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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da hemolinfa de ostras de mangue Crassostrea gasar Natanael Dantas Farias Orientadora: Profª Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua João Pessoa – 2014 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da hemolinfa de ostras de mangue Crassostrea gasar Natanael Dantas Farias Orientadora: Profª. Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua Trabalho - Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de conclusão de Curso), como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. João Pessoa – 2014 Catalogação na publicação Universidade Federal da Paraíba Biblioteca Setorial do CCEN F224c Farias, Natanael Dantas. Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da hemolinfa de ostras de mangue Crassostrea gasar / Natanael Dantas Farias. João Pessoa, PB, 2014. 52 p. : il. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal da Paraíba. Orientador: Profª Drª Patrícia Mirella da Silva Scardua. 1. Ostras. 2. Biologia da ostra. 3. Ostra de mangue. 4. Crassostrea gasar I. Título. UFPB/BS-CCEN CDU 564.1(043.2) UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Natanael Dantas Farias Caracterização morfológica e da capacidade fagocítica de hemócitos da hemolinfa de ostras de mangue Crassostrea gasar Trabalho – Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas Data:_________________________________ Resultado: ____________________________ BANCA EXAMINADORA: Dra. Patrícia Mirella da Silva Scardua - Orientadora UFPB/ Centro de Ciências Exatas e da Natureza/ Departamento de Biologia Molecular Dra. Márcia Rosa de Oliveira- Avaliador UFPB/ Centro de Ciências Exatas e da Natureza/ Departamento de Biologia Molecular Dr. Luis Fernando Marques dos Santos - Avaliador UFPB/ Centro de Ciências Exatas e da Natureza/ Departamento de Biologia Molecular AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a minha orientadora Dra. Patrícia Mirella da Silva Scardua pela confiança, pelo carinho e atenção em mim depositados. Por aceitar a minha entrada no Laboratório de Imunologia e Patologia de Invertebrados (LABIPI), desde a época da monitoria. Agradeço imensamente pela orientação de grande valor e também por ter conhecido essa pessoa maravilhosa que és, desde o início da graduação. Agradeço também pela paciência ímpar que teve e tem em me orientar. Ao professor Dr. Luis Fernando Marques dos Santos (DBM), a professora Dra. Márcia Regina Piuvezam (DFP) e a professora Dra. Márcia Rosa de Oliveira (DBM), por aceitarem o convite de serem membros da minha banca, bem como por fazerem parte de maneira construtiva, direta ou indiretamente, da minha graduação. Aos professores Dr. Isac Almeida e Dr. Robson, por disponibilizarem o citômetro de fluxo FACSCantoTM II, BD Biosciences. Aos meus pais José Edmar Leal Farias e Nilza Maria Dantas Farias, bem como às minhas irmãs Luciana Dantas e Marianne Farias, por todo apoio dedicado à minha formação. Bem como pela atenção e dedicação neste importante período da minha vida. Ao meu amigo e integrante do LABIPI, Msc. Fernando Ramos Queiroga, que me ajudou bastante na construção desse trabalho e na obtenção e análise dos resultados. Agradeço também pela paciência recíproca que tivemos. Aos meus amigos Anna Carolina, Cairé Barreto e Raianna Boni, por estarem juntos comigo desde o início da graduação e, juntos, atravessarmos os altos e baixos que ela nos trouxe. À Sâmia Sousa Duarte, Lucas Nunes Santana e Carol Costa, também membros do LABIPI pela companhia e pela amizade. À Cristina Toledo, Jaíse Paiva, Matheus Ramos e Heytor Queiroz, pela dedicação nos momentos que me senti para baixo e pela amizade. Ao pessoal do Laboratório de Biologia do Desenvolvimento (LABID), Leonardo Lima, Elis Torrezan, Jocelmo Cássio, Thaís Mangeon, Andrezza de Araújo, Thyago Fernandes e Dalliane Macedo, pelos construtivos e divertidos momentos que passamos juntos. RESUMO Os hemócitos são as células de defesa de moluscos bivalves e estão presentes na hemolinfa, líquido circulante análogo ao sangue de vertebrados. Estas células são capazes de realizar a fagocitose, principal mecanismo de defesa, e produzir moléculas citotóxicas capazes de destruir o agente patogênico. O objetivo de realizar este estudo foi caracterizar morfológica e funcionalmente as células imunológicas da ostra Crassostrea gasar. As ostras (n = 60) foram coletadas de um cultivo no estuário do Rio Mamanguape, na Paraíba, nos meses de março, agosto e setembro de 2013 e agosto, setembro e outubro de 2014. A hemolinfa foi extraída do músculo adutor. Para análise morfológica por microscopia óptica (n = 30) as células foram deixadas aderir espontaneamente em uma lâmina e foram coradas com vermelho neutro ou Giemsa. Para análise morfológica por citometria de fluxo, a mesma hemolinfa foi fixada com formol 4% em água do mar filtrada estéril, na proporção de 1:1. Para análise da fagocitose por citometria de fluxo (n = 30) as células foram adicionadas em contado com partículas fluorescentes inertes (látex) ou de natureza biológica (zymosan e E. coli). Quanto a caracterização morfológica, os resultados obtidos pelas duas técnicas mostram que a hemolinfa da ostra é bastante diversa e apresenta cinco subpopulações hemocitárias: granulócitos grandes, granulócitos pequenos, hialinócitos, hemócitos vesiculares e as células tipo-blásticas. As maiores células observadas foram os granulócitos grandes e hemócitos vesiculares e as menores foram as células do tipo-blásticas. As células mais abundantes na hemolinfa foram os hemócitos vesiculares e hialinócitos. Quanto a fagocitose, os hemócitos mostraram capacidade diferencial de fagocitar os três tipos de partículas com os quais foram desafiados; a maior taxa de fagocitose foi do zymosan (15,1% 0,94), seguida do látex (9,7% 0,45) e da E. coli (5,0% 0,54). Os diferentes tipos de hemócitos podem reconhecer e fagocitar diferencialmente as partículas; as de látex foram as mais fagocitadas pelos granulócitos (40,1% 1,87), enquanto que as de E. coli pelo hialinócitos e hemócitos vesiculares (7,2% 0,36). Os granulócitos foram as células com maior capacidade fagocítica de látex, quando comparado aos hialinócitos e hemócitos vesiculares juntos. Este é o primeiro estudo da caracterização morfológica de hemócitos de ostras C. gasar, uma espécie de grande importância comercial no Nordeste brasileiro. ABSTRACT The hemocytes are the defense cells of bivalve mollusks and are present in the hemolymph, analogous to the blood of vertebrates. These cells are able to perform phagocytosis, the main defense mechanism, and produce cytotoxic molecules capable of destroying the pathogen. The aim of this study was to characterize morphologically and functionally immune cells of the oyster Crassostrea gasar. Oysters (n = 60) were sampled in a oyster facility located at the estuary of the Mamanguape River, Paraíba, in March, August and September 2013 and August, September and October 2014. The hemolymph was extracted from the adductor muscle. For morphological analysis by light microscopy (LM; n = 30) cells were allowed to adhere spontaneously on a slide and stained with Giemsa or Neutral Red. To morphological analysis yet, the same hemolymph was fixed with formol 4% in filtered and sterilized water of sea, in proportion of 1:1. To analyze the phagocytosis by flow cytometry (FC; n = 30), the cells were added in contact with inert (latex) or biological (zymosan and E. coli) fluorescent particles.The results obtained by the two techniques (LM and FC) showed that oysters hemolymph is composed by five hemocytes subpopulations: large granulocytes, small granulocytes, hyalinocytes, vesicular hemocytes and blast-like cells. The largest cells were granulocytes and vesicular hemocytes and smallest cells were blast-like cells. The most abundant cells in the hemolymph were vesicular hemocytes and hyalinocytes. Concerning phagocytosis, C. gasar hemocytes showed differential ability to phagocyte the three types of particles which were challenged; the highest rate of phagocytosis was with zymosan (15,1% 0,94), followed by latex (9,7% 0,45) and then E. coli (5,0% 0,54). The different types of hemocytes can differentially recognize and phagocyte the particles; latex were preferentially phagocytosed by granulocytes (40,1% 1,87), whilst E. coli by hyalinocytes and vesicular hemocytes (0,36% 7,2). Granulocytes were more phagocytic than hyalinocytes and vesicular hemocytes for latex particles. This is the first study on morphological characterization of hemocytes of oysters C. gasar, a species with great commercial importance in the Northeast Brazil. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Sistema circulatório da ostra americana Crassostrea virginica 12 Figura 2. Diferenciação celular de hemócitos 14 Figura 3. Diferenciação celular proposta por análises morfológicas por citometria de fluxo 16 Figura 4. Mecanismos de defesa hemocitários 18 Figura 5. Mecanismos líticos para degradação de patógenos 20 Figura 6. Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos por ruptura de membrana 21 Figura 7. Modelo de funcionamento de um citômetro de fluxo 23 Figura 8. Citograma e histogramas representativos para fagocitose de partículas de látex fluorescentes 28 Figura 9. Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de Escherichia coli e zymosan fluorescentes 29 Figura 10. Granulócitos grandes da hemolinfa de Crassostrea gasar 33 Figura 11. Granulócitos pequenos da hemolinfa de Crassostrea gasar 34 Figura 12. Hemócitos vesiculares da hemolinfa de Crassostrea gasar 34 Figura 13. Hialinócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar 35 Figura 14. Células tipo-blásticas da hemolinfa de Crassostrea gasar 35 Figura 15. Populações de hemócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar observadas por citometria de fluxo 37 Figura 16. Fagocitose de diferentes partículas por hemócitos de Crassostrea gasar 38 Figura 17. Fagocitose (%) de diferentes partículas pelos hemócitos da ostra Crassostrea gasar 39 Figura 18. Fagocitose (%) diferencial de partículas de látex e Escherichia coli em ostras Crassostrea gasar 40 Figura 19. Capacidade fagocítica (%) de partículas de látex pelos hemócitos de Crassostrea gasar 40 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Média (± EP) do tamanho celular (µm e unidades arbitrárias) e da porcentagem (± EP) das subpopulações de hemócitos da hemolinfa da ostra Crassostrea gasar. Diferentes letras indicam diferenças significativas do tamanho entre as diferentes populações celulares. Análises independentes para cada técnica 31 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BPI - Bactericidal /permeability-increasing protein (Proteína bactericida de aumento de permeabilidade) FSC - Forward Scattered (Dispersão Frontal) LPS - Lipopolissacarídeo NET - Neutrophil extracellular traps (Armadilhas extracelulares de neutrófilos) NO - Nitric Oxide (Óxido Nítrico) NOS - Nitric Oxide Synthase (Óxido Nítrico Sintase) PAM - Peptídeo Antimicrobiano PAMP - Pathogen-associated molecular patterns (Padrão Molecular Associado ao Patógeno) PRP - Pattern Recognition Proteins (Proteínas de Reconhecimento Padrão) PRR - Pattern Recognition Receptors (Receptores de Reconhecimento Padrão) RNS - Reactive Nitrogen Species (Espécies Reativas de Nitrogênio) ROS - Reactive Oxygen Species (Espécies Reativas de Oxigênio) SOD - Superoxide Dismutase (Superóxido Dismutase) SSC - Side Scattered (Dispersão Lateral) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 11 1.1. Sistema de defesa de bivalve 11 1.2. Ontogenia e células imunoefetoras de bivalves 13 1.3. Mecanismos de defesa hemocitários 16 1.4. Mecanismos líticos na interação parasito-hospedeiro 19 1.4.1. Produção de espécies reativas de oxigênio 19 1.4.2. Produção de espécies reativas de nitrogênio 19 1.4.3. Produção de peptídeos anti-microbianos (PAMs) 20 1.4.4. Enzimas líticas 22 1.5. Outras funções dos hemócitos 22 1.6. Métodos de estudo dos hemócitos 22 1.7. Estudo de hemócitos em bivalves do Brasil 24 2. OBJETIVOS 25 2.1. Objetivo geral 25 2.2. Objetivos específicos 25 3. MATERIAL E MÉTODOS 26 3.1. Coleta dos animais 26 3.2. Extração de hemolinfa 26 3.3. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica 26 3.3.1. Monocamadas coradas com vermelho neutro 26 3.3.2. Monocamadas coradas com Giemsa 26 3.4. Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo 27 3.5. Caracterização da fagocitose dos hemócitos por citometria de fluxo 27 3.6. Análises estatísticas 30 4. RESULTADOS 31 4.1. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica 31 4.2. Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo 36 4.3. Caracterização funcional de hemócitos por citometria de fluxo 37 5. DISCUSSÃO 5.1. Caracterização morfológica dos hemócitos de Crassostrea gasar 41 41 5.2. Caracterização funcional dos hemócitos de Crassostrea gasar por citometria de fluxo 43 6. CONCLUSÕES 45 7. REFERÊNCIAS 46 11 1. INTRODUÇÃO 1.1. Sistema de defesa de bivalves O sistema imunológico de invertebrados, ao contrário dos vertebrados, é exclusivamente inato ou natural, pois não produz anticorpos específicos da imunidade adaptativa, não possuindo assim memória imunológica. As células imunoefetoras de bivalves são denominadas hemócitos e estão presentes no líquido circulante, a hemolinfa, análoga ao sangue de vertebrados, onde encontram-se também moléculas solúveis no plasma, que atuam no reconhecimento e degradação de agentes nãopróprios (Vargas-Albores & Barracco, 2001; Song et al., 2010) A hemolinfa de bivalves percorre um sistema circulatório aberto, que é bombeado por um coração protegido por uma fina camada de epitélio, o pericárdio, e contém 3 câmaras, sendo um ventrículo e dois átrios. Após ser bombeada pelo coração, a hemolinfa sai do ventrículo e penetra na artéria aorta anterior, onde supre o sistema gástrico e a região anterior do corpo e também penetra na artéria posterior. Essa artéria supre o músculo adutor e também o reto. A hemolinfa percorre as artérias até desembocar em seios hemolinfáticos que banham os diversos tecidos e órgãos, direcionando-a para as brânquias, retornando para o coração através de um conjunto de veias e desembocando no átrio por três veias (Fig. 1) (Cheng, 1981; Eble, 2009). 12 Figura 1 - Sistema circulatório da ostra americana Crassostrea virginica Brânquias Sistema arterial (A) e venoso (B) observados lateralmente. A hemolinfa é bombeada pelo coração (sistema arterial) do átrio (AT) para o ventrículo (V), seguindo para a artéria aorta anterior (AA), onde supre o sistema gástrico e outros órgãos da região anterior e posterior (PA), suprindo o músculo adutor (MA) e o reto. Ao atingir os seios hemolinfáticos que suprem esses órgãos, a hemolinfa retorna por um conjunto de veias e chega ao átrio por três veias (não mostradas). Adaptado de Eble (2009). 13 1.2. Ontogenia e células imunoefetoras de bivalves Embora existam algumas hipóteses para a origem dos hemócitos, o tecido hematopoiético em bivalves permanece desconhecido. Cheng (1981) sugere que o tecido conjuntivo seja o responsável pela origem destas células, que posteriormente migram para a hemolinfa, onde sofrem maturação e diferenciação. Esta hipótese teve o apoio do trabalho de Smolowitz; Miosky; Reinisch (1989) que identificaram, através da utilização de anticorpos, antígenos de superfície de hemócitos semelhantes à antígenos de superfície de células do tecido conjuntivo. Com respeito aos tipos hemocitários da hemolinfa de bivalves, existem controvérsias nas diferentes hipóteses de sua classificação. O primeiro trabalho de revisão sobre hemócitos de várias espécies de bivalves propôs sua classificação simples baseada em características morfológicas e citoquímicas e divide as células em duas grandes populações, os granulócitos e os hialinócitos (Cheng, 1981). Os granulócitos são geralmente as maiores células encontradas na hemolinfa, com a maior capacidade fagocítica e de produção de espécies reativas de oxigênio, sendo, portanto as células mais associadas à defesa (Fisher, 1988; Hine, 1999). Elas apresentam muitos filipódios e são facilmente distinguidas das outras pela abundância de vesículas ou grânulos citoplasmáticos que se dispõem geralmente na região endoplasmática, podendo ocupar também a ectoplasmática. Além disso, essas vesículas podem ser basófilas ou acidófilas, dependendo da espécie de bivalve analisada e do conteúdo enzimático presente em seu interior. O núcleo é excêntrico, basófilo e apresenta uma baixa relação núcleo:citoplasma. Os hialinócitos são células menores, com núcleo maior que o dos granulócitos e podem apresentar pouca ou nenhuma vesícula. Seu citoplasma é geralmente basófilo e possui uma alta relação núcleo:citoplasma. São células aptas a fagocitar, embora em menor proporção (Cheng, 1981). A diferenciação de hemócitos também foi postulada pela primeira vez por Cheng (1981) e hipotetiza duas linhagens celulares progenitoras: os granuloblastos e hialinoblastos. Essas células seriam capazes de dar origem aos granulócitos e aos hialinócitos maduros (Fig. 2). Como proposto por Cheng (1981), os granuloblastos se diferenciariam primariamente em progranulócitos, células menores que os granulócitos, contendo poucos grânulos citoplasmáticos, com núcleo e vesículas basófilas e capazes de fagocitar. Posteriormente, os progranulócitos se diferenciariam em granulócitos do tipo I, com tamanho mediano, numerosas vesículas citoplasmáticas basófilas ou acidófilas, com altos níveis de atividade de hidrolases e capazes de fagocitar. Por fim, os granulócitos do tipo I maturariam para o tipo II, sendo as 14 maiores células observadas, com presença do complexo de Golgi e lisossomos maduros, bem como com a maior atividade de hidrolases e maior atividade fagocítica. No caso de realizar uma fagocitose, os granulócitos do tipo II se caracterizariam por possuir poucas projeções, geralmente em polos opostos da célula, pouco ou nenhum grânulo, vacúolos de diversos formatos e tamanhos e menor atividade de hidrolases. Essa alteração morfológica ocorreria devido à ativação dos mecanismos de degradação intracelular, levando os granulócitos do tipo II à um aspecto “gasto”. Entretanto, os granulócitos do tipo II poderiam ainda se fusionar, formando células multinucleadas (Fig. 2). Os hialinoblastos por sua vez, se diferenciariam em prohialinócitos, com núcleo relativamente grande e pouco citoplasma, sem vesículas citoplasmáticas e essencialmente basófilas. Em seguida ocorreria a maturação de prohialinócitos em hialinócitos, que seriam as células maiores dessa linhagem, com poucos grânulos citoplasmáticos (Cheng, 1981) (Fig. 2). Figura 2 - Diferenciação celular de hemócitos Os hemócitos teriam sua origem em duas linhagens celulares, os granuloblastos e hialinoblastos. Os granuloblastos se diferenciariam em progranulócitos, granulócitos tipo I e granulócitos tipo II, aumentando gradativamente a capacidade fagocítica e amadurecimento de organelas. A fagocitose acarretaria uma mudança dos granulócitos tipo II para granulócitos “gastos” ou, no caso de fusão para células multinucleadas. Os hialinoblastos se diferenciariam em prohialinócitos e hialinócitos. Cheng (1981). Recentemente, trabalhos reunidos na revisão de Hine (1999) propuseram novas classificações envolvendo as subpopulações de granulócitos e hialinócitos. Os granulócitos com vesículas basófilas ou eosinófilas, bem como neutras, já foram observados nos bivalves das famílias Ostreidae (Crassostrea virginica, Crassostrea gigas e Ostrea edulis), Mytilidae (Mytilus edulis, Mytilus. galloprovincialis e Mytilus californianus), 15 Veneridae (Mercenaria mercenaria, Mercenaria campechiensis, Meretrix lusoria, Sunetta scripta, Villorita cyprinoides, Ruditapes decussatus e Tapes semidecussata), Myidae (Mya arenaria), Cardiidae (Cerastoderma edule), Arcidae (Scapharca inaequivalvis, Anadara ovalis), Tridacnidae (Tridacna crocea, Tridacna maxima) e Pinnidae (Pinna nobilis) (vide revisão de Hine, 1999). Os hialinócitos, apesar de conterem pouco ou nenhum grânulo, são células muito heterogêneas em nível de microscopia eletrônica. Por sua vez, podem ser subdivididos em grandes e pequenos, sendo este último muitas vezes chamado