nanda hampe

Transcrição

nanda hampe

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
Tese
Incompatibilidade de enxertia em Prunus, alterações
fenotípicas, bioquímicas e gênicas
Ivan dos Santos Pereira
Pelotas, 2012.
IVAN DOS SANTOS PEREIRA
Engenheiro Agrônomo
Incompatibilidade de enxertia em Prunus, alterações
fenotípicas, bioquímicas e gênicas
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Agronomia da
Universidade Federal de Pelotas,
como requisito parcial à obtenção
do título de Doutor em Ciências,
área
de
concentração
em
Fruticultura de Clima Temperado.
Orientador: José Carlos Fachinello
Co-orientador (es): Ana Pina
Luís Eduardo Corrêa Antunes
Pelotas, 2012.
Banca examinadora:
José Carlos Fachinello – Professor, FAEM – UFPel (Presidente).
Ângela Diniz Campos – Pesquisadora, Embrapa Clima Temperado.
Flávio Gilberto Herter – Professor, FAEM - UFPel.
Rodrigo Cezar Franzon – Pesquisador, Embrapa Clima Temperado.
Moacir da Silva Rocha – Professor, CAVG - UFPel (Suplente).
Paulo Celso de Mello Farias – Professor, FAEM – UFPel (Suplente).
Agradecimentos
Ao Profº José Carlos Fachinello, pela orientação, paciência e dedicação durante
os anos de pesquisa.
À Drª Ana Pina, pela brilhante orientação, paciência, dedicação, grande
incentivo e amizade. Pessoa, que além de possibilitar a qualificação deste
trabalho, me acolheu entre seus amigos e sua família.¡¡¡ Muchas Gracias !!!
Ao Dr. Luis Eduardo Corrêa Antunes, pela orientação, dedicação, incentivo,
parceria e grande amizade.
Ao Dr. Carlos Augusto Posser Silveira, pelas discussões, sugestões, grande
incentivo, parceria e enorme amizade, além das conversas descontraídas,
regadas ao seu insuperável chimarrão, elaborado de forma meticulosa, quase
que artística.
Ao Dr. Rafael da Silva Messias, pelo grande auxílio e sugestões com relação à
parte bioquímica, fisiológica e molecular, além do incentivo, da parceria e da
grande amizade demonstrada.
A Dra. Ângela Diniz Campos, pelo auxílio e sugestões com relação à parte
bioquímica e fisiológica, além do incentivo, paciência e amizade.
Aos Professores, Antônio Costa de Oliveira e Rogério Oliveira de Souza, pelo
auxilio relacionado ao Curso de Pós-Graduação, em especial no caso do
estágio de doutorado no exterior.
Ao Dr. Flávio Gilberto Herter, por ser um pesquisador magnífico e uma pessoa
exemplar, que acompanhou, incentivou, participou e contribuiu, para o meu
crescimento e consequentemente para a realização deste trabalho.
A Ana Wünsch, Ariana Cachi, Beatriz Bielsa, Enrique (Quique), Francisco Javier
Rodrigo García, José Manuel Alonso Segura, José Miguel Ansón Hernández,
Mari Carmen Villalba, María José Rubio Cabetas, María Pilar Bergua, María
Teresa Espiau, Olga Frontera Sancho, Ons Gharbi, Pilar Errea Abad, Rafael
Socias, Susana Ruber y demás funcionários del Centro de Investigación y
Tecnología Agroalimentária de Aragón (CITA), por la ayuda, compresión, apoyo
y amistad.
A Teresa Bespín y María Pilar Tomey, funcionarias del CITA, por el cariño,
dedicación y atención que tuvieron durante todo el tiempo que estuvimos juntos
en el laboratorio, trabajando en extracciones, PCRs, callos, haciendo medio, o
mismo fuera, en nostras cenas y copas. ¡¡¡ Muchas Gracias chicas !!!
A Rosa Fustero, funcionaria del CITA y mi madre española, que mi recibió como
a un hijo. Una amiga muy sensible, amable y con una alegría que contagia
todos a su alrededor. ¡¡¡ Muchas Gracias Rosa !!!
A Patricia Irisarri, colega de Doctorado en el CITA, por su cariño, sensibilidad,
ayuda, atención y dedicación en todos los trabajos que hemos hecho juntos y
por haber sido una gran amiga. ¡¡¡ Muchas Gracias Patri !!!
A David, que en el Aparicio, hizo para nosotros, las mejores tapas de toda
España, y donde he disfrutado de todo el sabor de la comida Española. Hasta
hoy, mi paladar no encontró otro sabor semejante a sus patatas rellenas y su
pulpo. ¡¡¡ Muchas Gracias amigo !!!
A Miguel y Esther, por la amistad y por los buenos momentos que hemos
pasado juntos.
Me gustaría agradecer más una vez a Ana Pina, por su cariño y su inmenso
corazón. ¡¡¡ Muchas Gracias Ana !!!
Aos colegas de Pós-Graduação, Fernando José Hawerroth, Fernanda
Quintanilha, Michel Aldrighi Gonçalves, Evandro Schneider, Gérson Vognolo,
Mateus Pasa, Juliano Schmitz, Doralice Lobato de Oliveira Fischer, Gisely
Moura e Simone Padilha Galarça, pelo auxílio e amizade.
A todo o pessoal do laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima
Temperado, Fabiane, Renê, Marcelo, Carol e Júnior, por toda ajuda, incentivo e
amizade.
A todos os professores da Pós-graduação, pelo convívio agradável e pelas
experiências compartilhadas.
A todo o pessoal do laboratório de Biologia Molecular, em especial, Vanessa e
Natércia, por toda ajuda, incentivo e amizade.
Aos estagiários e funcionários do departamento de Fruticultura da UFPel, em
especial, Marcos, Luciane, Aloir, Nei, Barcelos e Pedro, pelo auxilio e pela
amizade.
A Madelon, responsável pela secretária do Colegiado da Pós-Graduação em
Agronomia, pela enorme eficiência e boa vontade.
Ao Carlos Eloi Ribeiro e aos meus tios, Ivone e Eduardo, pelo carinho e auxílio
em um momento difícil.
À UFPel, a FAEM e ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Fruticultura de Clima Temperado, por permitir a realização do curso.
Ao Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentária de Aragón (CITA), por
permitir a utilização de sua estrutura e fazer parte do seu grupo de pesquisa
internacionalmente reconhecido.
À Embrapa Clima Temperado, por permitir a utilização de sua estrutura e de
conviver com seus pesquisadores e demais funcionários.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos no País e a CAPES, pela
concessão da bolsa de estudos no exterior.
Finalmente, agradeço a minha família, minha companheira de todas as horas
Natália, meus pais Danilo e Maria Helena e meus irmãos Rafael, Charles e
Elisa, pelo incentivo e apoio incondicional durante minha jornada.
A todos vocês, MUITO OBRIGADO !!!
Resumo
PEREIRA, Ivan dos Santos. Incompatibilidade de enxertia em Prunus,
alterações fenotípicas, bioquímicas e gênicas. 2012. 160f. Tese (Doutorado)
- Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas.
A enxertia permite combinar características específicas de diferentes espécies
frutíferas, viabilizando a produção nas mais variadas condições edafoclimáticas.
Entretanto, esse processo é muitas vezes limitado pela incompatibilidade de
enxertia, fenômeno complexo, responsável por uma série de interações
metabólicas entre porta-enxerto e cultivar. O objetivo deste trabalho foi estudar
algumas diferenças fenotípicas, bioquímicas e gênicas entre combinações
compatíveis e incompatíveis de Prunus. Desta forma, foram caracterizados: o
crescimento vegetativo das combinações, sintomas de incompatibilidade;
atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL); concentrações dos glicosídeos
cianogênicos amigdalina e prunasina e expressão das famílias de genes PAL,
cinamato 4-hidroxilase (C4H) e 4-cumarato:CoA ligase (4CL), em enxertos
compatíveis e incompatíveis. O experimento foi realizado no Centro
Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de Pelotas (Pelotas-RS,
Brasil), onde as cultivares Chimarrita e Maciel foram enxertadas sobre os portaenxertos Capdeboscq, Tsukuba 1 e Umezeiro. As avaliações bioquímicas foram
realizadas na Embrapa Clima Temperado (Pelotas-RS, Brasil) e a expressão
gênica no Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentária de Aragón
(C.I.T.A) (Zaragoza-Aragón, Espanha). Os resultados gerais indicam que: a)
‘Umezeiro’ apresenta elevado grau de incompatibilidade com as cultivares
Chimarrita e Maciel; b) a incompatibilidade é causada pela diferença de
concentração dos glicosídeos cianogênicos entre cultivar e porta-enxerto; c) a
cianogênese induz o aumento de expressão de todas as famílias de genes
estudadas e d) a prunasina é um marcador bioquímico consistente para a
predição da incompatibilidade de enxertia entre espécies de Prunus.
Palavras-chave: Prunus mume, P. persica, compatibilidade, fenilpropanóide,
cianeto e compostos fenólicos.
Abstract
PEREIRA, Ivan dos Santos. Graft incompatibility on Prunus, phenotypc,
biochemical and genetic changes. 2012. 160f. Tese (Doutorado) - Programa
de Pós-Graduação em Agronomia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Grafting allows to combine specific characteristics of different fruit species,
enabling the production in various soil and climatic conditions. However, this
process is often limited by the graft incompatibility, complex phenomenon,
responsible for a series of metabolic interactions between rootstock and variety.
The purpose of this work was to study some phenotypic, biochemical and
genetic differences between compatible and incompatible combinations of
Prunus. Thus, were characterized: the vegetative growth of combinations, graft
incompatibility symptoms; activity profile of phenylalanine ammonia-lyase (PAL);
concentrations of cyanogenic glycosides amygdalin and prunasin and gene
expression of PAL, cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and 4-coumarate:CoA
ligase (4CL) families in compatible and incompatible grafts. The experiment
was conducted in the Agricultural Center of Palma, of Federal University of
Pelotas (Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil), where Chimarrita and Maciel
varieties were grafted on Capdeboscq, Tsukuba 1 and Umezeiro rootstocks.
The biochemical evaluations were performed at the Center for Temperate
Climate Agricultural Research (Embrapa CPACT) (Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brazil), and the gene expression analysis at the Centre of Agrofood Research
and Technology of Aragón (C.I.T.A.) (Zaragoza, Aragón, Spain). The overall
results indicate that: a) ‘Umezeiro’ has a high degree of incompatibility with
Chimarrita and Maciel varieties; b) the incompatibility is caused by the difference
in cyanogenic glycosides concentration between variety and rootstock, c) the
cyanogenesis induces increased expression of all studied gene families and d)
prunasin is a consistent biochemical marker of the graft incompatibility between
Prunus species.
Keywords: Prunus mume, propagation, compatibility, phenylpropanoid, cyanide
and phenolic compounds.
Lista de Figuras
Figura 1. Produtividade de pêssegos e nectarinas nos principais Países
produtores (FAOSTAT, 2011). Pelotas, RS, 2012. ........................... 14
Figura 2. Figura esquemática das três etapas de formação do enxerto. (A)
proliferação de calo a partir da cultivar e do porta-enxerto; (B)
formação de um novo cambio; e (C) Produção de novo floema e
xilema. Adaptado de Hartmann et al. (2002). Pelotas, RS, 2012. .... 40
Figura 3. Região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012.
......................................................................................................... 68
Figura 4. Expressão gênica relativa diferencial de PAL1 e PAL2 na cultivar e no
porta-enxerto
das
combinações
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
......................................................................................................... 70
Figura 5. Expressão gênica relativa global de PAL1 e PAL2. Pelotas, RS, 2012.
......................................................................................................... 70
Figura 6. Atividade enzimática da PAL na cultivar e no porta-enxerto das
combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ...................................... 71
Figura 7. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e a atividade
enzimática da PAL no porta-enxerto das combinações
‘Chimarrita’/‘Tsukuba
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ...................................... 72
Figura 8. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e atividade
enzimática
da
PAL
na
cultivar
das
combinações
1’
e
‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ....................................... 72
Figura 9. Perfil cromatográfico padrão obtido por HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e
prunasina. Pelotas, RS, 2012. .......................................................... 91
Figura 10. Corte macroscópico longitudional interno da região de união das
combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’
(B),
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’
(C),
‘Maciel/Capdeboscq’
(D),
‘Maciel/Tsukuba 1’ (E), Maciel/Umezeiro (F), três anos e meio após a
enxertia. Pelotas, RS, 2012. ............................................................. 93
Figura 11. Corte macroscópico da região de união do enxerto (combinação
'Maciel/Umezeiro') com destaque para a linha de descontinuidade
vascular. Pelotas, RS, 2012. ............................................................ 94
Figura 12. Concentração dos glicosídeos cianogênicos (mg g-1) e atividade da
fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol min-1 g-1) nos porta-enxertos e
nas cultivares estudadas. Pelotas, RS, 2012. .................................. 96
Figura 13. Correlação entre a concentração de prunasina e atividade da
fenilalanina amônia-liase (PAL) nas combinações compatíveis e
incompatíveis. Pelotas, RS, 2012. .................................................... 98
Figura 14. Esquema resumido da rota fenilpropanóide. Adaptado de Taiz &
Ziger (2004). Pelotas, RS, 2012. .................................................... 113
Figura 15. Índice SPAD observado pela análise das folhas das combinações
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. .................................... 122
Figura 16. Aparência externa e corte macroscópico longitudinal interno da
região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A),
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B) e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (direita).
Detalhes internos da região de união da combinação
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C). Pelotas, RS, 2012. .............................. 124
Figura 17. Concentração do glicosídeo cianogênico prunasina (mg g-1) no portaenxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos portaenxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados.
Pelotas, RS, 2012........................................................................... 125
Figura 18. Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina (mg g-1) no
porta-enxerto
e
na
cultivar,
das
combinações
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba
1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012. ..................... 125
Figura 19. Expressão gênica relativa dos genes PA1L, PAL2, C4H1, C4H2 e
4C1L, 4CL2 e 4CL3 na cultivar e no porta-enxerto das combinações
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. .................................... 126
Figura 20. Relação filogenética entre genes PALs. As sequências de proteínas
foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o
programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining
(NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas
com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012.
....................................................................................................... 128
Figura 21. Relação filogenética entre os genes C4Hs. As sequências de
proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída
usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor
Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos
calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap).
Pelotas, RS, 2012........................................................................... 129
Figura 22. Relação filogenética entre os genes 4CLs. As sequências de
proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída
usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor
Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos
calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap).
Pelotas, RS, 2012........................................................................... 130
Figura 23. Esquema ilustrativo da via respiratória em combinações compatíveis
e incompatíveis. Pelotas, RS, 2012. ............................................... 134
Figura 24. Correlação entre a concentração de prunasina no porta-enxerto
‘Umezeiro’ e a expressão dos genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2,
4CL1, 4CL2 e 4CL3 na cultivar ‘Chimarrita’ (combinação
incompatível). Pelotas, RS, 2012. .................................................. 137
Figura 25. Múltiplo alinhamento de sequências de proteínas dos genes C4H1 e
C4H2 de P. persica, com identificação do motivo conservado
PPGPIPVP. Pelotas, RS, 2012. ..................................................... 139
Figura 26. Expressão dos genes 4CL1, 4CL2 e 4CL3, em tecidos de calo
(cultivados in vitro) e de casca. Pelotas, RS, 2012......................... 140
Lista de Tabelas
Tabela 1. Cronograma de atividades a serem executadas durante o ano de
2008. Pelotas, RS, 2012................................................................... 30
2009. Pelotas, RS, 2012................................................................... 30
Tabela 3. Cronograma de atividades a serem executadas de janeiro de 2010 a
março de 2011. Pelotas, RS, 2012. .................................................. 30
Tabela 4. Custo total do projeto. Pelotas, RS, 2012.......................................... 30
Tabela 5. Características dos primers PAL1, PAL2 e Actina. Pelotas, RS, 2012.
......................................................................................................... 65
Tabela 6. Estabilidade dos genes de referencia Actina, AT5G12240 e TEF2.
Pelotas, RS, 2012............................................................................. 65
Tabela 7. Análise de crescimento e compatibilidadde das combinações
1’
e
‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ....................................... 68
Tabela 8. Identificação dos tipos de incompatibilidade ‘translocada’, pelo índice
SPAD e ‘localizada’ pela avaliação anatomia da união conforme
Herrero & Mosse (1951). .................................................................. 92
Tabela 9. Concentração (mg g-1) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e
prunasina nas diferentes épocas, cultivares e porções do enxerto.
Pelotas-RS, 2012. ............................................................................ 95
Tabela 10. Diferença entre a concentração dos glicosídeos cianogênicos
amigdalina e prunasina encontradas nas cultivares e nos portaenxertos das combinações estudadas. Pelotas, RS, 2012............... 97
Tabela 11. Características dos primers de PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1,
4CL2 e 4CL3. Pelotas, RS, 2012.................................................... 117
Tabela 12. Características dos primers de Actina, TEF2, RPII e AT5G12240.
Pelotas, RS, 2012........................................................................... 118
Tabela 13. Estabilidade dos genes de referencia Actina, TEF2, RPII e
AT5G12240. Pelotas, RS, 2012. .................................................... 118
Tabela 14. Número de vezes em que os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2,
4CL1, 4CL2 e 4CL3, foram mais expressos na cultivar que no portaenxerto
das
combinações
....................................................................................................... 127
Sumário
1.
Introdução................................................................................................. 14
2. Projeto de pesquisa ................................................................................. 17
2.1.
Título .................................................................................................. 17
2.2.
Equipe técnica ................................................................................... 17
2.3.
Justificativa ....................................................................................... 17
2.4.
Revisão de Literatura........................................................................ 19
2.5.
Hipótese ............................................................................................. 27
2.6.
Objetivo .............................................................................................. 27
2.6.1. Geral................................................................................................ 27
2.6.2. Específicos ...................................................................................... 28
2.7.
Material e métodos............................................................................ 28
2.7.1. Material vegetal ............................................................................... 28
2.7.2. Extração de glicosídeos cianogênicos............................................. 28
2.7.3. Determinação cromatográfica de glicosídeos cianogênicos ............ 29
2.7.4. Delineamento e análise estatística .................................................. 29
2.8.
2.9.
2.10.
2.11.
Resultados esperados ...................................................................... 29
Cronograma ....................................................................................... 30
Custos ................................................................................................ 30
Referências bibliográficas ............................................................... 31
3. Revisão de Literatura ............................................................................... 35
3.1.
Origem e botânica ............................................................................. 35
3.2.
Uso de porta-enxertos na fruticultura ............................................. 36
3.3.
Tipos de porta-enxertos ................................................................... 36
3.3.1. Porta-enxertos de sementes ou francos .......................................... 37
3.3.2. Porta-enxertos clonais ..................................................................... 37
3.4.
Influência do porta-enxerto sobre a cultivar .................................. 37
3.5.
Enxertia .............................................................................................. 39
3.6.
Incompatibilidade de enxertia .......................................................... 40
3.7.
Tipos de incompatibilidade de enxertia .......................................... 41
3.7.1. Incompatibilidade ‘translocada’ ....................................................... 42
3.7.2. Incompatibilidade ‘localizada’ .......................................................... 43
3.7.3. Outros tipos de incompatibilidade.................................................... 45
3.8.
Mecanismos potencialmente envolvidos na incompatibilidade de
enxertia 45
3.8.1. Plasmodesmas: reconhecimento celular ......................................... 45
3.8.2. Hormônios ....................................................................................... 46
3.8.3. Compostos fenólicos ....................................................................... 47
3.8.4. Glicosídeos cianogênicos (GCs) ..................................................... 48
3.9.
Métodos de diagnóstico da incompatibilidade de enxertia ........... 49
3.9.1. Isoenzimas e proteínas totais .......................................................... 50
3.9.2. Estudo histológico da união do enxerto ........................................... 50
3.9.3. Estudo macroscópico da união do enxerto...................................... 51
3.9.4. Estimativa da concentração de clorofila .......................................... 51
3.9.5. Enxertia in vitro ................................................................................ 52
3.9.6. Diferenças bioquímicas ................................................................... 52
4. Relatório do trabalho de campo ............................................................. 54
4.1.
Avaliações fenotípicas ..................................................................... 54
4.2.
Mecanismo de incompatibilidade por cianogênese....................... 56
4.3.
Mecanismo de incompatibilidade por diferenças na composição
fenólica 57
5. Artigo 1: Compatibilidade de enxertia em pessegueiro: análise de
crescimento e expressão gênica da Fenilalanina amônia-liase .................. 59
5.1.
Resumo .............................................................................................. 59
5.2.
Abstract ............................................................................................. 60
5.3.
Introdução ......................................................................................... 61
5.4.
5.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia ....................................... 63
5.4.3. Extração de RNA e síntese de cDNA .............................................. 63
5.4.4. Análise da expressão gênica ........................................................... 64
5.4.5. Seleção do gene de referência ........................................................ 64
5.4.6. Atividade enzimática da PAL ........................................................... 65
5.4.7. Análise estatística............................................................................ 66
5.5.
Resultados ......................................................................................... 67
5.5.2. Seleção do gene de referência ........................................................ 68
5.5.3. Expressão gênica de PAL1 e PAL2................................................. 69
5.6.
Discussão .......................................................................................... 73
5.6.1. Compatibilidade de enxertia ............................................................ 73
5.6.2. Gene de referência para o estudo da compatibilidade de enxertia.. 73
5.6.3. Perfil da expressão gênica de PAL1 e PAL2 ................................... 74
5.6.4. Correlação entre transcrição e atividade da PAL ............................ 76
5.7.
Conclusões ........................................................................................ 78
5.8.
Referencias bibliográficas ............................................................... 79
6. Artigo 2: Cianogênese, a causa da incompatibilidade de enxertia em
Prunus .............................................................................................................. 84
6.1.
Resumo .............................................................................................. 84
6.2.
Abstract ............................................................................................. 85
6.3.
Introdução ......................................................................................... 86
6.4.
6.5.
6.6.
6.7.
6.8.
6.4.3. Determinação da atividade da PAL ................................................. 89
6.4.4. Determinação da concentração de GCs.......................................... 90
6.4.5. Análise estatística............................................................................ 91
Resultados ......................................................................................... 92
6.5.2. Concentração dos GCs ................................................................... 95
6.5.3. Atividade da PAL ............................................................................. 97
6.5.4. Correlação entre prunasina e atividade da PAL .............................. 97
Discussão .......................................................................................... 99
6.6.2. Diferenças bioquímicas entre combinações compatíveis e
incompatíveis ........................................................................................... 100
6.6.3. Correlação entre prunasina e atividade da PAL ............................ 102
Conclusões ...................................................................................... 104
Referencias bibliográficas ............................................................. 105
7. Artigo 3: Expressão gênica de PAL, C4H e 4CL em resposta a
incompatibilidade de enxertia por cianogênese......................................... 110
7.1.
Resumo ............................................................................................ 110
7.2.
Abstract ........................................................................................... 111
7.3.
Introdução ....................................................................................... 112
7.4.
Material e métodos.......................................................................... 114
7.4.1. Material vegetal ............................................................................. 114
7.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia ..................................... 114
7.4.3. Determinação da concentração de GCs........................................ 115
7.4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA ............................................ 115
7.4.5. Análise da expressão gênica e seleção do gene de referência ..... 116
7.4.6. Análise estatística.......................................................................... 121
7.5.
Resultados ....................................................................................... 122
7.5.1. Compatibilidade de enxertia .......................................................... 122
7.5.2. Concentração dos GCs ................................................................. 123
7.5.3. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........... 125
7.5.4. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........ 127
7.6.
Discussão ........................................................................................ 131
7.6.1. Incompatibilidade por cianogênese ............................................... 131
7.6.2. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........... 135
7.6.3. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........ 138
7.7.
Conclusões ...................................................................................... 142
7.8.
Referências bibliográficas ............................................................. 143
8. Conclusões ............................................................................................. 148
9. Referências bibliográficas..................................................................... 150
14
1. Introdução
Com uma produção de 216.000 toneladas anuais em uma área de 20.000
hectares, o pessegueiro (Prunus persica L. Batsch) é uma das frutíferas de clima
temperado mais importantes no Brasil.
No cenário mundial, o País ocupa a décima terceira posição no ranking de
produção e a vigésima quinta no ranking de produtividade (Figura 1), com 11,35
toneladas por hectare (FAOSTAT, 2011). A baixa produtividade faz com que a
produção nacional seja insuficiente para abastecer o mercado interno, tornando
necessária a importação de cerca de 14.000 toneladas anuais (AGRIANUAL 2010).
Os dados estatísticos evidenciam a necessidade de incrementos na
produtividade brasileira, a fim de alcançar a auto-suficiência e evitar a evasão de
divisas.
50
40
30
t ha
-1
)
20
10
Áustria
Israel
França
Malta
Venezuela
Estados Unidos
Turquia
Eslovênia
Grécia
Chile
Itália
Espanha
Marrocos
África do Sul
Suíça
República da Coréia
China
Turcomenistão
Japão
Colômbia
Jordânia
Guatemala
Líbano
Argentina
Brasil
0
Figura 1. Produtividade de pêssegos e nectarinas nos principais Países produtores
(FAOSTAT, 2011). Pelotas, RS, 2012.
Do ponto de vista técnico, um dos principais problemas responsáveis pela
baixa produtividade da cultura do pessegueiro no Brasil é a falta de porta-enxertos
adaptados as condições de cultivo. O porta-enxerto exerce uma importante
15
influência sobre vários aspectos do sistema de produção, como o vigor, a
precocidade, a qualidade dos frutos, a tolerância a estresses bióticos e abióticos e
principalmente a produtividade (WERTHEIM & WEBSTER, 2005; PICOLOTTO et al.,
2009; CANTÍN et al., 2010; OLMSTEAD et al., 2010; XIANG et al., 2010;
GJAMOVSKI & KIPRIJANOVSKI, 2011; JIMÉNEZ et al., 2011a; JIMÉNEZ et al.,
2011b; ORAZEM et al., 2011; ZRIG et al., 2011).
Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o
maior número de características desejáveis e que seja compatível com as
variedades que serão enxertadas (FINARDI, 1998). Entretanto, a utilização cada vez
maior de porta-enxertos com origem genética distinta da cultivar que será enxertada,
visando à obtenção de vantagens ao sistema de produção, aumenta a ocorrência de
um fenômeno conhecido como incompatibilidade de enxertia.
A incompatibilidade de enxertia pode ser descrita como a ausência do
desenvolvimento normal dos tecidos no ponto de enxertia, especialmente do sistema
vascular (xilema e floema), resultante da falta de afinidade entre porta-enxerto e
cultivar (MOSSE, 1958; HARTMANN et al., 2002).
Embora os eventos envolvidos na enxertia sejam conhecidos, os
mecanismos pelos quais a incompatibilidade se expressa não estão claros e várias
hipóteses têm sido estudadas na tentativa de explicar o fenômeno (PINA & ERREA,
2005).
Na cultura do pessegueiro, o mecanismo de incompatibilidade melhor
compreendido é o que ocorre entre pessegueiro (Prunus persica) e amendoeira
(Prunus dulcis). Neste caso, a incompatibilidade é provocada pela maior
concentração de prunasina no pessegueiro, composto que quando hidrolisado libera
cianeto na interface do enxerto, causando danos celulares com prejuízo a
continuidade vascular (MOORE, 1986; NOCITO et al., 2010). Entretanto, outros
mecanismos
de
incompatibilidade
têm
sido
propostos
para
justificar
a
incompatibilidade de enxertia entre diferentes espécies de Prunus (PINA & ERREA,
2005). Entre eles, o mais estudado envolve a diferença no perfil de compostos
fenólicos entre cultivares e porta-enxertos incompatíveis. Estes compostos estão
envolvidos em todos os estágios do processo de enxertia, e por isso, diferenças
quantitativas ou qualitativas entre cultivar e porta-enxerto são relacionadas com a
incompatibilidade de enxertia (ERREA, 1998; TELES et al., 2009; ZARROUK et al.,
2010).
16
O entendimento do mecanismo de incompatibilidade que se manifesta entre
diferentes combinações incompatíveis de Prunus pode acelerar o processo de
obtenção de novos porta-enxertos para pessegueiro e contribuir para a melhoria dos
índices de produtividade.
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos, avaliar diferenças
fenotípicas, bioquímicas e gênicas entre combinações compatíveis e incompatíveis
de Prunus e identificar um marcador para sua detecção ou previsão.
17
2. Projeto de pesquisa
2.1. Título
Cianogênese e a incompatibilidade de enxertia de Prunus sp.
2.2. Equipe técnica
Aluno: Ivan dos Santos Pereira
Orientador: José Carlos Fachinello
Co-orientador: Luis Eduardo Corrêa Antunes
2.3. Justificativa
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, ficando a traz
apenas de China e Índia. De acordo com o Instituto Brasileiro de Frutas (Ibraf),
o incremento de produção tem se mantido na média de 4,5% ao ano. Mas para
2008, estima-se que haverá incremento de 10% em volume e de 14% em
receita. Devendo, pela primeira vez ultrapassar a marca de US$ 1 bilhão nas
vendas externas. Porém, o Brasil ainda apresenta exportações incipientes,
sendo pouco participativo no mercado externo de frutas. Também está longe
de ser um grande consumidor de frutas, a demanda per capita é de 57kg,
enquanto que em países da Europa, como Espanha, Itália e Alemanha, essa
demanda atinge respectivamente, 120, 114 e 112kg (ANUÁRIO, 2007). Devido
a este cenário, há boas perspectivas futuras para o Brasil no que se refere ao
mercado de frutas, com possibilidade de crescimento no mercado interno e
externo. E além de tudo, a fruticultura brasileira está a cada ano firmando-se
como um dos principais geradores de renda, empregos e desenvolvimento no
meio rural.
Dentro deste contexto, a cultura do pessegueiro pode ocupar lugar de
destaque entre as frutíferas de clima temperado no crescimento deste setor.
