Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 1 1 29.10.07 11:24:10

Transcrição

Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 1 1
29.10.07 11:24:10
Tendências
em
HIV•AIDS
Volume 2 - Número 3 - 2007
Editor chefe
Ricardo Sobhie Diaz – Universidade Federal de São Paulo
Corpo editorial
Adauto Castelo Filho – Universidade Federal de São Paulo
André Lomar – Hospital Israelita Albert Einstein
Artur Kalichman – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP
Artur Timerman – Hospital Heliópolis
Breno Riegel – Hospital Nossa Senhora da Conceição, Rio Grande do Sul.
Celina Maria Pereira de Moraes Soares – Doutoranda da Universidade Federal de São Paulo
Celso Ramos – Universidade Federal do Rio de Janeiro
David Salomão Lewi – Universidade Federal de São Paulo – Hospital Israelita Albert Einstein
Eduardo Sprinz – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Érico A. Gomes de Arruda – Hospital São José de Doenças Infecciosas do Ceará
Esper George Kallas – Universidade Federal de São Paulo
Estevão Portella – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Guido Levi – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo
João da Silva Mendonça – Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo
José Luiz de Andrade Neto – Universidade Federal do Paraná
Jeová Keny Baima Colares – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP
Jorge Simão do Rosário Casseb – Médico Pesquisador do Laboratório de Imunologia 56 – LIM56 – Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
Márcia Rachid – Assessoria de DST/Aids da Secretaria do Estado do Rio de Janeiro
Marcos Vitória – Organização Mundial de Saúde
Marinella Della Negra – Instituto de Infectologia Emílio Ribas
Paulo Feijó Barroso – Universidade Federal do Rio de Janeiro
Reinaldo Salomão – Universidade Federal de São Paulo – Casa de Saúde Santa Marcelina
Ricardo Pio Marins – Organização Panamericana de Saúde
Rosana Del Bianco – Secretaria Municipal de Saúde de São Paulo
Unaí Tupinambás – Universidade Federal de Minas Gerais
Valdez Madruga – Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS – SP
ÍNDICE
REAL TIME PCR UMA MINI REVISÃO ............................................................................................................................................................... 5
Shirley Komninakis
QUAL A MELHOR ESCOLHA DE TRATAMENTO ANTIRETROVIRAL PARA PACIENTES CO-INFECTADOS HCV-HIV? ........................... 11
Paulo Roberto Abrão Ferreira e Simone de Barros Tenore
VACINAS PROFILÁTICAS ANTI-HIV ................................................................................................................................................................ 16
Jorge Casseb
CORECEPTORES CCR5 E CXCR4 E POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS .................................................................................................... 19
Monica Jaques de Morais
DESTAQUES ..................................................................................................................................................................................................... 23
RESUMO DE TESES ......................................................................................................................................................................................... 28
Atha Comunicação & Editora
Planejamento Editorial, Diagramação e Produção Gráfica
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EDITORIAL
Caro leitor
Fechando a porta para o HIV.
Inibição replicação do HIV interagindo nas fases mais precoces do ciclo de replicação do vírus tem sido uma grande
alternativa inovadora. Além dos inibidores de fusão como o T20, desenvolvem-se os inibidores que se ligam aos receptores do vírus; CD4, CCR5 e CxCR4. Neste fascículo a Dra Monica Jaques resume as possibilidades terapêuticas
relacionadas à inibição da entrada do vírus pela interação com os co-receptores CCR5 e CxCR4. Revisão oportuna, dada
a recente liberação pelo FDA da droga Maraviroc, um inibidor do CCR5. A grande luz sobre a possibilidade terapêutica
da inibição do CCR5 veio dos estudos sobre a observação da história natural da infecção pelo HIV e a relação com
o polimorfismo do CCR5. Descobriu-se, por exemplo, que o alelo que codifica o CCR5 pode apresentar em algumas
pessoas a deleção de 32 nucleotideos (∆32). Quando isto ocorre de forma homozigota, ou seja, em pessoas cujos
dois alelos são ∆32, vai haver a resistência à infecção pelo HIV in vivo e in vitro1. Esta deleção está presente em 1%
dos indivíduos brancos e é ausente nos negros, ameríndios ou asiáticos. Especula-se que este alelo de origem Viking
tenha sido selecionado na idade média por ocasião da peste, posto que este perfil também levaria a resistência a esta
infecção2. Interessante notar que os indivíduos heterozigotos, ou seja, que apresentam um alelo normal e outro ∆32,
apesar de se infectarem pelo HIV, apresentam uma progressão para a doença mais lenta3 e responderiam melhor ao
tratamento anti-retroviral4. Em outras palavras, esta diminuição natural das portas de entrada para o HIV em nível celular
contribuiria de forma benéfica para os pacientes. Mais interessante ainda, estas pessoas que apresentam a completa
ausência da expressão do receptor CCR5, que seriam as pessoas com homozigose para o ∆32, apresentam uma vida
normal sem aparentes prejuízos à saúde. Disto tudo veio à luz a estratégia de bloquear o CCR5 tendo como objetivo
impedir a entrada do vírus na célula sem possíveis danos à imunidade do hospedeiro, já que 1% da população sobrevive
sem a expressão deste receptor em decorrência da presença do ∆32 em homozigose. Um porém nesta estratégia: o
vírus eventualmente pode utilizar o CxCR4 para entrar na célula. O vírus que infecta inicialmente a pessoa tende a ser
R5 (vírus com tropismo pelo CCR5), pois este é o receptor da célula dendrítica que captura o vírus durante a infecção
primária para levá-lo ao linfonodo regional. Ao longo do tempo, o vírus pode mudar o seu tropismo e utilizar também
(ou exclusivamente) o receptor CxCR4.
Aparentemente existe um preço para a não expressão do CCR5 nas pessoas que apresentam homozigose para o ∆32.
Existe nestas pessoas uma mortalidade maior na infecção pelo vírus do Nilo oriental (west Nile vírus ou WNV)5. Sabe-se
que o CCR5 é um determinante chave para o tráfego de leucócitos para o cérebro e que camundongos com deleção
de CCR5 sempre morrem de WNV cerebral, além de apresentarem uma redução de células NK, leucócitos e células T
no cérebro6.
O preço pago pela inibição do CxCR4 é ainda maior. Aparentemente a importância biológica deste receptor é muito grande.
Como exemplo, ratos com knockout do CxCR4 desenvolvem anormalidades na formação das células B, do coração e
do fígado. Em tempo, o inibidor de CxCR4 conhecido como AMD 3100 foi descontinuado por cardiotoxicidade.
O artigo “Coreceptores CCR5 e CXCR4 e Possibilidades Terapêuticas” deste fascículo comenta também sobre a necessidade de realização de teste de tropismo para decisão sobre o uso dos inibidores do CCR5, sendo que chamo a
atenção de que não só os testes de fenotipagem tem utilidade, como também existem os testes de genotipagem que
poderiam ser aplicados para este fim7.
Ricardo Sobhie Diaz
REFERÊNCIAS
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2. Novembre J, Galvani AP, Slatkin M. The geographic spread of the CCR5 Delta32 HIV-resistance allele. PLoS Biol. 2005 Nov;3(11):e339.
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Jan 23;203(1):35-40. Epub 2006 Jan 17.
6. Glass WG, Lim JK, Cholera R, Pletnev AG, Gao JL, Murphy PM. Chemokine receptor CCR5 promotes leukocyte trafficking to the brain and survival in West Nile virus infection. J Exp Med.
2005 Oct 17;202(8):1087-98.
7. Silva WP, Santos DEM, Brunstein A, Leal ES, Sucupira MCA, Sabino EC, Diaz RS. Reactivation of ancestral strains of HIV-1 in the gp120 V3 env region in patients failing antiretroviral therapy
and subjected to structured treatment interruption. Virology, 2006, 354, 1:35-47.
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REAL TIME PCR UMA MINI REVISÃO
REAL TIME PCR A MINIREVIEW
Shirley Komninakis
Doutorndo do Laboratório de Retrovirologia, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina – Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina.
RESUMO
Real Time PCR tem e continuará a ter um impacto substancial nas ciências da vida por varias razões: o risco de contaminação
por amplicon é mínima pois o tubo permanece fechado, processamento pós PCR não é necessário e os resultados tem uma
alta precisão, reprodutibilidade e sensibilidade. As vantagens do Real Time PCR são exploradas no diagnóstico clinico, monitoramento de doenças infecciosas e tumores. Esta técnica é aplicada para medida de expressão gênica de citocinas e em
tecidos, amostras forenses, monitoramento de alimentos. Real Time PCR se tornara uma das mais importantes técnicas das
ciências da vida.
Descritores: Real Time PCR, Ácidos nucléicos, Reação em Cadeia da Polimerase
ABSTRACT
Real time PCR have had an will continue to have a substantial impact on life sciences for several reasons: the risk of carry-over
contamination is minimal because of the close tube, post PCR processing is not required and the results have a high precision,
reproducibility and sensibility. The advantages of Real Time PCR are exploited in clinical diagnosis, monitoring infectious diseases
and tumours. This technique is applied for the cytokine and tissues gene expression, forensic samples, food monitoring. Real
Time PCR will become one of the most important techniques in molecular life sciences.
Keywords: Real Time PCR, Nucleic acids, Polymerase chain reaction
INTRODUÇÃO
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), desde o início de
sua utilização, sempre representou uma importante ferramenta para a análise de genomas ou segmentos de DNA ou RNA,
detecção de patógenos, pré-requisito para o sequenciamento
gênico, engenharia genética, entre outras utilizações.
A associação da PCR com equipamentos que detectam e
monitoram sinais de fluorescências em tempo real durante o
processo de amplificação representou um avanço na biologia
molecular.
Higuchi et al em 1992 construíram um sistema que incluía um
termociclador que irradiava ultravioleta sobre as amostras e uma
câmera CCD acoplada para captar a fluorescência emitida1. O
sistema incluiu na reação o brometo de etideo, um reativo que
quando intercala entre duas fitas de DNA emite uma fluorescência 20 - 1000 vezes maior que a basal. Ele construiu gráficos de
acumulo de fluorescência versus os ciclos e, demonstrou que
a fluorescência acumulada do brometo de etideo ao longo dos
ciclos era diretamente proporcional a quantidade de alvo inicial.
Assim, poucos ciclos são necessários para produzir um sinal detectável quando um grande numero de copias esta presente2.
Um dos principais problemas do uso do intercalador é que este
se liga a produtos específicos e inespecíficos, mas Holland et al
em 1991, demonstraram que poderia ser utilizado um método
alternativo o 5ńuclease. Neste método uma probe alvo poderia ser clivada pela atividade 5ńuclease de uma polimerase,
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quando esta enzima estende um fragmento a partir do iniciador sense 3.
Em 1993 Lee et al desenvolveu as probes fluorescentes
que são oligonucletídeos com as porções 5´ e 3´marcadas
com um reporter dye e um quencher dye, respectivamente.
Enquanto a probe não é clivada pela atividade 5ńuclease,
ela não emite fluorescência devido a proximidade do reporter e do quencher por meio de FRET (Foster Resonance
Energy Transfer)4. Uma grande vantagem das probes fluorescentes é que se ocorrer pareamentos inespecíficos do
iniciador sense ou da probe não há emissão de sinal. Outra
vantagem é que podemos utilizar diferentes marcações nas
probes e, isso possibilitou a detecção de vários alvos em
uma única reação.
Apesar do que foi mencionado acima sobre os intercalantes
serem inespecíficos, atualmente se utiliza o minor-groove binding dye SYBR® Green I5. O SYBR® é muito utilizado por necessitar pouco desenho experimental e ter menor custo que
as probes . Além disso, atualmente é realizada uma análise
de melting curve no final da amplificação, quando se utiliza o
SYBR®. A temperatura é acertada em torno de 50ºC e então
aumentada gradativamente (0.1ºC/s) até alcançar os 94ºC.
Assim, conforme há o aumento da temperatura ocorre a fusão
das fitas (separação) e consequentemente o reativo intercalante é liberado na solução e a fluorescência diminui. Produtos
de reação específica geralmente se separam a altas temperaturas ao contrario e artefatos, dímeros e outros produtos espú-
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rios. A temperatura de melting é uma função do tamanho e da
quantidade de CG do fragmento amplificado6.
As vantagens da Real Time PCR são inúmeras, dentre elas, a
alta eficiência da detecção comparada com análises em gel,
a reprodutibilidade, a sensibilidade de detecção de até uma
cópia e a rapidez por não envolver passos pós-PCR que também contribuem para evitar contaminações do ambiente e das
reações com amplicons.
A PCR possui quatro fases: a primeira fase se encontra escondida sob um background de fluorescência (basal); na segunda fase ocorre a amplificação exponencial que ultrapassa
o background inicial; a terceira é a fase linear com eficiência
e aumento da fluorescência e a quarta fase conhecida como
plateau onde acontece a atenuação da taxa de amplificação
exponencial correspondente aos últimos ciclos7,8.
A quantidade de produto amplificado na fase exponencial é diretamente proporcional à quantidade de alvo inicial, somente
nesta fase. Na fase exponencial encontramos todos os reativos
necessários disponíveis na reação e, quando em concentrações adequadas, permitem que haja uma alta eficiência e análises quantitativas com alta reprodutibilidade e sensibilidade.
Nos ciclos iniciais da Real Time PCR há pouca mudança no
sinal de fluorescência. Isto define o baseline para o gráfico
de amplificação. Quando a reação entra na fase exponencial
ocorre um aumento na fluorescência acima deste basal e indica a acumulação do produto amplificado. Uma linha de base
pode ser fixada acima deste baseline (threshold). O CT (cycle
threshold) é definido no momento em que a fluorescência ultrapassa o baseline9. Podemos determinar o número de cópias
iniciais quando o valor do CT, representativo da quantificação
de amostras desconhecidas, é colocado frente a valores de
uma curva padrão.
O nível do threshold pode ser obtido pelo software do equipamento utilizado, que determina o desvio padrão dos pontos
que formam baseline10.
As quantificações podem alcançar uma larga faixa de detecção, com pelo menos oito ordens de magnitude sendo muito
mais específicas que os ensaios de end-point PCR os quais
possuem, duas ordens11-13. O grande problema da PCR convencional é que a fase final de plateau observada no gel não
pode ser diretamente relacionada com a quantidade inicial de
copias do alvo, pois nos estágios finais da PCR há escassez e
degradação dos reagentes, como também cada reação apresentou uma cinética de reação, acumulando alta variabilidade12-14. A análise em tempo real da amplificação permite, ou por
meio de probes ou análises de melting curve, a quantificação
de alvos que podem ser DNAs ou RNAs de forma acurada,
para análises de expressão gênica, diagnósticos de doenças
infecciosas, detecção de polimorfismos de um simples nucleotídeo (SNPs), análise de organismos geneticamente modificados (OGMs), pesquisa de contaminantes na industria de
alimentos, como bactérias e fungos, entre outros.
Formatos de detecção
SYBR Green I
O SYBR Green se liga ao minor-groove da dupla fita de DNA
com uma afinidade 100 vezes maior do que o brometo de etideo15,16. Ele pode ser excitado com luz azul com comprimento
de onda de 480nm. O mencionado self-quenching da ligação
do SYBR com a dupla fita de DNA não é fonte de erro para a
análise quantitativa, pois a taxa da marcação o sinal da fase
6
exponencial é usado para que a taxa de marcação dos pares
de bases seja maior do que 217. Então o produto da PCR é
saturado pelo SYBR e o self- quenching é proporcional a quantidade de produto da PCR.
