Anti-TG - WAMA Diagnóstica Produtos para Laboratórios

MS 10310030149
Anti-TG
Imuno-ELISA
Kit para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos Anti-Tireoglobulina
(Anti-TG) no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA).
Kit for the qualitative or semi-quantitative determination of Anti-Thyroglobulin (Anti-TG)
antibodies in human serum by enzyme immunoassay (ELISA).
Kit para determinación cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos Anti-Tiroglobulina (AntiTG) en el suero humano por enzimoinmunoensayo (ELISA).
R E F 446096-E
- 96 determinações / determinations / determinaciones
R E F 446192-E
- 192 determinações / determinations / determinaciones
WAMA Diagnóstica
EC R E P
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SAC 0800 772 9977
01
PORTUGUÊS
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
O espectro clínico das doenças autoimunes da tireoide é amplo, sendo que o paciente afetado pode ser
hiper, hipo ou mesmo eutireóideo. Existem duas formas principais de distúrbios autoimunes da
tireoide, a doença de Graves e a tireoidite de Hashimoto. As reações autoimunes também podem
ocorrer em outras alterações, como o bócio esporádico e o endémico, a doença de Plummer e a
oftalmopatia endócrina.
Os pacientes que sofrem destas desordens são frequentemente associados com a presença de
autoanticorpos contra os antígenos da tireoglobulina (Tg) e da tireoperoxidase (TPO). A Tg é uma
glicoproteína homodimérica, de 660 kD, que funciona como pro-hormônio da tireoide. A TPO é uma
enzima, de 105 kD, ligada a membrana, que catalisa a biossíntese dos hormônios da tireoide. A tiroxina
e a tri-iodotironina são produzidas através da iodação catalisada pela TPO e ligadas às tirosinas
homogênicas específicas.
A determinação dos autoanticorpos contra a Tg e a TPO é importante no diagnóstico das doenças
autoimunes da tireoide. Estes anticorpos podem ser medidos através de diversos métodos, como a
imunofluorescência indireta, a hemaglutinação passiva, a quimioluminescência e o ELISA.
O Imuno-ELISA Anti-TG da WAMA é um teste imunoenzimático para a determinação qualitativa ou
semi-quantitativa de anticorpos anti-tireoglobulina no soro humano, para o diagnóstico de doenças
autoimunes da tireoide.
PRINCÍPIO DO MÉTODO
As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de Tg (fase sólida).
Quando anticorpos anti-Tg específicos estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas
da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-IgG humana de
cabra marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos anti-Tg presentes. Um substrato (TMB) é
adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop
para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A
concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos
em unidades internacionais por mililitro (UI/mL).
APRESENTAÇÃO DO KIT
R E F 446096-E - 96 determinações
1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos Tg purificados (12 tiras removíveis com 8
cavidades cada)
2. Solução de lavagem – em pó (2 frascos)
3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (1 x 15 mL)
4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 mL)
5. Diluente de Amostra (1 x 60 mL)
6. Solução Stop (1 x 15 mL)
7. Calibrador-Tg:
A. 1 frasco, líquido, contendo 640 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
B. 1 frasco, líquido, contendo 320 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
C. 1 frasco, líquido, contendo 160 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
D. 1 frasco, líquido, contendo 80 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
E. 1 frasco, líquido, contendo
1 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL).
8. Soro Controle Negativo (1 x 1,75 mL)
9. Soro Controle Positivo (1 x 1,75 mL)
10. Instruções para uso
R E F 446192-E - 192 determinações
1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos Tg purificados (24 tiras removíveis com 8
cavidades cada)
02
2. Solução de lavagem – em pó (4 frascos)
3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (2 x 15 mL)
4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 mL)
5. Diluente de Amostra (2 x 60 mL)
6. Solução Stop (2 x 15 mL)
7. Calibrador-dsDNA:
A. 2 frascos, líquido, contendo 640 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
B. 2 frascos, líquido, contendo 320 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
C. 2 frascos, líquido, contendo 160 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
D. 2 frascos, líquido, contendo 80 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
E. 2 frascos, líquido, contendo
1UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL).
8. Soro Controle Negativo (2 x 1,75 mL)
9. Soro Controle Positivo (2 x 1,75 mL)
10. Instruções para uso
PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES
• MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a
temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope
laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8ºC.
• SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 mL de água destilada
ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com
aproximadamente 350µl. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes
de usar.
• CONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para
uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar.
Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar.
• SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para
uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar.
Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não
carcinogênico.
• DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento
impressa na etiqueta do frasco.
• SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É
corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a
temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na
etiqueta do frasco.
• CALIBRADORES-Tg (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo anti-Tg. A
concentração em UI/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta de cada frasco. Contém
conservante. Estável entre 2-8ºC. O uso do Calibrador-Tg é para determinar resultados semiquantitativos e valores em unidades internacionais. O Calibrador-Tg deve ser sempre utilizado em cada
ensaio realizado.
• SORO CONTROLE NEGATIVO (8): pronto para uso. Soro humano negativo para Anti-Tg. Usar
puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do
frasco. Contém conservante.
• SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para Anti-Tg. Usar puro,
ou seja, não diluído. A concentração em UI/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do
frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC.
Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade
descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2 - 8ºC).
AMOSTRAS
Usar amostra de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação.
A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser
mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas
03
antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem
causar falsos resultados.
MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
• Micropipeta de 5µl e 1000µl e ponteiras.
• Água deionizada para diluição do tampão de lavagem.
• Agitador de microplaca.
• Incubador com temperatura de 37 ºC.
• Leitor de microplaca com filtro de 450 nm.
• Lavadora de microplaca.
• Papel absorvente.
• Recipiente para descarte de material.
PROCEDIMENTO
IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento
de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do “blank” deve ser
desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm.
