Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin Sulfate A
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Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin Sulfate A
Trabalha de Pesquisa Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin Sulfate A fCiprovetTMJ as a Treatment to Experimental Corneal Ulcer in Rabbits José Joaquim Titton Ranzani' Daniela Nogueira Cremonini2 Cláudia Valéría S. Brand8.oJ Geórgia Nadalini Rodrígues4 Noeme Sousa Rachas Rodrigo Mannarino6 Adalberto José Croccí7 -~-Ranzani JJT, Cremonini DN, Brandao CVS, Rodrigues GN. Rocha NS, Mannarino R. Croccí AJ. Avalia~iío do uso t6pico de 5ulfato de condroitina A (Ciprove~ no tratamento de úlcera de c6mea experimental em coelhos. MEDVEP Rev Cienlif Med Vet Pequen05 Anim Anim Estim 2004; 2(5):51.6. \ Pretendeu-se avaliar a eficácia do sulfato de condroitina A como tratamento de úlceras de córnea experimentais ern coelhos, analisando-se seu potencial antiinflamatório, alérn da redu~óo de tecido cicatricial por ele promovida. Utilizaram-se 15 coelhos, divididos ern tratados e nóo tratados, subdivididos ern tres grupos de cinco animais cada, sacrificados no sétimo, 14° e 30° dias após a ceratedornia. Esta, do tipa lamelar, foi feíta ern ambos os olhos, sendo urn deles tratado corn Ciprovet~ colírio (sulfato de condroitina A e ciprofloxacina associados) e o contralateral, como controle, corn colírio de ciprofloxacina. Os olhos forarn avaliados quanto aos sinais clínicos, bern como suas córneas, ern exame histopatológico. Quanto aos sinais, verificouse hiperernia de conjuntiva e blefarospasmo nos dois primeiros dias e teste de fluoresceína pasitivo até, no máximo, o 5° dio. Nóo se observou diferen~a quanto aos sinais clínicos entre os grupas tratados e nóo tratados. No corte histológico, puderarn ser vistos maior organiza~óo lamelar, melhor distribui~óo de colágeno e fibrócitos e menor edema estromal, no grupo tratado corn Ciprove~ , indicando assirn urna cicatriza~óo mais eficiente. PALAVRAS-CHAVE: Úlcera da córnea/patologia; Coelhos; Sulfatos de condroitina. .Apoio financeiro: FAPESP (Auxílio Pesquisa e Bolsa de Aprimoramento Técnjco -nívellll) 1 Docente do Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária -FMVZ -UNESP -Botucatu, Departamento de Cirurgia e -Veterinária Botucatu, SP; e-mail: QUimOfmvz.unesp.br 2 Mestranda em Medicina Veterinária -Departamento UNESP- -FMVZ -UNESP; Dist. Rubiao Jr, s/n -CEP de Cirurgia e Anestesjologia Veterinária SP; 18618.OQO. -FMVZ Botucatu, SP -FMVZ UNESP -Botucatu, -Botucatu, SP -FMVZ- SP -UNESP -FM- MedveP -UNESP -Botucatu, SP UNESP -Botucatu. SP ., -UNESP -Botucatu. SP - Pequenos Animais e Animais de 2(5):51-6 - INTRODU(;ÁO A córnea é composta por quatro camadas: epitélio, estroma, membrana de Descemet e endotélio. Sua transparencia é atribuído a ausencia de vasos sangüíneos e pigmento, ao epitélio nao queratinizado e ao arranjo ordenado de suas fibrilas colágenas, as quais estao dispostas em laminas paralelas a superfície corneana; seu grau de hidrata~ao também contribui para a sua transparencial,2. O estroma da córnea é formado por fibrilas colágenas (Tipo I e II), queratócitos e fibras nervosas amielínicas. A matriz extracelular é composta por glicosaminoglicanos (sulfato de condroitina/ dermatana, queratossulfoto, ácido hialuronico) e proteoglicanos, essenciais para a manuten~ao da adequada hidrata~ao da córnea1,2. Similarmente a fun~ao dos condrócitos no tecido cartilaginoso, os queratócitos sao responsáveis pela manuten~ao e renova~ao da matriz extracelular, secretando o cológeno e os glicosaminoglicanos (GAGS)2. Os GAGs sao polissacárides de alto peso molecular, que podem apresentar-se como: polímeros monossulfatados, entre eles o sulfato de condroitina; polímeros