tese final 10.11.05 - DQI

Transcrição

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE DUAS
ESPÉCIES DA FAMÍLIA RUBIACEAE:
Cephalanthus glabratus e Palicourea crocea
Tese apresentada por Tereza Cristina
Marinho Jorge ao Programa de PósGraduação em Química do Departamento
de Química do Centro de Ciências Exatas
da Universidade Estadual de Maringá
como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Doutor em Química.
MARINGÁ, MARÇO/2005
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DA
FAMÍLIA RUBIACEAE: Cephalanthus glabratus e Palicourea crocea
TEREZA CRISTINA MARINHO JORGE
ORIENTADORA: Profa. Dra. MARIA HELENA SARRAGIOTTO
MARINGÁ, MARÇO/2005
À memória de minha mãe querida...
E quem diria?
À memória gloriosa de meu pai.
ii
AGRADECIMENTOS
À Profª. Drª. Maria Helena Sarragiotto, exemplo de dedicação e
profissionalismo, por ter aceitado me orientar, pela disponibilidade com que sempre
me recebeu e pelos ensinamentos indispensáveis à realização deste trabalho.
Ao meu marido Amaury Cezar Jorge e meus filhos Ivan Marinho Jorge e
Mariana Marinho Jorge – três razões de minha vida; por terem compreendido
minha ausência e me incentivado a continuar este curso.
À Lilian T. Düsmann aluna do Programa de Pós-graduação e Ana Paula
Ozima, acadêmica do Curso de Química e aluna do Programa de Iniciação
Científica, pela colaboração nos trabalhos práticos e pelas inúmeras vezes em que
realizaram mais do que o combinado.
Aos colegas do Laboratório de Produtos Naturais da UEM: Isis M.
Figueiredo, Anderson R. dos Santos, Maria da Conceição T. Truiti e Anelise S.
Nazari Formagio, que souberam cultivar muito bem o espírito de companheirismo.
À Drª Ivânia T. Schuckel, funcionária da UEM, pela realização das análises
de RMN e pelo interesse que sempre demonstrou em auxiliar minhas dúvidas.
À Profª. Drª. Cleuza C. da Silva, Professora de Química Orgânica do
Programa de Pós-graduação, pelas sugestões e gestos de consideração.
Aos professores da UEM: Profª. Drª. Maria Conceição de Souza, pela
identificação botânica das plantas; Profª. Drª. Lucília M. Zamuner, Profº. Drº.
Benedito Dias Prado, Profª. Drª. Ciomar A. B. Amado e Profa. Dra. Tânia
Nakamura, pela realização dos ensaios biológicos.
A Cleverson C. Bocca, aluno do Programa de Pós-graduação em Química,
pela realização dos cálculos de estrutura eletrônica; a Rafael R. Soares, aluno do
Programa de Pós-graduação em Química, pela realização dos espectros no UV–Vis;
à Ana Maria A. Bareli, funcionária da UEM, pela execução das análises de massas
e IV e a Moacir Torres, técnico do laboratório, pelo pronto atendimento às minhas
solicitações.
Aos funcionários e professores do Departamento de Química da UEM,
envolvidos no Programa de Pós-graduação, pelo esforço e vontade de oferecer este
curso com qualidade.
À UNIOESTE – Universidade Estadual do Oeste do Paraná e a meus
colegas de trabalho que possibilitaram a realização deste curso.
Ao CAPES pela bolsa de estudo concedida.
iii
RESUMO
Palavras-chave: Palicourea crocea; Cephalanthus glabratus; estudo químico;
atividade farmacológica; alcalóides; triterpenóides.
O presente trabalho é parte de um projeto realizado no município de Porto
Rico - PR, que visa conhecer o potencial químico e farmacológico de espécies
nativas nesta região. As plantas Palicourea crocea e Cephalanthus glabratus
pertencem à Família Rubiaceae e ocorrem num trecho do alto rio Paraná em Porto
Rico, denominado planície alagável. Um levantamento bibliográfico sobre os gêneros
Cephalanthus e Palicourea demonstrou ausência de estudos fitoquímicos sobre as
espécies P. crocea e C. glabratus, que motivou a realização deste trabalho, cujos
objetivos foram o seu estudo químico e a avaliação das atividades farmacológicas. O
estudo fitoquímico iniciou-se com a obtenção dos extratos brutos metanólicos e a
respectiva partição em solventes. As frações obtidas foram purificadas por
cromatografia em coluna, cromatografia em camada delgada preparativa ou por
filtração em Sephadex LH-20. O estudo químico de C. glabratus permitiu o
isolamento dos alcalóides heteroioimbínicos tetraidroalstonina (Cg 4), mitrafilina (Cg
5) e uncarina “E” (Cg 9); dos triterpenos ácidos ursólico (Cg 3) e 3-O-β-Dquinovopiranosídeo-28-O-β-glucopiranosídeo
quinóvico
(Cg7),
além
do
ácido
clorogênico 5-O-cafeoilquínico (Cg 8) e do esteróide sitosterol (Cg 6). Da espécie
vegetal P.crocea foram isolados dois alcalóides β-carbolínicos inéditos, identificados
como croceaina “A” (Pc 1) e croceaina “B” (Pc 3). A substância croceaina “A” foi
acetilada, utilizando-se Ac2O e produziu o respectivo derivado acetilado (Pc Ac). As
estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas com base na análise de dados
iv
espectroscópicas de UV, IV, EM, RMN de
1
H e de
13
C/DEPT e de técnicas
bidimensionais de RMN (1H-1H COSY, HMQC e HMBC) mediante comparação com
os constantes na literatura. A avaliação das atividades farmacológicas foi realizada,
submetendo-se os extratos brutos das plantas aos ensaios de suscetibilidade
antimicrobiana, atividade antiedematogênica, atividade moluscicida e atividade
antiproliferativa.
v
ABSTRACT
Key
words:
Palicourea
crocea;
Cephalanthus
glabratus;
chemical
studies;
pharmacological activity; alkaloids and triterpenoids.
This work is part of a project developed by researchers of Botanic and
Pharmacology Departments of the Universidade Estadual de Maringá. Our studies
are focused on chemical and pharmacological investigation of native plant from Porto
Rico – PR. In this work we report the chemical investigation and the evaluation of the
antiproliferative, anti-inflammatory, molluciscidal and antimicrobial properties of
Palicourea crocea and Cephalanthus glabratus species. These plants belong to the
Rubiaceae family and occur in riparian vegetation of the Upper Paraná River
floodplain in Porto Rico-PR. Studies reported on Cephalanthus and Palicourea
describe the presence of alkaloids as bioactive and chemotaxonomically important
constituents, among with other class of compounds. The importance of the
compounds isolated and the absence of reports on chemical or biological studies of
the plants C. glabratus and P. crocea motivated the present work. The chemical
studies were carried out by the fractionation of the crude metanolic extracts by
partition in solvents or by acid-basic extraction. Column chromatography on silica gel
or alumina, preparative TLC and filtration in Sephadex LH-20 were used for the
isolation and purification of the compounds. The chemical study of C. glabratus
afforded the alkaloids tetrahydroalstonine (Cg 4), mitraphylline (Cg 5) and uncarine E
(Cg 9), the triterpenoids ursolic acid (Cg 3) and 3-O-β-D-quinovopyranoside-28-O-βglucopyranoside (Cg 7), the chlorogenic acid 5-O-caffeoylquinic acid (Cg 8) and the
steroid sitosterol (Cg 6). From the plant P. crocea were isolated two new β-carbolinic
vi
alkaloids, identified as croceaine A (Pc 1) and croceaine B (Pc 3). The isolated
compound croceaine A was acetylated using Ac2O to produce the Nβ-acetylated
derivative Pc Ac. The structures of isolated compounds were established by
spectroscopy analysis (UV, IV, EM, NMR of 1H and
13
C, DEPT, COSY, HMQC and
HMBC). The crude methanolic extracts of the P. crocea and C. glabratus species
were submitted to bioassays for evaluation of their antibacterial, antifungal, antiinflammatory, molluscicidal and antiproliferative activies.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................xii
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................xv
LISTA DE ESQUEMAS..............................................................................................xvi
LISTA DE ESPECTROS ........................................................................................... xvii
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS..................................................................xx
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
1.1 A Família Rubiaceae............................................................................................2
1.2 O Gênero Cephalanthus .......................................................................................4
1.3 A Espécie Cephalanthus glabratus.......................................................................5
1.4 O Gênero Palicourea ............................................................................................7
1.5 A Espécie Palicourea crocea ..............................................................................11
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................14
3 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................15
3.1 Materiais e Métodos Empregados no Estudo Químico ......................................15
3.2 Materiais e Métodos Empregados no Estudo Farmacológico............................16
3.2.1 Teste de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica.....................................17
3.2.1.1 Teste de suscetibilidade antibacteriana........................................................17
3.2.1.2 Teste de suscetibilidade antifúngica.............................................................18
3.2.2 Teste de atividade antiedematogênica ............................................................19
3.2.3 Teste de atividade moluscicida........................................................................20
viii
3.2.4 Teste de atividade antiproliferativa ..................................................................20
4 ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE Cephalanthus glabratus .............23
4.1 Estudo Químico de Cephalanthus glabratus ......................................................23
4.1.1 Coleta e secagem da planta Cephalanthus glabratus.....................................23
4.1.2 Obtenção do extrato bruto de Cephalanthus glabratus...................................24
4.1.3 Fracionamento dos extratos brutos de Cephalanthus glabratus.....................24
4.1.3.1 Fracionamento do extrato bruto de Cephalanthus glabratus por partição
em solventes .................................................................................................27
4.1.3.1.1 Estudo da fração hexânica - Cg H.............................................................28
4.1.3.1.1.1 Estudo de ppt 1.......................................................................................29
4.1.3.1.2 Estudo da fração clorofórmica - Cg C........................................................30
4.1.3.1.3 Estudo da fração acetato de etila - Cg A ...................................................33
4.1.3.1.4 Estudo da fração hidrometanólica - Cg M .................................................35
4.1.3.2 Fracionamento do extrato bruto de C. glabratus por extração ácido base...............................................................................................................37
4.1.3.2.1 Estudo da fração CHCI3 alcaloidal de Cephalanthus glabratus ................38
4.2 Resultado e Discussão do Estudo Químico de Cephalantus glabratus .............39
4.2.1 Determinação estrutural das substâncias isoladas de Cephalanthus
glabratus ..........................................................................................................39
4.2.1.1 Identificação estrutural de Cg 4 ....................................................................40
4.2.1.4 Identificação estrutural de Cg3 .....................................................................87
4.2.1.6 Identificação estrutural de Cg 6 ..................................................................110
ix
4.2.1.7 Identificação estrutural de Cg 8 ..................................................................116
4.2.1.8 Identificação estrutural de Cg 1 e Cg 2 ......................................................124
4.2.2 Ocorrência e importância taxonômica das substâncias isoladas de
C. glabratus....................................................................................................127
4.2.3 Importância farmacológica das substâncias isoladas de C. glabratus..........128
4.3 Estudo Farmacológico do Extrato Bruto de C. glabratus .................................130
4.3.1 Avaliação da suscetibilidade antibacteriana e antifúngica ............................130
4.3.2 Avaliação da atividade antiedematogênica ...................................................131
4.3.3 Avaliação da atividade moluscicida ...............................................................132
4.3.4 Avaliação da atividade antiproliferativa .........................................................132
5 ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE Palicourea crocea ....................133
5.1 Parte Experimental do Estudo Químico de P. crocea ......................................133
5.1.1 Coleta e secagem da planta P. crocea..........................................................133
5.1.2 Obtenção do Extrato bruto de P. crocea .......................................................133
5.1.3 Fracionamento de P. crocea..........................................................................134
5.1.3.1 Fracionamento do extrato bruto de P. crocea ............................................136
5.1.3.1.1 Estudo das frações hexânica - Pc H e clorofórmica - Pc C.....................137
5.1.3.1.2 Estudo da fração acetato de etila - Pc A .................................................138
5.1.3.1.3 Estudo da fração hidrometanólica - Pc M................................................139
5.1.3.1.3.1 Purificação da fração MeOH:H2O - Pc M ..............................................140
5.1.3.1.3.2 Acetilação da fração MeOH:H2O - Pc M...............................................141
5.1.3.2 Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por extração ácido-base ....142
5.1.3.2.1 Estudo da fração CHCI3, alcaloidal de P. crocea ....................................142
5.1.3.2.2 Estudo da fração CHCI3, não-alcaloidal de P. crocea.............................143
x
5.1.3.2.3 Estudo das frações aquosa e hidrometanólica de P. crocea ..................144
5.2 Resultados e Discussão do Estudo Químico de P. crocea ..............................144
5.2.1 Determinação estrutural das substâncias isoladas de Palicourea crocea ....144
5.2.1.1 Identificação estrutural de Pc 1 ..................................................................145
5.2.1.4 Identificação estrutural de Pc Ac .................................................................189
5.3 Estudo Farmacológico do Extrato Bruto de P. crocea......................................205
5.3.1 Avaliação da suscetibilidade antibacteriana e antifúngica ............................205
5.3.2 Avaliação da atividade antiedematogênica ...................................................206
5.3.3 Avaliação da atividade moluscicida ...............................................................207
5.3.4 Avaliação da atividade antiproliferativa .........................................................207
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................209
7 REFERÊNCIAS....................................................................................................211
8 ANEXO: TRABALHOS PUBLICADO E SUBMETIDO.........................................218
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação Botânica de C. glabratus, segundo Engler............................6
Tabela 2: Classificação Botânica de P. crocea, segundo Engler..............................13
Tabela 3: Dados obtidos da CC da fração hexânica – Cg H.....................................28
Tabela 4: Dados obtidos da CC de ppt 1...................................................................29
Tabela 5: Dados obtidos da CC da fração clorofórmica – Cg C, em sílica gel .........30
Tabela 6: Dados obtidos da CC da fração clorofórmica – Cg C, em alumina...........32
Tabela 7: Dados obtidos da CC da fração C2.9, em alumina ...................................33
Tabela 8: Dados obtidos da CC da fração acetato de etila – Cg A, em alumina ......34
Tabela 9: Dados obtidos da CC da fração A6, em Sephadex LH-20........................35
Tabela 10: Dados obtidos da CC da fração MeOH:H2O – Cg M, em sílica gel ........36
Tabela 11: Dados obtidos da CC da fração M3, em Sephadex LH-20 .....................37
Tabela 12: Correlações homonucleares observadas no mapa de contorno
COSY de Cg 4 .........................................................................................43
Tabela 13: Dados de RMN de 13C de alcalóides heteroioimbínicos I .......................46
Tabela 14: Dados de RMN de13C de alcalóides heteroioimbínicos II .......................47
Tabela 15: Dados RMN de 13C e de 1H da tetraidroalstonina e de Cg 4 ..................48
Tabela 16: Correlações homonuclereares observadas no mapa de contorno
COSY de Cg 5 .........................................................................................57
Tabela 17: Correlações heteronucleares observadas no mapa de contorno
HMQC de Cg 5 .......................................................................................58
Tabela 18: Dados de RMN 1H e de 13C para mitrafilina e Cg 5 ................................63
Tabela 19: Correlações hormonucleares no mapa de contorno COSY de Cg 9 ......75
xii
Tabela 20: Correlaçoes heteronucleares observadas no mapa de contorno
HMQC de Cg 9 ........................................................................................76
Tabela 21: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMBC de Cg 9......77
Tabela 22: Correlações do mapa de contorno NOESY de Cg 9...............................78
Tabela 23: Dados de RMN 1H e de 13C para uncarina E e Cg 9...............................80
Tabela 24: Correlações homonuclearesno mapa de contorno COSY de Cg 3 ........89
Tabela 25: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HETCOR
de Cg 3.....................................................................................................90
Tabela 26: Dados de RMN de 13C e de 1H do ácido úrsólica e de Cg 3 ...................93
Tabela 27: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMQC de Cg 7 ...101
COSY de Cg 7 .......................................................................................102
Tabela 29: Dados de RMN 13C e de 1H para aglicona do ácido o ácido
3-Oβ-D-quinovopiranosídeo – 28-O-β-glucopiranosídeo
quinóvico e de Cg 7 ...............................................................................104
Tabela 30: Dados de RMN de 13C e de 1H para as unidades glicosídicas
quinovose e glucose do ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo
28-O- β -glucopiranosídeo quinóvico e de Cg 7 ......................................105
Tabela 31: Dados de RMN de 13C e de 1H do β-sitosterol e de Cg 6 .....................112
Tabela 32: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Cg 8 .....118
Tabela 33: Dados de RMN de 13C e de 1H do ácido 5-O-cafeoilquínico e
de Cg 8...................................................................................................119
Tabela 34: Dados de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica .........................130
Tabela 35: Efeito da aplicação tópica do extrato bruto de C. glabratus em
edema de orelha induzido por óleo de cróton .......................................131
xiii
Tabela 36: Dados obtidos da CC da fração Pc H em sílica gel ..............................137
Tabela 37: Dados obtidos da CC da fração Pc A ....................................................138
Tabela 38: Dados obtidos da CC da fração A 3’, em Sephadex.............................139
Tabela 39: Dados obtidos da fração Pc M...............................................................140
Tabela 40: Dados obtidos da CC de F Ac, em sílica gel .........................................141
Tabela 41: Dados obtidos da CC da fração CHCI3 não-alcaloidal de P. crocea.....143
Tabela 42: Dados de RMN de 13C e 1H para o ácido estrictosidínico e de Pc 1.....148
Tabela 43: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMBC de Pc 1 ....150
Tabela 44: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc 1 ..... 151
Tabela 45: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HETCOR
de Pc 1 ...................................................................................................153
Tabela 46: Correlações heteronucleares no mapa de contorno NOESY de Pc 1 ..154
Tabela 47: Dados de RMN de 13C e de 1H da braquicerina e de Pc 1....................157
Tabela 48: Dados de RMN de 13C e de 1H de Pc 1 e Pc 2 .....................................170
Tabela 49: Dados de RMN de 13C e de 1H de Pc 1 e Pc 3 .....................................179
Tabela 50: Correlações do mapa de contorno HMQC de Pc 3 ...............................181
Tabela 51: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc 3......182
Tabela 52: Dados de RMN de 13C e de 1H do lialosídeo e de Pc 3 ........................183
Tabela 53: Dados de RMN de 13C e de 1H de Pc 1 e Pc Ac ...................................192
Tabela 54: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc Ac....193
Tabela 55: Correlações do mapa de contorno HETCOR de Pc Ac ........................194
Tabela 56: Correlações do mapa de contorno NOESY para Pc Ac........................195
Tabela 57: Dados de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica .........................205
Tabela 58: Efeito da aplicação tópica do extrato bruto de P. crocea em
edema de orelha induzido por óleo de cróton .......................................206
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Foto da espécie vegetal Cephalanthus glabratus ........................................6
Figura 2: Foto da espécie vegetal Palicourea crocea ...............................................12
Figura 3: Atividade antiproliforativa de C glabratus em células Caco-2..................129
Figura 4: Conformação de menor energia de Pc 1 e algumas correlações do
Mapa de contorno NOESY ......................................................................132
Figura 5: Ensaio de atividade antiproliferativa do extrato bruto metanólico
da planta P. crocea...................................................................................208
xv
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Procedimento experimental geral empregado para o isolamento
das substâncias de Cephalantus glabratus (1ª coleta) ...................... 25
Esquema 2: Procedimento experimental de extração ácido base empregado
com Cephalanthus glabratus (2ª coleta)............................................. 26
Esquema 3: Fracionamento do extrato bruto de C. glabratus (1ª. Coleta) por
partição em solventes......................................................................... 27
Esquema 4: Extração ácido – base de C. glabratus ............................................... 38
Esquema 5: Fragmentação de alcalóide oxindólico ................................................ 59
Esquema 6: Fragmentação de oxindol heteroioimbínico pentacíclico .................... 60
Esquema 7: Fragmentação de alcalóide oxindólico ................................................ 60
Esquema 8: Rota para fragmentação do ácido ursólico.......................................... 91
Esquema 9: Procedimento experimental geral empregado para o isolamento
das substâncias de Palicourea crocea............................................. 135
Esquema 10: Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por partição
em solventes .................................................................................. 136
Esquema 11: Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por extração
ácido-base ...................................................................................... 142
xvi
LISTA DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 4.............................49
Espectro 2: Expansão do espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 4.......50
Espectro 3: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 4................51
Espectro 4: Mapa de contorno COSY de Cg 4 em CDCl3 .......................................52
Espectro 5: Espectro no UV – Vis de Cg 5 em EtOH, c=1,67.10-5 mol . L-1 .............54
Espectro 6: Espectro no IV (pastilhas de KBr) de Cg 5.............................................64
Espectro 7: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 5.............................65
Espectro 8: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 5................66
Espectro 9: Mapa de contorno COSY de Cg 5 em CDCl3 .........................................67
Espectro 10: Expansão do mapa de contorno COSY de Cg 5 em CDCl3 ................68
Espectro 11: Mapa de contorno HMQC de Cg 5 .......................................................69
Espectro 12: Espectro de massas (70 eV) de Cg 5 ..................................................70
Espectro 13: Espectro no UV – Vis de Cg 9 em EtOH, c= 1,74. 10-5 mol.L-1 ...........72
Espectro 14: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 9...........................81
Espectro 15: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 9..............82
Espectro 17: Mapa de contorno HMQC de Cg 9 .......................................................84
Espectro 18: Mapa de contorno HMBC de Cg 9 ......................................................85
Espectro 19: Mapa de contorno NOESY de Cg 9 .....................................................86
Espectro 20: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 3...........................94
Espectro 22: Mapa de contorno COSY de Cg 3 em CDCl3 .......................................96
Espectro 23: Mapa de contorno HETCOR de Cg 3 em CDCl3.................................97
xvii
Espectro 24: Espectro de massas (70 eV) de Cg 3 ..................................................98
Espectro 25: Espectro de RMN de 1H (CD3OD / 300 MHz) de Cg 7.......................106
Espectro 26: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CD3OD) de Cg 7..........107
Espectro 27: Mapa de contorno HMQC de Cg 7 em CD3OD..................................108
Espectro 28: Mapa de contorno COSY de Cg 7 em CD3OD...................................109
Espectro 29: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 6.........................113
Espectro 30: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 6 .......................114
Espectro 31: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 6............115
Espectro 32: Espectro de RMN de 1H (D2O / 300 MHz) de Cg 8............................120
Espectro 33: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz, D2O) de Cg 8 ..........................121
Espectro 34: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, D2O) de Cg 8...............122
Espectro 35: Mapa de contorno COSY de Cg 8 em CD3OD...................................123
Espectro 38: Espectro de massas de alta resolução, ESEMAR de Pc 1................158
Espectro 39: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc 1 ......................159
Espectro 40: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz / CD3OD) de Pc 1.....................160
Espectro 41: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz / CD3OD) de Pc 1 .........161
Espectro 42: Mapa de contorno HMBC (CD3OD) de Pc 1 ......................................162
Espectro 43: Mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc 1.......................................163
Espectro 44: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc 1..................................164
Espectro 45: Mapa de contorno NOESY (CD3OD) de Pc 1 ....................................165
Espectro 46: Expansão do mapa de contorno NOESY (CD3OD) de Pc 1 ..............166
Espectro 47: Curva de dicroismo circular de Pc 1...................................................167
Espectro 48: Espectro de massas de alta resolução, EMAR de Pc 2.....................171
xviii
Espectro 49: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc 2 .....................172
Espectro 52: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc 2..................................175
Espectro 53: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) do hidrocloreto
de Pc 1 ...............................................................................................176
Espectro 54: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc 3 ......................184
Espectro 56: Mapa de contorno HMQC (CD3OD) de Pc 3 ......................................186
Espectro 58: Expansão do mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc 3 ................188
Espectro 59: Espectro no IV (pastilhas de KBr) de Pc Ac.......................................196
Espectro 60: Espectro de massas de alta resolução, ESEMAR de Pc Ac..............197
Espectro 61: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc Ac....................198
Espectro 62: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz / CD3OD) de Pc Ac ..................199
Espectro 63: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz / CD3OD) de Pc Ac.......200
Espectro 64: Mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc Ac ....................................201
Espectro 65: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc Ac ...............................202
Espectro 66: Mapa de contorno NOESY em CD3OD de Pc Ac ..............................203
Espectro 67: Expansão do mapa de contorno NOESY em CD3OD de Pc Ac ........204
xix
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
δ
Deslocamento químico (em ppm)
CC
Cromatografia em coluna
CCD
Cromatografia em camada delgada
CCDP
Cromatografia em camada delgada preparativa
CMI
Concentração mínima inibitória
CMB
Concentração mínima bactericida
CMF
Concentração mínima fungicida
COSY
H-H Correlation spectroscopy
d
Dubleto
dd
Duplo dubleto
ddd
Duplo duplo dubleto
DEPT
Distortionless enhancement by polarization transfer
DMEM
Meio de cultura para células:
Meio mínimo de eagle modificado por Dulbecco
DMSO
Dimetilsulfóxido
EM
Espectroscopia de massas
HETCOR
Heteronuclear chemical shift correlation
HMBC
Heteronuclear multiple bond coherence
HMQC
Heteronuclear multiple quantum coherence
Hz
Hertz
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
xx
m
Multipleto
m/z
Relação massa/carga
MHz
Megahertz
PBS
Tampão fosfato de solução salina
ppm
Partes por milhão
RMN
Ressonância magnética nuclear
SBF
Soro fetal bovino
s
Singleto
q
Quarteto
ESEMAR
Espectro de massas de alta resolução
td
Tripleto de dubletos
TPP
Marca de frascos descartáveis utilizados em cultura de células
UV
Ultravioleta
VIS
Visível
xxi
1
1 INTRODUÇÃO
O estudo químico de espécies vegetais tem sido contínuo tema de pesquisas
devido à grande aplicação de substâncias naturais em diversas áreas, podendo-se
destacar a utilização destas no campo farmacêutico e agrícola.
