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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES CAPRINAS DO NORDESTE BRASILEIRO COM MARCADOR DE DNA MITOCONDRIAL NÚBIA MICHELLE VIEIRA DA SILVA AREIA-PB DEZEMBRO-2013 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES CAPRINAS DO NORDESTE BRASILEIRO COM MARCADOR DE DNA MITOCONDRIAL NÚBIA MICHELLE VIEIRA DA SILVA ZOOTECNISTA AREIA-PB DEZEMBRO-2013 NÚBIA MICHELLE VIEIRA DA SILVA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES CAPRINAS DO NORDESTE BRASILEIRO COM MARCADOR DE DNA MITOCONDRIAL Tese apresentada ao Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia da Universidade da Paraíba, Universidade Federal Rural de Pernambuco e Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Zootecnia. Área de concentração: Produção Animal Comitê de Orientação: Prof. Dr. Edgard Cavalcanti Pimenta Filho – Orientador Principal Prof. Dr. Carlos Manoel Martins Santos Fonseca – Co-orientador Prof.ª Dr.ª Maria Norma Ribeiro - Co-orientadora AREIA-PB DEZEMBRO-2013 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte. Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, Campus II, Areia – PB. S586d Silva, Núbia Michelle Vieira da. Diversidade genética de populações caprinas do Nordeste brasileiro com marcador de DNA mitocondrial. / Núbia Michelle Vieira da Silva. - Areia: UFPB/CCA, 2013. 135f. : il. Tese (Doutorado em Zootecnia) - Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2013. Bibliografia. Orientador (a): Edgar Cavalcanti Pimenta Filho. Coorientador (a): Carlos Manoel Martins S. Fonseca e Maria Norma Ribeiro. 1. Caprinos – caracterização genética 2. Filogenia 3. Caprinos – Nordeste, Brasil I. Pimenta Filho, Edgar Cavalcanti (Orientador) II. Título. UFPB/CCA CDU: 636.39(043.2) DADOS CURRICULARES Filha de Nivaldo Antonio da Silva e Maria das Graças Vieira da Silva, Núbia Michelle Vieira da Silva nasceu em Bezerros, cidade do Agreste de Pernambuco, em vinte e seis de Janeiro de 1984. Concluiu o segundo grau em 2001, no Colégio Nossa Senhora das Dores, em Bezerros. Em setembro de 2003, iniciou o curso de graduação em Zootecnia, na Universidade Federal Rural, Recife, PE. Quando graduanda, sob a orientação da Profa. Dra. Maria Norma Ribeiro, foi aluna bolsista PIBIC-CNPq-UFRPE e FACEPE, durante três anos, tendo concentrado suas pesquisas na área da produção de caprinos. Submeteuse à defesa do trabalho de conclusão de curso, para obtenção do título de Zootecnista, em 2008. Em agosto de 2008, iniciou o curso de pós-graduação em nível de mestrado em Produção Animal, no departamento de Zootecnia, na Universidade Federal Rural de Pernambuco, sob a orientação da Profa. Dra. Maria Norma Ribeiro. Continuou na linha da caprinocultura, tendo realizado diversos trabalhos, principalmente na área de conservação de caprinos locais. Em Julho de 2010, submeteu-se à defesa do trabalho de dissertação para obtenção do título de Mestre em Produção Animal. Na sequência, em Agosto desse mesmo ano, sob orientação do Dr. Prof. Edgard Cavalcanti Pimenta Filho, ingressou no Doutorado em Zootecnia do Programa de Doutorado Integrado da Zootecnia, (UFPB/Campus II, Areia), sendo bolsista da CAPES. Em 2012, iniciou o período sanduíche na Universidade de Aveiro, Aveiro, Portugal, sob a orientação do Prof. Dr. Carlos Fonseca, na Unidade de Vida Selvagem, ao apoio do PDSE é um programa institucional da CAPES, destinados à concessão de bolsas de doutorado sanduíche. Em 2013, concluiu o período sanduíche. Em Dezembro de 2013, Silva submeteu-se à defesa de sua tese para a obtenção do título de Doutor em Zootecnia. A vida vai ficando cada vez mais dura perto do topo. Friedrich Nietzsche DEDICATÓRIA A Deus, À minha família, e a todos os caprinocultores. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Edgard, que nos anos de convivência, muito me ensinou, contribuindo para meu crescimento científico e intelectual. Ao Prof. Dr. Carlos Fonseca, pela atenção e apoio durante o processo de orientação no doutorado sanduíche. À Universidade Federal da Paraíba, pela oportunidade de realização do curso de doutorado. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de doutorado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa. Ao Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro, por colocar à disposição o laboratório. À Profa. Dra. Maria Mascena, pelo carinho, mas também pela ajuda, indispensável à finalização deste trabalho; ao Prof. Dr. Manoel Adrião, por toda a ajuda neste trabalho desde o seu início; ao Pesquisador Júlio Oliveira, a Pesquisadora Patricy e aos Pós doc Dr. José Fábio e Dr. Josiane Veloso, pela ajuda construtiva neste trabalho. À Profa. Dra. Maria Norma (UFRPE), por iniciar as pesquisas com caprinos e estar presente ate hoje, na minha vida profissional. Aos amigos que permitiram a realização deste trabalho, Anna, Filipe, Rosália, Janaína, Carla, Elizabete, Denea, Eduardo, Irene e Rita. Aos amigos Marcinho e Ju presentes em todo o doutorado. Ao Dr. Aderbal Cavalcanti Neto que desde o início das coletas esteve presente para a realização deste trabalho. Aos criadores de caprinos que permitiram o acesso de seus rebanhos sempre com muita gentileza, e sua sensibilidade em trabalharem com essas raças valiosas para o Brasil. A Embrapa Meio-Norte, Embrapa Caprinos e Emparn pela contribuição ao nosso trabalho. Enfim, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para o término de mais uma etapa da minha vida. SUMÁRIO Lista de Figuras.............................................................................................................xii Lista de Tabelas............................................................................................................xiv Resumo Geral................................................................................................................xv Abstrat...........................................................................................................................xvi CONSIDERAÇÕES INICIAIS....................................................................................xvii CAPÍTULO 1. Referencial Teórico ............................................................................ 177 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 18 OBJETIVOS ................................................................................................................... 20 Objetivo Geral ............................................................................................................ 20 Objetivos Específicos ................................................................................................. 20 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 21 Classificações da Cabra e Origem .............................................................................. 21 Características dos ancestrais ..................................................................................... 24 Domesticações das cabras .......................................................................................... 24 Utilizações da Biologia Molecular para esclarecimento da Domesticação ................ 27 Definição e formação de raça ..................................................................................... 28 Rotas das raças atuais ................................................................................................. 32 Caprinos do Brasil ...................................................................................................... 38 As Raças Caprinas estudadas ..................................................................................... 41 Registro Genealógico de Caprinos e Associações ...................................................... 48 Marcadores Moleculares............................................................................................. 50 DNA mitocondrial ...................................................................................................... 54 Tipos de DNA presentes no organismo .......................................................................59 CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................................................61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................62 CAPÍTULO 2.Catalogação dos haplótipos do DNA mitocondrial de caprinos da raça Canindé............................................................................................................................75 RESUMO.........................................................................................................................76 ABSTRAT.......................................................................................................................77 INTRODUÇÃO...............................................................................................................78 METODOLOGIA............................................................................................................80 Local do Estudo...........................................................................................................80 Amostragem e descrição do local de colheita de material biológico para a pesquisa 80 Material biológico e extração do DNA....................................................................... 81 Amplificação da região D-loop e sequenciamento ..................................................... 82 Tratamento dos dados ................................................................................................. 83 Análise de dados ......................................................................................................... 84 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 86 Análise de polimorfismo ............................................................................................ 86 Distribuição dos haplótipos de mtDNA ..................................................................... 89 Diferenciação genética ............................................................................................... 91 Análises filogenéticas ................................................................................................. 93 Análise de correspondência entre distribuição geográfica e variância genética (SAMOVA) ................................................................................................................ 99 Dinâmica populacional ............................................................................................. 101 CONCLUSÃO .............................................................................................................. 103 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 104 CAPÍTULO 3.Diversidade Genética na Região D- loop do mtDNA de populações caprinas brasileiras e sua relação filogenética com seu grupo de origem .................... 108 RESUMO.......................................................................................................................109 ABSTRAT.....................................................................................................................110 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 111 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 112 Amostragem ............................................................................................................. 112 Material biológico .................................................................................................... 113 A amplificação da região D-loop do mtDNA e sequenciamento ............................. 115 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 116 CONCLUSÃO .............................................................................................................. 129 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 130 LISTA DE FIGURAS Capítulo 1. Referencial Teórico Figura 1. Localização geográfica dos principais centros de domesticação da espécie caprina. A-Turquia, B-Paquistão, C- Irã, D- Iraque, E- Anatólia, F- Síria, G- Israel e HJordânia............................................................................................................................25 Figura 2. Ibex, 11 000 a.C., Gruta de Niaux, Foix, França............................................26 Figura 3. Origem e desenvolvimento de algumas raças Caprinas..................................32 Figura 4. O brasão da família Cabral, com a representação de cabras (animais valentes e leais, comuns na região das Beiras, Portugal) indica que a família Cabral era influente na Corte Portuguesa.........................................................................................................34 Figura 5. Resumo dos conjuntos de cromossomos da Capra hircus (DONG et al., 2012)................................................................................................................................56 Capítulo 2 - Catalogação dos Haplótipos do DNA Mitocondrial de Caprinos da Raça Canindé Figura 1. Representação dos locais onde as amostradas foram coletadas......................81 Figura 2 - Amplificação bem sucedida dos fragmentos de DNA, evidenciado pelas bandas obtidas por eletroforese (o “controle” não apresenta bandas, o que indica ausência de contaminação)..............................................................................................82 Figura 3 - Cromatograma obtido para uma sequência....................................................83 Figura 4. Relação filogenética entre os haplótipos de caprinos da raça Canindé oriunda do Nordeste do Brasil. O tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos que apresenta o respectivo haplótipo. Os pequenos círculos vermelhos indicam vetores intermediários, introduzidos pelo algoritmo executado................................................. 94 Figura 5. Árvore filogenética não enraizada com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de caprinos Canindé do Nordeste do Brasil.......................... 96 Figura 6. Árvore filogenética enraizada com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de caprinos Canindé do Nordeste do Brasil..................................... 97 xii Figura 7. Árvore filogenética não enraizada construído com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de cabras Canindé e representantes dos seis haplogrupos de mtDNA para caprinos (A; B1, B2; C; D; F; G).....................................98 Capítulo 3. Diversidade genética na região d- loop do mtDNA de populações caprinas brasileiras e sua relação filogenética com seu grupo de origem Figura 1. As raças estudadas....................................................................................... 113 Figura 2. Locais de colheitas de dados e material biológico....................................... 114 Figura 2. A rede Median joining do mtDNA os haplótipos observados nas quatro raças caprinas locais brasileiras Canindé, Moxotó, Marota e Azul e duas exóticas Saanen e Alpina Britânica. A área do círculo é proporcional para a frequência da amostra. Os pequenos círculos vermelhos indicam vetores intermediários. ....................................122 Figura 3. Árvore Neighbour-Joining para os 39 haplótipos encontrados de um fragmento da região D-loop para amostras representativas de cada tipo caprino estudado e representantes dos seis haplogrupos de mtDNA para caprinos (A ;D ;F ;G ; B1 , B2 ;C )............................................................................................................126 Figura 4. Filogenia de caprinos a partir das sequencias de DNAmt da região D- loop. Árvore inferida por analise Bayesiana utilizando o modelo TrN+I+G, com valores de probabilidades a posteriori........................................................................................... 128 xiii 1 LISTA DE TABELAS Capítulo 1. Referencial Teórico Tabela 1. Distribuição geográfica do gênero Capra, de acordo com Shakleton (1997)...............................................................................................................................23 Capítulo 2 - Catalogação dos Haplótipos do DNA Mitocondrial de Caprinos da Raça Canindé Tabela1. Informação de coleta da raça Canindé.............................................................81 Tabela 2. Variabilidade genética nas 10 subpopulações de cabras da Raça Canindé a partir de sequências de 481pb de um fragmento da região D-loop do mtDNA..............88 Tabela 3. Catálogo dos haplótipos do DNA mitocondrial dos caprinos da raça Canindé. .........................................................................................................................................90 Tabela 4. Estimativas pareadas de distância genética entre dez populações de cabras Canindé com base em medidas de FST.............................................................................91 Tabela 5. AMOVA entre as populações amostradas do caprino Canindé..................... 92 Tabela 6. Análise espacial de variância molecular (SAMOVA) para as oito subpopulações de caprino Canindé. Agrupamentos gerados pelo programa estão indicados entre colchetes.................................................................................................99 Tabela 8. Índices de neutralidade calculados para cada população estudada...............102 Capítulo 3. Diversidade genética na região d- loop do mtDNA de populações caprinas brasileiras e sua relação filogenética com seu grupo de origem Tabela 1. Frequência numérica dos 39 haplótipos do DNA mitocondrial nos caprinos das seis raças por populações....................................................................................... 118 Tabela 2. Principais características das sequências analisadas nas populações de cabras brasileiras...................................................................................................................... 121 Tabela 3. AMOVA entre e dentro de populações e raças.............................................123 Tabela 4. Valores do índice de Fixação FST para as 15 populações utilizadas............ 124 xiv DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES CAPRINAS DO NORDESTE BRASILEIRO COM MARCADOR DE DNA MITOCONDRIAL RESUMO GERAL No Brasil existe uma grande variedade de raças caprinas. O avanço nos estudos moleculares, além do enriquecimento das análises filogenéticas intraespecíficas, tem possibilitado de maneira eficaz a interpretação de possíveis cenários evolutivos. Dados filogeográficos permitem estabelecer uma estratégia que priorize a conservação de grupos que incluam representantes da maior parte da historia evolutiva da espécie caprina. O objetivo foi caracterizar e avaliar a variabilidade genética de algumas raças caprinas brasileiras. Foram amostrados 271 indivíduos pertencentes a 15 populações. Foram analisadas as sequências da região D-loop, com 481pb com 62 sítios polimórficos, variabilidade relativamente alta quando considerada a história evolutiva do grupo. O pelo de 271 animais das raças Canindé (n=178), Moxotó (n=20), Marotá (n=24), Azul (n=19), Sannen (20) e Alpina (n=10) foi utilizado para realizar extração de DNA, amplificação da região D-loop, purificação e sequenciamento. Após edição, as sequências obtidas foram alinhadas, comparadas com cada sequência obtida e com uma referência, tendo estimados vários índices de divergência e de diversidade genética entre as subpopulações estudadas. Foram encontrados 39 haplótipos. A análise da estrutura populacional mostrou diferenciação significativa (P<0,05) entre alguns pares possíveis das seis raças. Na AMOVA verificou-se que apenas 5,13% da variação genética ocorrem entre grupos, ou seja, entre raças devido a diferenças entre raças. Já 9,99% ocorrem entre populações dentro de grupos, onde a maior diferença está dentro das populações onde 84,89% corresponderam a diferenças entre indivíduos. A maior diferença genética entre as seis raças foi observado entre Moxotó e Alpina Britânica, enquanto a maior similaridade verificou-se entre Canindé e a Marota. Estas observações são consistentes com a recorrente introdução de animais exóticos no plantel. Os animais brasileiros são classificados como haplogrupos A, com haplótipos de predominância de descendência européia e com participação africana e asiática. Dessa forma, a variação do DNA mitocondrial estimados neste trabalho em caprinos contribuiu com a geração de dados genotípicos para a realização de estudos futuros de origem e evolução dos animais na região Nordeste no Brasil. Palavras-chave: Capra hircus, caracterização genética, filogenia, recurso genético. xv GENETIC DIVERSITY OF GOAT POPULATIONS IN NORTHEAST BRAZIL WITH MITOCHONDRIAL DNA MARKER GENERAL ABSTRACT In Brazil there is a wide variety of goat breeds. Advances in molecular studies, in addition to enriching intraspecific phylogenetic analysis, has enabled effectively the interpretation of possible evolutionary scenarios. Phylogeographic data allows set up a strategy that prioritizes conservation groups including representatives of most of the evolutionary history of goat species. The objective was to characterize and evaluate the genetic variability of some Brazilian goat breeds. The sample consisted of 271 individuals from 15 populations. Sequences of the D-loop region containing 481pb with 62 polymorphic sites were analyzed, a relatively high variability when considering the evolutionary history of the group. The coat from 271 Canindé animal breeds (n = 178), Moxotó (n = 20), Marotá (n = 24), Azul (n = 19), Sannen (20) and Alpina (n = 10) was used for DNA extraction, amplification of D-loop region, purification and sequencing. After editing, the obtained sequences were aligned, compared with each obtained sequence and a reference, having estimated several divergence and genetic diversity indices among subpopulations studied. We found 39 haplotypes. Analysis of population structure showed a significant difference (P < 0.05) between some possible pairs from the six breeds. In AMOVA it was found that only 5.13% of genetic variation occurs among groups or among breeds due to differences between breeds. Meanwhile 9.99% occurs among populations within groups, where the largest difference is within populations in which 84.89% corresponded to differences between individuals. The largest genetic difference among the six breeds was observed between Moxotó and British Alpine, while the largest similarity was between Canindé and Marota. These observations are consistent with the recurring introduction of exotic animals in the squad. Brazilian animals are classified as haplogroups A, with haplotypes predominantly of European descent and African and Asian participation. Therefore, the change in estimated mitochondrial DNA in goats in this study contributed for the generation of genotype data for future studies on the origin and evolution of animals in the Northeast region of Brazil. Keywords: Capra hircus, genetic characterization, phylogeny, genetic resource. xvi CONSIDERAÇÕES INICIAS Existe um reconhecimento global da necessidade de conservação da diversidade genética e da caracterização de raças e populações, incluindo a sua diferenciação e relações genéticas (BARKER et al. 2001). Na Convenção para a Diversidade Biológica e na Agenda 21, foi confirmada a importância dos recursos genéticos dos animais domésticos como componente da diversidade biológica global, sendo reconhecida a soberania de cada país sobre os seus recursos genéticos e a obrigação de conservá-los. A perda da diversidade ocorre devido às pressões exercidas pela produção animal moderna, sendo causa de preocupação mundial. Grande parte da diversidade que se perde anualmente é desconhecida, incluindo raças de animais domésticos, incluindo a espécie caprina. Assim, é importante medir, documentar e proteger a diversidade existente em populações localmente adaptadas, por constituir material genético de valor para futuros objetivos de produção (BRUFORD et al., 2003). A caracterização genética de caprinos tem sido alvo de estudos em várias regiões do mundo (LUIKART, et al., 2001; JOSHI et al., 2004; PEREIRA et al., 2005; LIU et al., 2006; NADERI et al., 2007; ADEBAMBO, 2009; PEREIRA et al., 2009; BENJELLOUN et al., 2011). Esses estudos têm avaliado a diversidade inter e intrarracial, bem como a estrutura genética das populações e/ou raças. A maioria deles baseia-se na caracterização molecular, com vistas a apoiar programas de conservação em cada país (FAO, 2010). A criação de caprinos é um elemento que contribui para a fixação do homem no campo, pois representa importante fonte de renda familiar dos pequenos agricultores e também para a geração de emprego, principalmente, na região Nordeste do Brasil. Os caprinos brasileiros introduzidos a partir da colonização desenvolveram características particulares de adaptação. Apesar de suas potencialidades poucos são os estudos realizados com os caprinos locais com conservação da diversidade genética e avalição das relações genéticas existentes. A diversidade da variabilidade genética entre e intrapopulações da espécie caprina é importante tanto na conservação quanto na produção animal. 