avaliação do índice apoptótico em cistos e granulomas periapicais
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avaliação do índice apoptótico em cistos e granulomas periapicais
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS Faculdade de Odontologia AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS Rosana Maria Leal Belo Horizonte 2003 ROSANA MARIA LEAL AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Clínicas Odontológicas com ênfase em Estomatologia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de mestre. Orientadora: Profa. Helenice de Andrade Marigo Co-orientadora: Profa. Franca Arenare Jeunon BELO HORIZONTE 2003 Rosana Maria Leal AVALIAÇÃO DO ÍNDICE APOPTÓTICO EM CISTOS E GRANULOMAS PERIAPICAIS Dissertação apresentada ao curso de Mestrado em Clínicas Odontológicas com ênfase em Estomatologia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte, 16 de dezembro de 2003 Profa. Helenice de Andrade Marigo (Orientadora) – PUC Minas Profa. Mireile São Geraldo dos Santos Souza – FAFEID Diamantina Prof. Carlos Roberto Martins – PUC Minas Agradeço a Deus pela vida e por estar presente no meu coração. Ao meu pai, José Leal (in memorium), apesar de não estar mais ao meu lado, sempre me incentivou e tenho certeza que continua me abençoando sempre. A minha querida mãe, Maria Lima Leal pela imensa compreensão, dedicação, estímulo, paciência e tanto amor. Aos meus primos Maria das Graças e Luiz Henrique pelo carinho e apoio nos momentos difíceis. Aos meus queridos Daniel, Thiago, Gabriela e Luigi pelas alegrias ao longo de todos esses anos. O meu agradecimento em especial a Helen Madson Queiroz (in memorium), por tudo que realizou no curto período que permaneceu entre nós, e por me guiar desde o inicio da minha caminhada e durante todos estes anos. Agora, minha querida mestra e amiga, você é uma estrela que brilha com muito mais grandeza. AGRADECIMENTOS A Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, em nome do diretor Félix de Araújo Souza, e do coordenador dos programas de mestrados Roberval de Almeida Cruz, por tornar possível à realização de mais uma etapa na minha formação profissional. A coordenadora da graduação da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Franca Arenare Jeunon, pela amizade e colaboração para que eu pudesse continuar esse processo de capacitação profissional. A minha orientadora Helenice de Andrade Marigo, no desenvolvimento deste trabalho, através do incentivo, ajuda, paciência, dedicação e ensinamentos nos caminhos da “apoptose”. Aos professores, Hermínia Marques Capistrano, Martinho Campolina Rebelo Horta, Ângela Ferraz Souza e Paulo Eduardo Alencar de Souza, colegas da disciplina de Estomatologia da Faculdade de Odontologia da PUC Minas, pelo apoio, amizade e contribuições para a realização deste trabalho. Ao meu mestre Carlos Roberto Martins, pelo exemplo de profissionalismo e amor a arte de ensinar. Aos professores da disciplina de Clínica Integrada, da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Ana Maria Abras da Fonseca, Margarete Teixeira Lima Fernandes, Mônica de Oliveira Santiago, Elizete dos Reis Borges e Eduardo Nunes, pelo incentivo e amizade durante esta jornada. A técnica do Laboratório de Anatomia Patológica, da Faculdade de Odontologia Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Maria Reni Moitinha, por sua colaboração no preparo do material utilizado na realização deste trabalho e ao longo de todos estes anos. Aos meus colegas do curso de pós-graduação, Paulo César de Lacerda Dantas e Fernanda Fonseca, Fernanda Fonseca Nunes, Ramon Aluâne Hipólito e Syvie Brener pelo apoio e incentivo. A minha colega do curso de pós-graduação Ana Maria Rebouças Rodrigues pela amizade, carinho e compreensão. Ao meu aluno Ícaro Buchholz Abdala, pela dedicação durante a realização deste trabalho. Aos professores Hugo Pereira Godinho e Nilo Bazzoli, do programa de pós-graduação em zoologia de vertebrados da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, na realização da documentação fotográfica. A professora Elizete Rizzo, pela gentileza e apoio dispensado, colocando à disposição o Laboratório de Ictiohistologia do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Faculdade Federal de Minas Gerais. Aos meus alunos, razão do meu constante aprendizado. A todos os funcionários da Faculdade de Odontologia e do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho. Aos pacientes que são a verdadeira razão da realização deste trabalho. APOIO FINANCEIRO FIP - Fundo de Incentivo a Pesquisa, da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. “ A beleza é a única coisa preciosa na vida. É difícil encontrá-la Mas quem consegue, descobre tudo. ” Charles Chaplin RESUMO Apoptose é uma palavra de origem grega que significa a queda das folhas das árvores. É um processo de morte celular programada controlada geneticamente. A morte celular por apoptose difere da morte celular por necrose. Células que morrem por apoptose são caracterizadas por alterações bioquímicas e morfológicas específicas, que culminam com a diminuição do volume celular e fragmentação da célula formando os corpos apoptóticos, que são fagocitados por macrófagos ou células vizinhas, sem causar inflamação. A apoptose é essencial para o desenvolvimento celular e embrionário e para a homeostasia do tecido. Defeitos no processo de apoptose pode estar relacionado a muitas condições patológicas humanas, inclusive câncer, doenças autoimmunes e desordens neurodegenerativas. Cistos e granulomas periapicais são bem reconhecidos, principalmente com relação à proliferação. Entretanto, estudos sobre apoptose nestas lesões periapicias inflamatórias são escassos. Portanto, este estudo pretendeu aumentar o conhecimento sobre apoptose, analisando e comparando o índice apoptótico destas duas lesões. PALAVRAS-CHAVE: Apotose, Morte celular programada. ABSTRACT Apoptosis, from a Greek word meaning the dropping of leaves from a tree, is a process of programmed cell death genetically controlled. Cell death by apoptosis differs considerably from cell death by necrosis. Cells dying by apoptosis is characterized by specific biochemical and morphological features that culminate in shrinkage of the cell and breaking up into apoptotic bodies that are engulfed by neighboring macrophages. Since intracellular contents are not release from apoptotic cells this process is not accompanied by inflammation. Apoptosis is essential for normal cellular and embryonic development and tissue homeostasis. Defects in apoptosis underlie many human pathological conditions, including cancer, autoimmune diseases and neurodegenerative disorders. Periapical cysts and granulomas are well recognized, specially about proliferation. However, studies about apoptosis in these lesions are uncommon. Therefore, this study intended to increase the knowledge on apoptose, analyzing and comparing the apoptótic index of these two lesions. KEYWORDS: Apoptosis, Cell death, Programmed cell death. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 17 2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................... 18 2.1 Apoptose ................................................................................................. 18 2.2 Apoptose e Processos Inflamatórios ....................................................... 26 2.3 Imunologia das Lesões Periapicais ......................................................... 31 2.4 Cisto Periapical ........................................................................................ 34 2.5 Granuloma Periapical .............................................................................. 38 3 OBJETIVOS ............................................................................................... 41 3.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 41 3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 41 4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 42 4.1 Amostra e Processamento do material ................................................... 42 4.2 Coloração HE .......................................................................................... 42 4.3 Coloração em Metil-Green-Pironia .......................................................... 43 4.4 Marcação “in situ” da fragmentação do genoma ..................................... 44 4.5 Determinação da amostra mínima de campos a serem contados .......... 45 4.6 Análise estatística .................................................................................... 52 4.7 Microfotografias ....................................................................................... 52 5 RESULTADOS ........................................................................................... 53 6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 71 7 CONCLUSÕES .......................................................................................... 77 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 78 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o granuloma periapical (expressa em porcentagem) .............................................................. 47 TABELA 2 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o cisto periapical (expressa em porcentagem) ..................................................................................... 48 TABELA 3 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística (expressa em porcentagem) ......... 49 TABELA 4 - Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical (expressa em porcentagem).............. 50 TABELA 5 - Relação dos pacientes com granuloma periapical com os dados relativos ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença ....... 54 TABELA 6 - Relação dos pacientes com cisto periapical com os dados relativos ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença ..................... 58 TABELA 7 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) de granulomas periapical ........................................................................ 66 TABELA 8 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) de cistos periapicais .......................................................................................... 67 TABELA 9 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos granulomas periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais .......................................................................................... 68 TABELA 10 - Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do epitélio e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais ............................... 70 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 - Coeficiente de variação versus número de campos para o granuloma periapical ....................................................................... 47 GRÁFICO 2 - Coeficiente de variação versus número de campos para o cisto periapical ......................................................................................... 48 GRÁFICO 3 - Coeficiente de variação versus número de campos para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística .................. 50 GRÁFICO 4 - Coeficiente de variação versus número de campos para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical ........................ GRÁFICO 5 - 51 Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com o gênero dos pacientes ................................................................... 53 GRÁFICO 6 - Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com a cor dos pacientes ......................................................................... 53 GRÁFICO 7 - Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com o gênero dos pacientes ...................................................................... 57 GRÁFICO 8 - Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com a cor dos pacientes .................................................................................. 57 GRÁFICO 9 - IA entre granulomas e cistos periapicais ......................................... 