Na área de fármacos, esse estudo teve grande desenvolvimento e, até hoje,
muitas substâncias naturais são ainda utilizadas como medicamentos, na forma pura
ou após transformações químicas.
Embora o número de pesquisas na área de fitoquímica tenha aumentado
significativamente, um levantamento mostra que somente de 15 a 17% das plantas
foram estudadas do ponto de vista medicinal (SORJEATO, 1996). Da mesma forma,
há relatos de que poucos estudos envolvem uma avaliação científica com o objetivo
de demonstrar seu uso seguro, efeitos potenciais e efetividade (CALIXTO, 2000).
Assim, o estudo químico e farmacológico de plantas medicinais, visando a
obtenção de novos compostos bioativos, constitui uma linha de pesquisa de
interesse na área de Produtos Naturais, e grandes esforços têm sido envidados no
sentido de isolamento e da aplicação prática de produtos naturais ativos. No entanto,
para que este objetivo seja atingido, o trabalho deve envolver pesquisadores de
várias
áreas,
caracterizando-se
assim
como
uma
pesquisa
de
caráter
multidisciplinar.
O presente trabalho é parte de um projeto mais amplo que vem sendo
realizado por um grupo de pesquisa do departamento de Química, em conjunto com
pesquisadores das áreas de Botânica e Farmacologia da Universidade Estadual de
Maringá.
2
Os estudos estão sendo concentrados em espécies nativas presentes na
planície de inundação do alto rio Paraná, cuja região é considerada como área de
preservação ecológica do estado, visando contribuir para a ampliação do
conhecimento do potencial químico e farmacológico de tais espécies, bem como a
dar suporte à classificação botânica das mesmas, com base em estudos
quimiotaxionômicos.
Em trabalhos anteriormente realizados, foram investigadas várias espécies de
diferentes famílias presentes na região. Uma das famílias de interesse é a
Rubiaceae, de grande ocorrência na região, que se caracteriza pela presença de
compostos de importância farmacológica como alcalóides e iridóides, sendo estes
ainda considerados marcadores quimiotaxônomicos de determinados gêneros.
Algumas das espécies de Rubiaceae presentes na região, estudadas até o
momento incluem as plantas Diodia brasiliensis, Machaonia brasiliensis, Psychotria
leyocarpa, Randia hebecarpa e Chomelia sp.
Em continuidade ao trabalho sobre plantas da planície de inundação do alto
rio Paraná, região de Porto Rico, especialmente da família Rubiaceae, propôs-se um
estudo químico e avaliação da atividade farmacológica das espécies Cephalanthus
glabratus e Palicourea crocea.
1.1 A família Rubiaceae
A família Rubiaceae ocupa o quarto lugar em diversidade de espécies entre
as Angiospermas (MABBERLEY, 1997), sendo constituída por quatro subfamílias,
quarenta e quatro tribos, cerca de 637 gêneros e aproximadamente 10 700 espécies
(ROBBRECHT, 1988). Em sua maior parte ela é característica de regiões quentes,
3
essencialmente tropicais (BARROSO et al., 1991). A América do Sul, por exemplo,
supera todas as regiões do globo terrestre, apresentando 1200 espécies.
Estudos fitoquímicos realizados com espécies de Rubiacea têm mostrado
grande variedade de classes e atividades biológicas entre as substâncias isoladas.
Estão presentes, por exemplo, corantes como a alizarina (I), uma antraquinona
obtida da espécie Rubia tinctorum (THOMSON, 1987), alcalóides notadamente
antimálaricos, como a cinconidina (II) e quinina (III) isoladas de Cinchona ledgeriana
(ROBBERS, 1997) e metilxantinas estimulantes do sistema nervoso central, como a
cafeína (IV), que é característica do gênero Coffea (SIMÕES, 2003).
OH
H
HO
CH CH2
H
N N
HO C
HO3S
CH2
CH2
N
R
N
(I)
(II) R=H
(III) R= -OCH3
CH3
N
N
O
N
N
H3C
O
(IV)
CH3
H
4
1.2 O gênero Cephalanthus
O gênero Cephalanthus apresenta uma única espécie no extremo Sul do Brasil,
espalhada abundantemente no Uruguai e Paraguai. Na literatura encontram-se
registrados poucos estudos fitoquímicos sobre este gênero e as publicações
existentes registram alcalóides indólicos, como a diidrocorinanteína, hirsutina,
rincofilina, isorincofilina e N-óxido de rincofilina isolados de C. occidentalis
(PHILLIPSON, 1974).
N
N
N
C2H5
H
CHOCH3
CH3O2C
(V)
N
O
H
CH3OOC
CHOCH3
(VI)
H
H
7
N
H
N
O
C2H5
OCH3
H
N
O H CO CH
2
3
(VII) C-7 “R”
(VIII) C-7 “S”
-
H
+
O
N
H
(IX)
H
C 2H5
OCH3
CO2CH3
5
O estudo fitoquímico de C. spatthelliferus (LIMA, 1973) descreveu o
isolamento do flavonóide 7,4’-dimetilaromandendrina-O-metilada (X) e da cumarina
umbeliferona (XI), que também foi isolada da planta Palicourea demissa.
OCH3
HO
O
H3CO
OH
OH
HO
O
O
O
(X)
(XI)
1.3 A espécie Cephalanthus glabratus
A espécie Cephalanthus glabratus está incluída na tribo Naucleeae e sua
classificação tem sido controvertida, se encontrando em confusão taxonômica
(RAZAFIMANDIMBISON, 2002; GOH, 1985; PHILLIPSON, 1975). A tribo Naucleeae
inclui dois gêneros brasileiros, sendo o Cephalanthus um deles.
A planta C. glabratus (Figura 1) foi identificada por Engler (ENGLER, 1964) Tabela 1, e uma amostra está depositada no herbário da Universidade Estadual de
Maringá, sob o número HNUP 2971.
6
Figura 1: Foto da espécie vegetal Cephalanthus glabratus
Tabela 1: Classificação Botânica de C. glabratus, segundo Engler
Espécie vegetal
Classificação
Cephalanthus glabratus (Spreng.) K. Schum
Divisão
Angiospermae
Classe
Dicotyledoneae
Ordem
Gentianales
Família
Rubiaceae
Subfamília
Cinchonoideae
Tribo
Naucleeae
Gênero
Cephalanthus
Espécie
Cephalanthus glabratus
Buddleja glabrata Spreng e Cephalanthus sarandi Cham & Schltdl são
sinonímias da espécie Cephalanthus glabratus (Spreng.) K. Schum.
7
A planta é um arbusto baixo, que cresce no Brasil, Paraguai, Uruguai e
Noroeste da Argentina. É conhecida vulgarmente por “Sarandi colorado” e dela
ainda não se conhece uso.
1.4 O gênero Palicourea
O gênero Palicourea da Família Rubiaceae compreende cerca de 200
espécies de arbustos e pequenas árvores, distribuídas do México até o Nordeste da
Argentina (TAYLOR, 1997). Schumann (1891) foi o primeiro a realizar um estudo
sistemático sobre Rubiaceae, quando caracterizou o gênero Psychotria, separando-o
de Palicourea. Desde então, não há consenso quanto às características mais
adequadas na separação entre as espécies destes dois gêneros, considerados
morfologicamente muito semelhantes (STANDLEY, 1936; STEYERMARK, 1972;
TAYLOR, 1989, 1993, 1996).
As
espécies
de
Palicourea
destacam-se
por
apresentar
atividades
farmacológicas associadas à presença de alcalóides indólicos muitas vezes tóxicos.
Estudos com a P. domingensis resultaram no isolamento do alcalóide chimonantina
(XII) (RIPPERGER, 1982) e a investigação fitoquímica da P. fendleri, além da
chimonantina mostrou a presença de calicantina (XIII) (NAKANO, 1976).
H
N
H3C
CH3
H
N
N
N
N
CH3
N
H
(XII)
N
N
H
CH3
(XIII)
8
É interessante observar que a P. fendleri, mesmo não tendo afinidade com a
família Calycanthaceae, produz alcalóides como os citados acima. A calicantina
também foi isolada a partir da P. alpina (WOO-MING, 1975), sendo considerada o
constituinte tóxico principal da planta Calycanthus glaucu.
A presença de vomifoliol (XIV) (STUART, 1975) e dos derivados do ácido
fluoracético foi demonstrada no estudo fitoquímico de P. alpina. O ácido
monofluracético é um dos responsáveis pela toxidez da espécie (OLIVEIRA, 1963).
OH
OH
H
O
(XIV)
A P. marcgravii é uma planta brasileira tóxica, conhecida como “erva de rato”
que contém o palicosídeo (XV), um alcalóide indólico glicosilado (MORITA et al.,
1989).
H
N
H
N
CH 3
H COOR
H
OH
O
H HO
CH 2 O
OH
O
OH
(XV)
Experimentos com a P. marcgravii atribuem efeitos tóxicos e mortes súbitas
de ruminantes a fluoracetatos e às substâncias N-metiltiramina (XVI) e 2-
9
metiltetraidro-β-carbolina (XVII) (KEMMERLING, 1996), isoladas a partir desta
espécie.
H
N
CH3
N
N
HO
CH3
H
(XVI)
(XVII)
Recentemente, a partir das folhas da P. adusta foi isolada uma mistura de
derivados do ácido hidroxicinâmico (XVIII) e, pela primeira vez nesta espécie, o
alcalóide lialosídeo (XIX) (VALVERDE et al., 1999).
CO2H
CH=C
CN
OH
(XVIII)
OH
N
N
H
H
H
HO
O
OH
O
OH
O
CH3OOC
(XIX)
A atividade anti-tumoral de espécies de Palicourea encontra-se registrada na
literatura e foi atribuída à presença de alcalóides (HARTWELL, 1972).
10
O estudo fitoquímico de P. rígida - planta característica do cerrado brasileiro,
conhecida vulgarmente como “gritadeira”, possibilitou o isolamento dos triterpenos 3friedelanona (XX), 30-hidroxifriedelan-3-ona (XXI), 3-β-hidroxifriedelana (XXII), além
do triterpeno lupeol (XXIII) e de 3-β-glucosilsitosterol (XXIV) (BOLZANI et al., 1992).
R'
H
H
H
R
HO
R
R’
(XX)
O
CH3
(XXI)
O
CH2OH
(XXII) OH
H
(XXIII)
CH3
GluO
(XXIV)
O extrato bruto da espécie P. demissa mostrou atividade antiinflamatória e
antiviral. Seu estudo químico levou ao isolamento de derivados do ácido benzóico,
do triterpeno 3-friedelanona (XX), presente na espécie P.rígida, e das cumarinas:
escopoletina (XXV), isoescopoletina (XXVI) e umbeliferona (XI) (EL SEEDI, 1999).
11
H3CO
HO
HO
O
O
H3CO
(XXV)
O
O
(XXVI)
Estudos recentes com a espécie Palicourea condensata possibilitaram o
isolamento de um peptídeo novo - a palicoureína (XXVII) (BOKESCH, 2001),
considerado o maior peptídeo macrocíclico já isolado de vegetais, cujo estudo
farmacológico demonstrou inibição “in vitro” de efeitos citopáticos causados pelo
vírus HIV.
RNGDPTFCGETCRVIPVCTYSAALGCTCDDRSDGLCK
(XXVII)
G= Glicina, D= Aspartato, P= Prolina, T= Treonina, F= Fenilalanina, C=
Cisteína, E= Glutamato, V= Valina, Y= Tirosina, S= Serina, A= Alanina, L= Leucina,
R= Arginina e K= Lisina.
1.5 A espécie Palicourea crocea
A planta P. crocea está incluída na tribo Psychotrieae, que apresenta no
Brasil, grande variedade de espécies distribuídas em poucos gêneros. Esta planta é
um
arbusto
relativamente
grande,
conhecido
vulgarmente
como
cachimbo,
palicourea vermelha ou palicourea amarela. Os últimos dois nomes se devem ao fato
de que suas flôres podem ser vermelhas ou amarelas. Esta espécie vegetal é nativa
desde o Sul do México, América Central, América do Sul até o Brasil e Paraguai. Ela
12
é rica em nutrientes, sendo fonte de alimento para pássaros e, em algumas áreas de
Porto Rico, na Costa Rica, as folhas são usadas trituradas para estancar
hemorragias (LABRÓN, 1977).
A planta P. crocea (Figura 2) foi classificada por Engler (Engler, 1964) –
Tabela 2, e uma amostra encontra-se depositada no herbário da Universidade
Estadual de Maringá, sob o número HNPU 2060.
Figura 2: Foto da espécie vegetal Palicourea crocea (Sw.) Roem & Schultes.
13
Tabela 2: Classificação Botânica de P. crocea, segundo Engler.
Divisão
Espécie vegetal
Palicourea crocea (Sw.) Roen
Angiospermae
Classe
Dicotyledoneae
Ordem
Gentianales
Família
Rubiaceae
Subfamília
Rubioideae
Tribo
Psychotrieae
Gênero
Palicourea
Espécie
Palicourea crocea
Classificação
Palicourea coccínea Poiteau ex DC, Psychotria crocea Sw., Palicourea
reparia Benth., Palicourea croceoides Ham., Palicorea crocea DC. var. riparia
(Benth.) Griseb. e Palicourea brevithyrsa Britton & Standl são sinonímias da planta
Palicourea crocea (Sw.) Roem. & Schultes (CATÁLOGO de las plantas vasculares
de la Argentina, 2003).
14
2 OBJETIVOS
As plantas Palicourea crocea e Cephalanthus glabratus são nativas no
município de Porto Rico – PR, onde existe uma área de preservação ambiental, em
que um grupo de professores pesquisadores da Universidade Estadual de Maringá
(UEM) vem realizando vários trabalhos, inclusive o de avaliar o potencial
farmacológico das espécies nativas na região.
Após observar-se nos gêneros Cephalanthus e Palicourea a presença
freqüente de alcalóides e de várias substâncias com as mais diferentes funções,
realizou-se um levantamento bibliográfico sobre as espécies P. crocea e C. glabratus
e constatou-se que, além da ausência de estudos fitoquímicos sobre elas, também
existem, no caso do gênero Cephalanthus, problemas de classificação botânica.
Estes fatos motivaram a realização do presente trabalho, que tem como objetivos:
§
Isolamento dos principais constituintes e dos possíveis compostos
bioativos das espécies C.glabratus e P.crocea.
§
Identificação das estruturas dos constituintes isolados através do uso de
métodos espectroscópicos.
§
Realização
de
ensaios
biológicos
para
avaliação
das
atividades
antimicrobiana, antiedematogênica, moluscicida e antiproliferativa das
plantas em estudo.
§
Isolamento
de
marcadores
químicos,
quimiotaxonômico do gênero Cephalanthus.
visando-se
o
estudo
15
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Este capítulo descreve os materiais utilizados nos estudos químicos e
farmacológicos das plantas, bem como as respectivas metodologias.
3.1 Materiais e métodos empregados no estudo químico
Os espectros de absorção no UV foram obtidos em espectrofotômetro UVVIS, modelo Cary 50 Scan da Varian.
Os espectros de absorção no IV foram registrados em espectrofotômetro
FTIR-BOMEM MB-100, em pastilhas de KBr, na região de 400 a 4000 cm-1. A
referência utilizada foi o filme de poliestireno.
Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em equipamento
SHIMADZU GC/MS, modelo QP 2000, à 70 eV, equipado com sonda para sólidos.
Os espectros de massas de alta resolução (EMAR) foram obtidos em um aparelho
MICROMASS, modelo Autospec M 312, (Instituto de Química, UNICAMP).
Os espectros de RMN de1H e de
13
C foram obtidos em espectrômetros
VARIAN, modelos Gemini 2000, BB 300 MHz e Mercury plus, BB 300 MHz (300,06
MHz para 1H e 75,46 MHz para
13
C), utilizando-se DMSO-d6, CD3OD ou CDCl3 como
solventes e TMS (δ=0,0 ppm) como referência interna. A interpretação dos dados foi
realizada com auxílio da técnica DEPT 135 [CH3/ CH = sinal positivo (+), CH2 = sinal
negativo (-)] e DEPT 90 [CH = sinal positivo (+)], em que C quaternário = sinal zero
(C0) e confirmado por dados espectroscópicos de correlações bidimensionais COSY
90, HETCOR, HMQC e HMBC.
16
As cromatografias em coluna (CC) foram realizadas em colunas de vidro,
utilizando-se sílica gel 60 (70–230 mesh), da Merck, alumina ativa 90 neutra e
Sephadex Lipofílico LH-20 da Sigma. As dimensões das colunas variaram de acordo
com a quantidade de material empregado. As eluições foram feitas com solventes
orgânicos destilados, puros ou em mistura de solventes combinados em ordem
crescente de polaridade. Os frascos utilizados para recolher as frações provenientes
das eluições foram de aproximadamente 40 mL. O controle das frações coletadas foi
realizado por cromatografia em camada delgada analítica (CCD) e as que
apresentaram Rfs semelhantes foram reunidas e concentradas em evaporador
rotatório, à pressão reduzida. As placas para cromatografia em camada delgada
(CCD) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram feitas
utilizando-se sílica gel G60 e GF254, ambas da Merck, suspensas em água destilada e
distribuídas em camadas de 0,25 mm ou de 1,00 mm de espessura sobre placas de
vidro de 20x5 e 20x20 cm, respectivamente. As revelações das placas foram
realizadas através de irradiação com lâmpada ultravioleta em 254 / 366 nm e com
reveladores como o reagente de Dragendorff (revelador para alcalóides) ou
H2SO4:MeOH 1:1, seguido de aquecimento em placa.
3.2 Materiais e métodos empregados no estudo farmacológico
As metodologias e os materiais empregados no estudo farmacológico das
plantas são descritos para a realização dos seguintes testes de atividades
farmacológicas:
suscetibilidade
antibacteriana
e
antifúngica;
antiedematogênica, atividade moluscicida e atividade antiproliferativa.
atividade
17
3.2.1 Teste de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica
O ensaio de avaliação da atividade antimicrobiana foi realizado no
Departamento de Análises Clínicas da UEM, sob coordenação do Profo. Dro.
Benedito Dias Prado Filho, aplicando-se o teste de suscetibilidade para a
determinação da concentração mínima inibitória (MIC). O MIC é a menor
concentração de um fármaco em µg/mL, que inibe o crescimento do microrganismo.
O teste de susceptibilidade é determinado através de microtitulação da menor
concentração do fármaco teste sem turvação. A concentração mínima fungicida
(CMF) ou bactericida (CMB) é a menor concentração do fármaco que mata 99,9% do
fungo ou bactéria teste. A CMF ou CMB é determinada pela subcultura do poço “sem
crescimento” em placa que contém meio Agar Saboraund para o teste fungicida e
meio Müeller-Hinton para o bactericida.
A atividade antibacteriana e antifúngica das amostras e dos antibióticos de
referência foi estabelecida, de acordo com a concentração mínima inibitória (CMI):
CMI>500µg/mL (inativa); CMI 250 e 125µg/mL (moderadamente ativa); CMI 62,5 e
31,2µg/mL (ativa); CMI 15,6µg/mL (mais ativa); CMI 7,8µg/mL (fortemente ativa).
3.2.1.1 Teste de suscetibilidade antibacteriana
O teste foi realizado com o extrato metanólico das plantas e as bactérias
utilizadas foram Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e
Escherichia coli ATCC 2522. Os antibióticos-controle foram penicilina, vancomicina e
tetracilina. Os ensaios para avaliação da atividade antibacteriana foram realizados,
18
aplicando-se o teste de suscetibilidade, segundo as normas descritas na literatura
(WAYNE, 1997).
