Manual Metodos de Tipagem

MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MOLECULAR
Artur Alves, Isabel Henriques, Ana Santos, Marta Tacão & António Correia
Tipagem Genética de Microrganismos
AVEIRO - 2003
A. ALVES, I. HENRIQUES, A. SANTOS, M. TACÃO & A. CORREIA
Tipagem Genética de Microrganismos
 Lab. de Diversidade Microbiana
Centro de Biologia Celular
Dep. de Biologia, U. de Aveiro
3810-193 Aveiro
Tel: 234.370778 • Fax 234.426408
http://sweet.ua.pt/~f426
i
Índice
Introdução
1
Protocolos experimentais
9
RFLP's - Ribotipagem
2
Extracção de DNA total bacteriano
9
Digestão de DNA com endonucleases de
Rep - PCR
Electroforese em campo pulsado
Sequências nucleotídicas
3
4
6
restrição
10
Transferência por vácuo
12
Marcação por PCR da sonda de DNA 16S
13
Hibridação e Detecção
14
Preparação de DNA em blocos de
agarose
16
Digestão de DNA embebido em agarose
17
Electroforese em campo pulsado
17
BOX-PCR
18
Ligação de produtos de PCR a vector
19
Transformação
19
Extracção de DNA plasmídico
20
Preparação de um gele de agarose
21
Referências
23
i
Introdução
A correcta identificação e classificação de microrganismos é de extrema importância
prática, não só no aspecto clínico mas também na fitopatologia, biotecnologia e estudos
ambientais.
Os métodos usados na discriminação de géneros, espécies e estirpes de microrganismos
podem ser divididos em métodos fenotípicos e genotípicos. Os métodos fenotípicos
baseiam-se em fenómenos bioquímicos, fisiológicos e biológicos, enquanto os métodos
genotípicos detectam polimorfismos ao nível dos ácidos nucleicos, ou variação alélica ao
nível de enzimas.
A tipagem de microrganismos, i.e., a capacidade de os identificar ao nível da espécie, e de
discriminar entre indivíduos da mesma espécie conheceu grandes avanços nos últimos
anos, tendo sido galvanizada por uma série de novos métodos que fazem uso da tremenda
variação encontrada no DNA destes microrganismos.
O desenvolvimento de técnicas moleculares de tipagem de microrganismos, abriu novas
possibilidades nos campos da classificação, identificação e diagnóstico. O conhecimento
sobre a filogenia e evolução dos microrganismos foi também grandemente ampliado.
Figura 1: Capacidade discriminatória de diferentes métodos
de tipagem genética de microrganismos.
Qualquer método de tipagem genética deve permitir a diferenciação clara de estirpes, e
principalmente, deve ter uma elevada reprodutibilidade. Nem todos os métodos
moleculares de tipagem são igualmente eficazes, diferindo nomeaedamente na capacidade
discriminatória em diferentes níveis taxonómicos (Fig 1). Como tal, a escolha do método
a ser aplicado deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida (e.g. identificação,
diferenciação), entre outros aspectos, (reprodutibilidade, poder discriminatório, custos
envolvidos, etc).
1
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RFLP’s - Ribotipagem
RFLP’s - “Restriction Fragment Length Polymorphisms”, polimorfismos de
tamanho de fragmentos de restrição
Este método tem por base a digestão de DNA com endonucleases de restrição (ER’s), e
posterior separação dos fragmentos obtidos por electroforese em gel de agarose,
originando padrões de restrição. Os padrões de restrição obtidos podem ser
característicos ao nível da espécie ou mesmo da estirpe, dependendo do grau de
heterogeneidade genómica intraespecífica. Este é um dos primeiros métodos de tipagem
de DNA utilizado para avaliar a relação entre estirpes.
A detecção de fragmentos comuns a estirpes pertencentes a uma mesma espécie, ou
mesmo perfis típicos de determinados grupos, tornam esta técnica de grande interesse
taxonómico. Assim, podem ser identificados fragmentos de restrição que passam a
funcionar como marcadores moleculares diagnosticantes, por exemplo ao nível da
espécie.
A técnica de RFLP´s apresenta como vantagens o facto de ser altamente reprodutível e
de não necessitar de informação prévia sobre a sequência de DNA. Recorre-se à
designação de RFLP’s directos quando se analisam directamente os perfis obtidos por
electroforese. Embora esta análise seja dificultada pelo elevado número de fragmentos, é
possível restringi-la a uma gama de pesos moleculares correspondentes à zona de maior
resolução do gel. Obviamente apresenta-se uma desvantagem, que é o facto de apenas
uma fracção do genoma ser analisada.
A combinação da análise de fragmentos de restrição com hibridação, usando sondas
específicas de modo a reduzir o número de bandas a analisar, é a versão mais utilizada
desta técnica. Como os genes de rDNA estão presentes em várias cópias no genoma, a
utilização dos rDNA’s como sondas permite detectar, após hibridação, vários fragmentos
de restrição (Fig. 2). Algumas sequências desta região genómica são altamente
conservadas que mesmo sondas heterólogas hibridam fortemente com elas, enquanto
outras regiões genómicas variam consideravelmente, mesmo entre níveis taxonómicos
próximos. Esta variante dos RFLP’s recebe a designação de ribotipagem.
