÃO DO NF-KB
43
5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB
45
5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES
47
6. MALÁRIA E O NF-KB
48
7. ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFEÍCO-CAPE
50
8. OBJETIVOS
52
6
8.1. GERAL
52
8.2. ESPECÍFICOS
52
9. MATERIAL E MÉTODOS
53
9.1. GRUPOS DE ANIMAIS
53
9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS
54
9.3. PESQUISA DO PARASITO NO SANGUE
55
9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS
56
9.5. INIBIÇÃO DO NF-KB
56
9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE
56
9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)
56
9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução
do Radical DPPH
58
9.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO
TIOBARBITÚRICO (TBARS)
60
9.8. AVALIAÇÃO
DA
HEMATOENCEFÁLICA
PERMEABILIDADE
DA
BARREIRA
61
9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
62
10. RESULTADOS
64
10.1. PARASITEMIA
64
10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS
68
10.3. DOSAGENS PULMONARES
70
10.3.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+
70
10.3.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH
74
10.3.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
78
10.3.4. Estudo de Correlação para Amostras Pulmonares
82
10.3.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) versus
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)
82
7
10.3.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a
Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH
83
10.3.4.3. Substâncias
Parasitemia
e
84
10.3.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e
Parasitemia
85
10.3.4.5. Capacidade
Parasitemia
86
Reativas
ao
Antioxidante
Ácido
Tiobarbitúrico
Equivalente
ao
Trolox
(TBARS)
(TEAC)
e
10.4. DOSAGEM ENCEFÁLICAS
87
10.4.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+
87
10.4.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH
92
10.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
95
10.4.4. Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas
99
10.4.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) versus
99
10.4.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a
100
10.4.4.3. Substâncias
Parasitemia
e
101
Parasitemia
102
10.4.4.5. Capacidade
Parasitemia
103
Reativas
ao
Antioxidante
Ácido
Tiobarbitúrico
Equivalente
ao
Trolox
(TBARS)
(TEAC)
e
10.4.5. Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica
104
11. DISCUSSÃO
106
11.1. ACHADOS PULMONARES
107
11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS
109
12. CONSIDERAÇÕES FINAIS
114
13. CONCLUSÕES
115
14. REFERÊNCIAS
116
8
15. ANEXO
130
16. APÊNDICES
131
APÊNDICE 1- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo
A após 1 dia de infecção
131
B após 1 dia de infecção
132
C após 1 dia de infecção
133
D após 1 dia de infecção
134
A após 5 dia de infecção.
135
B após 5 dia de infecção.
136
APÊNDICE 7- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do
grupo C após 5 dia de infecção.
137
grupo D após 5 dia de infecção.
138
grupo A após 10 dia de infecção.
139
grupo B após 10 dia de infecção.
140
141
142
143
grupo B após 15 dia de infecção.
144
145
146
9
147
148
149
150
APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos
dias de análise.
151
APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos
dias de análise.
152
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro.
23
Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária.
24
Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados no 25
Brasil em 2010.
Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem e no mosquito
27
Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal 35
e no patológico.
Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre 44
organelas.
Figura 7- Regulação redox do NF-kB.
47
Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE).
50
Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao 58
Trolox através da redução do radical ABTS+
Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 60
através da redução do DPPH.
Figura 11- Curva padrão de Malondialdeido (MDA).
61
Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%.
62
Figura 13- Progressão temporal da parasitemia dos camundongos 64
infectados com o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A
(vermelho), e dos tratados com o CAPE, grupo B (roxo).
Figura 14- Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. 68
A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium
berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium
berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D
(verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).
Figura 15- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos 70
pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A
(vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium
Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos 74
pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A
11
Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 78
(TBARS) nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A
Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido 82
Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox
(TEAC) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P.
berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium
berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C)
tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo
(inóculo de hemácias saudáveis).
Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução
do Radical DPPH em amostras pulmonares de camundongos infectados
pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium
berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D)
Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).
Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos
camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com
etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com
CAPE e infectado com Plasmodium berghei.
Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da 85
Redução do Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos
camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com
etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com
Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao 86
Trolox (TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos
infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04%
e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado
com Plasmodium berghei.
Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em 87
encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A
Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em 91
encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A
12
Figura 25- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 95
(TBARS) nos encéfalos dos camundongos nos dias de eutanásia. A
Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido 99
Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao
Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado
com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com
CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não
infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias
saudáveis).
Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução
do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A)
tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B)
tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com
CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de
hemácias saudáveis).
Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo
infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
berghei.
Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da 102
Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de
estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e
infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado
com Plasmodium berghei.
Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao 103
Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados
e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
berghei.
Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da 105
solução azul de evans 2% nos dias de eutanásia.
13
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma 55
estimativa inicial da parasitemia.
Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC 57
Quadro 3-Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH
59
Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias
61
Tabela 1- Valores de parasitemia dos camundongos infectados em 65
função do tempo de infecção
Tabela 2- Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos 66
de camundongos para cada grupo isoladamente
Tabela 3- Valores de p referentes às correlações entre as
parasitemias dos grupos de camundongos A e B
67
Tabela 4- Percentual de sobrevida de todos os grupos de 69
camundongos de experimentação do presente trabalho
Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 71
nos pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de
infecção
Tabela 6- Valores de p das correlações das capacidade antioxidante 72
equivalente ao trolox através da redução do radical ABTS+ nos
pulmões entre os subgrupos de camundongos pertencentes aos
grupos A, B, C e D. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com
Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P.
berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).
Tabela 7- Valores de p das comparações para a capacidade
antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões entre os grupos de
camundongos
73
Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do 75
DPPH nos pulmões de cada grupo de camundongos
Tabela 9- Valores de p das comparações para a capacidade 76
antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões, entre os
subgrupos de camundongos
antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões entre os
grupos de camundongos
Tabela 11- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido 79
Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos em função do
14
tempo de infecção
Tabela 12- Valores de p referente à correlação das Substâncias 80
Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os
subgrupos de camundongos pertencentes aos grupos A, B, C e D. (A)
tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B)
tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado
com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo
(inóculo de hemácias saudáveis).
Tabela 13- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas 81
ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os grupos de
camundongos
Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox 88
nos encéfalos de cada grupo de camundongos em função do tempo
de infecção
antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos
de camundongos
antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de
camundongos
Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do 92
DPPH nos encéfalos de cada grupo de camundongos
antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os
subgrupos de camundongos
antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os
Tabela 20- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido 96
Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função
do tempo de infecção
Tabela 21- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas 97
ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos
de camundongos
Tabela 22- Valores de p das comparações para Substâncias
Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os
98
15
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ABTS
ATP
BAFFR
BCR
BHE
BKL
BTK
CAPE
CAT
CDC
cNOS
COX
DATASUS
DNA
DPPH
ELISA
ERK
ERON
ERN
ERO
Fe
FT
G-CSF
GM-CSF
GSH
GSH-Px
GSH-Rd
H2O2
HI
HIV
HO-2
ICAM-1
IEC
IKB
IKK
IFN
IL
iNOS
K2S2O4
KH2PO4
MC
MCF-7
MDA
MEKK
MP
MS
NAC
2,2 AZINO BIS (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico sal ácido diamônio)
Adenosina trifosfato
Fator de ativação de células B
Receptor de células B
Barreira Hematoencefálica
Quinase linfóide B
Tirosina quinase de Bruton
Ácido caféico éster fenetil
Catalase
Center for Disease Control
Óxido nítrico sintase constitutiva
Ciclooxigenase
Sistema de dados do Sistema Único de Saúde
Ácido desoxiribonucleico
2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil
Ensaio imunoenzimático
Quinase regulatória extracelular
Espécies Reativas do Oxigênio e do Nitrogênio
Espécies Reativas do Nitrogênio
Espécies Reativas do Oxigênio
Ferro
Fator de transcrição
Fator de crescimento celular de granulócitos
Fator de crescimento celular de granulócitos e macrófagos
Glutationa reduzida
Glutationa peroxidase
Glutationa redutase
Peróxido de hidrogênio
Hemácias infectadas
Vírus da imunodeficiência humana
Hidroperoxila
Moléculas de adesão intracelular 1
Instituto Evandro Chagas
Inibidor kappa B
IKB Kinase
Interferon
Interleucina
Óxido nítrico sintase induzível
Persulfato de potássio
fosfato monobásico de potássio
Malária cerebral
Células tumorais de glândulas mamárias de humanos
Malondialdeido
MEK quinase
Malaria pulmonar
Ministério da Saúde
N-acetil cisteína
16
NADPH
NEMO
NF-kB
NIK
NO
NOS
O2
O2OH.
OMS
ONOOP90RSK
PGE2
PKB
PKC
PKR
PMA
Q1
Q3
RE
RHD
RI
RL
RNA
SARA
SIRT-1
SOD
SYK
TCR
TEAC
TLR
TNF
TNFR
TPL2
TRAF
Trolox
UFPA
UV
WHO
Fosfato de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo reduzida
Modulador essencial NF-kB
Fator Nuclear-Kappa B
Iindutor de quinase NF-kB
Óxido Nítrico
Óxido nítrico sintase
Oxigênio Molecular
Radical Superóxido
Radical Hidroxil
Organização Mundial de Saúde
Peróxinitrito
Proteína 90 ribossomal S6 quinase
Protaglandina E2
Preoteína quinase B
Proteína quinase C
Preoteína quinase R
Forbol miristrato-13 acetato
Primeiro quartil
Terceiro quartil
Retículo endoplasmático
Domínio homólogo Rel
Radiação ionizante
Radicais livres
Ácido riboxinucléico
Síndrome da Angústia Respiratória Aguda
Sirtuína 1
Superóxido dismutase
Tirosina quinase do baço
Receptor de células T
Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
Receptor Toll-like
Fator de Necrose Tumoral
Receptor para TNF
Progressão do tumor lócus 2 quinase
Fatores associados ao TNFR
Ácido 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico
Universidade Federal do Pará
Ultra violeta
World Health Organization
17
RESUMO
O estresse oxidativo é um desequilíbrio redox que já foi identificado com importante
papel na patogenia da malária, com destaque nas formas graves da doença como
no acometimento cerebral e no pulmonar. Em meio a doença e o estresse oxidativo
uma partícula envolvida em vários processos fisiopatológicos é o fator de
transcrição NF-kB, responsável pela transcrição de uma série de partículas que
podem estar envolvidas no agravamento da doença. Utilizando modelo
experimental murino infectado pelo Plasmodium berghei, realizou-se a avaliação da
capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica e permeabilidade da barreira
hematocerebral. Ao promover a inibição do NF-kB constatou-se a diminuição da
parasitemia dos camundongos no 15º e 20º dias após a infecção sem promover
alteração na sobrevida. No tecido pulmonar poucas substâncias foram reativas ao
ácido tiobarbitúrico no primeiro dia de análise e ocorreu o aumento da capacidade
antioxidante a curto e longo prazo. No tecido encefálico o aumento da peroxidação
lipídica ocorreu a longo prazo e a capacidade antioxidante aumentou de forma
semelhante ao ocorrido no pulmão, além do prolongamento da manutenção da
barreira hematoencefáfica com o uso do inibibor do NF-kB. Dessa forma
concluímos que este fator de transcrição assim como o estresse oxidativo podem
contribuir com o agravamento da malária.
Palavras-chave: malária, NF-kB, CAPE, estresse oxidativo, antioxidantes
18
ABSTRACT
The oxidative stress is a redox imbalance that has been identified in some research
with an important role in malaria pathogenesis, especially in the severe form of the
disease, as in brain and lung malaria. In the middle of the disease and oxidative
stress a particle involved in several pathophysiological processes is the
transcription factor NF-kB, responsible for the transcription of a number of particles
that may be involved in the aggravation of the disease. Using an experimental mice
model infected with Plasmodium berghei, evaluation of total antioxidant capacity,
lipid peroxidation and disruption of blood-brain barrier was carried out. The
promotion of of NF-kB inhibition was found to decrease in parasitemia of mice at
15th and 20th days post infection without changes in the survival rate. In lung tissue
just a slight increase in thiobarbituric acid thiobarbituric reactive substances was
found on the first day of analysis and there was both short and long term increase of
antioxidant defenses. In brain tissue a long term lipid peroxidation increase was
found and antioxidant activity increased similarly to what happened in the lung, in
addition to prolonging the maintenance of the blood-brain barrier with the use of NFkB inhibitor. Thus we conclude that NF-kB, as well as oxidative stress, may
contribute to the worsening of malaria.
Keywords: malaria, NFkB, CAPE, oxidative stress, antioxidants
19
1. INTRODUÇÃO
A malária é uma doença endêmica, febril, transmitida pelo mosquito do
gênero Anopheles, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero Plasmodium,
que atinge mais de 100 países, 3,4 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco
(CDC, 2010b). É classificada como a quinta causa de morte por doença infecciosa
no mundo, na África é a segunda maior causa de morte, depois do HIV (vírus da
imunodeficiência humana), sendo que a maioria dessas ocorre em crianças de até
cinco anos de idade (Saraiva et al., 2009; WHO, 2009a).
Em 2008 foram registrado 243 milhões de casos de malária em todo o
mundo (WHO, 2009a). Nas Américas ocorreram 572.000 registros, sendo o
Plamodium vivax responsável pela maioria, 77% (WHO, 2009b). No Brasil, durante
o período de 2009, foram notificados 306.908 casos, com predominância nas
seguintes regiões: Pará, Amazonas, Rondônia, Roraima, Amapá, Acre e Tocantins
(DATASUS, 2008; MS, 2009). Medidas de controle implantadas no ano de 2006
resultaram na redução de 43% de sua ocorrência até 2008. A doença ocorre em
regiões que favoreçam o desenvolvimento do mosquito e do parasito, áreas rurais
e nas periferias urbanas, associando-se à deficiência na atenção básica à saúde
em locais endêmicos (Ferreira, 2008; MS, 2009; WHO, 2009b).
Apesar da diminuição do número de notificação da malária nos últimos anos,
a doença ainda apresenta elevado risco de incidência e transmissão. De acordo
com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Brasil, Colômbia, Costa Rica e
Peru, são regiões que apresentaram flutuações nos registros da doença durante o
período de 2000 a 2008 (WHO, 2009a).
Para controle da malária são utilizadas as seguintes intervenções: gestão
dos pacientes (diagnóstico e tratamento); prevenção da infecção através do
controle do vetor (uso de mosquiteiro e inseticidas) e da doença (administração de
antimaláricos). As últimas representam os alicerces para o controle e diminuição
dos gastos em saúde pública, pois são meios de prevenir casos graves e
conseqüente óbito, bem como eliminar as fontes de infecção para os mosquitos,
contribuindo assim, para a redução da transmissão (WHO, 2009a).
Mesmo diante de todo esse mecanismo de controle, o combate eficaz da
doença pode ser prejudicado, como se pode observar através do aparecimento de
cepas resistente a alguns antimaláricos em pacientes tratados com quinina,
20
cloroquina e artemisina (Walker et al., 2000; Baird, 2004). Estudos realizados por
Muñoz et al. (2006) sugerem resistência também à primaquina.
A ausência de conhecimento sobre o mecanismo completo de ação do
parasita no organismo humano dificulta a ação efetiva de antimaláricos, assim
como o controle dos sinais e sintomas característicos da malária, ressaltando as
suas formas severas, pulmonar e cerebral, que podem levar a morte de pacientes
acometidos pela doença causada pelo Plasmodium falciparum (Charoenpan et al.,
1990; Newton et al., 1997; Coban et al., 2006).
Recentemente, diversos pesquisadores vêm estudando o envolvimento de
agentes oxidantes alterando o equilíbrio redox em processos fisiopatológicos, como
já foi descrito em pacientes asmáticos, em portadores de ateroscleróticas, hipoxia
ou câncer (Gutierrez et al., 2010).
Nesse sentido, muitos discutem o envolvimento dos radicais livres, através
do estresse oxidativo, na patogenia da malária (Pablón et al., 2002; Huber et al.,
2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et
al., 2004; Wilmanski et al., 2005; Kumar et al., 2005; Jaramillo et al., 2005; Sohail et
al., 2007).
Sabe-se que o processo infeccioso desta doença promove alterações na
produção de interleucina (IL)-12, IL-6, fator de necrose tumoral α (TNF- α) e IL-10,
e que de acordo com Wilmanski et al. (2005) as citocinas apresentam papel
importante no estímulo redox celular. Outro achado envolvendo ação oxidativa é a
peroxidação lipídica ocorrida em eritrócitos infectados e não infectados (OmodeoSalé et al., 2003).
Fator importante no que diz respeito ao balanço redox no organismo humano
é a relação parasita-hospedeiro, onde a intensidade da patogenicidade, caso haja
desequilíbrio deste balanço, vai depender das concentrações locais das espécies
pró e antioxidantes, culminando com a
produção de radicais
lives
e,
consequentemente levando ao estresse oxidativo, quando a ação antioxidante é
deficiente, através da inibição de sua atividade, ou por meio da produção de
radicais em quantidade superior a capacidade antioxidante com o intuito de debelar
a infecção (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007).
Os radicais, como espécies reativas do oxigênio (ERO), do nitrogênio (ERN),
entre outras, podem ser produzida tanto pelo parasito como pelo hospedeiro
humano (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007). Além do uso de
21
antimaláricos, como a primaquina, os quais parecem atuar através de mecanismo
oxidativo (Vale et al., 2009).
O organismo humano possui diversas fontes de espécies reativas, tais como
as mitocôndrias, peroxissomas, citoplasma e membrana de células, retículo
endoplasmático, fagócito, lisossoma e através da catálise por metais de transição,
como o ferro e cobre (Ferreira & Matsubara, 1997).
As ERO, radicais superóxido (O2-) e hidroperoxila (HO-2) são produzidas a
partir do metabolismo do oxigênio molecular (O2). Segundo pesquisadores, tal
produção é catalisada na presença de metais, como o ferro (Fe), através das
reações de Fenton e de Haber-Weiss. Na malária o referido metal se torna
disponível durante o estágio eritrocítico do plasmódio, no qual o parasita realiza a
proteólise da hemoglobina obtendo nutrientes necessários para o seu metabolismo,
ocasionando a liberação de grande quantidade de grupos heme e moléculas de Fe
(Ferreira & Matsubara, 1997; Kumar et al., 2005; Lyaweh & Onigbinde, 2009; Circu
& Aw, 2010)
Outro radical livre que parece estar envolvido na doença é o óxido nítrico,
NO (Pablón et al., 2002; Huber et al. 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et
al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al. 2004, Pino et al., 2005). Este gás é
produzido com a finalidade de ação citotóxica e citostática contra microoganismos,
parasitas e células tumorais, que geralmente vem acompanhada de grande
produção de ERO. Citocinas e/ou endotoxinas estimulam a enzima NO sintase
induzível (i-NOS), que sintetiza NO a partir da oxidação da L-arginina (Pfeilschifter
et al., 2003; Shirley, 2005).
Na malária, entretanto seu papel ainda é controverso, alguns pesquisadores
afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma conseqüência da
produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas
(Favre et al., 1997), enquanto outros defendem que a malária cerebral decorra de
uma baixa biodisponibilidade deste gás (Gramaglia et al., 2006).
Este gás em associação ao O2 ou O2-, origina poderosos oxidantes, N2O3 e
peróxinitrito (ONOO-), este último, na presença de íon hidrogênio origina o radical
hidroxila (OH.; Pfeilschifter et al., 2003; Shirley, 2005).
Outro componente que pode está envolvido na sinalização e expressão de
genes sensíveis a regulação redox da doença é o fator nuclear de transcrição
kappa B (NF-kB), o qual de acordo com Kriete & Mayo (2009) atua diante de
22
agentes infecciosos, ambientais, ativando genes pertencentes ao processo
inflamatórios e está envolvido no estresse, porém este mecanismo ainda não foi
ainda esclarecido.
O NF-kB encontra-se no citoplasma associado ao inibidor IKB, que diante de
sinalizações, como através de citocinas (IL-1 e TNF- α), grupo heme livre, espécies
reativas de oxigênio, NOS e moléculas de adesão, sofre fosforilação por ação da
IKB kinase (IKK) e proteólise, liberando, portanto o NF-kB, que migra para o núcleo
e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de genes que podem estar
relacionado a defesa ou agravamento da doença (Arruda et al., 2004; Salminen et
al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Miller et al., 2010).