de células tipo-blásticas. Os hialinócitos grandes possuem núcleo grande, oval ou reniforme, com diversas organelas em seu citoplasma, e já foi identificado em espécies da família Ostreidae, Mytilidae e Veneridae. As células tipo-blásticas possuem núcleo central, relativamente pequeno e um citoplasma bem escasso em volume e organelas, sendo identificadas em alguns bivalves das famílias Ostreidae, Mytilidae, Dreissenidae, Veneridae, Cardiidae e Tridacnidae. Estas células também foram descritas para as espécies de ostras C. virginica, C.gigas, O. edulis e Saccostrea glomerata (Hine, 1999; Hégaret et al., 2003a; Lambert et al., 2003; Dang et al., 2012). Estudos recentes sugerem que as células tipo-blásticas, para a maioria dos bivalves, são precursoras dos hemócitos por apresentarem uma porção do citoplasma altamente basófila, o que indica a presença de ribossomos livres e sugere a imaturidade celular, além de características morfológicas semelhantes aos hialinócitos (Russell-Pinto et al., 1994; Wen et al., 1994; Carballal et al., 1997; Rebelo et al., 2013). Um novo grupo proposto por Hine (1999), os hemócitos vesiculares, encontrados apenas em alguns bivalves das famílias Ostreidae, Cardiidae, Dreissenidae e Veneridae, possuem características que são facilmente confundidas com os granulócitos, como a baixa relação núcleo:citoplasma e com os hialinócitos, pela ausência ou pouca quantidade de grânulos. Nos bivalves O. edulis, Dreissena polymorpha, M. mercenaria este grupo foi identificado como hialinócitos, hialinócitos e hemócitos grandes basófilos e hialinócitos e fibrócitos, respectivamente. Em M. lusoria, C. edule e S. inaequivalvis estes hemócitos foram classificados como hialinócitos granulares, hemócitos tipo III e hemócitos do tipo II, respectivamente. Rebelo et al. (2013) propõem ainda outro modelo de diferenciação celular de hemócitos da ostra C. rhizophorae baseado em características morfológicas, no tamanho e granulosidade interna, por análise de citometria-de-fluxo. Eles propuseram que as células tipo-blásticas iniciam o processo diferenciando-se em hialinócitos maiores, pelo aumento da quantidade de organelas. Em seguida, os hialinócitos podem desenvolver vesículas, adquirindo uma maior granulosidade interna e maior tamanho, tornando-se granulócitos. Os granulócitos, por fim, 16 poderiam degranular por estímulos extracelulares, conservando seu tamanho, mas com uma diminuição da granulosidade interna, sendo associados então aos hemócitos vesiculares (Fig. 3). Figura 3 - Diferenciação celular proposta por análises morfológicas por citometria de fluxo Este modelo de diferenciação corrobora a hipótese das células do tipo-blásticas serem precursoras de todos os hemócitos. O eixo X (FSC) representa o tamanho celular e o eixo Y (SSC) a granulosidade celular. O amadurecimento intracelular das células tipo-blásticas (BL) levaria à diferenciação em hialinócitos (HH) maiores, que posteriormente aumentariam a granulosidade e tamanho celular, se diferenciando em granulócitos pequenos (GP) e grandes (GG), que por sua vez poderiam degranular e tornarem-se hemócitos vesiculares (HV). Adaptado de Rebelo et al. (2013). 1.3. Mecanismos de defesa hemocitários A defesa contra os agentes infecciosos, realizada por hemócitos, acontece principalmente pelo mecanismo de fagocitose ou encapsulamento (Fig. 4). A fagocitose se realiza em sucessivas etapas: quimiotaxia, reconhecimento, englobamento e degradação. Primeiro ocorre a quimiotaxia, que é o movimento celular direcionado através de um gradiente de concentração químico, com objetivo de chegar a um destino, geralmente acontece da circulação para os tecidos. A quimiotaxia não acontece estritamente para a defesa do organismo, ela pode ocorrer também no reparo de tecido ou concha, onde os hemócitos têm que chegar no 17 local afetado (Donaghy et al., 2009b). Posteriormente, ocorre o reconhecimento do microrganismo por moléculas conservadas evolutivamente, chamadas de Padrões Moleculares Associados aos Patógenos (PAMPs, do inglês Pathogen-Associated Molecular Patterns), como por exemplo, os lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede celular de bactérias Gramnegativas e β1,3-glicanas presentes nas paredes de fungos. O reconhecimento dos PAMPs se dá por moléculas específicas denominadas Receptores ou Proteínas de Reconhecimento Padrão (PRR, do inglês Pattern Recognition Receptors ou PRP, Pattern Recognition Proteins) que se encontram na membrana dos hemócitos ou solúveis na hemolinfa (Song et al., 2010; Schmitt et al., 2011). Sete grupos de PRR são descritos em bivalves: receptores do tipo-Toll, scavengers, proteínas de reconhecimento de peptideoglicanas, proteínas de ligação à bactérias Gramnegativas, lectinas do tipo-C, galectinas e proteínas contendo thio-éster (Song et al., 2010). Após o reconhecimento, finalmente ocorre o englobamento do microrganismo em um vacúolo fagocítico para a sua destruição (Fig. 4). Várias vias de destruição podem ser ativadas, como a da produção e liberação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, a produção de peptídeos antimicrobianos (PAM) e produção de enzimas hidrolíticas, dentre elas a lisozima (Song et al., 2010; Schmitt et al., 2011). O encapsulamento, por sua vez, está relacionado com parasitas de maior tamanho, que neste caso, não poderiam ser fagocitados (Fig. 4). Esta resposta envolve a interação hemócitoparasita, onde os hemócitos se dispõem em várias camadas por volta do parasita, impedindo sua proliferação (Barracco & da Silva, 2008; Vargas-Albores & Barracco, 2001). Estudos sugerem que, posteriormente, os hemócitos secretam enzimas lisossomais e espécies reativas de oxigênio para degradar o parasita encapsulado (Chagot et al., 1987; Montes et al., 1997). 18 Figura 4 - Mecanismos de defesa hemocitários Os hemócitos, podem desencadear respostas dependentes principalmente do tamanho celular, fagocitose ou encapsulamento. Em ambos os casos, ocorre a quimiotaxia (passo 1), seguido do reconhecimento e adesão à superfície do microrganismo (passo 2). Quando o microrganismo é relativamente pequeno, o hemócito internaliza-o (passo 3) e o digere (passo 4). Se o parasito é maior, os hemócitos envolvem-no por camadas e secretaram substâncias que impedem sua disseminação pelo organismo (passo 3’) e outras que irão destruí-lo extracelularmente (passo 4’). Adaptado de Soudant; Chu; Volety (2013). 19 1.4. Mecanismos líticos na interação parasito-hospedeiro 1.4.1. Produção de espécies reativas de oxigênio A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês Reactive Oxygen Species) é um dos principais mecanismos de ação degradativa nas células de defesa de invertebrados, e seu maior efeito direto consiste na oxidação de proteínas, carboidratos ou bases do DNA. Sua produção pode ocorrer em grandes quantidades após o contato com os antígenos, processo chamado de “explosão respiratória” devido ao alto consumo de oxigênio (do inglês, respiratory burst). A catalisação da reação ocorre com o consumo de oxigênio molecular (O2) e é realizada pela ação da enzima NADPH oxidase presente nas membranas da célula: NADPH + 2O2 → NADP+ + 2O2- + H+ (Fang 2004, Robinson 2008). O produto desta reação, o ânion superóxido (O2-), pode ainda ser dismutado por enzimas como a superóxido dismutase (SOD, do inglês, Superoxide Dismutase) pela reação: SOD + O2- + O2- + 2H+ → 2H2O2 + O2, produzindo o peróxido de hidrogênio (H2O2), também um radical livre, tóxico para as membranas celulares. Outros radicais livres podem ser produzidos a partir da interação do O2- e H2O2 com outras moléculas intracelulares, como o radical hidroxila (OH∙), o oxigênio singlet (1O2) e o ácido hipocloroso (HOCl) (Robinson, 2008) (Fig. 5). Vários estudos têm verificado a produção de ROS pela detecção basal ou do respiratory burst em diversas ostras como C. virginica (Larson et al., 1989; Hégaret et al., 2003b), C. gigas (Lambert et al., 2003), Crassostrea ariakensis (Donaghy et al., 2009a) e Crassostrea gasar (Queiroga et al., 2013), mexilhões M. edulis (Pipe, 1992) e mariscos Ruditapes philipinarum (Cima et al., 2000) e M. mercenaria (Buggé et al., 2007). 1.4.2. Produção de espécies reativas de nitrogênio A produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS, do inglês Reactive Nitrogen Species), principalmente o óxido nítrico (NO), parece ter uma importante função na defesa de bivalves, embora não muito bem elucidada, e ocorre através da reação: Arginina + NADPH + O2 → Citrulina + NO + NADP+, catalisada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS, do inglês Nitric Oxide Synthase) (Fang, 2004; Schmitt et al., 2011) (Fig. 5). Os efeitos atribuídos às RNS envolvem passos bioquímicos muito mais complexos que o das ROS e dependem da condição redox do meio celular. O NO pode inibir, o crescimento celular de bactérias, através de mecanismos que sequestram o zinco de metaloproteínas necessárias à replicação e pode bloquear diretamente o processo respiratório. A produção de óxido nítrico pode ainda culminar no aumento da citotoxicidade das espécies reativas de 20 oxigênio, onde o NO pode interagir com O2- e produzir peroxinitrito (ONOO-) e outros intermediários tóxicos (Fang, 2004) (Fig. 5). Figura 2 - Mecanismos líticos para degradação de patógenos Fagossomo e diversas enzimas que agem para degradação de um parasito englobado. Complexo da NADPH oxidase que gera ânion superóxido (O2-) (1) a partir do oxigênio molecular (O2). O O2- pode ser dismutado (2) pela superóxido dismutase (SOD), produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2) ou reagir com óxido nítrico (3) (NO) produzindo peroxinitrito (ONOO-). A mieloperoxidase (MPO) pode converter H2O2 em HOCl (4) na presença de Cl-. Adaptado de Soudant et al. (2008). 