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Tipos de morte celular:
Necrose e Apoptose
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009
Objectivos:
• Definir o papel da morte celular em biologia, tanto
fisiológica quanto patologicamente.
• Exemplificar a sua função no desenvolvimento
embrionário, na organogénese, na renovação de células,
na regressão de tumores e ainda em processos
neurodegenerativos
• Definir necrose.
• Listar alguns tipos de necrose e caracterizar as diferentes
alterações celulares.
• Definir a apoptose.
• Identificar e descrever as diferentes vias apoptóticas.
Biologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária
Sandra Morais Cardoso
Homeostase de um organismo
multicelular
Controlada por: Proliferação
– Diferenciação – Morte Celular
Remoção activa de células indesejáveis a uma comunidade social
Controlo social da comunidade
Sobrevivência do organismo
Longevidade das células
• 210 tipos de células diferentes
• Cerca de 5x1011 de células de sangue morrem por dia
• Os neutrófilos vivem 6-7 h na circulação
Em células incapazes de receber sinais de sobrevivência e/ou
capazes de receber sinais de morte
Em células que não podem reparar uma lesão adequadamente
Perda do contacto c/ membrana basal - ANOIKIA (Loss of Home)
Hormonas, citocinas (TNF),
Radiação, citostáticos
Activação de um programa genético de suicídio
Morte celular em diferentes processos
biológicos
Desenvolvimento embrionário
Ex: Formação dos dedos
Sindactilia
Morte celular patológica
Doenças degenerativas
Actividade Dopaminérgica
Evolução da perda neuronal num doente de
Parkinson
Cancro
Necrose:
Morte acidental das células ou de um tecido, por
causas fisiológicas (isquémia, isto é, obstrução
arterial), traumatismos graves ou agentes
infecciosos (fungos, bactérias e vírus)
•
•
Processo passivo (independente de ATP)
Caracterizado por uma destruição massiva da célula:
-Colapso da membrana plasmática e por conseguinte das membranas
dos organelos
-Libertação dos componentes intracelulares
-Geralmente, os restos celulares são difíceis de serem fagocitados, por
falta de emissão de sinais, pelas células do sistema imunológico !
inflamação
Exemplos de doenças onde a necrose está envolvida:
Peste bubónica (peste negra)
•
Pandemia que, no século XIV (Idade
Média), assolou a Europa e dizimou cerca
de 25 a 75 milhões de pessoas (1/3 da
população).
•
Doença infecciosa causada pela Yersinia
pestis, bactéria transmitida ao homem
pelas pulgas dos ratos-pretos (Rattus
rattus) ou outros roedores.
– Estas bactérias (bacilos) invadem os
nódulos
linfáticos
que
ficam
inflamados,
necróticos
e
hemorrágicos.
Doença Vascular
Acidente Vascular Cerebral:
interrupção da irrigação sanguínea (oxigénio e glicose) numa região do
cérebro ! perda da função neuronal;
Existem dois tipos:
Isquémico: falta de irrigação
Hemorrágico: ruptura de um vaso
sanguíneo intracraniano
Factores de risco para AVC:
Hipertensão,
Aterosclerose,
Diabetes,
Colesterol elevado,
Tabagismo,
Álcool,
Problemas cardíacos
Doença Vascular
• Gangrena: é a necrose de um tecido por isquémia, ou
seja, devido a uma obstrução arterial, por embolia,
choque, infecção, ou por exposição a frio intenso
! 1º. perda do fornecimento de
oxigénio e outros nutrientes
! 2º. invasão bacteriana
! 3º. putrefacção do tecido
Gangrena devido a uma úlcera diabetica
Necrose - eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=g4tlx2W8ssY
O que é a Apoptose
Apoptose ou Morte Celular
Programada é um modo de
"autodestruição celular" que
requer energia e síntese
proteica, exercendo o papel
oposto ao da mitose
Apoptose
Condições fisiológicas
Desenvolvimento embrionário - Metamorfose
- Morfogenese
- Sinaptogenese
Adulto - Normal turnover celular
- Selecção tímica negativa
negativa
- Citotoxicidade mediada por células
Regulação defeituosa - Doenças
Cancro, doenças autoimunes
Doenças neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento
Fases da apoptose
A mitocôndria controla a decisão para a morte celular
Receptores Membranares
Apoptóticos
(Família TNF/NGF)
Insultos Celulares
(comp. citotóxicos, radiação,
choque térmico, privação de
Domínio Apoptótico
Molécula
Adaptadora
Pró-Caspase-8
Caspase-8