Considerando-se a elevada incidência de malária na região amazônica, a
produção de agentes oxidantes tanto pelo hospedeiro humano quanto pelo
parasito, e a ausência de conhecimento com relação aos mecanismos precisos da
regulação redox da transcrição gênica, se faz necessários estudos quantitativos e
qualitativos dos agentes oxidantes, capacidade antioxidante e o papel do fator
transcriptacional NF-kB na malária.
23
2.
MALÁRIA
2.1.
EPIDEMIOLOGIA
É uma doença endêmica, característica das áreas tropicais e subtropicais do
mundo, que apresenta como fatores determinantes para ocorrência a presença do
parasita, do mosquito (vetor) e do homem. Soma-se a estas as condições
climáticas regionais, principalmente as chuvas, que formam criadouros para o
inseto transmissor e a temperatura, cujos valores entre 20-30ºC, favorecem o seu
crescimento e o desenvolvimento do parasita no mosquito, exercendo assim,
importantes influências na distribuição geográfica da doença (Andrade, 2005;
Neves et al., 2007).
Em 2009 foram identificados 306.908 casos, com predominância na região
Norte, na qual os estados mais atingidos foram os seguintes: Amazonas, Amapá,
Rondônia, Acre e Pará, porém este demonstrou aumento (Figura 1) de
aproximadamente 44% com relação a 2008 (MS, 2009).
Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro.
Fonte: MS, 2009.
24
Em 2010 foram registrados casos de malária em 106 países do mundo
(Figura 2), a maioria destes no Continente Africano, em seguida no Sudeste
Asiático, região oriental do Mediterrâneo e Continente Americano (WHO, 2011a).
Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária.
Fonte: Adaptado de WHO, 2011a.
Nesse período no Brasil foram registrados 334.681 pacientes com malária,
destes 84,75% foram acometidos pelo P. vivax e 15,25% pelo P. falciparum (Figura
3), com 5451 casos de internação e 75 mortes causadas pela presença da doença
(WHO, 2011a).
No Brasil a distribuição da doença está associada à atividade exercida pela
população exposta, sendo frequente nos garimpeiros e trabalhadores envolvidos
nos projetos agropecuários e de colonização. Nas periferias das grandes cidades
como Belém e Manaus as más condições de habitação propiciam a ocorrência dos
focos epidêmicos (DATASUS, 2008).
25
Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados
no Brasil em 2010.
Fonte: WHO, 2011a.
De acordo com dados do World Malaria Report 2011, no período de 2000 a
2010 houve uma redução significativa de casos de malária na maioria dos países
do continente americano. No entanto, alguns desses como o Haiti apresentaram
aumento, acreditando-se que este resultado seja devido a não implementação de
métodos de controle da doença, prevenção e tratamentos, adequados (WHO,
2011b).
Em 2011 foram notificados no Brasil 267.045 casos da doença (WHO, 2013).
Mas recentemente, em 2012, foi estimado a ocorrência de 207 milhões de casos da
malária distribuidas no mundo com em torno de 627 mil mortes. Nesse ano a
estimativa no continente americano foi de 800,000 casos, sendo 0,1% ocasionando
como consequência o óbito do paciente infectado, principalmente crianças abaixo
de 5 anos de idade (WHO, 2013).
2.2. BIOLOGIA DO PARASITA
A doença é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium, um organismo
unicelular que apresenta como hospedeiro intermediário o homem e definitivo o
mosquito, pertencente à ordem dos dípteros, família Culicidae, gênero Anopheles,
sendo a espécie Anopheles darlingi, a que se destaca na transmissão (Vale et al.,
2005; MS, 2005).
26
Há quatro espécies de plasmódios de maior prevalência que podem infectar
o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale e o
Plasmodium malarie. O primeiro é responsável pela febre terçã maligna, o segundo
e o terceiro pela terçã benigna e o ultimo pela quartã cosmopolita (CDC, 2010a).
Destas, somente P. vivax e P. ovale são capazes de causar múltiplas recaídas da
malária após semanas ou meses da primeira infecção, característica que se
associa a presença da forma latente do protozoário no fígado (Deen et al., 2008).
O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos letais. Seu
crescimento é favorecido em temperatura de 25°C, pois provocam o encurtamento
do ciclo, com esquizogonia em até 10 dias, aumentando assim a possibilidade de
transmissão. O período de incubação desta espécie varia de 9 a 14 dias,
entretanto, climas temperados e subtropicais provocam o prolongamento deste
período em algumas cepas (Andrade, 2005; CDC, 2010a).
O ciclo assexuado ocorre no homem (Figura 4), e se inicia durante o repasto
sanguíneo, quando o mosquito infectado inocula os esporozoitos no organismo
humano, os quais migram para o fígado onde realizam o ciclo exo-eritrocítico. Nas
células hepáticas, os protozoários sofrem diferenciação e passam para a forma
arredondada de criptozoítos, em seguida se multiplicam e se diferenciam em cerca
de 40.000 merozoítos (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; CDC, 2010c).
Com a ruptura dos esquizontes hepáticos, os merozoitos migram para a
corrente sanguínea, onde iniciam o ciclo eritrocitário, degradam a hemoglobina
para a obtenção de aminoácido e síntese proteíca, através das enzimas produzidas
no vacúolo digestivo. A seguir, passam à forma amebóide intracelular de
trofozoítos, os quais evoluem até merozoítos, que irão infectar novos eritrócitos.
Neste momento, ocorre a diferenciação dos gametócitos que migram para a
periferia do organismo humano (Vale et al., 2005; CDC, 2010c).
Ao realizar a picada, o mosquito fêmea ingere os gametócitos juntamente
com o sangue humano, que ao alcançarem o estômago, realizam o ciclo sexuado
(esporogônia), no qual o microgameta se une ao macrogameta formando o zigoto,
que se torna móvel e alongado (oocineto) e invade o epitélio gástrico, originando o
oocisto, que sofre ruptura e libera numerosos esporozoítos, os quais migram para
as glândulas salivares do inseto, que durante o repasto serão inoculados no ser
27
humano, dando início a um novo ciclo do plasmódio (Bernan, 2004; Vale et al.,
2005; CDC, 2010c).
Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem no mosquito.
Fonte: Adaptado do CDC, 2010c.
2.3. PATOGENIA
A malária pode ocorrer de forma assintomática ou com sinais e sintomas
clássicos, como febre, sudorese, cefaléia e dores musculares. A gravidade
depende da espécie de plasmódio presente e do estado imunológico do
hospedeiro. Outros sinais e sintomas podem ocorrer, tais como mal estar geral,
fadiga, mialgia, artralgia, dor abdominal, náuseas, vômito e diarréia. Também
podem ocorrer hepatoesplenomegalia, hipoglicemia e anemia (Bernan, 2004; MS,
2008; CDC, 2010c).
28
A fisiopatologia está relacionada ao ciclo do parasito no organismo, mais
precisamente à ruptura dos eritrócitos ao final da esquizogonia, quando ocorre a
liberação na corrente sanguínea de parasitas e pirógenos, resultando na patologia
e alterações orgânicas características da malária (Barsoum, 2000; Andrade, 2005;
CDC, 2010c). Nesse processo, acredita-se que os fatores determinantes são:
-A destruição dos eritrócitos (Barsoum, 2000);
-Toxicidade resultante da liberação de citocinas (Urquhart, 1994);
-Sequestro de eritrócitos parasitados na rede capilar (Barsoum, 2000);
-Lesão capilar por deposição de imunocomplexos (Mibei et al., 2005).
Um fator interessante acerca da destruição de eritrócitos é que a mesma não
está relacionada à presença do parasita no interior do eritrócito, pois foi identificado
que mesmo células que não contenham plasmódios também são alteradas no
indivíduo com a doença (Omodeo-Salé et al., 2003).
Quanto ao segundo fator citado, tem se observado que na doença aguda
ocorre o estímulo de células imunocompetentes com consequente liberação de
citocinas, estas que são moléculas protéicas essenciais para a comunicação
intercelular. Como já foi constatado, o pigmento malárico hemozoína estimulando
macrófagos e a interleucina 1 (IL-1), esta é capaz de alterar o equilíbrio do
hipotálamo, provocando elevação da temperatura, a qual possui duração
característica de acordo com cada espécie (Urquhart, 1994; Barsoum, 2000; Olivier
et al., 2014). No P. falciparum os acessos febris são repetidos em intervalos de 36
ou 48 horas, tal fato pode ocorrer devido sua ação em eritrócitos de qualquer idade;
o P. vivax e o P. ovale com intervalos de 48 h e invadem células jovens, enquanto
que o P. malariae em intervalos de 72 h, atuando em eritrócitos velhos (Barsoum,
2000; Malagón, 2005).
Além da produção do pigmento, ocorre a indução da liberação de fator de
necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6 e IL-8 em fagócitos e provavelmente em células
endoteliais.
Outras
citocinas
parecem
está
envolvidas
na
inibição
da
gliconeogênese, com efeitos principalmente sobre a placenta, conferindo assim a
gravidade da doença durante a gestação. Essas moléculas proteicas também já
29
foram identificadas provocando o aumento na produção de óxido nítrico pelos
leucócitos, músculo liso, microglia e endotélio vascular, radical livre que parece
está envolvido na complicação da malária grave e o coma (Clarck et al., 2004).
Com relação ao sequestro de eritrócitos tem se observado que este efeito
ocorre devido às alterações provocadas na superfície das células vermelhas
infectadas, ocasionando o fenômeno de citoaderência mediado por proteínas
expressas na superfície das células, formando protuberâncias ou knobs. Esse
fenômeno e formação de rosetas ocorrem principalmente em vênulas de órgão
vitais como cérebro, fígado e rins, trazendo consequências graves como a
obstrução da microcirculação, redução do fluxo de oxigênio e acidose láctica,
resultando assim nas seguintes complicações: malária cerebral, insuficiência renal
e hepatite (Clarck et al., 2004; Rug et al., 2006).
Outra alteração observada é a
presença de imunocomplexos
na
patogenicidade da doença, como se observou em pesquisa realizada em crianças
infectadas pelo P. falciparum e se identificou a presença desses complexos na
malária grave associada a anemia ou a complicação cerebral (Mibei et al., 2005).
A inibição de certos neurônios do hipotálamo anterior tem sido descrita, com
consequente vasoconstrição periférica, originando a sensação de frio (Andrade,
2005; CDC, 2010c).
2.4. MALÁRIA GRAVE
A malária grave ou complicada ocorre quando há o agravamento da doença
causada por falha em algum órgão ou anormalidade sanguínea ou metabólica,
como na malária cerebral, na pulmonar (MP), na hemólise severa, hemglobinúria,
coagulação anormal, baixa pressão arterial, hipoglicemia, hiperparasitemia e
insuficiência renal aguda (CDC, 2010d).
Essa forma da doença é ocasionada pelo P. falciparum, porém tem crescido
o número de casos da forma grave da doença provocada pelo P. vivax, além do P.
Knowlesi (Cox-Singh et al., 2008; WHO, 2012a). Geralmente a complicação ocorre
após 3-7 dias iniciado a febre, mesmo diante de tratamento e eliminação total do
parasita (Trampuz et al., 2003; WHO, 2012a).
30
O diagnóstico é realizado pela identificação das formas assexuadas do
parasita no esfregaço sanguíneo e a presença das seguintes características
clínicas e laboratoriais, que podem ocorrer de forma isolada ou em combinação
com outros sinais e sintomas assinalados na doença (WHO, 2012a; WHO, 2012b):
Características Clínicas:
-Alterações na consciência ou coma irreversível (escala de coma Glasgow >11
para adultos e aplica-se para crianças escala de coma Blantyre >3). Além dessas
alterações o paciente em coma pode apresentar hemorragia em sua retina;
-Abatimento físico, psíquico e fraqueza generalizada;
-Mais de 2 convulsões em 24h;
-Dificuldade respiratória;
-Colapso respiratório, pressão sistólica baixa (<70mmHg em adultos e <50mmHg
em crianças);
-Icterícia;
-Hemorragia;
-Edema pulmonar.
Características Laboratoriais:
-Hipoglicemia (<40mg/dL);
-Acidose metabólica (bicarbonato plasmático<15mmol/dL);
-Hemoglobinúria;
-Hiperparasitemia (>20%);
-Hiperlactatemia (<5mmol/L);
-Lesão renal aguda (creatinina<264µmol/L);
-Anemia normocítica severa (hemoglobina>5g/dL e hematócrito < 15% em adultos
e <20% em crianças).
31
Crianças, gestantes no segundo ou terceiro mês de gestação, pessoas de
área não endêmica, submetidas à esplenectomia ou imunodeprimidas possuem
grande risco de desenvolver a forma grave da doença quando o parasita se instala
no organismo das mesmas (WHO, 2012b).
Os antimaláricos de escolha no combate aos parasitas na malária
complicada são: artemeter, artesunado ou quinina. Medicamentos que devem ser
administrados de forma isolada imediatamente por via parenteral após cálculo da
dose de acordo com o peso (WHO, 2012b).
Com relação a malária cerebral (MC), ela pode atingir cerca de 0,01 a 16%
dos pacientes com P. falciparum e promover de 10 a 50% de letalidade dos
mesmos (Braga et al., 2004; Alves et al., 2007).
Crianças com essa forma da doença possuem dificuldade de se alimentar,
apresentam febre que variam de 37,5ºC a 41ºC, vômito e tosse são comuns,
ocasionalmente podem desenvolver diarréia. Esses são sinais geralmente gerados
anteriores ao coma, o qual persiste por mais de 30 min após a convulsão. Esta
antes ou depois do coma está assosiado à morbidade e sequelas da doença
(WHO, 2012b). Essa faixa etária quando em coma profundo apresenta reflexos e
movimentos anormais dos olhos. Além dessas caracteristicas clínicas também se
observa uma respiração profunda, mãos e pés frios ou pulso fraco. Cinco a 30%
das crianças que sobrevivem a MC têm alguma sequela neurológica (WHO,
2012b).
Em adultos com essa forma grave da doença comumente são observados
convulsões, alterações na retina, fechamento fixo da mandíbula, bruxismo e
hepatomegalia. Porém pode ocorrer também disfunção motora com a presença de
membros superiores e inferiores esticados, rigidez leve da nuca, formação de
becinho que pode ser evidenciado com o toque nos lábios, raramente o edema de
papila é identificado (WHO, 2012b).
Em qualquer faixa etária devem ser excluídas outras causas de alterações
neurológicas que acontecem na malária, como hipoglicemia e acidentes
vasculares, ou por outras doenças como meningite bacteriana e encefalite viral
(WHO, 2012b; Rodrigues et al., 2013).
32
O mecanismo de ação patogênica na MC ainda não foi totalmente elucidado,
acredita-se em duas teorias. A primeira baseia-se no fenômeno de citoaderência de
eritrócitos infectados e não-infectados na microvalulatura cerebral impedindo o
fluxo sanguíneo e consequente impedindo a condução de nutrientes e oxigênio
para as células cerebrais (Berendt et al., 1994). A segunda é fundamentada na
resposta exceciva do sistema imunológico através da liberação de citocinas pelas
células Th1 (Clark & Rockett, 1994).
Ambas as teorias têm sido demonstradas de grande importância, chegandose assim a uma terceira hipótese da ação comcomitante das duas na gênese da
doença (Van de Heyde et al., 2006).
Já a malária pulmonar possui uma incidência de 3 a 10% dos casos de
complicações da doença e letalidade em torno de 70% (Boulos et al., 1993).
Essa complicação da doença apresenta como caracteristica clínica em
crianças o desconforto respiratório caracterizado pela respiração profunda com
retração da parede torácica inferior, sintoma que quando ausente deve-se suspeitar
de acidose metabólica (WHO, 2012b).
Outra alteração observada ao nível dos pulmões é o edema pulmonar devido
ao aumento na permeabilidade capilar pulmonar que geralmente ocorre depois de
dias de tratamento em pacientes com melhora do quadro da doença e sem
parasitas na periferia do organismo, é caracterizado pelo aumento da frequência
respiratória e diminuição da pressão parcial de O2. Essa complicação da doença
pode evoluir para a síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) devido ao
sequestro de eritrócitos parasitados no pulmão e liberação de citocinas, que pode
levar o indivíduo acometido pela doença a morte (WHO, 2012a; WHO, 2012b).
Acredita-se que a patogênese da malária pulmonar seja predominantemente
devido à resposta inflamatória após o tratamento, já que o aparecimento desta
forma grave da doença ocorre após cerca de 5 dias iniciado a adiministração de
medicamentos e ausência de parasitas periféricos no paciente (WHO, 2000).
Porém, Maguire et al. (2005) acreditam que a lesão pulmonar ocorra devido
a uma ação contínua sobre o pulmão progredindo de uma fase subclínica da
doença com obstrução de vasos sanguíneos pulmonares devido ao fenômeno de
33
citoaderêcia que persiste, promovendo alteração e disfunção da membrana
alvéolo-pulmonar, modificações
que permanecem
mesmo com depuração
parasitária devido ao tratamento, e assim promove o agravamento na malária
pulmonar com o desenvolvimento da SARA.
2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL
Roedores como CBA/CAJ, C57BL/6, Swiss e DBA-2 têm sido utilizados
como modelo experimental da malária grave humana ocasionada pelo P.
falciparum, quando os camundongos são infectados pelo Plamodium berghei
ANKA, sendo os três primeiros como modelo da MC e os dois últimos em modelos
de desordem pulmonar na malária experimental (Epiphanio et al., 2010; Oakley et
al., 2011; Nacer et. al., 2012).
Em pesquisa realizada por Nacer et al. (2012) observou-se que os
camundongos Swiss e CBA/CAJ fêmeas com 3 semanas de idade (jovens)
infectados com 106 hemácias parasitadas por P. berghei ANKA desenvolveram os
sinais neurológicos da doença e 50% de parasitemia em torno do 5º ou 6º dia após
infecção, chegando ao óbito com valor maior que 60% da mesma. Nos exames
histopatológicos desses camundongos foram identificadas as clássicas marcações
da malária cerebral, petéquias, hemorragia e poucos leucócitos. Além da presença
de células sanguíneas infectadas impedindo o fluxo sanguíneo normal na
microvasculatura cerebral, levando a alteração do endotélio e quebra da barreira
hematoencefálica, essas são modificações semelhantes às observadas em
humanos.
Camundongos Swiss fêmea com 6-18 semanas de idade infectados com 105
-106 hemácias parasitadas pelo P. berghei via i.p. utilizados por Franke-Fayard et
al. (2005) apresentaram os sinais da MC entre o 5º e 10º dia após infecção e
identificaram o CD36 como um importante provável mediador associado ao
seqüestro de esquizontes no pulmão desses roedores.
Epiphanio et al. (2010) demonstraram que os camundongos DBA-2 são
excelentes modelos experimentais da desordem respiratória humana ocasionada
na malária grave, pois ao serem infectado pela P. berghei ANKA observaram que
após 6 dias de infecção via i.p. (106-107 hemácia parasitas) que esse tipo de
34
camundongo desenvolveu
dispnéia, obstrução das vias aéreas, hipoxemia,
hemorragia pulmonar e edema. Características não observadas nos experimentos
realizados no C57BL/6, o qual é muito utilizado como modelo de MC.
Estudos
recentes
demonstraram o
efeito
da
suplementação
com
antioxidantes sobre ambas as formas grave da doença em camundongos Swiss
machos infectados P. berghei ANKA via i.p., 107 hemácia parasitas (Warwick et al.,
2013). Assim como esses pesquisadores, Desowitz & Barnwell (1980) utilizaram
esses tipos de roedores (fêmeas) em seus experimentos para testar a ação do
efeito de vacina indutora da imunidade contra a malária.
Através desses dados de modelos experimentais observou-se que os
mesmos são amplamente utilizados como uma ferramenta para desvendar o
mecanismo de ação do parasita e assim desenvolver drogas ou vacinas para o
combate eficaz contra a malária.
3.
