vývoj a súčasné trendy pri príprave nanoštruktúrovaných biosenzorov

vývoj a súčasné trendy pri príprave nanoštruktúrovaných biosenzorov

Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
VÝVOJ A SÚČASNÉ TRENDY PRI PRÍPRAVE NANOŠTRUKTÚROVANÝCH
BIOSENZOROV
né rozdeliť na viac skupín z rôznych hľadísk. Najbežnejšie
je delenie na základe typu fyzikálneho prevodníka4:
 elektrochemické (ampérometrické, konduktometrické,
potenciometrické, impedimetrické), založené na zmene prúdovej odozvy pri konštantnom potenciály (aj
opačne) alebo vodivosti, resp. odporu,
 optické, využívajúce v súčasnosti najmä zmenu vlastností elektromagnetických vĺn – napr. povrchová plazmónová rezonancia; (z angl. Surface Plasmon Resonance – SPR); meranie chemiluminiscencie, fluorescencie, či indexu lomu5,
 hmotnostné (akustické, piezoelektrické), založené na
zmene frekvencie oscilácie piezoelektrického kryštálu
v závislosti od zmien na povrchu prevodníka (napr.
naviazanie antigénu na protilátku)6,
 entalpické (pri endotermických alebo exotermických
dejoch), s využitím teplotného senzora6,
 FET (Field-Effect Transistor, tranzistory ovládané
poľom) biosenzory, pozostávajúce z dvoch elektród
(tzv. gate), pričom tok prúdu medzi nimi je závislý na
vlastnostiach prostredia medzi nimi (typ materiálu,
jeho vodivé vlastnosti, príp. či je matrica obohatená
o vodivé nanočastice), ale aj od množstva analytu
uchyteného na povrchu tejto matrice7.
Ďalšie rozdelenie je možné napr. na základe rôznych
biorozpoznávacích elementov – na enzýmové biosenzory
(najpočetnejšie), imunosenzory (s imobilizovanými protilátkami, ako veľmi početná skupina tzv. afinitných biosenzorov), biosenzory využívajúce hormóny, biomimetické
receptory (biozložky napodobňujúce činnosť skutočných
biologických receptorov; zaraďuje sa sem aj technológia
molekulových odtlačkov – polymerizácia v prítomnosti
analytu a jeho následné vyplavenie z matrice, čím vzniká
kavita, tzv. MIP (molecular imprinting) technológia alebo
celobunkové biosenzory (obyčajne najstabilnejšie)810.
Potenciálne využitie majú aj genosenzory, napr. pri štúdiu
mutácií, alebo sekvenčného polymorfizmu, a to aj
s využitím „label-free“ techník na detekciu11. Včasná diagnostika ochorení je dominantnou oblasťou bioanalytickej
chémie v súčasnej dobe. Hybridizácia a následná optická,
alebo elektrochemická detekcia hľadanej DNA predstavuje
citlivý spôsob odhalenia niektorých ochorení či patogénov.
Aj za týmto účelom sa vyvinuli krátke molekuly DNA
(DNA aptaméry), na jednom konci modifikované fluorofórom, na druhom konci zhášačom, vytvárajúce slučku
(loop), pričom oba konce vlákna sú spojené pomocou
komplementárnych báz. Pri hybridizácii týchto tzv.
„molecular beacons“ (majáky) s cieľovou molekulou sa
fluorofór dostane z dosahu zhášača, čím sa vytvára optický
signál. Ich využitie je možné pri štúdii degradácií bakteriálnych transkriptov, expresie niektorých génov, či detekcii patogénov ako Bacillus anthracis či Listeria
monocytogenes12.
TOMÁŠ BERTÓK, JANA ŠEFČOVIČOVÁ,
PETER GEMEINER a JÁN TKÁČ
Oddelenie glykobiotechnológie, Chemický ústav, Slovenská akadémia vied, Dúbravská cesta 9, 845 38 Bratislava
[email protected]
Došlo 1.4.11, prepracované 18.7.11, prijaté 2.9.11.
Kľúčové slová: biosenzor, nanočastice, nanorúrky, samousporiadaná monovrstva, nanotechnológie
Obsah
1.
2.
3.
4.
Úvod
Techniky imobilizácie selektora na povrch biosenzorov
Značené a neznačené detekčné koncepty
Moderné nanotechnológie ako nástroj pre modifikáciu
povrchov
4.1. Praktické aplikácie nanomateriálov v súčasných
technológiách
4.1.1. Nanočastice
4.1.2. Bio-čiarové kódy (bio-bar codes) 4.1.3. Uhlíkové nanomateriály
4.1.4. Kvantové bodky (quantum dots)
5. Záver
1. Úvod
Rôzne aplikačné technológie analytickej chémie prenikajú do najrôznejších oblastí súčasného výskumu, priemyslu či klinickej diagnostiky. Jedna zo sľubných oblastí
bioanalytickej chémie, ako veľmi potrebného interdisciplinárneho odboru, je príprava biosenzorov. Ich praktické
využitie je v súčasnosti široké a stále sa objavujú nové
konštrukčné metódy, resp. aplikačné spôsoby ich využitia.
Biosenzor je zariadenie využívajúce špecifické biochemické reakcie alebo interakcie, sprostredkované izolovanými
biomolekulami, organelami, celými bunkami alebo
tkanivami/pletivami na detekciu rôznych analytov1. Biosenzor má principiálne tri základné časti2,3: biorozpoznávací element (biomolekula  bioselektor, ktorý špecificky
interaguje so skúmaným analytom, čím sa podieľa na tvorbe biologického signálu), ktorý je v úzkom kontakte s fyzikálnym prevodníkom (transducer; premieňa biologický
signál na merateľný, fyzikálny signál) a napokon detektor
vyhodnocujúci daný fyzikálny signál. Biosenzory je mož-
174
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
tieto analytické metódy na metódy využívajúce značenie
pomocou špecifických molekúl (label), a metódy bez značenia (tzv. label-free)7. Typickým príkladom proteínovej
analýzy pomocou značenia je ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay), s využitím optickej (fluorescencia,
chemiluminiscencia) alebo elektrochemickej detekcie7.
