Princípios e aplicações da espectrometria de

Transcrição

Anais do II Simpósio de Biologia Molecular Aplicada à Produção Animal – 22 e 23 de junho de 2009
Embrapa Pecuária Sudeste – São Carlos – SP – Brasil
109
PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES DA ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM
PRODUÇÃO ANIMAL
Christina Ramires Ferreira1, Sérgio Adriano Saraiva1, Jerusa Simone Garcia1,2,
Gustavo Braga Sanvido1, Felipe Perecin3, Rodrigo Ramos Catharino4, Rosineide
Costa Simas1, Fábio César Gozzo5, Luiz Fernando Arruda Santos5, Helio Martins
Junior6, Andréa Cristina Basso7, José Henrique Fortes Pontes7, Flávio Vieira
Meirelles3, Mirela Batista Coelho1, Magali D’Angelo8 e Marcos Nogueira Eberlin1
1
Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas, Instituto de Química, Unicamp,
Campinas, SP, Brasil; 2Departamento de Ciências Exatas, Universidade Federal de
Alfenas, Alfenas, MG, Brasil; 3Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos,
USP, Pirassununga, SP, Brasil; 4Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de
Ciências Médicas, Unicamp, Campinas, SP, Brasil; 5Laboratório Nacional de Luz
Síncroton e Instituto de Química, Unicamp, Campinas, SP, Brasil;
6
Applied
Biosystems do Brasil, São Paulo, SP, Brasil; 7Divisão de Pesquisas, In Vitro Brasil
Ltda., Mogi-Mirim, SP, Brasil; 8Unidade de Biologia Celular do Centro de P&D de
Sanidade Animal do Instituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil. Endereço eletrônico:
<[email protected]>.
Introdução
Como técnica analítica das mais versáteis e das mais sensíveis, a
espectrometria de massas (MS) é atualmente uma das ferramentas analíticas
valiosas em diversos estudos nas áreas de Biologia, de Ciências Médicas e de
Ciências Tecnológicas. Por MS é possível determinar a massa molecular e
quantificar
biomoléculas,
tais
como
proteínas,
carboidratos,
lipídeos
e
oligonucleotídeos, e também fragmentá-las de forma a elucidar sua estrutura e
confirmar sua identificação.
O potencial de aplicação da MS em estudos biológicos tem sido bastante
estendido, em razão dos impressionantes avanços observados nos últimos anos
nas áreas de genômica, de transcriptômica, de metabolômica, de proteômica, de
lipidômica e de outras plataformas “omics”, e do desenvolvimento extraordinário dos
equipamentos (HOFFMANN e STROOTBART, 2007; FENG et al., 2008). A MS é
110
atualmente a técnica de escolha para identificação de proteínas e para estudo de
modificações
proteicas
pós-traducionais
(MPTs)
em
diferentes
condições
fisiológicas. Além disso, a MS vem sendo utilizada no monitoramento e na
caracterização de diversos processos industriais, tais como processos fermentativos
(ROYCE, 1993) e até mesmo análise de microrganismos intactos (CLAYDON et al.,
1996; FENSELAU e DEMIREV, 2001).
Um exemplo dos recentes avanços em MS foi o desenvolvimento da técnica
denominada MALDI1 imaging (IMS). Essa técnica utiliza a especificidade e a
sensibilidade da MS para mapear e para produzir imagens de biomoléculas em
cortes histológicos, permitindo o estudo da complexidade molecular em células
(STOECKLI et al., 2001; CHAURAND et al., 2004). Por exemplo, recentemente a
IMS foi utilizada para estudar a localização espacial, a estrutura molecular e a
abundância relativa de diversas proteínas em diferentes períodos da gestação de
embriões de camundongos. Foi possível identificar e mapear várias proteínas no
mesmo corte histológico (ubiquitina, calciclina, calgizarina e outras) e não houve
interferência do “ruído” de fundo, tornando a técnica vantajosa em relação à imunohistoquímica (BURNUM et al., 2008).
Para análise por MS, as amostras podem ser inseridas diretamente no
espectrômetro de massas, ou o equipamento pode ser acoplado a uma técnica de
separação, como a cromatografia gasosa (GC), a cromatrografia líquida (LC) ou a
eletroforese capilar. A possibilidade de automação aliada à rapidez das análises
permite que grande número de amostras seja analisado em curto período de tempo
(segundos ou minutos para cada amostra). Resumidamente, a análise por MS
(Figura 1) consiste na geração de íons com base em compostos (orgânicos ou
inorgânicos) por meio de um método de ionização apropriado. Em seguida, os íons
são separados por meio de sua relação massa−carga (m/z) em um analisador de
massas e detectados qualitativamente e ou quantitativamente por meio de um
detector, o qual “conta” os íons. A magnitude do sinal elétrico em função da razão
m/z é convertida por um processador de dados, o qual gera o espectro de massas
correspondente (GROSS, 2004).
Inicialmente a aplicação da MS estava restrita à análise de gases, de
substâncias voláteis e de substâncias termicamente estáveis, pois as primeiras
1
MALDI = dessorção e ionização a laser assistida por matriz.
111
técnicas de ionização empregadas (ionização por elétrons e ionização química) são
processos nos quais o analito é primeiramente vaporizado e a ionização só ocorre
quando a molécula está na fase gasosa. Essa restrição impossibilitava a análise de
biomoléculas, como proteínas, carboidratos e lipídeos, as quais não são voláteis e
se degradam em alta temperatura de vaporização (KINTER e SCHERMAN, 2000).
Figura 1. Diagrama de funcionamento de um espectrômetro de massas (APPLIED
BIOSYSTEMS, 2005).
Na década de 80, o desenvolvimento de técnicas de ionização mais brandas
causou uma revolução na extensão das aplicações de MS. Essas técnicas foram
principalmente as de ionização por electrospray – ESI (FENN et al., 1989, 1990) e
de ionização e dessorção a laser assistida por matriz – MALDI (KARAS e
HILLENKAMP, 1988). O termo “ionização branda” significa que os íons formados
possuem baixa energia interna, o que permite a observação de espécies iônicas
moleculares com pouca ou nenhuma fragmentação. As técnicas de ionização branda
permitiram, portanto, a produção de íons com base em compostos de alta massa
molecular e não-voláteis, estendendo a aplicação da MS a todos os tipos de
moléculas. Graças ao desenvolvimento e à aplicação de ESI-MS e de MALDI-MS, os
pesquisadores John B. Fenn e Koichi Tanaka receberam o prêmio Nobel em química
em 2002. Existem outros tipos de técnicas que permitem a ionização de moléculas
de média ou de baixa polaridade (como a fotoionização à pressão atmosférica e a
112
ionização química à pressão atmosférica). A técnica de ionização por elétrons é
geralmente utilizada em GC-MS.
Na ESI-MS e na MALDI-MS, os íons são obtidos por meio da protonação ou
desprotonação de moléculas neutras, ou ainda pela adição de outros íons, como
Na+, K+, NH4+ e Cl-, com formação de íons denominados adutos. As espécies
observadas são, portanto, denominadas espécies protonadas [simbolizadas por (M +
H)+], espécies desprotonadas [simbolizadas por (M – H)-] ou íons adutos [de sódio,
simbolizados por (M + Na)+ ou de potássio (M + K)+, por exemplo] (CHAPMAN,
1993). A obtenção de espécies iônicas moleculares proporcionada por ESI e MALDIMS impulsionou o desenvolvimento de técnicas de fragmentação induzida visando à
caracterização da estrutura molecular e à maior confiabilidade em experimentos de
quantificação. Com isso, é aplicada a espectrometria de massas tandem ou
sequencial (MS-MS), na qual fragmentos do íon de interesse são gerados por
dissociação induzida por colisão (CID, do inglês collision-induced dissociation), ou
seja, pela colisão de espécies iônicas moleculares com uma molécula de gás
(tipicamente argônio) em uma câmara de colisão.
A seguir, são exemplificadas algumas aplicações práticas e ainda potenciais
de MS em aspectos de elevado interesse na área de produção animal, como em
análises de produtos lácteos, em detecção e quantificação de substâncias de uso
veterinário, em biotecnologia animal e em avaliação de alterações epigenéticas em
animais clonados. É importante observar, porém, que as aplicações da MS na área
de produção animal têm sido amplas e novas aplicações são relatadas em número e
em extensão crescentes.
Análises de produtos lácteos por espectrometria de massas