polissulfatados; e polímeros nao sulfatados, como o ácido hialuronico2. O proteoglicano e o cológeno tipo I constituem os principais componentes do estroma corneano. Os proteoglicanos ocupam a regiao entre as fibrilas de colágeno e influenciam no organiza~ao estromal. Assim, eles podem representar um importante papel no manuten~ao da transparencia corneana3. Os glicosaminoglicanos sulfotados atuam como antiinflamatórios, uma vez que inibem competitivamente várias enzimas lisossomais e proteases, incluindo beta-glicosaminidase, betaglucuronidase, catepsina e elastase; também possuem efeitos inibitórios sobre o influxo leucocitário, síntese de prostaglandina E2, síntese de interleucina le forma~ao de complementos. Outro efeito desta substancia é estimular o aumento do diametro das fibras colágenas, influenciando assim sua matura~ao. Portanto, possui efeito condroprotetor, pois reduz a a~ao enzimática destrutiva local, e estimula a regenera~ao da cartilagem.'5,6,7,8. O sulfato de condroitina (SC) é um GAG encontrado predominantemente no cartilagem articular e é um componente natural de diversos outros tecidos corporais, como tendaes, ossos, discos vertebrais, cora~ao e córnea9. Estimula a 52 MedveP Revista Científica p Animais de de síntese de GAG e proteogliconos por mecanismos intra e extracelulares 10.O SC também contribui para manter as características da cartilagem ao aumentar o pool de GAG usado pelo condrócito para síntese de proteogliconos; em adi~áo a este efeito restaurativo, a incorpora~áo-do SC a c9-"ilagem articular diminui o processo inflamotório, agindo diretamente sobre as enzimos, inibindo o sistema complemento e a atividade anti-prostaglondina11.12. A ceratite ulcerativa, ou úlcera de córnea, é caracterizada por processos erosivos superfici. ais ou profundos no córnea, com perda de epitélio e exposi~áo do estromo. Os agentes cau. sois envolvidos com este tipo de ceratite sáo com freqüencia os traumas, defeitos palpebrais, de. sordens relacionadas com o sistema lacrimal, além de infec~óes por fungos, bactérios e/ou ví. rus. Os sinais mais evidentes sáo blefarospasmo, fotofobia, epifora, edema, secre~áo ocular e vasculariza~áo13. Devida a diversidade de causas, os procedimentos terapeuticos seguem primordialmente a identifica~áo e a elimina~áo da causa, tendo como objetivo a restaura~áo e a preserva~áo da córnea. Entre os procedimentos clínicos adotados, encontram-se a terapia antibiótico, os analgésicos, os agentes lubrificontes, a atropina e as drogas antiproteases (EDTA,acetilcisteína e heparina). As úlceras que nao .respondem aos tratamentos clínicos convencionais devem ser tratadas de forma cirúrgica, com ceratotomia, flap de conjuntiva ou de terceira p6lpebra, tarsorrafia ou aplica~ao de membranas biológicas13.14. Outros trabalhos avaliaram o uso de SC15 e de glicosaminogliconos polissulfatados no tratamento de úlceras de córnea indolentes em cáes16e cavalos17,mostrando serem uma alternativa terapeutica eficaz no trata mento de úlceras persistentes refratórias aos tratamentos convencionais. Medicina EstimacBo OBJETIVOS Avaliar a eficácia do sulfato de condroitina A a 20% no tratamento de úlceras de córnea experimentais em coelhos, analisando-se seu potencial antiinflamatório, além da forma~óo reduzida de tecido cicatricial. MATERIAL E MÉTODO Foram utilizados 15 coelhos hígidos, da ra~a Norfolk, machos e femeas, com peso variando entre 2200 e 3000g, com idade variando Veterinária 2004: 2(5):51-6 -Pequenos Animais 9".'V ...V.. ...