A amostra (20 mg) foi dissolvida em 1 mL de DMSO. A solução estoque da
amostra foi diluída repetidamente em meio Mueller-Hinton, obtendo-se uma série de
concentrações, na ordem de 1 mg para 10 µg/mL. O inóculo bacteriano foi
preparado com o mesmo meio e a densidade ajustada por comparação ao tubo n°
0,5 da escala Mac Farland (1,5 x 1018 UFC/mL), e em seguida diluída a 1:100 no
mesmo meio. Alíquotas de 5 µL da suspensão de bactérias foram adicionadas a
cada poço da placa de microdiluição, contendo 100 µL das diluições decimais da
amostra ou de antibióticos de referência. Foram utilizados, como controle, meio não
inoculado (controle de esterilidade) e meio sem droga (controle negativo). As placas
foram incubadas a 37°C por 24 horas.
3.2.1.2 Teste de suscetibilidade antifúngica
O teste foi realizado com o extrato metanólico das plantas frente ao fungo
Candida albicans, empregando-se a micostatina como antifúngico padrão (WAYNE,
1997).
Para a padronização do inóculo do fungo foi utilizado 5 colônias de uma
cultura de levedura em Ágar Sabouraud, em 5 mL de solução salina estéril, e
comparadas com o tubo 0,5 da escala Mac Farland (1,5 x 108 UFC/mL). A
suspensão do fungo foi diluída a 1:100 em água destilada (4,95 mL de água
destilada + 50 µL da suspensão). Em seguida 2 mL dessa suspensão foram
adicionados em 38 mL de meio RPMI-1640 (diluição 1:20). Um volume de 0,9 mL da
suspensão do fungo diluída em RPMI-1640 a 1:20 foi transferido para tubos (12 x 75
19
mm) estéreis numerados de 1 a 13. No tubo 14 foi colocado somente o meio RPMI1640 diluído (controle de esterilidade). No tubo 13 (controle de crescimento – tween80) foi colocado 100 µL de tween-80 a 1%. Nos tubos de 1 a 11 foram adicionados
100 µL do extrato metanólico diluídos em série. Os tubos foram incubados à
temperatura de 37°C por 24 horas.
3.2.2 Teste de atividade antiedematogênica
O teste de atividade antiedematogênica foi realizado no Departamento de
Farmácia e Farmacologia da UEM, sob coordenação da Profa. Dra. Ciomar A.
Bersani Amado, aplicando-se a técnica que utiliza o edema de orelha – modelo de
inflamação tópica VAN ARMAN (1974). O edema foi induzido através da aplicação
de uma substância irritante (20 ìl de óleo de
Cróton na concentração de 200
ìg/orelha, diluído em uma solução de acetona/água 7:3) em ambas as faces
internas das orelhas do camundongo. A concentração de 200 ìg/ore lha de óleo de
Cróton é a concentração máxima ideal a ser testada, pois provoca inflamação e não
degenera os tecidos da orelha. A seguir, foram administrados 20 ìl da solução do
extrato bruto da planta (na dose de 2,5 mg/orelha) na superfície interna da orelha
esquerda (orelha tratada). A orelha direita recebeu apenas o solvente do extrato (20
ìl do veículo). Após 6 horas, os animais foram sacrificados com éter etílico, e as
orelhas foram seccionadas com um vazador de metal, em discos circulares de 6 mm
de diâmetro. Estas secções foram pesadas em uma balança analítica e calculada a
porcentagem de inibição da inflamação através da seguinte fórmula:
% de inibição = (D-E /D) . 100
Onde:
20
D = peso da secção circular da orelha direita;
E = peso da secção circular da orelha esquerda, tratada com agente irritante
na presença da solução do extrato bruto da planta.
3.2.3 Teste de atividade moluscicida
O teste de atividade moluscicida foi realizado no Departamento de Farmácia e
Farmacologia da UEM, sob coordenação da Profa. Dra Maria Lucília Motinha
Zamuner, empregando-se amostras de extrato bruto metanólico das plantas e
caramujos da espécie Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do parasita
Shistosoma mansoni, causador da esquistossomose. A metodologia para a
avaliação da atividade moluscicida (HOSTETTMANN et al., 1982; BILIA et al., 2000)
utilizou amostras de 40 mg que foram dissolvidas em 200 µL de DMSO e diluídas
em 100 mL de água de aquário dos caramujos. O material foi dividido em dois
béqueres, e em cada um foi colocado um caramujo com batimentos cardíacos e
tamanhos apropriados. Após 24 horas, os batimentos cardíacos foram observados
através de uma lupa. Um ensaio em branco (controle) foi realizado nas mesmas
condições, porém sem a adição do extrato bruto metanólico.
O teste é considerado positivo, quando os caramujos morrem ou demonstram
alteração nos batimentos cardíacos.
3.2.4 Teste de atividade antiproliferativa
A avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto metanólico de C.
glabratus foi realizada no laboratório de Microbiologia Aplicada aos Produtos
21
Naturais e Sintéticos do Departamento de Análises Clínicas do Centro de Ciências
da Saúde da UEM, sob a responsabilidade da Profa. Dra. Tânia Nakamura. As
células utilizadas foram as de carcinoma intestinal (Caco-2) cultivadas em garrafas
plásticas de 75 cm2 com tampas de rosca e dispositivo para a entrada de CO2 (TPP),
contendo 15 mL de DMEM (Gibco) + 10% soro bovino fetal (SBF-cultlab) + 37,5
µLde gentamicina. O meio foi trocado diariamente até que o tapete de células fosse
confluente (observado em microscópio invertido) para o repique e inicio do ensaio de
atividade antiproliferativa, pelo método da sulforodamina B (SKEHAN et al., 1990).
Após o tapete estar completamente formado, a tripsinização das células foi realizada
pelo seguinte procedimento: a monocamada de células foi lavada 3 vezes com
solução salina de tampão fosfato (PBS) pH 7,2 0,01 M, estéril; 6 mL de tripsina
foram adicionados e passaram a agir durante 2 a 3 ou 7 a 12 minutos em estufa 37
°C.
Em seguida, neutralizou-se com com 3 mL de SBF e centrifugou-se em tubos
cônicos Falcon de 15 ml durante 3 min. O pellet foi suspenso em 6 mL de DMEM
(aspirado e espirado 10 X para evitar grumos de células). As células foram contadas
e semeadas em placas de 96 poços, cada um contendo 100 µL de meio de cultura
com 2,5 x 104 células. As placas foram incubadas em estufa com 5% CO2 à 37 ºC
por 24 horas. Em seguida, adicionaram-se 100 µL de cada concentração do extrato
realizando-se um controle para células (DMEM + SBF 5%). A placa foi incubada em
estufa por 48 horas, retirando-se o meio e os extratos, sendo fixada com 50 µL de
ácido tricloroacético (10%), mantendo-se a 4 0C por 1 hora. Em seguida, foi lavada
com água corrente 5 vezes cuidadosamente, secada, adicionando-se-lhe 50 µL de
Sulforodamida B e foi mantida a 4 ºC por 30 minutos ao abrigo da luz. A seguir o
corante foi removido, lavando-se a placa 4 vezes com ácido acético a 1%,
adicionando-se em cada poço 150 µl de 10 mM Trismabase, e sendo, finalmente
22
submetida à agitação por 15 minutos. A leitura foi feita em leitor de ELISA (Bio-Tek
FL-600 Microplate Fluorescence Reader), em densidade óptica (DO) de 530 nm.
A avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto metanólico de P.
crocea foi realizada no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrárias (CPQBA) da UNICAMP, sob a responsabilidade do Profo. Dr. João Ernesto
de Carvalho e foram empregadas as seguintes linhagens celulares humanas cedidas
pelo National Cancer Institute (NCI) dos EUA: melanoma (UACC.62), mamária
(MCF.7), pulmonar pequena (NCI.460), leucêmica (K.562), ováriana (OVCAR),
prostática (PCO.3), de cólon de útero (HT.29), renal (786.O) e mamária resistente
(NCI.ADR).
As células foram cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 suplementado
com 5% de soro fetal bovino inativado (SFB) sendo todos os procedimentos
descritos realizados sob condições estéreis, segundo a metodologia descrita na
literatura (MONKS et al., 1991). Os extratos utilizados nas concentrações de 15,6;
31,2; 62,5 e 125 µg/ mL foram adicionados em placas de 96 divisões, contendo
quatro linhagems por placa. As células foram fixadas, após um período de incubação
de 48 horas através de ácido tricloroacético (50%).Após 60 minutos, o ácido
tricloroacético foi removido por aspiração e as placas lavadas com água corrente,
secas e coradas com sulforrodamina B (SRB). O excesso de corante foi removido
após 10 minutos, através de lavagem em ácido acético a 1 %. O tampão trizmabase
foi utilizado para solubilizar o corante, e a leitura óptica foi realizada por leitor Elisa
em 540 nm.
23
4 ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE Cephalanthus
glabratus
O estudo químico e farmacológico de Cephalanthus glabratus compreende a
parte experimental, os resultados obtidos e respectiva discussão, além da
ocorrência, importância e atividades farmacológicas das substâncias isoladas e
conhecidas na literatura, bem como o estudo farmacológico do extrato bruto.
4.1 Estudo químico de Cephalanthus glabratus
A parte experimental do estudo químico da espécie C.glabratus descreve a
coleta e secagem da planta, obtenção do extrato bruto, extrações e fracionamentos,
além do isolamento das substâncias codificadas como Cg 1, Cg 2, Cg 3, Cg 4, Cg 5,
Cg 6, Cg 7, Cg 8 e Cg 9.
4.1.1 Coleta e secagem da planta Cephalanthus glabratus
As folhas e galhos da planta C. glabratus foram coletados na planície de
inundação do rio Paraná, região de Porto Rico–PR, em dezembro de 2001 e
também em abril de 2004. A espécie vegetal foi identificada pela Profa. Dra. Maria
Conceição de Souza do Departamento de Biologia da Universidade Estadual de
Maringá.
24
As partes aéreas da planta foram secas ao ar e moídas, sendo que o material
proveniente da coleta de dezembro de 2001 rendeu 135,9g e o da coleta de abril de
2004 forneceu 305,0g.
4.1.2 Obtenção do extrato bruto de Cephalanthus glabratus
O material seco e moído (135,9g) proveniente da coleta de dezembro de 2001
(1a. coleta) foi extraído exaustivamente com metanol, deixando-se a amostra em
maceração à temperatura ambiente. Após a evaporação do solvente, foram obtidos
14,67g de extrato bruto de C.glabratus. O material moído e seco (305,0g),
proveniente da coleta de abril de 2004 (2a. coleta), foi dividido em duas partes iguais
de 152,5g. Uma parte foi extraída exaustivamente com metanol, em condições
idênticas às utilizadas anteriormente e, após a evaporação do solvente, foram
obtidos 29,4g de extrato bruto. A outra parte foi tratada com hexano e, após
secagem ao ar, foi umedecida com NH4OH, seca ao ar novamente e utilizada em
extração ácido - base
4.1.3 Fracionamento dos extratos brutos de Cephalanthus glabratus
O extrato bruto (1a. coleta) foi submetido à partição em solventes e as frações
resultantes purificadas por cromatografia em coluna. O procedimento geral
empregado para o isolamento das substâncias presentes encontra-se no Esquema
1, pág. 25. O extrato bruto (2a. coleta) foi submetido à extração ácido - base, sendo o
procedimento geral descrito no Esquema 2, pág. 26.
25
Partição em Solventes
Folhas e galhos
135,9g
Maceração em metanol
Extrato Metanólico
14,67g
(1) Solubilização em MeOH:H2O 1:1
(2) Extrações sucessivas em hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH:H2O
(3) Evaporação dos solventes
CHCl3
CgC (3,10g)
Hexano
Cg H (2,94g)
CC/ Sílica
CC/ Sílica
Cg 1
10,4 mg
MeOH:H2O
Cg M (4,0g)
CC/ Alumina
CC/ Alumina
ppt- 1
Cg 4
3,4 mg
CC/ Sílica
Cg 2
16,9 mg
AcOET
Cg A (3,9g)
Cg 3
10,6 mg
Fração 96
Fração 47-49
CHCl3
ppt
CCDP
Cg 3
46,9 mg
Cg 5
3,48 mg
CCDP
Cg 6
3,5 mg
Fração 57-58
Sol. hexano
↓ Acetona
Cg 5
8,3 mg
Fração 63-71
CC/ Sephadex
CC/ Sephadex
Cg 7
7,3 mg
Cg 8
23,3 mg
Esquema 1: Procedimento experimental geral empregado para o isolamento das substâncias de Cephalantus glabratus
(1acoleta)
46
25
26
Extração Ácido-Base
2a. Coleta
C .glabratus
152,5g
hexano
C .glabratus
(Resíduo)
Extrato Hexânico
(1) Umedecimento c/ NH4OH
(2) Extração c/ CHCl3
(3) Extração com solução de HCl 5%
Fração CHCl3
Não Alcaloidal
Fração
Aquosa-ácida
(1) Basificação c/ NH4OH (pH 12)
Fração CHCl3
Alcaloidal
6,4 mg
CCDP
Hexano: AcOEt 50%
Fração
Aquosa-básica
Extração c/
CHCl3 – MeOH 50%
Cg 9
3,2 mg
Fração
CHCl3 - MeOH
Fração
Aquosa
Esquema 2: Procedimento experimental de extração ácido base empregado
com Cephalanthus glabratus (2a.coleta)
27
4.1.3.1 Fracionamento do extrato bruto de Cephalanthus glabratus
por partição em solventes
O extrato bruto metanólico de C.glabratus (14,67g) proveniente da primeira
coleta da planta foi dissolvido em solução de MeOH:H2O 1:1 e fracionado em
solventes de polaridade crescente. Este procedimento resultou nas frações hexânica
(Cg H), CHCl3 (Cg C), AcOEt (Cg A), MeOH:H2O (Cg M), além dos precipitados ppt 1
e ppt 2 formados durante as extrações com hexano e CHCl3 (Esquema 3).
Extrato MeOH
14,67g
MeOH:H2O 1:1
Solução
MeOH : H2O 1:1
Extração com hexano
Fração Cg H
2,94g
Solução
MeOH : H2O 1:1
Extração com CHCl3
ppt-1
0,53g
Fração Cg C
3,10g
Solução
MeOH : H2O 1:1
Extração com AcOEt
ppt-2
0,20g
Fração Cg A
3,90g
Fração Cg M
4,0g
Esquema 3: Fracionamento do extrato bruto de C. glabratus (1a. Coleta) por
partição em solventes.
28
4.1.3.1.1 Estudo da fração hexânica – Cg H
Uma amostra da fração Cg H (1,0g) foi submetida a CC (∅ 3,0cm) em sílica
gel (70,0g), utilizando-se como eluentes hexano:AcOEt, AcOEt, AcOEt:MeOH e
MeOH. Foram coletadas 66 frações, que foram reunidas, após análise em CCD
(Tabela 3).
Tabela 3: Dados obtidos da CC da fração hexânica - Cg H
Eluente
Código
H1
Frações
reunidas
1–3
Massa
(mg)
103,6
Hexano: AcOEt 20%
H2
4
96,0
H3
5
27,9
H4
6
22,5
H5
7
28,2
H6
8
25,5
H7
9
21,9
H8
10
56,6
H9
11–15
124,5
H10
16–21
55,7
H11
22–23
19,9
H12
24–28
42,4
H13
29
4,4
Hexano: AcOEt 30%
H14
30–33
14,6
Hexano: AcOEt 35%
H15
34–35
8,4
H16
36–38
13,2
Hexano: AcOEt 45%
H17
39–41
16,8
Hexano: AcOEt 60%
H18
42–43
13,2
H19
44–45
13,0
AcOEt
H20
46–53
38,6
AcOEt: MeOH 50%
H21
54–60
154,8
MeOH
H22
61–66
23,2
Hexano: AcOEt 25%
Recuperou-se 92,5% do material inicial
Substância Isolada
(mg)
Cg 1 (10,4)
Cg 2 (16,9)
29
As substâncias Cg 1 (10,4mg) e Cg 2 (16,9mg) foram purificadas por CCDP
em sílica gel, empregando-se hexano:AcOEt 12% e hexano:AcOEt 35%, como
eluentes.
As frações H1, H2, H8, H9, H10, H12 e H21 revelaram grande quantidade de
clorofila, quando analisadas por CCD. As demais frações não foram estudadas
devido à grande complexidade de seus perfis cromatográficos.
4.1.3.1.1.1 Estudo de ppt 1
Uma parte de ppt 1 (0,20g) foi submetido a CC (∅ 2,5cm) em sílica gel
(30,0g), coletando-se 62 frações, que foram reunidas, após análise em CCD (Tabela
4).
Tabela 4: Dados obtidos da CC de ppt-1
Eluente
Código
Frações
reunidas
Massa
(mg)
Hexano: AcOEt 25%
p1
p2
p3
p4
p5
p6
p7
p8
p9
p10
p11
p12
p13
p14
p15
1–4
5–13
14–18
19–33
34–38
39–44
45–47
48
49–52
53–55
56
57–58
59
60
61-62
28,2
10,1
4,5
10,6
2,2
3,0
17,2
4,1
2,0
1,6
5,1
4,9
75,9
14,3
5,2
Hexano: AcOEt 35%
Hexano: AcOEt 50%
AcOEt
MeOH
Substância
isolada (mg)
Cg 3 (10,6)
30
A fração p4 forneceu a substância pura codificada como Cg 3 (10,6mg).
As demais frações foram trabalhadas de diversas formas, porém devido às
suas complexidades não foi possível o isolamento de nenhuma substância.
4.1.3.1.2 Estudo da fração clorofórmica – Cg C
A análise através de CCD do precipitado formado durante a extração com
CHCl3 (ppt 2) mostrou um perfil cromatográfico semelhante ao de ppt 1, não sendo
estudada esta fração.
A fração Cg C foi dividida em duas partes e submetida a fracionamento em
CC em diferentes adsorventes: sílica gel e alumina.
Uma parte da fração Cg C (0,57g) foi submetida a CC (∅ 1,5 cm) contendo
20,0g de sílica gel, sendo coletadas 102 frações que foram reunidas, após análise
em CCD (Tabela 5).
Tabela 5: Dados obtidos da CC da fração clorofórmica – Cg C, em sílica gel
Eluente
Código
C1.1
Frações
reunidas
1–52
Massa
(mg)
2,0
Hexano:CHCl3 1:1
Hexano:CHCl3 70%
C1.2
53-55
1,3
C1.3
56–57
3,4
Hexano:CHCl3 80%
C1.4
58–73
8,9
CHCl3
C1.5
74–95
86,6
CHCl3:MeOH 5%
C1.6
96
129,5
Substância isolada
(mg)
Cg 4 (3,4)
Cg 5 (3,48)
Cg 3 (46,9)
C1.7
97
163,3
C1.8
98–102
86,0
Cg 3 (82,6)
31
A análise da fração C1.3 por CCD mostrou um composto puro com forte
fluorescência sob irradiação UV em 254 e 366nm. A revelação da placa de CCD,
utilizando o reagente de Dragendorff mostrou a presença provável de um alcalóide,
sendo esta substância codificada como Cg 4 (3,4mg).
A adição de CHCl3 às frações C1.6 e C1.7 produziu precipitados brancos
(46,9mg e 82,6mg, respectivamente), que foram filtrados e analisados por CCD. A
revelação com solução de MeOH:H2SO4, seguida de aquecimento, mostrou Rf iguais
e a mesma coloração púrpurea para ambos os precipitados. A substância isolada
apresentou Rf idêntico ao da substância obtida anteriormente da fração hexânica
(Cg 3).
O material sólido resultante da evaporação da água-mãe e oriundo da fração
C1.6 foi analisado por CCD e submetido a CCDP (hexano:AcOEt 1:1). O
procedimento resultou no isolamento do alcalóide codificado como Cg 5 (3,48 mg).
As frações C1.5 e C1.8 foram trabalhadas tentando-se precipitação e através
de CCDP, porém não foi possível isolar nenhuma substância devido ao perfil
cromatográfico complexo destas frações.
A parte restante da fração Cg C (1,9g) foi adsorvida em alumina e submetida a
CC (∅ 2,5 cm) que continha 200,0g do adsorvente. Foram obtidas 101 frações, que
após análise em CCD, foram reunidas de acordo com a Tabela 6.
32
Tabela 6: Dados obtidos da CC da fração clorofórmica – Cg C, em alumina
Eluente
Código
C2.1
Frações
reunidas
1-6
Massa
(mg)
8,0
Hexano:CHCl3 10%
Hexano:CHCl3 20%
C2.2
7-10
10,2
Hexano:CHCl3 30%
C2.3
11-34
4,3
Hexano:CHCl3 40%
C2.4
35-46
10,9
Hexano:CHCl3 80%
C2.5
47-49
11,8
Hexano:CHCl3 90%
C2.6
50
51,1
C2.7
51-55
13,8
C2.8
56
3,3
CHCl3
C2.9
57-58
397,4
CHCl3:MeOH 10%
C2.10
59-63
8,2
CHCl3:MeOH 20%
C2.11
64-74
11,8
MeOH
C-2.12
75-94
8,5
C-2.13
95-101
66,2
Substância isolada
(mg)
Cg 6 (3,5)
Cg 5 (8,3)
Recuperou-se 32,5% do material inicial.
A fração C2.5 (11,8mg) foi submetida à purificação por CCDP em sílica gel
(CHCl3:MeOH 2%), fornecendo a substância codificada como Cg 6 (3,5mg).
Das frações C2.6 e C2.13 não se isolou nenhuma substância, embora se tenha
tentado precipitação e purificação através de CCDP em sílica gel.
A fração C2.9 (397,4mg) foi dissolvida em clorofórmio e a adição de hexano
produziu um precipitado branco (8,3mg), que foi filtrado e analisado por CCD. A
revelação, mediante utilização de reagente de Dragendorff indicou a presença de
alcalóide e o valor Rf, evidenciou o isolamento de Cg 5, já isolado anteriormente.
A evaporação da água-mãe da fração C2.9 originou um sólido (200mg), que foi
submetido a CC (∅ 1cm) com 2g de alumina, sendo coletadas 183 frações que
foram reunidas, após análise, através de CCD conforme a Tabela 7.
33
Tabela 7: Dados obtidos da CC da fração C2.9, em alumina
Eluente
Código
C2.9.1
Frações
reunidas
1-24
Massa
(mg)
2,0
Hexano:CHCl3 90%
Hexano:CHCl3 95%
C2.9.2
25-50
4,2
C2.9.3
51-55
13,8
C2.9.4
56-62
16,1
C2.9.5
63-68
4,3
C2.9.6
69
2,1
CHCl3
C2.9.7
70-143
19,5
CHCl3:MeOH 5%
C2.9.8
144
23,3
CHCl3:MeOH 10%
C2.9.9
145-147
58,4
CHCl3:MeOH 15%
C2.9.10
148-170
4,1
MeOH
C2.9.11
180-183
4,8
A análise por CCD das frações C2.9.3, C2.9.4, C2.9.8 e C2.9.9 mostrou
substâncias com forte fluorescência, quando submetidas à irradiação UV em 254 e
366nm. A revelação com reagente de Dragendorff indicou a presença de alcalóides
e as frações foram trabalhadas tentando-se precipitação, filtração em Sephadex LH20 e CCDP em sílica, porém devido à complexidade cromatográfica destas frações
não foi possível a separação de nenhuma substância pura. As demais frações não
foram estudadas.