A MS permite uma visão global e dinâmica dos constituintes de diversos
alimentos e sua aplicação possui crescente interesse na indústria alimentícia.
Devido à sua função primária, o leite é um alimento altamente complexo que
desempenha papel fundamental na alimentação humana (FOX e McSWEENEY,
1998). A análise das proteínas do leite por MS é geralmente dificultada pela
presença de algumas poucas proteínas muito abundantes que interferem na
detecção de proteínas de menor abundância.
Fong et al. (2008) estudaram o soro de leite bovino por métodos proteômicos,
visando elucidar e melhor compreender a composição proteica do leite bovino e sua
113
relação com a bioatividade. Por meio de eletroforese bidimensional e de nanoreversed phase-liquid chromatography mass spectrometry (RP-LC-MS-MS), grande
número de proteínas minoritárias de soro de leite foi identificado, algumas das quais
não haviam sido relatadas anteriormente. O estudo da composição proteica dos
glóbulos de gordura do leite (MFGMs) também foi alvo de diversos trabalhos de
caracterização de componentes dessa secreção. Por exemplo, Reinhardt e Lippolis
(2006) isolaram MFGMs de vacas holandesas que estavam no período médio de
lactação, e realizaram fracionamento por eletroforese. Peptídeos provenientes da
digestão tríptica de bandas dos géis analisados foram novamente fracionados em
um cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a um espectrômetro de massas.
A análise dos dados resultou na identificação de 120 proteínas, das quais 71%
foram caracterizadas como proteínas de membrana e o restante como proteínas
citoplasmáticas ou secretadas. Apenas 15 proteínas identificadas nos MFGMs de
bovinos haviam sido identificadas em estudos anteriores com MFGMs de ratos e de
seres humanos.
A MS também pode ser utilizada como ferramenta no controle de qualidade
do leite e de seus derivados, bem como no controle de fraudes e de adulterações.
Há relato de um método analítico rápido, simples e preciso por MALDI-time-of-flight
(TOF) MS, destinado a avaliar tanto a presença de leite de vaca em amostras de
leite cru de ovelha e de búfala utilizadas em processos industriais e a adição de leite
em pó em amostras de leite cru. A presença de adulteração foi determinada pela
avaliação dos perfis de proteínas, tais como α-lactoalbumina e β-lactoglobulina,
utilizadas como marcadores moleculares. Sem pré-tratamento das amostras de leite
e em razão da rapidez e da facilidade de utilização de MALDI-TOF MS, o protocolo
analítico proposto pode ser utilizado como ferramenta de rotina para a identificação
de possíveis adulterações de leite cru recebido diariamente pela indústria
(COZZOLINO et al., 2001). Esses mesmos autores propuseram um método similar
para a identificação da presença de leite de bovinos e de ovinos em queijo do tipo
mozzarella (em português “mussarela de búfala”), por meio de utilização de MALDITOF MS. A diferenciação entre a mozzarella fabricada exclusivamente com leite de
búfala e aquela que contenha misturas com leite bovino e, mais recentemente, leite
ovino é realizada utilizando-se as proteínas do soro de leite, α-lactoalbumina e βlactoglobulinas como marcadores moleculares. Houve relação linear entre a
resposta relativa de espécies iônicas moleculares e a abundância das proteínas de
114
soro de leite analisadas. Esses resultados abrem perspectivas de um novo campo
para a MS na avaliação de possíveis fraudes na indústria de lacticínios.
O uso da MS para estudo de bactérias lácticas, consideradas microrganismos
benéficos para a saúde, também foi relatado (CHAMPOMIER-VERGÈS et al., 2002).
Além da sua importância tecnológica, as bactérias lácticas têm importante impacto
nas características organolépticas de produtos lácteos e estão relacionadas à
produção de bacteriocinas. Estudos semelhantes também foram realizados com
bactérias dos gêneros Enterococcus (GIARD et al., 2001) e Propionibacterium
(LEVERRIER et al., 2004), conhecidas por desempenhar papel fundamental no
queijo do tipo suíço. Streptococcus thermophilus é uma bactéria láctica termófila
amplamente utilizada como fermento na fabricação de produtos lácteos, em especial
na fabricação de iogurte, em combinação com Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus. No entanto, apesar da sua utilização maciça, o estado fisiológico de S.
thermophilus no leite tem sido pouco investigado. Herve-Jimenez et al. (2008)
estabeleceram, com aplicação da MALDI-TOF MS, o primeiro mapa proteômico
citosólico (ou seja, das proteínas citoplasmáticas) de S. thermophilus LMG18311
cultivado no leite, com a identificação de 203 proteínas. Além disso, foi analisada a
fisiologia desse estreptococo durante sua fase de crescimento tardia no leite (entre
2h e 30min e 5h e 30min de incubação). Observou-se a regulação dos peptídeos e
dos aminoácidos (AA) transportadores, da biossíntese de AA específicos, em
especial de AA com enxofre, e dos genes e das proteínas envolvidos no
metabolismo de açúcares.
Nos últimos anos, fortes evidências científicas têm sido fornecidas para a
existência de atividades biológicas de peptídeos e de proteínas provenientes de
alimentos que possam ter efeitos benéficos sobre a saúde humana. Foram
comprovados benefícios para a saúde humana proporcionados por proteínas e por
peptídeos bioativos obtidos de alimentos, principalmente quanto a ações
imunomoduladoras, anti-hipertensivas, osteoprotetoras e antilipêmicas (MÖLLER et
al., 2008). O conteúdo de dois peptídeos anti-hipertensivos − valina-prolina-prolina e
isoleucina-prolina-prolina − em 101 amostras de dez variedades de queijo suíço foi
avaliado com LC-MS. A menor média de concentração da soma dos dois tripetídeos
foi encontrado no queijo do tipo L'Etivaz à rebibes (19,1 mg.kg-1), enquanto o queijo
do tipo Appenzeller com 1/4 de gordura apresentou a maior concentração (182,2
mg.kg-1). Os resultados desse estudo mostram que diversas variedades tradicionais
115
de queijo contêm, em média, concentrações semelhantes dos dois peptídeos antihipertensivos quando comparadas aos produtos lácteos fermentados com ação
reguladora sobre a pressão arterial recentemente desenvolvidos (BÜTIKOFER et al.,
2008). Dessa maneira, as técnicas proteômicas têm se mostrado como ferramenta
útil para a caracterização das proteínas de leite e de microrganismos lácticos. O
próximo desafio envolve o estudo das proteínas, especialmente as enzimas,
liberadas em matrizes complexas que são os produtos lácteos.
Uma aplicação da MS ainda a ser desenvolvida seria a caracterização de
patógenos causadores de mastite em amostras de leite fluido por MS fingerprinting.
Com o diagnóstico rápido (alguns minutos, em vez de alguns dias para o cultivo
microbiológico) da infecção nos animais afetados, seria possível estabelecer o
tratamento antibiótico adequado e também proporcionar estratégias preventivas
mais efetivas para o controle da mastite em rebanhos leiteiros.
Espectrometria de massas em análises de resíduos de drogas utilizadas na
produção animal
A
indústria
farmacêutica
mundial
desenvolve
continuamente
novas
substâncias para emprego em rebanhos comerciais visando à melhora da eficiência
da produção animal. O uso dessas drogas faz com que o setor agropecuário e as
agências reguladoras busquem tecnologias eficientes e sensíveis para detectar
possíveis resíduos dessas substâncias, as quais não devem ser ingeridas pelo
consumidor dos produtos de origem animal. Em análises de resíduos de drogas
nesses produtos, a MS fornece resultados sensíveis e confiáveis.
O grande desafio do monitoramento de resíduos de drogas em produtos
animais é que os níveis considerados seguros para o consumo humano são
extremamente baixos ou, em alguns casos, a tolerância a esses compostos e ou
resíduos é praticamente nula. O cloranfenicol, por exemplo, um poderoso antibiótico
bacteriostático de amplo espectro que foi amplamente administrado em animais,
teve sua utilização proibida pela Comunidade Européia em 1994 (COMMISSION,