Um dos questionamentos sobre a utilização dos intercalantes é sua ligação a qualquer dupla fita, isto incluiria produtos
inespecíficos. Isto pode ser minimizado pelo desenho dos iniciadores, padronização da reação, aumento da temperatura
de melting dos iniciadores, definição de concentrações adequadas dos iniciadores e titulação do MgCL2. Se dímeros
de iniciadores (primer-dymer) se formam nos ciclos finais de
amplificação isto mascara o sinal. Outro enfoque importante é
realizar um melting curve no final da reação para separar os
produtos específicos dos inespecíficos, como mencionado no
item anterior16.
Probes de hibridização
As probes de hibridização são utilizadas no formato de FRET.
Há uma porção 3´doadora marcada usualmente com FAM
(6-carboxi-fluorisceína) e uma probe aceptora marcada na
porção 5´ com um fluoróforo (Cy3, Cy5, TET, TAMRA, ROX,
entre outros)18.
Para que o FRET ocorra dois fluoróforos devem estar próximos. Durante a fase de anelamento dos iniciadores as probes
hibridizam adjacentemente na fita simples de DNA e a energia
de excitação é transferida do doador para o aceptor. Quando
a Taq polimerase é utilizada as probes podem ser em parte
hidrolizadas diminuindo suas concentrações e produzir sinais
subótimos. Este problema pode ser solucionado pela utilização de polimerases sem atividade 5ńuclease19,20.
Probes Hidrolisáveis
Este sistema se baseia na ligação de dois iniciadores e uma
probe a três alvos diferentes, sendo que a probe se liga primeiro a seqüência alvo, seguido dos iniciadores, por diferença na temperatura. A “probe” possui uma fluorisceína na porção 5` (“reporter”) e na porção 3` (“quencher”) que por meio
de ressonância, obtida pela proximidade das duas regiões,
não permite que haja escape de fluorescência21. A separação
do reporter e do quencher se dá pela atividade 5ńuclease da
enzima Taq polimerase, que durante a polimerização da fita
que está sendo gerada, cliva a probe tendo assim a liberação
do sinal de fluorescência3,22. O desenho de uma probe com
ligação eficiente ao alvo é a chave para o sinal eficiente na
PCR. A utilização deste sistema para seqüências de DNA alvo
ricos em AT é problemática, pois a temperatura de melting da
probe tem que ser 5ºC a 10ºC acima dos iniciadores. Em alguns casos há a necessidade do desenho de uma probe com
seqüência longa. Este problema pode ser solucionado pela
adição de uma seqüência denominada minor grove binding
(MGB) que aumenta a TM, mas aumenta também a complexidade e o custo da probe23. O sistema de probes hidrolisáveis é produzido atualmente por várias indústrias, inclusive a
marca registrada Taqman é utilizada como sinônimo da Real
Time PCR 23.
Molecular Beacons
O molecular beacon foi descrito em 1995 por Tyagi et al24. A
sua estrutura química é muito parecida com as probes hidrolizaveis, sendo eles marcados nas porções 5é 3, por um reporTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10)
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ter e quencher. O meio da probe é seqüência complementar
ao alvo, enquanto 10 a 15 nucleotídeos terminais são complementares entre eles. A estrutura é em forma de “grampo”
(hairpin) onde o reporter e o quencher estão intimamente próximos. Durante a fase de anelamento dos iniciadores a parte
do meio da probe se liga ao DNA alvo afastando o quencher e
a fluorescência é então liberada25,26. As condições de hibridização são criticas para este ensaio e difíceis de otimizar.
Sunrise primers
Este sistema consiste de um iniciador com a porção 5´ com
estrutura em forma de “grampo” e proximidade do reporter e
do quencher. Num primeiro momento o sunrise primer sense
é estendido e esta seqüência serve como alvo para o iniciador reverso. No final a enzima polimerase abre a estrutura em
grampo, um produto da PCR em dupla fita é formado e a fluorescência liberada pelo afastamento do quencher e reporter27.
A porção posterior da alça (stem) também abre em dímeros e
produtos inespecificos, ou seja, o sinal não é realmente especifico para o produto da PCR
Scorpion primers
Este sistema é parecido estruturalmente funcionalmente com
o molecular beacon, mas serve como iniciadores na PCR.
Scorpion primers possuem seqüências complementares entre
eles, que forma uma estrutura em alça na porção 5´, com seqüência complementar ao alvo na alça e o final 3´ serve como
um iniciador. A região posterior da alça (stem) é marcada com
um fluoróforo e um quenche, No primeiro passo da amplificação o iniciador é estendido formando uma simples fita para
a ligação do iniciador reverso no segundo passo. O stem se
abre e a alça se liga a seqüência alvo havendo emissão de
fluorescência pela separação do quencher e fluoróforo. Em
contraste com o sistema sunrise a extensão reversa é bloqueada por um grupo hexetilenoglicol, assegurando que o reporter
do scorpion primers permaneça com quencher em produtos
inespecificos28,29.
Light-up probes
Light-up probes são peptídeos de ácidos nucléicos que usam
thiazole orange como fluoróforo. Durante a hibridização com a
seqüência alvo duplexes e triplexes são formados aumentando a fluorescência, sem necessidade de um quencher. Esta
técnica apresenta fluorescência inespecifica que aumenta durante a PCR e prejudica a sensibilidade30,31. Alguns formatos
aumentam o quencher por meio da presença de resíduos de
guanina no produto da PCR. A medida da diminuição do sinal, especialmente durante a fase exponencial, é um problema
pois somente poucas probes são quencheadas32,33.
Análises quantitativas
Para a realização de análises quantitativas curvas devem ser
construídas. O processo deve ser monitorado por meio de reagentes intercalantes ou sistemas de probes . É essencial que
as eficiências das curvas e amostras sejam iguais. A eficiência
(E) pode ser estimada por meio dos valores dos Cts (cycle
threshold) com concentrações conhecidas de um padrão.
O valor máximo de eficiência numa reação da PCR é 2 (quantidade de produto dobra a cada ciclo). Os valores de E podem
variar entre 1.5 e 1.9, mas isto implica na diminuição da senTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 05-10)
sibilidade, mas com alta especificidade. Uma eficiência constante na amplificação de diferentes amostras é um importante
critério para comparação e análise dos dados. Os valores de
Cts são muito reprodutíveis para reações com o mesmo numero inicial de cópias34,35,36.
A eficiência pode ser calculada pelo uso do valor de inclinação
(slope) da curva padrão: E=10-1/slope 37.
Em ensaios otimizados erros padrões de ±2 ciclos podem ser
alcançados. Assumindo que a eficiência da PCR é de 100%,
isto implica que o erro mínimo relativo para a quantificação
seria em torno de 10 a 20%38.
Para construir curvas padrões para os experimentos devemos
avaliar os tipos de quantificação absoluta ou relativa, ou seja,
que utilizam um padrão externo ou um gene de referencia, respectivamente.
Para a análise de quantificação absoluta necessitamos de
um padrão diluído com concentrações conhecidas. Devemos
considerar o desenho do padrão, sua produção, determinação
exata da concentração e estabilidade por um longo período.
Estes fatores podem ser problemáticos de serem alcançados.
O intervalo de quantificação (dynamic range) da curva deve
ser entre 101 a 1010 moléculas iniciais, com nove ordens de
magnitude, dependendo do material amplificado(13,39).
A curva de quantificação absoluta pode ser baseada em concentrações conhecidas de DNA, plasmideo com fragmento de
interesse clonado (DNA recombinante), produto de RT-PCR e
oligonucleotideos comerciais12,39,40. A estabilidade e reprodutibilidade dependem do tipo de padrão utilizado e da boa pratica de laboratório. DNAs e plasmideos são muito estáveis e
reprodutíveis. A vantagem dos oligonucleotideos comerciais e
seqüências curtas de DNA é evitar o processamento do material com ganho de tempo e o conhecimento acurado da concentração e comprimento do material8,12,39. Quando os Cts das
amostras estiverem disponíveis, estes podem ser comparados
aos valores de Cts obtidos e relacionados com concentrações
iniciais conhecidas da curva padrão. Outro problema que deve
ser evitado são os resultados falsos negativos, que podem
ocorrer pela presença de inibidores de reação. Para isso, é desejável a utilização de um controle interno com concentração
conhecida que pode ser adicionado na reação desde o procedimento de extração.
A quantificação relativa determina as mudanças nos níveis de
RNA de um gene através de múltiplas amostras e ela expressa
o nível relativo a um gene de referencia. Este gene de referencia é frequentemente um gene endógeno (housekeeping) que
pode ser co-amplificado no mesmo tubo, por meio de um ensaio
multiplex (amplificação de dois ou mais alvos em uma mesma
reação) ou pode ser amplificado separadamente13,40. A quantificação relativa não necessita de um padrão com concentração
conhecida e o gene de referencia pode ser qualquer transcrito,
como por exemplo um RNA mensageiro ribossômico 18S41.
Quantificação relativa e’ baseada nos níveis de expressão de
um gene alvo versus um gene de referencia e utilizado para
determinar mudanças fisiológicas da expressão de um gene.
Para calcular a expressão de um gene alvo em relação a um
gene de referencia adequado vários modelos matemáticos
são estabelecidos (normalização). Como exemplo temos os
cálculos de crossing points (CP), valores de threshold (Ct) ou
aquisição de CP de acordo com algoritmos matemáticos estabelecidos 42,43,44. O calculo de ΔCt entre os valores da amostra
e gene de referencia ‘e uma ferramenta fácil para estimar mudanças relativas. Um calculo muito utilizado ‘e o 2ΔΔCt descrito
por Livak45. Os resultados deste método são semi-quantitativos
pois utilizam o valor fixo de 2 para a eficiência de todas as
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amostras. Os calculo mais confiáveis são os descritos por Pfaffl
que inclui a analise de eficiência46.
Alguns softwares são utilizados para analise de comparação
de grupos e para mais de 100 amostras, por exemplo, REST e
REST-XL que utiliza a media dos valores de CP44. Estes programas se baseiam na eficiência da PCR ou uma eficiência
pré-determinada de 2 (100%).
A qualidade dos dados de expressão obtidos do alvo não devem ser melhores do que os dados do normalizador (gene de
referencia). Qualquer variação do normalizador pode obscurecer mudanças reais e produzir artefatos41,47.
Os genes de referencia mais comumente utilizados são o GAPDH, albumina, actina, tubulinas, ciclofilinas, microglobulinas,
rRNA 18S ou rRNA 28S48.
Uma analise de expressão pode ser prejudicada pela falta de
eficiência nos métodos de extração e de transcrição reversa
(RT), problemas com a integridade do RNA e presença de inibidores de reação que poderiam subestimar as quantidades
de material inicial entre as amostras 49,50,51. Isto é especialmente relevante quando amostras são obtidas de indivíduos
diferentes, tecidos diferentes e em tempos diferentes, pois resultaria na falta de interpretação do perfil dos genes alvo.
O problema crucial da analise expressão relativa é a utilização
de um gene de referencia adequado que não sofra variações
sob determinadas condições experimentais e entre os individuos. No entanto, quando usada de forma adequada pode gerar
informações importantes.
Aplicações
O Real Time PCR é utilizado para quantificacões relativas ou
absolutas de moléculas de RNA e DNA e para genotipagem em
uma variedade de aplicações. Este ensaio permite determinar
8
cargas virais, expressão gênica, presença de microorganismos
e contaminações em alimentos, sangue e outros fluidos e tecidos, graus de deleção e amplificação de genes52,53.
Este método esta também se tornando importante no diagnóstico de tumores, dtecção e monitoramento de doenças residuais, identificação de micrometástases em colon retal, neuroblastoma e cancer de próstata36, 54-57,58-60.
Outra utilização é a quantificação de oncogenes, analises de
deleções de genes supressores de tumor, como também a resposta as drogas no tratamento do câncer 61-64.
Uma aplicação importante na clinica é o estabelecimento de
perfis de citocinas por meio da analise da expressão gênica.
Analises de quimerismo são possíveis com o uso de probes
com seqüências especificas para diferenciar ou quantificar alelos. Para o quimerismo a faixa de detecção é grande baseada
na inserção/deleção de polimorfismos e os SNPs (single nucleotide polimorphysm) são também possíveis65,66.
O Real Time também é utilizado em analises forenses67-69. Podemos avaliar por meio do melting curve a presença de mutações, caracterização da especificidade do produto da PCR,
genotipagem, entre outros.
O Real Time PCR é uma técnica de alta precisão, reprodutibilidade e sensibilidade, que pode ser aplicada em varias áreas da biologia e medicina. Sua utilização minimiza o risco de
contaminação por meio de amplicons pois não é necessária a
manipulação pós PCR, além de podermos analisar um grande numero de amostras em pouco tempo. Por outro lado, há
a necessidade da boa pratica de laboratório e conhecimentos
sobre formas de análise dos resultados para que os experimentos fiquem adequados. Ainda assim, o Real Time PCR se
tornará uma das mais importantes ferramentas de análise das
ciências da vida.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences.Biotechnology
10:413–417.
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29.10.07 11:24:15
QUAL A MELHOR ESCOLHA DE TRATAMENTO
ANTIRETROVIRAL PARA PACIENTES
CO-INFECTADOS HCV-HIV?
WHICH IS THE BEST CHOICE OF ANTIRETROVIRAL THERAPY TO PATIENTS
WITH HCV-HIV COINFECTION?
Paulo Roberto Abrão Ferreira1, Simone de Barros Tenore2
1- Médico do ambulatório da Disciplina de Infectologia – UNIFESP
2- Médica do ambulatório da Disciplina de Infectologia – UNIFESP. Médica de Referência em Genotipagem (MRG)
pelo Ministério da saúde/BR
RESUMO
A importância do tratamento das morbidades associadas ao vírus da hepatite C (HCV) em uma população crescente de pacientes co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem aumentado desde a introdução do tratamento anti-retroviral altamente potente (HAART). Como resultado, as atenções investigativas têm se voltado para doença hepática causada
pelo HCV e para questões associadas ao tratamento na co-infecção. Pacientes co-infectados HCV-HIV têm cargas virais do
HCV mais elevadas e mostram progressão mais rápida de fibrose em relação aos monoinfectados. O tratamento combinado
com interferon peguilado e ribavirina (RBV) é considerado o padrão para pacientes co-infectados HCV-HIV. Este tratamento
reduz a progressão de fibrose, mas a toxicidade atrapalha a identificação da dose ideal de RBV. Pacientes co-infectados têm
cerca de três vezes mais risco de hepatotoxicidade associada aos anti-retrovirais, quando comparados com monoinfectados
HIV. Outros desafios incluem anemia, toxicidade mitocondrial, interações medicamentosas e leucopenia. Consequentemente,
a hepatite C crônica deve ser tratada em co-infectados, mas alguns passos têm que ser seguidos para se prevenir e tratar
potenciais efeitos adversos.
