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TCC01 - Faculdade de Biomedicina
1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FACULDADE DE BIOMEDICINA DIEGO SIQUEIRA SANTOS AVALIAÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata DUCKE APÓS ISQUEMIA ESTRIATAL POR ENDOTELINA-1 EM RATOS ADULTOS BELÉM 2012 2 DIEGO SIQUEIRA SANTOS AVALIAÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata DUCKE APÓS ISQUEMIA ESTRIATAL POR ENDOTELINA-1 EM RATOS ADULTOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Walace Gomes Leal. Co-orientador: Msc. Adriano Guimarães Santos. BELÉM 2012 3 DIEGO SIQUEIRA SANTOS AVALIAÇÃO DO EFEITO INIBITÓRIO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL DO ÓLEO-RESINA DE Copaifera reticulata DUCKE APÓS ISQUEMIA ESTRIATAL POR ENDOTELINA-1 EM RATOS ADULTOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina, aprovado com o conceito __________________. Belém (PA), 14 de Dezembro de 2012. Banca Examinadora: _________________________________ Prof. Dr. Walace Gomes Leal ICB – UFPA (Orientador) _________________________________ Prof. Dr. Rafael Rodrigues Lima (ICB-UFPA) __________________________________ Prof. Dr. Ênio Mauricio Nery dos Santos (ICB-UFPA) __________________________________ Prof. Msc. Rômulo Augusto Feio Farias – suplente (ICB-UFPA) 4 ‘’O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis." José de Alencar 5 Aos meus pais que sempre me ofereceram o seu melhor, ensinaram-me a ter foco e a ser persistente. Aos meus amigos pelo apoio e dedicação. 6 AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus por sempre me mostrar o caminho certo e colocar pessoas boas no meu caminho. Obrigado Senhor! Aos meus pais pela dedicação, afeto e principalmente pela oportunidade de poder sonhar. Ao Prof. Walace Gomes Leal pela orientação, paciência, pela compreensão nos momentos de ausência e principalmente por me ensinar a caminhar livre pelos caminhos do conhecimento. Ao Adriano Guimarães pela dedicação, amizade, por ter me ensinado as técnicas experimentais do trabalho e principalmente por ter me apresentado o mundo científico. Ao Ijair Rogério pela amizade, pela ajuda nos experimentos e por ter tornado essa caminhada mais divertida e alegre. Aos membros do Laboratório de Neuropreteção e Neurorregeneração Experimental que ajudaram diretamente ou indiretamente no processo experimental do trabalho. Aos professores da faculdade de Biomedicina, pela dedicação, pelo conhecimento passado e pela construção do profissional. Aos meus amigos de faculdade pela cumplicidade, pelos momentos alegres, pela partilha de conhecimento e principalmente por terem tornado esses 4 anos, os melhores da minha vida. Muito obrigado a todos! 7 SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES..................................................................................9 RESUMO............................................................................................................10 1. INTRODUÇÃO..............................................................................................11 1.1. O ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO (AVE).....................................11 1.2. FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENFEFÁLICO ISQUÊMICO.............................................................................................13 1.2.1. Glutamato e Excitotoxicidade...............................................................14 1.2.2. Despolarização Peri-infarto...................................................................15 1.2.3. Estresse Oxidativo.................................................................................16 1.2.4. A Ruptura da BHE..................................................................................16 1.2.5. Resposta Inflamatória............................................................................17 1.2.5.1. Resposta Molecular............................................................................17 1.2.5.2. Resposta Celular................................................................................19 1.2.6. Apoptose.................................................................................................21 1.3. REGIÃO ESTRIATAL..............................................................................22 1.4. COPAÍBA, SUAS APLICAÇÕES FITOTERÁPICAS E O PARADIGMA EXPERIMENTAL......................................................................................24 1.5. OBJETIVOS.............................................................................................26 1.5.1. Geral........................................................................................................26 1.5.2. Específicos.............................................................................................26 2. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................27 2.1. ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS..................................................27 2.2. MODELO DE ISQUEMIA FOCAL POR INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1...27 2.3. TRATAMENTO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS...................................28 2.4. PERFUSÃO...............................................................................................29 2.5. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICA........................29 2.5.1. Análise Histopatológica Geral.............................................................29 2.5.2. Imunoistoquímica.................................................................................30 2.6. ANÁLISE QUALITATIVA...........................................................................32 2.7. ANÁLISE QUANTITATIVA.......................................................................32 8 2.7.1. Método de Contagem.............................................................................32 2.7.2. Análise Estatística..................................................................................33 3. RESULTADOS.............................................................................................34 3.1. PERDA TECIDUAL COM CARACTERISTICAS NECRÓTICAS E INTENSA RESPOSTA INFLAMATÓRIA TRODUZIDA POR ET-1 NO CORPO ESTRIATAL SÃO MINIMIZADAS PELO TRATAMENTO COM COPAÍBA............................34 3.2. PERDA NEURONAL TRODUZIDA POR ET-1 NO ESTRIATO É MINIMIZADA PELO TRATAMENTO COM COPAÍBA.............................................................34 3.3. O TRATAMENTO COM ÓLEO-RESINA DE COPAÍBA INIBE ATIVAÇÃO MICROGLIAL APÓS LESÃO EXITOTÓXICA ESTRIATAL POR ET-1.............37 4. DISCUSSÃO...............................................................................................39 5. CONCLUSÃO.............................................................................................43 