Kb
M 1 2 3 4 5 6
23.1 –
9.4 –
6.6 –
4.4 –
2.3 –
2.0 ¯
0.6 –
Figura 2: Padrões de bandas resultantes de
ribotipagem. O DNA total das estirpes 1 a 6 foi
digerido com EcoRI e os fragmentos resultantes,
após separação electroforética, foram transferidos
para uma membrana de nylon. A hibridação com
uma sonda para rDNA 16S resultou nos padrões da
figura. 1 a 6 - estirpes de Brevibacterium linens; M
- marcador de peso molecular.
2
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rep-PCR
Método de tipagem baseado na amplificação via PCR de elementos de DNA
repetitivos presentes em genomas bacterianos.
A técnica de rep-PCR faz uso de “primers” complementares de sequências de DNA
repetitivas altamente conservadas, e presentes em múltiplas cópias nos genomas da
maioria das bactérias Gram-negativas e várias Gram-positivas. Três famílias de sequências
repetitivas foram identificadas, incluindo a sequência REP (“Repetitive Extragenic
Palindromic”) de 35-40 pb, sequência ERIC (“Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus”) de 124-127 pb, e o elemento BOX de 154 pb.
Estas sequências parecem estar localizadas em posições intergénicas distintas no interior
do genoma. Os elementos repetitivos podem estar presentes em ambas as orientações, e
os “primers” foram desenhados de modo a promover a síntese de DNA a partir da
repetição invertida nos REP e ERIC, e da subunidade boxA nos BOX, amplificando
assim regiões genómicas distintas localizadas entre os elementos repetitivos. Os
protocolos correspondentes são designados REP-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR, e repPCR colectivamente.
A amplificação com os “primers” REP ou ERIC pode ser efectuada com um só “primer”,
ou com um ou vários conjuntos de “primers”. No caso do elemento BOX utiliza-se um
único “primer” (Fig. 3). A aplicação de diferentes abordagens a uma amostra aumenta o
poder de discriminação.
Kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
12.0 -
5.0 -
2.0 1.0 -
0.5 -
Figura 3: Padrões obtidos por ampliação de
DNA total de várias estirpes do género
Brevibacterium com o primer BOX A1R. 1
a 6 - estirpes de B. linens; 7, 8 - estirpes de
B. casei; 9, 10 - estirpes de B. iodinum; M marcador de peso molecular.
O método de tipagem designado por rep-PCR é extremamente fiável, reprodutível,
rápido e altamente discriminativo. Esta técnica tornou-se uma ferramenta valiosa na
identificação e classificação de bactérias, e em estudos epidemiológicos de patogénicos de
humanos e fitopatogénicos .
3
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Electroforese em campo pulsado
PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis"
Com o advento da técnica de PFGE, que permite a separação de fragmentos de DNA de
grande tamanho (desde as centenas de quilobases até às megabases), surgiram novas
abordagens ao estudo da organização de genomas. A electroforese convencional limita a
análise de DNA a fragmentos que poderão ter no máximo, 20 a 50 kb, necessitando o
uso de agarose a muito baixa concentração para a separação de fragmentos de mais de 20
kb. Acima destes tamanhos, não há diferenças de mobilidade que permitam a separação
de fragmentos de acordo com o peso molecular.
Com a alternância periódica do campo eléctrico, as moléculas são permanentemente
forçadas a modificar a orientação em que se movem. Quanto mais longa for a molécula,
maior o tempo que necessita para que encontre uma orientação que favoreça o
movimento ao longo do gel. Estes são os princípios que determinaram a criação de
configurações que permitissem a aplicação de dois campos eléctricos, com diferente
orientação, a um gel de agarose.
Foram desenvolvidos aparelhos com diversos tipos de configurações de eléctrodos. O
sistema de campo eléctrico homogéneo, (CHEF, "contour-clamped homogeneous
electrical field") é actualmente o mais usado e apresenta uma série de eléctrodos dispostos
nos lados de um hexágono e com os dois campos eléctricos formando um ângulo de 120º
(Fig. 4). Ao longo de cada um dos lados do hexágono forma-se uma distribuição gradual
de potenciais, resultando num campo eléctrico homogéneo em todo o gel e,
consequentemente, carris perfeitamente rectos.
Este tipo de configuração é actualmente muito usada para tipagem de estirpes
bacterianas, nomeadamente bactérias entéricas. Outras aplicações, incluem a elaboração
de mapas físicos de pequenos genomas e a cariotipagem electroforética de pequenos
organismos eucariotas.