factores de crescimento)
Citocromo c
Apoptossoma
Pró-Caspase-9
Caspase-9
RE
Insultos ao RE
Pró-Caspase-4
(Tapsigargina)
Caspase-3
Caspase-7
Caspase-6
Caspase-2
Caspase-4
Condensação e
Fragmentação do
ADN
Núcleo
Morte da Célula
Via membranar ou
extrínseca
Via mitocondrial ou intrínseca
Libertação de Citocromo c da Mitocôndria
Ruptura não Específica da
Membrana Mitocondrial
Externa
A) Formação de um megacanal
mitocondrial
não
selectivo
elevada condutância
de
A
(PTP: ANT + VDAC + Ciclofilina D)
![Ca2+], ROS, !"#m,
Bax, !pH, Pi,
$[nucleó
nucleótidos adenina]
B
C
D
Bax
tBid
Formação de Canais
Condutores de Citocromo c
Função Mitocondrial Preservada
(Importante para o processo de
activação das caspases)
(Desagher & Matinou, 2000)
Via mitocondrial ou intrínseca
Morte celular por apoptose
Proteína
Pro-apoptótica
Proteínas
Anti-apoptóticas
Proteínas que promovem ou suprimem a
apoptose
•
Pró-apoptóticas
Caspases
Bax, Bad
Receptores do glutamato
Fas
Par-4
p53
•
Função
Clivagem de enzimas, citosqueleto e canais iónicos
Formação de poros, libertação de Cit c
Influxo de Ca2+, activação de cinases e proteases
Inicia cascata da morte/caspase-8
Disfunção mitocondrial, inibição NF-kB
Transcrição genes de morte, aumento de acção da Bax
Anti-apoptóticas
Bcl-2, Bcl-XL
IAPs
Factores tróficos/Citoquinas
Telomerase
Enzimas antioxidantes
Proteína cinase C%
Proteínas que ligam Ca2+
Estabiliza função mitocondrial, antioxidante
Inibição das caspases
Expressão de enzimas antioxidantes, proteínas
reguladoras de Ca2+, IAPs, Bcl-2
Previne o encurtamento dos telómeros
Reduz o stresse oxidativo
Estimula a expressão de NF-kB
Homeostase de Ca2+
APOPTOSE
Activação de Caspases
(cysteine-aspartic proteases)
&
Activação de endonucleases
&
Fragmentação do DNA
Apoptose: eventos celulares
http://www.youtube.com/watch?v=witLM-V2v8
Análise da Apoptose
•
•
•
•
•
•
Anexina
Br-dUTP
TUNEL
Imunohistoquímica
Função mitocondrial
Microarrays
Anexina
PI
•
•
•
•
Annexin V
São proteínas que ligam fosfolipidos na presença de cálcio
As alterações celulares que ocorrem durante o processo apoptótico
incluem a perda da assimetria dos fosfolípidos numa fase inicial
Os conjugados de Anexina V são utilizados para se detectar células
apoptóticas
Utiliza-se a Anexina V marcada fluorescentemente (Citometria de fluxo,
microscopia de fluorescência e confocal)
“DNA Laddering”
•
•
•
•
Degradação do ADN genómico em fragmentos de 180-200 pb
A fragmentação cria locais 3’-OH
Estes locais podem ser marcados com Br-dUTP (bromodeoxiuridina
trifosfato)
Pela acção da TdT (transferase terminal)
“Microarrays”
• Análise da expressão génica diferencial
• Genes agrupados em famílias de genes
Nº total de genes envolvidos na apoptose: 198
Apoptose na clínica
• Seres humanos têm aproximadamente 1014
células
-Capazes de entrarem em apoptose
• O processo apoptótico pode ficar comprometido
-Pode resultar numa morte celular inapropriada dando origem a doença
• Potencial uso terapêutico
-Modulação da apoptose para o tratamento de doenças
Factores Genéticos e Ambientais podem
desencadear a apoptose:
Disorder
AD
PD
HD
ALS
Genetic factors
APP, Presenilin mutations, ApoE
'-synuclein, parkin mutations
Poly-CAG expansions in huntingtin
Cu/Zn-SOD mutations
Environmental factors
Head trauma, low education, calorie intake
Head trauma, toxins, calorie intake
Toxins, autoimmune response
Doença de Alzheimer
* Doença neurodegenerativa que ocorre tardiamente:
- clinicamente ( decréscimo progressivo da capacidade cognitiva
- primeiro sintoma da DA ( declínio da memória recente
* Estadio inicial da DA: Alteração do citosqueleto por hiperfosforilação anormal
da proteína tau (neurónios piramidais corticais)
-
A
tau
fosforilada
dissocia-se
dos
microtúbulos
(
filamentos
insolúveis
* Cortex cerebral de doentes de DA: depósitos extracelulares de b-amilóide (Ab,
)4 kDa); Ab - produto minoritário do metabolismo da APP
Evidências de morte celular por apoptose:
- decréscimo Bcl-2 em neurónios contendo tranças neurofibrilhares
- aumento dos níveis de Bax (obs. antes da clivagem do ADN)
- abertura PTP; libertação citocromo c; activação de caspases
“Gostaria de não ficar inutilizada e se possivel melhorar”
(Escrito por um doente de Alzheimer)