1.4.3. Produção de peptídeos anti-microbianos (PAMs) Os peptídeos antimicrobianos são moléculas pequenas (menores que 10 kDa) que apresentam atividade microbicida e possuem natureza anfipática e catiônica. Atuam principalmente pela formação de poros na membrana e desequilíbrio iônico do patógeno, levando à lise celular (Schmitt et al., 2012). Dois modelos principais para a ruptura da membrana por peptídeos antimicrobianos são propostos, o modelo barril (do inglês “Barrel-stave” Model) e o modelo tapete (do inglês “Carpet” Model). No modelo barril, a formação de poros se dá pela agregação dos peptídeos, seguido da sua inserção na bicamada lipídica, onde os aminoácidos hidrofóbicos interagem com os lipídeos de membrana e os hidrofílicos entre si, formando um canal (Fig. 6A). O modelo tapete propõe que, os peptídeos em solução interagem primeiramente com os lipídeos e grupamentos fosfatos da face externa da membrana e posteriormente entre si, criando poros 21 transitórios que, com o aumento da concentração de peptídeos na membrana, levará a formação de micelas e a ruptura celular (Fig. 6B). Figura 3 – Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos por ruptura de membrana (A) O modelo barril propõe a agregação dos peptídeos e sua interação posterior com a bicamada lipídica formando poros que desestabilizarão ionicamente a célula. (B) O modelo tapete sugere que a interação dos peptídeos primeiramente com a superfície externa da bicamada lipídica e posteriormente entre si, formando micelas e destruindo a membrana plasmática. Li; Zhao; Song (2009). Outros peptídeos antimicrobianos podem atuar sobre moléculas envolvidas em processos vitais como enzimas ou moléculas menores relacionadas ao metabolismo celular, não causando ruptura da membrana. Os PAMs atuam como barreira primária do sistema de defesa, prevenindo o crescimento e a instalação de patógenos nos tecidos, sendo altamente expressos nos epitélios e liberados no muco (Li et al., 2009; Casas et al., 2011). A síntese de PAMs ocorre de maneira constitutiva e são armazenados em vesículas dentro dos hemócitos para liberação após interação com o patógeno. Essa síntese ocorre principalmente em órgãos que estão em contato frequente com o meio externo, como brânquias e manto (Mitta et al., 2000; Zhao et al., 2007). Diversos PAMs foram descritos em bivalves, como nos mexilhões M. galloprovincialis (Hubert et al., 1996), M. edulis (Charlet et al., 1996) e nas ostras C. gigas (Gonzalez et al., 2007). Em C. gigas, alguns peptídeos antimicrobianos foram caracterizados e incluídos nas famílias: defensinas e PAM ricos em prolina. As defensinas foram identificadas primeiramente a partir do manto (Cg-Defm) e posteriormente nos hemócitos (Cg-Defh1 e Cg-Defh2) e ambos possuem a capacidade de impedir a síntese de peptídeoglicanos de bactérias Gram-positivas. 22 Um PAM rico em prolina foi identificado também nos hemócitos de C. gigas (Cg-Prp) e, embora sua função seja pouco conhecida, observa-se uma atuação em sinergia com as defensinas hemocitárias. Outro PAM foi identificado e caracterizado em C. gigas pela atividade bactericida contra bactérias Gram-negativas e atua através da permeabilização da membrana externa e interna (BPI, do inglês Bactericidal /permeability-increasing protein) (Schmitt et al., 2011, 2012). 1.4.4. Enzimas líticas Os lisossomos de hemócitos contém uma variedade de enzimas hidrolíticas, como a βglucuronidase, arilsulfatase, lisozima e catepsina B, no interior de vesículas que podem ter o pH ácido ou básico e ocupam o citoplasma (Pipe, 1990). As lisozimas desempenham duas funções necessárias para a sobrevivência de bivalves, auxiliam na defesa contra patógenos e na digestão intracelular. Nos hemócitos, as lisozimas secretadas atuam principalmente quebrando moléculas de peptideoglicanos, fundamentais na estrutura da parece bacteriana (McHenery et al., 1986, Schmitt et al., 2011). Em relação à digestão, as lisozimas já foram identificadas em células da glândula digestiva de M. edulis e de C. gigas (Takahashi et al., 1986; Bachali et al., 2002). 1.5. Outras funções dos hemócitos Atualmente, outras funções têm sido atribuídas aos hemócitos de ostras de acordo com Marigómez et al. (2002). Como por exemplo, a remoção de metais tóxicos da circulação por fagocitose (complexos maiores) ou pinocitose (íons livres) e seu posterior transporte para órgãos de detoxificação, como brânquias e glândula digestiva. Elementos como Cu (Cobre), Zn (Zinco) e Cd (Cádmio) podem então ser absorvidos pelo organismo dos bivalves, em seguida serem associados com proteínas citosólicas ou internalizadas em lisossomos de hemócitos para posterior transporte (vide revisão MARIGÓMEZ et al., 2002). 1.6. Métodos de estudo dos hemócitos Diversos métodos são empregados nos estudos de caracterização morfológica e funcional das células imunoefetoras de bivalves (Hine, 1999). Entre eles estão o uso de corantes histológicos para ressaltar o caráter básico ou ácido do citosol ou dos seus componentes intracelulares e a microscopia eletrônica de transmissão que revela características ultraestruturais (Wootton & Pipe, 2003; Chang et al., 2005). Existe ainda a produção de 23 anticorpos monoclonais específicos para antígenos de superfície de hemócitos ou intracelulares, utilizados tanto na tentativa de caracterizar ou localizar as células em estádios de desenvolvimento (Renault et al., 2001; Xue & Renault, 2001), quanto de desvendar sua ontogenia (Smolowitz et al., 1989). Mais recentemente uma técnica muito utilizada em estudos de vertebrados, a citometria de fluxo, vem despontando nos estudos da morfologia e funções de diferentes subpopulações celulares da hemolinfa de bivalves. Esta técnica consiste na utilização de um equipamento que contém lasers que irão atingir células em suspensão, unitariamente e por um fluxo contínuo, difratando a luz ao atravessá-las e, posteriormente, atingindo detectores específicos, gerando assim diversas medidas simultâneas (Fig. 7). Dentre os detectores, destacam-se o Forward Scattered (FSC), que detecta o tamanho celular por receber a luz refratada frontalmente e o Side Scattered (SSC), que detecta a complexidade interna celular, recebendo a luz difratada nas laterais (Fig. 7). Existem ainda detectores de fluorescência, que serão atingidos por diferentes comprimentos de onda provenientes da excitação de fluoróforos usados para marcar componentes celulares (BD Biosciences, 2007) (Fig. 7). A utilização da citometria de fluxo traz a vantagem de permitir a realização de análises simultâneas em uma mesma amostra (Allam et al., 2002; Hégaret et al., 2003b; Donaghy et al.; 2009, Wang et al.; 2012). Figura 4 - Modelo de funcionamento de um citômetro de fluxo Vários parâmetros celulares são medidos em citometria-de-fluxo. O laser azul (488 nm) atinge as células em suspensão e em fluxo contínuo. A célula refrata a luz e é captada por um sensor de tamanho (Forward Scattered, FSC), localizado à frente do laser; por um sensor de complexidade interna (Side Scattered, SSC), que capta a luz difratada, localizado nas laterais. BD Biosciences (2007). 24 1.7. Estudo de hemócitos em bivalves do Brasil No Brasil, pouco se sabe ainda sobre os mecanismos de defesa de bivalves e poucos trabalhos de caracterização morfológica e funcional dos tipos hemocitários foram realizados. O primeiro estudo foi o da caracterização dos hemócitos do mexilhão Perna perna utilizando diversos métodos de coloração, como o Giemsa para afinidade de grânulos, método de Gomori para detecção de fosfatases ácidas e Azul de Sudan para marcação de lipídeos. Neste estudo foi caracterizada a produção de ânion superóxido e capacidade fagocítica dos hemócitos (Barracco et al., 1999). Posteriormente, os hemócitos da ostra C. rhizophorae foram caracterizados de forma similar (Barth et al., 2005). Schleder et al. (2008) caracterizou morfologicamente os hemócitos do pectinídeo Nodipecten nodosus utilizando a coloração de Giemsa e funcionalmente, detectando a produção de PAMs, atividade de fenoloxidase e atividade de aglutinação. E recentemente, dois estudos utilizaram a citometria de fluxo, um deles para caracterizar a produção de ROS, capacidade fagocítica e de aglutinação de hemócitos da ostra C. gasar (Queiroga et al., 2013) e outro para caracterizar morfológica e ultraestruturalmente os hemócitos da ostra C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013) Até o presente momento não há estudos da caracterização morfológica de hemócitos de ostras C. gasar, uma espécie de grande importância comercial no Nordeste brasileiro. 25 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Caracterizar morfológica e funcionalmente as células imunológicas da ostra Crassostrea gasar. 2.2. Objetivos específicos 2.2.1. Quantificar e caracterizar morfologicamente as células da hemolinfa da ostra C. gasar; 2.2.2. Caracterizar a capacidade fagocítica das células da hemolinfa da ostra C. gasar. 26 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Coleta dos animais Foram realizadas seis coletas de ostras da espécie Crassostrea gasar adultas (> 60 mm) nos meses de março (n = 10), agosto (n = 10) e setembro (n = 10) de 2013 e agosto (n = 10), setembro (n = 10) e outubro (n = 10) de 2014, em um cultivo comercial localizado no estuário do Rio Mamanguape (Marcação, PB - S06°47’08,2”; WO34°59’46,7”). As três primeiras coletas foram direcionadas para a caracterização morfológica dos hemócitos enquanto que as três últimas para a caracterização funcional. Todos os animais foram identificados a nível de espécie por biologia molecular (Queiroga et al. no prelo). 3.2. Extração de hemolinfa A hemolinfa das ostras foi retirada do músculo adutor com uma seringa de 1 ml acoplada a uma agulha (21 G) e foi imediatamente colocada em microtubos sobre gelo e em seguida preparada para análises em microscopia óptica e citometria de fluxo, como descrito abaixo. 3.3. Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica 3.3.1 Monocamadas coradas com vermelho neutro A hemolinfa (225 µl) de cada ostra (n = 10) foi corada com uma solução do corante vital vermelho neutro (concentração final de 0,005%) que penetra nos compartimentos ácidos das células vivas. Após 5 min. as células em suspensão foram observadas ao microscópio com contraste de fase (Olympus BX41) e fotografadas durante 20 min. Nesta preparação foram observadas a emissão de pseudópodes e a presença ou ausência de vesículas ácidas nos hemócitos. 