ESTRESSE OXIDATIVO
3.1. ESTRESSE
OXIDATIVO
E
OS
ANTIOXIDANTE NO ORGANISMO
MECANISMOS
DE
DEFESA
Os radicais livres são átomos ou moléculas que apresentam número ímpar
de elétrons na última camada eletrônica, devido a um processo de oxirredução,
logo, apresentam-se instáveis e altamente reativos, com a capacidade de captar
um elétron para obter estabilidade. Como exemplo desses há o radical O2- e o NO,
assim como radical hidroxila, hidroperoxila e peroxinitrito. O peróxido de hidrogênio
(H2O2) apesar de não possuir elétrons desemparelhados é considerado agente
oxidante devido produzir OH● (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al.,
2007).
Tais moléculas instáveis podem ser obtidas durante os processos
metabólicos normais, sendo que, o organismo humano apresenta as seguintes
fontes
endógenas dessas, a membrana celular, através da síntese de
prostaglandinas, lipoxigenase e o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo
reduzida (NADPH); o citoplasma através da xantina oxidase, hemoglobina,
riboflavina, catecolaminas, metais de transição (Ferro e Cobre); retículo
endoplasmático e lisossomas através do citocromo P450 e enzimas hidrolíticas;
mitocôndria no transporte de elétrons da cadeia respiratória e peroxissoma por
35
meio de oxidases e flavoproteínas. Outra fonte de ERO são os fagócitos que atuam
como primeiro mecanismo de defesa contra microrganismos, os quais estão
envolvidos na resposta não específica e na reação inflamatória. Enquanto que são
como fontes exógenas os raios ultravioleta (UV), outras radiações ionizantes,
quimioterápicos e xenobióticos, além de outras (Ferreira & Matsubara, 1997;
Chaves et al., 2000; Vasconcelos et al., 2007; Wells et al., 2009).
As ERO e ERN no organismo estão envolvidas em processo de produção de
energia, regulação do crescimento, sinalização intercelular e síntese de diversas
substâncias. No entanto, quando a quantidade de radicais excede a capacidade
antioxidante do organismo, originam o estado de estresse oxidativo (Figura 5), no
qual a agressão celular se torna eminente, esta pode ocorrer através de danos ao
ácido nucléico, proteínas, lipídeos e carboidratos. Dessa forma encontra-se
relacionada a várias patologias, tais como, câncer, hipóxia, artrite, doenças do
coração, choque hemorrágico, patologias semelhantes à doença vascular,
inflamatória e desordens neurológicas, assim como no envelhecimento celular,
podendo causar o agravamento destas (Ferreira & Matsubara, 1997; Barreiros et
al., 2006; Vasconcelos et al., 2007; Gutierrez et al., 2010).
Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal e no
patológico.
Fonte: Adaptado de Ma et al., 2010.
36
Durante a produção normal de oxiradicais o organismo responde através da
ação de defesas antioxidantes, as quais podem ser divididas em enzimáticas e não
enzimáticas, o primeiro grupo é composto de superóxido-dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa-peroxidase (GSH-Px) e glutationa-redutase (GSH-Rd), e
no segundo a vitamina A, C e E, bilirrubina, proteínas quelantes como a albumina,
ferritina e ceruloplasmina, dentre outros (Aguiar et al., 2006; Vasconcelos et al.,
2007; Bartosz, 2009).
A SOD é uma enzima que realiza a dismutação do radical superóxido a H2O2
e O2. Existem três tipos desta enzima no organismo humano: SOD-cobre-zinco
(SOD-Zi/Cu) no citosol, SOD-manganês (SOD-Mn) na mitocôndria e a SOD extracelular (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009; Ma, 2010).
Já a CAT catalisa a redução do peróxido a água e oxigênio, assim como a
GSH-Px, a qual requer a presença de glutationa, esta que em seguida se torna
oxidada e será reduzida através do NADPH em reação catalisada pela GSH-Rd
(Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009).
A vitamina C encontra-se no organismo na forma de ascorbato e atua na
redução de metais como o Fe e Cu. A vitamina E atua doando elétrons a radicais
hidroxilas impedindo, portanto, a peroxidação lipídica. No entanto, o -caroteno é o
principal carotenoide fonte de vitamina A, que age na redução em baixas
concentrações de oxigênio (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009).
Com relação à bilirrubina, é um pigmento formado a partir da degradação da
hemoglobina em processos oxidativos (Vasconcelos et al., 2007; Aguiar et al.,
2006).
4.
MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO
Diversos pesquisadores vêm observando o envolvimento de alterações
redox na malária, através da produção de radicais livres (RL) pelo hospedeiro
humano com atividade antiplasmódica, com a finalidade de debelar a doença,
assim como a existência de defesas antioxidantes pelo Plasmodiun sp. (Barsoum,
2000; Fritsche et al., 2001; Omodeo-Salé et al., 2003; Jaramilo et al., 2005;
Wilmanski et al., 2005, Yeo et al., 2009). Tais espécies reativas também são
produzidas por antimaláricos como a primaquina e derivados da artemisina,
promovendo a oxidação de células, ação que pode está envolvida na terapêutica
37
do medicamento (Bolchoz et al., 2002; Ittarat, 2003; Vale et al., 2009; Ferreira et
al., 2011).
De acordo com Fritsche et al. (2001) os radicais livres como o NO, O2. e
OONO- são as principais moléculas responsáveis pela ação tóxica de macrófagos
estimulados por citocinas contra o parasita. Estudo realizado por Greve et al.
(1999) já fornecia dados que sugeriam tal importância dos RL gerados em
granulócitos como primeira linha de resposta imunológica e defesa contra P.
falciparum. Esta ideia é compartilhada por Boutlis et al. (2003), já que acredita que
o aumento desses RL contribui para a tolerância da doença em adultos
assintomáticos de áreas endêmicas.
Além deste, estudos recentes demonstram o envolvimento do estresse
oxidativo na parede do miocárdio assim como no aumento da pressão pulmonar
em crianças com malária severa, devido à hemólise intravascular e diminuição na
produção de NO com consequente efeito cardiopulmonar (Janka et al., 2010).
Tal produção de RL ocorre em grande quantidade durante o ciclo
eritrocitário, o qual inicia com a invasão dos merozoítos hepáticos nos eritrócitos,
em seguida ocorre formação de esquizontes em forma de roseta e posterior ruptura
das hemácias, com a liberação dos merozoítos sanguíneos e toxinas maláricas, as
quais induzem a liberação de citocinas que vão atuar em outras células como as
endoteliais, além dos antígenos que estimulam o linfócito T, que secretam interfern
gama (IFN-γ) e outras citocinas, induzindo a produção destas em outras células,
como os monócitos (Miller et al., 1994).
Neste ciclo ocorre a degradação da hemoglobina no vacúolo digestivo do
parasita para a obtenção de aminoácidos da globina, este evento resulta na
produção de metemoglobina, ânions superóxidos e peróxidos, com ação oxidante
em lipídios e proteínas. Ambas as reações são catalisadas na presença de um
metal de transição, como o ferro do grupo heme (Mashima et al., 2002; Schwarzer
et al., 2003)
Estudos realizados por Potter et al. (2005) demonstraram a produção de RL
pelo parasita, pois utilizou camundongos knockout para o gene da enzima NADPH
oxidase, importante para a produção de espécies reativas do oxigênio e do
nitrogênio (ERON) em fagócitos, o que impediu a progressão da parasitemia para
todas as espécies de Plasmodium testadas (P. yoelii, P. chabaudi K562, P. berguei
ANKA, P. berguei K173 e P. Vinckei vinckei) quando comparado com animais
38
normais para a referida enzima. Os autores sugeriram que o aumento dos RLs
esteja associado ao parasita e não a explosão respiratória de fagócitos.
Das et al. (1990) identificaram tal ação através de estudo em pacientes com
malária, nos quais se constatou altos níveis do marcador de peroxidação lipídica,
malondialdeído, quando comparados ao controle, sendo que a deficiência de
ribovlavina, vitamina importante na conversão GSH-oxidada para a forma reduzida,
favorece a hemólise e oxidação de lipídios contribuindo com o aumento do número
de parasitas, ocasionando agravamento da doença. Omodeo-Salé et al. (2003)
relataram que tal ação oxidante nos lipídeos ocorre nos eritrócitos infectados assim
como nos não infectados, acelerando a senescência das células vermelhas.
Outro fator importante encontrado com relação à produção de radical livre é
a síntese de óxido nítrico. Esta molécula derivada do nitrogênio é sintetizada a
partir da ação enzimática da NOS sobre o aminoácido L-arginina, produzindo NO e
citrulina. Isoformas desta enzima já foram identificadas e classificadas em duas
categorias, a forma constitutiva (cNOS) e a induzível (iNOS), esta é produzida em
macrófagos e outras células ativadas por citocinas com função de promover a
morte de patógenos (Dusse et al., 2003; Vasconcelos et al., 2007).
No entanto, seu papel ainda é controverso, pois alguns pesquisadores
afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma consequência da
produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas,
enquanto outros defendem que a MC decorra de uma baixa biodisponibilidade
deste gás (Maneerat et al., 2000; Gramaglia et al., 2006; Cabrales et al., 2011). A
síntese dessa molécula também foi identificado em mosquito Anopheles infectado
com P. falciparum (Akman-Anderson et al., 2007)
Corroborando a primeira hipótese da ação do NO, Cabrales et al. (2011)
através de análise microscópica cerebral de camundongos infectados com P.
berghei recebendo suplementação de NO, concluíram que esta protege os
camundongos contra a MC, melhorando a microcirculação no cérebro e diminui a
patologia vascular.
Maneerat et al. (2000) em pesquisa realizada com pacientes tailandeses
adultos com MC detectou a enzima iNOS através da marcação imonohistoquímica
em neurônios, astrócitos, microglias e células endoteliais, sendo que esta foi
intensa nos macrófagos próximos aos anéis hemorrágicos. Adicionalmente,
apresentou associação positiva entre a expressão de iNOS e alterações
39
histopatológicas,
sugerindo
que
essa
enzima
possa
contribuir
para
o
desenvolvimento da MC, com a evolução do quadro do paciente para coma,
convulsões e morte.
Divergindo dessa hipótese, Gramaglia et al. (2006) demonstraram em estudo
realizado em camundongos iNOS ou eNOS knockout infectados com Plasmodium
berghei ANKA, que estes não diferem quanto a parasitemia e mortalidade quando
comparados ao controle, sugerindo que o NO não influencia na parasitemia, porém
quando submeteu os animais infectados a três doses diárias de um doador de NO
observou que eles passaram a ter um tempo de vida maior e proteção contra MC,
concluindo que a produção diminuída do agente oxidante contribui para a
ocorrência da MC experimental.
Semelhante achado foi observado em estudos realizados por Astey et al.
(1996) em crianças africanas com malária, nestas são percebidos baixos níveis de
nitratos e nitritos na MC e a concentração urinária e a plasmática das moléculas
foram identificadas inversamente proporcionais a severidade da doença.
De acordo com Yeo et al. (2009) e Omodeo-Salé et al. (2010) a diminuição
das concentrações de NO na malária pode está relacionada ao grupo prostético
heme livre oriundo da hemólise provocada pelo plasmódio.
O primeiro grupo de pesquisadores referente a esta teoria demonstrou
através de estudos realizados em pacientes com MC que a hemólise está
relacionada
com aumento
da
severidade
da
doença
e
diminuição
na
biodisponibilidade de NO, com consequente aumento da parasitemia e ativação
endotelial. Omodeo-Salé et al. (2010) identificaram significante impedimento no
transporte de L-arginina de forma dose-dependente em eritrócitos tratadas com
heme livre, o que contribui para a produção reduzida de NO na malária severa.
Fritsche et al. (2001) são mais específicos em suas pesquisas, através das
quais demonstram que o Fe tem um papel importante no metabolismo da iNOS,
pois na cocultura de macrófagos e eritrócitos de camundongos infectados com P.
falciparum e prévio tratamento da mesma com Fe, observou que após estimulação
dessa com citocinas ocorreu diminuição dos níveis de NO e aumento da
parasitemia, enquanto que a mesma cultura diante de um quelador de metais
proporcionou aumento de NO e diminuição da parasitemia, concluindo que a
adição de um quelador na terapia contra a malária aumentaria a disponibilidade de
NO e morte do parasita.
40
Além do NO, outras espécies reativas podem ser produzidas por células
vasculares, através de enzimas como as ciclooxigenase (COX), as quais já foram
identificadas na malária. De acordo com Ball et al. (2004) as isoformas COX-1 e
COX-2 foram expressas no cérebro de camundongos com e sem MC, sendo que
os que foram tratados com celocoxibe, inibidor da COX-2 e, consequentemente,
da produção de prostaglandina E2 (PGE2), apresentaram os sinais da MC precoce,
sugerindo que a COX-2 possui efeito protetor na malária experimental.
Estudos realizados por Perkins et al. (2005) atribuem mais precisamente a
ação protetora contra MC à PGE2, através de estudos realizados em crianças
infectadas e assintomáticas de áreas endêmicas, as quais possuíam altos níveis
dessa prostaglandina, enquanto que as crianças que manifestaram a MC
apresentaram baixos níveis da mesma. Semelhante achado foi obtido por Xiao et
al. (1999), além de que diante da ação da aspirina, ocorreu aumento de leucotrieno
e rápida ocorrência de MC, supondo que este eicosanóine provoque o detrimento
desta forma grave da doença.
5.
FATOR NUCLEAR-KAPPA B
O NF-kB é um fator transcricional (FT) descoberto devido a sua interação
com a cadeia leve de imunoglobulinas, sendo seus primeiros experimentos
realizados em células B, por isso tal denominação, como um FT se liga ao DNA e
regula a expressão de genes (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002).
Este FT está presente em organismos eucariontes, é considerado um dos
principais reguladores que atua diante de agentes infecciosos, estresse celular,
mecanismo de sobrevivência em infecções agudas, regulando genes envolvidos na
resposta inflamatória e imunológica (Kriete & Mayo, 2009).
Esse fator nuclear é composto por duas subfamílias, NF-kB e Rel, ambas
com a porção N-terminal de 300 aminoácidos conservada, denominada domínio
homólogo Rel (RHD), região de ligação ao DNA, dimerização e interação com os
membros da família do inibidor Kappa B, IKB (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002;
Gilmore, 2006).
A primeira subfamília possui os seguintes membros, p105 (NF-kB1) e p100
(NF-kB2) e a segunda o cRel, p65 (Rel A) e Rel B. As proteínas NF-kB se tornam
ativas através dos seus respectivos encurtamento, p105 a p50 e p100 a p52,
porém em geral, de forma isolada não são ativadores de transcrição, por isso
41
formam homodímeros ou heterodímeros com a família Rel, p50/p65, p50/c-rel,
p65/p65 e p65/c-rel entre outros (Gilmore, 2006). De acordo com O’Dea &
Hoffmann (2010) são quinze os possíveis dímeros formados, proporcionando uma
diversidade combinatória que contribui para a regulação de diferentes genes.
Além desta diversidade pode ocorrer diferentes associações entre os
dímeros e os Inibidores kappa B, como exemplo o p65:p50 que pode se ligar a
quatro tipo de inibidores, os quais são ativados em resposta a um estímulo
específico (O’Dea & Hofmann, 2010).
Porém, algumas de suas combinações atuam inativando ou reprimindo
expressões gênicas, como os homodímeros p50/p50 e a p52/p52, efeito que pode
ser devido à falta do domínio C-terminal de transativação, responsável por ativação
do gene sensível ao NF-kB (Ghosh et al., 1998).
Os dímeros são formados pela união da porção C-terminal, porém tanto esta
porção como a N-terminal se ligam a uma sequência consenso contendo 9 ou 10
pares de base do DNA (sítio KB), a qual possui uma grande quantidade de
variações de base (5’-GGGRNWYYCC-3’; R por A ou G; N, qualquer nucleotídeo;
W, A ou T; Y, C ou T). Sendo que o dímero mais frequente é o heterodímero
formado pela p50 associado a p65, o qual se encontra inativo através do IkB
(Kretz-Remy et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Gilmore, 2006).
O inibidor assim como o FT possui uma família de proteínas, composta por
proteínas clássicas, IkBα, IkBβ e IkBε, e proteínas não clássicas, IkBγ e IkBδ, estas
são proteínas de alto peso molecular e por isso denominadas “IkBsome” . Ambas
as classes possuem em comum a presença repetida da proteína “ankyrin”,
responsável pela interação entre proteínas (Ghosh et al., 1998; Salminen et al.,
2008; O’Dea & Hofmann, 2010).
O IkBα se liga predominantemente ao dímero p50:RelA enquanto que o
segundo ao p50:cRel, o IkBε somente ao homo e heterodímero p65 e cRel (Ghosh
et al., 1998).
Diante de um estímulo o IkB quinase (IkK), IKKα e/ou IKKβ, provoca a
fosforilação do IkB e induz a proteólise, liberando portanto o fator nuclear, que se
transloca para o núcleo e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de
genes (Kumar et al., 2004; Salminen et al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Ma, 2010;
Miller et al., 2010).
42
Tal proteólise envolve o processo de ubiquinação e ação do proteossoma
26, pois a proteína ubiquitina irá marcar a proteína indesejada, IKB fosforilada, para
que ela seja degradada pelo proteossoma, este processo também está envolvido
no encurtamento das p100 e p105, através da degradação da porção C-terminal,
evento que pode ser responsável pelo direcionamento da via de ativação, canônica
ou não canônica (Kretz-Remy et al., 1996; Hay et al., 1999; O’Dea & Hofmann,
2010).
Os principais caminhos de ativação do fator ocorrem através da via canônica
e a não canônica, ambos caracterizados pela presença da IkK, porém a primeira
ocorre através da ativação do receptor para TNF (TNFR), Interleucina 1, receptor
Toll-like (TLR), os de células B (BCR) e os de células T (TCR), e é realizada
através do modulador essencial NF-kB (NEMO) associado a uma das formas de
quinase, que irá fosforilar as proteínas IkB clássicas ou IkBγ associadas ao NF-kB,
ativando a transcrição de genes, entre os quais estão os que expressão IkBα, IkBε,
p105, p100, cRel e RelB (Hayden & Gosh, 2004; Gilmore, 2006; Yates & Górecki,
2006; O’Dea & Hoffmann, 2010).
Quando essa via utiliza o TNFR, IL-1 ou TLR promove a ação de quinases e
modificação dos membros de fatores associados ao TNFR (TRAF). No entanto
quando essa via usa o BCR ou o TCR, a ativação do NF-KB ocorre por meio de
uma cascata de fosforilação envolvendo a quinase linfóide B (BKL), tirosina
quinase do baço (SYK), tirosina quinase de Bruton (BTK), família de quinase-src
p56-lck (Lck) e p59-fyn (Fyn) e cadeia de proteína quinase associada ao ξ (ZAP70),
todas levam a ativação da proteína quinase C-β (PKC-β) e PKC-θ, resultando na
ativação do FT kappa B (Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006).
Por outro lado, a segunda via é ativada por meio do receptor da linfotoxina-β
(LT- βR), do fator de ativação de células B (BAFFR) e o de ativação do NF-KB
(RANK; Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006).
Ao serem ativados os receptores dessa via conseqüentemente ocorre a
ação da TRAF subseqüente atuação do indutor de quinase NF-kB (NIK), o qual
fosforila
dois
resíduos
de
serina
do
complexo
formado
por
2
IkKα,
consequentemente este realiza a fosforilação da p100 associado à RelB, formando
o complexo p52:RelB que migra para o núcleo e, entre outras expressões, provoca
o aumento da p52 a partir da produção de p100 (Gilmore, 2006; Yates & Górecki,
2006; O’Dea & Hoffmann, 2010).
43
Porém, uma atípica via também já foi descrita, a qual ocorre através de
“ativadores atípicos”, como EROS, raios UV, metais e as isquemias (Hayden &
Gosh, 2004; Janssens & Tschopp, 2006; Yates & Górecki, 2006).
De acordo com O’Dea & Hofmann (2010) a regulação do sistema de
sinalização NF-kB ocorre em duas escalas, uma ocorre a síntese de proteínas NFkB e formação de dímeros, outra através da regulação da atividade dos dímeros via
degradação do IkB e resíntese do mesmo.