Fluorescenčné metódy dosahujú veľmi vysokú citlivosť
(nM – fM detekčné limity)7. Pomerne časté je tiež značenie pomocou biotinylácie proteínu (využitie vysokej afinity biotínu k avidínu, ktorý môže byť značený chrenovou
peroxidázou (horse-radish peroxidase – HRP), prípadne
inou značkou)21. V súčasnosti však väčší význam nadobúdajú tzv. „label-free“ spôsoby detekcie analytu,
v súvislosti s týmto trendom aj tzv. „label-free“ biosenzory, a to s rôznymi spôsobmi detekcie (elektrochemické
metódy, SPR, piezoelektrické metódy ako Quartz Crystal
Microbalance (QCM), atď.)2224. Pre analýzu biomolekúl
sa v súčasnosti využíva hmotnostná spektrometria (MS),
schopná detekovať pM koncentrácie niektorých rakovinových markerov, SPR (detekčný limit na úrovni nM koncentrácií), prípadne AFM (Atomic Force Microscopy, pre
detekciu proteínových interakcií)7. Často využívané sú
práve elektrochemické metódy vzhľadom na vysokú citlivosť. Obmedzenia vznikajú pri konštrukcii elektrochemických imunosenzorov, nakoľko protilátky a antigény sa
bežne nesprávajú ako redoxní partneri, čo sa ale
v súčasnosti
obchádza
aplikáciou
nanomateriálov
(vodorozpustný grafén, derivatizovaný chitozán, zlaté
nanočastice, uhlíkové nanorúrky)25,26.
Medzi často využívané techniky pri elektrochemických metódach „label-free“ detekcie patrí využitie SAM
na povrchu najmä zlatých elektród, s využitím elektrochemickej sondy, akou je napr. ferocén. Časté je využitie ferocenyl alkántiolových prób pri práci so zlatými elektródami, a to už niekoľko rokov, nakoľko tiolová skupina sa
vyznačuje veľmi vysokou afinitou k zlatým povrchom
(vďaka vysokému rozdielu elektronegativít). Podobne je to
aj v prípade aminoskupiny2731. Medzi ďalšie redoxné
sondy podliehajúce elektrochemickej premene, patrí napr.
3,3’,5,5’-tetrametylbenzidín (TMB), ktorý sa môže použiť
napr. v kombinácii s nafiónom na elektródach zo skleného
uhlíka (glassy-carbon)32. V prípade TMB dochádza
k dvom následným stratám elektrónu a premene dvoch
aminoskupín v molekule TMB na iminoskupiny. Ďalšou
elektrochemickou próbou možu byť deriváty chinónu
(v prípade zlatých elektród merkaptochinón)33. Ferocenyl
alkántiolové próby však poskytujú vysoko stabilný
a reprodukovateľný systém3437 na meranie zmien elektrochemických vlastností na povrchu zlatých elektród, pričom
v určitom
rozmedzí
potenciálov
dochádza
k elektrochemickej premene – oxidácii ferocénu na
ferocínium38. Tento proces môže prebiehať pri rôznych
hodnotách potenciálov v závislosti od druhu a koncentrácie iónov v prostredí39,40. Odozva vyvolaná týmto dejom
sa navyše mení v závislosti od ďalších látok nasorbovaných na vopred pripravenú SAM vrstvu41, čo je možné
využiť pri konštrukcii elektrochemických biosenzorov
a sledovaní ich interakcií s analytom. Recyklácia zlatých
2. Techniky imobilizácie selektora na povrch
biosenzorov
Kľúčovým krokom v procese prípravy biosenzora je
práve stabilizácia biologickej zložky na jeho povrchu, ako
najcitlivejšej časti biosenzora  jej imobilizácia na vopred
upravený povrch. Vo všeobecnosti možno tieto techniky
zhrnúť do troch bodov, pričom využitie jednotlivých metód závisí od účelu a chemickej povahy imobilizovanej
biomolekuly14:
a) Adsorpcia (nekovalentné viazanie) predstavuje
najjednoduchší, a zároveň lacný spôsob imobilizácie. Ide
o využitie rôznych interakcií, najmä však o hydrofóbne
interakcie (v prípade látok s hydrofóbnym povrchom 
lipázy)15.
b) Kovalentné viazanie látok na daný povrch predstavuje stabilnejší, a teda reprodukovateľnejší systém oproti
nekovalentnému viazaniu. Ako veľmi spoľahlivý spôsob
chemickej sorpcie selektora na povrch biosenzora sa ukázala byť príprava tzv. samo-usporiadaných monovrstiev
(angl. self-assembled monolayers, SAM´s), umožňujúca
kontrolu nielen hustoty, ale aj orientácie biorozpoznávacieho elementu v imobilizačnom procese16, čo je veľmi
výhodné najmä pri imobilizácii protilátok. Následne je
možné využiť niektoré funkčné skupiny tejto monovrstvy
(derivatizácia nosiča s exponovanými aminoskupinami,
aktivácia s glutaraldehydom a následné viazanie enzýmu
priamo kovalentne cez voľnú aminoskupinu (napr.
v lyzínovom zvyšku), prípadne aktivácia karboxylovej
skupiny a kovalentné viazanie proteínu cez aminoskupinu
pomocou N-(3-dimetylaminopropyl)-N’-etylkarbodiimid
hydrochloridu (EDC) a N-hydroxysukcínimidu (NHS))
(cit.17,18).
c) Upevnenie v matrici, väčšinou z polymérnych materiálov, ktoré však v určitých prípadoch môžu pôsobiť
ako difúzna bariéra pre sledovaný analyt, a tým znížiť
rýchlosť odozvy14.