6. REFERÊNCIAS...........................................................................................44 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1. Principais mecanismos envolvidos com a morte celular isquêmica e a instalação de déficits neurológicos.............................................................................12 FIGURA 2. Representação temporal dos principais eventos envolvidos com a morte celular isquêmica........................................................................................................14 FIGURA 3. Resumo esquemático dos principais passos envolvidos na transmigração celular mediada pelas moléculas de adesão em resposta ao dano tecidual.......................................................................................................................19 FIGURA 4. Apresentação fenotípica da microglia em condições normais e patológica...................................................................................................................21 FIGURA 5. Imagem anatômica do cérebro humano..................................................23 FIGURA 6. Análise histopatológica em coloração com violeta de cresila.................35 FIGURA 7. Análise imunoistoquímica para células NeuN+ e representação gráfica.......................................................................................................................36 FIGURA 8. Análise imunoistoquímica para células ED1+ e representação gráfica.......................................................................................................................38 10 RESUMO No cenário nacional, onde o uso de plantas medicinais também é intenso, o óleo-resina de copaíba se destaca por seu amplo uso, e os múltiplos efeitos terapêuticos registrados desde o século XVI, e alguns dos efeitos fitoterápicos disseminados pela cultura popular como a atividade antiinflamatória têm sido comprovados cientificamente. Muitas doenças do Sistema Nervoso Central (SNC) envolvem a inflamação sugerindo uma participação nos danos em tecidos periféricos. No AVE (Acidente Vascular Encefálico), ocorre resposta inflamatória caracterizada pela intensa presença de macrófagos ativos, pela ausência de corpos neuronais e pela grande perda tecidual da zona de lesão. O presente estudo tem o objetivo de Investigar o possível efeito inibitório da ativação microglial por injeções intra-peritoniais do óleo-resina de copaíba (C. reticulata) após lesão isquêmica aguda no estriato de ratos adultos induzida por micro-injeções de endotelina-1. Utilizamos os efeitos vasoconstritores do peptídeo endotelina-1 para induzir isquemia focal no corpo estriado de ratos machos adultos da raça Wistar, no tempo de sobrevida de 7 dias. Os grupos (N=5) foram tratados com 200mg/Kg de Copaíba ou Tween. Foi realizada técnica histológica de violeta de cresila para identificar a região de lesão e técnicas de imunohistoquímica para NeuN e ED1 para avaliação de presença de corpos celulares e ativação microglial, respectivamente. O grupo Tween apresentou ausência de corpos celulares no centro da lesão e intensa ativação microglial, em contrapartida, o grupo tratado com Copaíba apresentou maior presença de corpos células no centro da lesão e menor ativação microglial. Estudos futuros devem ser estabelecidos para melhor compreender os mecanismos de ação desta planta no SNC. Palavras-Chave: Copaíba, Tween, Endotelina-1, Estriato, Ativação Microglial. 11 1. INTRODUÇÃO 1.1. O ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO (AVE) Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o acidente vascular encefálico (AVE) é definido como déficit súbito focal ou global da função neurológica de duração superior a 24 horas ou que leve a óbito, cuja única causa reside na origem vascular (WOLFE, 2000; MARKUS, 2008), tal distúrbio possui origens isquêmica ou hemorrágica, sendo, o AVE isquêmico o mais comum, cerca de 87% dos casos (ROSAMOND et al., 2008). O Brasil ocupa a sexta posição entre os países com maior índice de acometimentos por AVE (OMS), contudo, o maior da América latina chegando aproximadamente 90 mil óbitos por ano (LOTUFO, 2005; ABRAMCZUK & VILLELA, 2009). O Sistema Único de Saúde (SUS) registrou no ano de 2008 cerca de 200 mil internações por AVC, que resultaram em um custo de aproximadamente R$ 270 milhões para os cofres públicos. Desse total, 33 mil casos evoluíram para óbito (ABRAMCZUK & VILLELA. 2009). No Pará 9.686 pessoas morreram desde janeiro de 2006 até agosto de 2011 por AVE (Sespa). O AVE hemorrágico ocorre devido à ruptura do vaso sanguíneo no parênquima cerebral, provocando extravasamento e acumulo de sangue no tecido cerebral, ocorre principalmente pelo rompimento de aneurismas (CAPLAN et al., 2009). O AVE isquêmico é provocado pelo bloqueio do vaso sanguíneo que pode ser de caráter trombolíticos (acúmulo de placas de ateroma na parede interna do vaso e posterior entupimento) ou embólicos (placa de ateroma se soltam e obstruem a luz vascular seguinte), tal fato provoca a não irrigação das áreas adjacentes ao bloqueio (CAPLAN et al., 2009). Entre os fatores de risco para o AVE, estão: tabagismo, obesidade, diabetes, dislipidemia e hipertensão (PETTY et al., 1999; SCHULZ & ROTHWELL, 2003; MARKUS, 2008). A hipertensão arterial sistêmica é o principal fator de risco preditivo para AVE isquêmico, pois está presente em cerca de 70% dos casos; Cardiopatias são consideradas o segundo fator de risco mais importante para AVE, cuja freqüência é 41,9%; Diabete melito é fator de risco importante para AVE isquêmico, uma vez que acelera o processo aterosclerótico, cerca de 23% de pacientes com AVE isquêmico são diabéticos (PIRES et al, 2004). O AVE incide com 12 maior frequência na idade avançada período de vida em que se observam as maiores taxas de óbito e seqüelas. O doente idoso, comparado ao doente jovem, possui algumas características próprias em relação à etiologia e prevenção desta doença, há nítida predominância da aterosclerose como causa do AVE, ao contrário dos jovens, entre os quais prevalecem condições hereditárias, malformações e uso de drogas ilícitas (PIRES et al, 2004). AVE FIGURA 1. Principais mecanismos envolvidos com a morte celular isquêmica e a instalação de déficits neurológicos. Modificado de Brouns e De Deyn (2009). 