Quantificação da Expressão dos Genes FAS - PPGBAIP

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS GENES FAS, FASL, FOXP3, IL-10, NGF E
P75NTR EM CÉLULAS HEPÁTICAS DE PACIENTES COM INFECÇÃO CRÔNICA
PELOS VÍRUS DAS HEPATITES B E C
EDNELZA DA SILVA GRAÇA AMORAS
Belém-Pará
2014
Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau
de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Belém-Pará
2014
Tese apresentadA ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal do Pará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador:
Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA.
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz
Instituto Evandro Chagas, IEC
Prof. Dr. Juarez Antonio Simões Quaresma
Núcleo de Medicina Tropical, UFPA.
Profa. Dra. Simone Regina da Silva Conde
Instituto de Ciências da Saude, UFPA.
Profa. Dra. Rosimar Neris Martins Feitosa
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA.
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA (Suplente)
Belém – Pará
2014
Aos meus amores Paulo,
Amanda, Luciana, Aline e Fredinho,
fontes de energia e amor
na minha vida.
“ Com o coração se pede.
Com o coração se procura.
Com o coração se bate
e é com o coração que a porta se abre.”
Santo Agostinho
AGRADECIMENTOS
Agradecer às inúmeras pessoas que contribuíram para a finalização desta tese parece,
a princípio, ser muito difícil. Talvez por medo de que alguma contribuição possa ser
esquecida, pois todas foram igualmente importantes para mim. Muitas vezes as contribuições
são indiretas, como consequências casuais da convivência entre as pessoas e somente quando
chegamos aqui é que podemos ter essa percepção.
Agradeço em primeiro lugar ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário
Vallinoto, por confiar e permitir com que meu sonho de pós-graduação se realizasse,
novamente sob a orientação zelosa e impecável de um grande mestre e um excelente amigo.
Especialmente, agradeço à Dra. Simone Conde pela sua amizade, competência e
disponibilidade, que muito contribuiu em todas as etapas desse estudo tanto no ambulatório de
hepatologia do Hospital da Fundação Santa Casa de Misericordia como no Hospital
Universitario João de Barros Barreto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia dos Agentes Infecciosos e Parasitários.
Ao profº Dr. Ricardo Ishak e a todos os integrantes do Laboratório de Virologia,
especialmente à profª Rosimar Feitosa, Renata Hermes, Alice Queiroz, Bárbara Santana, Nubia
Carolina e Mike Santos, pelo companheirismo ao longo desse estudo.
À queridíssima Samara Gomes, pessoa iluminada que tive o prazer de conhecer no
LABVIR, e que teve participação imperativa na execução desse estudo, desde a fase de
validação até à conclusão.
Ao grande amigo Felipe Freitas, sempre generoso e participativo, que muito me
auxiliou na condução deste estudo, principalmente nos momentos iniciais onde o novo sempre
parece assustador.
Agradeço as técnicas de enfermagem Das Dores e Raimunda, do setor de biopsia
hepática do Hospital da Fundação Santa Casa de Misericordia, pela atenção e ajuda durante
toda a fase de coleta de biópsias hepáticas.
Quero agradecer a Deus pela capacidade de superação alcançada em vários
momentos e a minha família pelo amor e incentivo, principalmente ao meu marido Paulo,
sempre tão companheiro, entendendo minhas ausências e torcendo para que tudo desse certo.
Finalmente, agradeço a todos os pacientes do ambulatório de hepatologia do Hospital
da Fundação Santa Casa de Misericordia e do Hospital Universitario João de Barros Barreto
que, com muita generosidade, aceitaram participar deste estudo, me permitindo acompanhálos em um momento tão intimo e difícil de suas vidas.
Muito Obrigada!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
11
RESUMO
13
ABSTRACT
14
1
INTRODUÇÃO .................................................................................................
15
1.1
O VÍRUS DA HEPATITE ................................................................................... 19
1.1.1
Estrutura e genoma do VHB ............................................................................
19
1.1.3
Replicação viral e variabilidade genética do VHB .........................................
21
1.2
O VÍRUS DA HEPATITE C ...............................................................................
23
1.2.1
Estrutura e organização genômica do VHC ....................................................
24
1.2.2
Replicação viral e variabilidade genética do VHC .........................................
25
1.3
EPIDEMIOLOGIA DO VHB E DO VCH ..........................................................
27
1.4
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS HEPATITES VIRAIS B e C .........
30
1.4.1
Diagnóstico da Hepatite B .................................................................................
30
1.4.2
Diagnóstico da Hepatite C ................................................................................. 32
1.4.3
Biópsia hepática .................................................................................................
33
1.4.4
Exames complementares ...................................................................................
34
1.5
IMUNOLOGIA ...................................................................................................
34
1.6
APOPTOSE .........................................................................................................
36
1.6.1
Apoptose e fibrose hepática ............................................................................... 38
1.6.2
O receptor apoptótico Fas (CD95) e o ligante FasL (CD178) ........................
40
1.7
CÉLULAS T REGULADORAS FoxP3+ ............................................................
41
1.7.1
Células T reguladoras nas hepatites virais ......................................................
44
1.8
INTERLEUCINA 10 .........................................................................................
45
1.9
O FATOR DE CRESCIMENTO DO NERVO (NGF) E O RECEPTOR
p75NTR (NGFR) ....................................................................................................
47
OBJETIVOS ........................................................................................................
51
1.10.1 Objetivo Geral ....................................................................................................
51
1.10.2 Objetivos Específicos .........................................................................................
51
2
MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................................
52
2.1.1
População do estudo ..........................................................................................
52
2.1.2
Critério de inclusão e exclusão .......................................................................... 52
2.2
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ........................................................................
52
2.2.1
Exames hematológicos, bioquímicos e sorológicos .........................................
52
2.2.2
Procedimentos histopatológicos ........................................................................
53
2.3
MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR .....................................................
53
2.3.1
Extração de RNA ...............................................................................................
53
2.3.2
Eletroforese ......................................................................................................... 54
2.3.2
Trancrição reversa (cDNA) ..............................................................................
55
2.3.3
Quantificação dos RNAm por PCR em Tempo Real .....................................
55
2.4
PROCEDIMENTOS ESTATÍSTICOS ...............................................................
57
2.5
PROCEDIMENTOS ÉTICOS ............................................................................
57
3
RESULTADOS ..................................................................................................
58
3.1
QUANTIFICAÇÃO DO RNAm DO RECEPTOR FAS E DO LIGANTE
FAS-L ..................................................................................................................
62
1.10
3.2
QUANTIFICAÇÃO DO RNAm DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO FOXP3 .... 67
3.3
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DO RNAm DA IL-10 .................................... 69
3.4
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE RNAm DA NEUROTROFINA NGF E
SEU RECEPTOR P75NTR. ................................................................................... 71
3.5
ASSOCIAÇÃO DAS EXPRESSÕES GÊNICAS COM OS NÍVEIS
PLASMÁTICOS DAS ENZIMAS ALT, AST, GGT E AFP .............................. 75
4
DISCUSSÃO ....................................................................................................... 77
4.1
EXPRESSÃO DO RNAm DE FAS E DO LIGANTE FAS-L .............................
4.2
EXPRESSÃO DO RNAm DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO FOXP3 .............. 82
4.3
EXPRESSÃO DO RNAm DA IL-10 ................................................................... 87
4.4
EXPRESSÃO DO RNAm DO NGF E DO RECEPTOR p75 .............................
91
5
CONCLUSÃO ....................................................................................................
95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................
97
APÊNDICE ......................................................................................................................
121
80
ANEXOS ........................................................................................................................... 123
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1: História natural da doença hepática crônica ..................................... 15
Figura 2: Representação esquemática da partícula e do genoma do VHB .....
20
Figura 3: Ciclo de replicação do VHB .............................................................. 22
Figura 4: Representação esquemática da partícula e do genoma do VHC ...... 24
Figura 5 - Esquemática do ciclo replicativo do VHC....................................... 26
Figura 6: Áreas de prevalência HBsAg no mundo, por país. ............................ 28
Figura 7: Áreas de prevalência do vírus da hepatite C no mundo..................... 29
Figura 8: Curvas sorológicas na infecção aguda pelo VHB......................
31
Figura 9: Curvas sorológicas na infecção crônica pelo VHB....................
32
Figura 10: Gráfico da evolução da hepatite C .................................................. 33
Figura 11: Representação esquemática das vias de apoptose ........................... 38
Figura 12: Mecanismos celulares de lesão hepática e de fibrose ...................... 39
Figura 13: Origem e função das células T reguladoras ..................................... 42
Figura 14: Mecanismos de tolerância das células T no fígado ........................ 47
Figura 15: Vias de sinalizações ativadas pelo NGF ......................................... 49
Figura 16 - Separação eletroforética mostrando as bandas 28S, 18S e 5S do
RNA, indicando integridade das amostras ........................................................ 57
Figura 17 – Exemplo das curvas de padronização das reações de qPCR ......... 57
Figura 18 – Média dos níveis plasmáticos de ALT, AST e GGT em
pacientes: sem alteração histológica no fígado, com fibrose sem cirrose e
com cirrose e de acordo com a atividade inflamatória no tecido hepático de
todos os portadores de hepatites crônica viral e não viral................................ 61
Figura 19 - Quantificação do RNAm do receptor Fas e do ligante Fas-L (B)
entre os grupos com VHB, VHC, HNV e o grupo controle. ............................ 62
Figura 20- Quantificação do RNAm do receptor Fas e do ligante Fas-L
entre o grupo CT e entre os pacientes sem alterações histológicas, com
fibrose sem cirrose e com cirrose hepática. Niveis do receptor Fas e do
ligante Fas-L entre os individuos com fibrose sem cirrose e com cirrose
hepática de causa viral e não viral .................................................................... 63
Figura 21 - Correlação dos níveis de RNAm do receptor Fas e do ligante
Fas-L nos grupos de pacientes com VHB, VHC e HNV ................................
64
Figura 22 - Quantificação do RNAm do receptor Fas e do ligante FAS-L de
acordo com o grau de fibrose e atividade inflamatória no conjunto das
65
doenças hepáticas crônicas estudadas..........................................................
Figura 23 - Correlação dos níveis de RNAm do receptor Fas e do ligante
Fas-L com as concentrações plasmáticas de ALT e AST no conjunto das
doenças hepáticas crônicas estudadas ............................................................... 66
Figura 24- Quantificação do RNAm do fator de transcrição Foxp3 no tecido
hepático dos grupos com VHB, VHC, HNV e do grupo controle e nos grupos
com fibrose sem cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral ....... 67
Figura 25 - Quantificação do RNAm do fator de transcrição Foxp3 no tecido
hepático de acordo com os graus de fibrose e com os níveis de atividade
inflamatória no conjunto das doenças hepáticas crônicas estudadas .............. 68
Figura 26 – Correlação dos níveis de RNAm do fator de transcrição Foxp3
com o RNAm do receptor FAS e o ligante FAS-L no conjunto das doenças
69
hepáticas crônicas estudadas ......................................................................
Figura 27 - Quantificação do RNAm da IL-10 no tecido hepático dos grupos
com VHB, VHC, HNV e do grupo controle e nos grupos com fibrose sem
cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral ................................. 70
Figura 28 – Quantificação do RNAm da IL-10 no tecido hepático de acordo
com os graus de fibrose e com os níveis de atividade inflamatória no conjunto
71
das doenças hepáticas crônicas estudadas. ....................................................
Figura 29 - Quantificação do RNAm do NGF e seu receptor p75ntr no tecido
hepático dos grupos com VHB, VHC, HNV e do grupo controle e nos grupos
com fibrose sem cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral........ 72
Figura 30 - Quantificação do RNAm do NGF e seu receptor p75NTR de
acordo com o grau de fibrose e atividade inflamatória no tecido hepático de
indivíduos com hepatites crônicas virais e não virais........................................ 73
Figura 31 - Correlação dos níveis do RNAm do NGF e p75ntr nos grupos
com fibrose leve e moderada e fibrose acentuada e cirrose................................ 74
RESUMO
As hepatites virais são consideradas a maior pandemia mundial da atualidade e os
Vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC) são responsáveis pela grande maioria das formas de
doenças hepáticas crônicas no mundo, porém, independentemente da causa inicial, a lesão
hepática continuada causa dano inflamatório, deposição de matriz, morte das células do
parênquima e angiogênese, levando à fibrose progressiva.
O presente estudo avaliou a
expressão do RNAm dos genes FAS, FAS-L, FOXP3, IL-10, NGF e P75NTR em espécimes de
biópsia hepática obtidas de pacientes portadores do VHB (n=6), do VHC (n=28), de hepatites
não viral (HNV) (n=9) e de fígado com histologia normal (n=8) como controles (CT), visando
relacionar os seus possíveis papéis na patogênese dessas doenças hepáticas bem como no
estadiamento da fibrose segundo a classificação de METAVIR. A quantificação relativa dos
genes alvos foram realizados utilizando o método CT comparativo (ΔΔCT) através da técnica
de qPCR. A expressão do RNAm de FAS e FAS-L foi menor no grupo CT frente ao pacientes
e, entre esses, o grupo VHC mostrou as maiores expressões. Houve um aumento progressivo
da expressão do RNAm de FAS e FAS-L com a inflamação e progressão da doença, seguido
por declínio em cirrose, e uma associação com o aumento da ALT e AST. A expressão do
RNAm do FOXP3 foi maior no fígado de pacientes frente ao grupo CT, e os grupos com
VHC e HNV tiveram maiores expressões do que o VHB. A expressão do FOXP3 aumentou
em associação à intensidade da inflamação e da fibrose hepática e, ainda, com expressão do
RNAm de FAS e FAS-L em todos os pacientes. A expressão do RNAm da IL-10 foi maior no
grupo CT em relação aos pacientes, enquanto que o grupo com HNV mostrou menor
expressão dessa citocina frente aos grupos com infecção viral. A maior expressão da IL-10
esteve naqueles pacientes sem fibrose e sem inflamação hepática, com associação negativa
com a evolução da doença até cirrose. A maior expressão do RNAm do p75NTR esteve em
cirrose, enquanto que o NGF foi mais expresso nos pacientes com fibrose sem cirrose. O
RNAm do NGF foi mais expresso no escore F1 de fibrose e a expressão do receptor p75NTR
teve crescimento proporcional com a evolução da fibrose. A expressão do RNAm de p75NTR e
NGF mostrou correlação positiva com fibrose leve e moderada, mas não com fibrose
acentuada e cirrose. Esses resultados sugerem que o curso da doença hepática crônica pode
ser modulado por componentes virais e regulado pelos genes estudados diminuindo ou
inibindo a regeneração e proliferação dos hepatócitos nas fases finais da doença.
ABSTRACT
Viral hepatitis is considered the world's largest current pandemic Virus of hepatitis
B (HBV) and C (HCV) are responsible for most forms of chronic liver disease worldwide, so
are significant public health problem, however, regardless of the initial cause, the continued
liver damage cause inflammatory damage, matrix deposition, death of parenchymal cells and
angiogenesis, leading to progressive fibrosis. This study evaluated the relative expression of
the mRNA of genes FAS, FAS-L, FOXP3, IL-10, NGF and p75NTR in different histological
stages of liver disease, according to the METAVIR classification in liver biopsy specimens
obtained from patients HBV (n = 6), HCV (n = 28) of not viral hepatitis (NVH) (n = 9) and
histologically normal liver as controls (CT) (n = 8), to relate their possible roles in the
pathogenesis of these diseases and in liver fibrosis stage according to the classification
METAVIR. The relative quantification of the target genes were performed using the
comparative CT method (ΔΔCT) by qPCR techniques. The expression of FAS and FAS-L
mRNA was lower in the CT group against patients, and among these, the HCV group showed
the greatest expressions. There was a progressive increase in the expression of FAS and FASL mRNA with inflammation and disease progression, followed by decline in cirrhosis and an
association with increased ALT and AST. Expression of FOXP3 mRNA was higher in the
liver of patients against CT group, and groups with HCV and NVH had higher expression
than HBV. The increased expression of FOXP3 mRNA in association with the intensity of
inflammation, hepatic fibrosis and expression of FAS and FAS-L mRNA, both of viral and
non-viral causes. The expression of IL-10 mRNA was higher in the CT group compared to
patients, whereas NVH group showed lower expression of this cytokine compared to the
groups with viral hepatitis. The increased expression of IL-10 mRNA was in those patients
without fibrosis and liver without inflammation. Among patients with established liver
fibrosis score F1 had more expression with a negative association with disease progression to
cirrhosis. The highest expression of p75NTR mRNA been cirrhosis, whereas NGF was more
expressed in patients with fibrosis without cirrhosis. NGF mRNA was more expressed in the
F1 score of fibrosis and the expression of p75NTR mRNA receptor was proportional growth
with the development of fibrosis. The expression of p75NTR and NGF mRNA was correlated
with mild and moderate fibrosis but not with severe fibrosis and cirrhosis. These results
suggest that the course of chronic liver disease may be modulated by viral components and
studied gene regulated by decreasing or inhibiting the regeneration and proliferation of
hepatocytes in the late stages of the disease.
15
1 INTRODUÇÃO
Independente da causa inicial, a lesão hepática continuada causa dano inflamatório,
deposição de matriz, morte das células do parênquima e angiogênese, levando à fibrose
progressiva. A matriz de cicatrização, tipicamente, se acumula muito lentamente (a media de
tempo para cirrose na hepatite C crônica é de 30 anos), mas uma vez que a cirrose é
estabelecida o potencial para reverter esse processo é diminuído e se desenvolvem
complicações (Pellicoro et al., 2014). Polimorfismos genéticos, marcas epigenéticas e
cofatores como obesidade e álcool, podem modular o risco de progressão da fibrose. Porém,
se a causa da fibrose for eliminada, a resolução da fibrose hepática precoce pode ocorrer, isto
é, a completa reversão para a arquitetura hepática normal (Pellicoro et al., 2014). Na cirrose,
embora a resolução não seja possível, a regressão, ou seja, a melhoria, mas não reversão, da
fibrose melhora os resultados clínicos. Atualmente, o transplante de fígado é o único
tratamento disponível para a insuficiência hepática ou para alguns casos de câncer primário de
fígado (Figura 1) (Pellicoro et al., 2014).
Figura 1: História natural da doença hepática crônica (Fonte: Nature Reviews Immunology,
2014).
16
As hepatites virais são consideradas a maior pandemia mundial da atualidade e os
vírus das hepatites B (VHB) e C (VHC) são responsáveis pela grande maioria das formas de
doenças hepáticas crônicas no mundo, por isso constituem relevante problema de saúde
pública (Guirao et al., 2006; CDC, 2013). Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS)
estimam que exista cerca de 170 milhões de pessoas, 3% da população mundial, portadoras de
infecção crônica pelo vírus da hepatite C, com diferentes padrões de distribuição relacionados
à região geográfica, enquanto que, aproximadamente, 7% da população do mundo, ou seja,
450 milhões de pessoas estão cronicamente infectados com o vírus da hepatite B (Guirao et
al., 2006; WHO, 2013; Alter, 2007).
A hepatite B se desenvolve quando o hospedeiro monta uma reação imunológica
contra o VHB, nos hepatócitos infectados, sendo necessário algum grau de replicação do
VHB para esse evento. Os indivíduos com forte e ampla resposta imune desenvolvem uma
hepatite aguda auto-limitada (Ganem & Prince, 2004). Por outro lado, aqueles que não
tiverem uma resposta imune vigorosa, não conseguem eliminar o vírus, desenvolvem infecção
persistente e se tornarão portadores crônicos. A maioria dos portadores crônicos do VHB são
capazes de controlar a replicação do vírus e diminuir a carga de VHB-DNA a níveis baixos,
que não são suficientes para induzir uma reação imune do hospedeiro contra os hepatócitos
infectados, esses caracterizam os portadores chamados inativos do VHB com baixa carga de
VHB-DNA no soro e sem sinais de danos hepáticos. Os demais portadores crônicos
desenvolvem uma resposta imune parcial, que é incapaz de eliminar o vírus, mas apenas
sustenta a sua depuração parcial, e a infecção permanece ativa, com continuidade da atividade
inflamatória, essa fase denominados imunoclearence. Outro perfil é a hepatite B oculta, que é
caracterizada em indivíduos com persistência de VHB-DNA no tecido hepático e HbsAg
(antigeno de superficie do VHB) negativo no soro (Brasil, 2011) . Esta variante da infecção
pelo VHB pode estar presente não só em indivíduos com anticorpos anti-HBs e/ou anti-HBc
(proteína do core do VHB) circulantes, mas também em indivíduos negativos para todos os
marcadores do VHB e está relacionada à persistência nos núcleos dos hepatócitos do cccDNA
VHB (covalently closed circula DNA). Um estado de imunossupressão pode reativar o VHB
oculto com o desenvolvimento de uma hepatite B aguda (Raimondo et al. 2005).
O VHB é transmitido pelas vias parenteral e percutânea, assim como por exposições
de mucosa a sangue contaminado, por contato sexual ou por exposição perinatal (Alter et al.,
1977). Nas áreas de alta incidência de infecção pelo VHB, a disseminação ocorre,
principalmente, na infância, ao nascimento ou nos primeiros anos de vida, por transmissão
horizontal entre familiares (Margolis et al., 1991). Em áreas de baixa prevalência, a infecção
17
ocorre, principalmente, em indivíduos adultos, sendo a via de transmissão dependente de
padrões ambientais e comportamentais (Beltrami et al., 2000).
Uma das principais características do VHC, que o diferencia dos demais vírus
hepatotrópicos, se deve ao fato desse vírus causar lesão hepática progressiva, insidiosa e
silenciosa na maioria das pessoas infectadas, conferindo marcante tendência à cronificação da
doença hepática (Seef, 2002). Estima-se que 54 a 86% dos indivíduos infectados evoluem
para a forma crônica, predispondo a complicações em 20% dos casos, como a cirrose
hepática, a falência hepática e o hepatocarcinoma (Seef, 2002). Anualmente, ocorrem cerca de
500.000 novos casos de hepatocarcinoma, sendo o VHC responsável por 24% destes e a
insuficiência hepática, causada pelo vírus da hepatite C, apresenta-se como a principal
indicação de transplante de fígado (Shaw-Stiffel, 2004).
A grande maioria dos estudos tem demonstrado que as características do hospedeiro
são os principais determinantes da história natural da infecção crônica pelo VHC. Deste
modo, a idade à época da infecção, o gênero, a ingestão abusiva de etanol, a co-infecção com
HIV e a infecção dupla VHB-VHC foram identificados como fatores fortemente associados a
uma rápida taxa de progressão da fibrose hepática na hepatite C. Estudos sugerem que
cofatores como obesidade, esteatose hepática e diabetes mellitus exerçam, também, efeito
deletério na evolução dos portadores de VHC (Marcellin, et al., 2002; Poynard et al, 2003).
A transmissão do VHC ocorre, principalmente, por via parenteral, como dentre os
usuários de drogas injetáveis e os transfundidos até 1990, quando foi possível realizar triagem
sorológica nos bancos de sangue. Em um percentual significativo de casos, não é possível
identificar a via de infecção, mas a transmissão sexual é menos frequente (Guirao, 2006). A
transmissão vertical é rara, quando comparada à de hepatite B, mas gestantes com carga
elevada do VHC ou coinfectadas pelo HIV apresentam maior risco de transmissão da infecção
para os recém-nascidos (Guirao, 2006).
Um mecanismo pelo qual as células hepáticas infectadas podem limitar a
propagação viral inicial é a indução de apoptose ou morte celular programada (Guidotti &
Chisari, 2006). Na verdade, a morte celular por apoptose com infecção viral pode ser induzida
pela resposta imune do hospedeiro, a partir da função de células T citotóxicas e células NK,
ou por proteínas virais. Por si, o processo de apoptose tem sido considerado uma via freqüente
de interrupção da replicação viral e de eliminação das células infectadas (Lau et al., 1993).
Porém, muitos genomas virais codificam proteínas que reprimem o processo de apoptose, a
fim de escapar do ataque imunológico do hospedeiro, dessa forma estes vírus são capazes de
18
persistir no organismo, por anos, contribuindo para o aparecimento de hepatite crônica
(Guicciardi & Gores, 2005).
A lesão hepática desencadeada pelo VHB e pelo VHC é mediada, principalmente,
pela resposta imune do hospedeiro às proteínas virais expressas nos hepatócitos infectados e,
em menor grau, por efeitos citopático direto do vírus (Guicciardi & Gores, 2005). Portanto, as
interações vírus-hospedeiro, ou seja, resposta imune do hospedeiro contra várias proteínas
virais determinam a persistência viral, o grau de infecção dos hepatócitos, a gravidade da
inflamação do fígado e, possivelmente, a hepatocarcinogênese viral (Muratori et al., 2001;
Toubi et al., 2001).
Dentre as doenças do fígado de causas não virais, a doença hepática gordurosa não
alcoólica (DGHNA) mostra uma ligação estreita com a resistência à insulina e inflamação,
onde a depleção de células de Kupffer impede o desenvolvimento de esteatose e resistência à
insulina induzida por dieta, porém, certas citocinas exacerbam a esteatose não alcoólicas e a
resistência à insulina, tais como o Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e a Interleucina 6
(IL-6), ao passo que outras são protetoras, tais como a Interleucina 10 (IL-10) e a
adiponectina (Syn et al., 2010).
A infiltração de neutrófilos mediada por citocinas derivadas de células Kupffer é
uma proeminente característica da hepatite alcoólica, enquanto que o etanol inibe a função das
células natural killer (NK) e acelera a progressão da hepatite viral coexistente (Parola et
al.,2001).
Na hepatite autoimune, a predisposição genética, o mimetismo molecular e imunodeficiente, particularmente envolvendo células T reguladoras, contribuem para a iniciação e a
perpetuação de ataque autoimune, e danos ao fígado são mediados, principalmente, por
células TCD4+, embora estudos recentes suportem o envolvimento de diversas populações,
incluindo células Th17 (Longhi et al, 2012).
Na Cirrose biliar primária, a inflamação biliar é mediada por uma perda de tolerância
distinta para uma série de auto-anticorpos mitocondriais. Estudos de associação do genoma
humano indicam um papel crucial da Interleucina 12 (IL-12) no eixo de sinalização para a
patogênese (Liu et al., 2010).
A importância das infecções hepáticas crônicas pelos vírus B e C ou das doenças de
causas não virais, está no potencial risco a que esses portadores crônicos estão
permanentemente expostos, que é o desenvolvimento das complicações mais graves destas
formas de hepatite: a cirrose hepática e o carcinoma hepatocelular (Guirao, 2006, Pellicoro et
al, 2014).
19
1.1 O VÍRUS DA HEPATITE B
Em 1965, Blumberg observou que uma amostra de soro de um aborígine da
Austrália continha um antígeno que reagia, especificamente, com um anticorpo presente no
soro de um paciente hemofílico dos Estados Unidos, denominado então “antígeno Austrália”AU (Blumberg et al., 1965; Bayer et al., 1968).
A correlação do antígeno Austrália com a infecção pelo VHB pôde ser estabelecida
em 1968 (Okochi & Murakami,1968; Prince, 1968). Posteriormente, a purificação do VHB
foi realizada a partir do soro de portadores do antígeno Austrália e a partícula completa
(virion) foi identificada por microscopia eletrônica, sendo então denominada partícula de
Dane (Dane et al. 1970). Kaplan e colaboradores (1973) foram os responsáveis pela
identificação do seu material genômico e por conhecimentos sobre novos antígenos virais
(Kaplan et al., 1973; Robinson, 1975). Com a introdução das técnicas de biologia molecular,
na década de 80, como a reação de hibridização e a reação em cadeia mediada pela polimerase
(PCR), além de técnicas de sequenciamento genômico, tornaram-se possíveis estudos
moleculares detalhados do genoma do DNA do VHB (Seeger & Mason, 2000).
1.1.1 Estrutura e organização genomica do VHB
O VHB faz parte de um grupo de vírus DNA hepatotrópicos, classificados na
família Hepadnaviridae, os quais compartilham características comuns, tais como, tamanho,
ultra-estrutura do vírion, organização da molécula de DNA e um mecanismo exclusivo de
replicação
por
transcrição
reversa.
Esta
família
é
dividida
em
dois
gêneros,
Orthohepadnavirus e Avihepadnavirus, representando os vírus cujos hospedeiros são
mamíferos e aves, respectivamente (Crowther et al., 1994).
O vírion completo possui 42 nm de diâmetro e compreende um envelope
lipoprotéico, derivado da célula hospedeira, que compreende três componentes básicos: as
glicoproteínas denominadas Grande (G), Média (M) e Pequena (P), constituindo o antígeno de
superfície (HBsAg) (Seeger & Mason, 2000). O envelope, por vez, envolve o capsídeo
icosaédrico, com diâmetro de 30 a 34 nm, dentro do qual se encontram o genoma viral e a
enzima DNA-polimerase (P) (Gerlich e Robinson, 1980).
O capsídeo apresenta duas proteínas antigênicas, a proteína do core (HBcAg) e o
antígeno “e” solúvel do VHB, que é uma proteína não estrutural presente no soro, indicando
20
replicação e infectividade viral (Ganem & Prince, 2004). Cada antígeno do VHB (HBsAg,
HBcAg e HBeAg) induz a formação de anticorpos específicos que são denominados, antiHBs, anti-HBc e anti-HBe, respectivamente (Ferreira, 2000) (Figura 2).
Figura 2: Representação esquemática da partícula (A) e do genoma do VHB (Fonte: Beck &
Nassal, 2007).
O genoma do VHB consiste em uma sequência de DNA circular parcialmente
dupla, constituída por, aproximadamente, 3.200 pares de base. O filamento longo de DNA
contém toda a informação genética do vírus e se liga, covalentemente, pela sua extremidade
5’ à polimerase viral. O filamento curto tem extremidade 5’ fixa, mas extremidade 3’ variável,
à qual se liga sequência de oligorribonucletídeos. Os dois filamentos se organizam em uma
estrutura circular, não fechada covalentemente, conhecida como relaxed circular DNA
(rcDNA) (Seeger et al. 1986).
O DNA do VHB apresenta organização complexa, com quatro janelas de leitura,
que se sobrepõem parcialmente: genes pré-S/S, pré-C/C, P e X (Gerlish & Robinson, 1980).
As proteínas do envelope viral são codificadas pela região pré-S/S (pré-superfície –
superfície) do genoma viral (genes pré-S1, pré-S2 e S), que codifica três diferentes antígenos
de superfície, de acordo com a região onde inicia a transcrição.
A proteína mais abundante é a proteína S, que é conhecida como antígeno HBs
(HBsAg). O início da transcrição na região pré-S2 gera a proteína M (média). A proteína L
(large = grande) é gerada pelo início da transcrição na região pré-S1 e desempenha,
provavelmente, papel na ligação do vírus aos receptores da célula hospedeira e sua entrada na
21
mesma e, ainda, na formação do vírion e sua liberação pela célula (Neurath et al. 1986;
Klingmuller & Schaller, 1993).
Além dos vírions, as células infectadas pelo VHB produzem duas partículas
lipoproteicas distintas: esferas e filamentos de 20nm de diâmetro. Essas partículas contêm