Descritores: HIV, HCV, Anti-retroviral, Interferon, Ribavirina
ABSTRACT
The importance of treating hepatitis C virus (HCV)-associated morbidities in a growing population of patients coinfected with human immunodeficiency virus (HIV) has increased since the introduction of highly active antiretroviral therapy. As a result, investigative attention is turning to HCV-related liver disease and treatment-associated issues in coinfection. HIV/HCV-coinfected patients
have higher HCV RNA loads and show more rapid progression of fibrosis than do monoinfected patients. Combination therapy
with pegylated interferon plus ribavirin (RBV) is the standard of care for HCV in coinfected patients. Therapy slows fibrosis progression, but toxicity prevents identification of the most effective RBV dose. Coinfected patients have about a threefold greater risk
of anti-retroviral therapy-associated hepatotoxicity than patients with HIV only. Other challenges include anaemia, mitochondrial
toxicity, drug-drug interactions and leucopenia. Thus, chronic hepatitis C should be treated in HIV/HCV-coinfected patients, but
steps must be taken to prevent and treat potential toxicities.
Keywords: HIV, HCV, Antiretroviral, Interferon, Ribavirin
1. O Problema da Co-infecção HCV/HIV
Atualmente, a doença hepática é uma das causas mais comuns de morbi-mortalidade em pacientes portadores do HIV,
em áreas onde há um alto número de usuários de droga intravenosa, com alta prevalência de hepatite(1). Esta prevalência
pode chegar a 95% em pacientes usuários de drogas ilícitas,
porém tende a ser menor em homens que fazem sexo com
homens (11%)(2). No ambulatório da disciplina de infectologia
da UNIFESP a prevalência global de hepatite C crônica em
pacientes infectados pelo HIV é de 17,5%. O aumento da imTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15)
portância das complicações hepáticas entre pacientes infectados pelo HIV resulta da queda significativa da ocorrência de
infecções oportunistas, com a utilização do tratamento anti-retroviral com alta potência (TARV) e do aumento da sobrevida
nestes pacientes.
Há uma interferência bidirecional entre as infecções pelo vírus
da hepatite C (HCV) e o vírus da imunodeficiência humana
(HIV). A infecção aguda pelo HCV evolui mais facilmente para
hepatite crônica em pacientes infectados pelo HIV, especialmente se houver imunossupressão avançada. Uma vez instalada a infecção crônica pelo HCV, os níveis de HCV RNA ten-
11
29.10.07 11:24:15
dem a ser muito mais elevados que em indivíduos infectados
exclusivamente pelo HCV, no plasma e no tecido hepático(3).
A progressão para fibrose é mais acelerada em pacientes coinfectados, proporcionalmente à imunossupressão(4). Dados
recentes mostram que o paciente co-infectado tem de 2 a 6
vezes mais cirrose que o paciente exclusivamente infectado
pelo HCV. Consequentemente, a progressão para hepatopatia
em estágio terminal e o aparecimento do hepatocarcinoma
são mais rápidos(5,6).
Estudos clínicos mostraram resultados conflitantes sobre a influência do HCV na evolução da infecção pelo HIV e na capacidade de recuperação do CD4 com o uso de TARV(7). A infecção
pelo HCV pode influenciar negativamente a recuperação do
CD4, de forma indireta, pela baixa adesão ao TARV dos usuários de drogas intravenosas e pela maior hepatotoxicidade(8). A
hepatite C crônica foi identificada em vários estudos como um
dos principais fatores de risco para hepatotoxicidade do TARV,
particularmente nos pacientes com fibrose mais avançada.
Atualmente, a melhor forma de tratamento da hepatite C em
pacientes infectados pelo HIV é a combinação interferon peguilado (pegINF) e ribavirina (RBV), porém o sucesso deste
tratamento é menor quando se compara com pacientes infectados apenas com o HCV. Várias informações recentes têm
possibilitado aumento do sucesso terapêutico em co-infectados HCV-HIV, particularmente, no que se refere à escolha dos
anti-retrovirais (ARV).
2. Interações entre os Anti-retrovirais, Interferon e Ribavirina
Os inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos formam o “backbone” da maioria dos esquemas antiretrovirais. Estes componentes mimetizam os nucleosídeos
fisiológicos e entram nas vias intracelulares de fosforilação,
causando inibição competitiva e interrupção do alongamento
da cadeia, quando incorporados à síntese do DNA nascente.
Interações entre ARV e RBV, a qual é um análogo de guanosina, tem sido motivo de preocupação, visto que mais que 75%
dos pacientes co-infectados HCV-HIV, em tratamento com pegIFN e RBV, também estão recebendo ARV(9-15).
A administração concomitante dos anti-retrovirais pode afetar a atividade terapêutica do interferon peguilado e ribavirina (RBV) de duas formas. Primeiramente, pode aumentar o
risco de efeitos adversos pela sobreposição de toxicidades,
tais como anemia mais profunda quando se usa zidovudina
(AZT) concomitantemente(16). Estudo com interferon convencional alfa 2b e RBV mostrou que pacientes, ao receberem
AZT, apresentaram redução de hemoglobina significantemente mais importante em relação aos que não utilizaram (-3,64
versus -2,08 g/dL de hemoglobina; p<0,01) e uma maior percentagem de pacientes apresentaram um nadir de hemoglobina menor que 10g/dL (67% versus 0%; p<0,001). Houve
uma maior taxa de redução da dose de RBV nos pacientes
em uso de AZT (60% versus 16%, sem AZT; p<0,01)(17). O
mesmo fenômeno foi observado durante o tratamento com
pegIFN alfa 2a e RBV no estudo APRICOT. A máxima redução
de hemoglobina foi maior em pacientes utilizando AZT (-3,9
g/dL) comparativamente aos que não estavam utilizando AZT
(-3,1 g/dL), e mais pacientes, usando AZT, apresentaram nadir
de hemoglobina <10g/dL (26% versus 8%, sem AZT)(18). Ambos, AZT e pegINF, são mielossupressores a RBV pode levar
à anemia hemolítica(19,20). Uma vez que a exposição à RBV é
12
muito importante para o sucesso terapêutico contra o HCV(21),
é desejável que se evite o uso de AZT durante o tratamento da
hepatite C, evitando-se a redução de dose da RBV.
O aumento da lesão mitocondrial parece ser a via mais comum para explicar as interações deletérias entre RBV e alguns
análogos de nucleosídeos como a didanosina (ddI) e estavudina (d4T)(22, 23, 24). Soma-se a este fato a lesão mitocondrial
direta do HIV e do HCV, que é comprovada pela depleção de
DNA mitocondrial em diferentes tipos de células, facilitando
esta toxicidade(25).
A RBV aumenta a fosforilação intracelular de metabólitos da
didanosina (ddI) e, por isto, tem sido relatado maior risco de
pancreatite, acidose lática e cirrose hepática descompensada, com o uso concomitante destas duas medicações(26,27,22,23).
Atualmente, esta associação está contra-indicada. Em 31 casos relatados ao Food and Drug Administration (FDA) ocorreram 51 episódios de toxicidade mitocondrial em pacientes
utilizando, concomitantemente, ddI e/ou d4T e RBV. Comparando-se com todos os pacientes, o risco (OR) de toxicidade mitocondrial foi de 12,4 vezes maior para ddI + d4T, 8,0
para ddI e 3,0 para d4T (todos p<0,05)(28). A perda de gordura
subcutânea, tipicamente associada à estavudina e pode ser
exacerbada durante o tratamento com pegINF e RBV, mimetizando lipoatrofia rapidamente progressiva(29). Mais do que a
RBV, parece que o pegINF é o principal responsável por este
efeito adverso, porém um aumento da toxicidade mitocondrial
no tecido subcutâneo pela associação RBV e estavudina tem
que ser considerada.
O segundo mecanismo, pelo qual os ARV análogos de nucleosídeos podem influenciar o tratamento do HCV, pode ser através da interferência na atividade da RBV contra o HCV. Relatos
preliminares mostraram que a farmacocinética da RBV não foi
afetada pelo uso concomitante de tenofovir (TDF). O uso de
RBV com TDF pode aumentar a fosforilação de metabólitos
intracelulares do TDF, como ocorre com o ddI, já que ambos
são análogos de adenosina. Entretanto, não há evidências de
aumento do risco de nefrotoxicidade(30) e nem redução da resposta ao tratamento do HCV, quando do uso combinado do
TDF com RBV(32,33).
Estudos “in vitro” têm mostrado que metabólitos ativos da
RBV podem reduzir a fosforilação de outros análogos de nucleosídeos no compartimento intracelular(34), o que poderia
reduzir a atividade terapêutica dos ARV. No entanto, observações clínicas(35) e estudos de farmacocinética(36) não têm
confirmado quaisquer relevâncias destas interações.
Relatos recentes relatos indicam que o abacavir pode comprometer a eficácia da RBV e, consequentemente, o resultado
final do tratamento da hepatite C crônica, reduzindo a possibilidade de sucesso(37,38[113,114]). Ambas as medicações são
análogos de guanosina e podem competir no compartimento
intracelular pelas mesmas vias de fosforilação (FIGURA 1).
Em um grande estudo, envolvendo 426 pacientes co-infectados HCV-HIV, tratados com pegIFN e RBV, 46% dos pacientes
sem uso de abacavir apresentaram resposta virológica sustentada, o que ocorreu em apenas 26% dos pacientes em uso
de abacavir. Este efeito negativo persistiu após o ajuste para
potenciais variáveis confundidoras. Este pior resultado foi ainda mais importante no grupo e pacientes com concentrações
séricas mais baixas de RBV(38[114]). Estas observações geraram
novas reflexões sobre o mecanismo de ação da RBV. A pesar
de ainda haver controvérsias(39,40,41-46), estes dados, indiretamente, mas fortemente, suportam uma verdadeira ação antiviTendências em HIV • AIDS (Volume 2 - Número 3 - 11-15)
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ral da RBV contra o HCV, não apenas como imunomoduladora. É possível que o efeito antiviral da RBV contra o HCV seja
semelhante ao já demonstrado contra outros vírus RNA(47-49).
frequentemente envolvidos na toxicidade hepática relacionada ao dano mitocondrial(64). Mais grave, o uso prolongado de
ddI tem sido reconhecido como fator de risco independente
para o desenvolvimento de fibrose hepática amassada em
pacientes portadores do HIV, quando outras causas de lesão
hepática são excluídas(65).
Inibidores de transcriptase reversa não-nuclesídeos podem
causar lesão hepática no contexto das reações de hipersensibilidade ou por toxicidade direta. As apresentações clínicas variam conforme o mecanismo de toxicidade hepática
(Tabela 1), Quase todos os estudos mostram que a nevirapina
é mais hepatotóxica que o efavirenz(66-68). A presença de coinfecção com o HCV aumenta o risco de desenvolvimento de
elevações de enzimas hepáticas em pacientes que recebem
nevirapina, o que, geralmente, ocorre após 4 a 6 meses de tratamento(69,70). Este segundo pico de incidência de hepatoxicidade da nevirapina não está associado com reação de hipersensibilidade (54,70 nem com o aumento dos níveis da droga como
conseqüência da doença hepática crônica pelo HCV(71).
Precoce
Intervalo
Figura 1. Mecanismo proposto para a competição intracelular entre os
análogos de guanosina abacavir e ribavirina.
ABC = sulfato de abacavir; ABV = abacavir; CBV = carbovir; DP = difosfato; MP = monofosfato;
RBV = ribavirina; TP = trifosfato.
3. Hepatotoxicidade Relacionada à Utilização de Antiretrovirais
As elevações de enzimas hepáticas em pacientes infectados
pelo HIV são multi-fatoriais(50,51). Em pacientes expostos aos
ARV, quatro diferentes mecanismos de hepatotoxicidade têm
sido descritos: (1) lesão mitocondrial em pacientes recebendo análogos de nucleosídeos, especialmente após exposição
prologada ao ddI e d4T(52,53); (2) reações de hipersensibilidade
envolvendo o fígado (por exemplo, nevirapina, efavirenz ou
abacavir), geralmente após 12 semanas de tratamento e associada à farmacodermia(54); (3) lesão hepática direta (dose
dependente), como no caso de uso de ritonavir (RTV) em
dose plena(55); e (4) fenômeno de reconstituição imune, principalmente em pacientes gravemente imunossuprimidos, com
infecção crônica de base pelo HBV (HCV?), no primeiro mês
de tratamento com ARV(56). Em pacientes com infecção pelo
HCV, hepatotoxicidade medicamentosa pode ser mediada por
quaisquer destes mecanismos, mas as reações de hipersensibilidade são mais prováveis(57-59).
Análogos de nucleosídeos podem contribuir para a ocorrência de esteatose hepática, a qual é frequentemente observada
em pacientes portadores do HIV(60). A esteato-hepatite acelera
a progressão da fibrose hepática em pacientes com hepatite
C crônica. Resistência à insulina, dislipidemia e lipodistrofia
estão associadas com esteatose. Em pacientes portadores do
HCV genótipo 3, a esteatose é mais prevalente e isto poderia explicar a progressão mais acelerada de fibrose hepática
nestes pacientes(61) e a maior incidência de hepatotoxicidade
nos mesmos(62,63). O ddI e o d4T são os medicamentos mais
Mecanismo
1
semanas
Imune
Dose-dependente
Relação com o HCV
Relação com o CD4
Fármacos mais
comuns
Não
Não
Sim
Abacavir e
nevirapina
Tardia
4
4-8 meses
Toxicidade direta,
cumulativa
Sim
Sim
Não
Estavudina, didanosina,
nevirapina, ritonavir,
tipranavir
Tabela 1. Apresentação clínica da hepatotoxicidade aos anti-retrovirais
A maioria dos inibidores de protease tem sido associados
com episódios de toxicidade hepática, sendo menos hepatotóxicos: lopinavir/baixa dose de RTV, fosamprenavir/baixa
dose de RTV, nelfinavir(72,73), darunavir/baixa dose de RTV(31).
Tipranavir/baixa dose de RTV mostrou-se mais hepatotóxicos(75). Hiperbilirrubinemia está frequentemente associada
com atazanavir e/ou indinavir, mas não reflete lesão hepática
e está relacionada com a inibição da UDP-glucuronosyltransferase(76).
Apesar da preocupação pela, relativamente, alta incidência
de toxicidade hepática com o uso de ARV em pacientes coinfectados HCV-HIV, os benefícios superam os riscos. Muitos
relatos têm, claramente, demonstrado baixas de mortalidade por causa hepática em pacientes co-infectados HCV-HIV,
usando ARV, mesmo naqueles com doença hepática em estágio terminal(77), comparado com pacientes não recebendo
ARV ou tratados com combinações subótimas(78,79). Dado que
a imunossupressão acelera a progressão de fibrose relacionada à hepatite C(80,81,82), é recomendável iniciar o uso de ARV
até mais precocemente em co-infectados HCV-HIV(83). A carga
viral elevada do HIV está diretamente relacionada com o curso
da fibrose hepática em co-infectados HCV-HIV(84), e o sucesso
do uso de ARV é capaz de prevenir a rápida progressão da
fibrose hepática(85).
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15
29.10.07 11:24:16
VACINAS PROFILÁTICAS ANTI-HIV
PREVENTIVE VACCINES ANTI-HIV
Jorge Casseb
Médico-Pesquisador do Laboratório de Imunologia e Dermatologia – LIM56 FMUSP
Médico-Infectologista do Instituto de infectologia Instituto de Infectologia “Emílio Ribas”, Secretaria de Saúde do Estado
de São Paulo, Brasil.