13 1.2. FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENFEFÁLICO ISQUÊMICO Eventos isquêmicos cerebrovasculares desencadeiam uma série de mecanismos fisiopatológicos que culminam com a instalação de danos espaciais e temporais que duram desde algumas horas, até vários dias no parênquima cerebral (Figura 1). Tais danos, ocorrem nos primeiros momentos do AVE com a hipoglicemia, anóxia ou hipóxia da região lesionada, esses fenômenos provocam à morte celular por necrose, mediada por mecanismos citotóxicos (LO et al., 2003; DOYLE et al., 2008; BROUNS & DE DEYN, 2009). Do ponto de vista morfológico são estabelecidas duas regiões distintas na área de lesão: o centro isquêmico e a zona periférica, chamada de penumbra isquêmica. Após a isquemia, no centro da lesão observam-se os seguintes fenômenos que comprometem o tecido nervoso: despolarização peri-infarto, excitotoxicidade, necrose e morte celular programada, os quais também constituem os principais mecanismos presentes na degeneração neuronal secundária. A penumbra isquêmica sofre conseqüências moderadas, todavia, em uma janela temporal maior, diversos mecanismos secundários, tais como apoptose, inflamação e estresse oxidativo, podem promover o avanço da lesão, com comprometimento da penumbra isquêmica (LO et al., 2003; DOYLE et al., 2008; KAUFMANN et al., 1999; BROUNS & DE DEYN, 2009). Dias após o início da lesão, a penumbra isquêmica pode ser ainda mais afetada pelos mecanismos anteriormente citados (BROUNS & DE DEYN, 2009), juntamente com o aumento da intensidade do processo inflamatório devido à ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) e falência na rede microvascular (Figura 2). 14 FIGURA 2. Representação temporal dos principais eventos envolvidos com a morte celular isquêmica. Modificado de Brouns e De Deyn (2009). A seguir são apresentados os principais mecanismos celulares envolvidos com a fisiopatologia do AVE isquêmico. 1.2.1. Glutamato e Excitotoxicidade O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório dos mamíferos, é essencial para o desenvolvimento e envelhecimento do cérebro, interação entre estruturas cerebrais, comunicação cerebral e processo de aprendizagem e memória. O mesmo exerce suas ações através da ativação dos seus receptores ionotrópicos N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido 2α-amino-3-hydroxi-5-metil-4- isoxazolepropiônico (AMPA), kainato e/ou receptores metabotrópicos acoplados a proteínas G. Em condições fisiológicas, o glutamato é liderado na fenda sináptica, onde se liga aos seus receptores, tal ligação resulta na propagação de potencial de 15 ação nos neurônios glutamatérgicos. A regulação da neurotransmissão glutamatérgica envolve a remoção do glutamato da fenda sináptica por transportadores específicos, modulando o equilíbrio do tônus fisiológico e toxico da sinapse glutamatérgica (HOSSMANN, 2006; GANZELLA, 2010). A excitotoxicidade glutamatérgica ocorre decorrente ao aumento excessivo de glutamato na fenda sináptica, provocando hiper estimulação dos neurônios glutamartérgicos, tal fato é extremamente prejudicial ao cérebro. Logo após o AVE isquêmico, neurônios e células gliais entram em falência bioenergética com desequilíbrio do gradiente iônico. Esses fatores comprometem a remoção do glutamato da fenda sináptica por ATPases removedoras que levam o glutamato até aos receptores pré-sinápticos para sua reabsorção (HOSSMANN, 2006; GANZELLA, 2010). O acúmulo extracelular de glutamato excita continuamente a célula póssináptica até a morte. Os receptores glutamatérgicos: AMPA, kainato e NMDA promovem a entrada exagerada dos íons sódio, cloreto e cálcio que conduz ao edema citotóxico, ativação de endonucleases e à liberação de radicais livres. Isso culmina com a morte celular por necrose induzida por mecanismo excitotóxico (DOYLE et al., 2008; BROUNS & DE DEYN, 2009). 1.2.2. Despolarização Peri-infarto A anóxia e a despolarização excitotóxica de neurônios e células gliais, provocam no centro isquêmico o aumento da concentração extracelular de glutamato e K+ que podem se difundir para área de penumbra que envolve o centro da lesão. Esses fatos levam a despolarização eletroquímica e excitatória de mais neurônios e células gliais, as quais também liberam mais glutamato e K + dispersando a onda despolarizante até áreas mais distantes do centro isquêmico, tal fenômeno é chamado de despolarização peri-infarto. Como o processo de repolarização depende de energia, e as células da penumbra apresentam comprometimento metabólico, a despolarização peri-infarto pode contribuir para o alastramento da lesão primária do centro isquêmico para a região da penumbra (HOSSMANN, 1996; MERGENTHALER et al., 2004). 16 1.2.3. Estresse Oxidativo Os neurônios possuem mecanismos antioxidantes endógenos suficientes para degradar a demanda de radicais livres produzidos. Entretanto, em condições patológicas, tais mecanismos são ínfimos para conter a exacerbada produção de radicais livres (DOYLE et al., 2008). A perda da polaridade da membrana celular provoca um grande distúrbio, onde ocorre o excessivo influxo de íons cálcio e sódio na célula. Este acúmulo iônico induz a mitocôndria a produzir quantidades prejudicais de espécies reativas derivadas do oxigênio. A liberação de superóxido (O2-) da mitocôndria para o citoplasma leva à produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxidrila (OH-). Tais radicais ativam cascatas enzimáticas que destroem macromoléculas na célula e a levam à morte. Paralelamente, no citoplasma, o íon cálcio promove a produção de óxido nítrico (NO) que, em níveis elevados, também tem efeito deletério (BROUNS & DE DEYN, 2009; KNOTT et al., 2008; PRADEEP et al., 2012). 1.2.4. A Ruptura da BHE A produção de NO pela parede neurovascular promove vasodilatação e apresenta efeito antiinflamatório. Contudo, a liberação exacerbada, além de promover danos à integridade celular, pode ainda avariar a parede endotelial e comprometer a permeabilidade vascular pela ativação de metaloproteinase de matriz extracelular (MMP, do inglês, matrix metaloproteinases), em particular a MMP-9. A MMP é uma enzima proteolítica que degrada a laminina e fibras colágenas da lâmina basal. Esta protease prejudica a coesão entre as células endoteliais, aumentando a permeabilidade local e favorece o extravasamento de plasma, transmigração de leucócitos e eventuais hemorragias (LO, 2008; BROUNS & DE DEYN, 2009). 17 1.2.5. Resposta Inflamatória O isolamento anatômico e fisiológico e seu sistema imune próprio garantiram ao encéfalo o chamado ‘’privilégio imunológico’’, haja vista, que o mesmo possui uma escassa rede de drenagem linfática, a falta de células apresentadoras profissionais de antígenos como as células dendríticas, além do filtro imposto pela BHE e a suposta ausência do Complexo de Histocompatibilidade Principal Classe I (MHC-I, do Inglês: Major Histocompatibility Complex) (BARKER & WIDNER, 2004; BOULANGER & SHATZ, 2004). Atualmente, todavia, sabe-se que moléculas e células do sistema imune têm trânsito de entrada e saída do encéfalo e medula espinhal tanto em condições normais quanto patológicas (GALEA et al., 2007; KRIZ & LALANCETTE-HEBERT, 2009). De acordo com Cardoso et al. (2012), a resposta inflamatória ocorre da seguinte forma na isquemia: inicia pela liberação de mediadores inflamatórios, tais como as citocinas – interleucina-1 (IL-1, do Inglês: interleukin-1), fator-α de necrose tumoral (TNF-α, do Inglês: tumor necrosis factor alpha), interleucina-10 (IL-10, do Inglês: interleukin-10) e o fator-beta de crescimento transformador (TGF-beta, do Inglês: transforming growth factor beta); e quimiocinas – destaque para a proteína-1 quimiotática de monócito (MCP-1, do Inglês: monocyte chemotactic protein 1). Estes mediadores inflamatórios ativam células imunes e induzem a expressão de moléculas de adesão na parede endotelial, entre as quais seletinas, integrinas e imunoglobulinas. 