Inclusive com uma maior participação no mercado externo, tendência essa,
fortalecida com o avanço da Produção Integrada de Pêssego (PIP), tendo em
vista, que esse tipo de sistema de produção é de suma importância e preceito
básico para o estabelecimento de uma relação de sucesso com o mercado
externo. No âmbito nacional, contribui para a melhoria da qualidade de vida de
um grande número de produtores, que em geral exploram a atividade em
18
pequenas áreas, em média dois hectares, caracterizando-se como uma cultura
de base familiar e que gera de três a seis empregos por hectare, com grande
impacto socioeconômico nas comunidades produtoras.
Porém, os produtores de pêssego vêm sofrendo com uma baixa
lucratividade, devido às baixas produtividades obtidas, mesmo com o avanço
do melhoramento genético, que disponibiliza cultivares altamente produtivas,
as médias de produção verificadas ficam em torno de cinqüenta por cento do
potencial real dos genótipos. Dentre as principais causas pode-se citar a
desuniformidade de vigor dos pomares, devido utilização de porta-enxertos
originados de caroços e obtidos junto às indústrias processadoras sem nenhum
controle e havendo misturas varietais; a suscetibilidade das plantas ao ataque
de doenças e pragas de solo, como os nematóides; assim como ao replantio do
pessegueiro e a morte precoce do pessegueiro, que tem causado grandes
prejuízos aos pomares.
Sendo a principal solução para esses problemas, a utilização de portaenxertos adequados. Mas atualmente, principalmente na região Sul, onde se
concentra cerca de 64% da produção nacional, estão disponíveis aos
produtores brasileiros poucas opções de porta-enxertos, em geral além da
mistura varietal coletada nas indústrias, são utilizadas as cultivares Capdebosq
e Aldrighi, que são susceptíveis a maioria
dos fatores responsáveis pelas
baixas produções, se fazendo necessário a introdução de novas cultivares de
porta-enxertos, que confiram as características de interesse para a superação
dos fatores problema e que sejam compatíveis com as cultivares utilizadas
pelos persicultores brasileiros.
Porém, muitas vezes se esbarra em um grande problema que é
justamente a questão da compatibilidade, ou a falta da mesma, quando isso
ocorre se diz que houve incompatibilidade, ou seja, a falta de afinidade de
alguma natureza entre cultivar e porta-enxerto e que compromete a formação
da muda, diminui a produtividade do pomar ao longo do tempo ou mesmo
causa a morte de plantas já adultas.
As pesquisas sobre a incompatibilidade de enxertos foram iniciadas
porque constituem num importante problema para a fruticultura (HERNANDEZ,
2002). Segundo Mosse (1962), tais pesquisas tem três objetivos principais:
conhecer o fenômeno da incompatibilidade; conhecer os possíveis sintomas
19
iniciais e conhecer as causas fundamentais. Além da capacidade de predizer a
incompatibilidade, que seria um grande benefício para os produtores, tornando
possível a seleção de combinações compatíveis, evitando posteriores
problemas
de
incompatibilidade
(ANDREWS
&
MARQUEZ,
1993),
principalmente quando a mesma se desenvolve lentamente e debilita a planta
ao longo dos anos sem que o produtor perceba, lhe causando prejuízos
acumulativos.
Um método capaz de predizer e informar sobre a compatibilidade da
combinação porta-enxerto e cultivar, permitiria reduzir de forma importante o
processo de obtenção de novos porta-enxertos adaptados e seu estudo com
diferentes cultivares (ERREA et al., 2003).
2.4. Revisão de Literatura
O pessegueiro pertence à família Rosácea, gênero Prunus (L.). É uma
espécie nativa da China, tendo sido encontradas referências na literatura
chinesa 20 séculos a.C.. No Brasil, foi introduzido em 1532 por Martin Afonso
de Souza, por meio de mudas trazidas da Ilha da Madeira (SACHS &
CAMPOS, 1998).
Atualmente, segundo dados do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia
e Estatística), em 2006 foram colhidas no Brasil 199.719 toneladas de pêssego,
em uma área de 22.453 hectares, com um rendimento médio de 8.894kg ha-1.
Mas segundo Raseira & Nakasu (1998a; 1998b), pomares bem conduzidos e
com tecnologia adequada, apresentam produção média superior a 20ton ha-1.
O que configura um rendimento de menos de 50% do potencial existente.
Conforme já evidenciado por Zecca (2002), muitos dos aspectos que
possibilitam um maior rendimento da cultura do pessegueiro, estão
relacionados com o emprego de porta-enxertos adequados.
O emprego de porta-enxertos iniciou na Itália e em geral, na Europa, a
partir dos anos 60, mas assumiu importância com o desenvolvimento da
fruticultura industrial e responde as modernas exigências da fruticultura
tecnicamente evoluída (LORETI, 2008).
Para espécies como o pessegueiro, a demanda por novos portaenxertos é mais recente em conseqüência da difusão desta espécie em zonas
marginais ou não indicadas do ponto de vista edafoclimático, como regiões
20
caracterizadas por terrenos encharcados, compactados, ácidos, alcalinos ou de
baixa fertilidade (LORETI, 1988), ou devido a problemas como a presença de
nematóides nas áreas de plantio ou ainda a necessidade de se realizar o
replantio, devido à baixa disponibilidade de novas áreas, característica típica
dos produtores de pêssego.
Nas regiões produtoras de pêssego, no mundo, são usados diferentes
porta-enxertos em função de condições específicas de cada uma (FINARDI,
1998). Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o
maior número possível de características desejáveis, tais como: ser de fácil
obtenção; ser adaptado às condições de solo e clima locais; ser resistente a
doenças e pragas do solo; ter boa compatibilidade com o enxerto; induzir vigor
adequado à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem; induzir
precocidade (para iniciar a produção) do enxerto; ser eficiente na produção de
frutas de qualidade; propiciar longevidade às plantas; ser eficiente na absorção
de água e nutriente e ser resistente a condições de estresse (asfixia, solos
alcalinos ou ácidos, seca) (FINARDI, 1998).
Segundo Fachinello et al. (1996), a enxertia é o principal método de
obtenção de mudas para a formação de pomares comerciais. Sendo que 100%
das plantas de pessegueiro são propagadas por enxertia.
A enxertia é o processo de multiplicação pela qual parte de uma planta
é inserida sobre outra com a qual tenha compatibilidade, passando a
desenvolver-se sobre esta planta (LUZ, 1987).
A enxertia, igualmente a outros métodos de propagação vegetativa,
permite perpetuar as características genéticas da planta de origem (GEORGE
& NISSEN, 1987), além das plantas atingirem a fase produtiva mais
rapidamente em relação à propagação por sementes (HERNANDEZ, 2002;
HARTMANN et al., 1990), possibilidade de exploração das características
desejadas do porta-enxerto e da cultivar em uma única planta, possibilidade de
rápida mudança de cultivares aproveitando um sistema radicular já existente,
recuperação de plantas danificadas, auxilio no estudo de doenças virais pela
indexagem (HARTMANN et al., 1990). É comumente utilizada para fins
comerciais, como forma de propagação de espécies lenhosas, e com as partes
enxertadas geralmente pertencentes à mesma espécie ou gênero. No entanto,
as pesquisas com enxertia tem envolvido componentes com maior diversidade
21
genética, como por exemplo, a enxertia intersubfamilia (ANDREWS &
MARQUEZ, 1993). Os enxertos heterespecíficos de plantas frutíferas em geral
apresentam um sistema de simbiose problemático (ERREA, et al., 1992).
Sendo o processo de enxertia a união de dois materiais vegetais
geneticamente distintos, o ganho esperado no desempenho da copa está
relacionado com a eficiência do porta-enxerto utilizado e com a compatibilidade
dos tecidos de ambos. Portanto, a compatibilidade é fundamental para o
sucesso de um pomar ao longo do tempo (CARLOS et al., 1997).
Entende-se por compatibilidade de enxertia, a existência de uma união
bem sucedida no ponto de enxertia e um desenvolvimento satisfatório da
planta. Caso isso não aconteça, tem-se o que é chamado de incompatibilidade
de enxertia (HARTMANN et al., 1997). A incompatibilidade de enxertia constitui
num problema para a fruticultura (ERREA, et al., 1998).
Conforme Oliveira Junior (1999), duas plantas são incompatíveis
quando, por motivos intrínsecos a elas, não são capazes de formar uma união
completa e equilibrada, impossibilitando o desenvolvimento normal da planta.
Segundo o mesmo autor, a incompatibilidade surge devido as diferenças nas
características de crescimento da copa e do porta-enxerto, diferenças
fisiológicas e bioquímicas entre os dois ou ainda à produção de alguma
substância tóxica de uma parte para a outra. Já Mosse (1958), define
incompatibilidade como a ausência de desenvolvimento normal dos tecidos no
ponto de enxertia, resultando em feixes vasculares incompletamente
lignificados, que provocam uma interrupção da continuidade vascular e cambial
com conseqüentes problemas físicos da união. Para Fachinello et al. (1995),
duas plantas são incompatíveis quando por motivos intrínsecos a elas, não são
capazes de formar uma união perfeita, impossibilitando o desenvolvimento
normal da nova planta. Feucht (1988) define a incompatibilidade de enxerto
como uma senescência prematura, a qual está relacionada com aspectos
fisiológicas e bioquímicos.
Alguns sintomas de incompatibilidade em espécies lenhosas incluem o
excesso de suberização e espessamento da casca devido a um excesso de
produção de células crivadas; baixa produção de tracheídeos e acúmulo
excessivo de tanino indicado por manchas escuras na casca (COPES, 1980).
22
Sintomas externos, que também têm sido observadas, incluem atraso
na brotação (NELSON, 1968), anomalia na morfologia das folhas e prematura
queda das mesmas (COPES, 1980), redução do crescimento vegetativo, morte
prematura (HARTMANN et al., 1990), perda de turgescência, menores taxas de
transpiração durante o dia (SCHMID et al., 1988). Conforme Breen (1975),
também podem ocorrer descoloração observada em folhas na copa das plantas
devido à descontinuidade no enxerto vascular no ponto de união da enxertia.
Outros sintomas morfofisiológicos da incompatibilidade são: a falta de união
entre enxerto e porta-enxerto; diferenças de crescimento ou de vigor do enxerto
e do porta-enxerto, que resulta em marcante diferença entre os diâmetros dos
mesmos, com excessivo desenvolvimento abaixo, acima ou no ponto de união;
o amarelecimento das folhas seguido de desfolhamento precoce; crescimento
vegetativo reduzido; a diferença entre o enxerto e porta-enxerto com relação ao
início e final do período vegetativo; e a morte prematura de plantas
(FACHINELLO et al., 1995; SIMÃO, 1998).
Em plantas lenhosas, a quebra no local da união do enxerto é
considerado o mais confiável diagnóstico da incompatibilidade (GARNER,
1979). Implica que ocorre muito pouco ou nenhuma conexão vascular
funcional, a presença de fibras formada entre porta-enxerto e cultivar, não
conferindo resistência mecânica significativa para levar o enxerto ao pleno
desenvolvimento. Diferentemente da quebra, os sintomas anatômicas e/ou
fisiológicos
devem
ser
observados
cuidadosamente
antes
de
definir
combinações incompatíveis, uma vez que todos por si só lembram sintomas
causados por condições ambientais desfavoráveis ou falhas de manejo
(ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
Mosse (1962) dividiu a incompatibilidade em translocada e localizada.
A incompatibilidade translocada ocorre quando algum fator ocasional, como
uma toxina, é transportada de um componente do enxerto para o outro, e a
inserção
de
um
filtro
mutuamente
compatível
não
supera
essa
incompatibilidade. Outras características da incompatibilidade translocada
incluem:
• Continuidade vascular normal na união, embora possa às vezes haver
um super crescimento da copa, tendo por resultado tecidos comprimidos da
casca;
23
• Acumulação de amido na copa e sua quase total ausência abaixo do
ponto de enxertia, ou seja, no porta-enxerto;
• Degeneração do floema, que é o principal indicador;
• Comportamento diferenciado de enxertos recíprocos;
• Os efeitos são observados durante a fase inicial de crescimento;
• Os enxertos raramente morrem por bloqueio no ponto de união;
Alguns exemplos são a incompatibilidade de várias cultivares de
amêndoeira (Prunus dulcis Mill.) (HEUSER, 1987) e pessegueiro (BREEN,
1974) sobre o porta-enxerto de ameixeira ‘Marianna 2624’ (P. cerasifera Ehrh.
x P. munsoniona, que se caracteriza pela degeneração do floema e o fracasso
do filtro, ocorrendo a incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
A incompatibilidade localizada ocorre na interface do enxerto e requer o
contato entre os dois componentes do enxerto, uma vez que a inserção de um
filtro mutuamente compatível supera a incompatibilidade (MOSSE, 1962).
Neste modelo, o filtro aparentemente funciona como uma armadilha para a
incompatibilidade, ou seja, inibe os fatores originários de um dos componente
do enxerto que são prejudiciais ao outro, quando ambos estão em contacto
direto (ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
Segundo Andrews & Marquez (1993), outras características da
incompatibilidade localizada são:
• Necrose do câmbio e descontinuidade dos tecidos vasculares,
geralmente com a quebra na união do enxerto;
• As combinações recíprocas demonstram respostas similares à
incompatibilidade;
• O sistema radicular fica gradualmente desnutrido, sendo a lenta
evolução dos sintomas externos proporcional ao grau de severidade da
descontinuidade vascular.
Considerando o crescente número de estudos que levaram à
observação destas alterações morfológicas e fisiológicas entre combinações
compatíveis e incompatíveis em plantas lenhosas (Ermel et al., 1999; Espen et
al.,
2005),
existe
pouca
informação
sobre
a
base
bioquímica
da
24
incompatibilidade e os mecanismos moleculares envolvidos (PINA & ERREA,
2005; PINA & ERREA, 2007).
Rodrigues et al. (2001), estudando a compatibilidade da enxertia em
Prunus sp, concluíram que a atividade de peroxidase e a concentração de
fenóis elevada estão relacionadas com a união incompatível entre enxerto e
porta-enxerto. Schmid e Freitag (1998) observaram que o aumento de
peroxidase coincidiu com o escurecimento dos tecidos na região enxertada.
O aumento dos níveis de hexoses podem afetar os precursores de
polifenóis, resultando em um aumento das concentrações de polifenóis
endógenos, que são prejudiciais a compatibilidade (TREUTTER et al., 1985).
Este
também
é
um
efeito
da
descontinuidade
vascular
sobre
a
incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
A incompatibilidade pode ser relacionada ainda à presença de algum
tipo de vírus ou micoplasma existente em uma das duas partes que não é
tolerada pela outra (SALAYA, 1999).
Feucht e Schmid (1988) propôs que os fatores ambientais possam
suscitar pequenas alterações metabólicas, tais como mudanças na síntese e
de flavonóides e peroxidase, que eventualmente levam a incompatibilidade
fisiológica do enxerto.
Os efeitos do ferimento sobre os mecanismos de incompatibilidade
também devem ser considerados, tendo em vista que as respostas a um
ferimento estão necessariamente envolvidas ao processo de enxertia
(ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
Outros fatores também podem contribuir para a falha do enxerto,
incluindo a diferença taxonômica entre porta-enxerto e cultivar; condições
ambientais adversas, tais como temperaturas extremas, privação de oxigênio e
água (ANDREWS & MARQUEZ, 1993), nutrientes inorgânicos como N, P, K,
Ca e Mg (SALESSES & AL KAI, 1985); alterações nos níveis nutricionais
acompanhadas ou seguidas de alterações nos níveis de carboidratos devido a
descontinuidade vascular (BREEN & MURAOKA, 1975).
A incompatibilidade de enxertia, também pode estar relacionada com
diferenças no nível protéico entre o porta-enxerto e a cultivar. Musacchi (1996),
em estudo sobre incompatibilidade de enxertia de pereira sobre marmeleiro,
encontrou diferentes proteínas entre as duas espécies e a presença de
25
diferentes modelos protéicos nos calos unidos por cinco dias na mesma placa
de petri em comparação àqueles tecidos das duas espécies que não foram
colocados em contato. Fachinello et al. (1999), mediante análise do padrão
isoenzimático, observaram que além das alterações fisiológicas ocorre
interação celular em nível molecular que permite a manifestação de novas
formas isoenzimáticas como resultado da modificação bioquímica da união
copa/porta-enxerto.
Vários trabalhos descrevem a hipótese de que a incompatibilidade
esteja relacionada às diferenças fisiológicas e bioquímicas existentes entre
porta-enxerto e copa. A maior parte destes trabalhos descrevem as toxinas ou
metabólitos produzidos durante o processo de enxertia como a principal causa
da incompatibilidade.
O movimento de substâncias que possam afetar negativamente uma
das partes, ou que poderiam ser alterados durante o contato com a outra parte,
há muito tem sido um aspecto controverso das relações entre porta-enxerto e
cultivar (ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
Moore (1986) relata que a ocorrência da incompatibilidade está
associada à produção de glicosídeos cianogênicos. Que são compostos
causadores do fenômeno chamado cianogênese.
Dois glicosídeos cianogênicos têm sido encontrados em tecidos de
várias espécies de Prunus, o monoglicosídeo prunasina, que ocorre em
praticamente todas as partes da planta, e o diglicosídeo amigdalina,
encontrado principalmente nas sementes.
A cianogênese é a produção de cianeto por organismos vivos, sendo
um fenômeno relativamente comum em plantas superiores (VETTER, 2000).
Segundo Poulton, (1990) a capacidade das plantas de libertar cianeto foi
detectada em 3000 espécies de plantas de 110 famílias botânicas.
A liberação do cianeto ocorre quando a planta sofre algum ferimento.
Em plantas intactas, as enzimas que promovem a quebra dos glicosídeos
cianogênicos, chamadas genericamente de β-glicosidases, encontram-se
separadas destes por compartimentação (CONN, 1980). No caso da enxertia, o
ferimento é causado pelo próprio processo, devido ao ferimento em ambas as
pares do enxerto.
26
O envolvimento dos compostos cianogênicos no aparecimento da
incompatibilidade de enxertia já havia sido descrito por Gur (1957), que
verificou a ocorrência do glicosídeo cianogênico prunasina no marmeleiro e não
na pereira. Ocorrendo incompatibilidade quando da enxertia destas espécies.
No caso de algumas cultivares de pêra enxertadas sobre um portaenxerto marmeleiro, o glicosídeo cianogênico prunasina, produzido no
marmeleiro ascende para a pereira e é hidrolisado pela β-glicosidase,
produzindo cianeto na interface do enxerto (GUR et al. 1968). O cianeto
interrompe a translocação, por causar a destruição do xilema e floema. Isto
leva a uma redução da disponibilidade de carboidratos disponíveis para o
sistema radicular do marmeleiro. As cultivares de pêra compatíveis com
marmeleiro contém enzimas capazes de degradar a prunasina antes que seja
hidrolisada, evitando assim a formação de cianeto. Em outros casos de
combinações compatíveis, em que a prunasina está envolvida, podem ocorrer
outros mecanismos de desintoxicação, pelo qual o cianeto ou o benzaldeido
são metabolizadas (MOING & SALESSES, 1988).
A incompatibilidade de enxertia entre pessegueiro e amendoeira
também pode ser explicada pela incompatibilidade por toxinas. Em contraste
com a pêra e o marmeleiro, no pessegueiro e amendoeira, ambos contêm
glicosídeos cianogênicos. Porém as cultivares de pessegueiro incompatíveis
com amendoeira contém níveis consideravelmente mais elevados de prunasina
em relação aqueles que são compatíveis. Por isso, quando essas cultivares
são enxertadas em amendoeiras, ocorre uma rede de circulação de prunasina
para o porta-enxerto da amendoeira. E o aumento da atividade deste glicosídeo
nos tecidos de amendoeira gera a produção de cianeto, que se acumula na
interface do enxerto, resultando na incompatibilidade (GUR & BLUM, 1973),
possivelmente pelo fato do acumulo de cianeto ultrapassar os níveis tolerados
pela amendoeira.
O caso de incompatibilidade entre a cultivar ‘Elberta’ cultivar de
pessegueiro e ‘Marianna 2624’ de ameixeira é outro exemplo. Moing e
Salesses (1988) consideram que porta-enxertos de ‘Marianna 2624’ podem ser
progressivamente envenenados pela prunasina produzida na cultivar de
pessegueiro.
27
Estudos realizados por Heuser (1983), com espécies de Prunus in vitro
confirmam o mecanismo de incompatibilidade causado por toxinas. O calo de
duas espécies, P. besseyi Bailey e P. tomentosa Thunb., foram mais sensíveis
ao cianeto do que
cultivares de pêssego. Tanto P. besseyi quanto P.
tomentosa são utilizados como porta-enxertos para pessegueiro, e apresentam
problemas de incompatibilidade com este, sendo a cianogênese novamente
considerada a causa dessa incompatibilidade. Em estudos posteriores de
Heuser (1987) a incompatibilidade entre a amendoeira ‘Nonpareil’ e a
ameixeira 'Marianna 2624’ é causada pelos produtos da hidrolise do
benzaldeído e da amigdalina, possíveis toxinas responsáveis pelo mecanismo
de incompatibilidade. A amigdalina é um glicosídeo cianogênico, produzido
pelo catabolismo da prunasina e pode ser prejudicial para as culturas de calo
de ameixeira, porque quando hidrolisadas libera cianeto e benzaldeído. E a
amendoeira, no entanto é incapaz de hidrolisar a amigdalina.
O desenvolvimento de um método capaz de predizer a informação
sobre a compatibilidade da combinação porta-enxerto e cultivar, permitiria
reduzir de forma importante o processo de obtenção de novos porta-enxertos e
seu estudo com diferentes cultivares (ERREA et al., 2003).
2.5. Hipótese
A liberação de cianeto pela hidrólise dos glicosídeos cianogênicos
prunasina e amigdalina, provoca sintomas de incompatibilidade entre enxerto e
porta-enxerto de pessegueiro.
2.6. Objetivo
2.6.1. Geral
Determinar e relacionar os níveis de cianeto e dos glicosídeos
cianogênicos prunasina e amigdalina em combinações compatíveis e
incompatíveis de porta-enxertos e cultivares de Prunus.
28
2.6.2. Específicos
• Classificar as diferentes combinações de enxerto e porta-enxerto
com base nos níveis de cianeto;
• Verificar se os níveis de cianeto podem se constituir em marcador
de incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto;
• Relacionar os sintomas de incompatibilidade com os níveis
encontrados nas combinações de enxerto e porta-enxerto.
2.7. Material e métodos
2.7.1. Material vegetal
O tecido vegetal utilizado nas análises será coletado de plantas de
pessegueiro de três anos de idade, provenientes do Centro Agropecuário da
Palma - FAEM/UFPel. Serão utilizadas plantas com a combinação das
cultivares ‘Maciel’ (Prunus persica) e ‘Chimarrita’ (P. persica) com os portaenxertos ‘Capdbodq’ (P. persica), ‘Aldrighi’ (P. persica), ‘Viamão’ (P. persica),
‘Flordaguard’ (P.persica), ‘Nemaguard’ (P. persica), ‘Okinawa’ (P. persica),
‘Tsukuba’ (P. persica), e ‘Umezeiro’ (P. mume). As amostras de tecido serão
coletadas 5cm acima e abaixo do ponto de enxertia e no ponto de enxertia,
assim como das folhas. Possibilitando verificar as concentrações de
glicosídeos cianogênicos e cianeto total na cultivar, porta-enxerto e união entre
ambos, além de verificar seus níveis nas folhas e a possível translocação para
a região da enxertia. Tornando possível estabelecer uma relação entre essas
concentrações
com a ocorrência de incompatibilidade nas diferentes
combinações. As amostras serão coletadas, postas em nitrogênio líquido,
liofilizadas e armazenadas até o momento das análises.
2.7.2. Extração de glicosídeos cianogênicos
A extração será realizada no laboratório de Cromatografia do
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos – FAEM/UFPel. Para a
realização das análises serão utilizadas de 0,2-0,4 g de mostra, que serão
agitadas em 10 ml de metanol durante 12 h, à temperatura ambiente, em um
agitador recíproco, na presença de 0,2 g de poli(vinilpirrolidona), metodologia
adaptada de BERENGUER-NAVARRO et al., (2002). As amostras serão
29
centrifugadas a 3000 rpm durante 10 min. Após, a suspensão será decantada e
o sobrenadante filtrado, com filtro de nylon 0.45µm. A partir dessa solução,
será realizada a injeção diretamente na coluna, conforme o método de
Berenguer-Navarro et al., (2002).
2.7.3. Determinação cromatográfica de glicosídeos cianogênicos
A análise Cromatográfica também será realizada no laboratório de
Cromatografia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos –
FAEM/UFPel.
Onde
serão
realizadas
em
cromatógrafo
HPLC
(High
Performance (pressure) Liquid Chromatography), utilizando os padrões SigmaAldrich.
2.7.4. Delineamento e análise estatística
O delineamento estatístico do experimento onde as amostras serão
coletadas é em Blocos casualizados com três repetições, onde cada unidade
experimental constitui de cinco plantas.
Os resultados serão submetidos a análise de variância e pelo teste F e
as diferenças entre médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
significância.
2.8. Resultados esperados
Espera-se
que
sejam
esclarecidas
algumas
das
causas
da
incompatibilidade de enxertia do pessegueiro, seja possível acelerar a
introdução e disponibilização aos produtores de novas cultivares de portaenxertos, melhor adaptados, resistentes e compatíveis com as cultivares
atualmente recomendadas. Possibilitando uma evolução significativa nos
índices de produtividade e qualidade, além de tornar o sistema de produção do
pessegueiro mais sustentável e com menor custo, tendo em vista os inúmeros
benefícios que podem ser introduzidos pelas diversas cultivares de portaenxertos.
30
2.9. Cronograma
2008. Pelotas, RS, 2012.
ATIVIDADE
Revisão bibliográfica
Manutenção das plantas
Elaboração Projeto
Aquisição de regentes e materiais
Adaptação e desenvolvimento de metodologias
Execução de experimentos relacionados
Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x
x
x
2009. Pelotas, RS, 2012.
Atividade
Jan Fev
x x
x x
Adaptação e desenvolvimento de metodologias x x
Execução de experimentos relacionados
x x
Elaboração de trabalhos científicos
x x
Mar
x
x
x
x
x
Abr
x
x
x
x
x
Mai
x
x
x
x
x
Jun
x
x
x
x
x
Jul
x
x
x
x
x
Ago
x
x
x
x
x
Set
x
x
x
x
x
Out
x
x
x
x
x
Nov Dez
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Tabela 3. Cronograma de atividades a serem executadas de janeiro de 2010 a
março de 2011. Pelotas, RS, 2012.
Atividade
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar
x x
x x x x x x x x x
x x x
x x
x x x x x x x x x
x x x x
Aquisição de regentes e materiais
Adaptação e desenvolvimento de x x
x x x x x x x x x
metodologias
Execução
de
experimentos x x
x x x x x x x x x
relacionados
Elaboração de trabalhos científicos
x x
x x x x x x x x x
x x x x
Apresentação e divulgação dos
x x
resultados
2.10. Custos
Tabela 4. Custo total do projeto. Pelotas, RS, 2012.
Descrição
Material de consumo
Custo total (R$)
10.744,35
Serviços
6.300,00
Material permanente
9.550,00
Subtotal
Material existente na instituição
Imprevistos (10%)
Total
26.594,35
132.152,00
2.659,44
174.980,66
31
2.11. Referências bibliográficas
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35
3. Revisão de Literatura
3.1. Origem e botânica
O pessegueiro (Prunus persica L. Batsch) pertence a ordem Rosales,
família Rosaceae, subfamília Prunoideae, gênero Prunus e subgenero
Amygdalus (GILANI et al., 2010).
O gênero Prunus se divide em cinco subgêneros: Prunus ou
Prunophora, Amygdalus, Cerasus, Padus e Laurocerasus (RHEDER, 1940). As
plantas desse gênero são conhecidas como frutos de caroço, uma vez que
suas sementes estão envoltas em um capa lignificada, o endocarpo
(SRINIVASAN et al., 2005).
No subgênero Prunus se encontram espécies frutíferas de importância,
como as ameixeiras européia (P. domestica L. 2n6x48), a ameixeira japonesa
(P. salicina Lindl), a ameixeira do tipo mirabolano (P. cerasifera Ehrn), o
damasqueiro (P. Armeniaca L.), o damasqueiro japonês (P. mume Sieb &
Zucc.) e a cerejeira negra (P. serotina Ehrh.); no subgenero Cerasus, a
cerejeira (P. avium L.), a cerejeira nanking (P. tomentosa Thunb) e a cerejeira
ácida (P. cerasus L.); no subgenero Amygdalus, o pessegueiro (P. persica L.
Batsch), o pessegueiro chinês silvestre (P. davidiana Carrière Franch) e a
amendoeira (P. dulcis L.); no subgeneros Padus a cereja pássaro (P. padus L.);
e no Laurocerasus o louro cerejeiro (P. laurocerasus L.) (GILANI et al., 2010).
O subgenero Prunus se subdivide nas seções Prunus, Prunocerasus e
Armeniaca;
o
subgênero
Amygdalus
nas
seções
Euamygdalus
e
Chamaeamygdalus; o Cerasus, nas seções Microcerasus, Pseudocerasus,
Lobopetalum, Eucerasus, Mahaleb, Phyllocerasus e Phyllomahaleb; enquanto
Padus e Laurocerasus não possuem seções (RHEDER, 1940).
Dentro da espécie Prunus persica existem ainda três variedades
botânicas: vulgaris (pêssego comum), nucipersica (nectarina) e platycarpa
(pêssego chato). Todas possuem o mesmo número cromossômico, 2n=16, fato
que confere as mesmas características de compatibilidade de enxertia
(BARBOSA et al. 1990).
O nome botânico do pêssego refere-se ao seu país de origem, que
segundo Lineu era a Pérsia, atual Irã. Porém, no século XIX descobriu-se que
na verdade sua real origem era a China (BASSI & MONET, 2008).