16 CAPÍTULO 1 ________________________________________________________________ REFERENCIAL TEÓRICO DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES CAPRINAS DO NORDESTE BRASILEIRO COM MARCADOR DE DNA MITOCONDRIAL 17 INTRODUÇÃO As cabras foram domesticadas há 11000 anos, no Oriente Médio, na região que hoje reúne Iraque, Síria, Líbano e Jordânia que, desde então, desempenha um papel econômico, cultural e religioso em muitas civilizações humanas (PEREIRA; AMORIM, 2010). Devido à sua versatilidade e adaptabilidade, os caprinos conseguiram se espalhar por todo o mundo, seja ao lado do homem em movimentos migratórios seja pelo comércio (LUIKART et al., 2001). Isso proporcionou o desenvolvimento de vários tipos morfológicos, afetando, por exemplo, as orelhas, chifres, tipo de pelo e cores. Ao explorar a história da agricultura e alimentação é possível compreender as questões atuais das raças contemporâneas, já que as relações do homem com o mundo rural e a produção de alimentos estão sempre ligadas ao desenvolvimento e fracassos, tecnológicos econômicos, políticos e culturais (FLAMANT, 2002). O progresso das condições de vida e do bem-estar humano encontra-se, estreitamente, dependente das espécies animais e vegetais domesticadas durante os últimos milênios, as quais foram utilizadas para os mais variados fins. A cabra foi a primeira espécie a ser domesticada com o interesse econômico, uma vez que só o cão a antecede (SHELTON, 1993). Graças aos pequenos agricultores os animais desenvolveram adaptações a diferentes condições ambientais. Diferentes raças foram formadas de acordo com a necessidade de produção e do ambiente. Assim como nas demais espécies animais, a diversidade de recursos genéticos caprinos no mundo reflete sua adaptação aos diferentes sistemas de produção, com predomínio de raças nativas, muitas vezes em perigo de extinção (FAO, 2010). Segundo a FAO (2007) há cerca de 800 milhões de caprinos no mundo, dos quais 60% estão no continente asiático, com mais de 500 raças caprinas reconhecidas mundialmente, em que mais de 90% são consideradas locais. Todavia, em muitos países não se tem a tradição de classificar os animais por raça, mas sim pela sua distribuição geográfica, designando-os como Crioulos termo utilizado amplamente e que inclui genótipos e tipos raciais distintos (EGITO; MARIANTE; ALBUQUERQUE, 2002). O grande número de raças locais de caprinos existentes no mundo resulta em grande diversidade genética intraespecífica o que representa importante patrimônio genético mundial. Todavia, são escassas as informações sobre estes recursos, 18 particularmente, quando comparado a outras espécies de produção (GAMA; BRESSAN, 2011). Como parte da diversidade biológica, os caprinos locais brasileiros tem sido alvo de estudos, em geral, por serem considerados adaptados a áreas específicas bem como devido à importância social, econômica e cultural para as populações que ocupam essas áreas, que se concentram na região Nordeste. Muitas dessas raças economicamente importantes são atualmente raras e com uma combinação de genes ainda por avaliar e empregar nos sistemas de produção, elevando ao máximo os benefícios que este recurso pode proporcionar (EGITO et al., 2002). A importância da defesa da biodiversidade animal é seguida por avanços genéticos que auxiliam o planejamento e efetivam o objetivo da conservação. A genética molecular oferece ampla gama de técnicas para estudo e entendimento das bases genéticas da biodiversidade. Porém é impossível recriar a diversidade genética natural e, assim sendo sua perda é irreversível (GINJA, 2002). Desde a década de 70 do século passado o mtDNA é uma das moléculas mais empregadas em estudos envolvendo estrutura populacional, relações filogenéticas em nível inter ou intra-espécies e no entendimento de vários aspectos biológicos e evolutivos de uma grande variedade de organismos (AVISE et al., 1987; MORITZ; DOWLING; BROWN, 1987). A utilização dessa molécula em tais estudos se deve ao fato dela apresentar alta taxa de evolução, ser circular, pequena e de estrutura gênica simples. Além disso, o sequenciamento direto dos genes mitocondriais é mais fácil do que o de genes nucleares (que podem requerer clonagem), e o alinhamento das sequências não oferece problema (SANTOS, 2005). A investigação sobre a filogenia e estrutura das raças tem sido em termos históricos, uma área de trabalho de grande evidência em virtude da sua relevância nos aspectos culturais e socioeconômicos (EGITO; MARIANTE ; ALBUQUERQUE, 2002). Estes estudos populacionais devem, sempre que possível, ser interpretados considerando o contexto histórico (CAVALLI-SFORZA; MENOZZI; PIAZZA, 1994), sob pena de se cometer grandes equívocos na interpretação dos dados. Estudos genéticos, associados aos relatos históricos indicam que as raças caprinas do Brasil são adaptadas e distintas daquelas raças das quais derivaram, por isso são considerados locais (MENEZES et al., 2006). Por conseguinte, este estudo, visa conhecer as relações existentes entre diferentes populações caprinas do Nordeste brasileiro, analisando o patrimônio genético 19 disponível, entre e intrapopulções a partir de marcador molecular do tipo DNA mitocondrial. As informações geradas poderão fornecer subsídios para o gerenciamento das populações estudadas. OBJETIVOS Objetivo Geral Estimar a variabilidade genética de cabras brasileiras das raças Canindé, Azul, Moxotó e Marota, e duas exóticas existentes na região Nordeste do Brasil a fim de inferir as relações entre elas através de sequências de DNA mitocondrial. Objetivos Específicos Analisar a variabilidade genética inter e intra populacional em rebanhos caprinos criados no nordeste brasileiro. Inferir as relações evolutivas e a composição genética das raças caprinas estudadas através de analise de mtDNA. 20 REVISÃO DE LITERATURA Classificações da Cabra e Origem Os caprinos pertencem à ordem dos Artiodactyla, na qual os animais possuem cascos nas patas, subordem ruminante e, à família Bovidae, cuja evolução ocorre no Mioceno, há 20 milhões anos. É no grupo de ungulados que existe a maior diversidade, com mais de 300 táxons fósseis e cerca de 140 espécies de seres vivos, incluindo ovelhas, bovinos e antílopes (HASSANIN; DOUZERY, 1999). Comparações citogenéticas indicam alto nível de colinearidade entre cromossomos de caprinos e bovinos e, todos os 30 cromossomos que constituem o genoma caprino foram ordenados de acordo com o Sistema Internacional de Nomenclatura de cromossomo para bovídeos. Bovinos e caprinos teriam divergido há 23 milhões de anos atrás (DONG et al., 2012), enquanto ovinos e caprinos divergiram há, aproximadamente, seis milhões de anos. Taxonomicamente, o caprino tem a seguinte hierarquia, segundo Grzimek e Fontaine (1972), no Le Monde Animal: REINO: Animalia FILO: Chordata CLASSE: Mammalia SUPER ORDEM: Ungulados Com 2 ordens: Perissodactylos e Artiodactylos ORDEM: Artiodactylos Com 3 subordens : Tylopodes – Não ruminantes (Suiformes) – Ruminantes (Ruminantia) SUBORDEM: RUMINANTES Com 2 infra-subordens : Tragulina – Pecora (ruminantes verdadeiros) INFRA-SUBORDEM: Pecora Com 4 famílias : Cervídeos - Girafídeos - Antilocaprídeos – Bovídeos FAMÍLIA: Bovídeos Com 15 subfamílias SUBFAMÍLIA: Capríneos Com 5 tribos 21 TRIBO: Caprini Com 5 gêneros (incluindo: Ovis) GENERO: Capra Com 11 espécies (IUCN UNEP-WCMC, 2010) ESPÉCIE: Capra hircus L. : a cabra doméstica. As relações taxonômicas são baseadas na análise de características morfológicas, essencialmente, no formato dos chifres, nos machos. A morfologia do chifre pode não ser um critério adequado para resolver as questões referentes à taxonomia da Capra, uma vez que o chifre é uma característica muito variável, mesmo dentro de uma população pode passar por evolução convergente (SCHALLER, 1977). Do ponto de vista genético, todas as espécies pertencentes ao gênero Capra tem o mesmo número de cromossomos (2n=60), condição que favorece a hibridação. Pelo que se relata, este grupo não chegou ao seu ápice evolutivo e isso gerou no gênero Capra uma grande quantidade de espécies na sua divisão. Atribui-se a origem da cabra doméstica às espécies selvagens do Quaternário, encontrando-se disseminadas por todos os continentes com uma notável concentração na Ásia e norte da África (Tabela 1). Os estudos arqueológicos sugerem que a Capra hircus foi domesticada a partir da Capra aegagrus no Crescente Fértil (ZEDER et al., 2006). Isto foi confirmado em estudos genéticos através de mtDNA (MANCEAU et al., 1999; TAKADA et al., 1997; FERNÁNDEZ et a., 2005; NADERI et al., 2008). Alguns autores, contudo, consideram a Capra aegagrus, a única ascendente das cabras domésticas. Admite-se a origem difilética dos caprinos domésticos, ou seja, descenderiam de duas espécies selvagens: a Capra aegagrus e a Capra falconeri (MIRANDA DO VALE, 1949). 22 Tabela 1. Distribuição geográfica do gênero Capra, de acordo com Shakleton (1997). Espécie Nome Comum Distribuição Geográfica Capra hircus Cabra doméstica Mundial Capra aegragus Cabra Bezoar ou selvagem Cáucaso, Ásia Central e Oriente Próximo Capra falconeri Markhor Himalaia Ocidental Capra caucásica Oeste caucasiano Oeste Cáucaso Capra cylindricornis Leste caucasiano Cáucaso Leste e Central Capra ibex Alpina Ibex Alpes Capra pyrenaica Espanhol Ibex Península Ibérica Capra nubiana Nubiana Ibex Nordeste da África e partes da Arábia Capra sibirica Siberiana Ibex Ásia Central Capra walie Walia Ibex Montanhas do norte da Etiópia Há muitas lacunas no registro fóssil, isso devido à sua rápida taxa de diversificação do gênero Capra, o que explica as dificuldades na obtenção arqueológicas confiáveis e inferências filogenéticas. Como consequência, a taxonomia da Capra continua sob debate, tendo o seu número de espécies e subespécies propostas a mudar constantemente (PEREIRA et al., 2009). Em 2006, apenas nove espécies eram reconhecidas, principalmente, com base em características morfológicas, tais como chifres, características faciais e cores de pelagem, de acordo com Pidancier et al. (2006). Atualmente, IUCN UNEP-WCMC (United Nations Environment Programmes World Conservation Monotoring Centre), estabelece dez espécies do gênero Capra: Capra aegagrus, Capra ibex, Capra falconeri, Capra pyrenaica, Capra cylindricornis, Capra caucásia, Capra nubiana, Capra Sibirica, Capra walie e Capra hircus (INIA, 2010). 23 Características dos ancestrais As espécies do gênero Capra são adaptadas a climas extremos e são encontradas principalmente em áreas de montanhas. O conhecimento dos ancestrais da cabra doméstica foi primordial para a domesticação (MANCEAU et al., 1999). As cabras selvagens vivem em áreas montanhosas, rochosas, com vegetação aberta, arbustiva, acima do estágio da floresta de altitude, com pouca água disponível (EL MUNDO, 2012). Este ambiente é globalmente semiárido, apesar de apresentar fortes chuvas em alguns ecossistemas, com fortes variações de temperatura. Os predadores são, principalmente, o lobo, o leopardo, o lince e a águia (para os jovens nascidos). Esse conjunto de condições determina o comportamento do animal: o gosto para subir, a capacidade de arrancar no início da corrida, a fuga em zig-zag, mas enfrentando o perigo quando necessário, sempre alerta, com o hábito de esconder os filhotes antes deles poderem correr, e o hábito alimentar baseado em folhagem em vez de capim como os ovinos, entre outros (JASEN, 2004). A domesticação tirou progressivamente o animal de seu ambiente natural. Observa-se uma descida para as planícies mais favoráveis à espécie humana. As mudanças de condições ecológicas acarretaram uma adaptação das cabras aos vários ambientes, sempre ao lado dos grupos humanos que as moldaram em função de suas necessidades (MIKERNA et al., 2010). Se, por via de regra, as cabras são criadas numa ótica de produção mista (carne, leite, pele), observa-se também especialização. Por exemplo, a raça Saanen como leiteira em pasto herbáceo, a raça Boer para carne no semiárido temperado, a raça Maradi (no Mali) para a pele no semiárido quente. De um modo geral, o processo de domesticação trouxe mudanças para a espécie domesticada e, quanto maior o nível de domínio sobre ela mais mudanças acontecem. A ponto dos lobos, em determinado momento, terem se tornado um animal diferente, dócil o suficiente para ser mantido em casa. Essas e outras mudanças costumam fazer com que os animais domesticados pareçam drasticamente diferentes de seus ancestrais selvagens (BLONDEL; ARONSON, 1999). Domesticações das cabras Alguns focos de domesticação são citados na literatura, como o rio Eufrates, a Nevali Cori, Turquia (11.000) e as Montanhas Zagros do Irã em Ganj Dareh (10.000) (PETERS; SCHMIDT, 2004; ZEDER, 2000; HIRTS, 2008). Outros possíveis locais 24 incluem a bacia do rio Indus no Paquistão, em Mehrhah (9000), e talvez na Anatólia central e sul do Levante. Outros importantes sítios arqueológicos com evidência para o processo inicial da domesticação da cabra incluem Cayonu, Turquia (8500-8000 a.C.), Tell Abu Hureyra, Síria (8000-7400 a.C.), Jericó, Israel (7500 a.C.) e Ain Ghazal, Jordânia (7600-7500 a.C.) (ZEDER, 2008). Segundo a FAO (2010), com base em pesquisas arqueológicas e de genética molecular, identificaram-se pelo menos 12 grandes centros de domesticação animal. A dispersão dos caprinos, provavelmente, procedeu em diferentes direções. Arqueologicamente, este ponto torna-se mais claro nos vários focos de domesticação que são mostrados na Figura 1. A F C D G H E B Figura 1. Localização geográfica dos principais centros de domesticação da espécie caprina. A-Turquia, B-Paquistão, C- Irã, D- Iraque, E- Anatólia, F- Síria, G- Israel e H- Jordânia. O processo desta domesticação foi marcado pela "invenção" da agricultura e da pecuária. É o início do uso dos animais para alimentação leite, carne, lã e peles para habitação e vestuário, força de tração, fertilização dos solos pelo estrume. Os caprinos e ovinos foram às primeiras espécies a serem domesticadas com o intuito de servirem como alimento (CORREIA, 2004). Ao longo do tempo, os animais utilizados nesse processo foram aqueles que tinham algum tipo de relacionamento social, tal como a 25 capacidade de formar manadas ou rebanhos. Estes eram mais susceptíveis ou mais facilmente domesticados, no que diz respeito a adaptação e agregação no longo prazo com o homem (SHELTON, 1993). Investigações recentes têm evidenciado que a domesticação animal foi um processo gradual, extremamente complexo e que não está ainda completamente esclarecido (ZEDER, 2008). Devido ao fato de que este procedimento, que foi iniciado no passado, e prolonga-se até hoje (FLAMANT, 2002). Ainda de acordo com Flamant (2002), muitos trabalhos tendem demonstrar o processo de domesticação só com base em uma origem econômica e alimentar. Enquanto Jacques Cauvin, arqueólogo especializado em tempos pré-históricos, escreveu vários livros sobre suas pesquisas que em sua investigação sobre o Neolítico do Oriente Próximo (de 12 000 a 6 300 a.C.) e, assim, desenvolveu uma teoria sobre a origem da domesticação dos animais com base no plano social, cultural e simbólico. As pinturas rupestres foram o primeiro sinal que o homem evidenciou seu relacionamento com outros animais. Os animais mais representados são os mamíferos: cavalos selvagens, bisão, veados, ibex (Figura 2), javalis, ursos, grandes felinos, mamutes e rinocerontes. Estes animais representavam o centro da sociedade paleolítica, quer como fonte de alimento, quer por lhes conferirem características ou poderes divinos (SANTANA, 2008). Fonte: http://queridobestiario.blogspot.com.br/ Figura 2. Ibex, 11 000 a.C., Gruta de Niaux, Foix, França. 26 A história revela que as civilizações domesticaram animais, plantas e consequentemente, tiveram mais poder em suas mãos, sendo capazes de espalhar suas culturas e linguagens (DIAMOND, 2002). Em todo o mundo antigo as civilizações domesticaram animais por vários motivos, seja por esses viverem próximos ou pelo que esses animais poderiam fornecer. Alguns destes animais até alcançaram importância religiosa em várias civilizações, como no Antigo Egito, com gatos e boi, ou em Roma, com os cães. Nos Bestiários Medievais, a cabra aparece com ambivalência simbólica bem clara, isto é, podendo originar simultaneamente uma leitura positiva, quando se assume como animal selvagem, mas revestindo-se de uma significação negativa quando tratada como animal doméstico (VARANDAS, 2006). Utilizações da Biologia Molecular para esclarecimento da Domesticação À medida que a ciência avançava, com melhorias das técnicas de pesquisa, principalmente na área da Biologia Molecular, além das descobertas arqueológicas, todas as suposições relatadas poderiam ser reforçadas ou rejeitadas. Diante dessas suposições, sempre é necessário uma análise crítica sobre as diferentes vertentes da domesticação e o seu enquadramento na época estudada (CORREIA, 2004). Nos estudos arqueológicos ocorre constantes debates consideráveis sobre a capacidade para detectar a ocorrência da domesticação e as transições desta na estrutura das populações de uma dada espécie, deixando não esclarecidas questões de como espécies de ancestrais selvagens foram domesticadas e em que grau contribuiu para o patrimônio genético atual (BRUFORD; BRADLEY; LUIKART, 2003). Os marcadores genéticos têm contribuído para esclarecer algumas questões evolutivas e o marcador mitocondrial presente no DNA tem sido a ferramenta mais, amplamente, utilizada em estudos de filogenia e diversidade de populações (LUIKART et al., 2006). A história filogenética dos caprinos domésticos foi estudada através de DNA mitocondrial (mtDNA) por Luikart et al. (2001), Joshi et al. (2004) e Fernandez et al. (2006). Estes estudos demonstraram que os caprinos acompanharam os movimentos migratórios e exploratórios do homem. Luikart et al. (2001), verificaram que a Capra aegagrus, como progenitora da Capra hircus pela maior proximidade, assim como os tipos de DNA do cromossomo Y das Capra aegagrus eram idênticos aos das cabras 27 domésticas. Todos os marcadores genéticos demonstram relação da Capra hircus com a Capra aegagrus (TAKATA et al., 1997; LUIKART et al., 2001; MANNEN, NAGATA, TSUJI, 2001) e esse resultado é coerente com os estudos arqueológicos e morfológicos apresentados por Zeder e Hesse (2000). Os estudos com sequências de mtDNA revelam elevada homogeneidade genética na espécie caprina, mesmo em grupos muito distantes geograficamente, diferentemente do que ocorre em outras espécies, por exemplo, como bovinos e ovinos, em que são encontradas grandes diferenças genéticas entre as populações européias, asiáticas e africanas. A grande semelhança verificada na espécie caprina é resultado do grande fluxo gênico dentro da espécie ao longo do curso da história humana (FERNÁNDEZ et al., 2006). O mtDNA na espécie caprina apresenta um polimorfismo do haplogrupo A (que representa mais de 90% dos haplótipos), sendo demasiadamente elevado para ser o único haplótipo proveniente da domesticação (TABERLET et al., 2011). A análise detalhada do haplogrupo A sugere um número de haplótipos superior a 1.000 por Naderi et al. (2008), apoiando, fortemente, a ausência de gargalo no período da domesticação da espécie caprina, diferentemente do que ocorre na espécie bovina (TABERLET et al., 2011). Definição e formação de raça O conceito de raça surgiu há cerca de 200 anos atrás e este tem servido para categorizar diferentes populações de uma mesma espécie biológica com características hereditárias que permitem agrupá-los entre si e separá-los de outros da mesma espécie. Apesar da raça não ser considerada uma categoria taxonômica formal, não possuindo como tal um significado biológico definido, constitui a base dos trabalhos no âmbito da zootecnia atual (MONTEIRO, 2011). Logo, para que se possa definir um padrão racial, é necessário a descrição das características que permitam a identificação dos indivíduos da raça em questão. Essas características podem ser morfológicas, fisiológicas, comportamentais e econômicas (FERREIRA, 2011). Na maioria dos casos, as raças são nomeadas de acordo com a região geográfica em que se originou (por exemplo, Moxotó), ou para o grupo que os criaram ou, ainda, por alguma característica descritiva (por exemplo, Shorthorn, Red Poll), ou por uma combinação de duas dessas categorias (por exemplo, Rhode Island, Red). Ao mesmo tempo, deve-se ter em mente que as descrições implicavam em um nome que pode ser 28 falso ou enganoso a exemplo da ovelha Negra Persa que não se originou na Pérsia (PORTER, 2002). As raças podem ser formadas de dois modos: espontâneo ou artificial. A primeira