Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada

Transcrição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Imunossupressão induzida por sepse é dependente da idade
David Fernando Colón Morelo
Ribeirão Preto – SP
2015
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade São Paulo para obtenção do título
de Mestre em Ciência, Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha.
Co-Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula de Carvalho Panzeri
Carlotti.
Ribeirão Preto – SP
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Colón, David Fernando
Imunossupressão induzida por sepse é dependente da idade. Ribeirão Preto, 2015. 160 p;
il:30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área
de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Cunha, Fernando de Queiroz.
1. Sepse. 2. Imunossupressão. 3. Idade. 4. Células T Reguladoras.
Folha de Aprovação
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade São Paulo para obtenção do título
de Mestre em Ciência, Área de concentração: Imunologia
Aprovado em 02 de junho de 2015
Banca examinadora
Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha
FMRP-USP
Prof. Dr. Fabio Carmona
FMRP-USP
Prof. Dr. Beatriz Martins Tavares Murta
FMTM
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Inflamação e Dor do Departamento de
Farmacologia em colaboração com o Centro de Terapia Intensiva do Departamento de
Cirurgia e Anatomia e o Centro de Terapia Intensiva Pediátrica do Departamento de
Puericultura e Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (FMRP-USP), com apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência
do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (FAEPA).
Deus é o nosso refúgio e fortaleza, socorro bem presente na angústia.
Portanto não temeremos, ainda que a terra se mude,
e ainda que os montes se transportem para o meio dos mares.
Ainda que as águas rujam e se perturbem, ainda que os montes se abalem pela sua braveza.
Há um rio cujas correntes alegram a cidade de Deus, o santuário das moradas do Altíssimo.
Deus está no meio dela; não se abalará. Deus a ajudará, já ao romper da manhã.
Os gentios se embraveceram; os reinos se moveram;
Ele levantou a sua voz e a terra se derreteu.
O Senhor dos Exércitos está conosco; o Deus de Jacó é o nosso refúgio.
(Davi, Salmos 46:1-7)
Dedicatória
À minha amada família:
Meus pais, Ricardo e Maritza,
pois mais que a vida, me proporcionaram o desejo e a
busca pelo conhecimento;
Meus irmãos, Ricardo e Liney,
por o apoio em todos os
momentos em que mais precisei;
Meu Amor, Diana,
pelo amor, paciência, compreensão e apoio incondicional nesta longa caminhada;
e ao Prof. Dr. Diego Torres,
por me ensinar que não existe nada impossível.
Obrigado por mostrarem minha essência e minhas raízes.
Obrigado por tudo!
Agradecimentos
Agradeço inicialmente ao Prof. Fernando de Queiroz Cunha pela amizade e orientação, por
abrir as portas do laboratório de Inflamação e Dor, me oferecendo todo apoio e infraestrutura
para a realização deste trabalho. Obrigado também à Profa. Ana Paula Carlotti por facilitar
toda a logística de captação de pacientes para este estudo e ao Prof. Fernando Ramalho por
seu apoio e ajuda assessoria clinica durante este estudo.
Aos demais professores do LID, Thiago Cunha e Jose Carlos Alves-Filho, pela convivência
e discussão de resultados nestes dois anos.
Sou grato aos que colaboraram diretamente com meu trabalho, por meios de discussões,
ensinamento de técnicas as quais eu não tinha domínio, ou mesmo, a realização direta de
experimentos ao meu lado: Fernanda V. Castanheira (Fer) (grande amiga, pesquisadora e
dupla de experimentos), Marcelo Franchin (Chelo) (grande amigo e colaborador),
Adriana Helena Souza (Dri) (grande amiga), Raphael Sanches (Panda), Vanessa Borges,
Kalil Alves De Lima, Rafael França, Fabiane Sônego, Daniele Nascimento, Silvia Celoni
y Jhimmy Talbot.
Obrigado aos meus colegas do laboratório de Dor e Inflamação, que não realizaram
experimentos propriamente neste trabalho, mas contribuíram em grande parte para a minha
formação pessoal e profissional: Andressa Freitas, Larissa Garcia Pinto, Paula Giselle
Czaikoski, Paulo H. Melo, Caio Abner, Gabriela Trentin, Jaqueline Raymond,
Alexandre Kanashiro, Guilherme Rabelo de Sousa, Paula Barbim, Rafael Ferreira,
André, Dênis, João Paulo, Miriam, Alexandre Lopes, Maria Cláudia, Rangel Leal,
Maurício Mota, Flávia e Flávio.
Grato aos colegas que me deram a oportunidade de trabalhar em colaboração para o
desenvolvimento de seus respectivos trabalhos e auxiliaram no meu aprendizado como
pesquisador: Fernanda V. Castanheira, Marcelo Franchin, Cindy Hana Okuma, Maraiza
Teixeira, Daniel Zoppi, Adriana de Souza e Anselmo Jiro Kamada.
Obrigado a todos os Pós-graduandos do Departamento de Imunologia Básica e Aplicada,
pela amizade, discussões durante as disciplinas que cursamos juntos, pelos encontros no
corredor, pelo curso de inverno que realizamos com sucesso no ano de 2014.
Obrigado a todos os alunos e docentes que fazem parte do Journal Club do Programa de PósGraduação em Imunologia Básica e Aplicada, pelas ricas discussões de artigos que
contribuíram para minha formação profissional.
Agradeço a imensa amizade, além do auxílio técnico de: Giuliana Bertozi, Marcos Antônio,
Ieda Regina dos Santos, Diva Amábile, Ana Kátia dos Santos, Sérgio Roberto Rosa,
Tadeu Franco Vieira e Vagner Jesus.
Aos funcionários dos biotéiros: Júlio, Dener, Eliana e Orlando, pela criação, distribuição e
cuidado com os animais utilizados neste estudo.
À Ana Cristina, secretária da pós-graduação, não apenas pela competência com que realiza
seu trabalho e pelos anos de dedicação à nossa pós-graduação, como também pela amizade e
ajuda incondicional.
Aos queridos amigos, aos professores e técnicos do Programa de Imunologia, pelos bons
momentos de aprendizado e diversão.
Agradeço a Fernanda V. Castanheira e Marcelo Franchin não apenas pela ajuda e
ensinamentos que possibilitaram a realização deste trabalho, mas também pela grande
amizade, paciência e carinho com que sempre me trataram.
Obrigado aos membros da banca examinadora composta por: Prof. Dr. Fabio Carmona,
Prof. Dra. Beatriz Tavares Murta e o Prof. Dr. Fernando de Queiroz Cunha por se
dispuserem a atender meu pedido quanto à avaliação deste trabalho.
A toda minha família querida, meus pais (Ricardo e Maritza), meus irmãos (Ricardo e
Liney), meu amor (Diana QP), meus avós, minha babá (Rosa).
Agradeço em muito ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Fundação
de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência (FAEPA) pelo auxílio financeiro que
possibilitou a realização deste trabalho.
Finalmente, sou imensamente grato a aquele que propiciou tudo o que estudei e que
estudo, a fonte da toda sabedoria e ciência, a aquele que me deu a vida e ainda todo o
amparo que preciso para construí-la, obrigado a DEUS, meu pai e guia para todas as
horas, amigo fiel e companheiro para toda a vida.
“O cientista não é o homem que fornece as verdadeiras respostas; é quem faz as
verdadeiras perguntas”.
Claude Lévi-Strauss
Resumo e
Abstract
RESUMO
COLÓN, DF. IMUNOSSUPRESSÃO INDUZIDA POR SEPSE É DEPENDENTE DA
IDADE. Dissertação de Mestrado – Faculdade Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica decorrente de uma infecção,
caracterizada por lesão tecidual, apoptose e disfunção do sistema imune. Relatos da literatura
tem demonstrado que pacientes e animais de experimentação que sobrevivem à sepse
desenvolvem um quadro de imunossupressão tardia, o qual contribui com a maior
suscetibilidade destes a infecções secundárias. Nosso grupo demonstrou que as células T
reguladoras (Tregs) participam ativamente do desenvolvimento desta imunossupressão.
Porém, estes achados foram descritos somente em adultos e não haviam relatos na literatura
destas alterações no contexto da na sepse pediátrica. Assim, o objetivo do presente trabalho
foi avaliar o papel da idade na gênese da imunossupressão induzida após sepse. Para isso
camundongos C57BL/6 recém-nascidos (duas semanas de idade) e adultos (oito semanas de
idade) foram submetidos à sepse letal, induzida pela injeção intraperitoneal de bactérias e
tratados com um suporte básico (reposição hidríca e antibioticoterapia). Inicialmente
avaliamos a participação da idade na fase aguda da sepse. Demonstramos que nesta fase
camundongos recém-nascidos submetidos à sepse apresentam deficiências nas funções
antimicrobianas mediadas pela resposta imune inata, caracterizada pela menor migração de
PMN in vivo e in vitro, e diminuição da atividade bactericida, o qual determinou uma maior
susceptibilidade à sepse experimental, caracterizada por uma intensa resposta inflamatória
associada com um maior comprometimento multiorgânico. Na segunda parte, nós verificamos
que animais recém-nascidos sobreviventes à fase aguda da sepse, de maneira oposta aos
adultos, apresentam diminuição significativa na frequência das células Tregs, fenômeno
também observado em pacientes pediátricos sobreviventes à sepse. Adicionalmente,
demonstramos que animais recém-nascidos que sobrevivem à sepse não apresentam aumento
da diferenciação de macrófagos M2. Finalmente, em consonância com a diminuição nas
células Tregs, nós verificamos que camundongos recém-nascidos pós-sépticos apresentam
resistência à infecção secundária induzida pela inoculação intranasal com P. aeruginosa e
ausência do comprometimento da imunovigilância tumoral dependente de células T.
Finalmente, identificamos que a capacidade supressora das células Tregs de camundongos
recém-nascidos assim como de pacientes pediátricos sobreviventes à sepse foi mantida,
sugerindo que a diminuição no número das células Tregs e não a sua capacidade supressora a
implicada no não desenvolvimento da imunossupressão. Desse modo, esse conjunto de dados,
tanto no modelo experimental quanto em pacientes, demostram pela primeira vez que a
disfunção imune associada com a sepse e o desenvolvimento da imunossupressão são
dependentes da idade. Assim, o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos neste
fenômeno, proporcionará interessantes achados que podem contribuir para o desenvolvimento
de novas estratégias terapêuticas com intuito de prevenir a imunossupressão pós sepse em
adultos.
Palavras-chave: Sepse, Imunossupressão, Idade, Células T Reguladoras.
ABSTRACT
COLÓN, DF. SEPSIS-INDUCED IMMUNOSUPPRESSION IS DEPENDENT OF
AGE. Dissertation (Master) – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo,
Ribeirão Preto, 2015.
Sepsis is defined as systemic inflammatory response caused by an infection, characterized by
tissue injury, extensive apoptosis and immune dysfunction. It has been shown that septic mice
and patients that survived from sepsis develop a late immunosuppression, which contributes
to greater susceptibility to these secondary infections. Our group has shown that regulatory T
cells (Tregs) actively participate in the development of this immunosuppression. These
findings were reported in humans and adult mice; however, there is no evidence of these
alterations in the pediatric sepsis. The present study aimed to investigate the role of age in the
genesis of immunosuppression following sepsis. For that, newborn (two-weeks old) and
adults (eight-week old) C57BL/6 mice were underwent to severe sepsis induced by
intraperitoneal injection of bacteria and treatment with basic support (hydration and
antibiotics). Initially we evaluated the influence of age in the acute phase of sepsis. We show
that in this phase newborn mice subjected to sepsis showed deficiencies in the antimicrobial
functions mediated by the innate immune response, characterized by lower neutrophils
migration in vivo and in vitro, and decreased in its bactericidal activity, which led to a greater
susceptibility to sepsis experimental characterized by an intense inflammatory response
associated with a higher multiple organ dysfunction. In the second part, we found that
newborn animals surviving to the acute phase of sepsis, in the opposite way to adults, showed
a significant decrease in the frequency of Treg cells, a phenomenon also observed in pediatric
sepsis-surviving patients. Additionally, we demonstrated that sepsis-surviving newborn mice
did not show increased differentiation of M2 macrophages. Finally, in line with the decrease
in Treg cells, we found that post-septic newborn mice are resistant to secondary infection
induced by intranasal inoculation with P. aeruginosa and absence of tumor
immunosurveillance commitment dependent on T cells. In addition, we identified that the
suppressor capacity of Treg cells isolated from newborn mice as well as pediatric sepsissurviving patients was maintained, suggesting that is the decrease in the number of Treg cells
and not their suppressive capacity implicated in non-development of immunosuppression.
Thus, this data, in both experimental models and patients, demonstrate for the first time that
the immune dysfunction associated with sepsis and immunosuppression development are agedependent. Thus, understanding of the molecular mechanisms involved in this phenomenon
will provide interesting findings that may contribute to the development of new therapeutic
strategies aiming to prevent immunosuppression post-sepsis in adults.
Keywords: sepsis, immunosuppression, age, regulatory T cells.
Lista de
Esquemas e Tabelas
Esquema 1. Modelo de resposta imune na sepse neonatal. ...................................................134
Tabela 1. Terminologia e definições relacionadas à sepse. ....................................................32
Tabela 2. Características demográficas e clínicas dos pacientes adultos e pediátricos
sépticos....................................................................................................................................108
Lista de
Figuras
Figura 1. Caracterização das bactérias isoladas do conteúdo intestinal de camundongo adulto.
...................................................................................................................................................70
Figura 2. Camundongos recém-nascidos são mais susceptíveis à sepse. ...............................72
Figura 3. Camundongos recém-nascidos submetidos à sepse letal apresentam maior
disfunção orgânica. ..................................................................................................................74
Figura 4. Neutrófilos de camundongos recém-nascidos apresentam alterações na migração
celular in vivo e in vitro. ...........................................................................................................77
Figura 5. Camundongos recém-nascidos apresentam maior produção de NO e menor
mobilização intracelular de cálcio. ...........................................................................................80
Figura 6. Camundongos recém-nascidos apresentam maior produção de NO durante a sepse.
...................................................................................................................................................81
Figura 7. Camundongos recém-nascidos apresentam falência nos mecanismos de fagocitose e
killing bacteriano. .....................................................................................................................83
Figura 8. Macrófagos provenientes de camundongos recém-nascidos apresentam falência nos
mecanismos de fagocitose e killing bacteriano. .......................................................................84
Figura 9. Tratamento com antibiótico é capaz de controlar o processo infeccioso em animais
sépticos. ....................................................................................................................................87
Figura 10. Tratamento com antibiótico reduz a disfunção orgânica em animais sépticos. .....88
Figura 11. Padronização do inóculo de P. aeruginosa em animais recém-nascidos e adultos
naives. ......................................................................................................................................91
Figura 12. Animais C57BL/6 recém-nascidos sobreviventes à sepse são resistentes à infecção
pulmonar não letal induzida por Pseudomonas aeruginosa. ...................................................92
Figura 13. Camundongos adultos, mas não os recém-nascidos sobreviventes à sepse
apresentam disfunção proliferativa das células T CD4+. .........................................................94
Figura 14. Camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse letal não apresentam
expansão das células TCD4+FoxP3+ (Tregs) no baço. .............................................................97
Figura 15. Histograma de proliferação celular usando Ki67 e neuropilina no baço (A) e no
linfonodo (B) de camundongos adultos sobreviventes a sepse. ...............................................98
Figura 16. Capacidade supressora das células T Reguladoras é semelhante em camundongos
adultos e recém-nascidos sobreviventes à sepse. ...................................................................100
aumento no crescimento tumoral. ..........................................................................................102
expansão das células TCD4+FoxP3+ (Tregs) no baço e no microambiente tumoral. ............103
Figura 19. Camundongos recém-nascidos sobreviventes á sepse letal não apresentam
aumento na frequência de macrófagos M2 na cavidade peritoneal. .....................................105
Figura 20. Macrófagos de camundongos recém-nascido sobreviventes à sepse não
apresentam mudanças na capacidade microbicida. ................................................................106
Figura 21. Pacientes pediátricos sobreviventes à sepse não apresentam expansão das células
TCD4+FoxP3+ (Tregs). ..........................................................................................................110
Figura 22. Capacidade supressora das células T Reguladoras é mantida em pacientes
pediátricos sobreviventes à sepse. ..........................................................................................112
Figura 23. Pacientes pediátricos sobreviventes á sepse não apresentam elevação nas
concentrações de IL-33 e IL10. ..............................................................................................114
Lista de
Abreviaturas
μl
Microlitro (s)
AST
Aminotransferase
BAL
Lavado broncoalveolar
BMDM
Macrófagos derivado da medula óssea
BMDN
Neutrófilos derivado da medula óssea
BSA
Albumina derivada de soro bovino
CD
“Cluster of differentiation”
SIP
Sepse por inoculação de bactéria i.p
CCR
Receptor de quimiocinas CC
EDTA
Etilenodiaminotetracético
ELISA
“Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”
FITC
Isoticianato de fluoresceína
Foxp3 Fator de transcrição “forkhead Box P3”
GITR
Gene relacionado à família do receptor TNF induzido por glucocorticóide
H2O2
Água Oxigenada
IFN
Interferon
Ig
Imunoglobulina
IL
Interleucina
i.n.
Intranasal
i.p.
Intraperitoneal
kg
Kilograma (s)
P.a.
Pseudomonas aeruginosa
Log
Logaritmo da função matemática
mg
Miligrama (s)
PBS
“Phosphate buffered saline”
PE
Ficoeritrina
Percp
Clorofilia-peridinina
pg
Picograma (g)
RPMI
Meio de cultura para células 1640
SBF
Soro bovino fetal
s.c.
Subcutâneo
SIRS
Síndrome da resposta inflamatória sistêmica
TGF-β Fator de crescimento e transformação β
TNF
Fator de necrose tumoral
Tregs
Células T Reguladoras
UFC
Unidades formadoras de colônia
UTIs
Unidades de terapia intensiva
WT
Animais selvagens (Wide-type) C57Bl/6 ou BALB/c
TCR
T Cell Receptor
TLR
Toll-like Receptor
Sumário
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................31
1.1 Sepse: Conceitos gerais ................................................................................................31
1.2 Epidemiologia da sepse ................................................................................................33
1.3 Fisiopatologia da sepse ................................................................................................34
1.3.1
Sepse e o “cytokine storm” ....................................................................................35
1.3.2
Neutrófilos e Sepse ................................................................................................36
1.4 Imunossupressão na sepse ............................................................................................37
1.5 As células T Reguladoras .............................................................................................41
1.6 Sepse Pediátrica ...........................................................................................................42
2. OBJETIVOS ...............................................................................................................46
2.1 Objetivo Geral ..............................................................................................................46
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................46
3. MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................48
3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE EM ANIMAIS DE DUAS, QUATRO,
SEIS E OITO SEMANAS DE VIDA. .......................................................................48
3.1.1
Obtenção de Bactérias ............................................................................................48
3.1.2
Animais ..................................................................................................................48
3.1.3
Indução da sepse ....................................................................................................49
3.1.4
Protocolo de terapia com antibiótico .....................................................................49
3.1.5
Isolamento e quantificação de UFC em animais pós-tratamento ...........................49
3.1.6
Determinação do infiltrado neutrofílico aos tecidos ..............................................50
3.1.7
Migração celular ....................................................................................................50
3.1.8
Quimiotaxia in vitro ...............................................................................................51
3.1.9
Microscopia Intravital ............................................................................................51
3.1.10 Determinação da concentração de nitrito no soro e lavado peritoneal ...................52
3.1.11 Determinação das concentrações séricas de TGO, CK-MB e BUN ......................52
3.1.12 Determinação das concentrações de citocinas .......................................................52
3.1.13 Determinação das concentrações de citocinas no sangue e lavado peritoneal .......53
3.1.14 Análise histológica .................................................................................................53
3.2 ATIVIDADE FAGOCÍTICA, INFLUXO DE CÁLCIO E PRODUÇÃO DE
ESPÉCIES REATIVAS POR NEUTRÓFILOS E MACRÓFAGOS 53
3.2.1
Isolamento de neutrófilos e macrófagos ................................................................53
3.2.2
Ensaio de fagocitose e killing .................................................................................54
3.2.3
Produção de espécies reativas totais ......................................................................54
3.2.4
Influxo de cálcio .....................................................................................................54
3.3 AVALIÇÃO DA PRESENÇA DAS CÉLULAS TREGS EM CAMUNDONGOS
SOBREVIVENTES À SEPSE ...................................................................................55
3.3.1
Fenotipagem das Tregs ..........................................................................................55
3.3.2
Purificação das Células TCD4+CD25- (Teff) e TCD4+CD25+ (Tregs) ..................55
3.3.3
Ensaio funcional das Tregs ....................................................................................56
3.3.4
Ensaio de proliferação de células TCD4+ ..............................................................56
3.3.5
Infecção secundária intranasal com Pseudomonas aureginosa) ............................57
3.3.6
Obtenção do lavado broncoalveolar (BAL) ...........................................................58
3.3.7
Inoculação intradérmica da linhagem celular tumoral B16LucF10 .......................58
3.4 CARACTERIZAÇAO
FUNCIONAL
DOS
MACRÓFAGOS
EM
CAMUNDONGOS SOBREVIVENTES À SEPSE .................................................58
3.4.1
Ensaio de fagocitoses e quantificação do crescimento intracelular (killing) de P.
aeruginosa nos macrófagos ...................................................................................58
3.4.2
Macrófagos M2 em camundongos sobreviventes à sepse letal ..............................59
3.5 ANÀLISES DE AMOSTRAS DOS PACIENTES SÉPTICOS ..............................60
3.5.1
Pacientes .................................................................................................................60
3.5.2
Critérios de inclusão ...............................................................................................60
3.5.3
Critérios de Exclusão .............................................................................................60
3.5.4
Classificação clínica ...............................................................................................61
3.5.5
Fenotipagem das células Tregs ..............................................................................61
3.5.6
Ensaio funcional das Tregs ....................................................................................62
3.5.7
Determinação das concentrações de citocinas no sangue ......................................62
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................63
3.7 PREPARO DAS SOLUÇÕES E REAGENTES 63
3.7.1
Solução de Anestésico ...........................................................................................63
3.7.2
Corante Panótico Rápido (LaborClin) ...................................................................63
3.7.3
Solução de Tampão Salina-fosfato (PBS) 10X (Solução estoque) ........................64
3.7.4
PBS 1X (Solução de uso) .......................................................................................64
3.7.5
Tampão de lise .......................................................................................................64
3.7.6
Tampão de citometria de fluxo (Tampão de FACS) ..............................................64
3.7.7
PBS-EDTA (1 mM) ...............................................................................................64
3.7.8
Meio Brain Heart Infussion (BHI) .........................................................................64
3.7.9
Meio RPMI incompleto .........................................................................................65
3.7.10 Meio RPMI completo .............................................................................................65
3.7.11 Triton 0,2% pra Fagocitosis e Killing ....................................................................65
3.7.12 Hanks 10X ..............................................................................................................65
3.7.13 Ertapenem 0,05g/mL ..............................................................................................65
3.7.14 Meio Ágar Muller Hinton (M.M.H.) ......................................................................66
3.7.15 Tampões utilizados para o ensaio de ELISA .........................................................66
4. RESULTADOS ...........................................................................................................68
4.1 EXPERIMENTOS EM CAMUNDONGOS: MODELO EXPERIMENTAL DE
SEPSE EM CAMUNDONGOS COM DIFERENTES IDADES ...........................68
4.1.1
Caracterização das populações celulares da resposta imune inata e adaptativa em
camundongos com diferentes idades ......................................................................68
4.1.2
Obtenção e determinação do inóculo de bactérias para indução de sepse
experimental ...........................................................................................................69
4.1.3
Caracterização da fase aguda de camundongos C57BL/6 adultos e recém-nascidos
submetidos à sepse .................................................................................................71
4.1.4
Camundongos recém-nascidos submetidos à sepse letal apresentam maior
disfunção orgânica .................................................................................................73
4.1.5
Neutrófilos de camundongos recém-nascidos apresentam defeitos nos mecanismos
de migração celular in vivo e in vitro .....................................................................75
4.1.6
Diminuição na migração de neutrófilos e na capacidade fagocítica em
camundongos recém-nascidos está associada com uma menor mobilização
intracelular de cálcio ..............................................................................................78
4.1.7
Neutrófilos de camundongos recém-nascidos apresentam falência na fagocitose e
na produção de espécies reativas ............................................................................82
4.1.8
Caracterização
dos
camundongos
C57BL/6
adultos
e
recém-nascidos
sobreviventes à sepse letal .....................................................................................85
4.1.9
Padronização da infecção pulmonar secundária à sepse com P. aeruginosa .........89
4.1.10 Células T CD4+ de camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse não
apresentam falência na proliferação em contraste com os camundongos adultos
sobreviventes á sepse letal .....................................................................................93
4.1.11 Camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse não apresentam expansão das
células T reguladoras (CD4+Foxp3+) em contraste com os camundongos adultos
sobreviventes à sepse letal .....................................................................................95
4.1.12 As células T reguladoras CD4+Foxp3+ de camundongos adultos e recém-nascidos
sobreviventes á sepse mantêm sua atividade supressora .......................................99
4.1.13 Camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse não apresentam disfunção
imune em resposta ao desafio tumoral com a linhagem celular B16lucF10 ........101
4.1.14 Camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse não apresentam aumento no
número de macrófagos M2 ...................................................................................104
4.2 EXPERIMENTOS EM HUMANOS ......................................................................107
4.2.1
Características demográficas e clínicas dos pacientes pediátricos e adultos sépticos
...............................................................................................................................107
4.2.2
Pacientes pediátricos sobreviventes á sepse não apresentam expansão das células
Tregs (CD4+Foxp3+) ............................................................................................109
4.2.3
As células Tregs de pacientes pediátricos sobreviventes á sepse mantêm sua
capacidade supressora ..........................................................................................111
4.1.2
Pacientes pediátricos sobreviventes á sepse não apresentam aumento nas
concentrações da IL-33 e da IL10 ........................................................................113
5
DISCUSSÃO ................................................................................................................116
6
CONCLUSÃO .............................................................................................................134
7
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ......................................................................136
8
ANEXOS ......................................................................................................................147
8.1 CARACTERIZAÇÃO
DAS
POPULAÇOES
CELULARES
EM
CAMUNDONGOS DE DIFERENTES Idades: macrófagos e neutrófilos. ............147
8.1.2
Caracterização das populações celulares em camundongos de diferentes idades:
neutrófilos, linfócitos e monócitos no sangue periférico .....................................148
8.1.3
células NK e NKT ................................................................................................149
8.1.4
Gráfico representativo: células NK.......................................................................150
8.1.5
Gráfico representativo: células NKT ...................................................................151
8.1.6
células T CD+CD8- e CD8+CD4- ..........................................................................152
8.1.7
Gráfico representativo: Células T CD4+CD8- e CD8+CD4- ................................153
8.2 PADRONIZAÇÃO
DO
MODELO
DE
SEPSE
EXPERIMENTAL
EM
CAMUNDONGOS COM DIFERENTES IDADES ..............................................154
8.3 MIGRAÇAO DE NEUTRÓFILOS, BACTEREMIA, CARGA BACTERIANA E
MARACADORES DE LESÃO ORGÂNICA EM CAMUNDONGOS COM
DIFERENTES IDADES ..........................................................................................155
8.4 Cálculo de APACHE II – Acute Physiology and Chronic Health disease Classification
System II ……………………………………………………………………………156
8.5 Cálculo de SOFA – Sequential Organ Failure Assessment .......................................157
8.6 Cálculo de PRIMS – Pediatric Risk of Mortality score .............................................158
8.7 Cálculo de PELOD – Paediatric Logistic organ dysfunction .....................................159
8.8 Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa-FMRP ........................160
Introdução
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1 Sepse: Conceitos gerais
Sepse, do grego septikós (putrefação de matérias ou tecidos orgânicos) (Majno, 1991),
é uma resposta inflamatória sistêmica causada por um processo infeccioso frequentemente de
origem bacteriana, embora também possa ser causada por fungos, parasitas e vírus (Bone et
al., 1997). Por tratar-se de uma resposta inflamatória sistêmica com possibilidade de evolução
para quadros clínicos cujos sintomas e sinais diferem muito à medida que a doença evolui, por
muito tempo, vários termos e definições imprecisas foram utilizados para caracterizá-la, o que
dificultou a identificação do quadro real e o início precoce de terapia. Neste sentido, em 1991,
o American College of Chest Physicians (ACCP) e o Society of Critical Care Medicine
(SCCM) realizaram uma conferência e estabeleceram um consenso sobre a terminologia e
terapêutica da sepse. Desde então, a terminologia permanece padronizada de acordo com os
sinais e sintomas clínicos apresentados pelos pacientes (Bone et al., 1992; Levy et al., 2003).