Povrch je možné upraviť aplikáciou niektorých nanomateriálov (ktorých voľba závisí od požadovaných vlastností daného povrchu a od jeho stability), pričom dôjde
k prudkému
nárastu
imobilizačného
povrchu,
a v niektorých špeciálnych prípadoch k zlepšeniu vlastností povrchu či k zvýšeniu citlivosti (napr. pri aplikácii zlatých, resp. strieborných nanočastíc pri optických biosenzoroch)19,20.
3. Značené a neznačené detekčné koncepty
Detekcia biomolekúl z biologických vzoriek má zásadný význam pri štúdiu a diagnostike niektorých ochorení
(napr. štúdium proteínov krvného séra u pacientov
s rakovinou prostaty, pankreasu či pľúc pomocou protilátok). Analýza DNA pomocou DNA microarray je pomerne
zaužívanou metódou. Význam má však najmä analýza
proteínov, čo vyplýva aj z porovnania ľudského genómu
(približne 22 000 génov) a proteómu (predpoklad vyše
milión molekúl proteínov). V princípe je možné rozdeliť
175
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
povrchov sa uskutočňuje tzv. reduktívnou desorpciou tiolov (pri vysokej hodnote pH a negatívnom potenciáli)42.
Existujú i početné aplikácie ferocénových derivátov
v podobe polymérnych matríc, umožňujúcich rovnako
imobilizáciu selektora (oproti SAM vrstvám však neposkytujú možnosť kontrolovanej orientácie bioselektora).
Takýmto prípadom je využitie ferocénom derivatizovaného chitozánu (Cs-Fc) aplikovaného na zlaté nanočastice
pre prípravu imunosenzora na Hepatitis B povrchový
antigén43, alebo imobilizáciu glukózaoxidázy (GOx)44,
prípadne uzavretie GOx do Cs-Fc trojdimenzionálneho
hydrogélu spolu s viac-stennými uhlíkovými nanorúrkami
(MWCNT´s), ktorých prítomnosť zvyšuje vodivosť celého
systému45.
lyzátor cyklických redoxných procesov v meracom roztoku, ktoré umožnili merať zmeny vlastností na povrchu
elektródy v dôsledku viazania analytu zo vzorky53. Ďalšie
možné využitie zlatých nanočastíc je sprostredkovanie
elektrického kontaktu medzi elektródou a redoxnými enzýmami (napr. enzým GOx, s využitím rôznych ditiolov pre
upevnenie Au-NP´s na zlaté povrchy). Au-NP´s sa môžu
značiť nukleovými kyselinami s určitou katalytickou aktivitou. Takto značené Au-NP´s sa viažu na analyt uchytený
na komplementárnu sekvenciu nukleovej kyseliny (napr.
tiolového derivátu DNA), upevneného na povrch zlatej
elektródy54. Okrem značenia uhlíkových nanorúrok zlatými časticami, sa v rôznych prácach vyskytli aj iné povrchy
pre imobilizáciu Au-NP´s, ako silikón, boron nitridové
nanorúrky, a v niektorých prípadoch aj syntetické polyméry (napr. komerčne dostupný, modifikovaný polystyrén,
ktorého priemer častíc bol až 340 nm)55. Navyše sa preukázal pozitívny efekt Au-NP´s na biomolekuly počas imobilizácie bioselektora na povrch elektródy, ktoré nestrácajú
svoju biologickú aktivitu. Zároveň sa dokázalo, že môžu
zohrať kľúčovú úlohu pri konštrukcii elektrochemických
imunosenzorov. Ich hlavným znakom je vysoký pomer
povrchu k objemu, vysoká povrchová energia, schopnosť
priamo sprostredkovať komunikáciu medzi elektródou
a redoxným enzýmom, ale zároveň sa preukázali ich katalytické vlastnosti, napr. pri elektrokatalýze redoxných procesov molekúl ako H2O2, O2 alebo NADH, ktoré sa zúčastňujú mnohých biochemických procesov. Príklady imobilizácie enzýmov na Au-NP´s nanoštruktúrované povrchy sú
napr. enzým GOx (senzor pre glukózu), alkoholdehydrogenáza (pre etanol), HRP (pre H2O2), laktátdehydrogenáza
(pre kyselinu mliečnu), príp. xantínoxidáza, alebo tyrozináza (pre detekciu fenolických zlúčenín vo víne, alebo
v odpadných vodách)56. V prípade imunosenzorov je to
napr. biosenzor pre detekciu IgG z ľudského séra, IL-6
senzor, senzor pre detekciu progesterónu v mlieku, alebo
aflatoxínu B1. Rovnako využívané sú zlaté nanočastice pri
konštrukcii biosenzorov s imobilizovanou DNA, pričom
upevnenie zlatých častíc na povrch biosenzora je umožnené ich predošlou modifikáciou niektorou z báz (C, T, G,
A),
ktoré
následne
komplementárne
interagujú
s upevnenou DNA. Iný typ biosenzora s aplikáciou AuNP´s predstavuje ródium-grafitová elektróda s imobilizovaným cytochrómom P450scc, ktorý slúži na ampérometrickú detekciu cholesterolu56. Za účelom kovalentného
uchytenia Au-NP´s na povrch zlatých elektród je možné
použiť napr. cysteamín alebo rôzne ditioly.
4. Moderné nanotechnológie ako nástroj pre
modifikáciu povrchov
Okrem zlepšenia vlastností konvenčných biosenzorov
a prípravy nanobiosenzorov sú nanomateriály využiteľné
aj pri príprave tzv. „nanoarray“ alebo „lab-on-a-chip“
nanobiosystémov9,46. V princípe najpoužívanejšie nanomateriály v súčasnosti sú kovové nanočastice47 ako Pt, Au
alebo Ag (tzv. noble metal nanoparticles  NP´s, syntetizované aj biotechnologicky, s využitím baktérií, aktinomycét, húb ale aj rastlín (Cochlospermum gossypium)48, prípadne uhlíkové nanomateriály (nanorúrky, sadze, grafén –
gr. graphein = písať)). Pre nanomateriálmi modifikované
biosenzory je možné využiť elektrochemický spôsob detekcie sledovaného analytu, aj optický spôsob (SPR metóda, využívajúca efekt odozvy povrchových plazmónov/
polaritónov – elektromagnetických vĺn šíriacich sa v smere
paralelnom na kovový alebo diamagnetický povrch, na
ožiarenie určitej vlnovej dĺžky)49. I keď SPR metóda nedosahuje citlivosti elektrochemických metód, aplikácia kovových nanočastíc pred jej použitím citlivosť značne
zvyšuje50.
