a) Identificação da proposta

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
COLEÇÃO DE CULTURAS – MICOTECA URM
Título do Projeto:
Caracterização do acervo da Micoteca URM visando a
disponibilização de culturas como fonte de recursos
biotecnológicos
EDITAL FACEPE 16/2012
APOIO À DISPONIBILIZAÇÃO PARA A PESQUISA DE LABORATÓRIOS
MULTIUSUÁRIOS E DE ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO
Enfoque desta proposta: ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO
Proponente:
Profa. Dra. Cristina Maria de Souza Motta
Curadora da Micoteca URM
Recife,
2012
a. IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA
Título do projeto:
Caracterização do acervo da Micoteca URM visando a disponibilização de culturas como
fonte de recursos biotecnológicos
Dados da entidade proponente:
Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de
Micologia, Coleção de Culturas – Micoteca URM, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade
Universitária, Recife-PE, Fone: (81) 2126.8948, Fax: (81) 2126.8480.
Proponente e Coordenador:
Profa. Dra. CRISTINA MARIA DE SOUZA MOTTA, Universidade Federal de Pernambuco,
Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Curadora da Coleção de Culturas
– Micoteca URM, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade Universitária, Recife-PE,
[email protected], Fone: (81) 2126.8948, Fax: (81) 2126.8480, Professor Adjunto 3, DE.
EDITAL FACEPE 16/2012
APOIO À DISPONIBILIZAÇÃO PARA A PESQUISA DE LABORATÓRIOS
MULTIUSUÁRIOS E DE ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO MULTIUSUÁRIOS –
FACEPE
b) Justificativa para a realização do projeto, incluindo a descrição da natureza e
relevância, para atividades de pesquisa, do acervo ou dos laboratórios/serviços
especializados que são objeto do apoio solicitado
A Coleção de Culturas - Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca), do Departamento
de Micologia, Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco,
Recife-PE, foi fundada em 1954 pelo Prof. Augusto Chaves Batista, tem como curadora a
Profa. Cristina Maria de Souza Motta e vice-curadora a Profa. Rejane Pereira Neves. Esta
coleção apresenta um acervo diversificado de fungos pertencentes aos filos Zygomycota,
Ascomycota, Basidiomycota e “Deuteromycota” (Fungos anamorfos). A Micoteca URM está
registrada no Commonwealth Mycological Institute (CMI) sob a sigla URM (University
Recife Mycologia) e é filiada ao Word Federation for Culture Collections (WFCC) sob o
número 604 (MICOTECA, 2012; WORLD DATA CENTER FOR MICROORGANISMS,
WDCM, 2012; SOUZA-MOTTA, 2012). A coleção utiliza para preservação os métodos: óleo
mineral, liofilização, água destilada e, ultracongelamento a -80º C é o método mais
recentemente implementado, através do apoio do CNPq em 2009. Ao acervo da Micoteca
URM já foram inseridas aproximadamente 6.700 entradas de culturas de fungos e, ao longo
2
dos anos desde a fundação, cerca de 700 já foram consideradas inviáveis. As culturas do
acervo
pertencem
aos
Oomycota,
Zygomycota,
Ascomycota,
Basidiomycota
e
“Deuteromycota” (Fungos anamorfos), todas identificadas ao nível de espécie e mantidas em
duplicata em no mínimo dois métodos de preservação. No total, cerca de 20.000 culturas
estão preservadas na Micoteca URM. Além de receber amostras de fungos para compor o
acervo, a Micoteca URM atende a pedidos de fornecimento de amostras, isolamento e
identificação de culturas, liofilização e treinamento de estudantes e profissionais na área de
taxonomia e preservação, oferecendo também cursos de extensão. Estes pedidos são
procedentes de instituições de ensino e/ou pesquisa, nacionais e internacionais; de
laboratórios que utilizam amostras de microrganismos em testes para fabricação de
medicamentos, enzimas e outros metabolitos de interesse econômico e, dos que realizam
diagnóstico de micoses; e da comunidade em geral (SOUZA-MOTTA, 2012). De 2005 até
julho de 2012, foram incorporados ao acervo 1.768 amostras de fungos, procedentes de solos,
resíduos industriais, água doce e marinha, sedimento de manguezal, alimentos, vegetais,
endofíticos e animais. Estas amostras estão disponíveis à comunidade científica e a outros
interessados. Neste mesmo período foram identificadas ao nível de espécie 2.322 amostras e
fornecidas 3.352 amostras de fungos para instituições de ensino e pesquisa nacionais e
internacionais.
Coleções de culturas contribuem diretamente para o estudo da sistemática e da
biodiversidade mundial, por manterem e preservarem culturas que são essenciais para estudos
representando uma importante fonte de recursos biológicos permitindo a condução de
inúmeros trabalhos científicos, assegurando o sucesso de sua utilização em processos,
principalmente, biotecnológicos (FIGUEIREDO, 2001; CANHOS, 2006). Os métodos de
preservação de microrganismos asseguram a viabilidade, morfologia, fisiologia e genética,
mantendo a cultura por longo tempo e todos com o mesmo princípio: retardar ou paralisar o
metabolismo celular. Dentre estes métodos, podem ser citados o método de óleo mineral, água
destilada, liofilização, nitrogênio líquido, ultracongelamento a -80°C, sílica gel, solo e
repiques seriados (SMITH; ONIONS, 1994; LACAZ et al., 2002; NAKASONE et al., 2004).
O termo Centro de Recurso Biológico (CRB) foi primeiro associado ao programa
Microbiological Resource Centre (MIRCEN), lançado pela UNESCO em 1946, com o
objetivo de estabelecer centros de recursos microbiológicos, preservando uma diversidade
microbiana extremamente valiosa e ameaçada pela falta de recursos financeiros em países
menos desenvolvidos. Em 1998, o Japão tomou a iniciativa de propor à Organização para
3
Cooperação e o Desenvolvimento Econômico (OCDE) (OCDE, 2010), o estudo dos CRBs
como elementos chave da infra-estrutura científica e tecnológica das ciências da vida e
biotecnologia. Em fevereiro de 1999, realizou-se em Tóquio um Workshop da OCDE
dedicado as infra-estruturas científicas e tecnológicas para apoiarem os CRBs. Em 2001, a
OCDE publicou o relatório “Biological Resource Centers – Underpinning the Future of Life
sciences and Biotechnology”, que enfatiza o potencial dos CRBs, para consolidarem o futuro
das ciências da vida e biotecnologia, enquanto recomendava a criação de uma rede de centros
de recursos biológicos global. Os CRBs são uma parte essencial da infra-estrutura que
suportam as ciências da vida e a biotecnologia. Fornecem serviços e são depositários de
células vivas, de genomas de organismos, e da informação relacionada com a hereditariedade
e as funções biológicas dos sistemas. O relatório enfatiza ainda a necessidade das coleções
aderirem a elevados padrões de qualidade e de competência exigida pela comunidade
internacional de cientistas e da indústria no fornecimento de informação e materiais
biológicos. Finalmente, o relatório desafia os estados membros a criarem os CRBs nacionais
que respeitem padrões de qualidade, de competência e de estabilidade financeira, garantidos
por
critérios
internacionais
e
sistemas
governamentais
ou
independentes
de
acreditação/certificação. Nesta abordagem, surgiu a idéia de se construir um Global BRC
Network (GBRCN) que apóie a cooperação internacional e o desenvolvimento econômico
(BRASIL, 2002; LIMA, 2007)
No Brasil, em 2001 foi instituído pelo Ministério de Ciência e Tecnologia um Grupo
de Trabalho, com a finalidade de elaborar “um documento técnico sobre o panorama nacional
relativo às atividades de metrologia, normalização, regulamentação técnica e avaliação da
conformidade, aplicáveis a microrganismos”. Em 2002, foi publicado o documento “Sistema
de Avaliação da Conformidade de Material Biológico” enfatizando a constituição de sistemas
integrados, que possibilitem operar de forma harmônica, alinhada com as tendências
internacionais (BRASIL, 2002).
Em 2004, o ministro da ciência e tecnologia no comitê para política científica e
tecnológica, aprovou o documento elaborado pelo grupo de trabalho OCDE-BRC, contendo
regras base e regulamentos para futuros membros do GBRCN. Este documento define as
exigências gerais para o funcionamento de todos os BCRs como partes do GBRCN, tendo
como base as normas do common Access to Biological Resources and Information (CABRI) e
da World Federation for Culturwe Collection (WFCC), bem como o sistema de gestão da
qualidade da UK National Culture Collection (UKNCC). Como consequência de todo esse
trabalho, os países membros e não membros da OCDE foram tomando iniciativas para
4
transferir as coleções de culturas tradicionais para este novo conceito e, assim, posicionaremse para uma adesão efetiva ao futuro GBRCN. Em 2007, a OCDE publicou o guia de boas
práticas para os centros de recursos biológicos (gestão da qualidade, biossegurança,
conservação dos recursos biológicos e gestão dos dados) (LIMA, 2007).
Em 2005, atendendo à demanda formulada pelo Centro de Referência em Informação
Ambiental – CRIA e SICoL, no levantamento preliminar das Coleções de Culturas Nacionais
constavam 26 Coleções, destacaram-se 7 (sete) Coleções de Serviço (fornecem culturas
microbianas e apresentam controle de qualidade das coleções): Fiocruz – RJ; EMBRAPA;
CBMAI (CPQBA-UNICAMP); Instituto Adolfo Lutz; Instituto Biológico – SP; Coleção de
Cultura de Fitobactérias de Instituto Biológico de Campinas e Micoteca URM da UFPE
(VAZZOLER; UMINO, CANHOS, 2005).
Para seguir todo este panorama e visando aumentar a qualidade dos serviços de
identificação, fornecimento e preservação de culturas de fungos a pesquisadores desta e de
outras instituições nacionais e internacionais, está sendo implantada na Micoteca URM, a ISO
9001:2008. Esta norma tem por objetivo especificar requisitos para um sistema de gestão da
qualidade, implementando a capacidade para fornecer produtos que atendam a padrões
internacionais e visa também aumentar a satisfação do usuário, buscando a melhoria continua
do sistema. Em meados de outubro de 2012, será iniciada também a implantação da ISO
17025:2005, com o apoio do Convênio FINEP 01.08.0392.00.
Atualmente, existem 60 coleções de culturas brasileiras, 25 preservam fungos, estando
seis no nordeste, sendo quatro em Pernambuco, uma na Bahia e uma no Ceará. A Micoteca ,
CENTER FOR MICROORGANISMS, 2012).
A partir de 2005, a Micoteca URM, sob a curadoria da Profa. Cristina Maria de Souza
Motta, vem sendo apoiada por auxílio financeiro de diversas agências como CAPES, CNPq,
FACEPE e FINEP, e a equipe vem também oferecendo cursos de treinamento e participando
de curso de atualização para atender ao que está acontecendo no mundo em coleções de
culturas.
Em 05 de abril de 2010 a Micoteca URM foi aprovado o credenciamento pelo
Conselho de Gestão do Patrimônio Genético, como Instituição Fiel Depositária de Amostras
de Componente do Patrimônio Genético, sob o número 024/2010 SECEX/CGEN.
Em 2011, a Micoteca URM ministrou curso avançado intitulado “Identificação
Polifásica de Fungos Filamentosos dos Gêneros Aspergillus e Penicillium com Aplicação
Biotecnológica” em parceria com a Micoteca da Universidade do Minho-MUM, Braga,
Portugal. O curso foi ministrado pela Dra. Cristina Souza Motta, curadora da Micoteca URM,
5
pelos doutores Nelson Lima e Cledir Santos da MUM-Portugal e contou com a participação
da Drª Zofia Kozakiewicz e Dr. Jens Christian Frisvad, ambos do Reino Unido, e
reconhecidos mundialmente como grandes especialistas em taxonomia dos gêneros
Aspergillus e Penicillium.
Todas essas ações citadas acima demonstram o compromisso da equipe da Micoteca
URM em estar em constante atualização e busca de recursos, para atender a demanda
decorrente dos avanços na microbiologia industrial, biotecnologia e engenharia genética e
genômica, visando o fornecimento de serviços e material biológico, que atendam às normas
internacionais e boas práticas laboratoriais.
Neste contexto, a Micoteca URM está caracterizando amostras estocadas quanto a
aspectos taxonômicos e biotecnológicos, através de projetos de pesquisa e dos desenvolvidos
por alunos de graduação e pós-graduação em parcerias com instituições nacionais e
internacionais como a Micoteca da Universidade do Minho em Braga, Portugal, com o
Laboratório de Tecnologia de Bioativos (LABTECBIO) e a Unidade Acadêmica de
Garanhuns (UAG), ambos da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), com o
Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE). Outra parceria internacional está
sendo estabelecida com o Cereal Research Centre/Agriculture and Agrifood Canada, no
âmbito deste projeto.
As características morfológicas e fisiológicas além de análise de metabólitos têm sido
utilizadas na identificação de espécies, mas por causa de sua reconhecida variação não tem
sido suficientemente satisfatórias. Recentemente, dados de seqüências multilocus aliados a
outros critérios também tem se mostrado úteis para o reconhecimento de espécies (GEISER et
al, 2007). Devido às alterações taxonômicas de alguns gêneros de fungos, como Aspergillus,
Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Penicillium e Trichoderma, se faz necessário a
revisão e a atualização taxonômica contínua de espécies pertencentes ao acervo da Micotea
URM. A identificação de novas culturas e a autenticação taxonômica de fungos desta coleção,
não apenas pela taxonomia clássica, documentando os caracteres morfológicos por
microscopia óptica de luz e eletrônica de varredura, mas sim através de uma abordagem
polifásica que integra taxonomia clássica (morfologia e fisiologia), técnicas moleculares e a
técnica de MALDI-TOF MS, garantirão qualidade ao acervo da coleção.
Estudos recentes realizados sobre identificação de fungos e caracterização através de
MALDI-TOF MS (Matrix Assited Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass
Spectrometry) têm mostrado o potencial desta nova abordagem, com boa discriminação na
maioria dos casos. A validação por MALDI-TOF MS pode ser alcançada usando linhagens
6
fúngicas de referência para a obtenção de espectros correspondentes em bancos de dados,
além disso, os dados podem ser incluídos aos de morfologia, bioquímica e biologia molecular,
caracterizando desta forma uma abordagem polifásica (SANTOS et al., 2009). Neste sentido,
MALDI-TOF MS tem vantagens importantes sobre os métodos morfológicos e moleculares,
sendo uma tecnologia rápida, onde uma simples raspagem de um meio de cultura contendo o
fungo pode ser analisada por essa técnica (KELLER et al., 2008; SANTOS et al., 2009). Por
outro lado, a análise do secretoma fungos também pode ser como uma ferramenta de
diagnóstico para a identificação de estirpes de Fusarium. Para isso se faz é necessário
identificar péptidos únicos das proteínas secretadas que são cepa-específicos. Os secretomas
de Fusarium spp. utilizando uma abordagem LC-MS, demonstrou conter muitas proteínas
(DWIVEDI et al, 2008; BROWN et al., 2012).
Em 2007 um workshop internacional na Holanda pôs em ampla discussão sobre várias
questões para uma delimitação dos táxons Aspergillus e Penicillium, foi recomendada uma
abordagem polifásica neste contexto. Características morfológicas devem ser combinadas
com outros caracteres que incluem seqüenciamento de DNA, dados fisiológicos, ecológicos e
análise de extrólitos. Tem sido sugeridos o seqüenciamento da região ITS do rDNA além de
outros loci mais variáveis, no caso de espécies estreitamente relacionadas, tais com Btubulina, actina, calmodulina e outros gens ricos em introns (SAMSON et al., 2007).
Os Zygomycetes apresentam características morfológicas variadas, como a presença
de hifas cenocíticas, contendo septos apenas na base das estruturas de reprodução, ou
apresentam septos espaçados de forma irregular, além de estruturas assexuadas como
esporângios, esporangiósporos, esporangíolos, merosporângios e merósporos. Podem ser
isolados de diversos substratos como solo, excrementos e órgãos vegetais (ALEXOPOULOS
et al., 1996; KENDRICK, 2000). Varias espécies desse grupo são capazes de produzir
enzimas e ácidos orgânicos com potencial biotecnológico (CORDEIRO NETO et al., 1997,
SANTIAGO & SOUZA-MOTTA, 2006, NEVES et al., 2012). Esse aparato enzimático faz de
muitas espécies do grupo excelentes competidoras em comparação com os demais fungos. A
maioria dos Zygomycetes, principalmente os pertencentes à ordem Mucorales, apresentam
rápido crescimento, mesmo em meios de cultura simples, sendo os primeiros a colonizar
vários substratos, degradando os açucares menos complexos (RICHARDSON, 2009).
Para dar continuidade a ampliação ao aumento do acervo da Micoteca URM, serão
isolados fungos filamentosos de solo e endofíticos da Caatinga, bem como leveduras
presentes em mel das abelhas sem ferrão coletadas em área deste rico bioma.
7
Em geral, os fungos do solo possuem largo potencial biotecnológico, sendo
amplamente utilizados para a produção de enzimas de interesse industrial, ambiental,
farmacêutico, alimentício, etc. No entanto, estima-se que apenas 5% dos fungos existentes nos
solos tenham sido descritos (BDT, 2006). Nesse contexto destacam-se os fungos filamentosos
presentes em solos do bioma Caatinga, ainda pouco conhecidos pela ciência. A Caatinga é um
bioma exclusivo do Brasil, que abriga espécies de vegetais animais e micro-organismos
endêmicas, apresentando clima semi-árido, quente e com baixa pluviosidade, entre 200 e 800
mm anuais (LEAL et al., 2005; FRANCA - ROCHA et al., 2007; ALVES et al., 2009).
Por outro lado, na busca de microrganismos novos para a ciência, produtores de
substâncias de interesse econômico na medicina, na agricultura e indústria, os endofíticos, que
podem ser isolados do interior de tecidos vegetais desinfestados superficialmente, e que não
causam danos ao hospedeiro, se mostram como uma moderna e relativamente inexplorada
fonte de diversidade microbiana produtora de metabólitos biologicamente ativos, dentre os
quais destacam-se as enzimas (STROBEL et al., 2004; HALLMANN et al.,1997) e podem
desempenhar um papel importante na sobrevivência das plantas, melhorando a absorção de
nutrientes (GASONI e GURFMKEL, 1997; MALINOWSKI, BRAUER e BELESKY, 1999),
desenvolvimento e produção de metabólitos de promoção do crescimento, como giberelinas
(CHOI et al., 2005; RIM et al., 2005) e auxinas (DAI, YU e LI, 2008), auxiliando na
adaptabilidade ecológica do hospedeiro por incrementar a tolerância a estresses bióticos e
abióticos. Dentre as substâncias antitumorais produzidas por microrganismos endofíticos se
encontra a L-asparaginase que tem sido muito utilizada no tratamento anticancerígeno
(STROBEL et al., 1996; SARQUIS et al., 2004; THEANTANA et al., 2007, 2009; HYDE e
SOYTONG, 2008; LAPMAK et al., 2010; XU et al., 2010; SONIYAMBI et al., 2011; QUI et
al., 2012). Na literatura, são escassos os trabalhos referentes à avaliação da micobiota
endofítica de Cactaceae (BILLS, 1996), com exceção de um estudo preliminar de fungos
endofíticos associados à Opuntia stricta de regiões semi-áridas da Austrália (FISHER et al.,
1994), outra de espécies de cactos do Arizona (SURYANARAYANAN et al. 2005), e fungos
endofíticos isolados de Opuntia ficus-indica no nordeste do Brasil (BEZERRA et al., 2012).
Além de fungos do solo e endofíticos provenientes do bioma Caatinga, ainda são
desconhecidas as leveduras presentes no mel produzido por abelhas sem ferrão, como
mandaçaia (Melipona mandacaia), mandurí (Melipona marginata), cupira (Patarmonia
cupira) e canudo (Scaptotrigona postiça) comuns em áreas de Caatinga. Existe um crescente
interesse na microbiota do mel, uma vez que ele é utilizado desde como alimento até a
formulação de fármacos e cosméticos (SODRÉ et al. 2007). Algumas leveduras conhecidas
8
por osmofílicas são capazes de se desenvolverem no mel uma vez que toleram as condições
de baixa atividade de água e alta concentração de açucares desse alimento, podendo crescer
até mesmo no mel maduro, fermentando-o facilmente (SODRÉ et al. 2007). A habilidade das
leveduras colonizarem uma grande variedade de vegetais e substratos contribui para sua
diversidade de espécies, entretanto no Brasil, poucas espécies de leveduras foram descritas,
havendo possibilidade de novas descobertas (MAUTONE, 2008).
Com isto, o isolamento e identificação de fungos solo, endofíticos e de mel,
provenientes de áreas de Caatinga pode ser promissor para o aumento do acervo da Micoteca
URM e pela provável obtenção de espécies novas para a ciência e com possível capacidade de
produção de metabolitos de interesse biotecnológico.