RESUMO
Cerca de 60 milhões de pessoas foram infectadas pelo HIV nos últimos 25 anos da pandemia e com mais de 20 milhões de
mortes. A imunidade natural e virtualmente inexiste ao vírus e uma vacina preventiva permanece um desafio de elevada proporção. O acometimento e adoecimento de milhões de pessoas, especialmente nos países pobres leva uma disruptura nessas
sociedades, com elevadas perdas econômicas e sociais. Embora o uso de anti-retrovirais aumentou a sobrevida e diminuído a
morbidade, o seu elevado custo e efeitos adversos ao longo prazo, como também a incapacidade de erradicação do vírus, indica que a pesquisa de uma vacina deve ser uma prioridade cientifica mundial. Existem enormes desafios, coma variedade viral
e os vários mecanismos de imune escape, porém nunca na história da humanidade, houve tanto progresso contra um agente
infeccioso em pouco tempo. Deste modo, a descoberta de uma vacina profilática somente será possível com envolvimento de
cientistas de diversas áreas do conhecimento e de vários países trabalhando em estreita colaboração.
Descritores: HIV-1, Vacina, Prevenção
ABSTRACT
60 millions of persons had been infected by HIV in last the 25 years of the pandemic, with more than 20 millions of deaths. The
natural immunity virtually does not exist to the virus and a preventive vaccine remains a challenge. Millions of sick subjects, especially in poor countries, may lead to distress of these societies, with raised economic and social losses. Although the use of antiretrovirals, in the long fashion, increased the survival and diminished the morbidity, its raised adverse cost and effect, as well as the
incapacity of eradication of the virus, indicates that the research of a vaccine must be worldwide a scientific priority. Despite the
enormous challenges, such as high viral diversity and the several mechanisms of immune escape, never in the humanity’s history,
so much progress have been made against an infectious agent in a short time. In this way, the discovery of a prophylactic vaccine
will only be possible with scientist engagement of diverse areas and diverse countries working in close contribution.
Keywords: HIV-1, Preventive, Vaccine
INTRODUÇÃO
Hoje, após quase vinte e cinco anos de seu conhecimento, a
Aids se tornou a mais importante doença infecciosa do globo.
Somente em 2005, mais de 5,5 milhões foram infectadas pelo
vírus HIV, com uma taxa de aproximadamente 15.000 novas
infecções por dia. Apesar de todo o esforço científico no intuito da melhoria das terapias antiretrovirais, as medidas profiláticas continuam ser de capital importância para conter ou diminuir a evolução nos números de indivíduos contaminados.
Neste sentido, o desenvolvimento de uma vacina parece ser
uma resposta racional. Contudo, devido à história natural, a
fisiopatogenia da doença e a diversidade viral, o desenvolvimento de uma vacina com reais capacidades protetoras tem
sido de difícil obtenção. Apesar dos desafios do desenvolvimento de uma vacina contra Aids, os cientistas acreditam
que nessa possibilidade. Essas convicções se baseiam no
fato de que:
Um pequeno numero de indivíduos permanece não infectado
a despeito de uma evidente e repetida exposição ao HIV.
Existe uma robusta reposta celular contra o HIV que leva ao
contra parcial da infecção em poucos pacientes.
Durante um curso natural da infecção, a resposta celular consegue suprimir a carga viral por um período razoável.
16
Até o momento nenhum dos candidatos vacinais em teste
demonstraram estas características. Apesar disto, testes em
macacos indicam ser possível o desenvolvimento de uma vacina pois:
• Símios podem ser completamente protegidos contra SIV
com uma cepa viva atenuada do vírus criada pela mutação
em genes críticos; uma cepa equivalente em humanos implica
em uma doença com progressão lenta;
• Os macacos protegidos não são nem mesmo superinfectados pelo SHIV, de modo que a proteção não é cepa-específica;
• Na infecção aguda, o sistema imune inicialmente desenvolve uma resposta citotóxica capaz de controlar parcialmente a
replicação viral.
O produto vacinal mais adequado deveria possuir as seguintes qualidades:
• Ser de fácil administração, transporte e estável na armazenagem;
• Prevenir a infecção e/ou doença;
• Fornecer proteção contra a exposição de mucosa e parenteral;
• Induzir uma resposta imune durável e de ampla reatividade;
• Ser segura e bem tolerada.
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A ausência de correlatos claros da proteção imune é um obstáculo para o desenvolvimento de uma vacina efetiva e segura. As interpretações da correlação da proteção imune em
modelos animais da infecção pelo SIV varia amplamente na
literatura incluindo anticorpos neutralizantes e respostas celulares. Formulações vacinais individuais devem induzir respostas imunes celulares e humorais distintas por diferentes
mecanismos e assim proporcionar uma imunidade protetora.
A importância da imunidade de mucosa para o sistema imune tem sido negligenciada no desenvolvimento de vacinas. De
fato, mais de noventa porcento das novas transmissões do HIV
são através da mucosa. Os tecidos de mucosa são os sítios
primários da entrada do HIV e da infecção inicial e deste modo
a indução de uma resposta de linfócitos T citotóxicos na mucosa pode ser crítica para o sucesso contra vírus transmitidos
através da mucosa. Como exemplo, a imunização intra-retal
com glicoproteínas do envelope viral em camundongos induz
respostas citotóxicas nos sítios de mucosa que são mais protetoras que aquelas induzidas pela imunização sistêmica. Um
dos grandes argumentos a favor do desenvolvimento das vacinas que levem a uma imunidade de mucosa é o efeito “altruísta” posto que indivíduos vacinados e com imunidade de mucosa possivelmente tendam a disseminar baixas cargas virais e
talvez propagar a imunidade para indivíduos não vacinados.
A interação do HIV com as células alvo é um processo dinâmico que envolve sua ligação, fusão e entrada na célula. Cada
um destes processos distintos envolve diferentes moléculas
do sistema imune, muitos dos quais são potenciais alvos para
anticorpos que possam interromper o processo infeccioso.
O primeiro passo da entrada na célula envolve a interação de
alta afinidade entre a molécula CD4 da célula alvo e a glicoproteina (gp) oligomérica 120/42 expressa no envelope viral,
isso resulta em mudanças conformacionais substanciais do
envelope e conseqüente exposição diferencial de sítios antigênicos bloqueadores. Este passo inicial é seguido pela ligação aos receptores de quimiocinas CCR5 e CXCR4 com
posterior fusão das membranas viral e da célula hospedeira
mediada por regiões na gp41.
O alto grau de glicosilação presente nas proteínas do envelope viral é um obstáculo na construção de peptídeos vacinais.
Ensaios in vitro demonstraram que, embora uma cepa viral pudesse ser controlada através de anticorpos, estes mesmos anticorpos em sistemas biológicos (testes in vivo) não bloqueavam
efetivamente os epítopos virais. Isto deve-se as diferenças entre as cepas testadas in vitro e in vivo já que as últimas apresentam em seu envelope proteínas mais glicosiladas. A alta
taxa de carboidratos dificulta a apresentação antigênica eficaz
e também impede a exposição dos epítopos bloqueadores. Infelizmente, até agora, a maioria dos alvos vacinais relevantes
encontram-se nas áreas de grande glicosilação e que sofrem
de mudança conformacional durante a fusão com a célula hospedeira, alterando os epítopos.
Do ponto de vista imunológico as vacinas devem promover
tanto respostas humorais como respostas celulares citotóxicas. As primeiras são importantes para promover o bloqueio
da entrada do vírus nas células alvo enquanto que as últimas
são necessárias para destruir células já infectadas.
Esta noção é aplicada na definição de vacinas profiláticas e
terapêuticas. A possibilidade de elicitar uma resposta anticórpica capaz de impedir a entrada do vírus na célula do hospedeiro foi o objetivo de grande parte das vacinas testadas ate o
momento. Ela deve ser capaz de evitar o contágio e também
impedir a disseminação do vírus uma vez já dentro do organismo. Por outro lado, recentemente ficou claro que respostas
baseadas em CTL (linfócitos T citotóxicos) são úteis porque
possibilitam ao sistema imunológico do hospedeiro destruir
células já infectadas, onde o vírus fica protegido da ação de
anticorpos.
Recentes pesquisas têm buscado modificar estruturalmente
as glicoproteínas gp120 e gp41 do HIV-1 pela remoção de
regiões variáveis ou pela deglicolizacão seletiva, produzindo
isolados de HIV-1 mais suscetíveis á neutralização por anticorpos e capazes de induzir anticorpos para diferentes epítopos.
As respostas neutralizantes mais potentes têm sido induzidas
em camundongos pelo uso de uma vacina composta por um
complexo ternário expressando a gp160, CD4 e CCR5. Os
anticorpos assim induzidos neutralizam múltiplos isolados
primários de HIV e sugerem que a imunogenicidade para epítopos críticos no envelope do HIV pode ser aumentada após a
ligação com o CD4 e CCR5.
Ao contrário das primeiras vacinas baseadas nas glicoproteínas gp120 ou gp160 do HIV-1 e que visavam induzir anticorpos neutralizantes, as atuais são projetadas para promover
imunidade celular e fazem uso de vetores vivos recombinantes
como o poxvirus e o canaryvirus. Mais recentemente surgiram
abordagens vacinais baseadas na imunização com DNA.
Os testes com estes candidatos vacinais tem se mostrados
seguros e fornecidos informações importantes para novas
abordagens. A VaxGen (Brisbane, CA, USA) realizou a fase III
de testes com uma vacina de gp120 envolvendo 5400 voluntários no USA, na sua maioria homens homossexuais. Esta é
baseada em duas variantes do vírus B do HIV-1 que são prevalentes nos estados Unidos. A fase III foi iniciada pela mesma
companhia em março de 1999 na Tailândia e usou uma vacina
bivalente com a gp120 que, em adição a proteína do subtipo
B, inclui também uma gp120 derivada do subtipo E prevalente
naquele país. Esse estudo na demonstrou proteção contra a
infecção pelo HIV, porem não houve aumento de exposição
dos indivíduos e os pesquisadores concluíram que apesar do
fracasso na obtenção de um produto eficiente, existe a possibilidade de conduzir um estudo clinico em larga escala e em
diversos paises simultaneamente.
Atualmente dois grandes testes em fase II/III estão em andamento no mundo. A fase III de uma vacina construída com o
vetor Canarypox para HIV-1, sozinho ou reforçada com gp120,
está sendo conduzido pelo Instituto Nacional de Saúde dos
Estados Unidos e envolve 16.000 voluntários americanos e de
outros países. Os resultados esperados para 2008/2009, poderão indicar se estratégia pode ser útil em vacina preventiva,
ou mesmo diminuir a carga viral naqueles indivíduos que se
infectarem durante o estudo.
Um outro estudo usa como vetor o vírus adenovírus tipo 5, em
cerca de 3000 voluntários. Alem da vacina com três genes do
HIV, gag, pol e nef, o estudo também utiliza a estratégia chamada “primer booster”, cm reforço de uma vacina de peptídeos
coma subunidade da gp120. Deste modo, também a resposta celular citotóxica, quanto a humoral, deverão induzidas por
essas duas vacinas. Os resultados desses estudos poderão
trazer importante contribuição no entendimento da resposta
imune celular e possibilidade do uso de peptídeos sintéticos
com dose reforço. Na Tabela 1 estão relacionadas os principais candidatos vacinais testadas ate o momento.
17
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Resumos dos principais eventos relacionados ao desenvolvimento de vacina anti-HIV
Fonte: www.iavi.org/trialdh;
Boletim VACINAS anti HIV/AIDS – nº13 – GIV, Junho, 2005
Tabela 1. Ensaios de produtos candidatos a vacinas preventivas contra
HIV/Aids testadas desde 2001
Vetor
Inserto
Padrão
imune
Canary poxvirus Env (E), Gag/Pol Celular +
proteína
(B), Env (B,E)
humoral
Fabricante ou
patrocinador
Aventis/Vaxgen
RAd
Env (E), Pol, nef Celular
(B)
Merck
DNA/rAd
Env (E), Gag/Pol Celular
(B), Nef (B), Env humoral
(A, B, C)
VRC, NIAID, NIH
AAV
Gag (C), PR (C), Celular
RT (C)
IAVI
Lipopeptídeos
Gag (B), Pol (B), Celular
Nef (B)
ANRS
Descrição de candidatas à vacina anti aids em ensaios clínicos de fase II ou fase III. Os produtos
gênicos do HIV (Insertos) são mostrados e a forma de entrega (vetor); a esperada resposta imune
(Padrão imune); e os fabricantes ou patrocinadores. As letras em parêntesis indicam o subtipo de
origem de cada produto gênico viral. rAd, adenovirus defectivo de replicação; AAV, vírus adenoassociado. Env, proteína do envelope, Gag, antígeno grupo especifico, Nef, fator regulatório
negativo, Pol, polimerase, PR, protease, RT, transcriptase reversa.
Tabela 2. Vacinas anti Aids candidatas em ensaio clínico avançado
Descoberta da AIDS: Problema de Saude Pública – 1981
Progressos nas áreas: Virologia, imunologia, patogênese do
HIV, desenvolvimento de drogas anti-retrovirais
Objetivo:
• Vacina
Dificuldades:
• alta variabilidade do vírus,
• perda de correlato de proteção,
• limitações de modelo animal,
• dificuldades logísticas quanto a condução de múltiplos ensaios clínicos
Número de candidatos à vacina: >35
Fases de testes: I e II
Número de voluntários envolvidos: 7.500
Conceitos: múltiplos
Estratégias:
• vacinas com vírus vivo atenuado,
• vacinas com vírus inativado,
• vacinas com com particulas virais simile ( VLP),
• vacinas com subunidades baseadas em envolepes,
• vacinas com subunidades proteicas virais não estrutural,
• vacinas com DNA “naked” e recombinantes vírus
• vacinas com virus recombinante vivo,
• vacinas com fusão de proteinas e peptídeos,
• vacinas com combinações várias.
Centros envolvidos no desenvolvimento de vacinas anti- HIV :
NIAID, CDC, WRAIR, USA; ANRS, França, IAVI, New York; WHO/ UNAIDS – iniciativas Mundiais; AAVP, África; Fundação Bill e Melinda Gates
– USA; Global HIV Vaccine Enterprise.
LEITURAS RECOMENDADAS
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CORECEPTORES CCR5 E CXCR4 E
POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS
CCR5 AND CXCR4
CORECEPTORS
ANDANTI-HIV
THEIR POTENTIAL ON
PREVENTIVE
VACCINES
ANTIRETROVIRAL THERAPY
Monica Jaques de Morais
Médica de Referencia em Genotipagem Ministerio da Saúde
RESUMO
Cerca de 60 milhões de pessoas foram infectadas pelo HIV nos últimos 25 anos da pandemia e com mais de 20 milhões de
A busca recente e contínua por novas alternativas terapêuticas, seja pela demanda de drogas com menor toxicidade resultou
em um foco maior nos estudos das proteínas de superfícies CCR5 e CXCR4, reconhecidas como co-receptores do Vírus da
Imunodeficiência Humana do tipo 1 (HIV-1).
Estudos sobre a ação de inibidores agonistas e antagonistas de CCR5 tem sido realizados em relação ao tratamento e/ou a
prevenção da infecção pelo HIV. De todas as drogas pesquisadas apenas o maraviroc (Selzentry® Pfizer), foi aprovado com
bases no resultado de 24 semanas de 2 estudos clínicos (Motivate 1 e Motivate 2). Este artigo mostra os mais recentes resultados da ação benéfica desta droga apresentados, durante a 47º Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (ICAAC).
cientistas de diversas áreas do conhecimento e de vários países trabalhando em estreita colaboração.
Descritores: CCR5, CxCR4, Coreceptores, Viral tropism, Antiretrovirals.