3.3.2 Monocamadas coradas com Giemsa A hemolinfa (100 µl) de cada ostra (n = 27) foi adicionada em uma lâmina posicionada sobre papel umedecido, para formação de uma monocamada de hemócitos por adesão espontânea, durante aproximadamente 5 min a 25 °C. Após este tempo, a monocamada foi 27 fixada com metanol (5 min.) e corada com Giemsa puro (Newprov) por 5 min. e após secas foram montadas com Entellan (MERCK). As amostras foram observadas em campo claro e fotografadas no microscópio Olympus BX41. Cada célula (n 100 células / animal) foi caracterizada segundo o padrão de coloração de seus grânulos (basófilos ou acidófilos), relação núcleo:citoplasma (baixa ou alta), formato (circular ou estrelado) e tamanho celular (medida do maior eixo, sem considerar a projeção dos pseudópodes). Os tipos celulares encontrados foram quantificados e a porcentagem determinada sobre o total de células analisadas. 3.4 Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo A hemolinfa (200 µl) de cada ostra (n = 10) foi imediatamente fixada em solução de formaldeído à 4% em água do mar filtrada (0,22 µm) estéril na proporção de 1:1. Cada amostra foi analisada em citômetro de fluxo pelo período de 30s, onde foi obtido o primeiro gráfico de tamanho em função da complexidade interna (FSC vs SSC) e o experimento foi repetido três vezes (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, California, USA). 3.5 Caracterização da fagocitose dos hemócitos por citometria de fluxo Para a avaliação da capacidade fagocítica dos hemócitos da ostra C. gasar, diferentes partículas foram utilizadas nos ensaios: partículas inertes fluorescentes de látex (Polysciences, 2 µm), porções da parede de fungo, o zymosan (Life Technologies, 3µm) e bactérias Gramnegativas Escherichia coli (Life Technologies, 1µm). A hemolinfa de cada ostra (200 µl) (n = 10) foi subdividida em duas subamostras, em uma foi adicionada a partícula teste (8 µl) na proporção de 1:10 (hemócito:partículas) e na outra, foi adicionado o volume correspondente de água do mar filtrada estéril (amostra controle). As suspensões celulares foram incubadas por 1 hora à 25 °C e analisadas em citômetro de fluxo (FACSCantoTM II, BD Biosciences, San Jose, California, USA). O experimento foi repetido três vezes. Para a análise da fagocitose no gráfico de morfologia (FSC vs SSC), as populações de hemócitos foram selecionadas para serem representadas em um histograma contendo o número de hemócitos em função da fluorescência das partículas, verde (partículas de látex) ou vermelha (zymosan e E. coli). As células-blásticas não apresentaram capacidade fagocítica e foram retiradas desta análise. 28 Para a fagocitose de látex visualizou-se populações de hemócitos contendo diferentes quantidades de partículas fagocitadas (1 a 2 partículas e 3 ou + partículas) (Fig. 8A e C). Na fagocitose de zymosan e E. coli, não houve formação de picos definidos de fluorescência. Com isto, para determinação da porcentagem de células fagocíticas o processo foi distinto. Uma região no histograma da amostra sem adição de partículas (controle; Fig. 9B) foi feita e a mesma região foi analisada na amostra com adição da partícula fluorescente (tratado; Figs. 9C e 9D). A porcentagem de células com fluorescência da amostra tratada foi diminuída da amostra controle (Fig. 9B). Figura 5 - Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de partículas de látex fluorescentes Citogramas representativos das populações analisadas, correspondendo aos hemócitos totais (A) e as subpopulações hemocitárias (C). Histogramas (B e D) indicando a quantidade de hemócitos não fagocíticos (M0) e fagocíticos (M1) que fagocitaram 1 a 2 partículas (M2) e mais que 3 (M3). O eixo X (FSC) representa o tamanho celular e o Y (SSC) a granulosidade interna. Nos histogramas, o eixo Y representa a quantidade de células e no eixo X o canal de fluorescência vermelho. 29 Figura 96 - Citogramas e histogramas representativos para fagocitose de Escherichia coli e zymosan fluorescentes Citogramas representativos da população total de hemócitos analisada (A). Histogramas de fluorescência dos hemócitos sem adição de partículas (B; amostra controle) e com adição de E. coli (C) e de zymosan (D). As regiões de fagocitose foram determinadas pelas linhas. No citograma, o eixo X (FSC) representa o tamanho celular e o Y (SSC) a granulosidade interna. Nos histogramas, o eixo Y representa a quantidade de células e no eixo X o canal de fluorescência vermelho. 30 3.6 Análises estatísticas Os dados de porcentagem foram transformados para arco cosseno [acos(sqrt (X/100))] para respeitar aos requerimentos da ANOVA. A normalidade de todos os grupos de dados foi verificada com o teste D’Agostino & Person. O teste de Kruskal-Wallis com post-hoc teste de separação de médias de Dunns foi realizado para analisar dados não-paramétricos, como o tamanho celular das populações de hemócitos obtidos por análise em microscopia óptica das monocamadas de hemócitos e por citometria de fluxo. Para a comparação das proporções celulares obtidas com as duas técnicas citadas anteriormente, foi realizado o teste de independência (teste G), utilizando uma tabela de contingência e o teste χ² (Rohlf & Sokal, 1981). Uma ANOVA Two-way foi realizada para comparar a fagocitose de diferentes partículas: E. coli, Zymosan e látex. A réplica do experimento (coletas de agosto, setembro e outubro de 2014) foi considerada um segundo fator. Não havendo diferenças entre as réplicas, foi realizada uma ANOVA one-way, sendo o tipo de partícula o fator principal, e um post-hoc teste de separação de médias de Tukey. O teste T não-pareado foi utilizado para 1) comparar a fagocitose de E. coli e látex (separadamente); e 2) comparar a capacidade fagocítica de partículas de látex (separadamente) entre as subpopulações de hemócitos (granulócitos e hemócitos hialinos + hemócitos vesiculares). Os dados estão representados como média ± erro padrão (EP). Todas as análises foram feitas no software GraphPad versão 5.0. 31 4. RESULTADOS Caracterização morfológica dos hemócitos por microscopia óptica A hemolinfa das ostras da espécie C. gasar apresentou em sua composição diferentes populações celulares que se mostraram mais ou menos definidas segundo a técnica utilizada. Por microscopia óptica cinco populações puderam ser distinguidas por suas características morfológicas e tintoriais, sendo assim denominadas: granulócitos grandes, granulócitos pequenos, hemócitos vesiculares, hialinócitos e células tipo-blásticas. Os granulócitos grandes apresentaram o maior tamanho entre as subpopulações observadas (31,5 ± 0,31 µm; n = 27; Tab. 1). Este tipo celular apresentou muitos grânulos basófilos (Figs. 10B e D) distribuídos por todo o citoplasma e se coraram também com o vermelho neutro (Figs. 10A e C). A porcentagem observada deste tipo celular foi de 14,4% (± 1,58; Tab. 1). Em ambos os tipos de monocamadas, estas células projetaram filipódios (Fig. 10A) e lamelipódios (Fig. 10C). Observou-se o ectoplasma e o endoplasma contendo os grânulos quando corados com Giemsa (Figs. 10B e D). O núcleo mostrou-se excêntrico na maioria das células, redondo ou oval e com baixa relação núcleo:citoplasma. Tabela 1. Média (± E. P.) do tamanho celular (µm e unidades arbitrárias) e da porcentagem (± E. P.) das subpopulações de hemócitos da hemolinfa da ostra Crassostrea gasar. Diferentes letras indicam diferenças significativas do tamanho entre as diferentes populações celulares. Análises independentes para cada técnica. Hemócitos Granulócito Grande Granulócito Pequeno Hemócito Vesicular Hialinócito Células Blásticas Giemsa* Citometria* Giemsa Citometria Porcentagem (%) Tamanho (µm) Tamanho (u.a.) Porcentagem (%) 31,5 ± 0,31a 369,5 ± 12,96 a 14,4 ± 1,59 6,3 ± 0,79 694 27# 11,9 ± 0,22 c 160,3 ± 4,32 b 4,8 ± 1,10 1,3 ± 0,15 282 27# 23,1 ± 0,24 b 303,1 ± 2,34 a 31,7 ± 2,66 38,2 ± 2,13 528 27# 10,7 ± 0,13 c 5,4 ± 0,06 d 138,7 ± 2,3 b 43,55 ± 0,35 d 33,0 ± 2,12 16,0 ± 1,53 43,8 ± 1,85 10,6 ± 1,24 529 27# 489 27# Nt Np * p < 0,0001 (Kruskal-Wallis com post-hoc teste de Dunns); Nt = Número de células medidas por microscopia óptica; Np = Número de animais usados para cálculo da porcentagem. # 3 animais foram descartados. 32 Os granulócitos pequenos apresentaram tamanho médio de 11,9 µm (± 0,21; n = 27; Tab. 1) e foram as células menos abundantes (4,8% ± 1,09; Tab. 1). Os grânulos mostraramse abundantes e quando corados com vermelho neutro recobriam o núcleo (Figs. 11A e B), que foi visualizado quando a célula foi corada com Giemsa. Seus grânulos eram basófilos (Figs. 11A e B). Estas células apresentaram baixa relação núcleo:citoplasma e raramente emitiam pseudópodes. Os hemócitos vesiculares apresentaram tamanho médio de 23,1 µm (± 0,24; n = 27; Tab. 1) com grânulos refringentes (Fig. 12A) e raramente basófilos, com citoplasma levemente acidófilo (Fig. 12B) e sua porcentagem na hemolinfa foi de 31,7% (± 2,65; Tab. 1). A célula mostrou dois tipos de formatos após adesão espontânea, circular ou estrelado. O núcleo era excêntrico ou central e a célula possuía uma baixa relação núcleo:citoplasma. A célula apresentou projeções na forma de lamelipódios, sendo possível observar o ectoplasma e o endoplasma (Fig. 12B). Os hialinócitos apresentaram tamanho de 10,7 µm (± 0,12; n = 27; Tab. 1), sendo este similar ao dos granulócitos pequenos. O citoplasma não apresentou grânulos, exceto em raras exceções onde observou-se grânulos basófilos. Este tipo celular foi o mais abundante na hemolinfa (33,0% ± 2,12; Tab. 1). As células eram geralmente arredondadas ou alongadas e raramente emitiam projeções citoplasmáticas (Fig. 13A). O núcleo era grande, excêntrico ou central e possuía escasso citoplasma basófilo (Fig. 13B). Esta célula apresentou alta relação núcleo:citoplasma (Fig. 13). 33 Figura 10 - Granulócitos grandes da hemolinfa de Crassostrea gasar Hemócitos corados com vermelho neutro (A e C, contraste de fase) e Giemsa (B e D). Note as projeções citoplasmáticas do tipo filipódios e lamelipódios (setas largas), o ectoplasma (setas finas), o endoplasma contendo numerosos grânulos (setas pontilhadas) e os núcleos (pontas de flecha). 