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XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Efeito da adição dos antioxidantes Trolox C e Ácido Ascórbico no sêmen de ovinos sobre a motilidade
progressiva após a criopreservação1
Effect of addition of Trolox C and Ascorbic Acid in the ram semen on the progressive motility after
cryopreservation
Vitória Gomes Coelho2, Jonathan Maia da Silva Costa3, Elenice Andrade Moraes4, Wildelfrancys Lima de
Souza3, Laiane Moreira Vianna Magalhães3, Laio Ramon Cardoso Torres5, Dailli Ingrid de Brito Lima5,
Pedro Humberto Félix de Sousa6
1
Parte da dissertação de Mestrado do segundo autor, financiado pela Edital Universal-UNIVASF
Graduanda do Curso de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF),
Petrolina-PE, e-mail: [email protected]
3
Mestrando (a) do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, (CPGCA), UNIVASF, Petrolina-PE
4
Professora do Colegiado de Zootecnia e do CPGCA, UNIVASF, Petrolina-PE
5
Graduando (a) do Curso de Medicina Veterinária, UNIVASF, Petrolina-PE
6
Professor do Setor de Ovinocultura do DTCS, UNEB, Juazeiro-BA.
2
Resumo: Objetivou-se avaliar o efeito dos antioxidantes Trolox C e Ácido Ascórbico sobre a motilidade
progressiva dos espermatozoides a fresco e congelados de carneiros. Foram utilizados 30 ejaculados de três
ovinos das raças Dorper e Santa Inês. As colheitas de sêmen foram realizadas através de vagina artificial,
com auxílio de uma fêmea ovina em estro natural ou induzido. Os ejaculados coletados de cada animal foram
subdivididos em 5 tratamentos: Controle, sem antioxidante; adição de 100 µL de Trolox C; 200 µL de
Trolox; 0,05% de Ácido Ascórbico e 0,25% de Ácido Ascórbico. Após a diluição e adição dos diferentes
antioxidantes, as amostras em tubos de ensaio foram inseridos em becker com água a 32°C, e submetidas a
curva de refrigeração em câmera fria a 5°C por duas horas. Após esse período, as amostras foram envasadas
em palhetas de 0,5 mL e submetidas a rampa de congelação em vapor de nitrogênio líquido (N 2) por 15
minutos e em seguida imersas em nitrogênio líquido a -196ºC. Para a avaliação da motilidade progressiva as
amostras foram descongeladas a 37°C/30s e avaliadas pelo sistema CASA. Os dados foram submetidos à à
ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Não houve efeito sobre a
motilidade progressiva dos espermatozóides após adição dos tratamentos no sêmen fresco (P>0.05).
Entretanto, foi observado aumento da motilidade no sêmen descongelado em todos os tratamentos em
comparação ao grupo controle (P<0,05). A adição do antioxidante Trolox C e ácido e ascórbico no sêmen
antes do processo de congelamento aumentou a motilidade progressiva espermática, demonstrando ser
eficiente o uso destes antioxidantes no sêmen fresco de ovinos para a criopreservação.
Abstract: The objective was to evaluate the effect of antioxidants Trolox C and Ascorbic Acid on the
progressive motility of the sperm fresh and frozen ram. Thirty ejaculates from three ram (Dorper and Santa
Inês breeds). Semen samples were collected by artificial vagina using a female sheep in induced estrus. After
the collected from each animal, ejaculates were subdivided in five tubes to be diluted with diluents
previously prepared with five different treatments: control-without antioxidant; 100 µL of Trolox C; 200 µL
of Trolox; 0.05% of Ascorbic Acid; and 0.25% of Ascorbic Acid. Then, the samples of each treatment were
then cooled to 5ºC over 2 hours. After this period each samples was packaged into 0.5 ml straws and frozen
in static liquid nitrogen vapor (8.0 cm above the liquid nitrogen) for 15 minutes, before being plunged into
liquid nitrogen for storage. Straws were thawed at 37ºC in bath for 30 seconds. The progressive sperm
motility was determined using CASA. The dada was analyzed by analysis of variance using a Tukey test. The
progressive motility not differ among treatments for fresh sperm (P>0.05), however increased when used
Trolox C and ascorbic acid to thawed semen compared to control group (P<0.05). Addition of Trolox C and
ascorbic acid improve the progressive motility after cryopreservation ram sperm.