36
3.2. Uso de porta-enxertos na fruticultura
O emprego de porta-enxertos iniciou na Europa a partir dos anos 60,
mas assumiu importância com o desenvolvimento da fruticultura industrial
(LORETI, 2008) e a necessidade de adaptar as cultivares a condições de clima
e solo desfavoráveis, além de conferir resistência e/ou tolerância a
enfermidades e patógenos de solo (GARNER, 2003).
Para espécies como o pessegueiro, a demanda por novos portaenxertos é recente em consequência da difusão desta espécie em zonas
marginais ou não indicadas do ponto de vista edafoclimático, caracterizadas
por terrenos encharcados, compactados, ácidos, alcalinos, de baixa fertilidade,
infestados com nematoides ou ainda pela necessidade de se realizar o
replantio (LORETI, 1988; MAYER et al., 2008; XIANG et al., 2010; ZRIG et al.,
2011).
Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o
maior número possível de características desejáveis, tais como: ser de fácil
obtenção; ser adaptado às condições de solo e clima locais; ser resistente a
doenças e pragas do solo; ter boa compatibilidade com a cultuvar copa; induzir
vigor adequado à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem;
induzir precocidade; ser eficiente na produção de frutas de qualidade; propiciar
longevidade às plantas; ser eficiente na absorção de água e nutriente e ser
resistente a condições de estresse (asfixia, solos alcalinos ou ácidos, seca)
(FINARDI, 1998).
3.3. Tipos de porta-enxertos
Tradicionalmente os porta-enxertos eram obtidos via propagação
sexuada, o que gerava grande variabilidade genética e por consequência de
comportamento das plantas no pomar (AGUSTÍ, 2004; WERTHEIM &
WEBSTER, 2005). Atualmente, a nível mundial, a maioria dos porta-enxertos
são obtidos por propagação vegetativa (clonal), garantindo que as plantas
obtidas sejam idênticas à planta mãe e evitando as variações observadas em
porta-enxertos obtidos por sementes (FELIPE 1989; WERTHEIM & WEBSTER,
2005).
37
3.3.1. Porta-enxertos de sementes ou francos
São obtidos a partir de sementes germinadas de uma cultivar,
geralmente de maturação tardia (PEREIRA & MAYER, 2005; WERTHEIM &
WEBSTER, 2005).
A variabilidade genética encontrada nesse tipo de porta-enxerto induz
um comportamento heterogêneo que influi sobre características morfológicas e
fisiológicas das plantas (FELIPE 1989; AUGUSTÍ, 2004), causando problemas
como desuniformidade de germinação, vigor e compatibilidade, assim como
uma resposta diferencial ao ataque de pragas, doenças e de adaptação ao
solo, que resultam em variabilidade na produção (FELIPE, 1989; PEREIRA &
MAYER, 2005).
Em geral, sementes de pessegueiro apresentam taxa de germinação
de 60 a 80%. Plantas originárias de sementes desenvolvem-se melhor em
terrenos férteis e bem drenados, apresentando um sistema radicular extenso e
profundo (LORETI, 2008).
Este tipo de porta-enxertos vem sendo menos utilizado na implantação
de novos pomares, cedendo espaço aos do tipo clonal (MASSAI et al., 1996).
3.3.2. Porta-enxertos clonais
Um porta-enxerto clonal é obtido mediante um procedimento qualquer de
propagação vegetativa, do qual são gerados um conjunto de plantas com
mesma origem, geneticamente idênticos e de comportamento altamente
homogêneo (ZARROUK, 2006).
A variabilidade no comportamento de clones é reflexo das variações
ambientais e do meio de cultivo (FELIPE, 1989). Dependendo da origem, cada
clone possui determinadas características de comportamento, adaptação ao
meio, resistência a pragas e doenças e características específicas que induz às
cultivares enxertadas (AUGUSTÍ, 2004).
3.4. Influência do porta-enxerto sobre a cultivar
Inúmeros trabalhos demonstram a influência dos porta-enxertos sobre o
vigor da cultivar (USENIK et al., 2005; PICOLOTTO et al., 2009; JIMÉNEZ, et
al., 2011b; GJAMOVSKI & KIPRIJANOVSKIB, 2011). Este efeito sobre o
crescimento, embora não esteja completamente esclarecido, pode estar
38
relacionado com a restrição do fluxo de água, elementos minerais ou
hormonais do porta-enxerto para a cultivar (ATKINSON et al., 2003). Restrições
que, segundo Tombesi et al. (2011), podem estar relacionadas com
características do xilema, como por exemplo, a dimensão do mesmo.
O porta-enxerto também exerce significativa influência sobre a
necessidade de horas de frio e a tolerância ao frio da cultivar, que pode resultar
em mudança na data de floração (ROSSI et al., 2004; HERNÁNDEZ et al.,
2010). Mitani et al., (2008), observaram antecipação da data de floração e
sugerem que tal efeito pode estar associado ao controle do vigor exercido pelo
porta-enxerto.
Algumas pesquisas ainda apontam um aumento significativo do número
de gemas florais pela utilização de determinados porta-enxertos (CHUN et al.,
2002), oque pode estar relacionado com o aumento da produtividade
observada por vários autores quando da utilização de diferentes porta-enxertos
(TSIPOURIDIS & THOMIDIS, 2005; ZARROUK et al., 2006; BASSAL, 2009;
PICOLOTTO et al., 2009; HERNÁNDEZ et al., 2010; GJAMOVSKI &
KIPRIJANOVSKI, 2011; HUSSAIN et al., 2011).
A qualidade dos frutos é outro aspecto influenciado fortemente pelos
porta-enxertos. Diversos autores tem reportado seu efeito sobre o tamanho, a
coloração, a firmeza, o teor de açúcar, a acidez, o conteúdo de ácido
ascórbico, a composição química, resistência a danos pós-colheita, entre
outras características qualitativas (TSIPOURIDIS & THOMIDIS, 2005; BASSAL,
2009; CANTÍN et al., 2010; HERNÁNDEZ et al., 2010; ORAZEM et al., 2011).
Em geral, as cultivares são susceptíveis a maioria das formas de
estresses, no entanto, os porta-enxertos podem conferir resistência ou
tolerância
a
estresses
abióticos,
tais
como:
seca
(RIEGER,
2001;
RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010), asfixia de raiz (GÓMEZ-APARISI et al.,
2003), salinidade (HUANG et al., 2009; CHELLI-CHAABOUNI et al., 2010;
ZRIG et al., 2011); clorose férrica (JIMÉNES et al., 2011b) e deficiência de ferro
(GONZALO et al., 2011). Também a estresses bióticos, como: infestação por
nematóides (PINOCHET et al., 1995; FACHINELLO et al., 2000; MAYER et al.,
2003; XIANG et al., 2010), vírus (RUBIO, et al., 2005), bactérias e fungos
(SOCIAS I COMPANY et al., 1995; JIMÉNEZ et al., 2011).
39
3.5. Enxertia
É uma forma de propagação assexuada de tecidos vegetais superiores,
na qual se colocam em contato duas porções de tecido vegetal de tal maneira
que se unam e posteriormente se desenvolvam, originando uma nova planta
(FACHINELLO et el., 2005).
São necessárias três etapas principais para a formação de um enxerto
(HARTMANN et al., 2002):
A – Proliferação de calo e estabelecimento de contato entre as regiões
cambiais da cultivar e do porta-enxerto (Figura 2A). Nesta etapa, o cambio da
cultivar e do porta-enxerto produzem células parenquimáticas que se
entremeiam formando um tecido caloso que preenche os espaços vazios entre
cultivar e porta-enxerto. Alguns autores consideram que esse evento pode
ocorrer tanto em combinações compatíveis quanto incompatíveis.
B – Diferenciação de células parenquimáticas de calo em novas células
cambiais que conectam os câmbios da cultivar e do porta-enxerto (Figura 2B).
As células começam a se diferenciar a partir do cambio original da cultivar e do
porta-enxerto, evoluindo pela ponte de calo até se encontrarem.
C – Produção do novo floema e xilema (Figura 2C). O novo cambio, já
com atividade meristemática, se diferencia em novo xilema e floema, formando
um sistema vascular contínuo e funcional entre cultivar e porta-enxerto. Esta
etapa é apontada como fundamental para o sucesso da enxertia.
40
Cultivar
Parênquima medular
Xilema secundário
Câmbio vascular
Floema secundário
Porta-enxerto
Parênquima cortical
Periderme
(A)
(B)
(C)
Figura 2. Figura esquemática das três etapas de formação do enxerto. (A)
proliferação de calo a partir da cultivar e do porta-enxerto; (B) formação de um
novo cambio; e (C) Produção de novo floema e xilema. Adaptado de Hartmann
et al. (2002). Pelotas, RS, 2012.
3.6. Incompatibilidade de enxertia
Geralmente os dois indivíduos que compõem um enxerto (cultivar e
porta-enxerto) pertencem à mesma espécie botânica ou a espécies muito
próximas dentro de um gênero (ERREA, 1991; ZARROUK, 2006). No entanto,
atualmente é cada vez mais frequente o uso de porta-enxertos pertencentes a
espécies distintas da cultivar, com o objetivo de obter-se uma série de
vantagens, como: ser de fácil obtenção; ser adaptado às condições de solo e
clima locais; ser resistente a doenças e pragas do solo; induzir vigor adequado
à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem; induzir
precocidade; ser eficiente na produção de frutas de qualidade; propiciar
longevidade às plantas; ser eficiente na absorção de água e nutrientes; e ser
compatível com as cultivares recomendadas (ERREA, 1991; FINARDI, 1998).
Porém, a combinação de indivíduos geneticamente diferentes pode resultar em
problemas de afinidade entre os componentes do enxerto (HARTMANN et al.,
2002; PIROVANI et al., 2002).
Entre as frutíferas do gênero Prunus, a utilização de diferentes
espécies como porta-enxertos, associado ao grande dinamismo e a rápida
renovação varietal destas espécies, obriga que a compatibilidade entre porta-
41
enxerto
e
cultivar
seja
determinada
o
mais
precocemente
possível
(REIGHHARD, 2002; ZARROUK, 2006). Uma vez que, a falta de afinidade
entre porta-enxertos e cultivares atrasa a disponibilização de novos portaenxertos, pois prolonga o processo de seleção e/ou introdução (HOSSEIN, et
al., 2008; PINA & ERREA, 2009).
Mosse (1958) define incompatibilidade de enxertia como a ausência de
desenvolvimento normal dos tecidos no ponto de enxertia, resultando em feixes
vasculares não completamente lignificados, que provocam uma interrupção da
continuidade vascular e cambial com consequentes problemas físicos na união.
Os sintomas de incompatibilidade em espécies lenhosas incluem
espessamento da casca; queda prematura de folhas (COPES, 1980); atraso na
brotação; quebra no ponto de união do enxerto; diferenças de vigor entre portaenxerto e cultivar; desenvolvimento excessivo abaixo, acima ou no ponto de
união (FACHINELLO et al., 2005); redução do crescimento vegetativo e morte
prematura das plantas (HARTMANN et al., 2002). Em alguns casos os
sintomas não aparecem externamente, havendo prejuízos cumulativos ao
longo dos anos (ERREA & BORRUEY, 2004).
3.7. Tipos de incompatibilidade de enxertia
A incompatibilidade entre cultivar e porta-enxerto tem sido classificada
em distintos tipos. A primeira classificação foi proposta por Argles (1937), que
classificou os tipos de incompatibilidade de enxertia de acordo com a
expressão dos sintomas. Porém, essa classificação é considerada inadequada,
uma vez que não diferencia a falta de afinidade provocada por infecções virais
ou enxertia realizada de maneira equivocada (ANDREWS & MÁRQUEZ, 1993).
Posteriormente, as classificações tomaram por base as prováveis
causas da incompatibilidade e não apenas os sintomas.
Scaramuzzi (1955) dividiu a incompatibilidade em três grupos
baseados na resposta a um terceiro componente, um filtro. No primeiro grupo,
a incompatibilidade entre os dois componentes é superada pela utilização de
um filtro compatível com ambos; no segundo grupo, o filtro não é capaz de
prevenir a incompatibilidade; e no terceiro, o filtro induz a incompatibilidade
entre componentes compatíveis.
42
Herrero (1956) sugeriu uma classificação da incompatibilidade em
quatro classes: falha no pegamento do enxerto ou incompatibilidade total; falha
do enxerto devido à infecção por vírus em um dos componentes da
combinação; obstrução mecânica do enxerto e estrutura anormal da união
geralmente associada ao acúmulo desproporcional de amido.
Porém, entre as classificações já propostas, a de Mosse (1962) é a
mais utilizada. Essa classificação divide a incompatibilidade de enxertia em
plantas frutíferas em dois tipos: incompatibilidade ‘translocada’ e ‘localizada’.
3.7.1. Incompatibilidade ‘translocada’
Esse tipo de incompatibilidade se caracteriza por apresentar sintomas
visíveis
durante
o
desenvolvimento
das
plantas.
A
incompatibilidade
‘translocada’ pode estar associada aos seguintes sintomas (HERRERO, 1968;
MOING et al, 1987; ERREA, 1991; MORENO et al., 1993):
• Parada precoce do crescimento;
• Coloração anormal das folhas: progredindo de amarelada para
avermelhada ou alaranjada;
• Redução do crescimento radicular;
• Degeneração dos tubos crivados e células companheiras na região de
união do enxerto;
• Acúmulo de açúcares e amido na cultivar e decréscimo no porta-enxerto,
que acontece devido a uma redução da translocação na união do
enxerto;
• Alteração da continuidade vascular na união produzido espessamento
da casca nessa região;
• Persistência dos sintomas quando da utilização de filtro.
Em geral, os sintomas externos se manifestam em virtude da
dificuldade na translocação de substâncias, que com frequência ficam
acumuladas na cultivar durante o verão (USENIK & STAMPAR, 2000;
SYLAYEVA et al., 2004). Os sintomas externos podem começar a se
manifestar na primeira metade da estação seguinte à enxertia (SALESSES &
ALKAI, 1984). Esse tipo de incompatibilidade não fica restrita à zona de união,
43
se transloca inclusive através do filtro, quando este está presente (BREEN,
1974).
Atualmente a avaliação dos valores SPAD (Soil Plant Analysis
Diagnostic) e a análise da concentração de clorofila em folhas permitem
identificar casos de incompatibilidade severa entre cultivares de pessegueiro
com distintos porta-enxertos de Prunus (ZARROUK, 2006).
Um exemplo clássico deste tipo de incompatibilidade ocorre entre
combinações de pessegueiro com Mirabolano ou Mariana (MORENO et al.,
1993). Assim como, entre cultivares de pessegueiro ou necterineira enxertadas
sobre porta-enxertos de ameixeira. No entanto, embora os sintomas e muitas
mudanças
bioquímicas
sejam
conhecidas,
a
causa
desse
tipo
de
incompatibilidade não está clara.
3.7.2. Incompatibilidade ‘localizada’
A incompatibilidade do tipo ‘localizada’ geralmente é associada a uma
má formação estrutural do ponto de união entre cultivar e porta-enxerto, que
pode resultar em ruptura do enxerto (ERREA & FELIPE, 1992; SIMARD &
OLIVIER, 1999). A ocorrência dessa ruptura, em geral, esta associada à
descontinuidade das conexões vasculares (floema e xilema), presença de
tecidos parenquimatosos interrompendo essas conexões e descontinuidade da
casca no ponto de união (ERREA & FELIPE, 1994; ERMEL et al., 1999;
HARTMANN, et al., 2002). A incompatibilidade ‘localizada’ pode ocorrer ainda,
pela necrose do tecido cambial que provoca descontinuidade vascular e/ou
ausência de diferenciação do tecido vascular na linha de união (HERRERO,
1962; MUSACCHI et al., 2004).
Esse tipo de incompatibilidade é um problema grave na propagação de
plantas, principalmente porque a planta pode tardar vários anos para
apresentar sintomas externos, causando perda de tempo, material vegetal e
recursos financeiros (PINA, 2005).
Diferentes estudos têm mostrado a implicação dos compostos fenólicos
na diferenciação celular e na falta de lignificação em uniões incompatíveis
(ERREA et al., 1994; ERREA, 1998; USENIK & STAMPAR, 2001). O acumulo
de fenóis, seguido de sua oxidação, tem sido relacionado com a linha necrótica
que aparece no xilema das combinações incompatíveis (FEUCHT et al., 1992;
44
ERREA, 1998). Neste mesmo contexto, a enzima peroxidase, relacionada ao
processo de lignificação, tem sido observada em maiores quantidades nas
combinações incompatíveis (SANTAMOUR, 1992; RODRIGUES et al., 2002).
Outros compostos associados a problemas de compatibilidade desse
tipo são os glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina. O acúmulo de
cianeto liberado pela hidrólise dos glicosídeos na união do enxerto pode causar
necrose das células cambiais e a descontinuidade vascular por alterações no
xilema e floema (GUR et al., 1968; GUR & BLUM, 1973), oque foi confirmado
quando o damasqueiro foi enxertado sobre pessegueiro (POESSEL &
RUCART, 1988). Em estágios avançados pode-se observar o esgotamento do
sistema radicular (ERREA, 1994). Isso ocorre devido à translocação deficiente
no ponto de união, causada pela degeneração do floema (ZARROUK, 2006).
A incompatibilidade ‘localizada’ pode estar associada aos seguintes
sintomas (HERRERO, 1968; ERREA, 1991):
• Continuidade cambial e vascular danificada, que pode estar
associada à presença de tecido parenquimático não lignificado;
• Quando da colocação de um filtro compatível com a cultivar e o
porta-enxerto a incompatibilidade é inibida;
• Apresenta
sintomas
proporcionais
ao
externos
grau
de
e
desenvolvimento
descontinuidade
na
lento,
união
e
esgotamento do sistema radicular.
Mosse & Herreo (1951) propõe cinco graus de compatibilidade,
baseados na análise da estrutura interna das uniões, sendo eles: A, B, C, D e
E. As classes A, B e C são consideradas compatíveis, pois não apresentam
capa de parênquima no tecido lenhoso que possa prejudicar a resistência
mecânica. Já as classes D e E são incompatíveis, pois podem romper-se
devido a danos mecânicos ou pela ação do vento (HERRERO, 1962).
45
3.7.3. Outros tipos de incompatibilidade
3.7.3.1. Incompatibilidade total
A incompatibilidade total se caracteriza pelo completo desprendimento
do enxerto ou pelo estado de roseta que acaba com a morte da planta
(MOSSE, 1962, MORENO, 1990).
3.7.3.2. Incompatibilidade por vírus
Esse tipo de incompatibilidade se manifesta pela infecção por vírus em
um dos componentes do enxerto (MARÉNAUD, 1968). Um exemplo é o vírus
chlorotic leaf spot (CLSV) (BERNHAD, 1990), que pode estar presente em um
dos componentes do enxerto e que ao ser enxertado transmite a doença para o
outro.
3.8. Mecanismos potencialmente envolvidos na incompatibilidade
de enxertia
Os eventos envolvidos na enxertia são conhecidos. No entanto, o
mecanismo pelo qual a incompatibilidade se expressa não está claro e várias
hipóteses tem sido estudadas na tentativa de explicar este fenômeno (PINA &
ERREA, 2005).
O grande número de combinações interespecíficas implicam em uma
série de interações estruturais, bioquímicas e fisiológicas entre esses
indivíduos, gerando um leque bastante amplo de causas prováveis para a
ocorrência do fenômeno de incompatibilidade de enxertia.
3.8.1. Plasmodesmas: reconhecimento celular
O estudo da incompatibilidade vista deste aspecto trata de causas que
remetem à importância das plasmodesmas na comunicação celular.
As plasmodesmas são extensões tubulares da membrana plasmática
que atravessam a parede celular e conectam o citoplasma de células
adjacentes formando o simplasto (TAIZ & ZAIGER, 2004). Desta forma,
desempenham um importante papel no mecanismo de comunicação celular e
no processo de enxertia (SCHULZ, 1999; PINA & ERREA, 2005).
Jefree & Yeoman (1983) sugerem que o contato entre as células da
cultivar e do porta-enxerto é estabelecido pelas plasmodesmas, resultando em
46
uma conexão simplástica e permitindo a interação metabólica mútua entre
ambos (STRASBURGER, 1901; PINA & ERREA, 2005).
A pesquisa de Kollmann et al. (1995), sobre o mecanismo de formação
das
plasmodesmas
mostrou
o
desenvolvimento
de
plasmodesmas
interespecíficas entre cultivar e porta-enxerto, sugerindo que o reconhecimento
celular e a coordenação funcional podem estar envolvidos na formação do
enxerto.
Dessa forma, a ocorrência de plasmodesmas não funcionais tem sido
associada à ocorrência de incompatibilidade de enxertia (PINA & ERREA,
2005). Tais problemas de funcionalidade das plasmodesmas podem estar
associados a uma possível especificidade das mesmas.
3.8.2. Hormônios
Tem sido relatado que a relação entre cultivar e porta-enxerto é afetada
pelos hormônios de crescimento e que a incompatibilidade de enxertia também
pode ter a mesma causa (ANDREWS & MARQUEZ, 1993).
A auxina tem sido associada a estágios importantes do processo de
enxertia, como a proliferação e diferenciação do calo (SACHS, 1981),
sugerindo que o acúmulo de auxina na base da cultivar esta altamente
relacionada com o sucesso da enxertia.
Aloni
et
al.
(2008)
propuseram
que
a
principal
causa
da
incompatibilidade pode ser a ocorrência de desequilíbrio hormonal no sistema
radicular, principalmente com relação à auxina e etileno. Segundo essa teoria,
após a enxertia, quando as conexões vasculares estão estabelecidas, a auxina
produzida na cultivar, é translocada para o sistema radicular, onde ao atingir
um limiar de grande concentração, desencadeia processos de degradação e
deterioração das raízes.
Relatos sugerem ainda, que a inibição do crescimento da raiz por
concentrações elevadas de auxina pode ser causada pela produção excessiva
de etileno (MULKEY et al, 1982; RAHMAN et al, 2001), que estimula a
biossíntese de auxina em diferentes órgãos da planta e aumenta a capacidade
de transporte de auxina (RUZICKA et al., 2007; ALONI et al., 2010).
47
3.8.3. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são um grupo de produtos secundários
presente nas plantas com uma grande diversidade de funções (RHODES et al.,
1986; TAIZ & ZEIGER, 2004). Estes compostos desempenham papel
importante, pois participam da estrutura das plantas e estão envolvidos em um
grande número de rotas metabólicas, bem como na resposta das plantas ao
ambiente e na interação com patógenos (HASLAM, 1979; HARBORNE, 1980).
Inúmeros autores têm relacionado à incompatibilidade de enxertia com
diferenças quantitativas e qualitativas no conteúdo de fenóis, além de
mudanças na atividade das enzimas que regulam a síntese destes compostos
(TREUTTER & FEUCHT, 1991; ERREA, 1998; RODRIGUES et al., 2001;
RODRIGUES et al., 2002; USENIK et al., 2006; HOSSEIN et al., 2008; PINA &
ERREA, 2008).
Segundo Errea (1998), os compostos fenólicos estão implicados em
todos os eventos envolvidos no processo de enxertia. O autor demonstra que
uma situação de estresse contínuo, causado pela falta de adaptação das duas
partes que formam o enxerto, pode desencadear uma série de eventos,
resultando em anormalidades no desenvolvimento do mesmo. Mudanças que
afetam a difusão e a circulação de fenóis podem estar implicadas em dano
celular e alteração do sistema cambial na união do enxerto. Além disso, uma
forte acumulação de fenóis pode levar a sua oxidação com ação tóxica sobre
uma série de reações metabólicas, inclusive a síntese de lignina (BUCHLOH,
1960).
Têm sido demonstrado o envolvimento da fenilalanina amônia-liase
(PAL) a da UDP-glicose pirofosforilase (UGPase) na incompatibilidade entre
damasco e ameixeira em estágios precoces do desenvolvimento do enxerto
(PINA & ERREA, 2008; PINA & ERREA, 2005). Estes resultados indicam que
não ocorrem apenas alterações anatômicas durante a formação do enxerto,
mas
mudanças
moleculares
também
podem
estar
envolvidas
no
comportamento diferencial de combinações compatíveis e incompatíveis.
Compostos fenólicos como ligninas, flavonóides e antocianinas são
produzidos na rota fenilpropanóide (DIXON & PAIVA, 1995), rota que têm sido
relacionada com a resposta a muitos tipos de estresse, como no envolvimento
em estágios precoces do desenvolvimento do enxerto, consistindo em
48
importante fonte de pesquisa sobre o fenômeno de incompatibilidade de
enxertia. Por outro lado, há a possibilidade das alterações constatadas no perfil
fenólico de combinações incompatíveis serem uma resposta ao fenômeno de
incompatibilidade causado por outro fator, ainda desconhecido, e não a causa
da incompatibilidade.
Desta forma, torna-se importante que em estudos de incompatibilidade
de enxertia sejam estudados vários possíveis mecanismos ao mesmo tempo.
3.8.4. Glicosídeos cianogênicos (GCs)
Os
glicosídeos
cianogênicos
(GCs)
foram
confirmados
como
causadores da incompatibilidade entre algumas cultivares de pereira e
marmeleiro (GUR et al., 1968; MOORE, 1986) e pessegueiro e amendoeira
(GUR & BLUM, 1973). No primeiro caso, o glicosídeo cianogênico prunasina,
que ocorre no marmeleiro e não na pereira, ascende do porta-enxerto para a
cultivar, onde é hidrolisado pela β-glicosidase, ocorrendo a liberação de cianeto
na interface do enxerto (GUR et al. 1968).
Pelo
fato
dos
GCs
e
da
β-glicosidase
encontrarem-se
compartimentados, o processo de cianogênese inicia apenas quando ocorre o
rompimento
destes
compartimentos,
possivelmente
nesse
caso
seja
desencadeado pela enxertia. Uma vez em contato com a amigdalina, a enzima
o hidrolisa, gerando uma molécula de glicose e outra de prunasina.
Posteriormente, a prunasina é hidrolisada pela mesma enzima produzindo
outra molécula de glicose e uma α-hidroxilitrila, que finalmente sofre ação de
uma hidroxilitrila-liase, resultando na liberação do cianeto (CONN, 1980;
ZAGROBELNY et al., 2004).
Na combinação entre pessegueiro e amendoeira, a prunasina está
presente tanto na cultivar quanto no porta-enxerto. Mas, em muito menor
quantidade na amendoeira. Nesse caso ocorre a translocação de prunasina da
cultivar (pessegueiro) para o porta-enxerto (amendoeira), onde é hidrolisado e
libera cianeto. Moraes et al. (2001), sugerem que em seringueira, a
incompatibilidade observada entre as cultivares enxertadas sobre o portaenxerto PA1 é provocada pela translocação de GCs da copa para o portaenxerto, que não possui em seu metabolismo a capacidade de remoção do
cianeto.
49
Em geral, as espécies cianogênicas apresentam também a capacidade
de metabolizar o cianeto, evitando danos celulares. O processo de
desintoxicação do cianeto é composto por duas rotas principais (MOLLER &
POULTON,1993). A primeira rota envolve a formação de β-cianoalanina a partir
do cianeto e da cisteína, reação catalisada pela β-cianoalanina sintase. A βcianoalanina é posteriormente convertida em asparagina (MILLER & CONN,
1980). A segunda rota converte o cianeto em tiocianato e é catalisada pela
rodanase (BORDO & BORK, 2002). A rota mais comum em plantas é a da βcianoalanina (ZAGROBELNY et al., 2004). Desta forma, tanto a manifestação
quanto o grau da incompatibilidade podem depender também da capacidade
de desintoxicação por parte das plantas.
O cianeto liberado na união do enxerto causa prejuízo a atividade
cambial e necrose das células na interface do enxerto, afetando o sistema
vascular e dificultando a translocação (GUR et al. 1968; MOORE, 1986;
ANDREWS & SERRANO, 1993).
Segundo alguns autores, os níveis de GCs nos porta-enxertos e nas
cultivares podem servir como indicadores de compatibilidade (GUR & BLUM,
1973; MORAES et al., 2001).
3.9. Métodos de diagnóstico da incompatibilidade de enxertia
A detecção precoce da incompatibilidade de enxertia pode reduzir o
período necessário para a obtenção ou adaptação de novos porta-enxertos.
Atualmente, os métodos mais confiáveis para a detecção da
incompatibilidade são os tradicionais. Na incompatibilidade ‘translocada’,
observa-se os sintomas folhares, enquanto na ‘localizada’ são analisadas as
anomalias anatômicas da união do enxerto (ZARROUK, 2006). Porém, esses
métodos apresentam algumas desvantagens porque são necessários vários
anos de avaliações e muitas vezes os sintomas podem não se correlacionar
com a incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Por essas razões, a
tendência é que se busquem métodos de detecção rápidos e precoces,
relacionados a aspectos fisiológicos, bioquímicos e moleculares.
50
3.9.1. Isoenzimas e proteínas totais
Para alguns autores, a análise de isoenzimas entre porta-enxerto e
cultivar pode ser empregada para predizer a incompatibilidade de enxertia
(SANTAMOUR et al., 1986; ZARROUK et al., 2010). Gulen et al. (2002)
sugerem que as isoperoxidases A e B podem ser usadas como marcadores de
compatibilidade entre pêra e marmelo. Hossein et al. (2008), em estudo de
compatibilidade entre cultivares de pêra e um porta-enxerto de marmelo,
concluíram que a presença da banda A na união do enxerto foi um indicador de
compatibilidade enquanto a ausência foi relacionada com incompatibilidade
entre algumas combinações. A ausência da banda B também foi relacionada
com a incompatibilidade entre combinações. Gökbayrak et al. (2007) avaliaram
a possibilidade de utilizar isoenzimas (peroxidases, fosfatase ácida e esterase)
e proteínas totais no diagnóstico precoce da incompatibilidade entre uvas
americanas. Seus resultados indicaram que a fosfatase ácida e as proteínas
totais podem ser usadas para determinar a incompatibilidade em uvas. A
utilização de proteínas totais separadas por eletroforese também foi um método
viável segundo Gullen et al. (2005), onde em combinações incompatíveis
ocorre a formação de uma banda extra em relação as compatíveis.
