Extração de ADN: a molécula da vida!

Ciência em Três
Extração de ADN: a
molécula da vida!
Guia do Professor
Este trabalho foi licenciado com a Licença Creative Commons
Atribuição - NãoComercial - SemDerivados 3.0 Portugal.
Tem o direito de:
Compartilhar — reproduzir, distribuir e transmitir o trabalho
De acordo com as seguintes condições:
Atribuição - Tem de fazer a atribuição do trabalho, da maneira estabelecida
pelo titular originário ou licenciante (mas sem sugerir que este o apoia, ou que
subscreve o seu uso do trabalho).
NãoComercial - Não pode usar este trabalho para fins comerciais.
Trabalhos Derivados Proibídos - Não pode alterar ou transformar este trabalho,
nem criar outros trabalhos baseados nele.
No entendimento de que:
Renúncia - Qualquer uma das condições acima pode ser renunciada pelo titular do direito de
autor ou pelo titular dos direitos conexos, se obtiver deste uma autorização para usar o trabalho
sem essa condição.
Domínio Público - Quando a obra ou qualquer dos seus elementos se encontrar no domínio
público, nos termos da lei aplicável, esse estatuto não é de nenhuma forma afectado pela
licença.
Outros Direitos - A licença não afecta, de nenhuma forma, qualquer dos seguintes direitos:
• Os seus direitos de "uso legítimo" (fair dealing ou fair use) concedidos por lei, ou
outras excepções e limitações aplicáveis ao direito de autor e aos direitos conexos;
• Os direitos morais do autor;
• Direitos de que outras pessoas possam ser titulares, quer sobre o trabalho em si quer
sobre a forma como este é usado, tais como os direitos da personalidade ou o direito
à privacidade.
Aviso - Em todas as reutilizações ou distribuições, tem de deixar claro quais são os termos da
licença deste trabalho. A melhor forma de fazê-lo, é colocando um link para a página desta
licença.
Para ver uma cópia desta licença, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/pt/
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
Este Manual pretende auxiliar o(a) professor(a) na preparação prévia
da atividade Extração de ADN de Morango e na posterior execução em salade-aula/laboratório. Encontra-se organizado de forma a que o(a) professor(a)
possa:
1) RECORDAR alguns conceitos de Biologia que estão na base da atividade;
2) tomar nota do material que deverá PREPARAR e procedimentos que deverá
ter em conta antes de executar a atividade;
3) CONHECER os procedimentos experimentais que dizem respeito à atividade.
Pretende-se com esta atividade envolver ativa e autonomamente os
alunos na aprendizagem. Assim, sugerimos que o(a) professor(a) utilize métodos análogos aos do processo científico, de modo a:
ENVOLVER
Envolva os seus alunos, trabalhando as questões-chave que estão na origem
da atividade experimental, e que refletem os objetivos pretendidos. Capte os
conhecimentos prévios da turma, identifique potenciais erros de conceito e
incite a curiosidade para a descoberta de respostas às questões-chave.
SIMBOLOGIA
Chamada de atenção
EXPLORAR
Explore as questões-chave, experimentando com os alunos a atividade que
lhe propomos. Crie na turma um ambiente de aprendizagem por si-próprio,
garantindo que os alunos fazem realmente algo e participam ativamente
em todo o processo de experimentação. O(a) professor(a) não deve ser o
demonstrador mas o mediador/orientador das várias etapas de cada atividade.
Sugestão
Conceito teórico
Nota
Para pensar
Nota explicativa
Exercício
EXPLICAR
Num diálogo direto com a turma, dê lugar à discussão sobre os resultados
obtidos individualmente ou em grupo. Elabore formas para a apresentação
geral dos resultados permitindo que os alunos observem e expliquem os re-
Informação adicional
Website/ link
Referência bibliográfica
sultados da turma e, deste modo, elaborem conclusões finais, e as comuniquem à turma.
