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HEMOGLOBINA Ref.: 43 Instruções de Uso MS 10009010037 Finalidade . Não refrigerar o reagente. Não armazenar em frasco plástico. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] O reagente não aberto, quando armazenado nas condições indicadas, é estável até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, o reagente está sujeito à contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Sistema para a determinação da hemoglobina em amostras de sangue total por reação colorimétrica de ponto final. Princípio . O Fe (II) do grupo heme da hemoglobina, oxihemoglobina e carboxihemoglobina é oxidado ao estado férrico pelo ferricianeto formando hemiglobina (Hi), que se combina com o cianeto ionizado para produzir cianeto de hemiglobina (HiCN), o qual é medido em 540 nm. Características do sistema . O pH do Reagente de Cor é baixo para acelerar a velocidade da reação. Foi também adicionado um detergente não iônico para prevenir aparecimento de turvação. A comparação entre as imprecisões encontradas na repetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistema de medição é bastante robusto nas regiões de concentrações significativas para uso clínico, indicando um desempenho muito seguro no dia a dia. O sistema é facilmente aplicável à analisadores automáticos e semiautomáticos capazes de medir com exatidão a absorbância em 540 nm. Metodologia . Cianeto de hemiglobina (HiCN). Reagentes 1. 1 - Reagente de Cor - Estoque - Armazenar entre 15 - 25 ºC. Contém ferricianeto de potássio 60,7 mmol/L, cianeto de potássio 76,8 mmol/L e surfactante. Não refrigerar. Veneno - Manusear com cautela. O reagente não aberto, quando armazenado nas condições indicadas, é estável até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, o reagente está sujeito à contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Não utilizar o Reagente de Cor de Uso quando este mostrar-se turvo ou descorado. Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação de reagentes. O Reagente de Cor contém cianeto de potássio que é venenoso. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Não desprezar o Reagente de Cor Estoque, de Uso, ou o utilizado na dosagem, em pias e recipientes que contenham resíduos de ácido sulfúrico. 01 Português - Ref.: 43 Material necessário e não fornecido 1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 520 e 550 nm. 2. Pipetas para medir amostras e reagente. 3. Cronômetro. 4. Padrão de Hemoglobina Ref. 47. Amostra Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que estabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Usar sangue total (citrato, EDTA ou oxalato), que pode ser armazenado pelo menos por 7 dias a 4 ºC. Valores de hemoglobina falsamente elevados podem ocorrer com o uso de torniquete por tempo prolongado. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Valores de Bilirrubina até 38 mg/dL e Triglicérides até 250 mg/dL não produzem interferências significativas. Valores de Triglicérides maiores que 250 mg/dL produzem resultados falsamente elevados. Preparo do reagente de cor . Adicionar o conteúdo de um frasco (10 mL) a 990 mL de água destilada ou deionizada e misturar. Estável 6 meses em frasco âmbar, entre 15 - 25 ºC. A água deve ter uma resistividade ≥1 megaohms ou uma condutividade ≤1 microsiemens e concentração de silicatos <0,1 mg/L. Não refrigerar. Não armazenar em frasco plástico. Calibração Procedimento Teste 5,0 mL 0,02 mL Reagente de cor de uso Sangue total Homogeneizar e esperar 5 minutos. Determinar a absorbância do teste em 540 nm ou filtro verde (520 a 550) acertando o zero com água destilada. A cor é estável várias horas. Obter o valor em g/dL utilizando o fator de calibração obtido com o Padrão de Hemoglobina Labtest (Ref. 47). Rastreabilidade do Sistema A absortividade milimolar da hemoglobina é utilizada como sistema de referência para a calibração do ensaio. A calibração do fotômetro utilizado é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 931 do National Institute of Standards and Technology (NIST). Calibrações manuais Calibração de 2 pontos: Quando o controle interno da qualidade indicar; Quando utilizar novo lote de Reagentes ou quando mudar de frasco; Linearidade O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 5,0 mL. Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição. Controle interno da qualidade . O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro total sejam 4,5 baseadas nos componentes da variação biológica (VB) . Cálculos Valores de referência . Estes valores devem ser usados apenas O cálculo deve ser feito utilizando o produto Padrão de Hemoglobina Labtest (Ref. 47). como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na população atendida sua própria faixa de valores de referência. Homens . 12,5 a 17,5 g/dL Absorbância do teste Hemoglobina (g/dL) = O resultado da medição é linear até 25 g/dL. x 10 Absorbância do padrão Mulheres . 11,5 a 15,5 g/dL Conversão . Unidades Convencionais (g/dL) x 0,621 = mmol/L Exemplo Abs. do teste = 0,364 Abs. do padrão = 0,280 0,364 Hemoglobina (g/dL) = x 10 = 13 0,280 Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia pode-se utilizar o método do fator. 10 Fator de Calibração = Absorbância do padrão Hemoglobina (g/dL) = Absorbância do teste x Fator Exemplo 10 Fator = = 35,7 0,280 Hemoglobina (g/dL) = 0,364 x 35,7 = 13 02 Português - Ref.: 43 Características do desempenho6 Exatidão . Em duas amostras com valores iguais a 7,3 e 8,0 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito obtendo-se recuperações entre 99 e 103%. O erro sistemático proporcional médio obtido em um valor de 10 g/dL foi igual a 0,1 g/dL ou 1%. Especificidade . O método proposto foi comparado com um método similar utilizando 80 amostras com valores situados entre 5,0 e 24,9 g/dL. A comparação resultou na equação da regressão: y = 1,03x 0,23 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,986. O erro sistemático total (constante e proporcional) verificado no limite de decisão (10 g/dL) foi igual a 0,07 g/dL ou 0,7%. Como as amostras foram selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma especificidade metodológica adequada. Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra 2 N 20 20 Média 9,6 17,1 DP 0,12 0,23 Referências CV (%) 1,2 1,4 N 20 20 Média 9,1 16,5 DP 0,15 0,23 2. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry, Principles and Technics, 2nd Ed. New York, Harper & Row, 1974. 3. Westgard Jo, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501. Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra 2 1. Drabkin DL., Austin JH. J Biol Chem 1935:112:51. CV (%) 1,5 1,4 Sensibilidade metodológica . Uma amostra protéica não contendo Hemoglobina foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado um valor igual a 0,39 g/dL, equivalente à média de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecção fotométrica é 0,04 g/dL, correspondendo a uma absorbância igual a 0,001. Efeitos da diluição da matriz . Duas amostras com valores iguais a 27,4 e 24,0 g/dL foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 4 foram encontradas recuperações entre 100 e 109%. Significado clínico . A hemoglobina é o principal componente das hemácias e tem como função o transporte de oxigênio. A determinação dos níveis de hemoglobina é impor tante no diagnóstico e acompanhamento das anemias e policitemias, sendo seu valor utilizado no cálculo da Hemoglobina Corpuscular Média (HCM), Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) e índices hematimétricos empregados na classificação das anemias. 4. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, B a s e d e D a t o s d e Va r i a c i ó n B i o l ó g i c a . D i s p o n í v e l em:<http://www.seqc.es/ar ticle/ar ticleview/330/1/170> (acesso em 04/2006). 5. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica 2005. 6. Labtest: Dados de arquivo. Apresentação Produto Hemoglobina Referência 43 Conteúdo 1 2 X 10 mL Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Observações Labtest Diagnóstica S.A. 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38 Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000 Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve ter resistividade ≥1 megaohm.cm ou condutividade ≤1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/L. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. 03 Português - Ref.: 43 Serviço de Apoio ao Cliente e-mail: [email protected] Revisão: Junho, 2009 Ref.: 010414 0800 031 34 11 (Ligação Gratuita) Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 04 Português - Ref.: 43
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