Introdução e protocolo bilirrubina

DETERMINAÇÃO
DA
CONCENTRAÇÃO
PLASMÁTICA
DAS
BILIRRUBINAS (BILIRRUBINÉMIA)
• BILIRRUBINA
A bilirrubina refere-se à concentração de bilirrubina (Brb) no sangue.
A bilirrubina é um produto do catabolismo do heme da hemoglobina.
O heme consiste num ião ferroso (Fe2+) e num anel tetrapirrólico (protoporfirina IX). É
produzido em todos os tecidos humanos, mas a sua síntese é mais pronunciada na medula
óssea e no fígado, devido à necessidade de o incluir na hemoglobina e nos citocromos,
respectivamente.
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Síntese do Heme
O heme sintetiza-se a partir da glicina e do succinato. O 1º e os 3 últimos passos da sua
síntese ocorrem na mitocôndria, enquanto os intermédios ocorrem no citoplasma.
As reacções que ocorrem nas cadeias laterais do anel pirrólico envolvem a síntese de
produtos intermédios que são instáveis e oxidam facilmente por acção da luz porfirinogéneos.
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Catabolismo do Heme e produção de Bilirrubina
Os glóbulos vermelhos têm uma duração média de 120 dias.
As células "velhas" são reconhecidas pelas suas alterações de membrana, são removidas
e englobadas pelo sistema reticulo-endotelial e as cadeias de globina são desnaturadas e
libertam o heme para o citoplasma. A globina é degradada nos seus aminoácidos que são
reutilizados para as necessidades metabólicas gerais.
O catabolismo do heme, que ocorre no retículo endoplásmico (fígado, baço e medula
óssea), necessita de O2 e de NADPH. É o citocromo P450 que regenera o NADPH utilizado.
A heme-oxigenase quebra as ligações existentes entre dois resíduos pirrólicos. O
carbono envolvido nessas ligações é convertido em monóxido de carbono, sendo esta a única
fonte de CO endógena. A biliverdina IX é uma estrutura linear, resultante da acção da hemeoxigenase. Sofre uma redução e converte-se em bilirrubina por acção da bilirrubinaredutase.
A bilirrubina forma-se, não só a partir dos glóbulos vermelhos senescentes, mas também
do "turnover" de proteínas que contêm o heme, como os citocromos.
A bilirrubina, ligada à albumina sérica, é rápidamente degradada no fígado:
- Captação pelo hepatócito
- Conjugação com ácido glicurónico (formam-se diglicuronatos de bilirrubina).
- Secreção para a bílis
A bilirrubina é lançada no intestino e reduzida por enzimas de origem bacteriana aí
existentes, dando origem ao urobilinogénio (incolor), que pode, subsequentemente, ser
oxidado em urobilina, que dá a cor às fezes. Uma parte do urobilinogénio é reabsorvida (ciclo
entero-hepático), sendo outra parte excretada pela urina.
A bilirrubina conjugada diz-se directa, porque reage com sais diazotados e dá origem a
azobilirrubina. Esta reacção é a reacção directa de Van der Bergh .
A bilirrubina livre (não conjugada) só reage com sais diazotados quando se adiciona um
solvente orgânico como o etanol, na reacção indirecta de Van der Bergh.
A bilirrubina indirecta tem elevada afinidade para os lípidos de membrana, o que
condiciona a disfunção da membrana celular, particularmente grave no S. N. C..
A deposição de bilirrubina, directa e indirecta, na pele e escleróticas leva à coloração
ictérica ou icterícia.
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VALORES NORMAIS:
BILIRRUBINA DIRECTA:
0,0 - 0,1 mg %
BILIRRUBINA INDIRECTA:
0,1 - 0,5 mg %
BILIRRUBINA TOTAL:
0,2 - 0,8 mg %
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Doseamento da bilirrubina
A bilirrubina directa é determinada em meio alcalino por uma reacção com o ácido
sulfanílico diazotinizado, originando um complexo azul que pode quantificar
espectrofotometricamente. A bilirrubina total é determinada pelo mesmo princípio mas
em presença de cafeína, que liberta a bilirrubina ligada à albumina.
A bilirrubina indirecta é obtida por subtracção dos valores da bilirrubina directa aos
valores da bilirrubina total.
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PROTOCOLO DE BANCADA
SOLUÇÕES DO KIT E AMOSTRA:
Reagente 1 - ácido sulfanílico
29 mM
HCl
170 mM
Reagente 2 – nitrito de sódio
25 mM
Reagente 3 - cafeína
0.26 M
benzoato de sódio
Reagente 4 – tartarato
0.52 M
0.93 M
hidróxido de sódio 1.9 M
NaCl Amostra -
9 g/L
soro ou plasma (guardado no escuro)
A - Determinação da Bilirrubina Total (Grupo 1 e 3)
1. Proceder segundo a tabela, medindo para as cuvettes as quantidades indicadas:
Cuvette
Reagente 1
Reagente 2
Reagente 3
Amostra
Branco
0.20 mL
-1.00 mL
0.20 mL
Amostra
0.20 mL
1 gota (0.05 mL)
1.00 mL
0.20 mL
Misturar e deixar incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (20 a 25ºC)
Reagente 4
1.00 mL
1.00 mL
2. Misturar e deixar incubar 5 a 10 minutos nas mesmas condições (temperatura
ambiente)
3. Ler a absorvância da amostra contra o branco, a λ = 578 nm (Abs578 nm)
Cálculo da bilirrubina total :
µmol /L: 185 x Abs578 nm
mg /dL: 10.8 x Abs578 nm
Valores normais de bilirrubina total: < 17 µM (ou < 1 mg/ 100 mL)
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B - Determinação da Bilirrubina Directa (Grupo 2 e 4)
1. Proceder segundo a tabela, medindo para as cuvettes as quantidades indicadas:
Cuvette
Reagente 1
Reagente 2
NaCl (9g/L)
Amostra
Branco
0.20 mL
-2.00 mL
0.20 mL
Amostra
0.20 mL
1 gota (0.05 mL)
2.00 mL
0.20 mL
2. Misturar.
3. Esperar 5 minutos à temperatura ambiente.
4. Ler a absorvância da amostra contra o branco, a λ = 546 nm (Abs546 nm)
Cálculo da bilirrubina directa
µmol /L: 246 x Abs546 nm
mg /dL: 14.4 x Abs546 nm
Valores normais da bilirrubina directa: < 4,2 µM (ou < 0,25 mg/ 100 mL)
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