1994). Apesar da proibição ao uso, o cloranfenicol ainda é motivo de preocupação
dos programas de monitoramento de resíduos em consequência de seu emprego
irregular (Figura 2). Em concordância com a tolerância zero a resíduos de
cloranfenicol em produção animal, a Comissão de Decisão 2003/181/EC da
Comunidade Européia estabeleceu o limite mínimo de 0,30 µg.kg-1 ao desempenho
116
requerido para a análise de substâncias proibidas ou não autorizadas, além de
definir o número mínimo de pontos de identificação para a confirmação dos
resultados (COMMISSION, 2002). A técnica de referência recomendada na maioria
dos casos é a LC-MS-MS, por ser rápida, sensível e seletiva. Além disso, é uma
técnica autoconfirmatória, que evita a emissão de laudos com resultados falsospositivos ou falsos-negativos.
Figura 2. Cromatograma e espectros de massas ESI-MS e ESI-MS/MS de amostra
de leite bovino com 0,050 µg.L-1 de cloranfenicol. Fonte: Martins-Júnior et
al. (2006).
Existe grande diversidade de substâncias ou de drogas utilizadas que visam
melhorar a produção animal, tais como antibióticos, hormônios e antiparasitários.
Nesse contexto, a MS, nas suas mais diversas modalidades, é uma técnica analítica
que apresenta rapidez e sensibilidade adequadas. Por exemplo, rotineiramente
equipamentos de LC-MS-MS permitem a detecção e a quantificação de centenas de
drogas em uma única análise.
O Codex Alimentarius (2009), da Organização para a Agricultura e a
Alimentação e da Organização Mundial da Saúde, define resíduo de uma droga
veterinária como a fração da droga, seus metabólitos, produtos de conversão ou
reação e impurezas que permanecem no alimento originário de animais tratados. É
importante frisar que nem todas as drogas e nem todos os compostos químicos a
que os animais ficam expostos deixam resíduos perigosos à saúde humana e à
saúde animal. Por isso, existe o limite de tolerância ou o limite máximo de resíduo
(LMR) que o alimento pode conter, sem prejuízo para a integridade orgânica de
seres humanos e de animais. Após a conclusão desses estudos, organizações
internacionais
envolvidas
na
saúde
pública
analisam
os
resultados
117
e,
posteriormente, recomendam os LMR's dos compostos aprovados à consideração
dos países membros do Codex Alimentarius.
O Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de
Origem Animal (PNCRB), foi instituído pela Portaria Ministerial no 51 de 6 de maio de
1986. O plano prevê a adoção de programas setoriais para controle de resíduos e de
contaminantes em carnes (de bovinos, de aves, de suínos e de equinos), em leite,
em mel e em pescado (BRASIL, 2006). Esse plano foi revisado pela Instrução
Normativa no 9 de 30 de março de 2007 e, embora esteja em vigor somente para o
controle para carnes (PNCRC), existem várias tabelas que regulamentam o controle
de antimicrobianos, de anabolizantes, de micotoxinas, de sulfonamidas, de
metabólitos de nitrofuranos e de avermectinas, entre outros, em leite, em mel, em
ovos, em pescado e em seus derivados, cujos níveis vão de miligramas a
nanogramas por quilograma ou devem até ser nulos se a droga for banida (Figura
3).
Figura 3. A (esquerda): Cromatograma obtido de análise por cromatrografia líquida
com espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) de
sulfonamidas em leite na concentração de 0,2 µg.L-1. B (direita):
Cromatograma de detecção de avermectinas em carne por LC-MS/MS
na concentração de 5,0 µg.kg-1.
De acordo com informações disponíveis na literatura, as substâncias e as
drogas controladas podem ser classificadas em dois grandes grupos. O grupo A
engloba substâncias e drogas não autorizadas e com efeito anabólico, tais como
118
esteróides, β-agonistas e lactonas. Já o grupo B inclui substâncias permitidas para
uso em produção animal, mas com quantidade de resíduos limitada ou proibida, tais
como antibacterianos, drogas de efeito sedativo, anti-inflamatórios, anti-helmínticos
e anticoccidianos (De BRABANDER et al., 2007; REIG e TOLDRÁ, 2008).
A técnica de LC-MS-MS foi utilizada por Martins-Júnior et al. (2007) para a
detecção e a confirmação de múltiplas classes de medicamentos, tais como βlactâmicos, tetraciclinas, sulfonamidas, cefalosporinas e macrolídeos em leite
bovino. Nesse trabalho, nove marcas de leite foram adquiridas em mercados da
Capital de São Paulo e a presença dessas drogas foi verificada em limites de
quantificação que variavam entre 0,75 e 7,5 µg.L-1 desses compostos, exceto na
eritromicina, validada na concentração de 37,5 µg.L-1.
De Brabander et al. (2007) fizeram ampla revisão da evolução das técnicas
para análise de resíduos de substâncias não permitidas pela legislação da
Comunidade Econômica Européia na produção de carne, desde o uso da
cromatografia em camada delgada no início dos anos de 1970 até o uso de técnicas
cromatográficas mais atuais, como o acoplamento de ultra performance liquid
chromatography (UPLC) à MS.
Zeleny et al. (2009) relataram o uso do LC-MS com fonte de ionização por
electrospray para a detecção e a quantificação simultânea de compostos de
nitroimidazol (droga utilizada contra protozoários e para combater infecções
bacterianas) presentes em carne de porco. Com a metodologia desenvolvida, foi
possível identificar e quantificar seis espécies de interesse (dentre eles, três
metabólitos) em níveis inferiores a microgramas por quilograma. Outro trabalho de
identificação e de quantificação de drogas usadas no combate a infecções
ocasionadas por bactérias e coccídeos, utilizando LC-MS, foi feito por Li et al.
(2009). Esses autores desenvolveram e validaram uma metodologia para analisar
sulfadimetoxina e seu metabólito (N-acetilsulfadimetoxina) em amostras de plasma,
de urina e de fluido oral, além de tecido do rim e do fígado de bovinos. Os limites de
quantificação para ambos os analitos nessas amostras foram de 2, 100 e 5 mg.L-1 no
plasma, na urina e no fluido oral, respectivamente. Já nas amostras de rim e de
fígado, os limites de quantificação foram de 10 µg.kg-1. Nos EUA, a concentração
tolerável do metabólito dessa droga nos tecidos comestíveis do gado é de 0,1 mg.kg1
.
119
A técnica de LC-MS foi utilizada também na determinação da azaperona e
seu metabolito azeperol em vários tecidos animais (músculo, tecido adiposo e
fígado), além de leite (AOKI et al., 2009). Essa droga apresenta efeitos sedativos e
antieméticos, e é utilizada como tranqüilizante em suínos e equinos. Em suínos a
azaperona é usada para evitar estresse durante o transporte dos animais da fazenda
ao abatedouro, o que pode causar aumento na mortalidade ou piora na qualidade da
carne.
A aplicabilidade da UPLC acoplado à MS com analisadores de tempo de vôo
(UPLC-TOFMS) e de orbitrap (UPLC-orbitrap MS) foi demonstrada na análise de
hormônios e de resíduos de outras drogas presentes em pelos bovinos e em ração
animal (VAN DER HEEF et al., 2009). Os autores realizaram vários testes em que a
resolução empregada nesses equipamentos foi avaliada. Foi possível determinar
com exatidão (<5 mg.kg-1), e portanto com alta confiabilidade, as massas de vários
compostos e quantificá-los em níveis de microgramas por quilograma. No caso do
emprego da UPLC-orbitrap MS foi possível monitorar simultaneamente a presença
de 14 esteróides nos pelos, apesar da complexidade da matriz da amostra.
As drogas descritas nas tabelas do PNCRB têm LMRs extremamente baixos
ou são banidas para uso veterinário. Para determinar os resíduos dessas drogas ou
seus metabólitos é necessário utilizar tecidos musculares, vísceras, gordura, urina,
plasma, leite ou ovos inteiros ou em partes (clara ou gema). As matrizes das
amostras desse material são complexas e por meio de técnicas analíticas clássicas
não é possível a quantificação na sensibilidade requerida. Por isso, a utilização de
espectrômetros de massas triploquadrupolos com fonte de ionização por
electrospray ou de ionização química à pressão atmosférica se tornaram a
alternativa mais viável para atender à legislação brasileira e garantir a qualidade dos
produtos agropecuários exportados para os mercados externos que possuem
