Métodos de Estudo da Célula: Citoquímica

MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA
CELULAR
II - CITOQUÍMICA
Sistemas de estudos
in vitro
Cultura
Fertilização
Manipulações
Estudos
bioquímicos
Preparações citológicas
Citoquímica
Autorradiografia
Imunocitoquímica
Célula
Tecido
Órgão
Análises
in situ
Extrações/Purificações
Centrifugações
Diálises
Eletroforeses
Tecnologia do DNA/RNA
Métodos de Estudos in situ
Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas
O estudo do material biológico ao Microscópio requer alguns
procedimentos prévios que vão desde a escolha e coleta do
material até a montagem final do preparado histológico
Que os elementos a ser
analisados
não
sejam
difusíveis;
Que o produto da reação
seja
visível
(cor
ou
precipitado);
Que a reação seja
específica/seletiva para o que
se pretende analisar
Princípios da
Citoquímica
Métodos de Estudos in situ
Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas
O sucesso de uma reação citoquímica depende principalmente
dos passos anteriores ao da reação de coloração:
Coleta do material
Fixação e agentes fixadores
Agentes desidratantes
Coleta do Material
Preparado permanente
Células preservadas para melhor demonstração de sua estrutura
Ideal = sejam mantidos estrutura e composição química quando in vivo
1) Montagem total:
•Material fino / transparente – na lâmina
• Fixação e coloração
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)
Mesentério
Glândulas de insetos
Membranas fetais
Glândulas Salivares de Rhodnius prolixus
Montagem total
Glândula
Principal
Glândula
Acessória
Ducto
Acessório
Ducto
Principal
Coleta do Material
2) Esfregaço: consistem em promover o espalhamento de células livres
sobre a lâmina com o auxílio de outra lâmina
• Células livres: sangue, linfa, sêmen, líquor
• Fixação e coloração
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)
Coleta do Material
3) Espalhamento:
• Erroneamente esfregaço
• Raspagem (espátula / palitos) de camadas superficiais (mucosas)
Mucosas: bucal, anal, vaginal
• Fixação e coloração
• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)
Coleta do Material
4) Esmagamento:
• Esmagar, o material entre lâmina e lamínula,
• Coloração concomitante ou posterior
• Vantagem: estudo de divisões celulares
Cromossomos
Núcleo/Nucléolo
Coleta do Material
5) Decalque ou Imprint:
• Coleta de núcleos de tecidos moles – fígado, baço, rim. timo
• Retira-se órgão – face cortada lavada com salina – seca com papel –
pressiona contra a lâmina (carimbo)
Resultado: núcleos impressos
• Fixação e coloração
• Vantagem: - simples
- estudo da quantidade de DNA
6) Cortes Histológicos
TÉCNICA DE MICROSCOPIA DE
LUZ PARA O ESTUDO DAS
CÉLULAS E TECIDO
COMO PREPARAR UM CORTE HISTOLÓGICO ???
MATERIAL BIOLÓGICO
INIBIR A AUTÓLISE
PRESERVAR A
MORFOLOGIA E A
COMPOSIÇÃO QUIMICA
DO TECIDO
FIXAÇÃO
COAGULAR E
ENDURECER O
TECIDO
FACILITAR A
COLORAÇÃO
CONDUTA PARA BOA
FIXAÇÃO
Fixação por imersão: o fixador entra em
contato com o material biológico após a retirada
do organismo.
Fixação por perfusão: o fixador é injetado na
corrente sangüínea, possibilitando a fixação em
nível pericelular e celular.
CRIOSTATO:
objetivo é utilizar para o
estudo da distribuição dos
lipídeos.
FIXAÇÃO
QUÍMICA:
uso de
substâncias que reagindo com as
biomacromoléculas estabilizam as
mesmas.
FORMOL (ALDEÍDO FÓRMICO a 40%)
BOUIN (ÁCIDO PÍCRICO, FORMALDEÍDO
E ÁCIDO ACÉTICO)
KARNOVSKY ( PARAFORMALDEÍDO E
GLUTARALDEÍDO
FATORES QUE ATUAM NO PROCESSO
DE FIXAÇÃO
Tamponamento
Temperatura
Espessura da peça
Volume de fixador
Tempo de fixação
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
DESIDRATAÇÃO: retirada da água dos
tecidos e a sua substituição por álcool.
DIAFANIZAÇÃO: substituição do álcool
presente nos tecidos pelo óleo de cedro.
IMPREGNAÇÃO: o óleo é substituído
por parafina a 60°C.
INCLUSÃO: o tecido é colocado em caixas
com parafina e então solidificados.
PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
INCLUSÃO EM PARAFINA E
RESINAS HISTOLÓGICAS
INCLUSÃO
Diferentes planos dos cortes histológicos
Micrótomo Leica RM2155
Cortes blocos parafina e resina - lâminas
Navalha
parafina
Navalha
resina
Navalha diamante
DISTENSÃO DOS CORTES
DESPARAFINIZAÇÃO
HIDRATAÇÃO
COLORAÇÃO
Corte histológico
Clarificação
Citoquímica / Histoquímica
Área da biologia celular e estrutural dedicada
aos estudos dos métodos de coloração dos
tecidos e constituintes celulares e subcelulares
Células x Tecidos
Elementos químicos de Baixo P.M. (C, O, N, H, etc.)
↓ Matéria Orgânica
Baixo Contraste
Material a ser examinado ao M.L.
- Fino
- Transparente (→
→ luz → formação da imagem)
↓ Material Biológico
Coloração ou reações
Citoquímica
Métodos de coloração
Princípios químicos das reações de coloração
Procedimentos protocolares
Coloração do Material Biológico
Componentes químicos que podem ser avaliados pela
técnica citoquímica
Ácido Nucléicos
Proteínas
Polissacarídeos
Lipídios
Íons (Complexos moleculares)
Vitaminas e Enzimas
• Pesquisa científica
• Diagnóstico patológico
Sucesso da reação citoquímica:
Elementos avaliados → Não difusíveis no processamento
Produto da reação
cor
insolúvel
Reação específica para o composto celular analisado
Coleta
Passos anteriores à reação:
Fixação
Desidratação
Reações Citoquímicas
Natureza das reações citoquímicas envolvidas
Ligações eletrostáticas
Corante
Ligações covalentes
Interações hidrofóbicas
Substrato
Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Eletrostáticas
Afinidade eletrostática: um corante ionizado em uma
solução reage com um substrato de carga iônica oposta.
+
Substrato
catiônico
Substrato
aniônico
Acidofilia
Basofilia
Corante
aniônico
Corante
catiônico
+
Basofilia
Corantes Básicos (Catiônicos +)
Substrato carregado negativamente (aniônico) reage
eletrostaticamente com um corante carregado positivamente
(catiônico).
Corantes:
Azul de metileno
Azul de alcian
Azul de toluidina
Basofilia
Basofilia
Corantes catiônicos reagem com grupamentos ionizáveis na
célula / no tecido, que apresentam cargas negativas
(aniônicos)
Fosfatos
(ácidos nucléicos)
Grupamentos
negativos
Sulfatos
(Glicosaminoglicanos sulfatados)
Carboxilas
(Proteínas e açúcares ácidos)
Basofilia
Corante interage com um componente tissular,
corando-o com cor diferente da sua cor original.
O azul de toluidina é um corante básico que interage
com compostos poliméricos ricos em grupamentos
sulfato.
Metacromasia e Basofilia metacromática
Alguns corantes básicos, devido à natureza planar de suas moléculas,
podem promover um empilhamento ordenado ao ligarem-se a
substratos polianiônicos: Fenômeno - metacromasia
Metacromático
Ortocromático
Reação de Acidofilia
Corantes ácidos (Aniônicos)
Esses corantes reagem com os elementos que possuem cargas positivas
na célula, como por exemplo, as proteínas, que podem apresentar
radicais básicos de seus aminoácidos ionizados (NH3+).
Orceína
Fast green
Amarelo de
Naftol
Xilydine Ponceau
Sírius Red
Ex.: Corante aniônico
Orceína lacto-acética
• Corante se liga à proteínas histônicas ou totais, complexadas ao
DNA da cromatina;
• Diferenciação entre eucromatina e heterocromatina (corante mais
forte);
• Heterocromatina: Mais compacta e menor número de proteínas.
Orceína lacto-acética
Testículo de gafanhoto
Orceína lacto-acética
Espermatogênese em testículo
de triatomíneos
Hematoxilina Eosina
Hematoxilina (+)
Eosina (-)
⇓
⇓
Substratos (-)
Substratos (+)
⇓
⇓
Núcleos
Citoplasma
(grupam/os fostato do DNA)
(grupam/o NH2+)
⇓
⇓
Azul
Rosa
Hematoxilina Eosina
(Ribeiro & Lima, 2000)
Coloração de rotina para análise geral da
morfologia dos túbulos seminíferos
(Mus muscullus)
(ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)
R
HE
• Estrutura dos túbulos
seminíferos
• Formação do grânulo préacrossomal
(Peruquetti, 2004)
C
G
Corantes ácidos
Coram estruturas básicas do
tecido.
Ex: aminoácidos básicos
(lisina, arginina, histidina)
Corantes básicos
Coram estruturas ácidas do
tecido. Ex: ácidos nucleicos,
aminoácidos
ácidos
(aspártico, glutâmico).