Palavras–chave: antioxidantes, carneiro, motilidade progressiva
Keywords: antioxidants, progressive motility, ram
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Introdução
A criopreservação de sêmen dos animais domésticos contribuiu para a expansão das biotécnicas da
reprodução, como a inseminação artificial (IA) e a fertilização in vitro, o que a torna uma importante técnica
reprodutiva, tendo em vista que promove a conservação do germoplasma masculino por tempo indeterminado
(SILVA, 2013). Entretanto, a célula espermática é sensível a variações externas decorrentes do processo de
congelação-descongelação, que implicam em danos a motilidade espermática e a integridade das membranas
(SALAMON e MAXWELL, 1995), produzindo uma sub-população com menor tempo de vida in vivo, o que
reduz efetivamente a eficiência da população como um todo.
Visando reduzir os efeitos deletérios ocasionados pela criopreservação, antioxidantes nãoenzimáticos como o Trolox C e Ácido ascórbico, tem sido adicionados ao meio diluidor, os quais tem
demostrado efeitos benéficos na manutenção da viabilidade espermática pós descongelamento (MAIA et al.,
2009; CASTILHO et al., 2009), sendo está uma importante avaliação, uma vez que, os parâmetros da cinética
espermática têm sido correlacionados com provas de capacidade fecundante do espermatozoide
(ISACHENKO et al., 2004). Assim, objetivou-se avaliar o efeito da adição dos antioxidantes Trolox C e
Ácido Ascórbico, sobre a motilidade progressiva de espermatozoides fresco e congelado de ovinos, sobre o
sistema de análise computadorizada de sêmen (CASA).
Material e Métodos
Foram realizadas 30 colheitas através de vagina artificial, na presença de uma fêmea ovina em estro
natural ou induzido. Imediatamente após a colheita, os ejaculados foram avaliados quanto aos parâmetros:
volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade com auxílio do sistema de análise computadorizada de sêmen e
concentração espermática por meio de fotômetro (Minitub®), devidamente calibrado, para espécie ovina.
Após as avaliações os ejaculados com no mínimo 70% de motilidade foram pré-diluídos a 35ºC, em
etapa única, com diluente Tris-Gema de ovo, conforme Souza et al, (2014), afim de obter uma concentração
final de 200 milhões de células/mL. Em seguida os ejaculados pré-diluídos de cada animal foram
subdivididos em 5 tratamentos: Controle, sem antioxidante; adição de 100 µL de Trolox C; 200 µL de
Trolox; 0,05% de Ácido Ascórbico e 0,25% de Ácido Ascórbico. Após a diluição e adição dos diferentes
antioxidantes, as amostras em tubos de ensaio foram inseridos em becker com água a 32°C, os quais foram
acondicionados sobre rack em câmera fria a 5°C por duas horas. Após esse período, as amostras de cada
tratamento foram envasadas em palhetas de 0,5 mL e lacradas com seladora ultrassônica (Minitub).
Posteriormente, as palhetas foram submetidas a rampa de congelação em vapor de nitrogênio líquido (N 2) por
15 minutos, a 8 cm da lâmina líquida. Decorrido este tempo as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido
e armazenadas em botijão criogênico a -196ºC.
Para a avaliação de motilidade progressiva as amostras foram descongeladas em descongelador
automático a 37°C/30s e avaliadas pelo sistema CASA.
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e ao teste de Tukey, com P<0,05.
Resultados e Discussão
A motilidade progressiva do sêmen descongelado não diferiu entre os tratamentos no sêmen a
fresco (P>0,05), entretanto, após o descongelamento foi observado aumento da motilidade espermática
progressiva no sêmen descongelado nos tratamentos que foram adicionados os antioxidantes Trolox C e
ácido ascórbrico comparado ao grupo controle (Tabela 1; P<0,05).