67 GRÁFICO 10 - IA entre granulomas e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais 69 GRÁFICO 11 - IA entre epitélio e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais ....... 69 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - Granuloma periapical (aumento de 100x) em HE ............................... 55 FIGURA 2 - Granuloma periapical (aumento de 200x) em HE ............................... 55 FIGURA 3 - Granuloma periapical (aumento de 400x) em HE ............................... 56 FIGURA 4 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) em HE ............................. 56 FIGURA 5 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 59 FIGURA 6 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 60 FIGURA 7 - Cisto periapical (aumento de 100x) em HE ......................................... 61 FIGURA 8 - Cisto periapical (aumento de 400x) em HE ......................................... 61 FIGURA 9 - Cisto periapical – Infiltrado inflamatório (aumento de 1000x) em Metil-Green-Pironina ........................................................................... 63 FIGURA 10 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) em Metil-Green-Pironina.. 63 FIGURA 11 - Cisto periapical – Epitélio cístico (aumento de 1000x) em Metil-Green-Pironina ........................................................................... 64 FIGURA 12 - Cisto periapical (aumento de 1000x) – TUNEL (células apoptóticas).. 65 FIGURA 13 - Granuloma periapical (aumento de 1000x) – TUNEL (células apoptóticas) ......................................................................................... 65 ABREVIATURAS APAF - Fator ativador da apoptose APAF1 - Fator ativador da apoptose 1 IL-1 - Interleucina-1 IL-1α - Interleucina-1alfa IL-1β - Interleucina 1beta IL-2 - Interleucina-2 IL-4 - Interleucina-4 IL-6 - Interleucina-6 IL-8 - Interleucina-8 IL-10 - Interleucina-10 IL-13 - Interleucina-13 INF-γ - Interferon-gama PG - Prostaglandina TNF - Fator de necrose tumoral TNF-α - Fator de necrose tumoral-alfa TGF-β - Fator de crescimento transformador-beta TGF-β1 - Fator de crescimento transformador-beta1 PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas G-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos MG-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos monócitos NFkB - Fator nuclear-kB ICE - Enzima conversora de interleucina 1β DD - Domínio da morte FasL - Ligante Fas FADD - Domínio da morte associado ao Fas TNFr - Receptor para o fator de necrose tumoral TRADD - Domínio da morte associado ao TNFr MPTP - Poro de transição de permeabilidade mitocondrial NK - Linfócito natural killer Th - Linfócito T helper (auxiliar) Ts - Linfócito T supressor (citotóxico) PMN - Polimorfonucleares neutrófilos HE - Hematoxilina eosina µm - Micrômetro µm2 - Micrometro quadrado µl - Microlitro MM - Milímolar Ml - Mililitro Mm - Milímetros Cm - Centímetro Kda - kilodalton PBS - Tampão fosfato salina 0 - Grau centígrado TUNEL -Terminal dioxynucleotidyl transferase mediated digoxigenin-UTP-nick- C end-label (marcação das porções finais do genoma fragmentado através da inserção de nucleotídeos) IA - Índice apoptótico ME - Média DP - Desvio padrão CV - Coeficiente de variação P - Probabilidade 1. INTRODUÇÃO Apoptose é uma forma de morte celular que se distingue da necrose por dois aspectos básicos: primeiro porque é um processo ativo, durante o qual os componentes celulares se reorganizam e se agrupam, formando posteriormente fragmentos celulares envoltos por membrana (corpos apoptóticos), os quais não sofrem autólise, mas são fagocitados por células vizinhas; o outro aspecto básico é que a apoptose acomete células individualmente ou em pequenos grupos celulares. A apoptose é encontrada nos processos fisiológicos, como os que ocorrem durante a morfogênese dos órgãos, tanto na vida embrionária como após o nascimento. Como processo patológico, a apoptose é observada em lesões induzidas por agressão imunitária celular, por radiações ionizantes ou por drogas citotóxicas e por neoplasias malignas. Na literatura, os cistos e granulomas periapicais são muito bem reconhecidos e descritos, inclusive com relação ao índice mitótico, entretanto, os estudos sobre apoptose nestas lesões são escassos. Portanto, com este trabalho, pretendeu-se aumentar o conhecimento sobre apoptose, analisando e comparando o índice apoptótico destas duas lesões. 18 2 . REVISÃO DA LITERATURA 2.1 APOPTOSE A manutenção da homeostasia tecidual nos organismos multicelulares é assegurada por diferentes mecanismos biológicos regulatórios, entre os quais a apoptose. O termo apoptose descrito pela primeira vez por KERR, WYLLIE & CURRIE, em 1972, é de origem grega (apo=separação, ptosis=queda) e significa a queda de folhas das árvores ou das pétalas de uma flor em analogia para representar a morte celular fisiológica que implica em renovação (COHEN, 1991; HÄCKER, 2000; VAUGHAN et al., 2002). Além de seu papel fisiológico que regula a população celular, a apoptose controla os processos de desenvolvimento embrionário e morfogênese e limita as reações imunes. Desempenha também, um papel importante nos processos patológicos, como nas lesões induzidas por agressão imunitária celular (células T citotóxicas e linfócitos “Natural Killer” (NK), por radiações ionizantes ou por drogas citotóxicas e em neoplasias malignas não tratadas (COHEN, 1997; JIANG et al., 2000; KUWANO & HARA, 2000; AMEISEN, 2002). As alterações morfológicas observadas são representadas por compactação das organelas, principalmente mitocôndrias e ribossomos, tornando a célula mais arredondada. Os desmossomas são destruídos e os espaços intercelulares aumentados. O retículo endoplasmático, as mitocôndrias, os lisossomas e a membrana plasmática permanecem intactos (JÄNICKE et al., 1998; MILLS et al., 1999; ZHANG & XU, 2000). 19 As alterações morfológicas e bioquímicas no núcleo são representadas por picnose e condensação da cromatina, em forma de meia lua, na periferia da membrana nuclear, e pela clivagem internucleossômica da cromatina que forma fragmentos de DNA, de tamanho entre 180 e 200 pares de base ou seus múltiplos. A medida que o fenômeno prossegue, a célula separa-se das células adjacentes, perde as microvilosidades e forma protuberâncias na superfície, fragmentando-se e formando estruturas circundadas por membrana, contendo partes do núcleo e/ou citoplasma e/ou organelas intactas denominadas de corpos apoptóticos. Através de uma enzima denominada flipase, a membrana celular altera o posicionamento de seus lipídios, principalmente da fosfatidilserina, servindo de sinalizador para que fagócitos englobem os corpos celulares e completem o processo (COTTER et al., 1990; FESUS et al., 1991; WYLLIE, 1992; UEDA & SUDHIR, 1993; NAGATA et al., 2003). O estudo pioneiro no nematóide Caenorhaditis elegans, que contém 1090 células, permitiu através de sua transparência, observar o desaparecimento de 131 células durante o seu desenvolvimento e também conhecer todos 14 genes envolvidos no processo de apoptose. Os mais caracterizados são o ced-3 e o ced-4, considerados reguladores positivos da morte celular programada e o ced-9 considerado regulador negativo da apoptose (DUKE et al., 1996; LI et al., 1998). Um número crescente de genes tem sido identificado como capazes de atuar no processo de morte celular programada. Entre eles encontra-se a família das proteínas bcl-2, que desempenha papel fundamental na regulação da apoptose em condições fisiológicas ou patológicas. Pelo menos 15 membros dessa família já foram identificados nos mamíferos. Algumas dessas proteínas, como bcl-2, bcl-xl, 20 bcl-w e mcl-1 são anti-apoptóticos, enquanto outras, como a bax, bad e bid são pró-apoptóticas (ADAMS & CORY, 1998, WOO et al., 2000). Muitos membros da família bcl-2 residem na membrana externa da mitocôndria, na membrana nuclear e no retículo endoplasmático. Na mitocôndria, distribuem-se focalmente, nos locais de contato entre a membrana interna e externa. Três funções têm sido descritas para essas proteínas: dimerização, atividade formadora de poro ou canal de íons, e ligação a outras proteínas. A formação de heterodímeros entre proteínas agonistas e antagonistas, pode inibir a apoptose pela neutralização das agonistas ou promover a apoptose pelo deslocamento de fatores pró-apoptóticos ligados a antagonistas, como por exemplo, o fator-1 ativador da apoptose (APAF-1) (JARPE et al., 1998; HUMLOVÁ, 2002; SCORRANO & KORSMEYER, 2003). Os principais antagonistas da apoptose, bcl-2 e bcl-xl, localizam-se principalmente, na membrana mitocondrial e acredita-se que um dos mecanismos pelos quais essas proteínas mantêm a homeostasia celular, seja o de regulação da permeabilidade das membranas nas quais se distribuem. A proteína bcl-2, também bloqueia a penetração nuclear de perfurina e granzima-B, substâncias liberadas pelos linfócitos T citotóxicos contra seus alvos e que podem ser ativadoras de caspases. Os membros pró-apoptóticos da família bcl-2 são encontrados normalmente no citosol e quando ativados, se translocam para a mitocôndria, alterando a permeabilidade da membrana dessa organela, permitindo a liberação de proteínas pró-apoptóticas, tais como o citocromo c, o fator indutor da apoptose e pró-caspases 2 e 9 (HIDALGO & VIEIRO, 1999; REED, 2000; WOO et al., 2000; LAHM et al., 2003; OPFERMAN & KORSMEYER, 2003). 21 O p53, também envolvido no processo de morte celular programada é uma proteína codificada por um gene, que leva o mesmo nome (gene p53), em conseqüência de seu peso molecular de 53 Kda. Este gene está situado no cromossomo de número 17. Sua principal função está relacionada à preservação da integridade do código genético em cada célula, ou seja, a manutenção da mesma seqüência de nucleotídeos ao longo de toda a molécula de DNA (IRWIN & KAELIN, 2001). Durante o ciclo de divisão celular, essa proteína policia o genoma, verificando a ocorrência de uma mutação na seqüência do código genético em busca de uma duplicação defeituosa do DNA (erro de replicação). Quando ocorre o defeito no DNA, há dois caminhos que poderão ser seguidos: a correção da mutação através da ativação de proteínas de reparo ou a indução da apoptose (BRINCK et al., 2002). Devido a esta função de detecção de alterações no DNA e conseqüente reparo ou morte celular, a proteína p53 é considerada como uma guardiã do genoma, e é um importante elemento na prevenção do desenvolvimento de tumores, sendo seu gene codificador classificado como gene supressor de tumor (RALHAN et al., 2000). O gene c-myc codifica uma fosfoproteína nuclear (c-myc) a qual liga-se a seqüências específicas do DNA induzindo a transcrição de certos genes importantes na regulação da proliferação celular. Ele não está diretamente envolvido no processo apoptótico. Quando o c-myc está ativado com os genes envolvidos no processo de apoptose, a morte celular programada poderá ser induzida ou não. Quando o c-myc está associado ao p53 a apoptose poderá acontecer. Quando associado ao bc-2 o processo será inibido (SUSUMU et al., 2001; VERMEULEN et al., 2003). A apoptose pode ser induzida por estímulos externos, através de receptores específicos na superfície celular denominados receptores da morte ou por estímulos 22 internos, como lesão do DNA ou perturbações no ciclo celular ou nas vias metabólicas. Essas diferentes vias culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases, que desempenham um papel fundamental no processo de morte celular programada (PAROLIN & REASON, 2001). As caspases estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornado-se ativas após clivagem proteolítica à altura de resíduos do ácido aspártico. Pelo menos 14 membros dessa família já foram identificados nos mamíferos e estão envolvidos no processo de apoptose (THORNBERRY, 1999; SUSIN et al., 2000). Uma vez ativada, a maioria das caspases tem a habilidade de catalizar a ativação de muitos outros membros dessa família, resultando em amplificação da cascata proteolítica. Alguns membros, como a caspase-8, agem como reguladores e iniciadores, enquanto outros como a caspase-3, agem como efetores da fragmentação celular (SALVESEN & VISHVA, 1999). As caspases têm substratos restritos, o que lhes assegura um processo de seletividade e especificidade no processo de proteólise. Tais substratos incluem proteínas envolvidas no reparo de danos e replicação do DNA, no ciclo celular, na transdução e na manutenção da integridade da estrutura celular (HOWARD & XIAOLU, 2000; FALEIRO & LAZEBNIK, 2000; WOO et al., 2000; LeBLANC, 2003). Um dos mecanismos pelos quais a apoptose pode ser iniciada é através dos receptores da morte presentes na superfície celular, que são ativados em resposta ao acoplamento de ligantes específicos. A maioria dos receptores da morte identificados é membro da superfamília de receptores para o fator de necrose tumoral (TNFr) e é caracterizada por apresentar uma porção extracelular rica em cisteína e uma região citoplasmática, denominada domínio da morte (death domain = DD), essencial para a transdução intracelular do sinal da morte. 