3.9.2. Estudo histológico da união do enxerto
A tentativa de diagnosticar a incompatibilidade através da observação
da união do enxerto começou com Mosse (1962), no entanto, até hoje é um
método bastante empregado por vários autores na busca de uma detecção
precoce (SALVATIERRA et al., 1998; DOLGUM et al., 2008; PINA & ERREA,
2009). Na incompatibilidade ‘localizada’, a interface do enxerto apresenta
descontinuidade vascular associada à presença de células necróticas no lenho
e na casca, além de células não-lignificadas no lenho e invaginações ou quebra
do câmbio, como verificado entre combinações de pêssego e damasco (Lapins
1959) e de damasco e ameixa (ERREA et al. 1994). Herrero (1951) concluiu
que os sintomas típicos da incompatibilidade do enxerto ‘localizada’ não são
observados antes do final do primeiro ano de crescimento. Mas, Pina & Errea
(2009), observaram por meio de análise histológica, diferenças entre
combinações compatíveis e incompatíveis, de duas a quatro semanas após a
enxertia. Flaishman et al. (2008), em estudo histológico da compatibilidade
51
entre homoenxertos e heteroenxertos de Arabidopsis revelaram quatro estágios
de desenvolvimento na formação do enxerto: (1) desenvolvimento de uma
camada necrótica, (2) proliferação de calo na cultivar enxertada, (3)
diferenciação de novos tecidos vasculares no enxerto, e (4) formação de uma
união vascular plena entre cultivar e porta-enxerto. Ermel et al. (1999), relatam
que a análise multivariada de dados histológicos pode ser usada para estudar a
expressão estrutural da incompatibilidade de enxertia ‘localizada’. Essa técnica
leva em conta a alta variabilidade na estrutura da interface do enxerto, que
pode permitir a detecção dos primeiros eventos estruturais, decorrentes da
resposta de incompatibilidade. A análise multivariada dos dados histológicos
pode
servir
como
uma
ferramenta
para
o
diagnóstico
precoce
da
incompatibilidade em programas de melhoramento de porta-enxertos. Além de
facilitar o estudo dos estágios iniciais de desenvolvimento do enxerto (ERMEL
et al. 1997), e, assim, contribuir para a compreensão dos processos de
determinação celular, diferenciação e comunicação celular.
3.9.3. Estudo macroscópico da união do enxerto
A observação de uma possível descontinuidade da união do enxerto é
em geral empregada para determinar a existência de incompatibilidade
‘localizada’. Normalmente é realizada a partir do primeiro ano após a enxertia
(ZARROUK, 2006). Segundo Mosse & Herrero (1951), a incompatibilidade
‘localizada’ pode ser classificada de acordo com o grau em A, B, C, D e E,
conforme reportado anteriormente. Esse método é amplamente utilizado por
outros
pesquisadores
como
principal
forma
de
comprovação
da
incompatibilidade de enxertia (MORENO et al., 1993; ZARROUK et al., 2006)
3.9.4. Estimativa da concentração de clorofila
Para a determinação do nível de incompatibilidade ‘translocada’ a
campo, tem sido proposto um método baseado na estimativa do teor de
clorofila nas folhas de cada combinação. Isso porque entre os sintomas deste
tipo de incompatibilidade estão folhas amareladas e avermelhadas, desfolha,
vigor reduzido e morte (MORENO et al., 1993). Desta forma, a concentração de
clorofila pode ser estimada com a utilização de um aparelho SPAD que gera
um
valor
correspondente
ao
grau
de
incompatibilidade
‘translocada’
52
(ZARROUK, 2006). Diversos autores têm associado baixos valores SPAD com
combinações incompatíveis de Prunus (MORENO et al., 1993; ZARROUK,
2006).
3.9.5. Enxertia in vitro
O cultivo in vitro, com uniões de calo e microenxertos vem sendo uma
técnica cada vez mais difundida. Vários autores vêm utilizando essa técnica
para acelerar o diagnóstico da incompatibilidade de enxertia. Errea et al. (2001)
detectaram
anomalias
celulares associadas a
combinações de calos
incompatíveis de Prunus a partir da terceira semana, sugerindo a utilização de
uniões de calo in vitro como um método precoce de detecção da
incompatibilidade. Segundo Nito et al. (2005), quanto maior a diferença
taxonômica entre os dois componentes do enxerto, maior será a eficiência do
método in vitro.
Pina & Errea (2005) observaram diferenças na estrutura celular e na
presença de pectinas nos espaços intercelulares. Já Nocito et al. (2010) e Pina
& Errea (2009), constataram através de uniões in vitro, diferenças fisiológicas e
histológicas correlacionadas com o grau de compatibilidade das uniões.
Os métodos de diagnóstico da incompatibilidade baseados em uniões
in vitro apresentam uma série de vantagens, principalmente o ganho de tempo,
porém para a sua indicação é importante o estudo da sua correlação com
uniões in vivo. Vários estudos in vivo não confirmam as conclusões obtidas in
vitro (ERMEL et al., 1997).
3.9.6. Diferenças bioquímicas
Diferenças na distribuição de carboidratos são sugeridas como
indicativo de incompatibilidade. Alguns estudos relacionam a incompatibilidade
‘translocada’ com a distribuição de carboidratos acima e abaixo da união
(MOING et al., 1987; KUBOTA et al., 1990; SALVATIERRA et al., 1999; YANO
et al., 2002; OLMSTEAD et al., 2010). Em combinações incompatíveis de
Prunus, é observado um acúmulo de amido e açúcares (glicose, sacarose,
sorbitol e frutose) na cultivar e baixas concentrações no porta-enxerto (MOING
et al., 1987; YANO et al., 2002; OLMSTEAD et al., 2010). Esta diferença é
atribuída à dificuldade de translocação através da região de união do enxerto,
53
causada pelos danos ao floema, que em combinações incompatíveis é
funcional em algumas áreas e em outras não (BREEN, 1975; SALVATIERRA et
al., 1999; OLMSTEAD et al., 2010).
Diferenças na atividade enzimática de enzimas relacionadas à
produção de compostos fenólicos também são apontadas como forma de
avaliar a compatibilidade de enxertia. As peroxidases são as mais estudadas
(RODRIGUES et al., 2002; TELES et al., 2009; ZARROUK et al., 2010). A
quantificação da atividade da enzima peroxidase e do conteúdo de fenóis totais
nos tecidos vegetais pode ser um indicativo precoce da compatibilidade da
enxertia no gênero Prunus (TELES et al., 2009; ZARROUK et al., 2010).
Segundo Santamour (1992), para se obter plantas sem problemas de
compatibilidade e com um sistema vascular funcional na união do enxerto, é
necessário que as atividades da enzima peroxidase sejam similares, tanto no
enxerto como no porta-enxerto, para que ocorra a mesma reestruturação das
células e produção de ligninas correlatas.
Pina & Errea (2008), verificaram maior expressão gênica da PAL,
enzima que coordena a rota fenilpropanóide, em combinações incompatíveis
de Prunus. Expressão que se correlacionou com a maior concentração de
fenóis na união destas combinações. A rota fenilpropanóide é responsável pela
biossíntese da maior parte dos compostos fenólicos nas plantas. Os compostos
fenólicos regulam a síntese de AIA oxidase, mais precisamente o ácido pcumárico, precursor da lignina (TAIZ & ZEIGER, 2004).
Outros compostos utilizados na detecção da incompatibilidade de
enxertia são os glicosídeos cianogênicos. A diferença de concentração entre os
glicosídeos cianogênicos é conhecida como causa da incompatibilidade entre
pêreira e marmeleiro, pessegueiro e amendoeira (GUR & BLUM 1968; GUR,
1973; NOCITO et al., 2010). Moraes et al. (2001) sugerem que em seringueira
os glicosídeos cianogênicos também estão associados a incompatibilidade de
enxertia. Os glicosídeos responsáveis pela liberação de cianeto são
amigdalina, prunasina, linamarina (seringueira) e lotaustralina (seringueira)
(GUR 1957; MORAES et al., 2001). A determinação de tais compostos em
cultivares e porta-enxertos pode servir de parâmetro para a enxertia, que pode
ser realizada apenas entre cultivar e porta-enxerto com concentrações
similares.
54
4. Relatório do trabalho de campo
O projeto elaborado teve como base o experimento implantado no ano
de 2008, no Centro Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de
Pelotas. Onde foram transplantadas combinações das cultivares ‘Maciel’ e
‘Chimarrita’ com os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (Prunus persica), ‘Tsukuba 1’
(Prunus persica), e ‘Umezeiro’ (Prunus mume). O pomar experimental foi
implantado em delineamento estatístico, sendo composto por quatro blocos nos
quais foram alocadas as parcelas de cada combinação constituídas de cinco
plantas.
A partir do experimento de campo, foram desenvolvidas atividades
voltadas ao estudo da compatibilidade entre as combinações.
Inicialmente o trabalho tinha o objetivo de estudar a incompatibilidade de
enxertia apenas através do mecanismo de cianogênese, avaliando os
glicosídeos cianogênicos (GCs). Porém, com a possibilidade de parceria com o
grupo de pesquisa em fruticultura de clima temperado do Centro de
Investigación y Tecnologia Agroalimentaria de Aragón, em Zaragoza, na
Espanha, se agregou outro possível mecanismo incompatibilidade, relacionado
com as diferenças no perfil fenólico entre cultivares e porta-enxertos
incompatíveis.
Para diagnosticar a incompatibilidade de enxertia e relacionar os
resultados bioquímicos ao fenômeno, foram realizadas avaliações de
crescimento dos enxertos durante os quatro anos do projeto.
4.1. Avaliações fenotípicas
Paralelo
as
análises
bioquímicas
foram
conduzidas
avaliações
fenotípicas do crescimento das plantas, que foram realizadas durante os ciclos
de crescimento.
As variáveis avaliadas foram:
- Massa fresca de poda: obtida pela pesagem do total de material
retirado na poda de cada parcela nas safras 2008/09, 2009/10 e 2010/11.
- Área foliar: estimada pelo produto do número total de folhas de cada
planta pela área foliar média de 50 folhas, utilizando-se um medidor de área
foliar modelo Área Meter 3100 (safra 2009/10).
55
- Diâmetro do tronco: medido na cultivar (5cm acima da união), no ponto
de união e no porta-enxerto (5cm abaixo da união), durante as safras 2008/09,
2009/10 e 2010/11.
- Constante de compatibilidade a campo (CC): foi calculado segundo
Perraudine (1962), pela seguinte equação: CC= [(C/A)+(C+A)/2B]+10; onde:
A= diâmetro do tronco 5cm acima do ponto de enxertia (cultivar); B= diâmetro
do tronco no ponto de enxertia; C= diâmetro do tronco 5cm abaixo do ponto de
enxertia (porta-enxerto), sendo que quanto mais próximo de 12 for o resultado,
maior será a afinidade entre porta-enxerto e cultivar.
- Índice de sobrevivência: corresponde ao total de plantas que
sobreviveram após 36 meses da implantação do pomar experimental.
- Avaliação da incompatibilidade ‘translocada’: realizada através da
concentração da clorofila, estimada pelo índice SPAD. Já a incompatibilidade
‘localizada’, foi avaliada pela análise anatômica interna e externa da região de
união dos enxertos, conforme sugerido por Mosse & Herreo (1951).
A incompatibilidade ‘translocada’ foi analisada pela concentração de
clorofila por área de folha, estimativa a campo, usando um SPAD-502 meter
(Minolta). Foram realizadas duas medidas (lado superior e inferior) em 10
folhas de cada planta, sendo avaliadas três plantas de cada parcela,
totalizando 30 folhas por parcela. As medidas foram realizadas no verão de
2011, aproximadamente 150 dias após a plena floração. Quanto maior o grau
de incompatibilidade ‘translocada’ menor será o índice SPAD (MORENO et al.,
1993).
O grau de compatibilidade ‘localizada’ das combinações estudadas foi
avaliado na região da união do enxerto, três anos e meio após a enxertia,
através das classes (A, B, C, D e E) propostas por Mosse & Herreo (1951). As
classes correspondem aos seguintes níveis de compatibilidade:
•
A: união perfeita, a linha da união na casca e no lenho não é visível;
•
B: boa união, a linha de união na casca e no lenho são continuas,
embora no lenho seja muitas vezes visível devido a excessiva
formação de raias;
•
C: união com descontinuidade na casca, os tecidos da casca do
porta-enxerto e da cultivar são separados por uma camada marrom
escura com aparência de cortiça;
56
•
D: uniões com descontinuidade do lenho, os tecidos do lenho do
porta-enxerto e da cultivar foram separados em muitos pontos, por
outro lado os tecidos da casca seguem como na classe C;
•
E: quando ocorre a quebra da união no pomar ou viveiro.
As classes A, B e C, são consideradas compatíveis, pois não
apresentam prejuízo a resistência mecânica. Entretanto, as classes D e E são
incompatíveis, pois podem romper-se por dano mecânico ou ação do vento
(HERRERO, 1962).
4.2. Mecanismo de incompatibilidade por cianogênese
O estudo da cianogênese como mecanismo de incompatibilidade foi
realizado pela determinação das concentrações dos GCs amigdalina e
prunasina na cultivar e no porta-enxerto de cada combinação em duas épocas,
inverno e verão.
As análises foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da
Embrapa Clima Temperado em Pelotas, Brasil, no ano de 2011. No momento
da coleta as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e
logo após armazenadas a temperatura de -70ºC. Posteriormente passaram
pelo processo de liofilização e foram armazenadas em tubos plásticos vedados
até a realização das análises.
Foram utilizados padrões prunasina e amigdalina (Sigma-Aldrich),
carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol (Vetec) específicos para HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). A água utilizada foi obtida empregandose o sistema Milli-Q de purificação (Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1
µm.
A extração foi realizada em 500 mg de amostra, com 8 mL de metanol e
2000 mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16
horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a 3000
rpm durante 20 min e o sobrenadante foi filtrado à vácuo em filtro de nylon 0,1
µm. Do total filtrado, 20 µL foram submetidos à análise cromatográfica.
Para as determinações cromatográficas empregaram-se uma coluna
analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6 mm, 4 µm) e pré-coluna equivalente,
mantidas a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-metanol (60:40; v/v)
57
com fluxo de 1,3 mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254 nm.
Os resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca.
A separação cromatográfica dos compostos amigdalina e prunasina foi
realizada com sucesso. Foram obtidos quatro picos: Pico 1: água (1,16 min),
Pico 2: metanol (1,38 min), Pico 3: amigdalina (2,44 min) e Pico 4: prunasina
(3,44 min). Sendo os dois primeiros picos referentes à fase móvel.
4.3. Mecanismo
de
incompatibilidade
por
diferenças
na
composição fenólica
As diferenças entre a composição fenólica de cultivares e do portaenxertos incompatíveis foi avaliada pela atividade da fenilalanina amônia-liase
(PAL) e expressão gênica da fenilalanina amônia-liase 1 (PAL1), fenilalanina
amônia-liase 2 (PAL2), cinamato 4-hidroxilase 1 (C4H1), cinamato 4-hidroxilase
2 (C4H2), 4-cumarato:CoA ligase 1 (4CL1), 4-cumarato:CoA ligase 2 (4CL2) e
4-cumarato:CoA ligase 3 (4CL3).
As análises referentes a atividade da PAL foram realizadas no
laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado em Pelotas,
RS no ano de 2010. Foi determinada de acordo com as metodologias descritas
por Hyodo & Yang, (1971) e Hyodo et al., (1978), padronizada para análise de
casca com modificações de acordo com Campos et al. (2003).
Para a extração foram utilizados 500 mg de tecido fresco de casca,
macerados em microtriturador em uma mistura de 4 ml de tampão borato de
sódio 50 mM
pH 8,5
contendo 25 gL-1 de PVP 10
e 4 mL L-1 de
mercaptoetanol (±4 °C). Em seguida foi realizada a filtração do extrato bruto em
papel Whatman nº 1. O extrato bruto foi centrifugado por 15 min na velocidade
de 6.000 rpm e o sobrenadante (extrato enzímico) foi filtrado em papel
Whatman nº 1 e utilizado para análise da atividade da PAL.
As leituras foram realizadas em espectrofotômetro UV PC Shimadzu em
290nm. A atividade enzimática foi expressa em unidades que foram definidas
como a quantidade de enzima que produz 1 mM de ácido trans-cinâmico por
minuto por grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1).
Com base na sequência de aminoácidos do pessegueiro no GDR
(Genome Database of Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e homologia com
58
sequências de genes de mesma função em Arabdopsis foram desenhados
primers específicos.
A análise de Real Time qRT-pcr foram realizadas em um equipamento
Applied Biosystems 7500/7500 Fast (Applied Biosystems) com um volume total
de 25 µL contendo: 12,5 µL do SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems), 5 µL de cDNA diluído (1,6 ng µl-1), 0,75 µL de cada primer (300
mM) e 6,0 µL de água Milli-Q. O protocolo foi idêntico para todos os conjuntos
de primer: 95 ºC por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ºC por 30 seg, 60 ºC
por 1 min, 72 ºC durante 1min e uma extensão final de 72 ºC por 10 min.
Posteriormente, um protocolo de dissociação com gradiente de 95 ºC por 15
seg. Os níveis de expressão foram calculados pelo método Ct (cycle threshold).
O ∆Ct ou Ct normalizado foi obtido subtraindo valores Ct de cada gene alvo do
Ct do gene de referência (housekeeping), enquanto o ∆∆Ct foi calculado
usando o Ct de amostras não enxertadas.
Os resultados foram submetidos à análise da variância e as variáveis
com diferenças significativas (p<0,05) foram comparadas pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade de erro. As análises foram realizadas através do programa
estatístico WinStat versão 2.11 (MACHADO & CONCEIÇÃO, 2003).
59
5. Artigo 1: Compatibilidade de enxertia em pessegueiro: análise de
crescimento e expressão gênica da Fenilalanina amônia-liase
5.1. Resumo
A fenilalanina amônia-liase (PAL) é a enzima chave da rota fenilpropanóide.
Essa rota é responsável pela biossíntese de um grande número de compostos
secundários, como as antocianinas, os flavonóides e as ligninas. Níveis
elevados da PAL são associados ao acúmulo de compostos fenólicos na união
de enxertos incompatíveis. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a
expressão e a atividade da PAL em diferentes combinações de Prunus,
confirmando ou não a possibilidade de utilizar a PAL como indicador
bioquímico de incompatibilidade de enxertia. O estudo foi realizado em plantas
da cultivar Chimarrita (Prunus persica L. Batsch) enxertada sobre os portaenxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica L. Batsch), ‘Tsukuba 1’ (P. persica L.
Batsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. et Zucc.). As avaliações de crescimento
vegetativo mostraram que ‘Chimarrita’ enxertada sobre ‘Umezeiro’ apresentou
crescimento reduzido, resultando na morte de algumas plantas, enquanto os
demais porta-enxertos induziram crescimento vigoroso a ‘Chimarrita’. O cálculo
da constante de compatibilidade a campo (CC) indica que a combinação
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresenta certo grau de incompatibilidade. Além disso,
a expressão e a atividade da PAL foram maiores em ‘Umezeiro’. De acordo
com os dados, houve um elevado nível de incompatibilidade entre a cultivar
‘Chimarrita’ e o porta-enxerto ‘Umezeiro’. O incremento da expressão gênica e
da atividade enzimática da PAL podem ser usadas como marcador bioquímico
com a finalidade de predizer a incompatibilidade de enxertia em Prunus.
Palavras-chave: análise de crescimento, rota fenilpropanóide; atividade
enzimática, genes de referência.
60
Graft compatibility in peach: analysis of growth and gene expression of
phenylalanine ammonia-lyase
5.2. Abstract
The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the key enzyme of phenylpropanoid
pantway. This pantway is responsible for the biosynthesis of a large number of
secondary compounds such as anthocyanins, flavonoids and lignins. The high
levels of PAL are associated with the phenolic compounds accumulum in the
union of incompatible grafts. The objective of this work was to study the
expression and activity of PAL in different Prunus combinations, confirming or
not the possibility to use the PAL as a biochemical marker of graft
incompatibility. The study was conducted in the Chimarrita variety (Prunus
persica L. Batsch) grafted on Capdeboscq (Prunus persica L. Batsch), Tsukuba
1 (P. persica L. Batsch) and Umezeiro (P. mume Sieb. et Zucc.) rootstocks. The
growth evaluation indicated that ‘Chimarrita’ grafted in ‘Umezeiro’ showed
reduced growth, resulting in the death of some plants, while the other rootstocks
induced a vigorous growth on ‘Chimarrita’. The estimative of field determination
of compatibility constant (CC) indicates that ‘Chimarrita’/’Umezeiro’ combination
present a certain degree of incompatibility. The gene expression and activity of
PAL were higher in ‘Umezeiro’. According with the results had a high level of
incompatibility between ‘Chimarrita’ and ‘Umezeiro’. It was also noted that the
increase in gene expression and enzymatic activity of PAL can be used as a
biochemical marker to predict graft incompatibility in Prunus.
Keywords: growth analysis, phenylpropanoid pathway, enzymatic activity,
housekeeping.
61
5.3. Introdução
A enxertia é uma técnica amplamente utilizada na fruticultura moderna,
pela qual cultivar e porta-enxerto são unidos e formam uma nova planta.
Geralmente, tanto a cultivar quanto o porta-enxerto são pertencentes à mesma
espécie botânica, no entanto, quando são enxertadas espécies diferentes,
principalmente de gêneros distintos, são frequentes os problemas de
incompatibilidade de enxertia (Hartmann et al., 2002). A incompatibilidade é um
obstáculo
importante
no
desenvolvimento
de
novos
porta-enxertos,
especialmente em espécies frutíferas, onde enxertos incompatíveis podem
crescer vários anos sem nenhum sintoma externo (Errea & Felipe, 1993;
Hartmann et al., 2002).
A sequência normal de eventos para a formação do enxerto segue três
etapas básicas, que iniciam pela proliferação de células parenquimáticas de
ambos os componentes do enxerto, formando um tecido de calo que preenche
os
espaços
entre
cultivar
e
porta-enxerto;
posteriormente,
ocorre
a
diferenciação destas células parenquimáticas em novas células cambiais, que
ligam os câmbios da cultivar e do porta-enxerto; e por último, o novo câmbio se
diferencia em novos tecidos do xilema e floema, formando as novas conexões
vasculares (Hartmann et al., 2002). Entretanto, quando alguma destas etapas
não é cumprida, ocorre a incompatibilidade de enxertia.
Embora, para a maioria das combinações incompatíveis, a causa da
incompatibilidade não seja conhecida, vários autores associam níveis elevados
de compostos fenólicos a danos nas três etapas de formação do enxerto,
havendo um consenso de que diferenças no perfil fenólico de combinações
compatíveis e incompatíveis são um aspecto importante no processo de
incompatibilidade de enxertia (Wang & Kollmann, 1996; Hartmann et al., 2002;
Pina & Errea, 2008; Teles et al., 2009; Nocito et al., 2010; Zarrouk et al., 2010).
A principal origem dos compostos fenólicos nas plantas é a rota
fenilpropanóide, nesta rota, a enzima chave é a fenilalanina amônia-liase (PAL;
EC 4.3.1.24), que catalisa a desaminação da fenilalanina para a produção de
ácido trans-cinâmico, que posteriormente é convertido em ácido p-cumárico por
uma reação oxidativa catalisada pela cinamato 4-hidroxilase (C4H; EC
1.14.13.11) e que subsequentemente sofre uma tioesterificação ativada pela 4cumarato:CoA ligase (4CL; EC 6.2.1.12), produzindo o p-cumaroil CoA, que é
62
canalizado para a produção de flavonóides, antocianinas e ligninas (Dixon &
Paiva, 1995; Singh et al., 2009; Weitzel & Petersen, 2010; Neutelings, 2011).
Em combinações incompatíveis de calos da cultivar Moniqui (Prunus
armeniaca) com o porta-enxerto Marianna 2624 (Prunus munsoniana x Prunus
cerasifera), foi observado um elevado nível de transcrição da PAL associado ao
acúmulo de compostos fenólicos solúveis, como os flavonóides, porém, sem a
formação de lignina, indicando um aumento da concentração de compostos
fenólicos até um limiar prejudicial a compatibilidade de enxertia (Pina & Errea,
2008).
O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão e a atividade da PAL
em diferentes combinações de Prunus, confirmando ou não a possibilidade de
utilizar a PAL como indicador bioquímico de incompatibilidade de enxertia. Foi
estudado também o comportamento vegetativo das combinações a fim de
comprovar os diferentes graus de compatibilidade.
63
A cultivar de pêssego Chimarrita (P. persica L. Batsch) foi enxertada
sobre os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica L. Batsch), ‘Tsukuba 1’ (P.
persica L. Batsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. e Zucc.). O método de enxertia
foi o de gema ativa, realizado no verão de 2007. As plantas foram cultivadas a
campo no Centro Agropecuário da Palma na Universidade Federal de Pelotas,
Brasil. Amostras de casca foram coletadas dois anos após a enxertia, 5cm
acima e abaixo da união do enxerto. Todas as amostras foram imediatamente
congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC.
5.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia
A avaliação da compatibilidade consistiu de análise de crescimento,
índice de compatibilidade a campo (CC) e índice de sobrevivência. As variáveis
de crescimento foram: peso fresco do material de poda acumulado, área foliar
e diâmetro do tronco. O peso fresco do material de poda acumulado foi tomado
no primeiro e segundo ano após a enxertia. A área foliar foi avaliada no
segundo ano após a enxertia e o diâmetro do tronco foi medido durante o
primeiro, segundo e terceiro ano após a enxertia. A CC foi calculada de acordo
com a fórmula desenvolvida por Perraudine (1962): CC = [(C / A) + (C + A) /
2B] / 10, onde A: indica o diâmetro 5cm acima da união (cultivar); B: diâmetro
na união do enxerto e, C: diâmetro 5cm abaixo da união (porta-enxerto). Os
diâmetros do tronco empregados para os cálculos foram medidos no terceiro
ano após a enxertia.
5.4.3. Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA total foi isolado usando o protocolo CTAB adaptado por
Messias et al. (2010), no Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Clima
Temperado, Brasil. A concentração e a qualidade do RNA extraído foi medida
em um Nanodrop Spectrometer (Nanodrop 1000, Thermo Scientific) com
resultados indicando concentrações suficientes em todas as amostras e
qualidade variando de 1,90 e 2,10 (relação de absorção 260/280nm). A
integridade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1,0% com brometo
64
de etídio (EtBr). 1mg de RNA total foi empregado para a síntese de cDNA
utilizando o kit SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
5.4.4. Análise da expressão gênica
A análise da expressão gênica foi realizada no Laboratório de Biologia
Molecular do Departamento de Fruticultura do Centro de Investigación y
Tecnología Agroalimentaria de Aragón (C.I.T.A.), Espanha. Com base na
sequência de aminoácidos do pessegueiro no GDR (Genome Database of
Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e sua homologia com sequências de
genes de mesma função em Arabdopsis, foram desenhados primers
específicos para PAL1 e PAL2 de Prunus. A análise de expressão gênica foi
realizada por Real Time qRT-pcr, com os primers apresentados na Tabela 5.
As reações foram realizadas em um equipamento Applied Biosystems
7500/7500 Fast (Applied Biosystems) com um volume total de 25µL contendo:
12,5µL de SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5µL de cDNA
diluído (1,6ng µl-1), 0,75µl de cada primer (300 mM) e 6,0µl de água Milli-Q. O
protocolo foi idêntico para todos os conjuntos de primer: 95ºC por 10min,
seguido de 40 ciclos de 95ºC por 30s, 60ºC por 1min, 72ºC durante 1min e uma
extensão final de 72ºC por 10min. Posteriormente, um protocolo de dissociação
com gradiente de 95ºC por 15s, 60ºC por 1min e 95ºC por 15s. Os níveis de
expressão foram calculados pelo método Ct (cycle threshold). O ∆Ct ou Ct
normalizado foi obtido subtraindo valores Ct de cada gene alvo do Ct do gene
de referência, enquanto o ∆∆Ct foi calculado usando o Ct de amostras não
enxertadas.
5.4.5. Seleção do gene de referência
O gene de referência é o método mais comumente utilizado para a
normalização dos parâmetros internos sobre análise de expressão gênica em
Real Time. Como não existem estudos que indicam um gene de referência
específico para estudar a compatibilidade de enxertia em Prunus, foram
testados três genes utilizados para controle interno em estudos de expressão,
Actina, Translation Elongation Factor 2 (TEF2) e AT5G12240. Os genes foram
65
avaliados quanto a sua especificidade, presença de dímeros na curva de
dissociação, estabilidade e eficiência.
Os pares de primers foram testados por RT-PCR convencional e
eletroforese em gel de agarose 2,5% com EtBr para a verificação da
especificidade e do amplicon. A eficiência da Real Time qRT-pcr dos três
genes foi calculada usando dados brutos de fluorescência tomadas do 7500
System SDS Software (Applied Biosystems) e analisados no software
LinRegPCR, de acordo Ruijter et al. (2009). A análise da estabilidade foi
realizada pelo algoritmo NormFinder adaptado para Microsoft Excel, conforme
descrito por Andersen et al. (2004) e Tong et al. (2009). Os dados sobre os
pares de primers são apresentados nas Tabelas 5 e 6.
Tabela 5. Características dos primers PAL1, PAL2 e Actina. Pelotas, RS, 2012.
Símbolo
Sequências (5’-3’)
(1)
Temperatura (°C) Tamanh o (pb) Eficiência
R
2(1)
ATGAGGTGAAGCG
62
CATGGTG
85
1,941
0,999
CTATGGCAGCCAC
PAL1RqRT-Pp
62
TTGGGAA
AGGTCAAACGGAT
PAL2FqRT-Pp
58
GGTCAAC
85
1,974
0,999
ATTGCAGCCACCT
PAL2RqRT-Pp
60
GAGCTAT
TGAGGCTCCTCTC
Actina (forward)
62
AACCCTA
90
1,978
0,999
ATACATGGCAGGC
Actina (reverse)
58
ACATTGA
(1)
2
Real Time qRTpcr eficiência e o coeficiente de relação (R ) foram estimados através do
programa LinRegPCR de acordo com Ruijter et al. (2009).