Impregnação por Íons Prata
Impregnação pelo Nitrato de Prata
A técnica de impregnação pela prata é utilizada para marcar:
Nucléolos de núcleos interfásicos
Regiões organizadoras nucleolares (RONs) nos cromossomos
Nucléolo (ME)
CG
CG
CFD
CFD
CF
CF
Durante a intérfase, a impregnação pela prata ocorre
largamente no Centro Fibrilar (CF) e no Componente Fibrilar
Denso (CFD);
Testes citoquímicos e análises químicas indicaram que a prata
tem afinidade pelas proteínas acídicas (B23, C23)
Impregnação por íons prata
(Howell & Black, 1980)
Identificação de proteínas nucleolares (B23 e C23)
(nucléolos e corpúsculos nucleolares)
(Mus muscullus)
(ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)
Prata
• Proteínas nucleolares – B23 e C23
(Peruquetti, 2004)
Aplicações
A) Pesquisas citogenéticas
Bandamento cromossômico
Indicar atividades de transcrição do DNAr
Estudo da atividade nucleolar durante a gametogênese
B) Diagnósticos patológicos
Leucemias
Tumores:
ovário
mama
útero
tireóide
↑ Proteínas AgNOR
↑ Taxa de proliferação
↑ Grau de malignidade
Região Organizadora Nucleolar
Regiões cromossômicas com as quais os nucléolos se associam
e que são responsáveis pela reorganização destes, no final da
divisão celular, onde os genes de DNAr estão localizados
Reações citoquímicas mediadas por ligações covalentes
Muitas reações citoquímicas são mediadas por ligações
covalentes, principalmente aquelas que precisam ser
facilitadas por mordentes (componentes metálicos). Estas
reações são chamadas de reações Tricrômicas.
Tricômico de Masson
Tricrômico de Gömöri
Tricômico de Mallory
São técnicas específicas para fibras do tecido
conjuntivo e selecionam compostos celulares dos
compostos fibrosos
Métodos Tricrômicos de Coloração
Composição básica
- Dois ou + corantes aniônicos
- Mordentes (moléculas de componentes metálicos): ácido
fosfofúngstico / ácido fosfomolibdico
Resultados
- Coloração seletiva para os componentes do tecido conjuntivo
- Histopatologia
- Pesquisa científica (Biologia celular e tecidual)
Tricrômico de Mallory
Epitélio intestinal (roxo); fibras colágenas (azul)
Tricrômico de Gömöri
Tecido conjuntivo (azul esverdeado)
Células: pigmentos de fucsina
Núcleos: escuros
Tricrômico de Masson
Língua
Fibras musculares (lilás)
Fibras colágenas (azul)
Núcleos (azul escuro)
Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Covalentes
Outro exemplo clássico deste tipo de reação são as reações
intermediadas pelo Reativo de Schiff: Reação de Feulgen
(DNA); Teste do PAS (polissacarídeos neutros)
Aldeídos
livres
2(R-CHO)
Leucoderivado
da Fucsina básica
Restauração do grupo cromofórico
(2 fórmulas prováveis)
Reação de Feulgen
Importância da Reação de Feulgen
Verificar a influência da ação de drogas, hormônios e do
envelhecimento sobre o conteúdo do DNA;
Detectar a presença de aneuploidias e poliploidias em vários
tipos de tumores.
DNA – Feulgen +
RNA – Feulgen -
Controle da reação: Extração do DNA
Feulgen -
Mecanismo da Reação de Feulgen
Duas etapas
A) Hidrólise ácida (HCl) – remove bases púricas
Depurinação do DNA ⇒ Ácido apurínico
B) Exposição do material hidrolisado ao reativo de Schiff
( cora somente aldeídos livres)
Hidrólise Ácida
Depurinação
Ligação do corante à molécula
Reativo de Schiff
Fatores modificadores da resposta à
Reação de Feulgen
Disponibilidade de substrato a ser corado
Influência da fixação
Variações na etapa hidrolítica: molaridade do ácido / tempo
/ temperatura
Ex.:
HCl a 1N - 60o
HCl 5N - temperatura ambiente
Influência da composição e de outras características do
Reativo de Schiff
Túbulos Seminíferos de Mus musculus
Reação de Feulgen
R
Túbulos seminíferos
• Áreas nucleolares (-)
(espermatócitos I → Espermátides)
• Heterocromatina
(Peruquetti, 2004)
C
G
MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA
MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA
MATERIAL INCLUÍDO EM PARAFINA
MATERIAL INCLUÍDO EM HISTORRESINA
REFERÊNCIAS
MICHALANY, J., 1980. Técnica Histológica em Anatomia Patológica. São
Paulo: Editora Pedagógica e Universitária.
JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J., 2005. Biologia Celular e Molecular.
8. ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.
DE ROBERTIS JR. E.M.F. 2006. Bases da Biologia Celular e Molecular. 4ª.
Edição. Guanabara Koogan.
MELLO, R.C.N. 2002. Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Juiz
de Fora: Editora UJFJ.