TÍTULO Padrões diferenciais de resposta inflamatória, lesão axonal
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TÍTULO Padrões diferenciais de resposta inflamatória, lesão axonal
16 1 INTRODUÇÃO O sistema sensorial trigeminal transmite informações mecânicas, proprioceptivas (percepção espacial do próprio corpo), nociceptivas (dor), e térmicas das regiões craniofaciais (MARTINO et al., 1996; BERETIER, 2000). As vias neurais deste sistema atuam para manter a integridade dos tecidos craniofaciais através de reflexos que protegem outros sistemas sensitivos (visão, somestesia, olfação, gustação) e homeostáticos (tratos respiratório e digestório) (BERETIER, 2000). Considerando a importância do sistema trigeminal, na resposta a danos orofaciais profundos e a possibilidade de eventos fisiopatológicos comuns, em doenças neurodegenerativas agudas (isquemia e excitotoxicidade), também ocorrerem neste sistema, este trabalho investigou comparativamente os padrões inflamatórios, de lesão axonal e desmielinização, após a indução de lesão aguda excitotóxica e isquêmica no núcleo trigeminal de ratos adultos, com ênfase nas alterações na susbstância branca, do trato trigeminotalâmico. As lesões foram induzidas, respectivamente, através de microinjeções de N-Metil-D-Aspartato (NMDA) e Endotelina-1 (ET-1), no núcleo espinhal do sistema trigeminal e avaliadas em um tempo precoce e outro mais tardio. Um levantamento selecionado da literatura correspondente ao assunto investigado foi realizado, servindo como base para o trabalho proposto e será detalhado na seção seguinte. 17 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 A NEUROANATOMIA DOS SISTEMAS TRIGEMINAIS O nervo trigêmeo é assim chamado por possuir três ramos calibrosos distribuídos por áreas extensas da face, tanto superficiais como profundas (LAZAROV, 2002; RIZZOLO;MADEIRA, 2004). Estes ramos recebem denominações conforme seus territórios de distribuição principais: nervo oftálmico (V1), nervo maxilar (V2) e nervo mandibular (V3) (MARTINO et al., 1996; MOORE;DALLEY, 2001; DI DIO, 2002). As duas primeiras divisões (V1 eV2) são totalmente sensitivas e a terceira divisão (V3) é mista, contendo fibras sensitivas e motoras (MARTINO et al., 1996; MOORE;DALLEY, 2001; DI DIO, 2002) (Figura 1). Cada raiz sensitiva inerva mucosas e pele de diferentes regiões da cabeça, exceto a pele que reveste o ângulo da mandíbula, e a raiz motora inerva os músculos da mastigação (SICHER;DU BRUL, 1977; MARTINO et al., 1996; GO;KIM;ZEE, 2001; JAASKELAINEN, 2004). Os ramos periféricos destas subdivisões levam sinais tácteis, térmicos e álgicos ao Sistema Nervoso Central (SNC), enquanto os nervos facial, glossofaríngeo e vago inervam regiões periféricas, como certas áreas da pele, do ouvido externo, faringe, laringe, cavidade nasal, seios da face e ouvido médio (SICHER;DU BRUL, 1977; MARTINO et al., 1996; GO;KIM;ZEE, 2001; JAASKELAINEN, 2004). Os mecanorreceptores presentes nos tecidos periféricos mencionados transduzem a informação tátil, enquanto que os nociceptores e termorreceptores veiculam as 18 sensibilidades dolorosa e térmica, respectivamente (BEAR;CONNORS; PARADISO, 2002; LENT, 2002). As células que dão origem aos aferentes sensoriais trigeminais primários estão localizadas no gânglio sensorial periférico (Figura 1), de Gásser ou gânglio semi-lunar, na fossa craniana média (SICHER;DU BRUL, 1977; MARTINO et al., 1996). O gânglio trigeminal é análogo ao gânglio da raiz dorsal do Sistema Nervoso Periférico (SNP) (LAZAROV, 2002). Os neurônios deste gânglio são do tipo pseudo-unipolar, no qual um único axônio possui ramos periférico e central (LAZAROV, 2002). O complexo somestésico trigeminal é composto por três núcleos que medeiam a sensibilidade craniana: núcleos mesencéfálico, principal e espinhal (SICHER;DU BRUL, 1977; MARTINO et al., 1996; GRAY et al., 2003). O núcleo mesencefálico, constituído dos corpos neuronais dos receptores de estiramento presentes nos músculos da maxila, é formado por uma coluna de células nervosas que se estendem superiormente da zona de entrada do nervo trigêmeo, até o mesencéfalo. Este núcleo é importante para a percepção proprioceptiva da maxila. O núcleo principal trigeminal está localizado próximo da zona de entrada do nervo trigêmeo, seguido caudalmente pelo núcleo espinhal que é composto por três sub-núcleos: oral, interpolar e caudal (MARTINO et al., 1996; GRAY et al., 2003; RUB et al., 2003). A raiz sensorial trigeminal emite um ramo ascendente e outro descendente, através da face ventro-lateral da ponte. O ramo ascendente conecta as células ganglionares trigeminais ao núcleo sensorial principal do nervo trigêmeo, através de axônios de maior diâmetro, enquanto o ramo descendente chega ao trato 19 Figura 1. Divisões do nervo trigêmio. Nesta figura são ilustradas as divisões oftálmica (V1), maxilar (V2) e mandibular (V3) da raiz do nervo trigêmio. Adaptado de: http://www.umanitoba.ca/cranial_nerves/trigeminal_neuralgia/manuscript/ medications.html 20 trigeminal espinhal com fibras amielínicas e mielinizadas de menor diâmetro (LI et al., 1992; MARTINO et al., 1996; GO;KIM;ZEE, 2001; DALLEL et al., 2003) 2.1.1 Via Trigeminal para Sensação Tátil A habilidade de distinguir e interpretar informações térmicas e nociceptivas é um importante componente da sobrevivência humana, pois possibilita comportamentos motores adequados, de modo a evitar perda da integridade tecidual (DASILVA et al., 2002). Os estudos neuroanatômicos clássicos da organização funcional dos núcleos sensoriais trigeminais atribuiram ao núcleo trigeminal principal, grande importância para a gênese da sensação tátil e propriocepção (LI et al., 1992; MARTIN, 1998) e ao núcleo espinhal com seus subnúcleos (oral, interpolar e caudal), um papel principal na transmissão da informação nociceptiva das estruturas orofaciais (DALLEL et al., 1988). Os axônios que veiculam a sensação tátil entram na região pontina ventral e trafegam pela sua porção dorsal, principalmente em direção ascendente terminando no núcleo sensorial trigeminal principal. A maioria dos neurônios deste núcleo sensorial possui axônios que decussam na ponte e ascendem dorsomedialmente até o núcleo da coluna dorsal, no lemnisco medial. Os axônios ascendentes de segunda destes neurônios formam o lemnisco trigeminal e fazem sinapse no tálamo, no núcleo ventral póstero-medial. Os axônios dos neurônios talâmicos projetam-se via braço posterior da cápsula interna, para a parte lateral do córtex somestésico primário (SI), no giro pós-central. O córtex somestésico secundário (SII), localizado no opérculo parietal e córtex posterior, recebe 21 principalmente aferências de SI (MARTINO et al., 1996). A segunda via, bem menor, origina-se dos neurônios da porção dorsal do núcleo sensitivo principal e ascende ipsilateralmente (do mesmo lado), até chegar no lemnisco trigeminal, terminando no núcleo ventral póstero-medial talâmico (MARTINO et al., 1996) . Esta via menor é importante para o processamento de estímulos mecânicos dos dentes e tecidos moles da cavidade oral (MARTINO et al., 1996). Portanto, o núcleo ventral póstero-medial do tálamo recebe aferências bilaterais das estruturas intra-orais: projeção contralateral do lemnisco trigeminal e projeção ipsilateral da via dorsal (MARTINO et al., 1996; LAZAROV, 2002). Do tálamo, estas informações são direcionadas de forma topográfica para o giro póscentral do córtex somestésico primário no córtex parietal. Estas informações chegam veiculadas por axônios, que fazem sinapse em neurônios que estão principalmente na área de representação da face, na porção lateral do giro póscentral. SI possui conexões com áreas secundárias e terciárias (de associação) do córtex somestésico. A atividade integrada destas áreas corticais, que são conectadas através de sinapses, é que nos possibilita a percepção consciente das informações sensoriais, incluindo tato, propriocepção e dor (MARTINO et al., 1996; SHEPHERD, 1998; LENT, 2002). 2.1.2 Via Trigeminal Para Sensação Nociceptiva Nesta via, as fibras amielínicas e mielinizadas de menor diâmetro entram na ponte e descendem formando o trato trigeminal espinhal. Este trato extende-se da 22 porção média da ponte até a medula cervical (nível de C3 e C4), passando pelo bulbo, e recebe aferências dos nervos facial, glossofaríngeo e vago somando-se ao nervo trigêmeo (GO;KIM;ZEE, 2001; BOHOTIN et al., 2003). Colaterais axonais do trato trigeminal espinhal fazem sinapses com neurônios presentes nos três subnúcleos do núcleo espinhal: oral, interpolar e caudal. Os neurônios póssinápticos, por sua vez, enviam projeções axonais que cruzam a linha média, formando o trato trigeminotalâmico que veicula infomação nociceptiva até o tálamo contralateral, no núcleo ventral póstero-medial e nos núcleos intra-laminares (LAZAROV, 2002). O núcleo ventral póstero-medial projeta para as camadas III e IV de SI, na porção lateral do giro pós-central. Os núcleos intra-laminares, segundo local mais importante no tálamo a receber aferências trigeminais, processam aspectos emocionais da dor e possuem uma projeção mais difusa, a qual inclui aquela para o córtex insular anterior (MARTIN, 1998; GRAY et al., 2003; IKEDA et al., 2003). O núcleo caudal, a maior subdivisão do trato trigeminal espinhal, consiste em uma porção laminada alongada que se funde sem limites claros, com o corno dorsal cervical, enquanto a sua parte rostral forma uma zona de transição com a extremidade caudal do núcleo interpolar (BERETIER, 2000). A zona de transição entre os subnúcleos interpolar e caudal é uma região crítica para o processamento da dor craniofacial, possui grande importância na resposta a danos orofaciais profundos, configurando-se em uma região integradora de informações sensoriais das regiões peri e intra-orais (BERETIER, 2000; IKEDA et al., 2003). Anatomicamente, demonstrou-se que a projeção de neurônios trigeminais primários, da polpa dentária do gato terminam em todas as sub-divisões do 23 complexo sensorial trigeminal (ARVIDSSON;GOBEL, 1981). A representação somatotópica da face no núcleo trigeminal é semelhante a uma casca de cebola : as áreas peri-orais são representadas rostralmente no núcleo e áreas mais posteriores da face são representadas mais caudalmente no núcleo trigeminal (DASILVA et al., 2002) . Como vimos, diferenças anatômicas e funcionais distinguem fibras aferentes individuais do nervo trigêmeo. Fibras de maior diâmetro veiculam a sensibilidade tátil e fibras amielínicas, ou pouco mielinizadas veiculam sensações álgicas e térmicas. Portanto, as informações álgicas, térmicas e proprioceptivas são veiculadas através de vias neurais específicas até o tálamo, de modo análogo ao que ocorre com as informações sensoriais, captadas em outros tecidos periféricos e transmitidas a partir da medula espinhal. A principal via para percepção tátil na face é semelhante ao sistema colunar dorsal-lemnisco medial, enquanto que a organização da via ascendente, importante principalmente para a percepção de sensações álgicas e térmicas da face, é similar ao sistema anterolateral, para a transmissão de informações nociceptivas do resto do corpo. 2.1.3 A Fisiologia do Sistema Trigeminal A transmissão e o processamento de informação no SNC envolvem a participação de mediadores químicos, conhecidos como neurotransmissores. Entre os neurotransmissores pode-se destacar o glutamato (principal neurotransmissor excitatório do SNC) e o ácido gama amino butírico (GABA principal neurotransmissor inibitório do SNC). Existe uma comunicação bi- 24 direcional, entre células gliais pré-sinápticas e elementos neuronais na sinapse. A liberação de neurotransmissores do terminal pré-sináptico não apenas estimula os neurônios pós-sinápticos, mas também ativa a glia peri-sináptica (BEZZI et al., 1998). As células gliais ativadas, por sua vez, liberam gliotransmissores que podem diretamente estimular neurônios pós-sinápticos e regular a liberação de neurotransmissores (BEZZI et al., 1998; AULD;ROBITAILLE, 2003; NEWMAN, 2003). Os neurônios trigeminais primários são quimicamente heterogêneos e parecem utilizar vários neurotransmissores para a transmissão sináptica. Estes neurotransmissores são liberados na fenda sináptica e, ao se ligarem em receptores específicos na membrana do neurônio pós-sináptico, podem aumentar (neurotransmissor excitatório), ou diminuir (neurotransmissor inibitório) a excitabilidade do mesmo. Existe um grande número de neurotransmissores excitatórios e inibitórios e esta ação, depende do local do sistema nervoso (SHEPHERD, 1998). Dentre eles estão os aminoácidos excitatórios e inibitórios, as monoaminas e outros como a histamina e a acetilcolina (LAZAROV, 2002). A funcionalidade dos circuitos neurais depende da sintonia da comunicação entre unidades sinápticas excitatórias e inibitórias, compostas por terminações nervosas pré e pós-sinápticas, complexamente ligadas às células gliais (NEWMAN, 2003). O glutamato e o aspartato são os principais neurotransmissores excitatórios dos neurônios sensoriais primários (LAZAROV, 2002). A membrana dos neurônios do gânglio trigeminal possui receptores ionotrópicos e metabotrópicos para os diversos tipos de agonistas glutamatérgicos: ácido propiônico -amino- 25 hidroximetilsozazol (AMPA), cainato e NMDA. Células imunopositivas para glutamato constituem 63,8% dos neurônios de todos os tamanhos no gânglio trigeminal espinhal do gato (CLEMENTS et al., 1991) e aferentes primários, que inervam a polpa dentária destes animais, contém glutamato em seus terminais no núcleo caudal (CLEMENTS et al., 1991). O glutamato e o aspartato, em menor expressão, são transmissores químicos de informações proprioceptivas trigeminais, participam da transmissão química entre neurônios aferentes primários e células do núcleo trigeminal principal (LAZAROV, 2002), bem como neurônios do núcleo trigeminal mesencefálico, também são glutamatérgicos. Os neurotransmissores inibitórios mais comumente encontrados no SNC são a glicina e o GABA. A glicina não foi encontrada em neurônios do gânglio trigeminal, mas junto com o GABA participa do controle do ritmo mastigatório (LAZAROV, 2002). O GABA está presente em neurônios sensoriais no gânglio trigeminal, e no núcleo trigeminal principal de ratos, porcos da índia, coelhos e gatos (LAZAROV, 2002). Apesar do núcleo trigeminal caudal ser classicamente visto como um equivalente anatômico do corno espinhal dorsal, que apresenta a transmissão álgica bloqueada pelos neurônios gabaérgicos, neste núcleo os neurônios parecem ter ação diferente. Viggiano et al. (2004), investigando o papel da transmissão gabaérgica, na nocicepção dos núcleos do trato trigeminal espinhal demonstraram o aumento de GABA, no núcleo trigeminal caudal, em um modelo de dor inflamatória em ratos. O bloqueio de receptores GABAA inibiu a expressão comportamental da percepção da dor, sugerindo que a transmissão gabaérgica no núcleo trigeminal caudal sinaliza estímulos álgicos para centros 26 nervosos superiores. As monoaminas dopamina, noradrenalina, adrenalina, serotonina, bem como as catecolaminas, também estão associadas aos neurônios trigeminais aferentes primários (KHODOROV, 2004). A histamina, sintetizada por neurônios histaminérgicos, age no SNC como um neurotransmissor inibitório e/ou neuromodulador e está presente no gânglio trigeminal (KHODOROV, 2004). Os neurônios do gânglio trigeminal não sintetizam dopamina e não utilizam catecolaminas, mas estão sob influência de fibras aferentes catecolaminérgicas. Tallaksen-Greene et al. (1992) usaram autoradiografias quantitativas, para examinar a densidade e distribuição de receptores para aminoácidos excitatórios, nos núcleos do trato trigeminal espinhal e no núcleo trigeminal principal. A maior densidade dos mediadores foi observada na zona marginal (lâmina I) e substância gelatinosa (lâmina II), do sub-núcleo caudal, onde os receptores de AMPA apresentaram maior densidade relativa, seguido dos receptores metabotrópicos, cainato e NMDA. A densidade e distribuição observadas no núcleo sensorial principal foram bastante similares, embora ligeiramente mais baixas. Portanto, os receptores de aminoácidos excitatórios medeiam neurotransmissão somestésica em terminais aferentes primários, estando envolvidos no processamento de informações nociceptivas. Um grande número de neuropeptídeos foi identificado no gânglio trigeminal: substância P, neurocinina A, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, colecistocinina, somatostatinas, peptídeos opióides (encefalinas e endorfinas), polipeptídeo intestinal vasoativo e galanina (KNYIHAR-CSILLIK et al., 1998; LAZAROV, 2002; SHIN et al., 2003). Segundo Samsam et al. (2000), os 27 neurotransmissores neurocinina A, substância P, e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina atuam como moduladores da nocicepção, na primeira sinapse central da via trigeminal durante a ativação deste sistema sensorial. O óxido nítrico (NO), um importante mensageiro gasoso do sistema nervoso, atua nos neurônios aferentes primários, difundindo-se do pericário das células que o produzem para os neurônios adjacentes, onde ativa a guanilato ciclase solúvel na membrana plasmática (LAZAROV, 2002). 