Textbausteine Arbeitsanleitung

Instruções de Utilização
Melatonin-Sulfate
Urine ELISA
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitative
de Sulfato de Melatonina (sinónimos: sulfato de 6-hidroximelatonina,
6-sulfatoximelatonina) em urina humana.
RE54031
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
Melatonin-Sulfate Urine ELISA (RE54031)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Imunoensaio enzimático para a determinação quantitativa de Sulfato de Melatonina (sinónimos: sulfato de
6-hidroximelatonina, 6-sulfatoximelatonina) em urina humana.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A glândula pineal (corpus pineale) tem sido considerada um transdutor neuroendócrino devido ao seu
importante papel no fotoperiodismo. A principal hormona da glândula pineal é N-acetil-5-metoxi-triptamina
ou melatonina, que é sintetizada a partir do aminoácido triptofano. A melatonina apresenta os seus níveis
plasmáticos mais elevados durante a noite. O seu pico nocturno característico parece codificar informação
temporal tal como a duração da noite. A regulação da secreção de melatonina está sob controlo nervoso. A
inervação simpática parece ter um papel principal através da libertação de noradrenalina. Alterações nos
padrões e/ou níveis de secreção de melatonina têm sido identificados em relação com distúrbios de sono,
jet lag, depressão, stress, esquizofrenia, amenorreia hipotalamica, gravidez, anorexia nervosa, algumas
formas de cancro, desordens imunológicas assim como controlo da maturação sexual durante a puberdade.
A maior parte da melatonina em circulação é metabolizada no fígado a 6-hidroximelatonina e
subsequentemente a 6-sulfatoximelatonina que é excretada para a urina.
A concentração de sulfato de 6-hidroximelatonina na urina está correlacionada com o nível total de
melatonina no sangue durante o período de recolha.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Imunoensaio enzimático (ELISA) em fase sólida baseado no princípio de competição. Uma quantidade
indeterminada de antigénio presente na amostra e uma quantidade fixa de antigénio marcado com enzima
competem pelos locais de ligação dos anticorpos que revestem os poços. Depois da incubação, os poços
são lavados para parar a reacção de competição. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor
desenvolvida é inversamente proporcional à quantidade de antigénio na amostra. Os resultados das
amostras podem ser determinados directamente usando a curva padrão.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de
produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou
da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos
nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente
fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
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Melatonin-Sulfate Urine ELISA (RE54031)
6.
PORTUGUÊS
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Urina
É possível usar tanto a primeira urina da manhã como urina de 24 h. O volume total de urina excretada
durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco. Não são necessários
cuidados de conservação. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as
amostras antes de utilizar no teste.
Armazenamento:
2-8°C
≤ -20°C (Alíquotas)
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
Estabilidade:
4 dias
15 anos
Para mais detalhes, consulte: Griefahn et al. (2001).
7.
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 6 mL
ANTISERUM
1 x 0.2 mL
Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal).
Sulfato de Melatonina Antisoro
Pronto a usar. Contêm: Antisoro (coelho), Tampão Tris, 0.01 % Timerosal.
Conjugado Enzimático, Concentrado (40x)
ENZCONJ CONC Contêm: Sulfato de Melatonina, conjugado com peroxidase, tampão fosfato, 0.01 %
Timerosal.
Padrão A-G
1 x 7 x 0.1 mL
CAL A-G
1 x 2 x 0.1 mL
CONTROL 1+2
1 x 80 mL
ASSAYBUF
0; 1.7; 5.2; 15.6; 46.7; 140; 420 ng/mL
0; 5.2; 15.9; 47.6; 142; 427; 1281 nmol/L
Pronto a usar. Contêm: Sulfato de Melatonina, Tampão Tris, 0.01 % Timerosal.
Controlo 1+2
1 x 50 mL
8.
Pronto a usar. Contêm: 0.02 % Timerosal. Para concentrações / intervalos
aceitáveis consultar etiquetas dos frascos.
Tampão de Reacção
Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: Tampão Tris, BSA, 0.01 % Timerosal.