Doença de Poliglutaminas
•
Causadas por repitição do codão CAG, que codifica a glutamina
Disease
Gene name
Chromosomal
location
Pattern of
inheritance
Protein
Normal repeat
length
Disease repeat
length
Spinobulbar
muscular atrophy
(Kennedy disease)
AR
Xq13–21
X-linked recessive
androgen receptor
(AR)
9–36
38–62
Huntington disease
HD
4p16.3
autosomal dominant
huntingtin
6–35
36–121
Dentatorubralpallidoluysian
atrophy (Haw River
syndrome)
DRPLA
12p13.31
autosomal dominant
atrophin-1
6–35
49–88
Spinocerebellar
ataxia type 1
SCA1
6p23
autosomal dominant
ataxin-1
6–44
39–82
Spinocerebellar
ataxia type 2
SCA2
12q24.1
autosomal dominant
ataxin-2
15–31
36–63
Spinocerebellar
ataxia type 3
(Machado-Joseph
disease)
SCA3
14q32.1
autosomal dominant
ataxin-3
12–40
55–84
Spinocerebellar
ataxia type 6
SCA6
19p13
autosomal dominant
'1A-voltagedependent calcium
channel subunit
4–18
21–33
Spinocerebellar
ataxia type 7
SCA7
3p12–13
autosomal dominant
ataxin-7
4–35
37–306
Spinocerebellar
ataxia type 17
SCA17
6q27
autosomal dominant
TATA binding
protein
25–42
45–63
Mecanismos
celulares
Biologia da Proteólise:
Autofagia e Sistema Ubiquitina
Proteassoma
Biologia Celular e Molecular, 2008/2009
Objectivos:
• Descrever o processo autofágico e relacionar este
processo com a doença.
• Descrever autofagia celular como a chave para o
desenvolvimento de novos tratamentos contra o cancro,
doenças degenerativas e infecções.
• Descrever o papel dos lisossomas na função celular.
• Identificar as doenças associadas à disfunção dos
lisossomas.
• Definir o papel do sistema ubiquitina-proteassoma na
função celular.
• Identificar as doenças associadas à disfunção do
proteassoma.
ENDOPLASMIC RETICULUM (ER)
Rough ER
Smooth ER
Nuclear envelope
Nucleolus
NUCLEUS
Chromatin
Flagelium
Plasma membrane
Centrosome
CYTOSKELETON
Microfilaments
Intermediate filaments
Ribosomes
Microtubules
Microvilli
Golgi apparatus
Peroxisome
Mitochondrion
Lysosome
Lisossomas: compartimentos
Digestivos
Lisossoma
–
–
–
–
É um organelo membranar do citosol das células
Contem várias enzimas hidrolíticas
Tem um pH de 4.5 a 5.5
Tem como função a digestão intracelular
Digestivos
As enzimas do lisossoma são as hidrolases
Peptidases
DNAases
RNAases
Lipases
Fosfatases
Glucosidases
Carboxilases
Sulfatases
Esterases
Existe uma hidrolase para cada tipo de biomolécula
Digestivos
nucleótidos
H+
Bomba de protões
glucose
H+
H+
H+
H+
Glicoproteínas que protegem
contra a hidrólise
Transportadores
membranares
aminoácidos
Função dos lisossomas
•
Fagocitose: processo pelo qual as células internalizam material do
meio extracelular (<0.5 !m) que é depois digerido pela acção do
lisossoma. Ex: macrofagos
•
Autofagocitose ou autofagia: processo pelo qual as células degradam
organelos velhos ou danificados
•
Endocitose mediada por receptores: processo pelo qual as células
que
tem
determinados
receptores
tomam
determinadas
macromoléculas. Ex: hormonas, anticorpos, lipoproteínas
Digestão intracelular
1 µm
Nucleus
Fagocitose
Lysosome
Lysosome contains
active hydrolytic
enzymes
Food vacuole
fuses with
lysosome
Hydrolytic
enzymes digest
food particles
Digestive
enzymes
Lysosome
Plasma membrane
Digestion
Food vacuole
(a) Phagocytosis: lysosome digesting food
Autofagocitose
Fagocitose
Doenças associadas aos lisossomas
Aspartylglucosaminuria
Batten Disease
Cholesterol Ester Storage Disease
Cystinosis
Danon Disease
Fabry Disease
Farber Disease
Fucosidosis
Galactosialidosis
Gaucher Disease
GM1 Gangliosidosis
GM2 Gangliosidosis (AB Variant)
Hunter Disease
Hurler Disease
Hurler-Scheie Disease
I-Cell Disease (mucolipidosis II)
Infantile Free Sialic Acid Storage
Disease
Jansky-Bielschowsky Disease
Krabbé Disease
Kuf Disease
Mannosidosis
Maroteaux-Lamy Disease
Metachromatic Leukodystrophy
Morquio A Disease
Morquio B Disease
Mucolipidosis IIIC
Mucolipidosis IV
Mucopolysaccharidosis IX
Multiple Sulfatase Deficiency
Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
Niemann-Pick Disease A, B, C1, and C2
Northern Epilepsy
Pompe Disease
Pseudo-Hurler Polydystrophy (mucolipidosis
IIIC)
Pycnodysostosis
Salla Disease
Sandhoff Disease
Sanfilippo disease A, B, C, and D
Santavuori-Haltia disease
Scheie Disease