2.2 DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS AGUDAS: NOÇÕES GERAIS E EPIDEMILOGIA De acordo com a evolução temporal dos padrões lesivos, as doenças neurodegenerativas podem ser classificadas em agudas (por exemplo, acidente vascular cerebral, trauma cerebral e medular) e crônicas (por exemplo, doenças de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerose Múltipla, Esclerose Lateral Amiotrófica). Nas doenças neurodegenerativas agudas, a lesão neuronal ocorre rapidamente, começando em minutos até poucas horas após a lesão primária. Nas doenças crônicas, a morte celular ocorre durante um processo gradual mais lento (meses a anos). Entre as doenças neurodegenerativas agudas mais comuns destacam-se os traumas cerebral e da medula espinhal, além do Acidente Vascular Cerebral (AVC) (GRAHAM et al., 1995; TATOR, 1995; DIRNAGL;IADECOLA;MOSKOWITZ, 1999; LO, 2003; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Traumatismos cranioencefálicos (TCE) e medulares constituem importante causa de morte, especialmente em adultos jovens, bem como uma grande causa 28 de incapacidade que afeta de maneira importante não só a vida do paciente, mas também a de membros da família (KRAUS et al., 1985; KRAUS;NOURJAH, 1988; KRAUS;ROCK;HEMYARI, 1990; GRAHAM et al., 1995; TAOKA;OKAJIMA, 1998; MAYER;ROWLAND, 2002). A lesão traumática no SNC inicia uma complexa cascata de eventos onde ocorrem acúmulo patológico de aminoácidos excitatórios, edema, inflamação e isquemia pós-traumática por comprometimento vascular, o que leva à morte neuronal e glial e perda tecidual. (TATOR;FEHLINGS, 1991; FADEN, 1993; HONMOU, 1995; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996). O AVC é a terceira causa de morte no mundo ocidental, sendo superado apenas pelas doenças cardiovasculares e o câncer, e constitui a segunda causa mais freqüente de morte em pessoas idosas nestas sociedades (DIRNAGL; ADECOLA; MOSKOWITZ, 1999; LIPTON,1999; MERGENTHALER; DIRNAGL; MEISEL, 2004). Pode ser classificado em isquêmico e hermorrágico, de acordo com a patologia da lesão cerebral focal subjacente (SACCCO, 2002; LO, 2003). No infarto cerebral, a anóxia causada pela oclusão de vasos por período superior a cinco minutos dá início a uma cadeia de eventos, tais como: vasodilatação local, estase da coluna sangúínea com segmentação das hemácias, edema e necrose do tecido cerebral (SACCCO, 2002). Cerca de 75 % de todas as oclusões de vasos cerebrais originam-se de embolismos de origem arterial ou cardíaca (SACCCO, 2002). A Hemorragia Intracraniana decorre da ruptura de um vaso em qualquer ponto, na cavidade craniana e possui incidência de aproximadamente 15%. De todos os casos, 20% são causados por tromboses e hialinoses de arteríolas. As estenoses das arteríolas cerebrais correspondem a menos de 5 % 29 das ocorrëncias isquêmicas, sendo consideradas comparativamente raras (DIRNAGL; IADECOLA; MOSKOWITZ, 1999; SACCCO, 2002; MERGENTHALER; DIRNAGL; MEISEL, 2004). De um modo geral, o acidente vascular isquêmico é três a quatro vezes mais freqüente que o hemorrágico (SACCCO, 2002) e divide alguns fatores de risco com as doenças cardiovasculares (diabetes, hipertensão e ateroesclerose) (DIRNAGL; IADECOLA; MOSKOWITZ, 1999; MERGENTHALER; DIRNAGL; MEISEL, 2004). Estudos estatísticos publicados pela American Heart Association (2006) mostram que, em média, 700.000 pessoas/ano passam por alguma experiência de AVC e a cada três minutos uma pessoa morre em decorrência dele nos Estados Unidos. Estes dados impulsionaram a busca por terapias neuroprotetoras com a finalidade de reduzir a morte celular e o volume do infarto após episódios de AVC (CARMICHAEL, 2005), pois, dos pacientes que sobrevivem, 50% sofrem de hemiparesias, 26 % dependem de algum auxílio para realizar suas atividades diárias e 26 % permanecem restritos ao leito, implicando em altos custos econômicos (MERGENTHALER; DIRNAGL; MEISEL, 2004). 2.2.1 Modelo de isquemia focal por injeção de Endotelina-1 Os peptídeos do tipo Endotelina (ET-1, ET-2 e ET-3), originalmente isolados do sobrenadante da cultura de células endoteliais, são agentes vasoconstritores potentes presentes em várias espécies, incluindo suínos e humanos (YANAGISAWA et al., 1988; RUBANYI;POLOKOFF, 1994). A ET-1 age através de receptores específicos, tipo A (ETA-R) e tipo B (ETB-R), amplamente distribuídos 30 pelo SNC no endotélio vascular, bem como em neurônios, astrócitos, microglia, células epiteliais do plexo coreóide e células ependimais (RUBANYI;POLOKOFF, 1994). A ET-1 é principalmente sintetizada por células endoteliais, mas também por outros tecidos, incluindo pulmão, coração, fígado, cérebro e algumas células circulantes (MOTTE;MCENTEE;NAEIJE, 2005) e está envolvida em processos celulares fundamentais como proliferação celular, fibrose e inflamação (MASAKI;YANAGISAWA, 1992; MOTTE;MCENTEE;NAEIJE, 2005). A aumentada liberação de ET-1, em AVC isquêmicos, sugere que estes peptídeos endógenos podem ser um fator contribuinte na patogênese desta doença, possivelmente devido a sua potente ação vasoconstritora (ZIV et al., 1992; HUGHES et al., 2003; GUPTA et al., 2005). No SNC de ratos, ETA-R é encontrado em células do músculo liso de artérias do córtex cerebral (HAYNES et al., 1991; BHARDWAJ et al., 2000). Receptores ETB-R foram identificados no córtex cerebral humano, hipocampo e estriado de ratos. O antagonismo seletivo de ETA possui efeitos neuroprotetores, em modelos experimentais de isquemia (GUPTA et al., 2005). A ET-1 pode não ser diretamente neurotóxica, mas, em regiões isquêmicas, pode exacerbar a morte neuronal indiretamente, potencialmente através neurotóxicos, da tais liberação como o excessiva glutamato de de mediadores astrócitos (MOTTE;MCENTEE;NAEIJE, 2005). A injeção direta de ET-1 no parênquima neural constitui um excelente modelo experimental de isquemia focal (HUGHES et al., 2003). A injeção de 10 pmoles de ET-1, no estriado de ratos adultos induz isquemia focal transitória, com 31 redução de até 30% do fluxo sanguíneo. A injeção da quantidade mencionada de ET-1, diluída em 1 ou 0.25 µl de solução salina estéril induz isquemia focal restrita ao local de injeção, tanto em substância branca como cinzenta, corticais e ou o estriado, sem o rompimento da barreira hematoencefálica (BHE) (HUGHES et al., 2003). 2.3 DEGENERAÇÃO SECUNDÁRIA EM DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS AGUDAS: PRINCIPAIS MECANISMOS Em doenças neurodegenerativas agudas, a morte neuronal e/ou de células gliais pode ocorrer rapidamente, como conseqüência imediata de eventos primários (por exemplo, o trauma), ou ocorrer tardiamente como conseqüência de eventos secundários ativados, a partir do processo lesivo inicial. Na isquemia cerebral, são comumente distinguidas duas regiões: o centro do infarto e uma zona periférica, chamada de penumbra isquêmica. Uma redução significativa do fluxo sanguíneo na área isquêmica central causa alterações nos processos metabólicos, no suprimento energético da célula e na homeostase iônica, o que gera perda da integridade celular, por necrose e apoptose em poucos minutos (LIPTON, 1999; SACCCO, 2002; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Este fenômeno é conhecido como degeneração secundária, é definido como um grupo de eventos destrutivos que podem afetar células que não foram ou que foram apenas marginalmente afetadas pela lesão inicial (TATOR;FEHLINGS, 1991; MCDONALD;SADOWSKY, 2002). No SNC, os neurônios e seus axônios que não foram ou que foram apenas parcialmente afetados pela lesão primária, 32 podem degenerar tardiamente se não sofrerem intervenção terapêutica. Eventos fisiopatológicos complexos e diversos são envolvidos nos mecanismos de degeneração secundária (TATOR;FEHLINGS, 1991). No entanto, sabe-se que excitotoxicidade e disfunção iônica, estresse oxidativo, resposta inflamatória e apoptose são eventos cruciais neste importante fenômeno patológico (PERRY et al., 1995; CHOI, 1998; LIPTON, 1999; POPOVICH et al., 1999; CHOI, 2000; POPOVICH et al., 2002; LO, 2003; VILA, 2003). 2.3.1 Excitotoxicidade 2.3.1.1 Mecanismos Gerais A liberação do glutamato na fenda sináptica possui um papel central na comunicação neuronal e está envolvida nos vários aspectos da função cerebral normal incluindo cognição, memória e aprendizado (KHALERT;REISER, 2004). Os efeitos pós-sinápticos deste aminoácido excitatório endógeno são mediados por receptores de membrana celular farmacológica e funcionalmente distintos (SATTLER;TYMIANSKI, 2000). Os três receptores ionotrópicos principais são: NMDA, cainato, e AMPA. Estes receptores, quando ionotrópicos, ao serem ativados por seus agonistas, levam à abertura direta do canal iônico associado, que pode ser permeável em menor ou maior quantidade para os íons Na+, K+ e Ca++, dependendo do tipo de receptor (ATLANTE et al., 2001). Além disso, foi posteriormente estabelecido que o glutamato pode se ligar aos chamados receptores metabotrópicos, os quais atuam acoplados a um sistema envolvendo a 33 participação de proteinas G, que funciona através da liberação de segundos mensageiros, os quais ativam canais iônicos presentes na membrana (CONN;PIN, 1997). O cérebro contém grandes quantidades de glutamato, sendo o neurotransmissor excitatório mais abundante no SNC (KHALERT;REISER, 2004; HENDRIKS et al., 2005), porém só uma fração reduzida pode ser encontrada no meio extracelular. As concentrações de glutamato, tanto no meio extracelular como na fenda sináptica, são rigorosamente controladas por mecanismos envolvendo enzimas e transportadores de glutamato em neurônios e células gliais (DANBOLT, 2001). A capacidade funcional das sinapses é determinada pela capacidade de biossíntese, liberação, degradação e transporte dos neurotransmissores (SCHOUSBOE, 2003). Excitotoxicidade envolve a ativação excessiva de receptores de glutamato no SNC, resultando em morte neuronal (CHOI, 1988; 1992; ATLANTE et al., 2000; MATUTE et al., 2001). Em certas condições patológicas como isquemia cerebral, estado epiléptico, hipoglicemia, trauma mecânico e algumas doenças neurodegenerativas crônicas, a excessiva liberação deste mediador por terminais nervosos e seu acúmulo na fenda sináptica e no espaço extracelular, o torna uma poderosa neurotoxina apta a induzir danos celulares irreversíveis (OLNEY, 1990; CHOI, 1992; LI et al., 1999a), pois a íntima relação entre o metabolismo energético anormal e a neurotransmissão glutamatérgica expõe neurônios à excitotoxicidade mediada pelo glutamato (GREENE;GREENMYRE, 1996). Durante a excitotoxicidade no SNC, células gliais (astrócitos e oligodendrócitos), corpos neuronais e bainha de mielina sofrem danos estruturais 34 significativos, enquanto que o cilindro axonal é relativamente poupado durante a lesão primária, pois alguns estudos imunohistoquímicos demonstraram a presença de receptores glutamatérgicos, principalmente na membrana de oligodendrócitos, na bainha de mielina, em astrócitos e, em menor quantidade, no cilindro axonal (CHOI, 1992; LI;FIELD;RAISMAN, 1999; GALLO;GHINI, 2000; LI;JIANG;STYS, 2000; MATUTE et al., 2001; TEKKOK;GOLDBERG, 2001) . 2.3.1.2 Mecanismos moleculares e a participação do Ca++ O tecido neural possui um consumo relativamente alto de oxigênio e glicose, depende quase que exclusivamente da fosforilação oxidativa para a produção de energia (KHALERT;REISER, 2004). A diminuição do fluxo sangüíneo restringe a chegada de substratos, em especial de oxigênio e glicose ao cérebro (DIRNAGL;IADECOLA;MOSKOWITZ, 1999). Desta forma, com esta redução, as reservas energéticas são perdidas com subsequente desequilíbrio iônico, liberação de neurotransmissores e inibição da recaptação destes, especialmente do glutamato (MELDRUM, 2000; LO, 2003; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). A despolarização de neurönios e células gliais em decorrência da carência energética local resulta na ativação dos canais de Ca++ e leva a liberação de aminoácidos excitotóxicos, especialmente glutamato, no meio extra-celular (HERTZ;ZILKE, 2004; KANNURPATTI et al., 2004) . Este neurotransmissor, que em condições normais sofre direta recaptação pré-sináptica ou astrocítica, permanece no compartimento extra-celular e sofre acúmulo excessivo. A ativação 35 dos receptores de glutamato (NMDA, AMPA e metrabotrópicos) direta ou indiretamente, mediado por prostaglandinas (BEZZI et al., 1998; CHOI, 2005), leva a um aumento na concentração intra-celular (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004), através de sua de Ca++ liberação das reservas internas, acidificação do meio e toxicidade (CHOI, 2005). O aumento na concentração do Ca++ citoplasmático em neurônios do SNC de mamíferos, induzido pela estimulação de receptores glutamatérgicos, ativa mecanismos homeostáticos complexos, que proporcionam uma rápida recuperação para níveis fisiológicos (SATTLER;TYMIANSKI, 2000; KHODOROV, 2004). Estes mecanismos consistem em interações complexas entre quatro tipos de eventos: influxo de Ca++, tamponamento de Ca++ , estoque interno de Ca++, e efluxo de Ca++ (SATTLER;TYMIANSKI, 2000). A extrapolação dos mecanismos regulatórios fisiológicos, ativa inapropriadamente processos dependentes de Ca++ que tanto podem estar adormecidos como pouco ativados, induzindo neurotoxicidade (CHOI, 1988; KANNURPATTI et al., 2004). A neurotoxicidade do glutamato pode ser resumida em três fases, onde a primeira é marcada pela tumefação neuronal imediata (CHOI, 1987), a segunda pelo influxo excessivo de Ca++ (CHOI, 1988) e a terceira pela ativação excessiva de proteases (lipases, fosfatases e endonucleases, caspases, calpaínas, catepsinas) que tanto danificam diretamente a estrutura da célula, como induzem a liberação de radicais livres oxidativos, que atuam como mediadores da morte celular (CHOI, 1992; GOMES-LEAL, 2002b; ARUNDINE;TYMIANSKI, 2003; BANO et al., 2005). Em uma via bioquímica adicional, a sintase do óxido nítrico (SON), ao ser 36 ativada pelo Ca++, se liga à calmodulina e sintetiza NO (LIPTON;STAMLER, 1994; DAWSON;DAWSON, 1998; LIPTON, 2004). Quando sintetizado em excesso, o NO combina com o ânion superóxido e forma peroxinitrito, que leva a um estresse oxidativo e nitrosativo por disfunção mitocondrial (LIPTON;SINGEL;STAMLER, 1994; LIPTON, 2004). Portanto, a disfunção mitocondrial e o déficit energético resultante podem contribuir para a disfunção neuronal através de alterações em canais iônicos, neurotransmissão e transportes axonal e dendrítico (SATTLER;TYMIANSKI, 2000; BALES, 2004; BOSSYWETZEL;SCHWARZENBACHER;LIPTON, 2004; LIPTON, 2004; HOYER et al., 2005). Algumas evidências experimentais sugerem que a ativação de receptores do tipo AMPA e cainato na substância branca causa morte de oligodendrócitos maduros em cérebros isquêmicos, o que mostra a vulnerabilidade destas células à excitotoxicidade mediada por receptores do tipo não-NMDA (MCDONALD et al., 1998; LI;STYS, 2000; MATUTE et al., 2001; TEKKOK;GOLDBERG, 2001; FOWLER et al., 2003). Este tópico será discutido posteriormente. 