HIV-1, vacina, prevenção,
ABSTRACT
The constant search for new alternative therapies, driven by the need to find drugs with less toxicity, prompted studies on HIV-1
particle surface proteins as CCR5 and CXCR4, which are used as viral coreceptors.
There are already several studies on CCR5 inhibitors and their mechanisms to prevent or treat HIV-1 infections. From all studied
drugs only Maraviroc, (Selzentry® Pfizer) was approved based on 2 clinical studies with patients being followed up for 24 weeks
(Motivate 1 and Motivate 2). This paper is focused on the recent studies about the beneficial use of this drug presented during the
47º Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC).
millions of p
Keywords: CCR5, CxCR4, Co-receptores, Tropism viral, An-tiretrovirais. HIV-1, Preventive, vaccine
INTRODUÇÃO
As proteínas de superfície CCR5 e CXCR4 são reconhecidas
como coreceptores do vírus da imunodeficiência humana (HIV)
desde 1995, quando Cocchi e colaboradores identificaram que
ligantes naturais destas moléculas suprimiam a multiplicação
viral (Cocchi et al., 1995). A necessidade contínua de novas
alternativas terapêuticas, seja para tratamento de indivíduos
portadores de HIV resistentes às drogas disponíveis, seja pela
demanda de drogas com menor toxicidade, resultou recentemente em um foco maior sobre estes coreceptores. Drogas
com atuação sobre moléculas que viabilizam a entrada do vírus na célula oferecem uma estratégia atraente não só por pertencerem a uma nova classe de drogas, mas também devido
à possibilidade de supressão viral em uma fase muito precoce
da infecção.
CCR5 e CXCR4 são proteínas transmembrana que funcionam
como receptores celulares de quimiocinas, citocinas que promovem movimento celular por quimiotaxia. Pertencem à família
de receptores GPCP (do inglês G protein-coupled receptor).
Suas moléculas formam alças que atravessam a membrana
celular em sete domínios, constituindo alças externas à membrana celular (que interagem com as citocinas ligantes) e alças
intracelulares (que interagem com a proteína G, o que desencadeia um sinal para a resposta celular). Além da ativação intra-celular via proteína G, a ligação quimiciona-receptor pode
desencadear ativação via outras proteínas intra-celulares, que
após uma cascata de reações levam à interiorização do coreceptor e, posteriormente reciclagem deste para a superfície
celular. O resultado da ativação celular é a liberação de outras
citocinas e quimiocinas importantes para a resposta imune inata e adaptativa (Lederman et al., 2006).
Existem cerca de 15 receptores para 30 citocinas, mas apenas
seis são expressos em células T (CCR1, CCR2, CCR3, CCR5,
CXCR1 e CXCR4), dos quais apenas dois tem função coreceptora para o HIV (CCR5 e CXCR4).
O CCR5 é receptor para MIP-1α, RANTES e MIP-1 , mas as
duas primeiras quimiocinas também se ligam a outros receptores. O CXCR4 é receptor exclusivo da quimiocina SDF-1, que
por sua vez tem o CXCR4 como seu único receptor. A relativa
sobreposição desta rede pode ser responsável pelo fato de
que o bloqueio de um receptor não resulte em danos maiores
ao hospedeiro (Lederman et al., 2006; Kuritzkes e Tsibris, 2007).
De fato, 1% da população caucasiana é homozigota para o alelo variante CCR5∆32, que resulta em não-expressão da proteína CCR5 na superfície celular, o que não incorre em qualquer
19
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conseqüência clínica para estes indivíduos (Liu et al., 1996).
Coreceptores e HIV: entrada do HIV na célula
A entrada do HIV nas células-alvo depende da interação de
glicoproteínas do envelope viral (gp120 e gp41) com receptores das células-alvo (CD4, CCR5 e CXCR4). A glicoproteína
gp160, constituída pelas subunidades gp 41 e gp 120, situa-se
em trímeros na superfície do envelope viral. Após a aproximação do vírus às células-alvo, cada gp120 se liga a uma molécula de CD4 da superfície da célula-alvo. Esta ligação (attachment) promove mudança conformacional na gp120, que então
se aproxima do coreceptor (CCR5 ou CXCR4). A ligação entre
o coreceptor e a gp120 dispara o processo de fusão: a gp41
é exposta e se insere na membrana celular. Cada uma das 3
moléculas de gp41 tem dois domínios em hélice (HR1 e HR2)
que se dobram em encaixe um sobre o outro e assim forçam
a aproximação da membrana celular e do envelope viral, até
provocar a fusão de ambas, que leva à interiorização do vírus
(Lederman et al., 2006).
Em resumo, pode-se dizer que o processo de entrada do HIV
na célula ocorre em três etapas: a ligação gp120-CD4 (attachment), a ligação da gp120 com o coreceptor (“disparo” da fusão) e a fusão propriamente da membrana celular com o envelope viral, que depende da ação das hélices da gp41 forçando
a aproximação das membranas.
Figura 1. Os três passos principais para a entrada do HIV na célula
(adaptado de: Moore JP, Doms RW. The entry of entry inhibitors: a fusion of
science and medicine. PNAS 2003, 100:10598-602).
Fenótipo e tropismo celular
A proteína viral de superfície gp120 apresenta grande variabilidade genética entre os isolados de HIV, decorrente de cinco
regiões variáveis na sua seqüência de aminoácidos (V1-V5).
Esta variação determina a habilidade do vírus em usar o coreceptor CCR5 ou CXCR4 (Briggs et al., 2000).
Logo após a infecção predominam cepas que utilizam o coreceptor CCR5, chamadas por isso de R5. Estas cepas se multiplicam in vitro mais lentamente, não induzem a formação de
sincício e crescem bem tanto em macrófagos como em linfócitos. Na infecção avançada surge a variante X4, que utiliza o
coreceptor CXCR4 para entrar na célula. In vitro, é mais citopática, cresce mais rapidamente e tem tropismo por células T.
Clinicamente, a presença de isolados X4 está associada com
progressão mais rápida da doença e com risco de morte (Richmond & Bozzette, 1994; Japour et al., 1995). Embora seja
um marcador de progressão, não se sabe se o surgimento de
cepas X4 é causa ou efeito da evolução da doença.
Em todas as fases da infecção, os vírus R5 são mais frequentemente isolados. À medida que a infecção progride, aumenta
a freqüência de isolamento concomitante de R5 e X4. O isolamento de ambos significa ou a presença de vírus duotrópicos
(que utilizam tanto CCR5 como CXCR4 como coreceptores)
ou a ocorrência de populações mistas; ambos os fenômenos já
foram documentados (Moyle et al., 2005). A presença exclusiva
de cepas X4 é rara (Tabela 1) (Kuritzkes e Tsibris, 2007).
CCR5 como alvo de drogas anti-retrovirais
Logo após a identificação da função co-receptora do CCR5 e
CXCR4 na infecção pelo HIV, Liu e colaboradores, estudando
dois indivíduos com múltiplas exposições ao HIV que permaneciam não-infectados, identificaram a base genética dessa
resistência à infecção (1996). Ambos os indivíduos eram portadores de um defeito homozigótico no gene que codifica o
CCR5. O alelo variante (CCR5∆32) contém uma deleção interna de 32 pares de base e resulta na codificação de uma
proteína francamente truncada que não é expressa na superfície celular. Essa alteração confere resistência à infecção pelo
HIV, mas nenhuma outra alteração fenotípica foi reconhecida
nestes indivíduos. Estudos subseqüentes verificaram que da
população caucasiana, aproximadamente 1% é homozigota e
10 a 14% é heterozigota para esse alelo variante. Indivíduos
heterozigotos apresentam risco mais baixo de infecção e, uma
vez infectados, evolução mais lenta que a população portadora de dois alelos selvagens (Ioannidis et al., 2001). Estes
achados prontamente situaram o receptor CCR5 como atraente sítio de ação de drogas para prevenção e tratamento da
infecção pelo HIV.
Dois mecanismos de ação básicos sobre a proteína CCR5
têm sido explorados no contexto de tratamento e/ou prevenção da infecção pelo HIV: inibidores agonistas e antagonistas
de CCR5.
Inibidores agonistas são análogos de quimiocinas que se ligam ao CCR5 e promovem sua interiorização. O seqüestro intracelular do co-receptor o indisponibiliza para o HIV. Algumas
substâncias desse grupo foram exploradas para prevenção de
População
Amostra
R5 exclusivo
R5/X4
X4 exclusivo
Virgem de TARV
323
88%
12%
0%
Virgem de TARV
979
82%
18%
0,1%
Virgem de TARV
402
81%
19%
-
Expostos a TARV
117
67%
28%
5%
Expostos a TARV
125
78%
22%
-
Expostos a TARV
724
50%
48%
2%
Tabela 1. Prevalência de vírus R5 e X4 em diferentes coortes de individuos infectados pelo HIV (Adaptada de Kuritzkes e Tsibris, 2007)
20
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infecção por SIV em macacos, com resultados favoráveis (Lederman et al., 2006). A preocupação em relação a estes agonistas é que, ao promoverem a interiorização do co-receptor,
desencadeiem o sinal intra-celular e a decorrente inflamação,
à semelhança do que ocorre com as quimiocinas naturais.
O grupo dos inibidores antagonistas de CCR5 é o que se encontra mais desenvolvido. Estes antagonistas são classificados em dois subgrupos: os inibidores competitivos (anticorpos monoclonais anti-CCR5) e os não-competitivos (pequenas moléculas).
O anticorpo monoclonal PRO-140 se liga ao sítio de ligação do
HIV na molécula CCR5, com isso, inibindo competitivamente
a ligação do vírus à célula. Na 4a Conferência da Sociedade
Internacional de Aids sobre Tratamento, Patogênese e Prevenção, realizada em Sidney em 2007, foram apresentados
resultados positivos de tolerância e eficácia anti-retroviral obtidos em um estudo com 30 pacientes tratados com PRO-140
administrado por via intravenosa. Uma formulação de administração subcutânea continua sendo testada (Saag et al., 2007)
e a droga continua sob investigação.
Os antagonistas não-competitivos são pequenas moléculas
que se ligam ao CCR5, porém não no sítio de ligação do HIV.
A ligação destas pequenas moléculas ao co-receptor é nãocovalente e reversível. Promove uma mudança conformacional na molécula, de tal modo que impede a ligação do vírus ao
seu sítio de ligação. Este tipo de inibição é chamada alostérica
e não é competitiva.
Dentro do grupo de pequenas moléculas, três drogas chegaram a fases adiantadas de desenvolvimento mostrando resultados muito bons em termos de eficácia virológica: maraviroc
(Pfizer), já aprovada para uso clínico nos Estados Unidos da
América, na Europa e no Brasil, vicriviroc (Schering-Plough),
que está em fase avançada de estudos clínicos de fase III e
aplaviroc (GlaxoSmithKline), que foi abandonada devido à alta
freqüência de hepatotoxicidade.
A única droga aprovada desta classe, o maraviroc (Selzentry®, Pfizer) se liga ao receptor CCR5. Não desencadeia sinalização e interiorização do receptor e, portanto não tem efeito
agonista (não leva a liberação de citocinas e inflamação). Tem
atividade em concentrações nanomolares baixas, se liga por
tempo prolongado ao receptor e o efeito desta ligação é duradouro. De fato, é interessante que pacientes que interrompem a medicação demoram a apresentar rebote viral (Este &
Telenti, 2007).
O maraviroc foi aprovado com base nos resultados de 24 semanas de dois estudos clínicos que ainda estão em andamento, MOTIVATE 1 e MOTIVATE 2; recentemente os resultados de 48 semanas do MOTIVATE 1 foram apresentados na
47a Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents
and Chemotherapy (ICAAC) (Lalezari et al., 2007). Os dois
estudos MOTIVATE têm desenho idêntico: o primeiro incluiu
601 participantes da América do Norte e o segundo, 475 da
Europa, Austrália e Estados Unidos. Todos os pacientes eram
portadores de vírus com tropismo exclusivo para R5, apresentavam extensa experiência prévia com anti-retrovirais e
portavam vírus amplamente resistentes. Foram randomizados
em três grupos para receber, além de uma combinação de
drogas otimizada, 150 mg maraviroc em dose única ou em
duas doses diárias ou placebo. Os resultados de 48 semanas confirmaram os achados previamente apresentados de 24
semanas: maraviroc foi superior a placebo nas duas doses
(PCR-RNA HIV <50 cópias em 46,8% vs. 41,8% vs. 16,1% nos
grupos de dose única, duas doses e placebo, respectivamente). A droga foi muito bem tolerada (efeitos adversos grau 3
ou 4, inclusive hepatotoxicidade, ocorreram em freqüência
semelhante nos 3 grupos). Além disso, ao contrário do relato
prévio, os dados de 48 semanas apontaram para sinergismo
de enfuvirtide e maraviroc. Embora os dados da semana 24
não tenham apontado para benefício adicional da combinação com enfuvirtide, na realidade os indivíduos que usaram
a associação apresentaram resposta mais duradoura quando
se analisaram os resultados de 48 semanas (Lalezari et al.,
2007).
Nos estudos de fase 2, maraviroc não foi eficaz contra vírus
com tropismo CXCR4, duotrópico ou misto. Deste fato decorre a exigência de se selecionar pacientes portadores de vírus
com tropismo exclusivo R5 para tratamento com maraviroc.
Atualmente há um único teste aprovado para determinação
do tropismo viral, o teste Trofile® da Monogram Biosciences. É um teste caro, ainda não disponível comercialmente
no Brasil.
Com mecanismo de ação idêntico, o vicriviroc (Schering Plough) está em fase avançada de desenvolvimento. Resultados
de um estudo de fase 2 de 48 semanas foram apresentados
recentemente (Gulick et al., 2007), revelando resultados de eficácia e tolerância muito favoráveis. Um estudo de fase 3, também com pacientes com histórico de múltiplas falhas prévias
e portadores de vírus multirresistentes está em andamento,
utilizando a dose de 30 mg em uma tomada diária.
Possíveis repercussões do antagonismo de CCR5
Nos estudos de fase 2 e 3, os pacientes que apresentaram
falha virológica evoluíram com mais desvio do tropismo viral
de R5 para X4 em relação aos pacientes que usaram placebo. A conseqüência clínica deste desvio não está clara, se é
que exista alguma, porém há preocupação devido à conhecida associação entre tropismo X4 e pior evolução da infecção
(Lalezari et al., 2007).
Outra preocupação em relação aos antagonistas de coreceptores de entrada decorre do fato de que essas são as primeiras drogas anti-retrovirais cujo sítio de ação é uma molécula
do hospedeiro e não do vírus. Esta inovação traz consigo potenciais riscos.
A ligação com o receptor de quimiocina poderia ter um algum
efeito agonista e resultar em liberação de citocinas e inflamação?
Por outro lado, o bloqueio e o antagonismo completo poderiam resultar em algum grau de imunossupressão (aumento
de risco de infecções e neoplasias, inadequação de resposta
a vacinas)? De fato, sabe-se que ausência congênita de CCR5
aumenta o risco de infecção sintomática pelo vírus de encefalite do Oeste do Nilo (Glass et al., 2006).
Estudos de longo prazo e vigilância pós-comercialização serão necessários para responder estas questões.