34 Figura 11 - Granulócitos pequenos da hemolinfa de Crassostrea gasar Hemócitos corados com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Note as projeções citoplasmáticas do tipo filipódios (seta larga), o ectoplasma (seta fina), o endoplasma contendo numerosos grânulos (setas pontilhadas) e o núcleo (ponta de flecha). Figura 7 - Hemócitos vesiculares da hemolinfa de Crassostrea gasar Hemócitos corados com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Note as projeções citoplasmáticas do tipo filipódios e lamelipódios (setas largas), o ectoplasma (setas finas), o endoplasma contendo alguns grânulos refringentes ou raramente basófilos (setas pontilhadas) e os núcleos (pontas de flecha). 35 Figura 8 - Hialinócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar Hemócitos corados com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Note as projeções citoplasmáticas do tipo filipódios (setas largas), o endoplasma (seta pontilhada) e os núcleos (pontas de flecha). As células do tipo-blásticas foram as menores observadas, apresentando um tamanho médio de 5,4 µm (± 0,05; n = 27; Tab. 1) e porcentagem de 16,0% (± 1,53; Tab. 1). Seu núcleo era excêntrico, com citoplasma fortemente basófilo e possuia uma alta razão núcleo:citoplasma. Raramente se observou filipódios em células do tipo-blásticas coradas com vermelho neutro (Fig. 14). Figura 9 - Células tipo-blásticas da hemolinfa de Crassostrea gasar Células tipo-bláticas coradas com vermelho neutro (A, contraste de fase) e Giemsa (B). Observe a pequena área citoplasmática (seta pontilhada) e o núcleo (ponta de flecha). 36 Caracterização morfológica dos hemócitos por citometria de fluxo Os citogramas (tamanho vs compexidade interna, respectivamente, FSC vs SSC) indicaram a presença de cinco subpopulações de hemócitos (Fig. 15; Tab. 1). Os hemócitos com menor tamanho e granulosidade foram denominados de células tipo-blásticas (Fig. 13. BL). Duas outras populações celulares com maior tamanho e granulosidade foram classificadas como hialinócitos (Fig. 15. HH) e hemócitos vesiculares (Fig. 15. HV). As duas populações com maior granulosidade, mas similares entre si, foram classificados como granulócitos, e estas apresentaram diferenças em tamanho, correspondendo aos granulócitos grandes (Fig. 15. GG) e pequenos (Fig. 15. GP). As células mais frequentes na hemolinfa das ostras foram os hialinócitos e hemócitos vesiculares e as menos frequentes foram os granulócitos pequenos (Tab. 1). Este resultado ocorreu tanto para as monocamadas coradas com Giemsa quanto por citometria de fluxo. No entanto, as proporções celulares obtidas com elas diferiram (G = 9,27; GL = 4) (Tab. 1). 37 Figura 105 - Populações de hemócitos da hemolinfa de Crassostrea gasar observadas por citometria de fluxo Citograma morfológico representativo onde o eixo X (FSC-Height) representa o tamanho celular e o eixo Y (SSC-Height) a granulosidade interna. Destacam–se 5 subpopulações de hemócitos, denominadas de células tipo-blásticas (BL); hialinócitos (HH); hemócitos vesiculares (HV); granulócitos grandes (GG) e granulócitos pequenos (GP). Caracterização da capacidade fagocítica de hemócitos por citometria de fluxo Os hemócitos da ostra C. gasar foram capazes de fagocitar os três tipos diferentes de partículas com os quais foram desafiados: látex (Fig. 16A e B), E. coli (Fig. 16C e D) e zymosan (Fig. 16E e F). No entanto, os hemócitos mostraram uma atividade fagocítica diferencial, ou seja, as partículas de zymosan (15,1% 0,94), seguidas das partículas de látex (9,7% 0,45) foram as mais fagocitadas pelos hemócitos quando comparadas com as bactérias E. coli (5,0% 0,54) (p < 0.0001) (Fig. 17). 38 Figura 11 - Fagocitose de diferentes partículas por hemócitos de Crassostrea gasar Fagocitose de partículas de látex (A e B), E. coli (C e D) e zymosan (E e F) observadas em microscopia de contraste de fase e (coluna da direita) e em campo escuro (coluna da esquerda). As partículas ou agregados de partículas fagocitados estão indicadas pelas flechas. 39 Figura 17 - Fagocitose (%) de diferentes partículas pelos hemócitos da ostra Crassostrea gasar 20 % de hemócitos a 15 b 10 c 5 0 t Lá ex an os m Zy c E. i ol As diferentes letras indicam diferenças da fagocitose entre os três tipos de partículas testadas. (ANOVA One-way; p < 0.0001). No caso das partículas de látex e de E. coli foi possível analisar a fagocitose diferencial entre duas populações de hemócitos: os granulócitos e os hialinócitos + hemócitos vesiculares (Fig. 18). Para as partículas de látex, os granulócitos foram significativamente (teste t; p < 0.0001) mais fagocíticos (40,1% 1,87) que os hialinócitos + hemócitos vesiculares (7,2% 0,36) (Fig. 18A). Ao contrário, em relação as bactérias E. coli, os hialinócitos + hemócitos vesiculares foram mais fagocíticos (teste t; p < 0.0001) (5,0% 0,80) que os granulócitos (0,3% 0,15) (Fig. 18B). 40 Figura 128 - Fagocitose (%) diferencial de partículas de látex e E. coli em ostras Crassostrea gasar Fagocitose de partículas de látex (A) e de E. coli (B) por diferentes subpopulações de hemócitos. HH: Hialinócitos; HV: Hemócitos vesiculares; G: Granulócitos. * Indicam diferenças significativas (Teste t; p < 0.0001) entre as subpopulações de hemócitos para cada partícula. A capacidade fagocítica das partículas de látex foi determinada para as duas populações de hemócitos: granulócitos e hialinócitos + hemócitos vesiculares separadamente e está representado na Fig. 19. Os hialinócitos + hemócitos vesiculares foram as células que mais fagocitaram (p < 0.0001) 1 a 2 partículas (63,0 0,82%) enquanto que os granulócitos fagocitaram significativamente 3 ou + partículas (42,2 1,79%) (Fig. 19). Figura 19 – Capacidade fagocítica (%) de partículas de látex pelos hemócitos de Crassostrea 100 * 80 60 * 40 20 pa rt íc ul as G ) ( 3 pa rt íc ul as ) 3 2 H H +H G V ( ( 2 ( V H + H H pa rt íc ul as ) 0 pa rt íc ul as ) Capacidade Fagocítica (%) gasar Os hialinócitos + hemócitos vesiculares (HH + HV) possuem uma alta capacidade de fagocitar partículas de látex (2 partículas ou menos, enquanto que os granulócitos (G) possuem uma maior capacidade de fagocitar 3 ou mais partículas. (Teste t; p < 0.0001). 41 5. 5.1. DISCUSSÃO Caracterização morfológica dos hemócitos de C. gasar O presente trabalho representa a primeira caracterização morfológica e funcional dos hemócitos da ostra C. gasar. Recentemente, nosso grupo de pesquisa fez o primeiro estudo em células do sistema de defesa (hemócitos) desta espécie (Queiroga et al., 2013) e avaliou algumas respostas celulares (fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio) frente à infecção pelo protozoário do gênero Perkinsus. Na hemolinfa das ostras C. gasar foram identificadas duas populações principais de hemócitos, os granulócitos e os hialinócitos, já descritas e bem caracterizadas para os bivalves (Cheng, 1981; Hine, 1999). Queiroga et al. (2013) não tiveram a pretensão de realizar um estudo minucioso das células de defesa desta ostra, mas igualmente identificaram por citometria de fluxo as duas principais populações (granulócitos e hialinócitos). No presente estudo, os hemócitos diferenciaram-se por suas características citoquímicas e morfológicas, incluindo o tamanho, granulosidade interna e relação núcleo:citoplasma, em cinco subpopulações: os granulócitos grandes, os granulócitos pequenos, os hialinócitos, os hemócitos vesiculares e as células do tipo-blásticas. Subpopulações hemocitárias foram descritas para várias espécies de bivalves (Hine, 1999) e foram correspondentes as observadas no presente estudo. Os granulócitos em geral se diferenciam dos demais hemócitos por possuírem inúmeras vesículas no seu citoplasma, facilmente distinguíveis no citosol por um aspecto granuloso, quando coradas (associação com corantes) ou não (refringência da luz) e observadas ao microscópio de luz. Esta característica não é observada em nenhum outro tipo de hemócito (Hine, 1999). Um estudo com hemócitos do mexilhão M. edulis, mostrou que estas vesículas comportam diversas enzimas, dentre elas hidrolases ácidas e a lisozima, responsáveis pela destruição de partículas estranhas ao organismo (Pipe, 1990). Por este motivo, os granulócitos são considerados o tipo celular mais apto à defesa imune (Pipe, 1990). Neste estudo não foi feita nenhuma caracterização enzimática, mas foi possível confirmar a presença das vesículas ácidas coradas no citosol e a maior granulosidade intracelular, que se associam diretamente com a quantidade de vesículas e organelas celulares. As características dos granulócitos da ostra C. gasar também foram observadas em outras espécies do gênero, como em C. virginica (McCormich-Ray & Howarwt, 1991) e C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013) e em berbigões R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012). 