Agonistas deste fator nuclear incluem a IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, moléculas do
complexo de histocompatibilidade em resposta imune, ERON, grupo heme livre,
radiação ultravioleta, lipopolissacarídeos bacterianos, proteínas de transativação
viral, RNA (ácido ribonucleotídeo) de dupla fita, esfingomielina, ionóforo de cálcio e
células de adesão. A expressão deste TF tem sido observada em tecidos de
camundongos, músculo cardíaco, cérebro, órgãos linfóides, e mucosa gástrica,
pulmão, fígado, cartilagem e artérias coronarianas, tanto de humanos como de
animais (Barchowsky et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Arruda et al., 2004; Kriete &
Mayo, 2009; Kim et al., 2010).
Várias quinases que atuam nessa fosforilação já foram identificadas, como a
NIK, a proteína quinase R (PKR), a proteína 90 ribossomal S6 quinase (p90RSK),
as MEKs kinase (MEKK) 1, 2 e 3, a proteína quinase B (PKB ou Akt) e progressão
do tumor locus 2 quinase, TPL2 (Bowie & O’Nell, 2000; Salminen et al., 2008; Ma,
2010). Algumas das classes de genes induzidos pelo FT são os que expressam
citocinas como o TNF (α ou β), IFN (β ou γ) e IL, quimiocinas, fatores de
crescimento, moléculas imunoreguladoras, moléculas de adesão celular, proteínas
de resposta à fase aguda, genes sensíveis ao estresse, SOD-Mn, receptores de
superfície celular, reguladores de apoptose viral, fatores de transcrição, fatores que
controlam o crescimento, enzimas entre outros (Guo et al., 2003; Kumar et al.,
2004).
5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO (ERON)
NA ATIVAÇÃO DO NF-KB.
Um caminho diferente de ativação do NF-kB durante a infecção aguda
envolvendo ERON foi descrito por Kriete & Mayo (2009), através do qual prepõem
a comunicação cruzada entre duas organelas, retículo endoplasmático (RE) e
mitocôndria, provocando tal ativação. Pois, durante a infecção viral ocorre síntese
44
de muitas proteínas no RE, processo que demanda elevada energia, sendo esta
obtida através do efluxo de cálcio realizado pelo RE para o recrutamento da
mitocôndria, que absorve o metal e fornece ATP (adenosina trifosfato), através da
cadeia de transporte de elétrons, a qual além de energia tem como produto ERON
(Figura 6).
Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre organelas.
Fonte: Kriete & Mayo, 2009.
O aumento na síntese protéica pode ter como consequência uma overdose
de Ca++ e ERON, as quais ativam o FT que, para proteger as organelas da ação
oxidativa, pode ativar genes que expressam enzimas antioxidantes. Logo, o cálcio
pode ser importante segundo mensageiro envolvido na produção de ERON e
ativação do FT (Kriete & Mayo, 2009).
Tal aumento nos níveis do Ca++ e ativação do FT foi observado em estudo
realizado por Berchtold et al. (2007), os quais sugeriram que os agentes
genotóxicos como a camptotecina e etoposide, inibidores da topoisomerase I e II,
aumentam a quantidade de cálcio intracelular, provocando a formação do complexo
composto por NEMO, Ran-GTP e receptor nuclear de exportação, que ativam o
fator.
45
Semelhante achado com relação à elevação dos níveis do Ca++ foi
observado diante da ação genotóxica da radiação ionizante (RI) produzindo ERON
(Todd & Mikkelsen, 1994; Mikkelsen & Wardman, 2003).
De acordo com O’Dea et al. (2008), tal agente genotóxico pode ativar o FT
por duas vias, uma em que o estresse ativa a IKK, que fosforila o IKB acoplado ao
FT, este agora livre migra para o núcleo, enquanto que a outra via ocorreria através
da diminuição da síntese de IKBα, através da fosforilação do fator de iniciação
eucariótica-2α (eIf-2α) provocada pela RI, diminuindo portanto o IKBα livre e o
acoplado ao FT.
5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB
As ERON são componentes vitais para o mecanismo de sinalização celular
via oxigênio e nitrogênio, desempenham a expressão de genes envolvidos na
produção de energia, transferência de O2, diferenciação celular e combate ao
próprio RL através de estímulo da produção de antioxidantes. Entre o sinal via O2 e
a expressão de genes um dos principais fatores de transcrição sensível às
alterações do estado redox o NF-kB (Haddad, 2002; Martindale & Holbrook, 2002;
Borowski, 2006; Bubici et al., 2006).
Ainda não se tem o exato conhecimento de como tais espécies reativas
regulam o fator nuclear. Sabe se que a natureza do estímulo e o tipo de célula
podem influenciar na ação de ERON sobre o fator (Bubici et al., 2006).
Diversos pesquisadores vêm demonstrando a ação de antioxidantes, como a
L-cisteína, GSH, Mn-SOD, a N-acetil-L-cisteína (NAC), vitamina C, a E, o αtocoferol entre outros, na inibição do fator nuclear (Mihm et al., 1991; Staal et al.,
1993; Suzucki & Packer, 1993; Cho et al., 1998; Islam et al., 1998; Manna et al.,
1998; Sen et al., 1996). A ação inibitória já foi identificada sobre o estímulo do fator
através do TNF-α, LPS, IL-1β, forbol miristato-13 acetato (PMA), cicloheximida e
H2O2 (Bubici et al., 2006).
A inibição pode ocorrer em vários níveis da cascata de sinalização do TF: no
citoplasma bloqueando a estimulação do fator, interferindo em alguma das fases de
ativação (fosforilação, ubiquitinação ou proteólise), ou no núcleo impedindo a
ativação da transcrição (Droger et al., 1994; Bubici et al., 2006; O’Dea et al., 2008).
Já foram demonstrados que os antioxidantes podem atuar através de três
formas, inibindo a fosforilação, a degradação do IKB ou ligação do TF ao DNA. Cho
46
et al. (1998) demonstraram que a glutationa inibiu a ativação do NF-kB impedindo a
fosforilação e degradação do IKBα em células endoteliais de camundongos.
Enquanto que, Schubert et al. (2002) identificaram em pesquisa realizada
em células endoteliais bovina a inibição da ativação de transcrição utilizando a
NAC (N-acetil cisteína), porém sem provocar a fosforilação ou a degradação do
IKBα. Semelhante achado foi observado por Natarajan et al. (1996) que, através da
análise do éster fenetil do ácido caféico (CAPE), o qual possui estrutura
semelhante ao flavonóide, relataram que o CAPE atua impedindo a ligação do TF
ao DNA, ação atribuída ao agente redutor ditiotreitol, uma vez que o estado redox
do núcleo é importante para ativação da transcrição via NF-kB.
De acordo com Bowie & O’Nell (2000) o estado redox celular pode
influenciar na atividade do NF-kB através de 4 formas: (1) H2O2 ativando
diretamente o TF; (2) ativação através de estímulos como IL-1 ou TNF aumentando
o estresse oxidativo intracelular; (3) antioxidantes inibindo o estresse estimulado;
(4) enzimas oxidantes e antioxidantes modulando o estado redox na célula.
No entanto, para O’Dea et al. (2008) a regulação do NF-kB pelo estresse
pode ocorrer através das seguintes maneiras: (1) degradação do IkB livres ou IkB
acoplada ao NF-kB; (2) inibindo a resíntese do IkB; (3) através da IKK induzindo a
degradação do IKB e migração do NFkB para o núcleo.
Contudo, Droger et al. (1994) observou que a regulação do TF pode ocorrer
em duas condições: No citoplasma o estado oxidativo favorece a ativação e
translocação do TF para o núcleo, caso tal condição estiver presente no núcleo
desfavorece ligação do fator ao DNA, entretanto nesta localização o estado
reduzido favorece tal ligação.
A partir destes conceitos pode ser observado que o estado redox pode atuar
em vários níveis da cascata de sinalização do FT NF-KB como consta na figura 7.
47
Figura 7- Regulação redox do NF-kB.
5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES
Diversos estudos vem demonstrado citocinas e endotoxinas induzindo a
produção de NO via sinalização NF-kB (Bereta et al., 1995; Gilad et al., 1998;
Katsuyama et al., 1998; Lee et al., 2009). Além deste agente oxidante outros são
produzidos pela enzima COX-2, que possui mesma via de síntese (Li et al., 2007;
Chiu & Lin, 2008). No entanto, antioxidantes como a MnSOD também podem ser
produzidos pela sinalização envolvendo o fator de transcrição (Borrás et al., 2006).
Estudos realizados por Chiu & Lin (2008) revelaram o efeito provocado pelo
alcalóide esteroidal denominado tomatodino, que inibiu a expressão da enzima
48
responsável pela síntese de NO a iNOS e COX-2 induzida por LPS em macrófagos
murino, suprimindo a fosforilação do IkB-α e ativação do TF. Através desse achado
se ressaltou a importância desta via de sinalização para estudo de quimioterápicos
com ação anti-inflamatória.
A ação inibitória da expressão da iNOS via NFkB, foi observada em
pesquisa realizada com a melatonina, neuro-hormônio produzido pela glândula
pineal que estimula o sono e possui função antioxidante diante de radicais
hidroxilas e peroxinitritos, em células semelhantes às anteriormente citadas sob
estímulo da mesma endotoxina (Gilad et al., 1998).
Lee et al. (2009) identificaram que a inibição da expressão do NO pode ser
provocada também pelo resveratrol, que ativa a Sirtuína 1 (SIRT-1), esta promove
a desacetilação do NF-kB, prevenindo a citotoxidade provocada por citocinas e
consequente produção de NO.
Adicionalmente, Bereta et al. (1995) demonstraram que glicosídios cardíacos
inibidores da enzima Na+/K+ ATPase estimulam a expressão de iNOS em células
endoteliais de cérebro murino através do dímero NF-kB.Este dímero está envolvido
na expressão da iNOS mRNA em células do músculo liso diante do estímulo da IL1β (Katsuyama et al., 1998).
No entanto, Borrás et al. (2006) em seus experimentos observaram o
envolvimento do FT e produção de antioxidante, através da atividade da genisteína,
isoflavona da soja, classificada como fonte alternativa na reposição hormonal
através da ligação ao receptor-β do estrogênio, pois possui ação antioxidante
através da indução da expressão da enzima MnSOD em células tumorais de
glândulas mamárias de humanos (MCF-7) através do TF.
A partir destes dados é possível observar o envolvimento da via de
sinalização NF-kB na expressão de agentes oxidantes e antioxidantes.
6.
MALÁRIA E O NFKB
Durante o processo patológico o sistema imunológico monta uma rede de
defesa, através de sinalizações que comunicam o estado de lesão e infecção. Uma
maneira de induzir tal sistema é através de mensageiros como citocinas, algumas
induzem a proliferação e diferenciação de células específicas, como a IL-2 em
linfócitos T, GM-CSF em macrófagos e G-CSF em granulócitos. Outras induzem a
49
resposta de fase aguda, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, diante de infecções virais e ainda
outras induzem a produção de anticorpo a partir de linfócito B, sendo que o TF
comum na produção de todas essas diferentes moléculas é o NF-kB (Ghosh et al.,
1998).
Neste contexto, alguns pesquisadores vêm demonstrando o envolvimento
deste TF na malária, principalmente as subunidades p50 e p65 envolvidas na
expressão de quimiocinas, citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão e
NOS, em diferentes tipos de células (Jaramillo et al., 2003; Jaramillo et al., 2005;
Tripathi et al., 2006; Torgler et al., 2008; Tripathi et al., 2009).
Alguns resultados de estudos realizados em macrófagos de camundongos
sugerem que a hemozoina, em ação sinérgica com o IFN-γ, induza a expressão de
iNOS e produção de NO via fosforilação da quinase regulatória extracelular (ERK1/2) e ativação do NF-kB. A expressão de quimiocinas nessas células pode ocorrer
tanto pela fosforilação da ERK1/2 como pela produção de estresse oxidativo
celular, ativando o TF que realiza a transcrição de genes (Jaramillo et al., 2003;
Jaramillo et al., 2005).
Estudos em hepatócitos de camundongos indicam que a ativação do fator
nuclear pode ocorrer devido a ruptura destas células que é provocada pelos
esporozoitos, liberando fatores citosólicos que se ligam a receptores Toll/IL-1, que
recrutam proteínas adaptadoras, como a MyD88, com consequente ativação do
IKK, o qual fosforila o IKB-α, liberado o NF-KB que ativa a expressão de iNOS e
produção de NO nas células hepática, provocando a redução da infecção das
células (Torgler et al., 2008).
No entanto, estudos realizados por Delic et al. (2010) em camundongos
knockout para o aminoácido taurina e infectados pelo P. chaboud, observaram que
o aminoácido é importante na proteção contra a infecção do parasita, já que, na
ausência da taurina se identificou o aumento da parasitemia e expressão hepática
da IL1-, TNF-, iNOS, NF-kB e receptor de vitamina D, moléculas que podem está
envolvidas na patogênese da doença.
Outras pesquisas demonstram que células endoteliais do cérebro humano
quando expostas aos eritrócitos infectados com P. falciparum induzem a expressão
de moléculas de adesão intracelular 1 (ICAM-1) via NF-kB, molécula que pode
contribuir com o sequestro de células na malária cerebral (Tripathi et al., 2006). Em
modelo experimental semelhante se identificou a expressão de quimiocinas,
50
CCL20, CXCL1, CXCL2 e citocinas IL-6 e IL-12 através do fator de transcrição, as
quais se encontram elevadas no endotélio cerebral exposto aos eritrócitos
contendo o plasmódio (Tripathi et al., 2009).
7.
ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFÉICO-CAPE
O éster fenetil do ácido cafeico-CAPE (Figura 8) possui estrutura relacionada
ao ácido 3,4-dihidroxicinâmico, é um componente semelhante aos flavonoides e
com diversas propriedades biológicas, entre as quais estão: antioxidante (Ozguner
et al., 2005a), anti-inflamatória (Michaluart et al., 1999), anticarcinogênico (Cheen
et al., 2001), antiviral e imunomodulador (Grunberger et al., 1988).
Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE).
Fonte: Natarajan et al.,1996.
Além dessas diversas atividades, este composto é considerado como um
potente inibidor específico do Fator nuclear kappa B (Natarajan et al., 1996). O qual
pode ser ativado por citocinas inflamatória, produtos bacteriano, estresse oxidativo,
mitógenos e luz ultravioleta (Lu et al, 2004; Ghosh et al., 1998; Kriete & Mayo,
2009; Kim et al., 2010; Grilli et al., 1993).
Estudos em histiócitos humano realizados por Natarajan et al. (1996)
demonstraram que a ativação do NF-kB estimulada por agentes inflamatórios como
TNF e éster de forbol, além da ceramida, peróxido de hidrogênio e ácido ocadáico,
foi bloqueada pelo uso do CAPE de forma dose-tempo dependente e específica. Já
que, ao utilizar o CAPE diante de outros fatores de transcrição (AP-1, Oct-1 e
TIFIID) não se observou tal ação.
Outro efeito importante já relatado do Inibidor foi sua ação em camundongos
pré-tratados com CAPE 1mg/kg via i.p., pois inibiu a ação inflamatória induzida pelo
51
LPS, assim como a ativação do NF-KB, infiltração das células pulmonares,
hemorragia na medula renal e diminuição da metaloproteínase-9 (Jung et al.,
2008).
Acredita-se que este inibidor específico seja um composto que atue sobre
grupos sulfidrilas do FT kappa B, pois ao utilizar o agente redutor L-1-tosilamido-2feniletil-clorometilcetona se observou a reversão da ação bloqueadora, inibindo
assim a translocação da subunidade p65 para o núcleo, sem possuir qualquer
efeito sobre o inibidor IKBα (Natarajan et al., 1996).
Com relação à ação antioxidante do inibidor, foi demonstrado seu feito
protetor diante do estresse oxidativo provocado no miocárdio. Pois, pesquisas em
roedores realizadas por Ozgumer et al. (2005b) demonstraram que a radiação do
telefone (900HZ) promove o aumento de NO e MDA, além de diminuir a atividade
da SOD, CAT e GSH-Px no coração, alterações que foram revertidas pela
administração do CAPE (10µM/mL/Kg, i.p.), prevenindo assim o danos oxidativos
no tecido.
A mesma concentração do CAPE foi utilizada em estudos realizados por
Pekmez et al. (2010). No qual observou que ratos expostos à fumaça apresentaram
as seguintes alterações bioquímicas: elevação do ácido úrico sérico, nitrogênio da
urina e do sangue, SOD, GSH-Px, NO e MDA renal, além de mudanças
histopatológicas dos rins. Essas alterações foram prevenidas através da
administração i.p. do CAPE.
Este composto além de ação protetora sobre o dano oxidativo provocado no
miocárdio (Ozgumer et al., 2005b) e no rim (Pekmez et al, 2010), previne a
isquemia-hipóxica neonatal em cérebro murino tratado com CAPE, nos quais se
observou a inibição da caspase1 e a 3, iNOS, produção de NO, neurotoxidade e
morte de neurônios (Wei et al, 2004).
Essa espécie reativa do nitrogênio também foi inibida pelo CAPE em estudo
recente realizado por Abduljawad et al. (2013), pois ao tratar com o inibidor em dias
alternados os camundongos com diabetes constataram a inibição do NO, IL-1β,
IFN-γ, além da diminuição da glicose. Outro fator analisado nessa pesquisa foi o
efeito anti-angiogênico que foi identificado pela diminuição da metaloproteinase-9,
angiopoietina e níveis de endostatina.
Shen et al. (2008) identificaram em estudos in vitro utilizando células
endoteliais que a deficiência de zinco promove o aumento da ligação do FT ao
52
DNA e expressão de COX-2, esta foi inibida através do uso do CAPE. Logo,
observa-se que o CAPE é um importante inibidor do fator nuclear kappa B com
ação antioxidante.
8. OBJETIVOS
8.1. GERAL
Verificar o efeito da inibição da ativação do NF-kB sobre as alterações oxidativas e
da capacidade antioxidante na malária experimental cerebral e pulmonar causada
pelo P. berghei.
8.2. ESPECÍFICOS
 Verificar a parasitemia dos camundongos infectados com P. berghei, controles e
naqueles que são inibidos à ativação do NF-kB;
 Avaliar o efeito da inibição da síntese do NF-kB sobre a ação oxidativa dos
lipídios no pulmão e cérebro de camundongos com alterações da malária;
 Verificar a defesa antioxidante no cérebro e pulmão de infectados com P.
berghei;
 Avaliar possíveis correlações entre a oxidação de lipídios e a atividade
antioxidante diante do efeito da inibição do NF-kB no cérebro e pulmão de
infectados com P. berghei;
 Analisar o efeito da inibição do NFkB sobre a permeabilidade da barreira
hematoencefálica.
 Avaliar a ação oxidativa e a capacidade antioxidante sobre a permeabilidade da
barreira hematoencefálica.
53
9. MATERIAL E MÉTODOS
9.1. GRUPOS DE ANIMAIS
Foram utilizados 275 camundongos machos da raça Swiss com 10 semanas
de idade (adultos), procedentes do Biotério do Instituto Evandro Chagas (IEC) Belém/PA. Os animais foram mantidos em gaiolas no Biotério do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará (UFPA), à temperatura
ambiente (25 ± 3°C) com ciclo claro/escuro de 12 horas, tratados com alimentação
e água “ad libitum”. Vinte e cinco foram usados para a passagem da cepa e o
restante dividido randomicamente em 4 grupos, como segue:
Grupos A: No qual os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados com
meio de diluição do NF-KB.
Os animais do Grupo A foram subdivididos em subgrupos I-V; com n = 15
cada: Os animais do subgrupo I foram submetidos à eutanásia após 24h da
infecção; Os animais do subgrupo II foram submetidos à eutanásia após 5 dias da
infecção; Os animais do subgrupo III foram submetidos à eutanásia após 10 dias
da infecção; Os animais do subgrupo IV foram submetidos à eutanásia após 15
dias da infecção; Os animais do subgrupo V foram submetidos à eutanásia após 20
dias da infecção;
Grupos B: Neste grupo os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados
com o inibidor da ativação do NF-kB.