Os conceitos e critérios definidos na conferência são resumidos da seguinte forma:
31
Introdução
Termo
Definições
Infecção
Fenômeno microbiológico com resposta inflamatória ou invasão de tecidos
normalmente estéreis por microrganismos.
Bacteremia
Presença de bactérias viáveis no sangue.
Síndrome da
Resposta inflamatória sistêmica causada por vários fatores.
Resposta
Manifestada por dois ou mais das seguintes condições: (1) temperatura >
Inflamatória
38◦C ou < 36◦C; (2) batimentos cardíacos >90 batimentos/min.; (3)
movimentos respiratórios >20 movimentos/min. ou PaCO2 <32mmHg; ou
Sistêmica (SIRS)
Sepse
(4) leucócitos sanguíneos >12000/mm3 ou <4000/mm3.
Resposta inflamatória sistêmica durante infecção, manifestada por duas ou
mais características: (1) temperatura > 38◦C ou <36◦C; (2) batimentos
cardíacos >90 batimentos/min.; (3) movimentos respiratórios >20
movimentos/min. ou PaCO2 <32mmHg; ou (4) leucócitos sanguíneos
>12000/mm3 ou <4000/mm3; ou >10% de formas imaturas.
Sepse Grave
Sepse associada à disfunção de órgãos, hipotensão ou hipoperfusão. A
hipoperfusão pode ser caracterizada por acidose láctica, oliguria ou
alteração aguda do estado mental.
Choque Séptico
Hipotensão causada por sepse e resistente ao tratamento adequado, com
reposição eletrolítica e administração de agentes inotrópicos ou
vasopressores.
Síndrome da
Disfunção de múltiplos órgãos cuja homeostase não pode ser
Disfunção de
mantida sem intervenções.
Múltiplos
Órgãos
Tabela 1 – Terminologia e definições relacionadas à sepse (Bone et al., 1992; Levy et al.,
2003).
PaO2: Pressão parcial de oxigênio no sangue arterial; fração inspirada de oxigênio; INR:
Índice internacional normalizado; TTPA: tempo de tromboplastina parcial ativada.
32
Introdução
1.2 Epidemiologia da sepse
Apesar dos grandes avanços na compreensão da fisiopatologia da sepse e do
surgimento de novas intervenções terapêuticas, a incidência da doença cresce com o passar
dos anos. Dados americanos mostram que a incidência de sepse triplicou nos últimos anos,
atingindo cerca de 25% de mortalidade. Na década passada, os EUA apresentaram cerca de
240 casos por cada 100.000 habitantes e os custos ultrapassaram 17 bilhões de dólares anuais
(Angus et al., 2001; Martin et al., 2003; Angus e Van Der Poll, 2013). No Brasil, estudos
epidemiológicos sobre sepse são escassos. O estudo BASES (Brazilian Sepsis Epidemiogical
Study), desenvolvido em cinco UTIs dos estados de São Paulo e Santa Catarina, mostrou uma
incidência de sepse, sepse grave e choque séptico de 46,9%, 27,3% e 23%, respectivamente
(Silva et al., 2004). Posteriormente, um estudo epidemiológico multicêntrico, em 75 UTIs de
todas as regiões do Brasil, avaliou a incidência de sepse. Em uma população de 3.128
pacientes, 16.7% apresentaram sepse, com uma mortalidade geral de 46,6%. Quando
descriminados em sepse, sepse grave e choque séptico, a incidência foi 19,6%, 29,6% e
50,8% e a mortalidade foi 16,7%, 34,4% e 65,3%, respectivamente (Sales Junior, 2006). Tais
internações resultam em um alto impacto socioeconômico, com custo médio diário de
aproximadamente 934.00 dólares por paciente (Sogayar et al., 2008).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a sepse pediátrica é a
principal causa de morte nessa faixa etária mundialmente, sendo as principais origens os casos
graves de pneumonia, diarreia, malária e sarampo. Estes casos são classificados como sepse
se durante infecções ocorrer acidose, hipotensão ou ambos (Watson e Carcillo, 2005). Nos
Estados Unidos, em 1995, ocorreram 42.000 casos de sepse pediátrica, resultando em 4.400
óbitos e impacto socioeconômico de aproximadamente 1,7 bilhão de dólares. As condições
predisponentes para a sepse, neste grupo, dependem da faixa etária, variando desde
33
Introdução
cardiopatias congênitas e doenças pulmonares (em crianças de um ano de vida) até doenças
neuromusculares e câncer (em crianças de um e nove anos e adolescentes) (Watson e Carcillo,
2005).
1.3 Fisiopatologia da sepse
A sepse resulta de uma complexa interação entre o microrganismo, o sistema imune e
o sistema de coagulação do hospedeiro (Hotchkiss e Karl, 2003; Russell, 2006). A resposta do
hospedeiro e as características do microrganismo são as principais variáveis fisiopatológicas
da sepse. Assim, a progressão da sepse ocorre quando o hospedeiro não consegue conter a
infecção primária, por exemplo, pela presença de superantígenos ou quando o microrganismo
é resistente à opsonização, à fagocitose e à terapia antibiótica (Stearns-Kurosawa et al., 2011).
Os mecanismos de defesa iniciam-se com o reconhecimento do microrganismo
invasor. Este reconhecimento ocorre por meio de estruturas conservadas, constitutivamente
expressas em sua superfície, denominadas de padrões moleculares associados a patógenos
(PAMPs, pathogen-associated molecular patterns) (Bone et al., 1992; Medzhitov, 2007;
Medzhitov et al., 2012). Os PAMPs são reconhecidos por receptores encontrados em células
do sistema imune inato, entre elas macrófagos, neutrófilos e células dendríticas. Esses
receptores são coletivamente denominados de receptores de reconhecimento de padrões
(PRRs, pattern recognition receptors). Entre os membros mais importantes dos PRRs
destacam-se os receptores do tipo Toll (TLRs, Toll-like receptors) (Alves-Filho et al., 2006;
Alves-Filho et al., 2008). A ativação desses receptores desencadeia uma resposta inflamatória,
a qual é essencial para o controle dos agentes infecciosos (Majewska e Szczepanik, 2006).
Acredita-se que o início e a progressão da sepse sejam causados pelo descontrole desta
resposta, caracterizada pela produção de grandes quantidades de mediadores inflamatórios
34
Introdução
(citocinas, quimiocinas, espécies reativas de oxigênio, etc) e posterior disfunção celular (Bone
et al., 1992).
1.3.1
Sepse e o “cytokine storm”
A secreção de citocinas induzida via ativação dos receptores de reconhecimento
padrão nas células inflamatórias residentes, é importante para a estimulação da síntese de
moléculas de adesão na superfície de células endoteliais permitindo assim, o recrutamento de
outras células para o local da inflamação (Kubes, 2002). Porém, durante a sepse ocorre
ativação acentuada dos PRRs e ativação descontrolada de células inflamatórias, resultando em
uma reação ineficiente no controle do patógeno, altamente prejudicial ao organismo (AlvesFilho et al., 2006; Alves-Filho et al., 2008). Isto leva à produção e secreção de altas
concentrações de mediadores pró-inflamatórios na circulação, os quais, em suma, são
responsáveis pela maioria das alterações fisiopatológicas como as lesões teciduais e a
disfunção de órgãos, observadas tanto em pacientes como em modelos experimentais de sepse
(Dinarello, 1997).
Dentre os mediadores pró-inflamatórios, destacam-se o fator de necrose tumoral- α
(TNF- α) e as interleucinas IL-1β, IL-8 e IL-6. Adicionalmente, tem sido descrito que a
liberação inicial desses mediadores é acompanhada por uma resposta anti-inflamatória
compensatória do organismo, através da produção de mediadores anti-inflamatórios, como IL4, IL-10 e IL-13. Esta produção de citocinas anti-inflamatórias permite a homeostase do
sistema imune após o processo infeccioso, porém seu aumento é responsável pela inibição de
funções importantes envolvidas no controle imune das infecções (Adib-Conquy e Cavaillon,
2009). Portanto, o desequilíbrio da resposta imune em favor da resposta anti-inflamatória
pode resultar em um quadro de imunossupressão.
35
Introdução
1.3.2
Neutrófilos e Sepse
Os neutrófilos são leucócitos polimorfonucleados essenciais para o funcionamento do
sistema imunológico e, quando estimuladas, expressam receptores de membrana responsáveis
pela aderência e migração através do endotélio vascular, dirigindo-se, por quimiotaxia, ao
sítio da infecção. Após o neutrófilo realizar a fagocitose no interior do endolisossomo, ocorre
a morte do agente infeccioso pela ação de enzimas e agentes oxidantes (Janeway, 2007).
Devido ao fato dos neutrófilos serem a primeira linha de defesa contra os microrganismos,
qualquer falha no recrutamento destes está associada à permanência da infecção, invasão da
corrente circulatória pelo agente infeccioso e reação inflamatória sistêmica, culminando com
a morte do indivíduo (Brown et al., 2006).
Diversos estudos demonstraram que neutrófilos de animais submetidos à sepse letal ou
ao choque endotoxêmico apresentam um comprometimento na sua capacidade de migrar para
o foco infeccioso, evento denominado de falência da migração de neutrófilos. Dados de nosso
grupo demonstraram a importância da sinalização através de TLR2, TLR4 e TLR9 em
neutrófilos, e sua relação com a internalização dos receptores quimiotáticos (Alves-Filho et
al., 2006; Alves-Filho et al., 2008; Trevelin et al., 2012) e posterior desenvolvimento da
falência na migração. Os mecanismos responsáveis por essa falha na capacidade de migração
dos neutrófilos estão associados à internalização de receptores quimiotáticos, como o CXCR2.
Esta internalização é consequência da produção excessiva de óxido nítrico (NO), devido a
indução da enzima óxido nítrico sintetase induzida (NOSi). O NO ativa, sequencialmente, a
guanilato ciclase e as quinases de receptores ligados à proteína G (GRKs) (Benjamim et al.,
2000; Arraes et al., 2006; Rios-Santos et al., 2007; Paula-Neto et al., 2011). Esses eventos
estão diretamente associados à severidade da sepse e ao risco de óbito.
36
Introdução
Adicionalmente à expressão diminuída de CXCR2, Souto e colaboradores (2011)
demostraram, em um modelo de sepse induzida por CLP (cecal ligation and pucture) em
camundongos, que os neutrófilos apresentam maior expressão do receptor CCR2, o que esteve
associado com a migração dos neutrófilos para sítios não relacionados à infecção, como
coração, pulmões e rins. De maneira interessante, os autores observaram que a inibição
farmacológica ou deficiência genética de CCR2 levava à melhora na sobrevida dos animais.
Além disso, como observado em modelos experimentais de sepse, neutrófilos de pacientes
sépticos também apresentam uma redução significativa da resposta quimiotáxica in vitro
induzida por diferentes estímulos, como IL-8, LTB4 e fMLP (Tavares-Murta et al., 2002). Em
suma, a falência da migração de neutrófilos (in vitro e in vivo) está correlacionada com a
perda do controle local da infecção e consequente disseminação bacteriana, gerando uma
resposta inflamatória sistêmica seguida da morte do hospedeiro (Benjamim et al., 2000;
Tavares-Murta et al., 2002).
1.4 Imunossupressão na sepse
Durante a fase aguda da sepse, a mortalidade está relacionada com a bacteremia e a
ineficácia dos mecanismos de controle da resposta inflamatória. Porém, após a recuperação da
sepse, estudos clínicos têm demonstrado que os pacientes desenvolvem um quadro de
imunossupressão, o qual tem como principal manifestação clínica o aumento da
suscetibilidade às infecções oportunistas (Benjamim et al., 2004; Barichello et al., 2007;
Wang e Deng, 2008). Dados recentes sobre a mortalidade na sepse mostram a existência de
picos de mortalidade em fases distintas da doença: Na fase I, também chamada de precoce, a
mortalidade ocorre entre o 1° e o 5° dia, sendo intimamente relacionada com a bacteremia
causada pelo mesmo agente etiológico da sepse. Porém, nas demais fases, fase II (seis a 15
dias) ou na fase III (16 a 150 dias), nas quais a bacteremia primária foi abolida, a mortalidade
37
Introdução
é decorrente de uma infecção secundária por micro-organismos oportunistas (Otto et al.,
2011). Ainda, foi demonstrado que pacientes que se recuperaram da sepse apresentaram alta
taxa de mortalidade durante o primeiro ano subsequente ao episódio inicial, a qual foi superior
às taxas de mortalidade encontradas na população normal ou na população que desenvolveu
outras doenças graves (Sasse et al., 1995). Ademais, foi observado que a presença de comorbidades aumenta a incidência de morte em pacientes que se recuperaram da sepse
(Dejager et al., 2011). Também foi relatado que pacientes sobreviventes à sepse tem maior
risco de adquirir uma infecção secundária em até cinco anos após a alta hospitalar
(Cuthbertson et al., 2010).
Uma vez que a sobrevida à sepse vem aumentando e que os pacientes que sobrevivem
a sepse tornam-se mais suscetíveis a infecções oportunistas, faz-se necessária a compreensão
dos eventos decorrentes da sepse que possam contribuir para o desenvolvimento de uma
imunossupressão tardia. Neste sentido, Boomer e colaboradores (2011) demonstraram que
células do baço de pacientes que morreram de sepse apresentam uma irresponsividade a
diversos estímulos policlonais. Foi observada uma redução expressiva das células T CD4+ e
CD8+ e de moléculas responsáveis pela apresentação do antígeno e ativação de linfócitos,
como HLA-DR e CD80, além do aumento da expressão de moléculas como PD-1
(programmed cell death 1) e seu ligante PD-L1 (Programmed Cell Death 1). Desta forma,
pacientes que morreram de sepse apresentaram disfunções nas células imunes, o que não foi
observado nos pacientes que morreram de causas não relacionadas (Boomer et al., 2011).
Adicionalmente, Brunialti e colaboradores (2006) demonstraram que células do sangue
periférico de pacientes com sepse grave ou choque séptico apresentaram redução da produção
de citocinas pró-inflamatórias após estimulação com LPS.
38
Introdução
Nos últimos anos, com o intuito de entender os eventos imunológicos envolvidos no
desenvolvimento deste quadro de imunossupressão, foram desenvolvidos modelos
experimentais que reproduzem, de maneira fidedigna, as consequências crônicas da sepse.
Dentre eles, estão os chamados “two-hit models” caracterizados pela indução de sepse
seguida de infecção pulmonar por Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila ou Aspergillus fumigatus. Em um dos
estudos utilizando o modelo “two-hit”, os animais foram submetidos à sepse letal induzida
por CLP, e após 6 h foram tratados com antibiótico. Este tratamento reduziu a mortalidade
para 40% dos animais. De maneira interessante, dentre os sobreviventes, houve 100% de
mortalidade após infecção com A. fumigattus, o que não foi observado nos animais Sham
(animais não submetidos à sepse) (Benjamim et al., 2003; Benjamim et al., 2004),
demonstrando uma menor habilidade dos animais que sobreviveram à sepse em controlar uma
segunda infecção.
Em outro estudo utilizando este modelo, foi descrito o papel da prostaglandina E2
(PGE2) na geração de imunossupressão em camundongos Balb/c. O mecanismo descrito foi
via receptor EP4 da PGE2 o qual, uma vez bloqueado em cultura de macrófagos, levou à
diminuição de mediadores pró-inflamatórios, como o TNF-α e a IL-6 (Brogliato et al., 2012).
Muenzer e colaboradores (2006), usando modelos de pneumonia, demonstraram que animais
submetidos à sepse 15 dias antes, apresentaram uma taxa de mortalidade de 95%,
apresentando maior taxa de apoptoses dos linfócitos B e T e menor concentração plasmática
de IL-6 e MCP-1 Adicionalmente, em 2010, este mesmo grupo demostrou que, após o
estímulo policlonal (CD3 e CD28), esplenócitos de animais submetidos à CLP quatro dias
antes apresentaram uma menor produção de INF-γ em comparação com os animais controle
(Muenzer et al., 2010).
39
Introdução
Além disso, experimentalmente, foi demonstrado que animais que sobrevivem à sepse
letal são suscetíveis às infecções secundárias causadas por diversos patógenos oportunistas
como Pseudomonas aeruginosa (Muenzer et al., 2010), Aspergillus fumigatus (Benjamim et
al., 2003) e Legionella pneumophila (Nascimento et al., 2010). Também foi observado que
camundongos sobreviventes à sepse letal apresentam redução na capacidade de montar uma
resposta de hipersensibilidade tardia, bem como comprometimento na resposta imune contra
tumores (Venet et al., 2008; Cavassani et al., 2010; Nascimento et al., 2010). Muitos dos
estudos experimentais iniciais que demonstraram a suscetibilidade destes animais á infecções
secundárias apontaram um comprometimento na função de monócitos, neutrófilos, células
dendríticas e linfócitos, além do aumento de citocinas imunorreguladoras, como a IL-10, no
desenvolvimento deste comprometimento imune (Steinhauser et al., 1999).
Recentemente, nosso grupo, utilizando o modelo de sepse letal seguido de infecção
intranasal com Legionella pneumophila, demonstrou que a imunossupressão induzida pela
sepse decorre do aumento do número de células T Reguladoras (Tregs). Foi observada uma
maior frequência de células Tregs no baço dos camundongos após 15 dias da sepse,
comparados com o controle. A inibição da atividade supressora dessas células, pelo
tratamento com o anticorpo DTA-1, restaura a capacidade proliferativa das células T CD4+
efetoras, aumentando a resistência dos animais à infecção secundária (Nascimento et al.,
2010). Assim, um novo alvo responsável pelo evento de imunossupressão pós-sepse foi
apresentando, além daqueles descritos na literatura (Muenzer et al., 2010; Brogliato et al.,
2012). No entanto, o desenvolvimento da imunossupressão no contexto da sepse pediátrica
permanece desconhecido.
40
Introdução
1.5 As células T Reguladoras
As células TCD4+ CD25+ Foxp3+ (Tregs) desempenham um papel fundamental no
processo de tolerância periférica. Podem ser classificadas, segundo sua ontogenia, em Tregs
naturais, aquelas originadas no timo a partir do processo de tolerância central, e as Tregs
periféricas, aquelas diferenciadas a partir de células TCD4+ naives na presença de TGF-β em
órgãos linfóides periféricos (Thornton e Shevach, 2000; Mills, 2004; Liu et al., 2011).
Os mecanismos de ação das Tregs podem ser classificados em diretos e indiretos. Os
mecanismos diretos englobam mecanismos como a liberação de IL-10, IL-35 e TGF-β que
inibem diretamente as células T e as demais células mielóides; o consumo de IL-2 do
microambiente, levando as demais células T à apoptose; a liberação de granzimas que causam
apoptose da célula alvo e a liberação de monóxido de carbono (CO), que leva ao bloqueio da
produção de IL-2 nas células alvo (Thornton e Shevach, 2000; Brusko et al., 2005; Shevach,
2011). Os mecanismos indiretos podem englobar mecanismos como a interação entre a
molécula de superfície CTLA-4 das Tregs e o receptor B7 em células dendríticas, levando ao
aumento de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) nestas células e, consequentemente, a
degradação do triptofano e a produção de metabólitos pró-apoptóticos; a ação da molécula
inibitória LAG-3 (CD223), a qual possui grande afinidade pelo receptor MHC de classe II,
podendo se ligar a este durante a apresentação de antígenos e impedir a maturação das células
dendríticas. Outro mecanismo de ação indireto das Tregs ocorre via CD39, devido a sua
capacidade de induzir a inativação catalítica do ATP (mediador inflamatório importante para
a maturação de células dendríticas). As Tregs também expressam Neuropilina-1 (Nrp-1), a
qual promove uma longa interação com células dendríticas imaturas, restringido desta forma o
41
Introdução
acesso às células T convencionais (Thornton e Shevach, 2000; Brusko et al., 2005; Shevach,
2011). Como foi apresentado previamente, nosso grupo demostrou que a expansão de Tregs é
um evento importante e fundamental no desenvolvimento da imunossupressão pós-sepse.
1.6 Sepse Pediátrica
A imunidade pediátrica passa por uma radical mudança no momento do parto, quando
o indivíduo passa da vida intrauterina, com um ambiente estéril, para o meio exterior. O
sistema imune fetal é preparado inicialmente para três objetivos: controle de infecções
intrauterinas na interface materno-fetal; controle das respostas inflamatórias e de padrão Th1,
diretamente relacionadas com abortos e partos prematuros, e preparo para mudança do
ambiente do útero materno para o ambiente exterior, com consequente colonização da pele e
dos tratos gastrintestinal e respiratório por inúmeras espécies de bactérias. Devido ao fato de
respostas de padrão Th1 serem diretamente relacionadas a abortos, o sistema imune maternofetal, assim como no recém-nascido (RN), tem forte desvio favorável a citocinas de padrão
Th2 (Adkins, 2000).
Durante
muitos
anos,
neonatos
foram
classificados
como
indivíduos
imunossuprimidos, particularmente pela baixa produção de IL-2 e proliferação de células T.
Entretanto, durante a década de 1990, foi demonstrado que neonatos têm resposta imune em
menor escala e desvio para o padrão Th2, sendo possível gerar resposta Th1 através do uso de
imunomoduladores. Camundongos neonatos imunizados com proteína em adjuvante
incompleto de Freund (IFA) desenvolvem padrão de resposta Th2, enquanto que a imunização
em adjuvante completo de Freund (CFA) resulta em resposta Th1 (Forsthuber et al., 1996).
Do ponto de vista quantitativo, neonatos têm menor número de células T na ordem de
um a dois logaritmos em relação a adultos, sendo que estes números influenciam no padrão de
42
Introdução
resposta a ser desenvolvido. Desta forma, a quantidade de patógenos com o qual o sistema
imune é desafiado nessa fase da vida também influencia o padrão de resposta imune gerada,
uma vez que após infecções com grandes inóculos de vírus da leucemia ocorrem respostas
Th2 ineficientes, com pouca atividade de células T citotóxicas e não protetora, enquanto a
diminuição do inóculo resulta em resposta Th1 semelhante àquela observada em animais
adultos, com células citotóxicas gerando proteção (Sarzotti et al., 1996).
No modelo experimental de pneumonia por Pneumocystis carinii, foi demonstrada a
importância do microambiente na ação de células T em neonatos. Animais infectados foram
suscetíveis à infecção devido ao desenvolvimento de padrão de resposta Th2, porém células T
isoladas de neonatos foram eficazes quando transferidas adotivamente para animais adultos,
criando uma resposta protetora Th1 (Garvy e Qureshi, 2000). Em relação às células da
imunidade inata, neonatos têm deficiências parciais, quantitativa e qualitativamente, em
neutrófilos. Tais células têm baixa expressão e atividade de CD11b/CD18 e baixa expressão
de L-selectina, o que reduz sua capacidade de quimiotaxia, rolamento e adesão (Rebuck et al.,
1995). Os mecanismos microbicidas estão igualmente diminuídos, com menor quantidade de
proteínas e peptídeos microbicidas, como a lactoferrina, embora o nível de defensinas
permaneça normal (Levy et al., 1999). Fagócitos mononucleares também desenvolvem
respostas menos efetivas à infecção por Pneumocystis carinii. A baixa produção de citocinas
do padrão Th1, particularmente IFN-γ, prejudica a ativação deste tipo celular, ocorrendo
também deficiências na transdução de sinais através do receptor de IFN-γ, com menos
fosforilação de STAT-1, fundamental durante o processo de ativação de mecanismos efetores
destas células (Marodi, 2006).
Devido às dificuldades técnicas inerentes a modelos experimentais de sepse em
camundongos recém-nascidos, existem poucos trabalhos na literatura acerca deste assunto. O
43
Introdução
modelo experimental mais amplamente utilizado em estudos de sepse, o modelo de CLP, não
é aplicável a este tipo de animal por diversos motivos, entre eles a flora intestinal que não está
completamente formada; a manipulação excessiva durante a cirurgia que gera alterações de
odor e aumenta a chance de rejeição e/ou canibalismo pela mãe e a cirurgia propriamente dita,
que é tecnicamente difícil em camundongos muito jovens (Wynn et al., 2007a).
O modelo experimental de sepse por injeção intraperioneal de conteúdo cecal
previamente isolado de um animal adulto (“cecal slurry”) foi utilizado para caracterização da
resposta inata em animais recém-nascidos, com idade entre cinco e sete dias, e comparados a
animais adultos. Este trabalho demonstrou menor produção de diversas citocinas, como TNFα, IL-1α, IL-1β e RANTES, em animais recém-nascidos quando comparados a animais
adultos, resultando em maior susceptibilidade à sepse (Wynn et al., 2008). Posteriormente, o
mesmo modelo experimental foi utilizado para demonstrar que, nesta faixa etária, a resolução
da sepse depende da resposta inata e da inflamação em detrimento da resposta adaptativa, e
que o pré-tratamento com ligantes de TLR4 ou TLR7/8 potencializa esta resposta, com maior
migração de neutrófilos, fagocitose e capacidade microbicida e consequente melhora na
sobrevida (Wynn et al., 2007a). Dessa forma, estes trabalhos auxiliaram na caracterização da
sepse neonatal. No entanto, até o presente momento não existem trabalhos descrevendo as
consequências da sepse nas primeiras etapas da vida. Assim, a hipótese do presente trabalho e
a de que a diferenciação de células Tregs após a sepse e, consequente quadro de
imunossupressão, são dependentes da idade do hospedeiro.
44
Objetivo
Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o papel da idade no desenvolvimento da imunossupressão induzida pela sepse.
2.2 Objetivos específicos
i.
Estabelecer um modelo de sepse letal intraperitoneal (i.p) em camundongos de
diferentes idades (duas, quatro, seis e oito semanas de vida),
ii.
Avaliar a sobrevida pós-sepse em animais de diferentes idades de vida através da
infecção secundária intranasal (i.n) por P. aeruginosa,
iii.
Avaliar a frequência de células T Reguladoras após sepse i.p em camundongos com
duas, quatro, seis e oito semanas de vida,
iv.
Avaliar o status imunológico de camundongos submetidos à sepse letal com duas,
quatro, seis e oito de vida, através de infecção secundária com P. aeruginosa,
v.
Avaliar a frequência de células T Reguladoras em pacientes sépticos (pediátricos e
adultos).
46
Materiais e
Métodos
Materiais e Métodos
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MODELO EXPERIMENTAL DE SEPSE EM ANIMAIS DE DUAS, QUATRO,
SEIS E OITO SEMANAS DE VIDA.
3.1.1
Obtenção de Bactérias
Brevemente, o ceco de um camundongo adulto C57BL/6 foi removido por
laparotomia e seu conteúdo foi filtrado com uma gaze estéril e cultivado em meio com infusão
de coração e cérebro (BHI -Brain and heart infusion broth; Difco Laboratories, Detroit, MI),
durante cinco dias, a 37°C. O meio de cultivo das bactérias foi trocado a cada 24 horas por
meio de centrifugação (3000 g, 15 minutos, 23°C). Após cinco dias de incubação, as bactérias
foram novamente centrifugadas a 3000 g, 15 minutos, 23°C, o sobrenadante foi descartado e o
pellet foi suspenso em solução salina. Depois de dois ciclos de centrifugação, as bactérias
foram ressuspensas em 50 ml de solução salina, aliquotadas, liofilizadas (Hetovac® model
CT110, Birkercd, Denmark) durante sete horas e congeladas. No momento do experimento,
uma alíquota de bactérias foi descongelada e cultivada em 50 ml de meio BHI, a 37°C durante
20 horas. Após a incubação, essa cultura foi centrifugada (3000 g, 15minutos, 23°C). Após
duas centrifugações com solução salina estéril 0,9%, o pellet foi suspendido em 10 ml de
solução salina estéril. A concentração das bactérias foi avaliada por espectrofotometria a 600
nm (Molecular Devices, Sunnyvale, USA).