legislações até mais rigorosas do que a do nosso País.
Contribuição da espectrometria de massas em Biotecnologia da Reprodução
Atualmente, as pesquisas que visam a novas aplicações de MS na área de
biotecnologia de embriões podem ser divididas em quatro grupos principais: (i)
controle de qualidade de meios utilizados para a produção in vitro (PIV) de embriões,
(ii) lipidoma de oócitos e de embriões, (iii) estudos de composição de soro fetal
120
bovino e (iv) detecção de patógenos em meios utilizados para PIV de embriões
bovinos.
Controle de qualidade de meios utilizados para a produção in vitro de
embriões
A MS pode ser utilizada para obter o perfil químico (ou fingerprint) de meios
utilizados para a PIV de embriões visando ao controle de sua qualidade. Foram
obtidos perfis químicos com mínimo preparo de amostra (somente diluição dos
meios de cultivo em água) e infusão direta por nano-electrospray em modo positivo
[nano-ESI(+)-MS]. Os quatro meios estudados [maturação in vitro – MIV, fertilização
in vitro – FIV, synthetic oviduct fluid – SOF e ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina
etanossulfônico (Hepes) SOF – HSOF] foram diferenciados pelo seu perfil químico
(Figura 4), utilizando análise de componentes principais.
Figura 4. Espectrometria de massas com fonte de Nano-electrospray (Nano-ESIMS). Fingerprintings de quatro meios utilizados para a produção in vitro
de embriões bovinos (IVM: meio de maturação in vitro; IVF: meio de
fertilização in vitro; SOF: Synthetic Oviduct Fluid; HSOF: Synthetic
Oviduct Fluid tamponado com HEPES. Fonte: adaptado de Ferreira et al.
(2009b).
121
A PIV de embriões bovinos com a utilização de meios estocados a +4oC por
até 45 dias não apresentou variação na clivagem e no desenvolvimento até a fase
de blastocisto (P < 0,05) nem alteração do perfil químico por nano-ESI(+)-MS.
Quando os meios foram expostos a choque de calor (60oC por três horas), não
houve diminuição do desenvolvimento embrionário (P > 0,05), mas o perfil químico
de todos os meios foi significativamente afetado. Quando os meios foram
congelados (–70oC por dois meses), novamente não foi observado diminuição
significativa do desenvolvimento embrionário, porém o perfil químico dos meios foi
afetado. Dessa maneira, embora a seletividade tenha sido suficiente sem
procedimento de extração, protocolos mais complexos de preparo de amostra
podem ser avaliados para aumentar a especificidade em relação a determinados
componentes (p. ex., peptídeos e lipídeos). A aplicação dessa tecnologia deve ser
otimizada para cada laboratório, dependendo do meio de cultivo específico e das
condições de armazenamento, mediante a construção de um banco de dados
específico de fingerprints. Novas pesquisas serão realizadas visando à avaliação do
uso de nano-ESI(+)-MS para monitorar o metabolismo embrionário in vitro e para
determinar os efeitos isolados dos meios de MIV, de FIV, de SOF e de HSOF
(FERREIRA et al., 2009b).
Lipidoma de oócitos e de embriões
No último relatório da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
(THIBIER, 2006), o Brasil foi classificado como o primeiro país em volume de
produção de embriões in vitro. Essa atividade tornou-se intensa no País em razão da
combinação de vários fatores, tais como o volume do rebanho, a preponderância de
raças zebuínas e as condições do mercado no Brasil (PONTES et al., 2008). A
qualidade e a sobrevivência dos embriões produzidos in vitro são, entretanto,
inferiores às dos embriões gerados in vivo (BONI et al., 1999).
Estudos com gametas e embriões de mamíferos indicaram que a composição
de ácidos graxos influencia a maturação oocitária, a fertilidade e o desenvolvimento
embrionário in vitro (KHANDOKER e TSUJII, 1999). Nos estudos sobre a
composição de ácidos graxos em oócitos e em embriões de mamíferos utiliza-se
frequentemente a técnica de GC com necessidade de transesterificação e de
metilação da amostra (KHANDOKER et al., 1997, 1998; KHANDOKER e TSUJII,
1999; McEVOY et al., 2000; KIM et al., 2001,). Entretanto, a técnica de MS tem sido
122
utilizada com sucesso em estudos de lipidoma. Na análise de fosfolipídeos em
membranas celulares, até mesmo de células-tronco, recentemente descrita, utilizouse a técnica de MALDI-TOF MS em vários modelos biológicos (SCHILLER et al.,
2004, 2007; FUCHS e SCHILLER, 2008; FUCHS et al., 2008b,c). Além disso, o
perfil químico ou o fingerprint de fosfolipídeos foi utilizado para diferenciar
espermatozóides de felídeos e de ruminantes (FUCHS et al., 2008a).
Foram obtidos espectros individuais de oócitos e de embriões bovinos por
MALDI-TOF (FERREIRA et al., 2008; Figura 5). Os triacilglicerídeos (TAG) não
foram detectados nos oócitos imaturos, ocorreram em pequena quantidade nos
oócitos maturados e apareceram claramente nos embriões. TAG são detectados
como adutos de sódio [M + Na]+ . (“M” significa massa molecular).
Figura 5. Espectros de massas que indicam TAG de um oócito imaturo, de um
oócito maturado e de um blastocisto. Os espectros foram obtidos por
espectrometria de massas por dessorção e ionização a laser assistida por
matriz (MALDI-TOF MS) com matriz ácido 2,5,-dihidroxido benzóido
(DHB).
Nos oócitos maduros e nos embriões foram observados TAG com m/z de 827
(C51H96O6 ; 50:5), de 851 (C53H96O6; 50:3), de 853 (C51H98O6; 50:2) e de 881
(C55H102O6; 52:2). Além desses, somente os embriões apresentaram ainda TAG de
123
m/z de 883 (C55H104O6; 52:1), de 907 (C57H104O6; 54:3) e de 909 (C57H106O6; 54:2).
Os TAG descritos possuem em sua composição os ácidos palmitoleico (16:1),
palmítico (16:0), linolênico (18:3), linoleico (18:2), oleico (18:1) e esteárico (18:0).
Também foi possível detectar fosfolipídeos, principalmente fosfocolinas, em oócitos
individuais de seres humanos, de bovinos, de ovinos e de peixes. Cada espécie
apresentou um perfil característico. Esse perfil variou também entre oócitos e entre
embriões bovinos (FERREIRA et al., 2009a).
Estudo da composição do soro fetal bovino por espectrometria de massas
O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento comumente utilizado para a PIV.
Além de riscos sanitários, sabe-se que o SFB influencia a velocidade do
desenvolvimento, a expressão gênica e a composição lipídica de embriões (RIZOS
et al. 2003; WRENZYCKI et al., 2005). A utilização da MS para caracterização da
composição do SFB pode trazer informações importantes sobre o desenvolvimento
de um substituto sintético de SFB, de composição definida e adequada para o uso
na PIV comercial e acadêmica de embriões de ruminantes.
Estudos iniciais proporcionaram dados sobre a composição lipídica do SFB
por MALDI-TOF MS (GARCIA et al., 2009) e sobre a quantificação de estradiol por
LC-MS-MS com limite de detecção de 0,08 pg.mL-1 e limite de quantificação de 0,25
pg.mL-1 em diferentes partidas de soro fetal bovino, assim como em soro ovino e em
soro caprino (MARTINS-JÚNIOR et al., 2009). Estudos futuros serão conduzidos
para a quantificação de aminoácidos e de vitaminas.
Detecção de patógenos em meios utilizados para PIV de embriões bovinos por
espectrometria
Do ponto de vista econômico, o desempenho reprodutivo é crucial para a
produtividade na pecuária (NEVES et al., 1999). Em bovinos, em razão do interesse
crescente em se obter maior exploração do potencial genético de fêmeas para
incremento da produção animal, a PIV comercial de embriões tem sido desenvolvida
e aprimorada (RENESTO, 2004). Com o aumento da comercialização, intensifica-se
a preocupação pelo aspecto sanitário de embriões. Vários métodos de prevenção
são utilizados para se obter embriões livres de patógenos específicos. As
biotécnicas representam um desafio para o controle da transmissão de doenças,
pois produzem novos ambientes, promovem manipulação excessiva do material e
124
aumentam a oportunidade de contaminação e de disseminação de patógenos
(STRINGFELLOW et al., 2004).
A técnica de MALDI-MS tem sido muito utilizada para a caracterização de