4.1. Praktické aplikácie nanomateriálov v súčasných
technológiách
Nanočastice sú všetky častice s minimálne jedným
rozmerom menším ako 100 nm (cit.9). Kedže asi 80 %
chemického priemyslu závisí od efektívnej katalýzy, objavili sa mnohé práce skúmajúce vplyv nanočastíc na priebeh heterogénnej katalýzy. Nanočastice totiž oproti väčším
časticiam z toho istého materiálu vykazujú niektoré efekty
kvantových rozmerov51. Rovnako sa mení v niektorých
prípadoch vodivosť a aj povrchová reaktivita (napr. zlato
je bežne oproti Au-NP´s inertné)52. Tieto katalytické vlastnosti nanočastíc sa využívajú aj v oblasti prípravy biosenzorov, kedy sa napr. v prípade zlatých nanočastíc, obohatených o uhlíkové nanorúrky (Au-CNT´s), podarilo pripraviť
veľmi citlivý imunosenzor (na detekciu -fetoproteínu –
AFP, ako markera niektorých onkologických ochorení;
anti-AFP/glutaraldehyd/thionín na elektróde zo skleného
uhlíka, pričom modifikované nanočastice slúžili ako kata-
4.1.1. Nanočastice
Principiálne sa nanočastice rozdeľujú na kovové
a nekovové nanočastice, kovové ďalej na nanočastice
z ušľachtilých kovov (tzv. noble metal NP´s)
a z neušľachtilých (napr. magnetických kovov, a to najmä
pri tzv. Bio-Bar Code Assay, metódy využívajúcej magnetické častice, vačšinou používanej na ultracitlivú detekciu
proteínov). Veľký význam pri rôznych aplikáciách majú
v súčasnosti najmä ušľachtilé kovové nanočastice, napr.
Ag, Au a Pt. Pre syntézu napr. zlatých nanočastíc, ako
176
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
najpoužívanejších kovových nanočastíc, existuje niekoľko
spôsobov prípravy, pričom najjednoduchšia je Turkevichova metóda, spočívajúca v reakcii HAuCl4 s citrátom sodným, ktorý pôsobí ako redukovadlo a zároveň zvyšujú
citrátové ióny aj stabilitu Au-NP´s voči agregácii elektrostatickou repulziou medzi negatívne nabitými Au-NP´s
(cit.57,58). Ako aj pri iných nanomateriáloch, nanočastice
zvyšujú imobilizačný povrch pre chemisorpciu bioselektora na povrch biosenzora, vykazujú ale tiež určité katalytické vlastnosti, ktoré napr. u makroskopického zlata nenájdeme. Tieto katalytické vlastnosti sa môžu rovnako použiť pri príprave biosenzora, napr. pri katalýze priebehu
elektrochemickej reakcie na povrchu biosenzora, ako reakcie
nepriamo
svedčiacej
o interakcii
analytu
s bioselektorom v prípade, že tieto netvoria redoxný pár
(obr. 1a). Ďalším príkladom ich využitia je ich vlastnosť
zlepšiť transport elektrónov na povrch elektródy v prípade,
že sa pri imobilizácii bioselektora použije SAM vrstva
s pomerne veľkou dĺžkou reťazcov, ktoré by za normálnych okolností predstavovali väčšiu prekážku pre elektrický prúd (nanowiring) (obr. 1b). Tento princíp bol použitý
pri rekonštitúcii apo-GOx na AuNP´s modifikované pomocou FAD kofaktora, pričom turnover elektrónového transféru po tejto rekonštitúcii bol približne 5000/s. Pre porovnanie, prirodzený substrát tohoto enzýmu – kyslík, prijíma
elektróny rýchlosťou asi 700/s (cit.59).
(MMB, Magnetic Micro Beads) nesú bioselektor (DNA,
protilátka) pre rozpoznávanie, a nanočastice nesú molekulu viažúcu sa na analyt (opäť DNA, polyklonálna protilátka), a tzv. bio-bar code (hybridizovaný oligonukleotid).
Typická bio-bar code assay teda zahŕňa interakciu analytu
s MMB, následne naviazanie modifikovaných nanočastíc
a vytvorenie sandwichu MMB/analyt/NP, magnetickú
separáciu MMB z biologickej vzorky a opätovné rozsuspendovanie v destilovanej vode. To spôsobí dehybridizáciu bio-bar code oligonukleotidu, ktorý sa následne separuje a analyzuje, napr. pomocou DNA microarray metódy,
či RT-PCR. V prípade DNA je oligonukleotid dlhý približne 3050 báz. Využitie magnetických nanočastíc je možné
aj pri konštrukcii elektrochemických imunosenzorov, kde
jeden z hlavných problémov je regenerácia povrchu
s imobilizovanou protilátkou po ukončení analýzy. Z toho
dôvodu je obtiažna automatizácia takýchto zariadení. Tento problém sa obchádza imobilizáciou protilátok na magnetické častice, ktoré sa na elektródu uchytia s využitím
magnetu umiestneného pod povrchom elektródy. Princípom je opäť vytvorenie tzv. sandwich-komplexu kde sa na
antigén uchytený na povrchu elektródy pomocou protilátky a magnetu viaže druhý komplex protilátkaoxidoredukčný enzým, sprostredkúvajúci elektrochemickú
reakciu. Táto metóda sa označuje ako ELIME (Enzymelinked Immunomagnetic Electrochemical assay)60,61.