3.1.2
Animais
Para a realização deste trabalho, foram utilizados camundongos isogênicos da
linhagem C57/BL6, recém-nascidos (duas semanas), com quatro semanas, seis semanas e oito
semanas de idade. Todos os animais foram obtidos no Biotério Central do campus da
Universidade de São Paulo, em Ribeirão Preto, e mantidos ao longo do experimento no
48
Biotério de Experimentação do Departamento de Farmacologia da FMRP-USP, em condições
de temperatura de 23-25°C, ciclo de claro/escuro de 12 horas, com acesso livre a água e
ração.
3.1.3
Indução da sepse
As bactérias obtidas foram administradas intraperitonealmente em camundongos
C57BL/6 recém-nascidos, com quatro semanas, com seis semanas e adultos com oito semanas
de idade. Os recém-nascidos foram mantidos na caixa em contato com a mãe. Todos os
protocolos experimentais realizados neste trabalho estão de acordo com os princípios éticos
de experimentação animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) e foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) do
Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP sob protocolo de
número 098/2009.
3.1.4
Protocolo de terapia com antibiótico
Uma vez induzida a sepse em animais de diferentes idades, estes foram tratados com
Ertapenen sódico a uma concentração de 30 mg/Kg (animais de oito semanas e seis semanas
de idade) e 10 mg/Kg (animais recém-nascidos e de quatro semanas de idade). Este
tratamento foi iniciado quatro horas após do início da sepse (animais recém-nascidos, quarto
semanas e seis semanas de idade) e após 6 horas (animais de oito semanas de idade), seguido
de uma dose a cada 12 horas durante três dias. Os animais que sobreviveram a este tratamento
foram utilizados nos experimentos subsequentes.
3.1.5
Isolamento e quantificação de UFC em animais pós-tratamento
A contagem de bactérias foi determinada como previamente descrito (Godshall et al.,
2002). Resumidamente, os camundongos foram sacrificados seis horas após a indução da
49
sepse e o exsudato da cavidade peritoneal foi obtido por meio de lavagem da mesma com PBS
estéril contendo 1mM EDTA. As amostras de sangue foram colhidas do seio venoso
supraorbitário. O material obtido foi semeado em placas de Petri contendo ágar MüellerHinton (Oxoid Limited, Hampshire, UK) e incubados a 37°C. O número de unidades
formadoras de colônia (UFC) foi avaliado após 24 horas. Os resultados foram expressos como
o logaritmo das UFCs por cavidade peritoneal ou por mililitro de sangue.
3.1.6
Determinação do infiltrado neutrofílico aos tecidos
O infiltrado neutrofílico em tecido pulmonar foi avaliado por meio da quantificação da
atividade da Mieloperoxidase (MPO), como previamente descrito (Souza et al., 2001).
Brevemente, os animais foram sacrificados seis horas após a indução da sepse e o lóbulo
inferior do pulmão (50-100mg) foi retirado e homogeneizado em dois volumes de Tampão 1
gelado (NaCl 1 M, NaPO4 20 mM, Na EDTA 15 mM) com pH 4,7, e centrifugado a 800g por
15minutos. O pellett foi submetido a lise hipotônica (1 volume de NaCl a 0,2%, seguido de 30
segundos de agitação em vortex). Após uma centrifugação adicional, o pellet foi suspenso em
500 μl de Tampão NaPO4 50 mM, com pH 5,4, contendo 0,5% de Brometo de Hexa-1,6-bisdeciltrimetilamônio (H-TAB, Sigma). A atividade da MPO no pellet suspendido foi avaliada
pela mensuração da mudança da absorbância com o uso do tetrametilbenzidina (TMB) e H2O2
(0,5 mM). Os resultados foram reportados como o número total de neutrófilos por miligrama
de tecido, pela comparação da absorbância do sobrenadante do tecido com a absorbância da
curva padrão de neutrófilos.
3.1.7
Migração celular
A migração de neutrófilos foi avaliada seis horas após a indução da sepse.
Brevemente, após eutanásia, as células da cavidade peritoneal foram colhidas mediante
50
lavagem com 0,5 ml de PBS contendo 1mM de EDTA para animais recém-nascidos e de
quatro semanas de idade e com 1,5 ml de PBS contendo 1mM de EDTA para animais de seis
semanas e oito semanas de idade. As contagens totais de células foram realizadas em contador
automático de células (COULTER® Ac·T diff™ Analyzer, Beckman Coulter, Brea, USA) e
as contagens diferenciais foram realizadas por citocentrifugação (Shandon Southern Products,
Cheshire, United Kingdom) de 60 ul de solução de lavado peritoneal e corados com corante
panótico (Laborclin, Pinhais, Brasil) como previamente descrito (Benjamim et al., 2000). Os
resultados são apresentados como leucócitos totais e neutrófilos/cavidade.
3.1.8
Quimiotaxia in vitro
A quimiotaxia foi realizada usando a câmara de quimiotaxia de 48 poços (Neuroprobe,
Gaithersburg, MD) como previamente descrito (Alves-Filho et al., 2009). Brevemente,
neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos adultos (oito semanas de idade) e
recém-nascidos (duas semanas de idade) foram colocados para migrar por uma hora para
CXCL2 (20 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN) ou meio (RPMI; Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO).
3.1.9
Microscopia Intravital
Cada camundongo foi anestesiado com solução de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (15
mg/kg) e colocado sobre mesa cirúrgica aquecida a 37°C e acoplada a um microscópio. Foi
realizada celiotomia para exposição do mesentério. Os vasos foram focalizados em objetiva
40X, selecionando-se a vênula de diâmetro entre 10-18μm, que pudesse favorecer a
visualização do rolamento e aderência (células fixas ao endotélio) dos leucócitos durante
cinco minutos. Os resultados foram expressos em número de leucócitos aderidos por 100m 2
da vênula e número de leucócitos em rolamento/minuto.
51
3.1.10 Determinação da concentração de nitrito no soro e lavado peritoneal
A concentração de nitrato (NO3) no soro de camundongos seis horas após a indução da
sepse foi determinada pela redução enzimática do nitrato pela nitrato redutase como descrito
previamente (Tavares-Murta et al., 2002), seguida pela determinação do nitrito (NO2) pelo
método de Griess (Green et al., 1982). No lavado peritoneal o nitrito foi determinado
diretamente pelo método de Griess. Os resultados foram expressos no soro como μM de
NO3/NO2 e no lavado peritoneal como μM de NO2.
3.1.11 Determinação das concentrações séricas de TGO, CK-MB e BUN
Para avaliar a função hepática, cardíaca e renal foram realizadas dosagens de TGO,
CK-MB e BUN respectivamente, no soro dos animais Sham e dos animais sépticos com
diferentes idades seis horas após a infecção, utilizando um ensaio colorimétrico enzimático
comercial (LABTEST Diagnóstica-Brasil) como previamente descrito (Freitas et al., 2011).
Os valores foram expressos em U/L para TGO e CK-MB e mg/dl para o BUN.
3.1.12 Determinação das concentrações de citocinas
As quantificações de IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-2 (CXCL2), IL-13, IL-5, IL-10 e IL-33
no soro, lavado peritoneal e homogeneizado pulmonar foram realizadas em diferentes tempos
após a indução da sepse. A determinação dos níveis dessas citosinas foi realizada por método
imunoenzimático (ELISA). Brevemente, as placas de microtitulação (96 poços) foram
recobertas com 50 ml/poço do anticorpo específico anti-IL-1β (RD Systems), anti-IL-6 (BD),
anti-TNF-α (RD Systems) e anti-MIP-2 nas concentrações descritas pelos fabricantes. Esses
anticorpos foram diluídos em solução de ligação (coating buffer) e incubados por 18-24 horas
a 4ºC. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS/Tween-20 (0,05 % Sigma). As ligações
não-específicas foram bloqueadas com 200 μl de PBS contendo BSA 1 % (para kits da RD)
52
ou 200 μl de PBS contendo soro bovino fetal inativado 10% (para kits BD e eBioscinece)
durante 1 hora a 37 °C. As amostras e o padrão (curva-padrão) contendo as concentrações
adequadas de IL-1β (5000 pg/ml), IL-6 (4000 pg/ml), TNF-α (10000 pg/ml) e MIP-2
(4000pg/ml) foram colocados nas placas em um volume final de 50 μl e incubados overnight
a 4 ºC. Após este período, as placas foram lavadas com PBS/Tween e 50 μl dos anticorpos
biotinilados específicos para cada citocina foram adicionados nas concentrações descritas
pelos fabricantes. Após uma hora, as placas foram lavadas com PBS/Tween e o conjugado
avidina-peroxidase, na diluição de 1/5000, foi adicionado a cada poço. Em seguida, as placas
foram incubadas por 45 minutos. Posteriormente, elas foram lavadas com PBS/Tween e o
substrato (TMB) foi adicionado. As concentrações foram expressadas como pg/mL.
3.1.13 Determinação das concentrações de citocinas no sangue e lavado peritoneal
3.1.14 Análise histológica
Pulmão e fígado de camundongos adultos e recém-nascidos foram coletados seis horas
após a indução da sepse letal e fixados em formalina 4% (v/v). Os tecidos foram cortados e
desidratados em gradientes de etanol e depois incluídos em blocos de parafina para
preparação das lâminas, as quais forma coradas com Hematoxilina Eosina (H&E) para
avaliação histopatológica.
3.2 ATIVIDADE FAGOCÍTICA, INFLUXO DE CÁLCIO E PRODUÇÃO DE
ESPÉCIES REATIVAS POR NEUTRÓFILOS E MACRÓFAGOS
3.2.1
Isolamento de neutrófilos e macrófagos
As células peritoneais foram estimuladas pela injeção intraperitoneal de 2ml de
tioglicolato 3% e as células foras coletadas com RPMI 1640 após 72h ou 6h para macrófagos
e neutrófilos respectivamente.
53
3.2.2
Ensaio de fagocitose e killing
Para o ensaio de fagocitose, neutrófilos ou macrófagos (1 x 106) foram incubados com
bactérias do conteúdo cecal (2 x 106) previamente opsonizadas com 10% de soro, a 37oC por
30minutos. Após incubação, uma alíquota de 40 μl foi centrifugada em citocentrifuga a 520g
por 5 minutos (Shandon Southern Products, Cheshire, United Kingdom) e coradas com
corante panótico (Laborclin, Pinhais, Brasil). Para o ensaio de killing, as células foram
incubadas mais 2,5 horas a 37oC. Após incubação o pellet foi lisado com Triton X-100 0,2% e
sonicado por 2 minutos. Finalmente as amostras foram semeadas em placas de agar MullerHinton na diluição 10-4 ou 10-5 só para bactérias. O número de células que tinham ingerido
bactérias (células fagocíticas) e o número de bactérias ingeridas por célula foram contadas em
microscópio ótico. O Índice Fagocítico foi calculado pela multiplicação da percentagem de
células contendo ao menos uma bactéria (células fagocíticas) pela média do número de
bactérias por células.
3.2.3
Produção de espécies reativas totais
O ensaio de Luminol foi realizado com modificações do protocolo previamente
descrito (Leino e Paape, 1993; Lundqvist e Dahlgren, 1996).
3.2.4
Influxo de cálcio
Neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos foram incubados com 4 µM
de Fluo-3AM (Invitrogen Molecular Probes) por 40 minutos a 37oC em atmosfera de 5% de
CO2. A mobilização do cálcio em resposta ao fMLP (10-7 M; R&D Systems, Minneapolis,
MN) e LTB4 (10-5 M; R&D Systems, Minneapolis, MN) foi avaliada por ensaio de
fluorescência usando o FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).
54
3.3 AVALIÇÃO DA PRESENÇA DAS CÉLULAS TREGS EM CAMUNDONGOS
SOBREVIVENTES À SEPSE
3.3.1
Fenotipagem das Tregs
A fenotipagem de células Tregs foi realizada por citometría de fluxo (FACS). Brevemente, as
células foram ressuspensas em 100 μl de PBS 1X e incubadas com 1,5 μg de anticorpos
monoclonal especifico pra CD4 (Clone SK3), CD25 (Clone M-A251) ou FoxP3 (Clone
PCH101) conjugados com FITC, PE ou APC (eBiosciences). Para marcação intracelular com
FoxP3, foi utilizado o kit de tampões FoxP3 (eBiosciences). As células foram adquiridas em
FACSCanto II (BD Immunocytometry System, San Jose, USA) e analisadas usando o
software Flow Jo (TreeStar). Para a análise das citocinas intracelulares, o PBMC (Peripheral
blood mononuclear cell) (1 x106 celulas/mL) foram estimuladas com PMA/Ionomicina por 4
horas e incubadas com Cytofix/Cytoperm (BD), seguida pela marcação com anticorpo
monoclonal específico para IFN-γ e adquiridas por FACSCanto II.
3.3.2
Purificação das Células TCD4+CD25- (Teff) e TCD4+CD25+ (Tregs)
As subpopulações de células T CD4+CD25+ e T CD4+CD25- do baço de camundongos
C57BL/6 naive foram separadas por seleção negativa utilizando um kit comercial CD4
MACS beads Multisort (Miltenyi Biotec,Auburn, CA). Resumidamente, as células foram
primeiramente marcadas com um coquetel de anticorpos monoclonais biotinilados específicos
para camundongo contendo: CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCRγδ. Em
seguida, a suspensão celular foi incubada com micro-beads cobertas com biotina. Após 15
minutos de incubação a 37oC 5%CO2, as células foram lavadas em tampão de FACS por 400
g, por 10 minutos, a 4-8 ºC, e a população CD4- (pureza maior que 90%) foi separada
magneticamente por MACS®-sorting através da seleção negativa em colunas adequadas ao
55
número de células. Em uma segunda etapa, as células T CD4+ previamente selecionadas
foram diretamente marcadas com anti-CD25 PE e incubadas por 15 minutos a 4oC. Após duas
lavagens com PBS contendo 2% de soro fetal bovino inativado, as células foram marcadas
com micro-beads anti-PE e incubadas por 15 minutos a 4oC. Após a incubação, as células T
CD4+CD25+ foram selecionadas positivamente por ficarem retidas nas colunas MACS®
adequadas ao número de células. A pureza de células T CD4+ CD25+ Foxp3+ (Tregs) foi
maior do que 80%. As células T CD4+CD25- (convencionais) foram selecionadas
negativamente através da separação com colunas MACS® (pureza maior que 96 %).
3.3.3
Ensaio funcional das Tregs
As células TCD4+CD25+ (Tregs) isoladas de camundongos recém-nascidos e adultos
(oito semanas de idade) do grupo Sham e do grupo sobrevivente à sepse letal. Posteriormente,
foram cultivadas com células TCD4+CD25- (Teff) em placas de 96 poços U-bottom (Costar).
Brevemente, as células Teff foram marcadas com 1 μM Dye Efluor 670 (eBioscience) por 15
minutos, a 37°C e em atmosfera de 5% de CO2, lavadas e cultivadas (8 x104 células per poço)
com um as células Tregs (2 x104 células per poço) na presencia de α-CD3 (3 μg/mL) e αCD28 (1.5 μg/mL) por 4 dias. A proliferação celular foi determinada pela diluição do dye e
analisada por FACS.
3.3.4
Ensaio de proliferação de células TCD4+
Resumidamente, as células TCD4+CD25+ (Tregs) isoladas de camundongos recémnascidos e adultos (oito semanas de idade) do grupo Sham e do grupo sobrevivente à sepse
letal.foram cultivadas com células TCD4+CD25- (Teff) em placas de 96 poços U-bottom
(Costar). Brevemente, as células Teff foram marcadas com com 1 μM Dye Efluor 670
(eBioscience) por 15minutos, a 37 °C e em atmosfera de 5% de CO2, lavadas e cultivadas (1
56
x105 células por poço) durante quatro dias em presença de anti-CD3 (1 μg/ml, estímulo
policlonal). Após esse período, as células foram lavadas e marcadas com CD4 PE
(eBioscience). A proliferação celular foi determinada pela diluição do dye e analisada por
FACS, gerando um índice: (% células em divisão) = % de células que se dividiram no mínimo
uma vez.
3.3.5
Infecção secundária intranasal com Pseudomonas aureginosa
Isolado clínico de P. aeruginosa foi obtido junto ao Hospital das Clínicas de Ribeirão
Preto (HCRP) pertencente a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) e ampliado
por meio de cultivo em BHI (BD Diagnostic Systems, Sparks, USA), durante cinco dias, a
37°C. As bactérias foram centrifugadas(3000 x g, 10 minutos, 4°C) o sobrenadante foi
descartado e as bactérias ressuspensas em solução tampão fosfato (PBS), novamente
centrifugadas e o sobrenadante desprezado para retirada de qualquer vestígio de meio de
cultura. As bactérias P. aeruginosa foram ressuspensas em 5 ml de PBS, aliquotadas,
liofilizadas e congeladas. Antes de cada infecção, uma alíquota de bactérias foi descongelada
e cultivada em meio BHI a 37°C durante 20 horas. Essa cultura foi lavada duas vezes por
adição de solução salina 0,9% e centrifugação (3000 x g, 4°C, 15 minutos). Após a última
centrifugação, o pellet foi ressuspenso em volume de solução salina 0,9% estéril e a
concentração de bactérias foi avaliada por espectrofotometria (Molecular Devices, Sunnyvale,
USA) em 600 nm.
A infecção secundária foi feita após os animais serem anestesiados com injeção i.p. de
ketamina e xilazina (Sigma-Aldrich, Sant Louis, USA). Um volume de 40μl de suspensão
contendo 105 UFC de P. aeruginosa foi colocado sobre as narinas e sugado para o interior da
57
cavidade nasal pela própria respiração do animal, mantido sobre a imobilização até completa
sucção do volume de suspensão aplicado.
3.3.6
Obtenção do lavado broncoalveolar (BAL)
A eutanásia por dose letal de anestésico aplicada via i.p foi realizada após 12 horas de
infecção secundária por P. aeruginosa. A traqueia foi exposta e canulada com catéter de
1,3mm de diâmetro (Angiocath, Becton- Dickinson, Juiz de Fora-MG). O espaço broncoalveolar foi lavado com 3 ml de PBS contendo 1mM de EDTA. O material obtido foi
semeado em placas de Petri contendo ágar Müeller-Hinton (Oxoid Limited, Hampshire, UK)
e incubados a 37°C; o número de unidades formadoras de colônia (UFC) foi avaliado após 24
horas. Os resultados foram expressos como o logaritmo de UFC por animal.
3.3.7
Inoculação intradérmica da linhagem celular tumoral B16LucF10
Animais recém-nascido e adultos sobreviventes à sepse letal foram inoculados com 5
x 104 de células B16LucF10 intradermicamente. No 7° dia após a inoculação, a densidade
tumoral foi avaliada pelo IVIS (Xenogen IVIS Spectrum In Vivo Imaging System). No 15°
dia após a inoculação os animais foram eutanasiados e o tumor foi retirado dos camundongos
para análise das células Tregs, TCD4+IFN+ e TCD8+IFN+ no microambiente tumoral e no
baço. Adicionalmente, o crescimento tumoral foi monitorado desde o dia 0 da inoculação até
o dia 15 usando o Paquímetro.
3.4 CARACTERIZAÇAO
FUNCIONAL
DOS
MACRÓFAGOS
EM
CAMUNDONGOS SOBREVIVENTES À SEPSE
3.4.1
Ensaio de fagocitoses e quantificação do crescimento intracelular (killing) de
P. aeruginosa nos macrófagos
58
As células peritoneais foram estimuladas pela injeção intraperitoneal de 2 ml de
tioglicolato a 3% e coletadas com RPMI 1640 após 72 horas e os ensaios de killing e
fagocitose foram realizados como previamente descrito (Materiais e métodos, item 3.2.2).
3.4.2
Macrófagos M2 em camundongos sobreviventes à sepse letal
No intuito de caracterizar a população de macrófagos com função supressora, foram
realizadas marcações desses macrófagos M2 em células recuperadas da cavidade peritoneal,
com os seguintes marcadores: F4/80+ e MR+ (CD206). Brevemente, uma suspensão celular
do lavado peritoneal foi coletada com 3 ml de PBS com EDTA e posteriormente centrifugada
a 400 g por 10 minutos. As hemácias foram lisadas por choque hiposmótico utilizando um
tampão de lise e uma nova centrifugação foi realizada. Subsequentemente, as células foram
ressuspensas em 3 ml, 1 ml e 2 ml de PBS contendo 2 % de soro fetal bovino inativado. As
células foram contadas em contador automático (COULTER® AC T; Coulter Corporation,
Miami, Florida, USA).
As células (1x106 células/tubo) foram incubadas com 40 μl de Fc block (bloqueador
da porção Fc de imunoglobulinas), um anticorpo proveniente de sobrenadante de hibridoma
de anti-CD16/CD32, para evitar ligações inespecíficas, por 20 minutos, a 4 ºC. Em seguida,
foram adicionados 1,2 μl (1,2 μg) de F4/80 FITC (eBioscience) e 6 μl de MR Alexa Fluor 647
(Ab Serotec) (anticorpos monoclonais extracelulares), por 30 minutos, a 4 ºC. Após a
incubação, as amostras foram lavadas duas vezes com 2 ml de PBS contendo 2 % de soro
fetal bovino, centrifugadas a 400 g por 10 minutos e ressuspensas em 80 μl de solução de
formaldeído a 1 % em PBS. Após esses procedimentos, as amostras foram adquiridas em
FACScanto (BD Immunocytometry System, Franklin Lakes, NJ), utilizando os canais de
fluorescência 1 (FL1) para moléculas conjugadas a FITC; e 4 (FL4) para moléculas
59
conjugadas a APC ou Alexa Fluor 647. As análises foram realizadas utilizando-se o software
Flow Jo (TreeStar), os resultados foram expressos como porcentagem da expressão de
marcadores de macrófagos.
3.5 ANÀLISES DE AMOSTRAS DOS PACIENTES SÉPTICOS
3.5.1
Pacientes
Amostras de sangue periférico de 14 pacientes adultos e crianças com sepse foram
obtidas nas Unidades de Terapia Intensiva (UTI) pediátrica e de adultos do HCRP da FMRPUSP em, no máximo, 48 horas após o diagnóstico de sepse, com o consentimento dos pais ou
responsáveis. Todos os pacientes apresentavam critérios clínicos e laboratoriais de sepse
(Levy et al., 2003). Adicionalmente, novas amostras foram obtidas das crianças e adultos que
sobreviveram à sepse. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
HCRP e da FMRP sob o número 4886/2009. Amostras obtidas de voluntários saudáveis
foram incluídas como controles.
3.5.2
Critérios de inclusão
Foram incluídos no presente estudo pacientes internados na unidade de terapia
intensiva (UTI) pediátrica e de adultos do HCRP da FMRP-USP com diagnóstico de sepse
grave e choque séptico, cujos pais ou responsáveis assim o consentirem.
3.5.3
Critérios de Exclusão
Foram excluídos do estudo os pacientes que apresentaram uma ou mais das condições
abaixo:
I.
II.
Recém-nascidos pré-termo com menos de 28 dias de vida.
Solicitação dos pais ou responsáveis.
60
III.
Contagem de leucócitos abaixo de 1.500/mm3.
IV.
Contagem de neutrófilos abaixo de 1.000/mm3.
V.
VI.
VII.
VIII.
Pacientes portadores do vírus HIV (sintomáticos ou assintomáticos).
Neoplasias.
Imunossupressão prévia.
Pacientes sob terapia com glicocorticoides.
3.5.4
Classificação clínica
Em relação aos pacientes adultos, foram calculados o APACHE II (Acute Physiology
and Chronic Health Evaluation) no momento de internação no CTI para avaliação da
gravidade da sepse e o SOFA (Sequential Organ Failure Assessment), para disfunção de
múltiplos órgãos no momento da coleta da amostra (Knaus et al., 1985; Vincent et al., 1996).
Para avaliação da sepse em pacientes pediátricos, foram calculados o PRISM (Pediatric Risk
of Mortality) para avaliação da gravidade da sepse no momento de internação no CTIP e o
PELOD (Pediatric Logistic Organ Dysfunction), para avaliação de disfunção de múltiplos
órgãos no dia da coleta (Pollack et al., 1988; Leteurtre et al., 2003).
3.5.5
Fenotipagem das células Tregs
O sangue periférico foi coletado por venopunção e o PBMC foi isolado por gradiente
de Percoll (Sigma-Aldrich) como previamente descrito (Peres et al., 2015), submetido à lise
hipotônica (1 volume de NaCl a 0,2%) e lavado com Hanks 1x (Sigma-Aldrich). Após uma
centrifugação adicional, o pellet foi ressuspenso em um volume de meio (RPMI; SigmaAldrich, St. Louis, MO) e contado em uma câmara de Neubauer. A fenotipagem de células T
Reguladoras foi realizada por citometría de fluxo (FACS) como previamente descrito
(Materiais e métodos, item 3.3.1).
61
3.5.6
Ensaio funcional das Tregs
As células TCD4+CD25+ (Tregs) isoladas de crianças saudáveis e aquelas
sobreviventes à sepse foram cultivadas com células TCD4+CD25- (Teff) em placas de 96
poços U-bottom (Costar). Brevemente, as celulas Teff foram marcadas com 1 μM Dye Efluor
670 (eBioscience) por 15minutos, a 37°C, lavadas e cultivadas (1 x105 células per poço) por
quatro dias com um número gradual de celulas Tregs (Teff:Treg: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8...) na
presença de α-CD3 (3 μg/mL) e α-CD28 (1.5 μg/mL). A proliferação celular foi determinada
pela diluição do dye e analisada por FACS.
3.5.7
Determinação das concentrações de citocinas no sangue
Foi realizada quantificação de citocinas (IL-10 e IL-33) em amostras de plasma de
pacientes sépticos em idade adulta ou pediátrica A determinação dos níveis dessas citocinas
foi realizada por método imunoenzimático (ELISA). Brevemente, as placas de microtitulação
(96 poços) foram recobertas com 50 ml/poço do anticorpo específico anti-IL-33 (RD) e antiIL-10 (eBioscience) nas concentrações descritas pelos fabricantes. Esses anticorpos foram
diluídos em solução de ligação (coating buffer) e incubados por 18-24 horas a 4ºC. As placas
foram lavadas por quatro vezes com PBS/Tween-20 (0,05 % Sigma). As ligações nãoespecíficas foram bloqueadas com 200 μl de PBS contendo BSA 1 % (para kits da RD) ou
200 μl de PBS contendo soro bovino fetal inativado 10% (para kits BD e eBioscinece) durante
1 hora a 37 °C. As amostras e o padrão (curva-padrão) contendo as concentrações adequadas
de IL-10 (5000 pg/ml) e IL-33 (3000 pg/ml) foram colocados nas placas (50 μl) e incubados
overnight a 4 ºC. Após esse período, as placas foram lavadas com PBS/Tween e 50 μl dos
anticorpos biotinilados específicos para cada citocina foram adicionados nas concentrações
descritas pelos fabricantes. Após uma hora, as placas foram lavadas com PBS/Tween e o
62
conjugado avidina-peroxidase, na diluição de 1/5000, foi adicionado a cada poço. A seguir, as
placas foram incubadas por 45 minutos. Posteriormente, elas foram lavadas com PBS/Tween
e o substrato (TMB) foi adicionado. As concentrações foram expressas como pg/mL.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A sobrevida dos animais foi expressa como porcentagem de animais sobreviventes
analisadas pelo teste Mantel-Cox logrank (X2, chi-squared), e as diferenças foram
consideradas significativas para p<0,05. A contagem de bactérias foi expressa como mediana
do Log de UFC e analisada estatisticamente pelo teste Mann-Whitney U. Os demais dados
experimentais foram avaliados comparando-se a média dos valores encontrados, por análise
de variância (one-way ANOVA) seguida de Teste de Bonferroni, para comparações múltiplas
ou teste t-Student (comparações entre duas amostras) para amostras não pareadas. O número
(n) de animais por grupo experimental está descrito nas legendas das figuras. Os resultados
foram expressos como média ± erro padrão de média (EPM) e as diferenças foram
consideradas estatisticamente significantes para valores de p<0,05. Todos os experimentos
foram realizados em triplicata.