é através da seleção natural, onde o meio ambiente seleciona os indivíduos que passarão sua genética adiante, enquanto na seleção artificial o homem seleciona as características que melhor lhe convém para determinada produção. Segundo Domingues (1984) a raça não é um elemento estático, pois é um estágio no seguimento evolutivo de certa população em constante processo de adaptação ao ambiente. Este processo de adaptação às variações ambientais só foi possível graças à variabilidade genética que representa o potencial evolutivo de uma população ou espécie, sendo por isso um fator fundamental da sua sobrevivência á longo prazo (MAUDET, 2001). Para que se estabeleça uma raça é necessário haver evolução, logo, é fundamental existir variação nos caracteres pretendidos, e que esta variabilidade seja transmissível geneticamente (MONTEIRO, 2011). Assim, são necessários três processos: domesticação, seleção e o controle total da raça pelo homem relativo à sua gestão e reconhecimento (RODERO; HERRERA, 2000). Do ponto de vista zootécnico, a caracterização das raças é fundamental para que elas possam ser reconhecidas oficialmente. Ao identificar e caracterizar os indivíduos a ela pertencentes, permitiremos a definição do padrão racial. As características mais utilizadas na definição de uma raça são as morfológicas. Isso não se dá porque sejam mais importantes, mas porque são mais facilmente percebidas e, porque, ao descreverem adequadamente a raça, identificarão os indivíduos que apresentam as demais características que se deseja, mas que são mais difíceis de serem identificadas (RIBEIRO, 2000). Em conservação, a raça é a unidade de estudo. De acordo com a FAO, uma raça consiste num “grupo sub-específico de animais domésticos com características externas identificadoras e definidoras que permitem separá-las, por avaliação visual, de outros grupos semelhantes, que levou à aceitação de sua identidade separada” (FAO, 1999). Já para Sierra Alfranca (2001) está definição esta incompleta, pois em sua percepção faltaria à transmissão dos caracteres a descendência, além de características não estimáveis por observação, mas muito definidoras de uma raça como crescimento, produção leiteira e outros aspectos produtivos. Segundo a FAO “as raças têm sido desenvolvidas de acordo com diferenças geográficas e culturais e para ir ao encontro 29 dos requerimentos humanos de comida e agricultura”. Nesta perspectiva, o aspecto cultural é o principal elemento definidor da raça (SCHERF, 2000). A conservação das raças demanda um grande esforço, que gera benefícios em vários estágios do sistema de produção, além de contribuir para a preservação das tradições, que formam uma parte essencial de nosso legado cultural (BOETTCHER et al., 2010). No novo sistema de classificação de raças desenvolvido para o relatório “Situação Mundial dos Recursos Genéticos Animais para Agricultura e Alimentação”, a distinção principal se faz entre as raças que só ocorrem em um país, chamadas de raças locais, e as que ocorrem em mais de um país, chamadas de raças transfronteiriças. Dentro da categoria de raça transfronteiriça, introduz-se mais uma distinção entre raças transfronteiriças regionais, as que ocorrem em mais de um país dentro de uma única região (ou continente), e as raças transfronteiriças internacionais, as que ocorrem em mais de um país (ou continente) (FAO, 2010). Atualmente, os animais encontrados nos sistemas de produção foram formados ao longo dos séculos, devido a ação do ambiente e das decisões do homem, baseado nas crenças, costumes e necessidades. Foi possível a manifestação de diferenças genéticas embora não tivessem sido criados novos genótipos, sendo essas diferenças selecionadas pelo homem. Estas diferenças genéticas, aliadas à redução da pressão exercida pela seleção natural (LUSH, 1945), determinaram aumento considerável na taxa e na extensão da variabilidade genética (BELYAEV, 1979). Este aumento da variabilidade genética possibilitou a “criação” do elevado número de raças de animais domesticados atualmente existentes (7.616) mesmo que, cerca de 30 % delas sejam classificadas como ameaçadas (FAO, 2010). As raças da espécie caprina contribuem com 12% do número total de raças de mamíferos registradas no mundo FAO (2010), das quais mais de 90% são consideradas locais. Desde a origem do conceito de raça, as populações animais vêm sofrendo fortes pressões de seleção para a normalização da morfologia e desempenho, fragmentados em várias raças bem definidas. Esta fragmentação da população é conhecida por ter efeitos deletérios no longo prazo, aumentando a deriva genética e a endogamia, além de ser um importante elemento em espécies selvagens que conduz a extinção (TABERLET et al., 2011). Nas últimas décadas, tem-se assistido a seleção de um pequeno número de raças consideradas altamente produtivas, que tem causado o declínio de outras raças 30 (MAUDET et al., 2002). De fato, à medida que o processo de domesticação avançou acentuou-se a tendência para a homogeneização e a especialização, tendo-se chegado aos sistemas de produção em estabulação mono raciais (REICHERT, 1982). A produção animal mundial baseia-se, cada vez mais, em um número limitado de raças; além disso, a diversidade genética intrarracial está sendo prejudicada pelo uso de poucos reprodutores, fato que contribui para diminuição do número efetivo e aumento da consaguinidade, duas medidas inversamente proporcionais. Embora os sistemas intensivos de produção sejam mais, facilmente, controlados e explorados, as leis da ecologia impõem ao homem, em contrapartida, o fornecimento de grandes quantidades de energia para que a produtividade se mantenha elevada (SOUZA, 2006). É necessário equilíbrio entre o homem e o ambiente para que se possa produzir de forma a atender às necessidades de mercado e às limitações impostas pelo ambiente. 31 Rotas das raças atuais Saanen Saanen Branca Alemã sub tronco Alpino Parda Alpina Chamoiseé Alpina TRONCO EUROPEU Alpina Francesa Murciana Toggenburg sub tronco Pirineu La Mancha Grahadiana Anglo Nubiana TRONCO AFRICANO Jamnapari Bhuj Angorá TRONCO ASIÁTICO Cashemere Figura 3. Origem e desenvolvimento de algumas Raças Caprinas. Nos três e quatro mil anos iniciais dos eventos da domesticação as cabras foram difundidas pela Europa, África e Ásia. A origem dos caprinos é muito discutível, tendo cada autor a sua opinião. Porém, parece que a maioria dos autores aceita a existência de três troncos: o asiático, o europeu e o africano. Ao tronco europeu pertencia a Capra aegagrus, ao tronco asiático a Capra falconeri e a Capra prisca, e ao tronco africano a Capra nubiana, outra espécie ancestral (ALEMANDRA, 1996). 32 As cabras, em sua forma doméstica, teriam chegado à África através do Oriente Médio. Difundiram-se pelo leste e noroeste africano, enquanto uma parte teria ficado restrita à Ásia e ao Sudão (EPSTEIN; MASON, 1971). Elas se espalharam na Anatólia e Europa a partir do ano de 8.800 a.C. Segundo Pereira e Amorim (2010) houve migrações secundárias no sul da Europa quando fenícios e gregos estabeleceram suas importantes colônias comerciais no Mediterrâneo e durante os períodos romano e muçulmano. As evidências arqueológicas mostram que o homem, através da agricultura, colonizou a Europa por duas vias principais: a rota do Mediterrâneo e a do Danúbio. As raças espanholas atuais tiveram a influência da raça Savana e o tipo Bezoar que é amplamente difundido entre as etnias espanholas. Estando o caprino europeu com dois tipos de tronco, o Alpino e Pirenaico. Os animais foram introduzidos em Portugal pelos vizinhos espanhóis como no caso da raça Serpentina, antigamente chamada de Espanhola ou Castelhana e também conhecida por Raiana como cita Ariano Suassuna (CORREIA, 2004). No final do século XV, o comércio do Velho Mundo teve um grande desenvolvimento ao explorar rotas oceânicas para o sudoeste da Ásia, expandindo com isso o comércio entre o leste e oeste. Depois do conhecimento do sudeste asiático, veio em seguida o sudoeste africano, em 1448 (VARGAS, 1995). A chegada dos portugueses à ilha de Cabo Verde em 1462 é iniciada pelo povoamento com humanos, animais e plantas (CARVALHO; SÁ, 2007). Os primeiros caprinos cabo-verdianos foram oriundos de Portugal, mas é possível que a cabra Saheliana tenha também entrado na constituição da cabra destas ilhas (MACHADO et al., 1998). As explorações guiaram ao descobrimento da América em 1492, o Novo Mundo. As espécies domésticas foram distribuídas e introduzidas do Velho Mundo para o Novo Mundo (LOPES, 1976). Durante o século XVI, as primeiras introduções de animais afetaram particularmente, as Grandes Antilhas, as primeiras terras descobertas por Cristóvão Colombo, que constituíram as principais fontes da repopulação animal nas áreas que incluem o Haiti, Santo Domingo, Cuba, Porto Rico e Jamaica (MARCHECO et al., 2009). Essa dispersão por todo o mundo ocorreu em consequência das viagens migratórias dos vários povos, da ação mercantil, dos conquistadores, muito frequentes na historia da humanidade. A formação das raças caprinas no Brasil não poderia ser diferente do mecanismo que levou à formação das demais raças de cabras no mundo. 33 Os portugueses transportaram animais para o Brasil após a sua descoberta, em 1500 por Pedro Álvares Cabral (PRIMO, 2004). Os primeiros caprinos chegaram ao Brasil, juntamente com outros animais domésticos, apenas em 1534. Na época do descobrimento, não houve registros da presença desses animais nos documentos. Entretanto, alguns fatos justificam a presença do caprino desde a chegada dos portugueses. Um deles é que a família Cabral era admiradora das cabras (Figura 3), e o nome da família Cabral também é sobrenome português toponímico, referindo-se a um “lugar onde há ou pastam cabras”. O registro mais antigo conhecido deste nome é o de Aires Cabral, no tempo do rei D. Diniz, época dos primeiros reis de Portugal, que ocupou os Cabrais, os lugares mais honrados (ALMEIDA, 2010). Fonte: www.projetobrasilurgente.com.br Figura 4. O brasão da família Cabral, com a representação de cabras (animais valentes e leais, comuns na região das Beiras, Portugal) indica que a Família Cabral era influente na Corte Portuguesa. Outro fato é que a presença da espécie caprina está registrada no início da exploração mineira no Brasil, por volta de 1515 – 1540, quando os índios, escravos dos colonizadores utilizavam a pele de cabrito com pelos para reter pedras de ouro ou prata nas saídas de água (SIMONSEN, 1937). A presença dos caprinos foi, primeiramente, relatada por Cardim, em 1583 (MACHADO; CHAKIR; LAUVERGNE, 2000), e sabese que estes animais vieram de Portugal e da Ilha de Cabo Verde (DANTAS SILVA, 1995), uma vez que os barcos procedentes da Europa eram também abastecidos nesta ilha. Estas ilhas podem ter recebido, também, animais da costa Senegalesa. Lima e Loures (2010) ressaltam que as raças europeias que vieram junto com os colonizadores, 34 provavelmente, também sofreram influências de raças africanas, trazidas pelos navios negreiros. Em 1630, veio do Paraguai para São Paulo um grande número de caprinos, desta vez, de linhagem espanhola (MACHADO, 2001). Outras rotas foram, igualmente, importantes para a introdução de animais na América (CAPOTE et al., 2004). Pimenta Filho (1993) cita a contribuição das raças Charnequeira, Murciana e Maltesa na formação dos tipos nativos brasileiros, trazidos pelos portugueses. As raças padronizadas modernas começaram a serem introduzidas depois do século XIX. Até o ano de 1910 não se sabe ao certo quais foram às raças que chegaram ao Brasil, mas a partir de 1925 e até 1937, chegaram 387 animais das raças Toggenburg, vindos da Suíça; Murciana, vindas da Espanha nos anos de 1925, 1927, e 1934 a Angorá e a Nubiana, nos anos de 1927, 1929, 1935, 1936 e 1937, vindas da África do Sul tendo a Nubiana o maior número de animais dentre as demais raças (RIBEIRO et al., 2004) e as vindas dos Estados Unidos a partir de 1994. Segundo Pinheiro Junior (1973), as primeiras importações de caprinos da raça Bhuj foram feitas por criadores de Pernambuco, cujos animais, provenientes da Índia, foram levados para o território de Fernando de Noronha, porém, não é conhecida a data exata de entrada. O caprino Bhuj foi registrado no Ceará no ano de 1958, com animais vindos de Pernambuco e oriundos de Fernando de Noronha (ARAÚJO, 1979). Em 1975, o segundo Plano Nacional de Desenvolvimento proibiu a importação de queijo de leite de cabra, entre outros produtos, o que permitiu o desenvolvimento de uma criação de caprinos leiteiros com a importação das raças Anglo-Nubiana, Alpina, Saanen e Toggenbourg (MACHADO, 1984). Outras raças como Angorá, Alpina, Jamnapari, Murciana, Boer, Bhuj, Manbrina, entre outras, foram introduzidas ao longo dos anos no rebanho nacional. A importação da raça Boer e Anglo-Nubiana foram realizadas oficialmente em 1994. Esses animais ficaram em quarentena na estação experimental de Tacima na Paraíba (EMEPA). Na introdução da raça Boer foi realizada através de varias formas, como: sêmen, embriões e animais vivos provenientes da Alemanha, França, África do Sul e dos Estados Unidos e, ainda, da importação de Savana pela Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária (EMEPA) (PIRES, 2011). Em 1986, o criador Ronaldo Carneiro da Rocha importou, da Suíça, um pequeno lote de animais tidos como Grisona que ficou no Rio de Janeiro, tendo depois um reprodutor da raça seguido para um rebanho na Bahia (Asccorper). Em 1988 chegaram as primeiras Alpinas Britânicas ao Brasil (O Berro, 1988). Foram importados 11 fêmeas e 5 machos 35 da raça Alpina Britânica pelo patrocínio de Paulo Roberto de Miranda Leite, da EMEPA (PB), do cônsul inglês e a Associação dos Criadores na Inglaterra. A importação de raças exóticas, selecionadas em regiões de clima temperado, no início do século XX, levou a uma drástica substituição das raças nativas (EGITO; MARIANTE; ALBUQUERQUE, 2002). Como não houve trabalho paralelo de conservação e melhoramento genético dos caprinos locais, a maioria das ações com intuito de produzir animais produtivos e adaptados falhou. Pinheiro Junior (1947), já relatava que as tentativas de melhorar os rebanhos caprinos com estas importações não alcançaram o resultado esperado, um exemplo ocorreu em Pernambuco, onde alguns animais só se reproduziam na Zona da Mata e Agreste, não conseguindo se reproduzir no Sertão. Como a utilização de raças exóticas enfrentou dificuldades por razões de adaptabilidade procedeu-se ao cruzamento destas com raças locais, com consequente descaracterização racial das cabras brasileiras. Isso tem provocado várias ameaças à diversidade genética de nossas raças caprinas, a mais significativa talvez seja a marginalização de sistemas tradicionais de produção e das raças locais, motivada, sobretudo pela pecuária intensiva, utilizando-se um reduzido número de raças de alto rendimento, o que tende a estreitar a diversidade genética entre e dentro de raças. O exemplo desse fato é a raça caprina mais difundida no mundo, a Saanen que é encontrada em pelo menos 81 países (FAO, 2010). Atualmente, a região Semiárida Brasileira possui o maior rebanho de cabras do Brasil. Este fica quase todo concentrado nas mãos de pequenos criadores e composto de animais, na sua maioria, sem padrão racial definido, resultantes dos cruzamentos entre diferentes caprinos trazidos para o país (ARAÚJO et al., 2006), mas as semelhanças entre estes animais e os caprinos da Península Ibérica são ainda notórias (Figura 4). Egito et al. (2002) faz referência às semelhanças fenotípicas da raça Moxotó com a raça portuguesa Serpentina. Com base nessas semelhanças foi realizado um estudo genético molecular realizado por Oliveira et al. (2010), observaram que a raça Moxotó apesar da semelhança fenotípica com a raça Serpentina de Portugal os estudos genéticos indicam que são raças distintas. Isso valoriza a raça como patrimônio do Brasil. . 36 Raça Serrana Raça Serpentina Raça Alpina Britânica Raça Azul Raça Moxotó Raça Canindé Figura 5. Caprinos ibéricos (lado esquerdo) e brasileiros (lado direito). Vários escritores relatam a presença do caprino ao longo das décadas, principalmente na região do Nordeste Brasileiro. Segundo Monteiro (2004), na década de 20 e 30 havia a presença do caprino na paisagem em meio ao cangaço, retratando sua importância social e econômica. Domingues (1955) relata que na década de 50 eram encontrados mestiços das raças exóticas e locais, entretanto, a predominância remanescente era de ecótipos nativos no sertão, além de formas étnicas distintas, capazes de servirem a um trabalho de seleção. Nesta época, ocorreu a primeira tentativa de conservar as raças locais no Nordeste e, dentre os caprinos estavam os da raça Moxotó e os tipos Marota e Repartida, que eram os mais comuns na época (DOMINGUES et al., 1954). Nem sempre os relatos sobre os caprinos eram positivos. Desde a sua introdução no século XVI, eram desprestigiados e, genericamente eram 37 chamados de “miunças”, termo relacionado ao pequeno porte e a sua menor importância econômica. Nobre, Amaral e Pinheiro (2007) descrevem que a atividade da caprinoovinocultura era vista como uma prática denominada de “teimosia de pobre”, tida como uma atividade sem futuro e sem importância econômica. Nos domínios da grande lavoura, cabras, assim como outros animais domésticos de pequeno porte, chegam a ser considerados como “criaturas inúteis”. Mais que isso, os caprinos eram vistos como inimigos da cana e deveriam ser evitados como forma de se prevenir contra danos às lavouras, já que bastava que começasse o brotamento no campo trabalhado que lá iam elas investirem contra as plantas, alimentando-se (FREYRE, 1973). Este desprestígio da caprinocultura é, também, descrito em outros países. Pomponet (2009) relata o que aconteceu na Espanha, em 1826, quando se determinou uma “matança geral de cabras”, sob a alegação de que o animal poderia causar danos às florestas, o que, posteriormente, se concluiu não ter fundamento. Na Itália uma das mais significativas disposições, a da República de Veneza de 1972, na qual, proibia as cabras, sob a pena de matança imediata dos animais (GAUTIERI, 1816). Já nos Estados Unidos, os caprinocultores eram ridicularizados. Dizia-se que o animal era predador e malcheiroso. Somente entre os franceses existe algum reconhecimento, já que é definida como “vaca democrática”, por ser uma cria acessível a, praticamente, todos os camponeses, inclusive aos mais pobres (CASTRO, 1984). Mais recentemente, os caprinos passaram a ser vistos de outra forma devido ao reconhecimento da adaptação à região Semiárida, a capacidade produtiva, e reprodutiva adequada à área a qual foram moldados, além de ser uma atividade transformadora do quadro social. Atualmente, estão distribuídos em rebanhos particulares e públicos, sendo em maior número as raças Moxotó e Canindé (RIBEIRO et al., 2004). Caprinos do Brasil O Brasil possui um efetivo de 9.312.784 cabeças de caprinos, dos quais 8.458.578 estão na região Nordeste (IBGE, 2010). Quando comparamos com o ano de 2007 o efetivo caprino foi reduzido em 137.528 no rebanho nacional. Os maiores estados produtores são Bahia, Pernambuco, Piauí e Ceará, com uma participação no efetivo nacional de 75,1% revelando o potencial que a região possui para o 38 desenvolvimento de políticas associadas à organização do setor de recursos genéticos locais, dados baseados no IBGE (2010). A maioria dos caprinos é criado em sistema extensivo, quase sempre nas terras mais pobres da propriedade rural. Assim, fixam as populações rurais no campo e são considerados de múltipla função (GONÇALVES JÚNIOR, 2012). A caprinocultura vem aumentando sua participação no agronegócio brasileiro e a tendência é de que se mantenham em expansão. Vários fatores nos cenários nacional e internacional mostram essa vertente. A mudança de atitude da população abastecida no que se refere à alimentação é um exemplo. Como a carne caprina é uma das mais magras, superando, inclusive, a de frango, tem conquistado mais adeptos. As estratégias de conquistas de novos mercados, também, podem impulsionar o consumo mundial desse tipo de carne (MAPA, 2012). O leite de cabra não é diferente em suas qualidades e é classificado como alimento funcional, pois além de ser ótimo alimento, participar da manutenção da saúde, reduzir doenças crônicas também tem efeitos benéficos nas funções fisiológicas (OSMARI, 2006). Além de ser conhecida a sua alta digestibilidade, é utilizado por indivíduos com problemas alérgicos ao leite de vaca (OSMARI, 2006). Outro produto importante fornecido pela espécie caprina é a pele, que desde o princípio da domesticação revelam sua importância econômica na sociedade. A pele era utilizada para a escrita religiosa, os manuscritos e também foi usado pelos militares romanos para a construção de escudos de batalha e sandálias. Os cristãos, judeus e muçulmanos a utilizavam para tendas, cortinas, ofertas de presentes e sacrifícios (LUIKART et al., 2006). Hoje, considerada muitas vezes um subproduto ou um produto secundário da carne, segundo Rey et al. (2007), a pele pode contribuir com cerca de 8% do valor da carcaça na venda animal. Segundo Barros (1987), numa avaliação das raças nativas caprinas brasileiras, já classificou estas como, preferentemente, produtoras de pele. As diversas possibilidades dos produtos de origem caprina, bem como as raças permitem o desenvolvimento de regiões, em especial a semiárida, a forma de garantir a sobrevivência dessas é torná-las competitivas. Para que esse sistema se mantenha produtivo e rentável é necessário conhecer as potencialidades das raças para pode-se explorar de forma eficiente os seus produtos, agregando valor ao sistema de produção natural. Assim, a produção de animais locais seria uma alternativa economicamente interessante, a partir do momento que for conseguida a valorização com produtos 39 certificados, como a que acontece com os produtos da península Ibérica (ALMEIDA; MORAIS, 2001). O Brasil tem uma grande diversidade de Recursos Genéticos Animais (RGAn), representada por onze raças locais da espécie caprina, distribuída num vasto espaço territorial, resultado da enorme variedade de condições ambientais e nichos ecológicos específicos. A grande variedade de raças existentes no Brasil é fruto da interação positiva entre os criadores e o meio ambiente. Desde o início da agropecuária no país, os produtores buscaram um sistema de criação onde a melhor progênie fosse escolhida com intuito de aumentar a produção. Mas nem sempre esta escolha foi a melhor para se alcançar os objetivos de uma produção sustentável no seu sentido amplo (EGITO; MARIANTE; ALBUQUERQUE, 2002). As raças caprinas criadas no Brasil podem ser classificadas de duas formas, de acordo com sua origem: locais ou exóticas. O termo “local” será usado quando a raça foi desenvolvida