4.1.2. Bio-čiarové kódy (bio-bar codes)
Tzv. bio-bar code assay sa využíva najmä pri detekcii
proteínov a DNA, a je založená na vytvorení sandwichovej
štruktúry analytu s magnetickými časticami a nanočasticami, modifikovanými biorozpoznávacím elementom.
Magnetické častice umožňujú separáciu cieľových molekúl zo vzorky, pričom nanočastice sú zamerané na vytvorenie, resp. amplifikáciu fyzikálneho signálu z detekcie
skúmaného analytu. Využitie preto našla táto metóda najmä pri afinitných biosenzoroch. Magnetické častice
4.1.3. Uhlíkové nanomateriály
Podobne ako kovové nanočastice, našli svoje uplatnenie v oblasti prípravy biosenzorov aj uhlíkové nanomateriály. Najznámejšie a najviac využívané sú v súčasnosti
uhlíkové nanorúrky (carbon nanotubes, CNT´s). Objavené
boli v roku 1991 (Iijima62), a vyznačujú sa v podstate jednou z najjednoduchších atómových konfigurácií. CNT´s sú
tenké, cylindrické útvary zložené z atómov uhlíka, ktoré sú
navzájom pevne viazané, navyše schopné viesť elektrický
prúd. Najjednoduchším štrukturálnym motívom sú tzv.
Obr. 1. a) Elektrochemická detekcia analytu na povrchu biosenzora nepriamo pomocou komplexu GNP´s a CNT´s s uchytenou
protilátkou; b) Prenos elektrónov na povrch elektródy pri použití GNP´s počas prípravy samousporiadanej monovrstvy na
zlatej elektróde
177
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
jednostenné CNT´s (single-walled CNT´s, SWCNT´s).
Sp2-hybridizované uhlíkové atómy tvoria hexagonálne
kruhy, pripomínajúce štrukturálne motívy v planárnej
štruktúre grafitu. SWCNT´s majú priemer približne 1 nm,
a dĺžku až niekoľko m. Oproti tomu druhý typ CNT´s,
takzvané mnohostenné CNT´s (multi-walled CNT´s,
MWCNT´s), majú priemer 225 nm, a sú zložené
z niekoľkých koncentrických SWCNT´s (cit.63), navzájom
od seba vzdialených 0,34 nm (cit.64). V súčasnosti sú zaužívané tri základné metódy pre syntézu SWCNT´s
a MWCNT´s (cit.64). Pre využitie CNT´s je na výber niekoľko rôznych stratégií:

Dispergácia CNT´s v rozpúšťadlách a polyelektrolytoch:
 0,5% metanolický roztok nafionu,
 zmes
CNT´s
s chitozánom
(prípadne
s predúpravou pomocou NaOH alebo glutaraldehydu),
 cyklohexanón, dimetylformamid (DMF), 2%
vodný roztok -cyklodextrínu.

Inkorporácia CNT´s do kompozitných matríc
(teflón).

Ostatné techniky (napr. využitie oxidovaných
SWCNT´s na povrchu zlatých povrchov modifikovaných s monovrstvami 11-amino-N-undecylmerkaptánu cez karboxylové zvyšky).
Niektoré všeobecné príklady aplikácie uhlíkových
nanorúrok pri príprave biosenzorov zahŕňajú úpravu povrchov na detekciu homocysteínu, sacharidov (aj neenzymatický glukózový senzor), nitroaromátov, NADH, aminokyselín a peptidov (glutatión), kyseliny močovej, estrogénov, cholesterolu, fenolov, H2O2, cholínu, alkoholu,
tyrozínu, morfínu, inzulínu, dopamínu, fenylefrínu, kvercetínu, chloramfenikolu alebo kyseliny mliečnej64. Rovnako našli CNT´s uplatnenie aj pri konštrukcii genosenzorov,
resp. imunosenzorov – s naviazaním anti-biotínovej protilátky na CNT´s (cit.64,65). Využívajú sa ako hybridné materiály (kompozity CNT´s s vodivými polymérmi, ako napr.
polyakrylová kyselina, resp. kompozity CNT´s
s nanomateriálmi – napr. Au-NP´s, pričom takýto systém
sa použil pri príprave senzora, kde sa ako hlavné analyty
sledovali As(III) a Bi(III) vo vzorkách prírodných vôd)65.
Popri aplikácii CNT´s priamo na imobilizačný povrch je
rovnako možné ich využitie na uchytenie rôznych
(väčšinou redoxných) enzýmov zároveň s biorozpoznávacím elementom, kedy v sandwichovom usporiadaní
dochádza k detekcii neredoxného páru (analyt-bioselektor)
pomocou elektrochemických metód (obr. 2).