3.7 PREPARO DAS SOLUÇÕES E REAGENTES
3.7.1
Solução de Anestésico
Ketamina 10% .......................................................................................................................5 ml
Xilazina 2% ...........................................................................................................................3 ml
Salina 0,9% .........................................................................................................................42 ml
3.7.2
Corante Panótico Rápido (LaborClin)
Panótico rápido n°1: composto por uma solução de triarilmetano a 0.1%1minuto.
Panótico rápido n°2: composto por uma solução de xantenos a 0.1%- 1minuto.
63
Panótipo rápido n°3: composto por uma solução de tiazinas a 0.1% - 1 minuto.
3.7.3
Solução de Tampão Salina-fosfato (PBS) 10X (Solução estoque)
Cloreto de Sódio (NaCl, Merck) ...........................................................................................80 g
Cloreto de Potássio (KCl, Merck) ...........................................................................................2 g
Fosfato de Potássio monobásico (KH2PO4, Merck), ...........................................................20 g
Água Milli-Q q.s.p. .........................................................................................................1000 ml
3.7.4
PBS 1X (Solução de uso)
PBS 10X ...........................................................................................................................100 ml
Água Milli-Q q.s.p. ...........................................................................................................900 ml
Ajustado o pH 7.2, filtrado e estocado a 4 ºC.
3.7.5
Tampão de lise
Cloreto de Amônio ............................................................................................................ 8,02 g
EDTA ................................................................................................................................ 0,36 g
Bicarbonato de sódio ......................................................................................................... 0,84 g
Ajustado o pH 7.2, filtrado e estocado a 4 ºC.
3.7.6
Tampão de citometria de fluxo (Tampão de FACS)
Soro Fetal Bovino inativado (SBF-I, Difco) 2%...................................................................2 ml
PBS 1X q.s.p. ....................................................................................................................100 ml
3.7.7
PBS-EDTA (1 mM)
PBS 1X q.s.p.....................................................................................................................100 mL
Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA, Merck) ..........................................................37.2 mg
3.7.8
Meio Brain Heart Infussion (BHI)
Brain Heart Infussion Broth ………………………………………………………………. 37 g
64
3.7.9
Meio RPMI incompleto
Hepes (C8H18N2O4S, Sigma) ..........................................................................................2,38 g
RPMI 1640 (Sigma) ............................................................................................... 1 frasco (1L)
Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Synth) ............................................................................2,22 g
Água Milli-Q q.s.p...........................................................................................................1000 ml
Ajustado ao pH 7,2, filtrado e estocado a 4 ºC.
3.7.10 Meio RPMI completo
Soro Bovino Fetal inativado (10%)(LifeSciences)....................................................10 ml(10%)
Estreptomicina/penicilina (Sigma) (p /100ml)10mg/mL(10.000UI).....................................1 ml
Glutamina (p /100ml) ........................................................................................................... 1 ml
Fungizona (p /100ml) 250ug/mL ........................................................................................120ul
RPMI incompleto q.s.p......................................................................................................100 ml
3.7.11 Triton 0,2% pra Fagocitosis e Killing
Triton 100%........................................................................................................................ 200ul
Água Milli-Q q.s.p............................................................................................................. 100ml
3.7.14 Hanks 10X
Hanks Estoque
Água Milli-Q q.s.p .............................................................................................................100ml
3.7.15 Ertapenem 0,05g/mL
Ertapenem estoque ...........................................................................................................1g H2O
miliQ.................................................................................................................................... 20ml
Alíquotas de 500uL mantidas a -20oC
65
3.7.16 Meio Ágar Muller Hinton (M.M.H.)
M.M.H. (Difco) .....................................................................................................................38 g
Água Milli-Q q.s.p. ..................................................................................................................1 l
Autoclavado, plaqueado aproximadamente 22 ml por placa e estocado à 4 °C.
3.7.17 Tampões utilizados para o ensaio de ELISA
(A) Solução de ligação (coating buffer) pH 8.4
Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Merk) ..............................................................................4,2 g
Água de Milli-Q q.s.p. ......................................................................................................500 ml
(B.1) Tampão de bloqueio (para ELISA da companhia BD)
Soro Fetal Bovino inativado (SBF-I, Difco) 10% .........................................5ml (Para kits BD)
Ou BSA 1%............................................................................................... 500 ul (Para kits RD)
PBS 1X q.s.p. ......................................................................................................................50 ml
(B.2) Tampão de bloqueio (para ELISA da companhia eBioscience e RD)
BSA 0,1 %(Sigma) ...............................................................................................................0,1 g
PBS 1X q.s.p. ................................................................................................................... 100 ml
66
Resultados
Resultados
4. RESULTADOS
4.1 EXPERIMENTOS EM CAMUNDONGOS: MODELO EXPERIMENTAL DE
SEPSE EM CAMUNDONGOS COM DIFERENTES IDADES
4.1.1
CARACTERIZAÇÃO DAS POPULAÇÕES CELULARES DA RESPOSTA
IMUNE
INATA
E
ADAPTATIVA
EM
CAMUNDONGOS
COM
DIFERENTES IDADES
Análises iniciais foram realizadas para determinar possíveis diferenças nas populações
celulares efetoras da resposta imune inata e adaptativa no baço, linfonodos e no sangue
periférico de camundongos com duas, quatro, seis e oito semanas de idade. De maneira
interessante, os nossos resultados demonstraram que não existem diferenças significativas nas
frequências de neutrófilos, macrófagos, células NK, células T CD4+ e células T CD8+ entre
os camundongos de diferentes idades como mostrado no Anexo 8.1. Desse modo, os nossos
dados indicam que as populações celulares em camundongos apresentam semelhança em
frequência ao longo das idades estudadas.
68
Resultados
8.8.2
OBTENÇÃO E DETERMINAÇÃO DO INÓCULO DE BACTÉRIAS PARA
INDUÇÃO DE SEPSE EXPERIMENTAL
Uma vez observado que não existem diferenças nas frequências das células da
resposta imune inata e adaptativa, o nosso próximo passo foi estabelecer um modelo de
indução de sepse experimental nestes animais. O método escolhido foi administração
intraperitoneal de uma suspensão polimicrobiana previamente obtida do ceco de um
camundongo adulto C57BL/6, como descrito anteriormente (Materiais e Métodos, item 3.1.1).
A densidade ótica das bactérias isoladas foi correlacionada com o número de unidades
formadoras de colônias (UFC) cultivadas em Agar Müeller-Hinton (Figura 1A), permitindo o
cálculo do número de UFC necessário para a indução da sepse em cada grupo experimental. A
clássica coloração de Gram demonstrou que ocorre predomínio de espécies Gram negativas
(82%) sobre Gram positivas (16%) na suspensão bacteriana (Figura1B). Posteriormente,
animais com diferentes idades (duas, quatro, seis e oito semanas de idade) foram inoculados
(i.p.) com quantidades diferentes de suspensão bacteriana e a sobrevida foi determinada
diariamente durante os cinco dias subsequentes. O Anexo 8.2 demonstra que são necessárias
7,0 x 107, 1,0 x 108 e 2,0 x 108 UFCs/cavidade para a indução de sepse subletal, moderada e
letal, respectivamente, em animais recém-nascidos (duas semanas). Para animais com quatro,
seis e oito semanas de idade (adultos) a infecção subletal foi induzida com 4,0 x 10 7
UFC/cavidade, a moderada com 2,0 x 108 UFC/cavidade e a letal com 4,0 x 108
UFC/cavidade. Deste ponto em diante, os experimentos foram realizados com animais recémnascidos (duas semanas de idade) e adultos (oito semanas de idade) utilizando-se como dose
bacteriana moderada e letal em animais recém-nascidos 1,0 x 108 UFC/cavidade e 2,0 x 108
UFC/cavidade, respectivamente, e em animais adultos 2,0 x 108 UFC/cavidade e 4,0 x 108
UFC/cavidade, respectivamente.
69
Resultados
A
B
100
y= 1,52.10 9 + 3,25.10 11 . x
R2 = 0,9730
4
2
0
0.0
Gram Negativas
Gram Positivas
80
6
% de Bacterias
11
Bacteria (UFC x 10 /mL)
8
60
40
20
0
0.5
1.0
1.5
2.0
Densidade otica
(600nm)
Figura 1. Caracterização das bactérias isoladas do conteúdo intestinal de camundongo
adulto. O conteúdo cecal de um camundongo adulto C57BL/6 foi removido por laparotomia e
as bactérias foram quantificadas por espectrofotometria. A relação entre concentração de
bactérias por mililitro e densidade ótica (A) e a caracterização das bactérias presentes no
inóculo por coloração de Gram (B) são mostradas. Cálculo da concentração de bactérias
inoculadas por animal: UFC/ml: #Colônias x Fator de diluição x Volume de inóculo.
70
Resultados
8.8.3
CARACTERIZAÇÃO DA FASE AGUDA DE CAMUNDONGOS C57BL/6
ADULTOS E RECÉM-NASCIDOS SUBMETIDOS À SEPSE
Estudos epidemiológicos têm demostrado que a mortalidade na sepse neonatal é
significativamente maior que em adultos (Martinot et al., 1997; Watson et al., 2003; Lawn et
al., 2005). Assim, para verificar experimentalmente se animais recém-nascidos são mais
susceptíveis à sepse polimicrobiana que animais adultos, nós induzimos sepse em ambos os
grupos e monitoramos a sobrevida durante cinco dias. Foi observado que em resposta a
mesma dose bacteriana (2,0 x 108 ou 4,0 x 108 UFC/cavidade), camundongos recém-nascidos
apresentaram uma taxa de sobrevida significativamente menor (*p<0,05) que os
camundongos adultos (Figuras 2 A e B), como observado em estudos prévios (Zhang et al.,
2013; Cuenca et al., 2015). De maneira complementar, nós demostramos que este aumento na
mortalidade não foi o resultado de diferenças significativas nas populações celulares no baço,
linfonodo e sangue periférico entre os camundongos (Anexo 8.1).
Uma vez que o controle da carga bacteriana é fundamental para a melhora na sepse
(Sansonetti, 2001), o nosso próximo passo foi investigar o clearance bacteriano nos animais
recém-nascidos e adultos submetidos à sepse. Para isso, as quantidades de bactérias viáveis no
sangue e no lavado peritoneal foram avaliadas seis horas após a indução da sepse. Nós
observamos que camundongos recém-nascidos apresentam um aumento significativo da
contagem de bactérias no sague e lavado peritoneal quando comparados com camundongos
adultos submetidos à sepse (Figuras 2 C e D). Coletivamente, estes dados indicam que,
consistente com a alta susceptibilidade à sepse, camundongos recém-nascidos submetidos à
sepse apresentam uma menor capacidade de clearence bacteriano e consequente menor
capacidade de controle do processo infeccioso.
71
Resultados
A
B
Recem-nascidos (Duas semanas)
Adultos (Oito semanas)
60
40
*
100
Sobrevida (%)
80
80
60
40
*
20
20
0
0
0
24
48
72
96
0
120
24
48
8
D
Sham
Sepse
8
*
6
4
2
0
N.D
R. Nascidos
N.D
Adultos
Carga Bacteriana
(Log10 CFU/Cavidade)
C
72
96
120
Horas após da sepse
Bacteremia
(Log10 CFU/mL)
Sobrevida (%)
100
Sham
Sepse Letal
*
6
4
2
0
N.D
R. Nascidos
N.D
Adultos
Figura 2. Camundongos recém-nascidos são mais susceptíveis à sepse. Animais adultos
(oito semanas de idade) e recém-nascidos (duas semanas de idade) foram submetidos à sepse
pela inoculação de bactérias (i.p) na concentração de 2 x 108 UFC/cavidade (A) e 4 x 108
UFC/cavidade (B). A sobrevida dos camundongos foi avaliada diariamente por um período de
cinco dias. Os resultados foram expressos como % de sobrevida (n=10-20 camundongos por
grupo), *p<0,05 (Mantel-Cox log rank). A quantificação das bactérias viáveis presentes no
sangue e lavado peritoneal foi realizada 6 horas após a infecção. Os dados correspondem ao
logaritmo de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por ml de sangue ou por cavidade (BC), (*p<0,05). Dados representativos de dois experimentos independentes.
72
Resultados
8.8.4
CAMUNDONGOS RECÉM-NASCIDOS SUBMETIDOS À SEPSE LETAL
APRESENTAM MAIOR DISFUNÇÃO ORGÂNICA
A ativação acentuada das células inflamatórias que resulta na produção e secreção de
altas concentrações de mediadores pró-inflamatórios é responsável pela maioria das alterações
fisiopatológicas tais como, lesões teciduais e disfunção de órgãos observadas tanto em
pacientes como em modelos experimentais de sepse (Dinarello, 1997; Alves-Filho et al.,
2006; Singh e Evans, 2006; Alves-Filho et al., 2008; De Montmollin e Annane, 2011). Assim,
uma vez que camundongos recém-nascidos apresentaram uma maior susceptibilidade à sepse
experimental, o nosso próximo objetivo foi avaliar o nível de inflamação sistêmica e a
presença de danos orgânicos em camundongos com diferentes idades. Nós demostramos que,
associado à maior carga bacteriana nos animais recém-nascidos, maiores níveis séricos de
mediadores pró-inflamatórios (IL-6, TNF-α e IL-1β) são detectados nesses animais em
relação aos camundongos adultos (Figura 3A).
Adicionalmente, camundongos recém-nascidos apresentaram uma maior atividade da
enzima CK-MB, da aspartato-aminotransferase (AST) e de ureia (BUN) no plasma, indicando
uma maior presença de lesões cardíacas, hepáticas e renais, respectivamente (Figura 3B).
Além disso, estas alterações bioquímicas foram confirmadas com estudos histopatológicos,
mostrando
um
maior
comprometimento hepático e
pulmonar
evidenciados pelo
desenvolvimento de esteatose macro e microgoticular e de congestão pulmonar vascular grave
nos animais recém-nascidos em relação aos adultos (Figura 3C). Em conjunto, estes dados
demonstram que camundongos recém-nascidos submetidos à sepse apresentam uma intensa
resposta inflamatória sistêmica e maior comprometimento multiorgânico.
73
Resultados
Sham
Sepse
300
*
1000
500
0
N.D
N.D
R. Nascidos
B
2500
TNF- (pg/mL de soro)
IL-6 (pg/mL de soro)
1500
Sham
Sepse
*
200
100
0
Adultos
N.D
300
100
0
R. Nascidos
120
Adultos
Sham
Sepse
*
90
1500
BUN
(mg/dL)
200
TGO
(U/mL)
CK-MB
(U/L)
200
*
2000
*
300
Adultos
Sham
Sepse
Sham
Sepse
400
N.D
R. Nascidos
*
500
Sham
Sepse
IL-1 (pg/mL de soro)
A
1000
60
100
30
500
0
0
R. Nascidos
Adultos
0
R. Nascidos
Adultos
R. Nascidos
Adultos
C
Figura 3. Camundongos recém-nascidos submetidos à sepse letal apresentam maior
disfunção orgânica. Animais adultos (oito semanas de idade) e recém-nascidos (duas
semanas de idade) foram submetidos à sepse letal pela inoculação de bactérias (i.p). (A)
Concentrações séricas de IL-6, TNF e IL-1β foram determinadas 6 horas após a inoculação de
bactérias. (B) Concentrações séricas de AST, CK-MB e BUN e análise histopatológica (C) da
sepse letal em animais recém-nascidos e adultos após seis horas da sepse. Coloração de
Hematoxilina-Eosina. Os experimentos foram realizados em triplicata. Todos os resultados
correspondem às médias ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
74
Resultados
8.8.5
NEUTRÓFILOS
DE
APRESENTAM DEFEITOS
CAMUNDONGOS
NOS
RECÉM-NASCIDOS
MECANISMOS
DE
MIGRAÇÃO
CELULAR in vivo e in vitro
Os neutrófilos são leucócitos polimorfonucleados essenciais no funcionamento do
sistema imunológico, e a sua migração para o foco infecioso durante uma infeção é um evento
importante na eliminação dos patógenos (Nathan, 2006). Assim, para identificar os
mecanismos envolvidos na alta susceptibilidade dos camundongos recém-nascidos à sepse,
nós investigamos o recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal em camundongos
adultos e recém-nascidos seis horas após a indução da sepse. De maneira interessante, embora
a produção local de CXCL2 (MIP-2), uma quimiocina essencial para a migração de
neutrófilos (Wolpe et al., 1988), tenha sido similar em ambos os grupos (Figura 4A),
camundongos recém-nascidos apresentaram uma significativa redução (p < 0,05) do
recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal (Figura 4B). Neste sentido, com o
intuito de determinar possíveis alterações funcionais inatas nos mecanismos de migração
celular dos neutrófilos de camundongos recém-nascidos, a capacidade de migração de
neutrófilos isolados da medula óssea de camundongos recém-nascidos e adultos naives foi
avaliada in vitro. De maneira similar ao observado in vivo, neutrófilos derivados da medula de
animais recém-nascidos apresentaram uma menor capacidade de migração in vitro para as
quimiocina CXCL2 (MIP-2) e fMLP (Figura 4C).
Além da capacidade de migração, durante uma infecção, os leucócitos precisam
transmigrar do sangue periférico através do endotélio vascular para o local de inflamação.
Este processo é dependente do rolamento, adesão e expressão de integrinas na superfície do
neutrófilo (Langereis, 2013). Nós observamos, de maneira interessante, que leucócitos de
animais recém-nascidos naives apresentam uma redução significativa no rolamento e a adesão
dos leucócitos nas vênulas mesentéricas (Figuras 4C-D). Em suma, os nossos dados indicam
75
Resultados
que o menor controle da carga bacteriana e consequente susceptibilidade à sepse dos animais
recém-nascidos podem estar relacionados com alterações inatas nos mecanismos de migração
dos neutrófilos.
76
Resultados
B
Sham
Sepse
Neutrófilos
6
(celulas x 10 por cavidade)
4
4000
2000
R. Nascidos (Duas semanas)
*
3
2
*
1
0
0
R. Nascidos
*
*
8
4
Salina
MIP-2 30ng/ml
RPMI
Adultos
E
2.0
MIP-2 RPMI
30ng/mL
fMLP
10-7 M
Salina
MIP-2 30ng/ml
*
15
10
5
0
Células aderentes/100 m
2
20
12
0
R. Nascidos
Adultos
D
Rolamento (células/min)
MIP-2 na cavidade peritoneal
(pg/mL)
6000
C
Sham
Sepse
Quimiotaxia
(Neutrófilos/Campo)
A
*
1.5
1.0
0.5
0.0
R. Nascidos
Adultos
R. Nascidos
Adultos
Figura 4. Neutrófilos de camundongos recém-nascidos apresentam alterações na
migração celular in vivo e in vitro. Animais adultos (oito semanas de idade) e recémnascidos (duas semanas de idade) foram submetidos à sepse letal pela inoculação de bactérias
(i.p). (A) A concentração de MIP-2 na cavidade peritoneal e a migração para a cavidade
peritoneal (B) foi realizada seis horas após indução da sepse. Os dados são apresentados como
médias ± EPM do número de neutrófilos na cavidade peritoneal (n:8 animais por grupo). (C)
neutrófilos derivados da medulo óssea de camundongos adultos e recém-nascidos foram
colocados para migrar por 1 hora a 37oC para CXCL2 (20 ng/ml) na câmara de Boyden. (D e
E) Animais adultos e recém-nascidos foram anestesiados com ketamina (100 mg/kg)/xilazina
(15 mg/kg) e submetidos ao ensaio de microscopia intravital, como previamente descrito
(Materiais e Métodos 3.1.9). Depois de identificada uma vênula do mesentério, foi adicionado
MIP-2 (30 ng/mL) ou solução salina e foram quantificados o número de leucócitos que
rolaram sobre o vaso e o número de leucócitos aderidos ao endotélio, durante cinco minutos.
Os dados são apresentados com a média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
77
Resultados
8.8.6
DIMINUIÇÃO NA MIGRAÇÂO DE NEUTRÓFILOS E NA CAPACIDADE
FAGOCÍTICA
EM
CAMUNDONGOS
RECÉM-NASCIDOS
ESTÁ
ASSOCIADA COM UMA MENOR MOBILIZAÇÃO INTRACELULAR DE
CÁLCIO
O influxo de cálcio é um evento essencial para as diversas funções efetoras dos
neutrófilos, incluindo a quimiotaxia, a degranulação e a polimerização dos filamentos de
actina (Dixit et al., 2011; Nauseef e Borregaard, 2014). Neste sentido, neutrófilos isolados da
medula óssea de camundongos recém-nascidos e adultos naives foram incubados com Fluo3AM e o influxo de cálcio foi avaliado em resposta ao fMLP e ao LTB4. As Figuras 5 A e B
mostram que neutrófilos de camundongos recém-nascidos apresentam uma menor
mobilização de cálcio, sendo este efeito independe do estímulo utilizado (fMLP ou LTB4). De
maneira interessante este mesmo efeito foi observado quando usado o ionóforo de cálcio,
Ionomicina (5 µM). (Figura 5C). Portanto, estes dados mostram que neutrófilos de
camundongos recém-nascidos apresentam um comprometimento inato na ativação de vias
intracelulares dependentes de cálcio, o qual pode estar relacionado com os defeitos no
clearance bacteriano e na migração previamente descritos.
De maneira complementar ao menor influxo de cálcio, dados do nosso laboratório
demonstraram que a falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso durante a
sepse está associada com a internalização do receptor quimiotáctico CXCR2 na superfície dos
neutrófilos circulantes (Rios-Santos et al., 2007), via aumento na produção sistêmica de NO.
Neste sentido, nós demostramos que camundongos recém-nascidos submetidos à sepse
apresentam um aumento significativo nos níveis séricos de NO2 (Figura 6) quando
comparados aos animais adultos. Em suma, este conjunto de dados mostra que os mecanismos
responsáveis pela menor capacidade de migração dos neutrófilos de camundongos recém-
78
Resultados
nascidos, e consequente susceptibilidade à sepse, são produto de deficiências celulares inatas
e da marcada produção sistêmica de NO neste grupo.
79
Resultados
20
Neutófilos Recem-nascidos + Meio
Neutrófilos Adultos + Meio
Neutrófilos Recem-nascidos + fMLP 10-7 M
Neutrófilos Adultos + fMLP 10-7 M
600
Mobilizaçao de Ca (AUC)
15
10
2+
Mobilização de Ca
2+
(RFU)
A
5
0
20
40
60
80
Segundos
-5
100
120
400
200
0
2+
5
800
Mobilização de Ca
2+
(RFU)
Neutrófilos Recem-nascidos + LTB4 10-5 M
Neutrófilos Adultos + LTB4 10-5 M
0
20
40
60
80
Segundos
Recem-nascidos + Meio
Recem-nascidos + fMLP 10-7 M
Adultls + Meio
Adultos + fMLP 10-7 M
**
B
10
Neutrófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
100
120
Neutrófilos Recem-nascidos + Meio
Neutrófilos Recem-nascidos + LTB 4 10-5 M
Neutrófilos Adultos + LTB 4 10-5 M
***
600
400
200
0
-5
2+
60
Mobilização de Ca
40
20
0
Neutrófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
Neutrófilos
Recem-nascidos + Meio
Recem-nascidos + Ionomicina
Adultos + Meio
Adultos + Ionomicina
***
6000
4000
2000
0
20
-20
8000
80
2+
(RFU)
C
Neutrófilos Recem-nascidos + Ionomicina
Neutrófilos Adultos + Ionomicina
40
60
80
Segundos
100
120
Figura 5. Camundongos recém-nascidos apresentam maior produção de NO e menor
mobilização intracelular de cálcio. Neutrófilos derivados da medula óssea foram incubados
com 4 µM de Fluo-3AM por 40 minutos e a mobilização de cálcio foi estudada em resposta
ao fMLP (10-7M), ao LTB4 (10-5M) e à Ionomicina (A, B e C, respectivamente). Os
experimentos foram realizados em quadruplicata. Os dados são apresentados com média ±
EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
80
Resultados
M deNO3/NO2 no soro
200
Sham
Sepse
*
150
100
50
0
R. Nascidos
Adultos
Figura 6. Camundongos recém-nascidos apresentam maior produção de NO durante a
sepse. Animais adultos e recém-nascidos foram submetidos à sepse letal pela inoculação de
bactérias (i.p). A concentração de nitrito no soro foi determinada seis horas após a sepse pelo
método de Griess. Os resultados foram expressos como μM de NO3/NO2. Os experimentos
foram realizados em triplicata. Os dados são apresentados como a média ± EPM de seis
animais por grupo, *p<0,05.
81
Resultados
8.8.7
NEUTRÓFILOS
DE
CAMUNDONGOS
RECÉM-NASCIDOS
APRESENTAM FALÊNCIA NA FAGOCITOSE E NA PRODUÇÃO DE
ESPÉCIES REATIVAS
A mobilização de cálcio é essencial para o processo de fagocitose, maturação do
fagolisosoma e produção de espécies reativas (Edberg et al., 1995; Steinckwich et al., 2007;
Nunes e Demaurex, 2010). Assim, uma vez demonstrado que neutrófilos de animais recémnascidos apresentam uma menor mobilização de cálcio após diferentes estímulos, o nosso
próximo passo foi avaliar a capacidade fagocítica e a capacidade de killing de neutrófilos
isolados da medula de camundongos adultos e recém-nascidos. Para isso, os neutrófilos foram
incubados com bactérias do conteúdo cecal previamente opsonizadas, e a atividade fagocítica
foi avaliada após 30 minutos. As Figuras 7 A-C mostram que neutrófilos de camundongos
recém-nascidos apresentaram uma menor capacidade de fagocitose e killing quando
comparados com neutrófilos provenientes de camundongos adultos. De maneira interessante,
esta menor capacidade fagocítica esteve relacionada com uma menor produção de espécies
reativas totais quando comparados com neutrófilos de camundongos adultos incubados com
partículas de zymozan (Figura 7D).
De maneira similar aos dados obtidos com neutrófilos, macrófagos peritoneais de
camundongos recém-nascidos também apresentaram uma menor capacidade de fagocitose,
killing e produção de NO2 quando estimulados com LPS (Figura 8A-D). Em conjunto, os
resultados desta primeira fase do trabalho mostram que camundongos recém-nascidos
submetidos à sepse, apresentam uma intensa resposta inflamatória associada com maior
comprometimento multiorgânico, deficiência nas funções antimicrobianas mediadas pela
resposta imune inata, caracterizada pela menor migração de PMN in vivo e in vitro, e
diminuição da atividade bactericida por um mecanismo dependente da menor mobilização de
cálcio intracitoplasmático o que determina a maior susceptibilidade deles à sepse.