21
29.10.07 11:24:18
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29.10.07 11:24:18
DESTAQUES IAS 2007, SIDNEY, AUSTRÁLIA
Paulo Roberto Abrão Ferreira, Elkin Hernán Bermudez Aza, Simone de Barros Tenore
Tratamento de pacientes virgens de antiretroviral (ARV)
Merck 004: raltegravir em pacientes virgens de tratamento
Atualmente temos duas classes disponíveis para o tratamento
antiretroviral de pacientes virgens de terapia, os inibidores da
transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN) e não
análogos de nucleosídeos (ITRNN), e os inibidores da protease (IP). Usualmente a associação é feita entre dois ITRNs e um
ITRNN ou um IP associado a baixas doses de ritonavir (RTV).
Apesar destes esquemas apresentarem boa tolerabilidade,
não são isentos de toxicidade, e a inclusão de novas drogas,
atuando em outros alvos do ciclo de vida do HIV, potentes
e com boa tolerabilidade, poderiam ampliar as opções para
pacientes em início de terapia.
Dois estudos, MERIT e Merck004, avaliaram o uso de dois
novos ARVs, maraviros e raltegravir, em pacientes virgens de
terapia ARV. Em ambos os estudos o braço comparados foi o
efavirenz. O raltegravir mostrou ser comparável ao efavirenz,
com algumas vantagens em relação à tolerância e efeitos
adversos, enquanto o maraviroc mostrou ser não inferior ao
efavirenz e ususlmente bem tolerado, porém alguns critérios
evidenciam que talves não seja tão potente como efavirenz.
Estes estudos estão descritos abaixo.
Este estudo comparou o raltegravir, um inibidor da integrase,
com efavirenz em 198 indivíduos virgens de antiretroviral (Markowitz e colaboradores). Foram estudadas quatro doses de
raltegravir (100, 200, 400 e 600mg duas vezes ao dia), todas
comparadas com efavirenz, e usando FTC e tenofovir no esquema de base. A média de CV dos grupos variou de 4.6 a 4.8
log10 cópiasÚmL e CD4+ de 271 a 338 célsÚmm3.
Os resultados demonstrados na tabela evidenciaram eficácia
virológica semelhante entre as doses de raltegravir e efavirenz,
sem diferenças significativas nos cinco braços do estudo.
Estudo MERIT: Maraviroc em pacientes virgens de tratamento:
Estudo em andamento, de fase 2BÚ3, duplo-cego, comparando maraviroc (um inibidor de co-receptor CCR5) 300mg
duas vezes ao dia com efavirenz, ambos em combinação com
zidovudinaÚlamivudina (AZTÚ3TC), em 721 pacientes virgens
de tratamento, com tropismo R5. (Saag M,). O braço maraviroc 300mg uma vez ao dia foi descontinuado precocemente
na semana 16, devido à má performance durante análise interina. Os grupos apresentavam parâmetros similares no baseline, com CD4+ variando entre 241-254 célsÚmm3, e média de
carga viral (CV) de 4.9 log10 cópias mL. Dados de eficácia em
48 semanas (em tratamento) estão sumarizados na tabela.
HIV RNA < 400 cópiasÚmL (%)
HIV RNA < 50 cópiasÚmL (%)
Incremento de CD4+ (célsÚmm3)
Maraviroc
70.6
65.3
170
Efavirenz
73.1
69.3
143
Maraviroc demonstrou ser não inferior ao efavirenz na análise de CV < 400 cópiasÚmL, porém com performance inferior quando analisado CV < 50 cópiasÚmL. Maraviroc também
obteve resultados insatisfatórios, comparando com efavirenz,
em pacientes com CV superior a 100.000 cópiasÚmL.
Outro fator importante a ser considerado são os motivos de
descontinuidade do tratamento em ambos os grupos. Apesar
da porcentagem de pacientes descontinuados antes de 48 semanas ser semelhante nos grupos (26.9% maraviroc e 25.2%
efavirenz), descontinuidade devido a falência virológica foi maior
no braço maraviroc (11.9% vs 4.2%) enquanto que no braço
efavirenz o principal motivo foi evento adverso (4.1% vs 13.6%).
Assim, enquanto pacientes que descontinuaram efavirenz possivelmente tem pouca ou nenhuma resistência, aqueles que interromperam maraviroc tem maior probabilidade de desenvolvimento de resistência e perda de opções de tratamento.
Logo, baseado neste estudo, não temos justificativa para o
uso de maraviroc em indivíduos virgens de tratamento, associado ao fato da posologia ser duas vezes ao dia.
Raltegravir 100 mg
200 mg
400 mg
600 mg
Efavirenz
600 mg
nº
39
40
41
40
38
< 50 cópiasÚmL
85%
83%
88%
88%
87%
< 400 cópiasÚmL
97%
85%
98%
90%
87%
O ganho de CD4+ foi semelhante entre os grupos, e a única
diferença observada foi a velocidade de resposta para alcance de supressão viral nos braços raltegravir (Murray JM, TUAB
103), porém a significância clínica deste achado ainda não
está clara.
Ambas as drogas foram bem toleradas, com menos efeitos
colaterais relacionados ao sistema nervosos central nos braços raltegravir (13% vs 29%).Não houve relato de eventos adversos sérios nos grupos estudados.
Observou-se diferença significativa na elevação do colesterol
(-2.3 nos grupos raltegravir vs + 20.7 no grupo efavirenz), favorecendo o raltegravir. Os demais parâmetros lipídicos não
se alteraram neste grupo.
Baseado neste estudo, raltegrafir apresentou eficácia similar ao efavirenz para supressão virológica e incremento de
CD4+, e menor toxicidade metabólica. A administração duas
vezes ao dia do raltegravir pode limitar seu uso difundido para
terapia inicial, mas pode representar uma alternativa segura
neste cenário.
Tratamento de pacientes com experiência antiretroviral
prévia
Dois importantes estudos apresentados nesta conferência evidenciaram o benefício de novas drogas, de classes já conhecidas, para o tratamento de pacientes em falência antiretroviral e resistência. O estudo TITAN demonstrou que o darunavir
(DRV), um potente inibidor da protease usado para tratamento
de pacientes muiti-experimentados, também pode ser uma alternativa para uso em fases mais precoces do tratamento. Já
o estudo DUET evidenciou a eficácia da etravirina (ETV) em
paciente extensamente experimentados de ARV. O MOTIVATE
ressalta o uso do maraviroc nesta população de pacientes,
como descrevemos a seguir.
TITAN: Darunavir + ritonavir (DRVÚr) versus LopinavirÚr
(LPVÚr) no tratamento de pacientes em falência antiretroviral
Estudo aberto de fase III que comparou DRVÚr com LPVÚr em
pacientes com carga viral superior a 1000 cópiasÚmL em um
regime estável em falência por pelo menos 12 semanas (Valdez-Madruga e colaboradores, Lancet 2007;370:49-58). Este
23
29.10.07 11:24:18
estudo incluiu 604 pacientes que foram randomizados para
receber LPVÚr 400Ú100 mg duas vezes ao dia (inicialmente
cápsulas e posteriormente substituído para comprimidos) ou
DRVÚr 600Ú100 mg duas vezes ao dia, associado a um esquema de base otimizado com teste de resistência, que incluía
pelo menos duas drogas entre os ITRN e ITRNN. O uso de enfuvirtida e outras drogas experimentais não foram permitidas.
A média de carga viral dos indivíduos era de 4.35 log10
cópiasÚmL e CD4+ de 235 celsÚmm3. Em relação ao uso prévio de ARVs, 29% recebiam ITRN+ITRNN e 22% ITRN+IP,
46% dos pacientes já haviam experimentado as três classes
de ARV. A respeito do uso prévio de IPs, 32% eram virgens
desta classe, 36% haviam usado um IP e 32% já haviam recebido mais de dois IPs. O uso prévio de LPVÚr representava um
critério de exclusão.
O número médio de mutações principais na protease foi de
zero e o fold-change (FC) para DRV no braço DRV foi de 0.6
(0-37), com 2% dos indivíduos apresentando FC>10 (ação intermediária da droga), já no braço LPV o FC foi de 0.8 (0-74),
com 10% apresentando FC>10.
Foram apresentados os resultados de 48 semanas (o estudo
está em andamento, previsto 96 semanas de duração), usando análise de intenção de tratamento, e estão resumidos na
tabela.
<400 cópiasÚmL
<50 cópiasÚmL
Média de queda de CV (log10)
DRVÚr
77%
71%
-1.95
LPVÚr
67%
60%
-1.72
P
<0.0001
0.005
0.046
Incremento de CD4+ (célsÚmm3)
+88
+81
0.33
Estes dados demonstram a superioridade do DRVÚr em relação ao LPVÚr para supressão virológica (CV<400 cópiasÚmL)
e um número significativamente maior de pacientes no grupo
DRVÚr com CV<50 cópiasÚmL. Um menor número de indivíduos recebendo DRVÚr apresentou falência virológica em relação
ao LPVÚr (10% vs 22%), aquisição de novas mutações na protease (21% vs 36%) ou perda de drogas ativas.
Os grupos também foram comparados analisando-se CD4+
e CV basal, número de drogas ativas no esquema de base,
número de mutações primárias na protease e FC para DRV e
LPV. Em cada uma destas variáveis o DRV não foi inferior nem
superior ao LPV.
Ambos os IPs foram bem tolerados, com somente 7% de descontinuidade devidos a toxicidade. Exantema foi mais observado no grupo DRVÚr (16% vs 7%), enquanto diarréia foi mais
comum no grupo LPVÚr (32% vs 42%). Outros eventos adversos foram similares entre os grupos, incluindo alteração no
perfil lipídico.
Este estudo demonstra a potência e segurança do DRVÚr e
indica que nesta população, aonde 68% apresentavam falência a um ou mais IPs, que esta droga leva a maior supressão viral (<400 e <50 cópiasÚmL), menor falência virológica e
desenvolvimento de resistência quando comparado ao LPVÚr,
representando uma opção de tratamento para pacientes com
falha precoce aos IPs.
DUET: atividade da Etravirina (ETV) em vírus resistentes
aos ITRNN
DUET-1 e DUET-2 são dois grandes estudos de fase III, duplocego, comparando ETV versus placebo em combinação com
DRVÚr associado a um esquema de base otimizado por teste
de resistência (Cohen C e colaboradores)
Um total de 1203 indivíduos, todos com resistência documentada para ITRNN, foram randomizados para receber ETV
200mg duas vezes ao dia ou placebo associado a DRVÚr e
pelo menos dois outros ARVs selecionados pelo investigador,
incluindo ITRN eÚou enfuvirtida.
24
A maioria dos pacientes apresentavam duas ou mais mutações para ITRNN, e o FC demonstrava resistência fenotípica
para efavirenz ou nevirapina.
As características de baseline dos indivíduos estão demonstradas na tabela.
Caraterísticas
CV (log10 cópiasÚmL)
% com CV>100.000 cpÚmL
CD4+ (célsÚmm3)
Mutações de ITRNN
0
1
2
3
4
Fold-change IC50
ETV
Efavirenz
Nevirapina
Darunavir
Uso prévio de enfuvirtida
DUET 1
ETV
Placebo
DUET 2
ETV
Placebo
4.8
39%
99
4.9
41%
109
4.8
37%
100
4.8
31%
108
9%
25%
28%
17%
21%
12%
21%
24%
22%
20%
16%
19%
26%
19%
20%
15%
21%
24%
19%
17%
1.6
101.5
74.3
5.6
31%
1.4
72.8
73.8
6.1
34%
1.6
39.8
77.3
6.7
49%
1.7
27.6
74.3
7.0
50%
Como demonstrado na tabela, a adição de etravirina ao esquema de base otimizado aumenta significativamente a proporção de pacientes atingindo CV <400 e <50 cópiasÚmL.
Quando o FC para DRV é igual ou superior a 10, o uso de ETV
aumenta o número de indivíduos que atingem supressão viral
em 30% ou mais. Em ambos os estudos o uso de ETV apresentou bom desempenho mesmo em indivíduos com três ou
mais mutações para ITRNN.
% CV < 50 cpÚmL
% CV < 400 cpÚmL
% CV <50 cpÚmL de
acordo com mutações
para ITRNN em pctes
re-usando ou não usando
ENF
0
1
2
3
>4
DUET 1
ETV
Placebo
56%
39%
74%
51%
DUET 2
ETV
Placebo
62%
44%
75%
54%
47%
77%
64%
47%
44%
42%
45%
38%
34%
21%
80%
70%
48%
71%
57%
50%
44%
41%
28%
15%
33%
56%
66%
89
0%
19%
47%
64
43%
50%
73%
78
0%
17%
52%
66
% CV <50 cpÚmL de acordo
com FC para DRVÚr em
pctes re-usando ou não
usando ENF
>40
10-40
<10
Ganho médio de CD4+
(célsÚmm3)
A ocorrência de eventos adversos foi similar entre os grupos.
Exantema foi mais comumente observado no grupo que recebeu ETV, em comparação ao placebo (20% vs 10%); contudo
descontinuidade devido a este evento foi de apenas 2%. A
incidência de efeitos relacionados ao sistema nervoso central
e alterações laboratoriais foi semelhante entre os braços placebo e ETV.
29.10.07 11:24:18
A alta taxa de sucesso neste estudo deve-se ao fato de que
o uso de ETV permitiu que a maioria dos pacientes recebesse duas ou mais drogas plenamente ativas, uma estratégia
essencial para o tratamento de pacientes com resistência antiretroviral.
MOTIVATE: maraviroc em pacientes em falência
antiretroviral
Na 14ª Conferência em Retrovirus e Infecções Oportunistas
(CROI 2007) foram apresentados dados de 24 semanas dos
estudos MOTIVATE 1 e 2, demonstrando a eficácia e segurança do uso do maraviroc em pacientes em falência antiretroviral, com tropismo R5. Nas duas doses testadas (300 mg uma
vez ao dia e 150 mg duas vezes ao dia), em combinação com
um esquema de base otimizado, maraviroc demonstrou atividade virológica, com declínio de CV de aproximadamente 1.9
log10 cópiasÚmL em ambos os braços (Lalezari J, 14ª CROI
2007, 104blB; Nelson M, 104alB).
Duas subanálises destes estudos foram apresentados nesta conferência (IAS 2007) e demonstraram (1) quanto maior
o número de drogas ativas no esquema de base otimizado,
maior a probabilidade de pacientes tratados com maraviroc
atingirem carga viral indetectável, repetindo dados de outros
estudos com drogas experimentais (van der Ryst e colaboradores), e (2) apesar das duas posologias (uma ou duas vezes
ao dia) serem seguras, maiores taxas de supressão virológica
foram atingidas com a dose duas vezes ao dia em pacientes sem drogas ativas no esquema de base, baixos níveis de
CD4+ ou alta CV (Gulick e colaboradores). Logo, parece que
em indivíduos em falência antiretroviral, maraviroc deva ser
usado com o maior número possível de drogas ativas e preferencialmente duas vezes ao dia.
Coinfecção hepatite B e HIV
Análise de pacientes coinfectados com HIV e com o vírus da
hepatite B (HBV) ou hepatite C (HCV) no estudo SMART (Strategies for Management of Antiretroviral Therapy). Uma maior
proporção de pacientes coinfectados com o HBV reiniciaram
o tratamento (CD4<250 cél./mm3), o que não foi observado
comparando-se com o grupo HCV-HIV. A coinfecção HIV e
hepatite B ou C aumentou o risco de morte (3,8 vezes) por
causas não relacionadas às infecções oportunistas (doença
hepática, renal, neoplasias malignas e abuso de drogas ilícitas). Co-infectados apresentaram, significantemente, mais
mortes por causa desconhecidas. O risco de morte por causas cardiovasculares foi maior no grupo de monoinfectados
HIV.