2.3.1.3 Estresse Oxidativo A formação excessiva de radicais livres durante alterações patológicas do SNC, tais como AVC e trauma, é um mecanismo fundamental de degeneração secundária de doenças neurodegenerativas agudas e crônicas (LOVE, 1999; LEWEN;MATZ;CHAN, 2000; LO, 2003). Os mecanismos de excitotoxicidade, disfunção iônica e estresse oxidativo parecem agir em sinergismo durante o 37 desenrolar do processo neuropatológico (LOVE, 1999; LEWEN;MATZ;CHAN, 2000; ATLANTE et al., 2001; LO, 2003). Radicais livres parecem ser de extrema importância para os mecanismos lesivos durante lesão excitotóxica mediada por glutamato (SINGH et al., 1999; AGRAWAL;NASHMI;FEHLINGS, 2000). Espécies reativas derivadas de oxigênio podem induzir peroxidação lipídica e promover liberação de glutamato (AGRAWAL;NASHMI;FEHLINGS, 2000), tendo relação direta com a excitotoxicidade (KANNURPATTI et al., 2004). A ativação de receptores glutamatérgicos pode ter uma conexão com a formação de radicais livres, através de pelo menos três maneiras: ativação pelo Ca++ da fosfolipase A com a indução da liberação de ácido araquidônico e formação de radicais livres; Indução pelo Ca++ da conversão de xantina desidrogenase para xantina oxidase, o qual é fonte de radicais livres (DYKENS;STERN;TRENKNER, 1987); estimulação de receptores de NMDA com subsequente influxo de Ca++, ativação da SON com síntese de NO (DAWSON;DAWSON, 1998). Estes autores acreditam que a produção de NO seja um passo importante nos mecanimos de neurotoxicidade do glutamato. A inibição da respiração mitocondrial pelo NO pode ser o principal mecanismo envolvido, em desencadear a morte neuronal induzida pelo NO (BAL-PRICE;BROWN, 2001). O metabolismo do ácido araquidônico pode ser a principal fonte de radicais livres, pelo menos em cultura neuronal (CHOI, 1992, 1994). Parece existir um elo de ligação entre estresse oxidativo e disfunção mitocondrial (ATLANTE et al., 2000; ATLANTE et al., 2001). A liberação excessiva de glutamato em condições patológicas pode gerar estresse oxidativo com disfunção mitocondrial, por exemplo, diminuição dos suprimentos energéticos e do 38 transporte de metabólitos celulares (ATLANTE et al., 2000; ATLANTE et al., 2001). A resposta mitocondrial à exposição ao glutamato, bem como a excitotoxicidade são distintas entre animais jovens e adultos. A despolarização da membrana mitocondrial de ratos adultos foi menor, e estes animais mostraram-se menos sensíveis a citotoxicidade pelo glutamato (KANNURPATTI et al., 2004). O trifosfato de adenosina (ATP) é essencial para a maioria dos processos celulares e moleculares, tais como síntese proteica, manutenção do equilíbrio iônico intra e extracelular, transporte e degradação de proteínas, funcionamento do aparelho de Golgi e manutenção da transmissão sináptica. Uma redução no ATP disponível, devido a falta de glicose ou alguma alteração metabólica pode causar sérios distúrbios celulares, incluindo o metabolismo do precursor da proteína amilóide (HOYER et al., 2005). Este fenômeno parece ocorrer in vivo em algumas condições neurodegenerativas (ATLANTE et al., 2000; ATLANTE et al., 2001). Os mecanismos responsáveis pela indução de estresse oxidativo após liberação excessiva de glutamato parecem envolver duas fases (ATLANTE et al., 2001): produção inicial de xantina oxidase e uma fase tardia onde ocorre produção de radicais livres, o que é relacionado à disfunção mitocondrial (HORAKOVA et al., 1997; LEWEN;MATZ;CHAN, 2000). Além disso, a liberação de citocromo c pode induzir mais formação de radicais livres e disfunção celular, incluindo lesão mitocondrial (ATLANTE et al., 2000). Acredita-se que os mecanismos de defesa celulares envolvendo anti-oxidantes naturais estejam reduzidos em tais circunstâncias, levando a um considerável aumento do estresse oxidativo e lesão celular generalizada, mediada por radicais livres (ATLANTE et al., 2001). Este 39 evento pode ser o destino final da cascata bioquímica responsável pela morte neuronal mediada por ativação de receptores glutamatérgicos. Experimentalmente, o uso de antioxidantes como o ebselen tem sido utilizado com sucesso, para proteger as substâncias branca e cinzenta em modelos experimentais de doenças neurodegenerativas agudas, incluindo o de isquemia focal (REITER, 1998; RICHARDSON, 1999). 2.3.1.4 Modelos de excitotoxicidade por injeção de NMDA A resposta excitotóxica obtida pela degeneração celular é mais complexa, do que a obtida pela injeção de uma única citocina (BOLTON;PERRY, 1998). Portanto, a injeção de NMDA vem sendo utilizada como modelo de lesão excitotóxica. Com a finalidade de documentar aspectos da resposta inflamatória associada à degeneração neuronal induzida, a injeção intraestriatal de NMDA e cainato mostrou resposta inflamatória aguda, com recrutamento de neutrófilos seguidos de macrófagos. O infiltrado celular foi maior em animais jovens que em adultos. Entretanto, a resposta inflamatória aumentada não pareceu ter um efeito dramático no tamanho da lesão ou na resposta microglial e astrocítica, bem como a morte celular ocorreu tanto por necrose como apoptose. Contrastando, a quebra na BHE foi mais marcante em animais jovens após injeção de NMDA (BOLTON;PERRY, 1998). Em um modelo de lesão aguda da medula espinhal de ratos, demonstrouse recentemente a escala temporal dos padrões de ativação microglial e 40 astrocitária, após lesão excitotóxica (GOMES-LEAL, 2004). Células da microglia são ativadas precocemente e podem contribuir para o início do processo lesivo na substância cinzenta substâncias branca (GOMES-LEAL, e cinzenta da 2004). medula A ativação destes astrocitária animais nas aumentou consideravelmente entre 3 e 7 dias após a injeção de NMDA. A ativação dos astrócitos começou mais rapidamente e foi mais intensa na substância branca, que na substância cinzenta (GOMES-LEAL, 2004). Neste mesmo modelo experimental, as células inflamatórias parecem contribuir para lesão axonal em tempos de sobrevida mais tardios (GOMES-LEAL, 2005a). O fator ativador de apoptose mostrou ser um importante mediador excitotóxico, após a estimulação de receptores de NMDA. A exposição de uma cultura de células neuronais ao NMDA resultou em excitotoxicidade pelo NMDA independente de caspase. Portanto, a neurotoxicidade pelo NMDA não é afetada pelos inibidores da caspase (WANG et al., 2004. A habilidade de cabinóides em proteger neurônios contra lesões excitotóxicas depende da inibição da SON neuronal. A morte celular induzida pelo NMDA mostrou a participação do NO no efeito anti-excitotóxico de canabinóides em neurônios cerebrais do córtex de ratos (KIM et al., 2005). Sabendo que a neurogênese aumenta após lesão no encéfalo adulto, um modelo de lesão excitotóxica usando NMDA foi empregado para avaliar a dinâmica temporal e espacial, de proliferação nas zonas germinativas do cérebro durante o desenvolvimento pós-natal. O dano excitotóxico no córtex motor de ratos com 9 dias de idade causou degeneração neuronal, acompanhada de resposta glial em todo o córtex ao nível do sítio de injeção, extendendo-se para o 41 septum, estriado e hipocampo rostral, sem comprometimento do hemisfério contralateral. A lesão induziu diminuição significante do número de células progenitoras da zona sub-ventricular (ipsilateralmente a lesão) e do giro dentato (3 primeiros dias) (FAIZ et al., 2005). A expressão da enzima anti-oxidante superoxido dismutase do Cu e Zn em encéfalos intactos é principalmente observada em neurônios (PELUFFO et al., 2005). Em ratos recém-nascidos que sofreram lesão excitotóxica no SNC causada por NMDA, observou-se diminuição na expressão desta enzima, seguida por uma elevação de sua expressão por células astrogliais (PELUFFO et al., 2005). 2.3.2 Resposta Inflamatória 2.3.2.1 Inflamação no SNC A inflamação é um componente chave do mecanismo de defesa contra infecção, tanto no SNP como no SNC (FERRARI et al., 2004; MOYNAGH, 2005). O encéfalo possui várias características peculiares que fazem com que a sua resposta inflamatória seja diferente da que ocorre nos demais órgãos (ALLAN;ROTHWELL, 2003). Uma barreira natural regula o fluxo de substâncias que entram e saem do SNC, a BHE. Esta barreira protege o encéfalo de substâncias lesivas, limitando a entrada de moléculas grandes e células circulantes (PETTY;LO, 2002), protegendo-o de toxinas secretadas por bactérias e outras originadas da atividade (REICHEL;BEGLEY;ABBOTT, 2000). de células do sistema imune 42 A restrição imposta pela BHE às células do sistema imune faz com que a resposta inflamatória no tecido nervoso, seja menos intensa do que em outros tecidos (por exemplo, o tecido epitelial) (GOMES-LEAL, 2002a). Esta característica peculiar levou o sistema nervoso a ser considerado um órgão de privilégio imunológico (PERRY; ANDERSSON; GORDON, 1993; SCHWARTZ; KIPNIS, 2001b; SCHWARTZ; MOALEM, 2001; ALLAN; ROTHWELL, 2003). Por exemplo, estudos experimentais em roedores mostram que um estímulo inflamatório com lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) induz uma rápida e elevada invasão de neutrófilos na pele, mas uma resposta limitada e tardia no encéfalo (PERRY et al., 1995; MATYSZAK, 1998). O recrutamento de neutrófilos em tecidos não neurais tem seu pico máximo em torno de 4-6 horas (VILLARREAL;ZAGORSKI;WAHL, 2001), enquanto que no SNC ocorre em 24horas (BOLTON;PERRY, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002a, 2005b). Com relação aos monócitos sangüíneos, o recrutamento também é mais lento no SNC (em torno de 72h) do que em tecidos não neurais (em torno de 24h). A microinjeção de mediadores inflamatórios no parênquima do cérebro adulto mostrou pouco recrutamento de neutrófilos, resposta vascular mínima e um atraso no recrutamento de monócitos (ANDERSSON;PERRY;GORDON, 1992; LAWSON;PERRY, 1995. Diferenças significativas são encontradas entre os diversos compartimentos do SNC (SCHNELL et al., 1999). A resposta às lesões no SNC tem característica multicelular que muda continuamente com a evolução temporal e espacial do processo e é regulada por múltiplos eventos moleculares intra e extracelulares (SOFRONIEW, 2005). Em condições não patológicas, células do sistema nervoso podem mediar a resposta 43 inflamatória, mesmo que esta possua aspectos diferentes daquela de outros tecidos (GOMES-LEAL, 2002a). O encéfalo responde a estímulos inflamatórios periféricos (por resposta neural ou humoral), integra e regula vários aspectos da resposta aguda e exibe muitas respostas inflamatórias locais, que parecem contribuir com o aparecimento de doenças do SNC, tanto agudas como crônicas. O estágio mais precoce da inflamação, que inicia poucas horas após a isquemia, caracteriza-se pela liberação de moléculas de adesão tanto no endotélio vascular como por leucócitos circulantes (ALLAN;ROTHWELL, 2003). Os leucócitos aderem-se ao endotélio e transmigram do sangue para o parênquima cerebral (STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998). Esta adesão é de importância decisiva na inflamação cerebral induzida por AVC (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Neste caso, neutrófilos acumulamse em microvasos cerebrais localizados na área da penumbra isquêmica, levando a um dano adicional na microcirculação. Macrófagos e monócitos seguem os neutrófilos, migrando para o encéfalo isquêmico e tornam-se as células predominantes 5 a 7 dias após a isquemia. Leucócitos ativados (granulócitos, monócitos/macrófagos, linfócitos), bem como neurônios e células gliais (astrócitos e microglia) produzem quimiocinas e citocinas, principalmente citocinas pró-inflamatórias, tais como: Fator de necrose tumoral (FNT ) e as interleucinas-1 e 6 (IL-1 e IL-6), que exacerbam os danos provocados pela lesão isquêmica (DIRNAGL;IADECOLA;MOSKOWITZ, 1999; BECKER et al., 2001). Em modelos animais, o dano isquêmico é reduzido por vários antagonistas de receptores de citocinas (ALLAN;ROTHWELL, 2003; 44 MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Outras evidências mostram a contribuição da inflamação pós-isquêmica na lesão do cérebro isquêmico, pois o dano cerebral isquêmico reduz quando: a infiltração de neutrófilos é prevenida pela indução de uma neutropenia sistêmica, moléculas de adesão ou seus receptores são bloqueados por anticorpos neutralizantes, a ação de mediadores da inflamação é bloqueada e no rato, inibição dos genes que coordenam a liberação de genes relacionados com a inflamação (DIRNAGL;IADECOLA;MOSKOWITZ, 1999). Além das citocinas inflamatórias, algumas citocinas anti-inflamatórias também são sintetizadas, entre as quais fator transformador de crescimento- 1 e a IL-10. Estas citocinas regulam a inflamação, diminuindo-a e, por conseguinte, exercem efeito protetor no contexto da isquemia cerebral (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Duas enzimas também se mostraram essenciais para a inflamação: a sintase do óxido nítrico imunológica e a ciclooxigenase tipo II (COX2) (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Em modelos experimentais de isquemia cerebral, a inibição da sintase do óxido nítrico imunológica reduziu o tamanho do infarto em aproximadamente 30%, até mesmo quando o tratamento começou apenas 24h após a indução da isquemia (IADECOLA;ZHANG;XU, 1995; CHANG et al., 2004; PEREZ-ASENSIO et al., 2005). Além disso, esta enzima produz uma grande quantidade de ON, o qual é altamente tóxico, devido a sua participação na formação do peroxinitrito. A COX2 é mais facilmente detectada na região da penumbra isquêmica, participa ativamente na produção de radicais livres, o que a torna potencialmente lesiva para a área (NOGAWA et al., 1997; 45 HARA et al., 1998; NOGAWA et al., 1998). Dessa forma, tanto a sintase do óxido nítrico imunológica quanto a COX2 apresentam-se como alvos de grande interesse terapêutico, visto que em modelos experimentais de roedores, ambas apresentaram efeito protetor por 6-24 h após a isquemia (CHOPP;ZHANG, 1996). Existem diversas evidências na literatura que indicam que mecanismos inflamatórios participam dos fenômenos de degeneração secundária em doenças agudas e crônicas do SNC (BLIGHT, 1985,1994; PERRY et al., 1998; POPOVICH et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002a; POPOVICH et al., 2002; WYSS-CORAY, 2002). O uso de uma mistura de cloroquina e colchicina (GIULIAN, 1987) ou injeção intraperitoneal de pó de sílica (BLIGHT, 1994) ou liposomas de clodronato (POPOVICH et al., 1999), são procedimentos que inibem o recrutamento de monócitos sangüíneos para parênquima do SNC lesado, diminuem significativamente a área de lesão secundária, após lesão aguda da medula espinhal de roedores. Além disso, foi demonstrado experimentalmente que o uso de altas doses de metilpredinisolona, um anti-inflamatório esteróide, melhora a capacidade de recuperação motora e diminui a área de lesão, em ratos submetidos à lesão aguda da medula espinhal (BRACKEN, 2001a,2002). Inúmeros testes demonstraram que este procedimento é eficaz e atualmente utilizado como tratamento para lesão da medula espinhal de seres humanos (BRACKEN, 2001a; BRACKEN;HOLFORD, 2002). Acredita-se que componentes da resposta inflamatória também sejam envolvidos nos eventos patológicos de doenças neurodegenerativas crônicas, tais como as doenças de Parkinson, Huntington, Alzheimer, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica (HIRSCH et al., 1998; MCGEER;MCGEER, 1998; 46 MCGEER;YASOJIMA;MCGEER, 2001). 