na região, possuindo combinações genéticas que lhe confere adaptação ao ambiente onde se formaram. Essa adaptação a certos ambientes e adversidades quando comparadas a outras raças é retrata em alguns estudos (MARIANTE; EGITO; ALBUQUERQUE, 1999; RIBEIRO et al., 2004). Apesar de apresentarem níveis produtivos mais reduzidos, constituem, muitas vezes, um recurso socioeconômico que permite manter as populações rurais em regiões mais desfavorecidas (GAMA et al., 2004), particularmente, orientado pela sua adaptabilidade, para o aproveitamento dos recursos agrosilvopastoris existentes. O termo “exótico”, por conseguinte, é utilizado para denominar as raças comerciais que foram importadas a partir do século XX. Entre os caprinos são, oficialmente, reconhecidas apenas duas raças (Canindé e Moxotó), enquanto as demais raças locais ainda não homologadas (Marota, Azul, Gurgueia, Repartida, Graúna, Meridional, Nambi, Crespa e Biritinga). O reconhecimento oficial de um grupo genético como raça é um elemento importante para a conservação da referida raça. A maioria das raças locais tem seus números efetivos muitos reduzidos, apresentam consanguinidade devido ao fato de não haver renovação periódica dos reprodutores, aumentando esta taxa a cada geração. Os rebanhos de caprinos locais, em sua maior parte, são populações fechadas e encontram-se ameaçados de extinção. Para identificação das raças ou populações em perigo de extinção, podem-se listar cinco argumentos da conservação: manutenção de 40 populações reservas; manutenção de variabilidade genética para a produção animal; aumentar o conhecimento sob todos os aspectos da biologia animal e a manutenção de raças; variedades e rebanhos, por razões históricas, culturais e educacionais (SILVA, RIBEIRO; LIMA, 2010). As Raças Caprinas estudadas Raça Canindé Origem: Zona de Canindé nos estados de Piauí e Ceará (Rio Canindé). A cabra Canindé é também conhecida como Calindé. Características raciais Pelagem: castanho escura a preta por todo o corpo, exceto no ventre; o períneo tem pelos curtos e finos. Variedade da Canindé vermelha, avermelhada ou castanha. Altura: machos: 60 cm e fêmeas 50 cm (média). Características zootécnicas: apresenta certa aptidão leiteira acima da media das cabras nacionais, boa produção de carne, pele e esterco. Pele: excelente qualidade Peso: machos: acima de 40 e fêmeas: 25-30 Kg. Obteve o Livro de Registro e foi reconhecida como raça apenas em 1999. Histórico – Filogeneticamente, a cabra Canindé (ou Calindé) tem sua origem no grupamento ilustrado pela Grisone Negra, da Suíça, de onde derivaram a "British Alpine" e a "Poitevine". Segregada no Nordeste brasileiro desde o período colonial, 41 conforme bem o determina seu próprio nome, logrou consolidar um tipo específico no Semiárido (BOLETIM PECUÁRIO). Etimologicamente, a denominação "Calindé" deriva do nome da tanga branca, de algodão rústico, usada pelos escravos africanos, a qual recebia o nome de "Calindé". O negro escravo vestia sua "Calindé" da mesma maneira que essa cabra também vestia sua "Calindé", ou seja, ambos ostentavam a parte baixa do corpo em coloração branca, mantendo-se o restante negro. A cabra "Calindé", portanto, era a cabra do escravo alforriado por Fauna brasileira (2008). Alguns historiadores acreditam que as cabras recebiam o nome "Canindé" devido a região do rio Canindé, no Piauí, ou mesmo devido á "faca afiada" que o sertanejo piauiense sempre utilizou na cinta (O Berro, 1988). De fato, naquela região foram encontrados alguns poucos animais negros de barriga vermelha. Não foram encontrados, todavia, registros de rebanho ou de proprietários de cabras de barriga vermelha ou branca, que justificassem a adoção do nome "Canindé" de forma ampla. Quanto a significação de 'Canindé" como "peixeira" ou "faca afiada" é desprezível, dado o desvelo do sertanejo para com suas cabras (AGROCAVE). Foi descrita pela primeira vez em 1915 por Ingleses no estado do Piauí (CASTRO, 1984). Um dos primeiros trabalhos na raça Canindé ou "Calindé" foi o de João Batista de Andrade (Joãozito Andrade), da Fazenda Trindade, em Jeremoabo (BA), na década de 1970. O método utilizado foi por meio de consanguinidade e pelo uso intensivo de homólogas européias, seguindo a linha já utilizada por Manuel Dantas Vilar Filho, da Fazenda Carnaúba (Taperoá, PB) para regenerar as cabras pardas e brancas sertanejas (BOLETIM PECUÁRIO). Atualmente, o Canindé é um caprino encontrado nos estados do Piauí, Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Ceará e Paraíba. Os animais da raça Canindé são, em geral, explorados para dupla função carne – leite. O regime de exploração predominante é o extensivo, caracterizado por longos períodos de carência alimentar. No entanto, alguns criadores interessados no aumento da produção, procedem à suplementação dos animais, utilizando normalmente feno e palha. 42 Raça Moxotó Origem: Vale do Moxotó no município de Ibimirim em PE. A cabra Moxotó é também chamada de “Lombo Preto”. Características raciais: Pelagem: cor baia e suas tonalidades, até o lavado; linha dorso lombar com faixa preta (terço médio pescoço à cauda). Pelos pretos na região do ventre, nas faces internas dos membros, região perineal, úbere e canela. Linhas pretas nas faces laterais da maxilar, presença de óculos, e linhas que saem da inserção dos chifres indo à nuca. Altura: machos: 71 cm e fêmeas: 62 cm. Cabeça: perfil reto, chanfro seco e com bordas retilíneas quando visto frontalmente. Presença ou não de brincos. Mocho desclassifica. Características zootécnicas: Produção de leite baixa (0,3-0,4 Kg/dia) Peso: machos: acima de 36 Kg e fêmeas: 30-34 Kg. Partos duplos em 40% dos casos. Pele preta e fina além da produção de esterco. A raça Moxotó é a mais antiga oficialmente reconhecida desde 1977. Histórico – Provavelmente originou-se da Charnequeira e Serpentina ambas Alentejanas, sendo a primeira um ecótipo e a segunda considerada uma raça (Menezes, 2005). Alguns autores afirmam ser oriunda de cruzamentos de Alpina Francesa e cabras brancas nativas descentes da época da colonização. A origem do nome Moxotó vem do Vale do Rio Moxotó em Ibimirim no Estado de Pernambuco, foi Renato Faria quem descreveu a raça em 1937, identificando-a com 43 este nome. Hoje é encontrada nos estados de Piauí, Ceará, Bahia, Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte. No início das décadas de 30 e 40 eram encontrados da ilha de Marajó, do Pará a Pernambuco (DOMINGUES, 1942). Explorados de forma extensiva, devido a sua grande rusticidade estes efetivos realizam o pastoreio na caatinga, através da região mais agreste, periodicamente, são recolhidos e presos em currais, quando isto não ocorre abrigam-se em rochedos perto das povoações. Barros et al (2011) relata um sistema de uso comum de recursos, com animais soltos na caatinga, não representando problema para o manejo da raça Moxotó e tem sido pratica normal ao longo de anos no centro de origem. Raça Marota Origem: vale do São Francisco entre os sertões da Bahia e Pernambuco. Características raciais: Pelagem: pelos curtos e brancos, pele clara e alguma pigmentação na cauda e face interna das orelhas. Altura: acima de 50 cm. Cabeça: ligeiramente grande e vigorosa. Chifres desenvolvidos e divergentes desde a base, para cima, para trás e para fora. Orelhas pequenas e com pontas arredondadas. Características zootécnicas: Peso: acima de 35 Kg Pele: macia e flexível. A raça Marota, também denominada Curaçá, é descendente dos tipos raciais trazidos pelos colonizadores, como todas as demais raças nativas de caprinos aqui existentes, apesar de não se ter ainda estudos que comprovem essa origem (BARROS et 44 al., 2011). Por falta de um conhecimento mais profundo sobre sua importância zootécnica e até mesmo histórico-cultural, essa raça está desde muitos anos seriamente ameaçada de extinção (DOMINGUES, 1955; ARAÚJO, 1979). Esta raça encontra-se o último rebanho no núcleo de Conservação da Embrapa Meio-Norte, na cidade de Castelo no Piauí-PI. O rebanho foi formado no ano de 1982 através da iniciativa dos conservacionistas Luís Pinto Medeiros e José Herculano de Carvalho, pesquisadores da Embrapa Meio-Norte que por mais de vinte anos tentam manter a integridade do rebanho (ALMEIDA, 2007). Raça Azul Origem: Na África e Portugal, encontrada na região do Cariri Paraibano. Características raciais Pelagem: A pelagem é azulada, ou cinza-azulada, podendo apresentar as extremidades bastante escuras. Algumas apresentam o debrum (contorno fortificado) da orelha também escuro. A grande maioria apresenta uma "estrela" clara na testa. Altura: acima de 50 cm. Cabeça: vigorosa com chanfro seco. Chifres desenvolvidos e divergentes desde a base, para cima, para trás e para fora. Orelhas pequenas e com pontas arredondadas. Características zootécnicas: Peso: acima de 35 Kg Aptidão: leite Pele: macia e flexível. A pele é escura, as mucosas nasal e perineal são negras ou em tom cinza-escuro. 45 A Cabra Azul brasileira apresenta o pelo mais azul do mundo. Encontrada em pequena quantidade na Paraíba, Rio Grande do Norte, Pernambuco e Piauí. Os sertanejos têm grande apreço pelas cabras azuis, sendo muitas de boa aptidão leiteira, recebendo muitos nomes: azulega, zulanha, cabra-da-serra, azulona, azula e etc. É conhecida pela sua rusticidade e docilidade, muitos sertanejos pela tradição penduram chocalhos nelas por serem excelentes guias de rebanhos. Em alguns países como nos Estados Unidos, as cabras azuis são criadas como bicho de estimação (pets), no Brasil esta cresceu na Caatinga sendo de produção com grande possibilidade de progredir na região de catingueira (O BERRO, 2001). Raça Saanen Origem: Vale Saanen na Suíça. É, a raça leiteira mais famosa do mundo. Tem contribuído para a formação e/ou melhoramento de muitas outras raças caprinas leiteiras. É muito apreciada na Europa, Estados Unidos e outros países. Características raciais: Pelagem: Animais com pelos curtos, brancos a creme, predominantemente lisos e bem implantados. Altura: machos: 80-90 cm e fêmeas: 70 a 83 cm Corpo: animais longilíneos, descarnados e angulosos. Ventre profundo, dorso reto e lombo bem desenvolvido, com garupa ampla, membros delicados, mas fortes. Cabeça: leve, perfil retilíneo a côncavo, orelhas pequenas a médias e eretas, presença de brincos. Características Zootécnicas: Produção de leite: 520 a 920 Kg/lactação (250 a 302 dias) Peso: machos: 70-90 Kg e fêmeas: 45-60 Kg 46 Os animais são de aptidão leiteira e altamente produtivas, explorados de forma intensiva a semi-intensiva no Brasil. É uma das raças leiteiras mais usadas em cruzamentos com o intuito de aumento de produção, principalmente no Sul e Sudeste do país. Comercializada para inúmeros países por todo o mundo, no âmbito de programas de melhoramento, sendo uma das raças mais difundidas a nível mundial (LUIKART et al., 1999). É considerada uma raça cosmopolita. Raça Alpina Britânica Origem: A raça foi desenvolvida na Grã Bretanha no início de 1900 a partir de uma importação de caprinos alpinos tipo "Black Swiss" da Suíça, feita pela Inglaterra e utilizada em cruzamentos absorventes em cabras locais, iniciado em 1911. Características raciais: Pelagem: pelos curtos e finos, na grande maioria do corpo mas, às vezes, compridos no dorso e flancos, de cor preta; porém branca no ventre, parte interior dos membros e inferior da cauda, além de duas faixas brancas de cada lado do chanfro. Altura: machos: 85-1, 10 cm e fêmeas: 75 a 90 cm Corpo: animais longilíneos, descarnados e angulosos. Cabeça: com perfil retilíneo, fronte larga, orelhas levantadas de tamanho médio. Características Zootécnicas: Produção de leite: 515 a 634 Kg/lactação (280 a 305 dias) Peso: machos: 70-100 Kg e fêmeas: 55-70 Kg A Alpina Britânica especializada para a produção de leite chegou ao Brasil na década de 90 e conta com poucos criadores. Esta raça é principalmente utilizada na 47 “regeneração leiteira” para cabras do tipo Caimbé. Explorada de forma intensiva e semiintensiva (BERRO). Registro Genealógico de Caprinos e Associações A Lei Federal de nº. 4.716 de 29 de junho de 1965 foi complementada pelo Decreto nº. 58.984 de 3 de agosto de 1966 que regulamenta a execução dos Serviços de Registro Genealógico no Brasil. O Serviço de Registro Genealógico das Raças Caprinas – SRGC possui contrato de delegação com o Ministério da Agricultura da Pesca e do Abastecimento, desde 1975, e é mantido pela Associação Brasileira de Criadores de Caprinos – ABCC. O Registro Genealógico comprova tanto a ascendência quanto a descendência dos animais, além de sua idade, criatório de origem e, indiretamente, seu desempenho reprodutivo. Deste modo, a identificação individual se torna a melhor forma de registrar toda a informação praticada e útil para uma boa gestão da exploração (RIBEIRO, 1997). “O registro genealógico, juntamente, com o padrão racial é importante para o desenvolvimento organizado da produção dos caprinos domésticos, além de agregar valor comercial aos animais. Evidencia-se que, muitas vezes, o negócio vinculado a esses parâmetros têm-se mostrado muito lucrativo apesar de representar, apenas, uma pequena fatia do mercado, superando mesmo a própria renda obtida com os produtos primários oriundos da exploração dos animais como fontes de leite, de carne e peles ou lã. Daí cria-se um contraste entre a importância do registro genealógico e as potencialidades produtivas, real e potencial, das raças ou tipos raciais quando explorados racionalmente. Ainda, muitas vezes, surgem impasses entre os que trabalham na direção de maximizar a produção e aqueles que representam as Associações de Criadores e, às vezes, uma minoria de filiados, ditos selecionadores. Ressalta-se que estes, na maioria das vezes, consideram o controle ou o registro genealógico definitivo como elemento único para proceder à seleção dos indivíduos em detrimento de componentes produtivos, como o 48 desenvolvimento ponderal, a precocidade sexual, o perímetro escrotal, a taxa de ovulação à puberdade, o desempenho em prova de ganho de peso, a habilidade materna, a produção total de leite, a qualidade do leite, dentre outros. Sem dúvida, esta conduta prejudica o desenvolvimento e a sustentabilidade da caprinocultura no sentido de que ela ocupe o seu real papel no agronegócio brasileiro e, possivelmente, mundial” (ARAÚJO; SIMPLÍCIO, 2002). O número de animais registrados no registro genealógico definitivo das raças Canindé e Moxotó é muito reduzido, não passando de algumas centenas. Em um estudo preliminar, Silva et al. (2010) expõem o pequeno número de animais registrados das duas raças nacionais ao longo dos anos e o baixo efetivo de 378 e 475 animais das raças Canindé e Moxotó, respectivamente. Estes valores apontam o risco a que estas raças estão submetidas. As raças locais, tais como Marota, Repartida, Gurgueia e outras, serão enquadradas para fins de registro somente quando forem oficializadas como raça. Se partirmos do conceito de que raça é um grupo genético distinto, com semelhanças hereditárias, já se justifica enquadrá-las como raça e promover iniciativas de estabelecer o registro genealógico desses caprinos locais, porque zootecnicamente são raças (ARAÚJO; SIMPLÍCIO, 2002). O que falta é a homologação para que as mesmas sejam reconhecidas oficialmente. É através de associações que os criadores de uma mesma raça conseguem ficar ativo, isso tradicionalmente. Quando há associações de raça os grupos de criadores que façam parte desta, devem buscar aprimorar suas ações, incentivando a criação seletiva e promovendo a raça, pois os esforços deste grupo serão de manter a raça pura e conservar a variação existente (FAO, 2001). As associações, para se manterem ativas, são dependentes das contribuições dos membros, o que acontece muitas vezes na prática é que uma raça rara, com um ou poucos criadores, não oferece suporte para continuar. Nesta situação, organizações em rede podem ser muito eficazes na prestação de assistência aos membros (HENSON, 1984). As organizações e associações de criadores de raças autóctones são poucas e muitas vezes inexistentes, especialmente, no setor familiar. As poucas associações 49 existentes não estão a participar, plenamente, no desenvolvimento e promoção de RGAn locais por causa da falta de incentivos (nicho de mercado, rotulagem, certificação para o uso sustentável dos RGAn locais (TAWONEZVI, 1999). Pesquisa e desenvolvimento dos RGAn locais são necessárias para melhorar a compreensão de seu valor, bem como promover a sua utilização. Também falta apoio institucional para as comunidades envolvidas nas RGAn, em termos de orientação de mercado e serviços técnicos (FAO, 2010). Desde 1997, os agricultores em Botswana se organizam em uma associação de pequenos produtores de ruminantes, especificamente, para apoiar e implementar programas de conservação da integridade genética dos ovinos e caprinos daquele país. Esse programa pode ser estendido na seleção dentro das raças (SETSHWELO, 2001). Aglomerar-se em associações gera um ganho na eficiência e na flexibilidade que são raramente atingidas por pequenos criadores, se estiverem dispersos. A articulação dos sujeitos locais como empreendedores públicos e privados, produtores de bens, serviços e cultura poderá fortalecer tanto a sua autonomia quanto produzir um projeto estratégico de desenvolvimento regional e de inserção cooperativa e interdependente. Quando se tem informações sobre as várias raças a tomada de decisões políticas para a conservação e gestão desses recursos é agilizada (GANEM, 2011). Segundo Setshwelo (2001), em Botswana, 50% do gado são constituído de raças locais, e dessas 75% são geridos pelos pequenos produtores. Esta mesma autora comenta que, às vezes, por questões políticas, um mesmo recurso genético em regiões diferentes, mesmo que próximas geograficamente, como é o caso de Botswana com a África do Sul, gerem seus recursos genéticos de forma distinta. Em Botswana um determinado grupo caprino é considerado como raça, enquanto este mesmo grupo ao passar pela fronteira e estando na África do Sul já não será tido como tal. Marcadores Moleculares O termo marcador indica que sua função é identificar ou “etiquetar” algo (RAMALHO, 2008) e, no caso dos marcadores genéticos são utilizados para marcar alelos cuja expressão é de difícil identificação. Existe DNA em duas diferentes partes das células dos mamíferos, no núcleo e na mitocôndria, sendo denominados de nuclear e de mitocondrial, respectivamente, ambos 50 constituindo o DNA total. Com base nestes, é possível estudar a ancestralidade materna (marcadores uniparentais do DNA mitocondrial) e a paterna (marcadores uniparentais do cromossomo Y) assim como a ancestralidade genômica (marcador biparental autossômico) (CAVALCANTE NETO, 2010). Os marcadores moleculares são características de DNA, herdadas geneticamente, que servem como base para diferenciar um ou mais indivíduos. Estas características, as marcas, são alterações na sequência de nucleotídeos na molécula de DNA, denominada de polimorfismo, a maioria dessas alterações são estáveis e não acarretam em mudanças fenotípicas. Segundo Dias-Salman, Giachetto e Malago (2009), isto favorece a tolerâncias pelo indivíduo à transmissão para os descendentes e a fixação do polimorfismo dentro de uma população, com exceção de gêmeos idênticos. Os primeiros marcadores considerados modernos foram as isoenzimas, por volta dos anos 50. A partir dos anos 80 houve a grande mudança na utilização dos marcadores genéticos, passando do proteico para os de DNA. Esses novos marcadores agora possuem um maior potencial pelo genoma já que opera no DNA, na informação genética, livre de interferências do ambiente e herdada, trata-se do sistema mais direto. A partir daí, descobriram uma série de métodos, seguidos cronologicamente, pelos marcadores moleculares RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism Botstein et al., (1980), RADAP – Randon Amplified Polymorphic DNA Williams et al. (1990), microssatélite Litt e Luty, (1989), AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism (VOS et al., 1995). O auge da utilização de marcadores de DNA só foi alcançado em 1985 devido à descoberta da PCR (Polimerase Chain Reaction), por Kary Mullis. A PCR permitiu replicar regiões concretas de uma cadeia de DNA gerando um número muito elevado de cópias do fragmento inicial. Esta técnica foi possível graças ao descobrimento de uma polimerase termoestável, obtida a partir da bactéria Thermus aquaticus (SAIK et al., 1985). Dentre as variações da técnica de análise de polimorfismos no DNA, as mais utilizadas, tanto por motivos de maior confiabilidade quanto por um menor custo, tempo reduzido, dentre outras particularidades, estão: Single Nucleotide Polymorphism (SNP), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), SequenceCharacterized Amplified Regions (SCAR), Restriction Fragment Length Polymorphism DNA (RFLP), DNA Satélite, Minissatélites ou Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), Microssatélites ou short tandem repeats (STRs), Combinação entre SNPs e 51 STRs/microssatélites (SNPSTR), Short Insterspersed Elements (SINEs) e Haploides nos Microssatélites (HAPSR) (SEIXAS, 2011). A técnica de marcadores vem permitindo determinar pontos de referência nos cromossomos capazes de diferenciar indivíduos. Os marcadores podem diferir quanto ao tipo de herança, a abundância dentro do genoma, ao nível de polimorfismo e informação genética detectada, a especificidade dos locos, a reprodutibilidade e ao investimento técnico e financeiro. O uso desses é primordial tanto nos estudos de conservação como nos de melhoramento genético, pois auxiliam no conhecimento e gerenciamento da espécie (ODALIA-RÍMOLI et al., 2000). Entre os pequenos ruminantes temos a espécie caprina que concorre para um importante agronegócio mundial e com muitas características biológicas únicas. A caprinocultura é um importante recurso econômico, principalmente, em muitos países em desenvolvimento ao redor do mundo. No entanto, apesar da sua importância, o estudo de melhoramento genético caprino tem sido dificultado pela falta de uma referência na sequência do genoma de alta qualidade. Agora, com a recente conclusão da sequência do genoma caprino (SHENZHEN, 2012) será facilitada a identificação de marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) para produção assistida por marcadores e melhorará a utilidade da cabra como um modelo biomédico. A diversidade biológica nos caprinos locais tem sido alvo de estudos, por serem considerados adaptados a áreas específicas bem como devido à importância social, econômica e cultural para as populações que ocupam essas áreas. As raças locais detém uma valiosa combinação de genes que poderão atender as necessidades da produção animal nos diferentes cenários que surgirem (ROCHA, 2009). A variabilidade genética é o material inicial e