42 Os hialinócitos também foram encontrados na hemolinfa de C. gasar. Este tipo celular foi caracterizado por possuir alta relação núcleo:citoplasma e pouco ou nenhum grânulo intracelular. Tais características foram descritas para hemócitos de outros ostreídeos, como a ostra nativa do Brasil C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013), mas também em C. virginica (Cheng, 2009), C. gigas e O. edulis (Auffret, 1989). Além de outros bivalves, como A. cygnea (Soares-da-Silva et al., 2002; Salimi et al., 2009) e M. galloprovincialis (Carballal et al., 1997). Os hemócitos vesiculares encontrados na hemolinfa de C. gasar são semelhantes morfologicamente aos granulócitos, sendo grandes e apresentando baixa relação núcleo:citoplasma. Entretanto, diferem destes por não possuírem nenhum ou poucos grânulos citoplasmáticos, o que foi evidente pelo aspecto refringente mesmo após adição de corantes. Os hemócitos vesiculares foram descritos também em ostras O. edulis e C. gigas (Auffret, 1989) e C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013). As células do tipo-blásticas foram as menores células encontradas neste estudo. Possuem alta relação núcleo:citoplasma e alta basofilia. Essa grande afinidade pelo corante básico é uma característica que pode ser explicada pela ocorrência de muitos ribossomos livres (ricos em RNA ribossomal de caráter ácido) (Auffret, 1989; Russell-Pinto et al., 1994; Wen et al., 1994; Carballal et al., 1997). Estas características estruturais sugerem que as células tipo-blásticas estão envolvidas no processo hematopoiético (Hine, 1999; Rebelo et al., 2013). Sugere-se que estas células sejam capazes de maturar na hemolinfa, ou seja, transformar-se morfologicamente e fisiologicamente em outros tipos hemocitários como os hialinócitos, granulócitos ou hemócitos vesiculares (Rebelo et al., 2013). Através da técnica de citometria de fluxo, foi possível identificar e quantificar com sucesso as subpopulações hemocitárias da hemolinfa de C. gasar. Diversos estudos têm empregado esta técnica para compreender e elucidar, principalmente, a função dos hemócitos de outros bivalves, como nos ostreídeos O. edulis (Renault et al., 2001), C. gigas (Lambert et al., 2003), C. ariakensis (Donaghy et al., 2009), C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013), os venerídeos, como R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e R. philippinarum (Donaghy et al., 2009b) e A. cygnea (Soares-da-Silva et al., 2002). Os hialinócitos e hemócitos vesiculares constituíram as subpopulações hemocitárias mais abundantes. Esta observação foi coincidente tanto por citometria de fluxo quanto por microscopia óptica e este perfil foi descrito também para a hemolinfa de ostras C. ariakensis (Donaghy et al., 2009) e C. rhizophorae (Rebelo et al., 2013) e de pectinídeos Argopecten irradians (Zhang et al., 2006). Sabe-se que a alteração na proporção dos tipos hemocitários está associada principalmente à susceptibilidade dos animais aos parasitos, como descrito na ostra 43 O. edulis infectada pelo protozoário Bonamia ostreae (Comesaña et al., 2012). Inclusive na ostra C. gasar foi observado que na infecção avançada pelo protozoário Perkinsus sp., os parasitos podem induzir ou causar uma alteração nas proporções de hialinócitos e células do tipo-blásticas (Queiroga et al., 2013). Outros fatores ambientais podem levar à esta alteração, como a presença de químicos no ambiente, como foi observado no gastrópode Bellamya bengalensis e no bivalve Lamellidens marginalis (Ray et al., 2013). Portanto, conhecer os tipos celulares da hemolinfa e as proporções das subpopulações de hemócitos de uma espécie em condições normais é fundamental para análises futuras do impacto de agentes biológicos, químicos ou de outra natureza. 5.2. Caracterização da capacidade fagocítica dos hemócitos de C. gasar por citometria de fluxo Independentemente do tipo de hemócito, o zymosan e o látex foram as partículas mais fagocitadas quando comparadas às bactérias E. coli. Isto demonstra que estas células são capazes de reconhecer diversas moléculas não-próprias. Dentre elas, as que contém β1,3glicanos (zymosan), presentes nas paredes de fungos, e algumas moléculas presentes na parede da bactéria E. coli, como o LPS. Contudo, a baixa fagocitose de E. coli em relação a de outras partículas pode estar relacionada à sua não-patogenicidade para os bivalves (Tubiash, 1971) ou estas bactérias podem estar sendo mortas extracelularmente, através do uso de redes (NETs, do inglês, Neutrophil extracellular traps), e não fagocitadas (Ng et al. 2013). Este fato, pode ainda estar associado aos tipos de receptores expressos e o tempo de análise (Zhang et al. 2014). Nos berbigões R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e M. galloprovincialis (García-García et al., 2008) foi observado resultado semelhante, sendo a fagocitose de bactérias a menor dentre as partículas testadas. As bactérias do gênero Vibrio são Gram-negativas e abundantes na água do mar, assim como a E. coli, mas ao contrário destas, podem ser bastante patogênicas para bivalves (Tubiash, 1971). A infecção de diversas larvas de bivalves por bactérias deste gênero causa anormalidades na formação da concha, problemas de crescimento e mortalidade (Figueras & Novoa, 2011). Curiosamente, neste estudo, subpopulações de hemócitos mostraram uma diferente capacidade fagocítica segundo o tipo de partícula. Os granulócitos foram as células que mais fagocitaram as partículas de látex, enquanto que os hialinócitos e hemócitos vesiculares foram as células que mais fagocitaram a E. coli. De forma semelhante ao observado no venerídeo R. decussatus (Prado-Alvarez et al., 2012) e no ostreídeo C. ariakensis (Donaghy et al., 2009a), 44 os granulócitos foram as células que mais fagocitaram látex, demonstrando que essas células são mais aptas a fagocitar partículas estranhas ao organismo, como o poliestireno presente nas microesferas de látex. Em relação a E. coli, apenas, os resultados em M. galloprovincialis (García-García et al., 2008) e C. gigas (Terahara et al., 2006) contrapuseram o observado aqui, pois foi visto uma maior fagocitose dessa bactéria pelos granulócitos. No presente estudo, o fato da ausência de um número elevado de granulócitos que fagocitam E. coli pode ter ocorrido devido a degranulação desta célula, como observado em C. gigas (Iizuka et al., 2014), visto que o hemócito vesicular aparece em grande quantidade na hemolinfa, ou ainda pode ter ocorrido a formação de armadilhas extracelulares (NETs), o que levaria a morte dos hemócitos (Ng et al. 2013). A fagocitose é a principal resposta de defesa desencadeada por parasitas de pequeno tamanho e pode ser inibida ou potencializada por um agente infeccioso. Como verificado em ostras C. gasar infectadas pelo protozoário Perkinsus sp. (Queiroga et al., 2013) e em Anadara trapezia infectados com trematódeos (Dang et al., 2013), este mecanismo de defesa pode ser inibido. 45 6. CONCLUSÕES A hemolinfa da ostra Crassostrea gasar é composta por cinco subpopulações de hemócitos: os granulócitos grandes, granulócitos pequenos, hialinócitos, hemócitos vesiculares e células do tipo-blásticas. A citometria de fluxo mostrou-se uma técnica útil em estudos de aspectos morfológicos e funcionais de hemócitos de bivalves. A maior fagocitose de zymosan e partículas de látex mostra que os hemócitos da espécie Crassostrea gasar são capazes de reconhecer partículas estranhas ao organismo, como o β1,3-glucano presente na parede de fungos. Mesmo sendo considerada não-patogênica para bivalves, a E. coli é fagocitada em grande parte por hialinócitos e hemócitos vesiculares, indicando que há reconhecimento de bactérias Gram-negativas pelos hemócitos. A maior fagocitose de látex (≥ 3 partículas) pelos granulócitos indica que esta é célula mais responsável pela defesa da ostra. A maior fagocitose de látex (≤ 2 partículas) por hialinócitos e hemócitos vesiculares indica que estas células também respondem à estímulos externos. 46 7. REFERÊNCIAS Allam B., Ashton-Alcox KA, Ford SE (2002) Flow cytometric comparison of haemocytes from three species of bivalve molluscs. Fish & Shellfish Immunology 13:141–158 Auffret M. (1989) Comparative Study of the hemocytes of two oyster species: the european flat oyster, ostrea edulis, linnaeus, 1750 and the pacific oyster crassostrea gigas (thunberg,1793). Journal of Shellfish Research 8:367–373 Bachali S, Jager M, Hassanin A, Schoentgen F, Jollès P, Fiala-Medioni A, Deutsch JS. (2002) Phylogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function. Journal of molecular evolution 54:652–64 Barracco MA, Medeiros ID, Moreira FM (1999) Some haemato-immunological parameters in the mussel Perna perna. Fish & Shellfish Immunology 9:387–404 Barracco MA., Silva PM. da (2008) HEMOLINFA E SISTEMA IMUNE NO MEXILHÃO Perna perna. Barth T, Moraes N, Barracco MA. (2005) Evaluation of some hemato-immunological parameters in the mangrove oyster Crassostrea rhizophorae of different habitats of Santa Catarina Island, Brazil. Aquatic Living Resources 186:179–186 BD Biosciences (2007) BD FACSCalibur Instructions For Use. Buggé DM, Hégaret H, Wikfors GH, Allam B (2007) Oxidative burst in hard clam (Mercenaria mercenaria) haemocytes. Fish & shellfish immunology 23:188–96 Carballal MJ., Lopez MC, Azevedo C, Villalba A (1997) Hemolymph cell types of the mussel Mytilus galloprovincialis. Diseases of aquatic organisms 29:127–135 Casas SM., Comesaña P, Cao A, Villalba A (2011) Comparison of antibacterial activity in the hemolymph of marine bivalves from Galicia (NW Spain). Journal of invertebrate pathology 106:343–5 Chagot D., Comps M., Boulo V (1987) Histological study of a cellular reaction in Ruditpaes decussatus infected by a protozoan. Aquaculture 67:3–4 Chang S, Tseng S, Chou H (2005) Morphological characterization via light and electron microscopy of the hemocytes of two cultured bivalves: a comparison study between the hard clam (Meretrix. Zool Stud 44:144–152 Charlet M, Chernysh S, Philippe H, Hetru C, Hoffman JA, Bulet P (1996) Innate Immunity. ISOLATION OF SEVERAL CYSTEINE-RICH ANTIMICROBIAL PEPTIDES FROM THE BLOOD OF A MOLLUSC, MYTILUS EDULIS. Journal of Biological Chemistry 271:21808–21813 Cheng TC (1981) Bivalves. In: Ratcliffe NA, Rowley AF (eds) Invertebrate Blood Cells, 1st edn. Academic Press, London, p 233–300 47 Cima F, Matozzo V, Marin MG, Ballarin L (2000) Haemocytes of the clam Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850): morphofunctional characterisation. Fish & shellfish immunology 10:677–93 Comesaña P, Casas SM, Cao A, Abollo E, Arzul I, Morga B, Villalba A (2012) Comparison of haemocytic parameters among flat oyster Ostrea edulis stocks with different susceptibility to bonamiosis and the Pacific oyster Crassostrea gigas. Journal of invertebrate pathology 109:274–86 Dang C, Cribb TH., Osborne G, Kawasaki M, Bedin A-S, Barnes AC (2013) Effect of a hemiuroid trematode on the hemocyte immune parameters of the cockle Anadara trapezia. Fish & shellfish immunology 35:951–6 Dang C, Tan T, Moffit D, Deboutteville JD, Barnes AC (2012) Gender differences in hemocyte immune parameters of bivalves: the Sydney rock oyster Saccostrea glomerata and the pearl oyster Pinctada fucata. Fish & shellfish immunology 33:138–42 Donaghy L, Kim B-K, Hong H-K, Park H-S, Choi K-S (2009a) Flow cytometry studies on the populations and immune parameters of the hemocytes of the