~---I ...,., , ~ o""'.. .,...'V ,tral do compus de Botucatu -UNESP. Foi realizado exame oftalmológico individual para exclusáo dos animais que apresentassem quaisquer altera~óes. Finalmente, os animais foram identificados e mantidos em gaiolas individuais, onde receberam ra~áo (Ra~áo para coelhos -Purina~) e ógua a vontade. Os coelhos foram inicialmente tranqüilizados com acepromazina* (1mg/Kg, IM) e, após 15 minutos, receberam tiopental**, vio intravenasa, até atingirem plano anestésico adequado para o procedimento. Procedeu-se, entáo, a ceratectomia lamelar em ambos os olhos, demarcando-se a córnea com punch de 5mm de diámetro e removendo-se o botáo com auxílio de pin~a colibri e lámina de bisturi no15, para excisáo de 1/3 da espessura corneana total, sob mensura~áo de paquimetria. O olho direito de cada animal foi tratado com Ciprovet~**. colírio (sulfato de condroitina A a 20% e ciprofloxacina a 0,3%) e o contralateral, como controle, com colírio de ciprofloxacina.*.*, no mesma concentra~áo. Instituiu-se tratamento duas vezes ao dia no 1° dia e uma vez ao dia, nos subseqüentes. Os animais foram subdivididos em tres grupos, de acordo com os períodos de coleto das córneas, para avalia~áo histopatológica oos 7, 14 e 30 dias. Os animais foram avaliados, diariamente, com uso de ilumina~áo artificial direta, quanto aos seguintes sinais clínicos: fotofobia, blefarospasmo, quemose, hiperemia conjuntival, secre~áo, opacidade e neovasculariza~áo,além do teste da fluoresceína. Estos a Itera~óes foram quantificodas de forma subjetiva em: 0- ausente; 1 -leve; 2 -moderado; 3 -intenso; 4 -grovel8. Ao final de cada período, os onimais foram novamente anestesiados, sob o mesmo protocolo, e em seguido sacrificados com 1Oml de cloreto de potássio em ba/us, via intravenoso, pora enuclea~áo e posterior coleta das córneas. O exome histopatológico foi realizado em microscopia de luz com colora~áo de hemotoxilina-eosina e tricrómico de Masson. Nesse exame avoliaramse parometros referentes o edema epitelial e estromal, presen~a de abrosáo e células jovens epiteliais, neoforma~áo vascular, infiltra~áo de leucócitos mono e polimorfonucleares, prolifero~áo de fibrócitos e reorronjo das fibrilas de col6geno, observados segundo observa~óesdescritas por Spencerl9 (1985) e Margot, Grossniklous2° (1991 }. Estes parámetros morfológicos foram ovaliados no mesmo padráo utilizado poro os sinais clínicos. RESULTADOS Nóo se observaram, durante todo o tratamento, sinais defotofobia, neovasculariza~óo, quemose ou presen~a de pigmentos. Quanto aos sinois de blefarospasmo, hiperemia de conjuntiva e sec~óo seromucosa, os animais apresentaramnos em grau leve a moderado, apenas no primeiro dio após a ceratedomia. O teste de fluoresceína positivo foi obtido .em todos os animais até, no máximo, o 5° dio, náo se observando diferen~a entre os grupos tratados e nóo tratados. A opacidade local, limitada apenas a área ceratectomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo mais discreta após 15 dios do mesmo. Todos os animais apresentaram este sino1 clínico, nóo se observando diferen~a entre os grupos tratado e nóo tratado. Nos cortes histopatológicos dos animais sacrificados no sétimo dia, observou-se, no camada epitelial, grande quantidade de células jovens, edema, células descamadas e áreas de abrasóo, tanto no grupo tratado como no controle, sendo este quadro mais intenso neste último. Verificou-se, ainda, desorganiza~óo lamelar e edema estromal, além de intensa prolifera~óo de fibrócitos e fibrilas de colágeno, sendo que no grupo controle houve maior edema e desorganiza~óo lamelar e menor prolifera~óo de fibrócitos e fibrilas de colágeno. Nas córneas coletadas no 14° dia, mantiveram-se as altera~óes observadas na fase anterior (sétimo dio), porém, com menos intensidade, principalmente em rela~óo as 6reas de descama~óo ea desorganiza~óo lamelar, sendo mais intensas no grupo controle. Na última fase (30° dia), as 6reas de descama~óo estavam muito reduzidas e as células