modulação pré

A transmissão colinérgica no nervo frénico-diafragma do
rato: modulação pré-sináptica.
Alves, R., Moreira, R., Rocha, C.
Departamento de Farmacologia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Portugal, 2002
O objectivo do nosso trabalho foi o estudo da transmissão colinérgica no nervo frénico-diafragma. Para tal,
foram utilizados diferentes fármacos (tubocurarina, decametónio, eserina, atropina, pilocarpina,
acetilcolina) sobre uma preparação sujeita a uma estimulação eléctrica de frequência contínua (0,13 Hz).
Foi-nos permitido concluir que na junção neuromuscular existem, a nível pós-sináptico, receptores
nicotínicos (NM), enquanto que a nível pré-sináptico se verifica a existência de ambos os receptores
colinérgicos (nicotínicos e muscarínicos). Os nossos resultados levam-nos a crer que os receptores présinápticos são responsáveis por uma modulação da resposta, que pode ser do tipo inibitório (M2) ou
facilitatório (M1 e NN).
Introdução
Na extremidade terminal do axónio motor, responsável pela enervação do músculo, encontramos vesículas
sinápticas que contêm Acetilcolina (Ach). Quando é aplicado um impulso eléctrico no axónio motor dá-se
uma despolarização da membrana nervosa e um consequente aumento da permeabilidade, da mesma, ao
cálcio extracelular. Esta entrada de cálcio vai despoletar a fusão das vesículas de Ach com a membrana
nervosa e consequente libertação de mediador na fenda sináptica. A Ach vai-se, então, ligar aos receptores
existentes na membrana da célula motora, aumentando a permeabilidade desta aos iões sódio e potássio e
desencadeando um potencial de acção, o que leva a uma contracção. (#31)
A Tubocurarina (Tb) é um bloqueador selectivo para os receptores nicotínicos, que compete com a Ach
para os mesmos. Este composto é, também, referido como sendo um bloqueador não despolarizante, o que
significa que, ao ligar-se aos receptores nicotínicos, não ocorre qualquer estimulação dos mesmos (não há
abertura dos canais iónicos) e, consequentemente, não há o risco de despolarização da fibra muscular.
A Eserina (Ese) é um inibidor reversível das acetilcolinesterases (AchE), e a sua acção vai, portanto,
permitir que haja um aumento de concentração de Ach na fenda, uma vez que esta não vai ser degradada .
O Decametónio (Dec) é um bloqueador despolarizante selectivo para os receptores nicotínicos, tendo um
efeito semelhante àquele que é produzido por um excesso de Ach; logo vamos ter os canais de sódio e
potássio permanentemente abertos e, como resultado, uma interminável despolarização.
A atropina (Atr) é um antagonista muscarínico que tem diferente afinidade para os subtipos de receptores
existentes, consoante a concentração em que é utilizada
A Pilocarpina (Pil) é um agonista parcial muscarínico, tendo, supostamente, uma maior afinidade para os
receptores M2. (#2)
Material
Preparação: Frénico-diafragma de rato num banho de órgãos isolados, mergulhado em 50 ml de líquido
nutritivo de Krebs, arejado com carbogénio (95% O2, 5% CO2).
Sistema de registo: Quimógrafo/Alavanca de mola com inscrição lateral.
Estimulador de ondas quadradas: condições de estimulação (frequência) reguladas em função da sensibilidade
do fragmento.
Micropipeta
Fármacos
Tubocurarina
Eserina
Decametónio
Atropina
Pilocarpina
Acetilcolina
Protocolo experimental
Trabalho 1
Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções tenha uma amplitude uniforme).
Adicionar 100 µl de tubocurarina.
Depois de atingido o efeito máximo, adicionar 100 µl de eserina. Observar o efeito.
Lavar a preparação e aguardar até que o registo retome a amplitude inicial.
Adicionar 100 µl de decametónio.
Adicionar 100 µl de eserina. Observar o efeito.
Trabalho 2
Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme)
Adicionar volumes cumulativos (10 µl) de atropina (C=1 mg/ml). Observar o efeito.
Lavar a preparação.
Partindo de uma solução inicial de pilocarpina (C=367 µg/ml) preparar duas soluções diluídas, sendo uma
1:10 e outra 1:100
5.
Adicionar volumes cumulativos (10 µl) partindo da solução mais diluída até à mais concentrada. Observar o
efeito.
Lavar a preparação.
Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme)
Adicionar 100 µl de pilocarpina (C=367 µg/ml)
Adicionar volumes cumulativos (100 µl) de atropina (1 mg/ml)
Observar o efeito.