2.3.2.3 O papel de células do sistema imune em doenças neurodegenerativas e sua relação com a resposta inflamatória A integridade da BHE depende da interação da matriz celular, composta por células endoteliais e astrócitos (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). A isquemia cerebral pode danificar a interação entre estas estruturas. Proteases, como metaloproteinases de matriz, são secretadas 1 a 3 horas após a isquemia cerebral e atuam sobre as estruturas desta matriz (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). A destruição da lâmina basal, pelas metaloproteinases de matriz permite que leucócitos atravessem a BHE e contribuam para alterações patológicas nesta região (BOLTON;PERRY, 1998). No SNC, assim como em tecidos não neurais, o sistema imune inato age em sinergismo com o sistema imune específico, tanto contribuindo para a indução de seus componentes como sendo estimulado por ele (MATYSZAK, 1998). Acredita-se que alguns componentes da reposta inflamatória possam contribuir para o aumento da lesão secundária, após lesão do SNC (BLIGHT, 1992; POPOVICH et al., 1999; BLIGHT;ZIMBER, 2001). Abaixo sumarizamos a participação destas células, nos mecanismos inflamatórios envolvidos na fisiopatologia de doenças do SNC (GOMES-LEAL, 2002a, 2002b). Neutrófilos 47 Os neutrófilos, juntamente com os eosinófilos e basófilos, formam o grupo de leucócitos conhecidos como granulócitos (ABBAS;JANEWAY, 2000). Este termo é empregado devido à aparência dos grânulos (lisossomas) encontrados no citoplasma destas células. Os lisossomas possuem inúmeras enzimas, principalmente proteases, que são liberadas durante a fagocitose e digestão intracelular de patógenos (durante o processo de infecção), ou detritos celulares (durante o processo de degeneração). Como já mencionado neste trabalho, são as primeiras células inflamatórias a chegar ao sítio da inflamação aguda, tanto em tecidos neurais como não neurais, sendo este fenômeno um pouco mais tardio no SNC (STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMESLEAL, 2005b). São fisiologicamente células fagocitárias, mas acredita-se que os mesmos podem contribuir como o processo lesivo, durante o trauma tecidual, nos tecidos neurais e não neurais (TAOKA et al., 1997; TAOKA;OKAJIMA, 1998; TAOKA et al., 1998). Estas células podem ser encontradas no cérebro humano, após isquemia e a quantidade delas no tecido tem correlação positiva com a presença de sangue (TAOKA;OKAJIMA, 1998). Nestas circunstâncias, os neutrófilos podem liberar proteases e radicais livres, que são lesivos para o parênquima tecidual (CAMPBELL;CAMPBELL, 1988; OWEN;CAMPBELL, 1995). A diminuição do número de neutrófilos circulantes ou administração de anticorpos anti-quimiocinas tem mostrado redução significante na área do infarto, em modelos experimentais de isquemia cerebral em ratos. A expressão crônica de IL-1 leva ao recrutamento seletivo de neutrófilos, no parênquima cerebral e induz ativação de microglia e astrócitos, lesão da BHE, 48 desmielinização reversível, sem neurodegeneração (FERRARI et al., 2004). Macrófagos Os macrófagos derivam de células tronco e de monoblastos da medula óssea que transformam-se em monócitos, ao entrarem na corrente sangüínea (PERRY;GORDON, 1991). Durante a inflamação aguda, estes monócitos são recrutados para o parênquima tecidual, onde são ativados em situações patológicas (GOMES-LEAL, 2002a). Os monócitos sangüíneos penetram no SNC durante o seu desenvolvimento (PERRY;GORDON, 1991) e sua diferenciação em macrófagos envolvem alterações morfológicas e o aumento da expressão de diversos receptores de membrana de lisossomas (por exemplo, o antígeno glicosilado citoplasmático que é marcado pelo anticorpo ED1) (DIJKSTRA et al., 1985b) e o receptor C3 do complemento (REID et al., 1993). O fator de estimulação de colônia de granulócitos-macrófagos é expresso em uma variedade de células diferenciadas e não diferençadas, tipo: monócitos, macrófagos, fibroclastos, células tipo T e células endoteliais e estimulam a proliferação e maturação de progenitores mielóides, precursores de neutrófilos, monócitos, macrófagos e eosinófilos (FRANZEN;BOUHY;SCHOENEN, 2004). Os macrófagos são considerados as principais células efetoras da resposta imune (GORDON, 2001), permanecendo por mais tempo e em maior número no infiltrado inflamatório (POPOVICH et al., 1999). São fagócitos, portanto estão no local da lesão para matar microorganismos invasores, remover restos e facilitar o reparo e o retorno a homeostasia (PERRY;ANDERSSON;GORDON, 1993; 49 POPOVICH et al., 1999). Após lesão na medula espinhal o reparo precede a infiltração de macrófagos hematogênicos, mas não a ativação da microglia residente (POPOVICH et al., 1999). Desde que a matriz formada após a lesão não seja suficiente para manter o crescimento axonal, é possível que o infiltrado de macrófagos antagonize os esforços das células residentes para reparar o local da lesão. Uma ferramenta importante para eliminar células ou patógenos indesejados é a produção de mediadores, causadores da morte celular ou de microorganismos (HENDRIKS et al., 2005). A chegada destas células no local da inflamação está relacionada com a ativação de plaquetas e cascatas de proteínas plasmáticas, aumento da expressão de moléculas de adesão, nos vasos e aumento na permeabilidade vascular (PERRY;ANDERSSON;GORDON, 1993). Durante o processo de reparo tecidual, os macrófagos podem contribuir para a exacerbação da lesão neural pela capacidade de liberar citocinas inflamatórias (FNT , FESGM; IL-1 e IL-6), proteases (MPM), radicais livres (radicais hidroxila), NO (BLIGHT;SAITO;HEYES, 1993; BLIGHT, 1994; FERGUSON et al., 1997; POPOVICH et al., 1999; GOMES-LEAL, 2005a) e grandes quantidades de glutamato (HENDRIKS et al., 2005). Na lesão da medula espinal ocorre grande resposta de macrófagos, sendo possível que estas células atuem como mediadores da lesão traumática secundária e contribuam para o insucesso da regeneração axonal no SNC (POPOVICH et al., 1999). Em trabalhos experimentais, demonstrou-se que a depleção do recrutamento de macrófagos com pó de sílica (BLIGHT, 1985, 1992, 1994), clodronato (POPOVICH et al., 1999) ou metilpredinisolona (BRACKEN, 1990, 2000; BRACKEN et al., 50 2000; BRACKEN, 2001a, 2001b, 2002; BRACKEN;HOLFORD, 2002) diminui a área de lesão secundária e melhora o prognóstico de recuperação motora após lesão medular em roedores. Macrófagos são um alvo interessante para terapias que visam prevenir o dano axonal na Esclerose Múltipla. A prevenção da migração de monócitos através da BHE é um dos níveis de intervenção possível (HENDRIKS et al., 2005). Microglia As células microgliais são células gliais do SNC, possuem um importante papel na resposta inflamatória e apresentam propriedades compatíveis com as dos macrófagos hematogênicos (KHALERT;REISER, 2004; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). São ativadas por mediadores da inflamação em uma gama de patologias no SNC, tais como inflamação cerebral, trauma e AVC (BAL-PRICE;BROWN, 2001) e neste estado comportam-se como macrófagos residentes do SNC (PERRY;ANDERSSON;GORDON, 1993; GOMESLEAL, 2002a), adotando inclusive uma morfologia ramificada típica (STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998). Quando não ativadas, possuem a função geral de fazer a vigilância do sistema nervoso (GOMES-LEAL, 2002a). A microglia parece ser responsável pela fagocitose mais generalizada envolvendo a ativação de cascata complementar, onde astrócitos têm sido envolvidos em processos de fagocitose, tais como a remoção de sinapses individuais (WYSS-CORAY, 2002; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). A microglia e outros fagócitos participam não apenas da degradação de depósitos proteicos anormais, como na 51 Doença de Alzheimer, ou de micróbios invasores, mas também da remoção de células do hospedeiro em degeneração (WYSS-CORAY, 2002). É possível que haja um componente anti-inflamatório intrínseco no SNC (PERRY;ANDERSSON;GORDON, 1993). Semelhante aos leucócitos, a microglia ativada é capaz de produzir uma boa quantidade de citocinas inflamatórias, bem como metabólitos tóxicos (radicais livres oxigenados: peroxinitrito e superóxido) e enzimas (catepsinas) (MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Durante o fenômeno de ativação, a membrana de células microgliais aumenta a expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (CPH), do receptor C3 do complemento, (PERRY;GORDON, receptores 1991; CD4, ED1 STOLL;JANDER, e 1999; moléculas STREIT, de 2000; adesão BAL- PRICE;BROWN, 2001). Relatou-se que durante a isquemia cerebral, células da microglia liberam NO e IL-1, os quais podem contribuir para o processo de degeneração secundária (GEHRMANN et al., 1995; STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998; LOVE, 1999). Achados semelhantes foram observados após lesão cerebral obtida através de modelos excitotóxicos (GEHRMANN et al., 1995; STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998; LOVE, 1999). O fenômeno de ativação microglial foi dividido nas seguintes fases: estágio de alerta (estágio 1), aderência (estágio 2), fagocitose (estágio3a), ativação de células microgliais vizinhas (estágio 3b) (RAIVICH et al., 1999). O estágio 1 ocorre nas primeiras 24 horas é caracterizado pelo aumento da expressão de algumas moléculas relacionadas à função imune, tais como o componente Ci3b do complemento e MAI-1 em camundongos. No estágio 2, as células tornam-se menos ramificadas aderindo às estruturas lesadas, tais como neurônios sofrendo 52 degneração. Ao mesmo tempo, estas células apresentam diminuição da expressão de algumas moléculas em suas membranas, tais como MAI-1 e aumento da expressão de outras, como moléculas do CPH. No estágio 3a, as moléculas microgliais tornam-se fagócitos na presença de neurônios sofrendo degeneração. Neste momento, ocorre retração significativa das ramificações microgliais, as células da microglia se tornam arredondadas, com morfologia de macrófagos ativados. No estágio 3b, ocorre ativação generalizada da microglia em sítios distais ao da lesão e de outras células da resposta inflamatória, tais como linfócitos. O recrutamento de linfócitos é intenso nesta fase, sendo mediado pelo aumento da expressão de moléculas da classe II do CPH, com subseqüente apresentação de antígenos em seres humanos (GOMES-LEAL, 2002a). As células microgliais parecem estar envolvidas nos mecanismos de lesão autoimune (encefalite experimental alérgica) (NATHAN, 1987; NATHAN, 1992), de lesão do SNC durante infecção pelo HIV (STOLL;JANDER, 1999). Linfócitos Em condições não patológicas, no parênquima do SNC são encontrados poucos linfócitos ou mesmo sua total ausência. No entanto, em condições patológicas, além de serem encontrados no parênquima cerebral existem evidências de que podem causar dano tecidual adicional, após lesão primária (BRADL;FLUGEL, 2002). Existem evidências que sugerem que a atividade de células T pode ser importante para regeneração neural (SCHWARTZ, 2001a, 2001b). O recrutamento 53 de linfócitos T é limitado durante a lesão do SNC, este fato pode contribuir para a incapacidade de regeneração do tecido neural (SCHWARTZ;KIPNIS, 2001a). Astrócitos Nos últimos anos três funções principais dos astrócitos foram destacadas e pesquisadas em detalhes: suporte nutricional a células neuronais, modulação do nível glutamatérgico extra-celular e eliminação de radicais livres oxigenados. Os astrócitos também são encarregados de manter o gradiente de íons dependentes de energia (Ca++, N+ e K+) e o pH extracelular (KHALERT;REISER, 2004). Para desempenhar suas funções, não só os astrócitos, mas as células gliais precisam de quantidade considerável de energia (KHALERT;REISER, 2004). Ao contrário dos neurônios, os astrócitos estão em contato com os vasos sangüíneos e acessam o suporte de glicose do encéfalo pela circulação sangüínea (KHALERT;REISER, 2004). Então, a maior quantidade de glicose utilizada pelo encéfalo é entregue via astrócitos (KHALERT;REISER, 2004). O glutamato, bem como o GABA, é removido da fenda sináptica pelos astrócitos, através de um sistema de transporte altamente eficiente (SCHOUSBOE, 2003). Os astrócitos estão localizados próximos à fenda sináptica, por isso, são os primeiros candidatos a remover o glutamato, porém em situações isquêmicas esta função é alterada e revertida (KHALERT;REISER, 2004). A ativação de astrócitos ocasiona hipertrofia destas células, com aumento do tamanho do corpo celular, encurtamento e aumento da espessura de suas ramificações (astrocitose) (GOMES-LEAL, 2002a; SOFRONIEW, 2005). Estas 54 alterações morfológicas são reguladas por citocinas, tais como IL-6. A astrocitose é considerada uma resposta geral do SNC, ao processo lesivo como uma tentativa de preservar a integridade tecidual, mas a cicatriz glial formada, pode ser prejudicial ao fenômeno de regeneração axonal (SYKOVA, 2001). A cicatriz glial, composta por astrócitos e linhagens celulares de fibroblastos, demarca e envolve o tecido lesado do tecido neural viável (SOFRONIEW, 2005). Os astrócitos podem proliferar após lesões realmente severas (SOFRONIEW, 2005). Astrócitos reativos exercem funções tanto pro, como anti-inflamatórias em locais e períodos diferentes, como reposta a lesão e durante o reparo (SOFRONIEW, 2005). Exercem papel importante na manutenção e reparo da BHE, ajudam a regular os níveis de fluído tecidual, também regulam o edema tóxico que pode ocorrer no parênquima cerebral após várias lesões ao SNC, bem como ajudam a proteger neurônios, oligodendrócitos e a função neural (SOFRONIEW, 2005). Entretanto, possuem a capacidade de gerar moléculas com potencial citotóxico, tais como radicais de NO e radicais oxigenados (SOFRONIEW, 2005). 2.3.3 Apoptose e Outros Tipos de Morte Celular Durante o AVC, no centro do território de vascularização do vaso ocluído, as células morrem principalmente por necrose e na penumbra isquêmica o principal tipo de morte celular é apoptose (LO, 2003). Estudos experimentais estão elucidando cada vez mais os mecanismos moleculares dos vários tipos de morte celular, incluindo paraptose, necrose e apoptose (SYNTICHAKI, 2002a; 55 SYNTICHAKI, 2002b; LO, 2003; SYNTICHANKI, 2003; VILA, 2003). Estes estudos, principalmente os realizados no nematódio C. elegans, consolidaram a idéia que a necrose não é um tipo de morte celular caótica, mas que envolve a ativação seqüencial de proteases, o que é expresso na hipótese calpaínacatepsina (SYNTICHAKI, 2002b; SYNTICHANKI, 2003). Os mecanismos de apoptose e necrose são extremamente complexos, e não serão aqui revistos. Excelentes revisões estão disponíveis na literatura sobre o tema (HENGARTNER, 2000; YUAN, 2000; VILA, 2003). Estabeleceu-se um papel essencial para a morte por apoptose, durante o fenômeno de degeneração secundária em doenças neurodegenerativas agudas, tais como trauma cerebral e da medula espinhal e AVC (LI et al., 1996; LIU et al., 1997; LI et al., 1999a; BEATTIE;FAROOQUI;BRESNAHAN, 2000; LEE, 2002; TIKKA et al., 2002; RUAN, 2003; TAKAGI et al., 2003; GOMES-LEAL, 2004; STIRLING et al., 2004). Após lesão experimental da medula espinhal de ratos e primatas demonstrou-se que oligodendrócitos morrem por apoptose, em um tempo de sobrevida tardio (CROWE et al., 1997). Estudos na medula espinhal do rato, demonstram claramente que a morte apoptótica de oligodendrócitos é um componente importante da degeneração secundária (LI et al., 1996; LIU et al., 1997; LI et al., 1999a; BEATTIE;FAROOQUI;BRESNAHAN, 2000; GOMES-LEAL, 2004). O tratamento com Minociclina, uma tetraciclina de segunda geração, reduz a morte tardia de oligodendrócitos, impede lesão axonal retrógrada e melhora o prognóstico neurológico de ratos submetidos à lesão aguda da medula espinhal (LEE et al., 2003; STIRLING et al., 2004). A minociclina também possui efeito neuroprotetor, em modelos de isquemia focal no cérebro de ratos (YRJANHEIKKI 56 et al., 1999). 2.3.4 Lesão Axonal em Doenças Neurodegenerativas O SNC é composto pelo cérebro e medula espinhal. Estas duas regiões do SNC possuem as substâncias cinzenta, contendo principalmente corpos neuronais e células gliais, e substância branca que contém corpos celulares de alguns grupos neuronais (por exemplo, neurônios diaforase positivos) e células gliais, mas é principalmente formada por tratos de axônios mielinizados (MARTIN, 1998). Tanto a substância branca, como a substância cinzenta são lesadas durante as doenças neurodegenerativas agudas, tais como trauma cerebral e medular, AVC, doença neurológica devido à infecção pelo HIV, malária cerebral e doenças neurodegenerativas crôncias como as doenças de Alzheimer, Parkinson, Huntington e Esclerose mútipla (MEDANA;ESIRI, 2003). No entanto, os estudos neuropatológicos clássicos foram mais centrados nos eventos patológicos que acometem a substância cinzenta, os eventos que ocorriam na substância branca foram geralmente negligenciados (COLEMAN;PERRY, 2002). Recentemente percebeu-se que a lesão dos tratos axonais, presentes na substância branca do SNC é uma das principais causas dos déficits funcionais subjacentes a estas doenças, e que o desenrolar neuropatológico do processo lesivo depende da localização destes tratos axonais (DE_KEYSER;SULTER;LUITEN, 1999; DEWAR;YAM;MCCULLOCH, 1999; COLEMAN;PERRY, 2002; MEDANA;ESIRI, 2003). Por exemplo, sabe-se que após um AVC, lesão da medula espinhal e 57 malária cerebral, o comprometimento da substância branca exacerba os déficits funcionais em seres humanos (PETTY;WETTSTEIN, 1999; MCDONALD;SADOWSKY, 2002; MEDANA et al., 2002; LO, 2003). Cerca de 25% a 30% de todos os acidentes isquêmicos em humanos ocorrem na substância branca (LO, 2003; STYS, 2004), uma região bastante vulnerável durante acidentes isquêmicos (PANTONI;GARCIA;GUTIERREZ, 1996). Resultados experimentais confirmaram que abordagens terapêuticas que privilegiam a preservação da substância cinzenta e negligenciam a preservação da substância branca são ineficazes após AVC e trauma (DE_KEYSER;SULTER;LUITEN, 1999; DEWAR;YAM;MCCULLOCH, 1999). A lesão da substância branca após AVC ou trauma, por exemplo, nos tratos da medula espinhal e na cápsula interna, pode gerar déficits funcionais mais significativos que a lesão de substância cinzenta (DEWAR;YAM;MCCULLOCH, 1999; MCDONALD;SADOWSKY, 2002; STYS, 2004). Um dos fatores importantes para este fato é o comprometimento de axônios de passagem tanto do cilindro axonal como da bainha de mielina. As lesões da substância cinzenta induzem déficits funcionais mais locais. Um exemplo claro deste fato é que uma lesão restrita à substância cinzenta da sexta vértebra cervical em humanos, pode gerar alterações funcionais das mãos sem afetar funções em segmentos caudais (funções posturais, intestinais e da bexiga) (MCDONALD;SADOWSKY, 2002). No entanto, uma lesão neste mesmo segmento vertebral, mesmo que não afete a substância cinzenta, pode induzir tetraplegia e incontinência urinária (MCDONALD;SADOWSKY, 2002). A lesão axonal é um fator importante para a exacerbação