jovens e o edema estavam presentes, mas em menor intensidade. A rela~óo entre as altera~óes estromais dos grupos controle e tratado manteve-se, sendo, também, menos intensa que nos outras fases. ANÁLISE ESTATísTlCA Paro cada variável avaliada no experimento e representada por escores, foram utilizados '.'Labyes.Argentirla '-*Biamotil(AlIergan.Frurntost) 'Acepran(Unívet) '"HypnoI (Clis1áliaj MedveP -Revista Científica de Medicina Veterinária .Pequenos e Animais de Estima~ao 2004; 2(5):51-6 Animais 53 ~ testes noo-paramétricos21 visando a compara~oo do efeito de momentos em cada olho, pelo teste de Friedman, e do efeito nos olhos em cada momento, pelo teste de Wilcoxon. O nível de significancia adotado foi de 5% de probabilidode. Mostrou-se significancia (p<0,05) apenas entre os resultados histopatológicos oos 14 e 30 dios, mos nao entre os grupos. ,~-'" FIGURA 1: ÚIcelademnea~~n0018scelna. 24hapós~lamelar FIGURA 2; Fotomicrogralia comeMIB do oiho esquelOO aos 7 díaS; observar os def9itos na reepíteIiza¡;ao (HE. 2OOX). ---~ FIGURA 3: FotomicrografiacomeanaOOcitH1mr&1oaos --~.--" 14dí8s(HE, 200X). FIGURA.: Fotomicrogr&fía comeana doolhoesquerrJo Figura 3} ; tx¡IBf O edema eslromal e desorganíz8fio PBrBdos 80$ do oiho contra/ateral FIGURA5: FotomiCIOgIiIfiacomeana ¡jJ dho diI8#oaos 14 mas (tlÍCfOmiC() de Masson.. 2OOX).Notaro 8mHJjo~ 0IyaIWzaIXJ que /18Figura6, 19fB18111e ~ d/K) cootraiateraI¡jJ mesmoanimal. 80$14 días (mesmoanim81 da lameIar mais intensos qU8l1do CCHII- (HE. 200X). FIGURA 6: Fotomicrograti8comeana 00 oiho esquerdo 808 14dias (mesmo animal da Figura 5); notar o deS8I78/Ijolamelar,princip8/menleptúximo a membranab8s8/epitelial (~ de Masson. 200X). DISCUssAo Quanto aos efeitos antiinflamatórios do sulfato de condroitina A, pouco póde-se observar, comparativamente, entre os grupos, visto que a cerotedomio 10melar induziu pouca ou nenhuma reo~óo inflamotória local, por se trator de 54 ..~ MedveP -Revista um procedimento estéril, pouco abrasivo au agressivo. Por este mesmo motivo, os sinais clínicos observados foram muito superficiais, sendo a rea~áo inflamatória mínima, com ausencia de edema 00 redor da lesáo, neovasculariza~áo, 0Científica de Medicina e Anlmais de Estima~ao Veterinária -Pequenos 2004; 2(5):51-6 Anlmais fotofobia, quemose, blefarospasmo intenso, pigmenta~áo ou hiperemia conjuntival persistente. Quanto aos sinais de blefaraspasmo, hiperemia de conjuntiva e secre~áo seramucosa, as ani. mais apresentaram-nas em grau leve a moderado, apenas no primeiro dia após a ceratedomia. A reepiteliza~áo ocorreu até o 5° dia, corroborando as observa~óes de Rawe et a/.22 (1992), náo se observando diferen~a entre os grupos tratados e náo tratados. Segundo Spencer19(1985), a regenera~áo epitelial ocorre de modo extremamente rápido, sendo que a córnea desnuda é recoberta dentro de 4 a 7 dias. A opacidade local, limitada apenas a área ceratedomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo observada também por Roweet a/.22 (1992). Esta opacidade é causada pelo edema corneano associado a irregularidade das fibrilas de colágeno19. Todos os animais apresentaram este sinal clínico, náo se observando diferen~a entre os grupos tratado e náo tratado. A avalia~áo histológica foi baseada nos altera~óes citadas por Spencer19(1985) e Margot, Grossniklaus2°( 1991).Nos cortes histopatológicos da camada epitelial, a grande quantidade de células jovens, edema, células descarnadas e áreas de abrasáo, foi mais significativa no grupo controle. Neste mesmo grupo, edema mais intenso também foi observado, tanto no meio intra como no extracelular, ocorrendo principalmente próximo a membrana basal e caraderizado pela colora~áo pálida do citoplasma celular e das áreas náo preenchidas por epitélio, retratando