Culturas de fungos serão caracterizadas quanto a produção das enzimas lipase, Lasparaginase, tanase, xilanase, celulase, pectinase, amilase e protease, para que possam ser
empregadas com segurança por outros pesquisadores e pela indústria.
As lipases são enzimas capazes de catalisar reações de hidrólise, esterificação,
transesterificação e lactonização (esterificação intramolecular) em lipídios (PASTORE, 2003;
SAXENA et al., 2003; BUSSAMARA et al., 2010). Do ponto de vista econômico e industrial,
as lipases obtidas de microrganismos (bactérias, leveduras e fungos filamentosos) são as mais
utilizadas nos setores alimentícios e farmacêuticos (PEREIRA-MEIRELLES, 1997).
A tanase é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis
como ácido tânico, em glicose e ácido gálico (HELBIG, 2000; BANERJEE, et al, 2001;
COSTA, et al., 2008), podendo ser produzida na presença de acido tânico por fungos
filamentosos, bactérias e leveduras. Dentre os fungos filamentosos produtores de tanase, o
gênero Penicillium é o segundo melhor produtor, precedido apenas por espécies de
Aspergillus (AGUILAR et al., 2001 a,b; MACEDO et al., 2005; COSTA, et al., 2008). Esta
enzima pode ter vasta aplicação na indústria de bebidas (principalmente sucos e cervejarias)
cosméticos, farmacêutica e indústria química (LEKHA; LONSANE, 1994), sendo
principalmente utilizada para a produção de ácido gálico na estabilização da coloração dos
vinhos, refrigerantes a base de café, processo de tratamento do couro, detanificação de
alimentos e para tratamento de efluentes na indústria de couros (BANERJEE, et al, 2001).
As xilanases são um complexo de enzimas responsáveis principalmente pela hidrólise
das ligações β-1,4 presentes na xilana vegetal, componente da hemicelulose. Entre os fungos,
Aspergillus e Trichoderma são excelentes produtores da enzima em escala industrial.
(COUGHLAN; HAZLEWOOD, 1993; MOORE-LANDECKER, 1996). A xilanase pode ser
utilizada na dieta de animais monogástricos para hidrolisar os polissacarídeos não-amiláceos
9
como β-glucanos e arabinoxilanos, encontrados em cereais. A presença de altos níveis destes
polissacarídeos na dieta destes animais resulta em baixa conversão alimentar e lentidão no
ganho de peso (ALBERTON et al., 2009). Na indústria de papel, participa auxiliando no
branqueamento da polpa e reciclagem de papel. Tais enzimas podem ainda ser aplicadas na
clarificação de sucos e vinhos, na fabricação de café solúvel, no aumento do teor nutricional
da silagem e para dar textura a derivados lácteos (HALTRICH, 1996; NEVES et al., 2011).
Na natureza, a celulose, polissacarídeo mais abundante, é degradada pela hidrólise
enzimática das celulases, um complexo celulolítico composto por endo- -1-4-glicanases, exo-1-4-glicanases e
-glicosidases, que atuam em sinergismo (BHAT, 2000). As
endoglicanases quebram aleatoriamente as cadeias de celulose e diminuem o comprimento
dessas
cadeias
(endo-1-4- -D-glicano-hidrolase).
As
exo- -1-4glicanase
atacam
as
extremidades do polímero com o grupo final redutor ou não redutor e produzem
primeiramente celobiose. Estas quando presentes na mistura celulolítica, representam muitas
vezes 50 a 70% de todas as enzimas. As -glicosidases, que hidrolisa a celobiose à glicose,
remove a celobiose, que inibe as reações de degradação de celulose. A utilização de enzimas
celulolíticas isoladas de culturas de fungos na alimentação de ruminantes tem mostrado
resultados satisfatórios, como aumentos na digestibilidade da matéria seca e da fibra em
detergente neutro, na produção de leite e no teor de gordura, e no ganho de peso em bovinos
(SINGH et al, 2009). Aspergillus japonicus URM5620 é um dos promissores para produção
desta enzima (HERCULANO et a., 2012). As pectinases formam um grupo de enzimas que
degradam substâncias pécticas, hidrolisando ligações glicosídicas ao longo da cadeia
carbônica. Podem ser produzidas por plantas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias.
Dentre os fungos, o gênero Aspergillus se destaca como bom produtor destes biocatalizadores,
especialmente certas linhagens de A. niger (DINU et al., 2007, MACIEL et al., 2011). As
pectinases apresentam grande importância comercial na indústria de sucos de frutas, na
recuperação de óleos essenciais, na extração de óleos vegetais, na fabricação de ração para
animais, na indústria de vinhos, na indústria têxtil e na indústria de papel e celulose
(UENOJO; PASTORE, 2007).
As amilases são enzimas capazes de degradar o amido, sendo obtidas do malte ou
produzidas por diversos vegetais ou microrganismos, através de processos fermentativos
(CUZZI et al., 2011). Essa classe de enzimas é utilizada na indústria alimentícia para
preparação de cervejas, geléias e obtenção de glucose livre para as mais variadas aplicações
(MICHELIN, 2005). Além da indústria de alimentos, estas enzimas podem ser utilizadas na
10
formulação de detergentes e nas indústrias de papel, farmacêutica, fermentação e têxtil
(OLIVEIRA et al., 2007).
Asparaginase é uma enzima usada como agente quimioterápico para o tratamento de
câncer humano (WRISTON; YELLIN, 1973; CAPIZZI et al., 1984). A prática terapêutica
mais comum é injetar enzima livre por via intravenosa, a fim de diminuir a concentração
sanguínea de L-asparagina (MITCHELL et al. 1994). No entanto, L-asparaginase originada a
partir de bactérias e quando utilizada por longo prazo, pode causar hipersensibilidade, levando
a reações alérgicas e anafilaxia (REYNOLDS; TAYLOR, 1993, KEATING et al., 1993). Há
uma busca para as outras fontes de produção de L-asparaginase para que se dimuniam os
efeitos colaterais ocasionados pela utilização dessa substância quando sintetizada por
bactérias. Fungos como Aspergillus, Colletotrichum, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium e
Talaromyces têm sido relatados como grande potencial para a produção de asparaginase com
menores efeitos colaterais ao ser humano (WADE et al., 1971; IMADA et al., 1973; WIAME
et al.,1985; PINHEIRO et al., 2001; SARQUIS et al., 2004; THEANTANA et al. (2007,
2009)). A demanda por L-asparaginase tende a aumentar nos próximos anos devido a
potencial aplicação no tratamento de tumores cancerígenos contribuindo para a cura de
diversos pacientes acometidos por câncer (KRISHNAN et al., 1998; SOLIMAN et al., 2005;
PEDRESCHI et al., 2008).
Outro grupo de enzimas com elevada aplicação biotecnológica é o das proteases. As
proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de proteínas, possuem ampla variedade de
aplicações, estando entre os três maiores grupos de enzimas industriais. Constituem um dos
mais importantes grupos de enzimas industriais e têm aplicação em diferentes indústrias,
como de alimentos, bebidas, têxtil, farmacêutica e de detergentes. Na indústria de alimentos, a
protease provoca a degradação de proteínas pela hidrólise das ligações peptídicas e esta
reação é importante na preparação de uma grande variedade de produtos alimentícios
processados. O interesse científico em proteases e suas ações em diferentes proteínas dos
alimentos não somente podem resultar em melhores produtos, mas também estimulam o
desenvolvimento de um grande número de novas aplicações para as proteases na produção de
alimentos e seus ingredientes (MELO et al., 2009).
A atual proposta visa a ampliação e caracterização do acervo da Micoteca URM
através de uma abordagem polifásica, sobretudo o aumento do número de amostras fúngicas
que terão regiões do seu DNA sequenciado pela plataforma multiusuária de Genômica e
Expressão Gênica do Centro de Ciências Biológicas da UFPE na forma de serviço
11
tecnológico. O sequenciamento do DNA das amostras torna-se uma excelente ferramenta por
ser uma técnica com elevada precisão na identificação das espécies. Compondo a abordagem
polifásica, as análises morfológicas e moleculares serão integradas às análises por MALDI
TOF-MS. Além da ampliação e caracterização do acervo, com esta proposta pretende-se a
manutenção da ISO 9001/2008, que está em implementação com previsão da obtenção da
certificação em dezembro de 2012, com apoio do projeto Multiusuário APQ-0290-2.12/10 do
Edital FACEPE 07-2010.
c) Descrição das condições atuais de utilização do acervo, inclusive quanto ao número e
diversidade de pesquisadores/grupos/instituições usuárias e disponibilidade de acesso
por pesquisadores de outros grupos/instituições de pesquisa
Como uma coleção que foi fundada em 1954, as culturas do acervo da micoteca URM
deve está em contínua reativação e autenticação taxonômica.
A Micoteca URM disponibiliza culturas de fungos para diversos pesquisadores de
Pernambuco e de outros estados do Brasil, pesquisadores de diversas instituições de ensino,
pesquisa e do setor privado do país utilizam culturas do acervo desta coleção, dentre as
instituições podemos citar: Laboratório de Biocontrole Farroupilha LTDA-RS, Laboratório de
Análises e Pesquisas Clínicas Carbélia-PR; Universidade Federal de Alagoas, Centro de
Tecnologias Estratégicas de Pernambuco (CETENE), Universidade Federal de Pernambuco,
Universidade Federal Rural de Pernambuco (Campus Recife, Garanhuns e Serra talhada),
LAMEN – Garanhuns/PE, Laboratório de Controle Biológico – Maceió/AL, Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami-LIKA, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – SP,
Centro de Tecnologia de Análises LTDA. Vitória-ES, Hospital das Clínicas- UFPE, Hospital
Veterinário da UFRPE, UNICHAPECÓ, Universidade Federal de São Paulo, Universidade do
Vale do Paraíba, Universidade Federal da Paraíba, Universidade Estadual de Minas Gerais,
BioRJ Produtos Biológicos e Científicos LTDA, Laboratório Químico e Farmacêutico Nikkho
do Brasil LTDA, Universidade Estadual de Campinas, Universidade Federal do Espírito
Santo, Universidade Federal de Campina Grande, Faculdade Pernambucana de Saúde,
Universidade Católica de Pernambuco, Universidade de Pernambuco, Instituto de Medicina
Integral de Pernambuco, Escola de Engenharia de Lorena (USP), Faculdade de Ciências
Farmacêuticas
de
Ribeirão
Preto
(USP),
Universidade
Estadual
de
Montes
Claros(UNIMONTES), Hospital Otávio de Freitas (Recife), Biotech- Maceió –AL, Instituto
de Botânica de São Paulo, Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul, Universidade
Federal do Pampa, Universidade Estadual de Mato Grosso, Universidade Federal da Paraíba,
12
Universidade Federal de Sergipe, UNAERP/SP, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, EMBRAPA Jaguariúna - SP, FEJAL /
CESMAC – AL, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Faculdade de Filosofia, Ciências
e Letras de Ribeirão Preto – SP, Coleção do Departamento de Parasitologia da Universidade
Federal do Amazonas – DPUA, Universidade Estadual de Maringá-PN, Universidade de
Brasília, Universidade Federal Rural do Rio Grande do Sul, LAF-NUCT Campus São
Cristovão, Universidade Federal de Viçosa, Associação Caruaruense de Ensino Superior e
Claeff Engenharia e Produtos Químicos LTDA. Camaragibe-PE. Os pesquisadores estão
listados em uma tabela no ítem do relatório ao final deste texto.
A Micoteca URM disponibiliza também culturas para o desenvolvimento projetos de
pesquisa, de iniciação científica, monografias de conclusão de curso de graduação e
especialização, dissertações e teses, gerando diversas publicações em periódicos nacionais e
internacionais, contribuindo com a formação de recursos humanos especializados.
Cursos que a Micoteca URM atende com o fornecimento de culturas:
Cursos de Graduação:
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Bacharelado em Ciências Biológicas
Bacharelado em Biomedicina
Bacharelado em Ciências Biológicas-Ciências Ambientais
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
Medicina Veterinária – Unidade Acadêmica de Garanhuns(UAG)
Engenharia de Pesca – Unidade Acadêmica de Serra talhada (UAST)
Zootecnia – UAG e UAST
Agronomia – UAG
Engenharia de Alimentos – UAG
Programas de Pós-graduação:
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Biologia de Fungos
Ciências Biológicas
Bioquímica e Fisiologia
Ciências Farmacêuticas
13
Biotecnologia
Inovação Terapêutica
Genética e Biologia celular
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
Biociência Animal
Fitopatologia
Química
Biociência Animal Química
Biologia Aplicada à Saúde Química
Produção Agrícola/UAG
Rede Nordeste de Biotecnologia- RENORBIO.
Disponibilidade de acesso por pesquisadores de outros grupos/instituições de pesquisa
Uma das metas deste projeto é continuar o apoio a implantação de um laboratório de
micologia na Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UAST), da Universidade Federal de
Pernambuco (UFRPE), consolidação a formação de novo grupo de pesquisa em micologia
nesta unidade, que não tem Pós-Graduação na área. Os professores desta unidade envolvidos
neste projeto, foram recentemente contratados pela UAST são André Luiz Cabral Monteiro de
Azevedo Santiago e Cynthia Costa, ex-alunos do Programa de Pós-Graduação em Biologia de
Fungos do Departamento de Micologia da UFPE.
A implementação do acervo também atenderá a outros pesquisadores de diversas
instituições de Pernambuco e do país, e proporcionará um melhor atendimento aos atuais
usuários.
d) Descrição das condições e mecanismos específicos que se pretende implantar para a
disponibilização do acervo de interesse científico à comunidade de pesquisadores,
inclusive de outras instituições
Utilização de novas técnicas de identificação de fungos filamentos e leveduras, como a
técnica com a biologia molecular incluindo sequenciamento de regiões do genoma das
espécies novas e das que a taxonomia clássica não seja suficiente para identificar ao nível de
14
espécie. Desta forma, serão disponibilizadas culturas do acervo da Micoteca URM, com
identificação mais precisa para pesquisadores do Estado e do país;
Implantação de um setor na Micoteca URM para amplificação de regiões do DNA de
culturas do acervo, pois o Laboratório de Biologia Molecular do Depatamento de Micologia,
está sobrecarregado, tornando o tempo longo para análises das amostras;
Compondo uma abordagem polifásica para identificação e autenticação das espécies do
acervo da Micoteca URM será também utilizada a técnica do MALDI TOF-MS;
Implantar e disponibilizar on line no site da Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca) um
banco de imagens de culturas de fungos pertencentes ao acervo desta coleção, com as imagens
de culturas de fungos obtidas por microscopia óptica de luz e eletrônico de varredura;
Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial baseado na ISO 9001:2008, previsto para
ser implantado na Micoteca URM, em dezembro de 2012, com o apoio do Projeto FACEPE
Multiusuário do Edital 07/2010, e ISO 17025 previsto para ser implantado na Micoteca URM,
em outubro de 2013, com o apoio do Convênio FINEP: 01.08.0392.00, através auditorias e
assessorias semestrais por empresas especializadas;
Dar continuidade ao apoio a implantação de um laboratório de micologia na Unidade
Acadêmica de Serra Talhada-PE, da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
com a aquisição de materiais de consumo e de equipamentos necessários. Com isto, pretendese ampliar os estudos em taxonomia de fungos do semi-árido e aumento do acervo da
Micoteca URM com estes isolados. Esta atividade foi iniciada com o apoio do Projeto
FACEPE Multiusuário do Edital 07/2010;
Provável geração de processos e produtos passíveis de obtenção de patentes com o acervo
da coleção;
Implementação na rotina, o fornecimento também de culturas liofilizadas, para diminuir o
tempo entre a solicitação do interessado e a entrega da(s) amostra(s) de fungo(s),
proporcionando assim um atendimento mais rápido, seguro, preciso e de menor custo.
Disponibilização pela Micoteca URM de um maior do número de culturas do acervo
produtoras de enzimas com aplicações biotecnológicas diversas, podendo ser utilizadas por
outros pesquisadores e pelo setor industrial.
e) Objetivos e metas a serem alcançados
Ampliar o número de amostras de fungos pertencentes ao acervo da Micoteca URM,
autenticadas taxonomicamente através do sequenciamento de regiões do DNA;
15
Ampliar o acervo da Micoteca URM através de coleta e isolamento e recebimento de
fungos filamentosos e leveduras de outros pesquisadores, isolados de diversos
ambientes, substratos e hospedeiros;
Implantar na rotina, o fornecimento também de culturas liofilizadas;
Implantar na Micoteca URM, um setor para extração e amplificação de regiões do
DNA de culturas do acervo;
Aumentar o número de amostras de fungos fornecidas a pesquisadores e outros
interessados;
Identificar até o nível de espécie culturas de fungos filamentosos recém isoladas,
através de uma abordagem polifásica;
Caracterizar o secretoma de30 isolados de Fusarium solani pertencentes ao acervo da
Micoteca URM, utilizando uma abordagem LC-MS;
Reativar e revisar taxonomicamente culturas de interesse biotecnológico do acervo da
Micoteca URM, por abordagem polifásica;
Implantar e disponibilizar on line no site da Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca)
um banco de imagens de culturas de fungos pertencentes ao acervo desta coleção,
obtidas por microscopia óptica de luz e de varredura;
Caracterizar e disponibilizar para outros pesquisadores culturas de fungos
filamentosos e leveduras produtoras de enzimas de interesse biotecnológico, como
lipase, L-asparaginase, tanase, xilanase, celulase, pectinase, amilase e protease, assim
como com atividade antimicrobiana;
Colaborar na formação de recursos humanos nas áreas de taxonomia de fungos e
biotecnologia;
Manter e implantar novas parcerias nacionais e internacionais;
Manter um Sistema de Gestão Laboratorial baseado nas Normas ISO 9001:2008 e ISO
17025:2005;
Divulgar as atividades desenvolvidas pela Micoteca URM em eventos, reuniões e
artigos publicados em revistas nacionais e internacionais.
Metas
Acervo da Micoteca URM ampliado em 5% do total de acesso atual até a conclusão
do projeto;
Aumento em 20% do fornecimento de amostras do acervo da Micoteca URM;
16
Aumento
do
número
de
culturas
de
fungos
reativadas
e
autenticadas
taxonomicamente, em cerca de 200 culturas, de dezembro de 2013 a novembro de
2014;
Implantação do fornecimento de culturas de fungos liofilizadas a partir de junho de
2013;
Implantação na Micoteca URM de um setor para extração e amplificação de regiões
do DNA de culturas do acervo até o final do projeto;
Isolamento e identificação por taxonomia clássica, cerca de 1000 culturas de fungos
filamentosos e leveduras a partir de janeiro 2013 até outubro de 2013;
Caracterização molecular de aproximadamente 100 amostras de Aspergillus e
Penicillium e 65 culturas de Mucor do acervo da Micoteca URM, de março de 2013 a
março de 2014;
Sequenciamento de cerca 100 de fragmentos amplificados da região ITS do rDNA do
gen calmodulina e β tubulinina, de culturas de fungos do acervo da Micoteca URM, de
março de 2013 a setembro de 2014;
Deposito no GenBank de cerca de 200 sequências dos táxons estudados, até novembro de
2014;
Identificação cerca de 100 culturas de fungos utilizando também a técnica do MALDI
TOF MS de março de 2013 a outubro de 2014;
Conhecimento do secretoma de 50 isolados de F. solani pertencentes ao acervo da
Micoteca URM, utilizando uma abordagem LC-MS até o final do projeto;
Caracterizção qualitativa cerca de 100 culturas de fungos do acervo da Micoteca URM
quanto a produção de enzimas, , assim como com atividade antimicrobiana até
novembro de 2014;
Disponibilização de cerca de 200 culturas caracterizadas por abordagem polifásica e
quanto à produção de enzimas, assim como com atividade antimicrobiana na
conclusão do projeto;
Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial ao final do projeto;
Formação de cerca de 20 alunos e profissionais nas áreas de taxonomia de fungos e
biotecnologia ao longo do projeto;
Publicação de cerca de 100 resumos em eventos e 10 artigos em revistas nacionais e
internacionais.