Ďalším zaujímavým nanomateriálom na báze uhlíka,
využiteľného v elektrochémii, je grafén. Rovnako ako
uhlíkové nanorúrky obsahuje sp2 hybridizované atómy
uhlíka, a je zástupcom rodiny viac-rozmerných uhlíkových
nanomateriálov, konkrétne dvojrozmerných (2-D). Grafén
sa dá pripraviť rôznymi spôsobmi, pričom medzi najpopulárnejšie patrí „odlúpavanie“ tzv. vysoko-orientovaného
pyrolytického grafitu alebo naopak odvíjaním CNT´s rôznymi spôsobmi. Zaujímavý spôsob predstavuje Hummer-
komplementárna DNA
komplementárna DNA viazaná na CNT
analyt  molekula DNA
sondy  redoxné enzýmy
analyt  Ag
Ab naviazaná na CNT
imobilizačný povrch (elektróda)
Obr. 2. Využitie uhlíkových nanorúrok s imobilizovanou elektrochemickou sondou pri detekcii analytu na povrchu afinitného biosenzore (genosenzora - hore a imunosenzora - dole)
sova príprava oxidatívnou exfoliáciou grafitu na oxid grafénu, a následná redukcia tohoto oxidu na grafén66. Grafén
sa vyznačuje vysokým povrchom (2630 m2 g1, čo je dvojnásobok kapacity SWCNT´s), vysokou mechanickou pevnosťou (200krát viac ako oceľ), vysokou elasticitou
a tepelnou vodivosťou. Tak ako to bolo naznačené
v predošlých prípadoch kovových NP´s a CNT´s, aj grafén
je možné využiť v kombinácii s inými nanočasticami, najmä s katalytickým účinkom, ako sú napr. Pd-NP´s. Pripravený bol ako podporný katalyzátor pre Pt-Ru NP´s pre
elektrooxidáciu metanolu67. Grafén je zároveň biokompatibilný materiál. CNT´s boli študované z hľadiska ich bezpečnosti, pričom sa objavili určité podozrenia na rôzne
intoxikácie, spôsobené ale najmä prítomnosťou kovových
nečistôt, ktoré grafén neobsahuje, vzhľadom na spôsob
jeho prípravy68. Príkladom využitia uhlíkových nanočastíc
je biosenzor na detekciu AFP, kde sa použil kompozitný
materiál (MWCNT´s-AgNP´s na elektróde zo skleného
uhlíka, upevnený pomocou Cs-MnO2, pričom na imobilizáciu anti-AFP sa využili opäť Au-Np´s)69, prípadne sa
použila vrstva nafion/MWCNT´s na elektróde zo skleného
uhlíka, a následne sa pomocou thionínu imobilizovali AuNP´s s anti-AFP (cit.70).
Už niekoľko rokov je známa syntéza nanovlákien
(útvarov, ktorých aspoň jeden rozmer je menší ako
100 nm, ďalší však môže byť podstatne dlhší) pomocou
membrán. Pri membránovo syntetizovaných nanomateriáloch ide prakticky o narastanie vlákna v póroch membrány
z rôznych materiálov (pórovitý hliník, sklené membrány,
polykarbonát), pričom je možné takýmto spôsobom pripraviť dva typy útvarov: vlákna (nanowires) a (duté) rúrky,
väčšinou z vodivých polymérov, ako sú polypyrol alebo
polyanilín, ale aj kovov, polovodičov, uhlíka a ďalších
178
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
kovový povrch
menbránový templát
kovové nanovlákna
povrch membránového templátu
Obr. 3. Znázornenie priebehu rastu nanovlákien a nanorúrok
počas elektrochemickej depozície v pórovitej membráne
(obr. 3). Pre ilustráciu, v súčasnosti najpoužívanejšie
membrány sú práve polykarbonátové, ktorých komerčné
vlastnosti sú 10 nm priemer, a hustota pórov približne 109/
cm2 (cit.71).
Limitácie pripravovaných biosenzorov, ako nízka
selektivita alebo senzitivita, môžu byť často dôsledkom
práve nešpecifických interakcií. Preto je pri ich príprave
potrebné eliminovať nešpecifické interakcie. Často používané látky sú Tween 20, polyetylénglykol, kazeín, mliečne
proteíny, sérové albumíny, rybie sérum, alebo polyvinylalkohol. Veľmi efektívny sa ukazuje byť albumín
z hovädzieho séra, ktorý vykazuje pri 35% pokrytí monovrstvy efektivitu v blokovaní nešpecifických interakcií 90
až 100 % pri hydrofóbnych, a 68100 % na hydrofilných
povrchoch (testované pre konkanavalín A, IgG a proteín A
(ex Staphylococcus sp.))7274.
5. Záver
Prienik moderných nanotechnológií – teoretických
poznatkov aj praktických aplikácií, s chemickými disciplínami je logickým krokom vývoja súčasnej vedy. Nanomateriály poskytujú mnoho výhod oproti makročasticiam
a zároveň vykazujú unikátne vlastnosti s ich porovnaním.
Pri príprave biosenzorov – vysoko-citlivých a selektívnych
analytických zariadení nachádzajú uplatnenie už niekoľko
rokov. Najviac využívané sú zlaté nanočastice, resp. uhlíkové nanorúrky, a to najmä pri príprave senzorov
s medicínskymi aplikáciami, vrátane elektrochemických
imunosenzorov, a to aj napriek skutočnosti, že antigény
a protilátky navzájom nevystupujú ako redoxní partneri.
4.1.4. Kvantové bodky (quantum dots)
Nanoštruktúry, vyvinuté a používané pre ich intenzívnu, stabilnú fluorescenciu (odolnosť voči degradácii fluorofóru), sú tzv. „quantum dots“. Ich excitáciou je možné
dosiahnuť emisiu žiarenia v úzkom rozsahu vlnových dĺžok. Tvorené sú koloidným jadrom (z CdSe, CdS či InAs)
obaleným jedným alebo viacerými povrchmi, ktoré majú
zabrániť úniku jadra z častice. Často sa tieto útvary modifikujú streptavidínom, pre ľahšie uchytenie biorozpoznávacieho elementu (ako molekula DNA modifikovaná na
jednom konci biotínom) na ich povrch. Takto pripravený
nanosenzor sa použil napríklad na detekciu vírusových
častíc HIV-1 a HIV-2 na úrovni jedinej molekuly
(Zhang, Hu, 2010). V génovom inžinierstve sa na značenie a rozpoznávanie cieľových molekúl DNA využíva
QD-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer),
kedy fluorescenciu po excitácii QD sprostredkúva fluorofór,
napr. cyanín Cy5 (650670 nm, červená fluorescencia)72
(obr. 4).
Táto publikácia bola vytvorená v rámci projektu VEGA 1/0335/10.
LITERATÚRA
1. http://goldbook.iupac.org, ku dňu 4.3.2011.
2. Edelman P.G., Wang J.: Biosensors and chemical
sensors: optimizing performance through polymeric
materials, ACS Symposium series 487, American
Chemical Society, Washington 1992.
3. Walker J. M., Cox M.: The Language of Biotechnology, a Dictionary of Terms, 2. vyd. American Chemical Society, Washington 1995.