WASHBUF CONC Tampão de Lavagem, Concentrado (20x)
Contêm: tampão fosfato, Tween, 0.1 % Timerosal.
1 x 15 mL
TMB SUBS
Solução de Substrato TMB
1 x 15 mL
TMB STOP
Solução de Paragem TMB
3x
FOIL
Pronto a usar. Contêm: TMB, Tampão, estabilizantes.
Pronto a usar. 1 M H2SO4.
Película Aderente
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 10; 50; 100; 1000 µL
Tubos de ensaio de polistireno de fundo redondo (12 x 75 mm)
Suporte para tubos de ensaio
Agitador orbital (500 rpm)
Vortex
Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de
referência 600-650 nm)
9. Água bidestilada ou bi-destilada
10. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
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9.
PORTUGUÊS
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Alguns componentes contêm volume de solução ≤ 250 µL. Assegurar que a solução está toda no fundo
do recipiente antes de abrir.
5. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de
pipetagem.
6. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
7. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
8. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
9. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10.
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas.
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
10.1. Preparação de componentes concentrados
Diluir /
dissolver
Componente
15 mL
WASHBUF CONC
50 µL
ENZCONJ CONC
Diluente
Relação
juntar 300
mL
agua bidest.
1:20
com
2 mL
ASSAYBUF
1:41
Observações
Desfazer cristais a
18-25°C.
Preparar mesmo
antes de usar e
utilizar apenas uma
vez.
Armazenam
Estabilidade
ento
2-8°C
4 semanas
18-25°C
30 minutos
10.2. Diluição de Padrões, Controlos e Amostras de Urina dos Pacientes
1.
Pipetar 10 µL de cada Padrão, Controlo e amostra de urina dos pacientes para tubos de
polistireno, polipropileno ou vidro. Evitar exposição directa à luz solar.
2.
Pipetar 500 µL de Tampão de Reacção para cada tubo. Agitar no vortex.
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas com
Tampão de Reacção.
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1.
2.
3.
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5.
6.
7.
8.
9.
10.
12.
PORTUGUÊS
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Pipetar 50 µL de cada Padrão diluído, Controlo diluído e amostra de paciente diluída para os
respectivos poços da Microplaca.
Pipetar 50 µL do Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço.
Pipetar 50 µL de Antisoro para Sulfato de Melatonina para cada poço. Agitar cuidadosamente a
placa.
Tapar a placa com película adesiva. Incubar 2 h à TA (18-25°C) num agitador orbital (500 rpm).
Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 4 x com 250 µL de Tampão de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.
Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço.
Incubar 30 min à TA (18-25°C) num agitador orbital (500 rpm).
Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução Stop TMB para cada poço. Misturar
rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
Medir a densidade óptica num fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução Stop.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além
disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis
equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de
acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de
aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é
válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em
ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo
dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma
boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou
modelo logit-log.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar
um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).
A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras
com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como
descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
Calcular a quantidade excretada em 24 h para cada amostra de urina: µg/24 h = µg/L x L/24 h
Conversão:
Sulfato de Melatonina (ng/mL) x 3.05 = nmol/L
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PORTUGUÊS
Curva de Calibração Típica
14.
6-Sulfatoxym elatonin ELISA
2.000
DOMédia
1.805
1.741
1.536
1.185
0.773
0.341
0.164
DO/DOmax
(%)
100.0
96.5
85.1
65.7
42.8
18.9
9.1
OD 450 nm
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
Sulfato de
Melatonina (ng/mL)
A
0.0
B
1.7
C
5.2
D
15.6
E
46.7
F
140.0
G
420.0
1.500
1.000
0.500
0.000
1
10
100
1000
ng/m L
VALORES ESPERADOS
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser
correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores:
Sulfato de Melatonina
24h (µg)*
fracção nocturna (µg/h)
Média
90% percentil
Média
90% percentil
20-35
26
36.8
15.6 - 58.1
2.8
0.9 – 5.6
36-50
17
29.6
9.9 – 52.9
2.1
0.6 – 3.6
51-65
16
20.4
12.3 – 32.8
1.5
0.9 – 2.5
> 65
16
15.8
7.5 – 32.7
1.0
0.3 – 2.3
* A excreção de 24 horas foi calculada como a soma de quatro períodos de coleta. Para mais detalhes veja: Mahlberg
R. et al. Normative data on the daily profile of urinary 6-sulfatoxymelatonin in healthy subjects between the ages of 20
and 84. Psychoneuroendocrinology (2006) 31, 634-641
Idade
n
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
15.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
16.