1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-Tg
(7), frasco D, se o resultado pretendido for qualitativo, ou 5 cavidades, frascos de A a E, se o resultado
desejado for semi-quantitativo, 1 cavidade para o soro controle negativo (8) e 1 cavidade para o soro
controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o “blank”, a qual conterá somente 100 µl do diluente de
amostra (5).
2. Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5 µl da amostra + 500 µl do diluente de
amostra (5).
3. Dispensar 100µl dos calibradores-Tg (7), soro controle negativo (8), soro controle positivo (9) e
amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o “blank” se a leitura for
monocromática, dispensando nesta 100µl do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para
cada pipetagem, evitando com isso contaminação.
4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica
(agitador de placa) por 30 segundos.
5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o
cuidado de evitar contaminação entre as cavidades.
7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos).
Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µl de solução de lavagem (2) em cada cavidade,
aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total
de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática.
ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do
ensaio.
8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido
residual.
9. Dispensar 100µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no “blank”.
10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
11. Repetir as etapas 6 a 8.
12. Dispensar 10µl do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no
“blank”. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação
mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz.
14. Bloquear a reação dispensando 100µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto
no “blank”. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação
mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o “blank”, dentro
de 30 minutos.
NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência
de 630 nm quando disponível.
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IMPORTANTE:
• O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão
leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas.
• A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada.
• O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos.
RESUMO DO PROCEDIMENTO
1. Pipetar 100µl do calibrador-Tg (7), controle negativo (8), controle positivo (9), amostras (1:101) e
“blank” (leitura monocromática) nas respectivas cavidades.
2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos.
3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar
4 vezes com solução de lavagem (2).
4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual.
5. Pipetar 100µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto “blank”.
6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos.
7. Repetir as etapas 3 e 4.
8. Pipetar 100µl do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no “blank”. Haverá
mudança na cor da reação onde houver peroxidase.
9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz
10. Pipetar 100µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca.
11. Homogeneizar por 30 segundos.
12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo
comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos.
A
B
C
D
E
F
G
H
EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA
DETERMINAÇÃO QUALITATIVA
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A5
Controle neg.
A6
Controle pos.
A7
Calibrador D
A8
A1
A9
A2
A10
A3
A4
A
B
C
D
E
F
G
H
EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA
DETERMINAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A1
A9
Controle neg.
A2
A10
Controle pos.
A11
A3
Calibrador A
A12
A4
Calibrador B
A5
Calibrador C
A6
Calibrador D
A7
Calibrador E
A8
12
12
CÁLCULOS DOS RESULTADOS
Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido
subtraindo da leitura da D.O. do “blank”. Se duplo comprimento de onda é usado o “blank” é omitido e,
portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração.
Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para
cálculos e interpretação dos resultados.
05
A determinação da concentração das amostras pode ser determinada através de um dos seguintes
métodos:
1. Determinação Qualitativa
D.O da Amostra
x UI/mL do Calibrador D = UI/mL da Amostra
D.O do Calibrador D
Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como “REAGENTES” ou
“NÃO REAGENTES”. As amostras com resultados superiores ou iguais ao Calibrador D são consideradas
Reagentes.
2. Determinação Semi-Quantitativa
Plotar as D.Os. e concentrações dos Calibradores de A a E em papel linear-log, plotando as
concentrações em UI/mL no eixo X e as D.Os. no eixo Y, traçando uma curva que ligue os pontos
determinados. A concentração da amostra em UI/mL é obtida plotando a D.O. da amostra
desconhecida no eixo “Y” e traçando o ponto de intersecção na Curva de Calibração, cuja concentração
será o valor correspondente no eixo “X” em UI/mL.
2,5
2
D.O
1,5
1
0,5
0
-0,5
0
200
400
600
800
UI/mL
Importante:
·• Alternativamente, pode-se usar uma curva de calibração de 4 pontos, descartando-se o calibrador
Ant - TG.
·• Os resultados semi-quantitativos são reportados em UI/mL, devendo os “borderline” (80-100
UI/mL) serem retestados.
·• Amostras com valores elevados, superiores ao calibrador anti- TG, devem ser diluídas e retestadas,
cujo resultado final em UI/mL é obtido após multiplicar pelo fator de diluição.
VALIDAÇÃO DO TESTE:
O teste é válido se:
• A D.O. do “blank”, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450nm.
• O valor da D.O. do Calibrador-Tg A deve ser igual ou superior a 1,0, caso contrário o teste deve ser
repetido.
• A concentração do controle negativo deve ser inferior a 40 UI/mL.
• Quando se realiza determinação qualitativa, a D.O. do Calibrador-Tg D deve ser superior à D.O. do
controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo.
• Para as determinações semi-quantitativas, o controle positivo deve apresentar valores na faixa
indicada na etiqueta do frasco.
06
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Para a interpretação dos resultados sugere-se a seguinte referência:
Valores de Anticorpos Anti -TG
< 80 UI/mL
80 – 100 UI/mL
> 100 UI/mL
Interpretação
Resultado Negativo
Resultado “Borderline”
Resultado Positivo
IMPORTANTE: 1. Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos
resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência.
VALORES ESPERADOS
Os valores esperados numa população normal são negativos. No entanto, 5-10% de indivíduos
aparentemente saudáveis e assintomáticos podem apresentar resultados positivos para autoanticorpos da tireoide. A incidência destes auto-anticorpos aumenta com a idade.
O quadro abaixo mostra a incidência de auto-anticorpos da tireoide em indivíduos normais e em
diversas doenças autoimunes.
Condição
Doença de Graves
Nº de Indivíduos
24
Nº de Positivos
16
% de Positivos
66,7%
Tireoidite de Hashimoto
41
34
82,9%
Suspeita de Doenças da Tireoide
101
56
55,4%
Perda Autoimune da Audição
10
0
0,0%
Artrite Reumatóide
18
1
5,5%
Lupus Eritematoso Sistêmico
2
0
0,0%
Indivíduos Saudáveis Normais
104
4
3,8%
Os anticorpos anti-tireoglobulina ocorrem principalmente nas doenças de Graves e de Hashimoto.