1.2.5.1. Resposta Molecular As citocinas são proteínas solúveis que causam modificações comportamentais nas células do sistema imune (microglia e linfócitos), astrócitos e neurônios. Essas mudanças podem ser de caráter morfológico, expressão de moléculas de adesão, produção de radicais livres e liberação de mais citocinas. As citocinas podem ser agrupadas em moléculas pró-inflamatórias e antiinflamatórias (WANG et al., 2007; LIMA et al., 2007; MAGNUS et al., 2012). 18 Entre as citocinas pró-inflamatórias estão presente a IL-1 e o TNF-α, onde a concentração de ambas modula a intensidade da lesão, as quais são importantes para a ativação de células imunes periféricas e residentes e contribuem para a expressão de moléculas de adesão celular e NO. Em contrapartida, citocinas como a IL-10 e TGF-β possuem ação antiinflamatória. A IL-10 inibe a atuação próinflamatória da IL-1 e TNF-α, o mesmo é liberado por leucócitos mononucleares como os monócitos/macrófagos, contudo, em condições patológicas graves estas células manifestam fenótipo prejudicial. O TGF-β é liberado por células mononucleares periféricas e residentes (microglia e astrócitos) e possui ação sinérgica a IL-10 (WANG et al., 2007). Outro grupo de moléculas que atuam na inflamação são as quimiocinas, que são um grupo de família de macromoléculas com propriedade de comunicação e recrutamento celular que podem afetar a permeabilidade da BHE e são consideradas pró-inflamatórias, como exemplo a MCP-1 que pode ser liberada através da indução por TNF-α (WANG et al., 2007). A sinalização de citocinas e quimiocinas altera o comportamento celular e induz a expressão de moléculas de adesão na superfície de células residentes e leucócitos que favorecem o contato celular e a migração aos sítios de lesão (CARDOSO et al., 2012). As moléculas de adesão favorecem a migração trans-endotelial de leucócitos para o parênquima neural e possuem três tipos: seletinas, integrinas e imunoglobulinas, as mesmas medeiam os seguintes eventos: rolamento, adesão e transmigração (Figura 3) (WANG et al., 2007; WITTCHEN, 2009). 19 FIGURA 3. Resumo esquemático dos principais passos envolvidos na transmigração celular mediada pelas moléculas de adesão em resposta ao dano tecidual. Modificado de Wittchen (2009). 1.2.5.2. Resposta Celular Na fase aguda, os neutrófilos são as primeiras células recrutadas, seguido pelos linfócitos (DOYLE et al., 2008; LIMA et al., 2008; SOUZARODRIGUES, 2008). As células microgliais/macrófagos ativados dominam a cena lesiva nos tempos de sobrevida mais tardios após desordens neurais agudas, incluindo AVE, trauma cerebral e da medula espinhal (CLARK et al., 1993). Os neutrófilos são células fagocitárias que atuam na remoção de detritos teciduais após desordens neurais. Seu recrutamento tem inicio 30 minutos após o insulto isquêmico e com pico máximo 24 horas após AVE. O acúmulo de neutrófilo no sítio isquêmico é considerado prejudicial ao tecido pela quantidade de radicais livres, enzimas proteolíticas e citocinas inflamatórias liberadas por estes granulócitos (BOLTON & PERRY, 1998; CHOU et al., 2004; GOMES-LEAL et al., 2005; LIMA et al., 2008; SOUZA-RODRIGUES et al., 2008; DOYLE et al., 2008). Os linfócitos originam-se de precursores presentes na medula óssea, os quais se dividem em linfócito T e B, com atuação no sistema imune adaptativo e no armazenamento da memória imune, respectivamente. A migração e o acúmulo de linfócitos nos tecidos são mediados por seletinas e integrinas, nas lesões isquêmicas eles podem ser substancialmente prejudiciais, exercendo um papel importante na resposta inflamatória pela liberação de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) e por promover quimiotaxia para outros leucócitos, além do efeito citotóxico mediado pelo MHC classe I (PERRY, V. H., 1998; ABBAS & JANEWAY, 2000; SCHWAB et al., 2001; CABARROCAS et al., 2003). 20 As células microgliais são os macrófagos residentes do SNC, correspondendo a cerca de 20% da população celular do encéfalo (RANSOHOFF and PERRY 2009). A origem desta célula é controversa. Estudos, contudo, indicam que a microglia deriva de linhagem hematopoiética durante o período embrionário e pós-natal inicial (PERRY & GORDON, 1991). Demonstrou-se através de microscopia bifotônica que, em situações fisiológicas, estas células fazem uma varredura completa do tecido neural movimentando estocasticamente suas ramificações, provavelmente como um mecanismo para manter a integridade tecidual (NIMMERJAHN et al., 2005). Em desordens neurais agudas e crônicas, incluindo lesão cerebral e da medula espinhal, AVE, doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington, células microgliais são ativadas, o que é refletido em alterações morfológicas, onde antes a forma de latência apresentava-se como uma célula de corpo celular pequeno, com pouco citoplasma em torno do núcleo e numerosas ramificações, passa a apresentar ramos curtos e grossos e, finalmente, a uma morfologia arredondada fagocítica de macrófagos ativados, ocorrem também mudanças bioquímicas no estado de ativação ou não da microglia (Figura 4) (BLOCK et al., 2007; GOMES-LEAL et al., 2004; GOMES-LEAL et al., 2005). Além da atuação benéfica como fagócitos, células microglais ativadas poderiam liberar neurotoxinas, como NO, aminoácidos excitatórios e citocinas próinflamatórias (por exemplo, TNF-α e IL-1) que poderiam contribuir para a morte neuronal (LIPTON, 1999; SUGAWARA et al., 2004). Existem evidências experimentais que uma ativação microglial descontrolada poderia dificultar a neurogênese endógena que ocorre durante doenças neurodegenerativas (EKDAHL et al., 2003; MONJE et al., 2003). No AVE isquêmico, acredita-se que a ativação microglial contribua tanto para neuroproteção como para a exacerbação do processo lesivo, o que os autores chamam de a face de Janus da função microglial (SCHWARTZ et al., 2006). 21 FIGURA 4. Apresentação fenotípica da microglia em condições normais e patológica. A. Morfologia e ontogenética do estágio de ativação e origem da microglia. B. Representação esquemática da escala de ativação da microglia em função da severidade ou tipo de insulto. À esquerda: microglia em repouso (resting); à diteita: microglia ativada e; no centro: microglia reativa. Modificado de Soulet e Rivest (2008) e McColl; Allan e Rothwell (2009). 