Trabalho 3
Período de estabilização da preparação (até o registo das contracções ter uma amplitude uniforme)
Partindo de uma solução inicial de acetilcolina (2mg/ml) preparar uma solução diluída de 1:100
Adicionar volumes cumulativos de 10 µl da acetilcolina preparada anteriormente. Observar o efeito.
Lavar a preparação.
Adicionar 300 µl de atropina 1mg/ml (em volumes de 100 µl e 200µl sucessivamente)
Juntar doses cumulativas de acetilcolina 2 mg/ml nos seguintes volumes: 10, 10, 10, 100, 100, 200, 200, 200
µl.
Adicionar 100µl de eserina.
Juntar novamente 100µl de Atropina. Observar o efeito.
Discussão
Trabalho 1
A primeira parte do nosso trabalho consiste no estudo dos receptores pós-sinápticos colinérgicos, a nível
da placa motora, na junção neuromuscular. Salientamos que neste primeiro estudo foram desprezados
quaisquer contributos provenientes de uma possível modulação pré-sináptica.
100
% resp
80
60
40
20
0
Controlo
Tb
Ese
Lavagem
Após a adição de Tb à preparação previamente estabilizada foi possível verificar um decréscimo de
resposta contráctil até total ausência desta, efeito este que foi ligeiramente revertido pela adição de Ese à
preparação.
A que se deve isto? A Tb vai competir com a Ach para os receptores nicotínicos da placa motora
(NM).Essa competição justifica-se com a diminuição gradual da contracção.
Este composto, ao ligar-se aos receptores nicotínicos, não provoca qualquer estimulação dos mesmos e,
consequentemente, não ocorre despolarização da fibra muscular. O facto da Tb estar a ocupar os receptores
vai aumentar a probabilidade de degradação da Ach pelas colinesterases, diminuindo a possibilidade de haver
competição, atingindo-se, então, um estado de ausência de contracção. O facto de a Tb ser selectiva para os
receptores nicotínicos e conseguir inibir totalmente a contracção prova-nos que esta se deve, à partida, aos
receptores nicotínicos; caso existissem receptores muscarínicos na placa motora, a resposta não desapareceria
totalmente, podendo a Ach endógena, presente na fenda, mediar a contracção.
A Ese actua sobre as colinesterases, inibindo-as, e vai, portanto, permitir que haja um aumento de
concentração de Ach na fenda, uma vez que esta não vai ser degradada e está a ser continuamente libertada,
por acção de estímulo eléctrico. Isto cria uma situação em que existem concentrações de Ach suficientemente
elevadas para competir com a Tb para os receptores e, portanto, verificamos um ressurgimento da contracção,
o que ajuda a provar o efeito não despolarizante da Tb. No entanto, essa contracção fica longe de atingir o
máximo, já que estamos na presença de um antagonismo competitivo e de grande parte dos receptores
estarem ainda ocupados por Tb.
Desta vez, foi usado o Dec para bloquear os receptores nicotínicos da placa motora. Tal como com a Tb,
também se verificou o desaparecimento total da contracção apesar da contínua estimulação. No entanto, a
adição de Ese mostra-se incapaz de levar ao reaparecimento da contracção, ao contrário do caso analisado
anteriormente.
O Dec vai provocar uma interminável despolarização, o que não permite que um impulso seja gerado ao
longo da fibra muscular e, portanto, não permite a contracção da mesma. A Ese, neste caso, não vai levar à
obtenção de qualquer contracção, porque, apesar de provocar um aumento da concentração de Ach na fenda,
esta é incapaz de activar os receptores no sentido de haver uma contracção, porque ocorreu uma
dessensibilização dos mesmos.
Deste estudo podemos inferir que os receptores nicotínicos envolvidos no processo de contracção são
passíveis de serem dessensibilizados. Isto mostra-nos a necessidade do organismo possuir um mecanismo de
regulação da resposta contráctil, possivelmente uma modulação pré-sináptica, que nos serve como base para
os próximos estudos.
Trabalho2
“The results showed that atropine had a dual action at the neuromuscular junction; at low concentrations
(0,001-1,0 microM) enhanced, whereas at high concentrations (greater than 1,0 microM) decreased the
twitch, tetanic and post-tetanic twitch responses in the rat diaphragm preparation.” (#22)
Adicionando concentrações crescentes de atropina verifica-se uma ligeira diminuição da resposta, o que
seria de esperar tendo em conta a gama de concentrações usadas (superiores a 1,0 microM).
Tendo em conta que anteriormente verificamos que não existiam receptores muscarínicos a nível póssináptico, somos levados a concluir que qualquer alteração que seja mediada por receptores muscarínicos se
deve essencialmente a uma modulação pré-sináptica.
Deste modo, sendo a atropina um antagonista muscarínico e como nas concentrações referidas se verifica
uma diminuição da contracção, estaremos provavelmente a bloquear receptores do tipo facilitatório (M1).