Estes auto-anticorpos podem igualmente ocorrer no bócio nodular tóxico e em associação com outros
distúrbios autoimunes, como o LES.
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE
Em um estudo realizado com 121 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais
57 eram positivas e 64 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit ImunoELISA Anti-Tg da WAMA em comparação com o Kit comercial.
Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100
Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100
RESULTADO
Verdadeiros
Positivos
Falsos
Positivos
Verdadeiros
Negativos
Falsos
Negativos
Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
57
4
60
0
100
93,75
Foi também estudado a reatividade cruzada em indivíduos portadores de outras doenças autoimunes
ou reagentes para auto-anticorpos, cujos resultados são mostrados no quadro abaixo:
Condição
Perda Autoimune da Audição
Artrite Reumatóide
Lupus Eritematoso Sistêmico
TOTAL
Nº de Pacientes
10
18
2
30
Nº de Reagentes
0
1
0
1 (3,3%)
07
PRECISÃO DO TESTE
a. Precisão Intra-Ensaio
A precisão intra-ensaio foi determinada ensaioando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não
reagente, em 20 replicatas.
Amostras
Reagente
Não Reagente
Número de Vezes
Média UI/ml
Desvio Padrão
CV (%)
20
20
141,28
25,47
7,58
1,56
5,37%
6,12 %
b. Precisão Inter-Ensaio
A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não
reagente, em 20 replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes.
Amostras
Reagente
Não Reagente
Número de Vezes
20
20
Média UI/ml
140,40
25,13
Desvio Padrão
8,01
1,66
CV (%)
5,71%
6,62 %
LINEARIDADE
A linearidade do Imuno-ELISA Anti-TG é 12,6 – 640 UI/mL. Sugere-se que amostras com valores
superiores a concentração do calibrador-Tg A sejam diluídas e retestadas. O resultado final é
determinado pela multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição.
LIMITE DE DETECÇÃO
O limite de detecção do teste foi determinado como de 12,6 UI/mL com base em 60 replicatas do blank”
e 10 replicatas de cada uma de seis amostras com baixos níveis de anticorpos.
ESPECIFICADADE ANALÍTICA
Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações
indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/L) e Fator Reumatóide (até 100 UI/mL),
Colesterol (até 13 mmol/L) e Triglicérides ( até 37 mmol/L).
LIMITAÇÕES DE USO
• O teste Imuno-ELISA Anti-TG da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e
especificidade. Entretanto, devido à possibilidade de falsos resultados reagentes e interferência com
outras doenças, resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as
informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais.
• Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não
reagentes.
• Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer por várias
razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem.
• A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste.
PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS
1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 - 8 ºC.
2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do
kit.
3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol.
4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível.
5. O Imuno-ELISA Anti-TG contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com
resultados negativos para anticorpos anti-HIV I e II , anti-HCV e antígeno de superfície da Hepatite B
(HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e
de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente
infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais.
6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes.
7. Deixar os reagentes adquirirem a temperatura ambiente (20 - 25 ºC) antes de iniciar os testes.
08
8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após
o uso.
9. Não deixar as cavidades da microplaca secarem durante o ensaio.
10. Evitar repetidas pipetagem dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação.
11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para
manter as mesmas condições do teste.
12. Não usar reagentes após a data de validade.
13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes.
14. Descartar o material conforme regulamentações locais.
15. Utilizar as Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais
TERMO DE GARANTIA
A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro
do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na
execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se
responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.
ENGLISH
SUMMARY
The clinical spectrum of autoimmune diseases of the thyroid is broad, where the affected patient may
be hyper, hypo or even euthyroid. There are two main forms of autoimmune disorders of the thyroid
gland, the Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis. The autoimmune reactions can also occur in
other changes, such as sporadic goiter and the endemic, the disease of Plummer and the endocrine
ophthalmopathy.
Patients who suffer from these disorders are often associated with the presence of autoantibodies
against the thyroglobulin antigens (Tg) and thyroperoxidase (TPO). The Tg is a homodimeric
glycoprotein, 660 kD, that acts as pro-hormone of the thyroid gland. The TPO is an enzyme, 105 kD,
linked to the membrane, which catalyzes the biosynthesis of thyroid hormones. The thyroxine and triiodothyronine are produced through the iodination catalyzed by the TPO and linked the specific
homogenic tyrosine.
The determination of autoantibodies against the Tg and TPO is important in the diagnosis of
autoimmune diseases of the thyroid gland. These antibodies can be measured by various methods,
such as the indirect immunofluorescence, the passive hemagglutination, the chemiluminescence and
the ELISA.
The Imuno-ELISA Anti-TG from WAMA is an enzyme immunoassay test for the qualitative or semiquantitative determination of anti-thyroglobulin antibody in human serum for the diagnosis of
autoimmune diseases of the thyroid gland.
PRINCIPLE OF THE METHOD
The microtiter wells of the plate are covered with purified Tg antigen (solid phase). When specific antiTG antibodies are present in the serum sample, they bind to proteins from the solid phase. Material not
bound is removed by washing. A goat anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the anti-TG
antibodies present. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the
change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction
absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the
intensity of the reaction color. The results are expressed as international units per milliliter (IU/mL).
KIT PRESENTATION
R E F 446096-E - 96 determinations
1. Microplate with wells coated with purified TG antigen (12 removable strips with 8 wells each)
2. Washing solution - powder (2 bottles)
3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (1 x 15 ml)
09
4.
5.
6.
7.