-
-
- --
- -
+
+
+
+
+ +
+ +
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
- -
-- --
-
+
+
+
+
+ +
+ +
Figura 4: Funcionamento do sistema CHEF. Os campos eléctricos
funcionam alternadamente segundo cada uma das diagonais do gel. Como
resultado, as moléculas de DNA migram num percurso rectilíneo ao longo
do gel.
4
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Os perfis de restrição obtidos com endonucleases de baixa frequência de corte (Fig. 5)
têm sido usados por diversos autores para diferenciar estirpes da mesma espécie. O
procedimento pode revelar-se interessante para análise de estirpes com interesse
comercial, para comparação de isolados ambientais com interesse agrícola, ou
inclusivamente encontrar aplicações na análise epidemiológica de isolados clínicos.
A electroforese de campo pulsado utiliza uma matriz de agarose, com o gel submerso
num tampão de alta força iónica, normalmente TBE. O ideal é correr o gel a uma
temperatura compreendida entre 12 e 15 ºC: temperaturas superiores originam bandas
mal definidas e a temperaturas muito baixas são necessárias electroforeses muito
prolongadas. A concentração de agarose ideal é de 1%, não apresentando concentrações
superiores qualquer melhoria na resolução.
Kb
1
2
3
4
600 365 200 -
100 50 -
Figura 5: Perfis de restrição PacI (TTAATTAA)
de Corynebacterium lactofermentum (3) e C.
glutamicum (4) resolvidos por PFGE. 1 Cromossomas de S. cerevisiae; 2 - concatâmeros
de DNA do fago ë.
Para moléculas de tamanhos na ordem de várias megabases, pode ser útil baixar a
concentração de agarose para valores da ordem dos 0.5% de modo a diminuir o tempo de
electroforese, embora com obtenção de bandas menos definidas.
Para separação de fragmentos lineares até 1 Mb, o potencial do campo eléctrico é em
geral de 6 V/cm. Para moléculas de grande tamanho como por exemplo cromossomas de
fungos, usam-se valores de 2 a 2.5 V/cm. As moléculas de DNA de topologia circular,
apresentam uma mobilidade em campo eléctrico pulsado que parece não depender
directamente do tempo de alternância de campo.
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Sequências nucleotídicas
Discriminação e/ou identificação através de sequências de DNA
A discriminação entre microrganismos superficialmente semelhantes pode também ser
efectuada através da determinação das sequências nucleotídicas de genes evolutivamente
conservados. Desta forma, é possível detectar diferenças subtis entre estirpes.
A sequenciação de DNA tem vindo a ser aplicada por exemplo, na epidemiologia
molecular de doenças bacterianas. Para esse efeito, utiliza-se a reacção de PCR para
amplificar os genes a sequenciar. As sequências alvo incluem genes para proteínas de
superfície, genes de resistência a antibióticos, "housekeeping genes" e mais
frequentemente, os genes codificando para rRNA 16S. Para cada situação pode ser
necessário determinar empiricamente qual o gene cuja sequenciação é mais indicada. Por
vezes, a sequenciação é usada em conjunto com outros métodos de tipagem,
nomeadamente PFGE, permitindo examinar a transferência horizontal de genes entre
estirpes da mesma espécie. Este método, embora mais dispendioso é muito útil para
identificar e discriminar microrganismos difícieis de cultivar.
O método pode ser aplicado a culturas complexas, em que por vezes alguns dos
componentes da população são difíceis ou impossíveis de cultivar. Para esse efeito, ujma
colecção de fragmentos representando a sequência-alvo e resultantes de amplificação por
PCR a partir de uma população mista, podem ser clonados num vector apropriado,
introduzidos em E. coli e após selecção dos transformantes, os insertos presentes em
diferentes clones são sujeitos à determinação da sequência nucleotídica.
AMOSTRA
Clínica, ambiental,
industrial
PCR
ii)
Ligação ao
Vector
Transformação
de E. coli
i)
Sequenciação
directa
Sequenciação
de insertos
Análise de sequências
Figura 6: Os dois procedimentos mais utilizados para caracterizar
sequências nucleotídicas com fins de identificação e/ou discriminação de
microrganismos.
i
6
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Assim são possíveis dois procedimentos alternativos (Fig. 6): i) amplificação por PCR e
sequenciação directa dos fragmentos amplificados, sem necessidade de clonagem; ii)
clonagem dos fragmentos amplificados procedendo-se depois à determinação da
sequências de insertos individuais. O primeiro procedimento é normalmente utilizado
para microrganismos em cultura pura e abundante, o segundo, para culturas mistas ou
para microrganismos de difícil cultivo.