proteínas do envelope e lipídeos derivados da célula hospedeira e, em geral, superam,
quantitativamente, os vírions em 1.000:1 a 10.000:1 (Lee, 1997). As regiões pré-C/C (précore – core) do genoma do VHB codificam o antígeno do core (HBcAg) e o antígeno e do
VHB (HBeAg). O HBcAg é o polipeptídeo estrutural do capsídeo viral (Lee, 1997).
O gene longo P codifica a DNA polimerase, enzima que, também, apresenta função
de transcriptase reversa, uma vez que a replicação viral requer intermediário RNA. O gene X
codifica a proteína viral X (HBx), que modula a transmissão de sinal na célula hospedeira e é
necessária à replicação viral (Feitelson et al., 1997).
1.1.2 Replicação viral e variabilidade genética do VHB
A replicação do DNA, por transcrição reversa, a partir de RNA intermediário é a
principal característica da replicação do VHB (Summers & Mason, 1982). O vírion maduro
entra na célula, após ligação a um receptor de superfície e após a fusão de membranas. O core
é liberado no citoplasma da célula e transportado até o núcleo.
No núcleo, o DNA, que se encontra na forma circular aberta, “relaxed circular”
(rcDNA), é convertido à forma circular fechada, “covalently closed circular” DNA
(cccDNA). A partir do cccDNA, RNAs virais são sintetizados pela enzima RNA polimerase,
sendo, então, transportados até o citoplasma, onde a sua tradução produz as proteínas virais
(Summers & Mason, 1982).
No citoplasma, formam-se capsídeos e, durante esse processo, uma única molécula
de RNA pré-genômico é incorporada ao interior do capsídeo (Pollack & Ganem, 1994). Em
seguida, ocorre a transcrição reversa do RNA viral, pela ação da polimerase viral. A síntese
dos dois filamentos do DNA é sequencial: o primeiro, a partir do RNA e, o segundo, a partir
do filamento de DNA recém-sintetizado (Wang & Seeger,1993).
Alguns nucleocapsídeos retornam ao núcleo, onde o DNA pode ser convertido à
forma de cccDNA, para manter estável o conjunto intranuclear deste (Tuttleman et al., 1986).
Entretanto, a maioria dos capsídeos migra para o retículo endoplasmático, onde adquirem o
22
envelope viral e transformam-se em vírions completos, podendo ser exportados para o
exterior da célula (Figura 3) (Tuttleman et al., 1986).
Figura 3: Ciclo de replicação do VHB (adaptado de Ganem & Prince, 2004).
Tem sido sugerido que a infecção crônica pelo VHB seja mantida pelo cccDNA
(Seeger & Mason, 2000). Durante a infecção pelo VHB, o cccDNA acumula-se no núcleo da
célula, onde persiste como epissoma estável e serve como modelo para a transcrição dos
genes virais, o que dará origem aos RNAs pré-genômico (a partir do qual ocorre a transcrição
reversa) e subgenômicos, necessários à síntese das proteínas virais (Seeger & Mason, 2000).
Considerando-se a longa meia vida dos hepatócitos, o fator limitante à eliminação
da infecção é o clareamento dos reservatórios de cccDNA das células infectadas (Moraleda et
al., 1997). Apesar do papel crucial do cccDNA na persistência da infecção pelo VHB e da
importância do conhecimento dos mecanismos de seu clareamento, a maior parte do
conhecimento atual sobre o cccDNA foi obtida utilizando-se modelos animais, existindo
poucos estudos em seres humanos. Obstáculos históricos ao estudo do cccDNA foram a
necessidade de realização de biópsias hepáticas e a falta de métodos quantitativos sensíveis e
23
específicos para a sua detecção (Zoulim, 2004). Apesar dessas limitações, alguns estudos
foram realizados em fígados de pacientes cronicamente infectados pelo VHB e permitiram a
detecção tanto da presença do cccDNA em tecido hepático, utilizando-se técnica de Southern
Blot, como de sua persistência apesar do tratamento antiviral com interferon, utilizando-se
técnica de hibridização molecular (Zoulim, 2004).
O VHB produz uma infecção extremamente produtiva e a sua atividade replicativa
em hepatócitos produz cerca de 10¹¹ cópias virais/mL/dia. O aparecimento de grande número
de mutações deste vírus está associado ao fato do processo de replicação viral ser dependente
de transcriptase reversa, uma enzima sem mecanismos de correção, caracterizando um
conjunto heterogêneo de partículas virais, geneticamente relacionadas ou quasiespécies
(Locarnini, 2004).
Existem oito genótipos do VHB, que recebem denominação de A a H, distintos entre
si pela sequência de nucleotídeos no genoma e que apresentam uma distribuição geográfica
característica nas diferentes regiões do mundo e podem ser classificados, ainda, em subgrupos
por pequenas variações nos genótipos do virus, que permitem estabelecer quatro subtipos:
adw, ayw, adr e ayr (Kramvis et al., 2005).
Alguns estudos indicam que os genótipos do VHB possam influenciar na gravidade
da doença, como também na resposta ao tratamento, todavia, os genotipos do VHB ainda não
sao utilizados na rotina clinica para tomada de decisão terapeutica (Thakur et al., 2002; Lok &
McMahon, 2007).
1.2 O VÍRUS DA HEPATITE C
Na década de 1970 se observou que 90% da hepatite pós-transfusional não era
causado pelo vírus A ou pelo VHB, chamada essa hepatite de não-A, não-B. A clonagem do
vírus foi conseguida, por Choo et al., (1988) e nomeado VHC (Kuo et al., 1989).
O VHC circula de várias formas no hospedeiro infectado e pode ser associado a
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e de muito baixa densidade (VLDL), ambos das quais
parecem representar a fração infecciosa e, também, circula como virions ligados às
imunoglobulinas e como virions livres. Esses recursos podem explicar o dinamismo
incomumente heterogêneo e de baixa densidade desse virus (Kuo et al., 1989).
24
1.2.1 Estrutura e organização genômica do VHC
O VHC, da família Flaviviridae, do gênero Hepacivirus com diâmetro em torno de
55 a 65 nm, tem um envelope lipídico onde se encontram as glicoproteínas virais E1 e E2 e
um capsídeo icosaédrico formado pela proteína viral Core (Figura 4) (Kunkel et al., 2001).
(A)
RNA
Capsídeo
Envelope
(B)
Componentes estruturais
Componentes não estruturais
5
3
Figura 4: Representação esquemática da partícula do VHC (A) e do genoma viral (B).
(Fonte: Perkins, 2001).
O VHC possui um genoma de RNA de fita simples (9.6kb), polaridade positiva, que
contém uma região de leitura aberta (ORF, Open Reading Frame) flanqueada pelas regiões
não traduzidas (UTRs) nas extremidades 5’ e 3’ (Kunkel et al., 2001) codificando uma
poliproteína de, aproximadamente, 3000 aminoácidos.
Esta proteína é clivada no polo N-terminal em três proteínas estruturais, o
nucleocapsídeo (core), envelope um (E1) e envelope dois (E2) que estão envolvidas na
organização arquitetural do VHC. No polo C-terminal a poliproteína é clivada em seis
proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5 (NS5A e NS5B) e NS6, responsáveis
pelo ciclo biológico do vírus (Figura 3) (Preti, 2004).
25
1.2.2 Replicação viral e variabilidade genética do VHC
O VHC se liga à superfície da célula, onde as glicoproteínas do envelope interagem
especificamente com receptores celulares que permitem a endocitose da partícula viral pela
membrana plasmática.
Dentro da célula, o endossoma é acidificado e assim leva à libertação do
nucleocpsídeo no citoplasma. Nesse complexo, a atividade da enzima RNA polimerase
dependente de RNA gera a fita de RNA intermediário de polaridade negativa, complementar
ao RNA viral, que servirá de molde para produção de novas fitas de RNA de polaridade
positiva, que irão compor o genoma das novas partículas virais (Bartenschlager & Lohmann,
2000).
Essas
fitas
positivas
interagem
com
proteínas
estruturais
formando
o
nucleocapsídeo, o qual adquire o envelope no retículo endoplasmático e as partículas virais
são transportadas via, complexo de golgi, e eliminadas da célula hospedeira por exocitose
(Pileri et al., 1998; Bartenschlager & Lohmann, 2000) (Figura 5).
Uma característica importante dos vírus com um genoma de RNA, ou que use
moléculas RNA como intermediários de replicação, é a sua variabilidade genética, resultante,
principalmente, da baixa fidelidade da RNA polimerases viral. A variabilidade genética de
vírus RNA pode ter consequências importantes sobre a patogênese da infecção e as doenças
relacionadas (Simmonds, 2004).
O VHC apresenta alta taxa de replicação, aproximadamente 1x10¹² vírions ao dia,
além de alta taxa de mutação, estimada em 10-³ substituições de nucleotídeos ao ano (Timm &
Roggendorf, 2007), o que leva a grande heterogeneidade de apresentações, denominadas
quasispecies (Martell et al., 1992). O inoculo da infecção pelo VHC ou a alta taxa de
replicação viral pode ser um dos responsáveis pela persistência do vírus quando ela excede a
resposta do hospedeiro (Martell et al., 1992).
A seleção e a adaptação do hospedeiro às quasisespecies deu origem a distintos
genótipos cuja classificação baseia-se na similaridade da sequencia de nucleotídeos (Timm &
Roggendorf, 2007). Atualmente, o VHC é classificado em seis principais genótipos
numerados de 1 a 6, que apresentam diferentes prevalências no mundo (Simmonds, 2004).
26
(IRES) sítio interno de
entrada do ribossoma
RETICULO
ENDOTELIAL
Figura 5: Esquema do ciclo replicativo do VHC: (a) acoplamento e
internalização do vírus (b) liberação citoplasmática e desencapsulamento (c)
tradução e processamento de poliproteína (d) RNA de replicação (e)
embalagem e montagem do virus; (f) maturação e liberação do vírion
(Adaptado de Moradpour et al., 2007).
Apesar da extensa diversidade genética, todos os genótipos possuem o mesmo
arranjo linear de genes e relações filogenéticas, geralmente, consistentes ao longo de todo o
genoma (Simmonds, 2004). Este fato contribuiu para que grande parte da classificação atual
das variantes do VHC seja baseada em sequencias parciais de regiões subgenômicas como
C/E1 ou NS5B (Simmonds et al., 1993).
Essa natureza quasispécies do VHC lhe confere uma significativa vantagem de
sobrevivência, com a presença simultânea de múltiplos genomas variantes e a alta taxa com a
qual novas variantes são geradas, permitem a seleção rápida de mutantes mais adequados às
novas condições ambientais (Martell et al., 1992).
27
Estudos sugeriram que determinados genótipos, como o 1, poderiam ser mais
citopáticos (Dusheiko et al., 1994) ou induzir a maior progressão da doença (Kobayashi et al.,
1996), além desse genótipo ter maior associação com cronificação do VHC (Amoroso et al.,
1998). Por outro lado, Poynard et al., (1997) afirmaram que o genótipo e a a carga viral do
VHC não influenciam a progressão da doença, mas a resposta ao tratamento da hepatite C
crônica.
Mudanças ambientais ocorrem com frequencia durante o curso da infecção pelo
VHC, que podem ser espontâneas, relacionadas com interações metabólicas complexas no
hospedeiro, ou desencadeadas por fatores externos, tais como intercorrentes infecções,
ingestão de medicamentos ou tratamentos antivirais (Cabot et al., 2001).
1.3 EPIDEMIOLOGIA DO VHB E DO VHC
A epidemiologia global do VHB é melhor definida de acordo com as seis regiões
definidas pela OMS: Américas, Europa, África, Mediterrâneo Oriental, sudeste da Ásia e do
Pacífico Ocidental. Cada área geográfica pode ser descrita por sua endemicidade, que é
definida como a prevalência do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) na população
geral de determinada área geográfica (WHO, 2013).
Dessa maneira, o mundo pode ser dividido em três áreas, de acordo com a
prevalência da infecção crônica por VHB, que são: área de prevalência elevada (> 8%), de
prevalência intermediária (2-8%) e de prevalência baixa (<2%). Prevalência baixa é
encontrada na América do Norte, Europa Ocidental e Austrália. Nessas regiões, a infecção por
VHB ocorre em 5% a 7% da população e somente meio por cento a 2% são portadores
crônicos (Alter, 2007).
Em países da Europa Ocidental e Meridional, Japão, em parte da América do Sul e
no Oriente Médio, têm-se a prevalência intermediária, em que a evidência de infecção pelo
VHB corresponde de 10% a 60% da população e, os portadores crônicos, de 2% a 7% (Alter,
2007). Prevalência alta é o que se tem no Sudeste Asiático, na China, na África e na Bacia
Amazônica. Nessas regiões, 70% a 95% da população têm evidência sorológica de infecção
pregressa pelo VHB e no mínimo 8% da população são portadores crônicos (Alter, 2007; Hou
et al., 2005) (Figura 6).
28
Atualmente, o Brasil é considerado uma área de endemicidade intermediária para a
infecção pelo VHB, porém, observam-se taxas variáveis de prevalência em diferentes regiões
do país, sendo, então, divididas em sub-regiões, uma vez que localidades vizinhas podem
apresentar graus distintos de endemicidade. A análise, por região, demonstra que o Sudeste
concentra 36,6% dos casos, seguido pelo Sul, com 31,6% das notificações, entre 1999 e 2009.
Nesse período, tanto o país, quanto as regiões apresentaram crescimento das taxas de
incidência. No Brasil, a taxa passou de 0,5%, em 1999, para 5,6%, em 2009 (Brasil, 2013).
Figura 6: Áreas de prevalência HBsAg no mundo, por país. (CDC, disponível em
http://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2012/hepatitis. Acessado em 14 de maio de 2013).
No período de 1999 a 2011, foram registrados no Sistema de Informação de Agravos
de Notificação (Sinan) 120.343 casos confirrmados de hepatite B no Brasil, sendo a maior
parte deles noticados nas Regiões Sudeste (36,3%) e Sul (31,6%), na Região Norte foram
(13,3%) dos casos. Na Região Norte, a maioria foi no estado do Acre (27,7%), seguido por
Rondônia (24,5%) e Amazonas (22,8%) (Brasil, 2012).
Na Amazônia, a hepatite B está mais concentrada no lado ocidental, sendo a
transmissão intra-familiar mais prevalente que a vertical, posto que a maioria das crianças de
29
mães HBsAg positivas, soroconvertem para o anti-HBs antes do primeiro ano de idade
(Lobato et al., 2005).
Estratégias de prevenção à infecção pelo VHB incluem a prevenção primária
de novas infecções (vacinas e profilaxia pós-exposição), a prevenção secundária da
transmissão do VHB por adequadas práticas sexuais e de higiene e a prevenção terciária das
consequências patológicas da infecção crônica pelo VHB por tratamento antiviral. Em 2010,
a OMS recomendou a administração universal, ao.nascimento, de uma dose da vacina antiVHB, independentemente do nível de endemicidade (WHO, 2010).
A incidência mundial de hepatite C não é tão bem estabelecida, uma vez que a
infecção aguda é, geralmente, assintomática. Na Europa, essa taxa passa a ser de cinco a 10
milhões de pessoas e, na Índia, de 12 milhões de pessoas, sendo que a maioria delas
desconhece ter a infecção. Cerca de 150 mil casos novos de infecção ocorrem, anualmente,
nos EUA e na Europa enquanto no Japão, são 350 mil. Desses, 25 % são assintomáticos, 60%
a 80% podem progredir para hepatopatia crônica e 20% podem desenvolver cirrose (WHO,
2010; CDC, 2013) (Figura 7).
Figura 7: Áreas de prevalência do vírus da hepatite C no mundo. (CDC, disponível em
http://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2012/hepatitis. Acessado em 14 de maio de 2012).
30
Aproximadamente 5% a 7% podem morrer em consequência da infecção (WHO,
2010) que está disseminada em todo o mundo e os países com altas taxas de infecção crônica
são o Egito 22%), o Paquistão (4,8%) e a China (3,2%), sendo esses números atribuídos ao
principal modo de transmissão nestes países, que são às injeções utilizando equipamentos
contaminados (WHO, 2010; CDC, 2013) (Figura 7).
De acordo com a OMS, o Brasil é considerado um país de endemicidade
intermediária para hepatite C, com prevalência da infecção situada entre 2,5% e 10% (WHO,
2010).
Segundo dados do Boletim Epidemiológico de Hepatites Virais (2012), os casos
confirmados de hepatite C, entre 1999 e 2011, registrados no Sinan, perfazem um total de
82.041 casos confirmados de hepatite C no Brasil, a maioria dos quais nas Regiões Sudeste
(67,3%) e Sul (22,3%) (Brasil, 2012).
A Região Sudeste mantém, desde 2002, as maiores taxas de detecção, padrão
semelhante ao observado na Região Sul (Brasil, 2012).
Dentre as capitais da região Norte, em 2010, observam-se as maiores taxas de
detecção por 100.000 habitantes em Rio Branco/AC (37,2) e Macapá/AM (5,0). Ainda nesse
ano, com a exceção do Acre (18,1), todos os estados da Região Norte apresentam taxas de
detecção de hepatite C por 100.000 habitantes menores do que a média nacional (5,4). As
menores taxas de detecção para esse ano foram observadas nos estados de Tocantins (0,1) e
Roraima (0,2) (BRASIL, 2012).
1.4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS HEPATITES VIRAIS B e C
O diagnóstico etiológico das hepatites virais consiste em identificar o agente
causador da infecção e pode ser realizado através de técnicas sorológicas, imunohistoquímicas
ou moleculares, onde se pesquisam os marcadores sorológicos, alterações teciduais e o ácido
nucleico viral, respectivamente (Brasil, 2008).
1.4.1 Diagnóstico da hepatite B
O HBV inicia a replicação no hepatócito na semana que antecede as suas
manifestações clínicas. Nesta fase, o HBsAg pode ser determinado sem que o indivíduo tenha
ainda sintomas ou evidências de necrose hepatocelular (Hoofnagle & Di Bisceglie, 1991). Ao
iniciar a sintomatologia e a elevação de transaminases, aparecem o anticorpo anti-HBc da
classe IgM, com o marcador anti-HBc total. O anti-HBc IgM, juntamente com o HBsAg,
31
constituem a chave do diagnóstico da infecção aguda, uma vez que a fração IgG deste
anticorpo serve apenas como evidência de memória imunológica (Silva, 2003).
Apesar de ser um anticorpo de longa duração, o anti-HBc, não confere imunidade ao
indivíduo, pois não possui capacidade neutralizante (Sjogren, 1994). Na fase inicial da doença
os marcadores de replicação (HBeAg e o HBV-DNA) são encontrados em títulos altos. À
medida que a infecção se instala, a resposta imunológica do hospedeiro modula a infecção,
diminuindo progressivamente a replicação viral (Hoofnagle & Di Bisceglie, 1991; (Silva,
2003).
Os indivíduos que apresentam resposta imunológica satisfatória conseguem debelar a
replicação viral, geralmente até o 3º mês da doença, fazendo com que o HBeAg desapareça
dando lugar ao anticorpo anti-HBe, que está associado a uma baixa replicação do HBV.
A ausência da soroconversão HBeAg/anti-HBe até o 3º mês da doença aguda é sinal
de mau prognóstico, pois indica falha do sistema imunológico e tendência para cronificação
do processo (Silva, 2003).
Cessando a replicação viral, ocorrerá o desaparecimento progressivo do HBsAg e,
algumas semanas após, surgirá o anti-HBs, anticorpo neutralizante e indicativo de cura da
infecção. Os indivíduos que se tornam crônicos, permanecem como portadores do vírus por
tempo variado. A hepatite crônica é determinada pela persistência do HBsAg no soro por mais
de seis meses após o início da infecção (Hoofnagle & Di Bisceglie, 1991; (Silva, 2003).).
As figuras 8 e 9 apresentam as curvas dos marcadores sorológicos nas infecções
aguda e crônica, respectivamente.
Figura 8: Curvas sorológicas na infecção aguda pelo VHB (Fonte: Brasil, 2008).
32
Figura 9: Curvas sorológicas na infecção crônica pelo VHB (Fonte: Brasil, 2008).
1.4.2 Diagnostico da hepatite C
O diagnóstico de infecção pelo VHC é feito através de testes sorológicos para
detecção de anticorpos anti-VHC e testes moleculares, para pesquisa de partículas virais
(Silva, 2003).
A presença de anti-VHC não define isoladamente a presença de infecção ativa e deve
ser interpretada como contato prévio com o VHC, com posterior confirmação por testes
moleculares para detecção de ácidos nucleicos do VHC, denominados HCVRNA, que
permitem detectar o RNA viral e podem ser qualitativos ou quantitativos. Após a exposição
ao vírus da hepatite C, o RNA-HCV poderá ser identificado no soro antes da presença do antiHCV. A presença do RNA-HCV pode ocorrer cerca de duas semanas após a exposição
(Figura 10) (Silva, 2003).
33
Figura 10: Gráfico da evolução da hepatite C (Fonte: Brasil, 2008).
1.4.3 Biopsia hepática
O conhecimento do estágio de fibrose hepática é essencial para o prognóstico e para
a definição da terapêutica antiviral (Bedossa et al, 1994). Os pacientes que não apresentam
fibrose ou com grau mínimo parecem progredir lentamente e o tratamento, possivelmente,
poderia ser adiado ou desnecessário. Por outro lado, pacientes com grau de fibrose
significativa (septal ou em ponte) progridem quase invariavelmente para cirrose e, nesses
casos, o tratamento antiviral deve ser fortemente considerado (Poynard et al., 2003; Ryder et
al., 2004).
A análise histológica de material obtido por biópsia hepática constitui prática
fundamental para a condução clínica da hepatite C, na medida em que fornece informações
importantes de caráter prognóstico, ao permitir a estimativa da progressão da doença. Além
disso, auxilia na definição da necessidade de instituir terapia antiviral e permite o diagnóstico
diferencial com outras doenças hepáticas (Dienstag, 2002).
Os sistemas mais frequentemente usados são o índice de atividade histológica de
Knodell, a classificação de Ishak (modificação do escore de Knodell), o escore de METAVIR
(Knodell et al, 1981; Ishak et al, 1995; Bedossa & Poynard, 1996) e a Classificação da
Sociedade Brasileira de Patologia (Gayotto, 2000).
34
A classificação francesa METAVIR, pontua o grau de fibrose (F), com estadiamento
de 0- ausência de septos, 1- fibrose portal sem septos, 2- fibrose portal com raros septos, 3numerosos septos, mas sem cirrose e 4- cirrose. O grau de inflamação (A), nesta classificação,
é interpretado zero como a ausência de atividade e o 1, 2 e 3 como mínima, moderada e
intensa atividade, respectivamente (Bedossa & Poynard, 1996).
1.4.4 Exames complementares
Outros exames complementares como as provas bioquímicas de função hepática são
utilizadas para fins diagnósticos, pois seus níveis alteram durante a lesão ou necrose
hepatocelular. As transaminases (ALT/AST) são marcadores de dano hepatocelular que na forma
aguda, principalmente a ALT pode atingir valores até 25 a 100 vezes acima do normal, porém na
forma crônica elas não ultrapassam quinze vezes o valor normal, por isso em indivíduos
assintomáticos pode ser o único exame laboratorial sugestivo de dano hepático, o aumento da
gama-glutamiltransferase (GGT) eatá mais relacionada aos fenômenos colestáticos, enquanto que
a diminuição da atividade de protrombina (TAP), das proteínas séricas (albumina) e das plaquetas
indica diminuição da função hepática.
Valores elevados ou progressivamente crescentes da alfafetoproteína, em pacientes
portadores de hepatite crônica, indica o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (Silva,2003;
Brasil, 2011).
1.5 IMUNOLOGIA
O fígado é um componente do sistema imune, onde substâncias da resposta inata e
adaptativa estão presentes ou são sintetizadas. É um órgão enriquecido por células da resposta
imune inata, como as células NK, células NKT e uma população especial de macrófagos, as
células de Kupffer. A resposta inata antiviral é responsável pela ativação de citocinas, como o
interferon (IFN), que ativam proteínas antivirais inibindo a replicação do vírus. Enquanto que
a resposta adaptativa neutraliza as partículas virais e destrói células infectadas (Thime et al.,
2006). O balanço entre a efetividade, especificidade e rapidez dessas respostas e a taxa de
replicação viral, contribui para a eliminação ou persistência da infecção (Guidotti et al.,
1999).
35
Em qualquer infecção viral, como pelo VHB e VHC, a primeira linha de defesa é
mediada pelas próprias células infectadas, através da produção de interferon tipo 1 / que
direciona o alvo da resposta para os produtos de replicação viral (Bertoletti & Gerhing, 2006),
enquanto que as células NK inibem a replicação viral através da produção de IFN-, que
recrutam células inflamatórias intra-hepaticas e estimulam a resposta Th1 para inibir a
replicação viral, as células NKT exercem funções citolíticas e produzem IFN- e IL-4
(Guidotti et al., 1999). Esta fase que, em conjunto com a participação de linfócitos T
reguladores CD4+CD25+, parece ser crucial no desfecho da resposta imune e, por esta razão,
tem sido o objeto de vários estudos (Thime et al., 2006).
A resposta imune celular resulta da atividade de linfócitos T CD4+ (LTCD4) ou T
helper (Th), e linfócitos T CD8+ ou T citotóxicos (LTC). As células de Kupffer ativadas por
LTCD4+ podem ativar as células NK, levando à lise inespecífica de células infectadas do
hospedeiro. Elas também produzem citocinas que regulam linfócitos B, produtores de
anticorpos (Bertoletti & Gerhing, 2006). As células NK e NKT podem inibir a expressão e a
replicação viral sem destruição do hepatócito, promovendo, ao invés, um efeito antiviral
mediado por INF- e por TNF- (Guidotti et al., 1996; Thimme et al., 2003).
Considera-se que a reatividade dos LTC seja fundamental para a eliminação viral
(Bertoletti & Gerhing, 2006). Uma vez ativados, os LTCD8+ participam desse processo
antiviral por mecanismos citolíticos e não-citolíticos, diminuindo os níveis de vírus
circulantes (Guidotti et al., 1999). As células infectadas remanescentes recebem ação dos
LTCD8+ que, agora, pela via citolítica, promovem a apoptose dos hepatócitos e a eliminação
do restante da população viral (Baumert et al., 2007).
A resposta imune envolve, além da proliferação celular, a produção de fatores
solúveis, as citocinas, as quais regulam o funcionamento do sistema imune. De acordo com o
padrão das citocinas produzidas por LTCD4+, a resposta imune pode ser modulada em perfil
Th1 e Th2. O IFN-γ e a IL-2 são citocinas relacionadas com funções efetoras da resposta
imune, responsáveis por ativação e proliferação celular (Koziel, 1999).
A IL-10 relaciona-se com a desativação de células envolvidas na resposta imune,
estando ligada a funções das células Th2. Apresenta propriedade anti-inflamatória e
supressora da resposta imune, induz a produção de anticorpos, ao mesmo tempo em que inibe
a função dos macrófagos para destruir patógenos e a síntese de várias citocinas, tais como IL1, IL-8, IL-6, TNF-α e IL-12 (Koziel, 1999).
36
Durante a infecção aguda, a maioria das células que infiltram o fígado tem atividade
Th1, com função de destruir o patógeno. Essas células liberam IL-2 e IFN-γ, que podem
ativar efeitos antivirais, mas também causam inflamação e necrose. Citocinas do perfil Th2,
como a IL-10, inibem a atividade Th1 logo após a infecção aguda, e quando a infecção é
persistente, seu papel pode ser de proteger contra os potenciais efeitos danosos das células
Th1 (Koziel, 1999;Thimme et al., 2003). Sabe-se, também, que apesar do papel fundamental
dos LTC, deverá haver uma ativação coordenada entre as células TCD4+ e TCD8+ para o
clareamento viral completo, o que está presente, apenas, nos sujeitos que controlam a infecção
(Thimme et al., 2006).
1.6 APOPTOSE
A morte celular é um evento essencial, tanto na vida normal dos organismos quanto
nos processos patofisiológicos que desencadeiam a doença. A nomenclatura clássica distingue
três principais formas de morte celular: a apoptose (tipo I), a autofagia (tipo II) e a necrose
(tipo III) (Lemasters, 2005). O termo apoptose (do grego apó = separação, ptôsis = queda),
adotado pela primeira vez por Kerr e colaboradores na década de 70, designa forma
fisiológica de morte celular programada desencadeando um processo de autodigestão
controlada, em consonância com a remoção de células lesadas, senescentes ou imprestáveis,
sem alteração do microambiente celular (Thompson,1995).
Em nível celular, a apoptose é iniciada e executada pela ativação de enzimas
intracelulares chamadas caspases (cysteine aspartate-requiring proteinases) (Morgan, 2001).
As células que iniciam esse processo apresentam várias alterações típicas, tais como, a
condensação da cromatina, a degradação internucleossômica do DNA, a destruição do
citosqueleto, as alterações na assimetria de fosfolipídeos de membrana plasmática com
exposição da fosfatidilserina, a diminuição do volume citoplasmático, mantendo suas
organelas intactas. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana celular
forma vesículas, denominadas corpúsculos apoptóticos, os quais contêm fragmentos do
núcleo e algumas organelas. Estes corpúsculos ou corpos apoptóticos são rapidamente
reconhecidos e englobados por fagócitos e/ou células adjacentes e degradados pelos
lisossomos (Morgan, 2001).
A apoptose é, basicamente, mediada pelas vias extrínseca e intrínseca. Porém,
independente de como ela é iniciada, resulta na ativação de uma classe específica de caspases,
37
de extrema importância, pois clivam proteínas celulares que culminam na desestruturação
celular (Feig & Peter, 2007). As caspases são divididas em dois grupos, as iniciadoras
(caspases 2, 9 e 10), envolvidas nos eventos iniciais reguladores da apoptose e as efetoras (3,
6 e7), que são proteoliticamente ativadas em uma cascata de eventos que levam ao
aparecimento das alterações celulares características comuns a todas as células em apoptose e
conduzindo à desintegração celular. Dessa forma a ação destas proteases culmina em uma via
efetora comum independente da via estimulante (Feig & Peter, 2007).
A via extrínseca é desencadeada por sinais que surgem dos receptores de morte,
localizados na superfície celular, os quais são ativados por ligantes, tais como fator de necrose
tumoral (TNF) e FasL (CD95L). A apoptose mediada por Fas e pelo ligante Fas-L é uma das
vias de sinalização mais bem definida (Chowdhury et al., 2006). Neste modelo, ocorre o
acoplamento do ligante com o seu respectivo receptor, estes formam agregados que, na forma
de trímeros, ligam-se ao domínio de morte de proteínas adaptadoras presentes no citosol que
são recrutadas após a associação entre ligante e receptor (Chowdhury et al., 2006).
O acoplamento de Fas-L/Fas resulta na ligação do domínio de morte da proteína
FADD (domínio de morte associado ao Fas) ao receptor Fas, enquanto a associação entre o
ligante de TNF e seu receptor leva à ligação deste com o domínio de morte da proteína
adaptadora TRADD (domínio de morte associado ao receptor TNF), além do recrutamento
das proteínas FADD e RIP (proteína de interação com receptores) (Woo et al., 1998).
A proteína adaptadora FADD associa-se, então, com a pro-caspase 8, através da
dimerização do domínio efetor de morte, formando um complexo de sinalização indutor de
morte (DISC), o que promove a ativação da enzima iniciadora caspase 8, que, por sua vez,
ativa a enzima efetora caspase 3, que tem como consequência a degradação de proteínas
celulares e reguladoras da apoptose, assim como a decomposição do DNA cromossômico
(Woo et al., 1998) (Figura 11).
A via intrínseca da apoptose é desencadeada por vários estímulos tais como
radiação, privação de hormônios e citocinas e é regulada pelo equilíbrio de proteínas próapoptóticas (Bak e Bax) e anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-Xl) da família Bcl-2 (Bcell lymphoma
2), envolvidas no controle da permeabilidade da membrana mitocondrial. Com o aumento da
permeabilidade mitocondrial, há liberação do citocromo C no citosol, que desencadeia a
ativação das caspases (Burlacu, 2003).
Existem, ainda, outras vias que promovem a ativação das caspases efetoras, por
exemplo, produtos das células citotóxicas (perforina e granzima B) são capazes de ativar a
proteína BID ou caspase 3, fazendo com que a célula sofra apoptose (Green, 2003).
38
Figura 11: Representação esquemática das vias de apoptose. (Fonte: Nature Reviews
Immunology, 2002).
1.6.1 Apoptose e fibrose hepática
A ativação da caspase-8 via receptor-Fas é um importante mecanismo iniciador da
apoptose dos hepatócitos em condições fisiológicas e patológicas, sendo de extrema
relevância na fisiopatologia de diversas doenças hepáticas (Faubion & Gores, 1999). Em
condições normais, os hepatócitos expressam baixos níveis do receptor Fas. Citocinas
inflamatórias, tais como a IL-1, ou a presença de estresse oxidativo, que resulta na lesão de
DNA e na ativação do p53, podem aumentar a expressão dos receptores Fas, tornando as
células mais suscetíveis a apoptose pelo sistema Fas (Faubion & Gores, 1999).
Os mecanismos pelos quais a apoptose promove a inflamação se relacionam com a
ativação dos macrófagos residentes no fígado, as células de Kupffer (Malhi et al., 2010).
Após a fagocitose dos corpos apoptóticos, as células de Kupffer expressam os ligantes de
morte, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), o TNF ligante indutor de apoptose (TRAIL) e
39
o Fas ligante (Fas-L), capaz de induzir apoptose dos hepatócitos, o que pode agravar, ainda
mais, a inflamação do fígado tendo como consequência a fibrose (Canbay et al., 2003).
A fagocitose dos corpos apoptóticos por macrófagos, também, induz a expressão de
Fas-L, que exerce uma atividade pró-inflamatória (Canbay et al., 2003 ). Como consequência
de lesão hepática crônica, as células estreladas hepáticas passam por um processo de ativação
e aumentam o seu desenvolvimento em fibroblastos ou em miofibroblastos, que secretam
colágeno tipo I e TGFβ-1 (fator de crescimento transformador), promovendo o
desenvolvimento de fibrose (Figura 12) (Caruso et al., 2006; Malhi et al., 2010).
Figura 12: Mecanismos celulares de lesão hepática e de fibrose, devido à apoptose dos
hepatócitos (Adaptado de Malhi et al., 2010).
A fibrose é percebida como mecanismo fisiológico, inicialmente benéfico, para
limitar a extensão do processo inflamatório, mas, com a persistência da agressão, passa a ser
patológico (Zaman et al., 2007).
40
O processo inflamatório hepático caracteriza-se por flutuação, com períodos de
agravamento e de melhora. No entanto, a fibrose é resultante de uma injúria crônica e
persistente, de caráter progressivo, que leva à distorção da arquitetura hepática e à cirrose.
Dessa forma, a progressão da fibrose determina o prognóstico dos pacientes com doença
hepática crônica (Zaman et al., 2007).
1.6.2 O receptor apoptótico Fas (CD95) e seu ligante Fas-L (CD178)
As moléculas Fas (fibroblast associated) e seu ligante (Fas-L) foram descobertas no
final da década 80 e no começo da década de 90, respectivamente (Yonehara et al., 1989). Fas