Chromogen Substrate (TMB) (1 x 15 ml)
Sample Diluent (1 x 60 ml)
Stop Solution (1 x 15 mL)
Tg Calibrator:
A. 1 bottle, liquid, containing 640 IU/mL of anti-Tg (1 x 1.75 mL),
B. 1 bottle, liquid, containing 320 IU/mL of anti-Tg (1 x 1.75 mL),
C. 1 bottle, liquid, containing 160 IU/mL of anti-Tg (1 x 1.75 mL),
D. 1 bottle, liquid, containing 80 IU/mL of anti-Tg (1 x 1.75 mL),
E. 1 bottle, liquid, containing 1 IU/mL of anti-Tg (1 x 1.75 mL),
8. Negative Serum Control (1 x 1.75 mL)
9. Positive Serum Control (1 x 1.75 mL)
10. Instructions for use
446192-E - 192 determinations
Microplate with wells coated with purified Tg antigen (24 removable strips with 8 wells each)
Washing solution - powder (4 bottles)
Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (2 x 15 ml)
Chromogen Substrate (TMB) (2 x 15 ml)
Sample Diluent (2 x 60 ml)
Stop Solution (2 x 15 mL)
Tg Calibrator:
A. 2 bottles, liquid, containing 640 IU/mL of anti-Tg (2 x 1.75 mL),
B. 2 bottles, liquid, containing 320 IU/mL of anti-Tg (2 x 1.75 mL),
C. 2 bottles, liquid, containing 160 IU/mL of anti-Tg (2 x 1.75 mL),
D. 2 bottles, liquid, containing 80 IU/mL of anti-Tg (2 x 1.75 mL),
E. 2 bottles, liquid, containing 1 IU/mL of anti-Tg (2 x 1.75 mL),
8. Negative Serum Control (2 x 1.75 mL)
9. Positive Serum Control (2 x 1.75 mL)
10. Instructions for use
REAGENT PREPARATION AND STABILITY
• MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room
temperature (20 – 25°C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope,
with desiccant, and kept at 2 – 8°C.
• WASH SOLUTION (2): Dissolve the contents (powder) of 1 bottle in 1000 mL of distilled or
deionized water. During each wash cycle, each well must be washed filled with approximately 350µl.
Keep at 2-8ºC. Allow it to reach room temperature (20 – 25°C) before using it.
• GOAT ANTI-HUMAN IgG LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready for use. Stable at 2 – 8°C up
to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature
(20 – 25°C) before using it.
• CHROMOGEN SUBSTRATE (TMB) (4): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to
use. Stable at 2 – 8 °C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room
temperature (20 – 25°C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic.
• SAMPLE DILUENT (5): ready for use. Stable at 2 – 8°C up to the expiration date printed on the
bottle.
• STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On
skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature
(20 – 25°C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle.
•Tg CALIBRATORS (7): ready to use. Made from human sera containing anti-Tg. The concentration in
IU/mL and the expiration date are printed on the label of each bottle. Contains preservative. Stable at
2-8 °C. The use of Tg Calibrator is to determine semi-quantitative results and the values in
International Units. The T Calibrator must always be used in each test performed.
• NEGATIVE SERUM CONTROL (8): ready for use. Negative human serum to Anti-Tg. Use it as is (do
not dilute it). Stable at 2 – 8°C up to the expiration date printed on the bottle. Contains preservative.
• POSITIVE SERUM CONTROL (9): ready to use. Positive human serum to Anti-Tg. Use it as is (do not
dilute it). The concentration in IU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle.
Contains preservative. Stable at 2-8 °C.
REF
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
10
Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration
date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 °C).
SPECIMENS
Use serum specimens not hemolysed, lipemic or contaminated.
The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 ° C for 48 hours. For long-term storage, serum
or plasma must be kept in the freezer at – 20ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized
before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Micropipette of 5 μl and 1000 µl and tips.
• Deionized water for dilution of the wash buffer
• Microplate shaker.
• Incubator at 37 °C.
• Microplate reader with 450nm filter.
• Microplate washer.
• Absorbent paper.
• Container for material disposal
PROCEDURE
IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630
nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it
should be used only when using a 450 nm single filter.
1. In accordance with the established plan of distribution on the plate, use 1 well for the Tg-calibrator
(7), bottle D, if the desired result is qualitative, or 5 wells, bottles A to E, if the desired result is semiquantitative, 1 well for the negative serum control (8) and 1 well for the positive serum control (9). Use
1 well for the "blank", which will contain only 100 µl of the sample diluent (5).
2. Prepare dilution of samples to be tested at 1:101 (5 µl of sample + 500 µl of the sample diluent (5)).
3. Pipette 100µl of the Tg calibrator (7), serum negative control (8), serum positive control (9) and
samples (1:101) in the wells of the microtitre plate. Use a well for the "blank" if the reading is
monochromatic, dispensing 100µl of the sample diluent (5).Use individual tips for each sample, to
avoid contamination.
4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or
use a microtiter plate shaker.
5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes.
6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid
contamination between the cavities.
7. Wash the plate 4 times with the Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents).
Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of the Wash Solution (2) in each well, wait 30
seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 3 times (total of 4 cycles). We
recommend using a microplate washer (manual or automatic).
WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test.
8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual
liquid.
9. Pipete 100µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank.
10. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes.
11. Repeat the steps 6 to 8.
12. Pipete 100µl of the chromogen substrate (TMB) (4) into each of the cavity wells, except on the
blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a
microtiter plate shaker for 30 seconds.
13. Incubate at 37° C for 30 minutes,protecting from light.
14. Block the reaction by dispensing 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate,
including the blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it
or use a microtiter plate shaker for 30 seconds.
15. Read the abosrbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank within 30
minutes.
11
NOTE: it is recommended to use a dual wavelength using a reference filter of 630 nm when
available.
IMPORTANT:
• The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in
inaccurate readings or falsely elevated absorbance.
• Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended.
• The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes.
SUMMARY OF THE PROCEDURE
1. Pipette 100 µl of the Tg calibrator (7), negative control (8), positive control (9), samples (1:101) and
"blank" (monochrome reading) in their respecitve cavities.