17
f) Metodologia a ser empregada;
1. Ampliação do acervo da Micoteca URM
1.1. Coletas e isolamento de espécies de Zygomycetes, Aspergillus e Penicillium presentes
em solo de áreas de Caatinga de municípios de Pernambuco
Serão realizadas coletas de amostras de solo de áreas de Caatinga nos municípios de
Buíque, Ibimirim, Serra Talhada e Tupanatinga. Em cada área serão distribuídos
aleatoriamente 5 quadrantes de 25m2 (5x5m) respeitando uma distância mínima de 10m entre
si. Em cada quadrante serão coletadas seis subamostras de solo em pontos equidistantes a uma
profundidade de 0-20 cm, totalizando 5 amostras. As amostras de solo serão coletadas, com
auxílio de uma pá de jardinagem, acondicionadas em sacos plásticos etiquetados, conservadas
em caixas de isopor com gelo e encaminhadas para manipulação no laboratório de pesquisa da
Micoteca URM. Para o isolamento, uma suspensão do solo coletado será feita segundo o
método de Clark (1965) modificado, até a obtenção das diluições 1:1000 e 1:10000. De cada
diluição, 1 mL será semeado em triplicata na superfície dos meios: ágar Sabouraud, pH 5,5
acrescido de cloranfenicol (80μg/L) e rosa bengala (0,05ml/L) e em ágar dichloran glycerol
(DG- 18) (HOCKING E PITT, 1980) que favorece o desenvolvimento de fungos xerofílicos,
contidos em placas de Petri em triplicata. As placas permanecerão à temperatura ambiente (28
ºC ± 1 ºC) e o crescimento das colônias será acompanhado por até 72 horas. Após purificação,
os isolados serão transferidos para meios específicos (BENNY, 2008, LACAZ et al., 2002)
para posterior identificação.
1.2. Coletas e isolamento de fungos endofíticos da catingueira (Caesalpinia pyramidalis
Tui.) em área de Caatinga
O material vegetal será transportado ao Departamento de Micologia da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE) e processado em até 24 horas. De cada planta, serão retirados
15 fragmentos de cerca de 1cm2, perfazendo 45 fragmentos em cada amostra vegetal
(indivíduo). Serão inoculados cinco fragmentos em cada placa de Petri, totalizando 81 placas
para cada coleta. O material vegetal será desinfestado de acordo com Araújo et al. (2002).
Após a desinfestação, os fragmentos serão transferidos assepticamente para a superfície do
meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) suplementado com antibióticos (cloranfenicol e
tetraciclina), para suprimir o crescimento bacteriano. As placas de Petri serão incubadas a
30ºC por até 30 dias, verificadas diariamente e qualquer colônia de fungo presente será
isolada, purificada e mantida em BDA para posterior identificação. Para verificar a eficácia da
18
desinfestação alíquotas da última água de lavagem (1 mL), serão inoculadas no mesmo meio
contido em placas de Petri, seguindo as mesmas condições de incubação.
1.3. Coletas e isolamento de leveduras presentes no mel de abelhas sem ferrão e dos
frutos de plantas da Caatinga
Será coletado o mel das abelhas sem ferrão: mandaçaia (Melipona mandacaia),
mandurí (Melipona marginata), cupira (Patarmonia cupira) e canudo (Scaptotrigona
postiça). As coletas serão realizadas entre janeiro e dezembro de 2013 em uma área de
Caatinga e outra urbana, ambas localizadas no município de Serra Talhada/PE, Brasil.
Conforme recomendado por Gilliam, Roubik e Lorenz (1990) e Souza et al. (2009),
amostras de 1mL de mel serão obtidas por meio de sucção com seringa descartável
diretamente nos potes fechados de armazenamento das colmeias das abelhas. Antes da
retirada da alíquota para análise, os potes de mel serão previamente higienizados
externamente com água destilada e álcool 70% segundo Gilliam, Roubik e Lorenz (1990) para
retirada de sujeiras e microrganismos externos.
Todas as amostras serão etiquetadas e acondicionadas em caixa isotérmica para o
transporte e processamento no laboratório de Biologia da Universidade Federal Rural de
Pernambuco - Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UFRPE-UAST) para isolamento dos
micro-organismos. Em seguida as culturas puras, serão identificadas na Micoteca URM. As
leveduras serão isoladas por meio do plaqueamento em superfície seguindo as recomendações
de Vargas (2006) e incubadas por 5-8 dias a 35º C ± 3°C.
As colônias serão purificadas e analisadas quanto às características morfológicas e repicadas
para tubos contendo meio ágar Sabouraud acrescido de 0,2mg/L de clorafenicol, incubadas a
30º C por 48 h e em seguida estocadas sob refrigeração para posterior identificação.
2. Reativação de fungos do acervo da Micoteca URM
Para reativação, as culturas serão transferidas para Caldo Glicosado (LACAZ et al.,
2002) e mantidas à 28ºC por três dias. Após crescimento, serão transferidas para o meios de
cultura específicos, contidos em tubos de ensaio e posteriormente mantidas à mesma
temperatura. Para autenticação taxonômica das culturas, serão observadas as características
macroscópicas, tais como: coloração, consistência e diâmetro das colônias e, microscópicas
como: estruturas somáticas e reprodutivas, sendo estas últimas observadas através do cultivo
sob lamínula (DALMAU, 1929) utilizando o meio Ágar Czapeck, onde serão semeados
19
fragmentos da colônia em dois pontos eqüidistantes da placa, cobrindo-os com lamínulas
esterilizadas e incubados a 28ºC. Após aproximadamente 7 dias, será removida a lamínula do
cultivo e colocada sobre uma lâmina de microscopia, contendo uma gota de corante Azul de
Aman para posterior observação das microestruturas sob microscópio de luz
3. Identificação e autenticação de culturas de fungos
3.1 Fungos filamentosos
Taxonomia clássica
Para a identificação através de taxonomia clássica de todas as amostras de fungos
serão observadas características macroscópicas (coloração, aspecto e diâmetro das colônias) e
microscópicas (microestruturas somáticas e reprodutivas). A identificação será realizada
através de literatura específica, como: Benny (1982), Domsch (1993), Hesseltine & Fennel
(1995), Jacobs & Botha (2008), Klick e Pitt (1988); Klich (2002), Mehrotra & Mehrotra
(1979, 1978), Mirza et al. (1979), Pitt (1991), Raper e Thom (1949), Samson e Frisvad
(2004), Schipper (1978, 1984, 1990), Subrahamanyam (1983), dentre outros.
Visualização de microestruturas de culturas de fungos por Microscopia Óptica de
varredura (MEV)
Características microscópicas de cerca de 100 amostras de fungos serão também
observadas também por MEV no CETENE. As amostras serão armazenadas a 5 ºC em estufa
BOD por 24 h, sendo em seguida processadas segundo a metodologia adaptada de Kitajima &
Leite (1997).
Caracterização Molecular
Cerca de 200 amostras de fungos serão selecionadas para a caracterização molecular.
Estas amostras serão àquelas cuja identificação por taxonomia clássica não seja conclusiva e
as prováveis espécies novas. As atividades de amplificação do DNA serão realizadas no
Departamento de Micologia, Micoteca URM, UFPE.
Extração do DNA genômico e amplificação da Região ITS do rDNA
A extração do DNA genômico será realizada de acordo com O’DONNELL (1979) e
KURAMAE-IZIOKA et al. (1997). A massa micelial será triturada na presença de nitrogênio
líquido e o micélio colocado em tubos de Eppendorf de 1,5 mL. Serão adicionados 700 µL do
tampão de extração (tris-HCl 1M; pH 8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5 mM; pH 8,0; dodecil sulfato
20
de sódio 10%) previamente aquecido a 65°C. As amostras serão incubadas em banho-maria a
65°C, por 30 minutos, e agitadas, levemente, a cada 10 minutos. Em seguida, serão
adicionados 500 µL de acetato de potássio (5M), procedendo-se a homogeneização,
incubação no gelo por 30 minutos e centrifugação a 14500g por 10 minutos. Retirado o
sobrenadante, um volume da solução clorofil (clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de
24:1), será adicionado, seguido de centrifugação a 14500g por 10 minutos. Após a
centrifugação, o sobrenadante será transferido para novos tubos, aos quais será adicionado um
volume de isopropanol absoluto resfriado a 4°C. Após inversão dos tubos por várias vezes, os
mesmos serão centrifugados para precipitação do DNA, descartando-se o sobrenadante em
seguida. O “pellet” será lavado com etanol 75%, e as amostras submetidas à centrifugação a
14500g por 10 minutos. Após secagem em temperatura ambiente, o DNA será ressuspendido
em 70 µL de tampão TE (Tris-HCl 1M e EDTA 0,5M; pH 8,0), e a suspensão de DNA será
armazenada a -20°C até o momento do uso.
Amplificação das regiões ITS 1 e ITS2, gens B-tubulina e calmodulina
Caso ocorram novos táxons ou dificuldade na identificação de algumas espécies, as mesmas
serão analisadas pela amplificação e sequenciamento das regiões ITS1 e ITS2 do rDNA, gens
B-tubulina e calmodulina. O DNA total será extraído segundo Kuramae Itioka (1997). As
regiões ITS1 e ITS2 serão amplificadas utilizando os primers ITS 1 e ITS 4, como descrito
por Varga et al. (2000) e White et al. (1990). A amplificação parcial do gen β tubulina será
realizada utilizando os primers Bt2a e Bt2b, segundo Glass e Donaldson (1995) e Samson et
al. (2004). A amplificação parcial do gen calmodulina será feita como descrito por Serra et al.
(2006). Um ou dois representantes, de cada gênero, com taxonomia clássica confirmada, serão
utilizados como controle e analisados molecularmente.
Culturas de Zygomycetes- Amplificação das regiões ITS 1 e ITS2
Serão amplificadas e sequenciadas regiões ITS1 e ITS2 do rDNA de 65 culturas de
Mucor estocadas na Micoteca URM, bem como as culturas pertencentes ao filo Zygomycetes
que estejam sendo incorporadas à Coleção e apresentem dificuldade de identificação
por taxonomia clássica, ou sejam prováveis espécies novas. O DNA extraído será usado como
molde para as reações de PCR usando os primers ITS1 e ITS4 (White et al. 1990). As reações
de amplificação serão realizadas em um volume final de 50 µl, contendo75 mM Tris-HCl pH
8,8, 200 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTPs, 1 µM de
cada primer e 2 unidades de TaqTM DNA polimerase (Fermentas, Maryland, USA) e 25ng de
21
DNA; os parametros de ciclagem serão 5 minutos a 94°C, 40 ciclos de amplificação com
desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 59°C por 30 segundos, elongação a 72°C
por 1 minuto e extensão final a 72°C por 30 segundos. Os produtos de amplificação do locus
ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA serão separados por eletroforese em gel de agarose 1,4% a 3 V/cm
em tampão de corrida TBE 0,5X, pH 8,0, utilizando-se marcador de peso molecular 100pb
(“Invitrogen Life Tecnologies”), corado em solução de brometo de etídio por 30 minutos e
visualizado em trans-iluminador de luz ultravioleta.
Para espécies de outros gêneros, será utilizada a metodologia específica com base em
literatura especializada.
Purificação do DNA e sequenciamento das regiões amplificadas
O DNA amplificado será purificado no Depto. de Micologia/UFPE utilizando-se o
“PureLink PCR Purification Kit” (Invitrogen) e seqüenciado diretamente ou clonado com o
“CloneJETTM PCR Cloning kit” (Fermentas; Carlsbad, USA), seguindo instruções do
fabricante, e sequenciado. As análises de sequenciamento de DNA serão realizadas na
plataforma multiusuária de Genômica e Expressão Gênica do Centro de Ciências Biológicas
da UFPE na forma de serviço tecnológico. Com isso, dados moleculares de alta qualidade e
com muita rapidez serão gerados e comporão a plataforma de taxonomia polifásica da
Micoteca URM.
Análise filogenética
Inicialmente as sequências das amostras serão comparadas às estocadas no
“GenBank”, a partir do BLASTn, para confirmação genética dos táxons estudados.As
sequências obtidas serão alinhadas com outras recuperadas do GenBank, usando o programa
ClustalX (Larkin et al. 2007) e editadas com o BioEdit (Hall 1999). Antes da análise
filogenética o modelo de substituição nucleotídica será estimado usando-se Topali 2.5 (Milne
et al. 2004). A Análise de máxima verossimilhança (1.000 bootstraps) será realizada com
PhyML (Guindon & Gascuel 2003) a partir do programa Topali 2.5, usando o modelo de
substituição nucleotídica selecionado previamente. A análise de neighbor-joining e máxima
parcimônia (com 1.000 bootstraps cada) será executada a partir do PAUP*4b10 (Swofford
2003).
22
Caracterização das culturas de Aspergillus, Penicillium e Fusarium por MALDI-TOF
MS
As culturas serão crescidas por três dias em meio líquido e em seguida lavadas com
água destilada e liofilizadas. O micélio seco de cada uma das culturas será transferido como
uma película fina para o aço inoxidável modelo do MALDI e em seguida misturado com 1 µL
da solução matriz do MALDI (10mg/ml de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em água/acetonitrila
(1:1), com 0,03 % de ácido trifluoroacético). Após essa mistura cada amostra será seca a
temperatura ambiente e as análises realizadas utilizando o MALDI-TOF MS com um laser de
nitrogênio a 337 nm (Voyager DE-PRO, Applied Biosystems, Foster City, CA) de modo
linear. Durante o tempo de separação das proteínas ocorrerá os picos a uma precisão de massa
de pelo menos 200 ppm. Rotineiramente o intervalo de massas é de m/z = 2000-20000 Da
(KALLOW et al., 2006). Escherichia coli DH5alfa será utilizado para a calibração externa. O
banco de dados será o SARAMIS (Spectral Archiving and Microbial Identification System),
onde será feita a comparação dos espectros. (KALLOW et al., 2006).
O secretoma de F. solani será analizado por uma abordagem LC-MS de acordo com
Brown et al., (2012). Proteínas secretadas a partir de meios líquidos serão concentradas
através de precipitação com acetona, digerida com tripsina e analisada por LC-MS num
espectrómetro de massa. Serão comparados secretomes entre estirpes de F. solani para
identificar péptidos estirpe-específicos que podem ser utilizados para analisar as estirpes
usando uma abordagem mais simplificada com MALDI-MS.
Análises ecológicas das comunidades de fungos isolados
As comunidades de fungos serão avaliadas em termos quantitativos e qualitativos a
partir de dados populacionais (frequência de ocorrência, abundância relativa) e sua
estruturação, analisada por meio de índices ecológicos (riqueza e diversidade). Serão
estimadas a frequência de ocorrência (Fi) das espécies e a abundância relativa. As
abundâncias relativas das espécies serão classificadas como: < 0,5% = rara, ≥ 0,5 < 1,5% =
ocasional, ≥ 1,5 < 3,0% = comum, ≥ 3,0% = abundante (Schnittler e Stephenson, 2000). A
riqueza de espécies será avaliada como uma relação entre o número de espécies observadas e
o tamanho da amostra. Para o cálculo da diversidade será utilizado o índice de diversidade de
Shannon-Wiener. A comparação dos estimadores de riqueza ou diversidade será feita através
de ANOVA 2-fatores (setor x área).
23
Análises das propriedades físico-químicas das amostras de solo
As propriedades físico-químicas das amostras de solo, serão determinadas por um
laboratório credenciado. Serão analisadas as seguintes propriedades: matéria orgânica (M.O),
pH, fósforo (P), Nitrogênio (N), Carbono (C), Magnésio (Mg), Potássio (K), Alumínio (Al),
Sódio (Na), Enxofre (S), cálcio (C), cobre (Cu), ferro (Fe).
3.2 - Leveduras
Identificação e autenticação taxonômica de culturas do acervo da Micoteca URM
As culturas serão, identificadas e autenticas de acordo com os critérios taxonômicos
clássicos (características macroscópicas, microscópicas e fisiológicas) e moleculares. A
morfologia das células vegetativas crescidas em meio líquido e sólido, a formação de
pseudomicélio, micélio verdadeiro e clamidosporo serão realizadas de acordo com Lodder
(1970); a formação de balistosporos segundo Carmo-Souza; Phaff (1962). Para observação
das características dos ascos e ascósporos, as amostras serão cultivadas em ágar Gorodkowa
a 25±3 ºC por 15 dias (BARNETT et al., 2000). Os testes de fermentação (zimograma) e
assimilação (auxonograma) de fontes de carbono e nitrogênico (Zimograma), serão realizados
segundo Barnett et al. (2000). Para identificação serão também observados os demais testes:
requerimento vitamínico (crescimento em meio isento de vitamina), crescimento em meio de
alta pressão osmótica, em elevadas temperaturas, produção de ácido, etecção da presença
extracelular de componentes amiloides e hidrólise da uréia (LODDER, 1970; BARNETT et
al., 2000).
4. Caracterização de culturas de fungos da Micoteca URM quanto à produção de
enzimas
4.1 Seleção de Culturas de Aspergillus com potencial para produção de lipases
Serão avaliadas 18 espécies de Aspergillus (A. caepitosus, A. awamori, A. niveus, A.
niger, A. variecolor, A. melleus, A. flavus, A. sclerotiorum, A. parasiticus, A. versicolor, A.
fumigatus, A. japonicus, A. stromatoides, A. candidus, A. sydowii, A. ocraceus, A. duricaulis,
A. terreus). Discos de 5 mm de diâmetro das culturas serão transferidos para o centro da placa
de Petri com meio de cultura proposto por SIERRA (1957), ajustado o pH para 7,4. As
culturas serão incubadas a 37ºC e 28ºC, e observadas durante 24, 48, 72 e 96 horas, para
detecção de um halo claro em torno das colônias indicativo de atividade lipolítica. A seleção
24
será realizada em triplicata. O Índice Enzimático (IE) será expresso pela medida da relação
entre o diâmetro do halo e o diâmetro do crescimento da colônia segundo Hankin et al. (1971)
e Hankin e Anagnostakis (1975). As espécies que apresentarem halo de degradação serão
selecionadas para avaliação quantitativa da produção de lipase através de Fermentação em
Estado Sólido, utilizando resíduo de licuri, Syagrus coronata (Martius) Beccar como
substrato, fornecido pela COOPERLIC – Cooperativa de Colhedores e Beneficiadores de
Licuri - Caldeirão Grande, Bahia. As fermentações serão realizadas em frascos Erlenmeyers
de 250 mL, 10 g de resíduo umedecido com tampão fosfato 0,1 mol/L contanto que a umidade
inicial seja 40 %, pH 7,0. Os frascos serão esterilizados em autoclave, resfriados e inoculados
com 1 mL da solução de esporos na concentração 5x108 esporos/mL e incubados 30°C por
120 horas. Para obtenção do extrato bruto, em cada 24 h serão retirados três frascos para
extração da enzima e dosagem da atividade enzimática. Em cada frasco serão adicionados 50
mL de água destilada esterilizada com 0,01% de Tween 80 e mantidos em agitador rotativo
(Shaker) a 150 rpm durante 10 minutos. A enzima bruta do material fermentado será extraída
por filtração direta usando em papel de filtro (CELAB 22,15 micra). Os filtrados serão
distribuídos em tubos Falcon de 50 mL e preservados em 4°C para futuras análises (SABU et
al., 2005) e será considerado como extrato enzimático bruto.
4.2 Seleção de Culturas de Trichosporon com potencial para produção de lipases
Serão utilizadas 20 culturas de Trichosporon, preservadas sob óleo mineral na
Micoteca URM de 1954 a 2010. Cada cultura será transferida para frascos de Erlenmeyer de
250 mL contendo os seguintes meios de cultura: Meio I- composto por 1% (v/v) de óleo de
oliva (industrial) adicionado de 0,5% (p/v) extrato de levedura, pH 6,5 e Meio II- contendo
1% (v/v) de óleo de mamona (artesanal) adicionado de 0,5% (p/v) extrato de levedura, pH 6,5.
Os meios de cultura serão esterilizados a 120ºC durante 15 minutos, resfriados e inoculados
com disco de 5 mm obtidos a partir da colônia central e incubados em agitador orbital a 160
rpm a 30ºC por 96 horas. O meio fermentado será filtrado utilizando papel de filtro (CELAB).
Serão estudados os parâmetros como: temperatura, pH, concentração de extrato de levedura e
concentração de óleo, utilizando um planejamento fatorial completo (24). Será utilizado para o
Meio I óleo de oliva (10% m/v) e Meio II óleo de mamona (10% m/v) como substratos para
dosagem da enzima, os quais serão emulsionados por três minutos com goma arábica (5%
p/v) em água destilada. A 5 mL desta emulsão será adicionado 1 mL do extrato enzimático
bruto, incubado por 1 hora a 37ºC, posteriormente titulados com uma solução de NaOH (0,05
M) segundo Watanabe et al. (1977).
25
4.3 Seleção de fungos com potencial para produção de L-asparaginase
Serão testadas 50 culturas de fungos estocadas na Micoteca URM. Todos os isolados
de fungos endofíticos serão cultivados em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA)
durante 7 dias. Discos de 5 mm de micélio serão transferidos para placas de Petri contendo o
meio ágar Czapek Dox’s modificado (ACDM) (SAXENA; SINHA, 1981). O ensaio em placa
de ágar será utilizado para selecionar os fungos produtores de L-asparaginase. O meio ACDM
será composto por glicose (2,0 g/L), L-asparagina (10,0 g/L), KH2PO4 (1,52 g/L), KCl (0,52
g/L), MgSO4.7H2O (0,52 g/L), CuNO3.3 H2O (0,001 g/L), ZnSO4.7H2O (0,001 g/L),
FeSO4.7H2O (0,001 g/L), pH 6,2 e suplementado com vermelho de fenol (0,009%
concentração final) que será utilizado como indicador de produção de L-asparaginase. Placas
de ACDM sem asparagina serão utilizadas como controle. Todas as placas serão incubadas a
30 °C por cinco dias. O raio da zona cor-de-rosa e o diâmetro da colônia serão mensurados
após a incubação. A zona cor-de-rosa indica a capacidade de produção de L-asparaginase pelo
fungo (GULATI et al., 1997; THEANTANA et al., 2007).