82
Resultados
B
*
*
Taxa Fagocítica
30
20
10
0
30
20
10
0
R. nascidos Adultos
D
8
3
RLU (x10 )
8
Bacteria
WT Neutrófilos + Bacteria
R. Nascidos
7
Adultos
*
6
5
4
R. nascidos Adultos
Neutrófilos Adultos + Zymosan (5 particulas/célula)
Neutrófilos R. Nascidos + Zymosan(5 particulas/célula)
10
Viabilidade da bacteria fagocítada
(Log CFU/mL)
40
40
Neutrófilos Fagocíticos
(%)
C
6
4
2
0
410 0 5
Produção de especies totais
(AUC)
A
Neutrófilos Adultos + Zymosan
Neutrófilos R. Nascidos + Zymosan
310 0 5
*
210 0 5
110 0 5
0
0
200
400
600
800
Segundos
1000
1200
Figura 7. Camundongos recém-nascidos apresentam falência nos mecanismos de
fagocitose e killing bacteriano. Neutrófilos derivados da medula óssea (BMDN) de
camundongos adultos e recém-nascidos foram incubados in vitro com bactéria ou partículas
de zymozan opsonizadas. (A) Atividade fagocítica dos neutrófilos após 30 minutos de
incubação. (B) taxa de bactérias fagocitadas após 30 minutos de incubação e (C) killing
bacteriano após três horas de incubação. (D) Produção de espécies reativas totais após a
incubação de partículas de zymozan com BMDN. Os resultados foram expressos como
unidades relativas de luminescência (RLU) e Área Embaixo da Curva (AUC). Os dados são
apresentados como média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
83
Resultados
B
A
150
*
*
Taxa Fagocítica
Macrófagos fagocíticos
(%)
60
40
20
100
50
0
0
R. nascidos Adultos
R. nascidos Adultos
D
8
7
Bacteria
Macrófagos + Bacteria
R. Nascidos
150
Macrófagos
Macrófagos + LPS (10g/ml)
*
Adultos
6
*
M of NO2
(Log CFU/mL)
C
100
50
5
4
0
R. Nascidos
Adultos
Figura 8. Macrófagos provenientes de camundongos recém-nascidos apresentam
falência nos mecanismos de fagocitose e killing bacteriano. Macrófagos peritoneais de
camundongos adultos e recém-nascidos foram incubados in vitro com bactéria ou partículas
de zymozan opsonizadas. (A) Atividade fagocítica dos macrófagos após 30 minutos de
incubação, (B) a taxa de bactérias fagocitadas após 30 minutos de incubação e (C) o killing
bacteriano após três horas de incubação são apresentados. Os dados são apresentados com
média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
84
Resultados
8.8.8
CARACTERIZAÇÃO DOS CAMUNDONGOS C57BL/6 ADULTOS E
RECÉM-NASCIDOS SOBREVIVENTES À SEPSE LETAL
Determinada a ampla susceptibilidade dos animais recém-nascidos à sepse e os
mecanismos envolvidos nesse processo, o nosso próximo passo foi estudar as consequências
tardias da sepse em camundongos adultos e recém-nascidos. Assim, com o intuito de
mimetizar o que ocorre em termos fisiopatológicos em pacientes sobreviventes à sepse,
utilizamos o modelo de sepse polimicrobiana letal induzida pela inoculação intraperitoneal de
bactérias, seguido de tratamento com antibiótico. O protocolo de tratamento com antibiótico
nos camundongos C57BL/6 sépticos consistiu na administração intraperitoneal de Ertapenem
sódico na dose de 30 mg/kg (animais de oito semanas de idade) e 10 mg/Kg (animais recémnascidos). A primeira administração do antibiótico foi realizada seis horas após o início da
sepse, sendo o tratamento mantido em intervalos regulares de 12 horas por um período de três
dias. É importante ressaltar que nas primeiras seis horas após a indução da sepse, os animais
apresentaram aumento da carga bacteriana no sangue (Figura 9A). Além disso, animais
sépticos não tratados com antibiótico apresentaram sinais clínicos de letargia, piloereção,
secreção ocular, taquipnéia e taquicardia, com 100% de mortalidade três dias após a infecção.
No entanto, os sinais clínicos foram menos intensos após o tratamento com antibiótico (Sepse
+ Ab), com um significativo aumento na taxa de sobrevida (aproximadamente 30-40%).
Todos os animais Sham apresentaram uma taxa de sobrevida de 100% após os sete dias de
observação (Figura 9B).
Posteriormente, foi avaliado o clearance bacteriano após a indução da sepse grave e
tratamento antimicrobiano. Para isso, a carga bacteriana no sangue foi analisada nos dias 1, 3,
7 e 15 após indução da sepse. Como controle, foi determinada a quantidade de bactérias no
primeiro dia após a sepse nos animais que não foram tratados com antibiótico. Nas Figuras
85
Resultados
9B-C, demonstramos que no 1° dia após a inoculação de bactérias, o número de bactérias
viáveis nos animais tratados com antibiótico foi significativamente menor ao do grupo sem
tratamento. Esta diminuição foi mantida ao longo do tratamento antibiótico e no dia 15 após
tratamento, não foram detectadas bactérias viáveis no sangue, demonstrando que o tratamento
dos animais sépticos com antibiótico controla a infecção.
Como mencionado anteriormente, a mortalidade na sepse é decorrente, na maior parte
das vezes, de lesões teciduais capazes de desencadear falência múltipla de órgãos (Doerschuk,
2001). Uma vez que o tratamento com antibiótico melhora a sobrevida dos animais por
controlar a infecção, nosso próximo objetivo foi avaliar se também ocorre redução de dano
orgânico após tratamento com antibiótico. Para isso, avaliamos o dano hepático, já que o
fígado é um dos primeiros órgãos a ser acometido durante a sepse. No 1° dia após a indução
da sepse, como apresentado nas Figuras 10 A-B, animais sépticos tratados ou não com
antibióticos apresentaram aumento na quantidade de aspartato-aminotransferase (AST ou
transaminase oxalacética, TGO) no plasma, indicando a presença de lesão hepática. Porém, as
concentrações deste marcador foram gradativamente reduzidas nos animais sépticos tratados
com antibiótico, atingindo concentrações similares ao observado no plasma dos animais Sham
no 15° dia após a inoculação das bactérias. Adicionalmente, os animais sépticos tratados ou
não com antibióticos apresentaram perda progressiva do peso corporal, como apresentado na
Figura 10C. Contudo, os animais sépticos tratados com antibiótico recuperaram
gradativamente o peso corporal, atingindo porcentagem de peso similar ao dia 0. Em
conjunto, esses dados demonstram que embora os animais inoculados com bactéria
apresentem sinais característicos de um quadro de sepse, o tratamento com antibiótico é capaz
de controlar o processo infeccioso e, consequentemente, a disfunção de órgãos.
86
Resultados
A
Sham R. Nascidos
Sepse R. Nascidos
Sepse R. Nascidos + Ab
B
Sham
Sepsel
100
*
6
80
Sobrevida (%)
Bacteremia
(Log10 CFU/mL)
8
Sham Adultos
Sepse Adultos
Sepse Adultos + Ab
4
2
60
40
20
N.D
0
N.D
R. Nascidos
0
0
Adultos
C
D
Sham R. Nascidos
Sepse R. Nascidos
6
4
Bacteremia
(Log10 CFU/mL)
Bacteremia
(Log10 CFU/mL)
8
*
2
*
*
0
1
1
7
15
Dias após sepse
20
40
60
80
100
120
8
Sham Adultos
Sepse Adultos
Sepse Adultos + Ab
6
*
4
*
2
*
0
1
1
7
15
Dias após sepse
Figura 9. Tratamento com antibiótico é capaz de controlar o processo infeccioso em
animais sépticos. Animais adultos (oito semanas de idade) e recém-nascidos (duas semanas
de idade) foram submetidos à sepse pela inoculação de bactérias (i.p). (A), a quantificação das
bactérias presentes no sangue foi realizada seis horas após a infecção. Os dados correspondem
ao logaritmo de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por ml de sangue. (B),
camundongos submetidos à sepse foram tratados via intraperitoneal com antibiótico
Ertapenem sódico 30 mg/kg (animais de oito semanas e seis semanas) e 10 mg/Kg (animais
recém-nascidos, quarto semanas) seis horas após a infecção. O tratamento com antibiótico foi
mantido em intervalos de 12 horas, durante três dias. A sobrevida dos camundongos
submetidos à sepse foi avaliada diariamente por um período de cinco dias. Os resultados
foram expressos como % de sobrevida (n=10-20 camundongos por grupo). A taxa de
sobrevida dos animais sépticos tratados com antibióticos foi significativamente diferente em
relação à dos animais sépticos sem tratamento e dos animais Sham. (*p<0,05), (Mantel-Cox
log rank). (C-D), as contagens de bactérias viáveis no sangue foram analisadas no 1°, 3°, 7° e
15° dias após sepse em camundongos tratados ou não com antibióticos. Os dados
correspondem ao logaritmo de UFC por ml de sangue. Os dados são apresentados com a
média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
87
Resultados
A
Sham R. Nascidos
Sepse R. Nascidos
100
*
50
Sham Adultos
Sepsis Adult
Sepse Adultos + Ab
300
TGO
(U/mL)
TGO
(U/mL)
150
B
200
*
100
0
0
1
1
7
1
15
1
7
15
Dias após sepse
Dias após sepse
C
Peso Corporal (%)
100
Sepse R. Nascidos
Sepse Adultos
Sepse Adultos + Ab
90
80
70
60
0
30
60
90
120
Figura 10. Tratamento com antibiótico reduz a disfunção orgânica em animais sépticos.
Animais adultos (oito semanas de idade) e recém-nascidos (duas semanas de idade) foram
submetidos à sepse letal pela inoculação de bactérias (i.p). (A-B), as concentrações séricas de
aspartato aminotransferase (AST-TGO) foram avaliadas no 1°, 3°, 7° e 15° dias após a
inoculação de bactérias nos animais tratados ou não com antibiótico. A concentração de ASTTGO no plasma de animais sépticos tratados com antibióticos no 15° dia foi
significativamente diferente em relação à dos animais sépticos sem tratamento (*p<0,05). (C)
a percentagem da perda de peso corporal em animais adultos e recém-nascidos submetidos à
sepse foi avaliada a cada seis horas, por cinco dias e expressa como a porcentagem de perda
de peso corporal. Os dados são apresentados com a média ± EPM de seis animais por grupo,
*p<0,05.
88
Resultados
8.8.9
PADRONIZAÇÃO DA INFECÇÃO PULMONAR SECUNDÁRIA À SEPSE
COM P. aeruginosa
A Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista adquirido na comunidade e em
hospitais, responsável por quadros de pneumonia graves em humanos, especialmente em
indivíduos imunocomprometidos (Guidelines for the management of adults with hospitalacquired, ventilator-associated, and healthcare-associated pneumonia; Yang et al., 2010).
Assim, nós utilizamos este patógeno para estabelecer um modelo de pneumonia em animais
recém-nascidos e adultos sobreviventes à sepse e determinar o grau de susceptibilidade à
infecção secundária. Para isso, inicialmente padronizamos uma quantidade de bactérias capaz
de gerar uma infecção não letal em camundongos naives. A Figura 10A mostra a
quantificação de P. aeruginosa por espectrofotometria (600nm). Foi determinado como dose
subletal 8 X 105 UFC/40μl e 2 X 106 UFC/40μl para camundongos recém-nascidos e adultos,
respectivamente (Figura 11B-C). Nestas doses, 80% dos animais de ambos os grupos
sobreviveram, consistindo, portanto, um modelo de infecção com sobrevida semelhante
àquelas reportadas previamente (Muenzer et al., 2010).
Uma vez padronizada o inóculo de P. aeruginosa, camundongos adultos e recémnascidos submetidos à sepse 15 ou 30 dias antes foram infectados intranasalmente com P.
aeruginosa e a sobrevida foi analisada por 10 dias. Consistente com dados do nosso grupo
(Nascimento et al., 2010), camundongos adultos submetidos à sepse 15 ou 30 dias antes
apresentaram 100% de mortalidade até o 6° dia quando comparados ao grupo Sham.
Entretanto, camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse apresentaram uma marcada
resistência à infecção i.n com P. aeruginosa, exibindo uma sobrevida de 70% até o 10º dia de
observação (Figuras 12A-B). Consistente com a alta resistência à infecção pós-sepse dos
camundongos recém-nascidos, não observamos aumento no número de bactérias no lavado
89
Resultados
broncoalveolar 12 horas após a infecção por P. aeruginosa em comparação aos animais
naives (Figura 12C-D), em contrapartida, animais adultos sobreviventes à sepse apresentaram
um aumento significativo da carga bacteriana no lavado broncoalveolar quando infectados
com P. aeruginosa. Em conjunto, esses dados demonstram que animais recém-nascidos
sobreviventes à sepse são altamente resistentes a infecção secundária induzida pela P.
aeruginosa, sugerindo o não desenvolvimento de disfunção imune nestes animais.
90
Resultados
y= -2,23 10 2 + 3,05.10 5 . x
R2 = 0,9568
4
3
2
100
80
0
0.0
60
40
4 x 107
4 x 106
2 x 106
8 x 105
20
1
0
0.4
0.8
1.2
0
2
Densidade otica
(600nm)
C
Sobrevida (%)
Pseudomonas aeruginosa
5
(UFC x 10 /30µL)
5
B
Sobrevida (%)
Recem-nascidos
A
4
6
UFC/40µL
UFC/40µL
UFC/40µL
UFC/40µL
8
10
Dias após inoculação da Pseudomonas
Adultos
100
80
60
4 x 107 UFC/40µL
4 x 106 UFC/40µL
2 x 106 UFC/40µL
8 x 105 UFC/40µL
40
20
0
0
2
4
6
8
10
Figura 11. Padronização do inóculo de P. aeruginosa em animais recém-nascidos e
adultos naives. (A) O isolado clínico de P. aeruginosa foi ampliado através de cultivo em
BHI durante cinco dias, a 37°C. Após diluições seriadas, a bactéria foi quantificada por
espectrofotometria a 600nm. A densidade ótica correlaciona-se com o número de UFC
cultivadas em Agar Müeller-Hinton. (B-C), animais adultos e recém-nascidos foram
infectados intranasalmente com diferentes inóculos de P. aeruginosa. A sobrevida dos
camundongos submetidos à infeção i.n foi avaliada diariamente por um período de cinco dias.
Os resultados foram expressos foram expressos como % de sobrevida (10-20 camundongos
por grupo). A taxa de sobrevida dos animais sépticos tratados com antibiótico foi
significativamente diferente em relação aos animais sépticos sem tratamento e aos animais
Sham. Os dados são apresentados como a média ± EPM de seis animais por grupo.
91
Resultados
A
B
100
80
80
Sobrevida (%)
100
60
40
R. Nascidos pós-sepse (30d)
Adultos pós-sepse (30d)
60
40
20
20
0
0
0
2
4
6
8
0
10
C
2
4
6
8
10
D
4
2
0
Sham R. Nascidos + PA
R. Nascidos pós-sepse + PA
6
P. aeruginosa no BAL
(Log CFU/animal)
6
P. aeruginosa no BAL
(Log CFU/animal)
Sobrevida (%)
Sham R. Nascidos
Sham Adultos
R. Nascidos pós-sepse (15d)
Adultos pós-sepse (15d)
Sham R. Nascidos
Sham Adultos
Sham Adultos +PA
Adultos pós-sepse + PA
*
4
2
0
Figura 12. Animais C57BL/6 recém-nascidos sobreviventes à sepse são resistentes à
infecção pulmonar não letal induzida por Pseudomonas aeruginosa. (A) camundongos
submetidos à sepse foram tratados com antibiótico por três dias. (A-B) no dia 15 e 30 após a
sepse, os animais adultos e recém-nascidos foram infectados via i.n. com 106 ou 105 UFCs de
Pseudomonas aeruginosa respectivamente. A sobrevida foi determinada diariamente por um
período de 10 dias. Os resultados foram expressos foram expressos como % de sobrevida (510 camundongos por grupo). A taxa de sobrevida dos camundongos pós-sépticos infectados
com Pseudomonas aeruginosa foi significativamente diferente dos camundongos controles
(*p<0,05, Mantel-Cox log rank). (C-D), a quantificação da Pseudomonas aeruginosa foi
realizada 12 horas após a inoculação das bactérias no lavado broncoalveolar dos
camundongos sobreviventes à sepse e nos camundongos naives. Os dados são expressos
como o Logaritmo de UFC/animal (n=10, *p<0,05).
92
Resultados
8.8.10 CÉLULAS
T
CD4+
DE
CAMUNDONGOS
RECÉM-NASCIDOS
SOBREVIVENTES À SEPSE NÃO APRESENTAM FALÊNCIA NA
PROLIFERAÇÃO
EM
CONTRASTE
COM
OS
CAMUNDONGOS
ADULTOS SOBREVIVENTES Á SEPSE LETAL
No intuito de caracterizar a disfunção imune adaptiva nos animais sobreviventes à
sepse, a resposta proliferativa das células TCD4+ foi avaliada 15 dias após a sepse. Assim, a
células T CD4 efetoras (células TCD4+CD25-) isoladas de camundongos adultos e recémnascidos sobreviventes à sepse foram marcadas com o reagente cell proliferation Dye eFluor
647 (eBioescience) e ativadas in vitro na presença de estímulo policlonal. Consistente com
dados da literatura (Scumpia et al., 2007; Nascimento et al., 2010), células TCD4+ isoladas do
baço de camundongos adultos sobreviventes à sepse falharam em se proliferar após a
estimulação policlonal (anti-CD3). De maneira interessante, as células TCD4+ isoladas de
animais com duas semanas de idade apresentaram intensa proliferação após estimulação in
vitro, não apresentando diferenças significativas quando comparadas com as células dos
animais que não foram submetidos à sepse. (Figura 13), indicando o não desenvolvimento de
disfunções imunes nestes camundongos.
93
Resultados
Sham
Sepse15d
Proliferação celular (%)
40
*
30
20
10
0
Meio
+
Anti-CD3/CD28 -
-
+
+ -
-
+
+ -
R. Nascidos
-
+
+ - +
Adultos
Figura 13. Camundongos adultos, mas não os recém-nascidos sobreviventes à sepse
apresentam disfunção proliferativa das células T CD4+. Os camundongos adultos e recémnascidos submetidos à sepse ou controle (Sham) foram tratados com antibiótico por três dias.
No 15° dia após a sepse, os animais foram eutanasiados, o baço foi coletado e as células
TCD4+ isoladas e marcadas com 1 μM Dye Efluor 670 (eBioscience) por 15 minutos, a 37 °C,
lavadas, cultivadas (1 x105 células por poço) e incubadas com anti-CD3 (1μg/ml, estímulo
policlonal), por três dias. Os dados são apresentados como a média ± EPM de seis animais por
grupo, *p<0,05.
94
Resultados
8.8.11 CAMUNDONGOS RECÉM-NASCIDOS SOBREVIVENTES À SEPSE NÃO
APRESENTAM
EXPANSÃO
DAS
CÉLULAS
T
REGULADORAS
(CD4+FoxP3+) EM CONTRASTE COM OS CAMUNDONGOS ADULTOS
SOBREVIVENTES À SEPSE LETAL
Os efeitos supressores das células TCD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) sobre a resposta
imune adaptativa e em especial sobre as células TCD4 têm sido amplamente documentados
(Thornton e Shevach, 1998; Shevach et al., 2006; Sakaguchi et al., 2009). Adicionalmente,
tem sido reportado o aumento na frequência de células Tregs no sangue de pacientes sépticos
bem como no baço de camundongos sobreviventes à sepse (Monneret et al., 2003; Scumpia et
al., 2006; Venet et al., 2008; Venet et al., 2009; Cavassani et al., 2010; Nascimento et al.,
2010), e este aumento está associado com o desenvolvimento de uma condição de
imunossupressão, caracterizada pelo aumento da susceptibilidade à infecções secundárias
(Benjamim et al., 2003; Cavassani et al., 2010; Nascimento et al., 2010). Portanto, num
esforço para entender o mecanismo pelo qual camundongos recém-nascidos sobreviventes à
sepse são resistentes à infecção secundária, o nosso próximo objetivo foi avaliar o efeito da
injuria séptica letal sobre a expansão das células Tregs em animais sobreviventes à sepse.
Nas Figuras 14A-B estão representadas a frequência e o número absoluto das células
Tregs isoladas do baço de camundongos adultos e recém-nascidos sobreviventes à sepse,
respectivamente. Em concordância com estudos prévios, nós observamos um aumento na
frequência e número absoluto das células Tregs em animais adultos submetidos à sepse
(Benjamim et al., 2003; Cavassani et al., 2010; Nascimento et al., 2010). Ainda, este aumento
na frequência das Tregs foi associado à expansão da população CD4+ Foxp3+ neuropilina(iTregs) no baço e no linfonodo mesentérico dos animais adultos (Figuras 15A-B). De
maneira interessante, 15 dias após indução da sepse, animais recém-nascidos apresentaram
uma diminuição significativa na frequência das células Tregs esplênicas. Portanto, esta
95
Resultados
redução na expansão das células Tregs pode, em parte, estar correlacionada com a capacidade
proliferativa e a resistência à infeção secundária normal, previamente observados nos
camundongos recém-nascidos.
96
Resultados
B
Sham
Sepse15d
*
Sham
Sepse15d
*
+
15
6
5
20
Células TCD4 Foxp3 (x 10 )
por baço
*
10
4
+
+
+
Células T CD4 Foxp3 T (%)
por baço
A
5
0
2
*
0
R. Nascidos
Adultos
R. Nascidos
Adultos
C
expansão das células TCD4+FoxP3+ (Tregs) no baço. Os camundongos submetidos à sepse
foram tratados com antibiótico por três dias. No 15° dia após a sepse, os animais adultos e
recém-nascidos foram eutanasiados e o baço foi coletado para avaliar a frequência das células
T Reguladoras por FACS. (A) Porcentagem e (B) número absoluto de Tregs. Os dados são
apresentados com a média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
97
Resultados
Figura 15. Histograma de proliferação celular usando Ki67 e neuropilina no baço (A) e
no linfonodo (B) de camundongos adultos sobreviventes a sepse. Camundongos adultos
submetidos à sepse foram tratados com antibiótico por três dias. No 15° dia após a sepse, os
animais foram eutanasiados, o baço e o linfonodo mesentérico foram coletados e as células T
Reguladoras foram incubadas com o reagente de proliferação celular Ki67 (Santa Cruz
Biotechnology) e com Neuropilina-1 (NRP1). Porcentagem de células em proliferação no
baço (A) e no linfonodo mesentérico (B). As células foram analisadas por FACS.
98
Resultados
8.8.12 AS CELULAS T REGULADORAS CD4+Foxp3+ DE CAMUNDONGOS
ADULTOS E RECÉM-NASCIDOS SOBREVIVENTES Á SEPSE MANTÊM
SUA ATIVIDADE SUPRESSORA
Além do aumento do número de células Tregs, alterações de suas funções podem ser
determinantes na geração de quadros de imunossupressão (Cavassani et al., 2010). Portanto,
nós decidimos avaliar a capacidade supressora das células Tregs (TCD4+CD25+) isoladas do
baço de camundongos recém-nascidos e adultos sobreviventes à sepse. A partir de ensaios de
co-cultura, na proporção de uma célula Tregs (2 x104) para cada 4 células efetoras (8 x104),
demonstramos que a capacidade supressora das células Tregs de camundongos adultos e
recém-nascidos sobreviventes à sepse não difere (Figura 16B). Assim, podemos sugerir que é
a diminuição no número das células Tregs e não a diminuição de sua capacidade supressora a
implicada no não desenvolvimento da imunossupressão.
99
Resultados
B
100
Proliferação celular (%)
A
T eff
T eff +T reg
80
60
*
*
40
20
0
R. Nascidos
Adultos
Figura 16. Capacidade supressora das células T Reguladoras é semelhante em
camundongos adultos e recém-nascidos sobreviventes à sepse. Camundongos submetidos à
sepse foram tratados com antibiótico por três dias. No 15o dia após a sepse, os animais foram
eutanasiados, o baço foi coletado e as células TCD4+CD25+ (Tregs) e TCD4+CD25- (Teff) de
camundongos recém-nascidos e adultos Sham ou sobreviventes à sepse letal foram marcadas
com 1 μM Dye Efluor 670 (eBioscience) por 15 minutos, a 37 °C, lavadas, cultivadas (1 x105
células per poço) e incubadas com anti-CD3 (1μg/ml, estímulo policlonal), por três dias. Os
dados são apresentados como a média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
100
Resultados
APRESENTAM DISFUNÇÃO IMUNE EM RESPOSTA AO DESAFIO
TUMORAL COM A LINHAGEM CELULAR B16LucF10
O papel das células Tregs na progressão tumoral tem sido amplamente descrita (Kim
et al., 2006; Cavassani et al., 2010). Assim, no intuito de confirmar o não desenvolvimento de
imunossupressão em animais recém-nascidos, nós decidimos determinar se camundongos
recém-nascidos sobreviventes à sepse apresentam incremento da progressão tumoral quando
comparados com camundongos adultos. Para isso, os animais sobreviventes à sepse foram
inoculados com 5,0 x 104 células B16LucF10 subcutaneamente (s.c) e o crescimento tumoral
foi monitorado por 15 dias. No dia 7 após inoculação s.c das células tumorais, os
camundongos adultos sobreviventes à sepse apresentaram marcado crescimento tumoral,
avaliado pela intensidade de densidade tumoral (Figuras 17A-B). De maneira interessante,
camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse, não apresentaram mudanças na
densidade, nem no crescimento tumoral até o 15° dia após inoculação (Figura 17C).
Adicionalmente, em contraste com animais recém-nascidos sobreviventes à sepse, nós
observamos o aumento significativo na frequência das Tregs tanto no microambiente tumoral
como no baço de animais adultos (Figuras 18A-C), Este aumento na frequência das células
Tregs esteve associado com a diminuição na frequência das células T CD4+ e CD8+
produtoras de IFN-γ (Figuras 18D), subtipos celulares essenciais para o controle do
crescimento tumoral (Beatty e Paterson, 2001; Casares et al., 2003; Kim et al., 2006; Song et
al., 2007), no microambiente tumoral. Em conjunto, esses dados demonstram a ausência do
comprometimento da imunovigilância tumoral dependente de células T em animais recémnascidos sobreviventes à sepse, em parte resultado da não expansão das células Tregs.
101
Resultados
A
2.0
4
2
Radiancia X 10 (p/sec/cm /sr)
B
Sham
Sepse15d
*
1.5
1.0
0.5
0.0
R. Nascidos Adultos
1500
Sham R. Nascidos
R. Nascidos pós-sepse
Sham Adultos
Adultos pós-sepse
3
)
Volum e Tum oral (m m
C
1000
*
*
500
*
0
0
10
11
12
13
14
15
Dias após desafio tum oral
aumento no crescimento tumoral. Os camundongos submetidos à sepse foram tratados com
antibiótico por três dias. No 15º dia após a sepse, os animais adultos e recém-nascidos foram
inoculados via i.d. com 104 células B16Luc. Avaliação da densidade tumoral por IVIS (A),
por radianção (B) e curva de crescimento (C) em camundongos recém-nascidos e adultos
sobreviventes à sepse por paquímetro (coeficiente Pearson *p<0.05). Os dados são
apresentados como a média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
102
Resultados
B
D
*
15
10
5
10
5
0
0
R. Nascidos Adultos
20
+
+
% de células CD4 Foxp3
no baço
+
*
+
% de células CD4 Foxp3
(Tumor in situ)
20
30
Sham
Sepse15d
R. Nascidos Adultos
30
Sham
Sepse15d
20
+
15
+
25
Sham
Sepse15d
Sham
Sepse15d
% de células IFN- na gate CD4
(Tumor in situ)
C
% de células IFN- na gate CD8
(Tumor in situ)
A
*
10
0
R. Nascidos Adultos
*
10
0
R. Nascidos
Adultos
expansão das células TCD4+FoxP3+ (Tregs) no baço e no microambiente tumoral. Os
camundongos submetidos à sepse foram tratados com antibiótico por três dias. No 15º dia
após a sepse, os animais adultos e recém-nascidos foram inoculados via i.d. com 104 células
B16Luc. No 15° dia após inoculação da linhagem tumoral B16Luc, a frequência das células T
Reguladoras no tumor (A e C) e no baço (B e C) assim como as células T CD4+IFN-γ+ e T
CD8+IFN-γ+ no microambiente tumoral (D) foram avaliadas por FACS. Os dados são
apresentados como a média ± EPM de seis animais por grupo, *p<0,05.