Schindler Disease
Sialidosis
Sly disease
Sphingolipid Activator Protein Deficiency
Tay-Sachs Disease
Wolman Disease
Sistema Ubiquitina-Proteassoma:
processo de degradação proteica
• Ubiquitinação
– Marcação da proteína alvo a uma cadeia de
poliubiquitina
– Direciona estas proteínas para o proteassoma
• Proteassoma
– É um complexo multienzimático que degrada
proteínas
– Estas enzimas são proteases
Via da Ubiquitinação
E2, conjugadora
da ubiquitina
E1, activadora da
ubiquitina
4 monomeros de
ubiquitina
E3, ligase da
ubiquitina
Translocação de proteínas marcadas
DUB: Enzimas que desubiquitinam ou são proteases específicas para a ubiquitina;
ambas removem a ubiquitina das proteinas alvo, impedindo a sua degradação
Proteólise
A subunidade 20S do proteassoma tem 3 subunidades catalíticas com diferentes
especificidades para o substracto:
-“Quimiotripsina-like”
-“Tripsina-like”
-“PHGH-like” (peptidyl-glutamyl peptide-hydrolyzing)
O resultado da proteólise são polipeptídeos de 4 a 25 resíduos
Via de degradação
• Essencial para muitos
processos celulares:
Ciclo celular-mitose
Expressão génica
Respostas ao stress oxidativo
Apoptose
• Produtos da degradação:
Pequenos peptídeos
Factores de transcrição activos-NFkB
Reguladores do ciclo celular activosp53
Função do Proteossoma
http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc
Disfunção do proteossoma
• Inibição
Actividade anti-tumural
Redução das lesões da psoriase
Efeito positivo na asma
Doenças associadas ao
proteossoma
• Directamente: Duas formas familiares de
Parkinson:
Mutação no gene da parkina (ligase E3 da ubiquitina)
Mutação no gene da UCHL1 (terminal carboxilico da hidrolase 1 da
ubiquitina)
• Indirectamente: Doença de Parkinson
Doença de Creutzfeldt-Jakob
Doença de Huntington
Doença de Parkinson
• Afecta 1-2 % da população >65 anos
• Esporádica ou familiar
• Marcadores Neuropatológicos:
- Morte dos neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta
seguida de perda da inervação dopaminérgica do striatum
- Corpos de Lewy ('-sinucleína agregada)
• Característica clínicas:
- distúrbios extrapiramidais : bradicinésia, tremor de repouso, rigidez
Kuru
Doença neurológica descoberta em 1950 no povo Fore da Papua Nova Guiné
Tipo de encefalia espongiforme
Sintomas: tremores
Doença Creutzfeldt-Jakob
• Afecta 1-1000000 de indivíduos
• Idade média de início 50 anos
• Sintomas:
perda de memória, tremores, desordem na marcha, postura rígida e ataques
epilépticos devida à uma rápida perda de células cerebrais causada por uma
proteína transmissível chamada prião
Doença de Hungtinton
Doença de Hungtinton
•
•
•
Idade média de início: 40-50 anos (tb alguns casos de ocorrência
juvenil)
Morte dos doentes após 10-20 anos
Autossómica dominante (1:10000 indivíduos)
•
Marcadores Neuropatológicos:
- Morte dos neurónios ao nível do estriado, envolvido na iniciação dos
movimentos voluntários, e do cortex cerebral
•
Característica clínicas:
- Movimentos involuntários, frequentes e rápidos,
- Redução da função cognitiva e demência progressiva distúrbios
Lysosome containing
two damaged organelles
Mitochondrion
fragment
Peroxisome
fragment
1µm
Autofagia
É um processo catabólico que
envolve
a
degradação
de
componentes celulares através da
maquinaria do lisossoma
Permite manter a homeostase celular, entre a síntese e a degradação
de produtos celulares
Tipos de autofagia
Macroautofagia
Caracteriza-se pela sequestração de organelos ou de proteínas numa vesícula
membranar- autofagossoma- que posteriormente funde com o lisossoma –
autofagolisossoma- sendo o seu conteúdo degradado por hidrolases
lisossomais
Tipos de autofagia
Microautofagia
Ocorre quando os lisossomas “engolem” partes do citoplasma
H+
H+
Tipos de autofagia
Desde o principio…
Autofagia: visualização por M.E.
Funções da autofagia
• Privação de nutrientes
– Durante o jejum prolongado, os níveis de autofagia aumentam: !
degradação de componentes celulares não vitais e, consequentemente, !
libertação de nutrientes para a própria célula ! processo de sobrevivência,
adaptativo, da célula e do organismo.
• Infecção
– Quando as células são infectadas por determinadas bactérias, o processo
autofágico é activado como forma de as eliminar.