é uma proteína transmembrânica do tipo I, de peso molecular de 45kDa, que pertence à
família do fator de necrose tumoral/fator de crescimento do nervo (TNF/NGF) (Nagata et al .,
1995).
Assim como todos os membros dessa família, a proteína Fas, também denominada
Apo-1/CD95, é expressa na membrana das células com um domínio extracelular contendo três
repetições ricas em cisteína, um domínio transmembrana e um domínio intracelular
citoplasmático, onde se encontra o domínio de morte. Esta família inclui dois receptores de
TNF (TNFR1 e TNFR2) e o receptor de NGF de baixa afinidade (p75NTR) entre outros
(Nagata et al ., 1995). Codificada pelo gene FAS, localizado no braço longo do cromossomo
10 humano, consiste de 9 éxons que codificam 325 aminoácidos (Suda et al., 1993; Cheng et
al., 1995). O receptor Fas é amplamente expresso em tecidos e entre diferentes tipos de
células, mas estudos têm mostrado os níveis mais elevados no timo, no coração, no pulmão,
no rim, no ovário e no fígado, onde o receptor Fas é expresso nos hepatócitos, colangiócitos,
células estelares ativadas e células de Kupffer (Faubion & Gores, 1999; Nagata et al., 1995).
O ligante de Fas, também conhecido como Fas-L, CD95L, CD178, é uma proteína
transmembrana tipo II, de 40 kDa, pertencente à superfamília de proteínas TNF, codificado
pelo gene FAS-L, localizado no braço longo do cromossomo 1 humano (Suda et al., 1993;
Nagata & Golstein, 1995). É uma proteína trimérica, composta por uma região N terminal,
encontrada no citoplasma e uma região C terminal que se entende para o espaço extracelular
(Nagata et al., 1995).
Tem sido sugerido que a expressão de Fas-L seja restrita a células do sistema imune,
principalmente linfócitos T, células NK e monócitos ativados (Brown et al., 1999). O “cross-
41
linking” de Fas com Fas-L, geralmente, desencadeia o processo de apoptose na célula que
expressa a molécula de Fas (Su et al., 1998).
Além da forma de proteína de membrana, Fas e Fas-L são encontrados em formas
solúveis. Fas solúvel é originado por “splicing” alternativo do gene FAS, enquanto Fas-L
solúvel é resultante de clivagem proteolítica pela metaloproteinase (Mariani et al., 1995). A
molécula de Fas solúvel inibe competitivamente a ligação de Fas-L com Fas localizado na
membrana de células, enquanto que a função de Fas-L solúvel ainda não está bem esclarecida.
Diferentes variantes de “splicing” podem dar origem à Fas solúvel (Ruberti et al., 1996).
A apoptose aumentada de hepatócitos, mediada por Fas, está bem documentada em
doença crônica do fígado associadas ao VHB e ao VHC, bem como a expressão aumentada de
Fas, em paralelo, com a progressão da hepatite C crônica, demonstrando a importância do
papel de morte celular (Kountouras, 2003).
Hepatócitos infectados exibem uma expressão melhorada de Fas e desenvolvem
aumento na susceptibilidade à apoptose Fas-L-mediada. Assim, a via Fas-Fas-L desempenha
um papel importante na lesão de células do fígado (Kountouras, 2003).
Durante os últimos anos, a importância de apoptose para a patogênese de várias
doenças, incluindo as hepatites B e C, tem sido reconhecida. Tem sido sugerido que um
aumento da apoptose de células T durante a infecção pelo vírus da hepatite C é a causa de
prejuízo na regulação da resposta imunitária celular, ajudando a manter a infecção.
Assim, o interesse em descobrir os prováveis mecanismos pelos quas o VHB e
VHC se perpetua no fígado, e para determinar as condições que predispõem para a progressão
da doença, faz a investigação da apoptose em lesões hepáticas de grande interesse (Schinoni,
2006).
1.7 CÉLULAS T REGULADORAS FoxP3+
As células T reguladoras (Tregs), uma subpopulação de linfócitos TCD4+, que
expressam constitutivamente na sua superfície o receptor de cadeia α da IL-2 (CD25), são
capazes de inibir as funções efetoras das células T CD4+, CD8+, células NK e células NKT,
bloqueando a ativação e a função destes linfócitos auxiliando na manutenção da homeostasia
e da tolerância periférica a antígenos próprios.
As Tregs produzidas naturalmente no timo e que apresentam um grande repertório
de TCR (T cell receptor) reativos a antígenos próprios, são chamadas de células T reguladoras
42
naturais (nTregs) e representam 5 a 10% das células TCD4+ periféricas (Sakaguchi, 2005)
(Figura 13).
Figura 13: Origem e função das células T reguladoras (Abbas & Lichtman, 2011).
Outras células reguladoras são geradas na periferia após uma variedade de
estímulos antigênicos ou em condições ditas tolerogênicas, e suprimem funções efetoras de
células antígeno específicas, foram então denominadas células T reguladoras induzidas ou
adquiridas (iTreg) (Bacchetta et al., 2007).
Estas células exercem sua função através da liberação de citocinas inibitórias como
IL-10 e TGF-β (Jonuleit & Schmitt, 2003). Vários tipos de Tregs induzidas têm sido descritas,
incluindo as TR1, que produzem IL-10 e cuja função supressiva está bem documentada nas
doenças alérgicas, autoimunes e em transplante alogênico, outras Tregs induzidas citadas são:
TR3 (produtoras de TGF-β), células T CD4-CD8-, natural killer, CD8+ supressora e gamadelta (Jonuleit & Schmitt, 2003).
43
Para que as Tregs exerçam a função supressora, os mecanismos propostos são:
(i) contato célula-célula: depende do contato da Tregs com a célula T CD4+ efetora,
requer a participação de moléculas de superfície, tais como TGF-β e CTLA-4; além de
moléculas citolíticas (Fas e granzima B). A molécula CTLA-4 libera sinais inibitórios após a
ligação com o receptor de membrana B7-1 (CD80) expressa em células dendríticas e em
células T ativadas (Campbell & Ziegler,2007). Outro mediador importante é o monofosfato de
adenosina cíclica (AMPc), que é liberado pelas Tregs após o contato com as células efetoras
através das junções comunicantes ou gap junctions. O AMPc em níveis elevados inibe a
proliferação e a diferenciação celular, e em linfócitos leva a uma inibição seletiva da
expressão de citocinas, incluindo IL-2 e IFN-γ. Esta inibição pode ocorrer por bloqueio da
proteína cinase A (PCA), do fator nuclear NF-κB ou através da ativação de um repressor de
transcrição chamado ICER (inducible cAMP early repressor) (Sojka et al., 2008);
(ii) liberação de citocinas inibitórias: o TGF-β além da função supressora sobre as
células alvo, exerce a função de modular a expressão de FOXP3 pelas Tregs, sendo capaz de
transformar células T periféricas CD4+CD25- em CD4+ CD25+, tornando-se alvo importante
de estudos relacionados a reação enxerto–hospedeiro (Pyzik & Piccirillo, 2007), enquanto a
IL-10 inibe a ativação das APCs e é antagonista do IFN-γ, sendo relacionada às reações de
controle da inflamação nos tecidos alvo (Sojka et al., 2008);
(iii) competição por fatores de crescimento: as Tregs, também, atuam competindo
por fatores de crescimento, em especial a IL-2, com as células-alvo, o que levaria células a
apoptose por privação de citocinas (Sojka et al., 2008).
Apesar da heterogeneidade da população de células Tregs, com exceção das Tr1,
uma característica comum a todas elas é a expressão do fator de transcrição forkhead box
protein P3 (FoxP3), que é o maior marcador e regulador funcional das células Treg (Yagi et
al., 2004).
A importância de FoxP3 nas Tregs foi bem estabelecida a partir do trabalho de
Brunkow (2001), ao identificar a mutação do tipo frameship no gene FOXP3. Esta mutação é
responsável pelo fenótipo de camundongos scurfy, uma linhagem mutante recessiva, ligada ao
X que apresenta distúrbios auto-imunes graves com depleção completa de Tregs e óbito
precoce. Em humanos a deleção funcional do FOXP3 tem sido observada nos pacientes com a
síndrome IPEX (Immunodeficiency, Poliendocrinopathy and enteropathy X-linked syndrome),
caracterizada clinicamente por múltiplas doenças autoimunes, incluindo diarreia, eczema,
diabetes com destruição das glândulas endócrinas, insulinite e tireoidite, acometendo meninos
e culminando com óbito precoce, ao redor de 2 anos de idade (Campbell & Ziegler, 2007).
44
O gene FOXP3 humano está localizado no braço curto do cromossomo X, consiste
de 11 exons e codifica uma proteína de 431 aminoácidos, também denominada FOXP3. É
expresso predominantemente nas células do timo, baço e linfonodos e particularmente nas
células T CD4+CD25+ (Yagi et al., 2004).
A proteína FOXP3 é um fator de transcrição, cuja função é exercida sobre regiões
reguladoras específicas dentro do DNA, aumentando ou suprimindo a transcrição de genes
específicos1, acredita-se que o fator FOXP3 exerça funções efetora e facilitadora sobre os
genes de proteínas chaves na ativação celular, incluindo a IL-2 e o GM-CSF (Torgerson &
Ochs, 2007).
As proteínas FOX (forkhead box) são componentes de uma família de fatores de
transcrição19. Estas proteínas têm um domínio ligante de DNA altamente preservado
denominado forkhead/winged-helix, o qual recebeu este nome devido à forma de dupla-asa,
semelhante a uma borboleta (Torgerson & Ochs, 2007).
O fator FoxP3 é membro da subfamília P das proteínas FOX e assim como os demais
fatores de transcrição, é composto por três domínios (repressor, central e ligante de DNA ou
forkhead) (Campbell & Ziegler, 2007).
A sinalização nuclear através da FOXP3 nas Tregs não está ainda bem definida. De
acordo com estudos experimentais, após a ligação do antígeno com o TCR, há uma atenuação
na sinalização celular em decorrência da interação física dos fatores nucleares NF-κB e NFAT
com o fator FoxP3, reprimindo os genes de transcrição das citocinas IL-2, IL-4 e IFN-γ.
(Campbell & Ziegler, 2007). Outra conseqüência da ligação de NFAT e FOXP3 é o aumento
da expressão de CD25 e CTLA-4. E, finalmente uma terceira hipótese de atuação do FOXP3
seria a ativação de um co-fator com a função de liberar sinais inibitórios após a ligação do
TCR com o antígeno (Campbell & Ziegler, 2007).
1.7.1 Células T reguladoras nas hepatites virais
Em várias doenças infecto parasitária observa-se que o equilíbrio entre as células T
efetoras e células T reguladoras influencia na resolução dessas doenças (Alatrakchi & Koziel,
2009). O papel das células T CD4+CD25+FoxP3+
nas hepatites virais B e C tem sido
avaliado, principalmente nas formas crônicas da infecção (Billerbeck et al., 2007). A
depuração do VHC está associada com resposta vigorosas das células T CD4+ e T CD8+
45
vírus específica, na fase aguda da infecção. Em contraste, a persistência viral está associada
com uma resposta fraca e disfuncional de células T vírus específicas (Shoukry et al., 2004).
Estudos clínicos sugerem que células T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+,
participam da supressão da imunidade celular T anti-viral contra infecção pelo VHC. Com
efeito, um aumento no número e na funcionalidade de Tregs tem sido detectado em pacientes
com hepatite C crônica, em comparação com aqueles cuja infecção foi resolvida (Ward et al.,
2007) . Estudo com chimpanzés infectados com VHC, mostrou que a freqüência de células
Treg CD4+CD25+FoxP3+ e da capacidade supressora dessas células contra respostas de
células T vírus específicas foram tão elevadas nos chimpanzés recuperado como nos
chimpanzés persistentemente infectados pelo VHC (Manigold et al., 2006). Estes resultados
sugerem que as células Tregs CD4+CD25+ não só suprime respostas de células T vírus
específicas em infecção crônica, mas pode também controlar as células T de memória após a
recuperação de vírus.
O papel das citocinas imunossupressores, tais como a IL-10 e TGF-β, nas células
Treg CD4+ CD25+ dependente, permanece controverso. Alguns estudos relataram que as
células Tregs secretam IL-10 e TGF-β após estimulação do antígeno VHC e que a
neutralização de TGF-β inverte a supressão das Tregs, mediada por respostas de células T
vírus específicas (Bolacchi et al., 2006), enquanto outros não observaram este efeito (Boettler
et al., 2005).
Na infecção por VHB, cerca de 5% -10% dos pacientes com infecção aguda
desenvolvem uma infecção por VHB persistente que está associado com hiporeatividade e
disfunções das células T (Rehermann & Nascimbeni, 2005).
Tomados em conjunto, há uma forte evidência de que diferentes populações de
células T reguladoras mediam supressão das células T vírus específico na infecção pelo VHC
e VHB. Esta supressão imunológica pode contribuir para a persistência do vírus, mas também
para a proteção contra danos esmagadores no fígado (Billerbeck et al., 2007).
1.8 INTERLEUCINA 10 (IL-10)
A interleucina (IL) -10 é uma importante citocina imunorreguladora e antiinflamatória produzida após a estimulação antigênica, por diversas populações celulares como
linfócitos Th2 e Th0, células B, células dendríticas e monócitos (Fiorentino et al., 1989). No
46
fígado sua produção tem sido documentada nos hepatócitos, nas células endoteliais
sinusoidais, nas células de Kupffer, nas células estreladas hepáticas e nos linfócitos residentes,
com produção prevalente no fígado normal (Wan et al., 1997). Ela participa da resposta
inflamatória inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias como, IFN-γ, TNF-α, IL2,
IL1β, IL-8, IL-6 pela ativação de macrófagos, além da inibição de co-estimuladores e
moléculas de MHC II nestas células (Fiorentino et al., 1989). Também possui efeitos antiinflamatórios e supressivos na maioria das células hematopoiética e está envolvido na indução
da tolerância periférica, através dos seus efeitos sobre respostas mediadas por células T
(Moore et al., 2001).
O gene da IL-10 possui 5 éxons, totalizando aproximadamente 5,2 Kb de tamanho e
está localizado no cromossomo 1, posição 1q31-q32 (Dumoutier et al., 2002). O produto
codificado é um homodímero de 18 KDa que pertence ao grupo de citocinas com quatro
cadeias alfa-hélice e liga-se a um receptor de citocinas tipo II (Dumoutier et al., 2002). A
atividade da IL-10 é mediada pelo seu receptor RIL-10 específico, de superfície celular, que é
expresso numa variedade de células, especialmente em células do sistema imune (Dumoutier
et al., 2002).
A IL-10 possui fracos efeitos estimulantes sobre as células B, evita a apoptose e
melhora a proliferação e diferenciação das células do plasma, bem como a síntese de IgM e
inibe a liberação de várias quimiocinas pelos neutrófilos. Em contraste, a IL-10 também
produz efeitos estimulatórios nas células efetoras TCD8+ aumentando sua capacidade
citotóxica e de proliferação inibindo a apoptose de células T (Roncarolo et al., 2006). Estudos
mostram que a IL-10 inibe a proliferação tanto de resposta Th1 como da Th2 e por anergia
celular (Moore et al., 2001).
Os efeitos da IL-10 foram observados em hepatite viral ou auto-imune, na doença
hepática alcoólica e em modelos experimental. Existem evidências que pacientes com uma
forte resposta Th1 durante infecção aguda pelo VHC pode eliminar o vírus, enquanto os
pacientes que apresentam uma resposta de Th2 (níveis elevados de IL-10) podem evoluir para
cronicidade (Barrat et al., 2002), bem como no tratamento após transplante de fígado, onde a
IL-10, favorecendo à tolerância imunológica, pode aumentar a sobrevivência ao aloenxerto
(Barrat et al., 2002).
As propriedades anti-fibróticas da IL-10 foram mostradas em modelo experimental
da cirrose do fígado (Zhang, & Wang, 2006). Sugerindo que a administração in vivo de IL-10
a pacientes com infecção pelo HCV pode mudar o equilíbrio imunológico intra-hepática
diminuindo a predominância das citocinas Th1, exercendo, assim, o seu efeito anti-
47
inflamatório e antifibrótico (Nelson et al., 2003). Entretanto, sabe-se que a terapia em longo
prazo com a IL-10 diminui a atividade inflamatória hepática e a fibrose, mas leva ao aumento
dos níveis de partículas virais (Nelson et al., 2003).
Os mecanismos de tolerância das células T no fígado acontecem porque a expressão
de moléculas de adesão facilita a captura de células T ativadas em sinusóides do fígado, onde
elas podem sofrer apoptose devido a expressão dos ligantes Fas-L e TRAIL pelas células de
Kupffer e podem também ser fagocitados. Além disso, as células T que reconhecem o
antigénio no fígado são expostas a citocinas imunossupressoras, incluindo IL-10 e TGF-β1, e
ligantes, incluindo os inibidores de morte programada (DP-L1) (Figura 14) (Crispe, 2009).
Figura 14: Mecanismos de tolerância das células T no fígado (Fonte: The Annual
Review of Immunology, 2009).
De relevância fisiológica, o fígado é um órgão altamente imunotolerante, por isso,
funções supressoras e efetoras desequilibradas podem contribuem para a persistência do VHB
ou do VHC, onde as elevadas concentrações hepáticas constitutivas de IL-10 ou TGF-β1,
mantém as células dendríticas em um estado imaturo, que por sua vez poderia converter as
células TCD4+ naive residente ou infiltradas em células reguladoras Tr1 (Crispe,2002; Crispe
et al., 2006).
48
1.9 O FATOR DE CRESCIMENTO DO NERVO E O RECEPTOR p75NTR (NGFR)
O fator de crescimento do nervo (Nerve Growth Factor – NGF) descoberto por
Levi-Montalcini e colaboradores, no início da década de 50 e caracterizado, originalmente,
por sua capacidade de estimular o crescimento, a diferenciação, a sobrevivência e a
manutenção dos neurônios durante o desenvolvimento e após do dano (Cohen et al., 1954;
Levi-Montalcini & Hamburger, 1951).
Porém, além das ações neuronais bem descritas, há evidências crescentes que o
NGF é capaz de exercer um grande espectro de efeitos em células imunes, sendo considerada
uma molécula pleiotrópica envolvida em uma variedade de funções, como modulação de
neuropeptídeos e cicatrização tecidual (Nico et al., 2007). É produzido durante o
desenvolvimento, a vida adulta e envelhecimento por diferentes tipos celulares. A expressão
dinamicamente regulada do NGF e seus receptores durante a vida adulta sugerem múltiplas
funções para a sinalização por esse fator de crescimento, muitas das quais são pouco
conhecidas (Sofroniew et al., 2001).
Da família das neutrofinas (NT), que inclui, também, o fator neurotrófico derivado
do cérebro (BDNF), NT-3 e NT-4/5, o NGF representa o protótipo e o membro mais bem
caracterizado estrutural e funcionalmente (Sofroniew et al., 2001).
O NGF, uma molécula altamente conservada dentre espécies distintas, é uma
glicoproteína de 118 aminoácidos, que consiste de três subunidades (α2, β, γ2), cujo gene está
localizado no braço curto proximal do cromossoma 1 humano (Micera et al., 2007). Esta NT
exerce suas funções biológicas sob a forma de um dímero básico de subunidades de,
aproximadamente, 13 KD (Covaceuszach et al., 2004). A existência de RNAm para o NGF,
bem como a presença de receptores para essa molécula, em células de animais adultos, sugere
que esta neurotrofina continua funcional ao longo de toda a vida do animal (Bjerre et al.,
1975).
Os mecanismos de sinalização celular das neurotrofinas compreendem a ativação
de duas classes distintas de receptores transmembrânicos: o receptor de baixa afinidade e os
receptores de alta afinidade. Os receptores de alta afinidade pertencem à família dos
receptores tirosina-quinases (Trk) e são eles o TrkA, o TrkB e o TrkC (Barbacid, 1993;
Davies, 1994). A ligação ao receptor TrkA medeia a proliferação, diferenciação e
sobrevivência através da activação de PI3K / Akt, Ras / MAPK e PLCy vias, esta se estende a
invasão, metástase e morte celular autofágica condução em certos tipos de células de cancro.
49
Ao receptor de baixa afinidade p75NTR, se ligam todas as neurotrofinas com a
mesma afinidade, sendo que este pode formar complexo multimérico com Trk e outros
receptores relacionados, como o receptor de neurotensina e a sortilina ( Price et al., 2007). A
ligação ao receptor p75NTR inicia o recrutamento de diversos adaptadores, que ativam o NFkB e o c-JunN-terminal kinase (JNK), estes medeiam os efeitos opostos de sobrevivência e
apoptose, respectivamente (Figura 15).
exterior
interior
↓
Proliferação
Sobrevivência
Apoptose
Figura 15: Vias de sinalizações ativadas pelo fator de crescimento do nervo (NGF). (Fonte:
Niamh et al., 2011)
Os efeitos das neutrofinas, nos diferentes tipos celulares, dependem da expressão
seletiva de seus receptores por essas células, o NGF tem a capacidade de estimular uma
variedade de células inflamatórias, podendo ser produzido por uma variedade de tipos de
células estruturais e inflamatórias como neurônios, células endoteliais, células epiteliais,
fibroblastos, linfócitos B e T, eosinófilos, basófilos, monócitos/macrófagos e mastócitos
(Pierucci et al., 2001). Estudos, in vitro, indicaram que a síntese de NGF está associada ao
aumento de citocinas pró-inflamatórias, particularmente interleucina-1 beta (IL-1β) e o fator
de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Friedman & Greene, 1999).
50
O receptor p75NTR é uma glicoproteína de 75kDa, codificada por um gene de 23Kb
localizado no cromossoma 17 humano. É sintetizado como precursor solúvel, contendo um
peptídeo sinal de 28 aminoácidos, que é clivado após sua inserção na membrana. Em sua
forma madura, é uma proteína transmembrana do tipo I composta por 399 aminoácidos, cujo
domínio extracelular contém quatro módulos repetidos de seis cisteínas (uma estrutura típica
da superfamília de TNF-R), e o domínio intracelular é composto de 80 aminoácidos, que
corresponde ao DD (domínio de morte), que recruta proteínas adaptadoras para induzirem
morte, sendo desprovido de atividade catalítica intrínseca (Schor, 2005). Existe, ainda, um
domínio justamembrana composto de 150 aminoácidos, que recruta proteínas adaptadoras
para promover tanto apoptose ou sobrevivência celular (Freund & Frossard, 2008).
Estudos indicam que a cascata de sinalização apoptótica induzida pela ativação do
p75NTR é distinta daquela induzida por outros membros pro-apoptóticos da superfamília de
TNF-Rs (Roux & Barker, 2002). Essa diferença se encontra nos domínios de morte (DD) que
compõem esses receptores, que podem ser classificados como do Tipo I (ex.: TNF-RI e Fas) e
do tipo II (ex.: p75NTR), com base em suas similaridades e no espaçamento entre as α-hélices e
tem consequências fisiológicas importantes já que o DD do p75NTR não tem a propriedade de
autoagregação como descrito para o DD do Fas, além de que as moléculas adaptadoras que se
ligam ao DD de Fas, como TRADD e FADD, não se ligam ao p75NTR (Roux & Barker, 2002).
Relatos na literatura têm demonstrado que os componentes do eixo neutrofina, NGF
e p75
NTR
, são expressos, respectivamente, nos hepatócitos e nas CEH ativadas do fígado
normal e fibrótico, em humano e em ratos. E que as CEH expressam o p75NTR e que sofreram
apoptose em cultura de tecido, em resposta à estimulação com o NGF recombinante,
sugerindo o p75NTR como um novo marcador de CEH ativadas e que a sinalização através da
ligação desse receptor pode fornecer um mecanismo de apoptose seletiva de CEH (Figura 14)
(Sofroniew et al., 2001; Trim et al., 2000; Oakley et al., 2003, Passino et al., 2007).
Estudos genéticos, em tecido hepático, são, particularmente, difíceis de conduzir,
devido à natureza invasiva do procedimento de biópsia hepática. Entretanto, uma das
indicações para a realização desses estudos é a definição da importância dos genes FAS, FASL, FOXP3, IL-10, NGF e P75, na patogênese das doenças hepáticas crônicas tanto de causa
viral como não viral, apesar da natureza multifatorial destas doenças que incluem fatores do
hospedeiro, do patógeno e as variáveis ambientais, em diferentes proporções para cada doença
e para cada sujeito estudado.
51
1.10 OBJETIVOS
1.10.1 Objetivo Geral
Quantificar a expressão dos genes FAS, FAS-L, FOXP3, IL-10, NGF e P75NTR em
espécimes de biópsia do fígado de pacientes com hepatite crônica pelo VHB e pelo VHC,
bem como por causas não virais, visando relacionar os seus possíveis papéis na patogênese
dessas doenças.
1.10.2 Específicos
1- Descrever e comparar as frequências das alterções das enzimas hepáticas e dos
escores de fibrose e inflamação hepática nos diferentes grupos estudados;
2- Comparar a expressão dos genes FAS, FAS-L, FOXP3, IL-10, NGF e P75NTR dos
portadores de hepatites crônicas virais e hepatites crônicas de causas não virais ao perfil de
expressão obtido nos indivíduos do grupo controle.
3- Caracterizar a ocorrência de células Tregs no fígado de pacientes com hepatites
crônicas através da quantificação do FoxP3.
4- Correlacionar a quantificação da expressão dos genes FAS, FASL, FOXP3, IL-10,
NGF e P75NTR com:
- a apresentação clínica da infecção crônica pelo VHB e VHC e demais causas.
- os vários graus de estadiamento de fibrose hepática e atividade inflamatória pela
classificação de METAVIR.
- com os níveis séricos da ALT, AST, GGT e AFP
52
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO
Este estudo do tipo transversal e analítico foi constituído de 51 indivíduos, sendo
casos consecutivos, em pré-tratamento, de portadores crônicos do VHB (n=6), do VHC
(n=28) e hepatites não virais (HNV) (n=9), incluindo a doença hepática gordurosa não
alcoólica, a hepatite autoimune, a cirrose biliar primária entre outras, atendidos no
Ambulatório de Hepatologia do Hospital da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará
(FSCMPA) no período de agosto de 2010 a dezembro de 2013, e um grupo controle (CT)
(n=8) compostos por indivíduos submetidos à colecistectomia biliar convencional, sem
alterações hepáticas necro-inflamatórias, atendidos no Serviço de Cirurgia do Hospital
Universitário João de Barros Barreto/UFPA (HUJBB).
Todos os pacientes selecionados foram avaliados clinicamente e submetidos à
investigação complementar que constou de exames hematológicos, bioquímicos, sorológicos,
virológicos e ultra-sonográficos, além da biópsia hepática. Os pacientes foram divididos em
quatro grupos de acordo com o tipo de doença hepática (viral e não viral) e controles.
2.1.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Como critérios de inclusão foram selecionados indivíduos com idade igual ou
superior a 18 anos, de ambos os gêneros, portadores de HBsAg por mais de 6 meses,
portadores de VHC-RNA positivo, persistência de transaminases elevadas ou não. Foram
excluídos da pesquisa indivíduos que não preencherem os requisitos estipulados acima e
aqueles pacientes co-infectados pelo VHD e/ou HIV e pacientes que utilizaram ou estejam em
uso de terapia antiviral específica contra o VHB ou o VHC.
2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
2.2.1 Exames laboratorias bioquímicos, hematológiocos e sorológicos.
Foram coletadas amostras de sangue de todos os participantes em tubos a vácuo
com EDTA, e as amostras de plasma separados por centrifugação para exames bioquímicos,
sorológicos e de marcadores tumorais: ALT, AST, GGT realizados por reação enzimática
colorimétrica com metodologia automatizada, utilizando-se o equipamento Architect-Abbott
c8000; o marcador tumoral alfafetoproteina e os marcadores sorológicos HBsAg, HBeAg,
53
anti-HBeAg e anti-HCV foram analisados por técnica de quimioluminescencia de
micropartículas com metodologia automatizada, utilizando-se o equipamento Architect-Abbott
c8000 do laboratório do HUJBB. Os dados hematológicos, bem como os parâmetros de
coagulação sanguínea, os exames de carga viral e genotipagem para o VHC e o VHB,
constavam nos prontuários dos pacientes, e os exames ultrassonográficos foram realizados
pelo serviço de radiologia da FHSCM no momento, ou antes, da biópsia hepática.
2.2.2 Procedimentos histopatológicos
Espécimes de biópsia hepática foram obtidos de pacientes com indicação clínica
para investigação de alterações de parênquima hepático, realizadas por profissional médico do
referido serviço de hepatologia, utilizando agulha de Trucut e dirigidas por ultrassonografia.
Cada amostra foi separada em duas partes e uma delas foi submetida ao exame
histopatológico após colorações de hematoxilina-eosina (HE), cromotrope azul de anilina
(CAB), reticulina de Gomori e orceína de Shikata, no Departamento de Anatomia Patológica
da UFPA. O diagnóstico obedeceu a classificação da Sociedade Brasileira de Hepatologia
(Gayotto, 2000) e a francesa de METAVIR (Bedossa & Poynard, 1996), pontuando a
atividade do infiltrado inflamatório portal e peri-portal de 0 a 3 e as alterações estruturais de 0
a 4. A outra parte da biópsia foi enviada para estudo genético no Laboratório de
Virologia/ICB/UFPA e armazenada a -70°C até o momento do uso.
2.3 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
2.3.1 Extração de RNA
O fragmento de tecido hepático foi mantido em 500 μL de RNA later® Tissue
Collection para a conservação do RNA, que foi posteriormente extraído utilizando-se o kit
Norgen Biotek Corporation de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O grau
de pureza da amostra foi verificado pela razão entre as absorbâncias medidas a 260 e 280 nm.
Sendo considerada uma boa extração aquela que apresentou valores entre 1,6 a 1,8. Para
observação da pureza e integridade do RNA, as amostras foram carregadas em gel de agarose
1% em tampão TAE 1x corado com Brometo de Etídeo (0,5 μg/mL) e submetidas à corrida
eletroforética a 80 V durante 90 minutos. As bandas observadas correspondem aos RNAr
28S, 18S e 5S. As maiores bandas, 28S e 18S devem aparecer no gel na proporção 2:1,
54
respectivamente. A banda 5S deve aparecer o menos intensa possível, indicando o menor
nível de degradação do RNA (Figura 16).
28S
18S
5S
Figura 16 - Separação eletroforética mostrando as bandas 28S, 18S
e 5S do RNA, indicando integridade das amostras (Fonte:
LABVIR/UFPA).
Para o cálculo da concentração, o RNA foi quantificado pela leitura em
espectrofotômetro Qubit® 2.0 Fluorometer, utilizando-se o Qubit™ RNA Assay Kits, de
acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra foi feito o ajuste da concentração
para 50ng/μL e mantido a -70°C até o momento da transcrição.
2.3.2 Eletroforese
Os produtos da extração foram visualizados após eletroforese (100 V/45
minutos) em gel de antígenoarose a 1%, em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase 1,6
M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), contendo 6 μL de
Syber-Safe (Invitrogen, Oregon, USA), mediante a utilização de transiluminador com fonte de
luz ultravioleta.
55
2.3.3 Transcrição Reversa (cDNA)
As amostras de RNA foram transcritas em DNA complementar, utilizando-se o kit
High-Capacity cDNA Reverse Transcription (sem inibidor) (Applied Biosystems, USA). Para
a reação de cDNA foi preparado um mix com um volume final de 20,0 μL, contendo 4,2 μL
de H2O, 2,0 μL de buffer, 2,0 μL de Random Primers, 0,8 μL de DNTP mix (100mM), 1,0
μL de enzima transcriptase reversa (RT), fornecidos pelo kit e, 10,0 μL de RNA extraído.
Posteriormente, a mistura foi colocada no equipamento termo-ciclador da Perkin-Elmer Cetus
Corp.,USA., e submetidas às ciclagens de 25ºC a 10 minutos, 37ºC a 120 minutos e 85ºC a 5
minutos.
2.3.4 Quantificação dos RNAm por PCR em Tempo Real (qPCR)
As reações de PCR em Tempo Real (qPCR) foram realizadas em placas de 96
poços, utilizando os reagentes TaqManTM (Applied Biosystems, USA) no equipamento Step
One Plus (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
Os ensaios de expressão dos genes, tanto dos grupos de pacientes quanto do
controle, foram realizados em poços separados (singleplex) com iniciadores obtidos
comercialmente pela Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) (Tabela 1), e cada reação foi
composta por 15μL de 2X TaqMan® Universal PCR Master Mix, 1,5μL de 20X TaqMan
Gene Expression Assays, 3μL de cDNA e 10,5 μL água livre de RNAse. O gene GAPDH
(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) (P/N 4326317E, Life Technologies, CA, USA)
foi utilizado como gene de referência (controle endógeno) para normalizar as reações de
qPCR.
As condições de termociclagem foram: 1 ciclo de 2min a 50°C seguido de 10min a
95°C, 40 ciclos de 95°C por 15seg e 60 °C por 1min. A expressão relativa de cada gene foi
apresentada como um múltiplo do respectivo gene expresso na amostra de um controle
normal.
56
Tabela 1 - Identificação dos ensaios, iniciadores e sondas para amplificação dos genes
utilizados para PCR em Tempo Real Quantitativo.
Genes
Ensaios e sequências nucleotídicas
FOXP3
Hs01085834_m1
IL-10
Hs00174086_m1
NGF
Hs00171458_m1
p75NTR
Hs00609976_m1
FAZ
Fas For: 5' TGAAGGACATG GCTTAGAAGTG 3’
FasRev: 5’ GGTGCAAGGGTCACAGTGTT 3’,
Sonda Fas: 5’ - (FAM) – AAACTGCACCCGGA CCCAGAATACC-(TAMRA)-3’
FASL
Fas-L For: 5‘ GCAGCCCTTCAATTACCCAT 3’
Fas-LRev: 5’ CAGAGGTTGGACAGGGAAGAA 3’
Sonda Fas-L: 5’ - (FAM)-TCCCCAGATCTACTGGGTGGACAGC- (TAMRA)-3’
GAPDH
GAPDH For: 5’ GAAGGT GAAGGTCGGAGTC 3’
GAPDH Rev: 5’ GAAGATGGTGATGGGATTTC 3’
Sonda GAPDH: 5’ - (FAM)-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-(TAMRA) -3’
Na padronização das reações de qPCR, os cDNAs e as sondas (genes endógenos e
alvos) foram titulados objetivando o cálculo de eficiência das reações de amplificação. Para a
padronização, foram testados diferentes concentrações de cDNA (puro e em 4 diluições de
fator 2 – 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16). Todas as reações foram realizadas em triplicatas. Nas placas
foram analisados, simultaneamente, o mesmo cDNA (em diferentes diluições) com as
diferentes sondas, a fim de se construir uma curva de eficiência para validar o método de
análise 2-ΔΔCT (Figura 17).
A quantificação relativa (RQ) dos genes alvos e o cálculo do intervalo de confiança
foram realizados utilizando o método CT Comparativo (ΔΔCT) ou método 2–ΔΔ, método
utilizado para RQ da comparação do limiar da fase exponencial (threshold), sem recurso da
curva padrão, onde ΔΔCT=ΔCTamostra-ΔCTreferência (Life Technologies, Foster City, CA, USA).
57
Figura 17: Exemplo das curvas de padronização das reações de qPCR do gene endógeno
GAPDH (A) e dos genes alvos (NGF) (B), com concentrações de cDNA tituladas (puro e em
4 diluições de fator 2 – 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16) objetivando o cálculo de eficiência das reações de
amplificação.
2.4 PROCEDIMENTOS ESTATÍSTICOS
Todos os resultados das expressões são mostrados em valores de mediana e os