necessário para a seleção animal. A partir dela é possível moldar as espécies de interesse zootécnico de acordo com preferências e necessidades da pecuária atual, além de ser a base da evolução de todas as espécies. Em estudos evolutivos, a frequência na qual os alelos de um gene ocorrem em diferentes populações é usada para inferir relações de parentesco. As frequências genotípicas e alélicas permitem estabelecer coeficiente de diversidade genética entre populações e da estrutura genética das mesmas (MACHADO, 2003). Apesar da informação da caracterização genética de caprinos ter aumentado nos últimos anos, esta ainda é escassa, quando comparada com outras espécies como, por exemplo, a bovina. Gama e Bressan (2011) comentam sobre a falta de informação de muitas raças caprinas, tanto em termos de caracterização molecular, bem como no que diz respeito às suas características fenotípicas, sistemas de produção, distribuição 52 geográfica e socioeconômica e importância cultural. Apesar dos avanços da genética molecular, no Brasil os trabalhos com genes expressos e polimorfismo são limitados. A coleção de Etiquetas de sequencia expressa (ESTs) para caprinos hoje conta com EST 14236, quando em 2007 contava com apenas 637 vista por Coutinho et al., (2007). Um aumento representativo, porém ainda muito baixo quando comparado com as demais espécies domésticas, bovinos, aves e suínos. A coleção de EST obtidas para bovinos (Bos taurus), depositada no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), no Banco de Dados para etiquetas de sequencia expressa (dbEST), já totaliza mais 1.613.441 e para suínos (Sus scrofa) mais 1.672.966, baseados nos dados do NCBI, 2013. Os marcadores moleculares são caracteres qualitativos com herança mendeliana simples, facilmente reconhecida e cuja expressão não é influenciada pelo meio. Os já descritos são inserções e deleções (indels), os polimorfismo de base única (SNPS, single nucleotide polymorphism) e as regiões repetitivas (GARCIA, 2006). Estes marcadores abriram com maior clareza as informações sobre questões de variabilidade, relacionamento ou discriminação de indivíduos numa população, das diferentes relações entre populações e diferenças entre raças e espécies, combinando fluxo gênico e atributos demográficos. O marcador molecular vem auxiliando o rastreamento de genótipos superiores, permitindo dentro de programa de melhoramento a seleção de indivíduos com características de interesse. A genética vive uma fase ômica, ou era da genômica. Essa era teve início na década de 90, com o sequenciamento dos primeiros genomas, trascriptômica (definição de um conjunto de RNAs produzidos) e proteômica (definição do conjunto de proteínas produzidas). A partir dessa gama de dados gerados tornou-se possível explorar o código genético (DNA), o seu potencial de expressão gênica (RNA), os seus produtos protéicos (polipeptídios) e as interações e mecanismos moleculares do metabolismo de cada organismo (NUNES, 2010). O rápido progresso na área da genética molecular tem motivado pesquisadores de todo mundo para o uso direto de genes como forma de terapia, assim o tratamento de problemas genéticos logo ficou evidente que as manipulações genéticas envolvendo genes específicos e vetores de expressão direcionados para eucariotos, poderiam ser usadas como tratamento ou na ação preventiva para varias doenças (ROSINHA, 2004). O uso de marcadores moleculares nos estudos da espécie caprina torna-se cada vez mais necessário, é uma ferramenta a mais a ser utilizada nos trabalhos de 53 melhoramento genético, saúde animal, animais transgênicos, quanto na conservação dos recursos genéticos. DNA mitocondrial O DNA mitocondrial (mtDNA) é formado por uma fita simples de DNA circular – assemelha-se a um plasmídeo – possui menos que 20kb na maioria dos mamíferos e está localizado no citoplasma celular, dentro da mitocôndria (organela celular responsável pela produção de energia). O mtDNA de vertebrados não apresenta sequências espaçadoras entre genes ou íntrons e compreende 37 genes, dos quais 13 codificam proteínas, dois codificam RNAs ribossomais (12S e 16S), 22 codificam RNAs transportadores. Além desses genes, o mtDNA possui uma região não codificante chamada região controle (D-loop) que é responsável pela regulação da replicação e da transcrição de todo mtDNA (MEYER, 1993) e também conhecida como região rica em A+T (WOSTENHOLME, 1992). A origem do genoma mitocondrial ainda é controversa, porém, a teoria do endossimbionte tem sido a mais aceita para a explicação da origem da mitocôndria e do seu genoma. Essa teoria baseia-se em que uma célula eucariótica teria fagocitado uma α-protobactéria e esta se diferenciado em mitocôndria; durante esse processo, parte do genoma da α-protobactéria teria sido transferida para o núcleo celular e o inverso também teria ocorrido (GRAY et al., 2001). A origem da mitocôndria parece ter ocorrido uma única vez na história evolutiva dos organismos; tal evidência é apoiada pelo fato de que o conteúdo gênico mitocondrial é altamente conservado entre os mais diversos organismos. Essa conservação de conteúdo em uma ampla gama de organismos dificilmente seria explicada por convergência evolutiva (ARIAS et al., 2003). Outra característica importante do genoma mitocondrial é a ordem em que os genes estão arranjados nesse genoma. Essa ordem é muito conservada, principalmente, em se tratando dos genes codificadores de proteínas e das subunidades ribossômicas. Alterações na ordem desses genes maiores só são verificadas entre organismos filogeneticamente distantes, como, por exemplo, entre insetos e mamíferos (ARIAS et al., 2003). No processo de fertilização do óvulo, as mitocôndrias presentes nos espermatozoides são degradadas após a penetração no ovócito ou durante as primeiras 54 clivagens embrionárias (HIRAOKA; HIRAO, 1998). Assim, apenas o mtDNA materno vai ser herdado pelos filhos, através do citoplasma do óvulo. A mitocôndria é transmitida intacta de geração a geração, desconsiderando-se as mutações que podem ocorrer no mtDNA. Portanto, ao contrário do DNA nuclear, o DNA mitocondrial não não há mistura em cada geração, então se presume para mudar uma velocidade mais lenta, o que é útil para o estudo da evolução do organismo. Sequenciamento mitocondrial é usado para ilustrar a diversidade genética e evolução molecular no setor pecuário, por exemplo, nas raças caprinas. Os ovócitos contém aproximadamente 105 a 108 moléculas de mtDNA; enquanto que no espermatozoide só há de 10 a 100 moléculas; assim, por questões de probabilidade é quase impossível com essa pequena quantidade de mtDNA por via paterna, por isso que se atribui que este seja herdado por via materna (GROSSMAN; SHOUBRIDGE, 1996). Em estudos populacionais de origem e diversificação, a Região Controle do mtDNA pode ser aplicada, pois de todos os genes mitocondriais, esta região tem a maior taxa de substituição. As taxas de evolução da Região Controle são de duas a cinco vezes mais altas do que em genes mitocondriais codificantes de proteína (GREENBERG, 1983) e, portanto, sofrem mutações mais rapidamente, pois corresponde à região mais variável deste genoma (BROWN, 1985). Na espécie caprina a região controle é de 1213pb (SULTANA; MANNEN, 2004). O método mais utilizado para analisar o mtDNA no estudo do polimorfismo consiste em amplificar a região controle, por meio da técnica de PCR e sequenciar o produto amplificado. Então, são verificadas mutações pontuais, inserções e deleções em relação à sequência padrão, descrita por Anderson et al. (1981). O Sequenciamento de DNA mitocondrial tem sido usado para explicar as origens de muitas espécies de animais domésticos modernos. A existência de várias linhagens de DNA e sua mistura dentro das raças pode ser devido a vários eventos de domesticação ou introgressão entre espécies domésticas e selvagens. Os estudos sobre a estrutura e função do mtDNA se destaca na área de pesquisa da evolução molecular, classificação, análise genética da população, identificação relativa e traços loci quantitativos. A primeira sequência do genoma da cabra doméstica por uma abordagem robusta integrada com sequenciamento e mapeamento de todo genoma. O genoma do caprino (Figura 5) é o primeiro genoma de referência para os pequenos ruminantes e 55 pode ajudar a avançar a compreensão das características genômicas de ruminantes distintos de espécies não ruminantes. Este trabalho também produz uma experiência valiosa para facilitar as montagens de novos genomas no futuro (SHENZHEN, 2012). Figura 6. Resumo dos conjuntos de cromossomos da Capra hircus (DONG et al., 2012). O emprego da análise de mtDNA vem sendo, desde da década 70, utilizada em estudos envolvendo estrutura populacional, relações filogenéticas em nível inter ou intraespécies. Tais estudos permitem a construção de filogenias matrilineares, a partir das quais se inferem os possíveis ancestrais, o tempo de divergência, o número de eventos de domesticação e os locais onde estes teriam ocorrido (DOBNEY; LARSON, 2006). O mtDNA tem se mostrado um elemento bastante informativo nos estudos de origens dos animais domésticos (MACHUGH; BRADELY, 2001). WU et al., (2009) fazem menção de como os dados genéticos em nível molecular pode ser uma importante ferramenta para esclarecer as ambiguidades na atual 56 classificação taxonômica que se baseia na morfologia e em dados fisiológicos, o que é considerado insuficiente para determinar as relações entre raças. Além de relatar o reconhecimento dos padrões históricos de variação genética entre as raças caprinas há necessidade de preservar as relações evolutivas durante a prática de conservação dos animais. Apesar dos progressos da análise filogenética em diversos estudos, a origem de diversas espécies domésticas continua mal elucidada e um bom exemplo é a espécie caprina. Embora esta espécie desempenhe um importante papel em todo mundo, a sua origem ainda não está bem esclarecida. Isso pode ter decorrido devido à ocorrência de intercruzamentos, com a produção de descendência fértil, entre diferentes espécies selvagens e entre espécies domesticadas, implicando na possibilidade de uma ancestralidade múltipla para algumas populações domésticas. Os primeiros estudos com mtDNA permitiram a identificação de várias linhagens e os trabalhos realizados com a espécie caprina (JOSHI et al., 2004; LUIKART, et al., 2001; SARDINA et al., 2006; SULTANA et al., 2003). Este levantamento inicial vem fornecendo uma base para estudos mais detalhados regionais. Luikart et al. (2001) realizaram um levantamento mundial da diversidade no mtDNA da cabra doméstica e identificaram três grandes linhagens A, B e C. A linhagem A foi a mais comum em todos os continentes, principalmente na Europa Ocidental. As 150 cabras no estudo de Benjelloun et al., (2011), em Marrocos, se encaixaram todas no Haplogrupo A. A linhagem B foi encontrada no subcontinente indiano, Mongólia, Laos, Malásia, Paquistão e Sudeste da Ásia (LUIKART, et al., 2001). Existem várias linhas de evidência que indicam que a linhagem B é originária da região Sudoeste da China (WU et al., 2009). Já a linhagem C foi observada em algumas amostras da Mongólia, Suíça e Eslovénia, sendo esta linhagem também identificada por Sultana et al. (2003) nas cabras do Pasquitão. As três linhagens A, B e C encontradas por Luikart et al. (2001) foram estimadas ter divergido há mais de 200.000 anos. Assim, a divergência antiga e em diferentes localizações geográficas das linhagens sugeriu a probabilidade dos acontecimentos de domesticação terem sido múltiplos ou houve introgressão de linhagens adicionais após a domesticação. Segundo Sardina et al. (2006) as linhagens de mitocôndrias B e C representam expansões secundárias recentes. A variabilidade observada dentro de populações e regiões geográficas são consistentes com a elevada diversidade encontrada em todo o mundo na espécie caprina 57 (SULTANA et al., 2003; JOSHI et al., 2004; MANNEN, 2004; CHEN et al., 2005; PEREIRA et al., 2005; ODAHARA et al., 2006; SARDINA et al., 2006; NADERI et al., 2007; BENJELLOUN et al., 2011). A maioria da diversidade genética ocorre dentro de raças com uma estrutura geográfica fraca em decorrência do intenso fluxo de cabras entre os continentes relacionados à migração humana e o comércio. O trabalho de Sultana et al. (2003) foi o primeiro caso em que um único país se observaram quatro haplogrupos mitocondriais de cabras domésticas ( A, B. C e D). Tal descoberta suporta a tese de que o Paquistão seja um dos centros antigos de pastoreiro caprino. Também Joshi et al. (2003) encontraram Haplogrupos adicionais (D e E) em cabras indianas. Estas novas linhagens correspondem a um possível centro de domesticação no oriente do Pasquistão, corraborando com os resultados de Sultana et al. (2003). Os resultados obtidos por Chen et al. (2005) apoiam as múltiplas origens maternas dos caprinos domésticos e encontram também a linhagem D. No estudo de cabras domésticas da Sicília, Sardina et al. (2006) observaram três haplótipos que se agruparam com a cabra Bezoar, o qual considerou como uma nova linhagem (F), que poderia ser fruto de introdução de cabras selvagens. Segundo Naderi et al. (2007) estudaram numa amostra a nível mundial e incluindo uma síntese dos estudos anteriores citados, fazendo relações dos halogrupos mitocondriais, adicionaram um novo haplogrupo denominado de G, presente nos animais do Oriente médio e o norte da África, na região do Crescente Fértil. Nesse estudo a diversidade genética fica estruturada em seis haplogrupos diferentes, sendo que mais de 90% das cabras se enquadram no haplogrupo A. As cabras Corsas, na Ilha de Córsega, estudadas juntamente com as cabras do seculo XII mostram que a diversidade mitocondrial tem permanecido relativamente constante desde a Idade Média até o momento (HUGHES et al., 2012). Embora seja extremamente informativo em estudos evolutivos, o mtDNA possui limitações. Por se portar como um único loco (haplótipo) e ser um marcador extranuclear com uma dinâmica própria, não é um bom indicador para inferir a respeito da diversidade genética total (EGITO, 2007). Além disto, devido a sua herança materna não se detecta o fluxo gênico mediado pelo macho, o qual tem fundamental importância na evolução dos animais domésticos e na dinâmica dos rebanhos na atualidade (BRUFORD; BRADLEY; LUIKART, 2003). 58 Tipos de DNA presentes no organismo Há dois tipos de DNA nos organismos, o DNA nuclear que é formado por longas fitas, constituídas cada uma por dupla hélice e que codificam aproximadamente 100.000 genes e o mtDNA que representa de 1 a 2% do DNA celular, em duplo filamento circular, codificando 37 genes. Ele codifica aproximadamente 10% das proteínas constitutivas das mitocôndrias, sendo que para um bom funcionamento destas, é necessária uma boa cooperação entre o DNA nuclear e o DNA mitocondrial. O mtDNA não tem nenhuma característica exclusiva em sua composição química que o diferencie do DNA nuclear, entretanto, possui um código genético próprio. Ambos são marcadores moleculares, usados como teste de maternidade, enquanto o teste de paternidade é exclusivo do DNA nuclear, já que o mtDNA tem sua herança materna. Sendo essencialmente haploide e transmitido uniparentalmente. O mtDNA informa sobre a contribuição materna na evolução da população em análise (ALMEIDA, 2009). O mtDNA abriu uma nova perspectiva no estudo da genética de populações por não existir recombinação nesse compartimento genômico. É o marcador molecular mais utilizado em estudos de domesticação nas diferentes espécies e suas respectivas regiões do globo. O mtDNA pode ser amostrado de materiais biológicos como, por exemplo, o pelo, não sendo um método invasivo; sobrevive mais tempo do que o DNA nuclear, mantendo-se melhor em registros zoogeológicos; possui elevada variabilidade como consequência de baixas pressões seletivas; deficientes mecanismos de reparação; hereditariedade materna; não recombinante; haploide, não tem relações de linkage ambíguas; diferentes zonas do mtDNA tem diferentes taxas de mutação (BEEBEE; ROWE, 2004; PIRES, 2006). A principal vantagem do DNA mitocondrial, em comparação com o DNA nuclear, é que ele está presente num total aproximado de 500 a 2.000 cópias por célula. Por todas estas características vem sendo muito utilizado por ser facilmente isolado devido a sua estrutura. Existem várias diferenças entre o DNA nuclear e o mtDNA. As principais estão listadas no Quadro 1. 59 Quadro 1- Diferenças entre o DNA Nuclear e o DNA Mitocondrial PARÂMETRO Localização Conformação Mecanismo de proteção N° de Genes Funcionamento Composição Característica do genoma N° de pares de bases Atividade da Polimerase Sistema de reparo Taxa de evolução N° de DNA por célula DNA NUCLEAR No núcleo da célula, protegido pela membrana nuclear DNA MITOCONDRIAL Nas mitocôndrias, protegidas pela membrana mitocondrial – influência de radicais livres Dupla hélice Dupla fita circular Protegido por histonas Desprovido de histonas 100.000 genes 37 genes Autônomo Regiões codificantes (éxons) e não codificantes (íntrons) Necessita da cooperação do DNA nuclear 90% DNA codificante Genoma diploide (materno/ paterno) Genoma haploide (herança materna) – – sofre recombinação não sofre recombinação Bilhões de pares de bases 16.569 pares de bases Grande Fraca Presente Ausente Pequena 5 a 10 x maior que a nuclear 1 1.000 a 10.000 Fonte: SANTOS (2005) 60 CONSIDERAÇÕES FINAIS O conhecimento sobre diversidade genética intra-populacional é fundamental para a manutenção e perpetuação das populações caprinas locais. A variabilidade da espécie caprina é resultado da variabilidade entre inter-racial e intrarracial, ou seja, do número total de raças e da diversidade entre indivíduos de uma mesma raça. As raças locais muitas vezes com números reduzidos e ate mesmo desaparecendo dos criatórios devido a sua substituição e cruzamentos com raças exóticas. A perda de uma raça, compromete o acesso a sua combinação genética única de cada população, o que vem ocorrendo em vários países, o que é drástico tanto para a segurança alimentar quanto para o desenvolvimento sustentável. Portanto, espera-se que, as informações genéticas das raças caprinas brasileiras que detém um pool genético único possam auxiliar no desenvolvimento e acompanhamento de programas de preservação, conservação e melhoramento animal. 61 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADEBAMBO, A. Mitochondrial DNA D-loop analysis of South Western Nigerian chicken. Archivos de zootecnia, n. 224, p. 637-643, 2009. ISSN 0004-0592. 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ISSN 0036-8075. 74 CAPÍTULO 2. ______________________________________________________________________ CATALOGAÇÃO DOS HAPLÓTIPOS DO DNA MITOCONDRIAL DE CAPRINOS DA RAÇA CANINDÉ 75 CATALOGAÇÃO DOS HAPLÓTIPOS DO DNA MITOCONDRIAL DE CAPRINOS DA RAÇA CANINDÉ RESUMO Com o objetivo de catalogar os haplótipos do mtDNA dos caprinos da raça Canindé e de caracterizar sua diversidade genética por meio desse DNA, sequenciou-se um fragmento de 481 pb, correspondente à primeira porção da região-controle, de 178 indivíduos, provenientes de dez rebanhos (subpopulações), localizados em seis estados do Nordeste brasileiro. Os fragmentos foram amplificados via PCR, purificados e sequenciados. Após edição, as sequências obtidas foram alinhadas, comparadas com cada sequência obtida e com uma sequência referência, além de estimar os índices de divergência e de diversidade genética entre as subpopulações estudadas. Foram encontrados 29 haplótipos na população estudada, o que resultou em 53 sítios polimórficos, sendo 10 haplótipos comuns a todas as subpopulações e 19 exclusivos de uma subpopulação. A população apresentou diversidade haplotípica alta (0,82) – observando-se máxima de 0,90 e mínima de 0,56 – e nucleotídica baixa (0,014) – observando-se máxima de 0,02 e mínima de 0,004. A partilha dos haplótipos entre as subpopulações foi atribuída ao início da formação dos rebanhos. Todos os haplótipos encontrados pertencem ao Haplogrupo A, que é predominante no mundo. Ao agrupar as subpopulações em duas partes, com base em suas distribuições geográficas e sequências de mtDNA, na SAMOVA, a maior participação da variância genética observada entre as subpopulações foi 18,13%. A AMOVA revelou que 88,35% da variação observada na raça são em virtude das diferenças entre indivíduos intrapopulacionais; apenas 11,35% da variação genética são referentes às diferenças entre as subpopulações e 33,13% dos indivíduos de diferentes subpopulações compartilharam o mesmo haplótipo. Isso, provavelmente, é reflexo da proveniência de um mesmo pool genético original, com baixa diversidade ou por intercâmbios anteriores de animais. Palavras-chave: distribuição geográfica, marcador uniparental, Região Hipervariável. 76 CATALOGING MITOCHONDRIAL DNA HAPLOTYPES OF THE CAPRINE CANINDE RACE ABSTRACT Aiming to catalog the mtDNA haplotypes of the goats Canindé race and characterize their genetic diversity through this DNA, a fragment of 481 bp was sequenced, corresponding to the first portion of the control region of 178 individuals from ten herds (subpopulations), located in six states of the Brazilian Northeast. The fragments were amplified by PCR, purified and sequenced. After editing, the sequences were aligned, compared with each obtained sequence and with a reference, estimating the divergence rates and genetic diversity among studied subpopulations. In the studied population, 29 haplotypes were found, which resulted in 53 polymorphic sites, 10 of them being common to all subpopulations and 19 exclusive of one subpopulation. The population showed high haplotype diversity (0.82) - observing a maximum of 0.90 and a minimum of 0.56 - and low nucleotide diversity (0.014) - observing a maximum of 0.02 and a minimum of 0.004. The partition of haplotypes among subpopulations was attributed to the onset of herd formation. All haplotypes found belongs to the Haplogroup A, which is prevalent in the world. By grouping subpopulations into two parts based on their geographic distributions and mtDNA sequences in SAMOVA, the largest participation of the observed variance among subpopulations was 18.13%. The AMOVA revealed that 88.35% of the observed variation in the race is due to differences among intrapopulational individuals, only 11.35% of the genetic variation is related to differences among subpopulations and 33.13% of individuals of different subpopulations shared the same haplotype. This probably reflects the provenance of the same original gene pool, with low diversity or previous animal interchanges. Keywords: geographical distribution, uniparental marker, hypervariable region. 