• Morte celular autogáfica (autophagic cell death)
– Morte celular tipo II
Regulação da autofagia
Estimulam a autofagia
TOR-Regulador da autofagia
Inibem a autofagia
Como é que a autofagia mata uma célula?
Autofagia massiva (Morte celular tipo II)
Durante este processo ocorre a destruição de largas porções de citosol e de
organelos, causando uma irreversível atrofia celular, induzindo o colapso da
função celular.
Autofagia activa a Apoptose (Morte celular tipo I)
A autofagia desenvolve-se como a primeira resposta ao estimulo (stress) e só
depois activa a apoptose que vai ser responsável pela morte celular
A relação entre a autofagia e a apoptose
Interacção entre a autofagia e a apoptose
Doenças associadas
• Indirectamente: Doença de Parkinson
Doença de Alzheimer
Doença de Huntington
Cancro
SIDA
HIV-SIDA
•
A SIDA é provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (human
imunnedeficiency virus, HIV), podendo a sua transmissão ocorrer por:
– relações sexuais,
– contacto com sangue infectado (por exemplo, transmissão de mãe para filho
durante a gravidez ou durante o parto),
– amamentação (transmissão de mãe para filho).
•
A SIDA matou mais de 20 milhões de pessoas nos últimos 20 anos.
•
Ao atingir o sistema sanguíneo do organismo humano, o VIH começa de
imediato a reproduzir-se nos linfócitos T4 (células CD4+) conduzindo-os à
sua morte.
•
Sob a acção do vírus, a função de defesa do organismo fica enfraquecida; a
pessoa infectada, ou seropositiva, torna-se mais vulnerável à infecção por
outras bactérias e vírus ! doenças oportunistas: são exemplos as formas
raras de pneumonia, toxoplasmose, candidose, meningite criptocócica e
cancros, como o Sarcoma de Kaposi.
HIV-SIDA
•
No início ! infecção aguda (até quatro semanas após o contágio)
– O indivíduo infectado manifesta vários sintomas pouco característicos,
semelhantes aos de uma gripe;
•
O vírus continua-se a multiplicar, podendo o indivíduo ser seropositivo e
não apresentar quaisquer sintomas por um período de tempo longo
(exemplo, 15 anos);
•
O organismo já não consegue repor completamente a quantidade de
células CD4+ destruídas pelo vírus; esta fase caracteriza-se por uma
imunodepressão moderada, com sintomas e sinais associados:
emagrecimento, suores nocturnos, diarreia prolongada e febre;
•
O indivíduo seropositivo passa a desenvolver a doença – SIDA –quando
as células CD4+ baixam para valores inferiores a 200 celulas por mililitro
de sangue, ficando o organismo desprotegido ! infecções e/ou doenças
oportunistas.
HIV-SIDA
HIV-SIDA
Cancro
Cancro
Bibliografia
•
•
Papers:
-
Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol, 21: 165-170 (2002)
–
Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to
less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 931-937 (2007).
–
Ravikumar
huntingtin:
(2006).
B, Rubinsztein DC. Role
a step towards therapy?
molecular
Espert L et al. Autophagy and
(Review). Autophagy. 3: 32-34 (2007).
-
Karantza-Wadsworth
V,
White
Autophagy. 3: 610-613 (2007)
–
Kanduc D et al.
21: 165-170 (2002)
–
Maiuri
MC
et
al.
Self-eating
and
self-killing:
and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 741-752 (2007)
–
Thorburn
A.
Apoptosis
and
autophagy:
regulatory
supposedly different processes. Apoptosis (in press, 2008)
Cell
death:
in
of autophagy in the clearance of mutant
(Review) Mol Aspects Med, 27: 520-527
–
E.
understanding
CD4+
Role
apoptosis
T
lymphocyte
of
versus
destruction
autophagy
necrosis
in
breast
(review).
Int
crosstalk
between
connections
by
HIV-1
cancer.
J
Oncol,
autophagy
between
two
Livros:
- Alberts et al. Cell Biology: Chapter 18
Biologia das células estaminais:
Terapias Celular e Génica
Biologia Celular e Molecular 2008/2009
Objectivos:
•
Definir o que são células estaminais.
•
Identificar os diferentes tipos de células estaminais.
•
Explicar o cancro como uma doença das células estaminais.
•
Analisar a aplicabilidade da terapia celular na prática clínica.
-Doenças autoimunes
-Diabetes
-Doenças Neurodegenerativas
•
Descrever a Terapia Génica como um novo ramo terapêutico da medicina
moderna.
•
Analisar a aplicabilidade da terapia génica na terapia celular
-Exemplificar a importância dos siRNA
Células estaminais
• Células indiferenciadas com capacidade proliferativa.
• Podem-se diferenciar em diferentes tipos celulares em
resposta a diferentes estímulos.