Pesquisadores espanhóis liderados por Perez-Rodriguez demonstraram maior prevalência de anti-HBc isolado em coinfectados HCV-HIV em relação aos monoinfectados HIV (23%
vs 77%). A associação de infecção com HBV, anti-HBc isolado
e doença hepática foi maior em coinfectados HCV-HIV, comparativamente com os monoinfectados HCV.
HIV negativos
(n=2577)
HIV positivos
(n=151)
Infecção pelo HBV
340 (13%)
70 (47%)
Anti-HBc isolado
45 (14%)
31 (44%)
Anti-HBc isolado
e HCV
Doença hepática
(todos com HCV)
56%
79%
13%
26%
Pesquisadores poloneses, liderados por Kubicka, avaliaram a
presença de anti-HBs e HBV DNA em 65 pacientes que apresentaram anti-Hbc isolado: 25 pacientes com monoinfecção
HCV, 17 pacientes com coinfecção HCV-HCV, 23 pacientes
sem HCV e sem HIV. Não houve relação entre as variáveis
demográficas e os parâmetros do HBV. Detecção de HCV
RNA foi independentemente associado com baixos níveis de
antiHBs e ausência de HbsAg. HCV RNA detectável foi preditivo independente de HBV DNA detectável. Ausência ou baixo
nível de anti-HBs foi mais comum que presença de HBV DNA.
Em infectados pelo HIV foi mais frequente baixos títulos ou
ausência de anti-HBs (não estatisticamente significante). Infecção pelo HIV não foi preditivo de HBV DNA detectável
Pesquisadores de Melbourne e Sydney, liderados por Littlejonh, demonstraram a maior freqüência de genótipos mistos
do HBV em coinfectados com o HIV. Foram avaliados 44 pacientes com HBV-HIV, sendo 57% genótipo A e 35% com mais
de um genótipo (11 A+G, 2 A+D, 1 C+D, 1 D+G). Dos 35
pacientes monoinfectados HBV apenas 1 (3%) A+G.
O estudo TICO (Matthews e colaboradores) envolveu 36 pacientes HBV-HIV virgens de tratamento (Tailândia) randomizados (1:1:1) em 3 grupos: 3TC, TDF, 3TC+TDF. Idade média
foi 36 anos e um terço eram do sexo feminino. O CD4 inicial
médio foi 36, HBV genótipo C (83%), HBeAg positivo (61%),
3 com cirrose hepática. Na análise de intensão de tratar, na
semana 48, o declínio do HBV DNA foi de 4 a 5 log nos três
grupos e os seguintes resultados foram obtidos:
HBV DNA < 200 cp Ú mL
HBV DNA > 1000 cp Ú mL
Soroconversão do HBeAg
Soroconversão do HBsAg
Normalização da ALT
3TC
46%
38%
8%
8%
31%
TDF
75%
17%
8%
8%
42%
3TC+TDF
64%
0%
18%
9%
36%
Nove (25%) pacientes apresentaram exacerbação, com 4 soroconversões HBeAg e 2 soroconversões HbsAg e 1 paciente
foi a óbito por exacerbação e descompensação hepática.
Mutações de resistência ao 3TC (L180M+M204V) foram observadas em 1 paciente no grupo 3TC e HBV DNA > 1000 cpÚ
mL na semana 48 foi fator de risco para resistência.
Bortman e colaboradores, em estudo retrospectivo, mostraram que a imunização contra o HBV em pacientes portadores
do HIV é mais efetiva com dose dobrada.
Imunização
contra o HBV
Idade (mediana)
Sexo feminino
CD4 (mediana)
Aids
HAART
Respondedores
Aids
respondedores
10 mcg 0,1 e 60
(n=42)
41
33%
398
43%
88%
11 (26%)
3 (17%)
40 mcg 0,1 e 60
(n=11)
41
55%
353
64%
91%
9 (82%) p<0,001
7(100%) p<0,001
Coinfecção hepatite C e HIV
Um grupo de pesquisa baseado na Índia, apresentou a análise
de fatores de risco associados com UDI no cenário de países
em industrialização. Foram arrolados 400 usuários de drogas
intravenosas (UDI) nos quais foi feita a avaliação de infecção
pelo HIV, HBV e HCV. Foram detectadas as seguintes soropositividades: 43 (10.8%) para anticorpos HIV, 190 (47.8%) para
HCV; 15 (3.8%) para HBsAg. Dos 43 HIV positivos, 34 (79.1%)
tinham coinfecção pelo HCV e 3 (6.9%) também pelo HBV.
Usuários de heroína tiveram maior risco de monoinfecção pelo
HCV (OR 3.4; P<0.0001) e coinfecção (OR 4.3; P=0.0003) do
que os usuários de outros opióides como dextropropoxifeno.
Outros fatores associados foram: o período acumulado de
uso, o emprego de múltiplas drogas e o compartilhamento
dos elementos de injeção e preparação de drogas.
25
29.10.07 11:24:18
Trabalho liderado por Danta e cols. proporcionou os dados
dos clusters de infecção aguda pelo HCV em homens que fazem sexo com homens (HSH) HIV positivos observados desde o começo da década na Europa, Austrália e Estados Unidos. Nos 190 pacientes originários de quatro países europeus
foi observada uma média de idade de 38 anos, em prescrição de HAART e com contagem média de CD4 de 400 a 600
células/mm3. Foi feita a genotipagem e a análise filogenética
para 166 pacientes, achando 50% com genótipo 1a, 23% com
genótipo 4d, 7% com 3a e 5% com 1b. Foram observados
10 clusters de cepas relacionadas, dando conta de 88% de
todos os isolados. Os clusters detectados incluíram entre 3 e
36 indivíduos, sendo que um deles, de genótipo 4d incluiu 31
coinfectados provenientes dos quatro países incluídos. Desta
forma os autores sugeriram a implementação de ênfase nas
estratégias de prevenção e rastreamento para todos os indivíduos em risco.
Outro estudo, conduzido por Fox e cols, objetivou estudar a
incidência de HCV em soroconvertores para HIV. Um total de
155 HSH com infecção primária foram seguidos entre 2000
e 2006 no St Mary’s Hospital em Londres, 1 paciente tinha
coinfecção na avaliação de base; e no seguimento 12 experimentaram soroconversão, nos quais o tempo médio de aquisição de HCV foi de 17 meses (5 a 41 meses), no momento
do diagnóstico, unicamente 3 tinham alteradas as provas de
função hepática, 4 eram assintomáticos e nenhum tinha uma
outra doença sexualmente transmissível, sendo posteriormente diagnosticada em 5 indivíduos; todos reportaram práticas
de sexo não protegido e uso de drogas recreacionais. 10 foram classificados como genótipo 1a e 2 tinham genótipo 4d;
e durante a soroconversão para HCV, 4 experimentaram aumento na carga viral (CV) do HIV (incremento médio de 4.1
log copias/mL).
Pesquisadores na Alemanha exploraram os fatores de risco
em população HSH HIV positiva. Foram avaliados 22 não
usuários de UDI, pareados com 44 controles, sendo estatisticamente significantes após regressão logística o uso de drogas intra-nasais e lesões com sangramento. Como dado relevante os autores aprestaram na análise bivariada a significância estatística do antecedente de cirurgia de grande porte.
Tolia e cols compararam a progressão imunológica em pacientes que receberam tratamento para o HCV, foram inicialmente incluídos 57 pacientes coinfectados e com CV do HIV
não detectável, tratados com Interferon alfa 2b e Ribavirina.
Trinta e nove mantiveram a CV para HIV não detectável e completaram o esquema e seguimento do tratamento. Destes, 13
obtiveram resposta virológica sustentada (RVS). Foi observado que as quedas no número de células CD4 naive e CD4 de
memória foram maiores nos pacientes que não alcançaram
RVS, assim como, um maior aumento no número de células
CD8 em pacientes do grupo de RVS.
Thein e cols, apresentaram os dados de uma revisão sistemática e metanálise para avaliar o grau de progressão de fibrose,
investigando a repercussão do HIV na história natural da infecção pelo HCV. Após uma seleção de 46 estudos, 17 preencheram os critérios de inclusão, dentro destes, 82% dos indivíduos tinham história de UDI; foram achados como fatores de
progressão mais lenta de fibrose: menor idade no momento
da infecção pelo HCV, genótipo não 1 e uso de tratamento antiretroviral altamente potente (HAART). A taxa de cirrose entre
coinfectados foi o dobro frente aos HCV monoinfectados.
Grupo da Escola de Saúde pública de Harvard apresentou o
estudo da contribuição do HCV na disfunção neurocognitiva
em indivíduos adequadamente controlados com a HAART e
26
sem detecção de HIV, por, no mínimo, seis meses. Os pacientes foram submetidos a provas de função neuropsicológica.
As diferenças detectadas nos testes não foram estatisticamente significativas (média de -0.57 para HCV RNA-positivos e de
-0.47 para HCV RNA-negativos; P=0.21). Os pesquisadores
concluíram que a coinfecção não estaria contribuindo de
modo importante na disfunção neuropsicológica de pacientes
coinfectados e com supressão viral pelo HAART.
Estudo transversal, conduzido na França, avaliou a prevalência, gravidade e fatores de risco de esteatose nos pacientes
coinfectados, tendo como base 1000 pacientes HIV positivos,
40% deles coinfectados HCV-HIV, sendo incluídos para análise final 243 sujeitos, com as seguintes características: 68%
homens, com CV média de HIV de 2.3 log, número médio de
CD4 de 417 células/mm3, média de AST: 40 IU/mL, ALT: 61.5
IU/mL, e GGT: 83.5 IU/mL. Pela genotipagem foram encontrados: genótipo 1 (59.3%), 3 (27.5%), 4 (11.4%) e 2 (1,6%).
82.7% tinham um score METAVIR acima de F2 e 43% tinham
evidência de esteatose, tendo a metade deles tanto esteatose
micro como macrovesicular. A esteatose esteve correlacionada significantemente com os níveis de enzimas hepáticas, o
escore METAVIR e o tempo de seguimento da infecção pelo
HIV, sem ser achada associação com o genótipo de HCV ou a
duração de exposição à HAART.
Batisse e cols apresentaram o estudo de validação de testes
comercialmente disponíveis como Fibrometer, FibroTest, Hepascore e o índice AST-plaquetas (APRI) nos pacientes coinfectados HCV-HIV. Foram comparados 825 monoinfectados
com 82 coinfectados, sendo observada classificação errada
por estes testes quando comparados com a escala METAVIR
em entre 23 e 35% dos pacientes, e menores scores AUROC
quando comparadas com testes de protrombina e alfa-2-macroglobulina.
Pesquisadores de três centros na Itália estimaram a apresentação de resposta virológica rápida (RVR) (HCV RNA abaixo
de 50 IU/mL na semana 4 de tratamento), em 161 indivíduos
coinfectados com genótipo 3, tratados com terapia combinada. Foi feita a comparação com 173 monoinfectados pelo
HCV. Nos coinfectados a RVR esteve associada, independentemente, com doses diárias de ribavirina acima de 13 mg/
kg. A RVR foi observada em 43% dos coinfectados versus
80% dos monoinfectados. Nos pacientes coinfectados, 74%
com RVR e 34% sem RVR conseguiram alcançar RVS. (P <
0.0001). A taxa de RVS nos monoinfectados que tiveram RVR
foi de 96% e também foi estatisticamente significante maior
que em coinfectados.
Estudo piloto de cinética viral apresentou a comparação de
duas doses semanais de IFN peguilado nas quatro primeiras
semanas do tratamento versus dose única semanal em todas
as 48 semanas, no esquema que também inclui ribavirina em
dose diária entre 1000 e 1200 mg. Oito de 11 pacientes (72%)
no braço de dose dupla alcançaram a redução de 1 log na
CV de HCV no dia 7, comparado com 1 de 11 (9%) no braço
de dose única (P=0.02); adicionalmente, foi apresentado que
as percentagens de sujeitos com HCV RNA < 615 IU/mL nas
semanas 1, 4, 8 e 12 foram maiores no braço de dose dupla.
Também foi reportado que a obtenção de RVS foi maior no
grupo de dose dupla e os eventos adversos semelhantes entre os dois grupos.
Estudo retrospectivo avaliou a repercussão do tratamento para
HCV na progressão da doença hepática nos indivíduos coinfectados, ainda em ausência de RVS. Foram considerados 25
pacientes coinfectados não respondedores ao tratamento e
com diagnostico de cirrose, pareados com um grupo controle
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de 25 indivíduos não tratados. Foi estimada como progressão de cirrose a presença de pelos menos um dos seguintes eventos: morte, ascite, icterícia, encefalopatía, sangrado
gastrointestinal ou carcinoma hepatocelular (CHC). O modelo
de regressão logística empregado detectou como fatores independentes de progressão de cirrose: CV de HIV detectável
(RR 35.98); e alteração nos valores de ALT (RR 25.5) assim
como o papel protetor do emprego de terapia baseada em
IFN (RR 0.03).
Hepatotoxicidade dos antiretrovirais
O estudo KLEAN que comparou ritonavir com reforço de fosamprenavir (braço 1) versus lopinavir/ritonavir (braço 2) em
combinação com abacavir/3TC, em pacientes virgens de tratamento para HIV. Neste estudo, dentre 878 voluntários da América do Norte e Europa, foram incluídos 85 pacientes (9.68%)
coinfectados pelo HCV (47 no braço 1 e 38 no 2). Não foram
observadas diferenças na tolerância ao tratamento no grupo
de indivíduos coinfectados, porém os autores estimam que a
comparação de eventos adversos e eficácia nestes subgrupos
é intrincada pelo baixo número de indivíduos coinfectados.
Grupo liderado por Garcia-Gasco examinou a segurança e farmacocinética de tipranavir em 66 pacientes com diferentes estágios de fibrose, medida por elastografia hepática, sua relação
com coinfecção HCV-HIV e níveis farmacológicos circulantes
durante 12 semanas de seguimento. Foi observado aumento
de ALT durante o seguimento, especialmente, nos pacientes
com estágio F4, e os níveis de tripanavir foram maiores nos
pacientes com F3/4, quando comparados com os outros (51
vs 30 mcg/mL; P=0.02). Na análise multivariada, unicamente
o nível de fibrose esteve relacionado com níveis elevados do
fármaco (P=0.04).
Outro grupo também da Espanha, avaliou a segurança de atazanavir (em reforço de ritonavir) nos pacientes coinfectados
com fibrose hepática. Foram incluídos 185 pacientes coinfectados pelo HCV, 112 com grau de fibrose conhecida por:
biópsia hepática (n=49), elastografia (n=31) e APRI+índice
Forns (n=32). Após uma média de seguimento de 11 meses,
12 pacientes desenvolveram elevações graves de transaminases (grau 3-4). Os investigadores concluíram que a presença
de graus elevados de fibrose não incrementou o risco de elevações de transaminases.
Trabalho apresentado por McGovern e cols. comparou o número absoluto de células CD4 com a sua percentagem no
monitoramento da progressão de HIV em pacientes cirróticos.
Incluiu 6000 participantes HIV positivos da coorte italiana de
pacientes virgens de tratamento. O número médio de CD4 foi
de 427 células/mm3 (1-1361) e a média de percentagem de
CD4 foi 23% (1%-81%). Trinta e oito por cento da coorte tinha
coinfecção pelo HCV, sendo divididos em 2 grupos: com e
sem evidência da cirrose. Nos pacientes com cirrose, níveis altos de CD4, mas não altas percentagens estiveram associadas
com baixo risco de progressão a aids (RR 0.58 por incremento
de 100 células/mm3; 0.61 por cada incremento de 10%). Concluíram que a percentagem de células CD4 poderia ter maior
sensibilidade, como marcador de progressão para aids, nos
pacientes coinfectados HCV-HIV com cirrose.