77 INTRODUÇÃO O progresso das condições de vida e do bem-estar humano encontra-se estreitamente dependente das espécies animais e vegetais domesticadas. A cabra foi a primeira espécie de produção a ser domesticada, uma vez que só o cão a antecede. Isso ocorreu há 11.000 anos, na região que, hoje, reúne Iraque, Síria, Líbano e Jordânia e, desde então, desempenha um papel econômico, cultural e religioso em muitas civilizações humanas (PEREIRA; AMORIM, 2010). Com a domesticação o animal foi retirado progressivamente do seu ambiente natural, observando-se uma descida para as planícies favoráveis à espécie humana. As mudanças de condições ecológicas acarretaram uma adaptação das cabras a vários meios em volta de grupos humanos, cujas preocupações variam em função destes (MIKERNA et al., 2010). Se, via de regra, as cabras são criadas numa ótica de produção mista (carne, leite e pele), observa-se também especialização (MAPA, 2010). Por exemplo, a Saanen como leiteira em pasto herbáceo, o Boer para carne no semiárido temperado e a Maradi (no Mali) para a pele no semiárido quente. Devido a sua versatilidade e adaptabilidade, os caprinos se espalharam por todo o mundo, seja juntamente com o homem em movimentos migratórios seja pelo comércio (LUIKART et al., 2001). A formação das raças caprinas brasileiras seguiu o trajeto dos colonizadores intimamente ligada a colonização do Brasil. Essa movimentação proporcionou o desenvolvimento de vários tipos morfológicos de orelha, de chifre, de pelo e de cor (VIGNE; PETERS; HELMER, 2005). O Brasil tem uma grande diversidade de Recursos Genéticos Animais (RGAn), em que se verificam a existência de onze raças locais da espécie caprina, em um vasto território, resultado da enorme variedade de condições ambientais e nichos ecológicos específicos. São oficialmente reconhecidas apenas duas raças (Canindé e Moxotó), enquanto as demais raças locais não homologadas (Marota, Azul, Gurguéia, Repartida, Graúna, Meridional, Nambi, Crespa e Biritinga). O reconhecimento oficial de um grupo genético como raça é um elemento importante para a sua conservação. Com origem no Nordeste do Brasil, a raça Canindé é importante nativa, presente em diferentes sistemas produtivos, sendo utilizada para diversas finalidades (carne, leite, pele e esterco). Atualmente, encontra-se em risco, pois o censo estima que existam menos de 3.000 animais (informação pessoal)1. As populações remanescentes distribuem-se em 12 explorações, por seis estados da Federação Brasileira (Bahia, 78 1 Informação pessoal. Estimativa de comunicação pessoal. Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Norte, Ceará e Piauí), todos no Nordeste do país, sendo o Rio Grande do Norte o estado com maior número de rebanhos. Poucos são os trabalhos conduzidos com a raça Canindé, com vistas à determinação da variação genética intra e interpopulacional. Trabalhos dessa natureza são importantes para o desenvolvimento de um programa de conservação e melhoramento. Alguns trabalhos avaliando a diversidade genética dos animais nos núcleos de conservação já vêm sendo realizados com tal raça (PAIVA et al., 2008; ARAÚJO et al., 2010). Os avanços nos estudos moleculares proporcionaram maior clareza nas informações sobre variabilidade genética, relacionamento ou discriminação de indivíduos numa população, das diversas relações entre populações e das diferenças entre raças e entre espécies, combinando fluxo alélico e atributos demográficos (FAO, 2010). Os primeiros estudos na espécie caprina com mtDNA permitiram a identificação de várias linhagens, como o de Luikart et al. (2001) e o de Sultana et al. (2003), que identificaram quatro e seis respectivamente. Esse levantamento inicial vem sendo base para estudos regionais mais específicos. A variabilidade genética observada intrapopulacional e em diferentes regiões geográficas são consistentes com a elevada diversidade encontrada em todo o mundo na espécie caprina (JOSHI et al., 2004; SULTANA; MANNEN, 2004; CHEN et al., 2005; PEREIRA et al., 2005; ODAHARA et al., 2006; SARDINA et al., 2006; NADERI et al., 2007; BENJELLOUN et al., 2011;). A maioria da diversidade genética ocorre em raças com estrutura geográfica fraca em decorrência do intenso fluxo de cabras entre os continentes, relacionado à migração humana e ao comércio. Os estudos filogeográficos discriminam a história evolutiva de uma linhagem, relacionando-a com sua distribuição geográfica, através, principalmente, das diferenças entre sequências de DNA mitocondrial (AVISE, 2000). Neste trabalho, objetivou-se catalogar os haplótipos do mtDNA da raça Canindé e caracterizar sua diversidade genética por meio desse DNA, mediante análise de um fragmento da região-controle (D-loop). 79 MATERIAS E MÉTODOS Local do Estudo O trabalho de campo foi desenvolvido na região Nordeste do Brasil, enquanto que o processamento das amostras biológicas foi efetuado no Laboratório de Unidade de Vida Selvagem, no Departamento de Biologia, da Universidade de Aveiro – UA, Portugal, com o intuito de caracterizar a nível genético as populações caprinas através da análise de mtDNA. Amostragem e descrição do local de colheita de material biológico para a pesquisa As amostras utilizadas neste estudo provêm de seis estados (BA, PE, PB, RN, CE e PI) onde se encontram os criadores e produtores de caprinos da raça Canindé (Figura 1, Tabela 1). O número de criações varia de acordo com o estado, sendo que o com maior número de propriedades é Rio Grande do Norte, seguido da Paraíba. Barro Duro- PI Pedro Avelino- RN Floresta- PE Boa vista- PB o Lajes N- RN Lajes K- RN Jeremoabo- BA Taperoá-PB Lajes A- RN alex 80 Sobral-CE Figura 1. Representação dos locais onde as amostradas foram coletadas. Foram analisados dados relativos a 178 caprinos, correspondentes a 10 rebanhos (subpopulações) da raça Canindé (Tabela 1). Tabela1. Informação de coleta da raça Canindé. Nº de indivíduos Total: Latitude Longitude 18 Origem Rebanho (Subpopulação) Jeremoabo-BA 10º 04' 30" S 38º 28' 51" W 19 Taperoá-PB 07º 12' 27" S 36º 49' 36" W 10 Floresta-PE 08º 36' 04" S 38º 34' 07" W 18 Boa Vista-PB 07º 15' 34" S 36º 14' 24" W 15 Barro Duro-PI 05º 49' 01" S 42º 30' 47" W 18 Sobral-CE 03º 41' 10" S 40º 20' 59" W 20 Pedro Avelino-RN 05º 31' 18" S 36º 23' 17" W 60 Lajes-RN* 05º 42' 00" S 36º 14' 41" W 178 *Obs: No município de Lajes (K, N e L), estão situadas 3 propriedades, assim, devido à proximidade nas coordenadas, para a SAMOVA, consideraram-se como única subpopulação. www.geografos.com.br/cidade Material biológico e extração do DNA Para a extração de DNA, foram coletados pelos, conservados em envelopes de papel. Foram selecionados entre 10 e 12 bulbos capilares por animal, cortados em sua base, para proceder à extração. O DNA foi isolado utilizando-se da técnica do NaOH (COELHO et al., 2004). Para quantificar o DNA, usou-se um espectrofotômetro (NanoDrop®, da Thermo Scientific). 81 Amplificação da região D-loop e sequenciamento Foi obtido um fragmento de 481 pb – primeiro segmento hipervariável (HVR1) da região controle (CR) do DNA mitocondrial – corresponde à região entre as posições 15.707 e 16.187. A reação de polimerase em cadeia (PCR), com um volume final de 25 ul, incluía 2,5 µl de um tampão buffer completo; 2,5 µl BSA; 0,5 µl de DNTPs (10 mM); 1 µl de cada iniciador (10 µM); 0,2 µl (1U) de enzima Taq DNA polimerase (Bioron); e 2 µl de DNA genômico (50 ng/µl). A PCR foi realizada em 38 ciclos, de acordo com Pereira et al. (2004), (5'CGCTCGCCTACACACAAATA-3-') usando-se os e iniciadores diretos reversos (5'GAAGAGTGGGCGATTTTAGG-3'), com as seguintes condições: desnaturação inicial de 94 °C durante 3 min; 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 45 s, 72 °C durante 1 min e uma extensão final de 72 °C durante 10 min, 38 ciclos. Os produtos amplificados foram visualizados inicialmente em géis de agarose a 2% para identificar possíveis falhas (Figura 2). A eletroforese foi realizada em uma voltagem de 120 Volts por 30 minutos. Os géis foram corados com brometo de etídeo, analisados sob luz ultra-violeta e fotografados. Um marcador de peso molecular de peso molecular de 100kb Plus (Invitrogen) foi utilizado para verificar se de fato houve amplificação dos fragmentos esperados. M CN Figura 2 - Amplificação bem sucedida dos fragmentos de DNA, evidenciado pelas bandas obtidas por eletroforese (o “controle” não apresenta bandas, o que indica ausência de contaminação). Os produtos obtidos foram purificados utilizando-se o kit “QIAquick PCR purification Kit” (Quiagen Inc., Valencia, CA), seguindo-se os protocolos recomendados pelos fabricantes. Para o sequenciamento, foi utilizado o sequenciador 82 automático ABI 3100 (Applyed Biosystems) no laboratório da Empresa da Macrogen (Holanda). Tratamento dos dados As sequências geradas foram avaliadas e nos casos em que surgiram bases mal identificadas nas sequencias obtidas procedeu-se, visualmente, a correção das mesmas através da analise dos cromatogramas (Figura 3), utilizando o programa MEGA vs 5.10. Figura 3 - Cromatograma obtido para uma sequência. Em análise de mtDNA, os erros consequentes da verificação do processo de sequenciamento da amostra, que consistem, na maioria das vezes, em trocas de base, referências ambíguas e mutações fantasmas, são apontados como a maior causa de equívoco (BANDELT et al., 2001). Assim a fim de evitar erros as sequências foram aceitas com, no máximo, uma base não determinada a cada 100 sequenciadas. De 286 animais sequenciados, 271 ficaram na análise para serem alinhados. 83 Análise das sequências As sequências obtidas foram comparadas com uma referência (AF533441, Pietro et al., 2003), seguindo-se os critérios descritos em Pereira et al. (2004) e como grupo externo a Capra pyrenaica (FJ207528, HASSANIN et al., 2009). As sequências disponíveis no GenBank foram usadas nas análises filogenéticas com a raça estudada, juntamente, com sequências de diferentes haplogrupos obtidas do GenBank sob números de acesso: A (AJ317736, AJ317661 e AJ317778, Luikart et al., 2001); B1 (AJ317826, Luikart et al., 2001) e (EF618355 e EF617850.1, Naderi et al., 2007); B2 (AJ317833, Luikart et al., 2001); C (AJ317835, Luikart et al., 2001) e (AB110559, Sultana et al., 2003); D (AB110587, Sultana et al., 2003) e (EF617701, Naderi et al., 2007); F (DQ241349, Sardina et al., 2006); e G (EF617728, Naderi et al., 2007). Nessa análise, foi utilizado o segmento entre as posições 15735 e 16187, de modo a incluir todas as sequências disponíveis. As sequências foram editadas e alinhadas usando-se o software MEGA® vs 5.10 (KUMAR et al., 2012) – em que se empregou o algoritmo Clustal W – e comparadas entre si. Análise de dados Relações entre os haplótipos e entre as subpopulações Os haplótipos foram obtidos por meio de contagem direta usando-se o programa ARLEQUIN (EXCOFFIER et al., 2005). A proporção dos nucleotídeos diferentes entre os haplótipos foi estimada a partir da distância de TAMURA & NEI (1993). Foi utilizado o método Neighbour-Joining (SAITOU & NEI, 1987) para reconstruir as relações filogenéticas entre as subpopulações (Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Piauí e Rio Grande do Norte). E, para reconstruir as relações entre os haplótipos encontrados para os caprinos Canindé, utilizou-se, além do método citado, o Median Joining (BANDELT et al., 1999). Foi construída uma rede de haplótipo usando-se o programa NETWORK v.4.2.0.1® (BANDELT et al., 1999). Medidas de diversidade genética Como medidas de diversidade genética, foram estimadas as diversidades nucleotídica (π) nucleotídica e haplotípica (Hd). Esta resulta de uma função entre o 84 número de haplótipo existente na população e das suas frequências (NEI & TAJIMA, 1981), enquanto aquela pode ser calculada a partir da divisão da proporção média de diferença nucleotídica entre os pares de sequência (K) pelo comprimento total da sequência analisada (NEI, 1987). Assim, para a população de caprinos Canindés e para as suas subpopulações, foram estimadas as diversidades nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) assim como como o número médio de diferença nucleotídica (K), usando-se o programa ARLEQUIN (EXCOFFIER et al., 2005). Os valores de polimorfismo e os parâmetros de diversidade genética foram estimados com o programa DNASP v 5.10 (ROZAS et al., 2010). Medidas de divergência genética Para verificar se, de fato, existem possíveis subpopulações na população Canindé, foram utilizadas, além dos métodos filogenéticos citados, duas medidas de divergência genética, numa tentativa de averiguar a possível existência de estruturação entre as subpopulações. Assim, foi calculado o valor de divergência nucleotídica entre as subpopulações, por meio da estimativa do número de diferença nucleotídica que ocorre entre elas (DA). Essa medida incorpora informações tanto das frequências haplotípicas quanto das diferenças nucleotídicas entre os haplótipos, fornecendo o nível de distância genética entre as subpopulações. Outro método estatístico utilizado neste estudo para avaliar o grau de divergência genética entre as subpopulações definidas foi a estimativa do parâmetro FST (WRIGHT, 1951), que, através da combinação de várias medidas de heterozigose a diferentes níveis (indivíduos, subpopulações e população total), permite uma descrição detalhada da estrutura populacional (HARTL & CLARK, 2007). Esse parâmetro foi calculado usando-se também o programa ARLEQUIN (EXCOFFIER et al., 2005), por meio de 1.023 permutações paramétricas dos haplótipos entre as subpopulações. Teste de Neutralidade Para testar se o polimorfismo observado na região do mtDNA estudada é consistente com o modelo de evolução neutra, foram estimadas as estatísticas D (TAJIMA, 1989) e Fs (FU, 1997). Esses testes indicam se a seleção e/ou processos demográficos são fatores a se considerar como explicação das frequências haplotípicas observadas por oposição à deriva genética e à seletividade neutra. 85 Os testes de Tajima (Tajima 1989) e de Fu (Fu 1997) no programa ARLEQUIN v 3.5 (EXCOFFIER et al., 2005). AMOVA e SAMOVA Análise de variância molecular (AMOVA) foram realizadas por meio do programa ARLEQUIN v 3.5 (EXCOFFIER et al., 2005). A AMOVA possibilita o teste de hipóteses relativas à estruturação geográfica populacional. Os cálculos se baseiam numa matriz de distância entre a diversidade nucleotídica dos haplótipos. A repartição dessa diversidade entre as populações subpopulações e seus indivíduos revela a estruturação da espécie. A análise então retorna resultados em forma de um valor percentual que representa o quanto aquela partição explica a diversidade contida entre populações de um mesmo grupamento em relação aos agrupamentos (FCT) e ao total (FST), e entre agrupamentos em relação ao total (FSC). Os testes de significância envolvem permutações entre indivíduos, sub-populações e grupos de sub-populações. A análise espacial de variância molecular (SAMOVA) procura correspondência entre a distribuição geográfica, através das coordenadas geográficas de cada localidade, e a distância relativa à diversidade nucleotídica. Essa análise foi realizada no programa SAMOVA 1.0 (DUPANLOUP et al., 2002). A SAMOVA testa as melhores combinações de agrupamentos de subpopulações para todas as possíveis combinações de grupos, delimitadas pelo número de subpopulações. Neste trabalho, foram delimitadas 8 subpopulações devido as coordenadas geográficas e como a SAMOVA retorna resultados entre dois e sete agrupamentos. RESULTADOS e DISCUSSÃO Análise de polimorfismo Trabalhos em genética populacional com caprinos têm aumentado, principalmente, utilizando mtDNA. A raça Canindé revelou grande quantidade de haplótipos 29. A diversidade haplotípica (Hd) e a nucleotídica (π) de mtDNA são importantes índices para avaliar o polimorfismo populacional e diferenciações genéticas. Embora informativo esse marcador possui limitações. Um desses entraves está na particularidade de ser uniparental. 86 Pereira et al. (2005) analisaram 481pb da região controladora de mtDNA de 288 indivíduos de cinco raças autóctones portuguesas e obtiveram 118 sítios variáveis; Oliveira (2007), analisando um fragmento de 130pb da mesma região em 1531 sequências, verificou 55 sítios polimórficos em caprinos do Nordeste brasileiro; Lopes (2012) analisou 696pb em 64 indivíduos do ecótipo Crespa do sul do Brasil e encontrou 24 sítios variáveis. Nesse estudo, foram analisados 481pb da referida região em 178 indivíduos da raça Canindé, encontrando-se 53 sítios variáveis. Dos 29 haplótipos, 19 foram exclusivos, enquanto 10, comuns a diferentes subpopulações estudadas. Os haplótipos mais frequentes foram H 1 (33,13%), H 2 (19,66%), H 5 (11,79%) e H 6 (10,11%), seguidos por H 3 (2,24%), H 12 (2,24%), H 17 (3,37%), H 18 (1,68%), H 21 (2,24%) e H 28 (2,80%). Os demais haplótipos apresentaram frequência de 0,56%, ocorrendo em um único indivíduo. Os 29 haplótipos obtidos apresentaram uma diversidade haplotípica 0,82 maior que as cabras crespas estudadas por Lopes (2012), cujo valor foi 0,78, e menor que a observada por Liu et al. (2007), que foi 0,93. Essa quantidade de haplótipos encontrada pode ser fruto do sistema de criação, em que não há seleção restrita dos animais, e da distribuição metapopulacional da raça (dividida em pequenos), permitindo a manutenção de um elevado número de haplótipos, apesar do seu pequeno efetivo populacional. O valor obtido de diversidade haplotípica foi 0,82 para a população estudada, enquanto, para diversidade nucleotídica, foi 0,014. Esta não é diretamente proporcional àquela, pois são influenciadas por números de indivíduos e frequências dos haplótipos, respectivamente. Os índices de diversidade haplotípica para cada subpopulação foram altos (Tabela 2), variando de 0,5621 (Faz Boa Vista) a 0,900 (Faz Lajes K). A subpopulação de Jeremoabo apresentou a menor diversidade nucleotídica (π=0.00459), enquanto a de Lajes K, a maior (π=0,01869). 87 Tabela 2. Variabilidade genética nas 10 subpopulações de cabras da Raça Canindé a partir de sequências de 481pb de um fragmento da região D-loop do mtDNA. População mtDNA N nh Hd π Jeremoabo-BA 18 4 0.6275 0.00459 Taperoá-PB 19 4 0.6959 0.00902 Floresta-PE 10 6 0.8889 0.00569 Boa Vista-PB 18 6 0.5621 0.01306 Barro Duro-PI 15 7 0.7810 0.01022 Sobral-CE 18 6 0.8497 0.01696 PedroAvelino-RN 20 6 0.8105 0.01685 Lajes K-RN 20 11 0.9000 0.01869 Lajes N-RN 20 7 0.7895 0.01297 Lajes A-RN 20 7 0.8579 0.01399 n: tamanho da amostra; nh: número de haplótipos; Hd: diversidade haplotípica; e π: diversidade nucleotídica. Em relação à diversidade nucleotídica das populações estudadas, obteve-se 0,01413 menores que as encontradas por Paiva et al. (2008), que, trabalhando com caprinos Canindé do núcleo de conservação da Embrapa caprinos, observaram valores de 0,021642 ± 0,011461. A baixa diversidade nucleotídica e a alta diversidade haplotípica são indícios de que a população passou por um gargalo populacional seguido de um rápido crescimento, acumulando mutações (GRAND; BOWEN, 1998). A população de Jeremoabo foi a que apresentou altos valores de h, mas reduzido π, enquanto as demais criações apresentaram uma combinação de altos valores para Hd e π, o que poderia ter ocorrido por contato com outras linhagens. Monteiro (2007) sugere a utilização da diversidade nucleotídica como estimativa da variação entre população (subpopulação). Esta é bastante informativa, uma vez que divulga as diferenças nucleotídicas entre sequência de DNA, enquanto a diversidade haplótípica apenas indica se duas sequências são ou não idênticas. 88 Distribuição dos haplótipos de mtDNA Dos 29 haplótipos encontrados nos 178 indivíduos das dez subpopulações de caprinos analisadas, dez foram compartilhados entre diferentes fazendas. Apenas o haplótipo H1 foi compartilhado entre todas as subpopulações, aparecendo em 59 indivíduos. O H2 apareceu em 35 indivíduos, sendo o segundo mais presente na população, não estando, no entanto, presente na subpopulação Boa Vista-PB. O H3, com 4 indivíduos presentes nas populações de Jeremoabo-BA, Boa Vista-PB, Pedro Avelino-RN e Lajes K. O H5 esteve presente em 21 caprinos, oriundos das subpopulações de Taperoá, Boa Vista, Sobral, Pedro Avelino, Lajes A, Lajes N e Lajes K. O H6, com 18 indivíduos, aparecem na Taperoá, Floresta, Boa vista, Pedro Avelino, Lajes A, Lajes N e Lajes K. O H12 apareceu em quatro indivíduos, dois de Barro Duro e dois da população de Lajes A. O H17, em cinco caprinos de Sobral e em 1 Pedro Avelino, ao passo que o H18 aparece só na Sobral, em três indivíduos. O H21esteve presente tanto na população de Lajes A quanto na de Lajes K; e o H28, só na de Lajes N com cinco caprinos. Os demais 19 haplótipos foram exclusivos para diferentes populações (Tabela 3). 