Os animais do Grupo B foram subdivididos em subgrupos VI-X com n = 15
cada: Os animais do subgrupo VI foram submetidos à eutanásia após 24h da
infecção; Os animais do subgrupo VII foram submetidos à eutanásia após 5 dias da
infecção; Os animais do subgrupo VIII foram submetidos à eutanásia após 10 dias
da infecção; Os animais do subgrupo IX foram submetidos à eutanásia após 15
dias da infecção; Os animais do subgrupo X foram submetidos à eutanásia após 20
dias da infecção;
Grupos C: Neste grupo os animais foram tratados apenas com o inibidor da
ativação do NF-kB.
54
Os animais do Grupo C foram subdivididos em subgrupos XI-XV com n = 15
cada: Os animais do subgrupo XI foram submetidos à eutanásia após 24h de
inoculação do inibidor; Os animais do subgrupo XII foram submetidos à eutanásia
após 5 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIII foram submetidos à
eutanásia após 10 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIV foram
submetidos à eutanásia após 15 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XV
foram submetidos à eutanásia após 20 dias da inoculação;
Grupos D: Correspondem aos animais controles negativos (sham), os quais foram
submetidos à mesma ambientação e procedimentos técnicos realizados no grupo A
e B, com exceção da inoculação pelo protozoário e inibição do NF-kB, apenas com
inoculação de hemácias não infectadas. Esse grupo foi subdividido em 5 subgrupos
(XVI-XX) com n = 10 cada, submetidos à eutanásia nos mesmos tempos dos
animais dos subgrupos A, B e C.
Foram utilizados 5 camundongos de cada subgrupo (24h, 5, 10, 15 e 10
dias) pertencente ao grupo A, B, C e D para a análise da permeabilidade
hematocerebral. Exceto para os que tiveram o número reduzido dos camundongos
devido à infecção, nos quais se utilizou 1/4 do valor total de camundongos
sobreviventes. O uso dos animais foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa
Animal-UFPA, onde se obteve o seguinte registro 125-13 (Anexo)
9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS
Inicialmente foi feita a inoculação intraperitoneal de hemácias infectadas (HI)
pelo Plasmodium berghei ANKA fornecida pelo Laboratório de Neurociências da
UFPA em camundongos Balb-c. Posteriormente ao atingirem uma parasitemia em
torno de 10% foi feita a coleta de sangue e infecção de 106 HI nos camundongos
Swiss em estudo de acordo com procedimentos descrito adiante (Percário, 1994;
Scardoeli et al., 1996).
Após 10 dias de infecção do camundongo Balb-c foi feita a determinação do
percentual de hemácias parasitadas (vide tópico 9.3 Determinação da Parasitemia)
para verificar se está ideal (5-15% de HI) para o preparo do inóculo dos
camundongos a serem estudados. Observou-se a faixa ideal, em seguida realizase o corte transversal da ponta da cauda do animal e coleta de duas gotas de
55
sangue em tubo de ensaio contendo 2 mL de citrato de sódio 3,8%. Desta solução
são retirados 20 µL para a contagem de hemácias total na câmara de neubauer em
cinco quadrantes do quadrante mediano maior da câmara em microscópio óptico
(Olympus, CX2) num aumento de 400 vezes. O valor total desta contagem deve ser
multiplicado pelo fator de correção (fc = 50.000), assim o valor obtido reflete a
quantidade de hemácias em 1 ml da solução. E por fim realiza-se o ajuste da
solução para que a mesma tenha 1x106 HI através de sua diluição no meio RPMI
1640 (Sigma Aldrich, Cat # R5886) e soro bovino fetal (Invitrogen, Cat # 12657029)
com base no número de camundongos a serem infectados e sua massa corporal
(Peters, 1965; 1967).
9.3. PESQUISA DO PARASITA NO SANGUE
A contagem de hemácias infectadas pelo P. berghei nos camundongos foi
realizado em amostras sanguíneas obtidas dos animais por punção da veia caudal
no dia de eutanásia (1, 5, 10, 15 e 20 dias de infecção), para preparação de
esfregaço sanguíneo em lâmina para microscópio, depois de seco em temperatura
ambiente o esfregaço foi fixação com metanol (Dinâmica, Cat # 1230) por 2 min e
corado com o reagente de Gyemsa (Merk, Cat #1092041022) por 10min.
Posteriormente foi feita a lavagem da lâmina corada em água corrente. Após a
secagem dessa lâmina efetuou-se a contagem de HP em microscópio óptico
(Olympus, CX2) com aumento de 100X utilizando o óleo de imersão de acordo com
o quadro 1 abaixo.
Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma estimativa inicial
da parasitemia
% de Parasitemia
Nº de Hemácias a serem contadas
0
10.000
<6
5.000
6-10
2.000
11 a 20
1.000
>20
300
Nº=número; %=percentual
56
9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS
Depois da retirado dos pulmões e encéfalo do animal, ambos os órgãos
foram lavados com solução fisiológica 0,9% e secos (NaCl; CAAL, Cat # 16825;
mais H2O destilada). O lado direito do pulmão e do cérebro foram submetido à
disrupção e preparação do homogeneizado de tecido. Este foi realizado da
seguinte forma, se acrescenta inicialmente a cada órgão separadamente a
solução salina fosfato PBS na proporção de 1:10 (massa:massa) e realiza-se
cortes nos mesmo com uma tesoura, em seguida são processados no disrruptor
de células ultra-sônico (UNIQUE). Durante este processo os recipientes contendo
as amostras são colocados em um béquer com gelo para evitar que o calor
gerado no processo danifique as amostras.
9.5. INIBIÇÃO DO NFKB
Para a inibição do fator nuclear kappa B foi utilizado o éster fenetil do ácido
caféico (CAPE, Calbiochem, Cat # 211200), componente ativo isolado da própolis
de colmeias de abelhas solúvel em etanol (50 mg/mL, Dinâmica, Cat # 1336).
Inicialmente o inibidor foi preparado em etanol 100% e posteriormente a solução
de inoculação em PBS na concentração de 1 mg/Kg peso do camundongo,
obtendo assim uma solução final de 7,04% de etanol em PBS. Foi realizado 5 dias
de pré-tratamento e tratamento dos camundongos até o dia da eutanásia em dias
alternados através de injeção i.p. de 200 µL ± 40 g de peso do camundongo (Jung
et al., 2008; Abduljawad et al. 2013).
9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE
9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)
A capacidade antioxidante foi determinada no homogeneizado de cada
órgão pelo método TEAC baseado no radical cátion ABTS+ produzido pela reação
entre o 2,2.-azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-diamônio (ABTS; Sigma,
Cat # A1888 ) com persulfato de potássio (K2S2O8; Sigma, Cat # P5592), ambos
preparados em PBS. Esse radical é um cromóforo de coloração verde/azul, com
absorbância máxima nos comprimentos de onda 645, 734 e 815 nm em
Espectrofotômetro (Biospectro, SP-22) UV-visível (Re,1999).
57
O cromóforo é reduzido e perde a sua coloração tempo-dependente da
concentração de antioxidantes e duração da reação, mudança mensurada por
espectrofotometria a 734 nm durante um determinado intervalo de tempo. Assim, a
extensão da descoloração equivalente a inibição do radical cátion ABTS+ é
determinada como a atividade antioxidante total da amostra, sendo então calculada
a
sua
relação
com
a
reatividade
do
Trolox
(ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-
tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma, Cat # 23881-3) como padrão (Re,1999).
Este foi utilizado para o preparo de uma solução 2,5 mM, a partir do qual
preparou-se diluições sucessiva de acordo com o quadro 2 e se obteve a curva
padrão (Figura 9), desta se obteve a seguinte equação da reta TEAC=(ABS0,0235)/0,4905, onde ABS é igual a absorbância, sob as mesmas condições,
através do qual são fornecidos resultados finais expressos em milimolar por litro
(mM/L), método adaptado de Re (1999).
Para as amostras não quantificadas no dia da dosagem dos pontos da
curva, fez-se a correção utilizando fator de correção dosando-se apenas um ponto
da curva.
Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC
Tubo
Padrão de Trolox 2,5mM
PBS (µl)
Concentração de Trolox
(mM)
(µl)
A
5000
0
2,5
B
4000
1000
2,0
C
3000
2000
1,5
D
2000
3000
1,0
E
1000
4000
0,5
F
0
5000
0
58
Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao
Trolox através da redução do radical ABTS+
9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução do
Radical DPPH
O método é baseado na redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila
(DPPH), que apresenta coloração violeta e absorção em torno de 515-517nm em
Espectrofotômetro UV-visível (Biospectro, SP-22). Pois, a atividade antioxidante
(AAO) de substâncias contidas na amostra é medida através da interação de
antioxidantes da mesma com o DPPH, resultando na formação irreversível do
produto hidrogenado (hidrazina) que é incolor. Assim, a extensão da inibição e
conseqüente descoloramento do DPPH é determinado como a capacidade
antioxidante da amostra, a qual é calculada em comparação com a reatividade do
antioxidante Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma,
Cat # 23881-3) como padrão (Blois, 1958).
Para o ensaio foi utilizado o homogeneizado de cada órgão de acordo com o
método adaptado de Blois (1958), no qual foi preparada uma solução de DPPH a
0,1 mM em etanol (Dinâmica, Cat # 1336). Em cada tubo foi colocado 950 µL da
solução DPPH 0,1 mM, 50µL da amostra para completar um volume final de 1mL.
Após um período de 30 minutos em banho-maria a 37°C, foram feitas as leituras
das absorbâncias em 517 nm. Os valores de absorbâncias obtidos foram
subtraídos da absorbância inicial do DPPH.
59
As concentrações foram obtidas a partir da equação da reta da curva padrão
(Figura 10) do Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico;
Sigma, Cat # 23881-3) realizadas com a concentrações contidas no quadro 3, nas
mesmas condições das amostras e os resultado obtidos foram multiplicados pelo
fator de diluição 10. Os Resultados finais são expressos em milimolar por litro
(mM/L).
Quadro 3- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH
Tubo
Solução de
Trabalho de Trolox
(µl)
PBS (µl)
Concentração Final
(mM de Trolox)
A
0
1000
0 (BRANCO)
B
50
950
0,125
C
100
900
0,250
D
150
850
0,375
E
200
800
0,500
F
250
750
0,625
G
300
700
0,750
60
Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente
ao trolox através da redução do DPPH.
9.7.
DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO
(TBARS)
O lipídio sofre ação oxidativa denominada peroxidação lipídica que é
avaliada através da dosagem do Malondialdeído (MDA), este que reage com duas
moléculas do ácido tiobarbitúrico (TBA, Sigma, Cat # T5500), em pH baixo (2,5), o
qual foi aferido no pHmetro digital (Hanna) e temperatura elevada, para formar o
complexo TBA-MDA-TBA, de cor rósea e absorção máxima em 535 nm (Khon &
Livesedge, 1944).
O procedimento técnico foi realizado de acordo com fundamentos de Kornn
& Livesedge (1944), adaptados por Percário et al. (1994), método que consiste no
preparo inicial do fosfato monobásico de potássio (KH2PO4 75 mM, Synth, Cat #
35210) em água acidificada até o pH 2,5. Esta solução é utilizada na preparação do
(TBA 10 nM). Adiciona-se 250 l de amostra à 500 l da solução de ácido
tiobarbitúrico 10 nM. Em seguida leva-se ao banho-maria (95ºC x 60 min); após a
incubação deixa-se esfriar a temperatura ambiente; adiciona-se 2,0 ml de álcool nbutílico (Dinâmica, Cat # 1171), homogeneiza-se bem em vórtex e posteriormente
submete-se a centrifugação a 2500 rpm por 15 min; coleta-se 1,0 ml do
sobrenadante para leitura espectrofotométrica a 535 nm.
Ultilizou-se
como
padrão
a
solução
padrão
do
MDA
(1,1,3,3,
tetrahidroxipropano; Sigma, Cat # T9889) nas concentrações do quadro 4 abaixo,
61
através das quais se obteve as absorbâncias para a contrução da curva padrão
(Figura 11).
Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias.
Solução de MDA
(nM/mL)
ABS
(média)
7,5
0,137
15
0,247
30
0,515
60
0,974
100
1,637
Figura 11- Curva padrão de Malondialdeído (MDA).
9.8.
AVALIAÇÃO
DA
HEMATOECENCEFÁLICA
PERMEABILIDADE
DA
BARREIRA
A permeabilidade da barreira hematoencefálica foi avaliada de acordo com
procedimentos técnicos descritos por Herbas et al. (2010) com modificações,
através do qual se pode visualizar a impregnação do corante azul de Evan (2%,
Dinâmica, Cat # 1186) no tecido cerebral.
62
Pois, o corante se liga a proteína albumina, proteína plasmática, e durante o
extravasamento sanguíneo dos vasos se a barreira endotelial não estiver
preservada o complexo corante-proteína migra para o tecido, corando o mesmo em
azul coloração perceptível ao olho nu (Gehlen et al., 2004).
Esse corante foi preparado em PBS com pH = 7.2 nos referidos dias de
eutanásia de cada grupo. O volume de injeção da solução foi calculado de acordo
com o peso do camundongo (4 mL/kg peso). Após 20 min da anestesia injetou-se
na veia lateral da cauda a solução corante; 1h depois da circulação da solução
corante no organismo do camundongo (Figura 12) realizou-se a anestesia do
mesmo. Posterior a 20 min foi feita a eutanásia por exaguinação e dissecação do
cérebro para a visualização da impregnação do Azul de Evans no mesmo a olho nu
(Herbas et al., 2010).
Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%.
9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram tabulados em planilhas elaboradas para este
estudo no programa Microsoft Office Excel 2013. Inicialmente foi realizada a
determinação dos valores discrepantes de cada parâmetro com base nos quartis
(Outliers), o qual utiliza em seu cálculo o intervalo interquartil determinado pela
diferença entre o terceiro quartil (Q3) e o primeiro quartil (Q1), chamado de dj.
63
Considera-se todo valor menor que Q1- 3/2 dj ou maior que Q3+ 3/2 dj, como
sendo discrepante ou outliers. Para testar a normalidade e a homocedasticidade
das variáveis foram aplicados o Kolmogorov-Smirnov e Teste de Levene.
Quando as médias das amostras foram identificadas normais foi efetuado a
comparação das mesmas pela aplicação dos teste paramétrico, Análise de
Variância (ANOVA) e na ausência de nulidade entre a diferença das médias entre
as variáveis dos grupos estudados foi aplicado o teste de Tukey. Quando
detectada a diferença estatisticamente significante entre os pontos da mediana
aplicou-se o teste de Dunn´s. Já para as amostras que não apresentaram
normalidade foi aplicado o teste não-paramétrico Kruskal Wallis.
Além desses, foi empregada a correlação de pearson na estimativa das
correlações entre os diversos resultados obtidos no estudo. Foram atribuídas
intensidades de correlação, sendo até 0,30 (r < 0,30) uma fraca correlação, entre
0,31 e 0,70 (0,31 < r < 0,70) moderada correlação e entre 0,71 e 1,00 (0,71 < r <
1,00) uma forte correlação, o sinal de positivo (+) ou negativo (-), do valor da
correlação indica se a relação entre as variáveis é diretamente proporcional ou
inversamente proporcional, respectivamente.
Para aplicação dos testes estatísticos ANOVA Dois Fatores e Kruskal Wallis
foi utilizado o programa SigmaStat versão 3.5 e para o cálculo de correlações o
SPSS versão 17.0. O nível de significância aceito nas análises foi de 5% (p 
0,05).
64
10. RESULTADOS
10.1. PARASITEMIA
Na figura 13 pode ser observado a progressão da parasitemia dos camundongos
infectados e tratados com etanol 7,04% e dos que além do parasita foram tratados
com o inibidor. As médias dos percentuais da parasitemia estão dispostos na
tabela 1.
Em ambos os grupos infectados (A e o B) ocorreu aumento exponencial da
parasitemia (p< 0,001). Com diferença significativa entre os dois grupos no 15º (p=
0,02) e 20º (p< 0,001) dias após a infecção.
Figura 13 - Progressão temporal da parasitemia dos camundongos infectados com
o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A (vermelho), e dos tratados com
o CAPE, grupo B (roxo).
65
Tabela 1 - Valores de parasitemia dos camundongos infectados em função do tempo
de infecção.
PARASITEMIA (%)
Grupos
N
1dia
N
5dias
N
10dias N
15dias
N
20dias
A
15
0,07
±0,87
15
1,27
±0,52
13
2,01
±0,40
5
12,32
±4,1
3
45,95
±28,58
B
15
0,10
±0,15
15
1,38
±0,95
12
2,61
±0,77
5
1,94
±0,78
4
18,24
±12,09
A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei.
B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei.
N = Número de animais por grupo de dias.
Nas análises entre os subgrupos pertencentes aos grupos A e B observou-se os
seguintes valores de p nas correlações (Tabela 2):
66
Tabela 2 - Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos de
camundongos infectados para cada grupo isoladamente
Grupos
A
B
Comparação
P*
20º vs. 1º
< 0,001
20º vs. 5º
< 0,001
20º vs. 10º
< 0,001
20º vs. 15º
< 0,001
15º vs. 1º
0,004
15º vs. 5º
0,021
15º vs. 10º
0,045*
10º vs. 1º
0,913
10º vs. 5º
0,997
5º vs. 1º
0,989
20º vs. 1º
< 0,001
20º vs. 5º
< 0,001
20º vs. 10º
< 0,001
20º vs. 15º
< 0,001
15º vs. 1º
1,84
15º vs. 5º
0,831
15º vs. 10º
0,987
10º vs. 1º
0,999
10º vs. 5º
1,000
5º vs. 1º
0,987
A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de
animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. vs. = versus.
* Obtido por teste de Tukey
67
Na análise das parasitemias entre os grupos A e B foi identificado apenas
correlação significativa após 15º e 20º de infecção (Tabela 3).
Tabela 3- Valores de p* referentes às correlações entre as parasitemias dos
grupos de camundongos A e B
P*
Comparação
1d
A vs. B
0,991
5d
10d
15d
20d
0,967
0,828
0,02*
<0,001
A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei.
B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei.
d = dias após infecção.
*= obtido por teste de Tukey.
vs.= versus.
68
10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS
A sobrevida (%) de todos os grupos de camundongos é demonstrada na figura
14. Os valores percentuais obtidos estão dispostos na tabela 4.
Figura 14 - Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. A
(vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B
(roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado
com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo
de hemácias saudáveis).
69
Tabela 4 - Percentual de sobrevida de todos os grupos de camundongos de
experimentação do presente trabalho
SOBREVIDA (%)
DIAS
N
A
N
B
N
C
N
D
0
75
100,00
75
100,00
75
100,00
50
100,00
1
75
100,00
75
100,00
75
100,00
50
100,00
2
60
100,00
60
100,00
60
100,00
40
100,00
3
60
100,00
60
100,00
60
100,00
40
100,00
4
60
100,00
60
100,00
60
100,00
40
100,00
5
60
100,00
60
100,00
60
100,00
40
100,00
6
45
100,00
45
100,00
45
100,00
30
100,00
7
45
100,00
45
100,00
45
100,00
30
100,00
8
45
100,00
45
100,00
45
100,00
30
100,00
9
43
95,55
38
84,44
45
100,00
30
100,00
10
40
88,89
34
75,55
45
100,00
30
100,00
11
21
70,00
16
53,33
30
100,00
20
100,00
12
19
63,33
14
46,66
30
100,00
20
100,00
13
17
56,67
11
36,66
30
100,00
20
100,00
14
13
43,33
10
33,33
30
100,00
20
100,00
15
11
36,66
10
33,33
30
100,00
20
100,00
16
4
26,66
5
33,33
15
100,00
10
100,00
17
4
26,66
5
33,33
15
100,00
10
100,00
18
4
26,66
5
33,33
15
100,00
10
100,00
19
3
20,00
5
33,33
15
100,00
10
100,00
20
3
20,00
4
26,66
15
100,00
10
100,00
(A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com
CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado
com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
70
10.3. DOSAGENS PULMONARES
10.3.1.
Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+
Na figura 15 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante
equivalente ao trolox nos pulmões dos grupos de estudo nos dias de eutanásia. Os
valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 5 e os de p referentes às
correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 6 e entre grupos na tabela
7.