4.1.3.1.3 Estudo da fração acetato de etila – Cg A
A fração acetato de etila (3,90g) foi submetida a CC (∅ 2,5 cm) com 100,0g
de alumina. As 76 frações obtidas foram reunidas, após análise por CCD, conforme
a Tabela 8.
34
Tabela 8: Dados obtidos da CC da fração acetato de etila – Cg A, em alumina
Eluente
Código
A1
Frações
reunidas
1-44
Massa
(mg)
42,2
AcOEt:MeOH 30%
AcOEt: MeOH 40%
A2
45-48
32,6
AcOEt:MeOH 50%
A3
49–55
302,7
AcOEt:MeOH 60%
A4
56-59
67,0
AcOEt:MeOH 70%
A5
60-62
10,2
AcOEt: MeOH 75%
A6
63-71
180,0
MeOH
A7
72 –74
29,9
MeOH: H2O 50%
A8
75
37,4
A9
76
68,8
As frações A3 e A9 foram trabalhadas tentando-se precipitação e filtração em
Sephadex LH-20, mas não foi possível isolar nenhuma substância, devido à
complexidade cromatográfica que estas frações apresentaram. As outras frações
também mostraram um perfil cromatográfico de difícil separação e não foram
estudadas.
A fração A6 (180,0mg) foi purificada por filtração em Sephadex LH-20,
utilizando-se H2O, MeOH:H2O e MeOH como eluentes. Coletaram-se 9 frações que
foram reunidas, após análise através de CCD conforme a Tabela 9.
35
Tabela 9: Dados obtidos da CC da fração A6, em Sephadex LH-20
Eluente
Código
H2O
A6.1
Massa
(mg)
20,6
A6.2
18,8
A6.3
8,6
A6.4
8,1
A6.5
4,9
A6.6
14,4
A6.7
7,3
A6.8
2,4
A6.9
1,6
MeOH:H2O 50%
MeOH:H2O 25%
MeOH
Substância isolada (mg)
Cg 7 (7,3)
A fração A6.7 proveniente da filtração em Sephadex LH-20 possibilitou o
isolamento da substância codificada como Cg 7 (7,3mg). As demais frações foram
analisadas por CCD e não foram trabalhadas, devido à sua complexidade.
4.1.3.1.4 Estudo da fração hidrometanólica – Cg M
Uma parte da fração MeOH:H2O – Cg M (1,52g) foi submetida a CC (∅2,5
cm), contendo em 58,0g de sílica gel. Foram coletadas 72 frações, que foram
reunidas após análise em CCD, de acordo com a Tabela 10.
36
Tabela 10: Dados obtidos da CC da fração MeOH: H2O – Cg M, em sílica gel
Eluente
Código
M1
Frações
reunidas
1–2
Massa
(mg)
1,2
AcOEt
M2
3–15
250,0
AcOEt: MeOH 30%
M3
16–20
371,6
AcOEt: MeOH 40%
M4
21
12,3
AcOEt: MeOH 50%
M5
22
10,8
M6
23–29
61,3
M7
30–39
130,0
M8
40–44
66,4
M9
45–55
100,0
M10
56–58
42,1
M11
60–63
14,4
MeOH
M12
64–65
5,0
MeOH:H2O 20%
M13
66–72
9,0
AcOEt: MeOH 85%
Recuperou-se 70,7 % do material inicial.
A análise por CCD das frações M2, M6, M7, M8, M9 e M10 mostrou uma
mistura de substâncias que se tentou purificar através de precipitações e filtrações
em Sephadex LH-20, porém devido a complexidade do perfil cromatográfico destas
frações não foi possível isolar substâncias puras a partir delas. As demais frações
apresentaram pouca massa e não foram estudadas, porque mostraram um perfil
cromatográfico de difícil separação, após serem analisadas por CCD.
A fração M3 (371,6 mg) foi submetida novamente à filtração em Sephadex
LH-20, utilizando-se H2O, MeOH:H2O e MeOH como eluentes. Coletaram-se 8
frações que foram reunidas, após análise por CCD, conforme a Tabela 11.
37
Tabela 11: Dados obtidos da CC da fração M3, em Sephadex LH-20
Eluente
Código
Frações
Massa
Substância isolada
reunidas
(mg)
(mg)
H2O
M3.1
1–5
152,4
H2O:MeOH 25%
M3.2
6-8
133,4
M3.3
9–11
5,6
M3.4
12–19
15,3
M3.5
20–25
23,3
M3.6
26–29
7,0
H2O:MeOH 75%
M3.7
30–36
13,8
MeOH
M3.8
37-49
18,8
H2O:MeOH 50%
Cg 8 (23,3)
A análise da fração M3.5 por CCD, mediante revelação com solução de
MeOH:H2SO4 seguida de aquecimento, mostrou uma substância que estava pura e
foi codificada como Cg 8 (23,3mg).
As análises por CCD das demais frações revelaram um perfil cromatográfico
muito complexo não sendo estas frações estudadas.
4.1.3.2 Fracionamento do extrato bruto de C. glabratus por extração
ácido - base
Uma parte das folhas e galhos secos e moídos provenientes da segunda
coleta de C.glabratus (152,5g) foi tratada com hexano, seca, umedecida com NH4OH
e novamente seca ao ar. O material vegetal obtido foi extraído com CHCl3, deixandose em maceração 24 horas à temperatura ambiente. Após filtração, repetiu -se três
vezes o mesmo procedimento e o volume da solução foi reduzido, através de
evaporação do solvente, à pressão reduzida. A solução clorofórmica resultante foi
submetida à extração ácido - base, de acordo com o Esquema 4.
38
C.glabratus
152,5g
hexano
C.glabratus
(Resíduo)
Extrato Hexânico
(1) Umedecimento c/ NH4OH
(3) Extração com solução de HCl 5%
Fração CHCl3
Não Alcaloidal
Fração
Aquosa-ácida
(1) Basificação c/ NH4OH (pH 12)
Fração CHCl3
Alcaloidal
6,4 mg
Fração
Aquosa-básica
Fração
CHCl3:MeOH
Extração c/ CHCl3:MeOH 1:1
Fração Aquosa
Esquema 4: Extração ácido - base de C. glabratus (2a. coleta)
4.1.3.2.1 Estudo da fração CHCl3 alcaloidal de Cephalanthus
glabratus
Devido ao interesse por alcalóides, apenas a fração alcaloidal do
fracionamento proveniente da extração ácido – base de C.glabratus foi estudada.
A fração CHCl3 alcaloidal (6,4mg) foi submetida à CCDP (Hexano:AcOEt
50%) e o procedimento possibilitou o isolamento do alcalóide codificado como Cg 9
(3,2mg).
39
4.2 Resultados e discussão do estudo químico de Cephalanthus
glabratus
A parte de resultados e discussão inclui a elucidação estrutural das
substâncias isoladas da planta C.glabratus, cita a ocorrência destas substâncias em
outras espécies vegetais, menciona suas importâncias taxonômicas e respectivas
atividades farmacológicas, bem como descreve o estudo farmacológico realizado
com o extrato bruto desta planta.
4.2.1
Determinação
estrutural
das
substâncias
isoladas
de
A determinação estrutural descreve os resultados e discussões das análises
realizadas para a elucidação estrutural das substâncias isoladas de C. glabratus. Os
estudos revelaram a presença do alcalóide heteroioimbínico codificado como Cg 4;
dos oxindóis heteroioimbínicos codificados como Cg 5 e Cg 9; dos triterpenos Cg 3,
Cg 6 e Cg 7, além do ácido clorogênico Cg 8 e do material graxo Cg 1 e Cg 2.
40
4.2.1.1 Identificação estrutural de Cg 4
A substância Cg 4 foi isolada da fração CHCl3, resultante da partição em
solventes do extrato bruto metanólico de C. glabratus (1a. Coleta) e foi identificada
como o alcalóide tetraidroalstonina.
9
6
5
10
11
12
N
H H
3
N
14
15
21
H
20
H
H3CO2C
16
22
19
CH3
18
O
17
(Cg 4)
A estrutura da substância Cg 4 foi elucidada através da análise dos espectros
de RMN de 1H,
13
C, COSY, DEPT e comparação destes com os dados da literatura
(LOUNASMA, 1980; RAIMO, 1981; WENKERT et al., 1976).
RMN de 1H (Espectro 1 e 2, pág. 49 e 50) e 13C: (Espectro 3, pág. 51) dados
descritos na Tabela 15, pág. 48.
RMN 2D ,1H x 1H – COSY (Espectro 4, pág. 52): dados descritos na Tabela
12, pág. 43.
O espectro de RMN 1H de Cg 4 (Espectro 1, pág. 49) apresentou sinais
relacionados a NH em δ 7,76 e os correspondentes aos hidrogênios aromáticos de
núcleo indólico em δ 7,43 (d, J=7.5 Hz, H-9); δ 7,28 (dubleto parcialmente encoberto
41
pelo solvente, H-12), δ 7,05 (ddd, J=7,5; 6,0; 1,5 Hz, H-10) e δ 7,10 (ddd, J=7,5; 6,0;
1,5 Hz, H-11). Além destes, também mostrou um dubleto em δ 1,38 (J=6,3 Hz)
relacionado ao grupo CH3-18; um duplo quarteto em δ 4,48 (J=10,0; 6,0 Hz)
relacionado a H-19, um singleto correspondente a H-17 em δ 7,53, e o singleto
relacionado à metoxila em
δ
3,73 que foram característicos de unidade
secologanínica. O multipleto em δ 2,50 – 2,60 e o triplo dubleto em δ 2,93 (J=14,0;
5,7; <1) correspondente ao H-5α e H-5β, respectivamente, junto com os dubletos
relacionados ao H-6 em δ 2,65 e δ 2,87, o duplo dubleto relativo a H-3 em δ 3,34
(J=10,2 Hz) e os dois duplos dubletos referentes a H-21 em δ 2,73 (J=12,0; 6,3 Hz) e
δ
3,09 (J=12,0; 1,8) evidenciaram o sistema quinolizidínico, completando o esqueleto
heteroioimbínico proposto.
A análise do espectro de RMN de
13
C de Cg 4 (Espectro 3, pág. 51) mostrou
21 sinais e a do espectro DEPT revelou nove sinais relativos a C-H, quatro
correspondentes a CH2, dois referentes a CH3 e seis de carbonos quaternários.
Estes dados foram condizentes com a estrutura heteroioimbínica deste alcalóide. Os
sinais de RMN de
13
C em δ 135,9 (C-2); 108,1 (C-7); 129,6 (C-8); 118,0 (C-9); 119,3
(C-10); 121,3 (C-11); 110,7 (C-12) e 135,9 (C-13) são correspondentes ao núcleo
indólico. Os sinais em δ 31,3 (C-15); 38,4 (C-20); 72,4 (C-19), junto com os
apresentados em δ 109,5 (C-16) e 155,7 (C-17) correspondentes à dupla ligação de
um sistema carbonílico α,β-insaturado; em δ 167,9 correspondente a C=O de éster e
os dois sinais em δ 18,5 (CH3-18) e em δ 51,1 relativo a metoxila, foram
característicos da unidade secologanínica. Os sinais em δ 53,5 (C-5); 21,7 (C-6);
34,2 (C-14) e 56,2 (C-21) foram condizentes com os de um sistema quinolizidínico,
confirmando o esqueleto heteroioimbínico proposto.
42
O mapa de contorno COSY de Cg 4 (Espectro 4, pág. 52) apresentou
correlações homonucleares condizentes com a estrutura proposta. A análise dos
dados obtidos revelou correlações entre os hidrogênios aromáticos do núcleo
indólico em δ 7,43 d, J=7,5 Hz, H-9 e 7,05 (ddd, J=7,5; 6,0; 1,5 Hz, H-10); 7,28
(dubleto parcialmente encoberto, H-12) e 7,10 (ddd, J=7,5; 6,0; 1,5 Hz, H-11), entre
os hidrogênios da unidade secologanínica em δ 4,48 (dq, J=10,0; 6,0 Hz, H-19) e
1,38 (d, J=6,3 Hz, CH3-18); em δ 4,48 (dq, J=10,0; 6,0 Hz, H-19) e 1,68 m (H-20) e
entre os hidrogênios quinolizidínicos em δ 2,87 (m, H-6) e 2,60 (m, H-5); em δ 3,34
(dd, J=10,2 Hz, H-3) e 1,51 (encoberto, H-14); em δ 3,09 (dd, J=12,0; 1,8Hz, H-21) e
2,73 (dd, 12,0; 6,3 Hz, H-21) e 1,68 (m, H-20) conforme a Tabela 12.
43
1
Tabela 12: Correlações homonucleares
1
H x
H observadas no mapa de
contorno COSY de Cg 4
9
6
5
10
11
12
N
H H
3
N
14
15
21
H
20
19
H
17
22
no. H δ 1H multiplicidade (J em Hz) no. do H
9
7,43 d (7,5)
10
12
7,28 d parcialmente encoberto
11
19
4,48 dq (10,0; 6,0)
3
18
O
16
H3CO2C
CH3
δ
1
H multiplicidade (J em Hz)
7,05 ddd (7,5; 6,0; 1,5)
7,10 ddd (7,5; 6,0; 1,5)
3,34 dd (10,2)
CH3-18
20
14
1,38 d (6,3)
1,68 m
1,51 encoberto
21
3,09 dd (12,0; 1,8)
21
2,73 dd (12,0; 6,3)
6
2,87 m
5
2,6 m
20
1,68 m
21
2,73 dd (12,0; 6,3)
A análise dos espectros de RMN de 1H e de
13
C de Cg 4 e a comparação com
dados da literatura levou a sugerir o esqueleto de alcalóide heteroioimbínico (XXIX),
análogo aos isolados do gênero Cephalanthus.
9
6
10
5
11
12
N
H H
3
N
21
H
14
20
15
19
O
CH3O 2C
(XXIX)
16
17
18
CH3
44
Os alcalóides dessa classe (SHAMMA, 1963) apresentam 4 carbonos
estereogênicos (C-3, C-15, C-19 e C-20) e 16 estereoisômeros possíveis.
Entretanto, como H-15 é biogeneticamente α, o número de estereoisômeros é
reduzido a 8. O substituinte CH3-18 dessa classe de substâncias pode estar nas
posições α ou β e o grupo de estereoisômeros pode ser dividido. Assim, segundo a
literatura, os dois grupos de estereoisômeros resultantes foram classificados da
seguinte forma:
normais
(H-3 α; H-20 β; H-19 β )
(H-3 α; H-20β; H-19 α)
pseudos
(H-3β ; H-20 β; H-19 β )
(H-3β ; H-20 β; H-19 α)
allos
(H-3 α; H-20 α; H-19 β )
(H-3 α; H-20 α; H-19 α)
epiallos
(H-3 β; H-20 α; H-19 β )
(H-3β; H-20 α; H-19 α)
O dubleto em δ 1,38 relacionado ao grupo CH3-18 no espectro de RMN de 1H
é particularmente útil para a identificação das configurações allo e epiallo
(PHILLIPSON, 1983). Estes estereoisômeros apresentam junção cis entre os anéis
D/E e produzem espectros com deslocamentos químicos na região de δ 1,34-1,45
para os hidrogênios ligados a CH3-18, em contraste com os isômeros normal e
pseudo com junção D/E trans e valores correspondentes a δ 0,92-1,36. O espectro
de RMN de 1H de Cg 4 também mostrou um duplo dubleto em δ 3,34 (H-3)
característico da configuração H-3α (allo e normal), que em geral apresentam este
sinal em δ 3,33-3,49. Os isômeros que apresentam configurações H-3β (epiallo e
pseudo) mostram deslocamentos químicos maiores, compreendidos entre δ 3,784,56. Embora o valor da constante de acoplamento entre H-15 e H-20 seja
importante para a identificação dos estereoisômeros, não foi possível a sua
observação para Cg 4.
45
A comparação dos dados de RMN de
13
C (Tabela 13 e 14, pág. 46 e 47) dos
oito estereoisômeros possíveis também sugeriu a estereoquímica de um isômero
allo (H-3α; H-20α; H-19β). O deslocamento químico do C-19 de Cg 4 em δ 72,4
indicou a posição de H-19 como β, uma vez que os estereoisômeros C-19 (H-19α)
apresentam deslocamentos químicos maiores (examinar dados correspondentes a
C-19 na Tabela 13, pág. 46). A Tabela 14, pág. 47 mostra para os estereoisômeros
akuamigina e 3-iso-ajmalicina, deslocamentos químicos de C-3 (H-3β) em δ 54,5 e δ
54,2 respectivamente. O valor correspondente a C-3 em δ 59,8 para o
estereoisômero ajmalicina (H-3α) está condizente com o observado para Cg 4 em δ
59,7. A comparação dos deslocamentos químicos de C-19 (em δ 72,4) de Cg 4, bem
como a dos demais carbonos com os descritos para a tetraidroalstonina, um
alcalóide heteroioimbínico do tipo allo mostra valores concordantes.
A comparação dos dados apresentados pelos espectros de RMN de 1H e de
13
C de Cg 4 com os descritos na literatura para a tetraidroalstonina (Tabela 15, pág.
48) confirmaram a estrutura desta substância.
3
3
N
N
H H
H
15
H3CO2C
H
18
20
CH3
19
O
Rauniticina
Allo H-3α ; H-20α ; H-19α
2
3
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
CH3O-
134,3
58,0
52,8
21,1
107,6
127,0
117,7
119,1
121,0
110,6
135,8
32,5
29,5
107,7
154,3
19,1
76,4
34,2
53,7
168,0
51,0
N
H H
3
N
18
H
CH3
20
H
H3CO2C
15
N
H H
19
O
3-Isorauniticina
Epiallo H3β ; H-20α ; H-19α
N
H
H3CO2C
15
H
18
20
CH3
19
O
Mayumbina
19-Epiajmalicina
Normal H-3α ; H-20β ; H-19α
134,5
55,0
53,4
21,7
108,2
127,3
117,9
119,3
121,2
110,7
136,1
31,2
31,7
105,9
157,2
17,3
75,8
37,2
49,8
167,7
51,0
134,4
59,6
53,2
21,8
107,9
127,3
117,9
119,2
121,2
110,8
136,0
33,8
36,5
107,8
155,9
18,2
75,5
43,6
56,2
167,3
50,8
3
N
H H
N
H
20
H
H3CO2C
15
18
CH3
19
O
19-Epi-3-isoajmalicina
Pseudo H-3β ; H-20α ; H-19α
132,4
53,8
50,9
16,8
107,4
127,3
117,6
119,1
121,3
111,1
135,7
31,2
30,8
107,7
155,9
18,0
75,3
43,8
46,8
167,2
50,9
Tabela 13: Dados de RMN de 13C de Alcalóides Heteroioimbínicos I (CDCl3)
46
464
9
6
5
10
2
11
12
N
N
3
H
14
H
H3CO 2C
21
H
15
16
20
18
CH3
19
O
17
Tetraidroalstonina
Nº C Allo: H-3α ; H-20α; H-19β
2
134,4
3
52,6
5
53,3
6
21,7
7
107,6
8
126,9
9
117,8
10
119,0
11
120,9
12
110,6
13
135,8
14
34,2
15
31,2
16
109,3
17
155,5
18
18,4
19
72,3
20
38,3
21
56,0
22
167,8
CH3O51,0
N
N
H
H
H
H3CO2C
N
CH3
N
H
H
O
Akuamigina
Epiallo: H-3β ; H-20α ; H-19β
132,8
54,5
52,2
19,2
106,8
127,2
117,7
119,1
121,2
110,8
135,7
30,6
25,7
107,6
154,8
18,4
73,2
37,2
50,3
167,5
50,9
N
H
H3CO2C
CH3
N
H
H
H
O
Ajmalicina
Normal: H-3α ; H-20β ; H-19β
134,0
59,8
52,7
21,3
106,4
126,6
117,3
118,4
120,5
110,6
135,9
32,1
30,1
106,5
154,5
14,5
73,3
40,2
56,2
167,3
50,6
H3CO2C
CH3
O
3-Iso-Ajmalicina
Cg4
Pseudo: H-3β ; H-20β ; H-19β
132,0
135,9
54,2
59,7
50,9
53,5
16,8
21,7
106,6
108,1
127,6
129,6
117,8
118,0
119,3
119,3
121,5
121,3
111,2
110,7
135,8
135,9
31,0
34,2
26,0
31,3
106,5
109,5
154,6
155,7
14,9
18,5
73,6
72,4
41,0
38,4
47,3
56,2
167,3
167,9
50,9
51,1
Tabela 14: Dados de RMN de 13C de Alcalóides Heteroioimbínicos II (CDCl3)
47
474
48
Tabela 15: Dados de RMN de 13C e de 1H da tetraidroalstonina e de Cg 4
9
6
5
10
11
N
H H
12
3
N
14
15
21
H
20
19
H
H3C O 2C
22
Tetraidroalstonina / CDCl3
1
δ H (J em Hz)
16
C H3
18
O
17
Cg 4 / CDCl3
1
δ H (J em Hz)
N0.C
2
C
134,4
3
52,6
3,32 d (12,0)
59,7
3,34 dd (10,2)
5α
53,3
21,7
2,54 ddd (12,5; 11,0; 4,0)
2,92 ddd (12,5; 6,0; <1)
2,67 d (largo)
2,87 ddd (15; 6,0; <1 )
53,5
β
α
2,5 – 2,6 m
2,93 ddd (14,0; 5,7; <1)
2,65 d (largo)
2,87 m
6
δ
13
β
δ
13
C
135,9
21,7
7
107,6
108,1
8
126,9
129,6
9
117,8
7,42
118,0
7,43 d (7,5)
119,0
a
119,3
7,05 ddd (7,5; 6,0; 1,5)
a
10
7,05
11
120,9
7,10
121,3
7,10 ddd (7,5; 6,0; 1,5)
12
110,6
7,24
110,7
7,28 d
(parcialmente encoberto)
13
135,8
14α
34,2
135,9
2,50 dt (12,0; 4,0)
1,52 q (12,0; 4,0)
2,76 dt (4; 0,5)
β
34,2
15
31,2
16
109,3
17
155,5
7,55 d (0,5)
155,7
7,53 s
18
18,4
1,38 d (6,5)
18,5
1,38 d ( 6,3 )
19
72,3
4,48 dq (12; 6,5)
72,4
4,48 dq (10,0; 6,0)
20
38,3
1,68 d (largo)
38,4
1,68 m
21 α
56,0
2,72 dd (12,0; 5,0)
3,08 dd (12,0; 3,0)
56,2
2,73 dd (12,0; 6,3)
3,09 dd (12,0; 1,8)
β
22
167,8
CH3 O-
51,0
31,3
2,47 dt (12,5; 2,0)
1,51 (encoberto)
2,70 m
109,5
NH
LOUNASMAA, M. 400 MHz
167,9
3,74 s
7,86 s (largo)
51,1
3,73 s
7,76 s (largo)
49
9
6
5
10
11
12
N
H H
3
N
14
15
21
H
20
H
H3CO2C
22
16
19
CH3
18
O
17
Espectro 1: Espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 4
49
50
9
6
5
10
11
12
N
H H
3
N
14
15
21
H
20
H
H3CO2C
22
16
19
CH3
18
O
17
Espectro 2: Expansão do espectro de RMN de 1H (CDCl3 / 300 MHz) de Cg 4
50
51
Espectro 3: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 4
51
52
9
6
5
10
11
12
N
H H
3
N
14
15
21
H
20
H
H3CO2C
22
16
19
CH3
18
O
17
Espectro 4: Mapa de contorno COSY de Cg 4 em CDCl3
52
53
A substância Cg 5 foi isolada da fração CHCl3, resultante da partição em
solventes do extrato bruto metanólico de C.glabratus e foi identificada como o
alcalóide mitrafilina.