103
Resultados
APRESENTAM AUMENTO NO NÚMERO DE MACRÓFAGOS M2
Recentes trabalhos do nosso grupo têm mostrado o papel dos macrófagos do perfil M2
no estabelecimento da imunossupressão após a sepse (Nascimento, 2012). Confirmando esses
dados, observamos um aumento significativo do número de macrófagos M2 no 15° dia após a
sepse nos camundongos adultos sobreviventes à sepse. De modo interessante, camundongos
recém-nascidos não apresentaram mudanças na frequência dos macrófagos do perfil M2
(Figura 19). O aumento na frequência dos macrófagos M2 nos adultos foi associado com a
diminuição da capacidade de killing bacteriano, quando comparados com os animais
controles. De maneira interessante, não foi observado aumento nas frequências desta
população de macrófagos nem diferenças significativas na capacidade de killing bacteriano
dos macrófagos provenientes de camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse (Figura
20).
104
Resultados
Sham
Sepse15d
*
40
+
Células F4/80 MR+ na
cavidade peritoneal
60
20
0
R. Nascidos
Adultos
Figura 19. Camundongos recém-nascidos sobreviventes á sepse letal não apresentam
aumento na frequência de macrófagos M2 na cavidade peritoneal. Os camundongos
recém-nascidos e adultos submetidos à sepse letal foram tratados com antibiótico por três
dias. As células da cavidade peritoneal foram coletadas para as análises. A porcentagem de
expressão de marcador de macrófagos tipo M2 (F4/80+MR+) em foi analisada em células da
cavidade peritoneal 15 dias após a sepse, por citometría de fluxo. Todos os resultados
correspondem às médias ± EPM de seis animais por grupo. *p< 0,05.
105
Resultados
(Log CFU/mL)
Bacteria
8
Sham R. Nascidos
Sham Adultos
Pós-sepse R. Nascidos
Pós-sepse Adultos
7
**
6
5
4
Figura 20. Macrófagos de camundongos recém-nascido sobreviventes à sepse não
apresentam mudanças na capacidade microbicida. Os camundongos recém-nascidos e
adultos submetidos à sepse letal foram tratados com antibiótico por três dias. As células da
cavidade peritoneal (1 x 106) foram coletadas e incubados com bactérias do conteúdo cecal (2
x 106) previamente opsonizadas com 10% de soro e incubados por 3 horas a 37oC. Após
incubação, as células foram lisadas e semeadas na diluição 10-4.Os resultados são expressos
como o logaritmo do UFC por ml. Todos os resultados correspondem às médias ± EPM de 35 animais por grupo. **p< 0,05.
106
Resultados
8.9
EXPERIMENTOS EM HUMANOS
8.9.2
CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS E CLÍNICAS DOS PACIENTES
PEDIÁTRICOS E ADULTOS SÉPTICOS
No presente estudo foram incluídos 27 pacientes, sendo 14 em idade adulta e 13 em
idade pediátrica. O grupo de pacientes adultos participantes do estudo teve predomínio de
homens sobre mulheres (85,72%), sendo a idade média total 62,5 anos (I.Q.R 48,5-71,5). O
valor médio do APACHE (do inglês, Acute Physiology and Chronic Health disease
Classification System II) (Knaus et al., 1985) foi de 18,29 (± 7,75) e do SOFA (do inglês,
Sequential Organ Failure Assessment) (Vincent et al., 1996) foi de 9,28 (± 4,93). Entre esses
pacientes houve uma frequência de óbito de 35,7%.
Em relação aos pacientes pediátricos, houve predomínio do sexo masculino sobre o
feminino (53,84%), com idade média total de 4,8 (± 5,58) anos. O valor médio de PRISM (do
inglês, Pediatric Risk of Mortality score) (Pollack et al., 1988)foi de 5,33 (± 3,14) e o do
PELOD (do inglês, Paediatric Logistic organ dysfunction) (Leteurtre et al., 2003) foi de 7,0
(± 5,4). Entre esses pacientes houve predomínio de óbitos, com 61,53% (Tabela 2).
107
Resultados
Tabela 2. Características demográficas e clínicas dos pacientes adultos e pediátricos sépticos.
IQR: interquartile range.
108
Resultados
8.9.3
PACIENTES
PEDIÁTRICOS
SOBREVIVENTES
Á
SEPSE
NÃO
APRESENTAM EXPANSÃO DAS CÉLULAS TREGS (CD4+FoxP3+)
Com o intuito de transladar os nossos resultados para humanos, PBMCs de pacientes
pediátricos e adultos sépticos (pacientes nos quais as amostras foram coletadas em até 24
horas após a inclusão) e pós-sépticos (sobreviventes à sepse), com os respectivos controles
saudáveis, foram coletadas e as células Tregs foram fenotipadas para os marcadores CD4 e
Foxp3, como previamente descrito (Materiais e Métodos 3.5.5). Confirmando os dados do
modelo experimental, pacientes adultos sobreviventes à sepse apresentaram aumento na
frequência e número absoluto da população de células Tregs (CD4+Foxp3+) circulantes,
resultados que estão de acordo com descrições prévias de frequências aumentadas de células
Tregs encontradas na sepse (Monneret et al., 2003; Seddiki et al., 2006; Venet et al., 2009).
De forma interessante, pacientes pediátricos sobreviventes à sepse não apresentaram expansão
periférica das células Tregs quando comparados com indivíduos saudáveis da mesma faixa
etária, sugerindo que o estabelecimento do quadro de imunossupressão, também em humanos,
é dependente da idade (Figura 21).
109
Resultados
4
0
Pediatricos
Adultos
+
8
+
*
3
+
*
4
2
Células TCD4 CD25 Foxp3
5
(x 10 ) no sangue
12
+
+
B
Voluntarios saudaveis
Pacientes pós-septicos
+
Células TCD4 CD25 Foxp3 (%)
A
*
*
Pediatricos
Adultos
1
0
C
Figura 21. Pacientes pediátricos sobreviventes à sepse não apresentam expansão das
células TCD4+FoxP3+ (Tregs). (A e B) o sangue periférico de pacientes com sepse (n=13 e
14 para pacientes pediátricos e adultos, respectivamente) e de controles sadios (n=8 e 14
pediátricos e adultos, respectivamente) e de pacientes pediátricos e adultos sobreviventes à
sepse (n=5 e 8, respectivamente) foram coletados e a fracção do PBMC foi isolada para
avaliar a frequência das células T Reguladoras por FACS. A porcentagem (A), o número
absoluto (B) e o Dot plot representativo das populações (C) são apresentados, *p<0,05.
110
Resultados
8.9.4
AS
CÉLULAS
SOBREVIVENTES
TREGS
Á
DE
SEPSE
PACIENTES
MANTÊM
SUA
PEDIÁTRICOS
CAPACIDADE
SUPRESSORA
No intuito de avaliar a capacidade funcional das células Tregs, o ensaio de supressão
in vitro foi realizado. Brevemente, as células TCD4+CD25+ isoladas do sangue de pacientes
pediátricos sobreviventes à sepse e de voluntários saudáveis foram co-cultivadas com células
TCD4+CD25- de indivíduos saudáveis por quatro dias, como previamente descrito (Materiais
e Métodos 3.5.6). De maneira semelhante aos resultados obtidos no modelo experimental, nós
demostramos que células Tregs isoladas de pacientes pediátricos pós-sépticos não
apresentaram alterações significativas na sua capacidade supressora (Figura 22).
111
Proliferação de células TCD4+CD25(%)
Resultados
80
60
40
20
0
s
Re
s
Re
+
eg
Tr
)
:1
(1
s
Re
+
eg
Tr
)
:2
(1
s
Re
+
eg
Tr
)
:4
(1
s
Re
+
eg
Tr
)
:8
(1
s
Re
+
eg
Tr
6)
:1
(1
Figura 22. Capacidade supressora das células T Reguladoras é mantida em pacientes
pediátricos sobreviventes à sepse. (A e B) o sangue periférico de pacientes pediátricos
sobreviventes a sepse e de voluntários sadios foram coletadas, as células TCD4+CD25+
(Tregs) e TCD4+CD25- (Tregs) foram marcadas com 1 μM Dye Efluor 670 (eBioscience) por
15 minutos, a 37 °C, lavadas e cultivadas (1 x105 células per poço) por quatro dias com um
número gradual de células Tregs (Teff:Tregs: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8...) na presença de α-CD3 (3
μg/mL) e α-CD28 (1,5 μg/mL). A proliferação celular foi determinada pela diluição do dye e
analisada por FACS.
112
Resultados
8.9.5
PACIENTES
PEDIÁTRICOS
SOBREVIVENTES
Á
SEPSE
NÃO
APRESENTAM AUMENTO NAS CONCENTRAÇÕES DA IL-33 E DA
IL10
Uma vez que, dados experimentais recentes do nosso grupo têm mostrado o papel das
citocinas do tipo 2 (IL-4, IL10) e da IL-33 na ativação alternativa de macrófagos M2, e o
posterior estabelecimento do quadro de imunossupressão (Nascimento, 2012), nós avaliamos
a produção destas citocinas (IL-33 e IL-10) em amostras de plasma de pacientes pediátricos
sobreviventes à sepse. De maneira interessante, como demostrado na Figura 23, pacientes
pediátricos sobreviventes à sepse não apresentaram diferenças significativas nos níveis séricos
de ambas as citocinas no plasma. Desse modo, esse conjunto de dados, tanto no modelo
experimental quanto em pacientes, demostram pela primeira vez que a disfunção imune
associada com a sepse e o desenvolvimento da imunossupressão são dependentes da idade.
113
Resultados
250
Voluntarios saudaveis B
40
200
150
100
50
0
A
30
20
10
*
0
Figura 23. Pacientes pediátricos sobreviventes á sepse não apresentam elevação nas
concentrações de IL-33 e IL10. O plasma de pacientes pediátricos sobreviventes a sepse e de
voluntários sadios foram coletados e a quantificação da IL-33 (A) e da IL-10 (B) foi avaliada
por ELISA. Os dados são apresentados como a média ± EPM de seis pacientes pós-sépticos e
oito voluntários sadios, *p<0,05.
114
Discussão
.
Discussão
Discussão
5. DISCUSSÃO
Sepse é uma resposta inflamatória sistêmica decorrente de uma infecção caracterizada
por lesão tecidual, apoptose e disfunção orgânica (Angus e Van Der Poll, 2013), que pode
evoluir para um quadro de imunossupressão (Wang e Deng, 2008). Uma preocupação especial
na imunossupressão decorrente da sepse é a persistência desta condição. De fato, estudos
demonstram que pacientes sobreviventes à sepse são susceptíveis à infecções secundárias em
até cinco anos subsequentes ao quadro séptico (Perl et al., 1995). Nosso grupo de pesquisa
demonstrou que animais sobreviventes à sepse são susceptíveis à infecção secundária
oportunista durante meses após a resolução da sepse, evento associado com o aumento da
frequência e número de células T Reguladoras (Tregs) no baço (Nascimento et al., 2010). No
entanto, estes achados foram descritos em humanos e camundongos adultos, porém, ainda não
existiam estudos mostrando o estabelecimento da imunossupressão no contexto da sepse
neonatal. Deste modo, o presente estudo realizou importantes demonstrações neste contexto
utilizando tanto modelo experimental de sepse quanto amostras de pacientes pediátricos e
adultos sobreviventes à sepse.
Na primeira parte do estudo, nós demonstramos que camundongos de duas semanas de
idade (recém-nascidos) submetidos à sepse apresentam deficiências nas funções
antimicrobianas mediadas pela resposta imune inata, caracterizada pela menor migração de
PMN in vivo e in vitro, e diminuição da atividade bactericida, o qual determinou uma maior
susceptibilidade à sepse experimental, caracterizada por uma intensa resposta inflamatória
associada com um maior comprometimento multiorgânico, Na segunda parte, nós verificamos
que animais recém-nascidos sobreviventes à fase aguda da sepse, de maneira oposta aos
animais de oito semanas de idade (adultos), apresentam diminuição na população das células
Tregs, fenômeno também observado em pacientes pediátricos sobreviventes à sepse.
116
Discussão
Adicionalmente, demonstramos que animais recém-nascidos que sobrevivem à sepse não
apresentam aumento da diferenciação de macrófagos M2. Finalmente, em consonância com a
diminuição nas células Tregs, nós verificamos que camundongos recém-nascidos pós-sépticos
apresentam resistência à infecção secundária e ausência do comprometimento da
imunovigilância tumoral dependente de células T.
O desenvolvimento da SIRS durante a sepse é, muitas vezes, acompanhado de uma
resposta anti-inflamatória compensatória (CARS, resposta anti-inflamatória compensatória
sistêmica), caracterizada pela liberação de um conjunto de citocinas imunoreguladoras (AdibConquy e Cavaillon, 2009). O desequilíbrio e o favorecimento da SIRS resultam em lesão
tecidual, falência múltipla de órgãos e morte do hospedeiro (Dinarello, 1997). Trabalhos na
literatura demonstram o papel da CARS na proteção dos efeitos pró-inflamatórios mediados
pela SIRS durante o quadro de sepse, visto que a neutralização de citocinas do tipo 2, como a
IL-4, IL-13 e IL-10, aumentou a mortalidade de animais submetidos à sepse, resultado de um
aumento da resposta inflamatória sistêmica e lesão tecidual (Van Der Poll et al., 1995; Walley
et al., 1996). Deste modo, a produção de citocinas do tipo 2 funciona como potente
imunomodulação na proteção da fase efetora da sepse, no entanto, a persistência desta
resposta anti-inflamatória pode levar ao desenvolvimento de um quadro de imunossupressão
após a resolução da resposta inflamatória sistêmica (Kox et al., 2000; Adib-Conquy e
Cavaillon, 2009).
Embora tenha sido bem descrito que o sistema imune inato e adaptativo de neonatos e
crianças seja caracterizado por um status imaturo, o que leva a uma maior susceptibilidade
para o desenvolvimento da sepse (Adkins et al., 2004; Levy, 2007; Prabhudas et al., 2011;
Sharma et al., 2012), o sistema imune neonatal não tem sido bem caracterizado. Portanto, na
primeira parte do presente estudo, decidimos elucidar o papel da idade durante a fase aguda
117
Discussão
da sepse. Para isto, padronizamos um modelo experimental de sepse onde uma suspensão
bacteriana isolada do ceco de camundongo de seis semanas de idade foi administrada por via
intraperitoneal em camundongos adultos (oito semanas de idade) e recém-nascidos (duas
semanas de idade).
Corroborando as observações epidemiológicas da sepse neonatal (Watson e Carcillo,
2005), verificamos que camundongos recém-nascidos apresentam uma susceptibilidade
significativamente maior que os camundongos adultos, apresentando 100% de mortalidade 48
horas após indução da sepse. Adicionalmente, avaliamos os marcadores de lesão de função
orgânica, aspartato-aminotransferase (AST), CK-MB e Ureia (BUN). Os resultados sugerem
que
camundongos
recém-nascidos
submetidos
à
sepse
apresentam
um
maior
comprometimento multiorgânico. Estas observações foram confirmadas por análises
histopatológicas do fígado e do pulmão. Também verificamos que o aumento da mortalidade
de camundongos neonatos não é resultante de diferenças fenotípicas das populações
leucocitárias do baço, linfonodo e do sangue periférico.
De maneira interessante, observamos que camundongos recém-nascidos submetidos à
sepse apresentam um quadro de resposta inflamatória mais acentuado, caracterizado por
níveis maiores de citocinas pró-inflamatórias sistêmicas, como IL-6, TNF-α e IL-1β.
Diferentemente, estudos realizados em animais e humanos recém-nascidos, demonstraram
redução significativa nos níveis das citocinas pró-inflamatórias em comparação com
indivíduos adultos (Lee et al., 1996; Wynn et al., 2007b; Kollmann et al., 2009). Porém, a
diferença entre os dados pode ser devido ao fato destes estudos terem utilizado camundongos
recém-nascidos com idades diferentes daquelas utilizadas em nossos experimentos (quatro e
sete dias de idade).
118
Discussão
Adicionalmente, Angelone e colaboradores (2006), demostraram que monócitos
isolados do cordão umbilical e estimulados com diferentes agonistas para os receptores TLRs
incluindo, poli dl:dC (TLR3), lipopolisacarido (LPS), flagelina (TLR5) e CpG (TLR9), foram
caracterizados por maior produção de IL-6 e TNF-α comparado com monócitos isolados de
indivíduos adultos (Angelone et al., 2006). Corroborando nossos achados, Vandel Eijnden e
colaboradores (2006), verificaram que células dendríticas e monócitos isolados de crianças
apresentaram uma maior capacidade de produção de IL-23 e IL-12 do que APCs isoladas de
indivíduos adultos, quando estimuladas com LPS.
Uma vez que o controle da carga bacteriana é fundamental para a melhora da sepse
(Sansonetti, 2001), nós investigamos o clearance bacteriano em animais recém-nascidos e
adultos submetidos à sepse. Para isso, as quantidades de bactérias viáveis no sangue e no
lavado peritoneal foram avaliadas seis horas após a indução da sepse. Os resultados
demonstraram que camundongos recém-nascidos apresentam um aumento significativo na
contagem de bactérias no sague e lavado peritoneal quando comparados com camundongos
adultos submetidos à sepse. Neste sentido, consistente com a alta susceptibilidade à sepse,
camundongos recém-nascidos submetidos à sepse apresentam uma menor capacidade de
clearence bacteriano e, consequentemente, menor capacidade de controle do processo
infeccioso.
Geralmente, neonatos e crianças são mais susceptíveis do que os adultos a um amplo
número de infeções, especialmente infeções associadas aos patógenos intracelulares (Siegrist,
2001; Adkins et al., 2004). Este aumento na susceptibilidade às infeções tem sido atribuído às
deficiências tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa, particularmente o “status”
imaturo da resposta imune adaptativa, devido à pouca exposição antigênica dos neonatos
durante a fase intrauterina (Siegrist, 2001; Prabhudas et al., 2011).
119
Discussão
Além da pouca quantidade de células T de memória efetora (CD45RA-CD45RO+) e
células B de memória (CD27+), um grande número de células T e B imaturas é encontrado na
circulação durante a infância (Haines et al., 2009; Opiela et al., 2009). Neste caso, as células
T imaturas apresentam defeitos na polarização para um perfil Th1, enquanto que as células B
imaturas são menos efetivas na produção de anticorpos. Portanto, a predominância destes
fenótipos imaturos contribui para a alta susceptibilidade dos neonatos e crianças às infeções.
Ademais, o sistema imune adaptativo dos neonatos é caracterizado por defeitos na atividade
das células NK, pouca resposta das células TCD4+, reduzida resposta de anticorpos e
diminuição na expressão de MHC classe II nas células apresentadoras de antígeno (Adkins et
al., 2004; Levy, 2007; Siegrist e Aspinall, 2009; Marcoe et al., 2012). Embora as deficiências
na resposta imune adquirida já tenham sido descritas, a resposta inata no contexto da sepse
neonatal, em particular a resposta de fagócitos e neutrófilos, tem sido pouco estudada.
Os macrófagos e os polimorfonucleares (PMNs) representam a primeira linha de
defesa do hospedeiro contra um patógeno. Tem sido demonstrado, em modelos de sepse
polimicrobiana, que o influxo de PMN da circulação para o foco infecioso é um evento
importante para a eliminação dos patógenos (Zantl et al., 1998; Nathan, 2006; Alves-Filho et
al., 2010). Portanto, um recrutamento deficiente ou reduzido dos PMNs para o foco infecioso
poderia explicar, ao menos em parte, a menor capacidade de clearance bacteriano e a marcada
susceptibilidade à sepse experimental observada nos animais recém-nascidos. No presente
estudo, nós verificamos que, em resposta à sepse, uma marcada quantidade de neutrófilos é
rapidamente recrutada na cavidade peritoneal de camundongos adultos. Porém, camundongos
recém-nascidos apresentam uma diminuição significativa na migração dos neutrófilos in vivo,
fenômeno também observado in vitro sob o estímulo quimiotático de fMLP e CXCL2 (MIP2).
120
Discussão
Durante uma infecção, os leucócitos precisam transmigrar do sangue periférico para o
local de inflamação através do endotélio vascular. Este processo é dependente do rolamento e
adesão dos neutrófilos ao endotélio bem como da expressão de integrinas na superfície destes
neutrófilos (Langereis, 2013). Nossos resultados demonstraram que leucócitos de animais
recém-nascidos naives apresentam uma redução significativa nos mecanismos de rolamento e
de adesão ao endotélio em vênulas mesentéricas. No entanto, esta diminuição no influxo de
neutrófilos e na sua capacidade de rolamento e de adesão não foi ocasionada por uma
diminuição sistêmica da população de PMN ou pela menor produção de MIP-2 no local da
infecção.
Tem sido amplamente descrito que o recrutamento dos neutrófilos é dependente da
atividade do receptor de quimiocina CXCR2. A expressão reduzida deste receptor em
neutrófilos circulantes está associada com a inabilidade dos neutrófilos em migrar para o foco
infeccioso (Cummings et al., 1999; Rios-Santos et al., 2007). De maneira interessante, nós
demostramos que neutrófilos circulantes de camundongos recém-nascidos apresentam uma
maior expressão constitutiva do CXCR2 comparada com os camundongos adultos, sugerindo
que possíveis alterações na cascata intracelular do receptor, e não em seu nível de expressão,
possam ser responsáveis pelos defeitos na migração durante a sepse. Consistente com este
dado, neutrófilos e macrófagos de camundongos recém-nascidos apresentam redução em
processos essenciais para o controle da infecção tais como, capacidade fagocítica, killing
bacteriano e produção de espécies reativas, culminando em aumento da contagem bacteriana
no sangue e na cavidade peritoneal. Estes dados demonstram que apesar da exacerbada reação
inflamatória em resposta à sepse polimicrobiana em camundongos recém-nascidos, a resposta
antimicrobiana mediada pela imunidade inata é deficiente e, portanto, menos eficaz.
121
Discussão
A ativação dos neutrófilos está associada com a liberação tanto de espécies reativas de
oxigênio (ROS), via NADPH oxidase, quanto do conteúdo dos grânulos citoplasmáticos
(proteases, peroxidasses e outros mediadores inflamatórios) responsáveis pelo controle dos
patógenos (Edberg et al., 1995). A maioria dos receptores presentes nos neutrófilos induz o
influxo do cálcio extracelular, o que tem sido considerado importante para as funções efetoras
do neutrófilo, tais como, a migração via polimerização dos filamentos de actina, a fagocitose,
a maturação do fagolisossoma e a degranulação (Steinckwich et al., 2007; Nunes e Demaurex,
2010; Nauseef e Borregaard, 2014). No contexto neonatal, estudos realizados por Zhang e
colaboradores (2013), utilizando o modelo de sepse neonatal experimental, demostraram que
macrófagos peritoneais isolados de camundongos neonatos (duas semanas de idade)
apresentam defeitos na maturação do fagolisossoma após a fagocitose de bactérias Grampositivas (S. aureus) e Gram-negativas (S. typhimurium). Adicionalmente, em nosso estudo
verificamos que neutrófilos isolados de camundongos recém-nascidos apresentam um
comprometimento na ativação de vias intracelulares dependentes de cálcio quando
estimulados com fMLP 10-7M e LTB4 10-5M, comparados com camundongos adultos.
Em suma, nossos resultados desta primeira fase do trabalho corroboram e
complementam aqueles existentes na literatura sobre o efeito da idade na resposta imune
durante o desenvolvimento da sepse, revelando que camundongos recém-nascidos apresentam
deficiência nas funções antimicrobianas mediadas pela resposta imune inata, caracterizada por
uma menor migração de PMN in vivo, menor capacidade quimiotática in vitro, pouca
atividade bactericida e menor mobilização de cálcio intracitoplasmático, o que leva a uma
maior susceptibilidade à sepse experimental. No entanto, ainda não existem estudos clínicos
nem experimentais demostrando a participação da idade no desenvolvimento da
122
Discussão
imunossupressão induzida pela sepse. Desta forma, investigamos a influência da idade do
hospedeiro em uma fase tardia após a sepse.
Nesta fase, os animais sobreviventes à sepse não apresentam mais resquícios da
infecção primária, porém são mais susceptíveis a uma infecção oportunista ou ao
desenvolvimento de tumores (Venet et al., 2008; Cavassani et al., 2010; Nascimento et al.,
2010). O estado de imunossupressão dos animais na fase tardia após a sepse foi avaliado por
meio de um modelo de infecção secundária (Nascimento et al., 2010) e por um desafio
tumoral com uma linhagem celular de melanoma (células B16LucF10). A gravidade da fase
aguda da sepse está direta e proporcionalmente relacionada ao desenvolvimento da
imunossupressão, uma vez que um estímulo infeccioso subletal não é capaz de desencadear
uma imunossupressão tardia (Nascimento et al., 2010)
Entre os microrganismos Gram-negativos, a Pseudomonas aeruginosa é responsável
por
quadros
de
pneumonia
graves
em
humanos,
especialmente
em
indivíduos
imunocomprometidos (Guidelines for the management of adults with hospital-acquired,
ventilator-associated, and healthcare-associated pneumonia; Yang et al., 2010). Portanto,
usando um modelo de “two hits”, nós utilizamos este patógeno para avaliar o
desenvolvimento de imunossupressão e possíveis disfunções imunes nos camundongos
recém-nascidos e adultos sobreviventes á sepse. Observamos que animais adultos submetidos
à sepse 15 ou 30 dias antes de serem infectados intranasalmente com P. aeruginosa
apresentam 100% de mortalidade no 6° dia após a infecção secundária. No entanto,
camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse quando infectados com P. aeruginosa
apresentam uma sobrevida de cerca de 80% até o 10o dia após a infeção, sobrevida similar à
encontrada nos animais adultos e recém-nascidos Sham infectados com P. aeruginosa.
123
Discussão
Corroborando os dados da sobrevida, a avaliação da carga bacteriana mostrou que os
animais adultos sobreviventes à sepse apresentam maiores quantidades de UFC de P.
aeruginosa no local da infeção quando comparados com seu respectivo grupo Sham infectado.
Porém, camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse não apresentaram aumento
significativo da carga bacteriana, mostrando um perfil similar a seu respectivo grupo Sham
infectado. Desta forma, embora os camundongos recém-nascidos apresentem uma maior
susceptibilidade durante a fase aguda da sepse, na fase tardia nós demostramos, pela primeira
vez, que camundongos recém-nascidos são resistentes à infecção secundária e, portanto, não
desenvolvem um estado de imunossupressão pós-sepse. Assim, nós procuramos investigar
quais mecanismos poderiam contribuir para esta resistência à infecção secundária entre os
camundongos recém-nascidos sobreviventes à sepse.
Relatos da literatura mostram, inequivocamente, que a imunossupressão induzida pela
sepse está associada à disfunção das células T CD4+ (Scumpia et al., 2007; Nascimento et al.,
2010). De fato, as células T CD4+, provenientes de animais ou pacientes sépticos,
demonstram uma reduzida capacidade proliferativa e produção de IL-2 e IFN-γ após serem
estimuladas com anti-CD3 (Scumpia et al., 2007). Além disso, o comprometimento da
proliferação e função das células T CD4+ na sepse está associado com a repressão de eventos
de metilação da histona (Carson et al., 2010; Carson et al., 2011).