LIGAÇÃO AO VECTOR
A ligação dos produtos de PCR é feita na presenca de DNA ligase e de um vector
apropriado. Existem vectores plasmídicos que replicam em E. coli particularmenbte
adequados à clonagem de fragmentos obtidos por amplificação por PCR A figura 7
apresenta o mapa de um desses vectores, pCR 2.1, da Invitrogen. O vector contém uma
regioão com múltiplos locais de restrição, genes de resistência a antibióticos para
seleccionar os transformantes que adquiriram o plasmídeo e um gene lacZ, cuja sequência
é interrompida pela presença de um inserto, passando o gene a ser não-funcional.
pCR ® 2.1: 3929 nucleotides
LacΖα gene: 1-545
M13 Reverse priming site: 205-221
Multiple Cloning Site: 234-355
T7 promoter: 362-381
M13 (-20) Forward priming site: 389-404
f1 origin: 546-983
Kanamycin resistance ORF: 1317-2111
Ampicillin resistance ORF: 2129-2989
pUC origin: 3134-3807
Figura 7: Mapa do vector de E. coli pCR 2.1, para clonagem de fragmentos de
DNA obtidos por PCR.
TRANSFORMAÇÃO
A transformação é o tipo mais simples de transferência de genes: uma célula receptora
adquire genes de moléculas de DNA solúveis no meio. É este o procedimento usado em
laboratório para transferir para E. coli o produto de uma reacção de ligação. O processo
de transformação, embora ocorrendo nos ambientes naturais, é optimizado no
laboratório com a preparação prévia das células: a cultura de E. coli a utilizar é tratada de
forma a ser tornada "competente", tornando-se mais eficiente na aquisição de DNA
exógeno.
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Após a transformação, as células são semeadas em placas de meio de cultura com agente
selectivo adicionado (um antibiótico, normalmente ampicilina ou canamicina, por vezes
ambos) e incubadas durante cerca de 18 horas a 37 ºC. Neste tipo de meio, apenas se irão
dividir as células que receberam vector. As células não transformadas, não terão
oportunidade de formar colónias. A diferenciação entre colónias contendo plasmídeo
com inserto das que contêm plasmídeo sem inserto é feita pela cor: branca e azul
respectivamente (Fig. 8). A coloração azul resulta da presença do composto X-Gal, que é
alterado pelo gene LacZ, como se de lactose se tratasse. Por isso, nas colónias em que a
presença de inserto interrompe o gene LacZ, não há lugar ao desenvolvimento de cor
azul.
Figura 8: Colónias brancas e azuis
resultantes do crescimento em meio
selectivo de E. coli transformada com um
vector com selecção pelo LacZ.
8
1
Protocolos Experimentais
Extracção de DNA total bacteriano
ü
ü
Genomic DNA purification kit MBI Fermentas
1.
Inocular meio TSB com uma colónia isolada e incubar a 37 °C com agitação,
durante 15 a 18 horas (”overnight ”).
2.
Transferir 2 ml de cultura para um microtubo e sedimentar as células centrifugando
5 min. à velocidade máxima (13 200 rpm).
3.
Retirar todo o sobrenadante.
4.
Ressuspender o sedimento em 200 µl de TE.
Procedimento utilizado para bactérias Gram -. Para bactérias Gram +, adicionar
lisozima (25 µ l de solução stock a 10 mg/ml; 1 hora a 37ºC).
5.
Adicionar 400 µl de solução de lise e incubar a 65 ºC durante 5 min.
6.
Adicionar 600 µl de clorofórmio e misturar por inversão (3 a 5 vezes).
7.
Centrifugar durante 3 min. à velocidade máxima.
8.
Preparar a solução de precipitação misturando 720 µl de água desionizada com 80 µl
de solução concentrada 10 vezes.
9.
Transferir a fase superior aquosa de DNA para outro tubo e adicionar 800 µl de
solução de precipitação.
10. Misturar suavemente à temperatura ambiente durante 1 a 2 min.
9
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11. Centrifugar durante 2 min. à velocidade máxima (13 200 rpm).
12. Remover o sobrenadante e dissolver o DNA em 100µl de solução de NaCl 1.2 M.
13. Adicionar 2 µl de solução de RNase e incubar a 37 °C durante 10 min.
ü
Solução stock de RNase a 10 mg/ml, previamente fervida.
14. Adicionar 300 µl de etanol absoluto, frio (-20 ºC).
15. Precipitar o DNA a –20 ºC durante 10 min.
16. Centrifugar durante 3 a 4 min. à velocidade máxima.
17. Descartar o etanol.
18. Lavar o sedimento com etanol a 70 %, frio (centrifugar 3 min. à velocidade máxima).
19. Desprezar o etanol e secar o DNA sedimentado.
20. Ressuspender o DNA em 100 µl de TE.
Digestão de DNA com endonucleases de restrição
ü
Que quantidade de DNA digerir?
O DNA digerido pode ter por destino apenas o registo da imagem do gel (gel
analítico) ou pode ser usado para extrair uma banda do gel de agarose (gel
preparativo). Em qualquer das situações é necessário que a(s) banda(s) sejam
visíveis ao UV após coloração pelo EtBr. Para este efeito, é necessário que cada
banda contenha pelo menos 50 ng de DNA.