4
5
9
6
H
21
CH3
H
19
O
N
14
7
15
17
3
10
2
11
12
O
N
H
H
16
22CO 2CH
(Cg 5)
A estrutura da substância Cg 5 foi elucidada com base em dados
espectroscópicos de UV, IV, RMN de 1H, de
13
C, DEPT, COSY, HMQC, EM e por
comparação destes com os dados descritos na literatura para o alcalóide mitrafilina
(HIROKO, 1993).
UV, nm: 206, 243, 285, 280 (Espectro 5, pág. 54).
IV, νmáx.KBr cm-1: 3429, 2800, 2700, 1724, 1706, 1620, 1296, 1188,1099
(Espectro 6, pág. 64).
RMN de 1H, 300,06 MHz / CDCl3, δ ppm e RMN de 13C, (75,5 MHz / CDCl3), δ
ppm: dados descritos na Tabela 18, pág. 63 (Espectros 7 e 8, págs. 65 e 66).
54
RMN 2D (1H x 1H COSY), 300,06 MHz / CDCl3: dados descritos na Tabela 16,
pág. 57 (Espectros 9 e 10, pág. 67 e 68).
RMN 2D (13C x 1H HMQC), 75,5 MHz / CDCl3: dados descritos na Tabela 17,
pág. 58 (Espectro 11, pág.69).
EM m/z (int. rel. %): 368 (46,6); 351 (3,9); 223 (100,0); 130 (24,7); 69 (73,8).
(Espectro 12, pág. 70).
As absorções no UV de Cg 5 (Espectro 5, pág. 54) mostraram o espectro
padrão de alcalóide oxindólico heteroioimbínico, apresentando, além das bandas de
absorção (transições π → π*) relacionadas a éster α,β insaturado em 206 nm e
sistema aromático em 243 nm, as transições n → π* em 280-285 nm, que são
proibidas e se caracterizam por baixa absortividade.
0,7
206
Absorbância
0,6
0,5
0,4
243
0,3
0,2
0,1
0,0
200
280 - 285
250
300
Comprimento de onda (nm)
Espectro 5: Espectro no UV – Vis de Cg 5 em EtOH, c=1,67.10-5 mol . L-1
55
O espectro de absorção no IV (Espectro 6, pág. 64) mostrou em 3429 cm-1
banda
relacionada
à (N -H) de indol; em 1724 e 1706 cm-1 absorções
correspondentes à (C=O) de éster e amida respectivamente; em 1620 cm -1 banda
referente à ligação (C=C) e em 1296, 1188 e 1099 cm -1 absorções correspondentes
às ligações (C -O).
O espectro de RMN de 1H de Cg 5 (Espectro 7, pág. 65) mostrou sinais
correspondentes à estrutura de alcalóide oxindólico heteroioimbínico e apresentou
os sinais característicos do núcleo indólico: em δ 7,20 d (J=7,8 Hz) H-9 e em δ 7,04
ddd (J=7,8; 7,8 e 1,0 Hz) H-10; em δ 7,20 ddd (J=7,8; 7,5 e 1,0 Hz) H-11 e em δ 6,85
d (J=7,5Hz) H-12. O espectro também mostrou um multipleto em δ: 2,10
correspondente aos hidrogênios H-15 e H-20; um dubleto em δ 1,87 (J=10,0 Hz) e
um duplo dubleto em δ 3,18 (J=10,0 e 2,7 Hz) referentes a H-21; um duplo dubleto
em δ 2,41 (J=11,1 e 2,4 Hz) relacionado a H-3 e multipletos em δ 2,51 e 3,38
relativos aos hidrogênios metilênicos H-5, além dos multipletos em δ 2,03 e 2,49
correspondentes aos hidrogênios metilênicos H-6 e dos sinais correspondentes a H14 em δ 2,31 ddd (J=11,1; 2,7; 2,7) e 1,12 (ddd parcialmente encoberto pelo sinal
relativo a CH3-18). Estes dados são condizentes com um sistema indolizidínico.
Além destes, foi possível observar o dubleto correspondente a H-17, relacionado a
C-H em posição β à carbonila α,β insaturada em δ 7,44 (J=1,5 Hz); o duplo quarteto
em δ 4,40 (J=6,6; 3,6 Hz) relacionado a H-19; o singleto referente à metoxila em δ
3,61 e o dubleto relacionado ao CH3-18 em δ 1,11 (J=6,6 Hz) que indicaram a
presença da unidade secologanínica.
O espectro de RMN
13
C de Cg 5 (Espectro 8, pág. 66) mostrou em δ 180,8
sinal relacionado à carbonila de lactama; em δ 55,4 sinal correspondente ao carbono
56
do tipo “spiro” C-7 e em δ 133,7; 122,8; 123,1; 128,1; 109,4 e 140,6 absorções
referentes à unidade oxindólica. O espectro também apresentou em δ 54,3; 54,2;
35,0 e 28,2 sinais correspondentes a carbonos metilênicos e em δ 167,3 e 50,6
sinais relativos à carbonila e metoxila de éster que, junto aos sinais em δ 14,7 e δ
154,2 correspondentes respectivamente, ao grupo metílico (C-18) e C-H em posição
β
à carbonila α,β-insaturada, caracterizaram a unidade secologanínica.
O mapa de contorno COSY de Cg 5 (Espectros 9 e 10, pág. 67 e 68)
apresentou correlações homonucleares condizentes com a estrutura oxindólica
heteroioimbínica. A análise dos dados obtidos revelou correlações entre os
hidrogênios aromáticos do núcleo indólico em δ 7,20 d (J=7,8Hz) H-9 e 7,04 ddd
(J=7,8; 7,8; 1,0Hz) H-10; em δ 7,20 ddd (J=7,8; 7,5; 1,0Hz) H-11 e 6,85 d (J=7,5Hz)
H-12; entre os hidrogênios do esqueleto indolizidínico em δ 2,51 m H-5 e 2,03 m H-6;
em δ 2,31 ddd (J=11,1; 2,7; 2,7Hz) H-14 e 2,41 dd (J=11,1; 2,4Hz) H-3; 2,31 ddd
(J=11,1; 2,7; 2,7Hz) H-14 e 2,10 m H-15; 1,87 d (J=10,0Hz) H-21 e 2,10 m H-20 e
entre os hidrogênios da unidade secologanínica em δ 4,40 dq (J=6,6; 3,6Hz) H-19 e
1,11 d (J=6,6Hz) CH3-18. Os dados das correlações homonucleares do mapa de
contorno COSY foram relacionados na Tabela 16.
57
COSY de Cg 5
4
5
9
6
H
7
12
no. H
δ
1
H multiplicidade (J/Hz)
N
H
CH 3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2C H3
22
no. H
δ
1
3
2,41 dd (11,1; 2,4)
14 α
2,31 ddd (11,1; 2,7; 2,7)
5α
2,51 m
6α
2,03 m
5α
2,51 m
6β
2,49 m
6β
2,49 m
6α
2,03 m
9
7,20 d (7,8)
10
7,04 ddd (7,8; 7,8; 1,0)
11
7,20 ddd (7,8; 7,5; 1,0)
12
6,85 d (7,5)
14 α
2,31 ddd (11,1; 2,7; 2,7)
14 β
1,12 ddd (11,1) parcialmente encoberto
15
2,10 m
14 β
1,12 ddd (11,1) parcialmente encoberto
18
1,11 d (6,6)
19
4,40 dq (6,6; 3,6)
20
2,10 m
21 α
1,87 d (10,0)
21 α
1,87 d (10,0)
21 β
3,18 dd (10,0; 2,7)
A análise do mapa de contorno HMQC (Espectro 11, pág. 69) de Cg 5
mostrou as correlações entre os carbonos e os hidrogênios do núcleo oxindólico em
δ
122,8 C-9 e δ 7,20 d (J=7,8Hz) H-9; em δ 123,1 C-10 e δ 7,04 ddd (J=7,8; 7,8;
1,0Hz) H-10; em δ 128,1 C-11 e δ 7,20 ddd (J=7,8; 7,5; 1,0Hz) H-11; em δ 109,4 C12 e δ 6,85 d (J=7,5Hz) H-12; os do anel indolizidínico em δ 54,3 C-5 e 35,0 C-6
relacionados respectivamente aos multipletos em δ 2,51 e 3,38 H-5; e δ 2,03 e δ 2,49
H-6, além dos sinais em δ 28,2 C-14 e δ 54,2 C-21 também correlacionados aos
respectivos hidrogênios metilênico em δ 2,31 ddd (J=11,1; 2,7; 2,7Hz) e 1,12 ddd
(J=11,1) H-14; e em δ 1,87 d (J=10,0Hz) e 3,18 dd (J=10,0;2,7Hz) H-21; e os da
58
unidade secologanínica em δ 154,2 C-17 e δ 7,44 d (J=1,5Hz) H-17; em δ 30,2 C-15
e 2,10 m H-15 e em δ 73,8 C-19 e 4,40 dq (J=6,6; 3.6Hz) H-19, consolidando as
atribuições citadas anteriormente. Os dados do mapa de contornos HMQC estão
apresentados na Tabela 17.
HMQC de Cg 5
4
5
9
H
6
7
N
H
12
o
n . do C / H
δ
13
C
δ
1
H
CH3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
16
H
C O 2C H 3
22
multiplicidade
(J/Hz)
3
74,5
2,41
dd
(11,1; 2,4)
5α
54,3
β
α
35,0
m
m
m
m
d
(7,8)
9
122,8
2,51
3,38
2,03
2,49
7,20
10
123,1
7,04
ddd
(7,8; 7.8; 1,0)
11
128,1
7,20
ddd
(7,8; 7,5; 1,0)
12
109,4
6,85
d
14 α
28,2
ddd
ddd
m
6
β
(7,5)
15
30,2
2,31
1,12
2,10
17
154,2
7,44
d
(1,5)
18
14,7
1,11
d
(6,6)
19
73,8
4,40
dq
(6,6; 3,6)
20
40,4
2,10
m
21 α
54,2
β
CH3-O-
50,6
1,87
3,18
3,61
d
dd
s
β
(11,1; 2,7; 2,7)
(11,1) parcialmente encoberto
(10,0)
(10,0; 2,7)
59
O espectro de massas de Cg 5 (Espectro 12, pág. 70) confirmou a estrutura
proposta, mostrando o pico relacionado ao íon molecular em m/e 368. Este dado e
os obtidos dos espectros no UV, IV e RMN de 1H e
13
C são condizentes com a
estrutura de alcalóide oxindólico heteroioimbínico pentacíclico. O espectro de
massas de Cg 5 também mostrou um pico em m/z 351 (M+⋅ - 17) relacionado à perda
de radical hidroxílico, (Esquema 5) que caracterizou a natureza oxindólica do
alcalóide (BUDZIKIEWIEZ, 1964).
_
N
H
N
H
N
H OH
OH
N
N
H
N
O
m/z 351
Esquema 5: Fragmentação de alcalóide oxindólico
O espectro de massas de Cg 5 também apresentou pico base em m/z 223,
condizente com o de alcalóides oxindólicos pentacíclicos. Este pico é derivado da
porção alicíclica da molécula e aparece junto com outro sinal (M+
-
correspondente à perda de CH 3 ligado ao C-19 - Esquema 6 (PHILLIPSON, 1975).
15)
60
N
N
H
O
COOCH3
O
CH2
N
CH2
+
+
N
H
CH3
O
H3COOC
O
m/z 223
CH2
N
+
+
H3COOC
m/z 69 CH2
O
Esquema 6: Fragmentação de oxindol heteroioimbínico pentacíclico
A presença do núcleo oxindólico em Cg 5 foi também evidenciada pelo
fragmento em m/e 130 (Esquema 7).
CH2
N
H
CH2
e-
O
N
H
O
m/e 130
Esquema 7: Fragmentação de alcalóide oxindólico
As análises dos espectros de RMN de 1H, de
13
C, DEPT, COSY, HMQC e EM
confirmaram o esqueleto oxindólico heteroioimbínico para Cg 5.
61
Os alcalóides oxindólicos heteroioimbínicos contêm 5 centros quirais (C-3; C15; C-19; C-20 e C-7) e podem apresentar teoricamente 32 estereoisômeros. Nestes
oxindóis, do mesmo modo que nos alcalóides heteroioimbínicos, H-15 também é
biogeneticamente α, o que restringe o número de estereoisômeros para 16.
A classificação dos oxindóis heteroioimbínicos também é similar à utilizada
para os alcalóides heteroioimbínicos (normal, pseudo, allo e epiallo). Os do tipo
pseudo apresentam impedimento estérico no anel D e facilmente se epimerizam
para a configuração normal. Na prática, o número de estereoisômeros é limitado a
12 (SHAMMA et al., 1967).
Os alcalóides do tipo normal (H3-α; H-20β; H-19β) caracterizam-se pela
relação trans entre os anéis C/D e D/E, apresentando no espectro de RMN de 1H
sinais relacionados a H-15 em δ 2,05 - 2,2. Para Cg 5, este sinal apareceu em δ
2,10. Nos oxindóis de configuração normal o valor da constante de acoplamento
entre H-15 e H-17 é de 1,3-1,9 Hz. O sinal correspondente a H-17 no espectro de
RMN de 1H de Cg 5 apareceu como um dubleto, cuja constante de acoplamento foi
de 1,5 Hz. Também o deslocamento químico do sinal relativo a H-3 é influenciado
pela estereoquímica do C-7 (“spiro”). Assim, na configuração de oxindóis do tipo
normal, o isômero com C-7 “R” mostra o sinal referente a H-3 em δ 2,3-2,4. A
substância Cg 5 apresentou este sinal em δ 2,41. O isômero do tipo normal
apresenta, nos espectros de RMN de
13
C, o deslocamento químico de C-3 em δ
74,0-74,5, sendo o valor observado para Cg 5 (δ 74,5) condizente com a
estereoquímica proposta. A análise de todos estes dados sugeriu que a
estereoquímica de Cg 5 fosse a de oxindol com configuração normal.
A análise do espectro de absorção no IV (Espectro 6, pág. 64) também
contribuiu para a elucidação da estereoquímica de Cg 5. Além das bandas de
62
absorção descritas anteriormente, também foi possível observar Bandas de
Bohlmann (BOHLMANN, 1959). Estas bandas ocorrem na região entre 2800 – 2700
cm-1 e evidenciam o efeito do par de elétrons não-compartilhado do nitrogênio em
sistemas quinolizidínicos sobre a freqüência de absorção das ligações (C-H) trans de
carbonos adjacentes. Os orbitais antiligantes destas ligações são paralelos ao orbital
do átomo de nitrogênio que tem os elétrons não-compartilhados. A interação entre
estes orbitais fortalece a ligação (C-N), contudo enfraquece as ligações (C-H) trans,
que passam a absorver em freqüências menores no infravermelho. Bohlmann
deduziu que a simplicidade ou a complexidade relativa destas bandas de absorção
em quinolizidinas é devida à natureza equatorial ou axial das ligações (C -H) de
carbonos adjacentes ao nitrogênio. A absorção é mais complexa, quando existem
pelo menos duas ligações em relação trans ao par de elétrons não-compartilhado do
nitrogênio e indica a presença de hidrogênio em posição axial em carbonos
adjacentes a este nitrogênio. Ao contrário, quando não há bandas de absorção nesta
região, ou aparece uma absorção simples, a ligação (C-H) deve ser equatorial. A
presença de Bandas de Bohlmann no espectro de absorção no infravermelho de Cg
5 indica que em carbonos adjacentes ao nitrogênio do esqueleto análogo ao
quinolizidínico há ligações (C-H) trans. Esta dedução é indicativa de configuração α
para H-3.
O resultado das análises dos espectros de UV, IV, EM de Cg 5 e a
comparação dos dados de RMN de 1H e
13
C (Tabela 18) com os descritos na
literatura permitiram identificar a estrutura de Cg 5 como o alcalóide mitrafilina
(HIROKO et al., 1993).
63
Tabela 18: Dados de RMN de1H e de 13C para mitrafilina e Cg 5
4
5
9
6
H
7
3
2
12
19
N
10
11
CH3
H
21
O
15
14
17
16
H
O
CO2CH3
22
N
H
Mitrafilina*
0
n
.
δ
13
δ
C
2
3
181,3
74,5
5α
5β
6α
6β
7
8
9
54,2
55,5
133,3
122,8
10
H (JHz) / CDCl3
2,41 dd (11,1; 2,4)
2,50 m
3,39 m
2,03 m
2,49 m
35,1
Cg 5
δ
13
C
180,8
74,5
54,3
35,0
δ
1
H (JHz) / CDCl3
2,41 dd (11,1; 2,4)
2,51 m
3,38 m
2,03 m
2,49 m
7,19 d (7,8)
55,4
133,4
122,8
7,20 d (7,8)
122,4
7,03 ddd (7,8; 7,8; 0,9)
123,1
7,04 ddd (7,8; 7,8; 1,0)
11
128,0
7,18 ddd (7,8; 7,6; 0,9)
128,1
7,20 ddd (7,8; 7,5; 1,0)
12
109,7
6,89 d (7,6)
109,4
6,85 d (7,5)
13
14 α
14 β
15
140,8
28,3
30,4
2,38 ddd (11,1; 2,7; 2,4)
1,21 ddd (11,1; 11,1; 11,1)
2,10 m
16
17
106,9
154,0
18
140,6
28,2
30,2
2,31 ddd (11,1; 2,7; 2,7)
1,12 ddd (11,1) / encoberto
2,10 m
7,43 d (1,3)
106,9
154,2
7,44 d (1,5)
14,8
1,11 d (6,6)
14,7
1,11 d (6,6)
19
73,8
4,37 dq (6,6; 3,2)
73,8
4,40 dq (6,6; 3,6)
20
40,4
2,10 m
40,4
2,10 m
21α
21 β
22
54,3
1,85 dd (10,5; 10,4)
3,22 dd (10,5; 2,2)
54,2
1,87 d (10,0)
3,18 dd (10,0; 2,7)
CH3 O-
167,1
50,7
NH
*
1
HIROKO et al., 500 MHz.
3,58 s
7,74 s (largo)
167,3
50,6
3,61 s
64
4
5
9
6
H
7
12
N
H
CH3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2C H3
22
Espectro 6: Espectro no IV (pastilhas de KBr) de Cg 5
64
65
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
CH 3
2
14
O
15
17
H
16
CO 2C H3
22
65
4
5
9
6
H
7
3
12
N
H
2
66
CH 3
H
19
O
N
10
11
21
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
66
67
4
5
9
6
H
12
7
N
H
CH3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 9: Mapa de contorno COSY de Cg 5 em CDCl3.
67
68
4
5
9
6
H
7
12
N
H
CH 3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 10: Expansão do mapa de contorno COSY de Cg 5 em CDCl3
68
69
4
5
9
6
H
12
7
N
H
CH3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 11: Mapa de contorno HMQC de Cg 5.
69
70
4
5
9
6
H
7
12
N
H
CH 3
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2C H3
22
Espectro 12: Espectro de massas (70 eV) de Cg 5
70
71
A substância Cg 9 foi isolada da fração alcaloidal proveniente da extração
ácido-base realizada com as folhas e galhos de C. glabratus (2a. coleta) e foi
identificada como o alcalóide uncarina E.
CH3
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
(Cg 9)
A estrutura de Cg 9 foi elucidada com base em dados espectroscópicos de
UV, RMN de 1H,
13
C, DEPT, COSY, HMQC, HMBC, NOESY e por comparação
destes com os dados descritos na literatura para Uncarina E (HIROKO et al., 1993).
UV, nm:207, 245, 279, 283 (Espectro 13, pág. 72).
RMN de 1H, 300,06 MHz / CDCl3, δ ppm e RMN de
13
C, 75,5 MHz / CDCl3, δ
ppm : dados descritos na Tabela 23, pág. 80 (Espectros 14 e 15, pág. 81 e 82).
pág. 75 (Espectro 16, pág. 83).
72
pág.76 (Espectro 17, pág. 84).
RMN 2D (13C x 1H HMBC), 75,5 MHz / CDCl3: Dados descritos na Tabela 21,
pág. 77 (Espectro 18, pág.85).
RMN 2D (13C x 1H NOESY), 75,5 MHz / CDCl3: Dados descritos na Tabela 22,
As absorções no UV de Cg 9 (Espectro 13, pág. 72) mostraram o padrão
característico de alcalóide heteroioimbínico, apresentando transições π → π* em 207
nm relacionadas às duplas ligações conjugadas do grupo éster α,β insaturado,
transições π → π* em 245 nm correspondentes ao grupo oxindólico e transições n →
em 279-283 nm, que são proibidas e se caracterizam por baixa absortividade.
0,7
207
0,6
0,5
Absorbância
*
π
0,4
245
0,3
0,2
279 - 283
0,1
0,0
200
250
300
350
Comprimento de Onda (nm)
Espectro 13: Espectro no UV – Vis de Cg 9 em EtOH, c= 1,74. 10-5 mol.L-1.
73
O espectro de RMN de 1H (Espectro 14, pág. 81) apresentou os sinais
característicos do núcleo indólico relacionados ao H-9 em δ 7,28 (parcialmente
encoberto pelo solvente); ao H-10 em δ 7,02 dd (J=7,5; 7,5 Hz); ao H-11 em δ 7,18
ddd (J=7,5; 7,5; 1,2 Hz) e ao H-12 em δ 6,83 d (J=7,5 Hz). O espectro também
mostrou em δ 1,41 (J=6,3 Hz) um dubleto correspondente a CH3-18; em δ 3,60 um
singleto atribuído ao grupo metoxila; em δ 7,41 singleto referente ao H-17; em δ 4,34
(J=12,6; 6,3 Hz) um duplo quarteto relativo ao H-19, originado do acoplamento com
CH3-18 e também do acoplamento diaxial entre H-19 e H-20. Estes sinais foram
característicos da unidade secologanínica. Além deles, também foram verificados
sinais condizentes com um sistema indolizidínico, como o multipleto em δ 2,50
relacionado ao H-15 α, o singleto em δ 1,58 correspondente ao H-20 e três duplos
dubletos em δ 2,54 (J=11,7; 2,7 Hz) relativo ao H-3 α acoplado diaxialmente com H14; em δ 2,41 (J=11,7; 3,6 Hz) e 3,28 (J=11,7; 1,8 Hz) referentes ao CH2-21 α e β,
respectivamente .