23 Entre esses receptores, um dos mais estudados e bem reconhecidos é o receptor Fas (CD95 ou APO-1). Quando o ligante-Fas (Fas L) se acopla ao receptor Fas, as moléculas individuais do receptor se trimerizam formando um agregado de cadeias da morte, permitindo que as mesmas se liguem a uma proteína adaptadora presente no citosol, denominada domínio da morte associada ao Fas (Fas-associated death domain ou FADD). A ligação desse complexo a pró-caspase-8 resulta na ativação dessa enzima por clivagem proteolítica. A caspase-8 pode então, diretamente ativar a caspase-3 (AMARANTE-MENDES & GREEN, 1999; CECCONI, 1999; GULBINS et al., 2000; DUCKETT, 2002; BRIDGHAM et al., 2003). O receptor Fas é expresso em uma variedade de células, incluindo células epiteliais, hematopoiéticas e linfócitos B e T ativados. O padrão de expressão tecidual do ligante Fas é mais restrito, sendo expresso nos linfócitos T maduros CD4+ e CD8+ e nas células NK ativadas. A expressão simultânea de receptor Fas e Fas L, em linfócitos maduros ativados, pode representar um mecanismo de autolimitação da resposta imunológica. Citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-1, ou a presença de estresse oxidativo, que resulta na lesão de DNA e ativação do p53, podem aumentar a expressão dos receptores Fas, tornando as células mais susceptíveis a apoptose pelo sistema Fas (LAHM et al., 2003; MEDEMA, 2003). Além dos receptores da morte, a apoptose pode também ser induzida por sinais de estresse intracelular que resultam em disfunção mitocondrial e alterações nas vias metabólicas, através do aumento do cálcio intracelular, da redução do pH ou do estresse oxidativo, por drogas, toxinas ou privação dos fatores de crescimento. Na presença desses sinais, ocorre a translocação de proteínas pró-apoptóticas do citosol para a mitocôndria, resultando na liberação do 24 citocromo-c, presente no espaço existente entre a membrana mitocondrial externa e interna. No citosol, o citocromo-c forma um complexo com o fator ativador da apoptose (APAF), levando à ativação da caspase-9, que ativa caspases efetoras (REED, 2000; SEGAL & BEEM, 2001; BALIGA & KUMAR, 2003). A mitocôndria participa da manutenção de funções celulares vitais, tais como respiração celular e síntese de ATP, regulação osmótica, controle do pH, homeostasia do cálcio no citosol e sinalização intracelular. Paradoxalmente, a mitocôndria reserva no espaço intermembranoso substâncias letais, capazes de provocar o processo de morte celular programada, entre as quais o citocromo-c. Quando liberado da mitocôndria, o citocromo-c se associa a duas proteínas presentes no citosol – APAF-1 e a pró-caspase-9 e na presença de ATP, ativa a caspase-9. A caspase-9, por sua vez, ativa as pró-caspases-3 e 7, que executam o processo de apoptose. A caspase-3 pode amplificar a cascata de proteólise pela ativação da caspase-8 e pela clivagem da proteína anti-apoptótica bcl-2 que, normalmente, garante a integridade da membrana mitocondrial (CRYNS & YUAN, 1998; ROSETO & BRENNER, 1999; DEGLI, 2003). Para a manutenção da integridade celular é necessário que os componentes pró-apoptóticos, presentes no interior da mitocôndria, não sejam liberados para o citosol. Existe na membrana mitocondrial interna uma estrutura protéica denominada poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP), que se mantém habitualmente fechado, assegurando a sobrevivência celular. Seu fechamento é facilitado pelo magnésio intracelular, pelo potencial elevado da membrana mitocondrial, pela expressão das proteínas bcl-2 e bcl-xl, pela maior expressão da superperóxido dismutase mitocondrial, rica em manganês, que atua como 25 removedora de radicais de superperóxido, e pela translocação do fator nuclear-kB (NFkB) (JIANG et al., 2000; VAN GURP et al., 2003). Diferentes estímulos podem causar a abertura do poro de permeabilidade, resultando na morte celular pela ativação das caspases, como a ligação do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), ligantes-Fas, ou do fator de crescimento transformador-β1 (TGF-β1) aos respectivos receptores na membrana celular ou a entrada de granzima-B, liberada pelos linfócitos T citotóxicos e facilitada pela perfurina. A caspase-8 ativada cliva a proteína pró-apoptótica bid, presente no citosol, gerando um fragmento dessa proteína, que se liga à mitocôndria, permeabilizando as suas membranas (GRANVILLE et al., 1999; DUCKETT, 2002; VAN LOO et al., 2002). Uma das conseqüências da abertura do poro de permeabilidade é a expansão da matriz mitocondrial devido a sua hiperosmolaridade. A membrana mitocondrial interna, apresentando várias pregas, pode acomodar o aumento do volume da matriz, enquanto a membrana externa se rompe, liberando componentes pró-apoptóticos, como o fator indutor de apoptose e o citocromo-c. Outra conseqüência é a entrada de prótons na matriz, causando colapso no potencial de membrana mitocondrial e comprometendo a síntese de ATP (DEGTEREV et al., 2001). A abertura do poro de permeabilidade mitocondrial causa, simultaneamente, ativação das caspases (potencialmente levando à apoptose) e depleção de ATP (potencialmente levando à necrose). Essa disputa entre ativação das caspases e depleção de ATP irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja por necrose. A disputa pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente ativadas pelos receptores da superfície celular ou granzima-B e quando o poro de 26 permeabilidade se abre em apenas algumas mitocôndrias, permitindo que as demais sintetizem ATP. Nestas circunstâncias, a célula entra no processo de morte programada. Por outro lado, se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a célula não pode obter energia suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção do ATP impede que a apoptose se instale e a célula desenvolve o processo de necrose (GREEN & REED, 1998). A morte celular, definida como perda irreversível da estrutura e funções vitais da célula, ocorre por dois processos morfologicamente distintos: necrose e apoptose. A necrose se caracteriza pela perda da integridade da membrana plasmática e alteração de seus gradientes eletroquímicos promovendo a liberação dos constituintes intracelulares para o meio extracelular, estimulando a resposta inflamatória e ampliando a lesão tecidual (BRASILEIRO FILHO, 1993; ZHANG & XU, 2000; DENECKER, 2001). 2.2 APOPTOSE NOS PROCESSOS INFLAMATÓRIOS Os últimos anos presenciaram considerável avanço na compreensão dos mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na regulação da apoptose, elucidando seu papel na fisiopatologia de diversas doenças. As doenças em que este processo de morte celular programada parece exercer um papel importante podem ser divididas em dois grupos: 1) doenças com inibição parcial da apoptose, como por exemplo, neoplasias (câncer colorretal, gliomas, hepatocarcinomas, linfomas, neuroblastoma, carcinoma epidermóide e câncer de próstata), doenças autoimunes (artrite reumatóide, miastenia gravis e lupus eritematoso sistêmico) e doenças inflamatórias (inflamações intestinais e hepáticas) e 2) doenças com 27 apoptose excessiva, como por exemplo, doenças neurodegenerativas (Alzheimer e Parkinson), epilepsia, alcoolismo, anemia aplástica, síndromes mielodisplásicas, isquemia miocárdica e cerebral e doença renal policística (BOSMAN et al., 1996; ROSETO & BRENNER, 1999; RAMOS et al., 2000; SATCHELL et al., 2003). Durante os processos inflamatórios, citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, moléculas como o FasL, glicocorticóides e granzimas podem induzir apoptose em varias populações celulares, enquanto outras citocinas como a interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) normalmente, inibem este processo (OBERHOLZER et al., 2001). Níveis aumentados dessas citocinas pró-inflamatórias são relatadas nas síndromes sépticas e nas endotoxemias (CASEY et al., 1993) e em traumas severos (MARTIN et al., 1997). PAROLIN & REASON (2001) relatam que a presença de corpos apoptóticos em espécimes de biópsia hepática de portadores de hepatites virais é um achado comum e ilustra a participação da apoptose nestas infecções. O principal mecanismo efetor de morte das células infectadas pelo vírus é mediado pelos linfócitos T citotóxicos e pelas células NK. A apoptose via sistema Fas, tem sido documentada como um dos mecanismos de citotoxidade pelos quais os linfócitos T citotóxicos induzem a morte dos hepatócitos nas hepatites virais. Para assegurar o sucesso dessa função, visto que muitos vírus desenvolvem estratégias anti-apoptóticas, produzindo proteínas capazes de inativar o p53 ou estimular a maior expressão de bcl-2, os linfócitos T citotóxicos dispõem de diferentes mecanismos para levar a morte celular por apoptose, incluindo o sistema Fas e TNF-α, bem como a liberação de perfurina e grazima-B (PESSAYRE et al., 1999; SOLÁ et al., 2001). 28 O vírus Epstein-Barr, que causa a mononucleose e está associado ao câncer linfático, produz proteínas semelhantes a bcl-2 que inibe a apoptose (DUKE et al., 1996), e o papilomavírus, principal causa do câncer de colo uterino, desativa ou degrada a p53 indutora da apoptose (LILES, 1997). A resolução do processo inflamatório crônico proliferativo ou sua evolução para a esclerose nas glomerulonefrites está relacionada à presença ou ausência de fatores desencadeantes ou inibidores do processo de morte celular programada. Em pacientes com doenças glomerulares, foram identificados imunohistoquimicamente, células positivas para o Fas e para o bcl-2, indicando que a apoptose mediada pelo sistema Fas é responsável pela perda de células glomerulares na evolução dessas infecções e que a expressão aumentada de bcl-2 está relacionada à persistência da hipercelularidade (TAKEMURA et al., 1995; MAKINO et al., 1996; BONINI et al., 2000). Em modelo experimental de glomerulonefrite, em camundongos, demonstrou-se que, em estágios iniciais da inflamação, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e outras citocinas, diminuem a expressão do receptor Faz. Há síntese de proteínas que inibem o sistema de apoptose mediado por Fas em células mesangiais, favorecendo o padrão proliferativo da glomerulonefrite. Entretanto, em estágios avançados da inflamação, células mesangiais podem ser deletadas por este sistema, desde que a produção dessas proteínas inibidoras esteja suprimida e o receptor Fas seja expresso na superfície celular (YASUTOMO et al., 1996). VAISHNAW et al (1997) e RABINOVICH (2000) demonstraram através de estudos de imunohistoquímica, que a produção de citocinas pró-inflamatórias como a interleucina-1beta (IL-1β) e o TNF-α estão relacionadas com a inibição da 29 apoptose na artrite reumatóide, através da expressão aumentada de bcl-2, contribuindo para a degradação tecidual e destruição óssea e cartilaginosa nesta doença. A apoptose é detectada em várias doenças bucais, como por exemplo, líquen plano (ARENARE-JEUNON, 1999), ceratocisto odontogênico (MURAKI et al., 