Exemplo 1: digere um plasmídeo recombinante que inclui 3 kb de vector e 2 kb
de inserto; usa uma enzima de cuja acção resultam três fragmentos: o vector
linearizado (3 kb), o extremo 5' do inserto (0.5 kb) e o extremo 3' do inserto
(1.5 kb). A menor banda (0,5 kb) representa 1/10 do plasmídeo. Para visualizar
esta banda terá que digerir 10 x 50 ng ou seja, 500 ng de DNA (0.5 µ g). As três
bandas presentes no gel conterão 300 ng, 50 ng e 150 ng de DNA,
respectivamente. Serão claramente visíveis no gel e a banda maior deverá ter
uma intensidade 6 x superior à da banda menor.
Exemplo 2: digere o mesmo plasmídeo com uma enzima que efectua apenas
um corte. Se digerir 500 ng de DNA obtém uma banda no gel demasiado
intensa; o gel estará sobrecarregado. Demasiado DNA pode resultar num
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padrão de migração alterado, tornado difícil calcular as dimensões dos
fragmentos.
A. Protocolo típico:
1.
Marque os microtubos onde vai efectuar as digestões.
2.
Em cada microtubo prepare uma reacção do tipo da indicada na tabela I.
Tabela I: Reacção típica de digestão com enzima de restrição.
Volume
Tampão 10x
ddH2O
DNA a digerir
Enzima
3.
ü
ü
6.5 µl
2 µl
0.5 µl
Adicione primeiro o volume de água, depois o tampão.
ddH 2O: Água bidestilada; é conveniente misturar primeiro o tampão e a água. Se a
enzima for colocada directamente em água, pode desnaturar irreversivelmente.
4.
Dissolva bem o DNA a digerir.
5.
Adicione o volume de enzima.
Enzima: 0.5 a 1 µ l de enzima é em geral suficiente; não se deve usar um volume de
enzima superior a 10 % do volume final da reacção, já que as preparações comercias de
enzimas de restrição contêm glicerol, o qual, em excesso, pode inibir a reacção.
6.
ü
1 µl
Incubar a 37 ºC durante 3 a 5 horas.
A maioria das enzimas de restrição têm uma temperatura óptima de 37 ºC; no entanto,
existem enzimas que devem ser incubadas a temperaturas diferentes (25 º C, 50 ºC, etc.);
verificar as instruções do fabricante.
B. Precipitação do DNA após a digestão (opcional)
1.
No final da incubação, adicione 2, 5 volumes de EtOH a –20 ºC.
2.
Misture bem.
3.
Coloque o tubo a –20 ºC durante pelo menos uma hora.
11
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ü
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As digestões podem ser conservadas por períodos longos em EtOH a – 20 ºC.
4.
Centrifugue à velocidade máxima durante 10 a 15 minutos para recolher o DNA
precipitado.
5.
Seque totalmente de modo a eliminar todo o EtOH.
6.
Dissolva em TE.
Transferência por vácuo
Adaptado de Sambrook et al., 1989.
1.
ü
ü
Tratar o gel com solução despurinizante durante 10 minutos, com agitação suave.
O volume de solução deve ser suficiente para manter o gel submerso.
2.
Retirar a solução despurinizante e adicionar aproximadamente o mesmo volume de
solução desnaturalizante.
3.
Manter durante 30 minutos com agitação suave.
4.
Retirar a solução anterior e adicionar o mesmo volume de solução neutralizante.
5.
Manter durante 30 minutos com agitação suave.
6.
Entretanto cortar uma membrana de nylon cujas dimensões sejam superiores em 1
cm às dimensões do gel.
7.
Humedecer a membrana em água destilada.
8.
Colocar a membrana na unidade de transferência e efectuar a montagem do sistema
de acordo com as instruções do fabricante.
9.
Colocar suavemente o gel sobre a membrana.
Evitar que se formem bolhas de ar entre o gel e o filtro.
10. Com o auxílio de uma pipeta de vidro, deitar sobre o gel a solução de transferência
(SSC 20X).
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11. Transferir durante 60 minutos aplicando uma pressão de 50 mBar.
12. Retirar todo o líquido; remover o gel e, finalmente, a membrana.
13. Lavar o filtro em SSC 2X durante 5 minutos.
14. Secar e fixar o DNA durante 5 minutos num transiluminador de UV.
ü
Solução despurinizante: 0.25 N HCl
Solução desnaturalizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M NaOH
Solução neutralizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2; 1 mM EDTA
SSC 20x: 3 M NaCl; 0.3 M Citrato de sódio; pH 7.0
Marcação por PCR da sonda de DNA 16S
Durante as reacções de PCR a enzima Taq DNA polimerase tem a capacidade de
incorporar DIG-dUTP nas cadeias de DNA que são sintetizadas de novo.
ü
1.
Preparar a reacção de PCR de acordo com a tabela II.