Suminoe oyster, Crassostrea ariakensis. Fish & shellfish immunology 27:296–301 Donaghy L, Kim B-K, Hong H-K, Park H-S, Choi K-S (2009b) Flow cytometry studies on the populations and immune parameters of the hemocytes of the Suminoe oyster, Crassostrea ariakensis. Fish & shellfish immunology 27:296–301 Donaghy L, Lambert C, Choi K-S, Soudant P (2009) Hemocytes of the carpet shell clam (Ruditapes decussatus) and the Manila clam (Ruditapes philippinarum): Current knowledge and future prospects. Aquaculture 297:10–24 Eble AF (2009) The circulatory system. In: Kennedy VS, Newell RIE, Eble AF (eds) The Eastern Oyster Crassostrea virginica, 1st edn. Sea Grant, Maryland, p 271–298 Fang FC. (2004) Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature reviews Microbiology 2:820–32 Figueras A, Novoa B (2011) Enfermedades de moluscos bivalvos de interés en Acuicultura Enfermedades de moluscos bivalvos de interés en Acuicultura. Madrid García-García E, Prado-Alvarez M, Novoa B, Figueras A, Rosales C (2008) Immune responses of mussel hemocyte subpopulations are differentially regulated by enzymes of the PI 3-K, PKC, and ERK kinase families. Developmental and comparative immunology 32:637–53 Gonzalez M, Gueguen Y, Desserre G, Lorgeril J de, Romestand B, Bachère E (2007) Molecular characterization of two isoforms of defensin from hemocytes of the oyster Crassostrea gigas. Developmental and comparative immunology 31:332–9 Hégaret H, Wikfors GH, Soudant P (2003a) Flow cytometric analysis of haemocytes from eastern oysters, Crassostrea virginica, subjected to a sudden temperature elevation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 293:237–265 48 Hégaret H, Wikfors GH, Soudant P (2003b) Flow-cytometric analysis of haemocytes from eastern oysters, Crassostrea virginica, subjected to a sudden temperature elevation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 293:237–248 Hine P (1999) The inter-relationships of bivalve haemocytes. Fish & Shellfish Immunology:367–385 Hubert F, Noël T, Roch P (1996) A member of the arthropod defensin family from edible Mediterranean mussels (Mytilus galloprovincialis). European Journal of Biochemistry 306:302–306 Iizuka M, Nagasaki T, Takahashi KG. (2014) Involvement of Pacific oyster CgPGRP-S1S in bacterial recognition, agglutination and granulocyte degranulation. Developmental & … 43:30–4 Lambert C, Soudant P, Choquet G, Paillard C (2003) Measurement of Crassostrea gigas hemocyte oxidative metabolism by flow cytometry and the inhibiting capacity of pathogenic vibrios. Fish & Shellfish Immunology 15:225–240 Larson K, Roberson B, Hetrick F (1989) Effect of environmental pollutants on the chemiluminescence of hemocytes from the American oyster Crassostrea virginica. Diseases of aquatic organisms 6:131–136 Li C, Zhao J, Song L (2009) A review of advances in research on marine molluscan antimicrobial peptides and. Molluscan Research 29:17–26 Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L (2002) Cellular and subcellular distribution of metals in molluscs. Microscopy research and technique 56:358– 92 McCormich-Ray MG., Howarwt T. (1991) Morphology and Mobility of Oyster Hemocytes: Evidence for Seasonal Variations. Journal of Invertebrate Pathology 58:219–230 McHenery J, Allen J, Birkbeck T (1986) Distribution of lysozyme-like activity in 30 bivalve species. Comparative Biochemistry and … 85:581–584 Mitta G, Vandenbulcke F, Roch P (2000) Original involvement of antimicrobial peptides in mussel innate immunity. FEBS Letters 486:185–190 Montes JF., Del-Río JA, Durfort M., García-Valero F. (1997) The protozoan parasite Perkinsus atlanticus elicits a unique defensive response in the clam Tapes semidecussatus. Parasitology 114:339–349 Ng TH, Chang S-H, Wu M-H, Wang H-C (2013) Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Developmental and comparative immunology 41:644–51 Pipe RK (1990) Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine musselMytilus edulis. The Histochemical Journal 49 Pipe RK (1992) Generation of reactive oxygen metabolites by the haemocytes of the mussel Mytilus edulis. Developmental & Comparative Immunology 16:111–122 Prado-Alvarez M, Romero a, Balseiro P, Dios S, Novoa B, Figueras a (2012) Morphological characterization and functional immune response of the carpet shell clam (Ruditapes decussatus) haemocytes after bacterial stimulation. Fish & shellfish immunology 32:69–78 Queiroga FR, Marques-Santos LF, Hégaret H, Soudant P, Farias ND, Schlindwein AD, Mirella da Silva P (2013) Immunological responses of the mangrove oysters Crassostrea gasar naturally infected by Perkinsus sp. in the Mamanguape Estuary, Paraíba state (Northeastern, Brazil). Fish & shellfish immunology 35:319–27 Queiroga FR, Vianna R, Vieira CB, Farias ND, Silva PM da (2014) Parasites infecting the cultured oyster Crassostrea gasar (Adanson, 1757) in Northeast Brazil. Parasitology Ray M, Bhunia AS, Bhunia NS, Ray S (2013) Density shift, morphological damage, lysosomal fragility and apoptosis of hemocytes of Indian molluscs exposed to pyrethroid pesticides. Fish & shellfish immunology 35:499–512 Rebelo MDF, Figueiredo E de S, Mariante RM, Nóbrega A, Barros M de, Allodi S (2013) New insights from the oyster Crassostrea rhizophorae on bivalve circulating hemocytes. PloS one 8:e57384 Renault T, Xue QG, Chilmonczyk S (2001) Flow cytometric analysis of European flat oyster, Ostrea edulis, haemocytes using a monoclonal antibody specific for granulocytes. Fish & shellfish immunology 11:269–74 Robinson JM (2008) Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and cell biology 130:281–97 Rohlf FJ., Sokal RR. (1981) Statistical tables. In: Statistical tables, 2nd edn. New York, p 737–738 Russell-Pinto F, Reimão R, Sousa M De (1994) Haemocytes in Cerastoderma edule (Mollusca, Bivalvia)- distinct cell types engage in different responses to sheep erythrocytes. Fish & Shellfish Immunology 4:383–397 Salimi L, Jamili S, Motalebi A, Eghtesadi-Araghi P, Rabbani M, Rostami-Beshman M (2009) Morphological characterization and size of hemocytes in Anodonta cygnea. Journal of invertebrate pathology 101:81–5 Schleder DD, Kayser M, Sühnel S, Ferreira JF, Rupp GS, Barracco M a. (2008) Evaluation of hemato-immunological parameters during the reproductive cycle of the scallop Nodipecten nodosus in association with a carotenoid-enriched diet. Aquaculture 280:256–263 Schmitt P, Duperthuy M, Montagnani C (2011) Immune responses in the Pacific oyster Crassostrea gigas an overview with focus on summer mortalities. In: Qin JG (ed) Oysters.p 1–47 50 Schmitt P, Rosa RD, Duperthuy M, Lorgeril J de, Bachère E, Destoumieux-Garzón D (2012) The Antimicrobial Defense of the Pacific Oyster, Crassostrea gigas. How Diversity may Compensate for Scarcity in the Regulation of Resident/Pathogenic Microflora. Frontiers in microbiology 3:160 Smolowitz RM, Miosky D, Reinisch CL (1989) Ontogeny of leukemic cells of the soft shell clam. Journal of invertebrate pathology 53:41–51 Soares-da-Silva IM, Ribeiro J, Valongo C, Pinto R, Vilanova M, Bleher R, Machado J (2002) Cytometric, morphologic and enzymatic characterisation of haemocytes in Anodonta cygnea. Comparative biochemistry and physiology Part A, Molecular & integrative physiology 132:541–53 Song L, Wang L, Qiu L, Zhang H (2010) Invertebrate immunity. In: Söderhäl K (ed) Invertebrate Immunity, 1st edn. Springer Science+Business Media, Austin, p 44–65 Soudant P, Chu FLE, Villalba A, Cancela L (2008) Bivalves-Perkinsus spp. interactions. In: Villalba A (ed) Workshop for the analysis of the impact of Perkinsosis to the European Shellfish Industry. Vilanova de Arousa Soudant P, E Chu F-L, Volety A (2013) Host-parasite interactions: Marine bivalve molluscs and protozoan parasites, Perkinsus species. Journal of invertebrate pathology 114:196–216 Takahashi K, Mori K, Nomura T (1986) Occurrence and characterization of lysozyme in the marine bivalves . Bulletin of the Japanese Society of …:2007 Terahara K, Takahashi KG, Nakamura A, Osada M, Yoda M, Hiroi T, Hirasawa M, Mori K (2006) Differences in integrin-dependent phagocytosis among three hemocyte subpopulations of the Pacific oyster “Crassostrea gigas.” Developmental and comparative immunology 30:667–83 Tubiash HS (1971) Soft-Shell Clam, Mya arenaria, a Convenient Laboratory Animal for Screening Pathogens of Bivalve Mollusks. Applied Microbiology 22:321–324 Vargas-Albores F, Barracco M (2001) Mecanismos de defensa de los moluscos bivalvos con énfasis en pectínidos. Los Moluscos Pectínidos de Iberoamérica: Ciencia y Acuicultura:127–146 Wang Y, Hu M, Chiang MWL, Shin PKS, Cheung SG (2012) Characterization of subpopulations and immune-related parameters of hemocytes in the green-lipped mussel Perna viridis. Fish & shellfish immunology 32:381–90 Wen C-M, Kou G-H, Chen S-N (1994) Light and electron microscopy of hemocyte of the hard clam, Meretrix lusoria (Röding). Comparative biochemistry and physiology Part A, Molecular & integrative physiology 108A:279–286 Wootton EC, Pipe RK (2003) Structural and functional characterisation of the blood cells of the bivalve mollusc, Scrobicularia plana. Fish & Shellfish Immunology 15:249–262 51 Xue Q, Renault T (2001) Monoclonal antibodies to European flat oyster Ostrea edulis hemocytes: characterization and tissue distribution of granulocytes in adult and developing animals. Developmental and comparative immunology 25:187–94 Zhang T, Qiu L, Sun Z, Wang L, Zhou Z, Liu R, Yue F, Sun R, Song L (2014) The specifically enhanced cellular immune responses in Pacific oyster (Crassostrea gigas) against secondary challenge with Vibrio splendidus. Developmental and comparative immunology 45:141–50 Zhang W, Wu X, Wang M (2006) Morphological, structural, and functional characterization of the haemocytes of the scallop, Argopecten irradians. Aquaculture 251:19–32 Zhao J, Song L, Li C, Ni D, Wu L, Zhu L, Wang H, Xu W (2007) Molecular cloning, expression of a big defensin gene from bay scallop Argopecten irradians and the antimicrobial activity of its recombinant protein. Molecular immunology 44:360–8
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