Ademais, uma possível explicação para o comprometimento da resposta das células T
CD4+ poderia estar na viabilidade dessas células. Dados da literatura sugerem que a apoptose
está relacionada à imunossupressão (Hotchkiss et al., 2005). A morte celular durante a sepse
já foi amplamente descrita e, atualmente, é considerada um fenômeno importante. Apesar de
necrose e apoptose estarem ocorrendo simultaneamente durante a sepse, a forma
predominante de morte celular é a apoptose (Hotchkiss et al., 2005; Hotchkiss e Nicholson,
124
Discussão
2006). No entanto, já foi demonstrado que o comprometimento das células T CD4+ não se
deve a apoptose celular (Scumpia et al., 2007; Nascimento et al., 2010). Ainda, foi
demonstrado que as células T CD4+ apresentam uma diminuição da expressão de CD3ζ, o
principal regulador do TCR, acompanhada de uma possível disfunção destes receptores
(Scumpia et al., 2007). O comprometimento de células T CD4+, com reduzida expressão do
CD3, em outras patologias tais como infecções, inflamações, doenças autoimunes e doenças
malignas, já foi relatado e sugere-se que possa ocorrer em resposta às células T autoreativas e
às células efetoras no sitio do dano tecidual (Baniyash, 2004).
Em condições de inflamação crônica ou stress, muitos fatores têm sido atribuídos para
a indução da anergia nas células T efetoras, incluindo TNF-α (Isomaki et al., 2001), stress
oxidativo (Otsuji et al., 1996), depleção de arginina e células supressoras mielóides
(Rodriguez et al., 2004). A exposição aguda a agentes que causam stress oxidativo pode
também reduzir a expressão da cadeia do CD3ζ em células T (Otsuji et al., 1996). Isto nos
leva à hipótese de que a exacerbada liberação de citocinas e o burst oxidativo, comuns na fase
inicial da sepse ou da resposta inflamatória sistêmica, possam ser fundamentais para o
desenvolvimento de células T anérgicas, possivelmente como um mecanismo de
autoregulação ou um efeito colateral indesejável da disfunção imune induzida pela sepse.
No entanto, outros estudos sugerem que as células Tregs sejam responsáveis por este
comprometimento das células T CD4+, visto que as células Tregs são potentes supressoras da
proliferação e função das células T (Shevach, 2009; 2011). Embora as células Tregs
constituam uma pequena porcentagem da população total de linfócitos T, estas células
apresentam potentes propriedades imunoreguladoras sobre os mecanismos de ativação celular
associados com a disfunção imune adaptativa observada na sepse (Nascimento et al., 2010).
Adicionalmente, o aumento na frequência de células Tregs no sangue e baço tem sido
125
Discussão
reportado durante a fase inicial da sepse, tanto em modelos experimentais quanto em
pacientes com sepse. Além disso, há uma correlação entre este aumento na frequência das
células Tregs com o prognóstico de sobrevivência em longo prazo, após a resolução da sepse
(Monneret et al., 2003; Scumpia et al., 2006; Venet et al., 2008; Venet et al., 2009). Estudos
recentes também demonstraram que as células Tregs apresentam um aumento na capacidade
supressora das células T em animais sépticos (Scumpia et al., 2006; Cavassani et al., 2010).
Além disso, nosso grupo de pesquisa demonstrou recentemente que as células Tregs estão
envolvidas no comprometimento das células T CD4+ e na susceptibilidade às infecções
secundárias (Nascimento et al., 2010).
Embora existam importantes referências do papel das células Tregs na fase tardia da
sepse, ainda não foi descrito se estes fenômenos ocorrem no contexto da sepse pediátrica. Os
dados obtidos no presente estudo demonstram que células TCD4+ isoladas de camundongos
adultos sobreviventes á sepse apresentam uma capacidade reduzida de proliferação em
resposta a um estímulo policlonal (CD3 e CD28), como previamente reportado por nosso
grupo. No entanto, células TCD4+ isoladas de camundongos recém-nascidos sobreviventes à
sepse não apresentam comprometimento da capacidade proliferativa, sugerindo que poderia
haver alteração no número de Tregs nestes grupos de animais.
Corroborando estes achados, nós verificamos o aumento das células Tregs do baço de
camundongos adultos sobreviventes à sepse, porém observamos a redução deste subtipo
celular no baço de camundongos recém-nascidos 15 dias após a sepse. Portanto, nós
sugerimos que a incapacidade de expansão de células Tregs durante a sepse pode estar
relacionada com a resistência à infecção secundária, com o não comprometimento da
capacidade proliferativa das células TCD4+ e com o não desenvolvimento de
imunossupressão, todos estes, fenômenos observados em camundongos recém-nascidos
126
Discussão
sobreviventes à sepse. De modo complementar, nós demostramos que é a subpopulação de
células
iTregs
(CD4+CD25+Foxp3+neuropilina-)
e
não
de
células
nTregs
(CD4+CD25+Foxp3+neuropilina+), a responsável pela expansão da população total de Tregs
no baço de camundongos adultos sobreviventes à sepse.
Além do aumento do número de células Tregs, alterações de suas funções podem ser
determinantes na geração de quadros de imunossupressão. Cavassani e colaboradores (2010)
demonstraram que células Tregs induzidas três ou 15 dias após do início da sepse possuem
maior atividade supressora comparadas com células Tregs isoladas de animais controles. A
partir de purificação de células Tregs de animais previamente submetidos à sepse,
identificamos que a capacidade supressora destas células, oriundas tanto de camundongos
recém-nascidos quanto de pacientes pediátricos sobreviventes à sepse, foi preservada. Este
achado nos permite sugerir que a falha de expansão no número das células Tregs, e não o
comprometimento de sua capacidade supressora, está implicada no não desenvolvimento da
imunossupressão pós-sepse neste grupo.
O microambiente imunossupressor mediado pelas células Tregs promove o
crescimento tumoral (Kim et al., 2006). Cavassani e colaboradores (2010), utilizando um
modelo tumoral por inoculação subcutânea da linhagem celular LLC (Lewis lung carcinoma)
em camundongos pós-sépticos, demonstraram que o incremento da massa tumoral nestes
animais está relacionado com a capacidade das células Tregs para suprimir a resposta
antitumoral mediada pelas células TCD8 (Cavassani et al., 2010). Assim, confirmando os
dados da infecção secundária, nós verificamos que camundongos recém-nascidos
sobreviventes à sepse e inoculados com a linhagem tumoral de melanoma B16F10Luc10
apresentam uma capacidade defectiva de expansão de células Tregs no microambiente
127
Discussão
tumoral em contraste com os animais adultos pós-sépticos, tornando o ambiente menos
favorável para o crescimento tumoral.
Adicionalmente, sabendo que a produção de IFN-γ é essencial para o controle do
crescimento tumoral (Beatty e Paterson, 2001; Casares et al., 2003; Song et al., 2007), nós
observamos que a expansão das células Tregs no microambiente tumoral de camundongos
adultos pós-sépticos está associada com uma diminuição significativa das populações TCD8+
e CD4+ produtoras de IFN-γ no microambiente tumoral. Coletivamente, estes dados
demonstram que embora os camundongos recém-nascidos apresentem uma maior
susceptibilidade na fase aguda da sepse, a expansão das células Tregs e o posterior
desenvolvimento da imunossupressão não ocorre nestes animais, mostrando que este quadro é
dependente da idade do hospedeiro.
Recentemente, nosso grupo demonstrou que após a sepse ocorre ativação alternativa
de macrófagos, com excessivo aumento da frequência de macrófagos M2 em diferentes
tecidos linfóides ou não linfóides, como possível reflexo do reparo tecidual das lesões
decorrentes da sepse. Este evento foi dependente de citocinas como a IL-4, IL-13 e IL- 33,
contribuindo para o aumento de IL-10 e TGF-β no pulmão dos animais sobreviventes à sepse
(Nascimento, 2012). Relatos da literatura mostram que Tregs podem ser induzidas na
presença de outras células, como os macrófagos M2 (Weber et al., 2007), bem como estes
macrófagos podem ser induzidos pelas células Tregs (Biswas e Mantovani, 2010). Assim, a
cooperação entre estes tipos celulares contribui para a amplificação da produção de citocinas
imunoreguladoras, tais como IL-10 e TGF-β, e para o desenvolvimento da imunossupressão
após sepse.
Portanto, sabendo do importante papel dos macrófagos de perfil M2 na diferenciação
das células Tregs, nós avaliamos a frequência desta subpopulação celular na cavidade
128
Discussão
peritoneal de camundongos adultos e recém-nascidos sobreviventes à sepse. De fato, nós
verificamos que animais adultos sobreviventes à sepse apresentam expansão dos macrófagos
M2 no lavado peritoneal, enquanto que este aumento não foi observado em camundongos
recém-nascidos. Ainda, o aumento na frequência dos macrófagos M2 em animais adultos foi
correlacionado com a redução na capacidade de killing bacteriano neste grupo experimental.
Portanto, é plausível que fatores inerentes à diferenciação periférica de células T CD4+
convencionais em células Tregs, e não em Macrófagos M2, possam contribuir para a falha de
expansão de Tregs observada em animais recém-nascidos sobreviventes à sepse.
Com o intuito de reproduzir os nossos resultados em pacientes humanos, amostras do
sangue de pacientes pediátricos e adultos com sepse e pós-sepse (com seus respectivos
controles saudáveis) foram coletadas. Confirmando os dados do modelo experimental,
pacientes adultos sobreviventes à sepse apresentam aumento na frequência e número absoluto
da população de células Tregs (CD4+Foxp3+) circulantes. Estes dados são coerentes com os
achados prévios de frequências aumentadas de células Tregs observadas após sepse
(Monneret et al., 2003; Seddiki et al., 2006; Venet et al., 2009). Entretanto, de modo similar
ao observado na sepse experimental, pacientes pediátricos sobreviventes à sepse não
apresentaram expansão das células Tregs circulantes nem comprometimento na sua
capacidade supressora. Também observamos que a expansão das células Tregs, e não
alterações na sua atividade, é determinante para o desenvolvimento de imunossupressão em
adultos, confirmando nossos achados da sepse experimental.
Nosso grupo demonstrou recentemente que o incremento das citocinas do perfil Th2,
principalmente a IL-10 e a IL-33, no período pós-sepse é essencial na polarização de
macrófagos M2, na diferenciação de células Tregs e no estabelecimento da imunossupressão
(Nascimento, 2012). De forma interessante, nós observamos a diminuição nos níveis séricos
129
Discussão
destas duas citocinas em amostras obtidas de pacientes pediátricos sobreviventes à sepse, o
que reforça o não estabelecimento da imunossupressão pós-sepse tanto no modelo
experimental quanto em pacientes humanos. Poucos estudos avaliando o quadro de
imunossupressão foram conduzidos em pacientes pediátricos ou em modelos experimentais
com camundongos neonatos após a resolução da sepse. Informações disponíveis em trabalhos
de caráter epidemiológico apontam, de maneira indireta, para consequências distintas no
sistema imune de crianças após o desenvolvimento de sepse. Neste sentido, estudos feitos por
Wynn e colaboradores (2007), utilizando modelo de injeção intraperitoneal de suspensão de
“cecal slurry”, mostraram que camundongos neonatos (cinco a sete dias de idade) quando
submetidos à sepse apresentam um aumento na porcentagem de células CD4+CD25+Foxp3+
no baço, 24 horas após do início da sepse
Entretanto, neste estudo os autores não
fenotipicaram as células Tregs em períodos mais longos após o início da sepse ou fizeram
avaliações acerca das consequências funcionais decorrentes da variação nas frequências
destas células, como o possível desenvolvimento de imunossupressão e a susceptibilidade às
infecções secundárias.
Adicionalmente, Wang e colaboradores (2010) avaliaram a diferenciação de células
Tregs a partir de células TCD4+ isoladas do timo e baço de camundongos com quatro ou seis
dias de vida e demonstraram que, independentemente do tipo de estímulo e sem a adição
exógena de TGF-β mais de 70% das células TCD4+Foxp3- neonatais se diferenciam em
células TCD4+Foxp3+. Porém, somente 10% das células TCD4+Foxp3- isoladas de
camundongos adultos (oito semanas de idade) se diferenciam em células TCD4+Foxp3+ sob
as mesmas condições. Embora a alta capacidade de diferenciação das células TCD4+
provenientes de camundongos recém-nascidos em células Tregs observadas neste estudo, os
autores deste trabalho também descreveram que a capacidade de diferenciação de células
130
Discussão
TCD4+Foxp3- em TCD4+Fox3+ diminui com o avanço da idade. Assim, amostras de animais
com duas semanas de vida apresentaram a mesma capacidade de diferenciação de células
TCD4+Foxp3- em TCD4+Foxp3+ quando comparadas com amostras de células isoladas de
animais adultos (Wang et al., 2010).
Dessa forma, nós acreditamos que as consequências da sepse na população de células
Tregs em animais recém-nascidos, observadas no presente estudo, possam ser devido a
alterações das vias de sinalização relacionadas com a diferenciação periférica de células
Tregs.
Os mecanismos que dirigem a diferenciação extra-tímica das células Tregs em
condições de homeostase ou de doença têm sido amplamente estudadas. A secreção de
citocinas, especialmente IL-10, pelas células dendriticas (Manicassamy et al., 2009), a
sinalização do TCR, a densidade e afinidade de ligação do peptídeo-MHC ao TCR
(Kretschmer et al., 2005; Mucida et al., 2005; Gottschalk et al., 2010), a ativação sub-ótima
da molécula CD28 (Zheng et al., 2006; Guo et al., 2008; Semple et al., 2011), a sinalização
dependente da IL-2 (Davidson et al., 2007; Zheng et al., 2007; Yu et al., 2009; Chapman e
Chi, 2014; Huynh et al., 2015; Ray e Craft, 2015) e a sinalização via TGF-β (Chen et al.,
2003; Kretschmer et al., 2005; Mucida et al., 2005; Tone et al., 2008; Josefowicz et al., 2009;
Zheng et al., 2010), são eventos fundamentais para a diferenciação periférica das células T
CD4+ convencionais em células iTregs Foxp3+ in vitro.
Adicionalmente, foi demonstrado o papel da regulação epigenética no controle da
expressão gênica de Foxp3. Umas das consequências da diferenciação das células TCD4+
convencionais em células Tregs é a regulação epigenética do lócus Foxp3 (Huehn et al.,
2009). De fato, este lócus gênico apresenta uma forte associação com histonas metil e
acetiltransferases nas células Tregs, sugerindo a forte regulação por fenômenos epigenéticos
131
Discussão
desta população celular (Mantel et al., 2006; Kim e Leonard, 2007). Embora, nos últimos
anos, vários estudos tenham mostrado evidências da presença de mudanças epigenéticas
específicas relacionadas com a idade (Martino et al., 2011; Wang et al., 2012), o perfil
epigenético em células Tregs neonatais ainda não foi estudado. Neste sentido, é plausível que
alterações inerentes da via de sinalização de TCR/CD28 e/ou IL2 e/ou TGF-β ou
modificações epigenéticas no lócus gênico do Foxp3 possam estar envolvidas com a falha de
expansão de células Tregs em indivíduos recém-nascidos sobreviventes à sepse.
132
Conclusão
133
Conclusão
6. CONCLUSÃO
Nossos dados demonstram que, embora a fase aguda da sepse em camundongos
recém-nascidos esteja caracterizada por uma maior resposta pró-inflamatória, alterações
inerentes às células da resposta imune inata predispõem este grupo a uma maior
susceptibilidade à sepse experimental. No entanto, nós demonstramos que estes indivíduos
não desenvolvem imunossupressão pós-sepse, caracterizada pela defectiva capacidade de
expansão de células Tregs e macrófagos do perfil alternativo M2. De fato, indivíduos recémnascidos foram resistentes tanto à infecção secundária oportunista quanto ao posterior
crescimento tumoral. Com estas evidências experimentais, nós propomos um novo modelo
para entender os eventos imunológicos que acontecem no contexto da sepse neonatal
(Esquema 1). Finalmente, este conjunto de dados, tanto do modelo experimental quanto de
pacientes, colabora, de forma significativa, para a melhor compreensão dos mecanismos
imunológicos envolvidos no estabelecimento da imunossupressão induzida pela sepse e
demonstram, pela primeira vez, que a disfunção imune associada com a sepse e o
desenvolvimento da imunossupressão são dependentes da idade.
Esquema 1. Modelo de resposta imune na sepse neonatal.
134
Referências bibliográficas
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ADIB-CONQUY, M.; CAVAILLON, J. M. Compensatory anti-inflammatory response syndrome. Thromb
Haemost, v. 101, n. 1, p. 36-47, Jan 2009.
ADKINS, B. Development of neonatal Th1/Th2 function. Int Rev Immunol, v. 19, n. 2-3, p. 157-71,
2000.
ADKINS, B.; LECLERC, C.; MARSHALL-CLARKE, S. Neonatal adaptive immunity comes of age. Nat Rev
Immunol, v. 4, n. 7, p. 553-64, Jul 2004.
ALVES-FILHO, J. C. et al. Toll-like receptor 4 signaling leads to neutrophil migration impairment in
polymicrobial sepsis. Crit Care Med, v. 34, n. 2, p. 461-70, Feb 2006.
ALVES-FILHO, J. C. et al. The role of neutrophils in severe sepsis. Shock, v. 30 Suppl 1, p. 3-9, Oct
2008.
ALVES-FILHO, J. C. et al. Regulation of chemokine receptor by Toll-like receptor 2 is critical to
neutrophil migration and resistance to polymicrobial sepsis. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 106, n. 10, p.
4018-23, Mar 10 2009.
ALVES-FILHO, J. C. et al. Interleukin-33 attenuates sepsis by enhancing neutrophil influx to the site of
infection. Nat Med, v. 16, n. 6, p. 708-12, Jun 2010.
ANGELONE, D. F. et al. Innate immunity of the human newborn is polarized toward a high ratio of IL6/TNF-alpha production in vitro and in vivo. Pediatr Res, v. 60, n. 2, p. 205-9, Aug 2006.
ANGUS, D. C. et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence,
outcome, and associated costs of care. Crit Care Med, v. 29, n. 7, p. 1303-10, Jul 2001.
ANGUS, D. C.; VAN DER POLL, T. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med, v. 369, n. 9, p. 840-51,
Aug 29 2013.
ARRAES, S. M. et al. Impaired neutrophil chemotaxis in sepsis associates with GRK expression and
inhibition of actin assembly and tyrosine phosphorylation. Blood, v. 108, n. 9, p. 2906-13, Nov 1
2006.
BANIYASH, M. TCR zeta-chain downregulation: curtailing an excessive inflammatory immune
response. Nat Rev Immunol, v. 4, n. 9, p. 675-87, Sep 2004.
BARICHELLO, T. et al. Behavioral deficits in sepsis-surviving rats induced by cecal ligation and
perforation. Braz J Med Biol Res, v. 40, n. 6, p. 831-7, Jun 2007.
BEATTY, G.; PATERSON, Y. IFN-gamma-dependent inhibition of tumor angiogenesis by tumorinfiltrating CD4+ T cells requires tumor responsiveness to IFN-gamma. J Immunol, v. 166, n. 4, p.
2276-82, Feb 15 2001.
BENJAMIM, C. F.; FERREIRA, S. H.; CUNHA, F. Q. Role of nitric oxide in the failure of neutrophil
migration in sepsis. J Infect Dis, v. 182, n. 1, p. 214-23, Jul 2000.
BENJAMIM, C. F.; HOGABOAM, C. M.; KUNKEL, S. L. The chronic consequences of severe sepsis. J
Leukoc Biol, v. 75, n. 3, p. 408-12, Mar 2004.
136
BENJAMIM, C. F. et al. Septic mice are susceptible to pulmonary aspergillosis. Am J Pathol, v. 163, n.
6, p. 2605-17, Dec 2003.
BISWAS, S. K.; MANTOVANI, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets:
cancer as a paradigm. Nat Immunol, v. 11, n. 10, p. 889-96, Oct 2010.
BONE, R. C. et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative
therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest, v. 101, n. 6, p. 1644-55, Jun 1992.
BONE, R. C.; GRODZIN, C. J.; BALK, R. A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease
process. Chest, v. 112, n. 1, p. 235-43, Jul 1997.
BOOMER, J. S. et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure.
JAMA, v. 306, n. 23, p. 2594-605, Dec 21 2011.
BROGLIATO, A. R. et al. Ketoprofen impairs immunosuppression induced by severe sepsis and
reveals an important role for prostaglandin E2. Shock, v. 38, n. 6, p. 620-9, Dec 2012.
BROWN, K. A. et al. Neutrophils in development of multiple organ failure in sepsis. Lancet, v. 368, n.
9530, p. 157-69, Jul 8 2006.
BRUSKO, T. M. et al. An integral role for heme oxygenase-1 and carbon monoxide in maintaining
peripheral tolerance by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol, v. 174, n. 9, p. 5181-6, May 1 2005.
CARSON, W. F. et al. Epigenetic regulation of immune cell functions during post-septic
immunosuppression. Epigenetics, v. 6, n. 3, p. 273-83, Mar 2011.
CARSON, W. F. T. et al. Impaired CD4+ T-cell proliferation and effector function correlates with
repressive histone methylation events in a mouse model of severe sepsis. Eur J Immunol, v. 40, n. 4,
p. 998-1010, Apr 2010.
CASARES, N. et al. CD4+/CD25+ regulatory cells inhibit activation of tumor-primed CD4+ T cells with
IFN-gamma-dependent antiangiogenic activity, as well as long-lasting tumor immunity elicited by
peptide vaccination. J Immunol, v. 171, n. 11, p. 5931-9, Dec 1 2003.
CAVASSANI, K. A. et al. The post sepsis-induced expansion and enhanced function of regulatory T
cells create an environment to potentiate tumor growth. Blood, v. 115, n. 22, p. 4403-11, Jun 3 2010.
CHAPMAN, N. M.; CHI, H. mTOR Links Environmental Signals to T Cell Fate Decisions. Front Immunol,
v. 5, p. 686, 2014.
CHEN, W. et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by
TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med, v. 198, n. 12, p. 1875-86, Dec 15 2003.
CUENCA, A. G. et al. TRIF-dependent innate immune activation is critical for survival to neonatal
gram-negative sepsis. J Immunol, v. 194, n. 3, p. 1169-77, Feb 1 2015.
CUMMINGS, C. J. et al. Expression and function of the chemokine receptors CXCR1 and CXCR2 in
sepsis. J Immunol, v. 162, n. 4, p. 2341-6, Feb 15 1999.
CUTHBERTSON, B. H. et al. Quality of life in the five years after intensive care: a cohort study. Crit
Care, v. 14, n. 1, p. R6, 2010.
137
DAVIDSON, T. S. et al. Cutting Edge: IL-2 is essential for TGF-beta-mediated induction of Foxp3+ T
regulatory cells. J Immunol, v. 178, n. 7, p. 4022-6, Apr 1 2007.
DE MONTMOLLIN, E.; ANNANE, D. Year in review 2010: Critical Care--Multiple organ dysfunction and
sepsis. Crit Care, v. 15, n. 6, p. 236, 2011.
DEJAGER, L. et al. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?
Trends Microbiol, v. 19, n. 4, p. 198-208, Apr 2011.
DINARELLO, C. A. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis
of septic shock. Chest, v. 112, n. 6 Suppl, p. 321S-329S, Dec 1997.
DIXIT, N. et al. Migrational guidance of neutrophils is mechanotransduced via high-affinity LFA-1 and
calcium flux. J Immunol, v. 187, n. 1, p. 472-81, Jul 1 2011.
DOERSCHUK, C. M. Mechanisms of leukocyte sequestration in inflamed lungs. Microcirculation, v. 8,
n. 2, p. 71-88, Apr 2001.
EDBERG, J. C. et al. The Ca2+ dependence of human Fc gamma receptor-initiated phagocytosis. J Biol
Chem, v. 270, n. 38, p. 22301-7, Sep 22 1995.
FORSTHUBER, T.; YIP, H. C.; LEHMANN, P. V. Induction of TH1 and TH2 immunity in neonatal mice.
Science, v. 271, n. 5256, p. 1728-30, Mar 22 1996.
FREITAS, A. et al. Divergent role of heme oxygenase inhibition in the pathogenesis of sepsis. Shock,
v. 35, n. 6, p. 550-9, Jun 2011.
GARVY, B. A.; QURESHI, M. H. Delayed inflammatory response to Pneumocystis carinii infection in
neonatal mice is due to an inadequate lung environment. J Immunol, v. 165, n. 11, p. 6480-6, Dec 1
2000.
GODSHALL, C. J. et al. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.
J Surg Res, v. 102, n. 1, p. 45-9, Jan 2002.
GOTTSCHALK, R. A.; CORSE, E.; ALLISON, J. P. TCR ligand density and affinity determine peripheral
induction of Foxp3 in vivo. J Exp Med, v. 207, n. 8, p. 1701-11, Aug 2 2010.
GREEN, L. C. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal Biochem, v.
126, n. 1, p. 131-8, Oct 1982.
Guidelines for the management of adults with hospital-acquired, ventilator-associated, and
healthcare-associated pneumonia. Am J Respir Crit Care Med, v. 171, n. 4, p. 388-416, Feb 15 .
GUO, F. et al. CD28 controls differentiation of regulatory T cells from naive CD4 T cells. J Immunol, v.
181, n. 4, p. 2285-91, Aug 15 2008.
HAINES, C. J. et al. Human CD4+ T cell recent thymic emigrants are identified by protein tyrosine
kinase 7 and have reduced immune function. J Exp Med, v. 206, n. 2, p. 275-85, Feb 16 2009.
HOTCHKISS, R. S.; COOPERSMITH, C. M.; KARL, I. E. Prevention of lymphocyte apoptosis--a potential
treatment of sepsis? Clin Infect Dis, v. 41 Suppl 7, p. S465-9, Nov 15 2005.
138
HOTCHKISS, R. S.; KARL, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med, v. 348, n. 2,
p. 138-50, Jan 9 2003.
HOTCHKISS, R. S.; NICHOLSON, D. W. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in
sepsis. Nat Rev Immunol, v. 6, n. 11, p. 813-22, Nov 2006.
HUEHN, J.; POLANSKY, J. K.; HAMANN, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable
regulatory T-cell lineage? Nat Rev Immunol, v. 9, n. 2, p. 83-9, Feb 2009.
HUYNH, A. et al. Control of PI(3) kinase in Treg cells maintains homeostasis and lineage stability. Nat
Immunol, v. 16, n. 2, p. 188-96, Feb 2015.
ISOMAKI, P. et al. Prolonged exposure of T cells to TNF down-regulates TCR zeta and expression of
the TCR/CD3 complex at the cell surface. J Immunol, v. 166, n. 9, p. 5495-507, May 1 2001.
JANEWAY, C. A. T., P. WALPORT, M. SHLOMCHIK, M.J. Imunobiologia: o sistema imune na saúde e
na doença. Porto Alegre: Artmed, 2007.
JOSEFOWICZ, S. Z.; WILSON, C. B.; RUDENSKY, A. Y. Cutting edge: TCR stimulation is sufficient for
induction of Foxp3 expression in the absence of DNA methyltransferase 1. J Immunol, v. 182, n. 11,
p. 6648-52, Jun 1 2009.
KIM, H. P.; LEONARD, W. J. CREB/ATF-dependent T cell receptor-induced FoxP3 gene expression: a
role for DNA methylation. J Exp Med, v. 204, n. 7, p. 1543-51, Jul 9 2007.
KIM, R. et al. Tumor-driven evolution of immunosuppressive networks during malignant progression.
Cancer Res, v. 66, n. 11, p. 5527-36, Jun 1 2006.
KNAUS, W. A. et al. APACHE II: a severity of disease classification system. Crit Care Med, v. 13, n. 10,
p. 818-29, Oct 1985.
KOLLMANN, T. R. et al. Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults. J
Immunol, v. 183, n. 11, p. 7150-60, Dec 1 2009.
KOX, W. J. et al. Immunomodulatory therapies in sepsis. Intensive Care Med, v. 26 Suppl 1, p. S1248, 2000.
KRETSCHMER, K. et al. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nat
Immunol, v. 6, n. 12, p. 1219-27, Dec 2005.
KUBES, P. The complexities of leukocyte recruitment. Semin Immunol, v. 14, n. 2, p. 65-72, Apr 2002.
LANGEREIS, J. D. Neutrophil integrin affinity regulation in adhesion, migration, and bacterial
clearance. Cell Adh Migr, v. 7, n. 6, p. 476-81, Nov-Dec 2013.