2.Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes.
3.Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 4
times with wash solution (2).
4.Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid.
5.Pipette 100µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank.
6.Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes.
7.Repeat the steps 3 and 4.
8.Pipete 100µl of the chromogen substrate (4) into each of the cavity wells, except on the blank.
Change in reaction color will occur wherever peroxidase is found.
9.Mix for 30 seconds and incubated at room temperature for 30 minutes. Protected from light
10.Pipette 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate.
11.Mix for 30 seconds.
12.Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength
(450/630 nm), within 30 minutes.
EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE
QUALITATIVE DETERMINATION
.........
..........
1
2
3
4
A
B
C
D
E
F
G
H
Blank
Neg. Control
Pos. Control
Calibrator D
A1
A2
A3
A4
EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE SEMI QUANTITATIVE DE TERMINATION
1
2
3
4
..........
.........
A
B
C
D
E
F
G
H
Blank
Neg. Control
Pos. Control
Calibrator A
Calibrator B
Calibrator C
Calibrator D
Calibrator E
12
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
A11
A12
12
12
CALCULATION OF RESULTS
Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by
subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the
the O.D readings are used without subtracting.
If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and
interpretation of results.
The determination of the concentration of the samples can be determined by one of the
following methods:
1.Qualitative Determination
O.D of the Sample
x IU/mL of Calibrator D = IU/mL of the Sample
O.D. of the Calibrator D
Warning: It is recommended that the qualitative results are reported as "REACTIVE" or "NOT
REACTIVE". The samples with results greater or equal to the D calibrator are considered Reactive.
2,5
2
O.D
1,5
1
0,5
0
-0,5
0
200
400
600
800
IU/mL
IMPORTANT:
• Alternatively, you can use a 4 point calibration curve, discarding the E Tg calibrator.
• The semi-quantitative results are reported in IU/mL, and the "borderline" (80-100 IU/mL) should be
re-tested.
• Samples with elevated values, greater than the A Tg calibrator, should be diluted and re-tested, whose
final result in IU/ml is obtained after multiply by the dilution factor.
TEST VALIDATION:
• The test is valid if:
• The O.D of the blank,which contains only the sample diluent, mus be less than 0.3 at 450 nm.
•The value of O.D. of the A Tg-Calibrator must be equal to or greater than 1.0, otherwise the test must
be repeated.
• The concentration of negative control must be less than 40 IU/mL.
• When the qualitative determination in performed, the O.D. of the Tg D Calibrator must be greater than
the O.D. of the negative control and lower the O.D. of the positive control.
•For the semi-quantitative determinations, the positive control must have values in the range indicated
on the label of the bottle.
INTERPRETATION OF THE RESULTS
For the interpretation of the results, it's recommended the following reference range:
Anti-TG Antibody Values
< 80 IU/ml
80 - 100 IU/ml
> 100 IU/ml
Interpretation
Negative Result
Borderline Result
Positive Result
13
IMPORTANT: 1. The above values are provided only as guidance for the interpretation of results. It is
recommended that each laboratory establish its own reference range.
EXPECTED VALUES
The values expected in a normal population is negative. However, 5-10% of apparently healthy and
asymptomatic patients can show positive results for auto-antibodies against the thyroid gland. The
incidence of these auto-antibodies
increases with age.
The table below shows the incidence of auto-antibodies against the thyroid gland in normal individuals
and in several autoimmune diseases.
Number of Patientes
Number of Positives
% of Positives
Graves' disease
Condition
24
16
66.7%
Hashimoto's thyroiditis
41
34
82.9%
Suspicion of Thyroid Diseases
101
56
55.4%
Autoimmune Hearing Loss
10
0
0.0%
Rheumatoid arthritis
18
1
5.5%
Systemic Lupus Erythematosus
2
0
0.0%
104
4
3.8%
Normal Healthy Individuals
The anti-thyroglobulin antibodies occur mainly in Grave's disease and Hashimoto's thyroiditis. This
auto-antibody can also occur in toxic nodular goiter and in association with other autoimmune
disorders, such as the SLE.
SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST
In a study conducted with 121 samples of serum obtained from a reference laboratory, of which 57 were
positive and 64 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA AntiTG from WAMA in comparison to the commercial Kit.
Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100
Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100
RESULTS
True
Positives
False
Positives
True
Negatives
False
Negatives
Sensitivity
(%)
Especificity
(%)
57
4
60
0
100
93.75
Cross-reactivity was also studied in individuals carrier of other autoimmune diseases or reactive to
auto-antibodier, whose results are shown in the table below:
Condition
Autoimmune Hearing Loss
Rheumatoid arthritis
Systemic Lupus Erythematosus
TOTAL
Number of Patients
10
18
2
30
Number of Reagents
0
1
0
1 (3.3%)
PRECISION OF THE TEST:
a.Intra-Assay Precision
The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of sera, one reactive and one nonreactive, in 20 replicates.
14
Specimens
Reagent
Non-Reactive
Number of times.
Average IU/ml
20
20
141.28
25.47
Deviation Standard
7.58
1.56
CV (%)
5.37%
6.12 %
b. Inter-Assay Precision
The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one reactive and another not
reactive, in 20 replications, being 10 replicas for each lot and by different operators.
Specimens
Reagent
Non-Reactive
Number of times.
20
20
Average IU/ml
140.40
25.13
Deviation Standard
CV (%)
8.01
1.66
5.71%
6.62 %
LINEARITY
The linearity of the Imuno-ELISA Anti-TG is 12.6 - 640 IU/mL. It is recommended for samples with
values greater than the concentration of the A Tg calibrator be diluted and retested. The final result is
determined by multiplying the value obtained by the dilution factor.
DETECTION LIMIT
The detection limit for the test was determined as of 12.6 IU/mL based on 60 replicates of blank and 10
replicates for each one of six samples with low levels of antibodies.