1.2.6. Apoptose Fenômenos lesivos como Excitotoxicidade, produção de radicais livres, danos ao DNA, desequilíbrio iônico, danos a membrana mitocondrial e resposta imune não controlada são fatores que estão envolvidos na morte celular por apoptose, tal desequilíbrio pode envolver a via mitocondrial intrínseca ou estímulos extrínsecos à célula (DOYLE et al., 2008; BROUNS & DE DEYN, 2009). 22 A Via Intrínseca independe de sinalizações de receptores de membrana celular. No caso da isquemia, ocorre desequilíbrio da membrana mitocondrial que transloca para o citoplasma a enzima mitocondrial constituinte da cadeia respiratória citocromo-C e Smac/Diablo, inibidores de proteínas antiapoptóticas citoplasmáticas (IAPs). No citosol, a citocromo-C reage com Apaf-1 e dATP (moléculas pró-apoptóticas citoplasmáticas) para ativar a caspase-9, a qual aciona a caspase-3 que degrada o citoesqueleto celular e ativa endonucleases que danificam o DNA nuclear e levam a célula invariavelmente à morte (VILA & PRZEDBORSKI, 2003; SUGAWARA et al., 2004; DOYLE et al., 2008). No caso da via extrínseca que pode ser mediada por caspase efetora independentemente da presença de citocromo-C no citoplasma. Esta via depende de membros das famílias Fas/CD-95 e TNF-R1, e seus respectivos ligantes de morte FAS (FasL) e TNF-alfa, uma vez, estabelecida a ligação entre receptores e ligantes, uma proteína adaptadora intracelular é acionada e ativa a caspase-8, a qual pode ativar a caspase-3 efetora que aciona a poli(ADP-ribose)polimerase (PARP), que em excesso leva à depleção de NADP e ATP que, respectivamente, causam dano ao DNA e aumento da falência energética. Também pode haver a ativação da enzima desoxirribose nuclease ativada por caspase (CAD) que pode danificar o DNA nuclear. A caspase-8 também pode provocar o truncamento da proteína Bid citoplasmática, um membro da família Bcl pró-apoptótica, que em conjunto com Bax e Bak, formam poros na membrana mitocondrial com vazamento de citocromo-C, o que leva à morte celular mediada por caspase-3 (VILA & PRZEDBORSKI, 2003; SUGAWARA et al., 2004; DOYLE et al., 2008). 1.3. REGIÃO ESTRIATAL Os núcleos da base são o núcleo caudado, putâmen, globo pálido, núcleo subtalâmico e a substância nigra, por sua vez, os mesmos são alvo do córtex cerebral, particularmente dos córtices frontal, pré-frontal e parietal. Assim, temos uma alça na qual a informação vai do córtex aos núcleos da base e ao tálamo e de volta para o córtex, em especial para a área motora suplementar, uma das funções 23 dessa alça parece ser a de escolha e iniciação de movimentos voluntários (BEAR et al., 2008). O caudado e o putâmen, em conjunto, são chamados de estriado ou estriato, que é alvo da aferência cortical aos núcleos da base. Com adição do globo pálido, o qual é a origem das eferências ao tálamo, formam o corpo estriado ou estriatal (Figura 5). Os neurônios do estriato parecem estar espalhados aleatoriamente, contrapartida, em relação aos neurônios do córtex que estão organizados de forma ordenada. Contudo, essa aparência esconde um grau de complexidade na organização dos núcleos da base, ao quais participam de um grande número de circuitos paralelos, sendo apenas alguns poucos de função estritamente motora, outros estão envolvidos em certos aspectos da memória e da função cognitiva (BEAR et al., 2008). FIGURA 5. Imagem anatômica do cérebro humano, com destaque para as regiões do núcleo caudado, putâmen e globo pálido (corpo estriado ou estriatal). Disponível em: http://mindasks.blogspot.com.br/2012/09/neurociencia-16-area-da-inveja.html. Acessado em: 20/11/20012. 1.4. COPAÍBA, SUAS APLICAÇÕES FITOTERÁPICAS E O PARADIGMA EXPERIMENTAL O uso de plantas medicinais para fins terapêuticos tanto para o tratamento quanto para a prevenção de doenças é uma das praticas humanas mais antigas, e até o início da década de 1990 por volta de 65-80% da população dos países em 24 desenvolvimento dependia dessa pratica terapêutica como única forma de acesso a cuidados básicos de saúde (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2005). No cenário nacional, onde o uso de plantas medicinais também é intenso, o óleo-resina de copaíba se destaca por seu amplo uso, e os múltiplos efeitos terapêuticos registrados desde o século XVI (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2002). De acordo com a edição de 1996 do Index Kewensis, Copaifera L. possui 72 espécies, sendo que dezesseis existem somente no Brasil. Sendo encontradas facilmente na Região Amazônica, principalmente a espécie C. reticulata Ducke. São popularmente conhecidas como copaibeiras, ou pau d’óleo (LEITE & LLERAS, 1993; MORS & RIZZINI, 1976; PIO CORRÊA, 1931). A C. reticulata Ducke pertence ao gênero Copaifera L., a qual pela classificação de Engler, pertence à família Leguminosae Juss., subfamília Caesalpinoideae Kunth. Todavia, pelo sistema de classificação de Cronquist pertence à família Caesalpiniaceae R. Br. A classificação apenas como Fabaceae também é encontrada em alguns livros (HARBORNE et al., 1971). O óleo da copaíba é utilizado como antiinflamatório e cicatrizante pela medicina popular. Existem evidências científicas de efeitos antiinflamatórios, cicatrizantes e anti-proliferativos do óleo de copaíba em tecidos não neurais, como os do fígado, intestino e estômago (PAIVA et al., 2002; PAIVA et al., 2004; PAIVA et al., 1998; VEIGA JUNIOR et al., 2007). O componente mais abundante do óleoresina de C. Reticulata é o β-cariofileno, que corresponde a mais de 30% do óleoresina, sendo, apontado como agente responsavel pela ação antiinflamatória da copaíba (GUIMARÃES-SANTOS et al., 2012). O tratamento com óleo de copaíba parece induzir proteção tecidual apos lesão isquêmica do mesentério e este efeito parece estar relacionado á diminuição da peroxidação lipídica e resposta inflamatória (PAIVA et al., 2004). Há apenas o trabalho de Guimarãe-Santos et al., (2012), sobre o possível papel neuroprotetor do óleo de copaíba após lesão aguda do SNC. No presente estudo, investigamos experimentalmente os possíveis efeitos neuroprotetores do óleo resina de C. reticulata, que é popularmente usado como antiinflamatório e cicatrizante, em um modelo experimental de desordem neural aguda induzida por micro-injeções de endotelina-1 no estriato de ratos adultos. 25 1.5. OBJETIVOS 1.5.1. Geral Investigar o possível efeito inibitório da ativação microglial pelo óleo-resina de copaíba (C. reticulata) após lesão isquêmica aguda no estriato de ratos adultos induzida por micro-injeções de endotelina-1. 