1997), leucoplasia, papiloma escamoso, carcinoma de células escamosas (MARIGO, 1999), linfoma oral (REGEZI et al., 1998), úlcera aftosa (HONNA et al., 1985), eritema multiforme (CHRYSOMALI et al., 1997), síndrome de Sjögren (ISHIMARU et al., 2000), candidíase mucocutânea (HEIDENREICH et al., 1996) e doença periodontal (KOULOURI et al., 1999). JEWETT et al (2000) por imunohistoquímica, verificaram o papel da bactéria Fusobacterium nucleatum, na indução da apoptose em células mononucleares e polimorfonucleares neutrófilos (PMN), demonstrando que a morte celular programada nestas células foi induzida por uma proteína da superfície bacteriana e regulada através de proteínas sinalizadoras como a ICE (enzima conversora de interleucina 1β) e fator nuclear kB (NF-kB) das células alvo. Além disso, observaram que a apoptose prematura destas células, pode diminuir a resistência do hospedeiro e desempenhar um papel importante no inicio e progressão da doença periodontal. KATO et al (2000) demonstraram, imunohistoquimicamente, que o Actinobacillus actinomycetemcomitans induz apoptose nas células epiteliais orais através de sua toxicidade mediada por endonucleases endógenas e está envolvido na iniciação e progressão da periodontite, particularmente a do tipo agressiva. A periodontite é a maior causa da perda de dentes em adultos e é caracterizada pela presença de células mononucleares compostas por linfócitos T e B e plasmócitos, as quais persistem por um longo período de tempo (WASSENAAR 30 et al., 1995). A cronicidade dessa doença também pode ser explicada pela ausência da interleucina-4 (IL-4) na gengiva inflamada inibindo a apoptose dos macrófagos (YAMAMOTO et al., 1996). Na doença periodontal, o sistema Fas/FasL desempenha um importante papel no controle da morte celular programada, principalmente nos linfócitos T e B (NAGATA, 1997). As proteínas bcl-2 e bcl-xl, são expressas nos linfócitos das lesões periodontais indicando inibição da apoptose nestas células (KROEMER, 1997). A proteina bax, também é expressa na população linfocítica das lesões do periodonto e sua interação com a bcl-2 pode inibir a apoptose (PARIJS & ABBAS, 1998). SAWA et al (1999) analisaram, por métodos imunohistoquímicos, a expressão de proteínas bcl-2, bax e bcl-xl em linfócitos isolados de lesões periodontais e compararam-nas com linfócitos periféricos dos mesmos doadores. Estes autores observaram que, tanto bcl-2 quanto bcl-xl, mostraram menor expressão nos linfócitos das lesões periodontais do que nos periféricos. A expressão de bax foi superior à da bcl-2 nos linfócitos das lesões periodontais sugerindo que estas células são susceptíveis à apoptose. Investigaram também a interação entre Fas/FasL, demonstrando que o receptor Fas é mais expresso do que o FasL, sendo insuficiente para a interação deste sistema de sinalização e por isso, relacionada a persistência dessas células inflamatórias mantendo a cronicidade da doença. TAKAHASHI et al (1999) investigaram através da hibridização in situ e da imunohistoquímica a síntese celular, proliferação e apoptose em lesões periapicais. Neste estudo foram selecionadas 25 amostras de tecido periapical, sendo 15 granulomas e 10 cistos radiculares, obtidos de 13 indivíduos do gênero masculino e 12 do feminino, submetidos a exodontias ou a apicetomias. A idade média destes 31 pacientes foi de 38,8 anos e as lesões se apresentavam radiograficamente com aproximadamente, 5 mm de diâmetro. Foi demonstrado que os achados morfológicos característicos da apoptose não foram claramente observados nas secções coradas em HE, entretanto, a fragmentação nuclear dos PMN foi bem evidenciada através do método in situ-end labelling (ISEL). Células apoptóticas foram detectadas em 23 dos 25 casos selecionados. Segundo os autores o processo de apoptose ocorreu predominantemente em PMN, presentes nas lesões periapicais. 2.3 IMUNOPATOLOGIA DAS LESÕES PERIAPICAIS As principais alterações patológicas que acometem os tecidos periapicais são de natureza inflamatória, ocorrendo como resultado de estimulação antigênica contínua pelo egresso de bactérias e seus produtos dos canais radiculares estando associadas à resposta imunológica do hospedeiro, no intuíto de conter o avanço da infecção endodôntica. Quando a agressão é persistente e não resolvida pela mobilização dos mecanismos de defesa do hospedeiro, instala-se um processo crônico caracterizado por uma resposta imunológica adaptativa, de caráter especifico (MARTON & KISS, 2000; RUIZ et al., 2003). Os achados histopatológicos das lesões periapicais são os mesmos vistos em outros tecidos de granulação, envolvendo o tecido conjuntivo circundante ao local agredido. Um achado comum a estas lesões, independente da causa, é a exsudação persistente de um número grande de células imunocompetentes, como PMN, macrófagos, linfócitos, plasmócitos, células gigantes, células NK e mastócitos (PIATTELLI et al., 1991; KETTERING & TORABINEJAD, 1993). 32 Os PMN e os macrófagos são as células envolvidas na resposta imune inata, mediada pela fagocitose dos microorganismos opsonizados e células mortas. As células B e T são componentes predominantes nas lesões periapicais humanas, as quais desempenham um papel importante na resposta imune antígeno-específica. Vários estudos sugerem que, ambas as respostas imunes, humoral e celular, estão envolvidas na patogênese destas lesões periapicais (STERN et al., 1982; TAKAHASHI, 1998). Para determinar o perfil celular e as diferenças nas proporções destas células imunocompetentes, bem como o seu envolvimento na patogênese das lesões periapicais crônicas, estudos imunohistoquímicos têm sido realizados nestas últimas décadas. TORABINEJAD & KETTERING (1985), procuraram confirmar a presença de células T e determinar a média entre as células T e B em 13 amostras de lesões periapicais, sendo 9 granulomas e 4 cistos perirradiculares, representados por um infiltrado inflamatório crônico, predominantemente de linfócitos e plasmócitos. Os resultados mostraram que todas as lesões foram positivas para linfócitos T e B. Demonstraram também, que o número de células T, foi maior do que o de células B, não havendo diferenças significativas nas proporções de linfócitos T helper (Th) e T supressor (Ts), nas duas lesões. STASHENKO & YU (1989), ALAVI (1998) e De OLIVEIRA & LARA (2001), demonstraram os mesmos achados nas proporções de células T e B, entretanto, verificaram que durante a fase ativa do desenvolvimento das lesões periapicais, o número de células Th era maior, enquanto as células Ts aumentavam, numericamente nas fases mais tardias, sugerindo que linfócitos Th podem mediar atividades envolvidas na destruição óssea e expansão, enquanto as Ts, atuariam na estabilização da lesão. 33 LIAPATAS et al (2003), em 45 amostras de lesões periapicais, sendo 25 granulomas, 17 cistos e 3 fibroses cicatriciais, mostraram que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada no infiltrado inflamatório crônico entre granuloma e cisto periapical. Nas duas lesões, a maioria das células inflamatórias era representada por linfócitos T, B e macrófagos, indicando a persistência da resposta inflamatória, induzida por exposição prolongada dos tecidos periapicais a vários agentes desencadeando uma reação imunológica. Estes autores também verificaram que as células T se encontravam em maior número do que as células B. A proporção de Th foi maior do que a de Ts. Estes achados demonstraram que granuloma e cisto radicular representam dois estágios diferentes no desenvolvimento dos processos periapicais crônicos resultantes de uma resposta imune que não pode ser inibida. Os macrófagos representam uma grande população de células nas lesões periapicais, atuando na imunidade inata (fagocitose) e na adaptativa como células apresentadoras de antígeno e produtoras de citocinas, contribuindo para a iniciação e regulação do processo inflamatório (METZGER, 2000). Estas células podem ainda, estar envolvidas com alguns sinais e sintomas clínicos como expansão e sensibilidade à percussão (De OLIVEIRA & LARA, 2001). As citocinas pró-inflamatórias mais comumente presentes nas lesões periapicais são as interleucina-1alfa (IL-1α), interleucina-1beta (IL-1β) e TNF-α, produzidas por macrófagos. Estas citocinas estão envolvidas na estimulação de osteoclastos na reabsorção óssea, no aumento da resposta vascular local e na estimulação de linfócitos (STASHENKO et al., 1992). Os PMN também são capazes de gerar citocinas como IL-1β, TNF-α, IL-6 e interleucina-8 (IL-8), envolvidas nos processos de reabsorção óssea (TAKAHASHI et al., 1995). 34 As citocinas antinflamatórias são principalmente a interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10) e o fator transformador de crescimento-beta (TGF-β). O TGF-β, está envolvido no processo de reparação nas lesões periapicais, inibindo a formação de osteoclastos, estimulando a proliferação de fibroblastos, atuando na síntese de fibras colágenas e na angiogênese local. Esta citocina, também desempenha um papel importante na regulação do tônus muscular e na produção de vasoconstritores (STASHENKO et al., 1998; DANIN et al., 2000). WALKER et al (2000), KABASHIMA et al (2001) e LIAPATAS et al (2003), analisando a expressão de citocinas em lesões periapicais, demonstraram que a natureza da resposta imune é determinada, particularmente pelas subclasses das células T, e como parte desse arsenal, as células T sintetizam e secretam uma variedade de citocinas que podem ser divididas em duas categorias: as que aumentam as funções citotóxicas das células T, principalmente a interleucina-2 (IL-2) e o interferon-gama (INF-γ), secretadas pelos linfócitos Th1 e aquelas que promovem uma resposta do tipo humoral, como IL-4, IL-5, IL-6, secretadas pelos linfócitos Th2. Além disso, o envolvimento marcante da expressão da citocina pró-inflamatória IL-10, demonstra que as células inflamatórias estão empenhadas na regulação da resposta inflamatória modelando a atividade da doença. 2.4 CISTO PERIAPICAL Os cistos periapicais também denominados de cistos radiculares, perirradiculares ou periodontais apicais são cistos inflamatórios dos ossos maxilares formados nos ápices de dentes com polpas necróticas e infectadas, sendo considerados seqüelas direta dos granulomas periapicais, embora nem todo 35 granuloma torne-se um cisto durante o seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al., 1999). A transformação cística ocorre por estimulação dos restos epiteliais de Malassez presentes no ligamento periodontal, que passam a proliferar em decorrência de estímulos inflamatórios na região periapical, promovidos pelas bactérias e seus produtos, anteriormente presentes na polpa dental, acionando os mecanismos de defesa do hospedeiro (TORABINEJAD & KETTERING, 1985; BARKHORDAR & De SOUZA, 1988). O cisto periapical, como todo processo crônico, é caracterizado pela participação da resposta imunológica adaptativa de caráter específico. A formação cística ocorre assim que o epitélio prolifera para ajudar a separar o estímulo inflamatório do osso ao redor. A decomposição de restos celulares dentro da luz dos cistos aumenta a concentração de proteínas, produzindo uma pressão osmótica maior, resultando no transporte de fluídos através do revestimento epitelial para o lúmen da cavidade cística. A passagem do fluído ajuda no crescimento do cisto externamente. Com a reabsorção osteoclástica do osso, o cisto se expande. Outros fatores de reabsorção óssea, como as prostaglandinas (PG), interleucinas e proteinases, provenientes das células inflamatórias e células da lesão, também permitem o aumento do cisto (ROCHA, 1991; SIQUEIRA JR & LOPES, 1999; RAITZ et al., 2000). Embora o sistema imune disponha de mecanismos para eliminar as células epiteliais em proliferação nos cistos radiculares, elas continuam a se multiplicar em razão da manutenção do fator etiológico, ou seja, da infecção endodôntica que determina as reações imunológicas. Entretanto, quando a fonte de irritação é removida, através do tratamento endodôntico, a proliferação