O espectro de RMN de
13
C de Cg 9 (Espectro 15, pág. 82) apresentou sinais
concordantes com os da estrutura de alcalóide oxindólico heteroioimbínico,
mostrando deslocamentos correspondentes ao esqueleto oxindólico em δ 57,0 (C-7)
relacionado ao carbono “spiro”, em δ 180,8 (C=O) e δ 124,9 (C-9); 122,8 (C-10);
110,0 (C-11) e 109,5 (C-12). Os sinais em δ 167,8 (C=O); 110,0 (C-16) e 155,2 (C17) são relativos à carbonil a α,β-insaturada que, junto com os deslocamentos
correspondentes ao carbono do grupo metila C-18 em δ 18,8; δ 72,4 (C-19); 38,1(C20) e δ 30,7 (C-15), confirmaram a unidade secologanínica. Os sinais relacionados a
carbonos metilênicos em δ 54,3 (C-5); 35,0 (C-6); 30,4 (C-14) e 53,7 (C-21) junto aos
74
sinais para os carbonos metínicos em δ 71,6 (C-3); em δ 30,7 (C-15) e em δ 38,1 (C20) confirmaram a presença do esqueleto heteroioimbínico.
O mapa de contorno
1
H x
1
H COSY (Espectro 16, pág. 83) mostrou
correlações concordantes com a estrutura apresentada para Cg 9. Além das
correlações correspondentes à unidade secologanínica entre H -19 em δ 4,34 dq
(J=12,6; 6,3Hz) e H-18 em δ 1,41 d (J=6,3Hz); H-19 em δ 4,34 dq (J=12,6; 6,3Hz) e
H-20 em δ 1,58 m, H-15 em δ 2,50 m e H-20 em δ 1,58 m, também foi possível
observar as correlações entre os hidrogênios aromáticos H-9 em δ 7,28
(parcialmente encoberto) e H-10 em δ 7,02 dd (J=7,5; 7,5Hz); H-11 em δ 7,18 ddd
(J=7,5; 7,5; 1,2Hz) e H-10 em δ 7,02 dd (J=7,5; 7,5Hz); H-11 em δ 7,18 ddd (J=7,5;
7,5; 1,2Hz) e H-12 em δ 6,83 d (J=7,5Hz). Além das correlações entre H-6 α em δ
2,0 m e H-5 α em δ 2,46 ddd (J=7,5; 7,5; 7,5) e H-5 β em δ 3,25 ddd (J= 7,5; 7,5; 2,3)
verificou-se também as correlações entre os hidrogênios geminais H-14 α em δ 1,58
(encoberto) e H-14 β em δ 0,87 ddd (11,7; 11,7; 11,7), que completaram o esqueleto
carbônico proposto para Cg 9 (Tabela 19, pág 75).
75
Tabela 19: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Cg 9
CH 3
4
5
9
6
H
7
12
o
n .H
δ
N
H
19
O
N
3
10
11
H
21
2
1
H multiplicidade (J / Hz)
15
14
17
16
H
O
CO 2C H3
22
o
n .H
δ
1
9
7,28 parcialmente encoberto
10
7,02 dd (7,5; 7,5)
11
7,18 ddd (7,5; 7,5; 1,2)
12
6,83 d (7,5)
10
7,02 dd (7,5; 7,5)
18
1,41 d (6,3)
20
1,58 m
19
4,34 dq (12,6; 6,3)
21 β
3,28 dd (11,7; 1,8)
21 α
2,41 dd (11,7; 3,6)
5β
3,25 ddd
6α
2,0 m
5α
2,46 ddd
6α
2,0 m
15
2,50 m
20
1,58 m
14 α
1,58 encoberto
14 β
0,87 ddd (11,7; 11,7; 11,7)
A análise do mapa de contorno HMQC (Espectro 17, pág. 84) de Cg C9
mostrou as correlações entre carbonos e hidrogênios do núcleo oxindólico, do
esqueleto indolizidínico e da unidade secologanínica, confirmando todas as
atribuições descritas anteriormente. Os dados do mapa de contorno HMQC estão
apresentados na Tabela 20, pág. 76.
76
HMQC de Cg 9
CH 3
4
5
6
9
7
3
o
n .C/H
δ
13
C
2
N
H
12
δ
H
19
O
N
H
10
11
21
1
15
14
17
H
O
16
CO 2C H3
22
H
multiplicidade
(J /Hz)
3
71,6
2,54
dd
(11,7; 2,7)
5
54,3
35,0
9
124,9
ddd
ddd
m
m
d
(7,5; 7,5; 7,5)
(7,5; 7,5; 2,3)
6
2,46
3,25
2,37
2,0
7,28
(parcial./ encoberto)
10
122,8
7,02
dd
(7,5; 6,0)
11
127,9
7,18
ddd
(9,0; 7,5; 1,2)
12
109,5
6,83
d
(7,8)
14
30,4
30,7
s
ddd
m
(largo)
15
1,58
0,87
2,50
17
155,2
7,41
s
18
18,8
1,41
d
(6,3)
19
72,4
4,34
dq
(12,6; 6,3)
20
38,1
1,58
m
21
53,7
CH3-O-
51,2
2,41
3,28
3,60
dd
dd
s
(11,7; 3,6)
(11,8; 1,8)
O mapa de contorno HMBC (Espectro 18, pág. 85) para Cg 9, além das
correlações heteronucleares
13
C x
1
H entre os carbonos aromáticos do núcleo
indólico (C-10; C-12) e os hidrogênios (H-12; H-10), apresentou também correlações
correspondentes à unidade secologanínica de C -20 com os hidrogênios metílicos
77
(CH3-18); de C-16 com o hidrogênio olefínico (H-17) e da carbonila do grupo éster
(C-22) com os respectivos hidrogênios da metoxila. As correlações de C-21 com H15; de C-3 com H-5 e de C-7 com H-5 completaram o esqueleto heteroioimbinico
proposto para Cg 9 (Tabela 21).
Tabela 21: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMBC de Cg 9
CH 3
4
5
9
6
H
7
12
o
n .C
δ
13
C
N
H
19
O
N
3
10
11
H
21
2
15
14
17
16
H
O
CO 2C H3
22
δ
1
o
3
71,6
H (n . do H) / CDCl3
3,25 (H-5) β
7
57,0
3,25 (H-5) β
8
133,9
6,83 (H-12); 7,02 (H-10)
10
122,8
6,83 (H-12)
12
109,5
7,02 (H-10)
16
110,0
7,41 (H-17)
19
72,4
3,28 (H-21); 2,50 (H-15); 1,41 (CH3-18)
20
38,1
1,41 (CH3-18)
21
54,3
2,46 (H-5α);
22
167,8
3,60 (-O-CH3)
O mapa de contorno NOESY de Cg 9 (Espectro 19, pág. 86) apresentou
correlações entre o sinal correspondente a H-19 β em δ 4,34 e H-14 β em δ 0,87; H19 β em δ 4,34 e CH3-18 α em δ 1,41; H-21β em δ 3,28 e CH3-18 α em δ 1,41; H-5β
em δ 3,25 e H-6α em δ 2,0; H-5β em δ 3,25 e H-5α em δ 2,46; H-15 em δ 2,50 e H20 em δ 1,58 Tabela 22, pág. 78). A análise dos dados do mapa de contorno
NOESY de Cg 9 mostrou algumas correlações importantes, por exemplo: a
78
correlação entre H-19 β e H-14 β, sugeriu que a CH3-18 estivesse na posição α; a
correlação entre H-21 β e CH3-18 α confirmou a posição β de H-19 e a correlação
entre H-15 (biogeneticamente α) e H-20 sugeriu que a posição de H-20 é α. Assim, a
interpretação das correlações do mapa de contorno NOESY indicaram a
estereoquímica de Cg 9 como um estereoisômero do tipo allo.
Tabela 22: Correlações do mapa de contorno NOESY de Cg 9
CH 3
4
5
9
6
H
7
12
o
n . do H
δ
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
1
H multiplicidade (J Hz)
14
O
15
17
16
H
CO 2C H3
22
o
δ
1
19 β
4,34 dq (12,6; 6,3)
n . do H
14 β
19 β
4,34 dq (12,6; 6,3)
CH18 α
1,41 d (6,3)
21 β
3,28 dd (11,8; 1,8)
CH18 α
1,41 d (6,3)
5β
3,25 ddd (7,5; 7,5; 2,3)
6α
2,0 m
5β
3,25 ddd (7,5; 7,5; 2,3)
5α
2,46 ddd (7,5; 7,5; 7,5)
15
2,50 m
20
1,58 s
5α
2,46 ddd (7,5; 7,5; 7,5)
6α
2,0 m
0,87 m
A análise dos dados obtidos do mapa de contorno NOESY foi concordante
com a estrutura do alcalóide uncarina E, um oxindol heteroioimbínico do tipo allo (H3α; H-20α; H-19β), que se caracteriza por relações trans entre os anéis C/D e cis
entre os anéis D/E.
Os deslocamentos químicos dos sinais nos espectros de RMN de 1H e de
13
C
podem auxiliar na identificação entre os estereoisômeros heteroioimbínicos. O valor
do deslocamento químico do sinal relativo a H-3 é utilizado na identificação da
79
estereoquímica do carbono “spiro” (C-7). Nos estereoisômeros normal e allo 7(S), o
sinal correspondente a H-3 aparece em δ 2,5 –2,6 e nos isômeros 7(R) em δ 2,3 –
2,4. Cg 9 mostrou o sinal referente a H-3 em δ 2,54. O espectro de RMN de
13
C
apresenta o sinal relativo a C-3 em δ 71,2 – 71,8 nos isômeros do tipo normal e allo
(7S), enquanto que nos isômeros (R) os sinais aparecem em δ 74,0 – 74,5. O
espectro de RMN de
13
C de Cg 9 mostrou o deslocamento químico de C-3 em δ
71,6. Nos espectros de RMN de 1H dos estereoisômeros dos tipos allo, o sinal
relacionado a H-15 aparece em δ 2,4 – 2,5. A substância Cg 9 mostrou este sinal
como um multipleto em δ 2,50.
A análise destes dados confirmou que Cg 9 é um dos estereoisômeros
heteroioimbínicos do tipo allo. A comparação dos espectros de RMN de 1H e de
13
C
de Cg 9 com os publicados para a uncarina E (HIROKO et al., 1993), também
conhecida como isopteropodina, mostrou dados idênticos e completou a elucidação
estrutural de Cg 9 (Tabela 23, pág. 80).
80
Tabela 23: Dados de RMN de1H e de 13C para uncarina E e Cg 9
CH 3
5
9
6
H
7
12
0
n .C
N
H
H
19
O
N
14
3
10
11
21
4
2
O
15
17
16
H
CO 2C H3
22
Uncarina E
δ
13
C
2
3
181,2
71,2
5α
5β
6α
6β
7
8
9
54,1
34,8
56,9
133,7
124,5
10
δ
1
H (JHz) / CDCl3
2,57 dd (11,7; 2,8)
2,46 ddd (7,6; 7,6; 7,6)
3,22 ddd (7,6; 7,6; 2,4)
2,0 ddd (11,9; 7,6; 7,6)
2,39 ddd (11,9; 7,6; 2,4)
Cg 9
δ
13
C
180,8
71,6
54,3
35,0
δ
1
H (JHz) / CDCl3
2,54 dd (11,7; 2,7)
2,46 ddd (7,5; 7,5; 7,5)
3,25 ddd (7,5; 7,5; 2,3)
2,0 m
2,37 m
7,27 dd (7,7; 0,7)
57,0
133,9
124,9
7,28 (parcialmente encoberto)
122,5
7,02 ddd (7,7; 7,7; 1,1)
122,8
7,02 dd (7,5; 7,5)
11
127,6
7,19 ddd (7,7; 7,7; 1,3)
127,9
7,18 ddd (7,5; 7,5; 1,2)
12
109,6
6,89 d (7,7)
109,5
6,83 d (7,5)
13
14α
14β
15
140,2
30,1
30,4
1,62 ddd (11,7; 2,8; 2,8)
0,88 ddd (11,7; 11,7; 11,7)
2,51 ddd (11,7; 2,8; 2,8)
16
17
109,9
154,9
18
140,1
30,4
30,7
1,58 (encoberto)
0,87 ddd (11,7; 11,7; 11,7)
2,50 m
7,41 s
110,0
155,2
7,41 s
18,6
1,41 d (6,2)
18,8
1,41 d (6,3)
19
72,1
4,36 dq (10,4; 6,2)
72,4
4,34 dq (12,6; 6,3)
20
37,89
1,59 m (largo)
38,1
1,58 m
21α
21β
22
53,5
2,42 dd (11,9; 3,8)
3,29 dd (11,9; 1,8)
53,7
2,41 dd; (11,7; 3,6)
3,28 dd (11,7; 1,8)
CH3 O-
167,5
50,9
NH
HIROKO et al.; 500 MHz
3,60 s
167,8
51,2
3,60 s
7,32
81
CH3
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
81
82
CH 3
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
N
3
10
11
21
2
O
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
82
83
CH 3
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2C H3
22
83
84
CH3
4
5
9
6
H
12
7
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 17: Mapa de contorno HMQC de Cg 9.
84
85
CH3
4
5
9
6
H
12
7
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 18: Mapa de contorno HMBC de Cg 9.
85
86
CH3
4
5
9
6
H
7
12
N
H
H
19
O
N
3
10
11
21
2
14
O
15
17
H
16
CO 2CH3
22
Espectro 19: Mapa de contorno NOESY de Cg 9.
86
87
A substância Cg 3 foi isolada da fração CHCl3 resultante da partição em
solventes do extrato bruto metanólico de C. glabratus e também do precipitado (ppt1) formado durante a adição de hexano ao extrato bruto metanólico de C. glabratus .
A substância Cg 3 foi identificada como ácido ursólico (Cg 3).
30
29
20
21
19
12
13
11
25
1
18
22
17
26
14
10
2
16
CO2H
28
15
27
3
7
4
HO
6
23
24
(Cg 3)
RMN de 1H, de
13
C, DEPT, COSY, HETCOR, EM e por comparação destes com os
dados descritos na literatura para o ácido ursólico (JEWERS et al., 1971; BISSELS,
1974; RAZDAN et al., 1982).
13
ppm: dados descritos na Tabela 26, pág. 93 (Espectros 20 e 21, pág. 94 e 95).
88
RMN 2D (13C x 1H HETCOR), 75,5 MHz / CDCl3: dados descritos na Tabela
25, pág. 90. (Espectro 23, pág. 97).
EM m/z (int. rel. %): 456 (1,1) [M⋅+]; 411 (1,1) [M⋅+-CO2H]; 248 (100,0); 207
(27,9); 203 (58,2) [248 – CO2H]; 189 (22,5); 133 (72,6). Espectro 24, pág. 98.
O espectro de RMN de 1H de Cg 3 (Espectro 20, pág. 94) apresentou um
tripleto largo em δ 5,22, correspondente ao hidrogênio olefínico H-12, um duplo
dubleto em δ 3,14 relacionado ao H-3 e um dubleto em δ 2,19 correspondente ao H18. Além destes, o espectro de RMN de 1H exibiu singletos relacionados a cinco
grupos de hidrogênios metílicos em δ 1,11; 0,96; 0,84 e 0,76 (H-27; H-23, H-24, H-26
e H-25); e dois dubletos em δ 0,95 e 0,87 correspondentes aos H-30 e H-29.
13
C de Cg 3 (Espectro 21, pág. 95) revelou 30 sinais
e o DEPT mostrou 7 C0, 7CH, 9 CH2 e 7 CH3. Além dos sinais de carbonos
metilênicos em δ 38,1 (C-1); 27,8 (C-2); 19,4 (C-6); 34,3 (C-7); 24,3 (C-11); 29,1 (C15); 25,2 (C-16); 31,7 (C-21); 40,4 (C-22) e metílicos em δ 28,7 (CH3-23); 15,9 (CH324); 16,3 (CH3-25); 17,5 ((CH3-26); 24,0 ((CH3-27); 17,7 (CH3-28) e 21,5 (CH3-30), o
espectro de RMN de
13
C também mostrou as absorções em δ 79,7 (C-3) referentes a
carbono oximetínico, em δ 181,9 (C-28) correspondente à carbonila de ácido e em δ
139,8 e 127,0 (C-12 e C-13) sinais relacionados a carbonos olefínicos.
O mapa de contorno 1H x1H COSY de Cg 3 (Espectro 22, pág. 96) mostrou
correlações entre H-12 (δ 5,22) e H-11 (δ 1,92) ; entre H-18 (δ 2,19) e H-19 (δ 1,32 –
1,37). Além destas, foi possível identificar os valores dos deslocamentos químicos
relativos a H-2 (δ 1,55), através da correlação com H-3 (δ 3,14). O mapa de contorno
89
COSY de Cg 3 também confirmou a atribuição de H-19 em δ 1,32-1,37, através da
correlação com o grupo metila CH3-29 em δ 0,87. Os dados obtidos do mapa de
contorno 1H x1H COSY de Cg 3 estão relacionados na Tabela 24.
30
29
20
21
19
12
13
11
25
1
14
10
CO2H
28
15
7
4
HO
6
23
δ
16
27
3
o
22
17
26
2
n .H
18
24
1
o
n .H
δ
1
12
5,22 t
11
1,92 m
3
3,14 dd (11,2; 5,1)
2
1,55 dd (9,1; 3,3)
18
2,19 d (12)
19
1,32 – 1,37 m
11
1,92 m
9
1,61 m
CH3-29
0,87 d (6,3)
H-19
1,32- 1,37 m
CH3-30
0,95 d (4,8)
H-20
1,62 m
O mapa de contorno HETCOR de Cg 3 (Espectro 23, pág. 97) mostrou, além
das correlações heteronucleares,
13
C x 1H (Tabela 25, pág. 90) entre os sinais em δ
79,7 (C-3) e o duplo dubleto em δ 3,14 (H-3); em δ 127,0 (C-12) e o tripleto em δ
5,22 (H-12); sete correlações entre carbonos metílicos em δ 28,7 (C-23); 15,9 (C-24);
16,3 (C-25); 17,5 (C-26); 24,0 (C-27); 17,7 (C-29); 21,5 (C-30) e os hidrogênios
correspondentes em δ 0,96 (H-23 e H-24); 0,76 (H-25); 0,84 (H-26); 1,11 (H-27);
0,87 (H-29); e 0,95 (H-30), que estão de acordo com um esqueleto triterpênico,
confirmando as atribuições descritas anteriormente.
90
Tabela 25: Correlações heteronucleares do mapa de contorno HETCOR de Cg 3
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
22
17
26
1
14
16
CO2H
28
2
10
27
3
4
HO
6
23
o
n .C
1
2
3
5
10
11
12
18
19
20
22
23
24
25
26
27
29
30
δ
13
C
38,1
27,8
79,7
56,7
38,1
24,3
127,0
54,4
40,7
40,4
40,4
28,7
15,9
16,3
17,5
24,0
17,7
21,5
15
7
24
δ
H (J Hz) multiplicidade
1,67 – 1,65 m
1,15 s (largo) / 1,55 dd (9,1; 3,3)
3,14 dd (11,2; 5,1)
0,76 m
1,67 – 1,65 m
1,92 m e 2,01 m
5,22 t (largo)
2,19 d (12,0)
1,37 – 1,32 m
0,95 (encoberto)
0,95 (encoberto)
0,96 s
0,96 s
0,76 s
0,84 s
1,11 s
0,87 d (6,3)
0,95 d (4,8)
A análise do espectro de massas (Espectro 24, pág. 98) mostrou o pico do
íon molecular em m/z 456, sugerindo um triterpeno como o ácido ursólico ou
oleanólico. O pico base em m/z 248 no espectro de massas é referente à clivagem
retro-Diels-Alder de oleanos ou ursanos ∆12, que possuem um grupo carboxílico e
não têm hidroxilas nos anéis D e E. Além destes, o espectro de massas mostrou o
padrão de fragmentação de triterpenos ∆12, descritos na literatura (OGUNKOYA,
91
1981) e os sinais em m/z 411 [M+ - CO2H] e m/z 203 [248 - COOH] confirmaram a
presença do grupo carboxila (Esquema 8).
E
D
CO 2H
A
Fragmentação
Retro Diels Alder HO
B
m/z
m/z 456
411
CO2H
-
m/z
CO 2H
HO
m/z 248
-
-
CO 2H
CH2
m/z
203
189
- 70
CH2
CH2
m/z
HO
133
m/z 207
Esquema 8: Rota para fragmentação do ácido ursólico
A análise dos dados obtidos dos espectros de RMN de 1H e
13
C indicou um
esqueleto triterpênico para Cg 3, e a multiplicidade dos sinais correspondentes a H18 e dos relacionados com CH3-29 e CH3-30 determinou um triterpeno da série
ursano. Se Cg 3 fosse da classe oleano, H-18 seria relacionado a um duplo dubleto,
uma vez que C-19 nos oleanos é um carbono metilênico. Os dois dubletos em δ 0,87
e 0,95 relacionados aos hidrogênios metílicos H-29 e H-30, respectivamente,
92
também indicaram um esqueleto carbônico condizente com triterpenos da classe dos
ursanos, já que os da série oleano apresentam sete singletos nesta região.
A análise dos dados obtidos dos espectros de massas e de RMN de 1H e de
13
C de Cg 3, e dos publicados sobre o ácido ursólico (Tabela 26) confirmaram a
estrutura de Cg 3.