microrganismos em razão da sua capacidade de analisar moléculas de massa
elevada e misturas complexas de biomoléculas, e ainda por apresentar alta
sensibilidade mesmo em reduzida quantidade de amostra (SIUZDAK, 2006). Por
esse método, bactérias podem ser identificadas mediante comparação de seu
espectro de massa (obtido em poucos segundos) com espectros de referência de
cepas, por meio de análise estatística multivariada. A discriminação e a
caracterização de micobactérias foi obtida por MALDI-TOF MS (HETTICK et al.,
2006). A técnica foi usada também em estudos de quimiotaxonomia bacteriana
(CLAYDON et al., 1996; SMOLE et al., 2002; RUELLE et al., 2004). Recentemente,
nove cepas de bactérias anaeróbias foram caracterizadas por MALDI-TOF; aplicouse o método para identificação com sucesso dessas bactérias em amostras de 75
pacientes que apresentaram infecção periodontal. Os autores sugeriram que a
técnica de MALDI-TOF MS poderá se tornar útil para a identificação de bactérias
anaeróbicas, especialmente aquelas que não podem ser prontamente identificadas
por análise bioquímica. Dessa forma, essa técnica poderá ser atrativa até mesmo na
identificação de rotina de amostras clínicas (STINGU et al., 2008).
Um próximo desafio é desenvolver a aplicação da técnica de MS para o
diagnóstico e o monitoramento, de maneira não-invasiva e rápida, da sanidade de
embriões bovinos produzidos in vitro, visando ao diagnóstico e ao monitoramento
desses patógenos.
Perspectivas do uso da espectrometria de massas em estudos epigenéticos
aplicados à transferência nuclear
Os avanços no campo da biologia celular revelaram que as células possuem,
além das informações contidas na molécula de DNA, outro conjunto de informações
conhecido como epigenética. Os mecanismos epigenéticos são responsáveis por
diversos fenômenos, tais como a diferenciação celular, o envelhecimento, o câncer e
o desenvolvimento embrionário. No entanto, essas marcações epigenéticas são
múltiplas e as diferentes combinações entre elas produzem diferentes resultados.
Técnicas baseadas na MS têm o potencial de mapear essas distintas combinações e
125
de estudá-las dentro de um contexto, tornando claras suas interrelações e seu
significado biológico.
Conceito de epigenética
O controle da expressão gênica nas células eucariotas ocorre pela ligação de
fatores de transcrição nas regiões promotoras dos genes ou pela interação entre
proteínas ou entre regiões promotoras e sequências regulatórias dentro do próprio
DNA, capazes de influenciar a taxa de transcrição. A expressão gênica é controlada
também por modificações covalentes na própria fita de DNA ou pelo empacotamento
do DNA sob a forma de cromatina. Esses mecanismos são coletivamente
denominados “epigenéticos”.
Epigenética significa, literalmente, “sobre os genes” e refere-se às
modificações nos genes que não incluam alterações na sequência de DNA
propriamente dita. Há dois tipos principais de alterações epigenéticas: a metilação
do DNA e as modificações pós-traducionais (MPTs) nas histonas, principais
proteínas que compõem a cromatina.
A metilação do DNA ocorre na posição 5 do anel pirimídico que forma a
molécula de citosina, transformando-a em 5-metilcitosina. As modificações póstraducionais nas histonas, por sua vez, ocorrem nas caudas dos resíduos de
aminoácidos que se projetam do nucleossomo. Essas modificações incluem
acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação, ribosilação e sumoilação. As
diferentes combinações entre as modificações covalentes das histonas formam um
código, conhecido como “código das histonas”. As modificações nas citosinas e as
modificações pós-traducionais das histonas determinam a estrutura, o padrão de
condensação e, principalmente, a atividade transcricional da cromatina.
Embora todas as células dos organismos multicelulares contenham a mesma
sequência de DNA e a mesma informação genética, há um conjunto de informações
epigenéticas distinto entre elas, o qual permite que os genes adequados sejam
expressos nos tecidos ou nos tipos celulares, produzindo um controle harmônico de
quais genes serão expressos em quais tecidos e a que tempo. O código epigenético
pode ser entendido como um segundo grupo de informações, que está associado ao
código genético. Portanto, os organismos multicelulares possuem um único genoma
ao qual estão associados múltiplos epigenomas.
126
A espectrometria de massas como ferramenta para o estudo do epigenoma
A regulação epigenética por meio das modificações na cromatina possui
grande importância biológica e participa de processos tais como o estabelecimento e
a manutenção da pluripotência em células-tronco, a diferenciação celular e o
controle da divisão celular e o câncer.
No campo das biotécnicas da reprodução, os eventos epigenéticos tornam-se
importantes pelo papel crítico que desempenham no desenvolvimento embrionário
inicial. Nessa fase, a cromatina passa por uma série de alterações genericamente
denominadas de reprogramação epigenética. Essas alterações estabelecem os
padrões de expressão compatíveis com o início do desenvolvimento celular. Na
técnica de clonagem por transferência nuclear, o entendimento dos eventos
epigenéticos ganha importância adicional.
A transferência nuclear de células somáticas consiste na introdução de um
núcleo de uma célula somática doadora em um oócito enucleado para gerar um
animal clonado. A produção de animais vivos após a transferência nuclear
demonstrou que o estado epigenético das células somáticas, incluindo aquelas
terminalmente diferenciadas, apesar de estável, não é irreversível e pode ser
reprogramado para um estado embrionário capaz de comandar o desenvolvimento
de um novo organismo (JAENISCH e YOUNG, 2008).
Entretanto,
embriões
bovinos
produzidos
por
transferência
nuclear
apresentam baixo potencial de desenvolvimento gestacional e apenas pequena
quantia dos embriões clonados resulta em nascimento. Grande parcela dessa
ineficiência da técnica é decorrente de inapropriada reprogramação epigenética do
núcleo transferido (RIDEOUT III et al., 2001). A reprogramação epigenética do
núcleo da célula somática envolve desmetilação do DNA e alterações nas histonas
associadas (SIMONSSON e GURDON, 2004). Embora o núcleo da célula doadora
seja parcialmente desmetilado após transferência para um oócito enucleado, a
desmetilação
posterior
não
ocorre
de
maneira
completa,
enquanto
o
estabelecimento dos novos padrões de metilação se dá precocemente em grande
proporção dos embriões clonados (REIK et al., 2001). De maneira semelhante,
alterações nos padrões de modificações pós-traducionais das histonas já foram
descritas em embriões e em animais clonados e estão associadas à baixa
viabilidade desses clones (SANTOS et al., 2003).
127
Os métodos mais utilizados para identificação da metilação do DNA são
baseados no tratamento do DNA com bissulfito de sódio. Nesse tratamento, as
citosinas não metiladas são convertidas em uracilas. A detecção pode ser feita com
sequenciamento de DNA, por reação em cadeia da polimerase sensível à metilação
ou por digestão com enzimas de restrição sensíveis à metilação. Embora esses
métodos sejam capazes de gerar resultados de alta resolução, com a detecção
específica e ou pontual de citosinas metiladas, eles exigem intenso trabalho
laboratorial, especialmente quando se deseja mensurar os níveis de metilação. A
associação das técnicas de conversão com bissulfito de sódio e de MALDI-TOF
permite a execução de ensaios que quantificam as metilações do DNA com precisão
(SONG et al., 2009). Com essa estratégia, é possível determinar, por exemplo, se
determinado tratamento provocou aumento ou diminuição na quantidade de
metilação do DNA em uma sequência de DNA específica.
As estratégias de estudo do epigenoma com MS revelam-se ainda mais
interessantes quando utilizadas para mapear as modificações pós-traducionais
(MPTs) das histonas. O estudo do código das histonas pode ser feito por meio de
imunocitoquímica, uma abordagem que permite o estudo apenas de modificações