igual observa~áo de Spencer19(1985). Assim, tambérn, a intensa desorganiza~áo lamelar e o edema estromal, associados a redu- zida prolifera~óo de fibrócítos e fibrilas de colágeno, foram observados no grupo controle, comporativamente ao grupo tratado. A ausencia de neovasculariza~óo ou de polimorfonucleares, a nóo forma~óo de tecido cícatricial, caracterizado pela presen~a de tecido conectivo com arranjo irregular, c~Jroboram as informa~óes de Spencer!9 (1985). .Rawe et 0'}2 (1992) e Lance et 0/.23(1988) relataram uma alta densidade de fibrócitos próximo a área lesada, principalmente após 7 a 14 dias da ceratectomia, como foi observado nos cortes histológicos referentes a estes períodos. Lance et 0'.23 {1988) observaram a presen~a de neutr6filos no estrama anterior, próximo a área lesada, ao contrário do que foi observado aos 7, 14 e 30 días após ceratectomia. Apesar da análise estatística nóo apresentar diferen~as significativas entre os grupos tratado e nóo tratado, considerou-se a avalia~óo histopatol6gica relevante, visto que o número de animais utilizados é reduzido, de modo que nóo fornece varia~óes numéricas suficientes para indicar estas diferen~as. CONCLUsAo Quanto aos efeitos antiinflamatórios do sulfato de condroitina A a 20%, no trata mento de úlceras de córnea em coelho, pouco se p6de observar, comparativamente ao grupo controle. Este estudo, porém, mostrou efic6cia no uso tópico de sulfato de condroitina A, quanto a organiza~áo cicatricial do tecido estromal, caracterizando sua a~áo sobre o tecido composto por col6geno. ~~ ~--~ -c_-Ranzani JJT. Cremonjni DN. Brandio CVS. Rodrigues GN. Rocha NS. Mannarino R. Crocci AJ- Evaluation of Ihe topic uses of chondroitin sulfate A (Ciprovet"'. as a treatment to experimental comeal ulcer in rabbits, MEDVEP Rev Cientif Med Vet Pequenos Aním Anim Estim 2004; 2(5):51-6. The obiective of this test was to measure the efficacy of chondroitin sulfate A as a treatment to experi. mental corneal ulcer in rabbits. We observed, through exams, its anti-inflammatory potential, as well as a reduction of cicatricial tissue. We utilized 15 rabbits that were divided into two categories: treated and non-treated. The rabbits were also subdivided into three groups with five animals, on the seventh, 151h and 30'h days after lamellar ceratectomy. This one was done in both eyes. Only one eye was treated with Ciprovet'M eyewash (chondroitin sulfate A and ciprofloxacin associated) and the other, as a control, was treated only with ciprofloxacin. The eyes were evaluated as for clinical signs and its corneas underwent a histopathology exam. The signs observed were: hyperemic coniunctiva and blefarospasm in the two first days, and a positive fluorescein test within the following five days. There were no real significant differences in the clinical signs obtained from the treated and non-treated groups. In the histological exam, though, there was more lamellar organization, and a better collagen and fjbrocytes distribution. There was less stromal edema in the group treated with CiprovetTM, with indicatjon of a more efficjent cicatrisation. KEYWORDS: Corneal MedveP ulcer/pathology; -Revista Rabbits; Científica e Animais Chondroitin de de Medicina Estima<;ao sulfates. Veterinária 2004; 2(5):51-6 -Pequenos Animais 55 ~~~ t' REFERENCIAS 13.LausJL.CondíCioneS comease quera~as1ias.In.23. Congresso daAssCK:iat;Ao 1.SIMB'D.C<mea~ sciera.WI:_, Furxlamenlals ofvelefinary ~. 2"ed. Mundialde MedicinaVeterináriade PequenosAnimais; 1998; BuenosAires ~. Satn1eIS;1900 OphU1almology Presentations. BuenosAIres;1998. 2 BanksWJ.Hislologiavelerináliaaplicada.sao Paulo.MaooIe;1991.629p. 14.NasisseMP.CanineuJcela1ive keraütís.In_. 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