1.5.2. Específicos Descrever qualitativamente e quantitativamente os padrões histopatológicos após isquemia estriatal focal, nos grupos tratados com Copaíba e Tween no tempo de sobrevida de 7 dias. Descrever os padrões de ativação microglial após isquemia estriatal focal, nos grupos tratados com Copaíba e Tween no tempo de sobrevida de 7 dias. 26 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS Foram utilizados 10 ratos Wistar, machos adultos, pesando entre 250300g, provenientes do Biotério da Universidade Federal do Pará (UFPA), foram mantidos em condições padronizadas de temperatura, exaustão, ciclo de luz claro/escuro de 12 horas, água e comida ad libitum. Para este estudo foram planejados dois grupos experimentais. O grupo isquêmico tratado com óleo-resina de C. reticulata (N=5) e o grupo controleisquêmico tratado com Tween (N=5), ambos com tempo de sobrevida de 7 dias. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Neuroproteção e Neurorregeneração Experimental do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará. 2.2. MODELO DE ISQUEMIA FOCAL POR INJEÇÃO DE ENDOTELINA-1 Em estudos prévios ou de nossos colaboradores, determinamos o modelo experimental proposto (HUGHES et al., 2003; COSTA, 2006). Utilizamos os efeitos vasoconstritores do peptídeo endotelina-1 (ET-1) para induzir isquemia focal no corpo estriatal de ratos adultos, segundo protocolo adaptado de Hughes et al., (2003). Os animais foram profundamente anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p) de cloridrato de cetamina (72 mg/ Kg) e Xilazina (9 mg/ Kg). Os reflexos corneanos e de retirada das patas por estimulo à dor foram testados antes dos animais serem posicionados no aparelho estereotáxico (Insight, Brasil). A estereotaxia e a cirurgia foram iniciadas somente quando estes reflexos foram abolidos pela anestesia. Uma pequena abertura foi realizada no crânio dos animais com auxilio de um motor de baixa rotação para cirurgias odontológicas, sendo utilizadas as seguintes coordenadas estereotáxicas para injeções de ET-1 (40 pmol 27 diluídos em 1 µl de solução salina estéril) no corpo estriado, em relação ao Brégma: Antero-posterior: 1,0; médio-lateral: 2,0; dorso-ventral: 4,0 (Paxinos, 1982). O corante azul de colanil foi adicionado a endotelina-1 para a identificação do epicentro da lesão. Após a cirurgia, os animais foram mantidos com água e comida à vontade durante o tempo de sobrevida 168h (7dias). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas sugeridas pelo Comitê de Ética Em Pesquisa Com Animais de Experimentação da UFPA (CEPAE) e de acordo com normas internacionais da Society for Neuroscience and National Institutes of Health. 2.3. TRATAMENTO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS Neste presente estudo, utilizamos o protocolo descrito por GuimarãesSantos et al., (2011) para a inibição da ativação microglial. O óleo-resina de C. reticulata foi diluído em Tween (detergente não iônico para uso em laboratório), a 5% e aplicado no grupo tratado com copaíba, já o grupo controle recebeu apenas Tween a 5%, ambos os grupos receberam os tratamentos de forma intraperitoneal (i.p). Os animais experimentais e controles isquêmicos receberam duas injeções diárias (i.p) de 100 mg/kg de copaíba ou Tween de 12 - 12h, totalizando 200mg/kg por dia, durante os seis dias de tratamento e no sétimo dia os animais foram perfundidos. 28 2.4. PERFUSÃO Os animais foram profundamente anestesiados com injeção intraperitoneal (i.p) de uma mistura de cloridrato de cetamina (Vetanarcol®, König. 72mg/kg) e Xilazina (Kensol®, König. 9mg/kg). Abolidos os reflexos de retirada da pata e corneano, os mesmos foram perfundidos através do ventrículo esquerdo do coração com 250-300 ml de tampão fosfato salina (PBS 0,1M; 0,9%; pH 7,2 – 7,4) heparinizada, seguido de 250-300 ml de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato (PB 0,1M; pH 7,2 – 7,4). Após a craniotomia, os encéfalos foram pós-fixados por 24h no mesmo fixador. Em seguida, os encéfalos foram crioprotegidos em soluções com concentrações crescentes de sacarose diluída em mistura de glicerina com tampão fosfato 0,05M pH 7,2 – 7,4. Os encéfalos foram embebidos em Tissue Tek para congelamento à – 55°C em câmara de criostato (Microm HM 505 E). Secções coronais com 30μm de espessura foram obtidas após corte no criostrato e colocadas diretamente em lâminas gelatinizadas, as mesmas foram armazenadas em um freezer à temperatura de –20 ºC aguardando a realização dos procedimentos histológicos. 2.5. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICA 2.5.1. Análise Histopatológica Geral A análise histopatológica foi realizada pela coloração violeta de cresila. Esta coloração permite a visualização de corpos celulares e a perda dos mesmos em situações patológicas (DOS SANTOS et al., 2007; LIMA et al., 2008; GUIMARAES et al., 2009). A técnica nos permite identificar o epicentro da lesão isquêmica provocada pela injeção de endotelina-1. Secções mais próximas ao epicentro lesivo foram escolhidas para análise histopatológica. 29 2.5.2. Imunohistoquímica A ativação microglial/macrófagica foi identificada através da imunomarcação pelo anticorpo ED1 (1:200; Sorotec), que reconhece um epítopo na membrana de lisossomas de macrófagos ativados (ROBINSON et al., 1986). Os corpos neuronais foram marcados pelo anticorpo anti-NeuN (1:100, ChemiconMillipore), o qual marcada um epítopo específico no núcleo de neurônios maduros (MULLEN et al., 1992). O protocolo utilizado para técnica de imunohistoquímica foi adaptado de Gomes-Leal et al., (2002). Antes de passar pelo processo de imuno as secções sofreram pré-tratamento com o objetivo de recuperar sítios antigênicos e bloquear enzimas endógenas. As secções passaram pelos seguintes processos: PRÉ-TRATAMENTO: Estufa à 40ºC - 30 min; Lavadas em PBS - 3 min; Tampão Borato (65ºC) – 30 min; Lavadas em PBS - 3 min; Metanol + Peróxido de Hidrogênio – 20 min; Lavadas em PBS/Tween – 3 min (X3); Incubadas em soro normal de cavalo a 10% - 1h; Incubadas em Anticorpo Primário (ED-1 ou NeuN) – over night; Lavadas em PBS/Tween – 3 min (X3); Incubadas em Anticorpo Secundário Anti-Camundongo feito em Cavalo - 2h; Lavadas em PBS/Tween – 3 min (X3); Incubadas no Complexo Avidina-Biotina Peroxidase – 2h; Revelação utilizando Diaminobenzidina – DAB. Após o término da revelação, as secções foram lavadas em PB 0,1 M (pH 7,2 – 7,4), desidratadas em gradientes de álcool (70%, 80%, 90%, Absoluto I e Absoluto II), lamínula. xileno I e II para posterior montagem com Entellan® (Merck) e 30 2.6. ANÁLISE QUALITATIVA As secções marcadas pelos diferentes métodos de imunoistoquímica foram inspecionadas em microscópio óptico (Nikon® – ECLIPSE 50i). As imagens foram captadas por câmera fotográfica (Moticam® – 5500 – 5 MPixels) acoplada a microscópio óptico (Nikon® – ECLIPSE 50i) com os aumentos 10X e 40X da área de lesão. 