27
29.10.07 11:24:19
Resumo de Teses
Autor: Daniela Souza Araujo de Angelis
Orientador: Daisy Maria Machado
Instituição: Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo
Ano de Defesa: 2007
Nível: Mestrado
Título: Avaliação do perfil de resistência genotípica aos
anti-retrovirais de crianças infectadas pelo HIV-1 mantendo
supressão viral prolongada em vigência de tratamento
Resumo:
O tratamento de indivíduos infectados pelo HIV-1 com
terapia anti-retroviral (ARV) pode reduzir a viremia
plasmática abaixo dos limites de detecção dos ensaios
atuais em muitos pacientes, porém difícil de ser alcançada
em crianças na vida real. Falha em alcançar ou manter a
supressão da replicação viral está geralmente associada
com o desenvolvimento de vírus resistentes a drogas.
Nós investigamos o perfil de resistência genotípica em
crianças com supressão viral prolongada (< 400 cópias/
mL de RNA viral plasmático) em vigência de tratamento
anti-retroviral. Nós obtivemos 32 amostras de células
mononucleares do sangue periférico (do inglês PBMC)
de 16 crianças do CEADIPe - UNIFESP quem tinham tido
carga viral indetectável por 12 meses ou mais, em dois
momentos: a primeira amostra na inclusão e a segunda
após mínimo de 9 meses de acompanhamento. A análise
das seqüências foi realizada em vírus isolado de PBMC
pelo “ABI PRISM 377 sequencer” (Applied Biosystems,
USA). Dentre as principais características da população
do estudo encontramos: mediana da idade na inclusão de
11 (6-15 anos); esquemas terapêuticos com 2 inibidores
da transcriptase reversa análogos nucleosídeo (ITRN)
+ 1 inibidor da protease (IP) ou 2 ITRN + 1 inibidor da
transcriptase reversa não-nucleosídeo (ITRNN) ou 2 ITRN
+ 2 IP + 1 ITRNN ou 2 ITRN + 2 IP ou 2 ITRN; mediana de
células CD4 (cél/mm 3 ) de 1016 (347- 2588) e 938 (4403038) no primeiro e segundo momentos, respectivamente;
classificação clínica (CDC 1994): N = 1, A = 3, B = 6; e
classificação imune (CI): CI 1 = 4, CI 2 = 6, CI 3 = 6. O
tempo médio de seguimento foi 15 (9 - 27) meses a partir
da inclusão. Seis (37,5%) e 7 (43,75%) dos 16 pacientes
mostraram no mínimo uma mutação associada aos ITRN, na
primeira e na segunda amostra, respectivamente. Dois dos
dezesseis (12,5%) apresentaram mutações associadas aos
ITRNN na primeira amostra e 3/16 (18,75%) na segunda.
Além disso, 14/16 (87,5%) mostraram pelo menos uma
mutação associada aos IP nos dois momentos. A despeito
do tratamento com drogas anti-retrovirais potentes e
supressão do RNA do HIV-1 no plasma a níveis indetectáveis
por vários meses, resistência parcial à terapia pode ter
resultado primariamente de arquivos de vírus ou refletir
precocemente condições sub-ótimas de tratamento.
Aluno: Márcia Menezes Gomes da Silva
Orientador: Daniela Riva Knauth
Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Ano de Defesa: 2007
Nível: Mestrado
Titulo: Características das gestantes infectadas pelo HIV,
de acordo com o momento do seu diagnóstico.
Resumo:
Objetivo: Analisar fatores socioeconômicos, demográficos
e as características do pré-natal das gestantes infectada
pelo HIV, de acordo com o momento do seu diagnóstico.
Métodos: Realizou-se estudo transversal com 199 gestantes
infectadas pelo HIV que tiveram seu atendimento pré-natal
em três centros públicos de referência de Porto Alegre, no
período de julho de 2005 a janeiro de 2006. O questionário
avaliou informações sócio-econômicas, demográficas e
do prénatal. Durante a análise, elas foram divididas em 2
grupos: Grupo1 composto de 135 gestantes (68%) que
sabiam previamente a gestação o seu diagnóstico para HIV
e o Grupo 2 com 64 gestantes (32%) que conheceram o
diagnóstico naquele pré-natal. Resultados: A mediana de
idade das gestantes foi 26 anos (variando 15 a 42 anos).
Quanto à escolaridade, 59% (n=117) delas não chegaram
a concluir o ensino fundamental. 74% (n=147) não tinham
nenhum tipo de renda. Em termos conjugais, 81% (n=153)
das gestantes possuíam um relacionamento estável com
o pai da criança e 66% (n=132) possuíam menos de 20
anos de idade quando tiveram a primeira gestação. O
número mediano de gestações prévias foi 3 (variando
de 1 a 13 gestações), e 37% (n=73) tiveram pelo menos
um aborto prévio. Comparando os grupos, observou-se
que o início do prénatal no primeiro trimestre e o desejo
de realizar ligadura tubária foi significativamente mais
freqüente no Grupo 1 do que no Grupo 2. p=0,005 e p=0,
012, respectivamente. Conclusões: Não houve diferenças
estatisticamente significante entre os grupos nos aspectos
sócio-demográficos, todavia as gestantes que já tinham
o seu diagnóstico para HIV prévio a gestação iniciaram
mais precocemente seu pré-natal e mais freqüentemente
requisitavam a ligadura tubária.
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29.10.07 11:24:19
Autor: Fernanda Tavares de Mello Abdalla
Orientador: Lucia Yasuko Izumi Nichiata
Instituição: Faculdade de Enfermagem da Universidade
de São Paulo
Nível: Mestrado
Ano de Defesa: 2007
Título: Abertura da privacidade e o sigilo do HIV/AIDS nas
equipes do programa saúde da família de uma unidade básica de saúde do município de São Paulo
Resumo:
Desde a identificação das primeiras pessoas com aids vêm
ocorrendo mudanças no perfil da epidemia. Acometendo
inicialmente homens, adultos com alta escolaridade e com
práticas homossexuais, passou a atingir cada vez mais
os jovens, os grupos sociais de maior exclusão social,
as pessoas com práticas heterossexuais e as mulheres.
Observa-se crescimento de casos em mulheres a partir
da década de 90, embora proporcionalmente o número
de casos seja ainda maior em homens. Até novembro
de 2000, do total de 196 016 casos de aids notificados
no Brasil, um quarto era do sexo feminino. Após o
diagnóstico da infecção pelo HIV, as mulheres enfrentam
dificuldades das mais variadas formas, desde aquelas
relacionadas à infecção e ao adoecimento, ao tratamento
e aos cuidados diários, até aquelas referidas ao campo
afetivo-relacional. Dado que a doença é envolta em
preconceito, estigma que podem levar a discriminação há
preocupação das mulheres com o “segredo” da infecção
pelo HIV. Considerando isto, o Programa Saúde da Família
(PSF) pode incluir ações que desenvolvam habilidades
de busca e recepção de apoio social, fortalecimento de
vínculos familiares e sociais na assistência e convivência
com as pessoas acometidas pelo HIV/AIDS. O PSF
convergindo para a promoção da qualidade de vida das
pessoas e de seu ambiente pode intensificar as ações
de promoção à saúde e prevenção do HIV. Desta forma,
entende-se que, considerando a autonomia da usuária,
a abertura da privacidade pela usuária pode auxiliar na
resposta às necessidades de saúde pelas equipes de PSF.
As discussões sobre os conflitos que os profissionais de
saúde do PSF encontram no seu cotidiano e que envolvem
a manutenção da privacidade e sigilo das informações
das usuárias, na perspectiva da Bioética, especialmente
na questão do HIV/AIDS, são objetos do presente estudo.
Seus resultados podem servir como subsídios para
a reflexão das práticas do PSF e conseqüentemente
para a melhoria da qualidade da assistência em saúde.
Este estudo teve como objetivo discutir as situações
que envolvem questões de privacidade e sigilo das
informações nas experiências de assistência às mulheres
portadoras de HIV/AIDS, vivenciadas pelas equipes
do PSF. Trata-se de um estudo qualitativo descritivo,
exploratório, na qual foram utilizadas as metodologias
de grupo focal e entrevista semi estruturada. Foi
realizada numa Unidade Básica de Saúde que opera
com modelo de PSF no município de São Paulo. Foram
coletadas as falas de dois grupos focais com agentes
comunitários de saúde (ACS) e 25 entrevistas individuais
com enfermeiros, médicos e auxiliares de enfermagem.
Os depoimentos foram analisados segundo Bardin e
organizados nos temas: a) a revelação do diagnóstico de
HIV para a usuária; b) acolhimento e vínculo na abertura
da privacidade; c) a revelação do diagnóstico de HIV aos
membros da equipe de PSF e, d) discussão em equipe e
o sigilo das informações. Verificou-se que os profissionais
do PSF tomam conhecimento sobre o diagnóstico do HIV
pela própria usuária, familiares, vizinhos, ACS ou outro
membro da equipe e profissionais de saúde dos serviços
de referência, além do prontuário e dos resultados de
exames. A mulher revela seu diagnóstico de HIV, abrindo
sua privacidade quando há confiança e vínculo na relação
usuáriaprofissional. Os profissionais buscam assegurar
o sigilo referente ao diagnóstico do HIV. A abertura da
privacidade da informação possibilita a discussão das
necessidades de saúde da usuária e o planejamento das
ações pelas equipes de PSF.
Aluna: Audrey Janaina Pinto.
Orientadora: Alcione Artioli Machado
Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo
Nível: Doutorado
Ano de defesa: 2007
Titulo: Comparação do perfil genético do Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 em compartimento sangüíneo e
liquórico de pacientes com afecções neurológicas.
Resumo:
O Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) freqüentemente invade o sistema nervoso central (SNC) durante a
infecção primária, e eventualmente resulta em desordens
neurológicas acima de 50% dos pacientes sem tratamento.
A casuística deste estudo é de 31 pacientes com afecções
neurológicas, 11 pacientes com toxoplasmose cerebral, 11
com meningite criptococócica e nove pacientes com aids
demência, com níveis de RNA do HIV-1 medidos em líquido
29
29.10.07 11:24:19
cefalorraquidiano e em plasma, sugerindo que as doenças
e os níveis de RNA do HIV-1 podem influenciar na carga viral do líquor. Assim, o objetivo deste estudo foi comparar a
região do gene envelope (env) do vírus no compartimento
plasmático e liquórico. Métodos: fragmentos do gene env
do HIV-1 foram amplificados pela reação em cadeia polimerase (PCR) e nested PCR de plasma e líquor. Os produtos de PCR foram diretamente seqüenciados pelo seqüenciador 3.1 ABI Analysis Data Collection. Utilizou-se para o
alinhamento das seqüências o programa MEGA 3.1, onde
as seqüências de aminoácidos da região do env nas amostras de líquor e plasma foram comparadas intra-pacientes.
Procedeu-se a análise do uso do co-receptor feita pela posição 306 e 320 da alça do V3. Pela análise filogenética das
seqüências obtiveram-se os subtipos. Resultados: todas as
amostras amplificadas (41) foram do subtipo B. Tiveram-se
17 pacientes que possuíam seqüências de plasma e líquor
amplificadas, então, na análise intra-paciente 13 destes 17,
possuíam vírus que utilizaram o co-receptor CCR5, apresentando assim, viroses R5, um paciente apresentou virose X4 e dois pacientes apresentaram viroses diferentes nos
compartimentos, X4 e R5. A compartimentalização entre
líquor e plasma ocorreu em 4 de 17 indivíduos (23,53%)
e em 13 de 17 indivíduos (76,47%) possuíam seqüências
idênticas nos dois compartimentos. Conclusão: Identificaram-se mudanças idênticas em líquor e plasma, nas seqüências do HIV-1 na região do env, especificamente na alça
V3 principalmente no motif central.
Autor: Fernanda Cristina Ferreira
Orientador: Lucia Yasuko Izumi Nichiata
Instituição: Universidade de São Paulo
Ano de Defesa: 2007
Nível: Mestrado
Título : As condições que levam as mulheres soropositivas
ao HIV/AIDS a abrir a privacidade de suas informações às
equipes do programa saúde da família
Resumo :
A AIDS é uma doença infecciosa que aparece na década
de 1980. Desde sua descoberta até os dias atuais houve
mudanças nas características das pessoas infectadas.
Uma dessas mudanças foi a feminização. As mulheres
devido às questões de gênero possuem singularidades
na forma do enfrentamento da doença. O acompanhamento das mulheres infectadas pelo HIV é realizado principalmente, por serviços especializados de saúde. Depois
da criação do Programa Saúde da Família, em 1994, e o
incentivo às ações de promoção à saúde e prevenção do
HIV na atenção básica, torna-se de suma importância a
discussão de temas sobre bioética no caso da aids no
PSF. O PSF adentra as residências das famílias e tem uma
relação de maior proximidade com a comunidade, e incorpora um novo trabalhador que é o Agente Comunitário
de Saúde. É a mulher infectada pelo HIV que tem o direito
de decidir a quem, como, onde e quando a informação
sobre sua soropositividade deve ser revelada. Este estudo teve como objetivos descrever em que condições as
mulheres infectadas pelo HIV abrem sua privacidade em
relação a informação sobre o diagnóstico de soropositividade a familiares, amigos e vizinhos; e identificar quais as
motivações para abrir a privacidade de informações para
a equipe de PSF das mulheres infectadas pelo HIV/AIDS.
Trata-se de um estudo descritivo de natureza qualitativa,
com enfoque bioético, realizado no Município de São
Paulo, com mulheres em acompanhamento em um serviço especializado em DST/AIDS e cadastradas por uma
equipe de PSF. Verificou-se neste estudo que as mulheres infectadas pelo HIV/AIDS revelam a sua condição de
soropositividade a família, amigos e vizinhos quando há
identificação com outro soropositivo, pressão de outros,
confiança depositada em uma relação, vontade de busca
de apoio, preocupação com possível transmissão do vírus ao parceiro, quando houve experiências positivas de
apoio, e quando não consegue mentir quando questionada sobre sua soropositividade. E não revelam quando há
medo do preconceito, medo de ex-parceiros, medo de se
expor, houve experiências negativas como falta de apoio,
rejeição e disseminação da informação, foi estabelecido
uma pacto de silêncio, não querem que sintam pena, há
medo de que a relação mude, envolve filhos menores de
idade, preferem guardar para si e quando utilizam estratégias para manter o segredo. As mulheres abrem a privacidade do diagnóstico para a equipe de PSF quando o
diagnóstico de soropositividade foi feito na própria unidade, quando ela sente que é melhor atendida no PSF por
ser portadora do HIV, tem vínculo com os profissionais do
PSF como se fossem familiares, confiam nos profissionais
do PSF, sentem que os profissionais não sentem pena. E,
não revelam quando a atitude inadequada do profissional
gerou medo e insegurança quando comunicou à usuária
o diagnóstico, acham que o PSF está ligado ao cuidado
de pessoas com doenças graves e acamados, não confiam nesses profissionais por medo de quebra do sigilo,e
já possuem todo suporte assistencial no SAE.
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Tendencias em HIV Vol 2 n3 2007 1 1 29.10.07 11:24:10

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