Considerando que a Pil é “partial and putatively M2-selective agonist” e que este subtipo de receptores
muscarínicos medeia, neste caso concreto, uma modulação inibitória, esperaríamos, à partida, uma
diminuição da resposta contráctil. Todavia, pela adição de doses crescentes de pilocarpina observa-se um
aumento na amplitude da contracção, o que contradiz o referido anteriormente e nos permite deduzir que,
afinal, a pilocarpina actuou nos receptores facilitatórios (M1).
Outra explicação possível é a possibilidade de a Pil, em presença de altas quantidades de mediador
endógeno, deixar de se comportar como um agonista parcial e passar a apresentar características de um
antagonista. Desta forma, já poderá estar a actuar em receptores do tipo M2 bloqueando-os, o que justifica o
aumento de contracção verificado.
Trabalho 3
Quando colocamos Ach em concentrações não suficientes para causar dessensibilização dos receptores,
verifica-se um ligeiro aumento da contracção, o qual pode ser explicado por uma maior acção por parte deste
composto na placa motora, visto a concentração ser agora mais elevada do que a concentração controlo do
mediador endógeno.
No entanto, após a adição de mais Ach, até se atingir a concentração de 88 nM no banho, verificou-se
uma ligeira diminuição na intensidade contráctil. Isto poderá resultar de uma modulação pré-sináptica do tipo
inibitório devida a uma concentração de Ach suficiente para activar os receptores responsáveis por este efeito
(M2) ou então poderá dever-se a um início de dessensibilização, já que as doses de Ach foram aumentando
gradualmente.
Na presença de Atr, verificou-se um aumento da intensidade de contracção após a adição de Ach, o que
ocorre mais intensamente e com concentrações mais baixas do que o verificado para a adição de Ach sozinha.
Visto a Atr bloquear os receptores muscarínicos (pré-sinápticos), a Ach vê-se incapacitada de actuar neles e,
como tal, não há inibição na quantidade de Ach libertada pela estimulação eléctrica, ao contrário do que
acontecia no caso anterior. No entanto, este aumento da contracção verificado com Ach na presença de Atr, é
o mais significativo de todos; isto levar-nos-ia a pensar que, além do mecanismo inibitório estar
comprometido, poderíamos estar na presença de outros receptores moduladores da libertação de Ach que não
fossem bloqueados pela Atr, mas nos quais a Ach conseguisse actuar facilitando a libertação da Ach
vesicular. Estes receptores teriam de ser, logicamente, do tipo nicotínico.
Por este processo facilitatório e pela adição de Ach, esta passa a estar em concentração suficiente para
competir com a Atr, deslocando-a dos receptores muscarínicos. Deste modo, os receptores pré-sinápticos
anteriormente ocupados vão poder novamente modular a resposta , provocando uma ligeira diminuição da
contracção que se deverá em princípio à maior afinidade que, possivelmente, a Ach poderá ter para se ligar
aos receptores M2.
É importante notar, que todos estes resultados poderão estar influenciados por uma certa dessensibilização
dos receptores, tendo em conta as condições do trabalho. Ao trabalharmos com contracções de controlo já
próximas da máxima, todas as variações verificadas serão pouco significativas e esclarecedoras, dando
respostas pouco fiáveis, que poderão ser consideradas como artefactos.
Para além disso, também há que considerar a existência de co-transmissão, em que há a libertação de
outros mediadores endógenos das vesículas colinérgicas, tais como, ATP e VIP, que poderão influenciar estas
respostas obtidas. Também há indícios de uma possível acção por parte da 5-HT, em determinadas condições
e que poderão influenciar a transmissão nervosa na placa motora. (#24)
Diversos estudos referem a existência de variados tipos de receptores pré-sinápticos, tanto facilitatórios
(nicotinícos, muscarínicos, α1, β1, A2a, etc.), com o intuito de promover um aumento de Ach libertada de
forma a haver uma rápida e máxima activação dos músculos esqueléticos, como inibitórios (muscarínicos, α2,
β, receptores para o NO, P1), que têm como objectivo limitar a quantidade de Ach libertada de forma a
prevenir uma estimulação exarcebada das células efectoras. (#14)
Conclusão
Com a realização deste trabalho, verificámos que, no nervo frénico-diafragma, existem receptores
nicotínicos (NM), que se situam a nível pós-sináptico e são responsáveis pela contracção. Estes receptores
são susceptíveis de sofrerem uma dessensibilização.
Durante o processo contráctil, a Ach libertada pode automodular-se, quer por mecanismos inibitórios
(M2), quer por mecanismos facilitatórios (M1 e NN); estes receptores estão presentes a nível pré-sináptico.
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