Guia do Professor
3
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
Nesta atividade os alunos aprendem um dos procedimentos experimentais mais comuns num laboratório de Biologia Molecular - a
extração de ADN de seres vivos. A atividade consiste na extração do
ADN de células de morango seguindo um protocolo experimental
análogo ao que é utilizado nos laboratórios, mas usando simplesmente reagentes e materiais disponíveis em casa.
ANO(S) ESCOLAR(ES)
Ensino secundário
LIGAÇÃO AO CURRÍCULO
Biologia
ÁREA CIENTÍFICA
Biologia Molecular
Palavras-chave
Células
ADN
Extração
Morango
Biotecnologia
DNA recombinante
Objetivos
1. Recordar e/ou explorar conhecimentos sobre o ADN como
constituinte básico das células de todos os seres vivos (desde o
Homem ao morango);
2. Recordar e/ou reforçar o conceito de ADN como a molécula
responsável pela transmissão da informação genética de geração
em geração;
3. Adquirir práaticas de laboratório;
4. Compreender e descrever as transformações físicas e químicas
que ocorrem em cada passo da extração de ADN.
5. Ordenar a sequência de passos que constituem o processo de
extração de ADN.
6. Relacionar a extração do ADN com a sua utilização em algumas
tecnologias de ADN recombinante: clonagem (em bactérias),
manipulação genética (de plantas, de mamíferos), biotecnologia,
sequenciação.
Material necessário (para uma extração):
•
•
•
•
•
•
1 saco de plástico (de congelar, ou de sandes);
1 morango fresco ou congelado;
10 mL de solução de extração de ADN (previamente preparada);
1 funil;
1 proveta / tubo de plástico limpo;
1 filtro de café ou 1 ou 2 camadas de gaze cortadas aos quadrados;
• Álcool etílico (pelo menos a 90%) gelado;
• 1 vareta de vidro ou um pau de madeira (palito);
• Um pedaço de cartolina preta.
Duração
Preparação do material e introdução da atividade aos alunos:
10 minutos
Extração do ADN:
10 minutos (por cada grupo de 5 alunos, no máximo)
Tempo total necessário:
20 a 60 minutos (dependendo do número de grupos formados)
4
Guia do Professor
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
RECORDAR
No texto seguinte encontram-se brevemente listados alguns conceitos-chave que serão
necessários para a realização desta atividade.
I. O ADN
Graças aos avanços científicos, hoje sabemos que o ADN está presente praticamente em todas as células de todos os organismos vivos: animais, plantas, bactérias e
fungos. E também em muitos vírus - organismos que precisam de infectar células para
se manterem vivos. Em todos, tem a mesma estrutura química.
• Nos Humanos, assim como na maioria dos vertebrados, os glóbulos vermelhos são
as únicas células que não têm ADN. (Nota: os eritrócitos de galinha têm vestígios
de DNA.)
• À exceção das bactérias e das arqueobactérias, é no núcleo das células que o ADN
se encontra distribuído e na forma de estruturas compactas, os cromossomas. Cada
cromossoma não é mais do que uma única molécula de ADN ligado e enrolado
em proteínas, as histonas.
As células estão
organizadas em compartimentos, os organelos, separados uns dos
outros por membranas e
alguns micrómetros de
distância e suspensos
num fluido de água, sal
e moléculas orgânicas,
o citoplasma; cada
organelo está especializado em desempenhar
uma determinada
função na célula, sendo
um desses, o núcleo, o
armazenador da informação genética.
• Cada célula dos diferentes seres vivos pode conter várias cópias de cada cromossoma: nos humanos existem duas cópias - as células são diplóides (à exceção dos
gâmetas femininos e masculinos - óvulos e espermatozóides - que contêm apenas
uma cópia de cada cromossoma - dizem-se haplóides); existem organismos com
4 cópias de cada cromossoma por célula - tetraplóides (como por exemplo, o
Em cada célula
sapo africano e a batata branca), e outros com oito cópias - octaplóides (como por humana existem cerca
de 2 metros de ADN.
exemplo, o morango).