PAL1FqRT-Pp
Tabela 6. Estabilidade dos genes de referencia Actina, AT5G12240 e TEF2.
Pelotas, RS, 2012.
Ordem de estabilidade
1º (melhor gene)
2º
3º
Sem grupos
Actina
AT5G12240
TEF2
Sete grupos
Actina
AT5G12240
TEF2
5.4.6. Atividade enzimática da PAL
A atividade da PAL foi determinada de acordo com os métodos
descritos por Hyodo & Yang (1971) e Hyodo et al. (1978), padronizados e
modificados para análise de casca de acordo com Campos et al. (2003). Para a
extração foram utilizados 500mg de tecido fresco de casca, macerados (±4°C),
66
em microtriturador em uma mistura de 4 mL de tampão borato de sódio 50mM
(pH 8,5)
contendo 25g L-1 de PVP 10 e 4mL L-1 de mercaptoetanol. Em
seguida foi realizada a filtragem do extrato bruto em papel Whatman nº 1. O
extrato foi centrifugado por 15min na velocidade de 6.000rpm e o sobrenadante
(extrato enzimático) foi filtrado em papel Whatman nº 1 e utilizado para análise
da atividade da PAL.
As leituras foram realizadas a 290nm em espectrofotômetro UV PC
Shimadzu. A atividade enzimática foi expressa em unidades definidas como a
quantidade de enzima que produz 1mM de ácido trans-cinâmico por minuto por
grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1).
5.4.7. Análise estatística
O delineamento experimental foi em blocos casualizados com quatro
repetições. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as
variáveis com diferença significativa (p<0,05) tiveram as médias comparadas
pelo teste de Tukey (α 0,05). Sendo a análise dos dados realizada através do
programa estatístico WinStat 2.11 (Machado & Conceição, 2003).
67
5.5. Resultados
Em relação às variáveis de crescimento, peso fresco do material de
poda e área foliar, a combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou resultados
inferiores em relação as outras duas combinações (‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ que, entretanto, não diferiram entre si (Tabela 7).
Quanto ao diâmetro do tronco da cultivar, no primeiro ano não houve diferença
significativa entre as combinações. Porém, a partir do segundo ano, a cultivar
‘Chimarrita’
apresentou
diâmetro
superior
quando
enxertada
sobre
‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. No porta-enxerto, o diâmetro de ‘Umezeiro’
também foi menor em comparação ao dos demais porta-enxertos a partir do
segundo ano. No entanto, no ponto de união do enxerto, ‘Capdeboscq’ teve
diâmetro inferior nos dois primeiros anos, mas no terceiro já não houve
diferença entre as combinações. A combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’
apresentou ainda um maior diâmetro do tronco do ponto de união em relação à
cultivar e ao porta-enxerto, fato que não ocorre nas demais combinações
(Figura 3).
O cálculo da CC indica a formação de dois grupos de compatibilidade.
Um
grupo
formado
pelas
combinações
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’
e
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, com grau elevado de compatibilidade e outro
composto pela combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, com menor nível de
compatibilidade.
A combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou ainda, um índice de
sobrevivência
de
90%,
sendo
inferior ao
obtido
pelas combinações
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, que ao longo de três anos,
tiveram um índice de sobrevivência de 100%.
68
Tabela 7. Análise de crescimento e compatibilidadde das combinações
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’.
Pelotas, RS, 2012.
Combinações*
Variáveis de crescimento e compatibilidade
‘Chimarrita/ ‘Chimarrita/ ‘Chimarrita/
Capdeboscq’ Tsukuba 1’ Umezeiro’
Massa fresca de poda (g)
2
Área foliar (cm )
Constante de compatibilidade a campo (CC)
Índice de sobrevivência (%)
Diâmetro do tronco
(cm)
4.095,5
a
14.411,8
a
4.519,5
a
14.578,6
a
1.659,0
b
7.538,3
b
10,9
a
100,0
a
10,9
a
100,0
a
10,5
b
90,0
b
a
9,4
a
22,9
a
37,9
a
Cultivar
1º ano
2º ano
3º ano
11,7
a
23,9
a
39,3
10,2
b
19,8
b
31,7
a
b
15,9
b
28, 3
a
44,1
a
União
1º ano
2º ano
3º ano
18,3
a
32,3
a
48,8
19,0
a
32,6
a
49,9
a
12,1
a
24,8
a
41,9
a
Porta-enxerto
1º ano
2º ano
3º ano
14,7
a
27,9
a
42,5
12,9
b
22,1
b
32,9
a
a
*valores seguidos de letras minúsculas iguais na linha, não diferem pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro.
(A)
(B)
(C)
Figura 3. Região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
5.5.2. Seleção do gene de referência
Todos os genes apresentaram boa especificidade pela presença de
uma única banda com o tamanho esperado e não foi observado a presença de
dímeros. A eficiência foi calculada usando dados brutos de fluorescência
analisados no software LinRegPCR e os resultados indicaram não haver
diferenças significativas entre Actina e os genes alvo, PAL1 e PAL2 (Tabela 5).
A análise de estabilidade foi realizada considerando duas situações. Na
primeira, os valores Ct foram agrupados em sete grupos relacionados com as
condições experimentais: não enxertados, ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (cultivar),
69
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (porta-enxerto), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (cultivar),
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (porta-enxerto), ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (cultivar) e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (porta-enxerto). Na segunda situação, não foram
considerados grupos. Em ambos os casos Actina foi o gene de referência com
a melhor estabilidade (Tabela 6). Desta forma, Actina foi o gene de referência
selecionado para a normalização dos dados deste estudo.
5.5.3. Expressão gênica de PAL1 e PAL2
As análises de expressão gênica indicaram que PAL1 e PAL2 foram
altamente
influenciadas
pelas
diferentes
combinações
(Figura
4).
A
combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou expressão de PAL1 e PAL2
superior a ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ tanto na cultivar
quanto no porta-enxerto. Na cultivar da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’
(combinação incompatível), PAL1 foi oito e cinco vezes mais expressa que em
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, respectivamente. No
porta-enxerto da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, PAL1 foi seis e três vezes
mais expressa que ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’,
respectivamente.
A expressão gênica de PAL2 segue a mesma tendência. Na cultivar da
combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ foi quinze vezes mais expressa que em
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e três vezes mais que ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’. Entre
os porta-enxertos, PAL2 foi três vezes mais expressa em ‘Umezeiro’ que
‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’.
Tanto PAL1 quanto PAL2 foram mais expressas na cultivar, e entre as
isoformas, PAL1 foi cerca de quatro vezes mais expressa que PAL2 (Figura 5).
Resultados que indicam haver na cultivar e no porta-enxerto da combinação
incompatível, um significativo incremento da expressão da PAL1 e PAL2, mas
especialmente da PAL1.
70
14
Expressão gênica relativa
12
10
PAL1 Cultivar
PAL2 Cultivar
PAL1 Porta-enxerto
PAL2 Porta-enxerto
8
6
4
2
0
'Capdeboscq''Tsukuba 1' 'Umezeiro'
Figura 4. Expressão gênica relativa diferencial de PAL1 e PAL2 na cultivar e no
porta-enxerto
das
combinações
5
4
3
2
1
0
PAL1
PAL2
Figura 5. Expressão gênica relativa global de PAL1 e PAL2. Pelotas, RS, 2012.
A atividade enzimática da PAL também foi significativamente
influenciada pelas diferenças de compatibilidade (Figura 6). Assim como no
estudo de expressão, a atividade da PAL foi superior no porta-enxerto
‘Umezeiro’ da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Neste porta-enxerto, a
atividade de PAL foi 26 e 32% maior que nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’ e
‘Tsukuba 1’, respectivamente.
71
Por outro lado, a atividade da PAL não diferiu entre ‘Chimarrita’
enxertada sobre os três porta-enxertos.
Comparando a atividade entre cultivar e porta-enxerto, apenas na
combinação ‘Chimarrita/Umezeiro’ houve diferença significativa, sendo que a
atividade no porta-enxerto foi 32% maior que na cultivar.
Pela análise de expressão se poderia supor que a atividade da PAL na
cultivar da combinação incompatível deveria ser superior a das demais, porém,
a elevada expressão gênica de PAL1 e PAL2 na copa dessa combinação não
foi revertida em atividade enzimática. Este efeito pode ser observado com mais
clareza na análise de correlação entre transcrição e atividade da PAL, no portaenxerto, com índices de 0,94 e 0,88 para PAL1 e PAL2, respectivamente
(Figura 7). Por outro lado, na cultivar, os índices de correlação foram baixos,
0,36 para PAL1 e 0,37 em PAL2 (Figura 8).
Atividade enzimática da PAL
1,4
1,2
Cultivar
Porta-enxerto
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
'Capdeboscq''Tsukuba 1' 'Umezeiro'
Figura 6. Atividade enzimática da PAL na cultivar e no porta-enxerto das
combinações
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012.
72
1,4
y = 0,822 + 0,0878x
y = 0,788 + 1,007x R = 0.88
R = 0.94
1,3
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0
1
2
3
4
6 0,0
5
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Expreção gênica da PAL2
Expressão gênica da PAL1
Figura 7. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e a atividade
enzimática
da
PAL
no
porta-enxerto
das
combinações
‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’.
Pelotas, RS, 2012.
1,1
y = 0,780 + 0,00823x R = 0.36
y = 0,783 + 0,0225x R = 0.37
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0
2
4
6
8
10
12
14
16 0
1
2
3
4
5
6
7
Figura 8. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e atividade
enzimática da PAL na cultivar das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012.
73
5.6. Discussão
5.6.1. Compatibilidade de enxertia
Pela análise conjunta dos parâmetros de crescimento, sobrevivência e
CC, foi constatado que a combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresenta um
elevado grau de incompatibilidade de enxertia. Segundo diversos autores, o
crescimento reduzido da cultivar e do porta-enxerto’, o desenvolvimento
pronunciado do tronco na região de união do enxerto e a menor CC da
combinação
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’,
são
sintomas
que
comprovam
a
incompatibilidade de enxertia entre os dois genótipos (Abolins, 2004; Rodrigues
et al., 2004; Fachinello et al., 2005; Gökbayrak et al., 2007; Aloni et al., 2010;
Martínez-Ballesta et al., 2010). Resultado que está de acordo com Teles et al.
(2009), que observaram o mesmo comportamento entre os referidos genótipos.
5.6.2. Gene de referência para o estudo da compatibilidade de
enxertia
Real Time é um método avançado de estudo de expressão gênica
(Radonic et al., 2004; Feng et al., 2012). Mas para sua correta utilização é
necessário um método de padronização preciso (Czechowski et al., 2005;
Ruijter et al., 2009; Wan et al., 2011). O gene de referência é o método mais
utilizado para normalizar dados obtidos por Real Time e controlar possíveis
erros experimentais na mensuração da expressão gênica (Tong et al., 2009;
Feng et al., 2012). No presente estudo, as condições experimentais que podem
influenciar a expressão de genes são: os diferentes genótipos e os níveis de
compatibilidade. Para o estudo de diferentes genótipos, tublin beta, RNA
polymerase II (RPII) e translation elongation factor 2 (TEF2) são os genes de
referência mais recomendados para a normalização de estudos em
pessegueiro (Tong et al., 2009). No entanto, ainda não foram realizados
estudos sobre genes de referência para a condição de diferentes níveis de
compatibilidade de enxertia. Por esta razão, foram testados Actina, TEF2 e
AT5G12240, todos já empregados em outros estudos envolvendo diversas
condições experimentais em pessegueiro (Radonic et al., 2004; Tong et al.,
2009; Jiménez et al., 2010).
74
Embora todos apresentem uma boa especificidade, eficiência e sem
presença de dímeros, Actina foi o gene que mostrou a melhor estabilidade para
a condição experimental apresentada, com diferentes níveis de compatibilidade
de enxertia. Com base nesses resultados, Actina foi o melhor gene de
referência para normalização de dados relacionados com o estudo de
compatibilidade em Prunus. Este resultado não corrobora com Tong et al.
(2009) e Jimenez et al. (2010), que sugerem TEF2 e AT5G12240 como gene
de referência no pêssego. No entanto, estes autores testaram outras condições
experimentais que não a compatibilidade de enxertia.
5.6.3. Perfil da expressão gênica de PAL1 e PAL2
A via fenilpropanóide, coordenada pela PAL, é responsável pela
síntese de diversos metabólitos secundários com funções importantes para as
plantas, especialmente pela resposta a diferentes formas de estresse. Pina &
Errea (2008), estudando uniões de calo de Prunus observaram uma abundante
expressão da PAL associada a altos teores de compostos fenólicos em uniões
incompatíveis.
Neste estudo, o perfil transcricional mostra um forte aumento da
expressão dos genes PAL1 e PAL2, tanto na cultivar quanto no porta-enxerto
da combinação incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). Por outro lado, os
enxertos compatíveis apresentaram níveis baixos de transcrição de ambas
isoformas. Resultados que indicam que a análise gênica da PAL pode ser um
indicador promissor para a avaliação da incompatibilidade de enxertia em
espécie de Prunus.
O aspecto que torna os genes PAL1 e PAL2 marcadores promissores
para o estudo de compatibilidade se devem ao papel fundamental que esta
enzima
desempenha
na
biossíntese
de
muitos
compostos
fenólicos.
Substâncias apontadas por Errea (1998) como potencialmente causadoras da
incompatibilidade de enxertia. Conforme descrito por esse autor, em todas as
fases de estabelecimento de enxerto de combinações incompatíveis podem ser
encontradas diferenças quantitativas e/ou qualitativas no perfil de compostos
fenólicos. Neste estudo, houve um desequilíbrio quantitativo do perfil de
compostos fenólicos, mostrado pela elevada transcrição de PAL1 e PAL2 na
cultivar e no porta-enxerto da combinação incompatível (‘P. persica x P.
75
mume’). Resultados semelhantes foram relatados por outros autores em outras
combinações, como por exemplo, em ‘P. cerasifera’ x ‘P. salicina’ (Rodrigues et
al., 2001); ‘P. armeniaca’ x ‘P. persica’ (Usenik, et al., 2006); ‘P. avium’ x ‘P.
cerasus’ (Gebhardt & Feucht, 1982;. Treutter et al., 1986); ‘P. persica’ x ‘P.
tomentosa’ (Salvatierra et al., 1999); ‘P. armeniaca’ x ‘P. munsoniana’ x ‘P.
ceracifera’ (Pina & Errea, 2008) e ‘P. armeniaca’ combinado com outras
espécies de Prunus (Errea et al., 1994). O grande número de combinações de
Prunus com alterações quantitativas no perfil de compostos fenólicos indica um
modelo consistente para incompatibilidade do enxerto.
Ambos,
PAL1
e PAL2 apresentaram aumento
de
transcrição
relacionado à incompatibilidade, mas, cada gene tem um padrão distinto de
magnitude de mudanças. Comparando a expressão de PAL1 e PAL2 na
combinação incompatível e na expressão gênica global de PAL é evidente que
PAL1 foi mais expressa que PAL2. Portanto, além de diferenças quantitativas,
também podem estar ocorrendo diferenças qualitativas entre os tipos de
compostos fenólicos formados.
Estudos relatam que PAL1 e PAL2 têm padrões similares de expressão
e de desenvolvimento em tecidos específicos (Fukasawa-Akada et al., 1996),
mas, normalmente PAL1 e PAL2 estão filogeneticamente separados e talvez
sejam reguladas por diferentes mecanismos de controle do desenvolvimento
(Kumar & Ellis, 2001), o que pode induzir funções distintas.
No entanto, embora possam desempenhar funções diferentes, vários
autores sugerem que ambos são importantes para o processo de lignificação
(Oh et al., 2003; Raes et al., 2003; Rohde et al., 2004) e, consequentemente,
desempenham um papel importante no sucesso da enxertia. A lignificação
pode ser o principal evento para a formação de uma união sólida (Errea, 1998;
Buchloh, 1962), de modo que nos enxertos incompatíveis a lignificação ocorre
dentro de áreas isoladas da medula e nenhuma conexão vascular é observada
(Gebhardt & Goldbach, 1988).
Até o momento, a hipótese mais aceita para a incompatibilidade de
enxertia em pessegueiro é a do tipo ‘translocada’, (Herrero, 1951). Mas os
resultados
apresentados
neste
trabalho
indicam
a
ocorrência
da
incompatibilidade ‘localizada’ ou mesmo uma associação das duas formas. A
descrição dos sintomas de incompatibilidade ‘localizada’ segundo alguns
76
autores, concorda com esta proposição (Errea & Felipe, 1993; Errea, 1994;
Zarrouk et al., 2006).
As evidências mostradas neste trabalho sugerem, ainda, que os genes
PAL1 e PAL2, fortemente expressos na combinação incompatível, podem estar
associados a um desequilíbrio quantitativo ou qualitativo da biossíntese dos
compostos fenólicos na interface do enxerto, causando problemas na
biossíntese
de
alguns
compostos,
como
a
lignina
e,
induzindo
a
incompatibilidade de enxertia.
5.6.4. Correlação entre transcrição e atividade da PAL
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a atividade da PAL
foi sensível as diferenças de compatibilidade. A análise no tecido da casca da
cultivar e do porta-enxerto indica um forte aumento da atividade desta enzima
no porta-enxerto da combinação incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). No
entanto, não foram verificadas diferenças significativas de atividade na cultivar
(Figura 8). Por outro lado, no porta-enxerto essa correlação foi alta,
corroborando com Olsen et al. (2008), que também observaram uma elevada
correlação entre transcrição e atividade enzimática.
Estes resultados indicam que, na cultivar da combinação incompatível,
apesar de haver alta transcrição da PAL, por alguma razão, não se refletiu em
atividade enzimática. De acordo com Achnine et al. (2004), isso pode ocorrer
devido a canalização metabólica associada a complexos de membrana que
abrigam isoformas específicas da PAL e, alterações no metabolismo resultante
da superexpressão de uma isoforma da enzima pode nem sempre se refletir
simplesmente em aumento quantitativo na atividade enzimática ou numa
alteração qualitativa do padrão associado às isoformas com consequências
cinéticas. Mas, os mesmos autores sugerem que mais trabalhos são
necessários para determinar se as relações entre PAL1 e PAL2 diferem
durante o desenvolvimento ou em resposta a estímulos ambientais, e se isso
pode trazer consequências metabólicas independentes do nível geral de
atividade da PAL.
De uma forma geral, não está claro se a maior expressão e atividade
da PAL é causa da incompatibilidade de enxertia ou uma resposta ao estresse
causado pela incompatibilidade gerada por outro mecanismo. Desta forma, são
77
expostas duas hipóteses para estudos posteriores: A) A maior expressão de
PAL1 e PAL2 no porta-enxerto da combinação incompatível é responsável pelo
desequilíbrio quantitativo ou qualitativo na produção de compostos fenólicos,
causando a incompatibilidade de enxertia. B) A expressão diferencial de PAL1
e PAL2 na combinação incompatível é um reflexo do estresse gerado pelo
verdadeiro agente causador, ainda desconhecido.
78
5.7. Conclusões
Houve um aumento de transcrição e atividade da PAL em combinações
incompatíveis.
A PAL pode ser empregada como um marcador viável deste fenômeno
em Prunus.
Com
base
no
comportamento
vegetativo
apresentado
pelas
combinações neste estudo, a enxertia da cultivar ‘Chimarrita’ sobre o portaenxerto ‘Umezeiro’ caracterizou-se como incompatível, ao contrário das
combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, que foram
compatíveis.
79
5.8. Referencias bibliográficas
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84
6. Artigo 2: Cianogênese, a causa da incompatibilidade de enxertia
em Prunus
6.1. Resumo
A cianogênese é o único mecanismo de incompatibilidade conhecido em
frutíferas. Neste mecanismo o cianeto liberado pela hidrólise dos glicosídeos
cianogênicos amigdalina e prunasina causa lesões na interface do enxerto,
obstruindo totalmente ou parcialmente o sistema vascular. O objetivo deste
trabalho foi avaliar o potencial cianogênico de cultivares e porta-enxertos em
combinações compatíveis e incompatíveis de Prunus, assim como, confirmar
ou refutar a utilização dos glicosídeos cianogênicos como marcadores da
incompatibilidade de enxertia. O trabalho foi realizado em plantas das cultivares
Chimarrita (Prunus persica L. Batsch) e Maciel (P. persica L. Batsch) enxertada
sobre os porta-enxertos Capdeboscq (P. persica L. Batsch), Tsukuba 1 (P.
persica L. Batsch) e Umezeiro (P. mume Sieb. et Zucc.). Foram realizadas
estimativas do teor de clorofila (índice SPAD) e análises macroscópicas da
anatomia interna na interface dos enxertos, além da determinação do conteúdo
de glicosídeos cianogênicos e atividade da enzima fenilalanina amônia-liase
(PAL).
A
partir
dos
resultados,
conclue-se
que,
as
combinações
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel’/‘Umezeiro’ foram incompatíveis e que o teor
de
prunasina
pode
ser
utilizado
como
marcador
bioquímico
da
incompatibilidade de enxertia.
Palavras-chave:
compatibilidade
fenilalanina amônia-liase.
de
enxertia,
prunasina,
amigdalina,
85
Cyanogenesis, the cause of graft incompatibility in Prunus
6.2. Abstract
Cyanogenesis is the only incompatibility mechanism known on fruits species. In
this mechanism the cyanide released by the hydrolysis of cyanogenic
glycosides amygdalin and prunasin causes lesions in the graft interface that
block totaly or partially the vascular system. The objective of this study was to
investigate the cyanogenic potential of varieties and rootstocks in the
compatible and incompatible of Prunus combinations, as well as, to confirm or
to refute the use of cyanogenic glycosides as markers of graft incompatibility.
The work was conducted in Chimarrita (Prunus persica L. Batsch) and Maciel
varieties (Prunus persica L. Batsch) grafted in the Capdebosc (Prunus persica
L. Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L. Batsch) and Umezeiro (P. mume Sieb. et
Zucc.) rootstocks. Were made estimates of chlorophyll content (SPAD index),
macroscopic analysis of anatomy internal in the interface of the grafts,
determination of cyanogenic glycosides content and activity enzymatic of
phenylalanine
ammonia-lyase
(PAL).
The
results
indicate
that
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ and ‘Maciel/Umezeiro’ combinations are incompatibles
and the level of prunasina can be used as a biochemical marker of graft
incompatibility.
Keywords: graft compatibility, prunasin, amygdalin, phenylalanine ammonialyase.
86
6.3. Introdução
Cianogênese é um processo pelo qual as plantas e outros organismos
liberam cianeto, processo que ocorre através da hidrólise dos glicosídeos
cianogênicos (GCs) (Conn, 1980). Os GCs são compostos presentes em cerca
de 2500 espécies de plantas, pertencentes a mais de 130 famílias, com
destaque para as rosaceas (Buhrmester et al., 2000; Vetter, 2000; Neilson et
al., 2011). Em geral, as plantas cianogênicas utilizam essa capacidade como
mecanismo natural de defesa contra herbívoros e patógenos (Gleadow &
Woodrow, 2002; Zagrobelny & Moller, 2011), entretanto, a produção de cianeto
também é responsável pela incompatibilidade de enxertia entre algumas
espécies frutíferas (Gur et al., 1973; Moore, 1986; Nocito et al., 2010).
A incompatibilidade de enxertia pode ser descrita como a falta de
afinidade entre cultivar e porta-enxerto, havendo um desenvolvimento anormal
do sistema vascular no ponto de enxertia (Mosse, 1958). Em plantas
superiores, os poucos casos de incompatibilidade conhecidos tem como causa
os GCs amigdalina e prunasina, que nestes casos, estão presentes em
concentrações distintas na cultivar e no porta-enxerto (Gur et al., 1968; Gur &
Blum, 1973, Moore, 1986). O processo de incompatibilidade por cianogênese
inicia com a hidrólise da amigdalina pela β-glicosidase, produzindo uma
molécula de glicose e outra de prunasina, na sequência a prunasina também
sofre hidrólise da β-glicosidase formando outra molécula de glicose e αhidroxinitrila, que se dissocia formando cianeto e benzaldeído (Conn, 1980).
Desta forma, quando é realizada a enxertia entre genótipos com diferenças
elevadas na concentração destes GCs, o cianeto produzido pelo genótipo de
maior potencial cianogênico provoca danos oxidativos que podem levar a morte
de células no genótipo de menor potencial (Nocito et al., 2010). Nos casos
onde este mecanismo de incompatibilidade está presente, as diferenças
hormonais (Aloni et al., 2010), na composição de carboidratos (MartínezBallesta, 2010; Olmstead et al., 2010) e de fenóis (Errea, 1998; Rodrigues et
al., 2002; Pina & Errea, 2008; Zarrouk et al., 2010), verificadas por diversos
autores entre combinações compatíveis e incompatíves são na verdade um
efeito.
A hipótese proposta por este trabalho é de que os GCs amigdalina e
prunasina são responsáveis pela liberação de cianeto na união do enxerto,
87
causando descontinuidade vascular e o enfraquecimento da união de
combinações interespecíficas, resultando em incompatibilidade de enxertia.
Desta forma, o presente estudo tem como objetivos principais, avaliar o
potencial cianogênico de cultivares e porta-enxertos em combinações
compatíveis e incompatíveis de Prunus, assim como, confirmar ou refutar a
utilização dos GCs como marcadores da incompatibilidade de enxertia. Além
de verificar uma possível relação da cianogênese com a atividade da PAL em
combinações compatíveis e incompatíveis.
88
O experimento foi conduzido a campo, no Centro Agropecuário da
Palma, pertencente à Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (FAEM) da
Universidade Federal de Pelotas (UFPel), município de Capão do Leão, RS,
Brasil.
A enxertia foi realizada em dezembro de 2007 e o pomar implantado
em outubro de 2008, em uma densidade de 1333 plantas por hectare com
espaçamento 5 x 1,5m. Sendo o pomar conduzido em “Y” e conduzido
conforme as normas da Produção Integrada de Pêssegos (Fachinello et al.,
2003).
As cultivares ‘Chimarrita’ (P. persica L. Bastsch) e ‘Maciel’ (P. persica
L. Bastsch) foram enxertadas sobre os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica
L. Bastsch), ‘Tsukuba 1’ (P. persica L. Bastsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. et
Zucc.). Sendo os porta-enxertos obtidos por sementes originadas do banco de
germoplasmas da FAEM/UFPel.
A amostragem para as análises bioquímicas foram realizadas em duas
épocas, inverno de 2008 e verão de 2009. Para as avaliações da atividade da
PAL foram coletadas amostras apenas na segunda época. Foi amostrado o
tecido da casca da cultivar (5cm acima da união) e do porta-enxerto (5cm
abaixo da união). As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio
líquido e armazenadas a -80ºC até o momento das análises.
A fim de se especificar o tipo e o grau de compatibilidade entre as
combinações propostas, foi realizado um estudo para avaliar a manifestação
das incompatibilidades ‘translocada’ e ‘localizada’.
A diagnose da incompatibilidade ‘translocada’ foi realizada através da
concentração da clorofila por área de folha, estimada pelo índice SPAD
(Moreno et al., 1993; Zarrouk, 2006). A estimativa foi feita a campo, usando um
SPADA 502 meter (Minolta), sendo realizadas duas medidas (lado superior e
inferior) em 10 folhas de cada planta, sendo avaliadas três plantas de cada
parcela, totalizando 30 folhas por parcela. As medidas foram realizadas no
89
verão de 2011, aproximadamente 150 dias após a plena floração. Quanto
maior o grau de incompatibilidade ‘translocada’ menor será o índice SPAD
(Moreno et al., 1993).
Já a incompatibilidade ‘localizada’ foi avaliada pela análise anatômica
interna e externa da região de união dos enxertos, conforme sugerido por
Mosse & Herreo (1951). O grau de compatibilidade ‘localizada’ das
combinações estudadas foi avaliado na região da união do enxerto, três anos e
meio após a enxertia, através das classes (A, B, C, D e E) propostas por Mosse
& Herreo (1951). As classes correspondem aos seguintes níveis de
compatibilidade: A: união perfeita, a linha da união não é visível; B: boa união,
a linha de união na casca e no lenho são continuas, embora no lenho seja
muitas vezes visível devido a excessiva formação de raias; C: união com
descontinuidade na casca, os tecidos da casca do porta-enxerto e da cultivar
são separados por uma camada marrom escura com aparência de cortiça; D:
uniões com descontinuidade vascular, os tecidos do lenho do porta-enxerto e
da cultivar estão separados, por outro lado os tecidos da casca seguem como
na classe C; e E: quando ocorre a quebra da união no pomar ou viveiro. As
classes A, B e C, são consideradas compatíveis, pois não prejudicam a
resistência mecânica, entretanto as classes D e E são incompatíveis, pois
podem romper-se por dano mecânico ou ação do vento (Herrero, 1962).
6.4.3. Determinação da atividade da PAL
Embrapa Clima Temperado em Pelotas, RS, Brasil, no ano de 2010. A
atividade de PAL foi determinada de acordo com as metodologias descritas por
Hyodo & Yang, (1971) e Hyodo et al., (1978), padronizada para análise de
casca com modificações de acordo com Campos et al. (2003).
Para a extração foram utilizados 500mg de tecido fresco de casca, que
foram macerados em banho de gelo (±4°C), com o auxí lio de um
microtriturador em uma mistura de 4mL de tampão borato de sódio 50mM (pH
8,5) contendo 25g L-1 de PVP 10 e 4mL L-1 de mercaptoetanol. Em seguida foi
realizada a filtração do extrato bruto em papel Whatman nº 1. O extrato bruto
foi centrifugado por 15min na velocidade de 6.000rpm e o sobrenadante
90
(extrato enzimático) foi filtrado em papel Whatman nº 1 e utilizado para análise
da atividade da PAL.
As leituras foram realizadas a 290nm em espectrofotômetro UV PC
Shimadzu. A atividade enzimática foi expressa em unidades que foram
definidas como a quantidade de enzima que produz 1mM de ácido transcinâmico por minuto por grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1).