4.4 Seleção de culturas de Aspergillus e Penicillium com potencial taninolítico,
celulolítico e xilanolítico
Culturas de Aspergillus e Penicillium serão repicadas para o centro do meio agar
Czapek, modificado pela substituição da sacarose por 10 g/L de ácido tânico (C76H42O56),
contido em placas de Petri, sendo incubadas em estufa a 30°C por 72h. Após a incubação, a
aparência das colônias e tamanho do halo em torno das colônias será determinada
(MURUGAN et al., 2007). As culturas que apresentarem halo de degradação do ácido tânico
serão selecionadas para avaliação quantitativa da produção de tanase através de fermentação
em estado sólido, utilizando folhas da mangueira (Mangifera indica L.) como substrato,
preparadas segundo Trevino-Cueto et al. (2007). Em frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL será
adicionado 5.0 g de folhas da mangueira previamente tratadas e 5 mL de solução de sais na
composição (g/L): KH2PO4, 1.0 g; NH4NO3, 5g, NaCl 1g, MgSO4.7H2O 1g e ácido tânico
40g (Figura 01). O pH será ajustado para 5.5. Os frascos contendo as folhas serão
esterilizados a 121°C durante 20 min. Os frascos serão inoculados com 1 mL da solução de
esporos na concentração 5x108 esporos/mL e incubados a 30°C em estufa BOD. Após 120h
de fermentação, em cada frasco serão adicionados 50 mL de água destilada esterilizada com
0,01% de Tween 80 e mantidos em agitador rotativo (Shaker) a 150 rpm durante 10 minutos.
Em seguida o material fermentado será submetido a filtração direta usando em papel de filtro
26
(CELAB 22,15 micra). O filtrado de cada frasco será considerado extrato bruto enzimático e
preservado em 4°C para futuras análises (SABU et al., 2005).
4.5 Seleção de culturas de fungos quanto a produção de L-aparaginase
Um disco de 5 mm de micélio das culturas de fungos cultivados em cada placa de Petri
contendo o meio de cultura BDA serão usados como inóculo em frascos de Erlenmeyer (250
mL) contendo 50 mL de Czapex Dox’s modificado (CDM). Os fracos de Erlenmeyer serão
incubados a 30 ° C em agitador rotativo a 120 rpm durante 5 dias. Após esse período, as
culturas serão filtradas utilizando papel de filtro Whatman nº 1 e centrifugadas a 6000 rev
min-1 por 15 min.
4.6 Seleção de culturas de Mucor e Penicillium com potencial proteolítico
As linhagens serão replicadas no Meio seletivo para protease (meio básico
modificado) para classificar os possíveis produtores da enzima protease. O meio utilizado será
o proposto por Couri & Farias (1995), tendo por leite desnatado ou gelatina 10,00 (g/L) como
substrato, pH 4,5. A inoculação de cada espécie será realizada em triplicata a 30ºC por 96
horas. As espécies selecionadas como produtoras de protease serão inoculadas no meio de
produção. Em meio MS-2 para a produção dos metabólitos, descrito por Porto et al. (1996)
composto por farinha de soja 4,0% (p/v) dentre outros, pH inicial 7,0, por 48, 72 e 96 horas a
uma temperatura de 30oC. As condições serão modificadas e analisadas para otimizar a
produção da enzima. Outros constituintes como a milhocina, entrecasca da mandioca e a
palma forrageira serão avaliados como fonte de nitrogênio e/ou carbono para o crescimento da
espécie selecionada.
4.7 Detecção de Atividade Pectolítica
Para detecção pectinolítica será inoculado 2 µL de uma suspensão contendo 107 esporos
previamente padronizada. O teste será realizado na superfície de placas contendo meio sólido
(1,25% cítrico pectina, potássio fosfato 50mM pH 5,5, 6.7g / L extrato levedura, 0,2% e 1,5%
ágar glicose). Após quatro dias de crescimento a 25ºC, será vertida sobre as placas uma
solução com 0,05% vermelho congo (Sigma C-6277) e incubadas à temperatura ambiente
durante uma hora. Em seguida, a solução será removida da superfície do meio e lavada com
água destilada. A atividade pectinase será evidenciada pela formação de halo claro em torno
27
das colônias em placas com pectina conforme descrito e a Zona de atividade (ZA) será
calculada de acordo com a metodologia proposta por por Uenojo e Pastore (2007).
4.8 - Detecção de Atividade Amilásica
Para detecção da atividade amilolítica, 2 µL de uma suspensão contendo 107 esporos do
fungo a ser estudado serão inoculados no centro da superfície de uma placa de Petri contendo
meio mínimo (MM), cuja composição é, em g L-1: NaNO3 (0,38), KH2PO4 (1,19),
MgSO47H2O (0,50), KCl (0,50), FeSO47H2O (0,01), glicose (10), agar (20), suplementado
com 2% de Tween 80 (sorbitano monolaurato), suplementado com amido solúvel 2% e pH
6,0. As placas serão incubadas a 28 ºC, por sete dias. Após esse período, as placas serão
reveladas com lugol e a zona de atividade (ZA) será calculada como descrito anteriormente.
(Cuzzi et al., 2011).
4.9 Métodos analíticos
4.9.1 Dosagem do conteúdo de proteínas
A determinação da concentração protéica será realizada através do método de
Bradford (1976) modificado, que utiliza como corante o “Coomassie Brilhant Blue”, para
detectar quantidades mínimas de proteínas em líquidos biológicos. A curva de calibração será
realizada a partir de soluções estoques de soroalbumina bovina (BSA).
4.9.2 Atividades enzimáticas
Atividade lipásica
Para quantificação da atividade lipásica das culturas de Aspergillus e Trichosporon por
fermentação em estado sólido (FES) será realizada pelo método titulométrico, utilizando óleo
de oliva (10% m/v) como substrato para dosagem da enzima, segundo Watanabe et al. (1977).
A dosagem da atividade será realizada em triplicata e a média aritmética dos valores será
utilizada para determinação do cálculo da atividade enzimática segundo a equação
determinada por Leal (2000).
Atividade de L-asparaginolítica
A atividade de L-asparaginase será determinada do filtrado do CDM pela técnica de
Nesslerização e expressas como UI mL-1, como descrito por Imada et al. (1973). As amostras
serão incubadas a 37 °C por 60 minutos e depois a reação será interrompida com 100μL de
28
ácido tricloroacético (TCA) 1,5M. Dessa mistura serão retirados 100μL os quais serão
adicionados a 750μL água destilada esterilizada. O reagente de Nessler será adicionado e a
mistura incubada a 20 °C por 20 minutos. Todas as reações serão medidas em leitora de
microplacas a 450 nm. Uma unidade de L-asparaginase será considerada como a quantidade
de enzima que catalisa a formação de 1 μmol de amônia por min a 37 °C (GULATI et al.,
1997; THEANTANA et al., 2007). Todas as análises serão realizadas em triplicata.
Atividade taninolítica
A atividade enzimática da tanase das culturas de Aspergillus e Penicillium será
determinada colorimetricamente de acordo com Sharma et al. (2000) com modificações. Em
tubo de ensaio, serão adicionados 0.4 mL do extrato enzimático e em seguida 0,6 mL de
solução etanólica de rodanina, permanecendo em repouso por 5 minutos. Após este período,
serão adicionados 0,4 mL da solução de hidróxido de potássio 0,5 N. Após três minutos, serão
adicionados 8,6 mL de água destilada e após agitação, cada amostra, em triplicata, será lida
em espectrofotômetro a 520 nm. O aparelho será calibrado com um tubo nas mesmas
condições da amostra, porém com água destilada em substituição ao extrato enzimático.
Atividade xilanolítica
Para determinação da atividade xilanolítica das culturas de Aspergillus e Penicillium
será utilizado xilana a 1% como substrato. Será homogeneizado 1g do substrato em 70 mL de
solução 50 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0 a 60°C. Em seguida, a solução será
aquecida até a fervura em uma chapa de aquecimento com agitação magnética.
Posteriormente, a solução será resfriada em banho de água à temperatura ambiente. Após
resfriada, a solução permanecerá sob agitação lenta durante 2h30 a 60°C. A solução de xilana
será completada com tampão acetato de Sódio 50 mM, pH 5,0, até um volume final de
100mL. Em seguida, será utilizada uma mistura de 1,35mL de solução de xilana a 1%, logo
após a estabilização da temperatura (banho-maria, 50°C por 5 minutos). Serão adicionados
0,150 mL do extrato enzimático (PEG, sal, PEG branco e sal branco). Serão transferidos
0,300mL da mistura para outro tubo de ensaio e adicionados 0,900mL de Ácido
Dinitrosalicílico (DNSA) (MILLER, 1959), interrompendo a atividade da enzima para
determinar os açúcares redutores totais. Tais ensaios serão realizados em triplicata. Após
aquecimento dos tubos, em água fervente a 100°C por 10 minutos, os mesmos tubos serão
mergulhados por alguns minutos em um recipiente com água gelada. Logo após, a leitura será
realizada em espectrofotômetro a 540nm.
29
Atividade celulolítica
Serão realizadas atividade de celulase total ou FPase, Atividade da CMCase e
Atividade da G. A celulase total será determinada de acordo com o método proposto por
Ghose (1987) utilizando tiras de papel de filtro Whatman nº1 (50 mg, 1x6 cm), recortadas e
enroladas foram mergulhadas em solução de 0,5 mL do extrato enzimático com 1,0 mL de
tampão citrato (50 mM, pH 5,0) contida em tubos de ensaio. A hidrólise será interrompida
com a adição de 1 mL do reagente Ácido Dinitrossalicílico (DNSA) (MILLER, 1959) para
quantificação do conteúdo de açúcares redutores. A absorbância das soluções será mensurada
a 540 nm de comprimento de ondas, por meio de espectrofotômetro e pela confrontação da
leitura óptica com uma curva de calibração, na qual a D-glucose será utilizada como padrão.
A determinação da atividade da CMCase, será realizada segundo as determinações de Ghose
(1987). Para a determinação da G, será utilizada a metodologia descrita por Schwan-Estrada
et al (2003).
Atividade Proteásica
A atividade proteásica será determinada a 25ºC como descrito por Ginther (1979). O
substrato protéico utilizado será a azocaseína 1% (p/v) (Sigma, St. Louis, Mo USA) diluída
em solução tampão Tris-HCL 0,2 M pH 7,6, contendo 10mM CaCl2. A atividade enzimática
será definida como uma unidade de atividade (U) a quantidade de enzima que produz um
aumento na densidade ótica de 1.0, a 440nm no período de uma hora.
4.7.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
Os testes de avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeos bioativos obtidos
pela hidrólise das caseínas do leite caprino pelo extrato enzimático obtido por via
microbiológica e vegetal serão realizados pelo método CIM (Concentração Inibitória Mínima)
conforme descrito pela norma do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2003).
Os micro-organismos utilizados serão Enterococcus faecalis ATCC 138, Bacillus subtilis
ATCC 86, Escherichia coli ATCC 224, Pseudomonas aeruginosa ATCC 416, Klebsiella
pneumoniae ATCC 02 e Staphylococcus aureus ATCC 1007. As concentrações do
hidrolisado testadas contra estes micro-organismos serão 250mg, 125mg, 62,5mg, 50mg,
40mg, 30mg, 20mg e 10mg e os tempos de hidrólise testados serão de 40min e 2h – 24h.
30
4.8 Design experimental e análise estatística
Para análise estatística dos dados serái empregada a análise multivariada de um
planejamento experimental fatorial fracionário 25. Deste fatorial, será obtido um total de 32
ensaios diferentes entre si e quatro repetições no ponto central. Através dos resultados das
atividades específicas de cada enzima do complexo celulolítico (U/mL), será avaliada a
resposta de cada tratamento aplicado em confronto com as variáveis e níveis relacionados: ao
substrato utilizado e diferentes concentrações e às condições físicas para produção. Os
componentes observados explicarão 97,53% da variação nos dados (λ > 0,97) e suas
correlações. O processamento estatístico dos dados será realizado utilizando-se o programa
STATISTICA (Statsoft INC, 2008).
4.9. Efeito do pH e da temperatura na atividade das enzimas
O efeito do ao pH sobre a atividade lipásica será detectado pela verificação da
atividade, após incubação por 1 hora, do extrato enzimático bruto a 37ºC em diferentes pHs
(Tampão Citrato- fosfato 0,05 M pH 5,0-7,0 e Tampão Tris-HCL 0,05 M pH 7,0-9,0), na
proporção 1:1. O efeito da temperatura será determinado utilizando o pH ótimo selecionado
previamente, após incubação por 1 hora, do extrato enzimático em diferentes temperaturas
com variação entre 30 a 80 ºC, com uma faixa de variação de 5 °C. Após o período de
incubação, a atividade enzimática será realizada como descrita no item anterior. Todas as
análises serão realizadas em triplicata.
4.10. Estabilidade das enzimas ao pH e à temperatura
Para determinação da estabilidade da enzima à temperatura, o extrato enzimático será
previamente incubado a temperaturas de 30º a 90ºC com variação de 10°C por 1 hora e em
seguida serão submetidas à determinação da atividade lipolítica. Para determinação da
estabilidade da enzima ao pH o extrato enzimático será previamente submetido à ação de
diferentes valores de pH pelo uso das soluções tampões, com pH variando entre 5,0 a 8,8 por
um período de 1 hora e em seguida serão submetidas à determinação da atividade lipolítica.
As análises serão realizadas em triplicata.
4.11 Recuperação das enzimas com maior significância de resultados
Estudos de partição da celulase em sistema bifásico aquoso PEG/Citrato
31
Nos ensaios de recuperação de tanase serão utilizados tubos de vidro graduados (15
mL) onde serão pesados os sistemas de duas fases aquosas que possuirão concentrações
definidas através das curvas binodais. Os parâmetros de extração a serem estudados são:
massa molar e concentração do PEG, pH e concentração do sal na extração da enzima do
meio de fermentação. Para a extração da enzima, os sistemas serão preparados inicialmente
com PEG de diferentes massas molares (400, 1000, 3350 e 8000 g/mol) e sal segundo
Oliveira et al. (2001) e Sarubbo (2000).
Planejamento fatorial para otimização da extração das enzimas
Os estudos de extração serão baseados em planejamento experimental segundo Barros
Neto (2002). Existem vários fatores que interferem no sistema de duas fases aquosas, e eles
poderão ser analisados de tal forma que se poderá identificar o nível de significância e a
interação entre estes fatores sobre o coeficiente de partição, aumento de pureza e rendimento
da enzima com os respectivos erros experimentais. Para análise estatística dos resultados
serão utilizadas três variáveis respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e
rendimento. A melhor condição final de extração será definida como aquela que proporcionar
a melhor combinação entre as respostas.
Análise estatística
A análise estatística dos resultados será realizada com o auxílio do software Statistica
6.0.
5 – Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial da Micoteca URM
O Sistema de Gestão que está sendo implantado na Micoteca URM, é com base na
Norma ISO 2001:2008 com o apoio do Projeto FACEPE Multiusuários Edital 08/2010. A
previsão para a certificação é dezembro de 2012, sendo a Micoteca URM a primeira coleção
de culturas a obter este certificado no Brasil. A manutenção do sistema será realizada através
de auditorias internas realizadas por empresa especializada. Estas ações estão voltadas para
garantir a qualidade dos serviços da coleção e será de extrema importância para atendimento a
padrões internacionais e para fazer parte do Centro de Recursos Biológicos do Brasil, que está
sendo implementado nas instalações do InMetro, em Xerém-RJ.
6 - Métodos de preservação dos fungos
32
Os métodos de preservação utilizados serão: óleo mineral esterilizado (Sherf, 1943) e
água destilada esterilizada (CASTELLANI, 1967), liofilização (RAPER & ALEXANDER,
1945) e as espécies raras e as linhagens com potencial para produção de metabólitos de
interesse biotecnológico, serão também preservadas por ultracongelamento a -80 °C (SMITH
& ONIONS, 1994).
7 – Fornecimento de amostras liofilizadas do acervo da Micoteca URM
Para agilizar o fornecimento de amostras do acervo da Micoteca URM, todas as
amostras de fungos reativadas e autenticadas taxonomicamente serão liofilizadas em frascos
de penicilina (5 mL) (RAPER & ALEXANDER, 1945). As amostras serão enviadas também
nesta condição, pois algumas solicitações precisam ser atendidas com as amostras ativas em
meios de cultura específicos. Acompanhando as amostras, serão enviadas instruções de
reativação e manipulação.
g) Descrição dos mecanismos de gerenciamento do projeto, incluindo a composição
nominal e o modo de funcionamento propostos para o Comitê Gestor
Propomos para gerenciamento do projeto, os nomes dos professores Erika Valente de
Medeiros, Cristiano Souza Lima como membros externos a instituição proponente e as
professoras Janete Magali de Araújo e Leonor Costa Maia, como membros internos da
Universidade Federal de Pernambuco.
Erika Valente de Medeiros é Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de
Garanhuns/UFRPE, tem Doutorado em Agronomia - Fitotecnia Universidade Federal Rural
do Semi-Árido. Atua nas áreas Microbiologia Aplicada, Fitossanidade Microbiologia e
Bioquímica do Solo.
Leonor Costa Maia é Licenciada em Ciências Biológicas (Faculdade de Filosofia do
Recife), Especialista em Biossistemática Vegetal e em Micologia, Mestre em Botânica
(Universidade Federal Rural de Pernambuco) e PhD em Phytopathology (University of
Florida). Atualmente é Professora Titular da Universidade Federal de Pernambuco, exercendo
as funções de Curadora do Herbário URM, Chefe do Laboratório de Micorrizas e ViceCoordenadora da Pós-graduação em Biologia de Fungos.
Janete Magali de Araújo possui graduação em Bacharelado e Licenciatura em História
Natural pela Universidade Católica de Pernambuco (1965), graduação em Bacharelado em
Química pela Universidade Católica de Pernambuco (1970), mestrado em Ciências
(Microbiologia) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1976) e doutorado em Genética
33
e Melhoramento de Plantas pela Universidade de São Paulo (1990). Atualmente é professora
associada da Universidade Federal de Pernambuco, Chefe do Departamento de Antibióticos e
Curadora da Coleção de Microrganismos do Departamento de Antibióticos (UFPEDA)
WDCM114.
Cristiano Souza Lima é bolsista de produtividade em pesquisa 2F. Professor Adjunto I
da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG),
atuando no ensino de Graduação em Agronomia e Pós-Graduação em Fitopatologia. Possui
Graduação (2000) em Agronomia pela Universidade Federal do Ceará, Mestrado (2002),
Doutorado (2006) e Pós-Doutorado (2008) em Agronomia (Fitopatologia) pela Universidade
Federal de Lavras, com Doutorado Sanduíche na Kansas State University, Estados Unidos.
Atualmente é Curadora da Coleção de Microrganismos do Departamento de Antibióticos
(UFPEDA), Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos Profa. Maria Menezes
WDCM923.
O modo de funcionamento proposto para o Comitê Gestor será dividido em quatro
etapas: Curto, Médio e Longo prazo e Conclusão conforme tabela abaixo, através de reuniões
a serem realizadas de acordo com o quadro abaixo:
ETAPA
PERÍODO
ATIVIDADES
1
Fevereiro/2013
2
Junho/2013
3
Fevereiro/2014
4
Novembro/2014
Gerenciar os recursos financeiros a serem utilizados;
Verificação do alcance das metas a serem implementadas
em curto prazo, médio e longo prazo;
Acompanhar a implantação das novas técnicas previstas;
Apresentação de relatório dos recursos orçamentários
utilizados.
j) Identificação dos demais membros da equipe e de sua contribuição ao projeto
Nome
Ana Lúcia
Figueiredo Porto
André Luiz Cabral
Monteiro de
Azevedo Santiago
Anthony Alves dos
Santos Junior
Bruno Severo
Gomes
Cledir Rodrigues
Santos
Christof Rampitsch
Instituição
UFRPE
Função
Pesquisador
UFRPE/UAST
Pesquisador
UFPE
Aluno de
Graduação
UFPE
Pesquisador
Universidade do
Minho - Portugal
Cereal Research
Centre/Agriculture
Pesquisador
colaborador
Pesquisador
colaborador
Contribuição
Produção e purificação de
enzimas
Isolamento e identificação
de Zygomycetes
Reativação dos fungos do
acervo da Micoteca URM
Isolamento e identificação
de leveduras.