93
Tabela 26: Dados de RMN de 13C e de 1H do ácido úrsólico e de Cg 3
30
29
20
21
19
12
13
11
25
14
2
10
27
3
HO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
C
38,8
27,3
78,8
38,8
55,4
18,4
33,0
39,6
47,5
37,0
23,3
125,5
138,0
42,0
28,2
24,3
48,1
52,8
39,1
38,8
30,7
36,7
28,2
15,5
15,7
16,7
23,6
177,7
16,9
21,2
δ
15
24
Ácido ursólico*
δ
CO2H
28
6
23
n .C
16
7
4
13
22
17
26
1
0
18
1
H (JHz) / piridina-d5
3,40 t
5,45 s (largo)
2,8 d (11)
1,23 s
0,87 s
1,04 s
1,01 s
1,21 s
0,93 d (5,4)
0,98 d (6,3)
Cg 3
δ
13
C
38,1
27,8
79,1
39,8
56,7
19,4
34,3
39,9
48,0
38,1
24,3
127,0
139,8
43,2
29,1
25,2
48,0
54,4
40,7
40,4
31,7
40,4
28,7
15,9
16,3
17,5
24,0
181,9
17,7
21,5
δ
1
H (JHz) / CD3OD
1,15 s (largo) / 1,55 dd (9,1; 3,3)
3,14 dd (11,2; 5,1)
0,76 m
1,67 – 1,65 m
1,92 m e 2,01 m
5,22 t (largo)
2,19 d (12,0)
1,37 – 1,32 m
0,96 s
0,96 s
0,76 s
0,84 s
1,11 s
0,87 d (6,3)
0,95 d (4,8)
94
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
22
17
26
1
14
16
CO2H
28
2
10
27
3
15
7
4
HO
6
23
24
94
95
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
22
17
26
1
14
16
CO2H
28
2
10
27
3
15
7
4
HO
6
23
24
95
96
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
22
17
26
1
14
16
CO 2H
28
2
10
27
3
15
7
4
HO
6
23
24
96
97
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
1
14
2
10
27
3
22
17
26
16
CO2H
28
15
7
4
HO
6
23
24
Espectro 23: Mapa de contorno HETCOR de Cg 3 em CDCl3.
97
98
30
29
20
21
19
12
13
11
25
18
22
17
26
1
14
16
CO2H
28
2
10
27
3
15
7
4
HO
6
23
24
Espectro 24: Espectro de massas (70 eV) de Cg 3
98
99
A substância Cg 7 foi isolada da fração AcOEt, resultante da partição em
solventes do extrato bruto metanólico de C. glabratus, e foi identificada como ácido
3-O-β-D-quinovopiranosídeo-28-O-β-glucopiranosídeo quinóvico.
30
29
18
12
25
17
13
26
1
15
CO2H
3
Quinovose
COOGlc
28
27
O
23
24
(Cg 7)
A estrutura de Cg 7 foi determinada com base em dados espectroscópicos de
RMN de 1H,
13
C, DEPT, HMQC, COSY e por comparação destes com os descritos
na literatura (ARRIAGA et al., 1990; YÈPEZ et al., 1991)
13
ppm: dados descritos na Tabela 29, pág. 104 (Espectros 25 e 26, pág. 106 e 107).
pág. 101(Espectro 27, pág. 108).
100
O espectro de RMN de 1H (Espectro 25, pág. 106; Tabela 29, pág. 104)
apresentou sinais relacionados a seis grupos metílicos, sendo quatro singletos em δ
0,82 (H-23); δ 1,0 (H-24); δ 0,96 (H-25); δ 0,87 (H-26); e um dubleto em δ 0,90
correspondente aos H-29 e H-30, cuja presença auxiliou na caracterização de Cg 7
como triterpeno da série ursano (na série dos oleanos os sinais correspondentes aos
grupos metílicos são todos singletos). Além destes, em δ 5,61 (H-12) um multipleto
largo foi condizente com hidrogênio olefínico, em δ 3,09 (H-3) um duplo dubleto
correspondente a hidrogênio oximetínico, em δ 2,2 (H-18) a presença de um dubleto
foi característica de triterpeno da classe dos ursanos (nos oleanos H-18
corresponderia a um duplo dubleto).
13
C de Cg 7 associado ao espectro de DEPT
(Espectro 26, pág. 107) mostrou 40 sinais (8 C0, 16 CH, 9 CH2 e 7 CH3), indicando
um triterpeno glicosilado. Além dos sinais de carbonos metilênicos presentes na
região compreendida entre δ 62,5-19,2, as absorções em δ179,2 (C-27) e 177,9 (C28) relacionadas à carbonila; em δ 133,3 (C-13) e 130,8 (C-12) correspondentes a
carbonos olefínicos, junto com os seis sinais referentes a carbonos metílicos em δ
28,4 (C-23); δ 19,2 (C-24); δ 16,9 (C-25); δ 18,2 (C-26); δ 17,0 (C-29); e δ 21,4 (C30) sugeriram um esqueleto triterpênico como o do ác. quinóvico (Tabela 29).
O mapa de contorno HMQC para Cg 7 (Espectro 27, pág. 108) mostrou
correlações heteronucleares
13
C x 1H (Tabela 27) entre os sinais em δ 90,7 (C-3) e o
duplo dubleto em δ 3,09 (H-3); em δ 130,8 (C-12) e o multipleto em δ 5,61 (H-12); em
δ
55,3 (C-18) e o dubleto em 2,27 (H-18); além das correlações entre carbonos
metílicos em δ 28,4 (C-23); 19,2 (C-24); 16,9 (C-25); 18,2 (C-26); 17,0 (C-29); 21,4
(C-30) e os hidrogênios correspondentes em δ 0,82 (H-23); 1,0 (H-24); 0,96 (H-25);
0,87 (H-26); 0,90 (H-29 e H-30).
101
Tabela 27: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMQC de Cg 7
30
29
20
18
12
11
25
1
6'
H3C
4'
HO
HO
O
5'
2'
26
14
1'
O
3'
COO
16
28
1''
COOH
OH
Glucose
24
13
DEPT
3
90,7
CH
3,09 dd (12; 4,5)
12
130,8
CH
5,61 m
18
55,3
CH
2,27 d (10,2)
23
28,4
CH3
0,82 s
24
19,2
CH3
1,0 s
25
16,9
CH3
0,96 s
26
18,2
CH3
0,87 s
29
17,0
CH3
0,90 d (5,4)
30
δ
1
H (JHz) / CD3OD
21,4
CH3
0,90 d (5,4)
’
106,5
CH
4,26 d (7,8)
’
2
75,9
CH
3,25 dd (6,0; 2,4)
’
5
77,0
CH
3,20 m
’
18,1
CH3
1,24 d (6,0)
’’
1
95,6
CH
5,36 d (7,8)
2”
73,9
CH
3,33 m
1
6
3''
7 27
δ
C
OH
2''
º
NC
OH
5''
5
23
OH
Quinovose
O
15
8
6
22
17
4''
6''
13
9
10
2
3
OH
21
19
O mapa de contorno COSY (Tabela 28, Espectro 28, pág. 109) apresentou,
entre outras, correlações entre o sinal em δ 5,61 (H-12) e δ 1,94 (H-11); em δ 5,36
(H-1”) e δ 3,33 (H-2”); em δ 4,26 (H-1’) e δ 3,25 (H-2’); e, em δ 2,27 (H-18) e δ 1,0 (H19). Estes dados, junto com os dados obtidos das correlações do espectro de HMQC
(Tabela
27,
Espectro
25,
pág.
108)
possibilitaram
identificar
os
sinais
102
correspondentes ao H-11 em δ 1,94; ao H-2” em δ 3,33, ao H-2’ em δ 3,25 e ao H-19
em δ 1,0.
COSY de Cg 7
30
29
20
18
12
1
6'
4'
HO
HO
o
n . do H
H3C
5'
2'
1'
O
OH
Quinovose
13
14
16
O
COO
28
1''
15
8
6
3'
δ
9
10
2
3
O
26
4''
6''
22
17
11
25
OH
21
19
COOH
OH
5''
OH
2''
OH
Glucose
3''
7 27
5
23
1
24
o
n . do H
δ
1
H-12
5,61 m
H-11
1,94 m
H-1”
5,36 d (7,8)
H-2”
3,33 m
H-1’
4,26 d (7,8)
H-2’
3,25 m
H-18
2,27 d (10,2)
H-19
1,0 (encoberto)
A presença da unidade de açúcar em C-27 ou C-28 na aglicona foi
esclarecida através do dubleto em δ 5,36 (H-1”) e pela absorção do carbono em δ
95,6 (C-1”). As unidades glicosídicas presentes na estrutura foram identificadas
principalmente através dos sinais correspondentes aos carbonos anoméricos. Em δ
95,6 constatou-se o sinal referente ao carbono anomérico característico da glucose,
sendo possível observar também, além do sinal relacionado ao carbono anomérico
característico de quinovose em δ 106,5, a presença de um grupo metílico em δ 18,1
(CH3-6’) presente na estrutura da quinovose. Também a análise dos valores das
constantes de acoplamento (J=7,8Hz) sobre os sinais correspondentes aos
hidrogênios anoméricos das duas unidades glicosídicas indicou que estes estão em
posições axiais, evidenciando a configuração β dos carbonos anoméricos.
103
A análise de todos os dados mencionados anteriormente, bem como a
comparação entre os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H e
13
C de
Cg 7 com os publicados sobre o ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo-28-O-βglucopiranosídeo quinóvico descritos na literatura (Tabela 29 e 30), foram
concordantes e confirmaram a identificação desta substância.
Tabela 29: Dados de RMN
13
C e de
1
H para aglicona do ácido 3-O-β -D-
quinovopiranosídeo-28-O-β -glucopiranosídeo quinóvico e de Cg 7
104
30
29
OH
OH
12
O
25
26
COO
28
H3C
HO
HO
0
N.C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
O
27
O
OH
Quinovose
23
24
ácido 3-O-β -D-quinovopiranosídeo-28-O-β *
glucopiranosídeo quinóvico
13
1
δ C δ H multiplicidade (JHz) / CD3OD
39,9
26,4
90,7
40,1
56,8
19,2
38,0
40,8
48,0*
37,8
23,9
130,8
133,3
57,2
27,1
25,8
5,59 m
55,3
40,2
38,2
31,1
37,0
28,5
17,0
17,1
18,2
179,3
177,9
19,2
21,5
Dados de RMN de
2,3 d (10,5)
0,85 s
1,04 s
0,99 s
0,95 s
0,96 d
0,96 d
13
OH
Glucose
COOH
3
OH
Cg 7
δ
13
C
40,0
26,4
90,7
39,9
56,9
19,2
37,8
40,8
48,0
38,2
23,8
130,8
133,3
57,3
27,0
25,8
40,7
55,3
40,2
37,8
31,1
37,0
28,4
19,2
16,9
18,2
179,2
177,9
17,0
21,4
1
δ
1
H multiplicidade (JHz) / CD3OD
3,09 dd (12; 4,5)
1,94 m
5,61 m (largo)
2,27 d (10,2)
1,0 (encoberto)
0,82 s
1,0 s
0,96 s
0,87 s
0,90 d (5,4)
0,90 d (5,4)
C (Arriaga, 1990) e dados de RMN de H (Yépez, 1991), 250 MHZ.
105
Tabela 30: Dados de RMN de
13
C e de 1H para as unidades glicosídicas
quinovose e glucose do ácido 3-O-β -D-quinovopiranosídeo-28-O-β glucopiranosídeo quinóvico e de Cg 7
30
29
OH
OH
12
O
25
26
COO
28
H3C
HO
HO
º
n do C
O
27
O
OH
Quinovose
23
24
ácido 3β -O-β -D-quinovopiranosídeo
quinóvico
13
1
δ C
δ H (JHz) / CD3OD
1’
2’
3’
4’
5’
6’
106,4
76,0
78,1
71,4
77,1
18,1
1”
2”
3”
4”
5”
6”
95,6
73,9
78,7
71,2
78,6
62,5
OH
Glucose
COOH
3
OH
Cg 7
δ
13
C
Quinovose
4,31 d (7,5)
106,5
75,9
77,9
72,9
77,0
1,28 s (6)
18,1
Glucose
95,6
73,9
78,6
71,2
78,2
62,5
δ
1
H (JHz) / CD3OD
4,26 d (7,8)
3,25 m
1,24 d (6)
5,36 d (7,8)
3,33 m
106
30
29
18
12
17
25
13
26
COOGlc
1
15
CO2H
3
Quinovose
28
27
O
23
24
Espectro 25: Espectro de RMN de 1H (CD3OD / 300 MHz) de Cg 7
106
107
30
29
18
12
17
25
13
26
1
15
CO2H
3
Quinovose
COOGlc
28
27
O
23
24
Espectro 26: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, CD3OD) de Cg 7
107
108
30
29
18
12
17
25
13
26
1
15
CO2H
3
Quinovose
COOGlc
28
27
O
23
24
Espectro 27: Mapa de contorno HMQC de Cg 7 em CD3OD.
108
109
30
29
18
12
17
25
13
26
COOGlc
1
15
CO2H
3
Quinovose
28
27
O
23
24
Espectro 28: Mapa de contorno COSY de Cg 7 em CD3OD
109
110
A substância Cg 6 foi isolada da fração CHCl3 proveniente da partição em
solventes do extrato bruto metanólico de C. glabratus e foi identificada como o
esteróide β-sitosterol.
29
28
22
21
20
19
23
12
17
11
16
26
25
27
13
18
9
1
10
14
2
HO
24
15
8
3
5
7
6
(Cg 6)
A estrutura da substância Cg 6 foi elucidada através da análise dos espectros
de RMN de 1H,
13
C, DEPT e comparação destes com os dados da literatura do β-
sitosterol (MATIDA et al., 1996; MAHATO, 1994).
RMN de 1H, 300,06 MHz / CDCl3, δ ppm e RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz /
CDCl3), δ ppm: dados descritos na Tabela 31, pág. 112 (Espectros 29, 30 e 31, pág.
113, 114 e 115).
O espectro de RMN de 1H de Cg 6 (Espectro 29, pág. 113) mostrou um
dubleto em δ 5,35 (J=5,1 Hz; H-6) característico de hidrogênio olefínico, sinais
relacionados aos hidrogênios metílicos em δ 1,0 (s; CH3-21), 0,92 (d; J=6,6 Hz; CH3-
111
26), 0,85 (d; J=6,6 Hz; CH3-19), 0,83 (d; J=6,6 Hz; CH3-27), 0,81 (d; J=6,6 Hz; CH327) 0,68 (s; CH3-18) e em δ 3,51 um multipleto correspondente ao hidrogênio
oximetínico de um núcleo esteroidal.
13
C e DEPT de Cg 6 (Espectros 30 e 31, págs. 114 e
115), além dos outros sinais relacionados a um núcleo esteroidal, também mostrou
em δ 140,7 (C0) e 121,7 (C-H) os sinais correspondentes a carbonos olefínicos, em δ
71,8 (C-H) sinal condizente com o de um carbono oximetínico e sinais
correspondentes a seis grupos metílicos em δ 11,8; 11,9; 18,7; 19,0; 19,3 e 19,8
relacionados respectivamente aos carbonos C-18, C-19, C-21, C-26, C-27 e C-29.
Os valores dos deslocamentos químicos destes e dos demais carbonos da
substância Cg 6 foram comparados com os do β-sitosterol registrados na literatura e
mostraram-se concordantes (Tabela 31).
112
Tabela 31: Dados de RMN de 13C e de 1H do β -sitosterol e de Cg 6
28
22
21
19
23
12
17
11
16
10
8
5
14
15
7
6
*
0
N .C
δ
13
C
δ
27
9
1
2
3
26
25
13
18
HO
29
24
20
β -Sitosterol
H (JHz) / CDCl3: CD3OD 1:1
1
1
37,2
2
29,9
3
78,2
4
39,0
5
140,6
6
122,6
5,38 d (5,1)
7
31,9
8
31,8
9
50,0
10
36,6
11
21,0
12
39,6
13
42,2
14
56,5
15
24,2
16
28,2
17
55,9
18
11,7
0,70 s
19
19,1
20
36,1
21
18,9
1,02 s
22
33,9
23
26,1
24
45,7
25
29,2
26
18,7
0,93 d (6,6)
27
19,7
0,82 d (6,3)
28
23,1
29
11,9
0,85 d (6,6)
*
MATIDA, A. K.; 300 MHz
δ
13
C
37,2
31,6
71,8
42,2
140,7
121,7
31,8
31,8
50,1
36,4
21,0
39,7
42,2
56,0
24,2
28,2
56,7
11,8
19,3
36,1
19,0
33,9
26,0
45,8
29,1
18,7
19,8
23,0
11,9
Cg 6
1
δ H (JHz) / CDCl3
3,51 m
5,3 d (5,1)
0,68 s
0,85 d (6,6)
1,0 s
0,92 d (6,6)
0,81 d (6,6)
0,83 d (6,6)
113
28
21
22
20
19
17
16
26
25
27
13
18
9
1
10
14
2
HO
24
23
12
11
29
15
8
3
5
7
6
113
114
28
21
22
20
19
17
16
26
25
27
13
18
9
1
10
14
2
HO
24
23
12
11
29
15
8
3
5
7
6
Espectro 30: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz, CDCl3) de Cg 6
114
115
28
21
22
20
19
12
17
16
26
25
27
13
18
9
1
10
14
2
HO
24
23
11
29
15
8
3
5
7
6
115
116
A substância Cg 8 foi isolada da fração metanol:H2O, resultante da partição
em solventes do extrato bruto metanólico de C. glabratus e foi identificada como
ácido 5-O-cafeoilquínico.
HO
HO
2'
1'
3'
HO 4'
1
6
O
7'
8'
9'
O
COOH
5
4
2
3
OH
OH
6'
5'
(Cg 8)
RMN de 1H,
13
C, DEPT, COSY e por comparação destes com os dados descritos na
literatura sobre o ácido ácido 5-O-cafeoilquínico (SANTOS et al., 2004; CHEMINAT
et al., 1988).
RMN de 1H, 300,06 MHz / D2O, δ ppm e RMN de
13
C, DEPT (75,5 MHz /
CD3OD), δ ppm: dados descritos na Tabela 33, pág. 119 (Espectros 32, 33 e 34,
pág. 120, 121 e 122).
RMN 2D (1H x 1H COSY), 300,06 MHz / CD3OD: dados descritos na Tabela
32, pág. 118 (Espectro 32, pág 120).
117
A análise do espectro de RMN de 1H (Espectro 32) de Cg 8 revelou sinais
característicos de um grupo cafeoíla devido à presença de dois dubletos em δ 7,61
(J=16,0Hz) e δ 6,35 (J=16,0Hz), relacionados aos hidrogênios olefínicos trans H-7’ e
H-8’, além dos sinais correspondentes a hidrogênios aromáticos como os dubletos
em δ 7,17 (J=1,8 Hz, H-2’) e 6,92 (J=8,4 Hz, H-5’) e o duplo dubleto em δ 7,09 (J=
8,1; 1,8 Hz, H-6’). O espectro de RMN de 1H também mostrou dois dubletos em δ
2,18 e 2,05 relacionados aos hidrogênios metilênicos H-2 axial e H-2 equatorial, um
multipleto em δ 2,15 (H-6) e sinais referentes a três hidrogênios metínicos em δ 4,24
(d, J=3,6 Hz, H-3); em δ 3,87 (dd, J=9,0; 3,3 Hz, H-4) e em δ 5,31 (ddd, J=9,0; 9,0;
4,5, H-5) coerentes com a unidade derivada do ácido quínico e condizente com a
estrutura do ácido 5-O-cafeoilquínico.
A análise dos espectros de RMN de
13
C e DEPT (Espectro 33 e 34)
demonstrou a presença de um grupo cafeoíla, através dos sinais em δ 129,9 (C-1’);
118,0 (C-2’); 147,2 (C-3’); 150,0 (C-4’); 119,1 (C-5’); 125,5 (C-6’); 148,9 (C-7’), 117,7
(C-8’) e 172,0 (C-9’). Os sinais em δ 40,2 (C-2); 41,3 (C-6); 73,6 (C-3); 74,0 (C-5);
75,8 (C-4), 79,7 (C-1) e 183,6 (C-7) confirmaram a unidade derivada do ácido
quínico.
A análise do mapa de contorno de 1H x 1H COSY (Espectro 35, Tabela 32)
mostrou correlações entre H-2 e H-3; entre H-3 e H-4; entre H-4 e H-5 e entre H-5 e
H-6, indicando junto com os valores dos deslocamentos químicos de RMN de
13
Ca
substituição da unidade derivada do ácido quínico. Além destes, o mapa de contorno
de 1H x 1H COSY apresentou correlações entre os hidrogênios aromáticos H-7’ e H5’, entre os hidrogênios olefínicos H-8’ e H-7’ e ausência de correlação com H-2’,
que demonstrou a substituição dos carbonos C-1’, C-3’e C-4’do anel aromático.
118
HO
6
O
2'
HO
1'
3'
HO 4'
o
n .H
2 eq.
δ
1
7'
8'
9'
O
COOH
4
5
2
3
OH
OH
6'
5'
1
o
n .H
δ
1
2,05 d (14,0)
3
4,24 d (3,3)
4
3,87 dd (9,0; 3,3)
3
4,24 d (3,3)
4
3,87 dd (9,0; 3,3)
5
5,31 ddd (9,0; 9,0; 4,5)
5
5,31 ddd (9,0; 9,0; 4,5)
6
2,15 m
5’
6,92 d (8,4)
7’
7,61 (15,9)
A análise dos dados espectroscópicos de Cg 8 e a comparação com os
constantes na literatura mostraram-se concordantes com os do ácido 5-Ocafeoilquínico (Tabela 33).
119
Tabela 33: Dados de RMN de 13C e de 1H do ácido 5-O-cafeoilquínico e de Cg 8
HO
6
O
2'
HO
1'
9'
8'
HO 4'
1
7'
3'
O
COOH
4
5
2
3
OH
OH
6'
5'
*
0
n .C
δ
ácido 5-O-cafeoilquínico
1
C δ H multiplicidade (JHz) /D2O
13
1
79,9
2 axial
40,2
13
C
δ
Cg 8
H multiplicidade (JHz) /D2O
1
79,7
2,05 d (12)
40,2
1,96 d (12)
eq.
2,18 d (14)
2,05 d (14)
3
73,8
4,24 d (3,0)
73,6
4,24 d (3,3)
4
75,9
3,87 dd (10,0; 3,0)
75,8
3,87 dd (9,0; 3,3)
5
74,2
5,33 td (10,5; 10,5; 4,6)
74,0
5,31 ddd (9,0; 9,0; 4,5)
6
41,4
2,15 m
41,3
2,15 m
7
184,7
183,6
1’
130,1
129,9
’
2
118,2
’
3
147,4
147,2
’
4
150,2
150,0
’
5
119,3
6,91 d (8,4)
119,1
6,92 d (8,4)
’
6
125,7
7,06 d (8,2; 1,8)
125,5
7,09 dd (8,1; 1,8)
’
7
149,2
7,60 d (15,9)
148,9
7,61 d (15,9)
’
8
117,8
6,34 d (15,9)
117,7
6,35 d (15,9)
’
172,3
9
*
δ
Santos, 300 MHz
7,15 d (1,8)
118,0
172,0
7,17 d (1,8)
120
Espectro 32: Espectro de RMN de 1H (D2O / 300 MHz) de Cg 8
120
121
Espectro 33: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz, D2O) de Cg 8
121
122
Espectro 34: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz, D2O) de Cg 8
122
123
HO
6
O
HO
2'
1'
3'
HO 4'
8'
6'
1
7'
9'
O
COOH
5
4
2
3
OH
OH
5'
Espectro 35: Mapa de contorno COSY de Cg 8 em CD3OD
123
124
4.2.1.8 Identificação estrutural de Cg 1 e Cg 2
As substâncias Cg 1 e Cg 2 foram isoladas da fração hexânica – Cg H
proveniente da partição em solventes do extrato bruto de C. glabratus e foram
incluídas neste ítem, embora suas respectivas estrutras não tenham sido elucidadas.