• De organismo para organismo, o número total de cromossomas por célula varia. É
de notar que um organismo mais complexo, como o humano, não tem necessariamente mais cromossomas do que um organismo mais simples, como um morango.
Senão vejamos o exemplo: à exceção dos gâmetas, as células humanas contam 46
cromossomas (23 pares); já um morango tem 56 cromossomas em cada uma das
suas células.
• É nos cromossomas, mais especificamente no ADN, que se encontra armazenada a
informação que codifica a ‘vitalidade’ de cada um de nós, seres vivos. Ou, no caso
de alguns vírus, as instruções que permitem a sua replicação no hospedeiro que
infetam.
Recordar conceitos
da síntese proteica: transcrição e tradução
• Através de um processo complexo e finamente regulado, o ADN é continuamente
‘lido’ e codificado sob a forma de proteínas, assegurando dessa forma as funções
vitais das células.
• Apenas uma pequena parte do ADN, a correspondente aos genes, é codificada em
Guia do Professor
5
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
proteínas, sendo que a respetiva percentagem varia com a complexidade do
organismo. Por exemplo no humano, apenas ~ 1,5% do seu genoma (~ 25,000
genes) é expresso e codificado em proteínas. O restante ADN não é transcrito nem
traduzido em proteínas; no entanto, desempenha um importante papel na regulação
da expressão dos genes, nomeadamente na transcrição. Atua também na condensação
da cromatina e durante o processo de replicação do ADN.
Quimicamente,
todas as células são
constituídas por
macromoléculas (para
além de outras moléculas mais pequenas):
proteínas, lípidos,
hidratos de carbono e
ácidos nucleicos. Cada
uma destas classes
de macromoléculas
tem a sua função na
célula, podendo estar
envolvidas em diversos
mecanismos de sinalização, comunicação,
transporte, suporte,
expressão e regulação
II. Estrutura química do ADN
Quando Gregor Mendel, baseado nas suas experiências com a ervilheira,
estabeleceu os 3 princípios da transmissão dos caracteres hereditários (1865), ainda
nada se sabia sobre a existência do ADN (ou DNA, na sigla inglesa) e muito menos
conhecida era a sua composição e estrutura. Foi passado quase um século (1953) que
James Watson e Francis Crick descobriram a estrutura de dupla-hélice do DNA, sendo
descrita com as seguintes características (que ainda hoje prevalecem):
• A molécula de DNA tem uma estrutura tridimensional enrolada em forma de dupla hélice. As duas cadeias que a constituem estão unidas através de ligações de
pontes de hidrogénio entre nucleótidos complementares, estes por sua vez unidos
entre si por grupos fosfato.
• Cada nucleótido no DNA é composto por uma base azotada (adenina, timina, citosina ou guanina), um açúcar (desoxiribose) e um grupo fosfato, todos ligados por
ligações covalentes. As adeninas (A) de uma cadeia ligam-se sempre às timinas (T)
da cadeia complementar e as citosinas (C) emparelham sempre com as guaninas
(G) e vice-versa. É através de ligações de hidrogénio entre as bases azotadas, 2
ou 3 ligações dependendo do par de bases emparelhado, que as duas cadeias se
unem.
Todas as células
de um organismo têm
a mesma composição
genética. Em cada tipo
celular, é a ativação
(i.e., a transcrição) de
uns genes em deterimento de outros,
que vai determinar a
identidade da célula.
Por exemplo, uma célula
da pele é uma célula da
pele e não uma célula
nervosa porque os mesmos genes são expressos
(estão ‘ligados’) na
célula da pele mas não
são expressos (estão
‘desligados’ na célula
nervosa, e viceversa.