Análise dos extrólitos pela
técnica do MALDI TOF MS
Detecção de extrólitos de
Fusarium solani
34
and Agrifood
Canada,
Winnipeg/Canada
Christina Alves
Peixoto
Cyndy Mary de
Mello Farias
Débora Maria Massa
Lima
Dianny Carolyne
Vasconcelos da Silva
Diogo Xavier Lima
Évellyn Carollyne
Domingos
Eliane Barbosa da
Silva Nogueira
Gladstone Alves da
Silva
Heloiza Maria da
Silva Oliveira
Ildnay de Souza
Lima Brandão
Jadson Diogo Pereira
Bezerra
Juliana Silva de
Lima
Julyanna Cordoville
Fonseca
Keila Aparecida
Moreira
Laura Mesquita
Paiva
preservados na Micoteca
URM
CETENE
Pesquisador
UFPE
Aluna de
Mestrado
UFPE
Pesquisador
UFPE
UFPE
UFPE
Aluna de
Doutorado
Aluno de
Mestrado
Aluna de
graduação
UFPE
Técnico
UFPE
Pesquisador
UFPE
UFPE
UFPE
UFPE
UFPE
Aluna de
Doutorado
Aluna de
Doutorado
Aluno de
Mestrado
Aluna de
Mestrado
Aluno de
Graduação
Obtenção das imagens das
culturas por microscopia
eletrônica de varredura.
Reativação de fungos do
acervo da Micoteca URM
Identificação de culturas de
Fusarium
Caracterização de extrólitos
produzidos por fungos
Incorporar dados obtidos ao
acervo da Micoteca - URM.
Seleção de culturas
produtoras de enzimas
Manipulação das culturas do
acervo da Micoteca URM.
Caracterização molecular
das culturas fúngicas
Seleção de culturas
produtoras de enzimas
Seleção de culturas
produtoras de enzimas
Isolamento de fungos
endofíticos
Seleção de fungos quanto a
produção de enzimas
Caracterização enzimática
de fungos
Caracterização enzimática
das culturas de fungos
Caracterização enzimática
de fungos endofíticos
Colaborar com a
identificação e produção de
enzimas por fungos
Atualização do banco de
dados da Micoteca URM
Sequenciamento de regiões
do DNA de culturas de
fungos
Identificação de culturas de
Aspergillus e Penicillium
UFRPE/UAG
Pesquisador
UFPE
Pesquisador
Lidiane Roberta
Cruz da Silva
UFPE
Aluna de
Doutorado
Luan Amim de
Oliveira Penna
UFPE
Aluno de
graduação
Marcos Antônio de
Morais Júnior
UFPE
Pesquisador
Maria José dos
Santos Fernandes
UFPE
Pesquisadora
Marília de Holanda
Cavalcanti Maciel
UFPE
Aluna de
Doutorado
Seleção e produção de
enzimas por fungos
Aluna de
Mestrado
Aluno de
Caracterização enzimática
de fungos endofíticos
Caracterização enzimática
Marília Gomes da
Silva
Matheus Pessoa de
UFPE
UFPE
35
Melo Gomes
Graduação
de fungos
Colaborar com a
Minelli Albuquerque
Bolsista
UFPE
caracterização enzimática de
Sousa
PNPD/CAPES
fungos
Neiva Tinti de
Caracterização molecular
UFPE
Pesquisador
Oliveira
das culturas de fungos
Nelson Manuel
Universidade do
Pesquisador
Análise molecular e pela
Viana da Silva Lima
Minho - Portugal
colaborador
técnica do MALDI TOF MS
Odacy Camilo de
Aluna de
Participação na identificação
UFPE
Souza
Doutorado
de fungos filamentosos
Oliane Maria Correia
Pesquisador
Colaborar com o isolamento
UFPE
Magalhães
e incorporação de leveduras
Isolamento e colaboração na
Phelipe Manoel
Aluno de
UFPE
identificação de fungos do
Oller Costa
Doutorado
solo.
Polyanna Nunes
UFRPE/LABTECB
Aluna de
Caracterização enzimática
Herculano
IO
PNPD
das culturas de fungos
Rejane Pereira
Pesquisador
Colaborar com o isolamento
UFPE
Neves
e incorporação de leveduras
Renan do
Aluna de
Caracterização e
UFPE
Nascimento Barbosa
Mestrado
identificação de leveduras
Preparo de documentos para
Susana Carvalho de
UFPE
Técnico
incorporação dos fungos ao
Souza
acervo da micoteca URM
Susane Carvalho de
Caracterização molecular
Aluna de
Souza
UFPE
das culturas de Aspergillus e
Doutorado
Penicillium.
Caracterização enzimática
Tatiana Souza Porto
UFRPE/UAST
Pesquisadora
das culturas de fungos
Tatianne Leite
Aluna de
Isolamento e identificação
UFPE
Nascimento
Doutorado
de fungos endofíticos.
Vanilla Mergulhão
Aluna de
Caracterização enzimática
UFPE
Alves da Silva
Graduação
de culturas de fungos
Colaboração para
preparação das amostras
Virgínia Michelle
UFPE
Pesquisadora
para obtenção das imagens
Svedese
das culturas por microscopia
eletrônica de varredura.
36
h) Orçamento detalhado, com a devida justificativa para cada item solicitado e
totalização individualizada das seguintes rubricas:
(i) Capital (equipamento e material permanente) TOTAL: R$ 125.223,60 e material
bibliográfico (R$ 5.000,00)
EQUIPAMENTOS/
DESTINOS
Armário de ferro
Cabine de segurança
biológica Classe 2
(UAST/UFRPE e
Micoteca URM)
Cuba horizontal e fonte de
alimentação
Data Log/ Raitec
Deionizador de água 50L
Destilador de água
Impressora Laser
Kit micropipeta volume
variável
Lupa
Máquina de gelo 10Kg
Liofilizador
Termociclador com
gradiente
Transiluminador/ gradiente
JUSTIFICATIVA
VALOR
UNITÁRIO
(R$)
1.200,00
VALOR
TOTAL
(R$)
1.200,00
15.000,00
30.000,00
Eletroforese
5.700,00
5.700,00
Acompanhamento da temperatura do
Ultrafreezer
Purificador de água - Mili-Q
Purificação de água
Impressão de documentos
Dispensação de líquidos e fluidos em
pequenos volumes
Observação de caracteres
morfológicos dos fungos
Incubação de amostras para análise
Liofilização de um maior número de
amostras
Técnicas de PCR
1.200,00
1.200,00
850,00
1.000,00
2.000,00
1.800,00
850,00
1.000,00
2.000,00
1.800,00
7.000,00
7.000,00
8.473,60
34.000,00
8.473,00
34.000,00
28.000,00
28.000,00
4.000,00
4.000,00
Armazenamento material de
consumo
Manipulação de micro-organismos
Visualização de amostras de
DNA/RNA
TOTAL
Material bibliográfico
Necessário para aquisição de materila bibliográfico atualizado e aquisição
de normas de sistema de gestão.
125.223,00
R$ 5.000,00
(ii) Passagens – TOTAL: R$ 15.000,00
37
As passagens estão previstas para participação dos membros da equipe em eventos
científicos, treinamentos e/ou eventos científicos na área. As passagens internacionais serão
utilizadas para visitas científicas e para vinda dos pesquisadores de Universidades localizadas
fora do país para treinamentos da equipe.
(iii) Diárias – TOTAL: R$ 8.000,00
As diárias são necessárias para a realização de coletas e participação em reuniões, visitas,
cursos e eventos científicos.
(iv) Bolsas – TOTAL: R$ 161.800,00
BDCT-NM1
Numero de bolsas: 2
Duração: 6 meses
Valor mensal: R$ 360,00
Valor total: R$ 4.320,00
Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de segundo grau, desenvolvendo atividade de
preparo de materiais e meios de culturas na Micoteca URM, para o desenvolvimento do
projeto.
BDCT-NS1
Numero de bolsas: 2
Duração: 6 meses
Valor mensal: R$ 450,00
Valor total: R$ 5.400,00
Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de graduação, desenvolvendo atividade de
recebimento de pedidos de identificação e incorporação de amostras na Micoteca URM e
atualização do site desta coleção.
BCT 5
Numero de bolsas: 3
Duração: 12 meses
Valor mensal: R$ 2.880,00
Valor total: R$ 103.680,00
Justificativa: Estas bolsas serão destinadas a mestres/doutores com experiência em taxonomia
polifásica e caracterização de fungos quanto a produção de enzimas.
BCT 6
38
Numero de bolsas: 2
Duração: 12 meses
Valor mensal: R$ 2.200,00
Valor total: R$ 52.800,00
Justificativa: Estas bolsas serão destinadas a especialista em taxonomia de fungos com
experiência no desenvolvimento de diversos projetos de pesquisa.
BCT 9
Numero de bolsas: 1
Duração: 3 últimos semestres
Valor mensal: R$ 600,00
Valor total: R$ 14.400,00
Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de graduação, desenvolvendo atividade de
recebimento de pedidos de identificação e incorporação de amostras na Micoteca URM e
atualização do site e do banco de dados desta coleção.
BCT 10
Numero de bolsas: 4
Duração: 12 meses
Valor mensal: R$500,00
Valor total: R$ 24.000,00
Justificativa: Esta bolsa será destinada a estudantes de graduação para colaborar com as
atividades propostas no projeto, nas áreas de isolamento, identificação, reativação,
preservação e/ou caracterização de fungos quanto a produção de enzimas.
(v)Outros itens de custeio
a) Material de Consumo – TOTAL: R$ 107.225,99
MATERIAL
ABC
Acetato de etila (1L)
JUSTIFICATIVA
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Preparo de soluções
QTDE
VALOR
UNITÁRIO
(R$)
VALOR
TOTAL
(R$)
6
310,85
1.865,10
2
10,00
20,00
Acetato de sódio
(500mL)
Preparo de soluções
2
9,10
18,20
Ácido tricloroacético
Preparo de soluções
1
98,00
98,00
39
(500g)
Ágar bacteriológico
(500g)
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Preparo de meios de
cultura
Azul de Coomassie
(25g)
Quantificação de
proteínas
1
38,70
38,70
Preparo de meios de
cultura e soluções
3
51,00
153,00
Becker de vidro
(1000mL)
Preparo de reagentes e
soluções
6
20,00
120,00
Becker de vidro
(500mL)
Preparo de meios de
cultura e soluções
2
12,40
24,80
6
2.884,99
17.309,94
4
925,20
3.700,80
2
4.465,02
8.930,04
1
44,00
44,00
6
435,79
2.614,74
1
44,00
44,00
Adesivo de placa
Balão de fundo chato
(1000mL)
Big dye
Cacodilato de sódio
trihidratado (grau
microscopia eletrônica)
(500g)
Capilar 50cm
Carbonato de cálcio
(500 g)
CBC
Cloreto de cálcio
(500g)
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Preparo de tampão
para processamento de
amostras pra
microscopia eletrônica
de transmissão
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Identificação de
leveduras
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Preparo de meios de
cultura
1
771,96
771,96
4
274,00
1.096,00
Cloreto de mercúrio
(100g)
Caracterização
enzimática
1
76,80
76,80
Cloreto de potássio
(500g)
Identificação de
leveduras
1
52,80
52,80
12
77,70
932,40
Condicion
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
40
Dextrose (500g)
dNTP set, 100 mM, 4 x
250 µl
Etanol 95% (1000mL)
Extrato de levedura
(500g)
Preparo de meios de
cultura
6
12,00
Análise molecular
2
350,00
1
29,48
29,48
4
110,00
440,00
Preparação de
soluções
Preparo de meios de
cultura
72,00
700,00
Extrato de malte (500g)
Preparo de meios de
cultura
3
210,00
630,00
Ferricianeto de potássio
trihidratado (500g)
Pós-fixação de
amostras pra
microscopia eletrônica
2
117,00
234,00
10
176,00
1.760,00
2
358,00
716,00
Formamida HI DI
Fosfato de sódio
dibásico heptahidratado
(500g)
Análise molecular –
reações de
sequenciamento
Preparo de tampão
para processamento de
amostras pra
microscopia eletrônica
Fosfato de sódio
monobásico (500g)
Preparo de tampão
para processamento de
amostras pra
microscopia eletrônica
2
15,80
31,60
Frasco de Erlenmeyer
(250mL)
Preparo de reagentes e
soluções
20
32,00
640,00
Frascos de Erlenmeyer
(1000mL)
Preparo de reagentes e
soluções
3
40,00
120,00
Frascos de penicilina 5
mL
Liofilização das
amostras de fungos
500
4,00
2.000,00
Galactose (100g)
Identificação de
leveduras
1
175,70
175,70
Gelatina em pó (500g)
Caracterização
enzimática
1
490,00
490,00
GelRed™ para corar
dsDNA, ssDNA ou
RNA em gel de agarose
ou pós coloração
Análise molecular
1
970,00
970,00
41
Glucosamina (100g)
Identificação de
leveduras
1
429,00
429,00
Glutaraldeído grau I (10
amp. De 10mL)
Preparo de tampão pra
processamento de
amostras para
microscopia eletrônica
5
310,00
1.550,00
Kit de capilares
Kit de extração de DNA
Kit de marcação de
DNA
Kit de purificação de
produto de PCR (250
reações)
Análise molecular
Análise molecular
Análise molecular
2
8
3
8.500,00
450,00
2.890,00
17.000,00
3.600,00
8.670,00
Análise molecular
1
1.500,00
1.500,00
Kit para síntese de
cDNA
Kit purificação RNA
total - RNeasy Plant
mini kit (20rxn)
L – Arabinose (25g)
Análise molecular
1
950,00
950,00
1
716,43
716,43
Identificação de
leveduras
1
176,00
176,00
Lâmina 26x76mm
(caixa com 100 unid.)
Visualização das
estruturas fúngicas ao
microscópio
30
3,00
90,00
Lamínulas 24x32mm
Visualização das
estruturas fúngicas ao
microscópio
Identificação de
leveduras
30
3,00
90,00
1
86,70
86,70
Marcador molecular
(200 L)
Análise molecular
3
550,00
1.650,00
Material de escritório
(papel A4, envelopes,
pastas, etc.)
Redação e
armazenamento de
informações,
relatórios e
documentos
Material para
informática (cartuchos,
toners, DVDs, pen
drives, etc.)
Redação,
armazenamento e
impressão de
informações,
relatórios e
Maltose (100g)
Análise molecular
1.100,00
-
-
1.000,00
-
-
42
documentos
Material plástico
descartável
Metil-α-D-glicosídeo
(1g)
Análises moleculares
e enzimáticas
Identificação de
leveduras
-
-
5.000,00
1
570,00
570,00
Peptona bacteriológica
(500g)
Preparação de meios
de cultura
3
270,00
810,00
Placa de microtitulação,
fundo chato, 6 poços
Placa de microtitulação,
fundo chato, 96 poços
Placas de Petri
(80x15mm)
Análise de amostras
40
8,20
328,00
10
2,66
26,60
Isolamento, cultivo e
identificação dos
fungos
300
3,50
1.050,00
Placas de Petri
(90x15mm)
Isolamento, cultivo e
identificação dos
fungos
300
4,00
1.200,00
Rafinose (25g)
Identificação de
leveduras
1
297,00
297,00
Soro albumina bovina
(100g)
Caracterização
enzimática
1
356,00
356,00
Análise molecular
Pós-fixação de
amostras pra
microscopia eletrônica
10
1
200,00
6.000,00
2.000,00
6.000,00
Trealose (10g)
Identificação de
leveduras
1
128,00
128,00
Tris-Base
(Hidroxymethyl
aminomethano)
Preparo de reagentes e
soluções
1
153,00
153,00
Identificação de
leveduras
200
0,50
100,00
Cultivo, isolamento e
identificação dos
fungos
Cultivo, isolamento,
preservação e
identificação dos
fungos
100
0,40
40,00
600
0,80
480,00
Taq Polymerase
Tetróxido de ósmio
(conjunto com 10
unidades de 1g)
Tubos de Durham
Tubos de ensaio
(16x100mm)
Tubos de ensaio
(18x180mm)
Análise de amostras
43
UltraPure™
Agarose
100g
UltraPure™
EDTA
500g
UltraPure™
Tris
Hydrochloride 1Kg
Xilose (25g)
Análise molecular
Análise molecular
Análise molecular
Identificação de
leveduras
5
492,80
2.464,00
1
303,60
303,60
1
303,60
303,60
2
44,00
88,00
TOTAL
107.225,99
b) Serviços de terceiro pessoas jurídica – TOTAL R$ 30.000,00
- Manutenção de equipamentos
R$ 5.000,00
- Manutenção Certificação ISO 9001/2008 e ISO 17025/2005
R$ 16.000,00
- Serviços de marcenaria para confecção de armários para
armazenamento do acervo preservado sob óleo mineral
- Aquisição de cepas padrão
R$ 6.000,00
R$ 3.000,00
ORÇAMENTO TOTAL
RUBRICAS
Custeio
Capital
BOLSISTAS
Consumo
Serviços de terceiro
VALOR (R$)
107.225,99
30.000,00
Passagem
Diária
Equipamentos e
material permanente
Material bibliográfico
15.000,00
8.000,00
125.223,00
5.000,00
Bolsas
190.200,00
TOTAL
480.648,99
44
i) Cronograma de atividades;
Etapas
Ampliação do acervo
da Micoteca URM
Reativação e
autenticação
taxonômica das
culturas
Isolamento e
identificação das
culturas
Caracterização das
culturas quanto a
produção de
metabólitos de
interesse
biotecnológico
Caracterização
molecular das culturas
JAN
#
*
#
FEV MAR
#
#
*
*
#
#
ABR
#
*
#
MAI
#
*
#
Meses
JUN JUL AGO SET
#
#
#
#
*
#
#
#
#
OUT NOV DEZ
#
#
#
#
#
X
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
#
*
*
#
*
Seqüenciamento da
região ITS do r DNA
do gen calmodulina e b
tubulinina
Identificação de
culturas pela técnica do
MALDI TOF MS
Melhoria da qualidade
dos serviços
Participação em
cursos e treinamentos
Fornecimento de
amostras liofilizadas
Implantação do setor
de extração e
amplificação de DNA
Fornecimento de
material biológico
com qualidade
*
*
*
*
*
*
*
*
*
#
#
#
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
*
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
#
*
#
*
*
*
*
#
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
*
#
*
*
#
*
*
*
*
*
*
*
*
Formação de alunos e
profissionais
Avaliação do comitê
gestor
Manutenção do
Sistema de Gestão
Laboratorial
Entrega de Relatório
final
#
*
#
*
#
*
#
#
#
#
X
#
X
#
*
#
*
#
*
#
*
#
*
#
#
*
*
*
X= 2012; # = 2013; * = 2014
45
k) Indicação de colaborações ou parcerias interinstitucionais já estabelecidas para o
desenvolvimento do projeto, relevantes para sua exeqüibilidade;
A Coordenadora desta proposta participou e participa como coordenadora e como
membro da equipe de projetos em parceria com diversas instituições nacionais e
internacionais.
Para o presente projeto, foram estabelecidas parcerias com instituições nacionais e
duas internacionais: Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE); Unidade
Acadêmica de Garanhuns (UAG/UFRPE); Unidade Acadêmica de Serra Talhada
(UAST/UFRPE); o Laboratório de Tecnologia de Bioativos-LABTECBIO/UFRPE; a
Micoteca MUM, da Universidade do Minho em Braga-Portugal e o Cereal Research Centre,
Agriculture and Agrifood Canada, Winnipeg/Canada.
l) Disponibilidade efetiva de infra-estrutura e de apoio técnico para o desenvolvimento
do projeto;
Estão envolvidos com o desenvolvimento do projeto, pesquisadores, colaboradores,
técnicos e alunos de graduação e pós-graduação.
As instituições participantes (UFPE, UFRPE, CETENE e Universidade do Minho em
Braga-Portugal, e o Cereal Research Centre, Agriculture and Agrifood Canada,
Winnipeg/Canada), se comprometem em disponibilizar todos os equipamentos e em dar apoio
de pessoal técnico qualificado, necessários para a realização do projeto. A Universidade do
Minho disponibilizará pesquisadores especializados para a autenticação taxonômica das
culturas por técnicas clássicas, moleculares e pelo MALDI TOF MS.