epitelial tende a cessar 36 e o sistema imune promove a destruição e remoção das células epiteliais proliferadas e a lesão reduz-se ou desaparece (SHAH, 1988; ROCHA, 1991; CALISKAN & TÜRKÜN, 1997; SOARES & GOLDBERG, 2001). Os cistos periapicais representam quase a metade de todos os cistos relatados na literatura. Acomete mais pessoas do gênero masculino, entre a terceira e sexta década de vida, embora seja relativamente incomum na primeira década, ainda que cárie e dentes sem vitalidade sejam freqüentes neste grupo etário (LALONDE & LUEBKE, 1968; STOCKDATE & CHANDLER, 1988; GOMEZ et al., 1992; RAITZ et al., 2000). A maioria dos cistos periapicais localiza-se na maxila, região anterior, seguido pela região maxilar posterior, região posterior da mandíbula e, região anterior inferior (MORTENSEN et al., 1970; CABRINI et al., 1970; SOUZA et al., 1985; SOUZA et al., 2003). A maior parte dos cistos periapicais é assintomática, e são descobertos, com freqüência durante exames radiográficos de rotina. Radiograficamente, o cisto periapical não pode ser diferenciado do granuloma periapical. A radiolucidez associada a um cisto periapical é circular ou ovóide, com margem esclerótica estreita contígua com a lâmina dura do elemento dental envolvido. Esta margem esclerótica pode não estar presente, quando o cisto periapical encontra-se aumentando de tamanho. A lesão varia desde 0,5 cm ou menos, até vários centímetros de diâmetro, embora a maioria apresente menos de 1,5 cm. Nos cistos periapicais de longa duração, pode-se notar a reabsorção radicular do dente envolvido e, ocasionalmente, dos dentes vizinhos (PEREIRA, 1985; BARBOSA, 1990; ALMEIDA et al., 2001). Radiograficamente, o diagnóstico diferencial para o cisto periapical deve incluir o granuloma periapical. Em áreas previamente tratadas de alterações 37 patológicas periapicais, devem ser considerados defeitos cirúrgicos ou cicatriz periapical (NEVILLE et al., 1998; REGEZI & SCIUBBA, 2000). Na região anterior inferior, uma radiolucidez periapical deve ser diferenciada da fase precoce da displasia cementária periapical (SANTA CECÍLIA et al., 2000). Nos quadrantes posteriores deve ser considerado o cisto ósseo traumático (GADRE & ZUBAIRY, 2000). Ocasionalmente, tumores odontogênicos, lesões de células gigantes, doenças metastáticas e tumores ósseos primários podem imitar um cisto periapical. Em todas as condições discutidas, os elementos dentais apresentam-se com vitalidade pulpar (SCHOLL et al., 1999). Histologicamente, o cisto periapical é forrado por um epitélio pavimentoso estratificado não ceratinizado de espessura variável. Espongiose e transmigração de células inflamatórias através do epitélio são achados comuns. Na cápsula fibrosa, o tecido conjuntivo, pode estar focal ou difusamente infiltrado por uma população mista de células inflamatórias. Na direção do epitélio, predominam os PMN, mais profundamente no tecido conjuntivo os linfócitos são mais comuns (STERN et al., 1982; BARBOSA, 1990). Infiltrado plasmocitário associado com os corpúsculos de Russell, refratáveis e esféricos, são encontrados freqüentemente e, algumas vezes dominam a imagem microscópica. Focos de calcificação distrófica, fendas de colesterol e células gigantes multinucleadas podem ser encontrados, além de hemorragias na parede do cisto (PESCE & FERLONI, 2002; SINAN et al., 2002). Em uma pequena percentagem de cistos periapicais, corpúsculos hialinos, denominados corpúsculos de Rushton, podem ser encontrados. Estes corpúsculos no revestimento epitelial são caracterizados por uma forma levemente encurvada, laminação concêntrica e mineralização basofílica ocasional. Acredita-se que a 38 origem destes corpúsculos seja relacionada com hemorragia prévia (ROCHA, 1991; KUC et al., 2000). As opções terapêuticas para as lesões císticas periapicais variam entre o tratamento não cirúrgico, correspondendo ao tratamento endodôntico convencional ou retratamento do sistema de canais radiculares, e o tratamento cirúrgico, através de apicetomias ou de marsupialização. Em lesões de grande extensão a manobra de marsupialização, ocasiona descompressão da cavidade cística e alívio da pressão interna sobre as células circunvizinhas na área afetada (NEAVERTH & BURG, 1982; SHAH, 1988; TSURUMACHI & SAITO, 1995; GALLEGO et al., 2002). 2.5 GRANULOMA PERIAPICAL O termo granuloma periapical ou periodontite apical crônica refere-se a uma massa de tecido de granulação cronicamente inflamado, no ápice de um dente não vital. Esta denominação, comumente utilizada, não é totalmente correta, pois a lesão não demonstra, microscopicamente, uma inflamação granulomatosa verdadeira (NEVILLE et al., 1998). Os granulomas periapicais podem se originar após a estabilização de um abscesso periapical ou desenvolver-se como uma alteração periapical inicial. Estas lesões não são estáticas e podem se transformar em cistos radiculares ou desenvolver exacerbações agudas com a formação de abscessos (PAIVA & ANTONIAZZI, 1988). A maioria dos granulomas periapicais é assintomática, e o dente envolvido, caracteristicamente, não apresenta mobilidade ou sensibilidade significativa à percussão. O tecido mole que recobre a região periapical pode ou não estar sensível 39 e o elemento dental envolvido não responde aos testes pulpares térmicos ou elétricos. Esta alteração patológica representa mais ou menos 75% das lesões inflamatórias apicais (SOUZA et al., 1985; BARBOSA, 1990; LEDESMA-MONTES et al., 2000; SATORRES et al., 2001). Grande parte dos granulomas periapicais é descoberta durante exames radiográficos de rotina. Inicialmente, observa-se um espessamento do ligamento periodontal. Com a proliferação do tecido de granulação e a concomitante reabsorção óssea, a lesão aparece como uma área radiolúcida ligada ao ápice radicular, de tamanho variável, podendo ser bem circunscrita por uma linha radiopaca ou difusa, sem limites precisos com o osso circunjacente. A reabsorção radicular não é incomum. Embora as lesões maiores do que 2 cm de diâmetro representem muitas vezes cistos periapicais, vários pesquisadores não têm sido capazes de diferenciar granulomas periapicais de cistos periapicais, tomando como base somente o tamanho e o aspecto radiográfico (NAIR et al., 1996; ROCHA et al., 1998). Histologicamente, os granulomas periapicais consistem em um tecido de granulação inflamado, circundado por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso. O tecido de granulação apresenta um infiltrado linfocítico denso variável, freqüentemente mesclado com poucos neutrófilos, plasmócitos, macrófagos e, menos freqüentemente, mastócitos e eosinófilos. Podem estar presentes corpúsculos de Russell. Restos epiteliais de Malassez podem ser identificados no tecido de granulação. Coleções de cristais de colesterol com células gigantes multinucleadas associadas e áreas de extravasamento de hemácias com pigmentação por hemossiderina podem estar presentes (KUC et al., 2000; SINAN et al., 2002). 40 O tratamento centraliza-se na redução e eliminação dos microrganismos agressores. Se o elemento dental puder ser preservado, o tratamento endodôntico deve ser realizado. Os elementos dentais sem possibilidades de serem restaurados devem ser extraídos, seguidos pela curetagem de todo o tecido de granulação periapical (BARBOSA, 1990; MARIN et al., 2000). Nos relatos dos autores consultados, os cistos e granulomas periapicais, têm o comportamento biológico e os achados radiográficos muito semelhantes, por isso justifica a colheita do material em determinados tipos de tratamento, como por exemplo, nas exodontias seguidas por curetagem e nas apicetomias para análise anátomo-patológica, para estabelecer o correto diagnóstico entre ambas. 41 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Identificar a ocorrência de apoptose em cistos e granulomas periapicais. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS A. Estudar morfologicamente a ocorrência de apoptose em cistos e granulomas periapicais, B. Quantificar os índices apoptóticos (IA) destas lesões, C. Verificar se há diferenças quantitativas entre o índice apoptótico dos granulomas peripicais e o índice apotótico dos cistos periapicais, D. Verificar se há diferenças entre o índice apoptótico dos infiltrados inflamatórios entre cistos e granulomas, E. Verificar se há diferenças entre o índice apoptótico do epitélio e o índice apoptótico do infiltrado inflamatório do cisto periapical. 42 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostra e processamento do material Para este estudo, foram selecionadas 15 amostras de granuloma periapical e 15 de cisto periapical, todas provenientes do laboratório de Anatomia Patológica da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. O material já se encontrava fixado em formal a 10%, processado e incluído em blocos de parafina. Os blocos foram cortados em secções de 4 m de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE), para realização do diagnóstico histopatológico e com Metil-Green-Pironina, para a avaliação da ocorrência de células apoptóticas respectivamente. 4.2 Coloração em HE Os blocos cortados em secções de 4 µm de espessura foram desparafinados em três banhos de xilol, de três minutos cada um. Em seguida, foram hidratados em baterias sucessivas de álcool absoluto, 700, 500 e água corrente. As lâminas foram mergulhadas na hematoxilina, deixadas durante um minuto no corante e lavadas em água corrente. Logo após, foram mergulhadas na eosina durante trinta segundos e lavadas rapidamente em água corrente. As lâminas foram desidratadas utilizando-se álcool em concentrações crescentes (500, 700 e absoluto). Em seguida, foram diafanizadas e montadas com Entelan. 43 4.3 Coloração em Metil-Green-Pironina O método de Metil-Green-Pironina é específico para DNA, pois se liga aos grupos fosfóricos do DNA. Desta forma, as modificações ocorridas nos núcleos das células em apoptose são mais facilmente detectáveis (McELROY, 1992). Solução Estoque de Metil-Green: Metil-Green ................................... 2 gramas Água destilada ............................... 100 ml Purificação do Metil-Green através do clorofórmio: Para 100 ml de Metil-Green, foi colocado 100ml de clorofórmio. Deixou-se em repouso por uma noite e, no dia seguinte, o clorofórmio que se encontrava no fundo do funil separador foi desprezado. O mesmo volume de clorofórmio foi acrescentado e a troca foi sendo realizada até o clorofórmio sair sem corante. Solução Estoque de Pironina: Pironina ....................................... 1 grama Água destilada ............................. 100 ml (Aquecer, para melhor solubilidade) Solução de uso: 70 ml de Metil-Green – solução estoque 30 ml de Pironina – solução estoque Os blocos cortados em secções de 4 µm de espessura foram desparafinados em três banhos de xilol, de três minutos cada um. Em seguida, foram hidratados em baterias sucessivas de álcool absoluto, 700, 500 e água corrente, por 2 minutos cada. A seguir, as lâminas foram colocadas na solução de uso durante 4 minutos e depois envolvidas em papel filtro por 5 minutos. Logo após, as lâminas foram lavadas em água destilada (duas lavagens rápidas) e colocadas em álcool etílico 44 80%, gelado a 5 graus negativos, por 10 minutos. A seguir iniciou-se a desidratação das lâminas em xilol puro e depois foram montadas com Entelan. 