DESEMPENHO
Substância
Especificidade Analítica
(Reactividade Cruzada)
Melatonina Sulfato
Melatonina
6-OH-Melatonina
N-Acetil-L-OH-Triptamina
N-Acetil-L-Triptofano
5-Metoxi-Triptamina
Triptamina
5-HIAA
Sensibilidade Analítica
1.0 ng/mL
(Limite de Detecção)
Intervalo (ng/mL)
Precisão
5.8 - 204
Intra-Ensaio
12.4 – 220
Inter-Ensaio
Intervalo (ng/mL)
Linearidade
Recuperação
Comparação Método
Usado versus RIA
Version 2016-03
96.5 – 248.8
Média (%)
105.8
Reactividade
Cruzada (%)
100
0.002
0.001
0.0005
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
Reactividade cruzada de outras
substâncias testadas < 0.0001 %
Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD
CV (%)
5.2 – 12.2
5.1 – 14.9
Diluição em Série
Intervalo (%)
até
1:32
80 - 116
Intervalo (%)
% Recuperação após adição de “reforço”
91 - 122
Teste IBL = 1.15 x RIA + 4.2
r = 0.96; n = 40
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17.
PORTUGUÊS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
1. Kondo, M. Tokura H., Wakamura T., Hyun KJ., Tamotsu S., Morita T., Oishi T., Influence of twilight on
diurnal variation of core temperatuer, its nadir, and urinary 6-hydroxymelatonin sulfate during nocturnal
sleep and morning drowsiness. Coll. Antropol. 33 (2009) 1: 193-199
2. Radwan P., Skrzydlo-Radomanska B., Radwan-Kwiatek K., Burak-Czapiuk B., Strzemecka J. Is
melatonin involved in the irritable bowel syndrome? Journal of Physiology and Pharmacology (2009),
Suppl 3, 67-70
3. Mahlberg R. et al. Normative data on the daily profile of urinary 6-sulfatoxymelatonin in healthy subjects
between the ages of 20 and 84. Psychoneuroendocrinology (2006) 31, 634-641
4. Kunz et al. Melatonin in Patients with Reduced REM Sleep Duration: Two Randomized Controlled Trials.
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 89(1): 128-134 (2004)
5. Mahlberg et al. Melatonin and age. Somnologie 7 (Suppl. 1): 9-88 (2003)
6. Griefahn et al. Melatonin production during childhood and adolescence: a longitudinal study on the
excretion of urinary 6-hydroxymelatonin sulfate. J. Pineal Res. 34:26-31 (2003)
7. Bortkiewicz et al. The excretion of 6-hydroxymelatonin sulfate in healthy young men exposed to
electromagnetic fields emitted by cellular phone – an experimental study. Neuroendocrinology Letters
23(suppl 1):88-91 (2002)
8. Kunz et al. Exogenous Melatonin in Periodic Limb Movement Disorder: An Open Trial and a Hypothesis.
SLEEP, Vol. 24, No. 2, 183-187, (2001).
9. Griefahn et al. Long-Term Stability of 6-Hydroxymelatonin Sulfate in 24-h Urine Samples Stored at
–20°C. Endocrine, vol. 15, no. 2, 199-202, July (2001).
10. Kunz D et al. Melatonin as a therapy in REM sleep behavior disorder patients: an open-labeled pilot
study on the possible influence of melatonin on REM-sleep regulation. Movement Disorders, 14: 507511 (1999)
11. Pfluger DH, Minder CE. Effects of exposure to 16.7 Hz magnetic fields on urinary 6-hydroxymelatonin
sulfate excretion of Swiss railway workers. J. Pineal Res., 21: 91-100 (1996)
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιμοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθμός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test
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