6.4.4. Determinação da concentração de GCs
Embrapa Clima Temperado em Pelotas, RS, Brasil, no ano de 2011. No
momento da coleta as amostras foram imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido e logo após armazenadas a temperatura de -80ºC.
Posteriormente, passaram pelo processo de liofilização e foram armazenadas
em tubos plásticos até a realização das análises.
Foram utilizados padrões prunasina e amigdalina (Sigma-Aldrich),
carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol (Vetec), específicos para HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). A água utilizada foi obtida empregandose o sistema Milli-Q de purificação (Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1µm.
A extração foi realizada em 500mg de amostra, com 8mL de metanol e
2000mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16
horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a
3000rpm durante 20min e o sobrenadante foi filtrado a vácuo em filtro de nylon
0,1µm. Do total filtrado, 20µL foram submetidos à análise cromatográfica.
analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6mm, 4µm) e pré-coluna equivalente, mantidas
a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-met anol (60:40; v/v) com fluxo
de 1,3mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254nm. Os
resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca.
A separação cromatográfica dos GCs amigdalina e prunasina foi
realizada com sucesso, sendo obtidos quatro picos: Pico 1: água (1,16min),
Pico 2: metanol (1,38min), Pico 3: amigdalina (2,44min) e Pico 4: prunasina
(3,44min). Os dois primeiros são referentes à fase móvel e os dois últimos aos
GCs (Figura 9).
91
[mV]
3,44 Prunasina 4
2,44 Amigdalina 3
10
1,38 Metanol 2
20
1,16 Água 1
Voltage
30
0
0
1
2
3
Time
4
[min.]
Figura 9. Perfil cromatográfico padrão obtido por HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina.
Condições cromatográficas: coluna de fase reversa Inertsil ODS-3 (150 x
4,6mm, 4µm) acoplada a uma coluna de guarda equivalente. Fase móvel: 60%
água (Milli-Q) e 40% metanol (grau HPLC) (v/v). Temperatura de 25°C, fluxo de
1,3mL min-1, volume de injeção de 20µL e detecção em 254nm. Pico 1: água;
Pico 2: metanol; Pico 3: amigdalina e Pico 4: prunasina. Pelotas, RS, 2012.
O delineamento experimental para a análise dos GCs foi em blocos
casualizados, com quatro repetições, duas cultivares, três porta-enxertos, duas
porções do enxerto e duas épocas, em um esquema fatorial (2x3x2x2). A
atividade da PAL também segue um esquema fatorial (2x3x2), com quatro
repetições, porém, não foi contemplado o fator época.
5% de probabilidade de erro. As análises foram realizadas através do programa
estatístico WinStat versão 2.11 (Machado & Conceição, 2003).
92
6.5. Resultados
Não foram constatadas diferenças significativas entre o índice SPAD
das seis combinações estudadas, o que indica a ausência de incompatibilidade
do tipo ‘translocada’ (Tabela 8). Por outro lado, a avaliação macroscópica
anatômica do ponto de união dos enxertos aponta a existência de
incompatibilidade ‘localizada’ nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e
‘Maciel’/‘Umezeiro’, nas quais, pode-se observar uma clara descontinuidade
vascular na região de união do enxerto (Figuras 10C, 10F e 11), fato que as
classifica como incompatíveis da classe D (Herrero & Mosse, 1951). Outro
sintoma evidente é a desproporcionalidade do diâmetro da região de união do
enxerto em relação a cultivar e o porta-enxerto, sintoma clássico de
incompatibilidade de enxertia (Rodrigues et al., 2004; Fachinello et al., 2005).
Outros aspectos negativos observados a campo em relação a essas
combinações foram à baixa resistência mecânica e a morte de plantas quando
submetidas a situações de estresse, como déficit hídrico e encharcamento
(dados não apresentados).
Situação oposta pode ser observada entre ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Maciel/Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Maciel/Tsukuba 1’. Estas
combinações apresentam uma união vascular continua entre cultivar e portaenxerto, não havendo sintomas de descontinuidade vascular em nenhum nível
(Figura 10). Conforme os critérios de Mosse & Herreo (1951) essas quatro
combinações pertencem à classe A, ou seja, apresentam uma união perfeita.
Tabela 8. Identificação dos tipos de incompatibilidade ‘translocada’, pelo índice
SPAD e ‘localizada’ pela avaliação anatomia da união conforme Herrero &
Mosse (1951).
Combinações
Incompatibilidade ‘translocada’
ns
Incompatibilidade ‘localizada’
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’
37,05
ns
37,05
ns
37,59
A
A
D
‘Maciel/Capdeboscq’
36,28
ns
A
‘Maciel/Tsukuba 1’
36,67
ns
A
37,64
ns
D
‘Maciel/Umezeiro’
ns
Diferenças não significativas na coluna de cada cultivar, pelo teste de Tukey ao nível de
significância de 5 %. A: união perfeita; B: união boa; C: união com descontinuidade na casca;
D: união com descontinuidade na casca e lenho; E: quebra da união.
93
(A)
(D)
(B)
(E)
(C)
(F)
Figura 10. Corte macroscópico longitudional interno da região de união das
combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B),
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C), ‘Maciel/Capdeboscq’ (D), ‘Maciel/Tsukuba 1’ (E),
Maciel/Umezeiro (F), três anos e meio após a enxertia. Pelotas, RS, 2012.
94
Figura 11. Corte macroscópico da região de união do enxerto (combinação
'Maciel/Umezeiro') com destaque para a linha de descontinuidade vascular.
Pelotas, RS, 2012.
95
6.5.2. Concentração dos GCs
No inverno as concentrações de amigdalina foram superiores as do
verão, enquanto, entre as cultivares, Chimarrita teve maior concentração que
Maciel. Entretanto, as diferentes combinações avaliadas não induziram
diferenças significativas na concentração de amigdalina (Figura 12A).
Mas, comparando a concentração de amigdalina entre os portaenxertos não enxertados (Figura 12B), se observa uma maior concentração de
amigdalina
em
‘Umezeiro’,
caracterizado
como
incompatível.
Esta
concentração foi 44% superior a encontrada em ‘Capdeboscq’ e 56% superior
a ‘Tsukuba 1’. Comparando a concentração de amigdalina da cultivar e do
porta-enxerto de cada combinação, não houve diferença significativa (Tabela
10).
Tabela 9. Concentração (mg g-1) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e
prunasina nas diferentes épocas, cultivares e porções do enxerto. Pelotas-RS,
2012.
Glicosídeo
cianogênico
-1
Amigdalina (mg g )
-1
Prunasina (mg g )
Época
Inverno Verão
a
b
26,07
17,30
a
b
43,26
38,70
Cultivares
Chimarrita Maciel
a
b
24,16
19,21
a
a
40,26
41,70
Porção do enxerto
Cultivar
Porta-enxerto
a
a
19,38
23,99
b
a
35,66
46,30
* Valores seguidos de letras minúsculas iguais na linha, dentro de cada fator, não diferem pelo teste de Tukey a 5 % de
probabilidade de erro.
O estudo das concentrações de prunasina aponta um efeito diferencial
significativo entre as épocas, porções do enxerto e porta-enxertos, além de
interação entre porções do enxerto e porta-enxertos (Tabela 9).
Entre as épocas, as maiores concentrações de prunasina foram obtidas
no inverno, 11% superiores às do verão. Comparando as porções do enxerto,
os teores foram em geral 26% superiores no porta-enxerto em relação à
cultivar.
Entre todas as combinações estudadas, não houve diferença
significativa entre os teores de prunasina na cultivar. No entanto, nos portaenxertos, foi constatada uma concentração altamente superior de prunasina em
‘Umezeiro’, diferença de 118% em relação à concentração observada em
‘Capdeboscq’ e 121% em relação à ‘Tsukuba 1’ (Figura 12C).
96
Nos porta-enxertos não enxertados, a concentração de prunasina
também foi superior em ‘Umezeiro’. No entanto, com diferenças menores em
relação ao observado quando este foi enxertado (Figura 12B).
A Tabela 10 apresenta a diferença de concentração de amigdalina e
prunasina na cultivar em relação ao porta-enxerto de cada combinação. Esses
dados indicam que nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, a cultivar
Chimarrita apresentou uma concentração de prunasina 31,55mg g-1 ou 94,37%
menor
que
o
porta-enxerto
Umezeiro.
Em
relação
à
combinação
‘Maciel’/‘Umezeiro’, essa diferença é ainda maior, ou seja, ‘Maciel’ teve uma
concentração de prunasina, 114,62% menor que ‘Umezeiro’.
80
80
Cultivar
Porta-enxerto
(C)
60
60
40
40
20
20
-1
01,4
Cultivar
Porta-enxerto
(D)
1,2
-1
(B)
-1
-1
Amigdalina
Prunasina
Atividade da PAL (µmol min g )
800
Glicosideos cianogênicos (mg g )
Prunasina (mg g )
(A)
-1
Amigdalina (mg g )
Cultivar
Porta-enxerto
60
1,0
0,8
40
0,6
0,4
20
0,2
0
0,0
'Capbeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro'
'Capbeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro'
Figura 12. Concentração dos glicosídeos cianogênicos (mg g-1) e atividade da
fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol min-1 g-1) nos porta-enxertos e nas
cultivares estudadas. A: Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina no
tecido da casca da cultivar e do porta-enxerto das combinações estudadas; B:
Concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina no tecido
da casca dos porta-enxertos, não enxertados; C: Concentração do glicosídeo
cianogênico prunasina no tecido da casca da cultivar e do porta-enxerto das
combinações estudadas; D: Atividade da fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol
min-1 g-1). Pelotas, RS, 2012.
97
Tabela 10. Diferença entre a concentração dos glicosídeos cianogênicos
amigdalina e prunasina encontradas nas cultivares e nos porta-enxertos das
combinações estudadas. Pelotas, RS, 2012.
Cultivar
Glicosídeo
cianogênico
Amigdalina
Prunasina
Porta-enxerto
‘Chimarrita’
-1
‘Capdeboscq’
‘Tsukuba 1’
‘Umezeiro’
‘Capdeboscq’
‘Tsukuba 1’
‘Umezeiro’
mg g
a
3,77
a
-6,16
a
-8,11
a
4,26
a
0,11
b
-31,55
%
a
5,37
a
-46,00
a
-41,12
a
-11,37
a
9,25
b
-94,37
‘Maciel’
-1
mg g
a
-4,20
a
-1,62
a
11,32
a
0,82
a
1,07
b
-38,76
%
a
-12,12
a
-44,12
a
-73,87
a
1,25
a
-3,87
b
-114,62
*
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na coluna, dentro de cada glicosídeo cianogênico, não diferem pelo
teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro.
6.5.3. Atividade da PAL
Principal enzima da rota fenilpropanóide, sendo responsável pela
biossíntese de um grande número de compostos fenólicos, a atividade da PAL
não diferiu entre cultivares. Porém, entre os porta-enxertos, ‘Umezeiro’ teve
atividade 26% e 32% superior a ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba1’, respectivamente
(Figura 12D).
6.5.4. Correlação entre prunasina e atividade da PAL
Tendo em vista que tanto a prunasina quanto a PAL apresentaram uma
relação significativa com a incompatibilidade manifestada neste experimento,
foi realizado um estudo de correlação entre ambos.
Nas combinações compatíveis, o coeficiente de correlação foi
extremamente baixo (R = 0,01), indicando não haver relação entre as variáveis
(Figura 13A). Mas, nas combinações incompatíveis, foi constatada uma
correlação significativa (R = 0,87) entre a concentração de prunasina e a
atividade da PAL (Figura 13B).
98
1,3
y = 0,876 - 0,000269x R = 0,01
(B)
(p < 0,001)
-1
-1
Atividade da PAL (µmol min g )
y = 0,628 + 0,00815x R = 0,87
(A)
(p < 0,95)
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
20
25
30
35
40
-1
Prunasina (mg g )
45
20
40
60
80
100
-1
Prunasina (mg g )
Figura 13. Correlação entre a concentração de prunasina e a atividade da
fenilalanina amônia-liase (PAL) nas combinações compatíveis (A) e
incompatíveis (B). Pelotas, RS, 2012.
99
6.6. Discussão
Os resultados apresentados neste trabalho indicam que o porta-enxerto
Umezeiro (P. mume) é incompatível com as cultivares Chimarrita (P. persica) e
Maciel (P. persica), corroborando com Teles et al. (2009), que estudando a
enxertia entre as mesmas espécies, constaram elevada incompatibilidade, não
indicando sua utilização. Por outro lado, em estudos anteriores, Campo
Dall’Orto et al. (1992), concluíram que o grau de incompatibilidade apresentado
entre ‘Umezeiro’ e cultivares de pessegueiro não é total, sendo possível seu
aproveitamento como indutor de nanismo visando o adensamento de pomares,
ponto de vista apoiado por Mayer et al. (2006). No entanto, é importante
salientar que, embora a incompatibilidade entre ‘Umezeiro’ (P. mume) e
pessegueiro (P. persica) não seja total, há um risco significativo na sua
recomendação, uma vez que o grau de incompatibilidade observado nas
combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel’/‘Umezeiro’ foi elevado, podendo
gerar prejuízos aos produtores ao longo dos anos (Hartmann et al., 2002) e em
situações em que as plantas estão sujeitas a alguma forma de estresse, como
o déficit hídrico, pode ocorrer morte de plantas.
Entretanto, nas combinações compatíveis, ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, ‘Maciel/Capdeboscq’ e ‘Maciel/Tsukuba 1’ não foi
constatado linha parenquimática no lenho, fato que garante uma união
mecanicamente forte (Moreno et al., 1995). Sendo que, combinações que
mantêm essa característica até dois anos após a enxertia podem ser
recomendadas com segurança para o cultivo comercial (Herrero, 1951; Mosse,
1962).
O
estudo
de
compatibilidade
que
apontou
a
ocorrência
da
incompatibilidade ‘localizada’ nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e
‘Maciel/Umezeiro’ não corrobora com trabalhos anteriores, que indicavam de
forma geral a ocorrência de incompatibilidade ‘translocada’ (Herrero, 1951;
Salesses & Alkai, 1984). No entanto, à medida que se passou a utilizar novas
espécies como porta-enxertos para pessegueiro, além da ameixeira, também
se passou a observar a incompatibilidade ‘localizada’ em alguns casos (Errea
et al., 1994; Ermel et al., 1999). Alguns autores observaram ainda, que
100
dependendo das espécies combinadas, pode haver a coexistência de ambos
os tipos, como foi constatado por exemplo, entre cultivares de nectarina
enxertadas sobre ameixeira (Moreno et al., 1995; Zarrouk et al. 2006).
6.6.2. Diferenças bioquímicas entre combinações compatíveis e
incompatíveis
Nas combinações avaliadas, não foi observado relação entre a
concentração de amigdalina e a incompatibilidade de enxertia. Segundo Moore
(1986), a enxertia entre um genótipo com alta concentração deste GC com
outro de baixa concentração pode resultar em uma combinação incompatível.
Mas, como tal diferença não foi constatada, se poderia considerar que a
amigdalina não participa do processo de incompatibilidade. Entretanto, a
determinação dos níveis de amigdalina nos porta-enxertos não enxertados
revela uma concentração maior deste GC justamente em ‘Umezeiro’, portaenxerto caracterizado como incompatível. Esse fato, associado à concentração
elevada de prunasina em ‘Umezeiro’ enxertado, sugere que o processo de
enxertia pode estar desencadeando a hidrólise da amigdalina, convertendo-a a
prunasina e por isso não foram constatadas diferenças de concentrações da
amigdalina entre as combinações (Conn, 1994; Vetter, 2000; Zagrobelny et al.,
2004). Além disso, indica que o metabolismo dos GCs está ativo no sentido da
cianogênese, ou seja, da produção de cianeto.
Embora a amigdalina possa estar envolvida no processo de
incompatibilidade de enxertia, neste estudo o GC que parece estar associado
de forma direta com esse fenômeno, em todos os aspectos, é a prunasina. Sua
relação com a incompatibilidade de enxertia começa a ser evidente nas
diferenças de concentração entre os porta-enxertos não enxertados. Neste
caso, ‘Umezeiro’ já apresenta uma concentração de prunasina cerca de 50%
superior à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. Essa elevada capacidade cianogênica
de ‘Umezeiro’ já havia sido destacada por Nanda et al. (2005), que identificou
neste genótipo uma nova enzima da família das hidroxilitrila-liases, responsável
pela última etapa de liberação do cianeto. Entretanto, essa relação fica ainda
mais evidente nas combinações, onde a diferença nos níveis de prunasina é
ainda maior em ‘Umezeiro’, com relação à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’,
chegando a valores superiores a 100%.
101
Porém, o papel da prunasina neste fenômeno fica claro quando se
compara o teor da cultivar com o do porta-enxerto em cada combinação
(Tabela 10). As cultivares enxertadas em ‘Umezeiro’ apresentam um teor de
prunasina muito inferior ao encontrado neste porta-enxerto. Fato que não
ocorre em relação à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’, que integram as combinações
compatíveis e apresentam teores de prunasina semelhantes às cultivares
enxertadas sobre eles.
O elevado potencial cianogênico de ‘Umezeiro’ em relação às
cultivares de pessegueiro é a possível causa dessa incompatibilidade de
enxertia. Teles et al. (2009), já destacavam essa possibilidade quando
constataram combinações altamente incompatíveis entre as mesmas espécies.
A situação de incompatibilidade observada neste experimento é
semelhante à encontrada por Gur & Blum (1973), entre P. persica e P. dulcis.
Em ambos os casos, tanto a cultivar quanto o porta-enxerto são espécies
cianogênicas. A diferença é que o mecanismo de incompatibilidade por
cianogênese até agora conhecido, indica a translocação da prunasina do
componente do enxerto com maior potencial cianogênico para o de potencial
menor (Gur et al., 1968, Gur & Blum, 1973; Moore 1986). No entanto, neste
trabalho não há essa translocação de ‘Umezeiro’ para as cultivares Chimarrita
e Maciel, possivelmente, devido à liberação de cianeto na interface do enxerto,
que compromete a funcionalidade do sistema vascular.
Essa estreita relação entre os altos teores de prunasina e a ocorrência
de incompatibilidade pode habilitar a utilização da prunasina como marcador
bioquímico da incompatibilidade de enxertia.
O estudo da PAL revelou em ‘Umezeiro’ uma atividade muito superior
em relação à apresentada por ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. Tais resultados
corroboram com Pina & Errea (2008), que observaram uma maior expressão
da PAL nas combinações incompatíveis de Prunus. Os mesmos autores
observaram, ainda, que a atividade elevada da PAL está correlacionada com o
aumento de compostos fenólicos na união do enxerto, podendo ser esse
acúmulo de fenóis uma causa provável da incompatibilidade. Por estarem
implicados nos processos de divisão, desenvolvimento e diferenciação dos
novos tecidos vasculares, diferenças quantitativas do perfil fenólico entre os
componentes do enxerto podem resultar em disfunção metabólica entre as
102
células da cultivar e do porta-enxerto, resultando em incompatibilidade de
enxertia (Errea, 1998; Musacchi et al., 2000).
Usenik et al. (2006), observaram que em combinações incompatíveis,
há diferença significativa entre a quantidade de fenóis da cultivar e do portaenxerto, resultado que corrobora com este experimento, onde na combinação
incompatível foi observada a maior atividade da PAL no porta-enxerto. Alguns
autores sugerem que essa diferença pode ser utilizada como marcador
bioquímico da incompatibilidade de enxertia (Errea et al., 1992; Musacchi et al.,
2000).
6.6.3. Correlação entre prunasina e atividade da PAL
A análise conjunta da concentração de prunasina e da atividade da
PAL indica uma correlação altamente significativa entre esses dois compostos
nas combinações incompatíveis. Embora essa relação não esteja clara, é
possível analisá-la sobre duas óticas distintas.
Pode-se levar em consideração a origem de ambos os compostos.
Tanto a PAL como a prunasina estão relacionadas com a fenilalanina (Kumar &
Ellis, 2001; Olafsdottir et al., 2002; Xu et al., 2010). A PAL é a primeira enzima
da rota fenilpropanóide e catalisa a conversão da fenilalanina em ácido
transcinâmico (Liu et al., 2006). Posteriormente, o ácido transcinâmico é
hidroxilado a ácido p-cumárico pela cinamato 4-hidroxilase (C4H), enzima do
grupo da superfamília do citocromo P450 e, subsequentemente, o ácido pcumárico é transformado em compostos envolvidos em diversas funções, como
flavonóides, antocianinas e ligninas (Huang et al., 2010). Por outro lado, a
biossíntese de CGs derivados da fenilalanina é pouco conhecida, porém se
sabe que em Carica papaya, a biossíntese de prunasina inicia com o citocromo
P450 catalizando a conversão da fenilalanina em benzilaldoxima (Ganjewala et
al., 2010). A seguir, a benzilaldoxima é transformada em uma α-hidroxinitrila
pela ação de um segundo citocromo P450 e, por último, a UDPGglicosiltransferase cataliza a síntese de prunasina a partir da α-hidroxinitrila
(Zagrobelny et al., 2004). Desta forma, uma maior concentração do aminoácido
fenilalanina em enxertos incompatíveis pode estar relacionada com a maior
quantidade de prunasina e atividade da PAL nos mesmos.
103
Outro foco passível de análise refere-se a uma relação de causa e
consequência entre prunasina e PAL. A prunasina, presente em maiores
concentrações nos enxertos incompatíveis, quando hidrolisada pela βglicosidase, libera cianeto, provocando sérios danos celulares à união do
enxerto (Nocito et al., 2010). Em consequência, há uma maior atividade de
PAL, indicando um aumento da produção de compostos fenólicos pela rota
fenilpropanóide (Chang et al., 2010; Nocito et al., 2010; Giberti et al., 2012),
conforme ocorre em outras formas de estresse (Dixon et al., 1995; Su et al.,
2011; Giberti et al., 2012). Por tanto, pode estar havendo uma maior indução
da rota fenilpropanóide pela PAL, em resposta ao dano provocado pela
cianogênese na região de união do enxerto incompatível, explicando assim, a
sua correlação positiva com a prunasina.
De forma geral, é evidente que a cianogênese possui papel
fundamental, sendo o principal fator responsável pela incompatibilidade.
Porém, não está claro se a maior atividade da PAL é uma resposta da planta
ao estresse sofrido, ou se também atua como causa do fenômeno. Havendo a
necessidade de que em estudos futuros, a relação entre prunasina e PAL seja
pesquisada em um número maior de combinações incompatíveis de Prunus.
104
6.7. Conclusões
O porta-enxerto Umezeiro é incompatível com as cultivares Chimarrita
e Maciel.
Diferenças elevadas entre os teores de prunasina na cultivar e no
porta-enxerto causam incompatibilidade de enxertia entre P. persica e P.
mume.
A prunasina é um marcador bioquímico viável da incompatibilidade de
enxertia em Prunus;
Em combinações incompatíveis, a atividade da fenilalanina amônialiase (PAL) é altamente correlacionada com a concentração de prunasina.
105
6.8. Referencias bibliográficas
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110
7. Artigo 3: Expressão gênica de PAL, C4H e 4CL em resposta a
incompatibilidade de enxertia por cianogênese
7.1. Resumo
A
rota
fenilpropanóide
possui
papel
importante
no
crescimento,
desenvolvimento e na resposta das plantas a diversas formas de estresse.
Sendo coordenada pela fenilalanina amonia-liase (PAL), seguida da cinamato
4-hidroxilase (C4H) e da 4-cumarato:CoA ligase (4CL), esta rota pode estar
envolvida na resposta da planta a incompatibilidade de enxertia por
cianogênese. O objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão gênica
das principais enzimas da rota fenilpropanóide e uma possível relação do perfil
de expressão com a incompatibilidade causada pelos glicosideos cianogênicos.
Foi observada uma maior concentração de prunasina no porta-enxerto da
combinação incompatível. Onde, também foi constatado, uma maior expressão
de todos os genes estudados. Houve uma significativa correlação entre os
teores de prunasina e expressão destes genes. Com base nestes resultados, é
possível concluir que a incompatibilidade de enxertia é causada pelo maior
potencial cianogênico do porta-enxerto Umezeiro em relação a cultivar
Chimarrita, e que a maior expressão dos genes da rota fenilpropanóide ocorre
em resposta ao estresse gerado pela elevada produção de cianeto na interface
do enxerto.
Palavras-chave: Prunus, compatibilidade, cianeto, compostos fenólicos,
antioxidante, genes de referência.
111
Gene expression of PAL, C4H and 4CL in response to graf incompatibility
by cyanogenesis
7.2. Abstract
Phenylpropanoid pathway plays an important role in growth, development and
stress responses of various plants spécies. Being coordinated by phenylalanine
ammonia-lyase (PAL), followed by cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and 4cumarate:CoA ligase (4CL), this pathway may be involved in plant response to
graft incompatibility by cyanogenesis.The main objective of this study was to
analyze the gene expression of key enzymes of the phenylpropanoid panthway
and a possible relation of this expression profiles with the graft incompatibility
caused by cyanogenic glycosides. The results showed higher concentration of
prunasina in the rootstock of the incompatible combination. Where, also found
greater expression of all genes studied. Including a significant correlation
between the levels of expression of these genes with the prunasin
concentration. Based on these results, it is possible to say that the graft
incompatibility was caused by higher cyanogenic potential of Umezeiro
rootstock in relation to Chimarrita
variety. And the increased expression of
genes of the phenylpropanoid pathway, occurs in response to stress generated
by high production of cyanide in the graft interface.
Keywords: Prunus, compatibility, cyanide, phenolic compounds, antioxidant
housekeeping.
112
7.3. Introdução
A rota fenilpropanóide é responsável pela biossíntese de inúmeros
compostos secundários importantes para o metabolismo das plantas, como as
ligninas, os flavonóides e as antocianinas (Figura 14). Esta via é constituída por
três enzimas chave, a fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.24), a cinamato
4-hidroxilase (C4H, EC 1.14.13.11) e a 4-cumarato:CoA ligase (4CL; EC
6.2.1.12).
A PAL é a primeira enzima na rota fenilpropanóide e catalisa a
conversão de L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico (Kumar & Ellis, 2001; Liu
et al., 2006; Olsen et al., 2008). É uma das enzimas mais estudadas nas
plantas devido à sua importância na biossíntese de vários metabólitos
secundários. Na sequência, a C4H, segunda enzima-chave nesta rota, catalisa
a hidroxilação do ácido cinâmico, convertendo-o a ácido 4-cumárico, que
também está envolvido na biossíntese de diversos metabolitos, além de
controlar o fluxo de carbono para as fitoalexinas que são sintetizadas quando
as plantas são atacadas por agentes patogênicos, de forma semelhante a PAL
(Bell-Lelong et al., 1997; Bubna et al. 2011; Yang et al., 2012). Por fim, a 4CL
catalisa a reação de ativação do ácido 4-cumárico formando tioésteres de CoA,
como o p-cumaroil CoA (Hu et al., 1998; Kumar & Ellis, 2001; Gaid et al., 2011).
Vários estudos têm mostrado que a expressão dos genes PAL, C4H e
4CL são sensíveis a uma série de estímulos bióticos e abióticos, incluindo a
infecção por patógeno, ferimento, deficiência nutricional, radiação UV,
temperaturas extremas, entre outras condições de estresse (Dixon e Paiva,
1995; Betz et al., 2001; Olsen et al., 2008; Kiselev et al., 2009; El-kereamy et
al., 2011; Su et al., 2012). Neste sentido, Pina & Errea (2008), também relatam
a maior expressão da PAL em combinações incompatíveis de Prunus, que se
deu, concomitantemente ao acúmulo de compostos fenólicos.
Os compostos fenólicos são há muitos anos estudados como peças
importantes no processo de incompatibilidade de enxertia. Embora ainda não
seja conhecido o verdadeiro papel destes compostos nesse fenômeno, sabe-se
que ocorrem diferenças quantitativas e/ou qualitativas destes compostos entre
combinações compatíveis e incompatíveis (Errea, 1998; Rodrigues et al., 2001;
Pina & Errea, 2008; Teles et al., 2009; Zarrouk et al., 2010).
113
Recentemente, Nocito et al. (2010), estudando a incompatibilidade por
cianogênese entre calos de pereira (Pyrus communis) e marmeleiro (Cydonia
oblonga), encontraram evidências de que este mecanismo de incompatibilidade
atua produzindo um importante estresse oxidativo, resultando em danos que,
dependendo do nível, podem causar a morte das células. Os mesmos autores
observaram, ainda, o aumento da atividade de enzimas antioxidantes que
atuam na redução deste estresse oxidativo.
Considerando o papel das enzimas PAL, C4H e 4CL na rota
fenilpropanóide e o aumento da produção de enzimas e compostos
antioxidantes em combinações incompatíveis devido a cianogênese, o objetivo
do presente trabalho foi analisar a expressão gênica das principais enzimas da
rota fenilpropanóide e sua relação com a incompatibilidade causada pelos
glicosideos cianogênicos (GCs) amigdalina e prunasina.
L- Fenilalanina
Fenilalanina amônia-liase (PAL)
ácido cinâmico
Cinamato-4-hidroxilase (C4H)
ácido 4-cumárico
4-cumarato-CoA ligase (4CL)
p-cumaroil CoA
FLAVONÓIDES
ANTOCIANINAS
LIGNINAS
Figura 14. Esquema resumido da rota fenilpropanóide. Adaptado de Taiz &
Zeiger (2004). Pelotas, RS, 2012.
114
A cultivar Chimarrita (P. persica L. Batsch) foi enxertada sobre os
porta-enxertos Capdeboscq (P. persica L. Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L.
Batsch) e Umezeiro (P . mume Sieb. e Zucc.). O método de enxertia
empregado foi o de gema ativa. As plantas foram cultivadas a campo no Centro
Agropecuário da Palma na Universidade Federal de Pelotas, Brasil. Amostras
de casca foram coletadas dois anos após a enxertia, 5cm acima e abaixo da
união do enxerto. Todas as amostras foram imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC.