Figura 15 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões
dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com
etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e
infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado
com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
71
Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) nos
pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção
TEAC PULMÃO (mM/L)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
N
10dias
N
15dias
N
20dias
A
10
1,01
±0,25
10
0,94
±0,12
10
0,94
±0,03
3
0,70
±0,35
2
1,298
±0,001
B
10
1,12
±0,24
10
1,20
±0,17
10
0,89
±0,17
3
0,86
±0,10
2
2,00
±0,11
C
10
1.24
±0,08
10
1,12
±0,02
10
0,84
±0,10
10
0,89
±0,23
10
0,91
±0,07
D
10
0,84
±0,38
10
0,86
±0,03
10
0,67
±0,07
10
0,68
±0,07
10
0,56
±0,06
Valores expressos como média±desvio-padrão. A= grupo de animais tratados
com etanol 7,04% e infectados com Plasmodium berghei; B= grupo tratado com
CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C= animais tratados com CAPE e
não infectado com P. berghei; D= grupo Controle Negativo (inoculo de hemácias
saudáveis).
72
Tabela 6- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante
equivalente ao trolox nos pulmões, dentro dos subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
0,667
0,959
0,002
0,125
20º vs. 5º
0,127
1,000
0,204
0.096
20º vs. 10º
0,189
O,113
0,938
0,909
20º vs. 15º
0,006
0,176
0,995
0,918
15º vs. 1º
0,013
0,251
< 0,001
0,731
15º vs. 5º
0,285
0,056
0,088
0,670
15º vs. 10º
0,452
1,000
0,994
1,000
10 vs. 1º
0,590
0,114
< 0,001
0,634
10º vs. 5º
1,000
0,009*
0,041
0,563
5º vs. 1º
0,377
0,880
0,719
1,000
* obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle
Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus.
73
equivalente ao trolox nos pulmões, entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
1d
5d
10 d
15 d
20 d
A vs. B
0,996
0,019
0,976
0,701
0,953
A vs. C
0,288
0,255
0,848
0,449
0,052
A vs. D
0,068
0,845
0,186
0,999
< 0,001
B vs. C
0,436
0,876
0,969
0,999
0,099
B vs. D
0,048
0,007
0,249
0,613
< 0,001
C vs. D
< 0,001
0,090
0,403
0,349
0,006
*= obtido por teste de Tukey. vs.= versus. (A) tratado com etanol 7,04% e
infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com
Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D)
Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
74
10.3.2.
O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos
pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na
figura 16. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 8 e
os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 9 e entre os
grupos na tabela 10.
Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões dos
grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol
7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e
75
Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos
pulmões de cada grupo de camundongos
DPPH PULMÃO (mM/L)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
A
10
3,58
±0,26
10
3,42
±0,77
B
10
3,23
±1,09
10
C
10
5,11
±0,87
D
10
2,14
±2,03
N
10dias
N
15dias
N
20dias
10
3,91
±1,79
3
2,36
±0,86
2
6,24
±0,35
4,30
±0,87
10
3,60
±1,023
3
4,14
±0,86
2
4,14
±2,13
10
4,62
±0,55
10
3,88
±1,01
10
3,37
±1,40
10
4,64
±0,99
10
3,545
±1,24
10
2,49
±0,24
10
4,80
±1,08
10
3,79
±0,94
Valores expressos como média ± desvio-padrão. (A) tratado com etanol 7,04% e
76
Tabela 9- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da
redução do DPPH nos pulmões, entre os subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
0,021*
0,705
0,866
0,146
20º vs. 5º
0,009*
1,000
1,000
0,999
20º vs. 10º
0,067
0,947
0,537
0,741
20º vs. 15º
0,001*
1,000
0,101
0,471
15º vs. 1º
0,463
0,711
0,007*
0,004*
15º vs. 5º
0,557
0,999
0,116
0,350
15º vs. 10º
0,252
0,949
0,905
0,060
10º vs. 1º
0,983
0,961
0,100
0,805
10º vs. 5º
0,906
0,673
0,575
0,863
5º vs. 1º
0,998
0,199
0,839
0,234
*= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
77
Tabela 10- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da
redução do DPPH nos pulmões entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B
0,911
0,269
0,953
0,183
0,148
A vs. C
0,024
0,068
1,000
0,410
0,228
A vs. D
0,102
0,997
0,397
0,016
0,029
B vs. C
0,001
0,910
0,950
0,769
0,892
B vs. D
0,267
0,583
0,671
0,757
0,946
C vs. D
<0,001
0,272
0,343
0,132
0,389
78
10.3.3.
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
A figura 17 mostra a concentração das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico nos pulmões dos grupos de camundongos ao longo dos dias de
infecção. Os valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão
dispostos na tabela 11 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de
cada grupo estão contidos na tabela 12 e entre os grupos na tabela 13.
Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com
79
Tabela 11- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) nos pulmões dos camundongos, em função do tempo de infecção
TBARS PULMÃO (nM/mL)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
N
10dias
N
15dias
N
20dias
A
10
36,27
±14,6
10
13,40
±5,19
10
26,55
±13,3
3
26,41
±5,45
2
12,40
±2,43
B
10
12,27
±5,71
10
11,37
±5,16
10
13,32
±13,35
3
28,16
±3,27
2
8,291
±1,67
C
10
10,62
±4,80
10
10,57±5,
44
10
25,65
±17,72
10
25,56
±19,85
10
19,48
±8,18
D
10
42,21±
12,3
10
27,18
±6,03
10
25,3
±11,97
10
25,3
12,81
10
24,43
±10,31
±
Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei;
(C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo
(inoculo de hemácias saudáveis).
80
Tabela 12- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
0,037
0,981
0,399
0,101
20º vs. 5º
1,000
0,992
0,367
1,000
20º vs. 10º
0,509
1,000
0,735
1,000
20º vs. 15º
0,063
0,158
0,727
0,568
15º vs. 1º
0,625
0,173
0,024
0,004
15º vs. 5º
0,360
0,125
0,018
0,497
15º vs. 10º
1,000
0,08
1,000
0,497
10º vs. 1º
0,459
0,953
0,028
0,132
10º vs. 5º
0,183
0,979
0,022
1,000
5º vs. 1º
<0,001
1,000
1,000
0,199
81
Tabela 13- Valores de p das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) nos pulmões entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B
<0,001
0,976
0,035
0,997
0,974
A vs. C
<0,001
0,939
0,999
0,999
0,830
A vs. D
0,782
0,214
0,988
0,403
0,533
B vs. C
0,988
0,998
0,019
0,982
0,396
B vs. D
<0,001
0,104
0,056
0,296
0,168
C vs. D
<0,001
0,078
1,000
0,270
0,838
82
10.3.4.
Estudo de para Amostras Pulmonares
10.3.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
versus
Os gráficos de correlação entre TBARS e TEAC das amostras pulmonares dos
grupos de estudos são demonstrados na figura 18. Esta contém a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Entre todos os grupos (r=-3148;
p=0,0003) e no grupo C (r= -0,6780; p< 0,0001) foram identificadas correlações
moderadas. Enquanto que os grupos A (r = -0,0139; p= 0,9429), B (r=-0,0932; p=
0,6180) , ou D (r=-0,2053; p=0,3471) não apresentaram correlação.
r=-0,3148 p=0,0003
Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) em amostras
pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol
7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado
com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei;
(D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
83
10.3.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade
Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH
A figura 19 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas
amostras pulmonares dos grupos de estudos. Não foi observada nenhuma
correlação nos grupos analisados.
r=-0,1599 p=0,0737
(TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH em
amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com
etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e
infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P.
berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
84
10.3.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Parasitemia
A figura 20 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras
pulmonares e parasitemia dos grupos de camundongos infectados pelo P. berghei.
Os gráficos apresentam a análise comparativa da correlação em cada grupo. Como
pode ser observado, não houve correlação entre os parâmetros analisados.
r=-0,1453 p=0,2765
(TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo
P. berghei e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.
85
Parasitemia
A figura 21 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras
pulmonares e Parasitemia dos camundongos. O gráfico apresenta a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Foi identificada uma correlação
moderada (r= 0,3339; p= 0,104) na análise comparativa dos grupos A e B, assim
como na análise apenas do grupo A (r= 0,4607 p= 0,0136) e ausência de
correlação no grupo B (r= 0,1049 p= 0,5811).
Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da Redução do
Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados
pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
86
10.3.4.5. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) e Parasitemia
Na figura 22 consta os gráficos de correlação de TEAC nas amostras
pulmonares e Parasitemia dos camundongos. Após análise foi identificado
ausência de correlação pra todos os grupos (r= 0,1072; p= 4229), grupo A (r=
0,1931; p= 0,3343) e o B (r= 0,0272; p=0,8842).
r=0,1072 p=0,4229
Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
(TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo
P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
87
10.4. DOSAGENS ENCEFÁLICAS
10.4.1.
Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+
Na figura 23 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante
equivalente ao trolox nos encéfalos dos grupos de estudo nos dias de eutanásia.
Os valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 14 e os de p referentes
às correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 15 e entre grupos na
tabela 16.
Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em encéfalos
88
Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos
de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção
TEAC ENCÉFALO (mM/L)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
N
10dias
N
15dias
N
20dias
A
10
0,772
±0,10
10
0,588
±0,07
10
0,530
±0,11
3
0,555
±0,14
2
0,699
±0,16
B
10
0,811
±0,10
10
0,578
±0,03
10
0,573
±0,12
3
0,671
±0,11
2
0,761
±0,17
C
10
0,947
±0,23
10
0,705
±0,13
10
0,584
±0,08
10
0,527
±0,06
10
0,769
±0,16
D
10
0,293
±0,08
10
0,417
±0,02
10
0,408
±0,06
10
0,376
±0,14
10
0,499
±0,02
CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado
com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).
89
equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
0,948
0,975
0,018
0,118
20º vs. 5º
0,794
0,210
0,816
0,926
20º vs. 10º
0,481
0,198
0,017
0,826
20º vs. 15º
0,728
0,912
<0,001
0,605
15º vs. 1º
0,085
0,472
<0,001
0,837
15º vs. 5º
0,995
0,810
0,028
0,978
15º vs. 10º
0,999
0,785
0,870
0,995
10º vs. 1º
0,004
0,002
<0,001
0,605
10º vs. 5º
0,899
1,000
0,263
1,000
5º vs. 1º
0,018
0,002*
<0,001
0,526
90
equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
A vs. B
0,915
0,999
0,919
0,676
0,952
A vs. C
0,018
0,192
0,846
0,987
0,893
A vs. D
<0,001
0,141
0,397
0,224
0,271
B vs. C
0,098
0,155
0,998
0,324
1,000
B vs. D
<0,001
0,193
0,109
0,01
0,04
C vs. D
<0,001
0,002
0,068
0,153
0,003
91
10.4.2.
O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos
encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na
figura 24. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 17 e
os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 18 e entre
grupos na tabela 19.
Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em encéfalos
92
Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos
encéfalos de cada grupo de camundongos.
DPPH ENCÉFALO (mM/L)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
N
10dias
N
15dias
N
20dias
A
10
1,89
±0,37
10
0,83
±0,26
10
0,91
±0,27
3
1,85
±0,67
2
1,67
±0,35
B
10
1,30
±0,29
10
0,94
±0,37
10
2,00
±0,85
3
1,69
±0,73
2
2,94
±0,70
C
10
2,08
±0,20
10
1,86
±0,39
10
2,04
±0,70
10
1,84
±0,58
10
2,17
±0,67
D
10
0,98
±0,22
10
1,26
±0,37
10
2,09
±0,45
10
1,59
±0,32
10
1,43
±0,31
93
Tabela 18- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através
da redução do DPPH nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
0,984
<0,001
0,997
0,645
20º vs. 5º
0,190
<0,001
0,633
0,981
20º vs. 10º
0,330
0,049
0,979
0,232
20º vs. 15º
0,994
0,019
0,407
0,950
15º vs. 1º
1,000
0,765
0,768
0,276
15º vs. 5º
0,019*
0,157
0,998
0,719
15º vs. 10º
0,061
0,892
0,798
0,726
10º vs. 1º
0,002*
0,046
1,000
0,01
10º vs. 5º
0,998
<0,001
0,935
0,069
5º vs. 1º
<0,001
0,521
0,906
0,915
94
Tabela 19- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através
da redução do DPPH nos encéfalos entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B
0,059
0,967
<0,001*
0,976
0,028*
A vs. C
0,853
<0,001*
<0,001*
0,997
0,570
A vs. D
0,014*
0,400
<0,001*
0,964
0,938
B vs. C
0,017*
<0,001*
0,999
0,989
0,083
B vs. D
0,701
0,642
0,990
1,000
<0,001*
C vs. D
0,004*
0,125
0,998
0,979
0,039*
95
10.4.3.
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
A figura 25 demonstra a concentração das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico nos encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de análise. Os
valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão dispostos na
tabela 20 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de cada grupo
estão contidos na tabela 21 e entre os grupos na tabela 22.
Figura 25- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção. A
(vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B
(roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado
com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo
de hemácias saudáveis).
96
Tabela 20- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção
TBARS ENCÉFALO (nM/mL)
GRUPOS
N
1dia
N
5dias
N
10dias
N
15dias
N
20dias
A
10
78,68
±20,7
10
68,14
±6,73
10
44,65
±23,1
3
66,58
±20,01
2
30,40
±0,30
B
10
80,39
±9,21
10
71,40
±6.05
10
54,92
±14,48
3
66,50
±5,01
2
29,16
±8,83
C
10
92,78
±20,4
10
71,54
±6,44
10
60,11
±19,80
10
78,33
±5,99
10
70,55
±10,55
D
10
57,48
±23,3
10
61,76
±8,15
10
48,85
±16,78
10
26,67
±10,64
10
39,29
±5,52
97
Tabela 21- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos
P*
Comparação
A
B
C
D
20º vs. 1º
<0,001
<0,001
0,011
0,345
20º vs. 5º
0,011
<0,001
1,000
0,195
20º vs. 10º
0,735
0,076
0,552
0,865
20º vs. 15º
0,054
0,018
0,827
0,737
15º vs. 1º
0,716
0,624
0,267
0,018
15º vs. 5º
1,000
0,986
0,897
0,008
15º vs. 10º
0,216
0,766
0,103
0,163
10º vs. 1º
<0,001
0,006
<0,001
0,882
10º vs. 5º
0,029
0,128
0,492
0,679
5º vs. 1º
0,549
0,691
0,022
0,992
98
Tabela 22- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os grupos de camundongos
P*
Comparação
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B
0,995
0,965
0,562
1,000
1,000
A vs. C
0,140
0,966
0,190
0,648
0,003
A vs. D
0,045
0,891
0,964
0,003
0,883
B vs. C
0,285
1,000
0,883
0,643
<0,001
B vs. D
0,034
0,680
0,885
0,003
0,800
C vs. D
<0,001
0,693
0,511
<0,001
0,003
99
10.4.4.
Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas
10.4.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
versus
Os gráficos de correlação de TBARS e TEAC das amostras encefálicas dos
grupos de estudos estão demonstrados na figura 26. Esta contém a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada correlação moderada na
entre todos os grupos (r=-0,564; p= 0,0001), grupo B (r= 0,405; p= 0,0262) e C (r= 0,551; p= 0,0002). E ausência de correlação nos grupo A (r=-0,432; p= 0,215) e
grupo D (r=-0,032; p= 0,8920).
r=0,564 p<0,0001
Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras
encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com
100
10.4.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade
Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH
A figura 27 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas
amostras encefálicas dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada ausência de correlação
entre todos os grupos e na análise do grupo A, enquanto que o grupo B (r= 0,23;
p= 0,031) apresentou correlação moderada, e o C (r= 0,23; p= 0,031) e o D (r=
0,18; p= 0,002) fraca.
(TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de
amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e
101
10.4.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Parasitemia
A figura 28 mostra os gráficos de correlação de TBARS de amostras
encefálicas e parasitemia dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Observou-se que na comparação entre
grupos (r=-0,4202; p= 0,0001) e no grupo A (r= 0,4048; p= 0,0293) há uma
correlação moderada. O grupo B (r=-0,756; p<0,0001) possui uma forte correlação
para os parâmetros analisados.
r=-0,4202 p=0.0001
(TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a
Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei;
(B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.
102
Parasitemia
Os gráficos de correlação do DPPH e Parasitemia das amostras encefálicas
dos grupos de estudos são demonstrados na figura 29. Esta contém a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Identificou-se após a análise que há
correlação moderada para todos os grupos infectados (r= 0,3947; p= 0,002) e de
forma isolada, o grupo A (r= 0,4491; P= 0,0112) e o B (r= 0,5302; p= 0,037).
r=0,3947 p=0,002
Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da Redução do
Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a
Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei;
(B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.
103
10.4.4.5. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) e Parasitemia
A figura 30 mostra os gráficos de correlação da parasitemia e TEAC nas
amostras encefálicas dos grupos de estudos. Os gráficos apresentam a análise
comparativa da correlação em cada grupo. Não foi identificado correlação na
análise entre os grupos e de forma isolada.
r=-0,0166 p=0,8975
Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox
(TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia.
104
10.4.5.
Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica
Na figura 31 estão presentes as fotos dos encéfalos demonstrando o
comportamento da barreira hematoencefálica (BHE) nos grupos de estudos. Os
grupos que apresentaram quebra da barreira através da impregnação da solução
de azul de evans foram os grupos parasitados A após 10 dias de infecção e o B no
15º dia após de ser infectado.
Os camundongos do grupo A de 20 dias não resistiram à injeção e/ou circulação
da solução corante.
105
Grupo A
A24h
A5 dias
A10 dias
A15 dias
Grupo B
B24h
B5 dias
B10 dias
B15 dias
B20 dias
C15 dias
C20 dias
Grupo C
C24h
C5 dias
C10 dias
Grupo D
D24h
D5 dias
D10 dias
D15 dias
D20 dias
Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da solução
azul de evans 2% nos dias de eutanásia.
106
11. DISCUSSÃO
Para avaliar o efeito do NF-kB sobre o estresse oxidativo gerado durante a
malária cerebral e pulmonar experimental causada pelo P. berghei no presente
trabalho foi utilizado o CAPE, inibidor específico do NF-kB, de acordo com
procedimentos descritos no tópico de material e métodos.
No decorrer da coleta das amostras foi feita a anotação dos óbitos para
posterior análise da sobrevida. Enquanto que nos dias de eutanásia foram
determinadas as parasitemias dos camundongos e avaliado a quebra da barreira
hematoencefálica de todos os grupos. Em seguida para analisar o papel do
estresse oxidativo no modelo proposto utilizou-se métodos que quantificam a
peroxidação lipídica (TBARS), a capacidade antioxidante por meio da redução do
radical ABTS+ (TEAC) e capacidade antioxidante através da redução do radical
DPPH. Tais dados foram comparados entre si.
A partir dos resultados obtidos observou-se que os grupos A e B, infectados,
apresentaram um comportamento semelhante até o 10º dia após infecção. Porém,
no 15º (p= 0,02) e 20º (p< 0,001) dia ocorreu uma diminuição significativa da
parasitemia no grupo em que foi feito a inibição do NF-kB em comparação ao
grupo A. Sugere-se que o fator de transcrição pode estar envolvido na reprodução
do parasita no organismo murino. Pesquisas realizadas em cultura de células
indicam que o NF-kB atua estimulando a produção de moléculas inflamatórias e
de adesão na malária cerebral, sendo assim a presente pesquisa corrobora com o
envolvimento do fator de transcrição, porém atuando na proliferação do parasita
(Tripathi et al. 2006; 2009).
No que tange a sobrevida, observou-se diferença percentual acentuada
entre os grupos A e B a partir 10º dia de infecção, indicando que o CAPE
antecipou a diminuição da sobrevida dos camundongos, comportamento que não
se manteve ao longo do período após a infecção, já que no último dia de análise a
diferença entre ambos foi de 6,66%. Resultados diferentes foram obtidos por
Nacer et al. (2012), em semelhante experimento os camundongos eram levados
ao óbito no quinto dia após infecção.