valores das dosagens séricas mostradas em média. Para a análise estatística foram utilizados
os programas GraphPad Prisma 5.022 e BioEstat 5.023. Foram analisadas as diferenças entre
os grupos com o teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-teste, conforme apropriado. As
relações entre duas variáveis foram determinadas por análise de correlação de Spearman.
Estabeleceu-se em 5% o nível de significância (valor de p < 0,05).
2.5 PROCEDIMENTOS ÉTICOS
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, protocolos nº 117/2009 e 772.782 /2014,
seguindo as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos
(Resolução 196 do Conselho Nacional de Saúde) (ANEXOS 1 e 2). Todos os indivíduos que
concordaram em participar do estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) (ANEXO 3).
58
3 RESULTADOS
Em todos os três grupos de pacientes com doenças hepáticas crônicas, assim como
para o grupo controle, foram avaliados os níveis séricos de ALT, AST, GGT, AFP, os graus
de fibrose e de atividade inflamatória identificados no tecido hepático (Tabela 1).
Os níveis médios de ALT foram maiores nos grupos de pacientes portadores do VHC
(89UI/L) e de hepatite não viral (97UI/L), o mesmo sendo observado para GGT (78UI/L e
179UI/L, respectivamente). As comparações dos valores de ALT revelou significância entre
os grupos VHB vs. VHC (p=0.005), VHB vs. HNV (p=0.012), VHC vs. HNV (p=0.033),
VHC vs. Controles (p=0.004) e HNV vs. Controles (p=0.0007).
Entre os valores de AST houve significância entre os grupos VHB vs. VHC
(p=0.003), VHB vs. HNV (p=0.030), VHC vs. Controles (p<0.0001) e HNV vs. Controles
(p=0.012).
As comparações dos níveis séricos de GGT mostraram diferenças significantes entre
todos os grupos VHB vs. VHC [p=0.016], VHB vs. HNV (p=0.0003), VHC vs. NVH
(p=0.003), VHC vs. Controles (p=0.021) e HNV vs. Controles (p=0.0003). As comparações
dos níveis de ALT, AST e GGT entre VHB e controles mostraram-se não significante
(p>0.05).
Quanto ao nível de fibrose foram observados todos os graus (F0 a F4) entre os
portadores de hepatite C com 53,6% dos pacientes apresentando graus F0 e F1. Entre os
portadores de hepatite não viral, 50% apresentavam graus de fibrose entre F0 e F1, 52% eram
F3 e F4, enquanto que entre os portadores de hepatite B somente 16,7% apresentavam fibrose
grau F4.
O grau de resposta inflamatória revelou que 83,3% dos portadores de hepatites B e C
apresentavam graus A1 e A2, similar ao observado entre os pacientes com infecção não viral
(85,7%). Entre os controles 100% apresentavam grau A0 (Tabela 3).
O processo de inflamação esteve ausente em 50% dos indivíduos com escore de
fibrose hepática F0 e em 23,53% do F1, em todos os demais escores foi observada inflamação
leve (A1) e moderada (A2), sendo que em F2 esteve a maior frequência dos níveis de
inflamação A2 (71,43%) (Tabela 2).
59
Tabela 2 – Dados clínicos, bioquímicos e histopatológicos segundo escores de METAVIR da
população do estudo.
VHB
VHC
HNV
CT
(n=6)
(n=28)
(n=9)
(n=8)
Gênero (F/M)
4/2
16/12
5/4
5/3
ALT (UI/L) Média±D.P.
35.8 ± 60.8
89 ± 97.1
97 ± 76.21
27 ± 8.11
Mediana
30.5
56
96
27
AST (UI/L) Média±D.P.
33 ± 8.37
70 ± 52.00
74 ± 58.10
24 ± 6.56
Mediana
33.5
55
56
25
GGT (UI/L) Média±D.P.
30 ± 14.7
78 ± 98.8
170 ± 141.77
29 ± 10.74
Mediana
20.5
55
155
29
AFP ng/mL Média±D.P.
5.3 ± 3.16
5.2 ± 3.88
9.3 ± 18.02
1.6 ± 0.82
Mediana
4.45
4.30
3.47
1.39
F0 (%)
1 (16,7)
2 (7,1)
1 (16,7)
8 (100,0)
F1 (%)
4 (66,6)
13 (46,5)
2 (33,3)
-
F2 (%)
-
7 (25,0)
-
-
F3 (%)
-
3 (10,7)
1 (16,7)
-
F4 (%)
1 (16,7)
3(10,7)
2 (33,3)
-
A0 (%)
1 (16,7)
4 (14,3)
1 (16,7)
8 (100,0)
A1 (%)
4 (66,6)
13 (46,4)
4 (66,6)
-
A2 (%)
1 (16,7)
11 (39,3)
1 (16,7)
-
Estadiamento da fibrosea
Graus de inflamaçãob
ALT: alanina aminotransferase (normal: 14 a 55 UI/L); AST: aspartato aminotransferase
(normal: 14 a 32 UI/L); GGT: gamaglutamiltransferase (normal: < 50 UI/L); AFP:
alfafetoproteína (normal: < 15 nm/mL); aEscores de Fibrose F0: ausência de fibrose; F1:
portal sem septos;F2: portal com alguns septos; F3: muitos septos sem cirrose; F4: cirrose;
b
Atividade Inflamatória A0: ausente; A1: mínima; A2: moderada; *p: Kruskal-Wallis.
60
Tabela 3 – Frequência dos níveis de atividade inflamatória nos escores de fibrose
hepática dos pacientes com hepatite viral e não viral.
Escores de fibrose hepáticaa
Atividade
inflamatóriab
F0
F1
F2
F3
F4
A0
50%
23,53%
0
0
0
A1
50%
52,94%
28,57%
50,00%
50%
A2
0
23,53%
71,43%
50,00%
50%
a
Escoress de Fibrose F0: ausência de fibrose; F1: portal sem septos;F2: portal com
alguns septos; F3: muitos septos sem cirrose; F4: cirrose; bAtividade Inflamatória A0:
ausente; A1: mínima; A2: moderada.
A figura 18A mostra que quando analisadas as médias plasmáticas das enzimas
hepáticas dentre os pacientes sem alterações histológicas no fígado e aqueles com fibrose e
cirrose os maiores níveis de ALT e AST se encontraram nos grupos com fibrose e cirrose com
diferenças estatísticas significativas entre estes grupos e o grupo sem alterações histológicas
do fígado (p=0,18 e p=0,0442, respectivamente; p=0,18 e p=0,0442, respectivamente). As
concentrações de GGT foram maiores no grupo com cirrose apresentando diferença
significativa quando comparadas ao grupo normal e com fibrose (p=0,057 e p=0,022,
respectivamente).
Quanto ao processo inflamatório, as concentrações séricas de ALT, AST e GGT
foram maiores no grupo com atividade inflamatória A2, quando comparado aos grupos A0 e
àquele com inflamação hepática leve (A1), mostrando significância estatística nas diferenças
(p<0,05) (Figura 18B). As concentrações séricas do marcador tumoral alfafetoproteína se
apresentaram dentro da normalidade em todos os participantes do estudo, com média de 5,49
ng/mL.
61
Figura 18: Média dos níveis plasmáticos de ALT, AST e GGT em pacientes: sem alteração
histológica no fígado, com fibrose sem cirrose e com cirrose (A) e de acordo com a atividade
inflamatória (B) no tecido hepático de todos os portadores de doença hepática crônica viral e
não viral.
62
3.1 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DO RNAm DO RECEPTOR FAS E DO LIGANTE
FAS-L EM PACIENTES COM HEPATITE CRÔNICA E NO GRUPO CONTROLE.
Os níveis de expressão do RNAm dos genes estudados foram mensurados nos grupos
de pacientes com doença hepática crônica e comparados com os resultados obtidos no grupo
controle, considerando os valores expressos em fold change (vezes) em relação ao calibrador
de referência.
A quantificação do RNAm do receptor FAS e do ligante FAS-L foi maior no grupo de
pacientes com VHC, enquanto que os grupos com VHB e HNV apresentaram as menores
expressões gênicas e quando comparados ao grupo controle as diferenças mostraram
significância estatística (p<0,0001) (Fig. 19A).
Entre os grupos de pacientes as diferenças das expressões mostraram significância
estatística em relação ao receptor FAS entre VHB vs. VHC e VHC vs. HNV (p= 0,034 e
p=0,011, respectivamente) (Fig. 19A) e ao ligante FAS-L entre todos os grupos (p=0,0193)
(Fig. 19B).
Figura 19: Quantificação relativa do RNAm do receptor Fas (A) e do ligante Fas-L (B) entre
os grupos com VHB, VHC, HNV e o grupo controle.
A figura 20 mostra que em relação à apresentação clínica, no conjunto de toda a
população do estudo, o grupo com fibrose sem cirrose hepática deteve as maiores expressões
63
de Fas (Fig. 20A) e Fas-L (Fig. 20B) em relação aos pacientes com cirrose, aos pacientes sem
alterações histológicas e aos controles, com significância estatística (p<0,0001).
Figura 20: Quantificação relativa do RNAm do receptor FAS (A) e do ligante FAS-L (B)
entre o grupo controle e os pacientes sem alterações histológicas (Normal), com fibrose sem
cirrose e com cirrose hepática. Niveis do receptor FAS (C) e do ligante FAS-L (D) entre os
individuos com fibrose sem cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral.
Porém, quando os grupos foram analisados separadamente, de acordo com o tipo de
infecção e doença hepática, o receptor FAS (Fig. 20C) apresentou maior expressão nos
indivíduos com fibrose sem cirrose hepática tanto nos casos de origem viral como não viral,
64
porém, sem diferença estatística significativa (p>0,05), situação semelhante ao ligante FAS-L
(Fig. 20D).
Foi observada uma correlação positiva entre a expressão dos RNAm do receptor FAS
e do ligante FAS-L no tecido hepático de pacientes com VHC (Fig. 21B) e com HNV (Fig.
21C) com significância estatística (p=0,0120 e p=0,0255, respectivamente), entretanto, essa
correlação não foi observada nos portadores com VHB (Fig. 21A).
Figura 21: Correlação dos níveis teciduais do RNAm do receptor FAS e do ligante FAS-L
nos grupos de pacientes com VHB, VHC e HNV.
A figura 22 mostra que quando analisados todos os doentes crônicos agrupados, viral
e não viral, os níveis do RNAm de FAS (Fig. 22A) e FAS-L (Fig. 22B) foram menores em F0
e aumentaram de acordo com os graus de fibrose hepática com significância estatística entre
as diferenças de expressão (p<0,05) e foram notadamente diminuídos em cirrose (F4).
Dentre os escores de classificação de fibrose hepática (F1 a F4) a expressão do
RNAm de FAS foi maior em F1 e F2 com significância estatística quando comparadas com
F4 (p= 0,035 e p=0,041, respectivamente), enquanto que a expressão do RNAm do ligante
65
FAS-L (figura 22B) foi, significativamente, maior em F2 em relação aos demais escores de
fibrose (p<0,05).
Figura 22: Quantificação relativa do RNAm do receptor FAS de acordo com o grau de
estadiamento de fibrose (A) e atividade inflamatória (C) e do ligante FAS-L de acordo com o
grau de fibrose (B) e atividade inflamatória (D) no tecido hepático de indivíduos com doença
hepática crônica viral e não viral.
Com relação ao processo inflamatório hepático os menores níveis do RNAm de FAS
(Fig. 22C) e FAS-L (Fig. 22D) foram observados em A0 e as maiores expressões foram
66
observadas, de forma crescente, em A1 e A2, sendo as diferenças estatisticamente
significativa.
A figura 23 mostra que no conjunto das hepatites estudadas houve uma correlação
positiva das expressões do RNAm de FAS (Fig. 23A e 23C) (p=0,0002 e p=0,0136) e do
ligante FAS-L (Fig. 23B e 23D) (p=0,0102 e p=0,0466) com as enzimas hepáticas ALT e
AST e que essas associações tiveram significância estatística.
Figura 23: Correlação dos níveis de RNAm do receptor FAS (A e C) e do ligante FAS-L (B e
D) com as concentrações plasmáticas de ALT e AST no conjunto das doenças hepáticas
crônicas estudadas.
67
3.2 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DO RNAm DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO FOXP3
EM PACIENTES COM HEPATITE CRÔNICA E NO GRUPO CONTROLE.
Os níveis de expressão do fator de transcrição FOXP3 foram significativamente
maiores nos pacientes do que no grupo controle (p<0,0001) e, entre os primeiros, o grupo com
VHB teve menores níveis de expressão do que os grupos com VHC e com HNV que
apresentaram os maiores valores de expressão gênica, mas sem diferença estatística
significativa (Fig. 24A).
Quando os pacientes foram agrupados com relação aos aspectos clínicos da doença
hepática crônica, a expressão do fator de transcrição FOXP3 foi maior nos indivíduos com
cirrose em relação àqueles com fibrose sem cirrose hepática, tanto de causa viral como não
viral com diferença estatística significativa somente entre os indivíduos portadores de
infecção viral (p=0,043) (Fig. 24B).
Figura 24: Quantificação relativa do RNAm do fator de transcrição FOXP3 no tecido
hepático dos grupos com VHB, VHC, HNV e do grupo controle (A); e nos grupos com
fibrose sem cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral (B).
68
A figura 25 mostra que dentre os escores de fibrose hepática da população estudada,
os níveis do RNAm do fator de transcrição FOXP3 foram menores nos grupos sem fibrose F0
(Fig. 25A) com valores aumentando nos demais estágios da lesão do fígado, mostrando
diferenças estatísticas significativas (p<0,05).
O mesmo foi observado com relação à atividade inflamatória hepática (Fig. 25B),
onde os níveis de RNAm desse fator de transcrição foram, significativamente, crescentes à
medida em que se aumentava o grau de inflamação (p=0,024).
Figura 25: Quantificação relativa do RNAm do fator de transcrição Foxp3 no tecido hepático
de acordo com os graus de estadiamento de fibrose (A) e com os níveis de atividade
inflamatória (B) no conjunto das doenças hepáticas crônicas estudadas.
Entre os pacientes com alterações histológicas hepáticas, os escores de fibrose F1 e
F4 mostraram os menores e maiores níveis de expressão, respectivamente, com diferença
estatística significativa entre os mesmos (Fig. 25A) (p=0,017).
Foi observada uma correlação positiva entre a expressão do RNAm do fator de
transcrição FOXP3 com o receptor FAS (p=0,0157) (Fig.26A) e o ligante FAS-L (p=0,0093)
Fig. 26B) e essas associações foram estatisticamente significativas.
69
Figura 26: Correlação dos níveis de RNAm do fator de transcrição FOXP3 com o receptor
FAS (A) e o ligante FAS-L (B) no conjunto das doenças hepáticas crônicas estudadas.
3.3 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DO RNAm DA IL-10 EM PACIENTES COM
HEPATITE CRÔNICA E NO GRUPO CONTROLE.
A expressão hepática do RNAm da IL-10 foi maior no grupo controle quando
comparados com as formas de hepatites estudadas mostrando significância estatística entre os
mesmos (p<0,0001).
Os grupos com VHB e VHC tiveram os maiores níveis de expressão dessa citocina
do que o grupo com HNV, porém com diferença estatística significativa somente entre VHB e
HNV (p=0,018) (Fig. 27A).
Quando os níveis de RNAm foram avaliados de acordo com a quadro clínico de
fibrose sem cirrose ou cirrose hepática (Fig. 27B), os níveis de RNAm da IL-10 foram
superiores no grupo com fibrose sem cirrose quando comparado ao grupo com cirrose
hepática nos casos de origem viral, porém sem significância estatística (p=0,179) enquanto
que no grupo não viral as expressões foram similares entre aqueles com fibrose e o grupo
com cirrose.
70
Figura 27: Quantificação relativa do RNAm da IL-10 no tecido hepático dos grupos com
VHB, VHC, HNV e do grupo controle (A); e nos grupos com fibrose sem cirrose e com
cirrose hepática de causa viral e não viral (B).
Os maiores níveis do RNAm de IL-10 foram observados nos grupos sem fibrose e
sem inflamação hepática (F0 e A0) e mostraram diferenças significantes quando comparados
com os demais graus de fibrose e atividade inflamatória hepática (p=0,0216 e p=0,0092),
(Fig. 28A e 28B).
Dentre os indivíduos com fibrose hepática, o grupo com o escore F2 teve os menores
níveis de expressão de IL10 enquanto que nos escores F1, F3 e F4, respectivamente, esse gene
foi mais expresso, com diferença estatística significativa entre F2 e os demais (p=0,0385)
(Fig. 28A).
O grupo com atividade inflamatória leve (A1) mostrou maior expressão do RNAm
da IL10 quando comparado ao grupo A2, sendo a diferença significativa (p=0,0482) (Fig.
28B).
71
Figura 28: Quantificação relativa do RNAm da IL-10 no tecido hepático de acordo com o
grau de estadiamento de fibrose (A) e com os níveis de atividade inflamatória (B) no conjunto
das doenças hepáticas crônicas estudadas.
3.4 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DO RNAm
DA NEUROTROFINA NGF E SEU
RECEPTOR p75NTR EM PACIENTES COM HEPATITE CRÔNICA E NO GRUPO
CONTROLE.
A figura 29A mostra que os níveis de RNAm de NGF foram significativamente
maiores nos pacientes portadores de VHB, de VHC, e de HNV quando comparado ao grupo
controle, o mesmo padrão sendo observado quanto ao nível de expressão do RNAm do
receptor p75NTR (Fig. 29B). Nesse último caso, observou-se uma tendência de aumento
crescente dos níveis do RNAm no sentido VHB, VHC e HNV, sendo essas diferenças
estatísticamente significantes.
72
Figura 29: Quantificação relativa do RNAm da neurotrofina NGF (A e C) e seu receptor
p75NTR (B e D) no tecido hepático dos grupos com VHB, VHC, HNV e do grupo controle e
nos grupos com fibrose sem cirrose e com cirrose hepática de causa viral e não viral.
Quando os níveis de RNAm foram avaliados de acordo com a quadro clínico de
fibrose ou cirrose hepática (Figura 29C e 29D), os níveis de RNAm de NGF foram superiores
no grupo com fibrose sem cirrose quando comparado ao grupo com cirrose hepática (p=0,027
e p=0.040); enquanto que a expressão de p75NTR foi exatamente o inverso, com maior
expressão nos pacientes com cirrose do que o observado no grupo com fibrose sem cirrose
73
hepática, sendo essas diferenças significantes (p=0,031 e p=0.036), independente da origem
viral ou não viral da doença.
Considerando que não houve diferenças significativas nas expressões de NGF e p75
quando consideramos para comparação os grupos com infecção e os não infectados (Fig. 29C
e 29D), agrupou-se todos os indivíduos (VHB, VHC e HNV) para efeito da análise
comparativa dos graus de fibrose e de inflamação hepática e os níveis de expressão de NGF e
p75 (Fig. 30).
Figura 30: Quantificação relativa do RNAm da neurotrofina NGF de acordo com o grau de
estadiamento de fibrose (A) e atividade inflamatória (C) e seu receptor p75NTR de acordo com
o grau de fibrose (B) e atividade inflamatória (D) no conjunto das doenças hepáticas crônicas
estudadas.
74
Em relação ao grau de fibrose o NGF foi mais expresso nos casos de fibrose F1 a F3,
com menor expressão nos grupos F0 e F4 (Fig. 30A). O receptor p75NTR teve níveis de
RNAm menores nos tecidos sem fibrose (F0) com um aumento sequencial e significativo a
partir de fibrose grau F1 até F4 (Fig. 30B).
De acordo com o processo inflamatório, os níveis de RNAm do NGF foram maiores
nos tecidos com grau A0, com decréscimo significativo dos valores no sentido do grau A2
(Fig. 30C). Por outro lado, os níveis do RNAm do receptor p75NTR foram maiores no grupo
com atividades inflamatórias A1 e A2 e menores em tecido hepático sem inflamação (A0)
(Fig. 30D).
Foi observada uma correlação positiva entre a expressão dos RNAm de p75NTR e de
NGF no tecido hepático (Fig. 31A) com fibrose leve e moderada (p<0,0001), entretanto, essa
correlação não foi observada nos tecidos com fibrose grave e cirrose hepática (Fig. 31B).
Figura 31: Correlação dos níveis do RNAm da neurotrofina NGF e seu receptor P75NTR nos
grupos com fibrose leve e moderada (A) e fibrose acentuada e cirrose (B) das hepatites
crônicas estudadas.
75
3.5 ASSOCIAÇÕES DAS EXPRESSÕES GÊNICAS COM OS NÍVEIS PLASMÁTICOS
DAS
ENZIMAS
ALT,
AST,
GGT
E
DO
MARCADOR
TUMORAL
ALFAFETOPROTEINA
Tabela 4 – RQ dos genes estudados com os níveis séricos das enzimas hepáticas.
ALT
ALT
AST
AST
GGT
GGT
Normal
(n=26)
Elevado
(n=17)
Normal
(n=14)
Elevado
(n=29)
Normal
(n=18)
Elevado
(n=25)
FAS
1.44
1.87
0,037
1.00
1,87
0,009
1.22
1.78
0,011
FASL
1.30
1.50
0,020
1.09
1.45
0,032
1.28
1.45
0,065
FOXP3
3,39
7.18
0,025
3.02
5.00
0,042
5.00
4.99
0,250
NGF
0.58
0.77
0,041
0.52
77
0,028
0.80
0.55
0,028
P75NTR
0.82
0.56
0,552
0.77
0.66
0,416
0.62
0.81
0,012
IL-10
0.28
0.30
0.093
0.31
0.24
0,524
0.43
0.19
<0,0001
p*a
p*b
p*c
ALT: alanina aminotransferase (normal: 14 a 55 UI/L); AST: aspartato
aminotransferase (normal: 14 a 32 UI/L); GGT: gamaglutamiltransferase (normal: < 50
UI/L); *Test Mann-Whitney: a p:ALT normal vs. elevada; b p: AST normal vs. elevada; c
p: GGT normal vs. elevada.
Quando analisadas as expressões gênicas (RQ) e as possíveis corrrelações com as
alterações das enzimas hepáticas(Tabela 4), uma associação significativa foi observada entre
os maiores níveis de RNAm dos genes FAS, FAS-L, FOXP3 e NGF com as concentrações
76
elevados de ALT e AST (p=0,037; p=0,020; p=0,025 e p=0,041). Enquanto que as maiores
expressões do receptor p75NTR foram associadas com os níveis normais de ALT e AST, mas
sem significância estatística (p=0,552 e p=0,416). A expressão gênica da IL-10 não mostrou
diferença com relação aos níveis dessas enzimas hepáticas (p=0.093 e p=0,524).
Os genes FAS, FAS-L e p75NTR foram mais expressos no fígado de pacientes com
GGT alterada (p=0,011; p=0,065 e p=0,012) diferente da IL-10 e da neurotrofina NGF que
mostraram maior expressão naqueles com valores de GGT normal (p<0,0001 e p=0,028),
todos com significância estatística. O fator de transcrição FOXP3 não mostrou diferença dos
níveis de expressão do RNAm quanto às concentrações plasmáticas de GGT (p=0,250)
(Tabela 4).
77
4 DISCUSSÃO
Os mecanismos moleculares envolvidos na progressão da lesão hepática crônica até à
cirrose, e em última análise, para o carcinoma hepatocelular, decorrente das infecções pelo
VHB e pelo VHC, continuam a ser discutidos. A persistência da infecção por esses vírus e
consequente inflamação crônica do fígado é caracterizada por uma deficiência da resposta
imunitária mediada por linfócitos T citotóxicos ativados (Bertoletti & Ferrari, 2003), que têm
papel essencial na destruição do VHB e de células infectadas com o VHC, através de diversas
vias, incluindo a produção e síntese de citocinas com ação antiviral, perforina, granzima B e o
sistema Fas/Fas-L que é uma importante via de apoptose no fígado (Suda & Nagata, 1994;
Nagata & Golstein, 1995). Outros estímulos podem causar lesão hepática, como a ingestão de
álcool, a colestase, a esteatose, o abuso de drogas e a autoimunidade, assim a variabilidade
genética viral está sempre interagindo com os fatores ambientais, fazendo com que os danos
no fígado tenham um grandiente de severidade (Voruganti et al., 2010).
A avaliação histopatológica do tecido hepático através da biópsia é considerada a
forma mais especifica de avaliar os danos resultantes da infecção crônica pelos vírus das
hepatites B e C, bem como de outras doenças crônicas, possibilitando a graduação da
atividade necroinflamatória, o estadiamento da fibrose e a detecção de eventuais doenças
associadas (Bedossa et al., 1994).
Neste estudo, a histopatologia do fígado de todos os pacientes mostrou que
predominaram os estágios de fibrose leve ou moderada e a análise de parâmetros histológicos
revelou que o grupo com hepatites não virais deteve os maiores escores de fibrose hepática,
seguidos pelo grupo com hepatites virais C e B, enquanto que no grupo com VHC se
observou os maiores níveis de atividade inflamatória. Esses achados caracterizam a população
deste estudo como portadores de doença hepática pouco agressiva ou de tempo de doença
relativamente curto e em pré-tratamento, dados que corroboram com os estudos de Poynard et
al., (2001).
Sabe-se que a hepatite viral é a causa principal ou secundária da elevação das
enzimas ALT e AST (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005; Chen et al., 2007) e que a
atividade das transaminases é um indicador de lesão hepática tanto nas formas agudas como
nas crônicas (Rehermann & Nascimbeni, 2005). Nos hepatócitos a maior parte da AST está
localizada nas mitocôndrias, enquanto que a ALT se encontra principalmente no citoplasma
(Boyde & Latner, 1961).
78
A GGT é uma enzima microssomal que pode ser isolada a partir do hepatócitos e do
epitélio da vesícula biliar, e seu aumento pode ocorrer em várias doenças do fígado, da
vesícula biliar, do pâncreas, na síndrome metabólica e no diabetes mellitus tipo 2 (Aygün et
al., 2010)
Durante o curso da infecção hepática viral existe uma flutuação na atividade das
transaminases (Kim et al., 2008). No presente estudo foi observado que apesar das variações
nos níveis séricos das enzimas hepáticas ALT e AST as maiores média foram verificadas em
pacientes com HNV, seguidos de VHC e de VHB respectivamente, o mesmo perfil foi
observado para a GGT.
Os resultados do presente estudo estão de acordo com relatos da literatura mostrando
que dentre as hepatites não virais a esteatose hepática tem sido fortemente associada à
atividade da ALT (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005; Chen et al., 2007; Liu et al.,
2005), assim como na hepatite autoimune estudos mostram um nível de ALT
persistentemente baixo associado à melhora do prognóstico (Miyake et al., 2005), além de
uma associação entre a elevação persistente da ALT com a baixa sobrevida desses pacientes
(Miyake et al., 2007). Entretanto, na lesão hepática alcoólica, a atividade da AST é
caracteristicamente elevada em comparação com a atividade da ALT, embora discreta
elevação do nível de ALT seja comum (Sorbi et al., 1999). Isto é, provavelmente, devido à
maior meia-vida de AST mitocondrial liberado em resposta ao álcool e a coexistência de
deficiência de piridoxal-6-fosfato em alcoólatras, que é um cofator para a atividade
enzimática da ALT (Diehl et al., 1984).
Semelhantes aos nossos resultados Alter et al., (1997) mostraram que pacientes
assintomáticos com níveis de RNA-VHC positivos têm elevações de ALT, o mesmo
observado naqueles indivíduos positivo para anticorpos contra o VHC.
Importante enfatizar que todos os pacientes com VHB deste estudo eram HBeAg
soro convertidos e tiveram as menores médias nos valores de ALT, esses resultados
corroboram os de Yuen et al., (2006) que observaram, na soro conversão de pacientes HBeAg
positivo, uma redução dos níveis da atividade da ALT, sugerindo que na hepatite B a ALT é
útil não só para determinar a presença da doença do fígado e a necessidade de tratamento, mas
também para medir o curso da história natural da infecção e predizer a soro conversão do
antígeno HBeAg.
Em todos os grupos estudados a média da ALT foi superior à média da AST, perfil
típico da infecção e doença hepática crônica em fases iniciais e intermediárias (Kim et al.,
2008), o que corresponde ao estadiamento da maioria dos pacientes deste estudo.
79
Quando analisadas as associações das enzimas hepáticas nos pacientes com fígado
normal ou com fibrose ou cirrose, independente da doença hepática, foram observados
maiores valores de ALT em fibrose enquanto que a AST foi mais elevada em pacientes
cirróticos, resultados indicativos de que a extensão da fibrose pode ter influência na medida
dessas enzimas, concordando com outros relatos na literatura em que os valores séricos da
ALT são mais altos do que os da AST nas fases iniciais das hepatites, sugerindo que em
pacientes com hepatite crônica, os valores da AST superiores aos da ALT indicam liberação
adicional de AST das mitocôndrias nos hepatócitos, em consequência de dano hepatocelular
mais grave ou prolongado (Clermont & Chalmers, 1967; Zechini, et al., 2004). Semelhante
aos resultados do presente estudo, Granot et al., (2001) correlacionaram a atividade da ALT
ao escore de fibrose, com redução dos níveis de ALT na fase de cirrose hepática.
É possível que a evolução do dano hepático seja acompanhada por um aumento
progressivo na libertação AST apenas na presença de fibrose ou cirrose grave, uma vez que a
depuração plasmática da AST é modulada pelas células hepáticas sinusoidais e o
desenvolvimento de fibrose ou cirrose pode provocar uma diminuição na função sinusoidal
podendo resultar num aumento da AST adicional (Kamimoto et al., 1985).
Uma associação de altas concentrações de ALT e AST com os maiores níveis de
atividade inflamatória hepática observada neste estudo sugere que os valores elevados das
transaminases pode se correlacionar com parâmetros histológicos de gravidade da doença,
corroborando os resultados de Zechini, et al., (2004).
Diferente dos resultados do presente estudo, Roshan & Guzman (2014) concluíram
que a ALT não é um indicador confiável na associação da inflamação hepática ou fibrose em
pacientes com VHC visto que há uma variação significativa nos níveis da ALT no curso da
infecção.
No presente estudo, uma associação positiva entre o grau de fibrose e os níveis de
atividade inflamatória com os valores elevados de GGT foi observada no conjunto de todas as
doenças hepáticas, a avaliação por doença hepática não foi possível em virtude do tamanho
amostral dos pacientes com VHB. Em estudo recente foi proposto que em pacientes com
hepatite viral crônica, a GGT pode ser utilizada para prever avançada lesão histológica
hepática, especialmente em pacientes com hepatite B (Eminler et al., 2014).
Estudos consideraram a GGT um dos marcadores indiretos da fibrose hepática, tendo
sido incluída no FIBROINDEX desenvolvido por Imbert-Bismut et al., (2001) e validado por
Poynard et al., (2002). A elevação de GGT é atribuída à presença de lesões em ductos biliares
nos portadores de VHC (Giannini et al., 2001). Mossong et al., (2011) correlacionaram
80
positivamente a AST e a GGT com a pontuação METAVIR, seguida por contagem de
plaquetas e alfa2-macroglobulina, em pacientes com VHC.
4.1 EXPRESSÃO DO RNAm DE FAS E DO LIGANTE FAS-L
Dentre os grupos estudados, os pacientes com VHC mostraram maior expressão
intra-hepática do receptor Fas e do ligante Fas-L, com significância em relação aos grupos
HNV e VHB que tiveram os menores níveis de expressão gênica, porém todos os grupos de
pacientes tiveram maior expressão frente ao grupo controle. Resultados que podem estar
relacionados às diferentes estratégias adotadas pelos dois vírus para escapar da resposta imune
e a diferentes estímulos de injuria hepatica não viral.
Na
literatura
evidências
sugerem
que
a
apoptose
de
hepatócitos
está
significativamente envolvida na patogênese do VHC (Fischer et al., 2007; Mankouri et al.,
2009) e vários mecanismos de apoptose tem sido propostos. Alguns estudos demonstraram
que a proteína do core do VHC pode suprimir (Machida et al., 2001), ou induzir a apoptose
(Hahn et al., 2000). Também foram mostrados efeitos apoptóticos das duas proteínas de
envelope E1 (Ciccaglione et al.,2004) e E2 (Zhu et al., 2004), enquanto que as proteínas nãoestruturais (NS) exercem efeito anti-apoptótico (Berg et al., 2009; Chung et al., 2003). Esta
regulação da apoptose pode ser vantajosa para o vírus, a fim de contornar a apoptose
prematura do hepatócito antes que a replicação e a montagem do vírus tenham terminado.
Estudos sobre o VHB têm avaliado o impacto da expressão da proteina HBx sobre a
regulamentação das vias apoptóticas, com resultados contraditórios. A proteína HBx pode
induzir (Kim & Seong, 2003), inibir (Diao et al., 2001) ou não ter qualquer efeito sobre a
apoptose (Yun et al., 2002) em vários contextos celulares. Para explicar o paradoxo entre as
funções pró e antiapoptótica da HBx, foi proposto que ela possa aumentar a replicação viral
precoce após a infecção dos hepatócitos e induzir a apoptose em estágios mais avançados para
facilitar a eficiente libertação de partículas do VHB minimizando as respostas inflamatórias
antivirais (Guidotti & Chisari , 2006; Na et al., 2001; Clippinger et al., (2009).
Talvez nossos resultados em relação à menor expressão desses genes apoptóticos no
grupo com VHB estejam em conformidade com os resultados de Arzberger et al., (2010), que
demonstraram que a indução de apoptose em hepatócitos infectados pelo VHB pode
interromper a propagação do vírus, e que portanto a apoptose seria um poderoso mecanismo
de defesa contra o virus, ao induzir a morte da celula hospedeira. Bem como os resultados de
81
Ehrmann et al., (2000), que sugerem que interacções FAS/FAS-L são importantes não apenas
na geração de danos nos hepatócitos infectados, mas também, potencialmente, na indução de
apoptose em LTC levando à persistência da infecção nos hepatócitos.
Nas hepatites não virais como na doença hepática gordurosa não alcoólica
(DHGNA), a expressão de Fas e a indução de apoptose também aumentam e correlacionam-se
com a gravidade da doença (Feldstein et al., 2003). Da mesma forma, na hepatite alcoólica,
Fas solúvel está aumentada no soro, e no fígado os genes apoptóticos FAS e FAS-L se
correlacionam com a lesão hepática.
Como nenhuma diferença significativa foi observada na expressão de FAS e FAS-L
nas fases da doença de fígado em relação à infecção viral e não viral, consideramos todos os
sujeitos do estudo como um único grupo, em uma tentativa de investigar possíveis relações
entre a expressão desses genes e as alterações histológicas hepáticas. Nossos dados mostraram
um aumento progressivo da expressão do RNAm de FAS e FAS-L com a progressão da
doença hepática, seguido por um declínio para a cirrose, este achado pode ser atribuído a uma
modulação das vias da apoptose durante o curso da infecção. Quando a doença progride a
apoptose é inibida, levando a imortalização das células e ao desenvolvimento de cirrose, com
uma possibilidade crescente de hepatocarcinogenese, especialmente com o aumento da taxa
de proliferação e aquisição de dano genético, corroborando estudos de Zekri et al., (2011) e
Speletas et al., (2011). Diferente dos nossos resultados, foi verificado que o sistema de
expressão de Fas/Fas-L é regulado em tecido hepático cronicamente danificados, porém
atingindo um pico em pacientes com cirrose e um declínio no carcinoma hepatocelular
(Bortolami et al., 2008).
Tem sido relatado que a via extrínseca (Fas-Fas-L) desempenha um papel direto,
importante, em lesões de células do fígado através de infecção viral ou, indiretamente, através
do ataque imunológico às células infectadas com posterior recrutamento e ativação de células
estreladas e macrófagos, resultando em fibrose e cirrose (Feldstein et al., 2003 ).
Vale ressaltar que, no presente estudo, a expressão do ligante FAS-L foi
significativamente maior no escore de fibrose F2 (moderada), onde, também, o maior nível de
inflamação (A2) foi mais frequente (71,43%), justificando-se pelo fato do gene FAS-L exercer
atividades pró-inflamatórias por meio do estímulo à secreção de IL-1β, que é responsável
pela infiltração de neutrófilos, o que justificaria a presença de inflamação grave neste estágio
da doença (Bantel et al., 2001; Bortolami et al., 2008). A este respeito, estudos anteriores
demonstraram que a expressão aumentada do gene FAS-L induz a apoptose de linfócitos T
(Calabrese et al., 2000), o que favorece a persistência viral e, indiretamente, aumenta a
82
probabilidade de progressão para cirrose e carcinoma hepatocelular (Bantel & Schulze, 2003;
Bortolami et al., 2008).
De acordo com nossos resultados, significativas associações foram documentadas
entre as expressões do RNAm de FAS e FAS-L com os níveis de inflamação hepática,