Tabela II: Reacção de marcação por PCR (50 µl)
Quantidade
[ ] final
Variável
------
Tampão de PCR 10X, sem MgCl2
2.5 µl
0.5 X
Tampão de PCR 10X, com (NH4)2SO4
2.5 µl
0.5 X
MgCl2
6 µl
3 mM
PCR DIG Labeling Mix
5 µl
200 µM
Primer fd1
1.5 µl
0.3 µM
Primer rd1
1.5 µl
0.3 µM
H2O
DNA molde
Taq polimerase 1U/µl
variável, 50-100 ng
1 µl
1U
PCR DIG Labeling Mix (Roche): 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 1,9 mM dTTP
e 0,1 mM DIG-11-dUTP;
Primer fd1: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' ; Primer rd1: 5' AAG GAG
GTG ATC CAG CC 3' (Weisburg et al, 1991)
13
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2.
ü
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Após a reacção de amplificação, carregar 5 µl da reacção num gel de agarose, usando
marcadores de peso molecular adequados.
Apenas uma banda deve estar presente no gel de agarose após coloração com EtBr;
quantidades mínimas de produtos secundários podem resultar em sinais inespecíficos na
reacção de hibridação.
3.
Verificar a qualidade da reacção de amplificação e quantificar o DNA obtido.
4.
Caso necessário, purificar a banda a partir do gel de agarose.
Hibridação e Detecção
ü
ü
Pré-hibridação: O processo de pré-hibridação tem como objectivo bloquear locais de
ligação inespecíficos na membrana.
1.
Colocar a membrana num tubo de hibridação.
2.
Adicionar 20 ml de solução de hibridação por cada 100 cm2 de filtro.
Solução de hibridação: SSC 5X; Agente bloqueador 1 %; Sarcosil 0,1 %; SDS 0,02 %.
3.
ü
Manter à temperatura de hibridação durante 2 horas.
Hibridação: A temperatura de hibridação é estimada com base no tamanho da sonda
marcada e da percentagem de homologia esperada entre o DNA do fragmento sonda e o
DNA alvo. Geralmente para sondas 100 % homólogas, a hibridação deverá decorrer a 6568 ºC na ausência de formamida, ou a 42-45ºC na presença de 50 % de formamida.
4.
Desnaturar a sonda, fervendo durante 10 minutos.
5.
Colocar em gelo o tubo contendo a sonda.
6.
Desprezar a solução utilizada na pré-hibridação.
7.
Adicionar o mesmo volume de solução de hibridação na qual foi previamente
diluída a sonda marcada.
8.
Colocar no forno de hibridação, à temperatura de hibridação, durante 14-16 horas.
14
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9.
ü
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Após a hibridação, retirar a membrana.
A solução de hibridação pode ser reutilizada; para esse efeito, deve conservar-se a -20ºC.
10. Lavar a membrana em solução I, duas vezes, durante 5 min. à temperatura ambiente.
11. Lavar a membrana em solução II, duas vezes, durante 15 min. à temperatura de
hibridação.
ü
Solução I: SSC 2 X; SDS 0.1 %.
Solução II: SSC 0.5 X; SDS 0.1 %.
12. Após a hibridação e lavagens, equilibrar a membrana durante 5 minutos em tampão
de ácido maleico.
ü
Detecção: A detecção de sequências homólogas é efectuada com o Sistema DIG de
Marcação e Detecção Não-radioactiva de Ácidos Nucleicos (Roche).
13. Bloquear a membrana em solução bloqueadora durante 30 minutos.
14. Diluir o conjugado anti-digoxigenina-fosfatase alcalina (Roche) em solução
bloqueadora (1:5 000).
15. Remover a solução bloqueadora.
16. Incubar a membrana com a solução contendo anticorpos, durante 30 minutos.
17. Descartar a solução de anticorpos.
18. Lavar a membrana duas vezes, durante 15 minutos com tampão de ácido maleico.
ü
Estas lavagens permitem remover o anticorpo não ligado.
19. Equilibrar a membrana em tampão de detecção durante 5 minutos.
20. Entretanto, preparar a solução corante adicionando 200 µl de solução concentrada
de NBT/BCIP (Roche) a 10 ml de tampão de detecção.
21. Incubar a membrana com solução corante, na ausência de luz.
22. Observar periodicamente para verificar o desenvolvimento das bandas.
23. Parar a reacção lavando a membrana com água ou TE, quando o desenvolvimento
do sinal for satisfatório.
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Tampão de ácido maleico: ácido maleico 0.1 M; NaCl 0.15 M; pH 7.5
Solução bloqueadora: 1% de Agente bloqueador (Roche) em Tampão de àcido maleico
Tampão de detecção: Tris-HCl 0.1 M; NaCl 0.1 M; MgCl2 50 mM; pH 9.5
Preparação de DNA em blocos de agarose
Adaptado de Gautom, 1997.
ü
1.
Crescer a estirpe em meio TSB a 30 ºC, com agitação.
2.
Determinar a DO da cultura, e calcular o volume a utilizar de modo a usar na
preparação dos blocos 5 x 108 células/ml de agarose (considerar que no caso de
bastonetes 1 DO = 8 x 108 células).
3.