Na UFPE, a Coleção de Culturas-Micoteca URM da UFPE ocupa um total de 104,73
m2, contendo 7 salas: uma sala para equipamentos, uma onde ficam os armários contendo o
acervo mantido em óleo mineral e água destilada esterilizada, uma dos pesquisadores, uma de
apoio para vidrarias, uma para microscopia, uma de manipulação das culturas e uma sala de
computadores. A Micoteca conta com os seguintes equipamentos: 1 Liofilizador (Edwards), 3
capelas de segurança biológica-Nível 2, 7 refrigeradores, 2 freezer, 1 ultrafreezer a -80C, 3
BODs, 1 autoclave de bancada, 1 destilador, 1 banho maria, 1 câmara de visualização ultra
violeta, 1 microondas, 1 estufa de incubação, 1 estufa de esterilização e secagem, 2
potenciômetros, 1 espectrofotômetro, 2 rotaevaporadores, 1 centrifuga refrigerada, 1
incubadora com agitação orbital e controle de temperatura, 2 balanças semi analíticas, 2
balanças analíticas, 6 microscópios ópticos de luz, 1 câmera digital para microfotografias, 1
estereomicroscópio e 6 computadores. A plataforma multiusuária de Genômica e Expressão
46
Gênica do Centro de Ciências Biológicas da UFPE, provê serviços tecnológicos para todos os
laboratórios de pesquisa da UFPE e poderá atender às necessidades da Micoteca URM. Para
isso, será utilizado o sequenciador de DNA Gene analyser 3500 da Applied Biosystems, com
oito capilares. Para a preparação de amostras em larga escala, a plataforma conta com um
sistema de automação de preparação de amostras modelo QAgilit da empresa Quiagen que é
capaz de processar mais de 500 amostras de reação de marcação de DNA para
sequenciamento por dia. Esta plataforma conta ainda com um corpo de técnicos de nível
superior responsáveis pelo recebimento e processamento das amostras e envio dos resultados
de sequenciamento.
As observações e registros das características microscópicas das culturas serão realizados
no CETENE, no Laboratório Multiusuário de Microscopia (LAMM) Eletrônica quee
Microanálise constitui um centro de facilidades instrumentais com capacidade de realizar desde
análises de rotina como a de amostras biológicas de diversas origens. Em relação aos
equipamentos disponíveis no LAMM, relacionamos entre os principais: o Microscópio eletrônico
de transmissão FEI Tecnai G200KV, equipado com câmara CCD, analisador EDX e STEM, e
módulo de tomografia digital para obtenção de imagens tridimensionais de alta resolução; o
microscópio eletrônico de transmissão FEI Morgagni 268D com câmara CCD, configurado e
otimizado para análises em amostras de materiais biológicos; o microscópio eletrônico Field
Emission Ambiental FEI Quanta 200 FEG, que permite a aquisição de imagens com resolução de
até 1.2 nm. Equipado com CCD e analisador EDX. O equipamento inclui também o módulo de
STEM que permite realização de imagens em microscopia eletrônica de transmissão e módulo de
aquecimento até 1000oC; sputtering "Super Cool de Alto Vácuo", para evaporação de camadas
condutoras em amostras TEM/SEM (Cr,W,Au/Pd,Pt) para recobrimentos FE-SEM; bomba de
membrana e turbo molecular montadas dentro do gabinete para garantir um vácuo isento de óleo.
MODELO: SCD 500; o aparelho de Ponto Crítico, Baltec, que realiza a secagem de amostras
pelo método de ponto crítico, sem alteração da tensão superficial das mesmas, o que permite a
manutenção da topografia de superfície das estruturas dos fungos.
A técnica do MALDI TOF MS para autenticação taxonômica das culturas e análise de
extrólitos será realizada no CETENE, na Universidade do Minho, Braga, Portugal e no Cereal
Research Centre/Agriculture and Agrifood Canada, Winnipeg/Canada.
Nas instalações da Unidade Acadêmica de Garanhuns-UAG e no Laboratório de
Tecnologia de Bioativos-LABTECBIO da UFRPE serão realizadas a produção e purificação
de enzimas, disponibilizando os materiais e equipamentos necessários. No LABTECBIO,
serão realizadas as etapas de caracterização das enzimas e apresenta os principais
47
equipamentos, temos: Leitora de microplacas, Câmara de Fluxo laminar, Centrifuga de
bancada refrigerada, Shaker com temperatura controlada, Sistema completo para eletroforese
horizontal, Sistema completo para eletroforese vertical, Espectrofotômetro UV/Vis, Banhos
termostatizados, Sistema de Água Ultrapura, Câmara Clímática e Liofilizador. Estas unidades
ainda contarão com infra-estrutura da Central Analítica (CENLAG), local específico para
trabalhos voltados para a pesquisa na área de caracterização, determinação de melhores
condições de produção e purificação de enzimas.
Nas instalações da Unidade Acadêmica de Serra Talhada da UFRPE serão realizados o
isolamento de fungos do solo da caatinga e a identificação dos que pertencerem aos
Zygomycota, os demais serão identificados pela equipe da Micoteca URM. Com o
desenvolvimento deste projeto, pretende-se implementar um laboratório de micologia, pois
recentemente foram contratados dois professores Doutores em Biologia de Fungos pela
UFPE, porém a infra-estrutura atual precisa ser melhorada para que estes pesquisadores
desenvolver suas pesquisas. A infraestrutura atual conta com 1 balança analítica, balança
semi-analítica, espectrofotômetro, centrífuga para Eppendorf, destilador, estufa e mufla.
m) Estimativa dos recursos financeiros de outras fontes que serão aportados pelos
eventuais Agentes Públicos e Privados parceiros.
Parte do projeto utilizará os recursos financeiros procedentes da PROPESQ/UFPE,
obtido como apoio institucional para o desenvolvimento das atividades da Micoteca URM.
Outra fonte financeira será procedente do projeto abaixo:
- Projeto: COLEÇÕES DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS MICOTECA URM E
UFPEDA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO,
Referência nº 2083/2007
Agência Financiadora: Convênio FINEP 01.08.0392.00
Edital TIB 10 – Centro de Recursos Biológicos, período 2008 - 2013.
Valor: R$ 571.879,00
Coordenadora: Profa. Cristina Maria de Souza Motta (UFPE).
- Projeto: AMPLIAÇÃO DO CONHECIMENTO SOBRE AS PLANTAS E FUNGOS DO
BRASIL
Edital CNPq nº 47/2010 - Chamada 2 - Pesquisa em Redes Temáticas para ampliação
do conhecimento sobre a biota, o papel funcional, uso e conservação da Biodiversidade
Brasileira.
48
Processo número 563342/2010-2.
Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa
Coordenadora: Leonor Costa Maia (UFPE)
- Projeto: BIODIVERSIDADE E REGENERAÇÃO NATURAL EM FLORESTAS
TROPICAIS SECAS BRASILEIRAS
Edital CNPq nº 47/2010 - Chamada 2 - Pesquisa em Redes Temáticas para ampliação
do conhecimento sobre a biota, o papel funcional, uso e conservação da Biodiversidade
Brasileira.
Processo número 563342/2010-2.
Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa
Coordenador: Mário Marcos do Espírito Santo (UFMG)
- Projeto: PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DA QUERATINASE DE ASPERGILLUS
SULPHUREUS
URM
5029
EM
FORMULAÇÕES
DE
DETERGENTES
DE
LAVANDERIA E NA DEPILAÇÃO DO COURO
Situação: Em andamento Natureza: Auxílio financeiro e bolsa PNPD
Período: 2012-2015
Agências: CAPES e FACEPE
Coordenador: Cristina Maria de Souza Motta (UFPE)
- Recurso Próprio: UFPE/PROPESQ e Prestação de Serviços da Micoteca URM.
n) Relatório de atividades e dos resultados alcançados com o apoio recebido em termos
de disponibilização de acesso ao acervo/laboratório/serviço apoiado a pesquisadores de
outros grupos/instituições.
O projeto “Ampliação e caracterização do acervo da Micoteca URM visando a
disponibilização de culturas como fonte de recursos biotecnológicos para o estado de
Pernambuco”, está apoiado no âmbito do Edital 07/2010 “Multiusuários” FACEPE, Processo
Nº APQ-0290-2.12/10, coordenado pela Profa. Cristina Maria de Souza Motta (Depto. de
Micologia/UFPE). Estão relacionadas abaixo as metas e os resultados obtidos em cada uma
49
delas. A metodologia utilizada para o alcance das metas está descrita no projeto do Edital
07/2010.
Alcance das Metas Propostas no Projeto
 Acervo da Micoteca URM ampliado em 10% do total de acesso atual até a conclusão do
projeto; e
 Reativar e autenticar taxonomicamente cerca de 200 culturas de fungos de dezembro de
2010 a dezembro de 2011;
O alcance destas duas metas estão mostrados na Tabela 1. Pode ser verificado que o
número de serviços prestados pela URM vem aumentando. Os anos 2008, 2009 e 2010, fazem
parte da tabela apenas para comparação em relação aos anos seguintes que já havia o apoio
financeiro da FACEPE, no âmbito do Edital 07/2010 “Multiusuários”. Estas solicitações são
procedentes de alunos, professores e pesquisadores de instituições de ensino e/ou pesquisa,
públicas e privadas e de laboratórios e indústrias do setor privado no país. Em 2001, o número
de solicitações quase dobrou em relação ao ano anterior. O número de amostras fornecidas
corresponde também ao número de amostras reativadas e autenticadas taxonomicamente.
Tabela 1: Número de amostras de fungos identificadas, fornecidas e incorporadas através dos
serviços da Micoteca URM (2008 até agosto de 2012)
ANO IDENTIFICAÇÃO FORNECIMENTO INCORPORAÇÃO
2008
60
218
132
2009
175
326
242
2010
513
480
149
2011*
529
820
211
2012*#
470
200
185
* Período apoiado também pela FACEPE através do Projeto Multiusuário APQ-02902.12/10; # Até agosto de 2012.
 Isolar e identificar por taxonomia clássica, cerca de 1000 culturas de fungos a partir de
janeiro 2011 até dezembro de 2011;
Foram isoladas e identificadas, 1.967 amostras de fungos procedentes de solo, de plantas
(endofíticos) (Tabela 2).
50
Tabela 2. Número e procedência das culturas isoladas e identificadas por taxonomia
clássica a partir de janeiro 2011 até dezembro de 2011
Zygomycetes
Solo
Nº de
isolados
99
Penicillium
Solo
802
Acerola
437
Aroeira
308
Cavalinha
235
Cactaceae (palma forrageira)
86
Procedência dos isolados
Fungos endofíticos
TOTAL
1.967
 Caracterização molecular de aproximandamente 50 amostras de Aspergillus e Penicillium
de março de 2011 a março de 2012;
Foram realidadas amplificações da região ITS do rDNA, dos genes ß tubulina e
calmodulina de 52 culturas de Penicillium e 40 de Aspergillus, 12 de outros gêneros. As
amostras de DNA das culturas de fungos foram amplificadas no Laboratório de Biologia
Molecular do Departamento de Micologia da UFPE e sequenciadas no Centro de Estudos do
Genoma Humano da USP-SP. Com os resultados obtidos, amostras do acervo da URM foram
autenticadas taxonomicamente, algumas confirmadas e outras reclassificadas. Os dados estão
sendo incorporados ao banco de dados da Micoteca URM.
 Identificar cerca de 100 culturas de fungos utilizando também a técnica do MALDI TOF
MS de março de 2011 a outubro de 2012;
Até o momento, foram caracterizados por MALDI-TOF ICMS no CETENE, 50 isolados
de Penicillium e 40 de Aspergillus, procedentes da Micoteca URM.
 Disponibilização de cerca de 100 culturas caracterizadas por diversas técnicas
taxonômicas e quanto a produção de enzimas na conclusão do projeto;
Como verificado na Tabela 1, mais de 100 culturas foram identificadas e na Tabela 3,
observa-se que 232 culturas foram caracterizadas quanto a produção de enzimas.
51
Tabela 3. Número de isolados caracterizados quanto à produção de enzimas.
Enzimas
Fungos
Número de isolados
Trichosporon
39
Geotrichum
15
Aspergillus
18
Fitase
Mucor, Rhizomucor e Absidia
13
Celulase
Aspergillus
36
Tanase
Penicillium
50
Queratinase
Aspergillus
11
Pectinase
Aspergillus
25
Protease
Aspergillus, Penicillium, Mucor e
Rhizomucor
25
Lipase
Total
232
 Implantação do Sistema de Gestão Laboratorial ao final do projeto;
No projeto inicial, a proposta foi implementar ações com base na Norma ISO 17025, para
isso é necessário a conclusão da reforma da infraestrutura da Micoteca URM, já apoiada pela
instituição, porém não concluída. Então para iniciarmos a implantação de um Sistema de
Gestão, foi solicitado à FACEPE e atendido, a implantação da
ISO 9001/2008. A
implantação da ISO 17025, será apoiada pelo Convênio FINEP: 01.08.0392.00, coordenado
pela Profa Cristina Maria de Souza Motta, curadora da Micoteca URM.
Em abril de 2012 foi iniciada a consultoria por empresa especializada para obtenção
certificação, com base na norma ISO 9001/2008. Atividades já alcançadas: diagnóstico,
definição da estrutura do Sistema de Gestão (SG), elaboração de planos de ação, mapeamento
dos processos, descrição do escopo, elaboração do Manual do SG, elaboração de POPs,
treinamento da equipe, elaboração da documentação referente ao controle de documentos e de
registros e definição da política do SG. A previsão para obtenção da certificação é dezembro
de 2012.
 Formação de cerca de 20 alunos e profissionais nas áreas de taxonomia de fungos e
biotecnologia ao longo do projeto;
Em outubro de 2011, foi ministrado o curso “Identificação Polifásica de Fungos
Filamentosos dos Gêneros Aspergillus e Penicillium com Aplicação Biotecnológica”, no
52
Hotel Holyday Inn, São Paulo-SP. A organização foi da Micoteca da Universidade do Minho,
Portugal e da Micoteca URM, UFPE, Brasil. Foram membros da comissão organizadora:
Nelson Lima, Cledir Santos, Marta Simões, MUM, Portugal, Cristina Motta, URM, UFPE,
Brasil, Lara Sette, UNESP, Brasil. Vinte e oito inscritos foram obtidos, sendo 27 do Brasil,
(FIOCRUZ, Rio de Janeiro e Manaus), UFPE, HC-UFES, UFRRJ, USP, UNIFESP, INT,
UFMT, UFMG, UFRB, Embrapa Agroenergia, UERJ, UECE e uma da Venezuela (do
INHRR). Participaram também como palestrantes: Zofia Kozakiewicz (UK), Jens Frisvad
(Dinamarca), Marta Taniwaki (ITAL, Brasil).
Por outro lado, alunos de graduação (12) e pós-graduação nos níveis mestrado (8) e
doutorado (6) desenvolveram suas monografias, dissertações e teses orientados pela equipe do
projeto.
 Publicação de cerca de 100 resumos em eventos e 10 artigos em revistas nacionais e
internacionais;
Foram apresentados 108 trabalhos em eventos nacionais e internacionais (Tabela 4).
Tabela 4: Trabalhos apresentados pela equipe do projeto, em eventos nacionais e
internacionais no período de 2010 a 2012.
Eventos
Nº de trabalhos
XVIII Simpósio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul/RS, 2011
03
44° Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Bento Gonçalves, 2011
02
2o Congresso Brasileiro de Palma e outras Cactáceas, Garanhuns, 2011
02
X Congresso de Ecologia do Brasil, São Lourenço-MG, 2011
01
II Simpósio de Biossegurança, Recife-PE, 2011
01
26° Congresso Brasileiro de Microbiologia, Foz do Iguaçu-PR, 2011
22
30th Annual Meeting of the European Culture Collections'
01
Organization, 2011, Utrecht - Holanda
Congresso Nacional MicroBiotec11, Braga, Portugal, 2011
01
XI Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE, Recife, 2011
04
XIX Congresso de Iniciação Científica da UFPE, 2011
06
I Congresso Nacional de Ciências Biológicas, Recife-PE, 2011
08
31th Annual Meeting of the European Culture Collections'
10
Organizations (ECCO), Braga, Portugal, 2012
20 Encontro Pernambucano de Micologia (EPEM), Recife-PE, 2012.
8
(aceitos para apresentação)
XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia, Santos-SP 2012.
32
(aceitos para apresentação)
TOTAL
108
Prêmios recebidos:
Título do trabalho: Polyphasic identification of Aspergillus section Nigri preserved
under mineral oil at URM Culture Collection. (Primeiro lugar)
53
Título do trabalho: Three new aflatoxigenic species of Aspergillus section Flavi
isolated in Portugal. (Terceiro lugar)
Tipo de participação: Pôster.
Evento: European Culture Collections' Organizations 30 Meeting (ECCO) CBS, Utrecht,
the Netherlands, 2011.
Título do trabalho: Seleção preliminar de fungos endofíticos de palma forrageira
(Cactaceae) quanto a produção de enzimas extracelulares.
Tipo de participação: Pôster.
Evento: I Congresso Nacional de Ciências Biológicas, Universidade Católica de
Pernambuco, Recife-PE. 2011.
Trabalhos publicados em periódicos
1. GOMES, B. S., SIQUEIRA, A.B.S., Maia, R.C.C., GIAMPAOLI, V., TEIXEIRA, E. H.,
ARRUDA, F.V.S., NASCIMENTO, K.S., LIMA, A. N., SOUZA-MOTTA, C. M.,
CAVADA, B.S., PORTO, Ana Lúcia Figueiredo. Antifungal activity of lectins against
yeast of vaginal secretion. Brazilian Journal of Microbiology (Impresso). , v.1, p.770 - 778,
2012.
2. COSTA, P. M. O., SOUZA-MOTTA, C. M., MALOSSO, E. Diversity of filamentous
fungi in different systems of land use. Agroforestry Systems (Print). , v.85, p.195 - 203,
2012.
3. Neves, Maria Luiza Carvalho, Porto, Tatiana Souza, Souza-Motta, Cristina Maria, Spier,
Michele Rigon, Soccol, Carlos Ricardo, Moreira, Keila Aparecida, Porto, Ana Lúcia
Figueiredo. Partition and recovery of phytase from Absidia blakesleeana URM5604 using
PEG-citrate aqueous two-phase systems. Fluid Phase Equilibria. , v.318, p.34 - 39, 2012.
4. HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., MACIEL, M. H. C., MOREIRA, K. A., SOUZAMOTTA, C. M., PORTO, Ana Lúcia Figueiredo. Partitioning and Purification of the
Cellulolytic Complex Produced by Aspergillus japonicus URM5620 Using PEG-Citrate
in an Aqueous Two-Phase System. Fluid Phase Equilibria. , v.335, p.8 - 13, 2012.
5. BEZERRA, J. D. P., Santos, M. G. S., Svedese, V. M., LIMA, D. M. M., FERNANDES,
M. J. S., PAIVA, L. M., SOUZA-MOTTA, C. M. Richness of endophytic fungi isolated
54
from Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae) and preliminary screening for enzyme
production. World Journal of Microbiology & Biotechnology. , v.28, p.1 - 7, 2012.
6. Herculano, Polyanna Nunes, Porto, Tatiana Souza, Moreira, Keila Aparecida, Pinto,
Gustavo A. S., Souza-Motta, Cristina Maria, Porto, Ana Lúcia F. Cellulase Production by
Aspergillus japonicus URM5620 Using Waste from Castor Bean (Ricinus communis L.)
Under Solid-State Fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology. , p.1057 - 1067,
2011.
7. CAMBUIM, I. I. F. N., MACEDO, D. P. C., DELGADO, M., LIMA, K. M., SANTOS, G.,
MENDES, G. P., SOUZA-MOTTA, C. M., LIMA, D. M. M., FERNANDES, M. J. S.,
MAGALHÃES, O. M. C., QUEIROZ, L. A., NEVES, R. P. Clinical and mycological
evaluation of onychomycosis among Brazilian HIV/AIDS patients. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical (Impresso). , v.44, p.40 - 42, 2011.
8. SILVA, L., SOUZA, O., FERNANDES, M. J. S., LIMA, D. M. M., COELHO, R. R. R.,
Souza-Motta, Cristina. Culturable fungal diversity of shrimp Litopenaeus vannamei
Boone from breeding farms in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology (Impresso). , v.42,
p.49 - 56, 2011.
9. Vieira, Paula Danielle de Souza, SOUZA-MOTTA, C. M., Lima, Debora, Torres, Jorge
Braz, Quecine, Maria Carolina, Azevedo, Joao Lucio, Oliveira, Neiva Tinti de. Endophytic
fungi associated with transgenic and non-transgenic cotton. Mycology. , v.2, p.91 - 97,
2011.
10. Siqueira, Virginia Medeiros, Conti, Raphael, Araújo, Janete Magali, Souza-Motta,
Cristina Maria. Endophytic fungi from the medicinal plant Lippia sidoides Cham. and
their antimicrobial activity. Symbiosis (Philadelphia, Pa.). , v.53, p.89 - 95, 2011.
11. SILVA, D. C. V., Tiago, P.V., MATTOS, J. L. S., PAIVA, L. M., SOUZA-MOTTA, C.
M. Isolamento e seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do
Município de Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas
hidrolíticas. Revista Brasileira de Botânica (Impresso). , v.34, p.607 - 610, 2011.