dos déficits funcionais, principalmente por bloqueio total ou 58 disfunções no padrão de condução do potencial de ação (STYS, 2004). Lesão axonal é um fenômeno freqüente em doenças neurodegenerativas agudas e crônicas, tais como AVC (DE_KEYSER;SULTER;LUITEN, 1999; DEWAR;YAM;MCCULLOCH, 1999; HUGHES et al., 2003), trauma cerebral e da medula espinhal (GOMES-LEAL, 2002a; MCDONALD;SADOWSKY, 2002), malária cerebral (MEDANA et al., 2002) e esclerose múltipla (FERGUSON et al., 1997; TRAPP et al., 1998). Os mecanismos de lesão axonal parecem envolver uma série complexa de eventos fisiopatológicos, incluindo disfunções iônicas (influxo excessivo de Na+ e Ca++), alterações em bombas metabólicas do axônio e excitotoxicidade mediada por receptores do tipo AMPA/cainato, afetando principalmente a bainha de mielina, o corpo celular de oligodendrócitos e astrócitos (STYS, 2004). Antagonistas de receptores de NMDA são ineficazes na proteção da substância branca durante doenças neurodegenerativas agudas, indicando que estes receptores não participam do processo lesivo nesta região do sistema nervoso (YAM et al., 2000). Por outro lado, em uma série de estudos experimentais no nervo óptico e na substância branca dorsal da medula espinhal, demonstraram de forma irrefutável que a lesão da substância branca envolve a participação de ativação excessiva de canais de Na+ e Ca++ e excitotoxicidade mediada pela ativação de receptores AMPA/cainato, além de alterações em bombas metabólicas transportadoras de glutamato (LI et al., 1999b; LI;JIANG;STYS, 2000; LI;STYS, 2000, 2001). Em um modelo in vitro, estes autores infundiram os agonistas glutamatérgicos AMPA e cainato em colunas dorsais isoladas da medula espinhal de ratos (LI;STYS, 2000). Este procedimento resultou em 59 alterações estruturais em oligodendrócitos, astrócitos e particularmente da bainha de mielina. Nestes estudos, não foram encontradas evidências para lesão do cilindro axonal, como evidenciado pela imuncitoquímica para degradação da espectrina por proteases, bem como pela presença de GluR2/3 e GluR4 em células gliais. Em um outro paradigma experimental utilizando o mesmo modelo in vitro, a substância branca dorsal isolada de ratos foi submetida a 60 minutos de anóxia ou à compressão durante 15 segundos (LI et al., 1999b). Tanto antagonistas seletivos de receptores do tipo AMPA/cainato, como a inibição do transporte de glutamato dependente de Na+, protegeram a substância branca dos mecanismos lesivos induzidos por anóxia e trauma. Estudos posteriores pelo mesmo grupo (LI;STYS, 2001) demonstraram que a liberação endógena de glutamato pode ocorrer pela reversão dos gradientes de Na+ e K++ através do axolema. De acordo com estes autores, a inibição da ATPase de Na+ e K++ e despolarização induzem liberação de glutamato, através da reversão da atividade dos transportadores de glutamato dependente de Na+ . O glutamato liberado de fontes intracelulares agiria em receptores do tipo AMPA/cainato induzindo lesão excitotóxica principalmente em oligodendrócitos e mielina. Nestes estudos, a principal fonte de glutamato foi o cilindro axonal. Outros estudos sugerem que a injeção do bloqueador de canal de Na+ -TTX- diminui significativamente a lesão axonal, após contusão da medula espinhal, mostrando que influxo excessivo de canais de Na+ pode ser um importante evento subjacente, aos mecanismos de lesão, da substância branca após (ROSENBERG;TENG;WRATHALL, 1999). contusão da medula espinhal 60 2.4 O PARADIGMA EXPERIMENTAL O núcleo espinhal do sistema trigeminal, com seus subnúcleos, apresenta importante atuação na transmissão da informação nociceptiva das estruturas orofaciais (DALLEL et al., 1988). Dentre os sub-núcleos, destaca-se a zona de transição entre os subnúcleos interpolar e caudal, como uma região crítica para o processamento da dor craniofacial. Portanto, com grande importância na resposta a danos orofaciais profundos, constituindo uma região integradora de informações sensoriais das regiões peri e intra-orais (BERETIER, 2000; IKEDA et al., 2003). Eventos isquêmicos e excitotóxicos nesta região certamente induzem défices sensitivos em animais (VOS;STRASSMAN;MACIEWICZ, de 1994), experimentação mas os e eventos seres humanos histopatológicos relacionados aos padrões de lesão axonal, desmielinização e resposta inflamatória não foram descritos de forma sistemática para esta região, principalmente considerando-se os eventos que ocorrem nas substâncias branca e cinzenta da região em questão. A comparação entre os padrões de resposta excitotóxica e isquêmica no sistema trigeminal não está descrito na literatura. Na presente dissertação, utilizamos modelo de isquemia focal por injeção de ET-1 e de excitotoxicidade por injeção de NMDA para averiguarmos, em um tempo de sobrevida agudo (1 dia) e em um tempo de sobrevida crônico (7 dias), os padrões histopatológicos subseqüentes à isquemia focal e lesão excitotóxica experimental induzidas na substância cinzenta do núcleo espinhal do sistema trigeminal. 61 3 PROPOSIÇÃO O propósito desta investigação foi avaliar comparativamente os padrões inflamatórios, de lesão axonal e desmielinização após lesão aguda excitotóxica e isquêmica, do núcleo espinhal do sistema trigeminal com ênfase nas alterações na substância branca do trato trigeminotalâmico. Especificamente, induzir degeneração neuronal aguda através da injeção focal de NMDA e ET-1 no núcleo espinhal no sistema trigeminal, descrever os padrões de resposta inflamatória e degeneração axonal, após lesão excitotóxica e isquêmica e por fim, comparar os padrões de resposta inflamatória, lesão axonal e desmielinização obtidos após lesão excitotóxica e isquêmica no tronco cerebral de ratos adultos. Na presente dissertação, investigamos a hipótese de que eventos excitotóxicos e isquêmicos, no núcleo espinhal do sistema trigeminal podem induzir resposta inflamatória, com subsequente degeneração axonal secundária, e comprometimento da bainha de mielina, dos tratos de substância branca do sistema trigeminal. 62 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS E INJEÇÃO DE NMDA E ENDOTELINA-1 Este estudo utilizou ratos machos adultos da raça Wistar (n= 4-5 por tempo de sobrevida, sendo dois animais controle Tabela 1), pesando em média 290 g. Após anestesia profunda mediante injeção intraperitoneal de uma mistura de Vetanarcol ® (cloridrato de cetamina, 90 mg/Kg Laboratórios Koning S.A.), Kenzol ® (cloridrato de xilazina , 10 mg/Kg - Laboratórios Koning S.A.) e de sulfato de atropina (0,125 mg/Kg), foi aplicada uma anestesia tópica no pavilhão auricular com pomada de xilocaína (Cristália). De acordo com as normas internacionais, os reflexos corneano e de retirada da pata foram testados, para garantir que o animal estivesse devidamente anestesiado. Após este procedimento, os animais foram mantidos em aparelho estereotáxico (David Kopff) para serem submetidos à injeção de N-Metil-D-Aspartato (NMDA) ou Endotelina-1 (ET-1) no sub-núcleo caudal do trato trigeminal. Com o rato anestesiado e fixado ao aparelho estereotáxico, o campo cirúrgico foi limpo entre os pavilhões auditivos e os olhos, através de tricotomia e assepsia com solução de iodo à 2%. Em seguida, uma incisão foi realizada na linha mediana, no sentido rostro-caudal, até que a calota craniana ficasse à mostra, após a retirada de toda a gordura subcutânea e epicrânio, empregando raspagem com uma espátula, até que os pontos bregma e lâmbda fossem perfeitamente visualizados. O padrão de medidas estereotáxicas foi adotado a 63 partir do ponto brégma, de acordo com coordenadas pré-estabelecidas (PAXINOS;WATSON, 1997). Com a finalidade de demarcar o ponto da calota craniana, em que seria realizada a abertura do crânio para a injeção de NMDA ou ET-1, foram utilizadas as seguintes coordenadas estereotáxicas, considerando como referência o ponto Brégma: 6 mm dorso-ventral , -13,8 mm posterior e 2,9 mm lateral. A abertura no crânio, na região determinada pelas coordenadas estereotáxicas, foi realizada com o auxílio de broca odontológica carbide PM No. 6 (Meisinger), em baixa rotação, até a exposição da dura-máter. Esta meninge foi removida do campo cirúrgico, com subseqüente injeção por pressão de 80 nmol de NMDA ou 40 pmoles de ET-1, durante 3 minutos, no subnúcleo caudal do trigêmio. A micropipeta de vidro, (diâmetro interno 10-20 m), com a solução a ser injetada foi mantida por cinco minutos no parênquima neural, antes de sua remoção lenta e gradual, para evitar refluxo da solução de NMDA, durante a retirada da pipeta. Nos animais controle foi injetado o mesmo volume de solução salina estéril (1µl), (Tabela 1). As camadas musculares foram repostas e suturadas. A fim de identificar o sítio de injeção, uma pequena quantidade de azul de colanil foi adicionada à solução de NMDA, bem como à solução controle e de ET-1. Após a sutura dos planos cirúrgicos, os animais foram mantidos com água e comida ad libitum, durante os tempos de sobrevida de 1 e 7 dias. Este procedimento experimental configura-se em um método não traumático de lesão do subnúcleo caudal do trigêmio, onde o componente mecânico da lesão é desprezível. O referido método foi estabelecido com sucesso em outras regiões do SNC 64 (HUGHES et al., 2003; FERRARI et al., 2004; GOMES-LEAL, 2004). Todos os experimentos foram de acordo com as normas sugeridas pela Society for Neuroscience, National Institutes of Health (NIH, USA) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa Com Animais de Experimentação Animal da Universidade Federal do Pará (CEPAE-UFPA).(Anexo A). Tabela 1. Neurotóxicos injetados, concentração, volume e quantidade de animais por grupo e tempo de sobrevida. Neurotóxico NMDA ET-1 Concentração Volume Animais de Experimentação 80 nmol 40 pmoles 1 µl 1 µl 4-5 animais 4-5 animais Animais Controle 2 animais 2 animais 4.2 PERFUSÃO E ANÁLISE HISTOLÓGICA Após os tempos de sobrevida de 1 e 7 dias, os animais foram profundamente anestesiados com uma mistura de Vetanarcol ® (cloridrato de catamina, 90 mg/Kg Laboratórios Koning S.A.) e Kenzol ® (cloridrato de xilazina, 10 mg/Kg - Laboratórios Koning S.A.), perfundidos através do ventrículo esquerdo do coração, com solução salina a 0,9% heparinizada, seguida de solução de Paraformaldeído (Sigma Company, USA) a 4% em tampão fosfato 0,2M (pH 7,4). Após a dissecção do crânio, o tecido perfundido foi mantido em solução de sacarose a 25% por 2 horas, em seguida em solução de sacarose a 50 % por 12 horas e finalmente, em solução de sacarose a 100% por 24 horas para crioproteção. Os blocos de tecido para corte em criostato foram obtidos pela imersão dos encéfalos, em gel especial para este fim (Jung Tissue Freezing 65 Médium - Leica Microsystems). O tecido imerso em gel foi congelado à 55º C, em câmara de criostato (Microm HM 505 E), equipado com efeito Peltier. Secções coronais e longitudinais (dos lados ipsilateral e contralateral ao sítio de injeção) com 20 m de espessura foram obtidas com auxílio de criostato (Microm HM 505 E) a partir dos blocos feitos pelo procedimento descrito acima. Algumas secções de 50 m foram coletadas e reagidas pela técnica da reação de NADPH-diaforase e pela hematoxilina para a visualização da área de lesão. Todas as secções foram montadas diretamente em lâminas gelatinizadas durante a microtomia. Para aumento da aderência das secções, as lâminas permaneceram à temperatura ambiente por no mínimo 24 horas, antes de qualquer outro procedimento histológico. Após este período, as mesmas foram mantidas à temperatura de 20º C, aguardando imunocitoquímica ou outra técnica de coloração. 4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUNOCITOQUÍMICA 4.3.1 Visualização da Área de Lesão Os sítios de injeção de NMDA e ET-1 foram reconhecidos pela presença do azul de colanil no tecido, bem como pelo palor, vacuolização e perda de corpos neuronais, como previamente descrito (DUSART;MARTY;PESCHANSKI, 1991; GOMES-LEAL, 2002a, 2004). A área de lesão foi visualizada através da coloração para hematoxilina (H). Como uma técnica adicional, a reação de NADPH-diaforase foi realizada em algumas secções com espessura de 50 m para a visualização da 66 área de lesão. Segundo Gomes-Leal, com esta técnica de coloração, é possível delimitar claramente a perda de reatividade da neurópila (azul devido á deposição de formazan) reativa para NADAPH-diaforase após injeção de NMDA (comunicação pessoal). 4.3.2 Imunocitoquímica Com o intuito de avaliar a participação de células gliais e células da resposta inflamatória nos mecanismos de lesão do trato trigeminal, bem como a presença de lesão axonal e desmielinização, nos modelos de lesão excitotóxica e isquêmica, uma série de estudos imunocitoquímicos foi realizada (Tabela 2). Detalhes destes procedimentos podem ser encontrados nos anexos dete trabalho. Tabela 2. Anticorpos, fabricantes e diluição utilizados na presente dissertação Anticorpo ED-1 (monoclonal) MBS-1 (policlonal) ß-APP (monoclonal) MBP (monoclonal) 4.3.2.1 Fabricante Serotec CNS Inflammation Group Invitrogen Chemicon international Diluição 1:500 1:2000 1:50 1:500 Marcadores da Resposta Inflamatória Para identificarmos a presença de macrófagos e microglia ativados, na área de lesão e em regiões circundjacentes, utilizamos os anticorpos ED1 (1:500, Serotec), que reconhece um epítopo na membrana de lisossomas no citoplasma de macrófagos/microglia ativados (DIJKSTRA et al., 1985a). 67 Neutrófilos foram marcados utilizando o anticorpo policlonal MBS-1 (1:2000), o qual reconhece epítopos presentes na maioria da população de neutrófilos. Este anticorpo foi desenvolvido por Martine Bernardes Silva do CNS, inflammation Group da Universidade de Southampton e utilizados com sucesso pelo nosso grupo, em um modelo de lesão aguda da medula espinhal (GOMESLEAL, 2002a, 2004, 2005a). 4.3.2.2 Marcadores de Lesão Axonal Com o intuito de marcarmos lesão axonal, foi utilizada a imunocitoquímica para a proteína precursora -amilóide ( -APP do inglês amyloid precursor protein 1:50, Zymed). Demonstrou-se que esta técnica é bastante sensível para detectar lesão axonal (GENTLEMAN et al., 1993), tanto experimentalmente como em estudos de distúrbios patológicos em seres humanos (AHLGREN;LI;OLSSON, 1996; MCKENZIE et al., 1996; AN et al., 1997). 4.3.2.3 Marcadores de Mielina A fim de investigarmos se os modelos de degeneração neuronal aguda no núcleo trigeminal caudal induziram alterações na bainha de mielina, utilizamos um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína básica de mielina (MBP, do inglês myelin basic protein, 1:500, Chemicon International). 68 4.4 ANÁLISE QUALITATIVA Todas as secções, coradas pelos diferentes métodos histológicos e imunocitoquímicos, foram inspecionadas em microscópio óptico (ZEISS-AXI OPHOT). Imagens de secções com campos mais ilustrativos, obtidas de animais perfudidos 1 e 7 dias após a injeção de NMDA e ET-1, foram obtidas com o uso de uma câmera digital acoplada ao microscópio óptico (Optiphot-Kikon) e ao programa de computador Stereo Investigator (Microbrighfield, USA). 5. RESULTADOS 5.1 PADRÕES LESIVOS No presente estudo, a lesão tecidual induzida pela injeção de 80 nmols NMDA, ou 40 pmoles de ET-1 foi visualizada em secções coronais, ou parassagitais coradas pela hematoxilina (Figura 2). A injeção destes neurotóxicos induziu palor tecidual, lesão neuronal aguda, edema e resposta inflamatória no local da injeção, qual seja o núcleo espinhal do sistema trigeminal (Figura 2). Apesar da maior parte das injeções terem sido centradas no subnúcleo caudal, algumas injeções atingiram os outros subnúcleos, principalmente a zona de transição com o subnúcleo interpolar. Os animais controle, injetados com solução salina estéril, não apresentaram este padrão lesivo, às vezes, apresentando lesão mecânica desprezível (Figuras 2A-B). O sítio de injeção de NMDA ou ET-1 pôde 69 ser evidenciado pela presença do corante azul de colanil, co-injetado com os neurotóxicos ou com a solução salina estéril (Figura 2). A injeção de NMDA induziu clara perda tecidual, na substância cinzenta com aspecto necrótico que pôde ser visualizada 1 dia após a injeção (Figura 2C). Esta perda tecidual tornou-se mais intensa no tempo de sobrevida de 7dias (Figura 2E). Não houve comprometimento da substância branca, após a injeção deste agonista glutamatérgico (Figura 3). Houve pouco recrutamento de macrófagos e neutrófilos (Figura 2C) nos animais injetados com NMDA, mas não nos animais controle (Figura 2A), 1 dia após a injeção. No tempo de sobrevida de 7 dias, apesar do aumento da área necrótica, a resposta inflamatória foi negligenciável, segundo revelado pela coloração pela hematoxilina (Figura 2E). O padrão de lesão isquêmica induzida por injeção do peptídeo vasconstritor ET-1 apresentou aspectos diferenciais, quando comparada à lesão excitotóxica induzida pela injeção de NMDA. Um dia após a injeção de endotelina-1, a perda tecidual não foi tão intensa quanto a observada no mesmo tempo de sobrevida para a injeção de NMDA (Figura 2B). No tempo de sobrevida de 7dias, houve maior rarefação tecidual, sem a expansão necrótica observada na lesão excitotóxica (Figura 2E). O centro isquêmico foi geralmente restrito à substância cinzenta, mas o comprometimento da substância branca também foi encontrado, a partir de 1 dia após a indução da isquemia. A região de penumbra isquêmica englobava toda a substância branca, que neste caso correspondia ao trato trigeminotalâmico. O padrão de recrutamento de células inflamatórias marcadas pela hematoxilina foi bem mais intenso nos animais injetados com ET-1 (Figuras 2D;F), 70 do que naqueles injetados com NMDA (Figuras 2C;E). Como confirmado pelos estudos imunohistoquímicos descritos abaixo, apenas macrófagos foram recrutados para o epicentro da lesão e regiões circundjacentes, após a injeção de ET-1, nos dois tempos de sobrevida avaliados (Figuras 2D;F). Não houve recrutamento de neutrófilos após a injeção de ET-1. Nos tempos de sobrevida investigados, mas principalmente 7 dias após a injeção de ET-1, um grande número de células picnóticas foi encontrado na substância branca, próxima ao sítio de injeção no núcleo espinhal (Figura 4). 