2.7. ANÁLISE QUANTITATIVA 2.7.1. Método de Contagem Contou-se o número de micróglias ativadas (células ED1+) e corpos neuronais (células NeuN+) de todos os grupos experimentais, utilizando-se uma objetiva de 40X, com o uso de uma gradícula de área 0.0625 mm2 acoplada à ocular de um microscópio óptico (Nikon® – ECLIPSE 50i). Utilizou-se nas contagens 3 secções por animal, 25 campos por secção, e 5 animais para cada grupo experimental. 2.7.2. Análise Estatística Foi utilizado o teste t de student para amostras independentes para comparação entre o grupo tratado com Copaíba e o com Tween, com nível de significância p<0,05. Os resultados foram expressos em gráficos como média (± erro padrão da média). A construção gráfica e a análise estatística foram realizadas no programa BioEstat 5.0. 31 3. RESULTADOS 3.1. O TRATAMENTO COM COPAÍBA REDUZ A PRESENÇA DE CÉLULAS POLIMORFONUCLEARES EM LESÃO ESTRIATAL ISQUÊMICA. A injeção de 40 pmol de et-1 no estriato de ratos wistar adultos induziu o surgimento de células polimorfonucleares na região isquêmica, tal fenômeno ocorre em células lesadas, após lesão isquêmica estriatal. Tais células são reveladas pela coloração violeta de cresila (Figura 6). As células estão mais presentes nos animais tratados com Tween (Figura 6 A-B), e com menor presença nos animais tratados com copaíba (Figura 6 C-D). Estes resultados estão de acordo com estudos prévios (GOMES-LEAL et al., 2005; LIMA et al., 2008; SOUZA-RODRIGUES et al., 2008). 3.2. PERDA NEURONAL TRODUZIDA POR ET-1 NO ESTRIATO É MINIMIZADA PELO TRATAMENTO COM COPAÍBA. Para avaliar a presença de corpos neuronais no estriato lesado, foi realizado imunoistoquímica para NeuN (Figura 7), o qual marca um epítopo específico no núcleo de neurônios maduros (GOMES-LEAL et al., 2002). A injeção de ET-1 no estriato induziu intensa perda neuronal no tempo de sete dias de sobrevida, tal fato ficou mais notório no grupo tratado com Tween (Figura 7A), com pouca presença de corpos neuronais no centro da lesão (Figura 7B). Entretanto, no grupo tratado com copaíba houve maior presença de corpos neuronais (Figura 7C), com presença de células no centro da lesão (Figura 7D). Estes resultados foram confirmados por análise quantitativa com média de 8,66 para o grupo Tween e 24,09 para o grupo Copaíba (Figura 7E). 32 Endotelina 1 - Tween A B * VL Endotelina 1 - Copaíba C D * VL ▬ FIGURA 6. Análise histopatológica em coloração com violeta de cresila. Presença de ▬ células polimorfonucleares em animais injetados com ET-1 e tratados com Tween (A-B) ou Copaíba (C-D). Houve diminuição na presença de células polimorfonucleares após o tratamento com copaíba (C-D). O asterisco indica o epicentro da lesão. VL corresponde ao ventrículo lateral. Escalas: A,C (300µm); B,D (50µm). 33 Endotelina 1 - Tween A B → * → VL Endotelina 1 - Copaíba C D → → → * VL ▬ E ▬ Células / campo (Média) Células NeuN + 35 * 30 25 20 15 10 5 0 Tween Copaíba FIGURA 7. O tratamento com copaíba aumenta o número de corpos celulares após lesão estriatal (C), como revelado por imunoistoquimica para células NeuN +. Animais tratados com Tween houve redução drástica de neurônios (A), principalmente no centro da lesão (B), já no grupo Copaíba ocorre maior presença de corpos neuronais no centro da lesão (D). Densidade de corpos neuronais examinada 7 dias após lesão isquêmica (E). Notar que o grupo tratado com Copaíba exibiu maior quantidade de corpos neuronais maduros no estriato lesado (E). Os asteriscos mostram o epicentro da lesão. As setas apontam para neurônios maduros. VL para ventrículo lateral. Escala: A, C = 300 µm; B, D = 50 µm. 34 3.3. O TRATAMENTO COM ÓLEO-RESINA DE COPAÍBA INIBE ATIVAÇÃO MICROGLIAL APÓS LESÃO EXITOTÓXICA ESTRIATAL POR ET-1. Realizamos imunoistoquímica para ED-1, um anticorpo que marca microglia ativada, ou seja, microglia com formato amebóide e ação fagocitária (GOMES-LEAL et al., 2005). A injeção de ET-1 no estriato promoveu a esperada infiltração intensa de microglia ativada no centro e na periferia da lesão isquêmica (Figura 8). Contudo, o grupo tratado com óleo-resina de Copaíba apresentou uma drástica diminuição do recrutamento de microglia ativada (Figura 8C-D), em relação ao grupo tratado com Tween (Figura 8A-B). Esta relação demonstrou-se mais evidente através da analise quantitativa com média de 53,74 para o grupo Tween e 26,67 para o grupo Copaíba (Figura 8E). Endotelina 1 - Tween A 35 B * VL → → → → Endotelina 1 - Copaíba D C → * VL → → * ▬ Células / campo (Média) E 70 ▬ Células ED-1 + 60 50 40 30 20 10 0 Tween Copaíba FIGURA 8. Cérebros de animais tratados com Tween (A-B) ou Copaíba (C-D). Houve diminuição na ativação de células microgliais no grupo tratado com copaíba (C-D), em relação ao tratado com Tween (A-B), o qual houve intensa ativação microglial. Esta relação ficou bem nítida na analise quantitativa (E). Notar que o grupo Copaíba apresentou menor ativação microglia no estriato. Asteriscos = epicentro da lesão; Setas = microglias ativadas; VL = ventrículo lateral. Escalas: A,C = 300 µm (10X); B,D = 50 µm (40X). 36 4. DISCUSSÃO No presente estudo, foram realizadas microinjeções do agonista glutamatérgico ET-1 no estriato de ratos adultos com o objetivo de induzir lesão neuronal aguda. Este modelo de lesão isquêmica possui características histopatológicas, incluindo perda tecidual necrótica e intensa inflamação, similar aos modelos experimentais de trauma e isquemia, tais eventos são similares aos que ocorrem em humanos após trauma e AVE (GOMES-LEAL at al., 2004, 2005; SOUZA-RODRIGUES et al., 2008; DOS SANTOS et al., 2007; LIMA et al., 2008). Esta associação está ligada ao fato de existir forte evidência experimental que o acúmulo de aminoácidos excitatórios é um evento fisiopatológico comum a diversas desordens neurais, tanto em animais de experimentação quanto em humanos (MELDRUM, 1994). Neste estudo, foram analisados os efeitos de injeções intraperitoniais de 200 mg/kg do óleo-resina da C. reticulata sobre ratos adultos submetidos a lesão excitotóxica induzida por ET-1 e analisados sete dias após a lesão, com o objetivo de avaliar a ativação microglial/macrofágica (GOMES-LEAL at al., 2004, 2005; LIMA et al., 2008; GUIMARÃES-SANTOS et al., 2012). Apesar do uso tradicional da Copaíba na medicina popular como antiinflamatório e cicatrizante de alto desempenho, e das evidências científicas disponíveis na literatura sugerindo estes efeitos em tecidos não neurais, o potencial terapêutico da mesma foi pouco investigado em modelo de lesão aguda do SNC, havendo apenas o trabalho de Guimarães-Santos et al. (2012). A concentração do óleo-resina da C. reticulata usada na presente investigação, foi baseada em investigação prévia que mostrou um claro efeito antioxidante, antiinflamatório e neuroprotetor do óleo-resina de Copaíba na concentração de 400 mg/Kg em lesão excitotóxica por NMDA