demonstrando que na medida em que se exacerba a inflamação e a fibrose (cirrose) é
estabelecida, a expressão do RNAm desses mediadores de apoptose declina. Este achado pode
ser atribuído à evolução do dano hepático seguido por destruição de hepatócitos e acúmulo de
infiltrado linfocitário. Estes resultados estão em conformidade com vários estudos que têm
claramente mostrado a expressão de FAS e FAS-L nos hepatócitos e em linfócitos T
infiltrados, onde eles ativam sinais apoptóticos (Lee et al., 2001; Ono et al., 2002; Speletas et
al., 2011).
Houve uma correlação positiva entre esses genes apoptóticos com as concentrações
séricas das enzimas hepáticas ALT e AST, sugerindo que o sistema Fas/Fas-L pode ser
essencial na doença hepática crônica, uma vez que a elevação dos níveis de transaminases
reflete a destruição de um grande número dos hepatócitos na hepatite crônica ativa (Clark et
al., 2003).
No entanto, resultados contraditórios existem na literatura sobre a relação desses
genes apoptóticos com a inflamação e com os níveis de ALT. O dano hepático crônico e a
perda de hepatócitos por apoptose podem ocorrer em pacientes infectados com VHC sem
alterações bioquímicas evidentes, explicando a natureza progressiva da doença do fígado que
pode ser visto em indivíduos assintomáticos com transaminases persistentemente normais
(Calabrese et al., 2000; Lee et al., 2001).
4.2 EXPRESSÃO DO RNAm FATOR DE TRANSCRIÇÃO FOXP3
Dentre as populações de células T reguladoras (Treg) estão as Treg naturais,
presentes no hospedeiro antes da exposição ao patógeno, e as Treg induzídas que são as
células que adquirem função reguladora no contexto de uma dada infecção e dentre essas: as
células TR1, que secretam IL-10 e as células TH3, que segregam TGF-β, e que são
convertidas pelo Foxp3+ em células T reguladoras (Sakaguchi, 2005).
Está bem caracterizado que os linfócitos TCD4+ Foxp3+são ativadas por infecções
microbianas, levando a um aumento global de citocinas anti-inflamatórias. O aumento dessas
citocinas induz as funções supressoras de Treg naturais e poderia promover a sua
83
sobrevivência ou a retenção local alterando o equilíbrio entre Treg naturais e linfócitos
efetores, dessa maneira alterando a resposta imune e contribuindo para a progressão da
doença (Sakaguchi, 2005).
As respostas das células periféricas TCD4+ e TCD8+ têm impacto limitado no curso
da doença hepatite pelo VHC e VHB (Billerbeck et al., 2007) entretanto os linfócitos T intrahepáticos parecem controlar a patogênese da doença (Spangenberg et al., 2005). Portanto, a
regulação de respostas de células T intra-hepáticas vírus específicas podem ter importante
implicação não só para determinar a eliminação espontânea do vírus, mas também na
progressão da doença exercendo uma função supressora contra linfocitos T efetores vírus
especificos, sugerindo que a expansão das Treg durante a hepatite viral pode contribuir para
uma inadequada resposta imune que seria responsável por uma infecção viral persistente
(Guidotti & Chisari, 2006).
Ao quantificarmos o RNAm do fator de trancrição FOXP3 em biópsias hepáticas de
pacientes com VHB, VHC e HNV, esses grupos mostraram valores de expressão
significativamente maiores frente ao grupo controle, mas não entre si, evidenciando que a
regulação da imunidade intra-hepática por Treg não é exclusivo nas infecções virais, uma vez
que esse aumento de Treg já foi caracterizado no fígado de pacientes com cirrose biliar
primária ou hepatite autoimune (Lan et al., 2006; Ward et al., 2007; Sakaki et al.,2008).
Os resultados do presente estudo concordam com Ward et al., (2007), Claasen et al.,
(2010), Sturm et al., (2010) e Speletas et al., (2011) evidenciando que as Treg estão
envolvidas na regulação da doença hepática crônica, provavelmente por constituírem uma
parte importante de linfócitos infiltrados nos espaços porta e, também, dentro dos lóbulos
(Ward et al., 2007). Portanto, quando as Treg são altamente ativadas, podem prevenir danos
colaterais hepáticos induzidos por ativação imunitária excessiva, explicando o porquê que na
maioria dos pacientes a patologia do fígado é relativamente leve e apenas progride
lentamente, entretanto, como consequência, não é alcançado um controle imunológico eficaz,
resultando na manutenção da infecção crônica.
Entre os grupos de pacientes a expressão do RNAm do FOXP3 foi menor no grupo
com VHB, embora sem significância estatística. Esse resultado pode estar relacionado ao
perfil virológico desse grupo, como já descrito anteriormente, os quais eram HBeAg
negativos. A esse respeito existem relatos de correlação positiva entre a carga elevada de
VHB-DNA (replicação viral) com uma maior concentração de Treg no fígado, onde o
aumento de estimulação de linfocitos T pelo antígeno HBeAg aumentaria a ocorrência de
84
Treg intra-hepático, demonstrando que a ocorrência de Treg no fígado não exerce controle
sobre a resposta imune local, sobretudo na replicação desse vírus (Stoop et al., 2008).
Os grupos de pacientes com VHC e HNV tiveram as maiores expressões do RNAm
do FOXP3, corroborando com Speletas et al., (2011), que observaram a expressão aumentada
de FOXP3 intra-hepático, caracterizando o acúmulo de Treg no fígado, não só na hepatite
viral, mas também, em grau semelhante, na doença hepática gordurosa não alcoólica, bem
como na hepatite auto-imune, na cirrose biliar primária, e na hepatotoxicidade relacionada
com o metotrexato. Quanto à infecção crônica pelo VHC, estudos têm revelado um aumento
da frequência das Treg no fígado desses pacientes, em comparação com pessoas cuja infecção
pelo VHC foi espontaneamente resolvida ou em controles saudáveis. Sturm et al., (2010)
observaram, por citometria de fluxo e imunohistoquimica, que as Treg intra-hepáticas nos
pacientes com VHC crônica são, principalmente, os linfócitos TCD4+FoxP3+, enquanto que
os linfócitos TCD8+FoxP3+ são mais escassos, o mesmo observado, em biópsia do fígado com
e sem cirrose, por El-Hadii et al., (2012). Langhans et al., (2010) detectaram maior frequência
de Treg CD4+FoxP3+ em pacientes com VHC crônica do que naqueles com infecção autolimitada. Várias possibilidades poderiam explicar o aumento da frequência das Treg Foxp3+
em pacientes com VHC, uma delas seria a indução dessas células por produtos virais (Li et
al., 2007). No entanto, um mecanismo mais provável estaria relacionada às citocinas
reguladoras, como a IL-10 e o TGF-β, que são, caracteristicamente, produzidas em excesso
nos pacientes infectados com VHC (Cabrera et al., 2004).
No presente estudo, os pacientes com cirrose tiveram maior expressão do RNAm do
FOXP3 em relação àqueles com fibrose, tanto de causas viral quanto não viral, apesar dessa
diferença se mostrar significante apenas na população de indivíduos infectados. Ao
agruparmos todos os indivíduos, independente da causa da doença no fígado, a expressão do
RNAm do FOXP3 teve um aumento substancial em associação à intensidade da inflamação e
fibrose hepática. O mesmo foi observado com a expressão do RNAm de FAS e FAS-L, onde a
inflamação induzida por apoptose, também, foi observada significativamente. Ao mesmo
tempo em que foi mostrada uma correlação positiva entre a expressão de Fas e Fas-L com o
fator de transcrição Foxp3.
Ward et al., (2007) também observaram, por imunohistoquímica, que em pacientes
com VHC o número médio de células Foxp3+ se correlacionou fortemente com os escores de
inflamação hepática, embora não tenham encontrado relação com o processo de fibrose.
Sturm et al., (2010) estudaram, por meio de imunohistoquimica, a correlação entre o
grau/estágio da infecção por VHC (Metavir) e os níveis de linfócitos intra-hepáticos, tendo
85
sido observado um número maior de Treg Foxp3+ na fase intermediária da inflamação (A2),
assim como o aumento dessas células acompanhando o desenvolvimento da fibrose e sua
diminuição em relação à cirrose. Esses resultados sugerem que durante as primeiras etapas da
doença, as Treg modulam funções efetoras dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ e, durante a fase
final, em cirrose, quando o ambiente e a arquitetura do fígado são alterados, as Treg já
estariam esgotadas pelo excesso de linfócitos T efetores.
Os resultados do presente estudo corroboram os de Speletas et al., (2011) que
demonstraram, através da quantificação do RNAm do Foxp3 por qPCR em pacientes com
hepatites viral e não viral, que a inflamação persistente no fígado, independentemente da sua
causa, parece representar um dos principais fatores que contribui para a expansão das Treg.
Germanidis et al., (2013) mostraram que no fígado com infecção crônica por VHB a
expressão do RNAm do FOXP3 é regulada nos pacientes em remissão da infecção em
comparação com àqueles diagnosticados com doença ativa e sem qualquer tratamento,
também foi observada uma correlação positiva da expressão do FOXP3 com a intensidade da
inflamação hepática, sugerindo que a fase de expansão inicial da resposta imune adaptativa
contra o vírus é seguida por uma fase de contração, durante a qual as Treg podem
desempenhar um papel importante na manutenção de um equilíbrio entre uma forte resposta
imune para resolver a infecção e as consequências imunopatológicas dessa ativação imune
sustentada e inflamação (Fisicaro et al., 2010).
Resultados diferentes do presente estudo foram observados em uma população com
VHB, onde a frequência de Treg Foxp3+ no fígado não se correlacionou com a ALT, nem
com a inflamação e a fibrose. Sugerindo que nesse caso o aumento de Treg observado,
provavelmente, não resultam de danos no fígado ou da presença de auto-antígeno causada por
essa lesão (Stoop et al., 2008).
Os resultados do presente estudo discordam de Claassen et al., (2010) que
observaram que as Treg FoxP3+ se localizavam, principalmente, no infiltrado hepático de
infectados crônicos pelo VHC, sugerindo que essa ocorrência pode limitar o grau de fibrose e
que as Treg teriam um papel fundamental na diminuição desses efeitos colaterais suprimindo
a ativação imune excessiva induzida pelo VHC, visto que a ALT e a carga viral do VHC não
se correlacionaram com o número de Treg FoxP3+ no fígado, assim como a proporção dessas
células no fígado com fibrose foi menor em comparação com o fígado normal.
Sabe-se que na hepatite crônica um dos mecanismos pelos quais a apoptose promove
a inflamação se relacionam com a ativação dos macrófagos residentes no fígado, as células de
Kupffer (Malhi et al., 2010), que após a fagocitose dos corpos apoptóticos expressam os
86
ligantes de morte, entre eles o Fas-L, capaz de induzir apoptose dos hepatócitos, o que pode
agravar a inflamação, levando as células estreladas hepáticas a um processo de ativação,
produção de TGF-β e mudança fenotípica para miofibroblastos promovendo o
desenvolvimento de fibrose (Canbay et al., 2003).
Talvez a discordância dos resultados do presente estudo com os outros relatados se
deva à metodologia empregada que foi, na maioria, quantificação por imunohistoquimica e
citometria de fluxo, diferente da metodologia utilizada no presente estudo que utilizou a
quantificação, por qPCR, do RNAm do fator de transcrição FOXP3 em biopsias hepática,
mensurando, portanto, a expressão do gene não apenas em linfócitos infiltrados mas em todas
as estruturas celulares que, porventura, favoreçam a expressão desse gene no fígado,
mostramos que a expressão de Foxp3 não se relaciona com a causa da doença hepática mas
com a inflamação resultante no fígado, e que independente do indutor inicial, a inflamação
hepática está correlacionada com a expressão elevada de mediadores de apoptose que é
seguido por acumulo de Treg local. Entretanto à medida que a cirrose é estabelecida a
expressão desses mediadores de apoptose declina mostrando um aumento das Treg nessa fase
da doença. Este achado pode ser atribuído à evolução do dano hepático seguido por destruição
de hepatócitos e acúmulo de infiltrado linfocitário (Speletas et al., 2011). Vale ressaltar que
50% dos pacientes com cirrose tinham níveis mais altos de atividade inflamatória (A2).
No conjunto nossos resultados mostram que não está claro como as Treg podem se
correlacionar com a inflamação e fibrose hepática. Uma possibilidade seria que a IL-10
produzida por Treg inibisse a deposição de matriz de colágeno por células estreladas hepáticas
diminuindo a fibrose (Endharti et al., 2007). Ou que fosse decorrente da secreção de TGF-β,
também produzido por Treg, sendo um fator importante para a sobrevivência local das células
Treg e sua função (Bolacchi et al.,2007; Cabrera et al., 2004). Contudo, essa citocina ativa as
células estreladas hepáticas diminuindo a regeneração de hepatócitos o que favorece a fibrose
(Olaso & Friedman, 1998). Além disso, outras células do fígado produzem constitutivamente
TGF-β, incluindo as células epiteliais sinusoidais (Karrar et al., 2007) e as células de Kupffer
(Meyer et al., 1990), o que indica que o TGF-β produzido a partir de outras células podem
atuar em conjunto com as células estreladas hepáticas na indução de células Treg (Dunham et
al., 2013; Erhardt et al., 2007) o que também justificaria, no presente estudo, a observação da
maior expressão do RNAm do FOXP3 na cirrose.
87
4.3 EXPRESSÃO DO RNAm DA IL- 10
A IL-10 é caracterizada como uma citocina anti-inflamatória e moduladora da
resposta imune, por ser capaz de inibir citocinas do perfil Th1 e, também, por agir como
citocina estimuladora de respostas celulares como as de linfócitos B e T, entre outras,
importantes na prevenção de patologias de cunho inflamatório e auto-imune (Sabat et al.,
2010). Alguns agentes patogênicos podem aproveitar a capacidade imunossupressora da IL-10
para limitar a resposta imune do hospedeiro, conduzindo a infecção persistente (Brooks,
2006).
Apesar dos principais efeitos da IL-10 estar na regulação negativa do processo
inflamatório, no presente estudo a quantificação do RNAm da IL-10 mostrou níveis
significativamente maiores no fígado normal em relação aos doentes crônicos. Esses
resultados são compreendidos por que fisiologicamente o fígado possui um ambiente
tolerogênico, e esse ambiente supressivo se dá, dentre outras razões, pela exposição
constitutiva das células hepáticas a vestígios de endotoxinas e outros produtos de
lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), que resulta na baixa modulação de moléculas coestimuladoras e na síntese de IL-10 pelas células de Kupffer e células endoteliais sinusoidais
(Crispe, 2009). Devido ao elevado limiar para a iniciação de uma resposta adaptativa de
células T no fígado, os mecanismos da imunidade inata assumem maior importância, e alguns
patógenos humanos como o VHB e o VHC exploram o ambiente hepático, alteram a
imunidade e estabelecem a infecção persistente (Liu et al., 2000). A inversão desse padrão de
tolerância hepática acontece quando os interferons tipo 1 α/β ativam uma cascata de citocinas
e quimiocinas que recrutam células T em resposta à infecção viral (Liu et al.,2000). Os IFNs
do tipo 1 induzem a síntese de IL-15, que promove a sobrevivência de células TCD8+ (Mattei,
et al., 2001). Assim, a síntese de IFN de tipo 1 pode ser um evento importante que supera a
tolerância do fígado e permite que prossiga uma resposta de células T intra-hepática.
A maioria dos pacientes estudados se encontrava na fase inicial da doença crônica,
que sugere um perfil semelhante ao observado por MacDonald et al., (2002), em uma coorte
de mulheres com infecção persistente por VHC, onde as células TCD4+ secretavam IFN-γ e
IL-10 em resposta à proteína do núcleo, demonstrando que células TCD4+ e Treg são
induzidas contra os mesmos epítopos da proteína do núcleo durante a infecção pelo VHC.
Adicionalmente, o estudo de Chang et al., (2007) mostrou que no figado de portadores
crônicos do VHB, apesar da produção de IL-10 pelos linfócitos TCD8+, as células TCD4+
88
produziram TNF-α, e a produção desta citocina pró-inflamatoria foi significativamente
associada com as lesões hepática.
Dentre os pacientes estudados, o grupo com HNV mostrou níveis significativamente
menores de expressão do RNAm da IL-10 frente aos grupos com hepatites virais, quando
comparado ao VHB, que deteve as maiores expressões desse gene. Corroborando com relatos
na literatura de que nas doenças hepáticas não virais como a esteatose e a NASH, uma
diminuição na produção da IL-10 torna-se mais proeminente durante a progressão da doença
juntamente com o aumento de TNF-α, que acelera a síntese hepática de outras citocinas
inflamatórias, aumentando a quimiotaxia de neutrófilos e conduzindo a uma resposta
inflamatória grave, o que resulta em hepatoesteatose e necrose no fígado, mostrando uma
correlação negativa altamente significativa entre TNF-α e IL-10 na progressão da doença
hepática (Rolo et al.,2012; Straczkowski et al.,2005). A deficiência ou expressão anormal de
IL-10 também conduz ao desenvolvimento de doença hepática autoimune (Sellon et al.,
1998).
Outros estudos mostraram que nas hepatites B e C os níveis elevados da IL-10 se
correlacionam com a atividade diminuída de células T e a incapacidade dessas celulas em
controlar a replicação viral, enfatizando o importante papel do esgotamento das células T na
potencialização da persistência viral. Sugerindo que o desfecho da resposta imune para a
prevenção dessa persistência não é ditada pelos níveis inicialmente elevados da replicação
viral, mas, pelo contrário, uma infecção generalizada pode ser rapidamente contida pela
manutenção da atividade das células T (Missale et al., 1996; Rico et a., 2001; Rigopoulou et
al., 2005).
Entretanto, sabe-se que nas infecções virais crônicas com baixa carga de antígeno, as
células TCD8+ são capazes de produzir IFN-γ, TNF-α e IL-2, além de possuir uma função
citolítica e proliferativa. No entanto, com o aumento da carga de antígenio, tal como nas
infecções pelo HIV-1 ou VHC, a capacidade para produzir citocinas em resposta a antígenos
virais é progressivamente perdida começando com a IL-2, seguida pelo TNF-α e, finalmente,
com o IFN-γ (Muhlbauer et al., 2006).
A analise da expressão do RNAm da IL-10 nos diferentes estágios da doença,
segundo a classificação de METAVIR, revelou maiores níveis do RNAm da IL-10 nos três
grupos de pacientes que se apresentaram sem fibrose e sem inflamação hepática, evidenciando
a associação dessa citocina com a persistência viral e o seu papel imunossupressor nas fases
iniciais das infecções virais.
89
O mecanismo imunossupressor da IL-10 no fígado acontece quando os antígenos
solúveis que passam através dos sinusóides são absorvidos pelas células endoteliais
sinusoidais e apresentados para ambas as células TCD8+ e TCD4+, que são induzidas à
proliferação, mas não conseguem manter a secreção de IL-2 e IFN-γ (Knolle et al., 1999). As
células TCD8 que são ativadas por células endoteliais sinusoidais não conseguem se
diferenciar em células citotóxicas efetoras, ao passo que as células TCD4+
podem se
diferenciar para um fenótipo anti-inflamatório, secretora de IL-4 e IL-10 (Knolle et al., 1999).
Os padrões diferentes na produção de citocinas entre os individuos depuradores e persistentes
virais demonstram que a magnitude e o tipo de citocina produzida precocemente são críticos
na determinação da infecção (Wherry, 2011).
Entre os pacientes com fibrose hepática estabelecida os maiores valores de expressão
da IL-10 foram observados no escore inicial da lesão (F1), com associação negativa dessa
citocina com a evolução da doença até a fase de cirrose, o mesmo padrão foi observado com
os níveis de atividade inflamatória, caracterizando a IL-10 como inibidora da ação do INF-γ e
do TNF-α (Zhang & Wang, 2006), caracterizando o perfil dos pacientes com o escore F2 de
fibrose que detiveram os maiores níveis de inflamação hepática, o que justificaria os menores
níveis do RNAm da IL-10 frente aos demais escores.
Nossos resultados estão de acordo com os de Flynn
et al., (2011), onde os
indivíduos com uma forte resposta imune de perfil Th1 eliminaram a infecção pelo VHC na
ausência relativa de IL-10. Em contraste, aqueles que desenvolveram a infecção crônica
tiveram uma magnitude de produção precoce e alta de IL-10 na ausência relativa de IFN-γ.
Assim, a capacidade de IL-10 para inibir a produção de citocinas Th1 e apresentação de
antígenos, que afetam a ativação e manutenção das respostas imunitárias celulares e o
equilíbrio da produção de citocinas parece ser uma característica essencial para promover a
persistência do vírus. Estudos em pacientes crônicos com VHC, que não respondiam à terapia
com interferon, a administração de IL-10 normalizou os níveis séricos de ALT, melhorou a
histologia do fígado e reduziu a fibrose hepática, embora sem atividade antiviral aparente,
sugerindo que a IL-10 pode ter potencial terapêutico nesses casos (Nelson et al., 2003).
Brooks et al., (2006), mostraram, em camundongos com infecção viral persistente,
que o aumento de IL-10 leva à respostas de células T deficientes. E que em camundongos
“knockou”t para o receptor de IL10 a resposta de células T efetoras foi restabelecida,
promovendo a eliminação rápida do vírus e o desenvolvimento de respostas das células T de
memória antiviral. Esses resultados gugerem que o bloqueio do receptor de IL-10, no inicio
da infecção, restaura a função da célula T, evitando a evolução da doença.
90
Durante a progressão fibrótica, a inflamação e a lesão hepática ativam eventos
celulares que resultam em deposição de colágeno e na ruptura da arquitetura normal do fígado
onde a célula estrelada hepática ativada (CEH) é importante na produção de colágeno (Malhi
et a., 2010). Sabe-se que a IL-10 inibe a ação do INF-γ e TNF-α, controla a fibrogênese por
meio da supressão das CEH mediada pela ação do TGF-β1 (Nelson et al., 2003), agindo
diretamente sobre a produção de colágeno e de colagenases, regulando a remodelação da
matriz extracelular (Louis et al., 2003).
Neste contexto, observamos que nos estágios finais da doença hepática crônica, onde
o fígado está em processo de cirrotização ou já em cirrose, com os maiores níveis da enzima
hepática GGT, os valores da expressão gênica da IL-10 foram similares entre si, mas
significativamente menores do que os observados nas fases iniciais da lesão hepática.
Nossos resultados corroboram com relatos da literatura que demonstram o papel
antifibrótico e antifibrogênico da IL-10 nas lesões hepáticas. Wang et al., (1998) mostraram
os níveis do RNAm da IL-10 aumentados na fase inicial da fibrose, desaparecendo na fibrose
hepática avançada, sugerindo que a IL-10 liberada por CEH suprime a produção de colágeno,
através de um papel autorregulador negativo na indução da colagenase durante a fase precoce
da fibrose hepática, por outro lado, a falta de expressão da IL-10 pelas CEH em associação
com a indução de colágeno leva a fibrose hepática avançada.
Experiências in vitro
demonstraram que as CEH expressam IL-10 e seu receptor (Pinzani et al., 2001), e que essa
citocina desempenha um papel importante na fibrose hepática, suprimindo a função das HSC
e promovendo sua apoptose (Thompson et al., 1998).
Vale ressaltar que o TGF-β é considerado uma citocina fibrogênica potente, capaz de
conferir às CEH a maioria dos aspectos da ativação celular (Louis et al., 2003), podendo ser
liberada por macrófagos hepáticos ou pelas próprias CEH com capacidade para autoinduzir
sua expressão (Malhi et al., 2010). Assim, esta dissociação de expressão da IL-10 e do TGF-β
pelas CEH sugere a existência de uma regulação complexa dessas citocinas inibidoras na
evolução da doença hepática (Malhi et al., 2010).
Na doença alcoólica do fígado humano ou experimental, a produção defeituosa de
IL-10 pode resultar na doença hepática crônica, sugerindo que a IL-10 pode ser de valor
terapêutico na hepatite alcoólica, diminuindo a destruição dos hepatócitos (Hill et al., 2006).
No modelo de lesão crônica do fígado induzida por CCl4, animais deficientes de IL-10
tiveram um aumento persistente de infiltrado inflamatório, e desenvolveram uma fibrose mais
extensa do que os animais capazes de produzir IL-10, indicando que essa citocina está
91
envolvida no controle da fibrogênese (Zhang et al., 2004; Thompson et al., 1998; Wang et al.,
2003).
Zahran et al., (2013) mostraram que o TNF-α está aumentado na progressão da
esteatose hepática com diminuição da IL-10 na fibrose. Em lesão experimental, o tratamento
com a IL-10 pode reduzir significativamente a expressão do RNAm de TNF-α no fígado
(Braunersreuther et al., 2012). Estes resultados sugerem que a IL-10 elevada limita os efeitos
da resposta inflamatória, por contra-regulação, de modo que a função protetora da IL-10 no
fígado esteatótico está na supressão da produção de TNF-α, com capacidade de regular a lesão
hepática in vivo (Hashem et al., 2008).
Além disso, em ambas as infecções por VHC e VHB, os polimorfismos específicos
da IL-10 foram correlacionados com um aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento da
infecção crônica (VHC) e com o aumento da gravidade da infecção crônica (VHB),
respectivamente (Miyazoe et al., 2002; Knapp et a,., 2003; Persico et al., 2006).
Um estudo regional encontrou níveis séricos de IL-10 diminuídos nos indivíduos
infectados pelo VHB quando comparados a indivíduos saudáveis (Conde et al., 2013).
Em conjunto, nossos resultados mostram que o ambiente hepático tolerogênico onde
existe uma expressão constitutiva das citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β que,
principalmente, induzem tolerância de linfócitos infiltrados no fígado (You et al., 2008) e
levam a uma capacidade proliferativa diminuída com perda de funções efetoras antivirais de
células TCD8+ específicas do VHB e do VHC, favorecem a cronicidade e o agravamento da
doença hepática (Maini & Schurichl, 2010) e que a presença de IL-10 no fígado pode ter um
papel importante na redução da imunopatogênese, mas as custa de persistência viral.
4.4 EXPRESSÃO DO RNAm DO NGF E DO RECEPTOR p75
No presente estudo, observamos que a quantificação, no tecido hepático, dos níveis
do RNAm de NGF e do receptor p75NTR em portadores crônicos do VHB, VHC e HNV,
foram, significativamente, maiores quando comparados com biópsias de fígado normal.
Nossos resultados discordam, parcialmente, de estudos in vitro e com fibrose hepática
induzida de forma experimental (Oakley et al., 2003; Passino et al., 2007; Asai et al., 2006),
os quais mostraram a expressão desses genes somente no tecido hepático fibroso ou após
hepatectomia parcial. Nossos resultados corroboram os achados de Trim et al., (2000) e
92
Kendall et al., (2009), que por imunohistoquímica, em fígado normal, observaram células
perissinusoidais com morfologia consistente com células estreladas hepáticas (CEH) e
positivas para p75.
Os resultados do presente estudo mostra que nos indivíduos com fibrose hepática,
sem cirrose, houve uma maior quantificação do RNAm de NGF quando comparado ao grupo
com cirrose hepática, sugerindo que o NGF é expresso pelos hepatócitos em estado de
regeneração e proliferação, ao mesmo tempo em que fica claro os menores níveis de RNAm
de NGF no fígado cirrótico onde esse processo regenerativo está diminuído ou ausente (Taub,
2004; Bataller & Brenner, 2001). Inversamente ao NGF, evidenciamos maiores níveis de
expressão do RNAm do receptor p75NTR nos indivíduos com cirrose hepática em relação aos
pacientes somente com fibrose, estando a expressão do receptor p75 relacionada com a
reatividade das CEH ativadas (Pinzani, 1995), o que foi semelhante a outros estudos in vitro
com fibrose experimental (Trim et al., 2000; Oakley et al., 2003; Passino et a., 2007; Asai
et a,., 2006; Kendall et al., 2009).
Como esperado, houve uma associação dos maiores níveis de expressão do RNAm
do NGF com concentrações séricas elevadas de ALT e normais de GGT, enquanto que o
receptor p75NTR foi mais expresso em associação com as altas concentrações de GGT. Em
lesão hepatocelular crônica a ALT é mais comumente elevada, no entanto, com a progressão
para fibrose, a atividade da ALT tipicamente diminui (Williams & Hoofnagle, 1988; Sheth et
al., 1998). Embora alguns pacientes com enzimas hepáticas normais tivessem fibrose
acentuada ou até mesmo cirrose, a grande maioria deles tinha uma doença hepática moderada
por infecção pelo VHC.
Uma característica comum à população deste estudo foi a lesão hepática crônica,
com ausência de qualquer terapia medicamentosa prévia, onde avaliamos, em conjunto, os
níveis de expressão do RNAm de NGF e de p75NTR em relação aos graus de fibrose e
atividade inflamatória hepática, evidenciando a associação da expressão desses dois genes
com a progressão da lesão hepática. No primeiro estágio de fibrose e inflamação hepática
(F1/A1) foram, significativamente, maiores os níveis de RNAm de NGF do que nas demais
fases da lesão hepática, e em menores níveis o receptor p75NTR. Nos estágios iniciais da
fibrose do fígado, a ativação das CEH humanas mediadas pelo receptor de neurotrofina
p75NTR estimula a liberação de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento dos
hepatócitos (FCH), estimulando a regeneração e proliferação dos hepatócitos(Bataller &
Brenner, 2001; Uyama et al., 2002).
93
Observamos um aumento progressivo dos níveis do RNAm p75NTR diretamente com
a progressão da fibrose até a cirrose hepática, demonstrando que as CEH ativadas, mediadas
pela expressão do receptor p75NTR, podem mediar tanto o inicio como a cessação da
regeneração hepática. Nas fases iniciais da regeneração hepática, as CEH ativadas contém
altos níveis de FCH e este fator de crescimento fortemente mitogênico pode substituir os
efeitos do TGF-β1 que é o maior fator antiproliferativo dos hepatócitos, produzidos por estas
células (Oakley et al., 2009). Em contraste, nas fases terminais da cicatrização do fígado,
CEH ativadas produzem níveis elevados de TGF-β1 fazendo com que se inicie um ciclo de
sinalização autócrina que perpetua a ativação das CEH transformando-se em uma barreira
para a regeneração do fígado (Oakley et a,., 2009).
Diferente do presente estudo, alguns resultados com lesões experimentais induzidas
por tetracloreto de carbono (CCl4) e estudos in vitro, sugerem fortemente o papel próapoptótico do NGF, regulando diretamente a apoptose das CEH ativadas, mediadas pelo
receptor p75NTR, o que representaria um fator potencial determinante na resolução fibrose
hepática. Entretanto, esses resultados estão bem caracterizados somente em lesões
autolimitadas (Oakley et al., 2003). Foi observada uma correlação positiva da expressão do
receptor p75NTR com o NGF nas fases iniciais da fibrose hepática, caracterizando uma
provável ação parácrina das CEH ativadas mediadas pelo receptor p75 NTR na regeneração
compensatória dos hepatócitos via NGF, mas que, no entanto, nas condições de fibrose severa
e cirrose hepática essa associação não se sustentou. Novo et al., (2006) caracterizou em fígado
de pacientes com cirrose pelo VHC, que as CEH ativadas, são resistentes à maioria dos
estímulos pró-apoptoticos, inclusive à neurotrofina NGF, devido à superexpressão do
marcador anti-apoptótico
Bcl-2, presente no tecido hepático e esta característica pode
desempenhar um papel fundamental na progressão da fibrose em doenças crônicas do fígado
(Novo et al., 2006).
Por isso, acreditamos que pelo perfil da população estudada, nossos resultados de
expressão gênica, também, sejam produtos de outros estímulos no fígado lesado pela
persistência viral do VHC, VHB e outras infecções crônicas, uma vez que as CEH expressam
receptores para o VHC, como o CD80 e o receptor de LDL possibilitando o aumento da taxa
de infecção viral, e que a expressão de proteínas não estruturais e proteínas do núcleo do VHC
induzem a proliferação de células estreladas e a liberação de sinais inflamatórios (Bataller et
al., 2004; Shin et al., 2005). Na doença hepática gordurosa não alcoólica, as adipocinas
podem mediar a fibrogênese hepática (London & George, 2007; Ikejima et al., 2007),
especificamente, a leptina, um hormônio circulante adipogênico, que promove fibrogenese
94
nas CEH (Ikejima et al., 2002; Lin et al., 2006; Leclercqet al., 2002). Igualmente importante
para o desenvolvimento da fibrose hepática é a resistência à insulina, que por si só, está
relacionada com a esteatose (Kamada et al., 2003; Lonardo et al., 2004) e o estresse
oxidativo, associado com metabolismo do etanol, é um importante estímulo para a
fibrogênese hepática (Parola et a,.,2001).
Os resultados do presente estudo demonstram que no curso da doença hepática
crônica, na população estudada, existe uma regulação negativa das CEH ativadas mediadas
pelo receptor p75NTR inibindo a proliferação dos hepatócitos, que podem ser moduladas por
componentes virais e não virais sustentados pela persistência da agressão ao fígado. O grau de
fibrose histológica é um importante marcador da etapa da doença (Bedossa, 1994; Poynard et
al., 2003) porque a história natural da hepatite C e B envolve a progressão gradual da fibrose
hepática que pode, eventualmente, levar a cirrose, onde ocorre a maior parte das complicações
relacionadas (Mita et al., 1994). Nesse contexto, o conhecimento individual dos níveis de
expressão do receptor p75NTR valeria como um potente marcador de progressão da fibrose
hepática, ao mesmo tempo em que entendemos que seria necessário conhecer os mecanismos
da expressão gênica dessa neurotrofina e seu receptor posteriormente a terapias antivirais já
estabelecidas.
Como a progressão da doença hepática fibrótica é multifatorial, consequência da
excessiva ativação imunitária no fígado através de mecanismos de indução e de regulação
negativa que podem influenciar simultaneamente na imunopatologia e dificultar a eliminação
viral, mais estudos se fazem necessários para o entendimento da lesão hepática crônica, bem
como para o desenvolvimento de terapias antifibróticas.
95
5. CONCLUSÕES
Com base na casuística estudada, conclui-se que:

A histopatologia do fígado revelou estágios iniciais de fibrose, caracterizando o grupo
com doença hepática pouco agressiva;

As menores médias de ALT foram identificadas nos pacientes com VHB, que eram
HBeAg negativos e com alterações histopatológicas leves;

As alterações das enzimas hepáticas ALT, AST e GGT foram relacionadas com as
alterações histológicas, independentes da causa inicial da lesão;

A extensão da fibrose pode ter influência na atividade das ALT, AST e GGT e o aumento
de AST e GGT seria consequência do dano hepatocelular mais grave ou prolongado;

O aumento da expressão do RNAm dos marcadores apoptóticos FAS e FAS-L pelas
células hepáticas foi associada com a inflamação e fibrose, apresentando declínio na
evolução para a cirrose;

A correlação positiva da expressão do RNAm de Fas e Fas-L com a elevação das
transaminases, reflete a destruição hepatocelular e a importância da apoptose na
patogênese da hepatite crônica ativa;

O aumento da expressão do RNAm do FOXP3 em todos os pacientes demonstra que a
regulação da imunidade intra-hepática por células Treg não é exclusiva das infecções
virais;

A inflamação hepática foi associada ao aumento da expressão do RNAm de FAS e FAS-L
concomitantemente com a elevação da expressão do RNAm do FOXP3, caracterizando
uma regulação de resposta Treg local, independente da causa da hepatite;

Na cirrose a expressão do RNAm de FAS e FAS-L declinou com um aumento do Foxp3,
sugerindo que a evolução a hepatite é seguida por destruição dos hepatócitos e acúmulo
de infiltrado de células Treg;
96

Os maiores níveis do RNAm da IL-10 no fígado normal em relação aos pacientes, sugere
que na fase inicial da hepatite crônica haja um menor controle da resposta antiinflamatória;

A menor expressão do RNAm da IL-10 no grupo com HNV, com aumento da atividade
inflamatória (A2), sugere pouco controle dessa citocina na evolução das doenças
hepáticas não virais;

A maior expressão do RNAm da IL-10 foi observada no grupo com VHB, sugerindo que
em pacientes HBeAg negativo o aumento dessa citocina está associado com os baixos
níveis de ALT e de inflamação hepática;

A maior expressão da IL-10 em F0 sugere que a imunossupressão, na fase inicial da
doença, induz a tolerância de LT infiltrados no fígado, diminuindo a proliferação e as
funções efetoras antivirais, levando à cronicidade e ao agravamento da doença hepática;

O aumento nos níveis do RNAm da IL-10 na fase inicial da fibrose, e seu declínio na fase
de cirrose, sugere o papel imunossupressor e antifibrogênico dessa citocina;

O RNAm do NGF e do receptor p75NTR é expresso constitutivamente tanto no fígado
normal quanto naqueles com alterações histológicas;

O NGF é mais expresso pelo tecido hepático em estado de regeneração e proliferação,
porém com redução nos casos de cirrosse, onde os processos de regeneração e
proliferação estão diminuídos ou ausentes;

A expressão do receptor p75NTR pode estar relacionada com a reatividade das CEH
ativadas, visto que foi mais expresso nos indivíduos com cirrose hepática