covalentes particulares das histonas, para as quais se utilizam anticorpos
específicos. Essa abordagem exige conhecimento prévio das MPTs que se deseja
verificar e limita o número de ensaios concomitantes.
Resumidamente, a análise de MPTs envolve a digestão de proteínas em
pequenos peptídeos com uma enzima (tripsina), a separação desses peptídeos por
técnicas cromatográficas e a ionização no espectrômetro de massas por ESI para
obtenção de informações sequenciais por MS-MS. A tripsina cliva o C-terminal nos
resíduos de arginina e de lisina, produzindo uma mistura complexa de peptídeos
com um resíduo de aminoácido básico por peptídeo. Esses peptídeos ionizam por
electrospray para um estado de baixa carga, no qual geralmente são dissociados.
Embora a MS-MS por CID seja uma técnica mais poderosa, ela apresenta
algumas limitações na investigação de MPTs com a finalidade de entender suas
funções biológicas. Em razão das variadas ligações durante a transcrição e as
MPTs, as proteínas frequentemente apresentam múltiplas formas com diferentes
funções ou atividades biológicas. A atividade biológica e a função de qualquer
proteína são determinadas pela sua sequência e pela sua estrutura, incluindo
agregados de suas MPTs. O efeito funcional de uma MPT, em particular em um
128
aminoácido específico, pode depender do tipo e da presença ou da ausência de
outras MPTs em outros sítios relativamente remotos na proteína (MIKESH et al.,
2006).
Abordagens que utilizam a espectrometria de massas, especificamente
aquelas baseadas na fragmentação e no sequenciamento dos aminoácidos, tais
como a espectrometria de massas por dissociação por captura de elétrons (ECDMS) e a espectrometria de massas por dissociação por transferência de elétrons
(ETD-MS), são capazes de mapear múltiplas modificações pós-traducionais
presentes na mesma proteína. Isso permite o estudo de interações e de
combinações entre as diferentes MPTs, sem a necessidade de conhecimento prévio
de quais modificações estão presentes (PHANSTIEL et al., 2008; PLAZASMAYORCA et al., 2009)
A dissociação de peptídeos por ECD foi introduzida por McLafferty et al. há
dez anos. Nessa técnica, elétrons de baixa energia reagem com peptídeos
catiônicos armazenados em equipamentos do tipo ion trap, os quais podem estar
incluídos em espectrômetros de massas por ressonância ciclotônica de íons e
transformada de Fourrier (ICR-FT MS). Diferentemente de CID, a ECD não cliva
modificações
químicas
nas
cadeias
laterais
do
peptídeo,
mas
induz
preferencialmente quebras randômicas do peptídeo em suas ligações peptídicas.
Com ECD, as modificações lábeis, tais como a fosforilação (STENSBALLE et al.,
2000; SHI et al., 2001), a N-glicosilação e a O-glicosilação (MIRGORODSKAYA et
al., 1999) e a sulfonação (KELLEHER et al., 1999), assim como outras MPTs lábeis,
permanecem essencialmente intactas.
A ETD é um novo método, similar à ECD, para fragmentar peptídeos, a qual
utiliza a técnica química de reações do tipo íon a íon. Os fragmentos são gerados
por ETD pela transferência de um elétron de um radical aniônico para o peptídeo
protonado. Essa transferência libera energia que induz a fragmentação do esqueleto
peptídico, causando clivagem das ligações Cα-N, como na ECD. A fragmentação por
ETD cria complementaridade ao formar os íons dos tipos c- e z- em vez dos íons
típicos dos tipos b- e y- observados por CID. Embora os mecanismos de ECD e de
ETD ainda estejam sendo debatidos, a ETD preserva as MPTs que são lábeis pela
CID, de tal forma que a sequência com informações dos sítios de MPT nos
peptídeos possa ser obtida. ETDs podem ser realizadas por equipamentos do tipo
129
ion traps quadrupolares, em vez equipamentos ICR-FT MS, os quais são mais caros
e possuem custo alto de manutenção (SYKA et al., 2004).
O estudo do epigenoma avançou rapidamente nos últimos anos, revelando a
importância das modificações epigenéticas na diferenciação celular e no
desenvolvimento embrionário inicial. No campo da clonagem animal, diversos
grupos de pesquisa apontaram a ocorrência de alterações epigenéticas como
responsável pela baixa eficiência da técnica. O surgimento de tecnologias baseadas
em MS, capazes de mapear de forma integral as MPTs nas histonas, abre caminho
para a elucidação dos significados biológicos dessas alterações. Esse tipo de
abordagem deve permitir correlacionar os fenótipos observados em embriões e em
animais clonados com o padrão de suas marcações epigenéticas. Deve permitir
também correlacionar o padrão epigenético das células doadoras de núcleo com os
resultados da clonagem, bem como auxiliar na obtenção de protocolos que alterem o
estado epigenético da célula doadora de núcleo antes da transferência nuclear e que
favoreçam a reprogramação do núcleo somático pelo citoplasma do oócito.
Conclusão
Nos últimos anos, estudos envolvendo MS expandiram-se em ritmo
impressionante no campo das ciências biológicas. Além dos princípios da técnica,
foram citados neste trabalho exemplos do emprego da MS para análise de produtos
lácteos e de resíduos de drogas utilizadas em produção animal. Uma área em
expansão é também o desenvolvimento de novas aplicações em produção animal
como exemplificado pelas novas contribuições da MS em Biotecnologia da
Reprodução e pelas perspectivas de uso da MS em estudos sobre epigenética
animal. Para isso, é fundamental desenvolver experiência científica em grupos
multidisciplinares de modo a criar competências para novos desafios e resolver
problemas na área de agronegócios.
Referências bibliográficas
AOKI, Y.; HAKAMATA, H.; IGARASHI, Y.; UCHIDA, K.; KOBAYASHI, H.;
HIRAYAMA, N.; KOTANI, A.; KUSU, F. Simultaneous determination of azaperone
and azaperol in animal tissues by HPLC with confirmation by electrospray ionization
mass spectrometry. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in
the Biomedical and Life Sciences, v. 877, n. 3, p. 166-172, 2009.
130
APPLIED BIOSYSTEMS (Org). Espectrometria de massas e suas aplicações.
São Paulo: Abi Expert Training Center, 2005. 40 p.
BONI, R.; TOSTI, E.; ROVIELLO, S.; DALE, B. Intercellular communication in in vivoand in vitro-produced bovine embryos. Biology of Reproduction, v. 61, n. 4, p.
1050-1055, 1999.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria número 50 de
20 de fevereiro de 2006. Aprova os Programas de Controle de Resíduos em Carne,
Leite, Mel, Ovos e Pescado do exercício de 2006. Diário Oficial da União, Brasília,
DF, 3 março 2006, Seção 1, p.15.
BURNUM, K. E.; TRANGUCH, S.; MI, D.; DAIKOKU, T.; DEY, S. K.; CAPRIOLI, R.
M. Imaging mass spectrometry reveals unique protein profiles during embryo
implantation. Endocrinology, v. 149, n. 7, p. 3274-3278, 2008.
BÜTIKOFER, U.; MEYER, J.; SIEBER, R.; WALTHER, B.; WECHSLER, D.
Occurrence of the angiotensin-converting enzyme inhibiting tripeptides Val-Pro-Pro
and Ile-Pro-Pro in different cheese varieties of Swiss origin. Journal of Dairy
Science, v. 91, n. 1, p. 29-38, 2008.
CHAMPOMIER-VERGÈS, M. C.; MAGUIN, E.; MISTOU, M. Y.; ANGLADE, P.;
CHICH, J. F. Lactic acid bacteria and proteomics: current knowledge and
perspectives. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the
Biomedical and Life Sciences, v. 771, n. 1-2, p. 329-342, 2002.
CHAPMAN, J. R. Practical organic mass spectrometry: a guide for chemical and
biochemical analysis. NY, EUA, 2. ed. New York: John Wiley, 1993. 330 p.
CHAURAND, P.; SCHWARTZ, S. A.; BILLHEIMER, D.; XU, B. J.; CRECELIUS, A.;
CAPRIOLI, R. M. Integrating histology and imaging mass spectrometry. Analytical
Chemistry, v. 76, n. 4, p. 1145-1155, 2004.
CLAYDON, M.; DAVEY, S.; EDWARD-JONES, V.; GORDON, D. The rapid
identification of intact microorganisms using mass spectrometry. Nature
Biotechnology, v. 14, n. 11, p. 1584-1586, 1996.
CODEX ALIMENTARIUS. Toxicological evaluation of certain veterinary drug
residues in food. Codex Alimentarius Commission. Disponível em:
<http://www.codexalimentarius.net/web/jecfa.jsp>. Acesso em: 30 jan 2009.
COMMISSION DECISION 2003/181/EC of January 2002, Official Journal of the