6
• Cada cadeia de DNA tem uma extremidade 5’ e outra 3’. Cada grupo fosfato liga
o carbono na posição 3’ de um açúcar ao carbono 5’ do açúcar seguinte. A informação contida na sequência de DNA (os genes e sequências reguladoras) lê-se da
extremidade 5’ para a 3’.
• As duas cadeias de DNA estão dispostas paralelamente e ‘correm’ em sentidos
opostos – dizem-se antiparalelas: o nucleótido da extremidade 5’ de uma cadeia
liga-se ao nucleótido da extremidade 3’ da cadeia complementar.
• A composição química das bases azotadas permite, através de ligações de
hidrogénio, que outras moléculas se liguem ao DNA, nomeadamente proteínas
importantes na sua replicação e na expressão dos genes.
III. Regulação da expressão génica
Os processos de regulação da expressão dos genes determinam a identidade e
funcionamento das células.
Guia do Professor
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
• Sequências de nucleótidos não-codificadores (p.ex. promotores e reguladores
situados a montante dos promotores) funcionam como locais de ligação a
proteínas (RNA polimerase, indutores e repressores) cuja interação com o DNA
determina a transcrição dos genes (a jusante dos promotores).
• Nos eucariontes existem outros mecanismos celulares que também regulam a
expressão génica. São eles: 1) o estado de condensação da cromatina – uma
maior ou menor condensação da cromatina aumenta ou diminui o acesso da
RNA polimerase ao promotor e, consequentemente, ativa ou inibe a transcrição
de um determinado gene; 2) o processo de excisão alternativa – a remoção
de diferentes intrões a uma mesma molécula de pré-mRNA -, permite que um
mesmo gene transcrito origine duas proteínas distintas.
IV. Mutações
• Qualquer dano, à estrutura química do DNA, se não for reparado, resultará na
perda da integridade e, potencialmente, da estabilidade da molécula. Alterações
na identidade dos nucleótidos resultam em mutações, com efeitos benéficos
ou prejudiciais para o indivíduo (ou ser vivo). Entre as mutações benéficas
incluem-se aquelas que conferem vantagens na adaptação ao meio ambiente
(p.ex. mutações que tornam bactérias resistentes a antibióticos). Várias doenças,
por outro lado, resultam diretamente de mutações, (p.ex. a anemia falciforme).
• Uma mutação nem sempre resulta num efeito no organismo. As células (eucarióticas e procarióticas) ao longo da evolução desenvolveram mecanismos
capazes de detetar e reparar os vários erros que podem ocorrer no DNA, sejam
eles provocados por condicionantes externas, como a radiação UV ou o fumo
do tabaco, ou factores internos, como erros na replicação do DNA durante a
divisão celular.
A membrana celular, que separa cada
célula do exterior, constitui uma dupla barreira
para a célula: por um
lado, mantém a integridade dos seus constituintes e, por outro,
impede os compostos
de passarem livremente
de e para a célula.
V. Extração de DNA e a Biotecnologia
A descoberta do DNA permitiu não só compreender como as células
regulam o seu metabolismo mas também como as características hereditárias são
transmitidas entre gerações. Para além das implicações diretas no conhecimento
da biologia das células, as conclusões de estudos do DNA têm permitido grandes
avanços na compreensão da genética de doenças. Paralelamente, tem possibilitado
o aparecimento de inovadoras práticas biotecnológicas com impacto relevante, não
só em procedimentos de investigação básica como aplicada - a Biotecnologia.
O sector da indústria farmacêutica, por exemplo, tem beneficiado de todo
o conhecimento desde que se descobriu o DNA e o código genético: hoje em dia é
possível, a partir do DNA, produzir grandes quantidades de proteínas importantes
para o tratamento de doenças, acessíveis a todos na forma de vacinas e/ou medicamentos. Repercussões semelhantes foram sentidas nas áreas do ambiente e agricultura.