Os níveis de expressão do receptor p75NTR podem ser usados como um potente marcador
de progressão da fibrose hepática.
97
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS L. K., LICHTMAN A. H., Pillai S. Imunologia Celular e Molecular, 7ª Ed.
Elsevier, p. 327 e 330, 2012.
AFFORD S.C, RANDHAWA S., ELIOPOULOS A.G. CD40 activation induces apoptosis in
cultured human hepatocytes via induction of cell surface fas ligand expression and
amplifies fas-mediated hepatocyte death during allograft rejection. The Journal of
Experimental Medicine 189: 441-6, 1999.
ALATRAKCHI N., KOZIEL M. Regulatory T cells and viral liver disease. Journal of Viral
Hepatitis 16: 223 –229; 2009.
ALTER H.J., CONRY‐CANTILENA C., MELPOLDER J., TAN D., VAN RADEN M.,
HERION D., LAU D., HOOFNAGLE J.H. Hepatitis C in asymptomatic blood donors.
Hepatology 26(S3): 29S-33S, 1997.
ALTER H.J., PURCELL R.H., GERIN J.L., LONDON W.T., KAPLAN P.M., MCAULIFFE
V.J., WAGNER J., HOLLAND P.V. Transmission of hepatitis B to chimpanzees by
hepatitis B surface antigen-positive saliva and semen. Infection and Immunity 16: 928933, 1977.
ALTER M.J. Epidemiology of hepatitis
Gastroenterology 13: 2436-41, 2007.
C
virus
infections.
World
Journal
ALTER M.J. Epidemiology of hepatitis
C
virus
infections.
World
Journal
ARZBERGER S., HÖSEL M., PROTZER U. Apoptosis of Hepatitis B Virus-Infected
Hepatocytes Prevents Release of Infectious Virus. Journal of Virology 84 (22): 1199412001, 2010.
ASAI K., TAMAKAWA S., YAMAMOTO M., YOSHIE M., TOKUSASHI Y.,
YAGINUMA Y., KASAI S., OGAWA K. (2006) Activated hepatic stellate cells overexpress p75NTR after partial hepatectomy and undergo apoptosis on nerve growth factor
stimulation. Liver International 26: 595–603.
AYGÜN C., GÖZEL N., DEMIREL U. Kronik viral hepatit B tanisi olan hastalarda serum
GGT düzeyi ile karaciğer fibrozu ilişkisi. Fırat Medical Journal 15: 74-78, 2010.
AYRES M., AYRES JÚNIOR M., AYRES D.L., SANTOS, A.S. BioEstat 5.0: aplicações
estatísticas nas áreas de ciências biológicas e médicas. Belém: Sociedade Civil
Mamirauá; Brasília: CNPq,. 272p, 2008.
BACCHETTA R., GAMBINERI E., RONCAROLO M.G. Role of regulatory T cells and
FOXP3 in human diseases. Journal Allergy Clinical Immunology 120(2): 227-35;
2007.
BANCROFT W.H., MUNDON F.K., RUSSELL P,K. Detection of additional antigenic
determinants of hepatitis B antigen. Journal Immunology 109: 842-848, 1972.
98
BANTEL H., LUGERING A., POREMBA C., LUGERING N., HELD J., DOMSCHKE W.,
SCHULZE-OSTHOFF K. Caspase activation correlates with the degree ofinflammatory
liver injury in chronic hepatitis C virus infection. Hepatology 34: 758-767, 2001.
BANTEL H., SCHULZE-OSTHOFF K. Apoptosis in hepatitis C virus infection. Cell Death
and Differentiation 10(1): S48-5, 2003.
BARBACID, M. Nerve growth factor: a tale of two receptors. Oncogene 8: 2033-2042,
1993.
BARRAT FJ, CUA DJ, BOONSTRA A, RICHARDS DF, CRAIN C, SAVELKOUL H,
DEWAAL MALEFYT R, COFFMAN RL, HAWRYLOWICZ CM. In vitro generation
of IL-10-producing regulatory CD4+ T cells is induced by immunosuppressive drugs and
inhibited by T helper type 1 and Th2 inducing cytokines. Journal Experimental
Medicine 195: 603-616, 2002.
BARTENSCHLAGER R., LOHMANN V. Replication of hepatitis C virus. Journal of
General Virology 81:, 1631–1648, 2000.
BATALLER R., BRENNER D. A. Hepatic stellate cells as a target for the treatment of liver
fibrosis. Seminars in Liver Disease 21: 437-51, 2001.
BATALLER R., PAIK Y.H., LINDQUIST J.N. Hepatitis C virus core and nonstructural
proteins induce fibrogenic effects in hepatic stellate cells. Gastroenterology 126: 529 –
540, 2004.
BAUMERT T.F., THIMME R., von WEIZSÄCKER F. Pathogenesis of hepatitis B virus
infection. World Journal of Gastroenterology 13(1): 82-90, 2007.
BAYER M.E., BLUMBERG B.S., WERNER B. Particles associated with Australian
antigen in the sera of patients with leukemia, Down’s syndrome and hepatitis.
Nature 218: 1057-1059, 1968.
BEDOSSA P. Intraobserver and Interobserver Variations in Liver Biopsy Interpretation in
Patients with Chronic Hepatitis C. Hepatology 20(1): 15–20, 1994
BEDOSSA P., POYNARD T. An Algorithm for the Grading of Activity in Chronic Hepatitis
C. Hepatology 24: 2, 1996.
BECK, J. & NASSAL, M. Hepatitis B virus replication. World Journal of
Gastroenterology, 13(1): 48-64, 2007.
BELTRAMI E.M., WILLIAMS I.T., SHAPIRO C.N., CHAMBERLAND M.E. Risk and
management of blood-borne infections in health care workers. Clin Microbiol Rev 13:
385-407, 2000.
BENYON R. C., IREDALE J. P. (2000) Is liver fibrosis reversible? Gut. 46: 443–446.
BERTOLETTI A., FERRARI C. Kinetics of the immune response during HBV and HCV
infection. Hepatology 38(1): 4–13, 2003.
BERTOLETTI A., GEHRING A.J. The immune response during hepatitis B virus infection.
Journal of General Virology 87: 1439–1449, 2006.
99
BILLERBECK E., BÖTTLER T., THIMME R. Regulatory T cells in viral hepatitis. World
Journal Gastroenterology 13(36): 4858-4864; 2007.
BIWAS R., TABOR E., HSIA C.C, WRIGHT D.J., LAYCOCK M.E, FIEBIG E.W,
PEDDADA L., SMITH R., SCHREIBER G.B., EPSTEIN J.S, NEMO G.J, M.P. Busch
Comparative sensitivity of HBV NATs and HBsAg assays for detection of acute HBV
infection. Transfusion 43: 788–798, 2003.
BJERRE, B. O.; BJORKLUND, A.; EDWARDS, C. Axonal regeneration of peripheral
adrenergic neurons: effects of antiserum to nerve growth factor in mouse. Cell Tissue
Res. 148: 441:476, 1974.
BLUMBERG B.S., ALTER H.J., VISNICH S. A new antigen in leukemia sera. JAMA 191:
541-546, 1965.
BOETTLER T., SPANGENBERG H.C., NEUMANN-HAEFELIN C., PANTHER E.,
URBANI S., FERRARI C., BLUM H.E., VON WEIZSACKER F., THIMME R. T cells
with a CD4+CD25+ regulatory phenotype suppress in vitro proliferation of virus-specific
CD8+ T cells during chronic hepatitis C virus infection. Journal Virology 79: 78607867, 2005.
BOLACCHI F., SINISTRO A., CIAPRINI C., DEMIN F., CAPOZZI M., CARDUCCI F.C.,
DRAPEAU C.M., ROCCHI G., BERGAMINI A. Increased hepatitis C virus (HCV)specific CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes and reduced HCV-specific CD4+ T cell
response in HCV-infected patients with normal versus abnormal alanine aminotransferase
levels. Clinical Experience Immunology 144: 188-196, 2006.
BORTOLAMI M., KOTSAFTI A., CARDIN R., FARINATI F. Fas ⁄ FasL system, IL-1b
expression and apoptosis in chronic HBV and HCV liver disease. Journal of Viral
Hepatitis 15: 515–522, 2008.
BOYDE T.R.C., LATNER A.R. Starchgel electrophoresis of transaminase in human tissue
extracts and sera. Biochemistry Journal 82: 51, 1961.
BRASIL. Ministerio da Saude. Secretaria de Vigilancia em Saude. Departamento de
Vigilancia Epidemiologica. Hepatites virais: o Brasil esta atento, 3 ed. Brasilia,2008.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Hepatite B, 2010.
Disponível em: < http://portal.saude.gov.br/portal/saude >.
BRASIL. Ministerio da saúde. Secretaria de Vigilancia em Saúde Departamento de DST,
Aids e Hepatites Virais. Protocolo Clinico e Diretrizes Terapeuticas para o
Tratamento da Hepatite Viral Cronica B e Coinfeccoes. 1a edicao – 2a tiragem –
2011.
BRASIL. Ministério da Saúde - Secretaria de Vigilância em Saúde - Departamento de DST,
Aids e Hepatites Virais. Boletim Epidemiológico – Hepatites Virais Ano III - nº 1,
2012.
BRAUNERSREUTHER V., VIVIANI G.L., MACH F., MONTECUCCO F. Role of
cytokines and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease. The World Journal
Gastroenterology 18(8): 727–735, 2012.
100
BROOKS, D.G., TRIFILO M.J, EDELMANN K.H., TEYTON L., MCGAVERN D.B.,
OLDSTONE M.B. Interleukin-10 determines viral clearance or persistence in vivo.
Nature Medicine 12: (11): 1309-13, 2006.
BROWN S.B., SAVILL J. Phantígenoocytosis triggers macrophantígenoe release of Fas
ligand and induces apoptosis of bystander leukocytes. The Journal of Immunology
162(1): 480-5, 1999.
BRUNKOW M.E., JEFFERY E.W., HJERRILD K.A., PAEPER B., CLARK L.B.,
YASAYKO S.A., WILKINSON J.E., GALAS D., ZIEGLER S. F., RAMSDELL F.
Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal
lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nature Genetic. 27 (1): 68–73, 2001.
BURLACU A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins. Journal of Cellular and
Molecular Medicine 7(3): 249–257, 2003.
CABOT B., MARTELL M., ESTEBAN J. I.1 PIRON M., OTERO T., ESTEBAN R.,
GUARDIA J., GÓMEZ J. Longitudinal Evaluation of the Structure of Replicating and
Circulating Hepatitis C Virus Quasispecies in Nonprogressive Chronic Hepatitis C
Patients. Journal Virology 5 (24): 12005-12013, 2001.
CABRERA R, TU Z, XU Y, FIRPI RJ, ROSEN HR, LIU C. An immunomodulatory role for
CD4+CD25+ regulatory T-lymphocytes in hepatitis C virus infection. Hepatology 40:
1062–1071, 2004.
CAMPBELL D.J., ZIEGLER S.F. FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties
of regulatory T cells. Nature Review Immunology 7(4): 305-10. 2007.
CAMPIOTTO S., PINHO J.R.R., CARRILHO F.J., SILVA L.C., SOUTO F.J.D., SPINELLI
V., PEREIRA L.M.M.B., COELHO H.S.M., SILVA A.O., FONSECA J.C., ROSA H.,
LACET C.M.C., BERNARDIN A.P. Geographic distribution of hepatitis C virus
genotypes in Brazil. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 41-49,
2005.
CANBAY A., FELDSTEIN A.E., HIGUCHI H., WERNEBURG N., GRAMBIHLER A.,
BRONK S.F., GORES G.J. Kupffer cell engulfment of apoptotic bodies stimulates death
ligand and cytokine expression. Hepatology 38: 1188–1198, 2003.
CANBAY A., TAIMR P., TOROK N., HIGUCHI H., FRIEDMAN .S, GORES G.J.
Apoptotic body engulfment by a human stellate cell line is profibrogenic. Laboratory
Investigation 83: 655–663, 2003.
CARUSO J.A., MATHIEU P.A., JOIAKIM A., ZHANG H., REINERS J.J.JR. Aryl
hydrocarbon receptor modulation of tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis and
lysosomal disruption in a hepatoma model that is caspase-8-independent. Journal
Biological Chemistry 281: 10954–10967, 2006.
CDC. CENTERS FOR DISEASE CONTROL. Divison of Viral Hepatitis-Statistics and
Surveillance, 2012. Disponivelem:<http://www.cdc.gov/hepatitis/Statistics.htm>. Acesso
em 14/05/2013.
CHANG J. J., THOMPSON A.J.V., VISVANATHAN K., KENT S. J., CAMERON P.U.,
WIGHTMAN F., DESMOND P., LOCARNINI S.A., LEWIN R. The Phenotype of
101
Hepatitis B Virus–Specific T Cells Differ in the Liver and Blood in Chronic Hepatitis B
Virus Infection. Hepatology 46 (5): 1332-40, 2007.
CHEN C.H., HUANG M.H., YANG J.C., NIEN C.K., YANG C.C., YEH Y.H., YUEH S.K.
Prevalence and etiology of elevated serum alanine aminotransferase level in an adult
population in Taiwan. Journal of gastroenterology and hepatology 22(9): 1482-1489,
2007.
CHENG J., LIU C., KOOPMAN W.J., MOUNTZ J.D. Characterization of human Fas gene.
Exon/intron organization and promoter region. The Journal of Immunology 154(3):
1239-45, 1995.
CHOO K. L., KOU G., WEINER A. J., OVERBY L. R., HOUGHTON N. Isolation of small
cDNA clone derived from a blood-bome non-A non-B viral hepatiti genome. Science
244: 359-361, 1989.
CHOWDHURY I, THARAKAN B, BHAT GK. Current concepts in apoptosis: the
physiological apoptosis of T lymphocytes. Journal Immunology 160: 2065-71, 2006.
CHUNG Y.L., SHEU M.L., YEN S.H. Hepatitis C virus NS5A as a potential viral Bcl-2
homologue interacts with Bax and inhibits apoptosis in hepatocellular carcinoma.
International Journal of Cancer 107: 65-73, 2003.
CICCAGLIONE A.R., MARCANTONIO C., TRITARELLI E., EQUESTRE M.,
MAGURANO F., COSTANTINO A., NICOLETTI L., RAPICETTA M. The
transmembrane domain of hepatitis C virus E1 glycoprotein induces cell death. Virus
Research 104: 1-9, 2004.
CLAASSEN M, DE KNEGT R, TURGUT D, GROOTHUISMINK A, JANSSEN H. Role of
multiple regulatory T-cell populations in controlling peripheral blood and liver immunity
to human hepatitis C virus infections. Cytokine 48: 98, 2009.
CLARK J.M., BRANCATI F.L., DIEHL A.M. The prevalence and etiology of elevated
aminotransferase levels in the United States. The American journal of
gastroenterology 960-967, 2003.
CLERMONT R.J., CHALMERS T.C. The transaminase test in liver disease. Medicine 46:
197-205, 1967.
CLIPPINGER A.J., GEARHART T.L., BOUCHARD M.J. Hepatitis B virus X protein
modulates apoptosis in primary rat hepatocytes by regulating both NF-kappaB and the
itochondrial permeability transition pore. The Journal of Virolology 83: 4718–4731,
2009.
COHEN S., LEVI-MONTALCINI R., HAMBURGER V. A nerve growth-stimulating factor
isolated from sarcomas 37 and 180. Proceedings National Academy Sciences of the
United States of America 40: 1014–1018, 1954.
CONDE S.R., FEITOSA R.N., FREITAS F.B., HERMES R.B., DEMACHKI S., ARAÚJO
M.T., SOARES M.C., ISHAK R., VALLINOTO A.C..Association of cytokine gene
polymorphisms and serum concentrations with the outcome of chronic hepatitis B.
Cytokine 61(3): 940-4, 2013.
102
COTLER S., DHAMIJA M., LUC B., SIQUEIRA F., BARTRAM A., LAYDEN T., WONG
S. The prevalence and clinical correlates of elevated ALT levels in an urban Chinatown
community. Journal of Viral Hepatitis 17(2): 148-152, 2010.
COUROUCÉ-PAUTY A.M., PLANCON A., SOULIER J.P. Distribution of HBsAg subtypes
in the world. Vox Sang 44: 197-211, 1983.
COVACEUSZACH S., CASSETTA A., KORANEV P.V., GONFLONI S., RUDOLPH
R.. Dissecting NGF interactions with TrkA and p75 receptors by structural and
functional studies of an anti-NGF neutralizing antibody. Journal Molecular Biological
381: 881–889, 2008.
CRISPE
IAN
N.,
MATTHEW
GIANNANDREA,INGO
KLEIN, BEENA
JOHN, BRADFORD SAMPSON, SHERRY WUENSCH. Cellular and molecular
mechanisms of liver tolerance. Immunological Reviews 213 (1): 101–118, 2006.
CRISPE IAN NICHOLAS. The Liver as a Lymphoid Organ. Annual Reviews Immunology
27: 147–63, 2009.
CROWTHER R.A., KISELEV N.A., BÖTTCHER B., BERRIMAN J.A., BORISOVA G.P.,
OSE V., PUMPENS P. Three-dimensional structure of hepatitis B virus core particles
determined by electron microscopy. Cell 77: 943–950, 1994.
DANE D.S, CAMERON C.H., BRIGGS M. Virus-like particles in serum of patients with
Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet 1: 695 - 698, 1970.
DANIELL
B.
HILL, NYMPHA
B.
D'SOUZA, EUN
Y.
LEE, RAVSHAN
BURIKHANOV, ION V. DEACIUC* AND WILLEM J. S. DE VILLIER. A Role for
Interleukin-10 in Alcohol-Induced Liver Sensitization to Bacterial Lipopolysaccharide.
Alcoholism: Clinical and Experimental Research 26 (1): 74–82, 2002.
DAS H., KOIZUMI T., SUGIMOTO T., CHAKRABORTY S., ICHIMURA T.,
HASEGAWA K., NISHIMURA R. Quantitation of Fas and Fas ligand gene expression
in human ovarian, cervical and endometrial carcinomas using real-time quantitative RTPCR. British Journal of Cancer 82(10): 1682–1688, 2000.
DIAO J., KHINE A.A., SARANGI F., HSU E., IORIO C., TIBBLES L.A., WOODGETT
J.R., PENNINGER J., RICHARDSON C.D. X protein of hepatitis B virus inhibits Fasmediated apoptosis and is associated with up-regulation of the SAPK/JNK pathway. The
Journal Biological Chemistry 276: 8328 – 8340, 2001.
DIEHL A.M., POTTER J., BOITNOTT J., VAN DUYN M.A., HERLONG H.F., MEZEY E.
Relationship between pyridoxal 5 -phosphate deficiency and aminotransferase levels in
alcoholic hepatitis. Gastroenterology 86: 632-636, 1984.
DIENSTAG J. L. The Role of Liver Biopsy in Chronic Hepatitis C. Hepatology 36 (5):
Suppl. 1, 2002.
DUMOUTIER L., RENAULD J.C. Viral and cellular interleukin-10 (IL-10)-related
cytokines: from structures to functions. European Cytokine Network 13(1): 5–15,
2002.
103
DUNHAM, R.M., THAPA, M., VELAZQUEZ, V.M. Hepatic stellate cells preferentially
induce Foxp3+ regulatory T cells by production of retinoic acid. Journal of
Immunology 190: 2009–2016, 2013.
EHRENSCHWENDER M., WAJANT H. The role of FasL and Fas in health and disease. In:
Grewal,IS, editor. Therapeutic Targets of the TNF Superfamily. Advances in
Experimental Medicine and Biology 647: 64-93, 2009.
EHRMANN JR J., GALUSZKOVA D., EHRMANN,I KRO., JEZDINSKA V., VOJTO EK.,
MURRAY P. G., KOLAO Z. Apoptosis-related Proteins, BCL-2, BAX, FAS, FAS-L and
PCNA in Liver Biopsies of Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection. Pathology
Oncology Research 6 (2): 130-135, 2000.
EJRNAES M. Resolution of a chronic viral infection after interleukin-10 receptor blockade.
Journal the Experimental Medicine 203: 2461–72, 2006.
EL-HADY S.B.M., EMAN ALMASRY, MAHMOUD ABDU A. ASHOUR, ISAM SABEC.
FoxP3 expression in Egyptian patients with HCV. Egypt Journal Haematology 37:
116–122, 2012
EMINLER A.T., IRAK K., AYYILDIZ T., KESKIN M., KIYICI M., GUREL S., GULTEN
M., DOLAR E., NAK S. G.. The relation between liver histopathology and GGT levels in
viral hepatitis: More important in hepatitis B. Turk Journal Gastroenterology 25: 4115, 2014.
ERHARDT A., BIBURGER M. , PAPADOPOULOS T. , TIEGS G. IL-10, regulatory T cells,
and Kupffer cells mediate tolerance in concanavalin A-induced liver injury in
mice. Hepatology 45: 475–485, 2007.
FAUBION W.A., GORES G.J. Death receptors in liver biology and pathobiology.
Hepatology 29: 1-4, 1999.
FEIG, C., PETER M. E. How apoptosis got the immune system in shape. European Journal
Immunology 37 (1): S61-70. 2007.
FEINSTONE S.M., KAPIKIAN A.Z., PURCELL R.H., ALTER H.J., HOLLAND P.V.
Transfusion associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. The New England
Journal of Medicine 292(15): 767-70, 1975.
FEITELSON M.A., ZHU M., DUAN L.X., LONDON W.T. HBxAg and p53 are associated
in vitro and in liver tissues from patients with primary hepatocellular carcinoma.
Oncogene 8: 1109-1117, 1993.
FELDSTEIN A.E., CANBAY A., ANGULO P., TANIAI M., BURGART L.J., LINDOR
K.D. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human
nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 125: 437-443, 2003.
FERREIRA M.S. Diagnosis and treatment of hepatitis B. Revista da Sociedade Brasileira
de Medicina Tropical 33(4): 389-400, 2000.
FIORENTINO D.F., BOND M.W., MOSMANN T.R. Two types of mouse T-helper cell. IV.
Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. Journal
Experimental Medicine 170: 2081-2095, 1989.
104
FISCHER R., BAUMERT T., BLUM H.E. Hepatitis C virus infection and apoptosis. The
World Journal of Gastroenterology 13 (36): 4865-4872, 2007.
FISICARO P., VALDATTA C., MASSARI M, LOGGI E., BIASINI E., SACCHELLI L.
Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmeddeath1pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology 138: 682–93, 2010.
FLYNN J. K., DORE G. J., HELLARD M., YEUNG B., RAWLINSON W. D., WHITE P.
A., KALDOR J. M.. LLOYD A. R., FFRENCH R. A.. IL-10 predominant responses are
associated with progression to chronic hepatitis C virus infection in injecting drug users.
Journal of Viral Hepatitis 18: 549–561, 2011.
FRIEDMAN WJ, GREENE LA. Neurotrophin signaling via Trks and p75. Experimental
Cell Research 25;253 (1): 131-42, 1999.
GABELE E., BRENNER, D. A., RIPPE RA. Liver fibrosis: signals leading to the
amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Frontiers in Bioscience 8: D69–D77,
2003.
GALLE PR, HOFMANN WJ, WALCZAK H, SCHALLER H, OTTO G, STREMMEL W,
KRAMMER PH,RUNKEL L. Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand
in liver damage. The Journal of Experimental Medicine 182: 1223-30, 1995.
GANEM D., PRINCE A. M. Hepatitis B virus infection–natural history and clinical
consequences. The New England Journal of Medicine 350: 1118–29, 2004.
GARCÍA-MONZÓN C., SÁNCHEZ-MADRID F., GARCÍA-BUEY L., GARCÍA-ARROYO
A., GARCÍA-SÁNCHEZ
A., MORENO-OTERO
R..
Vascular
adhesion
moleculeexpression in viral chronic hepatitis: evidence ofneoangiogenesis in portal tracts.
Gastroenterology 108: 231–24, 1995.
GAYOTTO L.C. e Comitê SBP-SBH. Visão histórica e consenso nacional sobre a classif
icação das hepatites crônicas. Projeto do Clube de Patolo gia Hepática da Sociedade
Brasileira de Patologia aprovado pela Sociedade Brasileira de Hepatologia.
Gastroenterol Endosc Digestiva 19: 137-40, 2000.
GERLISH W.H., ROBINSON W.S. Hepatitis B virus contains protein attached to the
5’terminus of its complete DNA strand. Cell 21: 801-809, 1980.
GERMANIDIS G., ARGENTOU N., HYTIROGLOU P., VASSILIADIS T., PATSIAOURA
K., GERMENIS A. E. , SPELETAS M. Liver FOXP3 and PD1/PDL1 Expression is
Down-Regulated in Chronic HBV Hepatitis on Maintained Remission Related to the
Degree of Inflammation. Frontier Immunology 4: 207, 2013.
GIANNINI E, CAGLIERIS S, CEPPA P, RISSO D, LANTIERI PB, TESTA R. Serum procollagen III peptide levels are related to lobular necrosis in untreated patients with
chronic hepatitis C. European Journal Gastroenterology Hepatology 13: 137-141,
2001.
GIANNINI E., BOTTA F., FASOLI A., CEPPA P., RISSO D., LANTIERI P.B. Progressive
liver functional impairment is associated with an increase in AST/ALT ratio. Digestive
Disease an Science 44: 1249–1253, 1999.
105
GRANOT E., SHOUVAL D., ASHUR Y. Cell adhesion molecules and hyaluronic acid as
markers of inflammation, fibrosis and response to antiviral therapy in chronic hepatitis C
patients, Mediators Inflammation 10: 253–258, 2001.
GRAPHPAD SOFTWARE. Inc. Prism (data analysis software system), version 5. Software e
Guia do Usuário, 2007.
GREEN D. R. Overview: apoptotic signaling pathways in the immune system.
Immunological Reviews 193 (1): 5–9, 2003.
GUICCIARDI M. E., GORES G. J. Apoptosis: a mechanism of acute and chronic liver injury.
An International Journal of Gastroenterology and Hepatology 54: 1024-1033 2005.
GUIDOTTI L.G., CHISARI F.V. Immunobiology and Pathogenesis of Viral Hepatitis.
Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 1: 23-61, 2006.
GUIDOTTI L.G., ROCHFORD R., CHUNG J., SHAPIRO M., PURCELL R., CHISARI F.V.
Viral clearance without destruction of infected cells during acute VHB infection. Science
284: 825-829, 1999.
GUIRÃO A.A., YUSTE S.R., REGUEIRO B.J. Epidemiología y manifestaciones clínicas de
las hepatitis virales. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia clínica 24: 264–276,
2006.
HAHN C.S., CHO Y.G., KANG B.S., LESTER I.M., HAHN Y.S. The HCV core protein
actsas a positive regulator of fas-mediated apoptosis in a human lymphoblastoid T cell
line.Virology 276(1): 127-137, 2000.
HASHEM R.M., MAHMOUD M.F., EL-MOSELHY M.A., SOLIMAN H.M. Interleukin-10
to tumor necrosis factor-alpha ratio is a predictive biomarker in nonalcoholic fatty liver
disease: interleukin-10 to tumor necrosis factor-alpha ratio in steatohepatitis. European
Journal Gastroenterology and Hepatology 20(10): 995–1001, 2008.
HATZAKIS, A., MAGIORKINIS, E., HAIDA, C. HBV virological assessment. Journal
Hepatology 44: S71-6, 2006.
HIJIKATA M., KATO N., OOTSUYAMA Y., NAKAGAWA M., SHIMOTOHNO K. Gene
mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro
processing analysis. Proceedings National Academy Science USA 88: 5547–5551,
1991.
HIKITA H., TAKEHARA T., SHIMIZU S., KODAMA T., LI W., MIYANTÍGENOI T.,
HOSUI A., ISHIDA H., OHKAWA K., KANTO T., HIRAMATSU N., YIN X.M.,
HENNIGHAUSEN L., TATSUMI T., HAYASHI N. Mcl-1 and Bcl-xL cooperatively
maintain integrity of hepatocytes in developing and adult murine liver. Hepatology 50:
1217–1226, 2009.
HIRAMATSU N., HAYASHI N., KATAYAMA K., MOCHIZUKI K., KAWANISHI
Y., KASAHARA A., FUSAMOTO H., KAMADA T. Immunohistochemical detection of
Fasantigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis C. Hepatology 19: 1354–
1359, 1994.
IKEJIMA K., OKUMURA K., KON K., ET AL. (2007) Role of adipocytokines in hepatic
fibrogenesis. Journal of Gastroenterology and Hepatology; 22(1):S87–S92.
106
IKEJIMA K., TAKEI Y., HONDA H., ET AL. Leptin receptor-mediated signaling regulates
hepatic fibrogenesis and remodeling of extracellular matrix in the rat. Gastroenterology
122: 1399 – 1410, 2002.
IMBERT-BISMUT F, RATZIU V, PIERONI L, CHARLOTTE F, BENHAMOU Y,
POYNARD T. Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus
infection: a prospective study. Lancet 357: 1069-75, (2001).
ISHAK K, BAPTISTA A, BIANCHI L. Histologic grading and staging of chronic hepatitis.
Journal Hepatology 24: 289-293, 1995.
JĪÍ EHRMANN JR., DANA GALUSZKOVÁ, JĪÍ EHRMANN, IVO KR», VÏRA
JEZDINSKÁ, BŌIVOJ VOJTÃÄEK, PAUL G MURRAY, ZDENÏK KOLÁŸ.
Apoptosis-related Proteins BCL-2, BAX, FAS, FAS-L and PCNA in Liver Biopsies of
Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection. Pathology Oncology Research 6(2):
130–135, 2000.
JONULEIT H., SCHMITT E. The regulatory T cell family: distinct subsets and their
interrelations. The Journal of Immunology 171(12): 6323-7. 2003.
KALKERI G., KHALAP N., GARRY R.F., FERMIN C.D., DASH S. Hepatitis Cvirus
protein expression induces apoptosis in HepG2 cells.Virology 282: 26-37, 2001.
KAMADA Y., TAMURA S., KISO S. Enhanced carbon tetrachloride-induced liver fibrosis
in mice lacking diponectin. Gastroenterology 125: 1796 –1807, 2003.
KAMIMOTOY, HORIUCHIS, TANASES, MORINOY. Plasma clearance of intra venously
injected aspartate aminotransferases isoenzymes: evidence for preferential uptake by
sinusoidal liver cells. Hepatology 5: 367-75, 1985.
KAPLAN P.M., GERIN J.L., ALTER H.I. DNA polimerase associated with human
hepatitis B antigen. Journal of Virology 12: 995-1005, 1973.
KARMEN A., WROBLEWSKI F., LA DUE J. Transaminase activity in human blood. The
Journal Clinical Investigations 34: 12633, 1955.
KARRAR A., BROOMÉ U., UZUNEL M., QURESHI A.R., SUMITRAN-OLGERSSON.
Human liver sinusoidal endothelial cells induce apoptosis in activated T cells: a role in
tolerance induction. Gut 56: 243–252, 2007.
KENDALL T. J., HENNEDIGE S.A, AUCOTT R. L., HARTLAND S.N N., MADELEINE
A. VERNON,R. CHRISTOPHER BENYON, JOHN P. IREDALE. p75 Neurotrophin
Receptor Signaling Regulates Hepatic Myofibroblast Proliferation and Apoptosis in
Recovery from Rodent Liver Fibrosis. Hepatology 49(3): 901-910 2009.
KIM J.M., RASMUSSEN J.P., RUDENSKY A.Y. Regulatory T cells prevent catastrophic
autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nature Immunology 8: 191–7, 2007.
KIM K.H., SEONG B.L. Pro-apoptotic function of HBV X protein is mediated by interaction
with c-FLIP and enhancement of death-inducing signal. The European Molecular
Biology Organization 22: 2104–2116, 2003.
107
KIM W., FLAMM S.L., DI BISCEGLIE A.M., Bodenheimer HC: Serum activity of alanino
aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology 47(4): 13631370, 2008.
KLINGMULLER U., SCHALLER H. Hepadnavirus infection requires interaction between
the viral pre-S domain and a specific hepatocellular receptor. Journal of Virology 67:
7414- 7422, 1993.
KNAPP S., HENNIG B.J., FRODSHAM A.J. Interleukin-10 promoter polymorphisms and
the outcome of hepatitis C virus infection. Immunogenetics 55: 362–369, 2003.
KNODELL K.G., ISHAK K.G., BLACK W.C., CHEN T.S., CRAIG R., KAPLOWITZ N.,
KIERNAN T.W. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing
histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1: 431-435,
1981.
KNOLLE P.A., SCHMITT E., JIN S., GERMANN T., DUCHMANN R., HEGENBARTH
S., GERKEN G., LOHSE A.W. Induction of cytokine production in naiveCD4+T cells by
antigen-presenting murine liver sinusoidal endothelial cells but failure to induce
differentiation towardTH1 cells. Gastroenterology 116: 1428–1440, 1999.
KOUNTOURAS J., ZAVOS C., CHATZOPOULOS D. Apoptosis in Hepatitis C. Journal of
Viral Hepatitis 10: 335-42, 2003.
KOZIEL M.J. Cytokines in viral hepatitis. Seminary Liver Disease, 19: 157-169, 1999.
KRAMVIS A., WEITZMANN L., OWIREDU W.K.B.A., KEW M.C. Analysis of the
complete genome of subgroup A´ hepatitis B virus isolates from South Africa. The
Journal of General Virology 83: 835-839, 2002.
KUNDROTAS L., CLEMENT D. Serum alanine aminotransferase (ALT) elevation in
asymptomatic US Air Force basic trainee blood donors. Digestive Disease an Science,
39: 2145-2150, 1993.
KUNKEL M., LORINCZI M., RIJNBRAND R., LEMON S. M., WATOWICH S. J. Selfassembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis C virus core protein.
Journal of Virology 7: 2119–2129, 2001.
KUO G., CHOO G.L., ALTER H.J., GITNIK G.L., REDEKER A.G., PURCELL R.H.,
MIYAMURA T., DIENSTAG J.L., ALTER M.J., STEVENS C.E. An assay for
circulating antibodies to a major etiology virus of human non A non B hepatitis. Science
244: 362-4, 1989.
LA CAVA A, VAN KAER L, FU DONG S. CD4+CD25+ Tregs and NKT cells: regulators
regulating regulators. Trends Immunology; 27: 322–27, 2006.
LAI M., HYATT B.J., NASSER I., CURRY M., AFDHAL N.H. The clinical significance of
persistently normal ALT in chronic hepatitis B infection. Journal of hepatology 47(6):
760 – 767, 2007.
LAN R.Y., CHENG C., LIAN Z.X., TSUNEYAMA K., YANG G.X., MORITOKI Y.
Livertargeted and peripheral blood alterations of regulatory T cells in primary biliary
cirrhosis. Hepatology 43: 729–737, 2006.
108
LANGHANS B., BRAUNSCHWEIGER I., ARNDT S., SCHULTE W., SATOGUINA J.,
LAYL L.E. Core-specific adaptive regulatory T-cells in different outcomes of hepatitis C.
Clinical Science 119: 97–109, 2010.
LAU, J.Y.N.; DAVIS, G.L.; KNIFFEN, J.; QIAN, K. LAU, J.Y.N.; DAVIS, G.L.; KNIFFEN,
J.; QIAN, K. et al. Significance of Serum Hepatitis C Virus RNA Levels in Chronic
Hepatitis C. Lancet.341(12): 1501-1504, 1993.
LAUER G.M., WALKER B.D. Hepatitis C virus infection. The New England Journal of
Medicine 345: 41-52, 2001.
LE BOUVIER G.L. The heterogeneity of Australia antigen. Journal Infections Disease 123:
671-675, 1971.
LECLERCQ IA, FARRELL GC, SCHRIEMER R, ET AL. Leptin is essential for the hepatic
fibrogenic response to chronic liver injury. Journal of Hepatology 37: 206 –213, 2002.
LEE S.H., SHIN M.S., LEE H.S. Expression of Fas and Fas related molecules in human
heaptocellular carcinoma. Human Patholology 32(3): 250–256, 2001.
LEE W. M. Hepatitis B virus infection. New England Journal of Medicine 337: 1733-1745,
1997.
LEVENE C., BLUMBERG B.S. Additional specificities of Australia antigen and the possible
identification of hepatitis Nature 221: 195–196, 1969.
LEVI-MONTALCINI, R. AND V. HAMBURGER. Selective growth stimulating effects of
mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo.
Journal Exp Zool 116 (2): 321-61, 1951.
LI S, JONES K.L., WOOLLARD D.J., DROMEY J., PAUKOVICS G., PLEBANSKI M.
Defining target antigens for CD25+ FOXP3+ IFN-g-regulatory T-cells in chronic
hepatitis C virus infection. Immunology and Cell Biology 85: 197–204, 2007.
LIN S., SAXENA N.K., DING X., ET AL. (2006) Leptin increases tissue inhibitor of
metalloproteinase I (TIMP-1) gene expression by a specificity protein 1/signal transducer
and activator of transcription 3 mechanism. Molecular Endocrinology 20: 3376 –3388.
LINDH M, HORAL P, DHILLON AP, NORKRANS G. Hepatits B virus DNA levels,
precore mutations, genotypes and histology activity in chronic hepatitis B. Journal Viral
Hepatology 7: 258–67, 2000.
LIU C-M., TUNG T-H., LIU J-H., CHEN V., LIN C-H., HSU C-T., CHOU P. A communitybased epidemiological study of elevated serum alanine aminotransferase levels in
Kinmen, Taiwan. World Journal Gastroenterology 11(11): 1616-1622, 2005.
LIU X., INVERNIZZI P., LU Y., KOSOY R., LU Y., BIANCHI I. Genome-wide metaanalyses identify three loci associated with primary biliary cirrhosis. Nature Genetic 42:
658–660 2010.
LIU, Z. X., GOVINDARAJAN, S., OKAMOTO, S. & DENNERT, G. NKcells cause liver
injury and facilitate the induction of T-cell-mediated immunity to a viral liver infection.
Journal of Immunology 164: 6480–6486, 2000.
109
LOBATO C, TAVARES-NETO J, RIOS-LEITE M, TREPO C, VITYITSKI L,
PARVAZ P. Intrafamilial prevalence of hepatitis B virus in Western Brazilian
Amazon region: epidemiologic and biomolecular study. Journal Gastroenterology
Hepatology 21(5): 863-8, 2006.
LOCARNINI STEPHEN. Molecular Virology of Hepatitis B Virus. Seminars in liver
disease 24(1): 3-10, 2004.
LOK A.S.F., McMAHON B.J. Chronic Hepatitis B. Hepatology 45(2): 507-539, 2007.
LONARDO A. ADINOLFI L.E., LORIA P. Steatosis and hepatitis C virus: mechanisms and
significance for hepatic and extrahepatic disease. Gastroenterology 126: 586–597, 2004.
LONDON R.M., GEORGE J. Pathogenesis of NASH: animal models. Clinical Liver Disease
11: 55–74, 2007.
LONGHI, M. S. ET AL. Inhibition of interleukin-17 promotes differentiation of CD25– cells
into stable T regulatory cells in patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology
142: 1526–1535, 2012.
LOUIS H., LE MOINE O., GOLDMAN M., DEVIÈRE J. Modulation of liver injury by
interleukin-10. Acta Gastroenterology Belgic 66: 7–14, 2003.
MACDONALD A.J., DUFFY M., BRADY M.T., SUSAN MCKIERNAN,WILLIAM HALL,
JOHN HEGARTY, MICHAEL CURRY, KINGSTON H. G. MILLS1 .CD4 T Helper
Type 1 and Regulatory T Cells Induced against the Same Epitopes on the Core Protein in
Hepatitis C Virus–Infected Persons. The Journal of Infectious Diseases 185: 720–7,
2002.
MACHIDA K., TSUKIYAMA-KOHARA K., SEIKE E., TONE S., SHIBASAKI F.,
SHIMIZU M.,TAKAHASHI H., HAYASHI Y., FUNATA N., TAYA C., YONEKAWA
H., KOHARA M. Inhibition of cytochrome c release in Fas-mediated signaling pathway
in transgenic mice induced to express hepatitis C viral proteins. Journal of Biological
Chemistry 276(15): 12140-12146, 2001.
MAHNKE K., ENK A.H. Dendritic cells: key cells for the induction of regulatory T cells.
Current Topics Microbiology and Immunology 293: 133–50, 2005.
MAHONEY F.J. Update on diagnosis, management and prevention of hepatitis B virus in
fection. Clinical Microbiology Reviews 12 (2): 351-366, 1999.
MAINI M.K., SCHURICH A. The molecular basis of the failed immune response in chronic
HBV: therapeutic implications. Journal of Hepatology 52(4): 616-9, 2010.
MALHI H, GUICCIARDI M. E., GORES G. J. Hepatocyte Death: A Clear and Present
Danger. Physiological Reviews 90: 1165–1194, 2010.
MANIGOLD T., SHIN E.C., MIZUKOSHI E., MIHALIK K., MURTHY K.K., RICE C.M.,
PICCIRILLO C.A., REHERMANN B. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virusspecific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis C. Blood 107:
4424-4432, 2006.
110
MANKOURI J., DALLAS M.L., HUGHES M.E., GRIFFIN S.D., MACDONALD A.,
PEERS C.HARRIS M. Suppression of a pro-apoptotic K+ channel as a mechanism for
hepatitis C virus persistence. PNAS USA 106(37): 15903-15908, 2009.
MARCELLIN P., ASSELAH T., BOYER N. Fibrosis and disease progression in hepatitis C.
Hepatology 36 (1): 47-56; 2002.
MARGOLIS H.S., ALTER M.J., HADLER S.C. Hepatitis B: evolving epidemiology and
implications for control. Seminars in Liver Disease 11: 84-92, 1991.
MARIANI S.M., MATIBA B., BAUMLER C., KRAMMER P.H. Regulation of cell surface
APO-1/Fas (CD95) ligand expression by metalloproteases. European Journal of
Immunology 25: 2303- 2307, 1995.
MARTELL, M., ESTEBAN, J. I., QUER, J., GENESCA, J., WEINER, A., ESTEBAN, R.,
GUARDIA, J. & GOMEZ, J. Hepatitis C virus (HCV) circulates as a population of