4.4 Marcação “in situ” da fragmentação do genoma (TUNEL) O método TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated fluorescein-UTP-nick-End-Label) é um método de hibridização “in situ” associado a imunohistoquímica utilizado para marcação das porções finais do genoma fragmentado durante o processo de apoptose. Esta técnica consiste na inserção de nucleotídeo marcado, o qual deverá se ligar às regiões internucleossomais resultantes da fragmentação do DNA (MORENO et al., 2000). Para este método foi utilizado o kit comercial In situ cell death detection, (cat. n0 1.684 817, Roche). Os blocos foram cortados em secções de 3µm de espessura e montados em lâminas silanizadas. As lâminas foram desparafinadas em três banhos de xilol, de 3 minutos cada. Em seguida os cortes foram hidratados em baterias sucessivas de álcool absoluto, 950, 900, 800 e 700, por 3 minutos cada. Logo a seguir, as lâminas foram lavadas em água destilada e em tampão fosfato salina (PBS: 1,0 M de Na2HPO4 e 1,0 M de NaH2 PO4, pH 7.4). Aplicou-se a solução de bloqueio da peroxidase endógena (3 ml de H2O2 P.A. em 97 ml de metanol P.A.), durante 10 minutos. Logo após, as mesmas foram lavadas duas vezes em PBS, por 3 minutos cada. Em seguida, aplicou-se a proteinase K (20µg/ml) em todas as lâminas e estas foram incubadas por 30 minutos a uma temperatura de 370C. Logo depois, lavou-se duas vezes com PBS, por 3 minutos cada. 45 Após retirar o excesso de PBS ao redor dos cortes, aplicou-se a enzima TdT (enzyme solution) 50µl diluída em 450µl de solução de marcação (label solution) em toda a amostragem. Foram incubadas novamente em uma câmera úmida a 370C, durante uma noite. Após este período, as lâminas foram lavadas em PBS, por três vezes cada e por 3 minutos. Secou-se a área ao redor das amostras e adicionou-se 50µl de solução convertedora ligada a peroxidase (converter-POD) e logo a seguir, incubadas na câmara úmida por 30 minutos, a uma temperatura de 370C. Lavou-se novamente com PBS, por tres vezes e por 3 minutos cada. A seguir foi adicionada a diaminobenzidina (DAB) e H2o2 e incubadas durante 3 minutos a 250C. A seguir, as lâminas foram lavados tres vezes, por 3 minutos cada com PBS. A seguir, fez-se a contra-coloração com verde luz (2g /100 ml de água destilada) por 10 minutos. As lâminas foram desidratadas em álcoois em concentrações crescentes (800, 900, 950, absoluto), diafanizadas em xilol e montadas com Permount. Para o controle positivo utilizou-se Dnase I, grau I (3 U/ml em 50 mM de TRIS-HCL, pH 7.5). Para o controle negativo utilizou-se apenas a solução de marcação (label solution) dispensando a solução de enzimas (enzyme solution). 4.5 Determinação da amostra mínima de campos a serem contados Para determinar a amostra mínima representativa de campos a serem contados, foi utilizado o método descrito por SAMPAIO (1998). Foi escolhida uma lâmina ao acaso, para cada tipo de lesão e realizada a contagem de células apoptóticas, corpos apoptóticos e do número total de células que não apresentavam este processo. O número de células foi quantificado em campos obtidos no 46 analisador de imagens Kontron Eletronic KS-400 localizado no Laboratório de Ictiohistologia do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Este aparelho utiliza um microscópio Carl Zeiss, onde a imagem é captada por uma microcâmera e transferida para um monitor de alta definição onde os campos foram selecionados e gravados e, as células contadas. Foi utilizada a objetiva de imersão de 1000X que proporciona uma área total de contagem de 8.533,37 µm2. Nas lâminas de granuloma periapical e cisto periapical selecionadas aleatoriamente, foram avaliados 178 e 168 campos, respectivamente. Através de um aplicativo do software Microsoft Excell, foi realizado os sorteios e cálculos preconizados por SAMPAIO (1998) e que podem ser vistos nas TAB. 1 e 2, seguidas dos respectivos GRAF. 1 e 2, onde determinou-se o número mínimo de campos a serem contados nas duas lesões. A variação do índice apoptótico (IA) para o granuloma periapical e para o cisto periapical estabilizou-se a partir de vinte e cinco campos, quando o incremento de campos estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação (GRAF. 1 e 2 ). Portanto, em ambas as lesões, foram contados 25 campos em todas as amostras. Para determinar a amostra mínima representativa de campos a serem contados, separadamente, das células do epitélio de revestimento da cavidade cística e das células do infiltrado inflamatório do cisto periapical, foi escolhida uma lâmina ao acaso e realizada a contagem de células apoptóticas, corpos apoptóticos e do número total de células que não apresentavam este processo, no epitélio e no infiltrado inflamatório. O número de células também foi quantificado em campos obtidos no analisador de imagens Kontron Eletronic KS-400. 47 TABELA 1 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o granuloma periapical (expressa em porcentagem) Número de campos em cada grupo GRUPO 5 10 15 20 25 30 35 40 1 6,61 6,46 6,33 6,24 5,95 2 5,07 5,56 6,03 6,15 5,9 3 6,23 5,87 5,37 6,38 4 5,67 5,91 6,09 6,53 5 6,01 6,26 5,8 6 6,99 5,93 7 5,71 6,39 8 6,07 9 6,25 10 11 45 50 5,77 6,32 6,05 6,39 6,12 5,86 5,93 5,86 6,27 6,08 5,69 5,84 6,29 6,08 6,05 6,29 6,31 5,72 5,78 5,9 6,02 6,05 6,08 6,03 5,46 5,78 6,02 5,21 6,13 5,79 5,89 6,09 5,92 6,36 6,01 6,03 6,52 6,03 6,44 5,77 5,98 5,8 6,06 5,8 5,94 5,74 5, 47 5,78 6,25 5,89 5,79 5,83 6,38 5,63 5,53 6,21 5,9 6,44 5,88 5,91 6,08 5,99 6 5,87 5,72 5,75 5,79 6,33 5,54 5,9 5,84 6,05 5,93 6,41 6, 29 5,49 6,16 6,45 5,82 5,89 5,93 6,15 6,2 12 6,46 6 ,74 6,11 5,6 5,97 5,57 5,7 5,77 6,12 5,92 13 6,51 6,33 5,88 5,96 5,91 6,21 5,96 5,76 5,98 6,18 14 5,69 5,97 5,57 6,25 5,71 6,05 6,28 5,78 6,05 5,88 15 5,73 6,49 6,23 5,71 5,82 6,04 6,06 6,21 5,98 6,02 16 6,57 6,29 6,33 5,66 6,05 6,39 5,8 5,75 5,99 6,04 17 6,61 5,64 5,67 6,35 6,03 5,99 5,48 5,72 6,09 6,12 18 4,7 5,68 6 6,17 6,08 6,02 5,89 6,35 5,98 5,59 19 6,07 6,95 5,83 6,48 5,77 6 5,84 6,45 5,87 5,98 20 6,39 5,25 5,73 5,98 5,83 6,21 5,71 6,42 5,98 5,73 MÉDIA 6,081 5,998333 5,907368 6,075 6,019 5,908 5,9235 5,9935 6,019 6,0175 DP 0,551027 0,430639 0,277626 0,284614 0,234406 0,230094 0,231796 0,223943 0,24048 0,215819 CV 9,06145 7,179312 4,699651 4,685008 3,894439 3,894614 3,913153 3,736424 3,995344 3,586515 COEFICIENTE DE VARIAÇÃO GRÁFICO1 Coeficiente de variação versus número de campos para o granuloma periapical 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NÚMERO DE CAMPOS 48 TABELA 2 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para o cisto periapical (expressa em porcentagem) Número de campos em cada grupo GRUPO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 8,38 8,1 7,46 9,05 8,96 8,94 8,92 8,51 8,27 8,8 2 7,88 9,05 8,89 7,33 8,24 9,5 8,47 8,84 8,54 9,56 3 8,9 9,16 8,47 7,87 9,58 8,73 9,31 8,87 8,21 8,79 4 8,2 9,53 8,85 8,18 8,29 9,82 9,13 8,27 8,13 9,67 5 8,36 8,76 9,4 9,01 8,82 9,2 8,06 9,39 8,37 9,22 6 10,48 7,3 9,07 7,64 8,87 9,22 8,23 8,57 8,3 8,02 7 8,54 9,09 9,74 8,91 9,01 8,03 8,8 9,01 8,42 8,55 8 9,76 10,08 8,38 7,16 8,59 8,42 9,17 7,85 9,62 8,33 9 9,04 7,77 9,05 8,19 8,57 8,75 8,73 8,12 8,38 8,71 10 9,53 8,17 9,15 8,05 7,51 8,17 9,92 9,05 8,74 8,96 11 8,12 8,95 7,57 8,07 9,48 8,6 8,72 8,32 8,48 8,99 12 10,39 7,31 8,67 8,01 8,39 8,36 8,6 8,97 9,33 9,2 13 9,14 7,71 10,01 7,78 8,36 9,29 8,99 8,7 8,76 7,77 14 8,7 7,09 8,93 8,88 8,56 9,19 9,63 8,17 8,02 9,39 15 7,64 9,18 8 10,35 8,74 9,16 8,47 8,4 8,04 8,81 16 11,73 9,44 9,41 9,35 8,82 8,8 9,24 9,01 8,98 9,33 17 9,43 9,54 9,4 9,33 8,95 8,57 9,11 8,99 8,77 8,7 18 7,56 10,87 8,5 8,49 8,49 8,29 8,36 9,64 9,65 8,62 19 11,65 7,13 8,8 8,64 8,61 8,25 9,54 8,13 8,88 8,44 20 9,09 9,79 9,31 8,74 7,89 8,59 9,12 9,38 8,24 9,22 8,853 8,4515 8,6365 8,794 8,926 MÉDIA 9,126 8,701 8,7095 8,6065 8,854 DP 1,193197 1,075105 0,659738 0,774075 0,478597 0,483533 0,484338 0,485446 0,485314 0,49272 CV 13,0747 12,35611 7,452136 9,159027 5,541567 5,498443 5,426147 5,573751 5,638918 5,564938 COEFICIENTE DE VARIAÇÃO GRÁFICO 2 Coeficiente de variação versus número de campos para o cisto periapical 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NÚMERO DE CAMPOS 49 Na lâmina de cisto periapical selecionada aleatoriamente, foram avaliados 28 campos para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística e 91 campos para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical. Através do mesmo aplicativo do software Microsoft Excell, foi realizado os sorteios e cálculos preconizados por SAMPAIO (1998) e que podem ser vistos nas TAB. 3 e 4 seguidas dos respectivos GRAF. 3 e 4, onde determinou-se o número mínimo de campos a serem contados para os dois tipos de células do cisto periapical. TABELA 3 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística (expressa em porcentagem) GRUPO Número de campos para o epitélio de revestimento da cavidade cística 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 8,22 6,36 7,33 7,28 7,15 6,89 7,08 7,26 6,87 7,01 2 6,84 6,09 6,62 6,81 6,78 7,02 6,82 6,79 7,02 7 3 6,35 6,7 6,91 6,87 6,82 6,58 6,61 6,83 6,82 6,84 4 6,72 6,89 6,88 6,59 6,61 6,78 6,72 6,56 6,54 6,52 5 7,73 7,18 7,52 6,78 6,67 6,73 6,68 6,74 6,72 6,7 6 7,51 6,89 7,16 7,02 6,98 7,01 6,76 7,03 6,98 6,89 7 6,06 7,46 6,9 6,69 6,65 6,95 6,89 6,66 6,64 6,54 8 6,18 6,43 7,26 6,47 6,48 6,74 6,73 6,48 6,49 6,48 9 6,43 5,97 6,96 6,81 6,75 6,82 6,68 6,81 6,8 6,78 10 5,54 7,02 7,14 6,83 6,73 7 6,87 6,58 6,54 6,52 11 6,07 6,95 6,52 6,63 6,59 6,46 7,02 7,01 6,97 6,86 12 5,78 6,61 5,86 6,79 6,75 6,84 6,68 6,8 6,7 6,65 13 7,13 6,59 6,21 6,8 6,81 6,78 6,65 6,81 6,82 6,83 14 6,88 7,17 6,81 6,74 6,72 6,71 6,72 6,76 6,75 6,72 15 7,95 7,73 7,76 6,9 6,87 6,42 6,38 6,87 6,86 6,84 16 6,56 7,63 6,94 6,71 6,7 6,84 6,58 6,69 6,71 6,69 17 7,88 6,59 6,71 6,92 6,89 6,95 6,86 6,84 6,87 6,85 18 5,26 7,07 6,63 6,7 6,68 6,72 6,67 6,68 6,64 6,59 19 6,4 6,13 7,33 6,84 6,99 6,87 6,88 6,82 7,03 6,97 20 7,92 6,58 6,43 7,05 7,04 6,79 7,03 6,81 6,98 6,74 6,7705 6,802 6,894 6,8115 6,783 6,7655 6,7915 6,7875 6,751 MÉDIA 6,795 DP 0,866211 0,491278 0,451435 0,175747 0,165342 0,16637 CV 12,79389 7,222546 6,548232 2,580155 2,448417 2,496669 2,561605 2,426941 2,424883 2,43759 0,168912 0,173971 0,164729 0,163704 50 COEFICIENTE DE VARIAÇÃO GRÁFICO 3 Coeficiente de variação versus número de campos para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NÚMERO DE CAMPOS TABELA 4 Média (ME), desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) das 20 médias dos índices apoptóticos obtidos em cada categoria de números de campos sorteados para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical (expressa em porcentagem) Número de campos para o infiltrado inflamatório do cisto periapical GRUPO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 9,25 8,25 9,99 9,73 9,67 10,98 10,85 10,54 10,52 10,31 2 8,54 9,6 9,98 9,17 10,58 9,78 9,97 10,09 10,02 9,99 3 11,43 10,7 9,04 9,89 10,42 10,61 10,62 10,56 10,51 10,32 4 7,39 10,9 9,56 9,74 10,24 10,54 10,58 10,52 10,26 10,11 5 9,87 10,23 10,65 9,31 8,7 9,69 9,75 9,32 9,26 9,23 10,32 6 7,01 9,82 10,56 10,68 10,58 10,57 10,52 10,47 10,68 7 12,85 12,01 10,14 10,83 10,69 10,11 9,98 9,89 9,62 9,58 8 10,63 8,29 11,56 9,56 9,9 9,74 10,05 9,68 9,72 9,57 9 11,14 10,12 11,15 10,21 10,09 9,47 10,23 9,42 9,38 9,46 10 9,49 8,38 9,23 9,06 9,57 11,2 11,12 10,98 10,83 10,55 11 11,58 9,6 11,02 11,93 10,62 9,98 9,73 9,76 9,73 9,74 12 13,22 9,79 11,11 10,08 10,14 10,04 9,75 9,64 9,59 9,53 13 7,74 9,22 11,99 10,23 9,82 10,05 9,45 9,42 9,41 9,45 14 10,73 11,46 11,19 9,76 10,4 10,1 9,67 9,47 9,42 9,33 15 8,12 10,51 11,16 10,42 10,1 9,76 11,12 9,34 9,32 9,31 16 11,45 11,01 12,18 9,68 10,11 9,58 10,04 10,02 10 10,03 17 10,12 10,46 11,49 10,87 9,62 9,95 9,97 9,52 9,46 9,4 18 11,19 10,05 10,37 11,28 10,38 10,68 11,02 10,1 10,02 11,1 19 9,09 11,66 11,37 9,08 9,41 11,13 10,83 10,65 10,62 10,37 20 8,88 13,04 9,37 11,04 9,38 9,85 10,02 9,75 9,74 10,05 9,986 10,255 10,6555 10,1275 10,021 10,1905 10,2635 9,957 9,9055 9,8875 MÉDIA DP 1,750766 1,242788 0,917786 0,785023 0,513798 0,522197 0,524758 0,508207 0,505647 0,504432 CV 17,53221 12,11885 8,613262 7,751404 5,127213 5,124346 5,11286 5,104021 5,104707 5,101711 51 COEFICIENTE DE VARIAÇÃO GRÁFICO 4 Coeficiente de variação versus número de campos para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical 20 15 10 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NÚMERO DE CAMPOS A variação do IA para as células do epitélio de revestimento da cavidade cística estabilizou-se a partir de vinte campos, quando o incremento de campos estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação (GRAF. 3). A variação do IA para as células do infiltrado inflamatório do cisto periapical estabilizou-se a partir de vinte e cinco campos, quando o incremento de campos estudados não resultou em redução considerável do coeficiente de variação (GRAF. 4). O critério proposto por LIPPONEN & AALTOMAA (1994), para identificação e contagem das células e corpos apoptóticos foi utilizado quantificando as células que apresentavam condensação nuclear e citoplasmática e fragmento de citoplasma contendo densa condensação de cromatina. A contagem das células e corpos apoptóticos e do número total de células dos dois tipos de lesões e a obtenção do IA foi feita, por um único examinador, no analisador de imagens Kontron Eletronic KS 400. 