• Têm o potencial de se desenvolver em células maduras,
com funções especializadas
Classificação das células estaminais
• Células Totipotentes:
Zigoto ou Ovo fertilizado
• Células Pluripotentes:
Células que dão origem a todas as
células das camadas embriónicas
germinativas
• Unipotente: dão origem a um
tipo específico
de células
Células estaminais embrionárias
Oviducto
Derivam do embrião antes
da sua implantaçãono útero
Células estaminais da placenta e
do cordão umbilical
•
Uma fonte de células estaminais não
embrionárias é o sangue do cordão
umbilical, que possui uma grande
concentração de células estaminais
hematopoiéticas, para além de células
estaminais mesenquimais e células
estaminais/progenitoras endoteliais.
•
Estas células estaminais neonatais
podem ser colhidas e processadas logo
após o nascimento, num processo
totalmente seguro e indolor para a mãe e
para o recém-nascido, tendo substancial
aplicabilidade terapêutica
Células estaminais adultas
Como qualquer célula estaminal divide-se durante longos
períodos dando origem a cópias idênticas,
Podem dar origem a diferentes tipos de células
diferenciadas
Tipicamente são
chamadas de células
precursoras ou
progenitoras de um
determinado tipo de
células diferenciadas
Tipos de células estaminais adultas
• Células estaminais neuronais:
-
na zona Subventricular
na zona Ventricular
no Hipocampo
no cérebro fetal
na crista neural
• Células estaminais da medula óssea e sangue:
-
Hematopoiéticas
Medula óssea
• Células estaminais adultas em diferentes tecidos:
-
Células progenitoras endoteliais
Células musculo esquelético
Células precursoras epiteliais da pele e sistema digestivo
Células do pâncreas e fígado
Plasticidade de células estaminais adultas
Doenças autoimunes
• Tem de distinguir os mais variados componentes celulares do próprio
corpo dos componentes celulares dos organismos invasores
•Infecção versus Doenças autoimunes
•
•
Pneumonia
Cistite
•
•
•
Esclerose múltipla
Diabetes tipo1
Lúpus
Sistema Imunológico
•
•
•
No Timo as células T são educadas a
distinguirem as proteínas do próprio
corpo das outras
As células T auto-reactivas, são
eliminadas no Timo
Se o sistema falha: doenças auto-imunes
Células estaminais hematopoiéticas
• Hematopoiese:
todas as células derivadas de uma única
célula precursora, o hemocitoblasto, que dá origem a um
progenitor para cada tipo de célula
- Eritrócitos
- Leucócitos
- Plaquetas
Diferenciação das células hematopoiéticas e da medula
Selecção de células estaminais hematopoiéticas
Células ligadas
a ferro
FACS
Células
marcadas com
fluorescência
(1:10000
células)
Cancro
uma doença das células estaminais
•
As células estaminais adultas permaneceram no organismo durante
um período de tempo alargado, podendo acumular mutações próoncogénicas.
•
As células estaminais (em constante divisão) podem facilmente
adquirir um fenótipo tumorogénico.
•
O transplante de células estaminais em indivíduos adultos pode
conduzir à formação de tumores: teratocarcinomas, tumores
complexos derivados de células embrionárias pluripotentes. No
entanto nunca foram encontradas metástases após transplantes de
células estaminais embrionárias.
Terapêutica
•
•
-
Drogas anti-inflamatórias, imunossupressores (esteróides,
inibidores de citocinas)
Transplante de células hematopoiéticas do próprio indivíduo
(autólogo)
Injecções de um factor de crescimento: libertação de células
estaminais da medula óssea para a corrente sanguínea
Isolam-se as células estaminais do sangue do doente
Faz-se quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar as células
maduras do sistema imunológico
Transfusão das células estaminais, que migram para a medula
óssea onde se começam a diferenciar
7 doentes com Lúpus receberam este tratamento e durante 3 anos
não necessitaram de medicação imunossupressora
•
Diabetes
Caracterizada por níveis elevados
de
glicose
(hiperglicemia).
no
sangue
•
Os sintomas mais comuns são:
secreção excessiva de urina
(poliuria), sede (polidpsia) e fome
(polifagia) intensas.
•
O diabetes tipo 1 é uma doença
autoimune
caracterizada
pela
destruição
das
células
beta
pancreáticas pelas células do
sistema imune, e os pacientes
necessitam de injecções de insulina
exógena para sobreviver.
•
O diabetes tipo 2, está intimamente
relacionado a obesidade e atinge
principalmente pessoas com mais
de 40 anos.
How are embryonic stem cells stimulated to differentiate?