Guia do Professor
Recordar:
Organismos geneticamente modificados;
Clonagem; Sequenciação
7
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
Isolar e purificar DNA de células animais ou plantas, de fungos ou bactérias
é tarefa diária dos investigadores em Biologia Molecular, quer para aqueles que
procuram compreender a origem de certas doenças humanas como os que, por
exemplo, procuram melhorar a produtibilidade de determinada planta. Através do seu
isolamento, os cientistas conseguem obter e estudar genes que de outro modo seriam
difíceis de aceder, devido às restrições impostas pela própria constituição química e
biológica das células.
Mais sobre ratinhos
knockout em http://
learn.genetics.utah.
edu/content/tech/transgenic/
1. Uma vez isolado o DNA os cientistas conseguem por deleção de determinado
gene inativar a função desse gene nas células. A inserção do gene mutado nas
células faz-se com a produção de organismos designados knockout (é comum
utilizar-se o ratinho, a mosca da fruta, bactérias e plantas). É assim que os cientistas
conseguem estudar o efeito daquele gene mutado no funcionamento das células.
2. Uma vez isolado o DNA é possível aumentar a função de determinado gene, quer
por inserção de cópias extra do gene ou por aumento da síntese da proteína por si
expressa. Desta forma, os cientistas conseguem analisar em maior detalhe a função
do gene.
A técnica comummente usada para extrair DNA é a prova viva de que, algures
na história recente da ciência, foram ultrapassadas as barreiras impostas pela célula
e que nos separavam do DNA. Desde que esta possibilidade surgiu, as técnicas de
biologia molecular foram melhoradas e novas foram introduzidas – Biotecnologia - ,
sendo hoje possível manipular, modificar, clonar e/ou multiplicar genes – Engenharia
Genética.
Outro tipo de técninas usadas em Biotecnologia:
• Técnica de DNA
recombinante
• Produção de
bactérias geneticamente modificadas
• Síntese de DNA
complementar
• Electroforese
• PCR
Prepare-se para explicar o que está acontecer ou o que significa cada passo durante a
extração de ADN do morango. Em baixo seguem as respostas às perguntas mais importantes.
1. Porquê utilizar morangos?
É possível extrair DNA de qualquer célula, animal ou vegetal, mas não com a
mesma facilidade. As plantas são excelentes fontes de ADN: existem, geralmente, em
numerosos lugares e em grandes quantidades. Para além disso, a maioria das plantas
possui oito cópias de cada cromossoma por cada célula (octoplóides), o que significa
que possui muito ADN - mais do que a maioria das células animais que têm apenas
duas cópias (diplóides) ou das células germinativas (óvulos e espermatozóides) que
têm apenas uma cópia (haplóides). Os morangos maduros, para além de possuírem
muito ADN, produzem pectinases e celulases, enzimas que ajudam a degradar a
parede celular.
2. Qual a função do detergente?
A solução de extração do ADN contém detergente: shampô ou detergente da loiça. As
membranas das células são formadas por lípidos, que são gorduras. Tal como acontece
quando lavamos loiça, o detergente atua na membrana das células e do envelope do
8
Guia do Professor
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
núcleo emulsionando as gorduras e destruindo as membranas. Este é um passo importante da atividade, não só porque rebenta as células e faz com que os organelos
circulem suspensos na solução (de água, sal e detergente) mas principalmente porque
permite que o DNA se liberte do núcleo, tornando-se assim mais acessível para o
passo seguinte.
3. Qual a função do sal?
O DNA é muito solúvel em água devido aos seus iões fosfato (molécula hidrofílica).
Para impedir que o DNA liberto do núcleo da célula se dissolva totalmente na solução
e se torne invisível, usa-se sal. O sal, cuja fórmula química é NaCl, quando em
solução dissocia-se em iões de Na+ e Cl-. Os iões Na+, com carga positiva, vão interagir com os fosfatos, com carga negativa das moléculas de DNA, tornando-as neutras
e estabilizadas, e permitindo a sua agregação. Deste modo, as muitas moléculas de
DNA das muitas células de um único morango triturado aglomeram-se para mais tarde
poderem ser visualizadas a olho-nu.