Sedimentar as células por centrifugação. Lavar em 1/10 de TE. Ressuspender em 500
µl de TE.
4.
Adicionar um volume de agarose de baixo ponto de fusão (preparada a 1 % em TE),
previamente aquecida a 42 ºC.
5.
Misturar e distribuir imediatamente por moldes. Deixar solidificar a 4 ºC.
6.
Colocar os blocos de agarose em 10 volumes de solução de lise. Incubar durante 24
horas a 37 ºC.
7.
Descartar a solução de lise e adicionar 10 volumes de solução EPS. Manter a 50 ºC
durante 24 horas.
8.
Incubar os blocos em TE 2 x 1 hora, com agitação suave.
9.
Conservar os blocos em 20 mM Tris-HCl pH 8.0; 50 mM EDTA, a 4 ºC.
Solução de lise: Lisozima 1 mg/ml; Tris-HCl pH 7.2, 10 mM; NaCl 50 mM; EDTA 100
mM; Deoxicolato sódico 0.2 %; Sarcosil 0.5 %
Solução EPS: EDTA, pH 8.0, 100 mM; Sarcosil 1 %; Proteinase K 50 µ g/ml
TE: Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM
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Digestão de DNA embebido em agarose
ü
Utilizam-se enzimas de restrição que reconhecem sequências pouco frequentes, de modo
a obter fragmentos de DNA de grande tamanho. Na preparação das reacções de hidrólise
devem ser tomadas precauções de forma a evitar a quebra do DNA embebido em
agarose.
1.
Colocar o bloco a digerir em TE, durante 2 horas a 4 ºC.
2.
Retirar o TE e adicionar 1 ml de tampão de digestão; manter 2 horas a 4 ºC.
3.
Renovar o tampão de digestão até um volume final de cerca de 100 µl.
4.
Adicionar 10 a 25 U de enzima.
5.
Manter 12 a 16 horas a 4 ºC.
6.
Incubar à temperatura recomendada para cada enzima durante 3 horas.
7.
Retirar o tampão e adicionar 500 µl de TE.
8.
Lavar durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação.
9.
Carregar o bloco tratado no gel ou renovar o TE e conservar a 4 ºC
Electroforese em campo pulsado
1.
Preparar o gel TBE 0.5 X e com uma concentração de agarose de 1%.
2.
Ajuste a temperatura do sistema de arrefecimento do aparelho para uma temperatura
entre os 10 e os 14 ºC.
3.
Carregue os blocos de agarose digeridos nos poços do gel, com o gel fora da tina.
4.
Selar os poços com agarose de baixo ponto de fusão.
5.
Coloque o gel na tina e ajuste as condições de electroforese.
6.
Verifique a temperatura do tampão e a sua circulação na tina.
7.
Inicie a corrida.
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BOX-PCR
1.
Preparar a reacção de amplificação de acordo com a tabela III:
Tabela III: Reacção para BOX-PCR (50 µl)
Volume
[ ] final
H2O
variável
10x PCR buffer sem MgCl2
2.5 µl
0.5 x
10x PCR buffer com (NH4)2SO4
2.5 µl
0.5 x
MgCl2
6 µl
3 mM
dNTP’s
5 µl
200 µM
Primer BOX A1R *
2 µl
0.4 µM
DNA molde
variável (50-100 ng)
Taq polimerase 1 U/µl
1 µl
1U
* Primer BOX A1R - 5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3'
(Versalovic et al, 1994)
2.
ü
Proceder à amplificação por PCR.
Perfil de temperatura para a amplificação:
desnaturação inicial de 7 min. a 95 ºC;
30 ciclos: desnaturação a 94 ºC, 1 min.; “annealing” a 53 ºC, 1 min.; extensão a
65 ºC, 8 min;
extensão final de 16 min. a 65 ºC. No final, manter os tubos a 4 ºC.
3.
Observar uma alíquota de cada reacção de PCR num gel de agarose a 1% em TAE
1X.
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Ligação de produtos de PCR a vector
1.
Num microtubo preparar a reacção de ligação, segundo a composição indicada na
tabela IV.
Tabela IV: Reacção de ligação de produtos de PCR.
Quantidade
Vector pCR 2.1 (25 ng/µl)
2 µl
Produto de PCR
0.5 a 1 µl
Tampão de ligase 10x
1 µl
Ligase do fago T4
4U
dH2O estéril
até volume final de 10 µl
2.
Incubar a reacção a 14 ºC durante 12 a 16 horas.
3.
A reacção pode ser imediatamente utilizada ou armazenada a -20 ºC.
1.
Descongelar em gelo uma alíquota (50-200 µl) de células competentes de E. coli.
2.
Adicionar 2-10 µl da reacção de ligação às células competentes misturando
suavemente.
3.
Manter em gelo por 30 minutos.
4.
Submeter as células a um choque térmico durante 30 segundos a 42 ºC.
5.
Colocar novamente em gelo durante 2 minutos.
6.
Adicionar 250 µl de meio SOC.