Doenças Neurodegenerativas:
! Segunda doença neurodegenerativa mais comum
- idade média de início: 55 anos
! Afecta 1-2 % da população > 65 anos
! Idade é o principal factor de risco
Características clínicas
! ~80% dos casos de Parkinsonismo
! distúrbios motores graves
- bradicinésia (lentidão de movimentos)
- tremor de repouso
- rigidez
Na doença de Parkinson a via nigrostriatal degenera
! Perda acentuada de neurónios dopaminérgicos que projectam para o putamen
e modesta dos neurónios que projectam para o caudate
! Despigmentação da SNpc devido à perda de neurónios dopaminérgicos (perda
do pigmento castanho escuro neuromelanina)
Início dos sintomas: ~80% de
deplecção de DA no putamen e
~60% de morte de neurónios
dopaminérgicos na SNpc
Terapias na doença de Parkinson
Terapias Neuroprotectoras
"Antioxidantes
" L-DOPA
" Agonistas dopaminérgicos
" Antagonistas dos receptores do glutamato
" Inibidores da NOS
Terapias Cirúrgicas
" Estimulação cerebral profunda
" Palidotomia
Terapias de Substituição Celular
" Transplantes: células neuronais fetais
células estaminais embrionárias
células estaminais neuronais adultas
Transplante de células neuronais fetais dopaminérgicas
Problemas:
éticos (neurónios de mesencéfalo de fetos com 6 a 9 semanas)
células não formam sinapses
viabilidade e funcionalidade das células
aquisição de um fenótipo dopaminérgico
Investigação em células estaminais:
porquê?
http://www.youtube.com/watch?v=a9WB_PXjTBo
Ensaios clínicos em 2005:
10% doenças hereditárias monogénicas (ex: fibrose quística, SCID)
66% doenças poligénicas (ex: cancro)
Embora esta tenha muito potencial, é ainda muito experimental
Fase I: número pequeno de pacientes que são cuidadosamente observados, sendo dada
atenção especial a quaisquer efeito colateral detectados. Testada em várias doses, com o
objectivo de descobrir a dosagem ideal.
Fase II: se o tratamento apresenta
um efeito positivamente útil, será
testado num número maior de
pacientes
Fase III: Geralmente, esse ensaio envolve a comparação do novo tratamento com o que
tem sido o tratamento padrão até o momento. Num ensaio aleatório, geralmente metade dos
pacientes recebem o tratamento padrão e metade, o tratamento experimental.
A promessa:
•
Transplantes terapêuticos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Podem crescer em cultura indefinidamente (fáceis de manter)
Pluripotentes (formam vários tipos de células)
A presença de vírus/doenças transmissíveis pode ser analisada
Assumem o fenótipo das células vizinhas após transplante
Possuem a capacidade de migração após transplante
Produzem factores que contribuem para a reparação tecidular
Terapia Génica
• É um novo ramo terapêutico da medicina moderna.
• Permite a transferência de informação genética em células,
tecidos ou órgãos de pacientes para que o produto da sua
expressão possa curar ou retardar a progressão da
doença.
Terapia Génica
• Esta abordagem permite tratar doenças:
- eliminando genes deletérios
- substituir genes anormais por genes normais
- introduzir genes que codificam proteínas mediadoras, por
ex do sistema imunológico que ajudem a combater o
cancro
Tipos de Terapia Génica
• Terapia Génica in situ – O gene(s) terapêutico
transportado por um vector é directamente administrado
ao tecido afectado.
• Terapia Génica in vivo - O gene(s) terapêutico
transportado por um vector é directamente administrado
ao doente.
• Terapia Génica ex vivo – As células do paciente são
colhidas e semeadas em laboratório. São incubadas
com vectores que transportam o gene terapêutico. As
células com a nova informação genética são colhidas e
transplantadas no paciente.
Terapia génica: onde?
• Terapia germinativa – O gene é inserido no DNA das
células germinativas (óvulo ou espermatozóide), de
modo a que a descendência tenha o gene inserido.
• Terapia somática – Envolve a manipulação da
expressão génica em células que ser alteradas no
paciente mas não nos seus descendentes. As células
somáticas incluem todas as células do corpo humano
menos as reprodutivas.
Vectores: veículos que transportam e protegem o DNA até à
sua chegada a uma população celular alvo
• Viral
• Não viral
integram o seu material
genético no genoma
hospedeiro
Físico
-Retrovirus
-Lentivirus (HIV)
-Adeno-associados
Químico
-Injecção do DNA livre na célula
-Electroporação
-Lipossomas
Mantêm o seu material genético
epissomal
-Adenovirus
Terapia Génica: Doenças
genéticas
• SCID ligada ao X (Severe Combined Immune
Deficiency)
-
Mutação no gene que codifica a proteína "c presente na membrana
celular dos precursores dos linfócitos
Estes não diferenciam em linfócitos NK e T
3 das 17 crianças tratadas desenvolveram leucemia
• Hemofilia
- Mutação nos genes que codificam factores de coagulação
- O gene terapêutico foi inserido no fígado dos doentes
- O efeito terapêutico foi transiente, pois as células geneticamente
modificadas foram destruídas pelo sistema imune dos doentes.
Terapia Génica: Doenças
adquiridas
• Cancro
Terapêutica: Terapia Génica suicida; Terapia viral oncogénica ( Vírus
modificados que reconhecem as células tumorais e promovem a
sua lise) etc.