12. Herculano, Polyanna N., LIMA, D. M. M., FERNANDES, M. J. S., NEVES, R. P.,
SOUZA-MOTTA, C. M., PORTO, A. L. F. Isolation of Cellulolytic Fungi from Waste of
Castor (Ricinus communis L.). Current Microbiology (Print). , v.62, p.1416 - 1422, 2011.
13. Neves, Maria Luiza Carvalho, Silva, Milena Fernandes da, Souza-Motta, Cristina Maria,
Spier, Michele Rigon, Soccol, Carlos Ricardo, Porto, Tatiana Souza, Moreira, Keila
Aparecida, Porto, Ana Lúcia Figueiredo. Lichtheimia blakesleeana as a New Potencial
Producer of Phytase and Xylanase. Molecules (Basel. Online). , v.16, p.4807 - 4817, 2011.
55
14. GOMES, B. S., Souza-Motta, Cristina M., LIMA, A. N., Porto, Ana Lúcia Figueiredo.
Pathogenic characteristics of yeasts isolated from vaginal secretion preserved under
mineral oil. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases
(Online). , v.17, p.460 - 466, 2011.
15. MACIEL, M. H. C., HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., TEIXEIRA, M. F. S., Moreira,
Keila Aparecida, Souza-Motta, Cristina. Production and partial characterization of
pectinases from forage palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of
Biotechnology. , v.13, p.2469 - 2475, 2011.
16. LEAL, A. F. G., MACEDO, D. P. C., Souza-Motta, Cristina, FERNANDES, M. J. S.,
MAGALHÃES, O. M. C., NEVES, R. P. Ocorrência de fungos filamentosos de
importância médica em água de bebedouro. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso). ,
v.69, p.580 - 583, 2010.
17. Araújo Viana, Daniela, Albuquerque Lima, Carolina, Neves, Rejane Pereira, Mota,
Cristina Souza, Moreira, Keila Aparecida, Lima-Filho, José Luiz, Cavalcanti, Maria Taciana
Holanda, Converti, Attilio, SOUZA-MOTTA, C. M. Porto, Ana Lúcia Figueiredo.
Production and Stability of Protease from Candida buinensis. Applied Biochemistry and
Biotechnology. , p.13, 2010.
Artigos aceitos para publicação
1. SILVA, L. R. C., SANTOS, C. R., LIMA, J. S., FERNANDES, M. J. S., Moreira, Keila
Aparecida, Souza-Motta, Cristina Maria. Diversity of PENICILLIUM in soil of Caatinga
and Atlantic Forest areas of Pernambuco, Brazil: an ecological approach. Nova
Hedwigia. , 2012.
2. SILVA, A. C., QUEIROZ, A. E. S. F., PORTO, T. S., SPIER, M. R., SOCCOL, C. R.,
PORTO, A. L. F., SOUZA-MOTTA, C. M., MOREIRA, K. A. Partial Characterisation of
an Inulinase Produced by Aspergillus japonicus URM5633. Brazilian Archives of Biology
and Technology (Impresso). , p.671 - 676, 2012.
3. BEZERRA, J. D. P., LOPES, D. H. G., SANTOS, M. G. S., Svedese, V.M., PAIVA, L. M.,
CORTEZ, J. S. A., SOUZA-MOTTA, C. M. Riqueza de micro-organismos endofíticos em
espécies da família Cactaceae. Boletín de la Sociedad Latinoamericana y del Caribe de
Cactáceas y otras Suculentas. , 2012.
Capítulos de livros publicados
1. SOUZA-MOTTA, C. M.
56
Micoteca URM In: Estudos Universitários.22 ed.Recife : Universidade Universitária, 2011,
v.27, p. 167-169.
Outras atividades:
Atualização do Site e do banco de dados da Micoteca URM – todas as informações
associadas às culturas do acervo estão sendo incorporadas ao banco de dados desta
coleção.
Pesquisadores e respectivas instituições públicas e privadas que utilizaram os serviços da
Micoteca URM nos anos de 2010 a 2012 (até agosto).
Pesquisador/Professor
Alan Villela Pomella
Albino Citon
Adriana Todarop’
Adriana Ferreira de Souza
Alexandre Libanio Silva Reis
Ana Beatriz Sotero Siqueira
Ana Cristina Regis de Barros
Correia
Ana Lucia Figueiredo Porto
Ana Maria C. T de Arruda
Ana Maria Souto Maior
Ana Paula Portela
Ana Thereza dos Santos
André Luiz C.M. de A.
Santiago
Armando Marsden Lacerda
Filho
Bruno Sampaio
Bruno Severo Gomes
Carlos Eduardo de Araújo
Batista
Carlos Henrique Pessoa de
Menezes e Silva
Carolina da Silva
Cibele Callou
Cynthia de Oliveira
Nascimento
Cynthia Maria Carneiro Costa
Instituição
Laboratório de Biocontrole Farroupilha
LTDA
Laboratório de Análises e Pesquisas
Clínicas Carbélia-PR
Universidade Federal de Alagoas
Centro de Tecnologias Estratégicas de
Pernambuco
Centro de Tecnologias Estratégicas de
Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Sigla
LBF
Universidade Federal Rural de
Pernambuco
Lamen – Garanhuns/PE
Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Controle Biológico –
Maceió/AL
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
UFPE
Universidade Federal de Pernambuco
UFPE
Laboratório de Imunopatologia Keizo
Asami
Universidade Federal de Pernambuco
Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz - SP
Centro de Tecnologia de Análises LTDA.
Vitória-ES
Universidade Federal de Pernambuco
Hospital das Clínicas- UFPE
Hospital Veterinário da UFRPE
LIKA
Universidade Federal Rural de
UFRPE-UAST
LAPCC
UFAL
CETENE
CETENE
UFPE
UFPE
LAMEN
UFPE
BIOTECH
UFPE
UFPE
UFPE
ESALQ
CTA
UFPE
HC-UFPE
HV-UFRPE
57
Pernambuco
Cristina Maria de Souza Motta Universidade Federal de Pernambuco
Daiane Felberg Antunes
Universidade de Pernambuco
Galvão
Delson Laranjeira
Universidade Federal Rural de
Pernambuco
Diogo Luan de Oliveira
Unichapecó
Dulce Helena Ferreira de
Universidade Federal de São Paulo
Souza
Dráuzio Eduardo Naretto
Rangel
Edeltrudes de Oliveira Lima
Eduardo da Silva Martins
Edmilson Nascimento
Elza Áurea de Luna Alves
Lima
Elvira Maria Bezerra de
Alencar
Fabiane Cardoso
Fernanda Lopes Motta
Fernando Braleim
Flávia Cristina dos Santos
Lima
Frederico Costa
Galba Campos Takaki
Genilda Mendes
Geogges Gomes Oliveira
Gianne Rizzoto Araújo
Grazielle Santos Silva
Hamilton Cabral
Henrique Maia Valério
Idalina Inês Fonseca Nogueira
Cambuim
Isabel Cristina
Helio Fernandes de Melo
Janete Magali de Araújo
José Ivanildo de Souza
João Lúcio de Azevedo
Joelleton Oliveira
Julia Campos
UFPE
UAG-UPE
UFRPE
UNICHAPECÓ
UNIFESP
Universidade do Vale do Paraíba
UNIVAP
Universidade Federal da Paraíba
Universidade Estadual de Minas Gerais –
Frutal
BioRJ Produtos Biológicos e Científicos
LTDA
Universidade Federal de Pernambuco
UFPB
UEMG
Universidade de Pernambuco
UPE
Laboratório Químico e Farmacêutico
Nikkho do Brasil LTDA
Universidade Estadual de Campinas
Universidade Federal do Espírito Santo
Universidade Federal de Campina Grande
Nikkho do
Brasil
UNICAMP
UFES
UFCG
Faculdade Pernambucana de Saúde
Universidade Católica de Pernambuco
Universidade de Pernambuco
Instituto de Medicina Integral de
Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Escola de Engenharia de Lorena
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto
Universidade Estadual de Montes Claros
Hospital Otávio de Freitas
FPS-IMIP
UNICAP
UPE
IMIP
Biotech- Maceió -AL
Universidade Federal Rural de
Pernambuco. Campus Serra Talhada
Universidade Federal de Pernambuco
Instituto de Botânica de São Paulo
Escola Superior de Agricultura "Luiz de
Queiroz"
Universidade Estadual do Mato Grosso do
Sul
Centro de Tecnologias Estratégicas de
BIOTEC-AL
UFRPE-UAST
BioRJ
UFPE
UFPE
USP
USP
UNIMONTES
HOF
UFPE
IBOT-SP
ESALQ-USP
UEMS
CETENE
58
Juliana Tomazzoni Bold
Kátia Aquino
Keila Aparecida Moreira
Kelly Lana Araújo
Kelly Samara de Lira Mota
Larissa Isabela Oliveira de
Souza
Laura Mesquita Paiva
Leonildo Bento Galiza da
Silva
Leonice Asfora Sorubbo
Lilian M. M. Fiuza
Luciana Cristina Lins de
Aquino
Luiz Henrique Souza
Guimarães
Luiza Ribas Casseb
Luiz Roberto D. de Abreu
Madson Ralide
Marcelo Fraga
Marcela Motta Drechsee
Maria Anilda dos Santos
Araújo
Marina Kimico Kadawaki
Maria de Lourdes Polizelli
Maria Francisca Simas
Teixeira
Marialba A. A. de Castro
Marilene da Silva Cavalcanti
Maurício Batista Filho
Nadia S. Parachin
Nadja Elizabeth P. Lopes
Neiva Tinti de Oliveira
Nelson Correia
Norma Buarque de Gusmão
Oliane Maria Correia
Magalhães
Patrícia Maria Guedes Paiva
Polyana Nunes Herculano
Raiza Guerra Lima de
Medeiros
Pernambuco
Universidade Federal do Pampa
Universidade Federal de Pernambuco
Unidade Acadêmica de Garanhuns
Universidade Estadual de Mato Grosso
Universidade Federal da Paraíba
Universidade Federal de Alagoas
UFP-RS
UFPE
UFRPE
UEMT
UFPB
UFAL
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal Rural de
Pernambuco
Universidade Católica de Pernambuco
Laboratório Química Farmaceutica Nikko
do Brasil LTDA – Rio de Janeiro/RJ
Universidade Federal de Sergipe
UFPE
UFRPE
Universidade de São Paulo
USP
UNAERP/SP
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte
Universidade Estadual de Montes Claros
Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro
EMBRAPA
FEJAL / CESMAC - AL
UNAERP/SP
UFRN
Universidade Estadual do Oeste do
Paraná
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto - SP
Coleção do Departamento de
Parasitologia da Universidade Federal do
Amazonas - DPUA
Universidade Estadual de Maringá-PN
Universidade Federal de Pernambuco
Instituto de Botânica de São Paulo
Universidade de Brasília
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
UNIOESTE
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal Rural de
Pernambuco
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte
UFPE
UFRPE
UNICAP
NIKKO
UFSE
UNIMONTES
UFRRJ
EMBRAPA
CESMAC
FFCLRP
UFAM
UEM
UFPE
IBSP
UNB
UFPE
UFPE
UFPE
UFPE
UFPE
UFRN
59
Rejane Pereira Neves
Renata Pereira Limberger
Rita de Cassia Mendonça de
Miranda
Robert Weingart Barreto
Romero Moura
Ronnison Alves Marques
Rosimary Leão
Sabrina Garcia Bioetto
Sergio Barbosa da Silva
Simone Quinelato Bezerra
Silvia Mariana
Suraia Said
Taciana de Amorim Silva
Tânia Montenegro Stamford
Thais Rossini de Oliveira
Thiago Cavalcante da Silva
Uiara Pomina
Wagner Bettiol
Zilmeire Alves Marques
Zoilo Pires de Camargo
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal Rural do Rio
Grande do Sul
LAF-NUCT Campus São Cristovão
UFPE
UFRRS
Universidade Federal de Viçosa
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade Federal de Pernambuco
Associação Caruaruense de Ensino
Superior
Universidade de São Paulo
Universidade de Pernambuco
Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade de São Paulo
Universidade Federal do Amazonas
Universidade Federal de Pernambuco
Universidade de Campinas
Claeff Engenharia e Produtos Químicos
LTDA. Camaragibe-PE
Universidade Estadual de Montes Claros
Embrapa – Jaguariúna - SP
Universidade Federal Rural de
Pernambuco
Universidade Federal de São Paulo
UFV
UFPE
UFPE
ASCES
UFS
USP
UPE
UFRRJ
UFPE
USP
UFAM
UFPE
UNICAMP
CLAEFF
UNIMONTES
EMBRAPA
UFRPE
UNIFESP
A Micoteca URM disponibiliza também culturas para o desenvolvimento projetos de
pesquisa, de iniciação científica, monografias de conclusão de curso de graduação e
especialização, dissertações e teses, gerando diversas publicações em periódicos nacionais e
internacionais, contribuindo com a formação de recursos humanos especializados.
60
Referências Bibliográficas
AGUILAR, C.N.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; VINIEGRA-GONZÁLEZ, G. 2001.
Induction and repression patterns of fangal tannase in solid-state and submerged cultures.
Process Biochemistry, 36, 565-570.
AGUILAR, C.N.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; VINIEGRA-GONZÁLEZ, G. 2001.
Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in influence of glucose and tannic acid.
Journal of industrial Microbiolgy and Biotecnology, 20, 612-614.
ALBERTON,
L.
R.Produção
de
xilanase
em
resíduos
agroindustriais
por
Streptomycesviridosporus T7A e aplicação do extrato bruto em veterinária. (Tese) Doutorado
em Processos Biotecnológicos, Universidade Federal do Paraná, 2004.
ALEXOPOULOS, C.J., MIMS, C. W., BLACKWELL, M. 1996.Introductory Mycology.4. ed.
New York: John Wiley & Sons, 870 p.
ALVES, J.J.A.; ARAÚJO, M.A.; Nascimento, S.S. 2009. Degradação da caatinga: uma
investigação ecogeográfica. Caminhos de Geografia9: (27): 143 – 155.
ARAÚJO, W.L.; LIMA, A.O.S.; AZEVEDO, J.L.; MARCON, J.; SOBRAL, J. K.; LACAVA,
P.T. Manual: Isolamento de microorganismos endofíticos. ESALQ, Piracicaba, 2002, 86 p.
BARNETT, J. A.; YAMADA, T., NOZAMA, Y. Yeasts: Characteristics and identification. 3 ªed.
Cambridge: University Press. 2000. 1002 p.
BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. C.; BRUNS, R. E. Como fazer experimentos: pesquisa e
desenvolvimento na ciência e na indústria. Editora da Universidade de Campinas UNICAMP, Campinas, São Paulo, 2ª ed., p.401, 2002.
BENNY, G.L. The methods used by dr. R. K. Benjamin, and other mycologists to isolate
Zygomycetes. Aliso n.26, p.37-61, 2008.
BENNY, G.L. Zygomycetes. Synopsis and Classification of Living Organisms. McGraw - Hill
Book Co. Inc., New York. P.184-195, 1982.
BEZERRA, J.D.P., SANTOS, M.G.S., SVEDESE, V.M., LIMA, D.M.M., FERNANDES,
M.J.S., PAIVA, L.M., SOUZA-MOTTA, C.M. 2012. Richness of endophytic fungi isolated
from Opuntia ficus-indica Mill. Cactaceae) and preliminary screening for enzyme production.
World Journal of Microbiology and Biotechnology.
BHAT, M. K. 2000. Cellulases and Related enzymes in biotechnology.Biotechnology Advances
18: 355-383.
61
BILLS, G.F. 1996 Isolation and analysis of endophytic fungal communities from woody plants.
In: Redlin, S.C., Carris, L.M. (Ed). Endophytic Fungi in Grasses and Woody Plants:
systematics, ecology, and evolution. APS. St Paul, MN. 31–65.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities
of protein utilizing the principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, n.72,
p.248-254, 1976.
BROWN, N.A., ANTONIW, J., HAMMOND-KOSACK, K.E., The predicted secretome of the
plant pathogenic fungus Fusarium graminearum: a refined comparative analysis. PLoS One.
2012, 7, e 33731.
BUSSAMARA, R.; FUENTEFRIA, A. M.; OLIVEIRA, E. S.; BROETTO, L.; SIMCIKOVA,
M.; VALENTE, P.; SCHRANK, A.; VAINSTEIN, M. H. Isolation of a lipase-secreting yeast
for enzyme production in a pilot-plant scale batch fermentation. Bioresource Technology, p.
268-275, 2010.
CANHOS, V.P., UMINO, C.Y., MANFIO, G.P. 2006. Coleções de microrganismos: coleções de
culturas
de
microrganismos.
82-101.
Disponível
em:
<http://www.biota.org.br/pdf/v72cap03.pdf> Acesso em: 11 de dezembro de 2011.
CAPIZZI, R.L., POOLE, M., COOPER, M.R., RICHARDS, F., STUART, J.J., JAKSON, D.V.,
WHITE, D.R., SPURR, C.L., HOPKINS, J.O., MUSS, H.B. 1984. Treatment of poor risk
acute leukaemia with sequential higdone ARA-C and asparaginase.Blood 63, 649-700.
CHOI, W.Y., RIM, S.O., LEE, J.H., LEE, J.M., LEE, I.J., CHO, K.J., RHEE, I.K., KWON, J.B.,
KIM, J.G. 2005 Isolation of gibberellins producing fungi from the root of several
Sesamumindicum plants. Journal of Microbiology and Biotechnology 15, 1, 22–28.
CLARKE, K.R.; WARWICK, R.M. 1994. Change in marine communities – an approach to
statistical analysis and interpretation. Plymouth Marine Laboratory, USA.
CORDEIRO NETO, F.,PERSSONI, R.A.B., FIGUEIREDO-RIBEIRO, R.C.L. 1997. Fungos
produtores de inulinases isolados da rizosfera de Asteraceae herbácea do cerrado (MojiGuaçu, SP, Brasil). Revista Brasileira de Ciência do Solo 21, 149-153.
COSTA, A.M; RIBEIRO, W.X..; KATO, E.; MONTEIRO, A.R.G; PERALTA, R.M. Production
of tannase by Aspergillus tamarii in Submerged Cultures. Brazilian Archives of Biology and
Technology, 51, 399-404, 2008.
COUGHLAN, M.P.; HAZLEWOOD, G.P. Beta-1,4-D-xylan-degrading enzymesystems:
biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology andApplied Biochemistry,
v.17, p.259-289, 1993.
62
COURI, S.; FARIAS, A.X. Genetic manipulation of Aspergillus niger for increased synthesis of
pectinolytic enzymes. Review Microbiology, v. 26, p. 314-317, 1995.
CUZZI, C.; LINK, S.; VILANI, A.; ONOFRE, S. B. 2011. Enzimas extracelulares produzidas
por fungos endofíticos isolados de Baccharis dracunculifolia d.c. (Asteraeceae). Gl. Sci.
Technl, v. 04, p. 47 – 57.
DAI, C.C., YU, B.Y., LI, X. 2008 Screening of endophytic fungi that promote the growth of
Euphorbia pekinensis. African Journal of Biotechnology 7, 19, 3505–3510.
DALMAU, L.M. Remarques sur la technique mycologique. Annales Parasitologie et Humaine
Comparée, 7:536-545, 1929.
DINU, D.; NECHIFOR, T. M.; STOIAN G.; COSTACHE, M.; DINISCHIOTU, A. 2007.
Enzymes with new biochemical properties in the pectinolytic complex produced by
Aspergillus niger MIUG 16. Journal of Biotechnology, v.1,31:128-137.
DOMSCH, K.H.; GAMS, W.; ANDERSON, T. Compendium of soil fungi. San Francisco: IHW
– Verlag, 1993, 859p.
DWIVEDI, R., SPICER, V., HARDER, M., ANTONOVICI, M., et al., Practical Implementation
of 2D HPLC Scheme with Accurate Peptide Retention Prediction in Both Dimensions for
High-Throughput Bottom-Up Proteomics. Anal. Chem. 2008, 80, 7036-7042.
FISHER, P. J., SUTTON, B. C., PETRINI, L. E., PETRINI, O. 1994. Fungal endophytes from
Opuntiastricta: a first report. Nova Hedwigia 59, 195–200.
FRANCA-ROCHA, W.; SILVA, A.B.; NOLASCO, M.C.; LOBÃO, J.; BRITTO, D.; CHAVES,
J.M.; ROCHA, C.C. 2007. Levantamento da cobertura vegetal e do uso do solo do Bioma
Caatinga. In: Anais XIII Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto, Florianópolis, Brasil,
pp. 2629-2636.
FRISVAD JC, SAMSON RA. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium. A
guide to identification of food and air-borne terverticillate penicillia and their mycotoxins.
Stud Mycol. v.49,1–173, 2004.