no córtex motor de ratos adultos (GUIMARÃES-SANTOS et al., 2012). Todavia, nosso estudo avaliou a ação terapêutica da Copaíba em concentração inferior (200 mg/Kg), com obtenção de resultados semelhantes a concentração de 400 mg/Kg. A injeção de ET-1 no estriato de ratos adultos induziu intensa perda neuronal no tempo de sete dias de sobrevida, tal fato foi comprovado através da 37 quantificação de células NeuN positivas (GOMES-LEAL at al., 2004, 2005; LIMA et al., 2008). O grupo tratado com Tween apresentou baixa densidade celular na região estriatal lesionada por ET-1, caracterizando um quadro de perda celular intensa, principalmente no centro da lesão. Contudo, o grupo tratado com Copaíba apresentou maior quantidade de corpos neuronais (NeuN +) no estriato lesionado, com zona sub-ventricular mais populosa de células Neun +, em relação ao grupo tratado com Tween. Os mecanismos pelos quais a Copaíba atua na preservação tecidual após lesão estriatal aguda são desconhecidos. Especula-se que componentes do óleoresina inibam a liberação de citocinas pró-inflamatóriais (VEIGA JUNIOR et al., 2007), bem como aumentam os níveis de neurogênese endógena (GUIMARÃESSANTOS et al., 2012). O tratamento diário de ratos com lesão isquêmica por ET-1 durante seis dias com 200 mg/Kg de Copaíba diminuiu significativamente (em torno de 60%) a ativação microglial/macrofágica após lesão aguda do estriato. A comparação com outros estudos demonstraram que esta redução foi mais intensa que a obtida pela minociclina, uma tetraciclina semi-sintética que comprovadamente inibe a ativação microglial após isquemia, lesão da medula espinhal e outras desordens neurais agudas (YRJÄNHEIKKI et al., 1999; HAYAKAWA et al., 2008; CARDOSO et al., 2012). Tal ativação ocorre em torno da 1-2 semana após desordens agudas (MORIOKA et al., 1993; CLARK et al., 1993; GOMES-LEAL et al., 2004, 2005; THORED et al., 2009), incluindo lesão excitotóxica (BOLTON &PERRY, 1998; LIMA et al., 2008), e perdura por vários dias após a lesão (THORED et al., 2009). A ativação microglial após desordens neurais agudas está fisiologicamente relacionada aos eventos fagocitários, os quais são importantes para remoção de restos celulares de células mortas por necrose e/ou apoptose (STREIT, 1999). Essa ação é benéfica e contribui para o controle do processo inflamatório, favorecendo a regeneração e a neuroproteção (PERRY et al., 1987; NEUMANN et al., 2006, 2009). Entretanto, inúmeras evidências experimentais sugerem que a ativação microglial excessiva, não controlada das células microgliais é extremamente deletéria e intensifica o processo lesivo do AVE (YRJÄNHEIKK et al., 1999; BLOCK, 2007; HAYAKAWA et al., 2008). 38 Células ED+ são macrófagos extremamente ativados, derivados tanto da microglia residente quanto das células hematogênicas (POPOVICH & HICKEY, 2001). A considerável diminuição do número destas células após tratamento com Copaíba pode ter contribuído para a neuroproteção observada no presente estudo. Os mecanismos pelos quais o tratamento com Copaíba diminui a ativação microglial e induz neuroproteção são desconhecidos. No entanto, alguns estudos mostram uma grande concentração de sesquiterpenos e outros terpenos no óleo-resina de Copaíba (PEDREIRA, 2007; GOMES et al., 2006; VEIGA JUNIOR et al., 2007; SANTOS et al., 2008; GUIMARÃES-SANTOS et al., 2012). Entre os sesquiterpenos, o β-cariofileno representa 40 a 86% do total da constituição química, sendo o principal componente químico de C. reticulata (PEDREIRA, 2007; GOMES et al., 2006; VEIGA JUNIOR et al., 2007; SANTOS et al., 2008; GUIMARÃES-SANTOS et al., 2012). Os altos teores de β-cariofileno presente na Copaíba são indicativos de que o mesmo possa ser o possível princípio ativo, responsável pela diminuição da ativação microglial e neuroproteção. Não existem estudos que tenham investiga o papel do β-cariofileno no tratamento de AVE experimental. Todavia, sua propriedade canabinóide restrita ao receptor CB(2), o qual é antiinflatamatório e não psicoativo, já foi avaliado como estratégia terapêutica para o tratamento de processos inflamatórios, dor, aterosclerose e osteoporose (GERTSCH et al., 2008). O uso oral de β-cariofileno reduz intensamente a inflamação causada pela carregenina em camundongos do tipo selvagem, no entanto, não em nocautes para CB(2), propondo uma dependência do CB(2) para a atividade do β-cariofileno (GERTSCH et al., 2008). É sugerido que o mecanismo envolve a inibição da expressão de citocinas próinflamatórias no sangue periférico e também a redução do fosforilamento de Erk1/2 e JNK1/2 em monócitos, ambas estimuladas por LPS e responsáveis pelos fenótipos microglial considerado prejudicial (GERTSCH et al., 2008). Outra possibilidade de ação antiinflamatória do receptor CB(2) envolve a inibição do TNF-α, o qual parece possuir tanto efeitos benéficos quanto prejudiciais na lesão neural. Os receptores TNF-p55 são considerados pela maioria dos autores como benéficos em caso de lesão aguda, em paralelo com a tolerância isquêmica neuronal induzida pelo TNF-α em episódios de curta duração de hipóxia ou anóxia (TAOUFIK et al., 2009; LAMBERTSEN et al., 2009). Outros autores consideram o TNF-α como lesivo, através da ação nos receptores TNFR1 (WANG et al., 2004). A 39 atividade supressora do β-cariofileno sobre o TNF-α de papel lesivo poderia estar envolvida nos efeitos neuroprotetores descritos anteriormente. A inibição de TNF-α causada por agonistas de CB(2), observada em culturas de parede vascular aórtica, indica que através de um mecanismo indireto, componentes do óleo-resina de Copaíba podem suprimir moléculas de adesão celular, a proteína quimioatratora de monócitos e, portanto, interferir com a migração e adesão de monócitos e outros leucócitos (RAJESH et al., 2007). 40 5. CONCLUSÃO O tratamento com óleo-resina de Copaíba C. reticulata, na concentração de 200 mg/kg, diminui consideravelmente a ativação microglial/macrofágica, em torno de 60% em relação ao grupo tratado com Tween. O tratamento com Copaíba diminuiu o processo de perda neuronal no centro e em torno da área da lesão em ratos adultos no tempo de sete dias de sobrevida após lesão estriatal por ET-1. Os efeitos do tratamento com Copaíba, com diferentes concentrações e tempos de sobrevida, sobre outras células inflamatórias, bem como os eventos moleculares envolvidos, devem ser investigados em estudos futuros para a compreensão dos mecanismos de ação desta planta no SNC lesado. 41 6. REFERÊNCIAS ABBAS, A.K. & JANEWAY, C.A., JR. Immunology: improving on nature in the twentyfirst century. Cell, v.100, n.1, p.129-138. 2000. ABRAMCZUK, B.; VILLELA, E. A luta contra o AVC no Brasil. ComCiência, n.109, 2009. ARVIDSSON, A.; COLLIN, T.; KIRIK, D.; KOKAIA, Z.; LINDVALL, O. 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