5.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA Como mencionado anteriormente na descrição da histopatologia básica, houve um padrão diferencial do recrutamento de neutrófilos e macrófagos, nos modelos excitotóxico e isquêmico. Estes resultados foram confirmados através da marcação imunohistoquímica com anticorpos específicos (anti-MBS-1 para neutrófilos e anti-ED1 para macrófagos/microglia), para estas células do sistema imune inato que participam da resposta inflamatória nos tecidos neurais e não neurais. 71 Figura 2. Padrão histopatológico revelado pela coloração pela hematoxilina, em animais controle injetados com solução salina estéril (A-B) e animais injetados com NMDA (C;E) e endotelina (D;F), nos tempos de sobrevida de 1 e 7 dias. Notar a presença do corante azul de colanil nos animais controle, sem perda tecidual significativa (A-B). 1 dia após a injeção de NMDA (C) e endotelina-1 (D) a perda tecidual torna-se evidente, juntamente com presença de células inflamatórias (setas em C e D). Notar o maior número de células inflamatórias no subnúcleo caudal dos animais injetados com ET-1, nos dois tempos de sobrevida (setas em D e F). Escalas = 50 m. 72 Figura 3. Região necrótica (asterisco) induzida pela injeção de NMDA na substância cinzenta (SC) do subnúcleo caudal do núcleo espinhal, 7 dias após a injeção. A substância branca (SB) está intacta, indicando que o NMDA é um neurotóxico que lesa preferencialmente a substância cinzenta. As setas apontam para macrófagos no epicentro da lesão. Notar o azul de colanil no centro necrótico. Escalas = 50 m. Imunocitoquímica para macrófagos. 73 Figura 4. Picnose na substância branca do tronco cerebral de ratos injetados com endotelina-1. A região em B é uma ampliação do campo delimitado pelo retângulo em A. As setas apontam para células picnóticas em B. Escalas: A = m.Hematoxilina. 50 m; B = 100 74 A injeção de NMDA no núcleo espinhal do sistema trigeminal induziu pouco recrutamento de neutrófilos no tempo de sobrevida de 1 dia (Figura 5C), mas não induziu nos animais controle injetados com salina estéril (Figura 5A). Estas células inflamatórias não foram encontradas no parênquima neural 7 dias após a injeção (Figura 5E), o que está de acordo com o relato de investigações prévias em outras regiões do SNC (BOLTON;PERRY, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002b, 2005a). Também houve recrutamento de poucos macrófagos, 1 (Figura 6C) e 7 (Figura 6E) dias após a injeção de NMDA no núcleo espinhal de ratos. Ambos os tipos de leucócitos foram restritos às regiões de perda tecidual na substância cinzenta. Estas células inflamatórias não foram encontradas na substância branca (não ilustrado). A lesão isquêmica no núcleo espinhal, induzida por injeção de ET-1 revelou um padrão bem mais intenso de resposta inflamatória dominado pelo recrutamento e ativação de macrófagos/microglia (células ED1 +), nos dois tempos de sobrevida investigados (Figuras 2D;F, Figura 6D;F). Um grande número de células ED1+ foi encontrado na substância cinzenta do núcleo espinhal 1 (Figura 6D) e 7 dias (Figura 6F) após a injeção de endotelina-1. As células ED1+ também foram encontradas na substância branca, nos dois tempos de sobrevida investigados, mas principalmente 7 dias após a indução da lesão isquêmica (Figura 7). Não houve recrutamento de neutrófilos após a injeção de endotelina-1 no núcleo espinhal do sistema trigeminal no presente estudo, com exceção de um animal, em que alguns neutrófilos marcados foram encontrados em uma região focal distante do sítio de injeção (não ilustrado). 75 Figura 5. Recrutamento de neutrófilos nos animais injetados com NMDA e endotelina-1, 1 (C-D) e 7 dias (E-F) após a injeção. Nos animais controle injetados com solução salina estéril não houve recrutamento de neutrófilos (A-B). Poucos neutrófilos foram encontrados nos animais injetados com NMDA, apenas 1 dia após a injeção (setas em C). Não houve recrutamento de neutrófilos nos animais injetados com endotelina-1 em nenhum tempo de sobrevida. Notar o azul de colanil em A e D. Escalas = 50 m. 76 Figura 6. Recrutamento de macrófagos/microglia ativados após injeção de NMDA e endodelina-1 no núcleo espinhal de ratos adultos. Animais controle injetados com solução salina estéril (A-B). Houve recrutamento mais intenso de macrófagos/microglia ativados nos animais injetados com ET-1 (D;F) do que nos animais injetados com NMDA (C;E). As setas apontam para macrófagos/microglia ED1+. No o corante azul de colanil em E. Escalas = 50 m. 77 5.3 LESÃO AXONAL Na presente dissertação, axônios lesados foram marcados através da imunohistoquímica para a proteína precursora -amilóide ( -APP, do inglês - amyloid precursor protein), um marcador clássico de lesão axonal. Microinjeções de NMDA e ET-1 induziram o aparecimento de perfis axonais arredondados - APP+ na substância cinzenta do núcleo espinhal, 1 e 7 dias após a injeção dos neurotóxicos em questão (Figura 8), mas não nos animais controle (Figura 8-AB). No tempo de sobrevida 1 dia, o número de perfis -APP+ foi comparável para os animais injetados com NMDA e endotelina-1 (Figura 8C-D). No entanto, no tempo de sobrevida de 7 dias, o número destes perfis -APP+ foi claramente maior no núcleo espinhal de animais injetados com ET-1, do que naqueles injetados com NMDA (Figura 8E-F). Na substância branca dos animais injetados com NMDA, não houve marcação significativa pela imunohistoquímica para o -APP 1 dia após a injeção (Figura 9A-B). Sete dias após a injeção de NMDA, alguns perfis -APP+ arredondados foram encontrados na substância branca adjacente ao epicentro necrótico da substância cinzenta (Figura 9C-D). Na substância branca dos animais injetados com ET-1, os perfis arredondados -APP+ foram mais freqüentes e encontrados a partir de 1 dia, após a indução da isquemia (Figura 10C-D). Houve aumento do número e do tamanho destas estruturas arredondadas positivas para o -APP no tempo de sobrevida de 7 dias (Figura 10D). 78 Figura 7. Presença de macrófagos/microglia ativados na substância branca do sistema trigeminal dos animais injetados com endotelina-1, 1 dia (A-B) e 7 dias (C-D) após a injeção. As setas apontam para macrófagos/microglia ativados ED1+. B e D são ampliações de A e C. Escalas: A;C = 100 m; B;D = 20 m. 79 Figura 8. Lesão axonal na substância cinzenta do núcleo espinhal do sistema trigeminal. Animais controle injetados com salina estéril (A-B). Animais injetados com NMDA e endotelina-1, 1 (C-D) e 7 dias (E-F) após a injeção. As setas apontam para axônios lesados marcados pela imunohistoquímica para o -APP. Notar a maior quantidade de axônios lesados nos animais injetados com endotelina-1 (D;F) do que nos animais injetados com NMDA (C;E), principalmente no tempo de sobrevida de 7 dias. Escalas = 50 m. 80 Figura 9. Lesão axonal na substância branca do sistema trigeminal dos animais injetados com NMDA. Perfis axonais marcados pela imunohistoquímica para o APP (setas em A-D), 1 (A-B) e 7 dias (C-D) após a injeção de NMDA. Escalas: A;C = 100 m; B;D = 20 m. 81 5.4 ALTERAÇÕES NA BAINHA DE MIELINA Injeção de NMDA e ET-1 no núcleo espinhal do sistema trigeminal induziu alterações no padrão de marcação para MBP (MBP, do inglês myelin basic protein) em escalas temporais diferentes. Um dia após a injeção de NMDA não houve alteração aparente no padrão de marcação revelado pelo anticorpo antiMBP (Figura 11C), o qual foi comparável ao dos animais controle (Figura 11A-B). Para este mesmo tempo de sobrevida, houve perda significativa da marcação para MBP nos animais experimentais injetados com endotelina-1 (Figura 11D). Nestes mesmos animais, a substância branca contralateral apresentou um padrão de marcação normal (Figura 11A). Sete dias após a injeção de NMDA, em torno do epicentro necrótico na substância cinzenta, houve intensa perda da marcação para MBP, sem vacuolização significativa da substância branca (Figura 11E). Nos animais injetados com ET-1, a perda de marcação para MBP foi evidente, o que foi concomitante com intensa vacuolização da substância branca (Figuras 11F e 12). 82 Figura 10. Lesão axonal na substância branca do sistema trigeminal dos animais injetados com ET-1. Perfis axonais marcados pela imunohistoquímica para o APP (setas em A-D), 1 (A-B) e 7 dias (C-D) após a injeção de endotelina-1. B e D são ampliações de A e C. SC = substância cinzenta; SB = substância branca. Escalas: A;C = 100 m; B;D = 20 m. 83 Figura 11. Desmielinização na substância branca do sistema trigeminal após a injeção de NMDA e endotelina-1 no núcleo espinhal e ratos adultos. Animais controle: lado contralateral do animal injetado com ET-1 ilustrado em D (A); animal injetado com salina estéril (B). Notar conspícua desmielinização no trato trigeminotalâmico 1 dia após a injeção de endotelina-1 (D), mas não nos animais injetados com NMDA (C). Os animais injetados com NMDA apresentam desmielinização no tempo de sobrevida de 7 dias (E). Neste tempo de sobrevida, ocorre degradação da bainha de mielina nos animais injetados com endotelina-1 (F). A seta aponta para um microcisto em F. SC = substância cinzenta; SB = substância branca. Escalas = 50 m. 84 Figura 12. Formação de microcistos na substância branca dos animais injetados com ET-1, 7 dias após a injeção. As setas apontam para microcistos na substância branca. Escalas: A = 50 m; B = 20 m. 85 6 DISCUSSÃO 6.1 CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS No presente estudo, injetou-se ET-1 e NMDA, no núcleo espinhal do sistema trigeminal de ratos adultos, para induzir degeneração neuronal aguda e resposta inflamatória nesta região a fim de avaliar os padrões de degeneração secundária da substância branca no sistema neural em questão. Um aspecto original da presente dissertação, foi a comparação implementada entre os eventos histopatológicos induzidos por eventos isquêmicos e excitotóxicos, em um mesmo paradigma experimental, o que era inexistente da literatura. Este fato torna-se mais relevante, considerando-se que eventos isquêmicos e excitotóxicos são eventos fisiopatológicos importantes de doenças neurodegenerativas agudas, tais como AVC e trauma (SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; DIRNAGL;IADECOLA;MOSKOWITZ, 1999; LO, 2003; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). O principal argumento para o uso da injeção de NMDA para induzir degeneração neuronal aguda experimental encontra-se no fato de que a injeção deste neurotóxico induz alterações histopatológicas similares às encontradas durante trauma do cérebro e da medula espinhal de seres humanos (KAO;CHANG;BLOODWORTH, 1977; WOZNIEWICZ et al., 1983; FOX et al., 1988; TATOR;FEHLINGS, 1991; DAVIS;KHANGURE, 1994; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; TATOR;KOYANAGI, 1997). Estas alterações patológicas incluem necrose progressiva no eixo rostro-caudal com cavitação hemorrágica e seringomielia (KAO;CHANG;BLOODWORTH, 1977; WOZNIEWICZ et al., 1983; FOX et al., 1988; DAVIS;KHANGURE, 1994; TATOR;KOYANAGI, 1997), ativação glial e 86 lesão axonal (SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; LOPACHIN;LEHNING, 1997; STYS, 1998; CORNISH et al., 2000). Inexistem estudos que tenham investigado os padrões histopatológicos induzidos por injeção de NMDA no sistema trigeminal. Demonstrou-se experimentalmente que microinjeções de ET-1 constituem-se em um excelente modelo de isquemia focal transitória (CLARKE et al., 1989; FUXE et al., 1989; AGNATI et al., 1991; HUGHES et al., 2003). Injeções de pequenas quantidades deste neurotóxico induzem redução de mais de 60 % do fluxo sanguíneo na região injetada (HUGHES et al., 2003). Esta técnica de indução de lesão isquêmica focal é bem menos trabalhosa do que os métodos clássicos de clampeamento de vasos sanguíneos específicos, como a artéria cerebral média, onde a cirurgia possui considerável grau de complexidade. Além disso, a injeção de ET-1 e NMDA através de microcapilares de vidro com diâmetro interno de ponta variando entre 20-30 m faz com que os compomenentes mecânicos sejam desprezíveis, o que permite diferenciar claramente eventos lesivos primários e secundários. No presente modelo experimental, microinjeções de NMDA e ET-1 induziram eventos histopatológicos diferenciais, no que concerne aos padrões necróticos, inflamatórios e de lesão do cilindro axonal e da bainha de mielina. A injeção do agonista glutamatérgico NMDA induziu necrose mais intensa da substância cinzenta, sem indução de perda tecidual na substância branca. A resposta inflamatória induzida pela injeção deste neurotóxico foi moderada, com pouco recrutamento de neutrófilos e macrófagos para o parênquima neural. Houve lesão axonal na substância cinzenta após injeção de NMDA, com pouco 87 comprometimento axonal na substância branca. A mielina foi afetada no tempo de sobrevida mais tardio (sete dias) no modelo de lesão excitotóxica. Por outro lado, apesar da injeção de ET-1 induzir perda tecidual menos intensa do que a induzida pela injeção de NMDA, este peptídeo vasoconstritor induziu resposta inflamatória intensa dominada por recrutamento de macrófagos, mais lesão axonal e perda de mielina, a partir de tempos de sobrevida mais precoces. Além disso, a lesão isquêmica induziu o aparecimento de um grande número de células picnóticas, o que sugere apoptose. 6.2 PERDA TECIDUAL EM DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS AGUDAS Perda tecidual com necrose progressiva é um evento final, após lesão experimental do cérebro e medula espinhal, independente do modelo lesivo utilizado (SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; LIU et al., 1997; GUTH;ZHANG;STEWARD, 1999). Achados histopatológicos semelhantes são encontrados no SNC de seres humanos, após trauma e AVC (KAO;CHANG;BLOODWORTH, 1977; WOZNIEWICZ et al., 1983; FOX et al., 1988; DAVIS;KHANGURE, 1994; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). TATOR;KOYANAGI, Estas alterações 1997; patológicas incluem necrose na direção rostro caudal com cavitação hemorrágica e seringomielia (KAO;CHANG;BLOODWORTH, 1977; WOZNIEWICZ et al., 1983; FOX et al., 1988; DAVIS;KHANGURE, 1994; TATOR;KOYANAGI, 1997), ativação glial e lesão axonal (SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; LOPACHIN;LEHNING, 1997; STYS, 1998; CORNISH et al., 2000). 