4. Skládal P., Macholán L.: Chem. Listy 91, 105 (1997).
5. Wang Y., Dostalek J., Knoll W.: Procedia Eng. 5,
1017 (2010).
6. Manz A., Pamme N., Iossifidis D.: Bioanalytical Chemistry. Imperial College Press, London 2004.
7. Tkac J., Davis J. J., v knihe: Engineering the Bioelectronic Interface (Davis J. J., ed.). Royal Society of
Chemistry, Cambridge 2009.
8. Katrlík J., Voštiar I., Šefčovičová J., Tkáč J., Mastihuba V., Valach M., Štefuca V., Gemeiner P.: Anal.
Bioanal. Chem. 388, 287 (2007).
9. Bakoš D., Palou M., Labuda J., Ferancová A.: Biomateriály a biosenzory – Školiaci materiál projektu ESF
„Meditech-Inovačný program moderných biomedicínskych technológií“. STU, Bratislava 2008.
DNA značená sondou
hľadaný analyt
biotinylovaná DNA
streptavidín
Obr. 4. Schématické znázornenie usporiadania quantum dots
pri detekcii jednovláknovej DNA pomocou DNA značenej
fluorescenčnou farbou
179
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
10. Davis J. J., Tkac J., Humphreys R., Buxton A. T., Lee
T. A., Ferringo P. K.: Anal. Chem. 81, 3314 (2009).
11. Labuda J., Oliveira Brett A.-M., Evtugyn G., Fojta
M., Mascini M., Ozsoz M., Palchetti I, Paleček E.,
Wang J.: Pure Appl. Chem. 82, 1161 (2010).
12. Dolatabadi J. E. N., Mashinchian O., Ayoubi B., Jamali A. A., Mobed A., Losic D., Omidi Y., de la Guardia M.: Trends Anal. Chem. 30, 459 (2011).
13. Kotlín R., Dyr J. E.: Chem. Listy 100, 178 (2006).
14. Park B. W., Kim D.-S., Yoon D.-Y.: Korean J. Chem.
Eng. 28, 64 (2011).
15. Buchholz K., Kasche V., Bornscheuer U. T.: Biocatalysts and Enzyme Technology. Wiley, Weinheim
2005.
16. Gooding J. J., Mearns F., Yang W., Liu J.: Electroanalysis 15, 81 (2003).
17. Johnsson B., Löfas S., Lindquist G.: Anal. Biochem.
198, 268 (1991).
18. Wang S., Kotov N. A. v knihe: Dekker Encyclopedia
of Nanoscience and Nanotechnology, 2. vyd.,
(Contescu C., Putyera K., ed.). CRC Press, Boca Raton 2009.
19. Haes A., Zou S., Schatz G. C., Van Duyne R. P.: J.
Phys. Chem., B 108, 6961 (2004).
20. Haes A., Van Duyne R. P.: J. Am. Chem. Soc. 124,
10596 (2002).
21. Bratthauer G. L.: Methods Mol. Biol. 588, 257 (2010).
22. Piliarik M., Vaisocherová H., Homola J.: Methods
Mol. Biol. 503, 65 (2009).
23. Thillaivinayagalingam P., Gommeaux J., McLoughlin
M., Collins D., Newcombe A. R.: J. Chromatogr., B.
878, 149 (2010).
24. Le H. Q. A., Sauriat-Dorizon H., Youssoufi K.: Anal.
Chim. Acta 674, 1 (2010).
25. Zhao B. Y., Wei Q., Xu C., Li H., Wu D., Cai Y.,
Mao K., Cui Z., Du B.: Sens. Actuators, B 155, 618
(2011).
26. Tkáč J., Whittaker J. W., Ruzgas T.: Biosens. Bioelectron. 11, 1820 (2007).
27. Quek S. Y., Venkataraman L., Choi H. J., Louie S. G.,
Hybertsen M. S., Neaton J. B.: Nano Lett. 7, 3477
(2007).
28. Hiroaki T., Tetsuro S., Seishiro I., Kobayashi H.: J.
Am. Chem. Soc. 126, 15952 (2004).
29. Pergolese B., Muniz-Miranda M., Bigotto A.: J. Mol.
Struct. 924, 559 (2009).
30. Vallée A., Humblot V., Méthivier C., Pradier C.-M.:
Surf. Sci. 602, 2256 (2008).
31. Pong B.-K., Lee J.-Y., Trout B. L.: Langmuir 21,
11599 (2005).
32. Wu Y., Zheng J., Li Z., Zhao Y., Zhang Y.: Biosens.
Bioelectron. 24, 1389 (2009).
33. Umezawa N., Tsurunari M., Kondo T.: Chem. Lett.
38, 776 (2009).
34. Fujii S., Kurokawa S., Murase K., Lee K.-H., Sakai
A., Sugimura H.: Electrochim. Acta 52, 4436 (2007).
35. Lee L. Y. S., Sutherland T. C., Rucarcanu S., Lennox
R. B.: Langmuir 22, 4438 (2006).
36. Dong T.-Y., Chang L.-S., Tseng I.-M., Huang S. J.:
Langmuir 20, 4471 (2004).
37. Lyons M. E. G., O´Brien R., Kinsella M., Gloinn C.
M., Scully P. N.: J. Electrochem. Sci. 5, 1310 (2010).
38. Yang E. S., Chan M.-S., Wahl A. C.: J. Phys. Chem.
84, 3094 (1980).
39. Sun Q.-W., Murase K., Ichii T., Sugimura H.: J. Electroanal. Chem. 643, 58 (2010).
40. Valincius G., Niaura G., Kazakevičiene B., Talaikyté
Z., Kažemékaité M., Butkus E., Razumas V.: Langmuir 20, 6631 (2004).
41. Ho M. Y., Li P., Estrela P., Goodchild S., Migliorato
J.: J. Phys. Chem., B 114, 10661 (2010).