A compatibilidade foi avaliada através de dois métodos, o índice SPAD
e o método de análise visual proposta por Mosse & Herrero (1951).
O índice SPAD, que identifica diferenças de concentração de clorofila
por área de folha, foi empregado para avaliar a incompatibilidade ‘translocada’.
Com a utilização de um SPAD 502 meter (Minolta), foram realizadas duas
medidas (lado superior e inferior) em 10 folhas de cada planta, sendo avaliadas
três plantas de cada parcela, totalizando 30 folhas por parcela. As medidas
foram realizadas no verão de 2011, aproximadamente 150 dias após a plena
floração. Quanto maior é o grau de incompatibilidade ‘translocada’ menor será
o índice SPAD (Moreno et al., 1993).
A análise visual proposta por Mosse & Herrero (1951), que avalia o
grau de compatibilidade ‘localizada’ das combinações, foi realizada três anos e
meio após a enxertia, através das classes A, B, C, D e E, propostas pelos
referidos autores. As classes correspondem aos seguintes níveis de
compatibilidade: A: união perfeita, a linha da união na casca e no lenho não é
visível; B: boa união, a linha de união na casca e no lenho são continuas,
embora no lenho seja muitas vezes visível devido a excessiva formação de
raias; C: união com descontinuidade na casca, os tecidos da casca do portaenxerto e da cultivar são separados por uma camada marrom escura com
aparência de cortiça; D: uniões com descontinuidade vascular, onde os tecidos
do lenho do porta-enxerto e da cultivar estão separados em muitos pontos, no
115
entanto, os tecidos da casca seguem como na classe C, e E: quando ocorre a
quebra da união no pomar ou viveiro. Sendo as classes A, B e C, são
consideradas compatíveis, enquanto as classes D e E incompatíveis.
7.4.3. Determinação da concentração de GCs
Embrapa Clima Temperado, Brasil. No momento da coleta as amostras foram
imediatamente congeladas em nitrogênios líquido e, logo após, armazenadas a
-80ºC. Posteriormente foram liofilizadas e armazenadas em tubos plásticos até
a realização das análises cromatográficas.
Para as análises cromatográficas, foram utilizados, padrões prunasina
e amigdalina (Sigma-Aldrich), carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol
(Vetec), específicos para HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A
água utilizada foi obtida empregando-se o sistema Milli-Q de purificação
(Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1µm.
A extração foi realizada em 500mg de amostra, com 8mL de metanol e
2000mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16
horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a
3000rpm durante 20min e o sobrenadante foi filtrado à vácuo em filtro de nylon
0,1µm. Do total filtrado, 20µL foram submetidos à análise cromatográfica.
analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6mm, 4µm) e pré-coluna equivalente, mantidas
a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-met anol (60:40; v/v) com fluxo
de 1,3mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254nm. Os
resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca.
7.4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA
O RNA total foi isolado usando o protocolo CTAB adaptado por
Messias et al. (2010) no Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Clima
Temperado, Brasil. A concentração e a qualidade do RNA extraído foi medida
em um Nanodrop Spectrometer (Nanodrop 1000, Thermo Scientific) com
resultados indicando concentrações suficientes para todas as amostras e
qualidade variando de 1,90 e 2,10 (relação de absorção 260/280nm). A
integridade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1,0% com brometo
116
de etídio (EtBr). Sendo empregado 1mg de RNA total para a síntese de cDNA
utilizando o kit SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
7.4.5. Análise da expressão gênica e seleção do gene de
referência
O estudo de expressão gênica das enzimas da rota fenilpropanóide, foi
realizado no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Fruticultura
do Centro de Investigación y Tecnologia Agroalimentaria de Aragón, Espanha.
Com base nas sequências de aminoácidos de P. persica obtidas no
GDR (Genome Database of Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e sua
homologia com sequências de genes de mesma função em Arabdopsis, foram
desenhados primers específicos para PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e
4CL3. A análise por Real Time, foi realizada com os primers apresentados nas
Tabelas 11 e 12. As reações foram realizadas em um equipamento Applied
Biosystems 7500/7500 Fast (Applied Biosystems), com um volume total de
25µL contendo: 12,5µL do SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems), 5µL de cDNA diluído (1,6ng µl-1), 0,75µL de cada priemer
(300mM) e 6,0µL de água
Milli-Q. O protocolo foi idêntico para todos os
conjuntos de primer: 95ºC por 10min, seguido de 40 ciclos de 95ºC por 30s,
60ºC por 1min, 72ºC durante 1min e uma extensão final de 72ºC por 10min.
Posteriormente, um protocolo de dissociação com gradiente de 95ºC por 15s,
60ºC por 1min e 95ºC por 15s. Os níveis de expressão foram calculados pelo
método Ct (cycle threshold). O ∆Ct ou Ct normalizado foi obtido subtraindo
valores Ct de cada gene alvo do Ct do gene de referência, enquanto o ∆∆Ct foi
calculado usando o Ct de amostras não enxertadas.
Os genes de referência testados foram Actina, Translation Elongation
Factor (TEF2), RPII e AT5G12240. Os pares de primers foram testados por RTPCR convencional e eletroforese em gel de agarose 2,5% com EtBr para a
verificação da especificidade e do amplicon. A eficiência da Real Time qRT-pcr
dos três genes foi calculada usando dados brutos de fluorescência tomadas do
7500 System SDS Software (Applied Biosystems) e analisados no software
LinRegPCR, de acordo Ruijter et al. (2009). A análise da estabilidade dos
genes de referência foi realizada pelos programas GeNorm, NormFinder e
117
BestKeeper, adaptados para o programa Microsoft Excel, conforme descrito por
Andersen et al. (2004) e Tong et al. (2009).
Os dados sobre as caracteristicas dos pares de primers são
apresentados nas Tabelas 11, 12 e 13.
A análise de eficiência indica que os quatro genes de referência
testados podem ser utilizados, pois foram eficiêntes para as condições
experimentais (Tabela 11). No entanto, a análise de estabilidade, realizada por
três modelos e quatro métodos diferentes, sugere nos três casos, Actina como
melhor gene para a normalização dos dados (Tabela 13).
Tabela 11. Características dos primers de PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1,
4CL2 e 4CL3. Pelotas, RS, 2012.
Símbolo
Sequência (5’-3’)
PAL1FqRTpp
(forward)
PAL1RqRTpp
(reverse)
PAL2FqRTpp
(forward)
PAL2RqRTpp
(reverse)
C4H1FqRTpp
(forward)
C4H1RqRTpp
(reverse)
C4H2FqRTpp
(forward)
C4H2FqRTpp
(forward)
4CL1FqRTpp
(forward)
4CL1RqRTpp
(reverse)
4CL2FqRTpp
(forward)
4CL2RqRTpp
(reverse)
4CL3FqRTpp
(forward)
4CL3RqRTpp
(reverse)
ATGAGGTGAAGCGC
ATGGTG
CTATGGCAGCCACTT
GGGAA
AGGTCAAACGGATG
GTCAAC
ATTGCAGCCACCTGA
GCTAT
CTGGCATCCATGTCA
CAAAC
GTCCGATACCACAG
CCAAGT
CCACCCTGAGATCCA
AAAGA
GGGTGTCTGGCTCT
GTGATT
TAAGAGCTGGAGCT
GCCATT
CACGATGGGGGCAA
TACTAA
AGAGTTGGGGCGGC
GATTTT
GCACAAAAGGCGCA
ATGGTC
GTTCGTCGACAAGCT
TCGAG
CGCCAAGTTTCGGG
TAGTTA
(1)
(1)
Temperatura (ºC) Tamanho (pb) Eficiência
R
2(1)
62
85
1,93
0,999
85
1,97
1,000
78
2,01
0,999
83
1,99
0,999
98
1,99
0,999
97
1,98
0,999
74
1,99
0,999
62
58
60
60
60
60
61
60
61
62
62
61
60
Eficiência e coeficiente de relação (R2) da Real Time qRT-pcr, estimados através do programa LinRegPCR, de
acordo com Ruijter et al. (2009).
118
Tabela 12. Características dos primers de Actina, TEF2, RPII e AT5G12240.
Pelotas, RS, 2012.
Símbolo
Actina
(forward)
Actina
(reverse)
TEF2
(forward)
TEF2
(reverse)
RPII
(forward)
RPII
(reverse)
AT5G12240
(reverse)
AT5G12240
(reverse)
Sequência (5’-3’)
Temperatura (°C)
TGAGGCTCCTCTCAACC
62
CTA
ATACATGGCAGGCACAT
58
TGA
GGTGTGACGATGAAGA
60
GTGA
AAGGAGAGGGAAGGTG
60
AAAG
TGAAGCATACACCTATG
60
ATGATGAAG
CTTTGACAGCACCAGTA
60
GATTCC
AGTCAGCCCAGTACGAA
60
GAGG
TGCTTCTGCTTCACCCA
60
CCT
(1)
Tamanho (pb) Eficiência
R
2(1)
90
1,97
0,999
129
1,94
0,999
128
1,93
1,00
600
1,91
1,00
(1)
Eficiência e coeficiente de relação (R2) da Real Time qRT-pcr, estimados através do programa LinRegPCR, de
acordo com Ruijter et al. (2009).
Tabela 13. Estabilidade dos genes de referencia Actina, TEF2, RPII e
AT5G12240. Pelotas, RS, 2012.
Ordem
NormFinder
Sem grupos
Grupos*
Actina
Actina
TEF2
TEF2
RPII
RPII
AT5G12240
AT5G12240
GeNorm
BestKeeper
1
RPII e AT5G12240
Actina
2
Actina
TEF2
3
TEF2
RPII
4
AT5G12240
*sete grupos: 3 porta-enxertos x 2 dois pontos amostrados em cada combinação (cultivar e porta-enxerto) + amostra
não enxertada.
As sequências de proteínas analisadas foram: Arabidopsis thaliana
PAL1 (PAL1_ARATH), A. thaliana PAL2 (PAL2_ARATH), A. thaliana PAL3
(PAL3_ARATH),
A. thaliana PAL4 (PAL4_ARATH), Brassica napus PAL
(AAX22053.1), Capsicum annuum PAL (ACF17667.1), Catharanthus roseus
PAL (BAA95629.1), Cicer arietinum PAL2 (PAL2_CICAR), Citrus limon PAL
(Q42667.1), Cynara cardunculus var. Scolymus PAL1
cardunculus var. Scolymus PAL3
(BAG31930.1),
D.
carota
PAL1
(CAL91037.1), C.
(CAL91169.1), Daucus carota PAL
(PAL1_DAUCA),
Glycine
max
PAL1
(P27991.1), G. max PAL2 (ACS88364.1), G. max PAL (ACT32033.1), Ipomoea
batatas PAL1 (PAL1_IPOBA), I. batatas PAL2 (PAL2_IPOBA),
I.
(AAG49585.1),
sativa
Lactuca
sativa
PAL
(AAL55242.1),
L.
nil
PAL
PAL2
(AAO13347.1), Malus domestica PAL1 (MDP0000787168), M. domestica PAL2
(MDP0000668828), Manihot esculenta PAL1 (AAK60274.1), M. esculenta PAL2
(AAK60275.1), Morus alba PAL (ADI40166.1), Nicotiana tabacum PAL
119
(P35513.2),
N.
tabacum
PAL1
(PAL1_TOBAC),
N.
tabacum
PAL2
(PAL2_TOBAC), N. tabacum PAL3 (PAL3_TOBAC), N. tabacum PAL4
(ACJ66297.1),
Oryza
sativa
PAL1
(PAL1_ORYSJ),
O.
sativa
PAL2
(PAL2_ORYSJ), Petroselinum crispum PAL1 (P24481.1), P. crispum PAL2
(PAL2_PETCR), P. crispum PAL3 (P45729.1), Phaseolus vulgaris PAL1
(PAL1_PHAVU),
P. vulgaris
(PAL3_PHAVU),
Pisum
(Q04593.1),
kitakamiensis
PAL2 (PAL2_PHAVU),
sativum
PAL1
Populus
kitakamiensis
PAL1
(PAL1_POPKI),
(Q01861.1),
PAL2
P.
vulgaris
PAL3
P.
sativum
PAL2
(PAL2_POPKI),
Populus
Populus
kitakamiensis
PAL4
(PAL4_POPKI), Prunus avium PAL1 (O64963.1), P. persica PAL1 (PAL1
Peach), P. persica PAL2 (PAL2 Peach), Pyrus communis PAL (ABB70117.2),
Pyrus x bretschneideri
PAL1 (ADF59061.1), Pyrus x bretschneideri PAL2
(ADF59062.1),
idaeus
Rubus
PAL1
(Q9M568.1),
R.
idaeus
PAL2
(AAF40224.1), Scutellaria baicalensis PAL1 (ADN32767.1), S. baicalensis
PAL2 (ADN32768.1), Solanum lycopersicum PAL1 (PAL1_SOLLC), S.
lycopersicum PAL5 (PAL5_SOLLC), S. tuberosum PAL1 (PAL1_SOLTU), S.
tuberosum PAL2 (PAL2_SOLTU), Zea mays PAL (B6SRL9_MAIZE), Citrus
clementina PAL1 (CAB42793.1), C. clementina PAL2 (CAB42794.1), P.
cerasifera x P. munsoniana PAL (ABK32084.1), Pinus taeda PAL (P52777.1),
Coffea canephora PAL1 (AAN32866.1), C. canephora PAL2 (AAN32867.1),
Acacia auriculiformis x A. mangium C4H (ABX75854.1), Allium cepa C4H
(AAS48416.1), A. sativum C4H (ADO24190.1), A. thaliana C4H (NP_180607.1),
Brassica napus C4H2 (ABF17875.1), B. rapa C4H (BAI77480.1), Canarium
album C4H (ACR10242.1), Capsicum annuum C4H (ACF19421.1), C. sinensis
C4H (AAF66066.2), Citrus x paradisi C4H (AAK57011.1), Cucumis sativus C4H
(CAK95273.1),
G.
max
C4H
(Q42797.1),
Gossypium
hirsutum
C4H
(ACH56520.1), G. hirsutum C4H2 (ACZ06240.1), Gynura bicolor C4H
(BAJ17666.1), Hibiscus cannabinus C4H2 (ABF58026.1), Humulus lupulus C4H
(ACM69364.1), Ipomoea batatas C4H (ADB65927.1), Isatis tinctoria C4H
(ADG43134.1), Leucaena leucocephala C4H (ACZ54906.1), Lithospermum
erythrorhizon C4H (BAB71717.1), Malus domestica C4H (peach C4H1)
(MDP0000225698), M. domestica C4H (MDP0000229348), N. tabacum
CYP73A47v1 (ABC69411.1), Oryza sativa Japonica C4H (NP_001046819.1),
Parthenocissus henryana C4H (ABA59555.1), P. crispum (Q43033.1), Petunia
120
x hybrida C4H2 (ADX33333.1), P. vulgaris C4H
(CAA70596.1),
Pinus
taeda trans-cinnamate 4-hydroxylase (AAD23378.1), P. tremuloides transcinnamate 4-hydroxylase (ABF69099.1), P. trichocarpa trans-cinnamate 4hydroxylase (ACC63873.1), P. trichocarpa x P. deltoides C4H (AAG50231.1),
P. avium C4H (ADZ54778.1), P. persica C4H1 (C4H1 Peach), P. persica C4H2,
Ricinus communis C4H (XP_002534996.1), R. coreanus C4H (ABX74779.1), R.
occidentalis C4H (ACM17896.1), Rubus sp. C4H (ABX74781.1), Ruta
graveolens C4H (Q9AR74.1), Salvia miltiorrhiza C4H (ABC75596.1), S.
tuberosum
C4H
(ABC69046.1),
Sorghum
(XP_002452044.1), Trifolium pratense C4H
bicolor
hypothetical
protein
(ACB78015.1), Z. mays C4H
(NP_001151365.1), P. persica 4CL1 ; P. persica 4CL2; P. persica 4CL3; Z.
mays 4CL (Q6Q297); N. tabacum 4CL (Q42943); N. tabacum 4CL1 (O24145);
A. lyrata 4CL (XM_002894282.1); A. thaliana 4CL1 (NM_001084228.1); A.
thaliana 4CL2 (NM_113019.3); A. thaliana 4CL3 (NM_105180.3); A. thaliana
4CL5
(NM_113018.3);
A.
thaliana
4CL4
(AY376731.1);
A.
thaliana
(AC025294.14); Capsicum annuum 4CL (AF212317.1); C. annuum putative
4CL2 (EU616540.1); G. max 4CL (FJ770469.1); G. max 4CL14 (X69954); G.
max 4CL4 (X69955.2); Gossypium hirsutum 4CL (HM462000.1); G. hirsutum
4CL1 (FJ479707.1); G. hirsutum 4CL2 (FJ848870.1); M. domestica 4CL2
(MDP0000260512); M. domestica 4CL3 (MDP0000293578); O. sativa 4CL1
(L43362); Petroselinum hortense pc4CL-1 (X13324.1); P. hortense Pc4CL-2
(X13325.1); Pinus taeda PT4CL1 (U12012.1); P. taeda PT4CL2 (U12013.1); P.
tremuloides Pt4CL1 (AF041049.1); P. tremuloides Pt4CL2 (AF041050.1); S.
tuberosum St4C1-1 (M62755.1); P. avium 4CL1 (GU990523.1); O. sativa 4CL2
(X52623); R. idaeus 4CL1 (AF239687.1); R. idaeus 4CL2 (AF239686.1); R.
idaeus 4CL3 (AF239685.1); R. graveolens 4CL1 (EU196763.1); R. graveolens
4CL2 (EU196764.1); Salvia miltiorrhiza 4CL2 (AY237164.1); S. tuberosum 4CL2a (AF150686.1); Sorbus aucuparia p-CL1 (GU938595.1); S. aucuparia p-CL2
(GU949552.1);
S.
aucuparia
p-CL3
(GU949553.1);
Z.
mays
4CL2
(NM_001156842.1).
O alinhamento das sequências de proteínas foi realizado usando o
Clustal W implementado no programa MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007), que
também foi usado para a construção da árvore filogenética baseada no método
de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de
121
ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). O
multialinhamento das sequências de proteínas para a identificação de
sequências conservadas entre genes da mesma família foi realizado pelo
software
online
Multiple
Sequence
Alignment
by
CLUSTALW
(http://www.genome.jp/tools/clustalw).
O delineamento experimental foi de blocos casualizados, com quatro
repetições, em esquema fatorial (3x2), três porta-enxertos e duas porções do
enxerto (cultivar e porta-enxerto).
5% de probabilidade de erro, utilizando o programa estatístico WinStat versão
2.11 (Machado & Conceição, 2003). As análises de correlação foram realizadas
no programa gráfico estatístico SigmaPlot versão 11.0 (SigmaPlot, 2004).
122
7.5. Resultados
Não houve diferenças significativas entre os índices SPAD das
combinações
1’
e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (Figura 15), o que indica, a não existência de
incompatibilidade ‘translocada’ em qualquer das combinações. No entanto, pela
análise macroscópica da anatomia da união do enxerto, é possível observar na
combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, uma descontinuidade vascular entre
cultivar e porta-enxerto, havendo a formação de uma linha de separação entre
ambos, evento que não ocorre nas demais combinações (Figura 16). Conforme
a metodologia de avaliação proposta por Herrero & Mosse (1951),
combinações com tais características pertencem à classe D, ou seja, são
incompatíveis,
pois
podem
romper-se
com
relativa
facilidade.
Outra
característica que contribui para a caracterização desta combinação como
incompatível é o engrossamento do tronco na região de união, especialmente
na cultivar, associado ao pequeno diâmetro da cultivar e principalmente do
porta-enxerto (Figura 16G). Este comportamento é típico de uma combinação
incompatível (Fachinello et al., 2005).
50
Índice SPAD
40
30
20
10
0
'Capdeboscq' 'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
Figura 15. Índice SPAD observado pela análise das folhas das combinações
Pelotas, RS, 2012.
123
7.5.2. Concentração dos GCs
Foram observadas diferenças significativas entre os teores de
prunasina
nos
porta-enxertos
das
combinações,
tendo
‘Umezeiro’,
anteriormente caracterizado como incompatível, apresentado o dobro da
concentração verificada em ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’ (Figura 17). Por outro
lado, não foram constatadas diferenças entre os teores de prunasina na cultivar
Chimarrita enxertada sobre os diferentes porta-enxertos.
Nas combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’,
não houve diferenças significativas entre os teores de prunasina na cultivar e
no porta-enxerto. Porém, na combinação incompatível, ‘Chimarrita’ apresentou
uma concentração de prunasina 65% menor que ‘Umezeiro’.
Na comparação dos teores de prunasina entre porta-enxertos não
enxertados, ‘Umezeiro’ apresentou uma concentração de prunasina superior a
‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’ (Figura 17).
124
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Diâmetro: 3,9cm
‘Chimarrita’
Diâmetro: 6,0cm
Linha que demonstra a
descontinuidade
vascular
entre os componentes do
enxerto.
‘Umezeiro’
Diâmetro: 3,0cm
(G)
Figura 16. Aparência externa e corte macroscópico longitudinal interno da
região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A e D),
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B e E) e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C e F). Detalhes
internos da região de união da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (G). Pelotas,
RS, 2012.
Os níveis de amigdalina não foram significativamente diferentes na
cultivar ‘Chimarrita’ enxertada sobre os três porta-enxertos, ou mesmo entre os
porta-enxertos, quando estes estavam combinados com ‘Chimarrita’ (Figura
18). Porém, entre os porta-enxertos não enxertados, ‘Umezeiro’ teve
concentração superior aos demais (Figura 18).
125
100
Cultivar
Porta-enxerto
Porta-enxerto não enxertado
-1
Prunasina (mg g )
80
60
40
20
0
'Capdeboscq'
'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
Figura 17. Concentração do glicosídeo cianogênico prunasina (mg g-1) no
porta-enxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos
‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012.
100
-1
Amigdalina (mg g )
80
Cultivar
Porta-enxerto
Porta-enxertos não enxertados
60
40
20
0
'Capdeboscq'
'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
Figura 18. Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina (mg g-1) no
porta-enxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’,
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos
‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012.
7.5.3. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL
A
expressão
gênica
das
três
famílias
de
enzimas
da
rota
fenilpropanóide avaliadas neste trabalho foi fortemente influenciada pela
compatibilidade de enxertia. Tanto as PALs, quanto as C4Hs e as 4CLs foram
significativamente mais expressas na cultivar e no porta-enxerto da
combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, classificada como incompatível (Figura
19).
126
Comparando a expressão dos sete genes avaliados, é possível
constatar que em todos os casos há uma maior expressão na cultivar em
relação ao porta-enxerto. Ainda em relação a diferença de expressão entre
cultivar e porta-enxerto, na combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ todos os genes
foram várias vezes mais expressos na cultivar (Tabela 14).
14
12
10
PAL1 Cultivar
PAL2 Cultivar
PAL1 Porta-enxerto
PAL2 Porta-enxerto
8
6
4
2
100
0
80
C4H1 Cultivar
'Capdeboscq'
C4H2 Cultivar
C4H1 Porta-enxerto
C4H2 Porta-enxerto
'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
4CL1 Cultivar
'Capdeboscq'
4CL2 Cultivar
4CL3 Cultivar
4CL1 Porta-enxerto
4CL2 Porta-enxerto
4CL3 Porta-enxerto
'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
'Capdeboscq'
'Tsukuba 1'
'Umezeiro'
60
40
20
30
0
25
20
15
10
5
0
Figura 19. Expressão gênica relativa dos genes PA1L, PAL2, C4H1, C4H2 e
4C1L, 4CL2 e 4CL3 na cultivar e no porta-enxerto das combinações
Pelotas, RS, 2012.
127
Tabela 14. Número de vezes em que os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2,
4CL1, 4CL2 e 4CL3, foram mais expressos na cultivar que no porta-enxerto
das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012.
Combinações
‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’
PAL1
1
1
2
PAL2
2
2
9
C4H1
2
3
19
C4H2
1
1
11
4CL1
2
2
10
4CL2
1
1
15
4CL3
2
2
6
7.5.4. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL
As sequências de proteína de várias espécies foram utilizadas para
estimar as relações filogenéticas com as sequências de P. persica.
Em geral, todas as enzimas apresentaram maior homologia com
espécies da mesma família botânica. No caso da PAL1, foi homóloga com P.
avium (PAL1) e P. communis (PAL) e Pyrus x bretsscheideri (PAL1). Já PAL2,
teve maior homologia com M. domestica (PAL1 e PAL2), P. comunis (PAL) e
Pyrus x bretschneideri (PAL2) (Figura 20). Se pode observar também, uma
divisão entre monocotiledôneas e dicotiledôneas, onde ambas as isoformas da
PAL apresentaram maior similaridade com espécies dicotiledôneas, estando
mais distantes de monocotiledôneas, como O. sativa (PAL1 e PAL2), Z. mays
(PAL) e P. taeda (PAL).
A C4H2 apresentou maior proximidade genética com P. avium (C4H) e
M. domestica (C4H). Enquanto, C4H1 agrupou com P. vulgaris (C4H), R.
communis (C4H), Z. mays (C4H) e O. sativa (C4H) (Figura 21). Ao contrário do
que ocorreu com as PALs, que foram similares as monocotiledôneas, entre as
C4H, a C4H2 foi mais similar as dicotiledôneas e a C4H1 às monocotiledôneas.
Entre as isoformas de 4CL, as 4CL1 e 4CL2 apresentaram maior
proximidade genética entre si do que em relação a 4CL3. A isoforma 4CL1 foi
homóloga a R. ideaus (4CL1), S. aucuparia (p-CL1) e G. max (4CL14) (Figura
22). Enquanto 4CL2 foi agrupou com R. ideaus (4CL2), M. domestica (4CL2) e
S. aucuparia (p-CL2) e 4CL3 à P. avium (4CL1), M. domestica (4CL3) e S.
aucuparia
(p-4CL3).
dicotiledôneas.
Em
geral,
as
PALs
foram
agrupadas
com
as
128
86
99
81
97
93
99
75
55
99
99
99
91
97
66
68
98
99
88
97
99
94
86
99
99
79
99
97
90
86
99
73
99
99
64
91
94
55
97
99
99
67
96
Capsicum annuum PAL
Solanum lycopersicum PAL5
Nicotiana tabacum PAL1
Solanum lycopersicum PAL1
Solanum tuberosum PAL1
Solanum tuberosum PAL2
Ipomoea batatas PAL1
Ipomoea nil PAL
Ipomoea batatas PAL2
Nicotiana tabacum PAL
Catharanthus roseus PAL
Scutellaria baicalensis PAL1
Scutellaria baicalensis PAL2
Cynara cardunculus var. Scolymus PAL1
Lactuca sativa PAL2
Gynura bicolor PAL
Lactuca sativa PAL
Cynara cardunculus var. Scolymus PAL3
Daucus carota PAL1
Daucus carota PAL
Petroselinum crispum PAL3
Citrus limon PAL
Manihot esculenta PAL1
Populus kitakamiensis PAL4
Arabidopsis thaliana PAL3
Cicer arietinum PAL2
Rubus idaeus PAL1
Prunus persica PAL2
Malus domestica PAL1
Malus domestica PAL2
Pyrus x bretschneideri PAL2
Prunus avium PAL1
Prunus persica PAL1
Pyrus communis PAL
Pyrus x bretschneideri PAL1
Rubus idaeus PAL2
Citrus clementina PAL1
Citrus clementina PAL2
Brassica napus PAL
Manihot esculenta PAL2
Morus alba PAL
Phaseolus vulgaris PAL3
Pisum sativum PAL1
Pisum sativum PAL2
Glycine max PAL1
Glycine max PAL2
Coffea canephora PAL1
Coffea canephora PAL2
Pinus taeda PAL
Oryza sativa PAL1
Oryza sativa PAL2
Zea mays PAL
Dicotiledôneas
Monocotiledôneas
Figura 20. Relação filogenética entre genes PALs. As sequências de proteínas
foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa
MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de
suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000
repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012.
129
65
81
94
53
96
96
74
100
68
93
77
73
100
58
100
100
77
100
100
99
51
Petunia x hybrida C4H2
Solanum tuberosum C4H
Capsicum annuum C4H
Nicotiana tabacum CYP73A47v1
Lithospermum erythrorhizon C4H
Leucaena leucocephala C4H
Acacia auriculiformis x Acacia mangium C
Cucumis sativus C4H
Humulus lupulus C4H
Rubus coreanus C4H
Rubus sp. C4H
Rubus occidentalis C4H
Malus domestica C4H (peach C4H1)
Malus domestica C4H (peach C4H2)
Prunus avium C4H
Prunus persica C4H2
Hibiscus cannabinus C4H2
Salvia miltiorrhiza C4H
Gynura bicolor C4H
Petroselinum crispum
Isatis tinctoria C4H
Brassica napus C4H2
Arabidopsis thaliana C4H
Brassica rapa C4H
Ipomoea batatas C4H
Parthenocissus henryana C4H
Populus trichocarpa trans-cinnamate 4-hy
Populus trichocarpa x Populus deltoides
Populus tremuloides trans-cinnamate 4-hy
Canarium album C4H
Gossypium hirsutum C4H
Gossypium hirsutum C4H2
Ruta graveolens C4H
Citrus sinensis C4H
Citrus x paradisi C4H
Glycine max C4H
Trifolium pratense C4H
Allium cepa C4H
Allium sativum C4H
Pinus taeda trans-cinnamate 4-hydroxylas
Sorghum bicolor hypothetical protein
Zea mays C4H
Oryza sativa Japonica C4H
Ricinus communis C4H
Phaseolus vulgaris C4H
Prunus persica C4H1
Classe I
Classe II
Figura 21. Relação filogenética entre os genes C4Hs. As sequências de
proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o
programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com
medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de
1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012.