ANALYTICAL SPECIFICITY
It was not demonstrated significant interference for the following substances at the indicated
concentrations: Hemoglobin (up to 2g/L), bilirubin (up to 342 µmol/L) and Rheumatoid Factor (up to
100 EU/mL), cholesterol (up to 13 mmol/L) and trygliceryde (up to 37 mmol/L).
LIMITATIONS OF USE
• The test Imuno- ELISA Anti-TG from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and
specificity. However, due to the possibility of false results reagents and interference with other
diseases, results repeatedly reactive should always be interpreted with clinical information from the
patient and with the results of other laboratory tests.
• Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive.
• Due to the high sensitivity of the ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons,
many of which are related, but not limited to, improper washing step.
• The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test.
PRECAUTIONS AND WARNINGS
1. The reagents should be kept between 2 - 8 ºC.
2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit
box.
3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight.
4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage.
5. The Imuno-ELISA Anti-TG contains materials of human origin, which have been tested, with
negative results for anti-HIV I and II antibodies, anti-HCV and Hepatitis B surface antigen virus
(HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other
infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well
as having the same care when disposing these materials.
6. Do not use reagents or microplates fof different batches.
7. Allow the reagents to reach the room temperature (20 -25ºC) before starting the test.
8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use.
9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test.
10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination.
11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the
15
same test conditions.
12. Do not use the reagent after the expiration date.
13. Do not it reuse any one of the reagents.
14. Discard the material following local regulations.
15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials.
WARRANTY
WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration
date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution,
handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the
performance of the kits under these conditions
ESPAÑOL
IMPORTANCIA CLÍNICA
Lo espectro clínico de las enfermedades autoinmunes de la tiroides es vasto, donde el paciente
afectado puede ser hiper, hipo o incluso eutiroideos. Existen dos formas principales de trastornos
autoinmunes de la tiroides, la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto. Las reacciones
autoinmunes también puede ocurrir en otras modificaciones, como bocio esporádico y la endémica, la
enfermedad de Plummer y la oftalmopatía endocrina.
Los pacientes que sufren estos trastornos con frequencia se asocia con la presencia de autoanticuerpos
contra la tiroglobulina (Tg) y peroxidasa tiroidea (TPO). La Tg es una glicoproteína homodimérica, 660
kD, que actúa como pro-hormona de la glándula tiroides. La TPO es una enzima, de 105 kD, vinculado a
la membrana, que cataliza la biosíntesis de las hormonas tiroideas. La tiroxina y triyodotironina se
producen a través de la iodación catalizada por la TPO y vinculado a tirosina homogenica especifica.
La determinación de autoanticuerpos contra la Tg y TPO es importante en el diagnóstico de las
enfermedades autoinmunes de la tiroides. Estos anticuerpos pueden ser medidos por diversos
métodos, tales como la inmunofluorescencia indirecta, la hemaglutinación pasiva, la
quimioluminiscencia y el ELISA.
La Imuno-ELISA Anti-TG de WAMA es un inmunoensayo enzimático para la determinación
cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos anti-tiroglobulina en el suero humano para el diagnóstico
de enfermedades autoinmunes de la tiroides.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con antígeno purificado de Tg (fase sólida).
Cuando anticuerpos especificos anti-TG están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas
de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando anti-IgG humana de
cabra marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos anti-TG. Un sustrato (TMB) es adicionado, el
cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop
para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm).
La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los
resultados se expresan en unidades internacionales por mililitro (UI/mL).
PRESENTACIÓN DEL KIT
R E F 446096-E - 96 determinaciones
1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos TG purificados (12 tiras extraíbles con 8 pocillos
cada uno)
2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas)
3. Conjugado anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa (1 x 15 ml)
4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml)
5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml)
6. Solución Stop (1 x 15 mL)
7. Calibrador Tg:
A. 1 botella, líquido, que contiene 640 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
16
B. 1 botella, líquido, que contiene 320 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
C. 1 botella, líquido, que contiene 160 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
D. 1 botella, líquido, que contiene 80 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
E. 1 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-Tg (1 x 1,75 mL),
8. Suero control negativo (1 x 1,75 ml)
9. Suero control positivo (1 x 1,75 ml)
10. Instrucciones de uso
R E F 446192-E - 192 determinaciones
1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos Tg purificados (24 tiras extraíbles con 8 pocillos
cada uno)
2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas)
3. Conjugado anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa (2 x 15 ml)
4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml)
5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml)
6. Solución Stop (2 x 15 mL)
7. Calibrador Tg:
A. 2 botella, líquido, que contiene 640 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
B. 2 botella, líquido, que contiene 320 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
C. 2 botella, líquido, que contiene 160 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
D. 2 botella, líquido, que contiene 80 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
E. 2 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-Tg (2 x 1,75 mL),
8. Suero control negativo (2 x 1,75 ml)
9. Suero control positivo (2 x 1,75 ml)
10. Instrucciones de uso
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y ESTABILIDAD
• MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a
temperatura ambiente (20 - 25 °C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con
desecante, y se mantendrá a 2 - 8 °C.
• SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua
destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con,
aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y 8 °C. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20 25 °C) antes de usar.
• ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre
2 - 8 °C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la
temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar.
• SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para
usar. Estable a 2 - 8 °C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que
alcance la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico.
• DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2 - 8 °C hasta la fecha de vencimiento
impresa en el envase.
• SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado.
Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance
la temperatura ambiente (20 - 25 °C) antes de usar. Estable °C hasta la fecha de vencimiento impresa
en el frasco.
• CALIBRADORES Tg (7): Listo para usar. Producido de sueros humanos que contiene anti-Tg. La
concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella.
Contiene conservante. Estable entre 2 y 8 °C. Lo uso de Calibrador Tg es para determinar resultados
semi-cuantitativos y los valores en unidades internacionales. El Calibrador Tg deben utilizarse siempre
en cada prueba realizada.
• SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): listo para usar. Suero humano negativo para anti-Tg. Usar
puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2 - 8 °C hasta la fecha de vencimiento impresa en el
envase. Contiene conservante.
• SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para anti-Tg. Usar
puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se
imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 - 8 °C.
17
Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la
fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2 8ºC).
ESPECÍMENES
Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación.
Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor,
deben guardarse en freezer a -20 ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del
test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que
esto puede producir resultados falsos.
MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO
• Micropipeta de 5μl y 100μl y puntas de pipeta.
• Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado.
• Agitador de microplaca.
• Incubadora con una temperatura de 37 º C
• Lector de micro placa con filtro de 450 nm.
• Lavador de microplaca.
• Papel absorbente.
• Recipiente para descarte de material.
• Recipiente para descarte de material.
PROCEDIMIENTO
IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud
de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe
ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm.
1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, use 1 pocillo para el Calibrador Tg (7),
botella D, si el resultado esperado es cualitativa, o 5 pocillos, botellas A a E, si el resultado deseado es
semi-cuantitativo, 1 pocillo para el suero control negativo (8) y 1 pocillo para el suero control positivo
(9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 100μl de diluyente de muestra (5).
2. Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra + 500 µl de la muestra
diluyente (5).
3. Dispensar 100 µl de lo calibrador Tg (7), suero control negativo (8), suero control positivo (9) y
muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura
es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales
para cada pipeteo, evitando la contaminación.
4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración
mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de
evitar la contaminación entre pocillos.
7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos).
Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar
30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos).
Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual.
ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los
procedimientos de lavado sean adecuados.
8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar
cualquier residuo líquido.
9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank.
10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
11. Repetir los pasos 6 al 8.
12. Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el
blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por
vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
13. Incubar a 37° C durante 30 minutos, protegerlo de la luz.
14. Bloquear la reacción dispensando 100μl ?de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca,
18
inclusive el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la
placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos.
15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del
sustrato, en un plazo de 30 minutos.
NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud
de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible.
IMPORTANTE:
• El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a
lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas.
• Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio.
• El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
1. Dispensar 100μl del calibrador Tg (7) control negativo (8), control positivo (9), muestras (1:101), y
blank (lectura monocromatica) en sus respectivos pocillos.
2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 4 vezes con
solución de lavado (2).
4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido.
5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.
6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
7. Repetir los passos 3 y 4.
8. Dispensa.r 100μl del sustrato cromógeno (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank.
Cambio de color aparecerá donde está presente la enzima peroxidasa.
9. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.Protegido de la luz
10. Dispensar 100 µl de la Solución Stop (6) en cada uno de los pocillos de la microplaca.
11. Homogeneizar por 30 segundos.
12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del
sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 30 minutos.
A
B
C
D
E
F
G
H
EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA
DETERMINACIÓN CUALITATIVA
1
2
3
4
.....
.....
Blank
A5
Controle neg.
A6
Controle pos.
A7
Calibrador D
A8
A1
A9
A2
A10
A3
A4
12
EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA DETERMINACIÓN
SEMI-CUANTITATIVA
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Blank
Controle neg.
Controle pos.
Calibrador A
Calibrador B
Calibrador C
Calibrador D
Calibrador E
2
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
3
A9
A10
A11
A12
4
.....
.....
12
19
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene
restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco"
se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción.
Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación
de los resultados.
La determinación de la concentración de las muestras puede ser determinada por uno de los siguientes
métodos:
1. Determinación Cualitativa
D.O. de la muestra x UI/mL de Calibrador D = UI/mL de la muestra
D.O. del Calibrador D
Advertencia: Se recomienda que los resultados cualitativos se reportan como "REACTIVO" o "NO
REACTIVO". Las muestras con resultados igual o mayor que el calibrador D se considera Reactivo.
2. Determinación semicuantitativo
Trace el D. O. y las concentraciones de los calibradores A a E en un papel log-lineal , trazando las
concentraciones en UI/ml en el eje X y el D.O s en el eje Y, trazando una curva que conecta los puntos.
La concentración de la muestra en UI/ml se obtiene trazando el D.O. de la muestra desconocida en el
eje Y, trazando el punto de intersección de la curva de calibración, cuya concentración es el valor
correspondiente en el eje X en UI/ml .
2,5
2
D.O
1,5
1
0,5
0
-0,5
0
200
400
600
800
UI/mL
Importante:
• Como alternativa, puede utilizar una curva de calibración de 4 puntos, descartando el calibrador Tg E.
• Los resultados semi-cuantitativos se presentan resultados en UI/mL, y la "frontera" (80 a 100 UI/mL)
se debe volver a probar.
• Muestras con valores elevados, mayor que el calibrador de Tg A, deben ser diluidas y volver a pasar la
prueba, cuyo resultado final en UI/ml se obtiene tras multiplicar por el factor de dilución.
VALIDACIÓN DEL TEST:
El test es válido si:
• La D.O. del "blank", que contiene solamiente lo diluyente de muestra, debe ser inferior a 0,3 a 450nm.
• Lo valor de la D.O. de lo Calibrador Tg A deben ser igual o superior a 1.0 , de lo contrario, la prueba
debe repetirse.
• Lo valor de la D.O. de lo controle negativosdeben ser inferior a 40 IU/mL
• Cuando se determina la determinación cualitativa, lo D.O. de lo calibrador Tg D debe ser mayor que el
20
D.O. del control negativo y menor que el D.O. del control positivo.
• Para determinaciones semi-cuantitativas, el control positivo debe tener valores en el rango indicado
en la etiqueta de la botella.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Para la interpretación de los resultados, se recomienda el siguiente valores de referencia:
Valores de Anticuerpos Anti -TG
< 80 UI/ml
80 - 100 UI/ml
> 100 UI/ml
Interpretación
Resultado Negativo
Resultado "Borderline"
Resultado Positivo
IMPORTANTE: 1. Los valores anteriores son sólo un guía para interpretación de los resultados. Es
recomendable que cada laboratorio establecer su propio rango de referencia.