European Community, v. 45, L30, p. 50, 2002.
COMMISION REGULATION 1430/94 of June 1994, Official Journal of the
European Community, L156, p. 6, 1994.
COZZOLINO, R.; PASSALACQUA, S.; SALEMI, S.; MALVAGNA, P.; SPINA, E.;
GAROZZO, D. Identification of adulteration in milk by matrix-assisted laser
131
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass
Spectrometry, v. 36, n. 9, p. 1031-1037, 2001.
De BRABANDER, H. F.; BIZEC, B. L.; PINEL, G.; ANTIGNAC, J. P.; VERHEYDEN,
K.; MORTIER, V.; COURTHEYN, D. E.; NOPPE, H. Past, present and future of mass
spectrometry in the analysis of residues of banned substances in meat-producing
animals. Journal of Mass Spectrometry, v. 42, n. 8, p. 983-998, 2007.
FENG, X.; LIU, X.; LUO, Q.; LIU, B. F. Mass spectrometry in systems biology: an
overview. Mass Spectrometry Reviews, v. 27, n. 6, p. 635-60, 2008.
FENN, J. B.; MANN, M.; MENG, C. K.; WONG, S. F.; WHITEHOUSE, C. M.
Electrospray for mass spectrometry of large biomolecules. Science, v. 246, n. 4926,
p. 64-71, 1989.
FENN, J. B.; MANN, M.; MENG, C. K.; WONG, S. F.; WHITEHOUSE, C. M.
Electrospray ionization - principles and practice. Mass Spectrometry Reviews, v. 9,
n. 1, p. 37-70, 1990.
FENSELAU, C.; DEMIREV, P. A. Characterization of intact microorganism by MALDI
mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, v. 20, n. 4, p. 157-171, 2001.
FERREIRA, C. R.; CATHARINO, R. R.; SARAIVA, A. S.; FONSECA, M. F. R.;
BASSO, A. C.; PONTES, J. H. F.; ERENO JR., J. C.; EBERLIN, M. N. Perspectivas
para aplicação da técnica de espectrometria de massas na caracterização do
lipidoma de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. Acta Scientiae
Veterinariae, v. 36, (supl. 2), p. 549, 2008.
FERREIRA, C. R.; SARAIVA, S. A.; CATHARINO, R. R.; GARCIA, J. S.; SANVIDO,
G. B.; GOZZO, F. C.; SARTORI, R.; LO TURCO, E. G.; BERTOLLA, R. P.;
GUARDIEIRO, M. M.; EBERLIN, M. N. Single oocyte and embryo mass
spectrometry. In: CONGRESS OF THE INTERNATIONAL SOCIETY OF MASS
SPECTROMETRY, 18., 2009, Bremen, Alemanha. Proceedings... Bremen,
Alemanha: ISMS, 2009a. (Abstract 498).
FERREIRA, C. R.; SOUZA, G. H.; RICCIO, M. F.; CATHARINO, R. R.; PONTES, J.
H.; BASSO, A. C.; JÚNIOR, J. C.; PERECIN, F.; EBERLIN, M. N. Mass spectrometry
fingerprinting of media used for in vitro production of bovine embryos. Rapid
Communications of Mass Spectrometry, v. 23, n. 9, p. 1313-1320, 2009b.
FONG, B. Y.; NORRIS, C. S.; PALMANO, K. P. Fractionation of bovine whey
proteins and characterization by proteomic techniques. International Dairy Journal,
v. 18, n. 1, p. 23-46, 2008.
FOX, P. F.; McSWEENEY, P. L. H. Dairy chemistry and biochemistry. New York:
Thomson Science, 1998. 478 p.
FUCHS, B.; JAKOP, U.; GÖRITZ, F.; HERMES, R.; HILDEBRANDT, T.; SCHILLER,
J.; MÜLLER, K. MALDI-TOF "fingerprint" phospholipid mass spectra allow the
132
differentiation between ruminantia and feloideae spermatozoa. Theriogenology, v.
71, n. 4, p. 568-575, 2008a.
FUCHS, B.; NIMPTSCH, A.; SUSS, R.; SCHILLER, J. Analysis of brain lipids by
directly coupled matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass
spectrometry and high-performance thin-layer chromatography. Journal of
Association of Official Analytical Chemists International, v. 9, n. 5, p. 1227-1236,
2008b.
FUCHS, B.; SCHILLER, J. MALDI-TOF MS analysis of lipids from cells, tissues and
body fluids. Subcellular Biochemistry, v. 49, p. 541-565, 2008.
FUCHS, B.; SCHILLER, J.; SÜSS, R.; ZSCHARNACK, M.; BADER, A.; MÜLLER, P.;
SCHÜRENBERG, M.; BECKER, M.; SUCKAU, D. Analysis of stem cell lipids by
offline HPTLC-MALDI-TOF MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 392, n.
5, p. 849-860, 2008c.
GARCIA, J. S.; FERREIRA, C. R.; SARAIVA, S. A.; SANTOS, L. F. A.; PERECIN, F.;
CATHARINO, R. R.; GOZZO, F. C.; SANVIDO, G. B.; BASSO, A. C.; PONTES, J. H.
F.; EBERLIN, M. N. MALDI-TOF MS fingerprinting of blood serum used for ruminant
in vitro production. In: In: CONGRESS OF THE INTERNATIONAL SOCIETY OF
MASS SPECTROMETRY, 18., 2009, Bremen, Alemanha. Proceedings... Bremen,
Alemanha: ISMS, 2009. (Abstract 501).
GIARD, J. C.; LAPLACE, J. M.; RINCÉ, A.; PICHEREAU, V.; BENACHOUR, A.;
LEBOEUF, C.; FLAHAUT, S.; AUFFRAY, Y.; HARTKE, A. The stress proteome of
Enterococcus faecalis. Electrophoresis, v. 22, n. 14, p. 2947-2954, 2001.
GROSS, J. H. Mass spectrometry: a textbook. Heidelberg, Germany: Springer
Verlag, 2004. 518 p.
HETTICK, J. M.; KASHON, M. L.; SLAVEN, J. E.; MA, Y.; SIMPSON, J. P.; SIEGEL,
P. D.; MAZUREK, G. N.; WEISSMAN, D. N. Discrimination of intact mycobacteria at
the strain level: a combined MALDI-TOF MS and biostatistical analysis. Proteomics,
v. 6, n. 24, p. 6416-6425, 2006.
HERVE-JIMENEZ, L.; GUILLOUARD, I.; GUEDON, E.; GAUTIER, C.;
BOUDEBBOUZE, S.; HOLS, P.; MONNET, V.; RUL, F.; MAGUIN, E. Physiology of
Streptococcus thermophilus during the late stage of milk fermentation with special
regard to sulfur amino-acid. Proteomics, v. 8, n. 20, p. 4273-4286, 2008.
HOFFMANN, E.; STROOTBART, V. Mass spectrometry: principles and
applications. 3. Ed. West Sussex, England: Wiley-Interscience, 2007. 502 p.
JAENISCH, R.; YOUNG, R. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and
nuclear reprogramming. Cell, v. 132, n. 4, p. 567-582, 2008.
KARAS, M. I.; HILLENKAMP, F. Laser desorption ionization of proteins with
molecular masses exceeding 10.000 daltons. Analytical Chemistry, v. 60, n. 29, p.
2299-2301, 1988.
133
KHANDOKER, M. A. M. Y.; TSUJII, H.; KARASAWA, D. Fatty acid compositions of
oocytes, follicular oviductal and uterine fluids of pig and cow. Asian-Australasian
Journal of Animal Sciences, v. 10, n. 5, p. 523-527, 1997.
KHANDOKER, M. A. M. Y.; TSUJII, H.; KARASAWA, D. A kinetics study of fatty acid
composition of embryos, oviductal and uterine fluids in the rabbit. AsianAustralasian Journal Animal Sciences, v. 11, n. 1, p. 60, 1998.
KHANDOKER, M. A. M. Y.; TSUJII, H. Effect of exogenous fatty acids on in vitro
development of rat embryos. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, v.
12, n. 12, p. 169, 1999.
KIM, J. Y.; KNOSHITA, M.; OHNISHI, M.; FUKUI, Y. Lipid and fatty acid analysis of
fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes.
Reproduction, v. 122, n.1, p. 131-138, 2001.
KINTER, M.; SCHERMAN, N. E. Protein sequence and identification using
TANDEM mass spectrometry. New York, EUA: John Wiley, 2000. 320 p.
LEVERRIER, P.; VISSERS, J. P.; ROUAULT, A.; BOYAVAL, P.; JAN, G. Mass
spectrometry proteomic analysis of stress adaptation reveals both common and
distinct response pathways in Propionibacterium freudenreichii. Archives of
Microbiology, v. 181, n. 3, p. 215-230, 2004.
LI, H.; SMITH, M. L.; CHIESA, O. A.; KIJAK, P. J. Determination of sulfadimethoxine
and 4N-acetylsulfadimethoxine in bovine plasma, urine, oral fluid, and kidney and
liver biopsy samples obtained surgically from standing animals by LC/MS/MS.
Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and
Life Sciences, v. 877, n. 3, p. 237-246, 2009.
KELLEHER, N. L.; ZUBAREV, R. A.; BUSH, K.; FURIE, B.; FURIE, B. C.;
MCLAFFERTY, F. W.; WALSH, C. T. Localization of labile posttranslational
modifications by electron capture dissociation: the case of gamma-carboxyglutamic
acid. Analytical Chemistry, v. 71, n. 19, p. 4250-4253,1999.
MARTINS-JÚNIOR, H. A.; BUSTILLOS, O. V.; PIRES, M. A. F.; WANG, A. Y.;
LEBRE, D. T. Determinação de resíduos de cloranfenicol em amostras de leite e mel
industrializados utilizando a técnica de espectrometria de massas em “tandem”
(CLAE-EM/EM). Química Nova, v. 29, n. 3, p. 586-592, 2006.
MARTINS-JÚNIOR, H. A.; KUSSUMI, T. A.; WANG, A. Y.; LEBRE, D. T. A rapid
method to determine antibiotic residues in milk using liquid chromatography coupled
to electrospray tandem mass spectrometry. Journal of the Brazilian Chemical
Society, v. 18, n. 2, p. 397-405, 2007.
MARTINS-JÚNIOR, H. A.; FERREIRA, C. R.; SIMAS, R. C.; BASSO, A. C.;
PONTES, J. H. F.; MEIRELLES, F. V.; EBERLIN, M. N. Estradiol-17β quantification
in blood serum used for ruminant embryo in vitro production by LC-MS/MS. In:
CONGRESS OF THE INTERNATIONAL SOCIETY OF MASS SPECTROMETRY,
134
18., 2009, Bremen, Alemanha. Proceedings... Bremen, Alemanha: ISMS, 2009.
(Abstract, 502).
McEVOY, T. G.; COULL, G. D.; BROADBENT, P. J.; HUTCHINSON, J. S. M.;
SPEAKE, B. K. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep
oocytes with intact zona pellucida. Journal of Reproduction and Fertility, v. 118, n.
1, p. 163-170, 2000.
MIKESH, L. M.; UEBERHEIDE, B.; CHI, A.; COON, J. J; SYKA, J. E.;
SHABANOWITZ, J.; HUNT, D. F. The utility of ETD mass spectrometry in proteomic
analysis. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1764, n. 12, p. 1811-1822, 2006.
MIRGORODSKAYA, E.; ROEPSTORFF, P.; ZUBAREV, R. A. Localization of Oglycosylation sites in peptides by electron capture dissociation in a Fourier transform
mass spectrometer. Analytical Chemistry, v. 71, n. 20, p. 4431-4436, 1999.
MÖLLER, N. P.; SCHOLZ-AHRENS, K. E.; ROOS, N.; SCHREZENMEIR, J.
Bioactive peptides and proteins from foods: indication for health effects. European
Journal of Nutrition, v. 47, n. 4, p. 171-182, 2008.
NEVES, J. P.; GONÇALVES, P. B. D.; OLIVEIRA, J. F. C. Fatores que afetam a
eficiência reprodutiva na vaca. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 23, p.
99-106, 1999.
PHANSTIEL, D.; BRUMBAUGH, J.; BERGGREN, W. T.; CONARD, K.; FENG, X.;
LEVENSTEIN, M. E.; MCALISTER, G. C.; THOMSON, J. A.; COON, J. J. Mass
spectrometry identifies and quantifies 74 unique histone H4 isoforms in differentiating
human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, v. 105, n. 11, p. 4093-4098, 2008.
PLAZAS-MAYORCA, M. D.; YOUNG, N. L.; GARCIA, B. A. Identification of
differentially expressed histone codes using HILIC and mass spectrometry.
American Biotechenology Laboratories, v. 27, p. 10-12, 2009.
PONTES, J. H.; NONATO-JUNIOR, I.; SANCHES, B. V.; ERENO-JUNIOR, J. C.;
UVO, S.; BARREIROS, T. R.; OLIVEIRA, J. A.; HASLER, J. F.; SENEDA, M. M.
Comparison of embryo yield and pregnancy rate between in vivo and in vitro
methods in the same Nelore (Bos indicus) donor cows. Theriogenology, v. 71, n. 4,
p. 690-697, 2008.
REIG, M.; TOLDRÁ, F. Liquid chromatography for the rapid screening of growth
promoters residues in meat. Food Analytical Methods, v. 1, n. 1, p. 2-9, 2008.
REIK, W.; DEAN, W.; WALTER, J. Epigenetic reprogramming in mammalian
development. Science, v. 293, n. 5532, p. 1089-1093, 2001.
REINHARDT, T. A.; LIPPOLIS, J. D. Bovine milk fat globule membrane proteome.
Journal of Dairy Research, v. 73, n. 4, p. 406-416, 2006.
135
RENESTO, A. Associação das biotécnicas: aspiração folicular guiada por ultrasonografia e superovulação na produção in vitro e in vivo de embriões
bovinos. 2004. 59 f. Dissertação (Mestrado em Reprodução Animal) − Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP,
2004.
RIDEOUT III, W. M.; EGGAN, K.; JAENISCH, R. Nuclear cloning and epigenetic
reprogramming of the genome. Science, v. 293, n. 5532, p. 1093-1098, 2001.
RIZOS, D.; GUTIERREZ-ADAN, A.; PEREZ-GARNELO, S.; DE LA FUENTE, J.;
BOLAND, M. P.; LONERGAN, P. Bovine embryo culture in the presence or absence
of serum: implications for blastocyst development, cryotolerance, and messenger
RNA expression. Biology of Reproduction, v. 68, n. 1, p. 236-243, 2003.
ROYCE, P. N. A discussion of recent developments in fermentation monitoring and
control from a practical perspective. Critical Reviews in Biotechnology, v. 13, n. 2,
p. 117-149, 1993.
RUELLE, V.; EL MOUALIJ, B.; ZORZI, W.; LEDENT, P.; DE PAUW, E. Rapid
identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in
Mass Spectrometry, v. 18, n. 18, p. 2013-2019, 2004.
SANTOS, F.; ZAKHARTCHENKO, V.; STOJKOVIC, M.; PETERS, A.; JENUWEIN,
T.; WOLF, E.; REIK, W.; DEAN, W. Epigenetic marking correlates with
developmental potential in cloned bovine preimplantation embryos. Current Biology,
v. 13, n. 13, p. 1116-1121, 2003.
SCHILLER, J.; SÜSS, R.; ARNHOLD, J.; FUCHS, B.; LESSIG, J.; MÜLLER, M.;
PETKOVIĆ, M.; SPALTEHOLZ, H.; ZSCHÖRNIG, O.; ARNOLD, K. Matrix-assisted
laser desorption and ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry in lipid
and phospholipid research. Progress in Lipid Research, v. 43, n. 5, p. 449-488,
2004.
SCHILLER, J.; SUSS, R.; FUCHS, B.; MULLER, M.; ZSCHORNIG, O.; ARNOLD, K.
MALDI-TOF MS in lipidomics. Frontiers in Bioscience, v. 12, p. 2568-2579, 2007.
SHI, S. D.; HEMLING, M. E.; CARR, S. A.; HORN, D. M.; LINDH, I.; MCLAFFERTY,
F. W. Phosphopeptide/phosphoprotein mapping by electron capture dissociation
mass spectrometry. Analytical Chemistry, v. 73, n.1, p. 19-22, 2001.
SIMONSSON, S.; GURDON, J. DNA demethylation is necessary for the epigenetic
reprogramming of somatic cell nuclei. Nature Cell Biology, v. 6, n. 10, p. 984-890,
2004.
SIUZDAK, G. The expanding role of mass spectrometry in biotechnology. 2. ed.
San Diego, EUA: MCC Press, 2006. 257 p.
136
SMOLE, S. C.; KING, L. A.; LEOPOLD, P. E.; ARBEIT, R. D. Sample preparation of
gram-positive bacteria for identification by matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight. Journal of Microbiology Methods, v. 48, n. 2-3, p. 107-115, 2002.
SONG, F.; MAHMOOD, S.; GHOSH, S.; LIANG, P.; SMIRAGLIA, D. J.; NAGASE, H.;
HELD, W. A. Tissue specific differentially methylated regions (TDMR): changes in
DNA methylation during development. Genomics, v. 93, n. 2, p. 130-139, 2009.
STENSBALLE, A.; JENSEN, O. N.; OLSEN, J. V.; HASELMANN, K. F.; ZUBAREV,
R. A. Electron capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides.
Rapid Communications in Mass Spectrometry, v. 14, n. 19, p. 1793-1800, 2000.
STINGU, C. S.; RODLOFF, A. C.; JENTSCH, H.; SCHAUMANN, R.; ESCHRICH, K.
Rapid identification of oral anaerobic bacteria cultivated from subgingival biofilm by
MALDI-TOF-MS. Oral Microbiology and Immunology, v. 23, n. 5, p. 372-376,
2008.
STOECKLI, M.; CHAURAND, P.; HALLAHAN, D. E.; CAPRIOLI, R. M. Imaging mass
spectrometry: a new technology for the analysis of protein expression in mammalian
tissues. Nature Medicine, v. 7, n. 4, p. 493-496, 2001.
STRINGFELLOW, D. A.; GIVENS, M. D.; WALDROP; J. G. Biosecurity issues
associated with current and emerging embryo technologies. Reproduction, Fertility
and Development, v. 16, n. 1-2, p. 93-102, 2004.
SYKA, J. E.; COON, J. J.; SCHROEDER, M. J.; SHABANOWITZ, J.; HUNT, D. F.
Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass
spectrometry. Proceedings of the National Academy of Science USA, v. 101, n.
26, p. 9528-9533, 2004.
THIBIER, M. Data retrieval committee annual report. IETS Embryo Transfer
Newsletter, v. 24, p. 12-18, 2006.
VAN DER HEEFT, E.; BOLCK, Y. J. C.; BEUMER, B.; NIJROLDER, A. W. J. M.;
STOLKER, A. A. M.; NIELENA, M. W. F. Full-scan accurate mass selectivity of ultraperformance liquid chromatography combined with time-of-flight and orbitrap mass
spectrometry in hormone and veterinary drug residue analysis. Journal of the
American Society of Mass Spectrometry, v. 20, n. 3, p. 451-463, 2009.
WRENZYCKI, C.; HERRMAN, D.; LUCAS-HAHN, A.; KORSAWE, K.; LEMME, E.;
NIEMANN H. Messenger RNA expression patterns in bovine embryos derived from
in vitro procedures and their implications for development. Reproduction, Fertility
and Development, v. 17, n. 1-2, p. 23-35, 2005.
ZELENY, R.; HARBECK, S.; SCHIMMEL, H. Validation of a liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the identification and quantification of 5nitroimidazole drugs and their corresponding hydroxy metabolites in lyophilized pork
meat. Journal of Chromatography A, v. 1216, n. 2, p. 249-256, 2009.

Princípios e aplicações da espectrometria de

Transcrição

Documentos relacionados

the commonwealth of massachusetts office of the attorney general

Campeão, skatista Wacson Mass é homenageado pela Câmara

Transferência de embriões criopreservados doados

calendário da semana

Volume 11 - Novembro 2009

flurazepam

calendário da semana

stjameschurchrc.com - John Patrick Publishing Company

Inscrições abertas para 01 vaga de Pós

Linha Aberta - N° 765 - Embrapa Clima Temperado