7.
Incubar durante 1 hora a 37 ºC e com agitação.
8.
Semear 10-200 µl da transformação em placas de meio LA suplementado com o
antibiótico adequado, e quando necessário X-Gal e IPTG.
9.
Incubar as placas a 37 ºC durante 15 a 18 horas.
Transformação
10. Com palitos estéreis, replicar clones positivos para uma nova placa.
11. Proceder a caracterização do DNA plasmídico dos transformantes.
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X-Gal: solução stock preparada a 20 mg/ml em dimetil-formamida; usar a 40 µ g/ml
IPTG: solução stock preparada a 100 mM, em água; usar a 0.05 mM
Extracção de DNA plasmídico
ü
ü
1.
Inocular uma colónia com um palito estéril em 1.5 ml de meio LB, suplementado
com o antibiótico adequado.
2.
Incubar a 37 ºC durante 15 a 18 horas, com agitação.
3.
Sedimentar as células por centrifugação, a 14 000 rpm, durante 5 minutos.
4.
Ressuspender em 350 µl de STET.
5.
Adicionar 10 µl de solução de lisozima.
Solução de lisozima preparada a 10 mg/ml
6.
Deixar a lisozima actuar 1 minuto.
7.
Colocar o microtubo em água a ferver durante 45 segundos.
8.
Centrifugar 5 minutos a 14 000 rpm.
9.
Retirar o sedimento com um palito estéril.
O sedimento é constituído por resíduos celulares e DNA cromossómico.
10. Adicionar 1 volume de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M, pH
5.2.
11. Misturar e manter à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar o
DNA plasmídico.
12. Centrifugar a 14 000 rpm, 5 minutos.
13. Lavar o precipitado com etanol a 70 %.
14. Ressuspender em 30 µl de TE.
ü
STET: 0.1 M NaCl; 5 % Triton X-100; 10 mM Tris-Hcl, pH 8.0; 1 mM EDTA
TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA
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Preparação de um gel de agarose
ü
Para um gel a 0.7 % com um volume de 100 ml
1.
Pesar 0.7 g de agarose (Fig. 9-A).
2.
Com uma proveta (Fig. 9-B), medir 100 ml de tampão (TAE ou TBE).
3.
Num Erlenmeyer misturar a agarose e o tampão (Fig. 9-C).
A
B
C
Figura 9: A - Pesagem da agarose. B - Medição do volume apropriado do tampão.
C - A agarose não solubiliza no tampão, formando uma solução turva.
4.
Ferver num forno de micro-ondas até clarear a solução (Fig. 10-A).
5.
Entretanto, efectuar a montagem da plataforma do gel e do respectivo pente (Fig 10B).
A
B
Figura 10: A - Uso do micro-ondas para solubilizar a agarose; B- Preparação
da plataforma para o gel, com o respectivo pente.
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6.
Esperar que a temperatura da agarose baixe até cerca de 50 º C.
7.
Verter a agarose na plataforma (Fig. 11-A).
8.
Deixar solidificar à temperatura ambiente.
9.
Colocar o gel na tina, submergido em tampão.
A
B
C
Figura 11: A- Vertendo a agarose na plataforma; B - O pente é retirado com o
gel já submerso em tampão, dentro da tina (C).
10. Retirar o pente (Fig 11-B, C).
11. Adicionar tampão de carga às amostras (Fig. 12-A).
12. Carregar o gel, uma amostra em cada poço. (Fig 12-B).
A
B
Figura 12: A - Adição do tampão de carga, normalmente
contendo corantes azuis; B - Carregando uma amostra.
13. Ligar a tina à fonte, tendo em atenção a polaridade correcta.
14. Ajustar a voltagem e iniciar a corrida.
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15. Seguir a evolução da corrida através da migração dos corantes presentes no tampão
de carga.
16. Terminada a electroforese, retirar o gel.
17. Corar com EtBr (5 ìg/ml) durante cerca de 15 minutos.
18. Observar num transiluminador de UV.
19. Registar os resultados, fotograficamente ou com um sistema de análise de imagem.
ü
TAE: 40 mM Tris-HCl; 5 mM acetato de sódio; 2 mM EDTA; pH 8.0
TBE: 90 mM Tris-HCl; 90 mM ácido bórico; 2 mM EDTA; pH 8.3
Tampão de carga (6X): 0.02 % azul de bromofenol; 0.02 % xileno cianol; 60 % sacarose;
0.025 M EDTA
EtBr: Brometo de etídeo. Solução stock a 500 ìg/ml, em água.
Referências
Gautom R.K. 1997. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing of
Escherichia coli O157:H7 and other gram-negative organisms in 1 day. Journal of
Clinical Microbiology 35:2977–2980.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning - a laboratory manual.
2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Versalovic J.,Schneider M.,de Bruijn F.J., Lupski J.R. 1994. Genomic fingerprinting of
bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in
Molecular and Cellular Biology 5:25-40.
Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lupski J.R. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173:697-703.
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