130
100
99
98
100
99
60
61
100
100
55
53
58
84
100
84
88
98
100
55
100
100
100
56
100
81
88
97
100
56
Capsicum annuum 4CL
Capsicum annuum putative 4CL2
Nicotiana tabacum 4CL1
Solanum tuberosum 4CL1
Solanum tuberosum 4CL2
Nicotiana tabacum 4CL
Salvia miltiorrhiza 4CL2
Petroselinum crispum 4CL1
Petroselinum crispum 4CL2
Rubus idaeus 4CL2
Malus domestica 4CL2
Prunus persica 4CL2
Populus tremuloides 4CL1
Prunus persica 4CL1
Rubus idaeus 4CL1
Ruta graveolens 4CL2
Arabidopsis thaliana 4CL5
Pinus taeda 4CL1
Pinus taeda 4CL2
Ruta graveolens 4CL1
Gossypium hirsutum 4CL
Gossypium hirsutum 4CL1
Gossypium hirsutum 4CL2
Populus tremuloides 4CL2
Glycine max 4CL
Glycine max 4CL4
Rubus idaeus 4CL3
Malus domestica 4CL3
Prunus avium 4CL1
Prunus persica 4CL3
Oryza sativa 4CL
Zea mays 4CL
Zea mays 4CL2
Classe I
Classe II
Classe III
Figura 22. Relação filogenética entre os genes 4CLs. As sequências de
proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o
programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com
medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de
1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012.
131
7.6. Discussão
7.6.1. Incompatibilidade por cianogênese
A incompatibilidade de enxertia observada neste estudo, entre
‘Chimarrita’ (P. persica) e ‘Umezeiro’ (P. mume), é atribuída à maior
concentração de prunasina em ‘Umezeiro’. Resultado que corrobora com Teles
et al. (2009), que já haviam constatado a incompatibilidade entre os mesmos
genótipos e, além disso, indicavam um possível envolvimento da prunasina
neste processo.
O mecanismo de incompatibilidade por cianogênese já foi descrito
entre combinações de pereira/marmeleiro e pessegueiro/amendoeira (Gur et
al., 1968; Gur & Blum, 1973; Moore, 1984; Moore, 1986). No primeiro caso, a
pereira, que contêm concentrações elevadas de prunasina, é enxertada sobre
o marmeleiro, que por sua vez, não apresenta este composto. No segundo
caso, ambas as espécies contêm prunasina, porém, o pessegueiro apresenta
concentrações superiores, e essa diferença é suficiente para que se manifeste
a
incompatibilidade.
Situação
semelhante
ocorre
na
combinação
‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, onde ambos são cianogênicos, porém, a diferença de
concentração entre cultivar e porta-enxerto é elevada, tornando a combinação
incompatível.
A incompatibilidade por cianogênese ainda é pouco conhecida,
havendo um número restrito de trabalhos que abordam esse mecanismo.
Entretanto, sabe-se que o processo de incompatibilidade inicia na interface do
enxerto, onde a prunasina é hidrolisada pela β-glicosidase havendo a liberação
de cianeto (Gur & Blum, 1973; Moore, 1986). Desta forma, quando se combina
uma espécie com teor elevado de prunasina, como ’Umezeiro’, com outra de
baixo teor, como ‘Chimarrita’, há uma produção elevada de cianeto na interface
do enxerto, prejudicial especialmente à espécie com menor teor de prunasina.
Isso ocorre porque uma espécie que contêm baixo potencial cianogênico,
geralmente apresenta uma menor capacidade de desintoxicação (Zagrobelny
et al., 2004). A desintoxicação do cianeto acumulado em plantas é realizada
através de uma reação química entre o cianeto e a cisteína, catalisada pela βcianoalanina sintase, que converte esse composto tóxico em β-cianoalanina,
que posteriormente é convertida em asparagina (Miller & Conn, 1980). Em
132
plantas com baixo potencial de desintoxicação, o aumento da concentração de
cianeto na interface do enxerto resulta em estresse severo, que pode resultar
em uma série de distúrbios fisiológicos e bioquímicos em toda a planta e,
dependendo do grau, pode levar a morte de células na região de união do
enxerto. Essa morte celular forma uma linha necrótica separando a cultivar do
porta-enxerto e diminuindo a resistência mecânica entre ambos, fato que ficou
evidente no estudo de Gur et al. (1968), na combinação entre pereira e
marmeleiro. No presente trabalho, também foi constatada essa mesma linha
divisória que caracteriza uma separação entre ‘Chimarrita’ e ‘Umezeiro’, porém,
em menor grau. Essa menor intensidade do fenômeno entre ‘Chimarrita’ e
‘Umezeiro’ possivelmente se deve ao fato de ambos serem espécies
cianogênicas com relativo potencial de desintoxicação, ao contrário da
combinação pereira/marmeleiro.
Recentemente, estudos de Nocito et al. (2010), avaliaram o efeito da
incompatibilidade por cianogênese sobre o metabolismo da planta e seus
resultados explicam grande parte do processo em que o cianeto causa a
incompatibilidade
de
enxertia.
Os
referidos
autores
estudaram
a
incompatibilidade por cianogênese entre pereira (Pyrus communis) e
marmeleiro (Cydonia oblonga), encontrando fortes evidências de que este
mecanismo de incompatibilidade se dá por uma disfunção da via respiratória da
planta. As evidências que comprovam esse fato são uma menor produção de
energia (ATP) pela respiração mitocondrial, associada a um aumento do
consumo de oxigênio (O2) na combinação incompatível. Esse comportamento
indica a utilização de uma via respiratória alternativa, não sensível ao cianeto.
Em condições naturais, a respiração das plantas é composta por três
processos básicos, a glicólise, o ciclo do ácido cítrico e a cadeia de transporte
de elétrons. Este último é organizado em quatro complexos, Complexo I (NADH
desidrogenase), Complexo II (sucinato desidrogenase), Complexo III (complexo
de citocromos bc1) e Complexo IV (citocromo c oxidase) (Taiz & Zeiger, 2004).
Porém, em situações onde o cianeto está presente, a citocromo c oxidase é
inibida e os Complexos III e IV são inativados. Nestes casos, a partir do
Complexo II, a respiração segue uma via alternativa, que é composta pela
oxidase alternativa (AOX), único componente desta via e que catalisa a
redução de quatro elétrons de oxigênio para água. Nesta rota, a energia livre
133
que seria armazenada na forma de ATP é perdida na forma de calor (Taiz &
Zeiger, 2004) (Figura 23).
A utilização desta via alternativa sugere que o aumento no consumo de
O2 na combinação incompatível se deve a um incremento do fluxo de elétrons
ao longo da via de respiração mitocondrial alternativa (Nocito et al., 2010). Este
comportamento tem sido amplamente relacionado a diferentes formas de
estresses em tecidos vegetais e resulta em dano oxidativo secundário, devido
ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), que incluem peróxido de
hidrogênio (H2O2), o ânion oxigênio (O2-), os radicais hidroxila (OH) e o
oxigênio “singlet” (1O2) (Arora et al. 2002; Pellin et al., 2002; Kim et al., 2011;
Carneiro et al., 2012; Wang et al., 2012). ROS são geradas naturalmente como
subprodutos da via respiratória, onde as mitocôndrias são as principais
organelas produtoras (Apel & Hirt, 2004). Quando o aumento das ROS é
relativamente pequeno, a capacidade antioxidante das células é suficiente para
manter o equilíbrio entre produção e eliminação (Van Breusegem & Dat 2006).
Porém, em condições de estresse, como a incompatibilidade de enxertia por
cianogênese, este delicado equilíbrio é perturbado, levando a um acúmulo de
ROS (Figura 23). As ROS têm potencial de interagir com muitos componentes
celulares e a sua alta concentração gera estresse oxidativo, que causa danos a
proteínas, lipídios e DNA, e consequentemente a membranas e outras
estruturas, podendo levar a morte celular, que quando ocorre se caracteriza por
necrose dos tecidos (Van Breusegem & Dat 2006; Gao et al., 2008).
Além de indicar a ativação da via respiratória alternativa, a AOX
desempenha um papel importante no controle da produção de ROS
(Vanlerberghe et al., 2002). Mas no caso da incompatibilidade por
cianogênese, Nocito et al. (2010), observaram na combinação incompatível
uma baixa expressão desta enzima. Fato que sugere a manutenção da
situação
de
estresse
oxidativo.
Desta
forma,
pode-se
dizer
que
a
incompatibilidade de enxertia desencadeada pela cianogênese é causada por
danos celulares devido ao estresse oxidativo resultante do acúmulo de ROS
nas células próximas á interface do enxerto. Danos que podem ser mais ou
menos severos, dependendo do grau de estresse gerado.
134
RESPIRAÇÃO
Combinação
compatível
Combinação
incompatível
Cianeto
Glicólise
Glicólise
Ciclo do
ácido
cítrico
Ciclo do
ácido
cítrico
Cadeia de transporte de elétrons
Cadeia de transporte de elétrons
Complexo I
(NADH desidrogenase)
Complexo I
(NADH desidrogenase)
Complexo II
(sucinato desidrogenase)
Complexo II
(sucinato desidrogenase)
Complexo III
(complexo de citocromos bc1)
Oxidase alternativa (AOX)
Complexo IV
(citocromo oxidase)
- Energia (ATP);
- Consumo de O2 normal;
- Baixos níveis de ROS.
FUNCIONAMENTO CELULAR
PERFEITO
- Calor;
- Consumo de O2 elevado;
- Altos níveis de ROS.
ESTRESSE OXIDATIVO = DANO
CELULAR
Figura 23. Esquema ilustrativo da via respiratória em combinações compatíveis
e incompatíveis. Em combinações compatíveis, a via respiratória (sensível ao
cianeto) é composta por três processos básicos: glicólise, o ciclo do ácido
cítrico e a cadeia de transporte de elétrons. Estando a cadeia de transporte de
elétrons organizada em quatro complexos (I, II, III e IV), que ao final resulta na
formação de energia na forma de ATP com consumo normal de oxigênio (O2) e
baixa produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Nas combinações
incompatíveis, o cianeto está presente, a citocromo c oxidase é inibida e os
Complexos III e IV são inativados. A partir do Complexo II, a respiração segue
uma via alternativa (não sensível ao cianeto), que é composta pela oxidase
alternativa (AOX). Nesta rota, a energia é perdida na forma de calor, há um
grande consumo de O2 e uma produção elevada de ROS, que causa danos à
célula (estresse oxidativo). Pelotas, RS, 2012.
135
7.6.2. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL
Plantas submetidas a estresses bióticos e abióticos, como a
incompatibilidade de enxertia por cianogênese, induzem a produção de
grandes quantidades de ROS, gerando um estresse oxidativo que ocasiona
uma série de distúrbios, inclusive a morte de células e consequentemente de
tecidos. Porém, visando a sua própria proteção contra “super” produções de
ROS, as plantas desenvolveram estratégias adaptativas antioxidantes para
redução do dano oxidativo (Mitter, 2002; Saleh & Plieth, 2009; Gholizadeh &
Kohnehrouz, 2010; Giró et al., 2011; Wang et al., 2012).
A redução do estresse oxidativo gerado por altas concentrações de
ROS pode ser realizada tanto pela ação de enzimas antioxidantes, como a
peroxidase (POD), a ascorbato peroxidase (APX), a dehidroascorbato redutase
(DHR), a glutationa redutase (GR), a superóxido dismutase (SOD) e a catalase
(CAT) (Nocito et al., 2010), quanto por compostos antioxidantes, como os
flavonóides e as antocianinas (Gao et al., 2008). Nocito et al. (2010),
observaram que em combinações com incompatibilidade de enxertia causada
pela cianogênese, houve um significativo incremento da atividade da APX,
DHR, GR, SOD e CAT.
Da mesma forma, a fim de verificar um possível
incremento da atividade antioxidante na combinação incompatível, foram
avaliadas neste trabalho as mudanças na expressão gênica de PAL1, PAL2,
C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3, enzimas que coordenam a rota
fenilpropanóide e que, consequentemente, regulam a produção de compostos
fenólicos antioxidantes.
O estudo de expressão constatou uma maior expressão de todos os
genes avaliados, tanto na cultivar quanto no porta-enxerto da combinação
incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). Por outro lado, os enxertos compatíveis
apresentaram baixos níveis de expressão destes genes.
Este resultado indica haver um importante incremento da atividade
fenilpropanóide, voltada à produção de compostos fenólicos com ação
antioxidante, como flavonóides e antocianinas, visando combater o estresse
oxidativo gerado pelo acúmulo de ROS. Comportamento já verificado frente a
uma série de formas de estresses por inúmeros autores (Mittler, 2002;
Gholizadeh & Baghban, 2010; Nocito et al., 2010; Giró, et al., 2011; RubioWilhelmi et al., 2011). Inclusive, Pina & Errea (2008), verificaram uma maior
136
expressão da PAL associada ao aumento da concentração de compostos
fenólicos em uniões incompatíveis de Prunus.
Porém,
mesmo
com
o
aumento
da
capacidade
antioxidante,
caracterizada pela maior atividade de algumas enzimas, observadas por Nocito
et al. (2010) e da expressão das enzimas PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1,
4CL2 e 4CL3, produtoras de antioxidantes, apresentadas no presente estudo, a
taxa de produção de ROS possivelmente continua sendo superior a capacidade
antioxidante na combinação incompatível e, portanto, se mantém a condição de
estresse oxidativo e, por consequência, de incompatibilidade.
O papel da prunasina como agente causal, que desencadeia todo o
processo de incompatibilidade de enxertia, ficou evidente na correlação entre
os teores de prunasina no porta-enxerto e a expressão de todos os genes
chave da rota fenilpropanóide na cultivar, da combinação incompatível (Figura
24). Essa análise, com índices de correlação elevados, fortalece a linha de
raciocínio abordada na presente discussão, onde o enxerto parece estar sendo
submetido a uma situação de estresse oxidativo, causado pela elevada
liberação de cianeto e “super” produção de ROS na região de união. Esta
situação explica o grande aumento da expressão dos genes que coordenam a
rota fenilpropanóide e que são responsáveis pela biossíntese de compostos
fenólicos antioxidantes (flavonóides e antocianinas), que atuam no controle do
estresse oxidativo, e de compostos fenólicos estruturais (ligninas), que
contribuem para a manutenção da união entre cultivar e porta-enxerto.
Em geral, as famílias de genes PAL, C4H e 4CL apresentaram um
perfil de expressão gênica muito semelhantes em relação aos diferentes níveis
de compatibilidade de enxertia. A mesma tendência também foi observada por
outros autores (Singh et al., 2009; Tuan et al., 2010). Este fato indica a
existência de uma coordenação entre esses genes para a regulação da rota
fenilpropanóides.
137
25
Expressão gênica relativa de
PAL1 e PAL2
20
Prunasina vs PAL1
y = - 3,719 + 0,193x (R = 0,87)
Prunasina vs PAL2
y = - 1,798 + 0,0756x (R = 0,91)
30
40vs C4H1
50
Prunasina
y = -60
41,604 +70
1,608x (R80
= 0,90) 90
15
10
5
0
140
20
C4H1 e C4H2
120
X Data
Prunasina vs C4H2
y = - 23,951 + 0,909x (R = 0,93)
100
80
60
40
20
4CL1, 4CL2 e 4CL3
0
50 20
30
40vs 4CL1
50 y = - 7,353
60 + 0,293x
70 (R =80
0,86)
Prunasina
40
X Data
Prunasina vs 4CL2 y = - 14,157 + 0,532x (R = 0,91)
90
Prunasina vs 4CL3 y = - 5,091 + 0,208x (R = 0,904)
30
20
10
0
-10
20
30
40
50
60
70
80
90
Prunasina
Figura 24. Correlação entre a concentração de prunasina no porta-enxerto
‘Umezeiro’ e a expressão dos genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e
4CL3 na cultivar ‘Chimarrita’ (combinação incompatível). Pelotas, RS, 2012.
138
7.6.3. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL
A família de genes PAL é relativamente pequena na maioria das
espécies, com dois, três ou quatro genes como em Arabdopsis, mas há
exceções, como o caso do tomate, onde foram verificados cerca de vinte e seis
genes (Chang et al., 2008; Huang et al., 2010). No presente trabalho, o estudo
da família de multigenes da PAL realizado em pessegueiro possibilitou
identificar duas isoformas, PAL1 e PAL2. A análise filogenética das sequências
de proteínas dos genes PAL de Prunus com as sequências de outras espécies,
agrupou PAL1 e PAL2 próximas (Figura 20). Este resultado está de acordo
com o que dizem alguns autores, que apontam PAL1 e PAL2 como
pertencentes a uma mesma classe dentro da família das PAL, e que por isso
possuem estrutura similar e consequentemente desempenham funções
semelhantes (Raes et al., 2003; Rohde et al., 2004). A principal função
atribuída a PAL1 e PAL2 na maioria das espécies é de coordenar a biossíntese
de lignina (Raes et al., 2003; Souza & Abreu, 2007; Olsen et al., 2008; Huang
et al., 2010). Em geral, a análise filogenética das sequências de proteínas dos
genes PAL apresenta a formação de dois grupos, um composto pelas
dicotiledôneas e outro pelas monocotiledôneas (Kumar & Ellis, 2001; Tuan et
al., 2010), comportamento que também foi confirmado neste trabalho.
Em geral, a família de genes C4H também é composta de poucos
membros (Costa et al., 2003; Lucheta et al., 2007), e no genoma do
pessegueiro não foi diferente, sendo identificados apenas C4H1 e C4H2. A
identidade das duas isoformas foi confirmada pela verificação da sequência de
proteínas PPGPIPVP, que segundo Betz et al. (2001), está presente nas C4H2
e não na C4H1 (Figura 25).
Em virtude da similaridade filogenética, as
sequências de proteínas dos genes C4Hs são distribuídos em duas classes (I e
II) (Raes et al. , 2003; Lu et al., 2006; Liu et al., 2009), e na maioria das
espécies, ambas isoformas pertencem à classe I (Raes et al. , 2003; Lu et al.,
2006; Liu et al., 2009). Porém, no presente caso, enquanto C4H2 agrupou-se
com outros membros da classe I, C4H1 apresentou maior similaridade com
membros da classe II (Figura 21). Este resultado, embora não fora esperado,
está de acordo com Nedelkina et al. (1999), que observaram essa mesma
tendência para as espécies Zea mays e Phaseolus vulgaris. Inclusive se pode
verificar que essas mesmas espécies estão agrupadas com C4H1 de P.
139
persica na classe II da árvore filogenética. A localização das C4Hs em grupos
diferentes pode ser atribuída à estrutura diferencial dos dois genes, fato que
provavelmente confere a ambos funções distintas. Há uma série de funções
atribuídas à família C4H, como resposta a luz UV, ao ataque de patógenos, a
estresses nutricionais e a ferimentos sofridos pela planta. Porém, a mais
destacada é a sua realção com a biossíntese da lignina (Yang et al., 2005;
Bjurhager et al., 2010; Cook et al., 2012). Neste sentido, Lu et al. (2006),
estudando C4H1 e C4H2 em Populus tremuloides e P. trichocarpa, sugerem
que há uma maior expressão de C4H1 em tecidos com predominância de
lignina G (guaiacila), comum em órgãos tenros como caules jovens. Por outro
lado, a C4H2 é mais expressa em órgão com predomínio de lignina S
(siringuila), como tecidos fibrosos.
C4H1
C4H2
C4H1
C4H2
C4H1
C4H2
C4H1
C4H2
-----------------------------------XPLSIPIFGNWLQVGNDLNHRLLAS 25
MDLLLLEKTLLGLFIAVIVAITISKLRGKRFKLPPGPIPVPVFGNWLQVGDDLNHRNLTD 60
*:.:*:********:***** *:.
MSQTYGSIFLLKLGSKNLAVVSDPALATQVLHNQGIEFGSRPRNVVFDIFTGNGQDMVFT 85
LAKKFGDIFLLRMGQRNLVVVSSPDLAKEVLHTQGVEFGSRTRNVVFDIFTGEGQDMVFT 120
:::.:*.****::*.:**.***.* **.:***.**:*****.**********:*******
IYGDHWRKMRRIMTLPFFTNKVVQHYSNMWEEEMDQVVHDLNKDEGAKTEGIVIRKRLQL 145
VYGEHWRKMRRIMTVPFFTNKVVQQYRHGWESEAAAVVEDVKKYPGSATNGMVLRRRLQL 180
:**:**********:*********:* : **.*
**.*::* *: *:*:*:*:****
MLYNIMYRMMFNAKFESQEDPLFIEATRFNSERSRLAQSFEYNYGDFIPLLRPFLRGYLN 205
MMYNNMYRIMFDRRFESEEDPLFMKLKGLNGERSRLAQSFDYNYGDFIPILRPFLRGYLK 240
*:** ***:**: :***:*****:: . :*.*********:********:*********:
C4H1
C4H2
KCRDLQSRRLAFFNHYFVEQRRKIMAANGEKHK-ISCAIDHIIDAQIKGEISEENVLYIV 264
ICKEVKEKRIRLFKDYFVDERKKLSSTKTTTNEGLKCAIDHILDAQQKGEINEDNVLYIV 300
*::::.:*: :*:.***::*:*: ::: .:: :.******:*** ****.*:******
C4H1
C4H2
ENINVAAIETTLWSMEWAIAELVNHPTIQRKIRDEIS-IVHKGAPVTESNLHELPYLQAT 323
ENINVAAIETTLWSIEWGIAELVNHPEIQKKLRDELDSVLGPGVQITEPDTQKLPYLQAV 360
**************:**.******** **:*:***:. :: *. :**.: ::******.
VKETLRLHTPIPLLVPHMNLEEAKLGGYIIPKESKVVVNAWWLANNPAWWKDPEEFRPER 383
IKETLRLRMAIPLLVPHMNLNDAKLGSYDIPAESKILVNAWWLANNPALWKKPEEFRPER 420
:******: .**********::****.* ** ***::*********** **.********
C4H1
C4H2
C4H1
C4H2
C4H1
C4H2
FLDEECGTEAVAGGKVDFRYLPFGMGRRSCPGIILALPILGLVIAKLVSNFEMKAPQGVE 443
FLEEEAKVEANGN---DFRYLPFGVGRRSCPGIILALPILGITLGRLVQNFELLPPPGQS 477
**:**. .** ..
********:****************:.:.:**.***: .* * .
KIDVSEKGGQFSLHIANHSTVVFNPIKA 471
KLDTTEKGGQFSLHILKHSTIVLKPRS- 504
Figura 25. Múltiplo alinhamento de sequências de proteínas dos genes C4H1 e
C4H2 de P. persica, com identificação do motivo conservado PPGPIPVP.
Pelotas, RS, 2012.
As isoformas 4CL1 e 4CL2 foram agrupadas próximas, diferente da
4CL3, que está filogeneticamente distante (Figura 22). Segundo vários autores,
a família 4CL pode ser dividida em três classes (I, II e II). As 4CL1 e 4CL2
pertencem à classe I e a 4CL3 à classe II, enquanto a classe III é formada por
140
monocotiledôneas (Ehlting et al, 1999; Endler, et a., 2008; Silber et al., 2008;
Gaid et al., 2011). Neste estudo, foi observada a mesma divisão entre classes,
sendo as 4CL1 e 4CL2 agrupadas na classe I e a 4CL3 na classe II. Classes
diferentes estão associadas a funções distintas, desta forma, as 4CLs
pertencentes a classe I, normalmente são mais expressas em órgãos
lignificados, como o tecido do xilema, folhas, entrenós e raízes (Kumar e Ellis,
2003; Hu et al, 1998), indicando uma íntima participação dessas isoformas com
o processo lignificação. Por outro lado, a classe II tem sido relacionada com a
biossíntese de flavonóides e antocianinas (Hu et al, 1998; Cukovic et al 2001;
Kumar e Ellis, 2003; Gaid et al., 2011), e por isso as 4CL3 tem apresentado
maior expressão em órgãos como flores e frutas (Kumar e Ellis, 2003). Esta
relação, entre expressão e função das 4CLs foi confirmada neste estudo, onde
a expressão das 4CL1 e 4CL2 foi maior em tecidos da casca, altamente
lignificados, enquanto em tecido de calo, com baixa concentração de lignina, a
4CL3 foi mais expressa (Figura 26).
4CL3
4CL2
Tecido da casca
4CL1
4CL3
4CL2
4CL1
Tecido de calo
100pb
Figura 26. Expressão dos genes 4CL1, 4CL2 e 4CL3, em tecidos de calo
(cultivados in vitro) e de casca. Pelotas, RS, 2012.
Em geral, os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1 e 4CL2,
apresentaram na análise filogenética, um comportamento similar ao relatado
pela literatura, sugerindo uma participação ativa destas isoformas na
biossíntese de lignina. Estes resultados associados a “super” expressão destes
genes na combinação incompatível, sugere que, o engrossamento do caule na
região de união, principalmente na cultivar, é devido a uma elevada produção
de lignina pela planta, que busca estabilizar a união enfraquecida pela ação do
cianeto.
141
Por outro lado, a maior expressão da 4CL3 na combinação
incompatível pode estar associada á produção de flavonóides e antocianinas
que podem estar atuando na diminuição do estresse oxidativo gerado pelo
acúmulo de ROS.
142
7.7. Conclusões
A incompatibilidade de enxertia entre P. persica e P. mume é causada
pela prunasina, que quando hidrolisada, libera cianeto na interface do enxerto.
O cianeto, que é especialmente prejudicial à espécie de menor
capacidade cianogênica (P. persica), instala na planta uma situação de
estresse oxidativo pelo acúmulo de ROS.
Uma vez estressada, a planta busca sobreviver, ativando mecanismos
de defesa que são regulados pela rota fenilpropanóide. Desta forma, há um
aumento de expressão das três famílias de genes (PAL, C4H e 4CL) que
coordenam esta via, aumentando a produção de compostos antioxidantes e
estruturais, que buscam combater o estresse oxidativo e manter a união
estável.
143
7.8. Referências bibliográficas
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8. Conclusões
De forma geral, os três artigos desta Tese, geram em sequência uma linha
de
conhecimento
que
permite
compreender
melhor
o
mecanismo
de
incompatibilidade de enxertia existente entre P. persica e P. mume.
No Artigo 1, intitulado “Compatibilidade de enxertia em pessegueiro: análise
de crescimento e expressão gênica da Fenilalanina amônia-liase”, foram realizadas
avaliações bioquímicas e gênicas da composição fenólica de combinações
compatíveis e incompatíveis. Nas quais, foram constadas diferenças no perfil
fenólico da combinação incompatível em relação às compatíveis. Entretanto, não
ficou claro se essa diferença é a causa ou apenas uma consequência da
incompatibilidade. Por tanto, foram propostas duas hipóteses para estudos
subsequentes: a) A maior expressão de PAL1 e PAL2 na combinação incompatível
gera desequilíbrio na produção de compostos fenólicos de forma a causar
incompatibilidade de enxertia; e b) A maior expressão de PAL1 e PAL2 na
combinação incompatível é um reflexo do estresse gerado pelo verdadeiro agente
causador da incompatibilidade, que ainda é desconhecido.
O Artigo 2, cujo título é “Cianogênese, a causa da incompatibilidade de
enxertia em Prunus”, avalia o mecanismo de incompatibilidade por cianogênese
através da determinação da concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina
e prunasina na cultivar e no porta-enxerto das combinações. Sendo constatado que
a incompatibilidade presente entre P. persica e P. mume é devido à maior
concentração de prunasina em P. mume (porta-enxerto ‘Umezeiro’). Ao mesmo
tempo, observou-se, que há uma correlação altamente significativa entre o
mecanismo de incompatibilidade por cianogênese e a alteração do perfil de
compostos fenólicos. Fato que ajuda a responder a questão pendente do Artigo 1,
indicando que a hipótese mais provável é de que as alterações no perfil fenólico
sejam uma consequência da incompaibilidade por cianogênese.
Já o Artigo 3, intitulado “Expressão gênica de PAL, C4H e 4CL em resposta
a incompatibilidade de enxertia por cianogênese”, estuda a incompatibilidade por
cianogênese e as alterações na composição fenólica como um mecanismo único de
incompatibilidade de enxertia. Este último trabalho mostra que a incompatibilidade
por cianogênese causa alterações na via respiratória que desencadeiam uma série
de processos metabólicos que culminam em uma situação de estresse oxidativo,
149
especialmente para o genótipo de menor potencial cianogênico (P. persica). Como
forma de defesa contra esse estresse, a planta ativa a rota fenilpropanóide,
responsável pela produção de compostos fenólicos, produzindo compostos
antioxidantes para a diminuição do estresse oxidativo, e de ligninas para a
manutenção da estrutura da união do enxerto.
Com base nos resultados gerais apresentados e discutidos nos três artigos
deste trabalho, pode-se concluir que:
•
As combinações ‘Chimarrita’/’Umezeiro’ e ‘Maciel/Umezeiro’ são incompatíveis.
Entretanto, o grau de incompatibilidade não é total e a morte de plantas foi
verificada apenas em situações de estresse hídrico severo. Sendo assim,
acredita-se que em situações onde essas mesmas combinações sejam
cultivadas em condições ótimas de fertilidade do solo, irrigação e sanidade, o
grau de incompatibilidade manifestado pode não ser limitante;
•
A incompatibilidade observada entre P. persica e P. mume é resultado de uma
diferença quantitativa dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina,
onde a espécie P. mume possui maior concentração;
•
O glicosídeo cianogênico prunasina é um marcador bioquímico viável e estável
para a diagnose da incompatibilidade de enxertia entre espécies de Prunus.
Constatando-se
que
combinações
com
diferenças
elevadas
entre
as
concentrações de prunasina na cultivar e no porta-enxerto não são
recomendadas.
•
Em resposta ao estresse gerado pela cianogênese há uma “super” expressão
das famílias de genes fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase
(C4H) e 4-cumarato:CoA ligase (4CL); e
•
Os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3 apresentaram uma
importante relação com a incompatibilidade de enxertia em Prunus, podendo ser
empregados como indicadores de incompatibilidade de enxertia.
Trabalhos futuros, sobre o mecanismo de incompatibilidade de enxertia por
cianogênese, devem ser realizados em uma gama maior de combinações,
envolvento distintas espécies de Prunus.
150
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