89 Tabela 3. Catálogo dos haplótipos do DNA mitocondrial dos caprinos da raça Canindé Haplótipo Subpopulação Barro Duro H1 7 H2 2 H3 Boa Vista 12 1 Pedro Avelino Floresta 2 2 5 2 1 Jeremoabo Lajes A Lajes K Lajes N 9 4 5 8 7 3 59 7 6 1 2 8 2 35 1 H4 Taperoá Sobral 1 4 1 H5 1 6 H6 2 5 3 Total haplótipo 1 2 3 2 3 2 4 1 1 4 21 18 H7 1 1 H8 1 1 H9 1 1 H 10 1 1 H 11 1 1 H 12 2 H 13 1 2 1 H 14 1 1 H 15 1 1 H 16 1 1 H 17 4 1 H 18 H 19 H 20 1 H 21 3 5 6 3 3 1 1 1 1 4 H 22 1 1 H 23 1 1 H 24 1 1 H 25 1 1 H 26 1 1 H 27 1 1 H 28 5 5 H 29 1 1 Total Pop 15 18 20 10 18 20 20 20 19 18 178 90 A apresentação dos haplótipos é desequilibrada, havendo uns muito frequentes, como é o caso do H1 (33,13%), e outros bastante raros, aparecendo em apenas uma amostra, que constituem 10,74% do total de haplótipos obtidos. Esses raros estão sujeitos a um maior risco de desaparecimento na população. Diferenciação genética Estimativas de diferenciação genética entre as dez subpopulações de cabras Canindé, por meio do índice de fixação Fst para mtDNA, demonstram que a menor diferenciação significativa está entre as populações Lajes A e Jeremoabo, enquanto que os animais de Sobral-CE e Jeremoabo-BA apresentam maior diferenciação genética, FST = 0,32882 (Tabela 4). Tabela 4. Estimativas pareadas de distância genética entre dez populações de cabras Canindé com base em medidas de FST. Pop. Jeremoabo Jeremoabo Taperoá Taperoá 0.02345 Floresta 0.32298* 0.19109 BoaVista Floresta BoaVista BarroDuro Sobral Pedro Avelino LajesA LajesK LajesN 0 0.07192 0 0.07946 0 0.14263 0 BarroDuro -0.00919 -0.00936 Sobral 0.32882* 0.23788* 0.22067* 0.26541* 0.25021* Pedro Avelino 0.23953* 0.08506 0.16974 -0.00954 0 0 0.01573 0.16105 0.13207 0.16274 * LajesA 0.13413* 0.02349 0.05925 0.10222 0.04778 0.20377* 0.01348 LajesK 0.16485* 0.05548 -0.00907 0.06328 0.05789 0.18162* -0.01906 -0.00863 LajesN 0.13597 0.04636 0.21036* 0.06869 0.06249 0.10290 0.05090 0 0 0.03813 0 0.01829 0 * Significativo a 5% A maioria dos valores encontrados de divergência (FST) entre pares de populações foi de baixo a moderado, revelando pouca diferenciação genética entre as populações. Segundo Wright (1931), valores de FST acima de 0,25 são considerados de forte diferenciação. A maior diferenciação genética encontrada na subpopulação de Sobral em relação às demais ocorre, possivelmente, por ser uma subpopulação fechada, provavelmente pelo isolamento com as demais localidades, diminuindo, consequentemente, o trânsito de matrizes. Com informações pessoais dos criadores dessa raça sobre a formação dos rebanhos, os animais base foram recolhidos em várias localidades do nordeste. Poder-se 91 considerar que todas as subpopulações são a mesma população dividida por causas antropogênicas. A falta de diferenciação das subpopulações, mesmo com localidades distantes, estaria sujeita ao início e ao tipo de formação, como também no decorrer da criação, em que há a constante interferência do criador por meio dos critérios de seleção e do tipo de criação. Segundo Luikart et al. (2001), essa fraca diferenciação geográfica é comum nas raças domésticas devido ao intenso fluxo de animais desde a domesticação. A falta de diferenciação entre as subpopulações, possivelmente, deve-se ao trânsito de matrizes, já que os criadores sempre fazem compras e vendas entre as diversas localidades, a fim de evitar endogamia, porém, na maioria das criações, a variabilidade genética é ocasionada mais pelos reprodutores machos, o que influencia o genoma nuclear, já que a herança mitocondrial é materna. Algumas subpopulações tem sistema produtivo baseado em endogomia, consequentemente o nível de variação intrapopulacional tende a diminuir como resultado a disparidade entre as diferentes populações tende a aumentar. O grau de diferenciação genética das subpopulações foi verificado não só pelo índice de fixação FST como também pela Análise de Variância Molecular (AMOVA). O teste de AMOVA revelou fraca diferenciação genética entre populações, a qual é apoiada, significativamente, pelo índice de fixação (FST = 0,08306; P < 0,05). Observou-se que 11,35% da variação encontrada entre as sequências correspondem à variação entre as subpopulações, enquanto 88,64% da variação são relativas à variação intrasubpopulacional (Tabela 5). Resultados que corrobora com os estudos realizados por Lopes (2012), que encontrou nas cabras crespas 10,6% da variação entre as populações e por Oliveira (2007), que, com caprinos oriundos do Nordeste, comparando com os do velho mundo, observaram 11,49% de variação. A variação intrapopulacional obtida neste trabalho foi 88,64%, o que ocorre, principalmente, devido ao alto número de diferenças nucleotídicas. Tabela 5. AMOVA entre as populações amostradas do caprino Canindé. Fonte de Variação Entre populações Soma dos quadrados 95,950 Componentes Percentual da variância de variação 0,41745 11.35 Dentro de populações 547,186 3,25907 88,64 Total 643,136 3,67652 100,00 92 Análises filogenéticas A relação filogenética entre os haplótipos foi inferida pelo método medianjoining. Para facilitar a compreensão, os códigos H1, H2,..., Hn foram utilizados na rede de Haplótipos (Figura 4). Através dessas redes, foi possível verificar que não há tendência de estruturação geográfica ou por subpopulação, visto que os haplótipos das diferentes subpopulações se misturam. Nota-se que os haplótipos representados no primeiro clado hipotético que apresenta o H1 que foi o que apresentou a maior frequência, sugere que possivelmente seria oriundo de uma mesma matrilinha. Foram também identificados, na rede de haplótipos, sete vetores médios, que sugerem a possibilidade de existência de haplótipos não amostrados ou correspondentes a haplótipos ancestrais já extintos. 93 Figura 4. Relação filogenética entre os haplótipos de caprinos da raça Canindé oriunda do Nordeste do Brasil. O tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos que apresenta o respectivo haplótipo. Os pequenos círculos vermelhos indicam vetores intermediários, introduzidos pelo algoritmo executado. 94 No programa MEGA, foram realizadas 1000 replicações (bootstrap) para avaliar o suporte dos ramos. Na figura 5 apresenta-se a filogenia consenso dos 481pb dos 178 indivíduos de caprinos Canindé pertencentes as dez subpopulações amostradas onde verifica-se, que a maioria dos valores de suporte dos ramos são superiores 50%. Não houve uma clara separação das populações sem ramos terminais distintos. O clado situado na base dessa árvore é composto por um individuo da subpopulação Taperoá, quatro da subpopulação Floresta, três de Boa Vista, cinco de Pedro Avelino, dois de Lajes A, cinco de Lajes K e um de Lajes N, com um suporte de 95%. Dois clados apresentaram um suporte de 99%, um deles composto por nove indivíduos de Sobral e de Pedro Avelino e o outro caldo com três indivíduos de Lajes A e um de Lajes K. Na construção da arvore filogenética com os mesmos indivíduos, usando como grupo externo C. pyrenaica, sendo sua sequência obtida do GenBank sob o número de acesso (FJ20528.1). Para essa análise a maioria dos valores de boostrap superiores a 50%. O caldo da base com suporte de 99%, composto por três indivíduos de Lajes A e um da subpopulação Lajes K. Outros ramos terminais também aparecem bem suportados, como o ramo de suporte de 90% composto de cinco indivíduos da subpopulação de Lajes N e o ramo com 80% composto por nove indivíduos de Sobral e um de Pedro Avelino. Alguns indivíduos de cada subpopulação aparecem em ramos terminais suportados, acima de 50%, enquanto os demais aparecem mais relacionados com os de outras subpopulações que com aqueles da sua própria subpopulação de origem (Figura 6). A árvore gerada com amostras dos diferentes haplogrupos indica que todas as amostras caprinas da raça Canindé pertencem ao haplogrupo A, sendo que na base da arvore posicionam-se os demais haplogrupos. As sequencias referentes aos haplogrupos C e F aparecem na base da árvore, seguidos pelo clado dos dois subgrupos B(B1 e B2). Em seguida, aparece o haplogrupo G e por ultimo o haplogrupo D, mais relacionado com todas as demais sequências incluindo as quatro sequências representativas do haplogrupo A. (Figura 7). 95 c an235 d7 c an255 f3 c an185_h6 c an268 g4 c an143_d12 c an107 a12 c an155_e12 c an221 c 5 c an277 h1 c an171_g4 c an176_g9 c an232 d4 c an236 d8 c an284 h8 c an280 h4 c an256 f4 c an247 e7 c an238 d10 c an237 d9 c an234 d6 c an231 d3 c an230 d2 c an226 c 10 c an223 c 7 c an215 b11 c an214 b10 c an211 b7 c an206 b2 c an196 a4 c an174_g7 c an170_g3 c an147_e4 c an142_d11 c an135 d4 c an134 d3 c an131 c 12 c an130 c 11 c an122 c 3 c an121 c 2 c an119 b12 c an118 b11 c an115 b8 c an113 b6 c an112 b5 c an111 b4 c an109 b2 Can99_a4 Can98_a3 c an261 f9 c an177_g10 c an117 b10 c an128 c 9 c an132 d1 c an154_e11 c an189_h9 c an200 a8 c an202 a10 c an208 b4 c an209 b5 c an218 c 2 c an220 c 4 c an224 c 8 c an227 c 11 c an228 c 12 c an241 e1 c an243 e3 c an249 e9 c an252 e12 c an253 f1 c an257 f5 c an269 g5 c an286 h10 c an167_f12 c an108 b1 c an182_h3 c an287 h11 c an285 h9 c an282 h6 c an281 h5 c an278 h2 c an273 g9 c an272 g8 c an270 g6 c an267 g3 c an264 f12 c an263 f11 c an254 f2 c an251 e11 c an242 e2 c an240 d12 c an239 d11 c an229 d1 c an219 c 3 c an216 b12 c an203 a11 c an201 a9 c an191_h11 c an187_h8 c an186_h7 c an181_h2 Can96_a1 c an100 a5 c an101 a6 c an102 a7 c an103 a8 c an104 a9 c an106 a11 c an110 b3 c an114 b7 c an116 b9 c an124 c 5 c an125 c 6 c an126 c 7 c an127 c 8 c an129 c 10 c an133 d2 c an139_d8 c an141_d10 c an149_e6 c an150_e7 c an152_e9 c an156_f1 c an159_f4 c an160_f5 c an161_f6 c an162_f7 c an163_f8 c an164_f9 c an165_f10 c an166_f11 c an169_g2 c an175_g8 c an178_g11 c an179_g12 c an260 f8 c an204 a12 c an193 a1 c an194 a2 c an195 a3 c an205 b1 c an207 b3 c an225 c 9 c an197 a5 c an198 a6 c an199 a7 c an146_e3 c an244 e4 c an246 e6 c an248 e8 c an259 f7 c an271 g7 c an274 g10 c an275 g11 c an276 g12 c an283 h7 c an288 h12 c an184_h5 c an137_d6 c an158_f3 c an123 c 4 c an136 d5 c an138_d7 c an140_d9 c an148_e5 c an157_f2 c an210 b6 c an212 b8 c an213 b9 c an217 c 1 c an222 c 6 c an233 d5 c an245 e5 c an250 e10 c an258 f6 c an265 g1 c an266 g2 c an262 f10 c an279 h3 Jeremoabo-BA Taperoá-PB Floresta-PE Boa Vista-PB Barro Duro-PI Sobral-CE PedroAvelino-RN Lajes A –RN Lajes K –RN Lajes N -RN Figura 5. Árvore filogenética não enraizada com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de caprinos Canindé do Nordeste do Brasil. 96 can141_d10 can260 f8 can139_d8 can133 d2 can129 c10 can127 c8 can126 c7 can125 c6 Jeremoabo-BA can124 c5 can116 b9 can114 b7 can110 b3 can106 a11 can104 a9 Taperoá-PB can103 a8 can102 a7 can101 a6 can100 a5 Can96_a1 can149_e6 Floresta-PE can150_e7 can152_e9 can156_f1 can159_f4 can160_f5 can161_f6 Boa Vista-PB can162_f7 can163_f8 can164_f9 can165_f10 can166_f11 can169_g2 Barro Duro-PI can175_g8 can178_g11 can179_g12 can181_h2 can186_h7 can187_h8 Sobral-CE can191_h11 can201 a9 can203 a11 can216 b12 can219 c3 PedroAvelino-RN can229 d1 can239 d11 can240 d12 can242 e2 can251 e11 can254 f2 Lajes A –RN can263 f11 can264 f12 can267 g3 can270 g6 can272 g8 can273 g9 Lajes K –RN can278 h2 can281 h5 can282 h6 can285 h9 can287 h11 can182_h3 Lajes N -RN can108 b1 can167_f12 Can98_a3 Can99_a4 can109 b2 can111 b4 can112 b5 can113 b6 can115 b8 can118 b11 can119 b12 can121 c2 can122 c3 can130 c11 can131 c12 can134 d3 can135 d4 can142_d11 can147_e4 can170_g3 can174_g7 can196 a4 can206 b2 can211 b7 can214 b10 can215 b11 can223 c7 can226 c10 can230 d2 can231 d3 can234 d6 can237 d9 can238 d10 can247 e7 can256 f4 can280 h4 can284 h8 can232 d4 can236 d8 can176_g9 can171_g4 can221 c5 can277 h1 can155_e12 can107 a12 can268 g4 can143_d12 can185_h6 can235 d7 can255 f3 can261 f9 can177_g10 can117 b10 can128 c9 can132 d1 can154_e11 can189_h9 can200 a8 can202 a10 can208 b4 can209 b5 can218 c2 can220 c4 can224 c8 can227 c11 can228 c12 can241 e1 can243 e3 can249 e9 can252 e12 can253 f1 can257 f5 can269 g5 can286 h10 can146_e3 can204 a12 can193 a1 can194 a2 can195 a3 can205 b1 can207 b3 can225 c9 can197 a5 can198 a6 can199 a7 can276 g12 can283 h7 can275 g11 can274 g10 can271 g7 can288 h12 can184_h5 can137_d6 can158_f3 can123 c4 can136 d5 can138_d7 can140_d9 can148_e5 can157_f2 can210 b6 can212 b8 can213 b9 can217 c1 can222 c6 can233 d5 can245 e5 can250 e10 can258 f6 can265 g1 can266 g2 can262 f10 can279 h3 can244 e4 can246 e6 can248 e8 can259 f7 CpyrFJ207528.1 Figura 6. Árvore filogenética enraizada com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de caprinos Canindé do Nordeste do Brasil. 97 H2 H20 H8 H23 H16 H3 H27 H12 H11 H4 H1 H24 H9 H25 H22 H5 H13 gi28|AJ317778.1|Af ChAF533441 gi27|AJ317736.1|As gi29|AJ317661.1|Aeu H19 H17 H18 H21 H28 H29 H15 TH6 H26 H7 10 H14 35|AB110587.1|das 37|EF617701.1|deu 36|EF618341.1|gas 38|EF617728.1|Gaf 39|EF617850.1|b1eu gi32|AJ317833.1|b2as gi30|AJ317826.1|B1as gi31|EF618355.1|b1af 40|DQ241349.1|feu gi33|AJ317835.1|ceu 34|AB110559.1|cas Figura 7. Árvore filogenética não enraizada construído com base em 481pb de um fragmento da região HVR1 do mtDNA de cabras Canindé e representantes dos seis haplogrupos de mtDNA para caprinos (A; B1, B2; C; D; F; G). 98 Os grupos formados mostram, claramente, a diferenciação entre os haplótipos europeus e os africanos junto com os asiáticos. Nas subpopulações de Canindé estudadas, aparecem haplótipos de origem europeia como pode ser observados nos haplótipos (H17, H18 e H19) pertencentes ao haplogrupo A. Este fato é atribuído à relação comercial desde o período colonial e às várias introduções ao longo dos anos de animais no Brasil. Os resultados das análises da raça Canindé é apoia a ampla distribuição da linhagem A que é dominante em todos os continentes. Nos demais haplótipos, observa-se a participação de haplótipos africano, asiático e europeu. Oliveira (2007), trabalhando com diversas raças de caprinos nativos do Brasil, encontrou forte participação de populações de raças europeias e africanas na formação das populações de Canindé. Análise de correspondência entre distribuição geográfica e variância genética (SAMOVA) A análise de SAMOVA, que relaciona a variância genética com a distribuição geográfica, explorando e otimizando todas as possibilidades de agrupamentos das populações pré-definidas, encontra-se na Tabela 6. Tabela 6. Análise espacial de variância molecular (SAMOVA) para as oito subpopulações de caprino Canindé. Agrupamentos gerados pelo programa estão indicados entre colchetes. Nº grupos Agrupamentos % de variação FCT 2 [Sobral] [Floresta, Jeremoabo, Taperoá, Boa Vista, Pedro Avelino, Lajes, Barro Duro] 18,13% 0,181 3 [Sobral] [Floresta] [Jeremoabo, Taperoá, Boa Vista, Pedro Avelino, Lajes, Barro Duro] 15,47% 0,1547 4 [Sobral] [Floresta] [Pedro Avelino, Lajes] [Jeremoabo, Taperoá, Boa Vista, Barro Duro] 13,14% 0,1314 5 [Pedro Avelino, Lajes] [Boa Vista] [Jeremoabo, Taperoá, Barro Duro] [Floresta] [Sobral] 13,23% 0,1322 13,98% 0,1398 14% 0,1399 6 [Pedro Avelino] [Lajes] [Floresta] [Boa Vista] [Jeremoabo, Taperoá, BBarro Duro] [Sobral] 7 [Jeremoabo, Barro Duro] [Boa Vista] [Floresta] [Taperoá] [Sobral] [Lajes] [Pedro Avelino] Não significativo. 99 O resultado de dois grupos foi o que obteve o maior valor (18,13%) da participação de variância genética entre grupos. Porém, nos resultados da SAMOVA, esta percentagem de variação é muito baixa, já que o FCT deve apresentar valores superiores a 50. Para esse resultado, o agrupamento correspondente a Sobral forma um único grupo, e o segundo grupo é formado pelos demais Estados (PB, PE, BA, RN e PI). A porcentagem de variação genética entre os dois grupos é menor que as intrapopulacionais, não sendo possível encontrar diferenciação genética em relação às coordenadas geográficas. As raças caprinas brasileiras foram moldadas através de seleção artificial e natural de maneira a atender as diversas condições naturais em todo o mundo. Houve um grande intercâmbio comercial desde a expansão da agricultura, o que contribuiu para uma estrutura filogeográfica fraca nos caprinos domésticos. Essa estruturação fraca foi observada também em estudos anteriores (LUIKART et al., 2001; CHEN et al., 2005; NADERI et al., 2007; LIU et al., 2008). Apesar de a distância geográfica entre Jeremoabo e outras localidades desse agrupamento ser grande (cerca de 970 km da fazenda mais distante de Jeremoabo-BA até Sobral-CE) e a mais próxima ser a de Floresta-PE (com 197km), tal resultado sugere relações entre essas localidades. As vias de contato entre as subpopulações se dão pela compra e venda de matrizes e reprodutores, visto que um dos principais centros de fornecimento de caprinos da raça Canindé é na localidade de Jeremoabo-BA. Os valores encontrados de FST foram de modo geral moderados (Tabela 4), mostrando pouca diferenciação entre as subpopulações inferidas. Segundo Wright (1978), os valores de divergência podem ser classificados como baixo (entre 0,00 e 0,05); moderado (entre 0,05 e 0,15); alto (entre 0,15 e 0,25); e muito alto (maior que 0,25). Quase todos os valores encontrados de divergência entre os pares de subpopulações são de baixo a moderado. Foram observados, no entanto, valores acima de 0,25, sendo considerado divergência muito alta e significativa, o que é vista entre os pares Sobral e Jeremoabo, seguidos de Floresta e Jeremoabo e de Sobral e Boa Vista. Os valores significativos com alta divergência envolvem as localidades de Pedro Avelino-RN com Jeremoabo-BA, Sobral-CE com Taperoá-PB, Floresta com Sobral-CE, Barro Duro-PI com Sobral-CE, sobral com Lajes-RN. As localidades com moderada divergência são: Jeremoabo com Boa Vista e Pedro Avelino; Taperoá com Boa Vista e Pedro Avelino; Floresta com Boa Vista, Barro Duro e Pedro Avelino; Boa Vista com Lajes; Barro Duro com Pedro Avelino. 100 Com baixa diferença (FST), porém, o valor não foi significativo, estando nessa condição Jeremoabo com Taperoá; Lajes com Taperoá; Floresta com Pedro Avelino ; Barro Duro com Lajes e Lajes com Pedro Avelino. Já quanto às relações negativas ou iguais a zero, esse fato significa que não existe diferença entre as populações, o que pode ser visto nas localidades de Barro Duro com Jeremoabo, Taperoá com Boa Vista, sendo similares. Existem, contudo, haplótipos comuns a todas as subpopulações, como o Hap1, que sugerem a existência de linhagens em comum, o que implica que há linhagens maternas que contribuíram na formação de todas as subpopulações estudadas, possivelmente por meio do fluxo alélico e, por isso, os valores baixos de divergência genética encontrados. Dinâmica populacional O teste de neutralidade (Fs) aplicado nos diferentes grupos revelou valores não significativos (P > 0,10) (Tabela 8). Em conjunto, o valor obtido também não é significativo para o índice de D Tajima, enquanto o Fs é significativo. Os valores calculados estão relacionados logo a seguir: D de Tajima: -0,63365 (P> 0,10) Fs de Fu: -2,019 (P< 0,05) Valores de Fs negativos e significativos são evidências de um excesso de alelos, como se espera em casos de expansão populacional recente ou efeito carona. Segundo Hartl e Clark (2007), valores significativos e negativos no teste D de Tajima, evidenciam uma população em crescimento. Neste mesmo cenário, para Monteiro (2007), esses valores negativos e significativos podem ser obtidos, se houve seleção desfavorável sobre haplótipo raro. 101 Tabela 8. Índices de neutralidade calculados para cada população estudada. Grupos Nº de indivíduos D de Tajima Fs de Fu Jeremoabo 18 1,64497 1.910 Taperoá 19 -0,77275 4,668 Floresta 10 0,54694 2,202 Boa Vista 18 -0,67285 3,265 Barro Duro 15 -0,67516 0,669 Sobral 18 1.85022 4,500 Pedro Avelino 20 0,58138 5,035 Lajes A 20 0,13808 2,805 Lajes K 20 0,70523 0,294 Lajes N 20 0,40405 2,495 Não foi significativo 102 CONCLUSÃO Com base nas análises da região da D-loop do mtDNA nas 10 subpopulações de caprinos da raça Canindé estudadas, foram catalogadas um elevado número de haplótipos, 29, quando comparado com outros estudos em caprinos brasileiros. Os haplótipos H1, H2, H5 e H6 foram os mais frequentes. Os valores de diversidade genética foram, relativamente, moderados e com uma fraca diferenciação genética e geográfica. A associação entre distância genética e distância geográfica não foi evidente em toda a amostragem. As 178 cabras da raça Canindé estudadas são todas do haplogrupo A, que é a linhagem predominante em nível mundial. Mesmo com pequenos rebanhos, a raça Canindé apresentou variabilidade mitocondrial onde existe uma maior variação entre indivíduos de uma mesma população que entre populações, o que torna possível a manutenção de muitas das linhagens maternas que contribuíram na sua formação, tão fundamental em programas de conservação genética. 103 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, A. M. et al. Monitoramento e caracterização molecular de genótipos locais de caprinos no Nordeste. P. 382-398. Ciência e Tecnologia na pecuária de caprinos e ovinos. Fortaleza: Banco do Nordeste do Brasil, 2010. AMILLS M, et al. Strong phylogeographic relationships among three goat breeds from the Canary Islands. Journal Dairy Research. 71:257–262, 2004. AVISE, L.C. Phylogeography: The history and formation of species. Harvard University press, Cambridge, 2000. AZOR P. J, et al. Phylogenetic relationships among Spanish goats breeds. Animale Genetics 36:423-425, 2005. BANDELT, H. J.; FORSTER, P.; ROHL, A. 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A análise da estrutura populacional mostrou diferenciação significativa (P<0,05) entre alguns pares possíveis das seis raças. Na AMOVA apenas 5,13% da variação genética ocorreu entre grupos, ou seja, entre raças devido a diferenças entre raças. Já 9,99% ocorrem entre populações dentro de grupos onde a maior diferença está dentro das populações, com 84,89% correspondente a diferenças entre indivíduos. A maior diferença genética entre as seis raças está entre Moxotó e Alpina Britânica, enquanto a maior relação de similaridade verificou-se na Canindé e a Marota. Foi também observado que as distâncias genéticas entre as raças não se correlacionam com microgeografia do Nordeste do Brasil. Estas observações são consistentes com a recorrente introdução de animais exóticos no plantel, ou resulta do fato dos haplótipos terem esta mistura nas populações desde a colonização do Brasil. Os animais brasileiros são classificados como haplogrupos (A) com haplótipos de maior influência de raças europeias e com participação africana e asiática. Palavras-chaves: análises filogenéticas, cabras brasileiras e linhagens mitocondriais. 109 GENETIC DIVERSITY IN THE D - LOOP REGION OF MTDNA BRAZILIAN GOATS POPULATIONS AND THEIR PHYLOGENETIC RELATIONSHIP WITH THEIR ORIGINAL GROUP ABSTRACT The wide varie-te of existing breeds of goats in Brazil results of culture systems adopted by farmers holding a key role in the economy especially in the Northeast. Aiming to elucidate the genetic origin of Brazilian goats and contribute to their conservation, we analyzed the hypervariable region of the mitochondrial DNA of Brazilian local breeds Canindé Moxotó and Blue, plus two exotic breeds Sannen and British Alpine 271 animals the Northeast. All breeds showed average haplotype diversity of 0.8428. The analysis of population structure showed a significant difference (P< 0.05) among some possible pairs of the six races. In AMOVA only 5.13 % of the genetic variation occurs between groups or between races due to differences between races. While 9.99% occurs among populations within groups where the largest difference is within populations, in which 84.89 % corresponded to differences between individuals. The largest genetic difference between races, is among the six Moxotó and British Alpine, while the highest ratio of similarity found in the Canindé and Marota. It was also observed that the genetic distances between breeds do not correlate with microgeography of Northeast Brazil. These observations are consistent with the recurring introduction of exotic animals on the roster, or results from the fact they have this mixture of haplotypes in populations since the colonization of Brazil. Brazilian animals are classified as haplogroups (A) haplotypes with greater influence of European breeds and African and Asian participation. Keywords: phylogenetic analyzes, Brazilian goats and mitochondrial lineages. 