88 O tratamento da necrose hemorrágica primária não influencia no prognóstico da lesão, no entanto, em doenças neurodegenerativas agudas do SNC, a lesão primária, seja na substância branca ou na substância cinzenta, expande-se com o tempo, o que aumenta o déficit funcional principalmente através do aumento do número de axônios lesados ou degeneração de oligodendrócitos (TATOR;FEHLINGS, 1991; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; LIU et al., 1997; TATOR;KOYANAGI, 1997). Este fenômeno é conhecido como degeneração neuronal secundária. Sabe-se que na medula espinhal, a lesão necrótica induzida por contusão ou compressão, que é inicialmente restrita à substância cinzenta, pode atingir a substância branca em torno de 8h (SCHWAB;BARTHOLDI, 1996). Na presente dissertação, apesar da maioria das injeções de ET-1 e NMDA terem sido restritas aos subnúcleos do núcleo espinhal, principalmente o subnúcleo caudal, observouse comprometimento da substância branca, incluindo lesão axonal, perda da reatividade para a proteína básica de mielina e vacuolização. Como previamente relatado, estes efeitos foram mais intensos no modelo isquêmico do que no modelo excitotóxico. Estes resultados sugerem que a substância branca é afetada por mecanismos secundários, nos dois modelos experimentais, mas principalmente no modelo isquêmico. Estes achados estão de acordo com outras investigações que sugerem que a substância branca do SNC é altamente vulnerável à isquemia DEWAR;YAM;MCCULLOCH, (PANTONI;GARCIA;GUTIERREZ, 1999; PETTY;WETTSTEIN, 1996; 1999; KANELLOPOULOS et al., 2000). Como o acúmulo de aminoácidos excitatórios é um evento secundário ao processo isquêmico (LO, 2003; 89 MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004), e, considerando-se que o modelo excitotóxico pela injeção de NMDA, usado na presente dissertação simula este evento patológico, os resultados da presente dissertação mostram que outros eventos patológicos além da excitotoxicidade, são responsáveis pelos eventos lesivos durante a degeneração neuronal secundária subjacentes à isquemia. O fenômeno de degeneração neuronal secundária foi descrito originalmente por Allen em 1911, em seus estudos na medula espinhal do gato (apud Tator & Felings, 1991) e consiste de um grupo de eventos destrutivos, que podem afetar células e axônios que foram apenas marginalmente afetados pelo evento lesivo primário, ou mesmo que não foram afetados (TATOR;FEHLINGS, 1991; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; YAMAURA et al., 2002; LO, 2003; MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). Durante este fenômeno, neurônios e axônios não afetados pelo estímulo lesivo primário podem degenerar por mecanimos ditos secundários se não forem protegidos por intervenção terapêutica (TATOR;FEHLINGS, 1991; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996). Acredita-se que inúmeros mecanimos sejam envolvidos no fenômeno de degeneração secundária no SNC, mas a inflamação aguda, lesão vascular, excitotoxicidade mediada pelo glutamato, estresse oxidativo, acidose metabólica, despolarização peri-infarto parecem ser os principais fatores envolvidos (TATOR;FEHLINGS, 1991; SCHWAB;BARTHOLDI, 1996; YAMAURA MERGENTHALER;DIRNAGL;MEISEL, 2004). et al., 2002; LO, 2003; 90 6.3 PADRÃO DIFERENCIAL DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA EM MODELOS EXCITOTÓXICOS E ISQUÊMICOS No presente estudo, avaliou-se os padrões de recrutamento de neutrófilos e macrófagos, em um modelo excitotóxico (injeção de NMDA) e um modelo isquêmico (injeção de ET-1), em um tempo precoce (1dia) e no tempo de sobrevida mais tardio (7dias). Os resultados mostraram um padrão diferencial de recrutamento destes leucócitos. No modelo excitotóxico, houve recrutamento de poucos neutrófilos, no tempo de sobrevida de 1 dia e de pouquíssimos macrófagos no tempo de sobrevida de 7 dias. Estas células inflamatórias foram basicamente restritas à substância cinzenta do núcleo espinhal. No modelo isquêmico induzido por injeção focal de ET-1, a resposta inflamatória foi caracterizada por recrutamento intenso de macrófagos, tanto para a substância cinzenta como para a substância branca. Não houve recrutamento de neutrófilos para o parênquima neural induzido por injeção de endotelina-1, no modelo experimental proposto. O aparecimento de células ED1 +, na substância branca ocorreu no tempo de sobrevida de 7 dias. A escala temporal do recrutamento de células inflamatórias nos modelos experimentais investigados segue o já relatado na literatura, em modelos traumáticos e não traumáticos de lesão do cérebro (BOLTON;PERRY, 1998) e medula espinhal (SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002b, 2004, 2005a). No cérebro e na medula espinhal foram estabelecidos que o pico para o recrutamento de neutrófilos ocorre 1 dia após a injeção de NMDA, enquanto o pico para o recrutamento de macrofágos ocorre a partir de 3 dias após a injeção deste 91 neurotóxico (BOLTON;PERRY, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002b, 2004, 2005a). Sabe-se também que a intensidade da resposta inflamatória depende do compartimento do SNC analisado, por exemplo, sendo mais intensa na medula espinhal do que no cérebro (SCHNELL et al., 1999). No tronco cerebral, de acordo com os resultados da presente dissertação para o modelo excitotóxico, a quantidade de células inflamatórias recrutadas foi aparentemente menor do que as relatada para outras regiões do SNC, por exemplo, medula espinhal e núcleos da base (BOLTON;PERRY, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002b, 2004, 2005a). Isto pode significar que, dependendo do compartimento do SNC, a regulação da resposta inflamatória pode ser mais ou menos intensa, provavelmente para a preservação da integridade do tecido neural. Isto seria oportuno no tronco cerebral, onde existem núcleos neuronais que constituem-se em centros respiratórios. Lesão nestes centros neurais vitais podem induzir coma e morte rapidamente (MEDANA et al., 2002; MEDANA;ESIRI, 2003). O fato de ter havido recrutamento de neutrófilos, mesmo que moderado, apenas no modelo excitotóxico, mas não no modelo isquêmico, pode ter relação com o comprometimento ou não da barreira hematoencefálica. Hughes et al., (2003) relataram que microinjeções ET-1 no estriato, substância cinzenta e substância branca cortical do cérebro de ratos adultos induzem resposta inflamatória caracterizada por recrutamento de macrófagos, principalmente 3 dias após a indução isquêmica. Estes autores também relataram ausência de recrutamento de neutrófilos, no modelo experimental utilizado. Portanto, neutrófilos não são recrutados no modelo de isquemia focal induzido por injeção de ET-1. No modelo utilizado por Hughes et al. (2003), não houve 92 comprometimento da barreira hematoencefálica, como avaliado por um ensaio histoquímico específico para estes fins utilizando injeção da peroxidase de raiz forte (HRP). Portanto, o comprometimento da barreira hematoencefálica é um evento crucial para que neutrófilos, mas não monócitos, cheguem ao parênquima neural. Isto foi demonstrado claramente por Schnell et al., (1999). Neste estudo, o recrutamento mais intenso de neutrófilos foi concomitante com um comprometimento mais conspícuo da barreira hematoencefálica. A ausência de recrutamento de neutrófilos no modelo isquêmico utilizado no presente estudo mostra que estas células não participam do processo lesivo, por exemplo, desmielinização, vacuolização e lesão axonal. Monócitos têm livre acesso ao SNC, mesmo através de uma barreira hematoencefálica intacta (PERRY;GORDON, 1991). Estas células transformam-se nos macrófagos residentes do SNC na vida adulta, as células microgliais (PERRY;GORDON, 1991). Durante lesão aguda do SNC, tais como durante trauma e AVC, monócitos derivados da corrente sanguínea alcançam o parênquima neural lesado e transformam-se em macrófagos ativados (POPOVICH et al., 1999; POPOVICH;HICKEY, 2001; POPOVICH et al., 2002; GOMES-LEAL, 2005a). Na presente dissertação, a resposta inflamatória do modelo isquêmico foi dominada por um intenso recrutamento de macrófagos/microglia para o parênquima lesado. Estes resultados mostram que os mecanismos moleculares, que induzem a ativação de macrófagos/microglia no modelo isquêmico diferem daqueles presentes no modelo excitotóxico, onde o recrutamento de macrófagos foi escasso. Após lesão mecânica e excitotóxica do cérebro e da medula espinhal, macrófagos são recrutados para o tecido neural lesado, principalmente nos 93 tempos de sobrevida mais tardios (BOLTON;PERRY, 1998; SCHNELL et al., 1999; GOMES-LEAL, 2002a, 2005a). Os resultados da presente dissertação mostraram o aumento do número de células ED1+ (macrófagos/microglia ativados), principalmente no tempo de sobrevida de 7 dias, o que está de acordo com os estudos anteriormente relatados. A presente investigação também mostrou, entre as duas técnicas comparadas, um recrutamento diferencial de células ED1+, para a substância branca no tempo de sobrevida mais tardio, após a indução da lesão isquêmica em relação a trabalhos citados na literatura. A imunohistoquímica utilizando o anticorpo anti-ED1 marca macrófagos/microglia ativados, mas não é capaz de diferenciar os macrófagos derivados da microglia, daqueles macrófagos hematogênicos oriundos de monócitos derivados da corrente sanguínea. Estes dois subgrupos de macrófagos podem contribuir diferencialmente para o processo lesivo (POPOVICH;HICKEY, 2001). Popovich e Hickey, (2001) utilizaram ratos quiméricos de diferentes linhagens, que tiveram a medula óssea destruída por radiação para a caracterização da participação dos dois subgrupos de macrófagos mencionados após contusão experimental da medula espinhal de ratos. Os animais quiméricos tiveram seus macrófagos derivados da corrente sanguínea, marcados por anticorpos específicos que os diferenciavam dos macrófagos ativados derivados da microglia residente. Estes autores demonstraram que a cena lesiva é inicialmente dominada por macrófagos derivados de células microgliais, que depois são suplantados por macrófagos hematogênicos. Ainda segundo estes autores, os macrófagos hematogênicos ficavam geralmente restritos à substância cinzenta da medula espinhal, enquanto que os macrófagos derivados da microglia residente possuíam uma distribuição 94 mais ampla, inclusive na substância branca. No presente estudo, o aparecimento de células ED1+ na substância branca em um tempo de sobrevida mais tardio pode significar o aumento da atividade microglial, ou mesmo a maior infiltração de macrófagos hematogênicos na substância branca. Existem fortes evidências na literatura de que células da resposta inflamatória ao desempenharem seus papéis fisiológicos como células fagocitárias, removendo detritos celulares e outros produtos da lesão, podem também agravar o fenômeno lesivo (BLIGHT, 1985; BLIGHT;DECRESCITO, 1986; BLIGHT, 1991, 1992, 1993; GIULIAN et al., 1993; BLIGHT, 1994; POPOVICH et al., 1994; BLIGHT et al., POPOVICH;STOKES;WHITACRE, 1995; 1996; POPOVICH et al., 1996; POPOVICH;WEI;STOKES, 1997; POPOVICH;YU;WHITACRE, 1997; POPOVICH et al., 1999; POPOVICH, 2000; BLIGHT;ZIMBER, 2001; HERMANN et al., 2001; POPOVICH;HICKEY, 2001; POPOVICH et al., 2001). Os mecanismos específicos pelos quais células da resposta inflamatória podem agravar o processo lesivo após lesão do SNC não são totalmente estabelecidos, mas inúmeras possibilidades têm sido aventadas na literatura. Acredita-se que macrófagos e microglia ativados podem contribuir para exacerbação da lesão no SNC, como uma espécie de efeito colateral de suas atividades fisiológicas (BLIGHT, 1985; GIULIAN et al., 1989; GIULIAN;VACA;NOONAN, 1990; BLIGHT, 1992, 1994; POPOVICH;WEI;STOKES, 1997; POPOVICH et al., 1999). A depleção do recrutamento de macrófagos com pó de sílica (BLIGHT, 1985, 1992, 1994) ou clodronato (POPOVICH et al., 1999) diminui a área de lesão secundária e melhora o prognóstico de recuperação motora, após lesão da medula espinhal em roedores. A Injeção intraperitoneal de 95 pó de sílica induz uma forte resposta inflamatória local, tornando monócitos menos disponíveis em outros tecidos (BLIGHT, 1994; FISCHER;REHN;BRUCH, 1996; IYER et al., 1996). Blight propôs inicialmente, que a atividade de macrófagos poderia ser importante para a exacerbação de lesão neuronal, após lesão da medula espinhal (BLIGHT, 1985;1992). Blight (1994) testou esta hipótese através de injeções intraperitoneais de pó de sílica, em porquinhos da índia submetidos a contusão da ME. Este autor relatou que o referido procedimento resultou em redução da perda de axônios mielinizados e diminuição da hipervascularização da area lesada. Blight concluiu que macrófagos poderiam causar lesão direta a axônios ou vasos sanguíneos nas condições experimais analisadas. Popovich et al., (1999) relataram outra forte evidência para a participação de macrófagos em mecanismos lesivos. Estes autores efetuaram injeção intravenosa de lipossomas de clodronato, em ratos submetidos à lesão aguda da medula espinhal. Animais que receberam injeção de clodronato apresentaram melhora das funções motoras, acompanhada por diminuição da cavitação no eixo rostrocaudal, além de regeneração axonal. Além disso, tem sido relatado que a injeção de altas doses do anti-inflamatório metilprednisolona produz diminuição da área de lesão secundária e induz melhora da recuperação motora em ratos submetidos a LME (BRACKEN, 1990, 2000; BRACKEN et al., 2000; BRACKEN, 2001b; 2001a, 2002; BRACKEN;HOLFORD, 2002). Esta droga é atualmente usada para o tratamento de seres humanos que sofreram lesão aguda da ME (BRACKEN et al., 2000; BRACKEN, 2002; BRACKEN;HOLFORD, 2002). Os mecanismos pelos quais a metilpredinisolona diminue a área de lesão secundária podem ser relacionados aos seus efeitos anti-inflamatórios, por exemplo, a 96 diminuição da liberação de FNT- (XU et al., 1992; XU et al., 1998) ou mesmo a uma função anti-oxidante (KOC et al., 1999; BLIGHT;ZIMBER, 2001). O TNF- é uma citocina pro-inflamatória considerada importante para os mecanismos lesivos, relacionados à resposta inflamatória e degeneração secundária, após lesão do cérebro e da medula espinhal (HERMANN et al., 2001). Hermann et al., (2001) relataram que injeções de pequenas doses de FNT- (60pg) ou cainato não induzem ou induzem lesões diminutas na SC da ME, mas que injeções concomitantes de TNF- (60pg) e cainato induzem lesões significativamente maiores. Estes autores sugeriram que o TNF- poderia potencializar os efeitos da excitotoxicidade mediada por receptores AMPA, talvez induzindo liberação de glutamato por microglia ou astrócitos. Finalmente, existem evidências in vitro a favor da participação do NO sintetizado pela SON imunológica (NOSi), presente em células gliais na expansão da lesão necrótica durante lesão do SNC (BAL-PRICE;BROWN, 2001). Estes estudos mostram que o NO liberado por células gliais, durante a inflamação aguda pode ser responsável por cerca de 70-75 % da morte celular, por necrose que ocorre no meio de cultura. Em outro estudo, Popovich et al., (2002) realizaram microinjeções do ativador microglial zymosan, com esta abordagem demonstraram lesão axonal e desmielinização seletiva no sítio de injeção. Todos os estudos, relatados acima mostram o potencial para células inflamatórias causarem perda tecidual após lesão aguda do SNC, como a induzida no presente modelo experimental. No entanto, é válido mencionar que existem 97 evidências experimentais de que o processo inflamatório pode possuir efeito benéfico, após lesão do SNC (LAZAROV-SPIEGLER et al., 1998; RAPALINO et al., 1998; KNOLLER, 2005; SCHWARTZ;YOLES, 2005). Recentemente, relatouse um ensaio clínico de fase I, no qual o transplante autólogo de macrófagos foi bem tolerado, por alguns pacientes humanos com lesão aguda da medula espinhal. Estas pessoas apresentaram melhor prognóstico clínico, do que o grupo que não foi submetido ao tratamento (KNOLLER, 2005). 