GASONI, L. GURFMKEL, B.S. 1997 TheendophyteCladorrhinumfoecundissimum in cotton
roots: phosphorus uptake and host growth. Mycological Research 101, 867–870.
GEISER, D.M.; KLICH, M.A.; FRISVAD, J.C.; PETERSON, S.W.; VARGA, J.; SAMSON,
R.A. The current status of species recognition and identification in Aspergillus. Stud Mycol.
v.59, n.1, p.1-10, 2007.
GINTHER, C. L. Sporulation and the production of serine protease and cephamycin c by
Streptomyces lactamdurans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 15, 522-526, 1979.
63
GLASS, N. L.; DONALDSON, G. C. Development of primer sets designed for use with the PCR
to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl. Environ. Microbiol . v.61,
p.1323–1330, 1995.
GUINDON, S.; GASCUEL, O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large
phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biol. 52:696–704.
GULATI, R., SAXENA, R.K., GUPTA, R. 1997. A rapid plate assay for screening Lasparaginase producing micro-organisms. Lett Appl Microbiol 24, 23-26.
HALL, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 41:95–98,
HALLMANN, J.A.; QUADT-HALMANN, W.; MAHAFFEE, F.; KLOEPPER, J.W. 1997
Bacterial endophytes in agricultural crops. Canadian Journal of Microbiology 43, 895-914.
HALTRICH, D.; NIDETZKY, B.; KULBE, K.D; STEINER, W.; ZUPANIC, S. Production of
fungal xilanases.BioresourceTechnology, v. 58, p. 137-161, 1996.
HELBIG, E. Ação da maceração prévia ao cozimento do feijão-comum (Phaseolus vulgaris, L)
nos teores de fitatos e taninos e conseqüências sobre o valor protéico. 67 f. Dissertação
(Mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2000.
HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., MACIEL, M. H. C., MOREIRA, K. A., SOUZA-MOTTA,
C. M., PORTO, A. L. F. Partitioning and Purification of the Cellulolytic Complex Produced
by Aspergillus japonicus URM5620 Using PEG-Citrate in an Aqueous Two-Phase System.
Fluid Phase Equilibria, v.335, p.8 - 13, 2012.
HESSELTINE, C.W.; FENNEL, D.I. The genus Circinella. Mycologia, v.7, p.193-211, 1995.
HYDE, K.D., SOYTONG, K. 2008 The fungal endophyte dilemma. Fungal Divers33, 163–173.
IMADA, A., IGARASI, S., NAKAHAMA, K., ISONO, M. 1973 Asparaginase and Glutaminase
Activities of Micro-organisms, SGM 76, 85-99.
JACOBS, K.; BOTHA, A. 2008.Mucorrenisporus sp. nov., a new coprophilous species from
southern Africa. Fungal Divers 29:27–35.
KEATING, M.J., HOLMES, R., LERNER, S., HO, D. H. 1993. L-asparaginase and PEG
asparaginase – Past, present and future. Leuk Lymphoma 10, 153-157.
KELLER, B. O.; SUI, J.; YOUNG, A. B.; WHITTAL, R. M. Interferences and contaminants
encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, v.627, p.71-81, 2008.
KENDRICK, B. 2000. The Fifth Kingdom. 3 ed. Mycologue publications.
KLICH, M. A. Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia, v. 94: 21-27,
2002.
64
KREGER-VAN RIJ , N. J. W. The yeast: a taxonomic study. 3ª ed. Amsterdan: Elsevier Science
Publication, 1984.
KRISHNAN, S., PRAPULLA, S.G., RAJALAKSHMI, D., MISRA, M.C., KARANTH N.G.
1998. Screening and selection of media components for lactic acid production using PlackettBurman design. Bioprocess Eng 19, 61-65.
KURAMAE-IZIOKA, E.E.; LOPES, C.R.; SOUZA, N.L.; MACHADO, M.A. 1997.
Morphological and molecular characterization of Colletotrichum spp. from citrus orchards
affected by post bloom fruit drop in Brazil. Eur. J. Plant Pathol., 103:323-329.
LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS-VACARRI, E. M.; MELO, N. K.
Tratado de Micologia Médica. 9. ed. São Paulo: Editora Savier, p. 1104, 2002.
LAPMAK, K., LUMYONG, S., THONGKUNTHA, S., WONGPUTTISIN, P., SARDSUD, U.
2010 L-Asparaginase Production by Bipolarissp. BR438 Isolated from Brown Rice in
Thailand Chiang Mai J. Sci. 37(1), 160-164
LARKIN, M.A.; BLACKSHIELDS, G.; BROWN, N.P.; CHENNA, R.; MCGETTIGAN, P.A.;
MCWILLIAM, H.; VALENTIN, F.; WALLACE, I.M.; WILM, A.; LOPEZ, R.;
THOMPSON, J.D.; GIBSON, T.J.; HIGGINS, D.G. 2007. Clustal W and Clustal X version
2.0. Bioinformatics 23:2947–2948.
LEAL, I.L.; SILVA J.M.C.; TABARELLI, M.; LACHER JR, T.E. 2005. Mudando o curso da
conservação da biodiversidade na Caatinga do Nordeste do Brasil. Megadiversidade 1(1):
139-146.
LEKHA, P.K.; LONSANE, B.K. And properties of tannin acyl hidrolase produced by PKL 104
in solid-state, liquid surface and submerged fermentations. Process Biochemistry, 29, 497503, 1994.
LODDER, J. The Yeast: a taxonomic study. Oxford: North Holland Publishing Company, 1970.
1385p.
LONG WANG; WEN-YING ZHUANG. A Phylogenetic analyses of penicillia based on partial
calmodulin gene sequences. BioSystems v.88, p. 113–126, 2007.
LONG WANG; WEN-YING ZHUANG. Eupenicillium saturniforme, a New Species Discovered
from Northeast China. Mycopathologia, v.167, p.297–305, 2009.
MACEDO, G.A.; MATSUDA, L.K.; BATTESTIN, V. Seleção de Fungos Produtores de Tanases
em resíduos Vegetais Ricos em Taninos. Ciênc. Agrotec. v.29, p.833-838, 2005.
MACIEL, M. H. C., HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., TEIXEIRA, M. F. S., Moreira, Keila
Aparecida, Souza-Motta, Cristina. Production and partial characterization of pectinases from
65
forage palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of Biotechnology. , v.13, p.2469
- 2475, 2011.
MALINOWSKI, D.P., BRAUER, D.K., BELESKY, D.P. 1999 Neotyphodiumcoenophialumendophyte affects root morphology of tall fescue grown under phosphorus deficiency. Journal
of Agronomy and Crop Science 183, 53–60.
MAUTONE, J.N. Diversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a
leveduras isolados de folhas de figueiras do Parque de Itapuã, RS, Brasil. Dissertação
(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da
Saúde. Programa de Pós- Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Porto
Alegre, 2008.
MEHROTRA, B.S.; MEHROTRA, B.M. 1979-1978.Another azygosporicspecies of Mucorfrom
India.Sydowia 31:94–96.
MELO, M.N.; FERRE,R.; CASTANHO, M.A.R.B. Antimicobial peptides: linking partition,
activity and high membrane-bound concentration. Nature opinion, v.7, 2009.
MICHELIN, M. Estudo da glucoamilase e da ƒ¿-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces
variotii: purificacao, caracterizacao bioquimica e relacoes filogeneticas. 2005. 160f.
Dissertacao (Mestrado em Ciencias) . Departamento de Biologia . Universidade de Sao Paulo,
Ribeirao Preto, 2005.
MICOTECA URM. Histórico. Disponível em: <http://www.ufpe.br/micoteca/historico. html>.
Acesso em: 15 de agosto de 2012.
MILNE, I.; WRIGHT, F.; ROWE, G; MARSHAL D.F.; HUSMEIER, D.; MCGUIRE, G. 2004.
TOPALi: Software for Automatic Identification of Recombinant Sequences within DNA
Multiple Alignments. Bioinformatics 20:1806–1807.
MIRZA, J.H.; KHAN, S.M.;
BEGUN,
S.;
SHAGUFTA, S.
1979. Mucorales
of
Pakistan.Universityo f Agriculture, Faisalabad.
MURUGAN, K.; S. SARAVANABABU, M.; M. ARUNACHALAM. Screening of tannin acyl
hydrolase (E.C.3.1.1.20) producing tannery effluent fungal isolates using simple agar plate
and SmF process. Bioresource Technology, v.98, p. 946-949, 2007.
NAKASONE KK, Peterson AW, Jong S. Preservation and distribuition of fungal cultures. In:
Mueller GM, Bills GF, Foster MS. Biodiversity of fungi, inventory and monitoring methods.
1st ed. San Diego: Elsevier Academic Press; 2004.
NEVES, M. L. C., PORTO, T. S., SOUZA-MOTTA, C. M., SPIER, M. R., SOCCOL, C. R.,
MOREIRA, K. A., PORTO, A. L. F. Partition and recovery of phytase from Absidia
66
blakesleeana URM5604 using PEG-citrate aqueous two-phase systems. Fluid Phase
Equilibria, v.318, p.34 - 39, 2012.
O’DONNELL, K.L. 1979. Zygomycetes in culture. University of Georgia, Georgia.
OCDE. www.oecd.org/dataoecd. > Acesso em: 13 de maio de 2010.
OLIVEIRA, G. G. G.; SILVA, D. P.; ROBERTO, I. C.; VITOLO, M.; PESSOA-JUNIOR, A.
Purificação de glicose-6-fosfato desidrogenase em sistemas de duas fases aquosas utilizando
PEG/citrato. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v.37, n.2, p.176-187, 2001.
OLIVEIRA, A.N; OLIVEIRA, L.A.; ANDRADE, J.S.; CHAGAS-JUNIOR, A.F. 2007. Produção
de amilase por rizóbios, usando farinha de pupunha como substrato. Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Campinas, v.27, n.1, p. 61 – 66.
PASTORE, G.M.; COSTA, V. S.; KOBLITZ, M.G.B. Purificação parcial da lipase extracelular
produzida por nova cepa de Rhizopus sp. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 23, p. 135140, 2003.
PEDRESCHI, F., KAACK, K., GRANBY, K. 2008. The effect of Asparaginase on acrylamide
formation in French fries. Food Chem 109, 386–392.
PEREIRA-MEIRELLES, F. V.; ROCHA-LEÃO, M. H. M.; SANTŤ ANNA, G. L. A stable
lipase from Candida lipolytica -Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 63-65, p. 73-95,
1997.
PINHEIRO, I.O., ARAUJO, J.M., XIMENES, E.C.P.A., PINTO, J.C.S., ALVES, T.L.M. 2001
Production of L-asparaginase by Zymomonas mobilis strain CP4. BD 06, 243-244.
PITT, J.I. 1988. A laboratory guide to common Penicillium species . Commonealth scientific and
Industrial Research organization Division Food Processing. 187p.
PORTO, A. L. F., CAMPOS-TAKAKI, G. M. and LIMA FLIHO, J. L. Effects of culture
conditions on protease production by Streptomyces clavuligerus growing soy bean flour
medium. Applied Biochemistry Biotechnology, v. 60, p.115-122, 1996. QUI, F., ZHAN, Y.,
ZENG, F., JING, T. 2012. Effect of endophytic fungi on the growth situation in cell
suspension cultures of Acer ginnala Maxim. AMR 343-344, 384-390.
RAPER, K.B.; FENNELL, D.I. The genus Aspergillus.Baltimore.Williams & Wilkins. 1965.
686p.
RAPER, K.B.; THOM, C. 1949. A manual of the penicillia. Baltimore, Williams & Wilkins, 709
p.
REYNOLDS, D.R., TAYLOR, J.W. 1993. The Fungal Holomorph: A Consideration of Mitotic
Meiotic and Pleomorphic Speciation, CAB International, Wallingford. UK.
67
RICHARDSON, M. 2009. The ecology of the Zygomycetes and its impact on environmental
exposure. ClinMicrobiol Infect15, 2-9.
RIM, S.O., LEE, J.H., CHOI, W.Y., HWANG, S.K., SUH, S.J., LEE, I.J., RHEE, I.K., KIM, J.G.
2005. Fusarium proliferatum KGL0401 as a new gibberellins-producing fungus. Journal of
Microbiology and Biotechnology 15, 4, 809–814.
RODRIGUES, W.C. 2005. DivEs - Diversidade de espécies. Versão 2.0. Software e Guia do
Usuário. Disponível em: <http://www.ebras.bio.br>. Acesso em: 10/05/2007.
ROSA, C. A.; LACHANCE, M. A.; SILVA, J. O. C.; TEIXEIRA, A. C. P.; MARINI, M. M.;
ANTONINI, Y.; MARTINS, R. P. Yeast communities associated with stingless bees. FEMS
Yeast Research, v. 4, p. 271-275, 2003.
SAMSON R.A. , VARGA J. , WITIAK S.M. GEISER D.M. The species concept in Aspergillus:
recommendations of an international panel 3Stud Mycol 59(1): 71-73 2007
SAMSON, R. A.; FRISVAD, J. C. Penicillium Subgenus Penicillium: new Taxonomics
Schemes, Mycotoxins and Other Extrolites. 2004. Studies in Mycology, 49: 1-260
SANTIAGO, A.L.C.M.A., SOUZA-MOTTA, C.M. 2006. Mucorales isolados do solo de
mineração de cobre e produção de amilase e inulinase.Acta BotanicaBrasilica.20, 641-647.
SANTOS, C.; PATERSON, R. R. M.; VENÂNCIO, A.; LIMA, N. 2009. Filamentous fungal
characterizations
by
matrix-assisted
laser
desorptionionization
time-of-flight
mass
spectrometry. Journal of Applied Microbiology, 1-11.
SARUBBO, L. A. 2000. Caracterização de um novo sistema bifásico aquoso e aplicação em
extração de proteínas com coluna de discos perfurados rotativos. Tese Doutorado em
Engenharia-química) - Universidade de Campinas/UNICAMP, Campinas, 174p.
SARQUIS, M.I.M., OLIVEIRA, E.M.M., Santos, A.S., Costa, G.L. 2004 Productionof Lasparaginasebyfilamentousfungi. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99, 489-492.
SAXENA, R.K., SINHA, U. 1981. L-Asparaginase and glutaminase activities in the cultures
filtrates of Aspergillus nidulans. Curr. Sci 50, 281-219.
SAXENA, R.K.; W.S DAVIDSON, SHEORAN, A.; GIRI, B. Purification and characterization
of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus. Process Biochemistry, p 239247, 2003.
SCHIPPER MAA. 1978. On certain species of Mucor with a key to all accepted species. Studies
in Mycology 17: 1-69.
SCHIPPER MAA. 1984. A revision of the genus Rhizopus I. The Rhizopus stolonifer group and
Rhizopus oryzae. Studies in Mycology 25: 1-34.
68
SCHIPPER, M.A.A. (1990). On certain species of Mucor with a key to all accepted species.
Studies in Mycology 25: 1–53.
SCHNITTLER M, STEPHENSON SL. 2000. Myxomycetes biodiversity in four different forest
types in Costa Rica. Mycologia 92: 626-637.
SELWAL M.K., SELWAL, K.K. 2011 High-level tannase production by Penicillium
atramentosum KM using agro residues under Submerged fermentation. Ann Microbiol 62(1):
139-148.
SERRA, R., CABANES, F. J., PERRONE, G., CASTELLA, G., VENANCIO, A., MULE, G. &
KOZAKIEWICZ, Z. (2006). Aspergillus ibericus: a new species of section Nigri isolated
from grapes. Mycologia 98, 295–306.
SHARMA S, BHAT T.K., DAWRA R.K. (2000) A Spectrophotometric Method for Assay of
Tannase Using Rhodanine. Anal Biochem 279:85–89. doi:10.1006/abio.1999.4405
SHERF, A.F. 1943. A method for maintaining Phytomonas sepedonica in culture for long periods
without transfer. Phytopathol 33, 330-332.
SINGH, A., SINGH, N., NARSIBISHNOI, R. 2009. Production of Cellulases by
AspergillusHeteromorphus from Wheat Straw under Submerged Fermentation.International
Journal of Civil and Environmental Engineering v. 1, n.1. SMITH; ONION. 1994. Projeto
“The Tree of Life” em http://tolweb.org.
SODRÉ, G.S; MARCHINI, L.C.; ROSA, V.P; MORETI, A.C.C.C; CARVALHO, C.A.L.
Conteúdo microbiológico de méis de Apis mellifera (Hymenoptera: apidae) dos estados do
Ceará e Piauí. B. Indústr.anim., N. Odessa,v.64, n.1, p.39-42,jan./mar., 2007.
SOLIMAN N.A., BEREKAA M.N., ABDEL-FATTAH Y.R. 2005. Polyglutamic acid production
by Bacillus sp. SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate
culture requirements. Appl. Microbiol. Biotechnol 69, 259-67.
SONIYAMBI, A.R., LALITHA, S., PRAVEESH, B.V., PRIYADARSHINI, V. 2011 Isolation,
Production and Anti-tumor activity of L-asparaginase of Penicillium sp. Internacional Journal
of Microbiological Research 2 (1), 38-42.
STATSOFT. 1997. Statistic for Windows 5.1. CD ROM. TULSA, STATSOFT INC.
RODRIGUES, W.C. 2005. DivEs - Diversidade de espécies. Versão 2.0. Software e Guia do
Usuário. Disponível em: <http://www.ebras.bio.br>. Acesso em: 10/05/2007. (
STROBEL, G., DAISY, B., CASTILLO, U., HARPER, J. Natural Products from Endophytic
Microorganisms. Journal of Natural Products 67(2): 257-268, 2004.
STROBEL, G.A., HESS, W.M., FORD E., SIDHU, R.S., YANG, X. 1996 Taxol from fungal
endophyte and issue of biodiversity. Journal of Industrial Microbiology 17, 417–423.
69
SUBRAHAMANYAM, A. 1983.Studies on thermo mycology.Mucorthermohyalospora sp.
nov.BibliothecMycol 91:421–423.
SURYANARAYANAN, T.S., WITTLINGER, S.K., FAETH, S.H. 2005. Endophytic fungi
associated with cacti in Arizona. Mycol. Res 109, 5, 635–639.
SWOFFORD, D.L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other
Methods). Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
THEANTANA, T., HYDE, K.D., LUMYONG, S. 2007 Asparaginase production by endophytic
fungi isolated from some Thai medicinal plants. KMITL Sci. Tech. J 7, S1, 13-18.
THEANTANA, T., HYDE, K.D., LUMYONG, S. 2009 Asparaginase production by endophytic
fungi from Thai medicinal plants: citoxicity properties. IJIB 7, 1.
UENOJO, M.; PASTORE, G.M.. 2007. Pectinases: Aplicações Industriais e Perspectivas.
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas, CP 6121, 13083-862 Campinas – SP, Brasil. Quim.
Nova, Vol. 30, No. 2, 388-394.
VARGA, J., KEVEI, F., HAMARI, Z., TO´ TH, B., TE´ REN, J., CROFT, J. H. &
KOZAKIEWICZ, Z. (2000). Genotypic and phenotypic variability among black Aspergilli. In
Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus classification, pp.
397–411. Edited by R. A. Samson & J. I. Pitt. Amsterdam: Harwood Academic Publishers.
VARGAS, T. Avaliação da qualidade do mel produzido na região dos Campos Gerais do Paraná.
2006. 134f. Dissertação (Mestrado em Ciência e tecnologia de alimentos) – Universidade
Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, 2006.
WADE, H.E., ROBINSON, H.K., PHILIPS, B.W. 1971. Asparaginase and glutaminase activities
of bacteria. J Gen Microbiol 69, 299-312.
WATANABE, N., OTA, Y., MINODA, Y., YAMADA, K. Isolation and identification of
alkaline lipase producing microrganisms, cultural conditions and some properties of crude
enzymes. Agricultural and Biological Chemistry, v.41, p.1353-1358, 1977.
WHITE TJ, BRUNS T, LEE S, TAYLOR J, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics. 315–322, in Innis MA, Gelfand DH, Shinsky JJ,
White TJ, (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San
Diego.
WIAME, J.M., GRENSON, M., ARST, N.H.J.R. 1985. Nitrogen catabolite repression in yeasts
and filamentous fungi. Adv Microbiol Physiol 26, 1-88.
Wriston, J.C., Yellin, T. 1973 L-asparaginase: A review. Adv. Enzimol 39, 185.
70
World Data Center for Microorganisms (WDCM). 2012. Home Pages of Culture Collections in
the World. Disponível em: <http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html>. Acesso em:15 de Maio de
2008.
XU, J.; EBADA, S.S.; PROKSCH, P. 2010. Pestalotiopsis a highly creative genus: chemistry and
bioactivity of secondary metabolites. Fungal Divers. doi:10.1007/s13225-010-0055-z.
ZAR JH. 1996. Biostatistical analysis. Prentice-Haal, New Jersey.
71