LAWN, J. E.; COUSENS, S.; ZUPAN, J. 4 million neonatal deaths: when? Where? Why? Lancet, v. 365,
n. 9462, p. 891-900, Mar 5-11 2005.
LEE, S. M. et al. Decreased interleukin-12 (IL-12) from activated cord versus adult peripheral blood
mononuclear cells and upregulation of interferon-gamma, natural killer, and lymphokine-activated
killer activity by IL-12 in cord blood mononuclear cells. Blood, v. 88, n. 3, p. 945-54, Aug 1 1996.
LEINO, L.; PAAPE, M. J. Comparison of the chemiluminescence responses of bovine neutrophils to
differently opsonized zymosan particles. Am J Vet Res, v. 54, n. 7, p. 1055-9, Jul 1993.
139
LETEURTRE, S. et al. Validation of the paediatric logistic organ dysfunction (PELOD) score:
prospective, observational, multicentre study. Lancet, v. 362, n. 9379, p. 192-7, Jul 19 2003.
LEVY, M. M. et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit
Care Med, v. 31, n. 4, p. 1250-6, Apr 2003.
LEVY, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev
Immunol, v. 7, n. 5, p. 379-90, May 2007.
LEVY, O. et al. Impaired innate immunity in the newborn: newborn neutrophils are deficient in
bactericidal/permeability-increasing protein. Pediatrics, v. 104, n. 6, p. 1327-33, Dec 1999.
LIU, G. et al. Phenotypic and functional switch of macrophages induced by regulatory CD4+CD25+ T
cells in mice. Immunol Cell Biol, v. 89, n. 1, p. 130-42, Jan 2011.
LUNDQVIST, H.; DAHLGREN, C. Isoluminol-enhanced chemiluminescence: a sensitive method to study
the release of superoxide anion from human neutrophils. Free Radic Biol Med, v. 20, n. 6, p. 785-92,
1996.
MAJEWSKA, M.; SZCZEPANIK, M. [The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune
responses and their function in immune response regulation]. Postepy Hig Med Dosw (Online), v. 60,
p. 52-63, 2006.
MAJNO, G. The ancient riddle of sigma eta psi iota sigma (sepsis). J Infect Dis, v. 163, n. 5, p. 937-45,
May 1991.
MANICASSAMY, S. et al. Toll-like receptor 2-dependent induction of vitamin A-metabolizing enzymes
in dendritic cells promotes T regulatory responses and inhibits autoimmunity. Nat Med, v. 15, n. 4, p.
401-9, Apr 2009.
MANTEL, P. Y. et al. Molecular mechanisms underlying FOXP3 induction in human T cells. J Immunol,
v. 176, n. 6, p. 3593-602, Mar 15 2006.
MARCOE, J. P. et al. TGF-beta is responsible for NK cell immaturity during ontogeny and increased
susceptibility to infection during mouse infancy. Nat Immunol, v. 13, n. 9, p. 843-50, Sep 2012.
MARODI, L. Innate cellular immune responses in newborns. Clin Immunol, v. 118, n. 2-3, p. 137-44,
Feb-Mar 2006.
MARTIN, G. S. et al. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl
J Med, v. 348, n. 16, p. 1546-54, Apr 17 2003.
MARTINO, D. J. et al. Evidence for age-related and individual-specific changes in DNA methylation
profile of mononuclear cells during early immune development in humans. Epigenetics, v. 6, n. 9, p.
1085-94, Sep 1 2011.
MARTINOT, A. et al. Sepsis in neonates and children: definitions, epidemiology, and outcome.
Pediatr Emerg Care, v. 13, n. 4, p. 277-81, Aug 1997.
MEDZHITOV, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature, v.
449, n. 7164, p. 819-26, Oct 18 2007.
140
MEDZHITOV, R.; SCHNEIDER, D. S.; SOARES, M. P. Disease tolerance as a defense strategy. Science, v.
335, n. 6071, p. 936-41, Feb 24 2012.
MILLS, K. H. Regulatory T cells: friend or foe in immunity to infection? Nat Rev Immunol, v. 4, n. 11,
p. 841-55, Nov 2004.
MONNERET, G. et al. Marked elevation of human circulating CD4+CD25+ regulatory T cells in sepsisinduced immunoparalysis. Crit Care Med, v. 31, n. 7, p. 2068-71, Jul 2003.
MUCIDA, D. et al. Oral tolerance in the absence of naturally occurring Tregs. J Clin Invest, v. 115, n.
7, p. 1923-33, Jul 2005.
MUENZER, J. T. et al. Characterization and modulation of the immunosuppressive phase of sepsis.
Infect Immun, v. 78, n. 4, p. 1582-92, Apr 2010.
NASCIMENTO, D. C. Participação da interleucina-33 e citocinas do tipo 2 na ativação alternativa de
macrófagos e estabelecimento da imunosupressão induzida pela sepse. 2012. (Doctor). Imunologia
Básica e Aplicada, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
NASCIMENTO, D. C. et al. Role of regulatory T cells in long-term immune dysfunction associated with
severe sepsis. Crit Care Med, v. 38, n. 8, p. 1718-25, Aug 2010.
NATHAN, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol, v. 6, n. 3, p.
173-82, Mar 2006.
NAUSEEF, W. M.; BORREGAARD, N. Neutrophils at work. Nat Immunol, v. 15, n. 7, p. 602-11, Jul
2014.
NUNES, P.; DEMAUREX, N. The role of calcium signaling in phagocytosis. J Leukoc Biol, v. 88, n. 1, p.
57-68, Jul 2010.
OPIELA, S. J.; KORU-SENGUL, T.; ADKINS, B. Murine neonatal recent thymic emigrants are
phenotypically and functionally distinct from adult recent thymic emigrants. Blood, v. 113, n. 22, p.
5635-43, May 28 2009.
OTSUJI, M. et al. Oxidative stress by tumor-derived macrophages suppresses the expression of CD3
zeta chain of T-cell receptor complex and antigen-specific T-cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A,
v. 93, n. 23, p. 13119-24, Nov 12 1996.
OTTO, G. P. et al. The late phase of sepsis is characterized by an increased microbiological burden
and death rate. Crit Care, v. 15, n. 4, p. R183, 2011.
PAULA-NETO, H. A. et al. Inhibition of guanylyl cyclase restores neutrophil migration and maintains
bactericidal activity increasing survival in sepsis. Shock, v. 35, n. 1, p. 17-27, Jan 2011.
PERES, R. S. et al. Low expression of CD39 on regulatory T cells as a biomarker for resistance to
methotrexate therapy in rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 112, n. 8, p. 2509-14, Feb
24 2015.
PERL, T. M. et al. Long-term survival and function after suspected gram-negative sepsis. JAMA, v.
274, n. 4, p. 338-45, Jul 26 1995.
141
POLLACK, M. M.; RUTTIMANN, U. E.; GETSON, P. R. Pediatric risk of mortality (PRISM) score. Crit Care
Med, v. 16, n. 11, p. 1110-6, Nov 1988.
PRABHUDAS, M. et al. Challenges in infant immunity: implications for responses to infection and
vaccines. Nat Immunol, v. 12, n. 3, p. 189-94, Mar 2011.
RAY, J. P.; CRAFT, J. PTENtiating autoimmunity through Treg cell deregulation. Nat Immunol, v. 16, n.
2, p. 139-40, Feb 2015.
REBUCK, N.; GIBSON, A.; FINN, A. Neutrophil adhesion molecules in term and premature infants:
normal or enhanced leucocyte integrins but defective L-selectin expression and shedding. Clin Exp
Immunol, v. 101, n. 1, p. 183-9, Jul 1995.
RIOS-SANTOS, F. et al. Down-regulation of CXCR2 on neutrophils in severe sepsis is mediated by
inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med, v. 175, n. 5, p. 490-7,
Mar 1 2007.
RODRIGUEZ, P. C. et al. Arginase I production in the tumor microenvironment by mature myeloid
cells inhibits T-cell receptor expression and antigen-specific T-cell responses. Cancer Res, v. 64, n. 16,
p. 5839-49, Aug 15 2004.
RUSSELL, J. A. Management of sepsis. N Engl J Med, v. 355, n. 16, p. 1699-713, Oct 19 2006.
SAKAGUCHI, S. et al. Regulatory T cells: how do they suppress immune responses? Int Immunol, v.
21, n. 10, p. 1105-11, Oct 2009.
SALES JUNIOR, J. A. L. A. G. D. E. D. S. D. F. A. E. A. Sepse Brasil: estudo epidemiológico da sepse em
Unidades de Terapia Intensiva brasileiras. Rev. bras. ter. intensiva, v. vol.18, n.1, p. pp. 9-17, 2006.
SANSONETTI, P. Phagocytosis of bacterial pathogens: implications in the host response. Semin
Immunol, v. 13, n. 6, p. 381-90, Dec 2001.
SARZOTTI, M.; ROBBINS, D. S.; HOFFMAN, P. M. Induction of protective CTL responses in newborn
mice by a murine retrovirus. Science, v. 271, n. 5256, p. 1726-8, Mar 22 1996.
SASSE, K. C. et al. Long-term survival after intensive care unit admission with sepsis. Crit Care Med,
v. 23, n. 6, p. 1040-7, Jun 1995.
SCUMPIA, P. O. et al. Treatment with GITR agonistic antibody corrects adaptive immune dysfunction
in sepsis. Blood, v. 110, n. 10, p. 3673-81, Nov 15 2007.
SCUMPIA, P. O. et al. Increased natural CD4+CD25+ regulatory T cells and their suppressor activity
do not contribute to mortality in murine polymicrobial sepsis. J Immunol, v. 177, n. 11, p. 7943-9,
Dec 1 2006.
SEDDIKI, N. et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human
regulatory and activated T cells. J Exp Med, v. 203, n. 7, p. 1693-700, Jul 10 2006.
SEMPLE, K. et al. Strong CD28 costimulation suppresses induction of regulatory T cells from naive
precursors through Lck signaling. Blood, v. 117, n. 11, p. 3096-103, Mar 17 2011.
142
SHARMA, A. A. et al. The developing human preterm neonatal immune system: a case for more
research in this area. Clin Immunol, v. 145, n. 1, p. 61-8, Oct 2012.
SHEVACH, E. M. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression. Immunity, v. 30, n. 5,
p. 636-45, May 2009.
______. Biological functions of regulatory T cells. Adv Immunol, v. 112, p. 137-76, 2011.
SHEVACH, E. M. et al. The lifestyle of naturally occurring CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells.
Immunol Rev, v. 212, p. 60-73, Aug 2006.
SIEGRIST, C. A. Neonatal and early life vaccinology. Vaccine, v. 19, n. 25-26, p. 3331-46, May 14 2001.
SIEGRIST, C. A.; ASPINALL, R. B-cell responses to vaccination at the extremes of age. Nat Rev
Immunol, v. 9, n. 3, p. 185-94, Mar 2009.
SILVA, E. et al. Brazilian Sepsis Epidemiological Study (BASES study). Crit Care, v. 8, n. 4, p. R251-60,
Aug 2004.
SINGH, S.; EVANS, T. W. Organ dysfunction during sepsis. Intensive Care Med, v. 32, n. 3, p. 349-60,
Mar 2006.
SOGAYAR, A. M. et al. A multicentre, prospective study to evaluate costs of septic patients in
Brazilian intensive care units. Pharmacoeconomics, v. 26, n. 5, p. 425-34, 2008.
SONG, A. et al. Cooperation between CD4 and CD8 T cells for anti-tumor activity is enhanced by
OX40 signals. Eur J Immunol, v. 37, n. 5, p. 1224-32, May 2007.
SOUZA, D. G. et al. Effects of inhibition of PDE4 and TNF-alpha on local and remote injuries following
ischaemia and reperfusion injury. Br J Pharmacol, v. 134, n. 5, p. 985-94, Nov 2001.
STEARNS-KUROSAWA, D. J. et al. The pathogenesis of sepsis. Annu Rev Pathol, v. 6, p. 19-48, 2011.
STEINCKWICH, N. et al. Potent inhibition of store-operated Ca2+ influx and superoxide production in
HL60 cells and polymorphonuclear neutrophils by the pyrazole derivative BTP2. J Leukoc Biol, v. 81,
n. 4, p. 1054-64, Apr 2007.
STEINHAUSER, M. L. et al. IL-10 is a major mediator of sepsis-induced impairment in lung
antibacterial host defense. J Immunol, v. 162, n. 1, p. 392-9, Jan 1 1999.
TAVARES-MURTA, B. M. et al. Failure of neutrophil chemotactic function in septic patients. Crit Care
Med, v. 30, n. 5, p. 1056-61, May 2002.
THORNTON, A. M.; SHEVACH, E. M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell
activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med, v. 188, n. 2, p. 287-96, Jul 20
1998.
______. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific.
J Immunol, v. 164, n. 1, p. 183-90, Jan 1 2000.
TONE, Y. et al. Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer. Nat
Immunol, v. 9, n. 2, p. 194-202, Feb 2008.
143
TREVELIN, S. C. et al. Toll-like receptor 9 activation in neutrophils impairs chemotaxis and reduces
sepsis outcome. Crit Care Med, v. 40, n. 9, p. 2631-7, Sep 2012.
VAN DER POLL, T. et al. Endogenous IL-10 protects mice from death during septic peritonitis. J
Immunol, v. 155, n. 11, p. 5397-401, Dec 1 1995.
VENET, F. et al. Increased circulating regulatory T cells (CD4(+)CD25 (+)CD127 (-)) contribute to
lymphocyte anergy in septic shock patients. Intensive Care Med, v. 35, n. 4, p. 678-86, Apr 2009.
VENET, F. et al. Regulatory T cell populations in sepsis and trauma. J Leukoc Biol, v. 83, n. 3, p. 52335, Mar 2008.
VINCENT, J. L. et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ
dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European
Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med, v. 22, n. 7, p. 707-10, Jul 1996.
WALLEY, K. R. et al. Balance of inflammatory cytokines related to severity and mortality of murine
sepsis. Infect Immun, v. 64, n. 11, p. 4733-8, Nov 1996.
WANG, D. et al. Individual variation and longitudinal pattern of genome-wide DNA methylation from
birth to the first two years of life. Epigenetics, v. 7, n. 6, p. 594-605, Jun 1 2012.
WANG, G. et al. "Default" generation of neonatal regulatory T cells. J Immunol, v. 185, n. 1, p. 71-8,
Jul 1 2010.
WANG, T. S.; DENG, J. C. Molecular and cellular aspects of sepsis-induced immunosuppression. J Mol
Med (Berl), v. 86, n. 5, p. 495-506, May 2008.
WATSON, R. S.; CARCILLO, J. A. Scope and epidemiology of pediatric sepsis. Pediatr Crit Care Med, v.
6, n. 3 Suppl, p. S3-5, May 2005.
WATSON, R. S. et al. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States. Am J Respir
Crit Care Med, v. 167, n. 5, p. 695-701, Mar 1 2003.
WEBER, M. S. et al. Type II monocytes modulate T cell-mediated central nervous system
autoimmune disease. Nat Med, v. 13, n. 8, p. 935-43, Aug 2007.
WOLPE, S. D. et al. Macrophages secrete a novel heparin-binding protein with inflammatory and
neutrophil chemokinetic properties. J Exp Med, v. 167, n. 2, p. 570-81, Feb 1 1988.
WYNN, J. L. et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by
generalized peritonitis. Shock, v. 28, n. 6, p. 675-683, Dec 2007a.
WYNN, J. L. et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by
generalized peritonitis. Shock, v. 28, n. 6, p. 675-683, Dec 2007b.
WYNN, J. L. et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome
but is reversed by TLR agonists. Blood, v. 112, n. 5, p. 1750-8, Sep 1 2008.
YANG, Z. et al. Mast cells mobilize myeloid-derived suppressor cells and Treg cells in tumor
microenvironment via IL-17 pathway in murine hepatocarcinoma model. PLoS One, v. 5, n. 1, p.
e8922, 2010.
144
YU, A. et al. A low interleukin-2 receptor signaling threshold supports the development and
homeostasis of T regulatory cells. Immunity, v. 30, n. 2, p. 204-17, Feb 20 2009.
ZANTL, N. et al. Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a
novel murine model of abdominal sepsis. Infect Immun, v. 66, n. 5, p. 2300-9, May 1998.
ZHANG, Q. et al. Inefficient antimicrobial functions of innate phagocytes render infant mice more
susceptible to bacterial infection. Eur J Immunol, v. 43, n. 5, p. 1322-32, May 2013.
ZHENG, S. G. et al. IL-2 is essential for TGF-beta to convert naive CD4+CD25- cells to CD25+Foxp3+
regulatory T cells and for expansion of these cells. J Immunol, v. 178, n. 4, p. 2018-27, Feb 15 2007.
ZHENG, S. G. et al. TGF-beta requires CTLA-4 early after T cell activation to induce FoxP3 and
generate adaptive CD4+CD25+ regulatory cells. J Immunol, v. 176, n. 6, p. 3321-9, Mar 15 2006.
ZHENG, Y. et al. Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell
fate. Nature, v. 463, n. 7282, p. 808-12, Feb 11 2010.
145
Anexos
Anexos
8. ANEXOS
8.1 CARACTERIZAÇÃO
CAMUNDONGOS
DAS
DE
POPULAÇÕES
DIFERENTES
IDADES:
CELULARES
EM
MACRÓFAGOS
E
NEUTRÓFILOS
Neutrófilos no baço
(%)
8
*
B
Neutrófilos no mLN
(%)
A
Quatro-semanas
Seis semanas
6
4
2
D
50
40
30
20
*
*
10
0
Macrófagos no mLN
(%)
Macrófagos no baço
(%)
15
10
*
5
0
0
C
20
15
10
5
*
*
0
Figura 1. Macrófagos e neutrófilos em camundongos de diferentes idades. Macrófagos e
neutrófilos no baço (A-C) e no linfonodo (B-D) em camundongos de diferentes idades. Dados
representativos de dois experimentos independentes.
147
Anexos
8.1.2
CARACTERIZAÇÃO
CAMUNDONGOS
DAS
DE
POPULAÇÕES
DIFERENTES
CELULARES
IDADES:
EM
NEUTRÓFILOS,
Contagem diferencial de WBC (%)
LINFÓCITOS E MONÓCITOS NO SANGUE PERIFÉRICO
Neutrófilos
Linf'ócitos
Monócitos
100
80
60
40
20
0
R. Nascidos
4-Semánas
6- Semánas
Adultos
Figura 2. Distribuição periféricas das populações celulares. Neutrófilos, linfócitos e monócitos no
estendido do sangue periférico segundo o local e a idade do camundongo. Dados representativos de
dois experimentos independentes.
148
Anexos
8.1.3
CARACTERIZAÇÃO
DAS
POPULAÇOES
CELULARES
EM
CAMUNDONGOS DE DIFERENTES IDADES: CÉLULAS NK E NKT
Quatro-semanas
Seis semanas
Células NKTno baço
(%)
6
B
3
*
4
2
Células NKT no mLN
(%)
A
15
10
5
0
D
Células NK no mLN
(%)
Células NK no baço
(%)
20
1
0
0
C
2
6
4
2
0
Figura 3. Células NKT e NK em camundongos de diferentes idades. Células NKT no baço (A) e
no linfonodo (B); células NK no sangue (C) e no linfonodo (D) de camundongos naives. Dados
representativos de dois experimentos independentes.
149
Anexos
8.1.4
GRÁFICO REPRESENTATIVO: CÉLULAS NK
Estratégia de gate
Figura 3,1. Células NKT de camundongos de diferentes idades. Dot plot representativo das populações das células NKT no baço e no linfonodo de
camundongos sem sepse. Dados representativos de dois experimentos independentes.
150
Anexos
8.1.5
GRÁFICO REPRESENTATIVO: CÉLULAS NKT
A, Estratégia de gate
Figura 3,2. Células NKT de camundongos de diferentes idades. Dot plot representativo das populações das células NKT no baço e no linfonodo de
camundongos sem sepse. Dados representativos de dois experimentos independentes.
151
Anexos
8.1.6
CARACTERIZAÇÃO
DAS
POPULAÇOES
CELULARES
EM
CAMUNDONGOS DE DIFERENTES IDADES: CÉLULAS T CD4+CD8- E
CD8+CD4-
80
60
+
20
(%)
40
+
(%)
-
60
B
Células CD4 CD8 no mLN
80
-
CD4 CD8 cells in the spleen
A
Quatro-semanas
Seis semanas
D
30
50
40
+
Células CD4 CD8 no mLN
(%)
30
-
20
-
+
Células CD4 CD8 no baço
(%)
20
0
0
C
40
10
0
20
10
0
Figura 4. Células T CD4+ e CD8+ de camundongos de diferentes idades. Células T CD4+ em baço
(A), linfonodo (B) e sangue (C) de camundongos sem sepse. Células T CD8+ no baço (A-C) e no
linfonodo (B-D) de camundongos sem sepse Dados representativos de dois experimentos
independentes.
152
Anexos
8.1.7
GRÁFICO REPRESENTATIVO: CÉLULAS T CD4+CD8- E CD8+CD4Estratégia de gate.
Figura 4,1. Células T CD4+ e CD8+ de camundongos de diferentes idades. Dot plot representativo das populações de Células T CD4+ no baço e no
linfonodo de camundongos sem sepse. Dados representativos de dois experimentos independentes.
153
Anexos
8.2 PADRONIZAÇÃO
DO
MODELO
DE
SEPSE
EXPERIMENTAL
EM
CAMUNDONGOS COM DIFERENTES IDADES
A
7 107 CFU/Cavidade
1 108 CFU/Cavidade
2 108 CFU/Cavidade
100
Quatro semanas
100
Sobrevida (%)
Sobrevida (%)
80
B
60
40
20
4 107 CFU/Cavidade
2 108 CFU/Cavidade
4 108 CFU/Cavidade
80
60
40
20
0
0
24
48
72
Horas após sepse
96
0
120
0
24
48
72
Horas após sepse
96
120
D
C
Seis semanas
Sobrevida (%)
4 107 CFU/Cavidade
2 108 CFU/Cavidade
4 108 CFU/Cavidade
80
60
40
Sobrevida (%)
100
100
4 107 CFU/Cavidade
2 108 CFU/Cavidade
4 108 CFU/Cavidade
80
60
40
20
20
0
0
*
0
24
48
72
Horas após sepse
96
120
0
24
48
72
Horas após sepse
96
120
Figura 5. Sobrevida de animais com diferentes idades cinco dias após indução da sepse experimental.
154
Anexos
8.3 MIGRAÇAO DE NEUTRÓFILOS, BACTEREMIA, CARGA BACTERIANA E MARACADORES DE LESÃO ORGÂNICA EM
CAMUNDONGOS COM DIFERENTES IDADES
Sham
Sepse Moderada
Sepse Letal
Sham
Sepse Moderada
Sepse Letal
8
Carga bacteriana
(Log10 CFU/Cavidade)
8
Bacteremia
(Log10 CFU/mL)
*
6
4
2
0
N.D
N.D
N.D
N.D
*
120
2
N.D
N.D
N.D
N.D
R. nascidos 4-semanas 6-semanas
Sham
Sepse
2500
*
Adultos
Sham
Sepse
*
2000
200
90
BUN
(mg/dL)
TGO
(U/mL)
4
150
100
50
0
Adultos
CK-MB
(U/L)
250
Sham
Sepse
6
0
Adultos
*
60
1500
1000
30
500
0
0
Adultos
Adultos
155
Anexos
8.4 Cálculo de APACHE II – Acute Physiology and Chronic Health disease
Classification System II (Knaus et al., 1985)
156
Anexos
8.5 Cálculo de SOFA – Sequential Organ Failure Assessment (Vincent et al., 1996)
Variável
Respiração
PaO2/FIO2
Pontuação
1
2
3
4
<400
<300
<200
<100
e
Suporte respiratório
Coagulação
Plaquetas
(103/μL)
Bilirrubina
(mg/dL)
Cardiovascular
Neurológico
Escala de Coma
de Glasgow
Renal
Creatinina
(mg/dL)
Produção Urina
<150
<100
<50
<20
1.2-1.9
2.0-5.9
6.0-11.9
>12
PA média < 70
mmHg
Dopamina ≤5
ou
dobutamina
Dopamina >5
ou epinefrina
≤0.1 ou
norepinefrina
≤0.1
Dopamina >15
ou epinefrina
>0.1 ou
norepinefrina
>0.1
13-14
10-12
6-9
<6
1.2-1.9
2.0-3.4
3.5-4.9
>5.0
ou
<500mL/dia
<200ml/dia
157
Anexos
8.6 Cálculo de PRIMS – Pediatric Risk of Mortality score (Pollack et al., 1988)
Variáveis
Lactentes
Maiores
Pontuação
Pressão arterial sistólica (mmHg)
130-160
55-65
>160
40-54
<40
150-200
65-75
>200
50-64
<50
2
2
6
6
7
6
4
4
1
5
5
2
3
1
5
6
4
10
2
6
1
1
5
5
2
2
6
6
4
4
8
8
3
3
Pressão arterial diastólica (mmHg)
Frequência cardíaca
Frequência respiratória
PaO2/FIO2
PaCO2 (mmHg)
Escala de coma de Glasgow
Reação Pupilar
TP/TTPA
Bilirrubina total (mg/dl)
Potássio (mEq/L)
Cálcio iônico (mM)
Glicemia (mg/dL)
Bicarbonato (mM)
>110
>160
<90
61-90
>150
<80
51-90
>90
Apnéia
200-300
<200
51-65
>65
<8
Dilatadas
Fixas e Dilatadas
>1.5 x Controle
>3.5
3-3.5
6.5-7.5
<3
>7.5
0.8-0.85
1.3-1.5
<0.8
>1.5
40-60
250-400
<40
>400
<16
>32
158
Anexos
8.7 Cálculo de PELOD – Paediatric Logistic organ dysfunction (Leteurtre et al., 2003)
Definição Orgânica de Variável
0
Neurológica
Escala de Coma de Glasgow
Reações Pupilares
Cardiovascular
Frequência cardíaca
(batimentos/minuto)
<12 Anos
≥12 Anos
Pressão sanguínea sistólica (mm Hg)
<1 mês
1 mês- 1 ano
1-12 anos
≥12 Anos
Renal
Creatinina (µmol/L)
<7 Dias
7 Dias –1 Ano
1–12 Anos
≥12 Anos
Respiratório
Razão PaO2 (kPa)/FIO2
PaCO2 (kPa)
Ventilação mecânica
Hematológico
Contagem Leucócitos (células 109/L)
Plaquetas (células 109/L)
Hepático
Aspartato transaminase (IU/L)
Tempo de prótrombina
INR
Pontuação
1
10
20
4-6
ou
Ambas Fixas
3
12-15
e
Ambas Reativas
7-11
≤195
≤150
e
NA
NA
>195
>150 NA
ou
NA
NA
>65
>75
>85
>95
NA
NA
NA
NA
35-65
35-75
45-85
55-95
<35
<35
<45
<55
<140
<55
<100
<140
NA
NA
NA
NA
≥140
≥55
≥100
≥140
NA
NA
NA
NA
>9.3
e
≤11.7
e
Sem ventilação
NA
NA
NA
≤9.3
ou
>11.7
Ventilado
NA
NA
≥4.5
e
≥35
1.5-4.4
ou
<35
<1.5
NA
NA
NA
<950
e
>60
<1.4
≥950
ou
≤60
≥1.4
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
159
Anexos
8.8 Certificado de aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa-FMRP
160

Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada

Transcrição

Documentos relacionados

PROPOSTAS DE MUDANÇAS RELATÓRIO ILAS

Hospital 9 de Julho 2014

diagnóstico e tratamento - Hospital Sírio

Diagnóstico e Tratamento Precoce da Sepse Grave no Adulto

Diretriz ITU

a culpa é so dos pais

Membros do Laboratório - CRID

SEGURANÇA

Avaliação da adesão ao protocolo de septicemia em

leia mais