52 4.6 Análise estatística Foi realizada uma analise paramétrica na comparação de dois grupos independentes, com distribuição normal utilizando o teste t de student para testar as hipóteses de haver ou não diferenças significantes entre o índice apoptótico de cistos e granulomas periapicais, entre o infiltrado inflamatório dos granulomas e cistos periapicais e entre o epitélio e o infiltrado inflamatório dos cistos periapicais. 4.7 Microfotografias Neste estudo, a documentação fotográfica das lâminas coradas em HE, Metil-Green-Pironina e pelo Túnel, foi feita em um microscópio Olympus BX50 com lentes plano-apocromáticas, acoplado a uma câmera fotográfica Olympus. 53 5. RESULTADOS Clinicamente, das 15 amostras selecionadas de granuloma periapical, 6 (60%) eram do gênero feminino e 9 (40%) do gênero masculino (GRAF. 5). GRÁFICO 5 Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com o gênero dos pacientes 40% 60% Feminino Masculino Quanto a cor, na amostra total de granuloma periapical, 8 (53%) eram leucodermas, 4 (27%) feodermas e 3 (20%) melanodermas (GRÁF. 6). GRÁFICO 6 Distribuição das amostras de granuloma periapical de acordo com a cor dos pacientes 20% 53% 27% Leucoderma Feoderma Melanoderma Os elementos dentais envolvidos nas lesões do granuloma periapical foram os 11, 12, 14, 16, 17, 22, 23, 26, 28 e 36 e nenhum destes, apresentava 54 sintomatologia dolorosa. Quanto ao tempo da doença, em 10 casos foi indeterminado e os demais variou de 4 meses a 8 anos (60,8±43,57). A idade variou entre 20 e 62 anos (40,2±15,22) (TAB. 5). TABELA 5 Relação dos pacientes com granuloma periapical com os dados relativos ao gênero, cor, idade, localização e tempo da doença Casos Gênero Cor Idade Localização Tempo da Doença 1 M L 20 11 INDETERMINADO 2 M M 37 28 INDETERMINADO 3 F F 45 14 INDETERMINADO 4 M L 34 23 INDETERMINADO 5 F L 21 36 8 ANOS 6 M M 62 22 4 MESES 7 M L 55 16 INDETERMINADO 8 F L 60 12 7 ANOS 9 M M 21 36 INDETERMINADO 10 F L 33 26 2 ANOS 11 F F 54 11 8 ANOS 12 M L 43 12 INDETERMINADO 13 F F 34 16 INDETERMINADO 14 M F 24 17 INDETERMINADO 15 M L 42 26 INDETERMINADO Dados obtidos dos arquivos da Laboratório de Anatomia Patológica da FOPUC/MG M= masculino L= leucoderma F= feoderma Histologicamente, todas as amostras do granuloma periapical foram representadas por um tecido de granulação inflamado, circundado por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso. O infiltrado inflamatório era predominantemente, do tipo linfocítico, mesclado com plasmócitos, macrófagos e poucos neutrófilos (FIG.1,2,3, e 4). Áreas hemorrágicas, hemossiderina e alguns corpúsculos de Russell também foram observados. Nenhum cordão ou ilhota de epitélio odontogênico (restos epiteliais de Malassez) foi encontrado. 55 FIGURA 1 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 100X), observa-se um tecido de granulação. FIGURA 2– Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 200X), observa-se um tecido conjunto fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear. 56 FIGURA 3 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 400X), observa-se um tecido conjuntivo fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear. FIGURA 4 – Granuloma periapical coloração em HE (aumento de 1000X), observa-se um tecido conjunto fibroso com um infiltrado inflamatório mononuclear, (linfócitos, plasmóitos e macrófagos). 57 Em 9 (60%) secções do granuloma periapical, o infiltrado inflamatório mostrou-se denso nas porções mais centrais e moderado na parte mais externa. Em 6 (40%) secções, o infiltrado inflamatório foi moderado tanto nas porções centrais quanto nas partes mais periféricas. As áreas hemorrágicas, da amostragem total, estavam distribuídas homogeneamente em toda a extensão do tecido inflamado, e as áreas contendo hemossiderina estavam mais localizadas próximas à periferia. Dos achados clínicos das 15 amostras de cisto periapical, 9 (60%) foram representadas pelo gênero masculino e 6 (40%) pelo gênero feminino (GRAF. 7). Gráfico 7 Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com o gênero dos pacientes 40% 60% Masculino Feminino Quanto a cor, 5 (34%) eram leucodermas, 5 (33%) feodermas e 5 (33%) melanodermas (GRAF. 8). Gráfico 8 Distribuição das amostras de cisto periapical de acordo com a cor dos pacientes 33% 33% Leucoderma 33% Feoderma Melanoderma 58 No cisto periapical, os elementos dentais envolvidos eram os 11, 12, 13, 16, 22, 23, 26, 27, 35 e 36, todos sem sintomatologia dolorosa. O tempo da doença, em 9 casos foi indeterminado e os demais variou de 2 meses a 10 anos (38±48,06). A idade mostrou variar entre 9 e 70 anos (36,1±14,93) (TAB.6) TABELA 6 Relação dos pacientes com cisto periapical com os dados relativos a sexo, cor, idade, localização e tempo da doença Casos 1 Sexo M Cor F Idade 29 Localização 22 Tempo da Doença INDETERMINADO 2 F M 35 36 6 MESES 3 M M 41 12 INDEERMINADO. 4 F L 29 35 INDETERMINADO 5 M L 30 11,12 e 13 4 MESES 6 F M 70 11,12, 21 e 22 INDETERMINADO 7 M F 12 26 2 MESES 8 M L 42 23 INDETERMINADO 9 M F 9 36 INDETERMINADO 10 M M 53 12 e 13 INDETERMINADO INDETERMINADO 11 M F 45 16 12 F M 39 22 2 ANOS 13 F L 42 22 10 ANOS 14 F F 37 27 INDETERMINADO 15 M L 29 11 e 12 6 ANOS Dados obtidos dos arquivos da Laboratório de Anatomia Patológica da FOPUC/MG M= masculino L= leucoderma F= feoderma Os achados histopatológicos da amostragem total dos cistos periapicais foi representada por uma cavidade cística revestida por um epitélio do tipo pavimentoso estratificado não ceratinizado e hiperplasiado, com a camada basal bem delimitada e corada e por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso apresentando um infiltrado inflamatório do tipo mononuclear, com predominância de linfócitos, além de plasmócitos e macrófagos (FIG. 5,6,7 e 8). Os neutrófilos foram pouco representativos. Observou-se corpúsculos de Russell nas lesões e alguns aglomerados de corpúsculos de Rushton. Imagem negativa de cristais de colesterol 59 puderam ser identificadas. Áreas hemorrágicas e hemossiderina, também foram vistas. FIGURA 5- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso com áreas hiperplasiadas e atróficas e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e vasos sanguíneos dilatados. 60 FIGURA 6- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso paraceratinizado hiperplasiado e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e vasos sanguíneos dilatados. 61 FIGURA 7- Cisto periapical corado em HE (aumento de 100X), observa-se cavidade cística revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso paraceratinizado atrófico e uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e vasos sanguineos dilatados. FIGURA 8 - Cisto periapical corado em HE (aumento de 400X), observa-se um tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear. 62 Em 8 (53,3%) secções de cistos periapicais avaliadas, o revestimento epitelial mostrou-se aproximadamente com 15 a 20 camadas de células epiteliais. Em 4 (26,6%) secções, o epitélio de revestimento da cavidade cística apresentou-se com 10 a 15 camadas de células. Em 3 (20,1%) secções, o epitélio cístico mostravase atrófico, exibindo de 3 a 5 camadas de células. Em 6 (40%) amostras avaliadas, o infiltrado inflamatório era denso logo abaixo da camada basal do revestimento epitelial e moderado na parte mais central e próximo a periferia. Em 5 (33,4%) secções, mostrou-se moderado, próximo a camada basal do epitélio cístico e denso na parte central e periférica. Em 4 (26.6%) amostras, era moderado em toda a sua extensão. No infiltrado inflamatório das amostras de granuloma e cisto periapical coradas com metil-green-pironina, para avaliar as alterações morfológicas das células em apoptose, os nucléos das células apoptóticas, mostraram-se com uma coloração azulada, bem mais intensa do que as células não apoptóticas. Os núcleos estavam bem condensados, podendo apresentar-se em forma de meia lua. Os corpos apoptóticos foram observados como fragmentos citoplasmáticos contendo cromatina no seu interior (FIG. 9 e 10). 63 FIGURA 9- Cisto periapical corado em Metil-Green-Pironina (aumento de 1000X), observa-se tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e células apoptóticas. FIGURA 10- Granuloma periapical corado em Metil-Green-Pironina (aumento de 1000X), observa-se um tecido conjuntivo fibroso com infiltrado inflamatório mononuclear e células apoptóticas e corpos apoptóticos. 64 As células do revestimento epitelial dos cistos perirradiculares apresentaram-se de cor rosa. As células epiteliais em apoptose mostraram-se condensadas com os núcleos corados mais intensamente. Observa-se um halo claro ao redor destas células (FIG. 11). FIGURA 11- Cisto periapical corado em Metil-green-Pironina (aumento de 1000X), observa-se cavidade cística revestida por um tecido epitelial estratificado pavimentoso com células apoptóticas. No tecido conjuntivo, as fibras colágenas foram coradas em rosa e as hemácias que formavam as áreas hemorrágicas coraram-se em tons de verde e azul. A confirmação do processo de apoptose foi feita pela técnica do TUNEL. Através deste método, confirmou-se a ocorrência de apoptose, já observada 65 morfologicamente, nas colorações em Metil-Green-Pironina nas duas lesões (FIG. 12 e 13). FIGURA 12 - Cisto periapical corado pelo TUNEL (aumento de 1000X), observa-se marcação positiva dos fragmentos de DNA nas células do infiltrado inflamatório. FIGURA 13- Granuloma periapical corado pelo TUNEL (aumento de 1000X), observa-se marcação positiva dos fragmentos de DNA nas células do infiltrado inflamatório. 66 O índice apoptótico (IA) dos granuloma periapicais variou de 0,056 a 0,101 (0,078±0,014; n=15) (TAB. 7). TABELA 7 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos granulomas periapicais GRANULOMA PERIAPICAL CASO IA 1 0,101 2 0,088 3 0,097 4 0,090 5 0,078 6 0,082 7 0,056 8 0,056 9 0,068 10 0,065 11 0,084 12 0,087 13 0,074 14 15 0,065 0,073 MÉDIA DESVIO PADRÃO 0,078 0,014 O índice apoptótico (IA) dos cistos periapicais variou de 0,055 a 0,115 (0,075±0,017; n=15) (TAB. 8). A analise estatística entre o IA dos granulomas periapicais e dos cistos periapicais, mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre estas duas lesões (p=0,05; GRAF. 9). 67 TABELA 8 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) dos cistos periapicais CISTO PERIAPICAL CASO IA 1 0,073 2 0,083 3 0,058 4 0,087 5 0,064 6 0,056 7 0,065 8 0,085 9 0,115 10 0,055 11 0,067 12 0,087 13 0,097 14 0,063 15 0,063 MÉDIA 0,075 DESVIO PADRÃO 0,017 GRÁFICO 9 IA entre granulomas e cistos periapicais 68 O índice apoptótico (IA) do infiltrado inflamatório dos granuloma periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais, variou de 0,056 a 0,101 (0,078±0,014) e 0,054 a 0,101 (0,073±0,013), respectivamente (TAB. 9). TABELA 9 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do infiltrado inflamatório dos granulomas periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais GRANULOMA PERIAPICAL INFILTRADO INFLAMATÓRIO DO CISTO PERIAPICAL CASO IA CASO IA 1 0,101 1 0,070 2 0,088 2 0,079 3 0,097 3 0,061 4 0,090 4 0,079 5 0,078 5 0,063 6 0,082 6 0,061 7 0,056 7 0,079 8 0,056 8 0,101 9 0,068 9 0,054 10 0,065 10 0,068 11 0,084 11 0,083 12 0,087 12 0,090 13 0,074 13 0,065 14 0,065 14 0,084 15 0,073 15 0,064 MÉDIA 0,078 MÉDIA 0,073 DESVIO PADRÃO 0,014 DESVIO PADRÃO 0,013 A analise estatística entre o IA do infiltrado inflamatório dos granulomas periapicais e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais, mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre estas duas lesões (p > 0,05; GRAF. 10). 