different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution.
Journal of Virology 66: 3225-3229, 1992.
MASASHI SAKAKI, KAZUMASA HIROISHI, TOSHIYUKI BABA, TAKAYOSHI ITO,
YUICHI HIRAYAMA, KOJI SAITO, TAKAHIKO TONOIKE, MIKI KUSHIMA,
MICHIO IMAWARI. Intrahepatic status of regulatory T cells in autoimmune liver
diseases and chronic viral hepatitis. Hepatology Research 38: 354–361, 2008.
MATHIESEN U., FRANZEN L., FRYDEN A., FOBERG U., BODEMAR G. The clinical
significance of slightly to moderately increased liver transaminase values in
asymptomatic patients. Scand Journal Gastroenterol 34: 85-91, 1999.
MATLOFF D. F, SELINGER M.J., KAPLAN M. M. Hepatic transaminase activity in
alcoholic liver disease. Gastroenterology 78: 138-992, 1980.
MATTEI, F., SCHIAVONI, G., BELARDELLI, F. & TOUGH, D. F. IL-15 is expressed by
dendritic cells in response to type I IFN,double-stranded RNA or lipopolysaccharide and
promotes dendritic-cell activation. The Journal of Immunology 167: 1179–1187, 2001.
MEYER D. H., BACHEM M. G., GRESSNER A. M. Modulation of hepatic lipocyte
proteoglycan synthesis and proliferation by Kupffer cell-derived transforming growth
factors type beta 1 and type alpha. Biochemical and biophysical research
communications 171: 1122–1129, 1990.
MICERA, A.; LAMBIASE, A.; STAMPACHIACCHIERE, B.; SGRULLETTA, R.;
NORMANDO, E.M.; BOVINI, S., BOVINI, S. Nerve growth factor has a modulatory
role on human primary fibroblast cultures derived from vernal keratoconjunctivitisaffected conjunctiva. Molecular Vision 13: 981-987, 2007.
MISSALE G., BERTONI R., LAMONACA V. Different clinical behaviours of acute
hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the anti-viral cellmediated immune response. Journal Clinical Investigations 98(3): 706–714, 1996.
MITA E., HAYASHI N., IIO S. Role of Fas ligand in apoptosis induced by hepatitis C virus
infection. Biochemical Biophysical Research Communicatiopns 204: 468–74, 1994.
MIYAKE Y., IWASAKI Y., TERADA R., OKAMAOTO R., IKEDA H., MAKINO Y.,
KOBASHI H., TAKAGUCHI K., SAKAGUCHI K., SHIRATORI Y. Persistent
111
elevation of serum alanine aminotransferase levels leads to poor survival and
hepatocellular carcinoma development in type 1 autoimmune hepatitis. Alimentary
pharmacology & therapeutics 24(8): 1197-1205, 2006.
MIYAKE Y., IWASAKI Y., TERADA R., TAKAGI S., OKAMAOTO R., IKEDA H.,
SAKAI N., MAKINO KOBASHI H., TAKAGUCHI K. Persistent normalization of
serum alanine aminotransferase levels improves the prognosis of type 1 autoimmune
hepatitis. Journal of hepatology 43 (6): 951-957, 2005.
MIYAZOE S., HAMASAKI K., NAKATA K. Influence of interleukin-10 gene promoter
polymorphisms on disease progression in patients chronically infected with hepatitis B
virus. The American Journal of Gastroenterology 97: 2086–2092, 2002.
MOCHIZUKI K., HAYASHI N., KATAYAMA K., HIRAMATSU N., KANTO T., MITA
E., TATSUMI T., KUZUSHITA N., KASAHARA A., FUSAMOTO H., YOKOCHI
T., KAMADA T.. B7/BB-1 expression and hepatitisactivity in liver tissues of patients
with chronic hepatitis C. Hepatology 25: 713-718 , 1997.
MOORE K.W., DE WAAL MALEFYT R., COFFMAN R.L., O'GARRA A. Interleukin-10
and the interleukin-10 receptor. Annual Review Immunology 19: 683-765, 2001.
MORADPOUR D, PENIN F., RICE C. M.. Replication of hepatitis C virus. Nature Reviews
Microbiology 5: 453-463, 2007.
MORALEDA G, SAPUTELLIJ, ALDRICH CE. Lack of effect of antiviral therapy in
nondividing hepatocyte cultures on the closed circular DNA of woodchuck hepatitis
virus. Journal Virology 71: 9392-99, 1997.
MORGAN M.J., THORBURN J., THOMAS L., MAXWELL T., BROTHMAN A.R.,
THORBURN A. An apoptosis signaling pathway induced by the death domain of FADD
selectively kills normal but not cancerous prostate epithelial cells. Cell Death Differ 8:
696–705, 2001.
MOSSONG J, BILL S, HAWOTTE K. Predicting significant fibrosis in hepatitisC patients in
Luxembourg using serological markers. Bull Soc Sci Med Grand Duche Luxemb 1930, 2011.
MUHLBAUER M., FLECK M., SCHUTZ C., WEISS T., FROH M., BLANK C. PD-L1 is
induced in hepatocytes by viral infection and by interferon-alpha and -gamma and
mediates T cell apoptosis. Journal of Hepatolology 45: 520-52, 2006.
MURATORI P., MURATORI L., STROFFOLINI T., PAPPAS G., TERLIZZI P., FERRARI
R., LOFFREDA S., CASSANI F., RAPICETTA M., GUADAGNINO V., BIANCHI
F.B., LENZI M. Prevalence of non-organ specific autoantibodies in HCV-infected
subjects in the general population. Clinical and Experimental Immunology 131(1):
118-21, 2003.
NA B., HUANG Z., WANG Q., QI Z., TIAN Y., LU C.C., YU J., HANES M.A., KAKAR S.,
HUANG E.J. Transgenic expression of entire hepatitis B virus in mice induces
hepatocarcinogenesis independent of chronic liver injury. PLoSOne 6: e26240, 2011.
NAGATA S., GOLSTEIN P. The Fas death factor. Science 267: 1449–1456, 1995.
112
NELSON DR, TU Z, SOLDEVILA-PICO C, ABDELMALEK M, ZHU H, XU YL,
CABRERA R, LIU C, DAVIS GL. Long-term interleukin 10 therapy in chronic hepatitis
C patients has a proviral and antiinflammatory effect. Hepatology 38: 859-868, 2003.
NEURATH A.R., KENT S.B.H., STRICK N., PARKER K. Identification and chemical
synthesis o a host cell receptor binding site on hepatitis B virus. Cell 46: 429-436, 1986.
NICOL G.D., VASKO M.R. Unraveling the story of NGF-mediated sensitization of
nociceptive sensory neurons: ON or OFF the Trks? Molecullar Interv 7: 26–41, 2007.
NORDER H., HAMMAS B., LEE S.D., BILE K., COUROUCÉ A.M., MUSHAHWAR I.K.,
MAGNIUS L.O. Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical
origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. Journal
General of Virology 74: 1341-1348, 1993.
NOVO E., MARRA F, ZAMARA E., VALFRE DI BONZO L., MONITILLO L., CANNITO
S., ET AL. Overexpression of Bcl-2 by activated human hepatic stellate cells: resistance
to apoptosis as a mechanism of progressive hepatic fibrogenesis in humans. Gut 55:
1174-1182, 2006.
OAKLEY F., TEOH V., CHING-A-SUE. Angiotensin II activates IκB kinase
phosphorylation of RelA at Ser536 to promote myofibroblast survival and liver fibrosis.
Gastroenterology 136: 2334–2344, 2009.
OAKLEY F., TRIM N., CONSTANDINOU C. M., WEILAN YE, GRAY A. M., FRANTZ
GRETCHEN, HILLAN K, KENDALL T., BENYON R. C., MANN D. A., IREDALE J.
P. Hepatocytes Express Nerve Growth Factor during Liver Injury Evidence for Paracrine
Regulation of Hepatic Stellate Cell Apoptosis. American Journal of Pathology 16 (5):
1848-1859, 2003.
OKAMOTO H., TSUDA F., SAKUGAWA H., SASTROSOEWIGNJO R.I., IMAI M.,
MIYAKAWA Y., MAYUMI M. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide
sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal General of Virology 69:
2575-2583, 1988.
OKOCHI K., MURAKAMI S. Observations on Australian antigen in Japanese. Vox Sang 5:
374-385, 1968.
OLASO E., FRIEDMAN S.L. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis. The Journal of
Hepatology 29: 836–847, 1998.
OTSUKI T., SAKAGOUCHI H., TOMOKUNI A., AIKOH T., MATSUKI T., ISOZAKI Y.,
HYODOH F., KAWAKAMI Y., KUSAKA M., KITA S., UEKI A. Detection of
alternatively spliced variant messagens of Fas gene and mutational screening of Fas and
Fas ligand coding regions in peripheral blood mononuclear cells derived from silicosis
patients. Immunology Letter 72 (2): 137-43, 2000.
PALTANIN L.F., REICHE E.M.V. Soroprevalência de anticorpos antivírus da hepatite C em
doadores de sangue, Brasil. Revista de Saúde Pública 36(4): 393 - 399, 2002.
PAROLA M., ROBINO G. (2001) Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis.
Journal of Hepatology 35: 297–306.
113
PASSINO M. A., ADAMS R. A., SIKORSKI S. L., AKASSOGLOU K. Regulation of
hepatic stellate cell differentiation by the eurotrophin receptor p75NTR. Science 315:
1853-1856, 2007.
PAWLOTSKY, J. M. Hepatitis C virus genetic variability, pathogenic and clinical
implications. Clinical Liver Disease. 7: 45-66, 2003.
PENDINO G.M., MARIANO A., SURACE P., CASERTA C.A., FIORILLO M.T.,
AMANTE A., BRUNO S., MANGANO C., POLITO I., AMATO F. Prevalence and
etiology of altered liver tests: A population‐based survey in a Mediterranean town.
Hepatology 41(5): 1151-1159, 2005.
PERKINS, J. A. Disponível em: <: http://people.rit.edu/japfaa/infectious.html, 2002.
PERSICO M., CAPASSO M., PERSICO E. Interleukin-10 – 1082 GG polymorphism
influences the occurrence and the clinical characteristics of hepatitis C virus infection.
Journal of Hepatology 45: 779–785, 2006.
PERSICO M., ROMANO M. Alanine aminotransferase measurements and histological
disease in hepatitis C. Lancet 342: 136970,1993.
PIERUCCI D, CICCONI S, BONINI P, FERRELLI F, PASTORE D, MATTEUCCI C. NGFwithdrawal induces apoptosis in pancreatic beta cells in vitro. Diabetologia 44(10):
1281-95, 2001.
PILERI, P., UEMATSU, Y., CAMPAGNOLI, S., GALLI, G., FALUGI, F., PETRACCA, R.
Binding of hepatitis C virus to CD81. Science 282: 938-941, 1998.
PINZANI M. Novel insights into the biology and physiology of the Ito cell. Pharmacology &
Therapeutics 66: 387-412, 1995.
PINZANI M., MARRA F. Cytokine receptors and signaling in hepatic stellate
cells. Seminary Liver Disease 21: 397–416, 2001.
POLLACK JR, GANEM D. Site-specific RNA binding by a hepatitis B virus reverse
transcriptase initiates two distinct reactions: RNA packaging and DNA synthesis.
Journal Virology 68(9): 5579–5587, 1994.
POYNARD T, IMBERT-BISMUT F, RATZIU V, CHEVRET S, JARDEL C, MOUSSALLI
J. Biochemical markers of liver fibrosis in patients infected by hepatitis C virus:
longitudinal validation in a randomized trial. Journal Viral Hepatology 9: 128-33, 2002.
POYNARD T., RATZIU V., CHARLOTTE F., GOODMAN Z., MCHUTCHISON J.,
ALBRECHT J. Rates and risk factors of liver fibrosis progression in patients with
chronic hepatitis C. Journal of Hepatology 34: 730–39, 2001.
POYNARD T., YUEN M., RATZIU V., LAI C. L. Viral hepatitis C. Lancet 362: 2095–100;
2003.
PRICE R.D D., STUART A. M., SHARKEY J., MATSUOKA N. Advances in small
molecules promoting neurotrophic function. Pharmacology & Therapeutics 115 (2):
292–306, 2007.
114
PRINCE A.M. An antigen detected in the blood during the incubation period of serum
hepatitis. Proc Nationall Academy Science USA 60: 814-821, 1968.
RABIZADEH S., Oh J., ZHONGL.T.,YANG J., BITLER CM, BUTCHER L.L., BREDESE
N D. E. Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor. Science 261: 345–348,
1993.
RAIMONDO G., POLLICINO T., CACCIOLA I., SQUADRITO G. Occult hepatitis B vírus
infection. Journal Hepatology 46: 160-170, 2005.
REHERMANN B., NASCIMBENI M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus
infection. Nature Reviews Immunology 5(3): 215-229, 2005.
RICO M.A., QUIROGA J.A., SUBIRA D. Hepatitis B virus-specific T cell proliferation and
cytokine secretion in chronic hepatitis B e antibody-positive patients treated with
ribavirin and interferon alpha. Hepatology 33: 295–300, 2001.
RIGOPOULOU E.I., ABBOTT W.G. H., HAIGH P., NAOUMOV N.V. Blocking of
interleukin-10 receptor – a novel approach to stimulate T-helper cell type 1 responses to
hepatitis C virus. Clinical Immunology 117(1): 57–64, 2005.
RIZZETO M., CANESSE M.G., ARICO S., CRIVELLI O., TREPO C., BONINO F.,
VERME G. Immunoflorescence detection of a new antigen/antibody system 131
(delta/antidelta) associated with hepatitis B virus in liver and serum of HBsAg carriers.
Gut 18: 998-1003, 1977.
ROBINSON W.S. DNA and DNA polimerase in the core of the Dane particle of hepatitis B.
American Journal of Medicine and Science 270: 151-159, 1975.
ROLO A.P., TEODORO J.S., PALMEIRA C.M. Role of oxidative stress in the pathogenesis
of nonalcoholic steatohepatitis. Free Radic Biol Med 52: 59–69, 2012.
RONCAROLO
M.G., GREGORI
S., BATTAGLIA
M., BACCHETTA
R., FLEISCHHAUER K., LEVINGS M.K. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T
cells in rodents and humans. Immunology Review 212: 28-50, 2006.
ROUX, P.P.; BARKER, P.A. Neurotrophin signaling through the p75 neurotrophin receptor.
Progresse Neurobiology 67: 203-233, 2002.
RUBERTI G., CASCINO I., PAPOFF G., ERAMO A. Fas splicing variants and their effect
on apoptosis. Advances in experimental medicine and biology.406: 125-34, 1996.
RYDER D. S. Progression of hepatic fibrosis in patients with hepatitis C: a prospective repeat
liver biopsy study. Gut 53: 451-455, 2004.
SABAT R., GRÜTZ G., WARSZAWSKA K., KIRSCH S., WITTE E., WOLK K.,
GEGINET J. Biology of interleukin-10. Cytokine Growth Factor Review 21(5): 331–
44, 2010.
SAKAGUCHI S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in
immunological tolerance to self and nonself. Nature Immunology 6(4): 345-52. 2005.
115
SAKAKI M., K. HIROISHI, T. BABA. Intrahepatic status of regulatory T cells in
autoimmune liver diseases and chronic viral hepatitis, Hepatology Research 38 (4):
354–361, 2008.
SCHAEFER S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World
Journal of Gastroenterology 13: 14-21, 2007.
SCHINONI M. I., PARANÁ R., CAVALCANTE D. Apoptosis and Progression of Hepatic
Fibrosis in Hepatitis C Patients. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 10 (2):
117-121, 2006.
SCHOR, N.F. The p75 neurotrophin receptor in human development and disease. Prog.
Neurobiol, 77: 201-214, 2005.
SEEGER C. & MASON, W. Hepatitis B virus biology. Microbiology and Molecular
Biology Reviews 64 (1): 51-68, 2000.
SEEGER C., GANEM D., VARMUS H.E. Biochemical and genetic evidence for the hepatitis
B virus replication strategy. Science 232: 477-484, 1986.
SELLON R.K., TONKONOGY S., SCHULTZ M., DIELEMAN L.A., GRENTHER W.,
BALISH E., RENNICK D.M., SARTOR R.B. Resident enteric bacteria are necessary for
development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10deficient mice. Infections and Immunity 66(11): 5224–31, 1998.
SHAW-STIFFEL T. Reference to Hepatitis C Infection. London: Science Press; 2004.
SHETH S. G., FLAMM S. L., GORDON F. D., CHOPRA S. AST/ALT ratio predicts
cirrhosis in patients with chronic hepatitis C virus infection. American Journal
SHEVACH E.M., DIPAOLO R.A., ANDERSSON J., ZHAO D.M., STEPHENS
G.L.,THORNTON A.M. The lifestyle of naturally occurring CD4+ CD25+ FOXP3+
regulatory T cells. Immunology Review 212: 60–73, 2006.
SHIBAYAMA E., KOIZUMI H. Cellular localization of the trk neurotrophin receptor family
in human non-neuronal tissues. American Journal Pathology 148: 1807-1818, 1996.
SHIN J.Y., HUR W., WANG J.S., ET AL. HCV core protein promotes liver fibrogenesis via
up-regulation of CTGF with TGF-beta1. Experimental & Molecular Medicine 37: 138 –
145.189,190, 2005.
SHOUKRY N.H., CAWTHON A.G., WALKER C.M. Cell-mediated immunity and the
outcome of hepatitis C virus infection. Annual Review Microbiology 58: 391-42441,
2004.
SILVA I.S., FERRAZ M.L., PEREZ R.M., LANZONI V.P., FIGUEIREDO V.M., SILVA
A.E. Role of gamma-glutamyl transferase activity in patients with chronic hepatitis C
vírus infection. Journal of Gastroenterology and Hepatology 19: 314 -318, 2004.
SILVA L.C. Aspectos clínicos e diantígenonósticos das hepatites por vírus e por outras
causas. In: Hepatites Antígenoudas e Crônicas. Silva, L.C. (3 ed.), São Paulo. p. 135147, 2003.
116
SIMMONDS P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus – 15 years on. Journal of
General Virology 85: 3173–3188, 2004.
SIMMONDS, P., HOLMES, E. C., CHA, T.-A., CHAN, S.-W., MCOMISH, F., IRVINE, B.,
BEALL, E., YAP, P. L., KOLBERG, J. & URDEA, M. S. Classification of hepatitis C
virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the
NS-5 region. Journal of General Virology 74: 2391±2399, 1993.
SOFRONIEW, MV HOWE, CL MOBLEY, WC Nerve growth factor signaling,
neuroprotection, and neural repair. Annual review of neuroscience 24: 1217-81, 2001.
SOJKA D.K., HUANG Y.H., FOWELL D.J. Mechanisms of regulatory Tcell suppression - a
diverse arsenal for a moving target. Immunology 124(1): 13-22. 2008.
SORBI D., BOYNTON J., LINDOR K. The ratio of aspartate aminotransferease to alanine
aminotransferase: potential value in differentiating nonalcoholic steatohepatitis from
alcoholic liver disease. American Journal Gastroenterology 94: 1018-1022, 1999.
SPANGENBERG H.C., VIAZOV S., KERSTING N., NEUMANN-HAEFELIN C.,
MCKINNEY D., ROGGENDORF M. Intrahepatic CD8+ T-cell failure during chronic
hepatitis C virus infection. Hepatology 42: 828–837, 2005.
SPELETAS M., ARGENTOU N., GERMANIDIS G, VASILIADIS T., MANTZOUKIS
K., PATSIAOURA K., NIKOLAIDIS, VAIOS K.P., RITIS K., GERMENIS A. FOXP3
expression in liver correlates with the degree but not the cause of Inflammation.
Mediators of Inflammation, 2011: 9, 2011.
STOOP J.N., CLAASSEN M.A., WOLTMAN A.M. Intrahepatic regulatory T cells are
phenotypically distinct from their peripheral counterparts in chronic HBV patients.
Clinical Immunol 129: 419–427, 2008.
STOOP J.N., VAN DER MOLEN R.G., KUIPERS E.J., KUSTERS J.G., JANSSEN H.L.
Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral
immune response in chronic hepatitis B. Virology 361: 141-14, 2007.
STRACZKOWSKI M, KOWALSKA I., NIKOLAJUK A., KRUKOWSKA A., RSKA M.
Plasma interleukin-10 concentration is positively related to insulin sensitivity in young
healthy individuals. Diabetes Care 28(8): 2036–7, 2005.
STURM N, THÉLU MA, CAMOUS X, DIMITROV G, RAMZAN M, DUFEU DUCHESNE
T. Characterization and role of intra-hepatic regulatory T-cells in chronic hepatitis C
pathogenesis. The Journal of Hepatology 53: 25–35, 2010.
SU X., CHENG J., LIU W., LIU C., WANG Z., YANG, P., ZHOU T.,, MOUNTZ, J.D.
Autocrine and paracrine apoptosis are mediated by differential regulation of Fas ligand
activity in two distinct Jurkat T cell populations. The Journal of Immunology 160(11):
5288-93, 1998.
SUDA T., NAGATA S. Purification and characterization of the Fas-Ligand that induces
apoptosis. The Journal of Experimental Medicine 179(3): 873–879, 1994.
SUDA T., TAKAHASHI T., GOLSTEIN P., NANTÍGENOATA S. Molecular cloning and
expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell.,
75(6): 1169-78, 1993.
117
SUMMERS J., MASON W. S. Replication of the genome of a hepatitis B-like virus by
reverse transcription of an RNA intermediate. Cell, 29, (2): 403 – 415, 1982.
SYN, W. K. Accumulation of natural killer T cells in progressive nonalcoholic fatty liver
disease. Hepatology 51: 1998–2007, 2010.
TAUB R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell
Biology 5: 836-47, 2004.
THAKUR, V., GUPTAN, R.C., KAZLN, S.N., MALHOTRA, V., SARIN, S.K. Profile,
spectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the
Indian subcontinent. Journal of Gastroenterology and Hepatology 17: 165-170, 2002.
THIMME R., LOHMANN V., WEBER F. A target on the move: innate and adaptive immune
escape strategies of hepatitis C virus. Antiviral Resourch 69: 129-141, 2006.
THIMME R., WIELAND S., STEIGER C., GHRAYEB J., REIMANN K.A., PUCELL R.H.,
CHISARI F.V. CD8+ T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during
acute hepatitis B virus infection. Journal of Virology 77(1): 68-76, 2003.
THOMPSON C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 10:
267(5203):1456-62, 1995.
THOMPSON K., MALTBY J., FALLOWFI ELD J., MCAULAY M., MILLWARDADLER H., SHERON N. Interleukin-10 expression and function in experimental murine
liver infl ammation and fi brosis. Hepatology 28: 1597-1606, 1998.
THOMPSON K.C., TROWERN A., FOWELL A., MARATHE M., HAYCOCK C.,
ARTHUR M.J., SHERON N. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the
macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation In
vitro. Hepatology 28: 1518–1524, 1998.
TIMM, J. E ROGGENDORF, M. Sequence diversity of hepatitis C virus: implications for
immune control and therapy. World Journal of Gastroenterology 13: 4808-4817, 2007.
TORGERSON T.R., OCHS H.D. Regulatory T cells in primary immunodeficiency diseases.
Current Opinion Allergy Clinical Immunology 7(6): 515-21. 2007.
TOUBI E., KESSEL A., GOLDSTEIN L., SLOBODIN G., SABO E., SHMUEL Z.,
ZUCKERMAN E. Enhanced peripheral T-cell apoptosis in chronic hepatitis C virus
infection: association with liver disease severity. Journal of Hepatology 35: 774–780,
2001.
TRIM N, MORGAN S, EVANS M, ISSA R, FINE D, AFFORD S, WILKINS B, IREDALE
J: Hepatic stellate cells express the low affinity nerve growth factor receptor p75 and
undergo apoptosis in response to nerve growth factor stimulation. American Journal
Pathology 156: 1235–1243, 2000.
TUTTELMAN J.S., PUGH J.C., SUMMERS J.W. In vitro experimental infection of primary
duck hepatocyte cultures with duck hepatitisBvirus. Journal Virology 17: 25-58 1986.
UYAMA N., SHIMAHARA Y., KAWADA N., SEKI S., OKUYAMA H., IIMURO Y.
Regulation of cultured rat hepatocyte proliferation by stellate cells. Journal of
Hepatology 36: 590-9, 2002.
118
VOLPES, R., VAN DEN OORD, J. J. & DESMET, V. J. Hepatic expression of intercellular
adhesion molecule-1 (ICAM-1) inviral hepatitis B. Hepatology 12: 148–154, 1990.
VORUGANTI V.S., COLE S.A., EBBESSON S.O., GORING H.H., HAACK K., LASTON
S. A variação genética na APOJ, LPL, e TNFRSF10B afeta a distribuição de ácidos
graxos no plasma esquimós do Alasca. American Journal Clin Nutrition 91: 15741583, 2010.
WAN S., LECLERC J.L., SCHMARTZ D., BARVAIS .L, HUYNH C.H., DEVIERE J.,
DESMET J.M., VINCENT J.L. Hepatic release of interleukin-10 during cardiopulmonary
bypass in steroid-pretreated patients. American Heart Journal 133: 335–339, 1997.
WANG GH, SEEGER C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein
primer for viral DNA synthesis. Cell 13; 71(4): 663–670, 1993.
WANG S. C., OHATA M., SCHRUM L., RIPPE R.A., TSUKAMOTO H. Expression of
interleukin-10 by in vitro and in vivo activated hepatic stellate cells. The Jounal of
Biological Chemistry 273: 302–308, 1998.
WANG X.Z., ZHANG L.J., LI D., HUANG Y.H., CHEN Z.X., LI B. Effects of transmitters
and interleukin-10 on rat hepatic fibrosis induced by CCl4. World Journal of
WARD S.M., FOX B.C., BROWN P.J., WORTHINGTON J., FOX S.B., CHAPMAN R.W.
Quantification and localisation of FOXP3+ T lymphocytes and relation to hepatic
inflammation during chronic HCV infection. Journal of Hepatology 47: 316–324, 2007.
WHERRY EJ. T cell exhaustion. Nature Immunology 12: 492–499, 2011.
WILLIAMS A. L., HOOFNAGLE J. H. Ratio of serum aspartate to alanine aminotransferase
in chronic hepatitis: relationship to cirrhosis. Gastroenterology 95: 734-739, 1988.
WOO, M., HAKEM, R., SOENGAS, M.S., DUNCAN, G.S., SHAHINIAN, A., KAGI, D.,
HAKEM, A., MCCURRACH, M., KHOO, W., KAUFMAN, S.A., SENALDI, G.,
HOWARD, T., LOWE, S.W., MAK, T.W. Essential contribution of caspase 3/CPP32 to
apoptosis and its associated nuclear changes. Genes & Development 12: 806-819, 1998.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Hepatites C. Estimated prevalence and number
infected
by
WHO
region.
Disponível
no
endereço:
http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/. 2010.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Hepatitis B vaccines: WHO position paper—
Recommendations. Vaccine 28(3): 589-590, 2010.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Prevalence of hepatitis B virus infection in the world
by country. Data from the World Health Organization website, available at
http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/en/. Accessed jan 14, 2013.
XU D., FU J., JIN L., ZHANG H., ZHOU C., ZOU Z., ZHAO J.M., ZHANG B., SHI M.,
DING X., TANG Z., FU Y.X., WANG F.S. Circulating and liver resident CD4+CD25+
regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease
progression in patients with hepatitis B. Journal Immunol 177: 739-747, 2006.
119
YAGI H., NOMURA T., NAKAMURA K., YMAZAKI S., KITAWAKI T., HORI S. Crucial
role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD4+ regulatory T
cells. International Immunology 16(11): 1643-56. 2004.
YANG G, LIU A, XIE Q, GUO TB, WAN B, ZHOU B, ZHANG JZ. Association of
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells with chronic activity and viral clearance in
patients with hepatitis B. International Immunology 19: 133-1, 2007.
YANG J., GALLAGHER S.F., HAINES K. Kupffer cell-derived Fas ligand plays a role in
liver injury and hepatocyte death. The Journal Gastrointestinal Surgery 8(2): 166–174,
2004.
YONEHARA S, ISHII A, YONEHARA M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to
a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor.
Journal Experimental Medicine 169: 1747-1756, 1989.
YOU Q., CHENG L., KEDL R.M., JU C. Mechanism of T cell tolerance induction by murine
hepatic Kupffer cells. Hepatology 48: 978-990, 2008.
YUEN M.F., YUAN H.J., HUI C.K., WONG D.K., WONG W.M., CHAN A.O. A large
population study of spontaneous HBeAg seroconversion and acute exacerbation of
chronic hepatitis B infection: implications for antiviral therapy. Gut 52: 416-419, 2003.
YUN C., UM H.-R., JIN Y., WANG J.-H., LEE M.-O., PARK S., LEE J.-H., HYESEONG C.
NF-κB activation by hepatitis B virus X (HBx) protein shifts the cellular fate toward
survival. Cancer Letter 184: 97–104, 2002.
ZAHRAN W.E., SALAH EL-DIEN K. A., KAMEL P.G., EL-SAWABY A.S. Efficacy of
Tumor Necrosis Factor and Interleukin-10 Analysis in the Follow-up of Nonalcoholic
Fatty Liver Disease Progression. Indian Journal Clinical Biochemistry 28(2): 141–146,
2013.
ZAMAN A., ROSEN H.R., INGRAM K., CORLESS C.L., OH E., SMITH K. Assessment of
FIBROSpect II to detect hepatic fibrosis in chronic hepatitis C patients. American
Journal Medical 120(3): 280. e 9-14, 2007.
ZECHINI B., PASQUAZZI C., ACETI A. Correlation of serum aminotransferases with HCV
RNA levels and histological findings in patients with chronic hepatitis C: the role of
serum aspartate transaminase in the evaluation of disease progression. European
Journal Gastroenterology Hepatology 16: 891-896, 2004.
ZEKRI A-R. N., BAHNASSY A.A, HAFEZ M.M, HASSAN Z.K, KAMEL M., LOUTFY
S.A, SHERIF G.M, EL-ZAYADI A-R., DAOUD S.S. Characterization of chronic HCV
infection-induced apoptosis. Comparative Hepatology 10: 4, 2011.
ZHANG L.J., YU JP, LI D, HUANG YH, CHEN ZX, WANG XZ. Effects of cytokines on
carbon tetrachloride-induced hepatic fi brogenesis in rats. World Journal of
ZHANG LI-JUAN, WANG XIAO-ZHONG. Interleukin-10 and chronic liver disease World
Journal Gastroenterology 21; 12(11): 1681-1685, 2006.
ZHAO DM, THORNTON AM, DIPAOLO RJ, SHEVACH EM. Activated CD4+CD25+ T
cells selectively kill B lymphocytes. Blood107: 3925–32, 2006.
120
ZHU L.X., LIU J., XIE Y.H., KONG Y.Y., YE Y., WANG C.L., LI G.D., WANG Y.
Expression of hepatitis C virus envelope protein 2 induces apoptosis in cultured
mammalian cells. The World Journal Gastroenterology 10: 2972-8, 2004.
ZOULIM F. Mechanism of viral persistence and resistance to nucleoside and nucleotide
analogs in chronic hepatitis B virus infection. Antiviral Research 64: 1-15, 2004.
121
APÊNDICE
Extração de RNA de tecido (Kit NORGEN)
(Adaptado-Animal Tissue RNA Purification Product # 25700)
1. Preparação do lisado celular
a. Amostra do tecido.
b. Determinar a quantidade de tecido por pesagem. Recomendado começar com uma
quantidade de não mais de 10 mg.
Nota: tecido hepático 15mg (máximo).
c. Triturar o tecido cuidadosamente com um bastão mantendo-o em temperatura baixa
durante o processo.
d. Adicione 300 µl de solução de Lise para a amostra de tecido e continuar a moer até que
a amostra fique homogeneizada.
Nota: homogeneização máxima pode ser obtida ao se passar o lisado através de uma
agulha calibre 25 acoplada a uma seringa.
e. Com uma pipeta, transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga livre de RNase.
f. Adicionar 600 µL de água livre de RNase ao lisado. Vortex para misturar.
g. Adicionar 20 µL de Proteinase K reconstituída ao lisado, e incubar a 55°C por 15
minutos. Vortex os tubos ocasionalmente durante a incubação.
h. Centrifugar o lisado durante 1 minuto. Transferir o sobrenadante para um tubo de
microcentrífuga novo livre de RNase.
i. Adicionar 450 µL de etanol a 95% ao lisado. Vortex para misturar.
2. Montagem (encaixe) da coluna de RNA
a. Encaixe uma coluna (spin columns) dentro do collection tubes.
b. Adicione 600 µL do lisado com o etanol (do passo 1) dentro da coluna e centrifugue
por 1 minuto a 14. 000 rpm.
122
Nota: O volume completo do lisado tem que passar para dentro do collection tubes
através da coluna (spin columns). Se o volume completo do lisado não passar,
centrifugue novamente a coluna por 1 minuto a 14. 000 rpm.
c. Descartar o precipitado. Remonte a coluna com o collection tubes
d. Dependo do volume do seu lisado, repita os passos 2B e 2C, se necessário.
3. Lavagem da coluna
a. Adicione 400 µL da solução de lavagem dentro da coluna e centrifugue por 1 minuto.
Nota: O volume completo do lisado tem que passar para dentro do collection tubes
através da coluna (spin columns). Se o volume completo do lisado não passar,
centrifugue novamente a coluna por 1 minuto a 14. 000 rpm.
b. Repetir o passo 3a por mais duas vezes.
4. Eluição do RNA
a. Coloque a coluna dentro de um elution tube (fornecido pelo Kit.)
b. Adicione 50 µL do buffer de eluição dentro da coluna.
c. Centrifugue por 2 minutos a 2.000 rpm, em seguida centrifugue novamente por 1
minuto a 14.000 rpm. Se os 50 µL não estiverem bem eluídos, centrifugar novamente
a 14.00 rpm por 1 minuto.
Nota: Para um aproveitamento máximo de RNA possível. É recomendada uma
segunda eluição; feito dentro de um tubo de microcentrífuga (separado) e repetir os
passos 4B e 4C.
5. Estocagem do RNA
A amostra de RNA purificada pode ser estocada a -20° C por poucos dias. É recomendado
que as amostras sejam estocadas a -70 ° C quando o período de tempo de estocagem for
longo.
123
ANEXOS
124
ANEXO 1
125
ANEXO 2
126
127
128
ANEXO 3
FUNDAÇÃO SANTA CASA DE MISERICÓRDIA DO PARÁ
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA – ICCB
INSTITUTO EVANDRO CHAGAS
DEPARTAMENTO DE ANATOMIA PATOLÓGICA – UFPA
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO JOÃO DE BARROS BARRETO
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
1- Estou sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa sobre a CORRRELAÇÃO DE
MARCADORES IMUNOLÓGICOS, GENÉTICOS E DE ESTRESSE OXIDATIVO
COM A APRESENTAÇÃO CLÍNICA DA HEPATITE B CRÔNICA, que está sendo
desenvolvida na Fundação Santa Casa, no laboratório do Instituto Evandro Chagas, no de
Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará (UFPA) e
no Hospital Universitário João de Barros Barreto.
2- Para que eu decida em participar ou não da pesquisa me foram prestadas as seguintes
informações:
3- Os pesquisadores responsáveis são o Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto, biomédico e
professor de Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA e a Dra. Simone
Conde Professora do Instituo de Ciências da Saude da UFPA. Como integrante a aluna de
doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários Ednelza da Silva Graça,
Farmacêutica-Bioquímica do Hospital Universitário João de Barros Barreto/UFPA.
4- O objetivo da pesquisa é avaliar a associação entre as citocinas e o polimorfismo de seus
genes, bem como a expressão dos genes Fas, FasL, NGF, P75NTR e FOXP3 com o
padrão de infecção crônica pelo vírus da hepatite B.
5- Para esta pesquisa, será coletada uma pequena quantidade de sangue (10 mL) e nos casos
possíveis será realizada uma biópsia do fígado.
6- Os possíveis riscos incluem dor local e sangramentos. Todos os pacientes permanecerão
em observação por quatro horas após a realização da biópsia, sendo utilizados todos os
meios para evitar estes riscos. Serão utilizados materiais descartáveis, como agulhas e
seringas.
7- Além da coleta de sangue e biópsia hepática, os dados referentes a todo seu
acompanhamento e história clínica serão transportados para uma ficha de protocolo,
permitindo comparar os resultados do questionário com os achados nos testes de sangue.
8- Ninguém é obrigado a participar da pesquisa, assim como qualquer pessoa poderá deixar o
estudo no momento que quiser, pois não haverá prejuízo pessoal por esta causa,
garantindo o atendimento médico participando ou não da pesquisa.
9- Não haverá nenhum tipo de despesa para participação, assim como não haverá nenhuma
forma de pagamento para participação.
10- O grande benefício desta pesquisa par todos que participam é possibilitar um melhor
entendimento sobre a influência da resposta imunológica do hospedeiro (pessoa infectada)
através de suas citocinas e genes apoptóticos no tipo de evolução da doença crônica do
fígado pelo vírus da hepatite B. Alguns que se infectam podem eliminar espontaneamente
o vírus, enquanto outros se tornam crônicos, podendo evoluir para cirrose ou tumor de
fígado.
11- A participação é sigilosa, isto significa que, somente os pesquisadores ficarão sabendo de
sua participação. Os dados utilizados na pesquisa terão uso exclusivo neste trabalho, sem a
identificação individual do participante.
129
12- Ao final da pesquisa, os resultados serão fornecidos a todos os participantes através do
contato direto com seu médico assistente.
13- Qualquer dúvida sobre a pesquisa, o paciente poderá em contato com a Dra. Simone
Conde, no ambulatório de doenças hepáticas da Fundação Santa Casa, de 7:00 às 11:00h,
nas segundas, quartas e quintas-feiras, ou pelo telefone 4009-2273.
________________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsável
_________________________________________
No. da Carteira de Identidade
Consentimento Livre e Esclarecido
Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente
esclarecido (a) acerca do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro
ainda que por minha livre vontade, aceito participar, cooperando com a coleta de material
para exame.
Belém, ______ / ______ / _______
__________________________________________
Assinatura do Participante ou Responsável Legal
_________________________________________
No. da Carteira de Identidade
Prontuário:______________
Protocolo:_________________
Fone de contato: (91) 4009-2273
Ambulatório de Doença Hepática da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará
Hospital Universitário João de Barros Barreto

Quantificação da Expressão dos Genes FAS - PPGBAIP

Transcrição

Documentos relacionados

Resumo xpto

a hepatite c - Associação Portuguesa para o Estudo do Fígado

HEPATITES VIRAIS CRÔNICAS DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO

Liver Fibrosis in Chronic Hepatitis C Virus Infection

Adenomatose hepática - Departamento de Diagnóstico por Imagem

Clique para fazer o - Fundação Amazonas Sustentável

Dia europeu de Fibrose Quistica

PFF_PatEdu_note pad_ Portuguese-Brazil.indd

O Fígado - TalkingAlcohol.com

CIRROSE BILIAR PRIMÁRIA AMA NEGATIVA: CASO CLÍNICO