6.4 INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1 INDUZ MAIS LESÃO AXONAL DO QUE INJEÇÃO DE NMDA No presente modelo experimental, o modelo de isquemia focal por injeção de ET-1 induziu mais lesão axonal, tanto na substância branca como na substância cinzenta, do que a injeção de NMDA. Sabe-se que os déficits energéticos, concomitantemente com mecanismos inflamatórios, excitotóxicos e cidose metabólica contribuem para a perda tecidual após isquemia (DIRNAGL; IADECOLA; MOSKOWITZ,1999; MERGENTHALER; DIRNAGL; MEISEL, 2004). Poucos estudos investigaram os padrões de lesão axonal após lesão aguda do SNC. Gomes-Leal et al., (2005) relataram lesão axonal na substância cinzenta ventral e dorsal, após microinjeções de NMDA no corno ventral da medula espinhal de ratos. Neste estudo, houve correlação entre a ativação de macrófagos/microglia e o número de axônios lesados, três dias após a indução da lesão primária. No presente estudo, a injeção de NMDA no núcleo espinhal do sistema 98 trigeminal induziu lesão axonal, principalmente na substância cinzenta. Sabe-se que a lesão neuronal aguda excitotóxica induz degeneração de corpos neuronais, com subsequente ativação astrocitária, microglial, inflamação, apoptose e formação de radicais livres (GOMES-LEAL, 2002a, 2004, 2005a). Estes eventos podem induzir lesão axonal direta. Existem evidências experimentais que ativação de macrófagos e microglia podem contribuir diretamente para lesão axonal, através da liberação de citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF- , IL-1, IL-6), proteases e NO (POPOVICH et al., 2002; GOMES-LEAL, 2005a; HENDRIKS et al., 2005). Um papel direto do NMDA nos mecanismos de lesão axonal, na substância cinzenta no presente modelo experimental seria muito improvável, quando se considera que não existem receptores de NMDA em células gliais, mielina e axônios (AGRAWAL;FEHLINGS, 1996; 1997; GARCIA_BARCINA;MATUTE, 1998; MATUTE, 1998). O TNF- pode contribuir para a lesão axonal, através de efeitos lesivos primários em oligodendrócitos (HENDRIKS et al., 2005). O glutamato liberado de neurônios ou células gliais sofrendo degeneração na substância cinzenta ou de outras fontes, também poderia contribuir para lesão axonal. No presente modelo de lesão excitotóxica, os efeitos lesivos na substância branca foram desprezíveis, quando comparados aos induzidos por injeção de ET1. Estes resultados diferem dos relatados por Gomes-Leal et al., (2005), que encontraram quantidade significativa de axônios lesados nos tratos de substância branca da medula espinhal, após lesão excitotóxica induzida por injeção de NMDA no corno ventral da medula espinhal de ratos. A razão destes resultados discrepantes não é clara, mas pode estar relacionada a fatores anatômicos e 99 fisiológicos inerentes à constituição destes diferentes compartimentos do SNC. Por exemplo, a medula espinhal possui tratos de substância branca mais exuberantes do que os encontrados no tronco cerebral, que certamente são mais vulneráveis a processos lesivos. Na medula espinhal, diferentes fascículos de substância branca podem ser lesados por diferentes mecanismos lesivos (ZHANG;KREBS;GUTH, 1997). Estes mesmos mecanismos podem não ser atuantes em outras regiões do SNC, como no trato trigeminotalâmico do sistema trigeminal. A lesão isquêmica induzida por injeção de ET-1 induziu, comparativamente, mais lesão axonal do que a lesão excitotóxica induzida pela injeção de NMDA, tanto na substância branca, como na substância cinzenta. Sabe-se que o tecido neural é altamente vulnerável à isquemia, principalmente a substância branca (PANTONI;GARCIA;GUTIERREZ, 1996; DE_KEYSER;SULTER;LUITEN, 1999; DEWAR;YAM;MCCULLOCH, 1999; PETTY; WETTSTEIN, 1999;KANELLOPOULOS et al., 2000). Existem diversos possíveis mecanismos que poderiam ser responsáveis pela lesão axonal durante doenças neurodegenerativas agudas (STYS, 2005). Recentemente, Stys e colabaoradores (LI et al., 1999b; LI;JIANG;STYS, 2000; LI;STYS, 2000), usando substância branca isolada da medula espinhal in vitro, relataram evidências para um papel de receptores do tipo não-NMDA, nos mecanismos lesivos após trauma e isquemia. No primeiro paradigma experimental estudado (LI;STYS, 2000), a infusão dos agonistas glutamatérgicos AMPA e cainato na substância branca dorsal isolada da medula espinhal resultou em alterações de oligodendrócitos, astrócitos e particularmente da bainha de mielina. 100 Nestes estudos, não foram encontradas evidências de lesão do cilindro axonal, como evidenciado pela imunocitoquímica para degradação da espectrina por proteases, bem como pela presença de GluR2/3 e GluR4 em células gliais. Em um outro paradigma experimental utilizando o mesmo modelo in vitro, a substância branca isolada de ratos foi submetida a 60 minutos de anóxia ou à compressão durante 15 segundos (LI et al., 1999b). Tanto antagonistas seletivos de receptores do tipo AMPA/cainato, como a inibição to transporte de glutamato dependente de Na+, protegeram a SB medular dos mecanismos lesivos induzidos por anóxia e trauma. Estudos posteriores pelo mesmo grupo (LI;STYS, 2001) demonstraram que a liberação endógena de glutamato pode ocorrer pela reversão dos gradientes de Na+ e K++, através do axolema. De acordo com estes autores, a inibição da ATPase de Na+ e K++ e despolarização induzem liberação de glutamato, através da reversão da atividade dos transportadores de glutamato dependente de Na+. O glutamato liberado de fontes intracelulares agiria em receptores do tipo AMPA/cainato induzindo lesão excitotóxica, principalmente em oligodendrócitos e mielina. Nestes estudos, a principal fonte de glutatamo foi o cilindro axonal. Outros estudos sugerem que a injeção do bloqueador de canal de Na+ -TTX- diminui significativamente a lesão axonal, após contusão da ME, mostrando que ativação de canal de Na+ pode ser um importante evento subjacente aos mecanismos de lesão da SB após contusão da ME. No presente modelo in vivo, é possível que mecanismos similares possam ocorrer. Nos tempos de sobrevida mais tardios, encontramos maior índice de lesão axonal, tanto na substância branca como na substância cinzenta. Apesar de sua imensa importância fisiológica para a homeostase tecidual, 101 em condições patológicas incluindo isquemia, trauma e doenças neurodegenerativas, a ativação de macrófagos/microglia parece estar envolvida no aumento da área de lesão. Entre os diversos mecanismos em potencial, macrófagos/microglia ativados poderiam exacerbar o processo lesivo através da liberação de fatores tóxicos incluindo NO, enzimas proteolíticas, metabólitos do ácido araquidônico, TNF- e IL-1 (NATHAN, 1987; NATHAN, 1992; BANATI et al., 1993; MINGHETTI;LEVI, 1998). Durante isquemia cerebral, células da microglia liberam NO e IL-1, os quais podem contribuir para o fenômeno de degeneração neuronal secundária (GEHRMANN et al., 1995; STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998; LOVE, 1999). Achados similares foram relatados após lesão cerebral isquêmica (GEHRMANN et al., 1995; STOLL;JANDER;SCHROETER, 1998; LOVE, 1999; STOLL;JANDER, 1999). Recentemente, Hermann et al., (2001) sugeriram que o FNT- pode potenciar os efeitos da excitotoxicidade mediada por receptors AMPA durante lesão da ME em ratos. De acordo com esta hipótese, FNT- poderia agir em receptores AMPA, presentes na membrana de células microgliais induzindo-as a liberarem mais glutamato e FNT- , portanto exacerbando o processo lesivo. Outros estudos sugerem que células da microglia e/ou astrócitos podem liberar glutamato ou ácido quinolínico em condições patológicas (PIANI et al., 1992; BARGER;HARMON, 1997; HERMANN et al., 2001). É possível que através de um dos mecanismos descritos, ou mesmo através da associação destes, a ativação de macrófagos/microglia pode contribuir para a exacerbação da lesão na substância branca no presente estudo. 102 6.5 ALTERAÇÃO DIFERENCIAL NA BAINHA DE MIELINA NOS MODELOS EXCITOTÓXICO E ISQUÊMICO No presente estudo, encontramos perda da reatividade para proteína básica de mielina a partir de 24h, após a injeção de ET-1 no subnúcleo caudal, do sistema trigeminal e 7 dias após a injeção de NMDA na mesma região. Nos animais injetados com ET-1, a substância branca apresentou microcistos no tempo de sobrevida de 7 dias. Outros estudos relataram achados similares em outras regiões do SNC, tanto no modelo de lesão excitotóxica por injeção de NMDA (GOMES-LEAL, 2002a), como no modelo de isquemia focal por injeção de ET-1 (HUGHES et al., 2003). Gomes-Leal, (2002) relatou diminuição da reatividade para a proteína básica de mielina 3 dias após a lesão excitotóxica. Esta alteração na bainha de mielina foi confirmada por microscopia eletrônica (GOMES-LEAL, 2002a, 2005a) e foi concomitante com a formação de microcistos na substância branca. Hughes et al., (2003) relataram perda da reatividade para proteína básica de mielina, 24h após injeção de ET-1 na substância branca do córtex motor de ratos adultos. No modelo de desmielinização induzida por cuprizona (LUDWIN, 1978), a desmielinização ocorre como um evento secundário às alterações patológicas primárias em oligodendrócitos. Nestas circunstâncias, alterações osmóticas em oligodendrócitos poderiam induzir a formação de vacúolos intramielínicos apresentando periodicidade espacial. No entanto, em condições patológicas, tais 103 como a EEA e toxicidade induzida pelo hexaclorofenol, a formação de microcistos parece ser o evento patológico primário (WINCHELL;STERNBERGER;WEBSTER, 1982). Na presente investigação, as alterações precoces na bainha de mielina podem estar relacionadas à resposta inflamatória, pois grande número de macrófagos/microglia foi encontrado na substância branca, a partir deste tempo de sobrevida. Em outras condições patológicas, como a esclerose múltipla, ou no seu modelo experimental, a encefalomielite alérgica experimental, a perda da mielina é sabidamente devida às ações deletérias de células inflamatórias como macrófagos (FERGUSON et al., 1997; TRAPP et al., 1998; TRAPP et al., 1999; TRAPP;RANSOHOFF;RUDICK, 1999). Este fenômeno patológico pode ser mediado por citocinas e proteases liberadas por macrófagos (HENDRIKS et al., 2005). Formação de microcistos na substância branca do trato trigeminotalâmico foi observada 7 dias após a injeção de endotelina-1, no subnúcleo caudal. Este fenômeno foi relatado em outros modelos de isquemia (KANELLOPOULOS et al., 2000) e lesão por impacto da ME (LI et al., 1995). Li et al., (1995) relataram intensa formação de microcistos nos tratos longitudinais da substância branca da medula espinhal de ratos, após lesão por impacto severa. Após lesão excitotóxica por injeção de NMDA na medula espinhal de ratos, Gomes-Leal et al., (2004,2005) relataram formação de microcistos entre 3 e 7 dias após injeção de NMDA, no corno ventral da medula espinhal de ratos adultos. Os mecanismos responsáveis pela formação de microcistos não são totalmente estabelecidos, mas podem estar relacionados à tumefação de axônios 104 e/ou ramificações astrocitárias, bem como formação de espaços entre a bainha de mielina e o axolema (PANTONI;GARCIA;GUTIERREZ, 1996; YAM et al., 1998). A formação de microcistos pode estar relacionada ao fenômeno de desmielinização. Todas as doenças desmielinizantes apresentam duas caracerísticas patológicas principais: perda e/ou vacuolização (microcistos) da bainha de mielina (LUDWIN, 1987). A formação de microcistos pode ser uma consequência direta de lesão à bainha de mielina, ou aparecer como um evento secundário à lesão de oligodendrócitos, ou mesmo ocorrer devido a ambos os fatores, em condições patológicas que incluem doenças imunes, tóxicas e desmielinização viral (LUDWIN, 1987). Nestas condições patológicas, geralmente a formação de microcistos representa a separação da mielina do axolema, gerando acumúlo de fluído entre a mielina e o cilindro axonal, com periodicidade espacial no tecido edemaciado. É possível que mecanismos semelhantes sejam os responsáveis pela formação de microcistos, na substância branca dos animais submetidos à lesão isquêmica. Resultados semelhantes foram obtidos com o modelo de intoxicação pelo hexaclorofenol (ANDREAS, 1993; HANTZSCHEL;ANDREAS, 1998; , 2000). Durante a excitotoxicidade induzida pelo hexaclorofenol edema e vacuolização da substância branca cerebral são achados comuns, o que é concomitante com o edema de oligodendrócitos (ANDREAS, 1993; HANTZSCHEL;ANDREAS, 1998, 2000). Nestas circunstâncias, mecanismos excitotóxicos mediados por receptores do tipo não-NMDA parecem estar envolvidos, à medida que o uso de antagonistas para estes receptores induzem neuroproteção investigação, não (HANTZSCHEL;ANDREAS, investigamos o 2000). comprometimento Na presente patológico de 105 oligodendrócitos, o que deve ser implementado em estudos futuros. No presente estudo, claramente a formação de microcistos ocorreu posteriormente à desmielinização, o que sugere que o comprometimento da bainha de mielina e/ou oligodendrócitos é um evento crucial para esta condição patológica. 6.6 PICNOSE NA SUBSTÂNCIA BRANCA APÓS LESÃO ISQUÊMICA Sete dias após a injeção de ET-1 no núcleo espinhal do sistema trigeminal, um grande número de células picnóticas foi observado na substância branca. Outros estudos relataram a presença de picnose, na substância branca após lesão aguda da medula espinhal (GOMES-LEAL, 2004). Gomes-Leal et al., (2004) relataram grande quantidade de células picnóticas em todos os tratos de substância da medula espinhal, principalmente nos tempos de sobrevida mais tardios após a injeção de NMDA no corno ventral da medula espinhal de ratos. Estes autores correlacionaram os perfis picnóticos com a degeneração tardia de oligodendrócitos, como sugerido por outros autores (SHUMAN;BRESNAHAN;BEATTIE, 1997; LI et al., 1999a; CASHA;YU;FEHLINGS, 2001; TAKAGI et al., 2003). Na presente investigação, os perfis picnóticos encontrados na substância branca do sistema trigeminal podem ser oligodendrócitos apoptóticos, mas estudos com dupla marcação utilizando técnicas específicas para a marcação de apoptose e oligodendrócitos devem ser utilizados para a averiguação desta hipótese. 106 7 CONCLUSÃO Na presente dissertação, investigamos os padrões inflamatórios de lesão axonal e da bainha de mielina, após lesão excitotóxica e isquêmica no núcleo espinhal do sistema trigeminal. A análise comparativa dos padrões histopatológicos demomonstraram padrões lesivos diferenciais, com resposta inflamatória mais intensa caracterizada por recrutamento de macrófagos, mas não de neutrófilos no modelo de lesão isquêmica e resposta inflamatória discreta caracterizada por recrutamento escasso dos dois tipos de leucócitos. O modelo isquêmico induziu mais lesão axonal, sugerindo que a substância branca é mais vulnerável ao modelo isquêmico, do que ao modelo excitotóxico. Alterações na bainha de mielina ocorreram mais precocemente, na substância branca dos animais submetidos à isquemia, do que nos submetidos à excitotoxicidade induzida pela injeção de NMDA. Futuros estudos, utilizando marcadores de oligodendrócitos, microglia, de células apoptóticas e técnicas de microscopia eletrônica devem contribuir para a elucidação das diferenças observadas nos dois modelos experimentais. 107 8 REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS Abbas AK, Janeway CA, Jr. Immunology: improving on nature in the twenty-first century. Cell 2000; 100(1):129-38. Agnati LF, et al. A new model of focal brain ischemia based on the intracerebral injection of endothelin-1. Ital J Neurol Sci 1991; 12(3 Suppl 11):49-53. Agrawal SK, Fehlings MG. Mechanisms of secondary injury to spinal cord axons in vitro: role of Na+, Na(+)-K(+)-ATPase, the Na(+)-H+ exchanger, and the Na(+)Ca2+ exchanger. J Neurosci 1996; 16(2):545-52. Agrawal SK, Fehlings MG. Role of NMDA and non-NMDA ionotropic glutamate receptors in traumatic spinal cord axonal injury. J Neurosci 1997; 17(3):1055-63. Agrawal SK, Nashmi R, Fehlings MG. 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A temperatura foi mantida constante neste período. Após este período, permitiu-se que as seções resfriassem por 25 minutos, tempo após o qual as secções foram submetidas ao protocolo normal para imunocitoquímica. Imunocitoquímica a. secções de 20 m já montadas em lâminas foram retiradas do freezer e deixadas na estufa por 30 minutos e em seguidas submetidas ao pré tratamento com tamão borato. b. peróxido de hidrogênio a 1% (100ml de H O /250ml de metanol) - 20 minutos 2 2 c. lavagem em tampão fosfato salino (TFS)/Tween - 3 vezes de 3 minutos d. Bloqueio em soro normal do animal que produziu o anticorpo secundário por 30 minutos. No caso dos anticorpos ED1, APP, e MBP o soro normal de cavalo a 10% foi utilizado. No caso dos anticorpos anti MBS-1 o soro nomal de cabra a 10% foi utilizado . e. Após o bloqueio em soro normal, sem retirá-lo das secões incubou-se as mesmas no anticorpo primário, diluído em TFS por 1.5 a 2h (cerca de 50 l de solução por secção) . 131 f. Lavagem TFS/Tween 3 vezes durante 3 minutos g. Anticorpo secundário por uma hora com as seguintes diluições: para os anticorpos ED1, APP, MBP utilizou-se o anticorpo secundário biotinilado anticavalo feito em camundongo (1:100, Vector). Para os anticorpos anti MBS-1 utilizou-se o anticorpo secundário biotinilado feito em cabra anti coelho. h. Lavagem TFS/Tween 3 vezes durante 3 minutos i. Incubação no complexo avidina-biotina-peroxidase (Kit ABC, vector) por 45 minutos (uma gota da solução A + uma gota da solução B/5ml de TFS (peletes, Sigma Aldrich) j. Lavagem TFS Tween 3 vezes durante 3 minutos k. Reação em diamino benzidina (DAB ) para revelação da peroxidase do antígeno. Aliquotas de DAB foram descongeladas e diluídas em 250 ml de tampão fosfato 0.1M em uma cubeta. Antes do início da reação, acrescentouse à solução de DAB 100 l de H O 2 2 . As secções montadas em lâminas dispostas em uma cesta histológica foram imersas na solução de DAB/H O e 2 2 monitoradas com auxílio de um microscópio até que o padrão da reação fosse satisfatório. Em seguida, as secções foram lavadas em tampão fosfato 0.1M por cerca de 2 vezes durante 3 minutos, contracoradas com Hematoxilina e, desidratadas e cobertas com lamînula em DPX. This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.