110 INTRODUÇÃO Ao explorar a história da agricultura e alimentação, é possível compreender as questões atuais das raças contemporâneas, já que nossas relações com o mundo rural e a produção de alimentos estão sempre apoiadas por desenvolvimento e fracassos, tecnológicos, econômicos, políticos e culturais (FLAMANT, 2002). O progresso das condições de vida e do bem-estar humano encontra-se, estreitamente dependente das espécies animais e vegetais domesticadas durante os milênios, as quais foram utilizadas para os mais variados fins. A cabra foi a primeira espécie de produção a ser domesticada, uma vez que só o cão a antecede (SHELTON, 1993). A domesticação da cabra (Capra hircus) remota do período Neolítico, a cerca de 11.000 anos provavelmente no Crescente Fértil, região do Oriente Próximo (PEREIRA; AMORIM, 2010). A sua origem, evolução e diversidade tem sido objeto de uma grande variedade de trabalhos. Nos últimos anos, os estudos efetuados a partir de DNA mitocondrial (mtDNA) apontam para alta diversidade genética dos caprinos (NADERI et al., 2007; PEREIRA et al., 2009). A diversidade de recursos genéticos caprinos mundiais reflete sua adaptação aos diferentes sistemas de produção, com predomínio de raças nativas, muitas vezes em perigo de extinção. Segundo a FAO (2007) existiam mais de 500 raças caprinas reconhecidas mundialmente, em que mais de 90% são consideradas locais. Todavia, em muitos países não se tem a tradição de classificar os animais por raça. Mas, sim pela sua distribuição geográfica, ou ainda, designam como Crioulos, termo utilizado de forma mais ampla, que inclui várias populações distintas (EGITO; MARIANTE; ALBUQUERQUE, 2002). O grande número de raças implica uma forte diversidade genética e, consequentemente, constitui um importante patrimônio genético. Contudo são escassas as informações sobre estes recursos, particularmente, quando comparado com outras espécies de produção (SIDER; ZAROS, 2008). O Sequenciamento de DNA mitocondrial tem sido usado para explicar as origens de muitas espécies de animais domésticos modernos. A existência de várias linhagens de DNA e sua mistura dentro das raças pode ser devido a vários eventos de domesticação ou introgressão entre espécies domésticas e selvagens (NADERI et al., 2007). Os estudos sobre a estrutura e função do mtDNA se destaca na área de pesquisa 111 da evolução molecular, classificação, análise genética da população, identificação relativa e traços loci quantitativos (ALMEIDA, 2007). A história filogenética dos caprinos domésticos vem sendo estudada através de DNA mitocondrial (mtDNA) (LUIKART et al., 2001; JOSHI et al., 2004 e FERNÁNDEZ et al., 2006). Estes estudos demonstraram que os caprinos acompanharam os movimentos migratórios e exploratórios do homem. No trabalho realizado por Luikart et al., (2001) verificou a Capra aegagrus como progenitora da Capra hircus pela maior proximidade, assim como os tipos de DNA do cromossomo Y das Capra aegagrus que eram idênticos aos das cabras domésticas. Todos os marcadores genéticos concordam com a relação da Capra hircus e Capra aegagrus por Takada et al., (1997); Luikart et al., (2001); Mannen; Nagata; Tsuji, (2001), esse resultado é coerente com os estudos arqueológicos e morfológicos (ZEDER; HESSE, 2000). Os estudos com sequências de DNA revelam em caprinos uma elevada homogeneidade genética, mesmo em animais muito distante, geograficamente. Diferentemente do que ocorre em outras espécies, por exemplo, como nos bovinos e ovinos, são encontradas diferenças genéticas entre as populações 112europeias, asiáticas e africanas. A semelhança na espécie caprina é a confirmação do grande intercâmbio de genes que os caprinos sofreram durante o curso da história humana (FERNÁNDEZ et al., 2006). Diante do exposto o objetivo do estudo foi caracterizar as raças caprinas brasileiras Canindé, Moxotó, Marota e Azul e as raças exóticas Sannen e Alpina Britânica ao nível das suas linhagens maternas, comparando com sequências de cabras existentes no GenBank de várias regiões do Mundo. MATERIAL E MÉTODOS Amostragem No total foram analisados dados relativos a 271 caprinos, correspondentes a seis raças de caprinos: 4 raças brasileiras e 2 raças exótica. Sendo a maior parcela de animais da raça Canindé 178 indivíduos. 112 Canindé Alpina britânica Azul Marota Saanen Moxotó Figura 1. As raças estudadas Material biológico Foram submetidos a um estudo genético os caprinos de raças locais: Canindé dos Estados de PE, PB, RN, PI e BA (CAN, n=178), Moxotó do Ceará (MOX-CE, n=20), Marota do Piauí (MAR-PI, n=24), Azul de Pernambuco (AZU, n=19) e duas raças cosmopolitas de origem Alpina, a Saanen e a Alpina Britânica encontradas em Pernambuco e Bahia (SAA, n= 20; ALP, n=10) (Figura 1). Os animais amostrados foram selecionados a partir da segunda muda e aqueles que melhor representassem a raça, de acordo com os parâmetros morfológicos estabelecidos pela Associação Brasileira de Criadores de Caprinos (ABCC) e homologados pelo Ministério da Agricultura. 113 Barro Duro- PI Raça Canindé Teresina-PI Raça Marota Sobral-CE Raça Canindé e Moxotó Lajes-RN Raça Canindé Pedro Avelino-RN Raça Canindé Taperoá-PB Raça Canindé Boa Vista-PB Raça Canindé Floresta-PE Raça Canindé Afrânio-PE Raça Azul Jeremoabo-BA Raça Canindé e Alpina Britânica Recife-PE Raça Saanen Figura 2. Locais de colheitas de dados e material biológico. Foram coletados pelos com bulbo dos animais para a extração de DNA, que foram condicionados a seco em envelopes de papel ou sacos plásticos. Em torno de 10 a 12 bulbos capilares, por amostra, foram selecionados e cortados em sua base para proceder à extração. A extração do DNA foi baseada na técnica do NaOH (COELHO et al., 2004). Para quantificar o DNA, usou-se um espectrofotómetro (NanoDrop®, da Thermo Scientific). As extrações e amplificações foram realizadas no laboratório da Biologia (dbio/CESAM) da Universidade de Aveiro. 114 A amplificação da região D-loop do mtDNA e sequenciamento Foi obtido de um fragmento de 481 pb – primeiro segmento hipervariável da região controle do DNA mitocondrial – corresponde à região entre as posições 15.707 e 16.187. A reação de polimerase em cadeia (PCR), com um volume final 25µl, incluía 2,5 µl de um tampão buffer; 2,5 µl BSA; 0,5 µl de DNTPs (10 mM); 1 µl de cada iniciador (10 µM); 0,2 µl (1U) de enzima Taq DNA polimerase (Bioron) e 2 µl de DNA genômico (50 ng/µl). A PCR foi realizada em 38 ciclos, de acordo com Pereira et al. (2004), usando-se os iniciadores diretos (5' CGCTCGCCTACACACAAATA-3-') e reversos (5'-GAAGAGTGGGCGATTTTAGG-3'), com as seguintes condições: desnaturação inicial de 94 ° C durante 3 min, seguida de 38 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 45 s, 72 ° C durante 1 min e uma extensão final de 72 ° C durante 10 min. Os produtos obtidos foram purificados utilizando-se do kit “QIAquick PCR purification Kit” (Quiagen Inc., Valência, CA), seguindo-se os protocolos recomendados pelos fabricantes. Para o sequenciamento, foi utilizado o sequenciador automático ABI 3100 (Applyed Biosystems) no laboratório da Empresa Macrogen (Holanda). As sequências obtidas foram comparadas com uma referência (AF533441, Pietro et al., 2003), seguindo-se os critérios descritos em Pereira et al. (2004) e como grupo externo a Capra pyrenaica (FJ207528, Hassanin et al., 2009) . As Sequências disponíveis no GenBank foram usadas nas análises filogenéticas com a raça aqui estudada juntamente com sequências de diferentes haplogrupos obtidas do GenBank sob números de acesso: A (AJ317736, AJ317661 e AJ317778, Luikart et al., 2001); B1 (AJ317826, Luikart et al., 2001) e (EF618355 e EF617850.1, Naderi et al., 2007); B2 (AJ317833, Luikart et al., 2001); C (AJ317835, Luikart et al., 2001) e (AB110559, Sultana et al., 2003); D (AB110587, Sultana et al., 2003) e (EF617701, Naderi et al., 2007); F (DQ241349, Sardina et al., 2006); e G (EF617728, Naderi et al., 2007). Nessas análises, foi utilizado o segmento entre as posições 15735 e 16187, de modo a incluir todas as sequências disponíveis. As sequências foram editadas e alinhadas usando-se o software MEGA® vs 5.10 (Kumar et al., 2012) – em que se empregou o algoritmo Clustal W – e comparadas entre si. Os valores de polimorfismo e os parâmetros de diversidade genética foram estimados com o programa DNASP v 5.10 (ROZAS et al., 2010). 115 A divergência genética foi analisada mediante a Análise de Variância Molecular (AMOVA) por meio do programa ARLEQUIN v 3.5 (EXCOFFIER et al., 2005). A rede network das sequências foi obtida através do método median-joining, com o software NETWORK v.4.2.0.1. Para a análise bayesiana foi utilizado o modelo de evolução mais apropriado para cada região inferido. Usando o programa MrBayes v.3.2 (HUELSENBECK e RONQUIST, 2001). Iniciou-se gerando árvores aleatórias e procederam por 2,0 x 106 gerações. RESULTADOS E DISCUSSÃO Em programas de conservação, conhecer a estrutura populacional dos caprinos é essencial. O mtDNA tem-se mostrado eficaz na detecção de fenômenos de endocruzamento, de fragmentação e isolamento, de efeito de gargalo, de fluxo genético, ou ainda na quantificação da variabilidade genética em risco. Nas análises filogenéticas há um grande uso do estudo da região controladora ou D-loop por apresentar uma taxa de mutação mais elevada (COOK et al., 1999). O alinhamento da região D-loop com segmento de 481pb em 271 sequências das cabras brasileiras e exóticas avaliadas, revelou 62 sítios polimórficos. Observou-se uma média de 19,47 transições, 1,47 transversões e 0,07 deleções. Este valor, foi maior que os estimados em estudos anteriores 17/1(Luikart et al. 2001), 16/1 (Joshi et al. 2004), 13,9/1 (Pereira et al. 2005). As análises revelaram 39 haplótipos diferentes, dos quais 13 são compartilhados entre as populações e 26 são exclusivos. Os haplótipos predominantes foram H1 (26,56%), H2 (20,29%), H6 (16,60%), H5 (13,28%) e H17 (4,06%). Os demais apresentaram uma frequência abaixo de 2%. O H1 o mais frequente dos haplótipos e que pode ser observado em diferentes raças brasileiras, essa matrilinha foi a que, possivelmente, mais contribuiu com a formação dos grupos genéticos do Brasil. O H1 ocorreu em 72 indivíduos em todas as raças, exceto na raça Moxotó, com uma frequência de 12 a 2 indivíduos por raça. O H1 está presente em animais da raça ibérica (PIETRO et al., 2003). Em seguida, H2 com 56 indivíduos e H5 com 36 indivíduos que, esteve presente em todas as raças. H6 foi observado em 45 indivíduos, só não esteve presente na raça Alpina Britânica. O H17 com 11 indivíduos distribuídos nas raças Canindé em duas Populações 4 em Sobral e 5 em Pedro Avelino, na raça 116 Moxotó e na Marota. O haplótipo 29 foi restrito a raça Azul com 2 indivíduos. Os demais haplótipos foram restritos a uma única localidade, sendo encontrados em um ou dois indivíduos (Tabela 1). 117 Tabela 1. Frequência numérica dos 39 haplótipos do DNA mitocondrial nos caprinos das seis raças por populações. Haplótipo Populações Pop1 Pop2 Pop3 Pop4 Pop5 Pop6 Pop7 Pop8 Pop9 Pop10 Pop11 H1 2 12 7 3 2 4 5 8 9 7 3 H2 2 2 2 5 6 2 2 7 8 5 1 1 H3 1 1 H4 Pop12 Pop13 Pop14 Pop15 4 2 4 3 2 4 6 1 1 2 4 6 9 10 4 4 1 H5 1 H6 3 H7 1 H8 1 H9 1 4 2 H10 1 H11 1 H12 2 H13 1 H14 1 H15 1 H16 1 6 2 4 2 5 2 4 1 3 1 2 H17 5 H18 3 H19 1 1 4 H20 1 H21 4 1 1 H22 1 H23 1 H24 1 H25 1 118 Tabela 1. Continuação... H26 1 H27 5 H28 1 H29 H30 2 1 H31 1 H32 1 H33 2 H34 1 H35 2 H36 1 H37 1 H38 1 H39 1 Distribuição dos 39 haplótipos de seis raças de caprinos entre as quinze populações amostradas. Pop 1: Can_Floresta, Pop 2: Can_Boavista, Pop 3: Can_BarroDuro, Pop 4: Can_Sobral, Pop 5: Can_Pedro Avelino, Pop 6: Can_A, Pop 7: Can_K, Pop 8: Can_N , Pop 9: Can_Jeremoabo, Pop 10: Can_Taperoá, Pop 11: Azul, Pop 12: Moxotó, Pop 13: Alpina, Pop 14: Saanen e Pop 15: Marota. 119 A diversidade genética encontrada em todas as raças brasileiras e a partilha de alguns haplótipos com outras raças estrangeiras é consistente com a introdução repetida de animais exóticos nos rebanhos brasileiros. Esse resultado corrobora com os dados históricos que relatam a entrada dos caprinos domésticos no Brasil pelos colonizadores portugueses em 1515, descrito por SIMONSEN, (1937). Como sabido, as raças Saanen, Alpina Britânica, Anglonubiana, entre outras foram introduzidas no Brasil para fins de aumento de produção, e muitos criadores de raça local utilizaram-nas em cruzamentos no intuito de melhorar a produção dos seus animais. As diferentes influências, bem como a existência provável de haplótipos muitos distantes nos estoques iniciais dos fundadores trazidos para a região Nordeste Brasileiro levaram à presença de várias linhagens no pool de genes na linha materna das cabras brasileiras. A principal influência seria entre as raças ibéricas, e essas têm origem a partir do tronco asiático visto por Luikart et al. (2001), o que elucidaria esta proximidade das raças locais com as raças asiáticas. Os índices de diversidade haplotípica (Hd) para cada população foram altos (acima de 0.5). Considerando cada população amostrada, verifica-se que as diversidade haplotípicas (Hd) variam de 0,5621 (Pop 2) a 0,9000 (Pop7) (Tabela2). Em relação à diversidade nucleotídica, a variação encontrada foi de 0,00459 (Pop. 9) a 0.01869 (Pop 7). A raça Canindé apresenta a maior diversidade nucleotídica (0.01869), seguida da raça Moxotó (0.01829). As diversidades nucleotídicas não são diretamente proporcionais as haplotípicas, pois são influenciadas por números de indivíduos e frequência dos haplótipos. Dentre as populações analisadas, a que apresentou o maior número de (Hd) e (π) foi a (Pop 7). Os testes de neutralidade (Tabela 2) não tiveram valores significativos para as populações analisadas. Os valores de Fs foram positivos, evidenciando poucos alelos em todas as populações, porém quando tratamos todas as subpopulações, referentes à raça Canindé esta apresenta o Fs= -2.019, sugerindo que a raça preserva sinais de expansão. O valor obtido de diversidade haplotípica Hd e nucleotídica π, sítios polimórfico, o teste de Tajima D e Fu de Fs, de todas as raças e suas populações se encontram na Tabela 2. 120 Tabela 2. Principais características das sequências analisadas nas populações de cabras brasileiras. Populações Nº indivíduos π diversidade nucleotídica 0.00569 Tajima D Fu Fs 6 Hd diversidade haplotípica 0.8889 0.54694 2.202 1 10 Nº sítios polimórfico s 26 Nº haplótipos 2 18 26 6 0.5621 0.01306 -0.67285 3.265 3 15 19 7 0.7810 0.01022 -0.67516 0.669 4 18 19 6 0.8497 0.01696 1.85022 4.500 5 20 25 6 0.8105 0.01685 0.58138 5.035 6 20 24 7 0.8579 0.01399 0.13808 2.805 7 20 27 11 0.9000 0.01869 0.70523 0.294 8 20 20 7 0.7895 0.01297 0.40405 2.495 9 18 5 4 0.6275 0.00459 1.64497 1.910 10 19 19 4 0.6959 0.00902 -0.77275 4.668 11 20 19 5 0.7368 0.01623 1.72990 6.463 12 19 22 5 0.6842 0.01829 1.54092 6.934 13 10 10 5 0.8222 0.00822 0.52752 0.977 14 20 20 8 0.8895 0.01611 1.42219 2.348 15 24 25 8 0.8478 0.01613 0.59029 3.175 1:Can_Floresta, 2:Can_Boavista, 3:Can_BarroDuro, 4:Can_Embrapa, 5:Can_Emparn, 6: Can_A, 7:Can_K, 8:Can_N 9:Can_Jeremoabo, 10:Can_Taperoá, 11Azul, 12:Moxotó, 13:Alpina 14: Saanen, 15:Marotá As cabras brasileiras obtiveram uma diversidade haplotípica de (0,8428). Para avaliar a relação entre os haplótipos, uma rede de median joining foi construída (Figura 2). Não foi possível verificar uma tendência de estruturação por raça ou por fazenda/população. O principal fator que poderia contribuir para esta falta de estrutura é o alto fluxo gênico induzido pela ação humana (LUIKART et al., 2001; CHEN et al., 2005; PEREIRA et al., 2005; NADERI et al, 2007, PEREIRA et al., 2009). Um fluxo constante entre os animais dos diferentes estados poderiam apagar um possível padrão geográfico. Foram também verificados na rede de haplótipos onze vetores médios, que representam a existência de haplótipos extintos ou não amostrados (Figura 2). 121 Figura 2. A rede Median joining do mtDNA os haplótipos observados nas quatro raças caprinas locais brasileiras Canindé, Moxotó, Marota e Azul e duas exóticas Saanen e Alpina Britânica. A área do círculo é proporcional para a frequência da amostra. Os pequenos círculos vermelhos indicam vetores intermediários. 122 Os valores da análise de variância molecular (AMOVA) demonstram que 5,13% da variação genética ocorrem entre grupos, ou seja, entre raças. Já 9.99% acontecem entre populações dentro de grupos onde a maior diferença está dentro das populações, com 84,89% de toda variação genética observada (Tabela 3). Resultado este que corrobora com os estudos realizados por Pereira et al., (2005) e Benjelloun et al., (2011). Tabela 3. AMOVA entre e dentro de populações e raças. Fonte de variação GL Entre raças 5 Soma de quadrados 85.840 Componentes de variação 0.20923 Va Porcentagem da variação 5.13 Entre populações dentro de raças 9 96.260 0.40755 Vb 9.99 Dentro de populações 256 886.763 3.46392 Vc 84.89 Total 270 1068.863 4.08070 100,00 Índices de fixação FSC 0.10527 FST 0.15115 FCT 0.05127 O número de haplótipos compartilhados entre todos os pares de raças e o FST foi utilizado para estabelecer as distâncias genéticas das 15 populações (Tabela 3), onde foi encontrado um FST=0.15115 classificada como moderada. Os resultados evidencia o baixo valor de divergência entre populações FSC e o baixo valor de diferença entre grupos determinado FCT. A maior diferenciação genética das populações ocorre entre a população 12 e 13, referente, respectivamente, a raça Alpina e a Moxotó com o FST= 0,40220. A menor diferenciação genética significativa ocorre com a raça Marota (Pop.15) e Sobral Canindé (Pop 4), na tabela 4. 123 Tabela 4. Valores do índice de Fixação FST para as 15 populações utilizadas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.14549 0 0.16038 -0.00318 0 0.22067* 0.26844* 0.23761* 0 0.01573 0.16296 0.13063 0.16274 0 0.05925 0.10363 0.04844 0.20377* 0.01348 0 -0.00946 0.06382 0.06069 0.18205* -0.01981 -0.00936 0 0.10290 0.05163 0.04620 0.21036* 0.06869 0.03813* 0.01773 0 0.32298* 0.07371 -0.00616 0.32882* 0.23953* 0.13413 0.16538* 0.13597 0 0.19109 0.08093 -0.00318 0.23788* 0.08506 0.02349 0.05516 0.06249 0.02345 0 -0.05421 0.18717 0.20775* 0.26847* 0.03689 0.08988 0.01415 0.12728 0.34239* 0.22363* 0.04496 0.34811* 0.37076* 0.25107* 0.15830* 0.25783* 0.16445 0.28338* 0.50116* 0.39721* 0.19683 0.07870 -0.01537 0.22409 0.09030 0.03443 0.05970 0.07008 0.01637 -0.06921 0.02048 0.19007* 0.16265* 0.20907* -0.04225 0.0368 -0.00954 0.09487 0.28214* 0.11875 0.02953 0.09539 0.06568 0.15824* -0.03382 -0.00989 -0.03073 0.03204 0.15203* 0.02670 11 12 0 0.05955 0 0.24227 0.40220* 0.03877 0.16797 0.05447 0.20126* 13 14 15 0 0.1259 0 0.03081 -.0161 0 0 *significativo 5% de probabilidade Os resultados mostram como as raças analisadas estão intimamente relacionadas, visto que a diversidade entre elas foi pequena. Isso pode ocorrer devido ao fato de que o mtDNA é altamente conservado, o que levaria a uma semelhança genética, que permite analisar comparativamente as sequências obtidas com outras sequências do GenBank. Análise comparativa com outras populações de cabras A fim de avaliar as relações entre as raças de caprinos brasileiros e outras raças de caprinos em todo o mundo e comparar o grau de diversidade encontrada no Nordeste brasileiro, com outras cabras domésticas e selvagens, usou-se as sequências disponíveis da região controle do mtDNA. Foi feito o alinhamento de 271 sequências de cabras do Brasil e comparando com 24 sequências disponíveis da região controle do mtDNA no GenBank. De 481pb passouse para 447 de modo que às sequências ficassem com o mesmo tamanho para a comparação. Foi realizada uma análise filogenética abrangente, a fim de definir as origens genéticas dos caprinos brasileiros. Foi construída a árvore de NJ a partir das sequências de 271 indivíduos agrupados nos seis tipos de caprinos, 16 sequências de cabras representativas dos 6 haplogrupos já descritos no mundo (A, B, C, D, F e G) por Naderi et al., (2001) e uma sequência da C. pirenaica, como grupo externo com relação aos demais agrupamentos. Para essa análise, poucos foram os valores de bootstrap superiores a 50%. Apenas alguns indivíduos de cada raça aparecem em ramos terminais bem suportados, os demais aparecem relacionados com indivíduos de outras raças do que aqueles da sua própria raça 124 pré-determinada (Figura 3). Este resultado também foi verificado por Lopes (2012) com as raças A topologia resultante na árvore gerada com amostras dos diferentes haplogrupos (isto é, A, B, C, D, F e G) indica que todas as amostras caprinas analisadas do nordeste do Brasil pertencem ao haplogrupo A. A linhagem A é predominante em todos os trabalhos já realizados com caprinos (Luikart et al., 2001; Sultana et al., 2004; Chen et al., 2005; Pereira, et al., 2005; Liu et al., 2007; Naderi et al., 2007; Benjelloun et al., 2011; Piras et al., 2012). Luikart et al. (2001) relatam que a diversidade encontrada no haplogrupo A é resultado do início da domesticação na região do Crescente Fértil e sua expansão pelo mundo. 125 gi 2 9|A 30 s .1|A Af 736 .1| 78 3 17 77 |AJ u e 1 J3 gi27 .1|A 1 |A 8|A 84 66 gi 2 441 3 17 J3 F53 H18 7 9 7 1 A 4 H 71 5 473 12 H 19 75 h31 H2 H 28 1 Ch 29 H 431652 43 H2 Hh H160H8332 11 H 23 H2 6 1110 h3 752675 h3143 H h35 5 H2 H H1 2 H25 5 77 39 H 9 h33 2 h H27363220 330 1032291630 52 9 1 8 H6 5 7 2 10 6 H12 2 47 2 h38 H2 4H1H430 H2 h 6 H1 4 1 0 H1h37 H1 64 35 36 18 H7 F6 |E 94 37 98 62 96 J3 33 aif30|A 317e8u |Gg J 1 2|A 1|b 8. 1 gi 3 50. 72 8 1s 7 17 Fga6 |E1| F6 381. |E 39 34 99 |E F36 51 |A 77B 0111 .1058 |d 7 eu . 1| d as 100 gi31|EF618355.1|b1af as 2a1s 6.1b|B 1782 .1| 4 40|DQ2413 ceu as 0559.1|c gi33|AJ317835.1| 34|AB11 9.1|feu Figura 3. Árvore Neighbour-Joining para os 39 haplótipos encontrados de um fragmento da região D-loop para amostras representativas de cada tipo caprino estudado e representantes dos seis haplogrupos de mtDNA para caprinos (A B2 ;C ;D ;F ;G ; B1 , ). 126 Na figura 4, os resultados encontrados mostram que os caprinos brasileiros das diferentes raças, apareceram na matrilinha A, como uma mistura, separados dos demais grupos que se apresentam bem coesos (B; C; D, F; G). Nesta árvore, o valor de bootstrap mais elevado foi atingido na ramificação periférica envolvendo o nó 98%, enquanto os nós internos apresentaram valores desde 51 até 99%. Nas populações avaliadas, aparecem haplótipos de origem europeia como pode ser observado nos haplótipos (H17, H18, H19 e H31). O H17 presente nas raças Canindé em duas subpopulações (Sobral e Pedro Avelino), Moxotó e Marota. O H18 e H19 referente à subpopulação de Sobral da raça Canindé. O H31 presente na raça Alpina Britânica (Figura 4). 127 Figura 4. Filogenia de caprinos a partir das sequencias de DNAmt da região D- loop. Árvore inferida por analise Bayesiana utilizando o modelo TrN+I+G, com valores de probabilidades a posteriori. 128 CONCLUSÃO A variabilidade de haplótipos nas cabras brasileiras mostrou que, mesmo em áreas muito distante dos centros de domesticação, há uma importante diversidade que pode ser útil em programas de conservação. A caracterização destas raças locais é importante para o uso adequado em programas de seleção que permitam aumentar a produção sem perda de adaptação local. A análise da região D-loop mostra que a ancestralidade materna dos caprinos locais é uma mistura de haplótipos europeus, africanos e asiáticos. Houve maior relação dos caprinos brasileiros com os caprinos europeus. 129 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMILLS, M, et al. Strong phylogeographic relationships among three goat breeds from the Canary Islands. J. Dairy Res. 71:257–262. 2004. AZOR, PJ, et al. 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