Tabela 1. Motilidade progressiva (MP) (%) espermática do sêmen a fresco e descongelado após adição de
diferentes antioxidantes antes do congelamento
Tipo
CONTROLE
TRO 100 µL
TRO 200 µL
AA 0,05%
AA 0,25%
Fresco
79,24±1,33
80,09±1,33
81.38±1,33
80,05±1,33
77,74±1,33
39,57±2,68b
42,60±2,68a
46,70±2,68a
44,29,68±a
a,b
Médias diferentes na mesma linha indicam diferenças significativas (P<0,05).
*AA: Ácido ascórbico; TRO: Trolox.
44,84, 68±a
Descongelado
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Observamos que a adição das concentrações testadas de Trolox C e Ácido ascórbico não promoveu
alteração na motilidade progressiva do sêmen descongelado (P>0,05). Pode-se sugerir que os antioxidantes
atuaram de maneira semelhante e foram eficientes na redução das espécies reativas de oxigênio (ERO), após
um processo de congelamento-descongelamento. Os resultados obtidos são similares aos reportados por Maia
(2009) e Castilho (2009), que avaliaram a adição destes após descongelamento no sêmen de ovino e caprino,
respectivamente. Estes elevados percentuais de motilidade progressiva que variaram entre 42 a 46% entre os
grupos aditivados com os antioxidantes são importantes, uma vez, que a motilidade espermática é primordial
para proporcionar a capacidade necessária do espermatozoide percorrer o trato reprodutivo feminino,
permitindo sua penetração efetiva nas células do cumullus e zona pelúcida do oócito.
Conclusões
A adição do antioxidante Trolox C e ácido e ascórbico no sêmen antes do processo de congelamento
aumentou a motilidade progressiva espermática, demonstrando ser eficiente o uso destes antioxidantes no
sêmen fresco de ovinos para a criopreservação.
Agradecimentos
Universidade Estadual da Bahia-UNEB pela concessão dos animais experimentais. A Univasf pela
estrutura e apoio financeiro a pesquisa (Edital 17/2013-Universal Pós-Univasf), e a Fundação de Amparo à
Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela bolsa de mestrado.
Literatura citada
CASTILHO, F. E.; GUIMARÃES, D. J.; MARTINS, F. L.; PINHO, O. R.; GUIMARANHÃES, F. E. S.;
ESPESCHIT, B. J. C. Uso de própolis e ácido ascórbico na criopreservação do sêmen caprino. Revista
Brasileira de Zootecnia, v.38, n.12, p.2335-2345, 2009.
ISACKENKO, E.; ISACKENKO, V.; KATKOV, I.I., et al. DNA integrity motility of human spermatozoa
after standard slow freezing versus cryoprotectant-free vitrification. Hum. Reprod., v. 19, n.4, p. 932-939,
2004.
MAIA, M. S.; BICUDO, S. D.; AZEVEDO, H. C.; SICHERLE, C. C.; SOUSA, D. B.; RODELLO, L.
Motility and viability of ram sperm cryopreserved in a Tris-egg yolk extender supplemented with antioxidants. Small Ruminant Research. v. 85, p. 85–90, 2009.
SALAMON, S.; MAXWELL, W.M.C. Frozen storage of ram semen I. processing, freezing, thawing and
fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, v. 37, p.185-249, 1995.
SILVA, J. C. Criopreservação de sêmen ovino com diferentes concentrações espermáticas associado ou
não com ácido ascórbico. Viçosa, 2013. 52p. Tese (Doutorado em zootecnia). Universidade Federal de
Viçosa.
SOUZA, W. L.; COSTA, J. M. S.; MORAES, E. A.; TORRES, L. R. C.; COELHO, V. G.; MAGALHÃES,
L. M. V. Efeito da adição de diferentes concentrações de crioprotetores ao meio diluente de sêmen
ovino após a criopreservação. Simpósio de Produção Animal do Vale do São Francisco, Petrolina-PE,
2014.
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