42. Walczak M. M., Popenoe D. D., Deinhammer R. S.,
Lamp B. D., Chung C., Porter M. D.: Langmuir 7,
2687 (1991).
43. Qiu J.-D., Liang R.-P., Wang R., Fan L.X., Chen Y.
W., Xia X. H.: Biosens. Bioelectron. 25, 852 (2009).
44. Qiu J.-D., Wang R., Liang R.-P., Xia X.-H.: Biosens.
Bioelectron. 24, 2920 (2009).
45. Liang R.-P., Fan L.-X., Wang R., Qui J.-D.: Electroanalysis 21, 1685 (2009).
46. Salata OV.: J. Nanobiotechnol. 2, 1 (2004).
47. Pérez-López B., Merkoci A.: Adv. Funct. Mater. 21,
255 (2011).
48. Vinod V. T. P., Saravanan P., Sreedhar B., Devi D.K.,
Sashidhar R.B.: Colloids Surf., B 83, 291 (2011).
49. Kodoyianni V.: BioTechn. 50, 32 (2011).
50. Barbillon G., Ou M., Faure A.-C., Marquette C., Bijeon J.-L., Tillement O., Roux S., Perriat P.: Gold Bulletin 41, 174 (2008).
51. Bethell D., Brust M., Schiffrin D. J., Kiely C.: J. Electroanal. Chem. 409, 137 (1996).
52. Cuenya B. R.: Thin Solid Films 508, 3127 (2010).
53. Tang J., Tang D., Su B., Huang J., Qui B., Chen G.:
Biosens. Bioelectron. 26, 3219 (2011).
54. Willner I., Willner B., Katz E.: Bioelectrochemistry
70, 2 (2007).
55. Wang T., Shi S., Akiyama Y., Zhou L.M., Kuroda S.:
J. Mater. Sci. 45, 4539 (2010).
56. Pingarrón J. M., Yánez-Sedeno P., Gonzáles-Cortés
A.: Electrochim. Acta 53, 5848 (2008).
57. Akbarzadeh A., Zare D., Farhangi A., Mehrabi M. R.,
Norouzian D., Tangestaninejad S., Moghadam M.,
Bararpour N.: Am. J. Appl. Sci. 4, 691 (2009).
58. Kimling J., Maier M., Okenve B., Kotaidis V., Ballot
H., Plech A.: J. Phys. Chem., B. 110, 15700 (2006).
59. Xiao Y., Patolsky F., Katz E., Hainfeld J. F., Willner
I.: Science 299, 1877 (2003).
60. Nam J.-M., Thaxton C. S., Mirkin C. A.: Science 301,
1884 (2003).
61. Ding C., Zhang Q., Zhang S.: Biosens. Bioelectron.
24, 2434 (2009).
62. Iijima S.: Nature 354, 56 (1991).
63. Atkins P., de Paula J.: Atkins´ Physical Chemistry, 9.
vyd. Oxford University Press, Oxford 2010.
64. Rivas G. A., Rubianes M. D., Rodríguez M. C., Ferreyra N. E., Luque G. L., Pedano M. L., Miscoria S. A.,
180
Chem. Listy 106, 174181 (2012)
Referát
Parrado C.: Talanta 74, 291 (2007).
65. Agüí L., Yánez-Sedeno P., Pingarrón J. M.: Anal.
Chim. Acta 622, 11 (2008).
66. Rasuli R., Iraji A. Z.: Appl. Surf. Sci. 256, 7596
(2010).
67. Pumera M., Ambrosi A., Bonanni A., Ching E. L. K.,
Poh H. L.: Trends Anal. Chem. 29, 954 (2010).
68. Bong S., Kim Y.-R., Kim I., Woo S., Uhm S., Lee J.,
Kim H.: Electrochem. Commun. 12, 129 (2010).
69. Che X., Yuan R., Chai Y. Q., Li J. J., Song Z. J.,
Wang J. F.: J. Colloid Interface Sci. 345, 174 (2010).
70. Su H., Yuan R., Chai Y.: Electrochim. Acta 54, 4149
(2009).
71. Martin C. R.: Chem. Mater. 8, 1739 (1996).
72. Jeyachandran Y. L., Mielczarski J. A., Mielczarski E.,
Rai B.: J. Colloid Interface Sci. 341, 136 (2010).
73. Frederix F., Bonroy K., Reekmans G., Laureyn W.,
Campitelli A.: J. Biochem. Biophys. Methods 58, 67
(2004).
74. Thompson R., Creavin A., O´Connel M., O´Connor
B., Clarke P.: Anal. Biochem. 15, 114 (2011).
T. Bertók, J. Šefčovičová, P. Gemeiner, and
J. Tkáč (Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences, Bratislava): Development and Current Trends in
Manufacture of Nanostructure Biosensors
This review deals with the main characteristics of
modern nanostructures like Au nanoparticles or C nanotubes and the great potential of their application in biosensor manufacture. The principles of biosensing are also
mentioned, focusing on the label-free electrochemical
detection using self-assembled monolayers on Au surfaces.
This review deals mostly with biosensors for use in clinical chemistry and diagnostics as immunosensors. Application of nanoparticles can improve electrode transduction although antigens and antibodies do not form a redox couple.
Ústav lékařské chemie a biochemie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci vypisuje
konkurs na přijetí do doktorského studia v oboru Lékařská chemie a biochemie.
Výzkumné zaměření:

chemoprotektivní účinky přírodních látek

biologické účinky nanočástic a nové materiály v medicíně

studium metabolismu a úloha lidského mikrobiomu v metabolismu cizorodých látek

elektrochemické senzory a membránové separace v experimentální medicíně

studium angiogeneze in vitro
Konkrétní Ph.D. témata lze dohledat na http://www.medchem.upol.cz
Termín pro podání přihlášky: 20.5.2012
Kontakt: Prof. RNDr. Jitka Ulrichová, CSc., Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, Tel: 585 632 302,
e-mail: [email protected]
181