107
A discussão advinda dos resultados da sobrevida e a diminuição da
parasitemia provocada pela a inibição do NF-kB corroboram com achados de
Maguire et al. (2005), que observaram em pacientes com malária a presença da
oclusão de vasos pulmonares devido ao sequestro de células vermelhas e
brancas que promovem o impedimento da função da barreira alvéolo-pulmonar,
desenvolvendo assim as complicações pulmonares após iniciado o tratamento e
clearence parasitário. Dessa forma sugere-se que a complicação da doença não
ocorra devido ao aumento efetivo do número de parasitas do organismo, e sim
outros mecanismos de ação desencadeados pela presença do Plasmodium.
Ao ser analisado o início de óbito no presente experimento foi identificado o
mesmo para os grupos A e B, a partir do nono dia após infecção com parasitemia
em torno de 45%, resultados que diferem de estudos realizados por Nacer et al.
(2012), que fizeram experimentos utilizando mesmo tipo de camundongo infectado
por P. berghei e morreram no quinto dia após infecção, porém com quase o dobro
da quantidade de parasitas (80%).
11.1. ACHADOS PULMONARES
No que diz respeito aos achados pulmonares, observou-se entre os
subgrupos de cada grupo que os valores da capacidade antioxidante equivalente
ao trolox nos pulmões que o grupo A apresentaramu uma diminuição no 15º dia (p=
0,013), seguido de um aumento no 20º dia (p= 0,006). Sugere-se a alteração inicial
seja devido a presença do parasita estimulando o sistema imune a produzir radicais
livres para combater o patógeno, consumindo a defesa antioxidante, seguido de um
estímulo tardio na produção da defesa antioxidante (van de Crommenacker et al.,
2012).
Diante da inibição do NF-kB e a infecção pelo parasita, a capacidade
antioxidante apresentou diminuição apenas do 5º para o 10º dia (p= 0,009),
mantendo o estado redox nos outros dias analisados. Entretanto, na ausência do
NF-kB, a diminuição da capacidade foi progressiva a partir do 5º dia (p= 0,041)
indicando que o fator de transcrição pode estar envolvido na codificação de
enzimas antioxidantes, como já citado por Kumar et al. (2004).
Esses resultados diferem dos achados no grupo D, em que não foi
observada alteração da capacidade antioxidante, indicando que a inoculação de
108
hemácias não promove alteração da ação antioxidante do organismo murino. Os
dados dos grupos sugerem que a presença do parasita, do inibidor e do meio
etanólico de diluição do fator promovem alterações na capacidade antioxidante.
Esta quando analisada entre grupos foi identificado comportamento
semelhante com relação aos grupos infectados (A e B) em relação ao grupo D (<
0,001) após 20 dias de infecção, ratificando a alteração redox na presença do
parasita com níveis mais elevados de defesa com a inibição do NF-kB e infecção
pelo Plasmodium (1,999 mM/L).
No que diz respeito ao outro método de avaliação da capacidade
antioxidante através da redução do radical DPPH, observou-se valores maiores da
atividade antioxidante em longo prazo no grupo A após 20 dias de infecção (Tabela
6), resultado semelhante ao encontrado no uso do TEAC, corroborando com a ideia
de indução de defesa antioxidante na presença do parasita de forma tardia.
Já os grupos tratados com inibidor do NF-kB tiveram alteração da ação
contra radicais após 15 dias de infecção de forma contrária, no C teve diminuição
da capacidade antioxidante (p= 0,007), e no D a aumento (p= 0,004), indicando que
o inibidor promova a diminuição da produção de defesa contra os radicais,
resultado semelhante ao obtido no uso ABTS+, com antecipação da diminuição da
atividade antioxidante no 10º dia, permanecendo o raciocínio de inibição da
codificação de moléculas antioxidantes (Kumar et al., 2004). No grupo D ocorreu
aumento da defesa antioxidante após 15 dias, sugerindo-se a presença de estresse
oxidativos induzida pela inoculação de hemácias.
O método utilizando o radical ABTS+ pareceu mais sensível com capacidade
de detectar pequenas quantidades (0,0564 mM/mL) e adequado para a análise da
atividade antioxidante dos diferentes grupos de estudo, já que através do mesmo
pode se ter uma inferência mais racional dos resultados.
Após 24h de experimento e análise utilizando o DPPH no grupo contendo só
inibidor teve capacidade antioxidante mais elevada que os outros grupos em
estudo, infere-se dessa forma que o tempo de tratamento não é suficiente para
efetiva inibição do NF-kB. A referida elevação foi identificada no grupo A após 15
dias, sugerindo que o parasita possa induzir o estresse oxidativos e demanda de
109
defesa para o combate do mesmo, e após 20 dias de infecção o consumo das
moléculas antioxidantes, diferente dos achados com o método utilizando o ABTS+,
neste só foi identificado elevação no 20º dia, nos dois grupos infectados.
Com relação à peroxidação lipídica, observou-se que ocorre diminuição da
mesma após 5 (p > 0,001) e 20 (p= 0,037) dia de infecção nos camundongos
infectados pelo P. berghei e tratados com o meio de diluição do NF-kB. Após 5 dias
de infecção na presença apenas do inibidor os níveis de lipídios oxidados
aumentaram (p< 0,05) sugerindo novamente que a inibição do NF-kB está
relacionada com a expressão de antioxidante e consequente aumento da
disponibilidade de radicais sobre ação nos lipídios.
A inoculação de hemácias promoveu uma diminuição da peroxidação lipídica
após 15 dias de inoculação da mesma (p= 0,004), sem alterações nos outros dias
analisados. Acredita-se que essa diminuição seja devido à adaptação posterior às
hemácias acrescidas no organismo do camundongo diminuindo assim a quantidade
de lipídios oxidados.
Na análise da oxidação de lipídeos do tecido pulmonar entre grupos
observou-se que ocorreu uma inibição aguda da ação oxidativa (p > 0,001) nos
grupos tratados com inibidor (Figura 17), indicando que o inibidor pode atuar
impedindo a ação oxidativa promovida pela presença do parasita ou da hemácia.
Na análise entre TBARS e TEAC foi observada correlação moderada
negativa para todos os grupos (r = -0,3148; p< 0,003) e no Grupo C (r = -0,6780; p<
0,001), sugerindo-se assim que na inibição do NF-kB no organismo murino sem
agente infeccioso a tendência de ocorrer um aumento da capacidade antioxidante
promovendo assim a diminuição dos radicais endógenos, por isso a correlação é
negativa.
Na análise entre TBARS e DPPH não foi observada correlação significativa
nos grupos infectados, assim como na comparação da peroxidação com a
parasitemia.
Já na correlação DPPH e parasitemia identificou-se correlação moderada
entre os grupos A e B (r = 0,3339; p= 0,104) e na análise apenas do grupo A (r =
0,4607 p= 0,0136). Esses resultados sugerem uma tendência da elevação da
110
parasitemia promover maior produção de antioxidantes, comportamento também
encontrado na análise isolada do grupo A, já que teve a referida correlação.
Diferente da análise do método utilizando ABTS+, em que não houve correlação
com a parasitemia.
11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS
Nas análises do TEAC em cada grupo observou-se que a capacidade
antioxidante teve diferença significativa nos grupos A e B, pois em ambos foi
observado diminuição após 5 e 10 dias de infecção com relação ao primeiro dia.
Sugerindo que na presença do parasita promova a diminuição da defesa
antioxidante nos referidos períodos. No grupo C a diminuição foi semelhante aos
grupos anteriores e se estendeu ao 15º e seguinte aumento no 20º dia após
infecção. Alterações que ocorrem nesse grupo provavelmente devido à solução de
etanol a 7,04% (Tabela 15).
Os subgrupos do grupo D tiveram semelhante comportamento nas amostras
encefálicas e nas pulmonares, ou seja, sem alteração da capacidade antioxidante
através da redução do radical ABTS+. Indicando que a presença de hemácias não
promove alteração da capacidade antioxidante ao longo da progressão da doença.
Na análise da referida capacidade antioxidante entre grupos foi identificado
que após 24h da infecção os grupos A e B (p= 0,915) apresentaram
comportamento semelhante, ou seja, níveis elevados de TEAC devido à presença
do parasita e/ou inibidor CAPE. Houve significância estatística entre os grupos A e
C (p= 0,018) e entre A e D (p< 0,001), refletindo a diferença aguda da doença no
grupo A com níveis de TEAC maiores que os do grupo de D e menores que o C, as
alterações indicam que a presença do parasita induzir a capacidade em níveis
menores de quando foi usado o inibidor de forma isolada no camundongo.
Além
desses
resultados
também
foi
constatado
que
valores
significantemente elevados entre os grupos B (p< 0,001) e C (p< 0,001), em
comparação ao D. Ou seja, a inibição do NF-kB após 1 dia de infecção promove
elevação da capacidade antioxidante a níveis maiores que a capacidade de
camundongos contendo o inoculo de hemácias.
111
Após 5 dias de infecção entre o grupo C e D (p= 0,002) ocorreu um aumento
níveis de TEAC que pode ter sido ocasionado pela presença do inibidor. Este
raciocínio também de aplica após 15 dias de infecção, porém na presença
concomitante do parasita (B vs. D; p= 0,01). No 20º dia de análise observou-se que
os dois grupos contendo o inibidor (B e C) tiveram elevadas concentrações de
TEAC (p< 0,05) em comparação ao grupo inoculado com hemácia (D), assim esses
resultados sugerem que a ausência da ação do NF-kB promova um aumento na
capacidade antioxidante de forma aguda e tardia.
No uso do outro método de capacidade antioxidante através da redução do
DPPH observou-se que na análise dos subgrupos pertencentes ao grupo A ocorreu
diminuição da defesa contra os radicais após dez dias de infecção. Resultados que
diferem na análise entre 5º e 15º dias (p< 0,001) para o mesmo grupo, em que se
identificou um aumento. Sugere-se que o aumento ocorra devido à ação oxidativa
provocada pelo parasita em longo prazo induzindo a produção endógena de
antioxidantes.
Já o grupo B desenvolveu uma ação acentuada da capacidade antioxidante
após 10 e 20 dias de infecção com relação aos outros dias de análise, esta que
pode ter sido ocasionada devido à inibição do FT (Tabela 18). Já o aumento dessa
capacidade foi identificado após 10 dias de injeção da solução de hemácias no
grupo D (p= 0,01).
Na avaliação entre grupos foi observado após 24h de infecção níveis
semelhantes de redução do radical DPPH nos grupos A e C (p= 0,059), e elevados
em comparação ao grupo D (Tabela 19). Elevação também observada no grupo
tratado apenas com o inibidor em relação ao B. Dessa forma credita-se que os
níveis elevados seja devido à ação etanólica em ambos os grupos e que a
presença do parasita produzindo produz radicais que diminuem a disponibilidade
de moléculas antioxidante.
Este efeito também parece ter ocorrido no quinto dia após infecção quando
comparamos os grupos contendo parasita com o que foi tratado apenas com o
inibidor (p< 0,001). No dia seguinte de análise os grupos contendo inibidor e o D
tiveram comportamento semelhante com níveis elevados de defesa antioxidante
(p< 0,001). Os achados indicam que o NF-kB apesar de promover a codificação de
112
moléculas antioxidantes não é a principal via de produção das mesmas, porém é
um fator de transcrição que se inibido diminui o comprometimento na malária.
O uso crônico do inibidor promoveu aumento da atividade antioxidante na
presença do parasita, assim como o uso do inibidor isolado em comparação ao
grupo inoculado com hemácias (p< 0,001). Os grupos parasitados tiveram um
comportamento diferente, quando na presença apenas do parasita observou-se
maiores níveis de capacidade antioxidante (p< 0,028). Identificou-se com esses
dados que o NF-kB pode ser uma via parcial da produção de antioxidantes.
No que diz respeito à ação oxidativa sobre os lipídios encefálicos,
identificou-se diferença significante entre os subgrupos do grupo A nas correlações
seguintes: 1º e 20º dia (p< 0,001) após infecção, 5º e 20º dia (p= 0,011), 1º e 10º
dia (p< 0,001) e 5º e 10º (p= 0,029). Todas as comparações refletem em uma
diminuição da peroxidação lipídica que possa ter sido ocorrida devido o aumento
da produção de antioxidante frente à presença do parasita no organismo dos
camundongos. Comportamento semelhante foi observado no grupo B, porém com
ausência de correlação entre 5º e 10º (p= 0,128), e presença entre 15º e 20º dia
(p= 0,018), reforçando a suposição feita anteriormente. Essa mesma diminuição foi
observadas nos grupos C e D em determinados períodos de infecção (Tabela 21).
Essas reduções da peroxidação foram também notadas na análise entre
grupos em diferentes períodos (Tabela 22). Resaltando que o grupo com hemácias
teve as menores quantidades de peroxidação no primeiro dia após infecção se
mantendo também no 15º dia de análise. Diferente do identificado no 20º dia, em
que a peroxidação promovida pelo parasita parece ter sido neutralizada, já que os
grupos infectados tiveram os menores níveis de MDA, assim como o grupo controle
inoculado com hemácias.
Diante da correlação dos parâmetros analisados foi observada correlação
moderada positiva entre TBARS e TEAC para todos os grupos, B e no C. Dessa
forma foi observado que na presença de lipídio oxidado deve haver produção de
antioxidantes no tecido cerebral impedindo o dano oxidativo (Figura 26),
principalmente na presença do inibidor.
113
Comportamento também observado na correlação entre peroxidação lipídica
e a capacidade antioxidante através da redução do radical ABTS+, porém de forma
moderada (r = 0,4339 e p= 0,0165) na presença do parasita e sem ação do NF-kB
e fraca (r = 0,3092 e p= 0,0410) quando tratado apenas do o inibidor.
Diferentes resultados foram encontrados na análise da parasitemia em
comparação ao TBARS, pois ocorreu uma diminuição da peroxidação lipídica com
o aumento da quantidade de parasitas. Esta relação foi fraca para os grupos
infectados e de forma isolada no A, enquanto que no B foi forte, indicando que o
inibidor promove a diminuição da ação oxidativa promovida pelo parasita.
Em comparação ao DPPH, a parasitemia demonstrou correlação moderada
em todas as análises realizadas. Sugerindo que no aumento da parasitemia ocorre
o estímulo da capacidade antioxidante independente da presença do inibidor
(Figura 20).
Observou-se com relação à quebra da barreira hematoencefálica que a
mesma ocorreu de forma mais precoce no 10º dia de infecção no grupo A infectado
e sem tratamento com o inibidor, pois na presença do mesmo a quebra foi
observada após 15 dias da infecção do camundongo e tratamento com o CAPE.
Achados semelhantes aos observados por Baptista et al. (2010) que ao tratarem
camundongos com pirimetamina observou a impregnação do tecido cerebral em
torno do 13º ou 15º dia após infecção.
No dia em que houve a quebra da barreira hematoencefálica no grupo A foi
constado uma baixa concentração de defesa antioxidante utilizando o radical DPPH
em comparação ao grupo com inibidor e infetado com P. berghei (p< 0,001).
Sugerindo que o NF-kB não é a principal via de estimulação de defesa antioxidante
e que este fator de transcrição pode está envolvido na codificação de outras
moléculas envolvidas no agravamento da doença.
No grupo B de 15 dias de infecção observou-se que a defesa utilizando o
+
ABTS se manteve em comparação ao grupo D (p= 0,01). Dessa forma, apesar de
baixa em comparação ao início da análise acredita-se que a capacidade
antioxidante pode ter contribuído no grupo B para o prolongamento da integridade
114
da barreira hematoencefálica, porém não suficiente para o impedimento total da
disrupção da BHE.
No que tange a ação oxidativa dos lipídios observou-se diminuição da
peroxidação lipídica ao longo do período de análise nos grupos infectado. Com
destaque para o primeiro dia, dessa forma essa ação oxidativa de lipídio parece
fazer parte do processo inicial da doença, com níveis igualmente elevados nos
grupos A (p= 0,045) e B (p= 0,034) em comparação ao D. Sugerindo que o inibidor
não seja efetivo contra a ação oxidativa de lipídio, no entanto pode atuar no
combate de outras formas de dano oxidativos, como a ação sobre DNA,
carboidratos e proteínas (Ma et. al., 2010).
Diferentes dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
encontradas no presente projeto, Omodeo-Salé et al. (2003) identificaram elevadas
concentrações de peroxidação lipídica em células humanas infectadas pelo
Plasmódio.
12.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar das diferenças estatísticas encontradas não podemos afirmar que a
inibição do fator de transcrição NF-kB ocorreu de forma efetiva. Esta análise será
posteriormente realizada por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA) realizado
para determinação da atividade do FT, através do “NF-kB Pathway Activation
InstantOne™ ELISA” (eBiociensce®), projetado para determinar a proteína NFkB
p65 (Ser536), IkB (Ser32/36), e Ikk (Ser176/180) em homogenado celular.
115
13.
CONCLUSÕES

Os achados referentes à parasitemia apontam que diante da inibição do fator
de transcrição kappa B ocorre uma diminuição da parasitemia a partir do 10º
dia de infecção dos camundongos sem alterar a sobrevida.

A avaliação da inibição do NF-KB para os achados pulmonares apontaram
para a inibição da ação oxidativa sobre os lipídios após 24h, diferente dos
achados encefálicos em que tal inibição ocorreu em longo prazo.

Os achados pulmonares apontam para uma ação aguda e em longo prazo
da inibição do NF-kB promovendo aumento da capacidade antioxidante.
Comportamento semelhante aos achados encefálicos.

A inibição do NF-kB aumenta a capacidade antioxidante e diminui a ação
oxidativa sobre lipídio nas amostras encefálicas.

A avaliação da inibição do NF-kB demonstrou um efeito tardio da quebra da
barreira hematoencefálica diante do impedimento da ação do NF-kB.

A
capacidade
antioxidante
prolonga
a
integridade
da
barreira
hematoencefálica, mas sem ação efetiva contra a peroxidação de lipídeos.
116
14. REFERÊNCIAS
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Perfusion in Severe Falciparum Malaria. The Journal of Infectious
Diseases, v.200, p.1522–1529, 2009.
130
15.