2/3 dos ensaios clínicos são para cancro
• Doenças Neurodegenerativas
Terapêutica: Remover células da pele de
doentes de Alzheimer, introduzir o gene que
codifica o NGF (Nerve growth factor),
e injectar estas células no cérebro dos doentes.
Terapia Génica & Terapia Celular
• Terapia Celular –
Infusão ou transplante de células num
paciente para o tratamento de doenças herdadas ou adquiridas
Sobreposição das terapias génica
e celular:
Ex – Utilização de linfócitos-T no
tratamento do cancro. Muitos
tumores são reconhecidos e
destruídos pelas células T dos
doentes. Isolam-se os linfócitos-T
e expandem-se fora do corpo,
para depois serem administrados
ao doente. Estas células podem
ser manipuladas geneticamente
por forma a tornarem as células
eficientes a matarem as células
tumorais.
Manipulação genética e selecção das células
estaminais em cultura
Para introduzir o material genético no interior da célula é necessário fazer chegar o
gene até às células defeituosas.
Transfecção, processo de entrega e expressão de material genético com sucesso.
(lipossomas, DNA desaparece em poucos dias ou semanas se transiente)
(vector viral, transfecção estável, integração no genoma da células hospedeiras,
mas episomal)
Integração “random”
-silenciamento de genes,
-introdução de mutações
Recombinação homóloga
(processo de reparação do DNA)
Processo raro
Integração do transgene no genoma das células
Terapia génica: Hoje
Janeiro, 2008
• Distrofia Muscular Duchenne
Gene que codifica a proteína distrofina (A
distrofina é uma proteína que faz parte do
complexo que liga o citoesqueleto de uma fibra
muscular à matrix extracelular, através da
membrana celular) está presente no
cromossoma X. Mutações neste gene dão
origem à distrofia muscular Duchenne em
indivíduos do sexo masculino.
Injecção no musculo: gene da distrofina
Terapia génica: Hoje
Outubro, 2007
(SCID) (severe combined immunodeficient)
por deficiência da adenosina deaminase
(ADA)
Estes doentes não têm linfócitos-T e têm poucos ou disfuncionais linfócitos B.
Terapêutica: Transplante de medula ossea.
Ou Terapia Génica: o gene da ADA é inserido nas células da medula
óssea do próprio doente. Estas células são depois administradas ao doente após
uma depleção moderada das células da medula óssea.
RNAi em células estaminais
•
O RNA de interferência pode ser usado para manter um
determinado nível de actividade de um gene.
•
A supressão estável de genes deletérios por RNAi, em células
estaminais adultas isoladas e modificadas ex vivo e depois
reintroduzidas, pode ser uma nova estratégia no tratamento de
determinadas doenças.
RNA de interferência
RNA de interferência (RNAi):
• Processo biológico
altamente conservado,
desde os nemátodos até
ao homem.
• Regulação da expressão
génica por silenciamento
RNA de interferência e sua importância na
biomedicina molecular
Aplicações
1.
Análise funcional de genes (genómica funcional)
a supressão estável dos genes pode ser induzida nas
células de mamíferos, permitindo estudar os seus
fenótipos em várias gerações de células,
estudo de genes implicados nas vias metabólicas;
2.
3.
Identificação de genes implicados no processo
tumoral;
Desenvolvimento
terapêuticas:
de
novas
abordagens
cancro " inibição da expressão de oncogenes ou de
genes que conferem resistência à quimioterapia,
A quase totalidade
dos 19 000 genes do
C.
elegans
foi
estudada por RNAi.
doenças virais " inibição da replicação do vírus da
SIDA ou do vírus da hepatite.
A promessa:
• Terapia génica
1.
2.
3.
São facilmente transfectáveis com genes terapêuticos,
podendo expressar mais de um gene de interesse
Apresentam uma implantação correcta no tecido
hospedeiro, permitindo a transcrição genética, logo a
expressão proteíca
Migram para áreas lesadas, permitindo a “distribuição”
de genes em diferentes áreas (cérebro)
Bioética
• O que é a vida?
• Um ser Humano vivo tem de ser protegido jurídica,
ética e moralmente.
Critérios de morte cerebral por declaração da Ordem dos Médicos
prevista no artigo 12º da Lei nº 12/93 de 22 de Abril, pressupõem
que a certificação requer a demonstração da cessação das funções
do tronco cerebral e da sua irreversibilidade. Após se assegurarem
as condições prévias, como por exemplo a ausência de respiração
espontânea e se observarem as regras de semiologia, que
presupõem a ausência na totalidade de determinados reflexos do
tronco cerebral, a verificação de morte cerebral requer entre outras
metodologias a execução das provas de morte cerebral por dois
médicos especialistas.
Bioética
•
Portanto, se um indivíduo morto é aquele que não responde a um
estimulo doloroso, não respira espontaneamente, etc
então será cientificamente correcto dizer que um zigoto ou óvulo
fertilizado não é um indivíduo vivo, mesmo que tenha todo o
potencial de vir a ser?

Pdf`s Prof Sandra

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