4. Porque se filtra o extrato?
A filtração permite eliminar da solução os restantes constituintes celulares e que só
“atrapalham”: os restos das membranas, os organelos que não rebentaram, etc. Assim,
a solução filtrada está tão pura quanto possível, contendo o DNA e outras moléculas,
como proteínas, que não interferem com o sucesso da extração.
5. Qual a função do álcool etílico?
Para finalmente se poder ver o DNA, usa-se álcool. Este desidrata as moléculas de
DNA, ou seja, afasta a água à sua volta retirando-as da solução. Ocorre precipitação
do DNA. O precipitado final vê-se como um conjunto de filamentos esbranquiçados.
Estes correspondem a milhares de moléculas de DNA, com muitas outras moléculas
associadas.
A preparação de DNA que se obtém tem um elevado grau de impureza: para além do DNA
das células do morango, contém também proteínas e outras macromoléculas.
A visualização da estrutura em dupla-hélice da molécula de DNA não é possível a olho-nu
e nem mesmo o microscópio mais potente consegue captar essa imagem. Só através de uma
técnica de cristalografia por difração de raios-X é possível obter imagens que revelam a sua
estrutura. Esta foi a mesma técnica que Rosalind Franklin (conhecida biofísica britânica) usou
quando, um pouco antes da publicação do modelo proposto por J. Watson & F. Crick, apresentou, junto da comunidade científica uma fotografia de um cristal de ADN. Foi nesta fotografia
que Watson e Crick se basearam em grande parte para construir o modelo teórico da dupla
hélice.
Guia do Professor
9
Ciência em Três
Extração de ADN: a molécula da Vida!
PROTOCOLO
1. Preparar a Solução de Extracção de DNA (1 litro):
•
•
•
100 mL de champô (sem amaciador) ou 50 mL de detergente de loiça
15 g de sal de cozinha (2 colheres de chá)
Água para perfazer um litro
2. Lavar o morango e tirar as sépalas (folhas verdes).
A atividade proposta foi planeada de
forma a ser realizada
com pequenos grupos
de alunos (máximo 5),
em esquema rotativo
mas sequencial.
3. Colocar o morango no saco e esmagá-lo com o punho durante 2 minutos.
4. Adicionar 10 mL da solução de extração de DNA ao conteúdo do saco.
5. Misturar tudo, apertando com as mãos, durante 1 minuto.
6. Colocar o extrato no funil (com o papel de filtro ou a gaze) e deixar verter o
líquido filtrante para o tubo até 1/8 do seu volume.
7. Adicionar o álcool, previamente gelado, ao tubo até perfazer metade do
volume do tubo
Manter o tubo ao nível dos olhos para ver o que acontece; o resultado é visível em
poucos segundos mas aconselhamos esperar entre 3 a 10 minutos e ir observando a formação do precipitado de DNA. Verá que à medida que o tempo passa mais precipitado
se forma.
8. Mergulhar a vareta de vidro ou o pau de madeira/palito no tubo, onde o
álcool está em contacto com o extrato (DNA precipitado).
9. Retirar uma amostra do DNA precipitado, ou todo o DNA, e observar a sua
textura viscosa e pegajosa.
10. Colocar a amostra num pedaço de cartolina preta e deixá-la secar ao ar
(durante o tempo necessário para que o álcool evapore).
11. Observar a estrutura do DNA: uma rede esbranquiçada que representa o
DNA de milhões de células digeridas de um único morango.
10
Guia do Professor
© Ciência em Três
FOLHA DE REGISTO INDIVIDUAL/ GRUPO
Nome da atividade:
Membros do grupo:
O que sabemos sobre
este tema?
O que ainda não sabemos
e queremos descobrir?
Como podemos
descobrir?
O que observámos?
O que aprendemos?