VALORES ESPERADOS
Los valores esperados en una población normal es negativo. Sin embargo, 5-10% de aparentemente
pacientes sanos y asintomáticos pueden mostrar resultados positivos para auto-anticuerpos contra la
glándula tiroides. La incidencia de estos auto-anticuerpos aumenta con la edad.
La siguiente tabla muestra la incidencia de auto-anticuerpos contra la glándula tiroides en individuos
normales y en varias enfermedades autoinmunes.
Número de Pacientes
Número de Positivos
% de Positivos
Enfermedad de Graves
24
16
66,7%
Tiroiditis de Hashimoto
41
34
82,9%
Sospecha de Enfermedades de la tiroides
101
56
55,4%
Hipoacusia Autoinmune
10
0
0,0%
Artritis Reumatoide
18
1
5,5%
Lupus Eritematoso Sistémico
2
0
0,0%
104
4
3,8%
Condición
Individuos sanos normales
Los anticuerpos anti-tiroglobulina ocurren principalmente en enfermedad de Graves y la tiroiditis de
Hashimoto. Este auto-anticuerpo pueden ocurrir también en bocio nodular tóxico y en asociación con
otros trastornos autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST
En un estudio de 121 muestras de suero obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 57
eran positivos y 64 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de lo Imuno-ELISA AntiTG de WAMA en comparación con el Kit comercial.
Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100
Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100
RESULTADOS
Verdadero
Positivos
Falso
Positivos
Verdadero
Negativos
Falso
Negativos
Sensibilidad
(%)
Especificidad
(%)
57
4
60
0
100
93,75
Reactividad cruzada también se ha estudiado en individuos portadores de otras enfermedades
autoinmunes o reactivas para auto-anticuerpos, cuyos resultados se muestran en la tabla abajo:
21
Condición
Hipoacusia Autoinmune
Artritis Reumatoide
Lupus Eritematoso Sistémico
TOTAL
Número de Pacientes
10
18
2
30
Número de Reactivos
0
1
0
1 (3,3%).
PRECISIÓN DEL TEST:
a. Precisión Intraensayo
La precisión intraensayo se determiné mediante el ensayo 2 muestras de sueros, un reactivo y un noreactivo, en 20 replicas.
Especímenes
Reactivo
No reactivo
Número de Veces
Media UI/ml
Desviación Estándar
20
20
141,28
25,47
7,58
1,56
CV (%)
5,37%
6,12 %
b. Precisión Interensayo
La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestras de suero, un reactivo y otro no reactiva,
en 20 replicas, siendo 10 réplicas para cada lote y por operadores diferentes.
Especímenes
Reactivo
No reactivo
Número de Veces
20
20
Media UI/ml
140,40
25,13
Desviación Estándar
8,01
1,66
CV (%)
5,71%
6,62 %
LINEALIDAD
La linealidad de Imuno-ELISA Anti-TG es 12,6 - 640 UI/ml . Se recomienda para muestras con
valores superiores a la concentración calibrador Tg A se diluye y testeadas nuevamiente. Lo resultado
final se determina multiplicando el valor obtenido por el factor de dilución.
LÍMITE DE DETECCIÓN
Lo límite de detección de lo test se determinó como 12.6 UI/mL basado en 60 replicas del "blank" y 10
replicas para cada una de las seis muestras con bajos niveles de anticuerpos.
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
No se demostró una injerencia significativa de las siguientes sustancias en las concentraciones
indicadas: Hemoglobina (hasta 2 g/L), bilirrubina (hasta 342 µmol/L) y Factor reumatoideo (hasta 100
EU/mL), colesterol (hasta 13 mmol/L) y trygliceryde (hasta 37 mmol/L).
LIMITACIÓN DEL USO
• Lo test Imuno-ELISA Anti-TG de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y
especificidad. Sin embargo, debido a la posibilidad de falso resultado reactivos y interferencias con
otras enfermedades, resultados repetidamente reactivos siempre debe interpretarse con información
clínica del paciente con los resultados de otras pruebas de laboratorio.
• Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no
reactivo.
• La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
1. Los reactivos deben conservarse entre 2 - 8 ºC.
2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja
del kit.
22
3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa.
4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles.
5. Lo Imuno-ELISA Anti-TG de WAMA contiene material de origen humano, que se pusieron a
prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-HIV I e II, anti-HCV (excepto el Suero Control
Positivo) y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer
completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de
todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la
eliminación de estos materiales.
6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes.
7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20 - 25 ºC) antes de iniciar los tests.
8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata
después de su uso.
9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo.
10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación.
11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para
mantener las mismas condiciones del test.
12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad.
13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos.
14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales.
15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y
eliminación de los materiales.
TERMINO DE GARANTÍA
WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha
de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución,
la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se
responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones.
BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA
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various thyroid and non-thyroid diseases; relationships with thyroglobulin and thyroperoxidase
autoantibody parameters. Europ J Endocrinol; 141: 563-569, 1999.
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Paul Med; 120 (5): 146-51, 2002.
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1-9, 2003.
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Medicina (Buenos Aires); 64: 227-230, 2004.
5. Swain, M., Swain, T. and Mohanty, B.K.: Autoimmune Thyroid Disorders - An Update. Ind J Clin
Biochem; 20 (1): 9-17, 2005.
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2006.
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Antibodies in Women with Autoimmune Thyroid Disease. J Clin Endocrinol Metab; 96: E1466 –E1471,
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8. Joshi, S.R.: Laboratory Evaluation of Thyroid Function. DO Japi (Supplement); 59: 14-20, 2011.
Edição I: Rev. 12/2012