ANEXO
131
APÊNDICE 1- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após
1 dia de infecção.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,924
0,672
0,855
0,437*
0,798
0,572
0,803
0,758
0,773
0,790
0,772
0,101
0,758
0,803
0,045
0,067
0,690
0,871
Pulmão
1,189
1,016
0,819
1,104
0,655
1,344
1,049
1,394
0,977
1,410
1,096
0,247
0,987
1,305
0,318
0,477
0,510
1,782
DP= Desvio Padrão
Q1= primeiro quartil
Q3= terceiro quartil
DJ= Q3-Q1
Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável
Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
2,458
1,307
1,864
1,514
2,322
1,643
2,043
1,629
1,764
2,208
3,373
3,316
3,488
3,831
1,064
4,596*
3,330
3,795
2,458
3,953
44,50
43,37
88,37
88,56
68,87
77,06
90,75
94,50
105,56
85,25
37,31
16,06
41,37
21,87
57,12
26,18
53,18
34,81
22,06
52,75
1,875
0,374
1,632
2,167
0,534
0,801
0,830
2,968
3,584
0,268
3,352
3,813
0,461
0,691
2,660
4,505
78,68
20,72
70,92
90,20
19,28
28,92
42,00
119,12
36,27
14,68
23,09
49,90
26,81
40,21
-17,12
90,12
132
APÊNDICE 2- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B
após 1 dia de infecção.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,792
0,839
0,864
0,810
0,832
0,904
0,986
0,358*
0,921
†
0,811
0,180
0,810
0,904
0,093
0,140
0,670
1,045
DPPH
MDA
Cérebro
Pulmão
Pulmão
0,977
1,061
0,607
1,425
1,333
1,197
1,295
1,145
0,995
†
Cérebro
1,364
1,450
0,813
1,149
1,214
1,650
1,686
1,428
0,935
†
Pulmão
3,581
3,223
2,058
2,680
3,652
2,866
1,514
4,703
4,761
†
76,43
67,93
72,75
76,81
77,31
86,37
93,12
34,37*
92,43
†
8,06
8,12
2,31
12,25
13,25
12,75
13,31
20,93
19,31
†
1,115
0,244
0,995
1,295
0,299
0,449
0,545
1,744
1,299
0,298
1,149
1,450
0,300
0,450
0,699
1,900
3,226
1,093
2,680
3,652
0,972
1,458
1,221
5,111
80,39
9,21
75,51
87,89
12,37
18,56
56,95
106,45
12,25
5,71
8,12
13,31
5,18
7,78
0,34
21,09
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
†= Animal falecido antes do dia da coleta
133
APÊNDICE 3- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,853
1,251
0,739
1,191
0,871
1,366
0,775
1,232
1,102
1,344
1,129
1,230
0,912
1,089
1,123
1,179
1,369
1,235
0,596
1,314
0,947
0,230
0,794
1,118
0,323
0,485
0,309
1,604
1,243
0,082
1,201
1,298
0,097
0,146
1,054
1,445
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
ND= amostra não determinada
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
1,836
0,549*
0,356*
1,893
2,215
3,209*
2,322
3,280*
1,965
2,251
2,080
0,206
1,911
2,242
0,330
0,496
1,415
2,738
66,87
69,75
63,87
104,68
105,18
104,00
83,43
111,43
121,93
96,68
92,78
20,43
73,17
105,06
31,89
47,83
25,33
152,89
4,131
5,933
6,362
5,283
5,061
5,898
4,067
5,411
5,204
3,760
5,111
0,873
4,364
5,776
1,412
2,118
2,245
7,895
14,31
6,18
10,56
18,56
6,18
16,31
4,31
10,25
ND
8,93
10,62
4,88
6,1875
14,31
8,12
12,18
-6
26,50
134
APÊNDICE 4- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D
Animal
1
2
3
4
5
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,221
0,942
0,204
0,533
0,278
1,460
0,352
0,752
0,4005
0,533
0,292
0,085
0,221
0,352
0,130
0,196
0,025
0,548
0,844
0,384
0,533
0,942
0,408
0,612
-0,078
1,554
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
1,149
0,685
0,928
1,149
1,686*
1,614
0,327
5,419
2,622
0,692
MDA
Cérebro
Pulmão
ND
46,18
85,56
33,25
24,75
53,56
59,43
30,00
71,50
52,06
0,978
0,221
0,867
1,149
0,282
0,423
0,443
1,573
2,135
2,039
0,692
2,622
1,930
2,896
-2,203
5,519
57,48
23,38
46,18
71,50
25,31
37,96
8,21
109,46
42,21
12,31
32,43
52,43
20,00
30,00
2,43
82,43
135
APÊNDICE 5- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,625
ND
0,633
0,853
0,510
0,850
0,721
1,001
0,655
1,093
0,577
1,059
0,553
1,057
0,608
0,970
0,480
0,717
0,518
0,880
0,588
0,074
0,526
0,631
0,104
0,157
0,369
0,788
0,942
0,124
0,853
1,057
0,203
0,305
0,548
1,362
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
2,015*
0,420
1,035
0,799
0,670
1,056
1,278
0,556
0,892
0,727
3,009
2,823
3,552
2,622
4,525
3,852
4,339
3,709
2,058
3,738
96,68*
75,06
70,81
69,75
74,31
30,37*
64,56
64,68
54,50
71,43
17,18
ND
17,00
21,31
13,25
11,56
16,00
12,00
4,06
8,25
0,826
0,268
0,670
1,035
0,364
0,547
0,123
1,582
3,423
0,779
2,869
3,824
0,954
1,431
1,437
5,256
68,14
6,73
64,65
72,15
7,50
11,25
53,40
83,40
13,40
5,19
11,56
17,00
5,43
8,15
3,40
25,15
136
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,518
0,565
0,618
0,605
0,588
0,623
0,442*
0,546
0,554
0,590
0,578
0,035
0,554
0,605
0,051
0,076
0,477
0,682
DPPH
MDA
Cérebro
Pulmão
Pulmão
1,057
1.197
1,459
1,096
1,265
1,456
1,032
1,007
1,051
1,330
Cérebro
Pulmão
1,049
1,049
1,629
0,663
1,121
1,064
0,885
1,764*
0,642
0,306
3,638
4,425
4,274
4,153
3,738
3,481
5,247
4,639
4,739
4,625
68,25
74,31
75,18
61,81
63,06
79,37
66,87
73,18
74,18
77,75
7,00
10,93
7,18
10,12
14,87
13,87
6,37
13,37
23,00
7,00
1,195
0,174
1,052
1,313
0,261
0,391
0,661
1,705
0,934
0,373
0,663
1,064
0,400
0,600
0,062
1,664
4,296
0,555
3,842
4,636
0,793
1,190
2,651
5,826
71,40
6,05
67,21
74,96
7,75
11,62
55,59
86,59
11,37
5,16
7,04
13,75
6,70
10,05
-3,00
23,80
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
137
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,629
1,092
0,978
ND
0,534
0,985*
0,623
1,117
0,712
ND
0,673
1,125
0,667
1,101
1,024*
1,135
0,804
1,359*
0,727
1,169
0,705
0,127
0,629
0,727
0,098
0,147
0,482
0,874
1,123
0,027
1,105
1,132
0,027
0,040
1,064
1,173
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
MDA
Cérebro
Pulmão
Cérebro
Pulmão
2,444
2,301
2,000
1,385
1,300
1,979
1,478
2,108
1,986
1,593
4,160
3,674
4,532
4,589
5,554
4,432
4,632
4,217
5,240
5,118
100,12*
76,87
98,06*
79,50
74,18
68,93
65,87
66,00
62,75
78,25
5,25
6,75
19,37
7,12
6,75
8,43
14,43
20,06
10,18
7,37
1,857
0,394
1,507
2,081
0,573
0,860
0,646
2,942
4,615
0,559
4,271
4,997
0,725
1,088
3,182
6,085
71,54
6,44
65,96
77,21
11,25
16,87
49,09
94,09
10,57
5,44
6,84
13,37
6,53
9,79
-2,95
23,17
138
Animal
1
2
3
4
5
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,449
0,386
0,420
0,541
0,445
0,417
0,029
0,403
0,433
0,029
0,044
0,359
0,477
Pulmão
0,922
1,366
0,544
0,852
0,603
0,857
0,326
0,603
0,922
0,319
0,478
0,124
1,400
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
0,942
1,793
0,992
1,521
1,042
4,553
5,111
2,301
3,288
2,494
24,5*
51,31
61,12
71,06
63,56
29,68
27,93
16,81
29,06
32,43*
1,258
0,378
0,992
1,521
0,529
0,793
0,198
2,315
3,549
1,243
2,494
4,553
2,059
3,089
-0,594
7,643
61,76
8,15
58,67
65,43
6,76
10,14
48,52
75,58
25,87
6,08
25,15
29,21
4,06
6,09
19,06
35,31
139
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,476
0,440
†
0,380
†
0,615
0,607
0,380
†
†
0,529
0,111
0,449
0,613
0,163
0,245
0,204
0,859
Pulmão
1,118*
0,897
†
0,942
†
0,952
0,951
0,812*
†
†
0,936
0,026
0,931
0,951
0,019
0,029
0,901
0,981
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
0,677
0,971
†
0,613
†
1,307
1,135
0,763
†
†
6,520
3,516
†
1,822
†
5,504
3,616
2,458
†
†
29,68
14,00
†
82,12
†
39,62
53,06
49,43
†
†
17,12
33,43
†
ND
†
42,56
30,43
9,18
†
†
0,911
0,274
0,699
1,094
0,395
0,592
0,106
1,687
3,906
1,792
2,723
5,032
2,309
3,464
-0,741
8,497
44,65
23,18
32,17
52,15
19,98
29,97
2,19
82,13
26,55
13,31
17,12
33,43
16,31
24,46
-7,34
57,90
140
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,556
0,561
0,436
0,686
†
0,751
0,696
†
0,448
0,451
0,573
0,125
0,450
0,688
0,238
0,357
0,092
1,046
Pulmão
0,979
0,289*
0,966
1,083
†
0,918
0,961
†
0,746
0,560
0,887
0,175
0,832
0,972
0,140
0,210
0,621
1,183
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
0,870
ND
3,202
2,816
†
2,444
1,714
†
1,207
1,721
4,096
ND
4,553
4,732
†
3,953
3,288
†
2,086
2,444
52,00
40,93
55,56
67,50
†
63,68
36,50
†
44,25
78,93
3,56
ND
ND
39,81*
†
6,12
7,37
†
12,25
10,81
1,996
0,853
1,460
2,630
1,169
1,753
-0,292
4,383
3,593
1,023
2,866
4,324
1,458
2,188
0,677
6,513
54,92
14,48
43,42
64,64
21,21
31,82
11,59
96,46
8,02
3,52
6,12
10,81
4,68
7,03
-0,90
17,84
141
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,621
0,922
0,445
0,655
0,440
0,915
0,630
0,931
†
†
0,534
0,776
0,630
0,713
0,636
0,878
0,687
0,925
0,626
0,888
0,584
0,089
0,534
0,636
0,102
0,154
0,379
0,791
0,845
0,103
0,776
0,922
0,146
0,219
0,557
1,142
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
1,600
1,164
1,907
2,701
†
2,479
1,085
3,109
1,721
2,544
3,867
2,715
5,140
3,087
†
3,702
4,289
2,344
4,811
4,997
36,31
37,75
61,43
75,93
†
66,68
69,37
78,12
31,68
83,75
9,43
41,81
37,31
8,68
†
5,87
52,06
7,87
30,31
37,50
2,035
0,708
1,600
2,544
0,943
1,415
0,184
3,960
3,883
1,015
3,087
4,811
1,723
2,585
0,502
7,396
60,11
19,80
37,75
75,93
38,18
57,28
-19,53
133,21
25,65
17,72
8,68
37,50
28,81
43,21
-34,53
80,71
142
TEAC
Animal
1
2
3
4
5
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
Cérebro
0,407
0,375
0,323
0,476
0,459
Pulmão
0,677
0,607
0,631
0,767
0,444*
0,408
0,062
0,375
0,459
0,084
0,126
0,248
0,585
0,671
0,070
0,625
0,700
0,074
0,111
0,514
0,811
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
2,501
1,407
1,922
2,472
2,122
2,522
2,801
2,222
4,467*
2,401
64,56
29,12
32,25
58,06
60,25
42,75
16,31
14,87
20,06
32,50
2,085
0,450
1,922
2,472
0,550
0,825
1,096
3,298
2,487
0,243
2,356
2,592
0,235
0,353
2,002
2,946
48,85
16,78
32,25
60,25
28
42
-9,75
102,25
25,30
11,97
16,31
32,50
16,18
24,28
-7,96
56,78
143
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
0,724
1,064
†
†
0,479
0,361
†
†
0,460
0,671
0,554
0,147
0,470
0,602
0,131
0,197
0,272
0,800
0,698
0,352
0,516
0,867
0,351
0,527
-0,011
1,394
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
DPPH
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
MDA
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
2,222
†
2,265
†
1,071
2,766
†
1,357
†
2,944
89,50
†
57,68
†
52,56
20,12
†
29,31
†
29,81
1,853
0,677
1,646
2,243
0,597
0,895
0,751
3,139
2,356
0,869
2,061
2,855
0,793
1,190
0,870
4,046
66,58
20,01
55,12
73,59
18,46
27,70
27,42
101,29
26,41
5,45
24,71
29,56
4,84
7,26
17,45
36,82
144
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
†
†
0,765
0,546
0,703
†
†
†
†
†
0,671
0,112
0,625
0,734
0,109
0,164
0,460
0,898
Pulmão
†
†
0,765
0,977
0,843
†
†
†
†
†
0,862
0,107
0,804
0,910
0,106
0,159
0,645
1,070
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
DPPH
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
MDA
Cérebro
†
†
Pulmão
†
†
0,842
2,208
2,008
†
†
†
†
†
3,180
4,875
4,346
†
†
†
†
†
71,06
67,31
61,12
†
†
†
†
†
30,62
24,12
29,75
†
†
†
†
†
1,686
0,737
1,425
2,108
0,682
1,024
0,400
3,132
4,134
0,867
3,763
4,610
0,847
1,271
2,492
5,882
66,50
5,01
64,21
69,18
4,96
7,45
56,76
76,64
28,16
3,52
26,93
30,18
3,25
4,87
22,06
35,06
145
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
0,349*
0,519
0,532
0,557
0,570
0,850
0,440
0,807
0,513
0,688
0,639
1,072
0,457
1,120
0,497
1,003
0,547
1,114
0,541
1,064
0,526
0,059
0,497
0,547
0,049
0,074
0,423
0,622
0,879
0,230
0,718
1,070
0,352
0,528
0,189
1,599
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
0,756
2,158
2,229
2,429
1,478
1,993
2,308
2,179
1,936
0,928
1,471
3,066
1,214
4,239
ND
4,861
4,496
3,609
4,897
2,465
37,12*
73,18
78,81
89,43
75,12
83,12
58,62*
74,12
74,50
101,81*
51,75
44,12
37,25
48,62
38,06
7,31
7,68
7,31
7,31
6,18
1,839
0,587
1,593
2,217
0,623
0,935
0,657
3,153
3,369
1,405
2,465
4,496
2,030
3,046
-0,580
7,542
78,33
5,99
74,31
80,96
6,65
9,98
64,32
90,95
25,56
19,85
7,31
42,60
35,29
52,94
-45,63
95,55
146
Animal
1
2
3
4
5
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,149
0,321
0,411
0,537
0,460
0,376
0,148
0,321
0,460
0,139
0,209
0,112
0,669
Pulmão
0,705
0,734
1,110*
ND
0,592
0,677
0,075
0,648
0,719
0,070
0,106
0,542
0,826
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
1,264
1,764
2,036
1,292
1,600
4,196
5,590
5,826
ND
3,581
19,68
29,18
85,81*
40,62
17,18
27,87*
14,12
11,81
ND
12,50
1,591
0,325
1,292
1,764
0,471
0,707
0,584
2,472
4,798
1,084
4,042
5,649
1,607
2,410
1,631
8,060
26,67
10,64
19,06
32,04
12,98
19,47
-0,41
51,52
12,81
1,18
12,15
13,31
1,15
1,73
10,42
15,04
147
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
0,813
1,285
†
†
0,568
1,291
†
†
†
†
0,699
0,161
0,642
0,756
0,114
0,171
0,471
0,927
1,288
0,004
1,286
1,289
0,003
0,004
1,282
1,294
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
DPPH
Cérebro
Pulmão
†
†
†
†
†
†
†
†
†
†
MDA
Cérebro
†
†
†
†
†
Pulmão
†
†
†
†
†
1,586
†
1,757
†
†
5,983
ND
6,484
†
†
30,25
†
29,81
†
†
14,12
†
10,68
†
†
1,671
0,121
1,629
1,714
0,085
0,128
1,500
1,843
6,234
0,353
6,109
6,359
0,250
0,375
5,733
6,734
30,03
0,30
29,92
30,14
0,21
0,32
29,59
30,46
12,40
2,43
11,54
13,26
1,71
2,57
8,96
15,84
148
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,568
†
†
†
†
0,085
†
†
0,801
0,911
0,760
0,174
0,685
0,856
0,171
0,257
0,428
1,113
DPPH
Pulmão
1,071
†
†
†
†
ND
†
†
1,261
1,266
Cérebro
ND
†
†
†
†
1,199
0,111
1,166
1,264
0,097
0,146
1,019
1,411
2,944
0,704
2,701
3,348
0,647
0,970
1,730
4,319
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
3,431
3,266
†
ND
2,136
Pulmão
5,612
†
†
†
†
ND
†
†
5,118
1,693
4,141
2,134
3,406
5,365
1,959
2,939
0,466
8,304
MDA
Cérebro
Pulmão
34,93
6,37
†
†
†
†
†
†
†
†
19,00
ND
†
†
†
†
33,56
9,06
ND
9,43
29,16
8,83
26,28
34,25
7,96
11,95
14,32
46,20
8,29
1,67
7,71
9,25
1,53
2,29
5,42
11,54
149
TEAC
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
Cérebro
0,482
0,620
0,761
0,750
0,838
0,968
0,885
0,960
0,848
0,574
Pulmão
0,847
1,290*
0,894
0,850
0,900
0,906
1,014
0,841
0,929
1,032
0,768
0,164
0,652
0,876
0,223
0,335
0,317
1,211
0,913
0,069
0,850
0,929
0,078
0,118
0,731
1,047
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
1,621
1,764
1,807
2,065
2,780
3,595*
1,879
2,501
2,379
1,257
5,161
6,620
3,688
3,903
4,131
4,053
3,695
5,040
5,840
4,303
77,50
72,75
64,62
64,31
73,43
79,75
82,31
ND
72,75
47,56
43,68*
26,00
20,62
37,06
9,37
16,81
19,81
18,18
12,06
15,43
2,165
0,673
1,775
2,471
0,695
1,043
0,732
3,514
4,643
0,991
3,940
5,131
1,190
1,785
2,154
6,917
70,55
10,55
64,62
77,50
12,87
19,31
45,31
96,81
19,48
8,18
15,43
20,62
5,18
7,78
7,65
28,40
150
Animal
1
2
3
4
5
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
TEAC
Cérebro
0,571
0,624
0,474
0,622*
0,525
0,498
0,025
0,484
0,515
0,031
0,046
0,437
0,562
Pulmão
DPPH
Cérebro
Pulmão
MDA
Cérebro
Pulmão
0,571
0,624
0,474
0,622
0,525
1,528
1,149
1,135
1,893
1,457
3,974
4,811
2,708
4,303
2,751
36,37
33,50
41,25
46,06
76,18*
20,75
40,43
28,68
16,75
15,56
0,563
0,064
0,526
0,622
0,096
0,144
0,381
0,766
1,433
0,312
1,149
1,528
0,379
0,568
0,581
2,097
3,709
0,942
2,751
4,303
1,551
2,327
0,424
6,631
39,29
5,52
35,65
42,45
6,79
10,19
25,46
52,64
24,43
10,31
16,75
28,68
11,93
17,90
-1,15
46,59
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
151
APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos dias de
análise.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
24h
0,143
0,172
0
0,146
0
0
0
0,178
0
0
ND
0
0,182
0
0,19
0,072214286
0,087376
0
0,1655
0,1655
0,24825
-0,24825
0,41375
5 dias
0,657
ND
ND
1,778
1,86
ND
1,217
0,781
ND
1,48
2,09
0,594
ND
0,985
1,237
1,2679
0,524892
0,832
1,7035
0,8715
1,30725
-0,47525
3,01075
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
PARASITEMIA (%)
10 dias
15 dias
†
15,5
1,78
15
1,837
13
†
†
2,117
7,6
2,089
†
2,49
†
†
†
3,833*
6,7
1,543
†
1,66
†
†
†
1,821
†
ND
†
2,791
16,13
2,1961
12,32166667
0,690747
4,150568
1,79025
8,95
2,39675
15,375
0,6065
6,425
0,90975
9,6375
0,8805
-0,6875
3,3065
25,0125
20 dias
7,76
†
†
†
†
40,408
†
69,212
†
†
†
†
†
†
66,451
45,95775
28,58089
32,246
67,14125
34,89525
52,34288
-20,0969
119,4841
152
APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos dias de
análise.
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Média
DP
Q1
Q3
DJ
2/3DJ
Q1-3/2DJ
Q3+3/2DJ
24h
0
0,541
0,264
0,137
0
0,098
0
0
0
0,152
0
0,181
0
0
0,488*
0,124066667
0,180054
0
0,1665
0,1665
0,24975
-0,24975
0,41625
5 dias
0,094
0,371
0,627
ND
8,309*
ND
6,903*
2,3
2,787
1,255
2,414
1,151
ND
ND
1,45
2,514636364
2,675074
0,889
2,6005
1,7115
2,56725
-1,67825
5,16775
DP= Desvio Padrão
DJ= Q3-Q1
*= pontos excluidos
PARASITEMIA (%)
10 dias
15 dias
2,66
†
2,91
†
4,34*
0,99
3,12
2,4
ND
1,64
2,34
†
ND
†
ND
†
3,93
†
2,56
†
ND
†
ND
†
1,29
2,74
2,05
†
ND
ND
2,8
1,9425
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10,47844
7,043438
34,98594

Efeito da Inibição da Ativação do NF-KB sobre o - PPGBAIP

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