69 GRÁFICO 10 IA entre granulomas e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais O índice apoptótico (IA) do infiltrado inflamatório e do epitélio de revestimento cístico dos cistos periapicais, variou de 0,054 a 0,101 (0,073±0,013) e 0,048 a 0,098 (0,083±0,015), respectivamente (TAB. 10). A analise estatística entre o IA do infiltrado inflamatório e do epitélio da cavidade cística dos cistos periapicais, mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre estas duas lesões (p > 0,05; GRAF. 11). GRÁFICO 11 IA entre epitélio e infiltrado inflamatório dos cistos periapicais 70 TABELA 10 Índice apoptótico (IA), média (ME) e desvio padrão (DP) do epitélio e do infiltrado inflamatório dos cistos periapicais CISTO PERIAPICAL - EPITÉLIO CISTO PERIAPICAL – INF. INFLAMATÓRIO CASO IA CASO IA 1 0,048 1 0,070 2 0,069 2 0,079 3 0,084 3 0,061 4 0,095 4 0,079 5 0,095 5 0,063 6 0,097 6 0,061 7 0,087 7 0,079 8 0,098 8 0,101 9 0,083 9 0,054 10 0,067 10 0,068 11 0,085 11 0,083 12 0,069 12 0,090 13 0,094 13 0,065 14 0,073 14 0,084 15 0,097 15 0,064 MÉDIA 0,083 MÉDIA 0,073 DESVIO PADRÃO 0,015 DESVIO PADRÃO 0,013 71 6. DISCUSSÃO A apoptose é um processo fisiológico que tem como finalidade o controle da população celular e eliminação de células envelhecidas que perderam a sua função ou que sofreram algum tipo de alteração no seu genoma. Ao revisar a literatura, observou-se a presença da morte celular programada em diversos processos inflamatórios agudos ou crônicos, como na artrite reumatóide (RABINOVICH, 2000), nas doenças periodontais (SAWA et al., 1999) e no líquen plano bucal (ARENARE-JEUNON, 1999). Nos maxilares, as lesões inflamatórias mais comumente encontradas são os cistos e granulomas periapicais, pois são formados nos ápices de dentes com polpas necróticas. Até o presente momento, o único trabalho que relacionou a apoptose nestas lesões foi o de TAKAHASKI et al (1999). Desta forma, a apoptose será analisada neste estudo e nestas lesões, de forma a contribuir para o entendimento da patogenia das mesmas. Ao analisar as características clínicas do granuloma periapical neste trabalho, notou-se uma prevalência maior no gênero masculino (60%) e em indivíduos leucodermas (53%). A análise dos achados clínicos do cisto periapical mostrou uma prevalência maior no gênero masculino (60%) e também em pessoas leucodermas (33%). Nas duas lesões, a faixa etária variou entre a terceira e sexta década de vida. A localização foi, preferencialmente, na maxila. E o tempo da doença foi indeterminado na maior parte das amostras. Estes achados estão concordantes com os relatados na literatura por LALONDE & LUEBKKE (1968), MORTENSEN et al (1970), STOCKDATE & CHANDLER (1988), GOMEZ et al (1992), LEDESMAMONTES et al (2000) e SATORRES et al (2001). 72 As secções coradas em HE apresentaram os achados histológicos principais para o diagnóstico dos granulomas e cistos radiculares. No granuloma periapical, foram observados um tecido de granulação cronicamente inflamado, circundado por um tecido conjuntivo fibroso. O infiltrado inflamatório era formado principalmente por linfócitos, além de plasmócitos, macrófagos e poucos neutrófilos (KUC et al., 2000; SINAN et al., 2002). Os cistos periapicais são considerados seqüelas diretas dos granulomas (FIGUEIREDO et al., 1999). Há proliferação dos restos epiteliais de Malassez com posterior destruição das células mais centrais, devido a hipóxia, iniciando a formação da cavidade revestida por um epitélio do tipo estratificado pavimentoso não ceratinizado e hiperplasiado. Na cápsula cística, observa-se a presença de um tecido conjuntivo fibroso e um infiltrado inflamatório mononuclear, variando de escasso a intenso (ROCHA, 1991; SIQUEIRA JR & LOPES, 1999; RAITZ et al., 2000; PESCE & FERLONI, 2002; SINAN et al., 2002). Acredita-se que, inicialmente, o processo inflamatório nos granulomas periapicais inicia-se pela ativação da resposta imune inata, mediada por PMN e macrófagos, que fagocitam microrganismos e células mortas no local inflamado, para conter a disseminação de bactérias e seus produtos (MARTÓN & KISS, 2000; RUIZ et al., 2003). Há formação de um tecido de granulação com a presença de um infiltrado inflamatório mononuclear, neoformação de vasos sanguíneos e uma fibrose circunscrevendo e delimitando o processo. Os PMN estão presentes nas áreas adjacentes ao forame apical onde se verifica a maior quantidade de antígenos bacterianos. Sua quantidade é pequena quando comparada às células mononucleares, indicando que o processo inflamatório é crônico, devido à 73 persistência do agente agressor (STERN et al., 1982; TAKAHASHI, 1998; KUC et al., 2000). Quando se determina o perfil celular das células imunocompetentes nas lesões periapicais, de granulomas e cistos radiculares, observa-se que linfócitos T e B são componentes predominantes destas duas lesões. Porém, as células T encontram-se em maior número que as células B. (TORABINEJAD & KETTERING, 1985; STASHENKO & YU, 1989; ALAVI, 1998; De OLIVEIRA & LARA, 2001). Ao avaliar as proporções de linfócitos Th e Ts, os estudos de TORABINEJAD & KETTERING (1985) não demonstraram diferenças significativas entre estes dois tipos celulares, nas duas lesões. Entretanto, os trabalhos realizados por STASHENKO & YU (1989), ALAVI (1998), De OLIVEIRA & LARA (2001) e LIAPATAS et al., (2003) mostraram diferenças nas proporções de linfócitos Th e Ts, em ambas as lesões periapicais. Estes autores acima citados, também demonstraram que, as células Th estavam aumentadas nas fases iniciais do desenvolvimento destas lesões, enquanto as células Ts estavam em maior número nas fases mais tardias do desenvolvimento dos granulomas e cistos periapicais. Desta forma, sugere-se que a resposta imune específica está envolvida na patogênese destas duas lesões periapicais. Os linfócitos Th poderiam mediar atividades de destruição óssea e expansão enquanto os linfócitos Ts atuariam na estabilização das duas alterações patológicas (STASHENKO & YU, 1989; ALAVI, 1998, De OLIVEIRA & LARA, 2001 e LIAPATAS et al., 2003). Ao analisarem a expressão de citocinas nas lesões periapicais, WALKER et al (2000) e LIAPATTAS et al (2003), demonstraram que os linfócitos T, dependendo do estímulo diferenciam-se em linfócitos Th1, que são produtores de IL-2, IFN-γ, TNF-β e fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos 74 (GM-GSF), consideradas citocinas pró-inflamatórias e em Th2, que são produtores de IL-4, IL-5 e IL-10, consideradas citocinas antiinflamatórias. Estas duas subclasses de linfócitos T, (Th1 e Th2) , atuam exercendo efeitos inversos, ou seja, quando um antígeno estimula uma forte resposta Th1, a resposta Th2 é fraca e vice-versa. Citocinas como TNF são capazes de induzir a apoptose em células inflamatórias através do TNFr, que se ligam a uma proteína adaptadora presente no citosol, denominada (TNFR- associated domínio death da domain). morte A associada ligação da ao TNFr proteína ou TRADD adaptadora a pró-caspase-8, resulta na ativação das caspases iniciadoras e efetoras, concluindo o processo de morte celular programada (GULBINS et al., 2000; DUCKETT, 2002; BRIDGHAM et al., 2003). Citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 e GM-GSF normalmente inibem o processo de apoptose no local da agressão (OBERHOLZER et al., 2001), uma vez que elas devem manter e perpetuar o processo inflamatório. A apoptose via sistema Fas/FasL também é importante na indução deste processo, principalmente pela expressão de FasL nas populações de células inflamatórias (OBERHOLZER et al., 2001). A união do FasL a seu receptor, promove a ativação de uma proteína adaptadora FADD, de modo semelhante ao TRADD, havendo sua ligação a pró-caspase-8, resultando na ativação das caspases indutoras e efetoras, completando o processo de apoptose (AMARANTES-MENDES & GREEN, 1999; CECCONI, 1999). Para a quantificação das células e corpos apoptóticos, foi utilizado o critério proposto por LIPPONEN & AALTOMAA (1994), que é baseado nas características morfológicas de condensação nuclear e citoplasmática e fragmentos de citoplasma contendo cromatina. Não foi possível identificar, satisfatoriamente, estes critérios nas 75 secções coradas em HE. Fato este, relatado por TAKAHASHI et al (1999). Nas células epiteliais do revestimento da cavidade cística, as alterações morfológicas das células apoptóticas foram bem reconhecidas em HE, entretanto, nas células do infiltrado inflamatório, nas duas lesões, estas mesmas alterações não puderam ser evidenciadas com clareza, uma vez que em linfócitos, o citoplasma é escasso e o núcleo condensado (FIG. 4). Portanto, utilizou-se para a contagem das células e corpos apoptóticos as secções coradas em Metil-Green-Pironina, que é especifica para ácidos nucléicos, pois estes corantes ligam-se aos grupos fosfóricos do DNA, tornando as modificações nucleares das células em apoptose mais facilmente detectáveis (McELROY, 1992). A média do IA entre granuloma periapical (0,078) e o cisto radicular (0,075) não mostrou haver diferenças estatisticamente significativas entre estas duas lesões. Dados estes, que corroboram com o fato das lesões terem a mesma etiopatogenia, o mesmo perfil celular e comportamento biológico. Além disto, ao se comparar o valor da média do IA do infiltrado inflamatório dos cistos radiculares (0,073) e do granuloma periapical (0,078) também não se observou diferenças estatisticamente significativas. Acredita-se que o IA aumente neste infiltrado inflamatório mononuclear quando o agente agressor for eliminado. Nestas lesões, após o tratamento endodôntico, observa-se a redução do infiltrado inflamatório (ALAVI, 1998; LIAPATAS et al., 2003). Neste estudo, identificou-se as células apoptóticas no infiltrado inflamatório mononuclear das lesões periapicais e no epitélio de revestimento da cavidade cística. Estes resultados contradizem o trabalho de TAKAHASHI et al (1999), que observaram a apoptose predominantemente em PMN, sugerindo que, o que foi 76 detectado por estes autores acima citados, foram os corpos apoptóticos, que são morfologicamente semelhantes aos PMN fragmentados. Quando se comparou a média do IA do epitélio cístico (0,083) e do infiltrado inflamatório (0,073) dos cistos periapicais, observou-se que não houve diferenças estatisticamente significativas, apesar da média absoluta do IA do epitélio cístico ter sido maior do que o do infiltrado inflamatório. Tal fato demonstra que, as células epiteliais sofrem o processo de diferenciação e terminam por descamar na superfície, o que no caso dos cistos ocorreria dentro da cavidade dos mesmos. 77 7. CONCLUSÕES 1. As células apoptóticas foram observadas morfologicamente no infiltrado inflamatório crônico de cistos e granulomas periapicais e no epitélio cístico. 2. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os IA’s das duas lesões. 3. Também não foram identificadas diferenças estatisticamente significativas entre o IA do infiltrado inflamatório das duas lesões. 4. O IA entre o epitélio e o infiltrado inflamatório cístico também não mostrou diferenças estatisticamente significativas. 78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, J.M.; CORY, S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science, v.281, n.4, p.1322-1326, august. 1998. ALAVI, A.M.; GULABIVALA, K.; SPEIGHT, P.M. Quantitative analysis of lymphocytes and their subset in periapical lesions. International Endodontic Journal, v.31, n.4, p.233-241, 1998. ALMEIDA, S.M.; BÓSCOLO, F.N.; HAITER NETO, F.; DOS SANTOS, J.C.B. Avaliação de três métodos radiográficos (periapical convencional, periapical digital e panorâmico) no diagnóstico de lesões apicais produzidas artificialmente. Pesqui Odontol Brás, v.15, n.1, p.56-63, jan/mar. 2001. AMARANTES-MENDES, G.P.; GREEN, D.R. The regulation of apoptotic cell death. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.32, n.9, p.1053-1061, 1999. AMEISEN, J. 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