A análise dos espectros de RMN de 1H (Espectros 36 e 37, pág. 125 e 126)
mostrou sinais relacionados a hidrogênios metilênicos em δ 1,25 e metílico em δ
0,88 condizente com materiais constituídos por lipídeos, razão porque Cg 1 e Cg 2
não foram identificados.
125
125
126
126
127
4.2.2 Ocorrência e importância taxonômica das substâncias
isoladas de C. glabratus
Atualmente existe grande interesse pela quimiotaxonomia na classificação
dos vegetais, pois a existência de um padrão comum no metabolismo secundário
das plantas pode fornecer mais evidências de parentesco entre elas do que as
similaridades morfológicas. No entanto, ainda são poucos os autores que levam em
consideração as características químicas da planta. Os trabalhos de Cronquist
(SIMÕES, 2003), por exemplo, citam a ocorrência de metabólitos secundários de
cada ordem e família, mas não atribuem grande relevância a estes dados, mesmo
que o padrão de distribuição de marcadores taxonômicos como os alcalóides, possa
modificar os sistemas de classificação dos vegetais.
O gênero Cephalanthus da família Rubiaceae é um membro da tribo
Naucleeae,
cuja
classificação
apresenta
confusão
taxonômica
(RAZAFIMANDIMBISON, 2002). A tribo Naucleeae pode ser subdividida em seis
subtribos distintas morfologicamente, porém as relações entre elas ainda não foram
determinadas. No estudo químico realizado com a espécie Cephalanthus glabratus
foram isolados três alcalóides: tetraidroalstonina, mitrafilina e uncarina E.
A tetraidroalstonina é um alcalóidede heteroioimbínico pentacíclico muito
comum no reino vegetal e está presente não só na família Rubiaceae, mas também
em espécies da família Apocynaceae, como, por exemplo, Tabernaemontana
cymosa (ACHENBACH, 1997); Ophiorrhiza discolor (ARBAIN, 1991), Amsonia
sinensis (LIU, 1991) e Alstonia undulata (GUILLAUME, 1984).
A mitrafilina também é um alcalóide heteroioimbínico pentacíclico, mas do tipo
oxindólico e que também já foi isolada da espécie Canthium dicoccum (HERATH,
128
1979) da família Rubiaceae. Freqüentemente, a mitrafilina é encontrada nos gêneros
Uncaria e Mitragyna (Rubiaceae), sendo que estudos fitoquímicos com as espécies
Uncaria guianensis (LAUS, 2003), Uncaria attenuata (TANTIVATANA et al., 1980),
Uncaria glabrata (ARBAIN, 1993) relatam o seu isolamento. Da mesma forma,
estudos com as espécies Mitragyna stipulosa (HOUGHTON, 1976), Mitragyna
rubrostipulata (SHELLARD, 1978) também reportam a presença deste alcalóide.
A uncarina E é outro alcalóide heteroioimbínico oxindólico pentacíclico comum
no perfil alcaloidal dos dois gêneros de Rubiaceae: Uncaria e Mitragyna. Estudos
fitoquímicos com as espécies Uncaria tomentosa (Muhammad, 2002), Uncaria
guianensis (LEE, 1999) e Mitragyna parvifolia (SHELLARD, 1968) reportam a
presença de uncarina E.
O isolamento dos alcalóides tetraidroalstonina, mitrafilina e uncarina E na
espécie Cephalanthus glabratus representa um dado importante para o estudo
taxonômico do gênero Cephalanthus e mostra com clareza a afinidade existente
entre os gêneros Cephalanthus, Uncaria e Mitragyna, bem como sua inclusão na
tribo Naucleeae.
4.2.3 Importância farmacológica das substâncias isoladas de
O estudo químico de C. glabratus resultou no isolamento dos alcalóides
heteroioimbínicos: tetraidroalstonina, mitrafilina e uncarina “E”, além dos triterpenos
ácido
ursólico
e
ácido
3-O-β-D-quinovopiranosídeo-28-O-β-glucopiranosídeo
quinóvico e do ácido clorogênico 5-O-cafeoilquínico.
129
Alcalóides indólicos como a tetraidroalstonina são comuns no reino vegetal e
já foram associados à atividade bactericida (HERNANDEZ, 1977). Os oxindóis
pentacíclicos heteroioimbínicos como a mitrafilina e uncarina “E” estão presentes
freqüentemente nos gêneros Uncaria e são considerados os metabólitos bioativos
das espécies U. sinensis e da U. callophylla. A utilização da planta U. sinensis como
antitérmica e no tratamento de pertubações nervosas é conhecida na medicina
popular (LIU et al., 1993). O emprego da espécie U. callophylla também é conhecido
por apresentar atividade hipotensiva (ÚGAZ, 1971).
Os triterpenos fazem parte de uma classe de compostos, cujas atividades
biológicas são bem avaliadas e a literatura contém várias referências sobre suas
atividades antiinflamatória e antialérgica. O ácido ursólico, por exemplo, é
reconhecido
por
suas
propriedades
antiinflamatória,
anti-hiperlipidêmica
e
hepatoprotetora envolvida com a inibição de substâncias tóxicas do sistema
imunológico (LIU, 1995).
Triterpenos glicosilados análogos ao ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo-28-Oβ-glucopiranosídeo
quinóvico isolado de C. glabratus, também foram isolados de U.
guianensis cujo extrato aquoso das raízes é usado para o tratamento de câncer,
artrites, diabetes e como potente agente antiinflamatório (YÈPEZ, 1991). O extrato
bruto de U. tomentosa levou ao isolamento de um derivado do ácido quinóvico
glicosilado na posição 7, que também demonstrou efetiva atividade antiinflamatória
(SEKI et al., 1991).
Os
ácidos
clorogênicos
são
constituintes do café e, também, são
responsáveis por várias atividades biológicas. O ácido clorogênico isolado de C.
glabratus - ácido 5-O-cafeoilquínico, por exemplo, já mostrou atividade inibitória
sobre o vírus HIV-1 (KWON, 2000).
130
4.3 Estudo farmacológico do extrato bruto de C. glabratus
O estudo farmacológico do extrato bruto de C. glabratus compreende os
resultados das avaliações de suscetilibidade antibacteriana e antifúngica; atividade
4.3.1 Avaliação da suscetibilidade antibacteriana e antifúngica
A suscetibilidade antibacteriana e antifúngica foi avaliada pelo método de
microdiluição. A Tabela (34) apresenta a concentração mínima inibitória (CMI) ou
concentração mínima de extrato bruto de C.glabratus dissolvido em DMSO, capaz
de inibir o crescimento microbiano e concentração mínima bactericida (CMB) ou
concentração mínima de extrato bruto de C.glabratus em DMSO, capaz de matar as
bactérias Staphilococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomona
aeruginosa. A Tabela 34 também mostra a concentração mínima inibitória (CMI) e
concentração mínima fungicida (CMF) ou concentração mínima do extrato bruto de
C.glabratus em DMSO, capaz de matar o fungo Candida albicans.
Tabela 34: Dados de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica
(extrato bruto dissolvido em DMSO)
Microorganismo
CMI
mL
250
> 1000
> 1000
> 1000
µ g/
S. aureus
B. subtilis
E.coli
P. aeruginosa
Candida albicans
(CMI, CMB, CMF: > 500 µg/ mL inativa;
ativa; > 7,8 µg/ mL fortemente ativa)
>
CMB
mL
500
> 1000
> 1000
> 1000
CMF
µ g/
> 1000
> 1000
250 – 125 µg/ mL moderadamente ativa; > 15,6 µg/ mL
131
A análise dos dados da Tabela 34 mostrou que o extrato bruto da planta
Cephalanthus glabratus não foi ativo frente a maioria dos microrganimos testados,
apresentando CMI maiores do que 1000 µg/mL. A CMB de 500 µg/ mL também
apresenta ausência de atividade e a CMI frente ao crescimento da bactéria S.
aureus mostrou o valor de 250 µg/ mL, que não pode ser considerado expressivo.
4.3.2 Avaliação da atividade antiedematogênica
A atividade antiedematogênica foi verificada através da reação inflamatória ao
óleo de cróton aplicado na orelha do camundongo. A Tabela 35 mostra que a
aplicação tópica de 20 µL em dose única, da solução de extrato bruto C.glabratus
em acetona (2,5 mg/orelha) provocou redução significativa (p<0,05) na intensidade
da resposta inflamatória. Assim, os dados indicam que a solução de extrato bruto de
C. glabratus apresentou efeito antiedematogênico neste modelo experimental.
Tabela 35: Efeito da aplicação tópica do extrato bruto de C. glabratus em
edema de orelha induzido por óleo de cróton
Tratamento
Inibição
(%)
Controle
Ä Aumento do peso da orelha
(mg)
6,08 ± 0,47
Extrato bruto de C. glabratus
2,2 ± 0,57*
26,69
Óleo de cróton (200 µg/orelha) foi utilizado como agente irritante. A solução de extrato bruto em
acetona foi administrada em dose única (2,5 mg/orelha). Valores representam a média ± E.P.M. de 11
a 22 camundongos. P < 0,001 comparado com o controle, ANOVA (teste de Tukey).
132
4,3.3 Avaliação da atividade moluscicida
A avaliação da atividade moluscicida do extrato bruto de C.glabratus não
mostrou alteração dos batimentos cardíacos dos caramujos da espécie Biomphilaria
glabrata, hospedeiro intermediário do parasita Shistosoma mansoni, causador da
esquistossomose. Portanto, os resultados deste ensaio significam que o extrato
bruto de C. glabratus não é ativo sobre o caramujo transmissor da esquistossomose.
4.3.4 Avaliação da atividade antiproliferativa
A avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto de C.glabratus foi
realizada em culturas de células tumorais humanas Caco-2 (carcinoma intestinal).
A análise dos resultados da Figura 3 mostrou inibição de crescimeto celular
menor do que 50% em concentrações altas, que não representa efeito
antiproliferativo.
% de Inibição
100
50
38,4
27,9
8,3
10,8 11,5
0
1
10
100
1000
Concentração (µ g/ml)
Figura 3: Atividade antiproliferativa de C. glabratus em células Caco-2
133
5 ESTUDO QUÍMICO E FARMACOLÓGICO DE Palicourea crocea
O estudo químico e farmacológico de P.crocea compreende a parte
experimental do seu estudo químico, os resultados obtidos e respectiva discussão,
bem como o estudo farmacológico do extrato bruto.
5.1 Parte experimental do estudo químico de P. crocea
A parte experimental do estudo químico da espécie P. crocea descreve a
coleta e secagem da planta, obtenção do extrato bruto, extrações e fracionamentos.
5.1.1 Coleta e secagem da planta P. crocea
As folhas e galhos da planta P. crocea foram coletados na planície de
inundação do rio Paraná, região de Porto Rico–PR em dezembro de 2000. A espécie
vegetal foi identificada pela Profa. Dra. Maria Conceição de Souza do Departamento
de Biologia da Universidade Estadual de Maringá e uma exsicata foi depositada no
herbário desta universidade sob o número HNPU 2060.
As partes aéreas da planta foram secas ao ar e moídas, rendendo 848,3g.
5.1.2 Obtenção do extrato bruto de P.crocea
O material moído (848,3g) foi extraído exaustivamente com metanol,
deixando-se em maceração à temperatura ambiente. Após a evaporação do
134
solvente, foram obtidos 29,4g de extrato bruto de P.crocea, que foram divididos em
duas partes: a primeira parte foi submetida à extração ácido - base e a segunda foi
fracionada, utilizando-se solventes em gradiente de polaridade.
5.1.3 Fracionamento de P. crocea
O Esquema 9 apresenta uma visão geral do procedimento empregado para o
isolamento de substâncias presentes nas folhas e galhos de P .crocea.
135
Partição em Solventes
Extrato MeOH
24,26g
Fração Hexânica
Pc H
Fração CHCl3
Pc C
Fração AcOEt
Pc A
Fração MeOH: H2O
Pc M
CC/Sílica
Fração A3’
Ac2O
Fração A4’
CCDP
(CHCl3:MeOH 20%)
CC / Sephadex
Fração A3.2’
Fração A5’
Pc Ac
CCDP
(CHCl3:MeOH 20%)
Pc 1
Pc 2
27,9mg
61,5mg
CCDP
(CHCl3:MeOH 20%)
Pc 2
Pc 3
46,7 mg
10,2mg
Esquema 9: Procedimento experimental geral empregado para o isolamento das substâncias de Palicourea crocea
135
136
5.1.3.1 Fracionamento do extrato bruto de P.crocea por partição em
solventes
Uma parte do extrato bruto metanólico de P. crocea (55,09g) foi dissolvida em
MeOH:H2O 1:1 e fracionada por sucessivas extrações com solventes em gradiente
de polaridade. O procedimento resultou nas frações hexânica - Pc H (0,47g), CHCl3 Pc C (1,79g), AcOEt – Pc A (3,20g) e MeOH:H2O – Pc M (18,80g) (Esquema 10).
Extrato MeOH
24,26g
MeOH:H2O 1:1
Solução
MeOH:H2O 1:1
Extração com hexano
Fração Pc H
0,47g
Solução
MeOH : H2O 1:1
Fração Pc C
1,79g
Solução
MeOH : H2O 1:1
Extração com AcOEt
Fração Pc A
3,20g
Fração Pc M
18,80g
Esquema 10: Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por partição em
solventes
137
5.1.3.1.1 Estudo das frações hexânica – Pc H e clorofórmica – Pc C
A fração hexânica - Pc H (0,47g) foi submetida à CC ( ∅ 2,5 cm) contendo
56,4g de sílica gel. As 180 frações obtidas foram reunidas, após análise por CCD, de
acordo com a Tabela 36.
Tabela 36: Dados obtidos da CC da fração Pc H em sílica gel
Eluente
Código
H1’
Frações
reunidas
1-3
Massa
(mg)
22,6
Hexano: AcOEt 15%
Hexano: AcOEt 20%
H2’
4-7
11,0
Hexano: AcOEt 35%
H3’
8-10
9,4
AcOEt
H4’
11-20
12,4
AcOEt:MeOH 50%
H5’
21-33
30,7
H6’
34-57
34,0
H7’
58-111
34,3
H8’
112-165
38,4
H9’
166-170
179,8
H10’
171-180
10,4
MeOH
O material obtido da CC da fração Pc H apresentou muita clorofila e
compostos graxos, razão pela qual estas frações não foram trabalhadas.
A análise da fração CHCl3 – Pc C (1,79g) por CCD mostrou um perfil
cromatográfico complexo, revelando a presença de alcalóide e vários constituintes
com forte fluorescência sob luz UV. Uma parte desta fração (224,0mg) foi submetida
a CCDP (CHCl3:MeOH 10%), porém após a separação das faixas, extração e
evaporação dos solventes, não foi possível o isolamento de substância pura.
138
5.1.3.1.2 Estudo da fração acetato de etila – Pc A
A fração acetato de etila – Pc A (3,20g) foi submetida a CC (∅2,5cm)
contendo 45,4g de sílica gel. O procedimento resultou em 6 frações que foram
reunidas, após análise por CCD, conforme a Tabela 37.
Tabela 37: Dados obtidos da CC da fração Pc A
Eluente
Código
A1’
Frações
reunidas
01-29
Massa
(mg)
122,6
CHCl3:MeOH 10%
Substância isolada
(mg)
CHCl3:MeOH 15%
A2’
30-35
73,9
CHCl3:MeOH 20%
A3’
36-43
297,3
Pc-2 (11,6)
A4’
44-54
578,2
Pc 1 (27,9)
CHCl3:MeOH 60%
A5’
55-71
233,8
Pc 2 (61,5)
MeOH
A6’
72-95
203,9
A fração A4’ (578,2mg) foi submetida a CCDP (CHCl3:MeOH 20%) e forneceu
o alcalóide codificado como Pc-1 (27,9mg).
A purificação das frações A3’ (297,3mg) e A5’ (233,8mg) por CCDP
(CHCl3:MeOH 20%), resultou no isolamento de 11,6mg e 61,5mg, respectivamente,
de outra substância codificada como Pc-2.
Parte da fração A3’ (209,3mg) foi purificada em CC em Sephadex LH-20,
empregando-se como fase móvel H2O, H2O:MeOH 75% e 50% e MeOH, originando
35 frações, que foram reunidas após CCD (Tabela 38).
139
Tabela 38: Dados obtidos da CC da fração A3’, em Sephadex
Eluente
Código
Massa
(mg)
40,0
Substância isolada
(mg)
A3.1’
Frações
reunidas
1-8
H2O
H2O:MeOH 75%
A3.2’
9-18
64,0
Pc 2 (35,1)
A3.3’
19-23
13,0
H2O:MeOH 50%
A3.4’
24-25
10,6
MeOH
A3.5’
26-35
40,4
A fração A3.2’ (64,0mg) foi submetida a CCDP (CHCl3:MeOH 20%),
resultando novamente no isolamento da substância Pc-2 (35,1mg).
As faixas restantes das placas preparativas utilizadas na purificação das
frações A3.2’ (CC, em Sephadex), A3’ e A4’ foram extraídas com MeOH, filtradas e
reunidas. Sucessivas CCDP (CHCl3: MeOH 20%) do resíduo obtido após
evaporação do solvente forneceram o alcalóide codificado como Pc 3 (10,2 mg).
5.1.3.1.3 Estudo da fração hidrometanólica – Pc M
A análise das placas de CCD da fração MeOH:H2O - Pc M mostrou uma
mistura complexa de diversos constituintes e a revelação com o reagente de
Dragendorff indicou entre eles a presença de alcalóide. Assim, uma parte desta
fração foi submetida a CC em sílica gel e uma amostra da mesma fração foi
acetilada.
140
5.1.3.1.3.1 Purificação da fração MeOH:H2O – Pc M
Uma parte da fração MeOH:H2O (6,8g) foi fracionada em CC (∅2,5cm) em
sílica gel (77,0g), coletando-se 101 frações que foram reunidas, após análise através
de CCD, conforme a Tabela 39.
Tabela 39: Dados obtidos da fração Pc M
Eluente
Código
M1’
Frações
reunidas
1-13
Massa
(mg)
34,2
CHCl3:MeOH 25%
CHCl3:MeOH 30%
M2’
14-17
26,9
M3’
18-20
31,6
M4’
21-27
146,6
M5’
28
22,6
M6’
29-33
37,4
M7’
34
63,7
CHCl3:MeOH 40%
M8’
35-65
53,0
CHCl3:MeOH 50%
M9’
66
28,1
M10’
67-74
67,6
CHCl3:MeOH 60%
M11’
75-83
167,6
CHCl3:MeOH 70%
N12’
84
60,4
M13’
85-87
359,9
CHCl3:MeOH 80%
M14’
88-99
409,5
MeOH
M15’
100-101
100,7
CHCl3:MeOH 35%
Substância isolada
(mg)
Pc1 (22,6)
Pc2 (63,7)
As frações M5’ e M7’ forneceram as substâncias puras já isoladas Pc 1
(22,6mg) e Pc 2 (63,7mg). As frações que apresentaram quantidade maior de
material (M4’, M11’, M13’, M14’ e M15’) foram fracionadas por CC em sílica gel,
originando material polimérico e misturas de açúcares não identificados.
141
5.1.3.1.3.2 Acetilação da fração MeOH:H2O – Pc M
Uma parte da fração MeOH:H2O - Pc M (1,7g) foi dissolvida em 1,0 mL de
anidrido acético e permaneceu 7 horas sob agitação à tempe ratura ambiente.
Extraiu-se a mistura reacional com AcOEt e a solução resultante foi lavada em água,
seca com Na2SO4 e filtrada. O material sólido originado após a evaporação do
solvente foi codificado como F Ac (138,7mg) e purificado por CC (∅ 1,5cm) em sílica
gel (20,50g), obtendo-se 53 frações que foram reunidas, após análise por CCD,
conforme a Tabela 40.
Tabela 40: Dados obtidos da CC de F Ac, em sílica gel
Eluente
Código
M2.1’
Frações
reunidas
1-2
Massa
(mg)
8,8
CHCl3:MeOH 10%
M2.2’
3-5
43,6
M2.3’
6-16
9,8
M2.4’
17-36
3,3
CHCl3:MeOH 20%
M2.5’
37-38
4,6
MeOH
M2.6’
39-53
4,2
Substância isolada
(mg)
Pc Ac (9,8)
A análise da fração M2.3’ por CCD mostrou uma substância pura com
fluorescência sob irradiação UV em 254 e 366nm e a revelação com reagente de
Dragendorff indicou um alcalóide, que foi codificado como Pc Ac (9,8mg).
142
5.1.3.2 Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por extração
ácido-base
A outra parte do extrato bruto metanólico da planta P.crocea (5,1g) foi
submetida à extração ácido - base, de acordo com o Esquema 11.
Extrato MeOH
5,1g
Dissolução em solução de HCl 5%
Fração CHCl3
Não Alcaloidal
4,26g
Fração CHCl3
Alcaloidal
0,50g
CCDP
CHCl3:MeOH 15%
Pc 1
30,3 mg
Fração
Aquosa-ácida
Basificação com NH4OH (pH 12)
Fração
Aquosa-básica
Extração com CHCl3:MeOH 1:1
Fração
CHCl3: MeOH
0,20g
Fração Aquosa
0,09g
Esquema 11: Fracionamento do extrato bruto de P. crocea por extração ácidobase
5.1.3.2.1 Estudo da fração CHCl3 alcaloidal de P. crocea
A análise por CCD da fração CHCl3 alcaloidal resultante do fracionamento por
extração ácido – base da planta P.crocea revelou a presença de alcalóide e uma
143
amostra de 50,0mg foi submetida a CCDP (CHCl3:MeOH 15%), isolando-se o
alcalóide codificado como Pc 1 (30,3mg).
5.1.3.2.2 Estudo da fração CHCl3 não-alcaloidal de P.crocea
A fração CHCl3 não-alcaloidal (4,26g) proveniente da extração ácido - base do
extrato bruto de P. crocea foi fracionada por CC em sílica gel (27,63g), utilizando - se
solventes em gradiente crescente de polaridade, originando 9 frações, conforme a
Tabela 41.
Tabela 41: Dados obtidos da CC da fração CHCl3 não-alcaloidal de P. crocea
Eluente
Hexano: CHCl3 20 %
C1’
Massa
(mg)
19,2
Hexano:CHCl3 50%
C2’
67,5
Hexano:CHCl3 75 %
C3’
900,0
C4’
73,1
CHCl3: MeOH 10 %
C5’
700,0
CHCl3: MeOH 20 %
C6’
651,4
CHCl3: MeOH 50 %
C7’
521,5
CHCl3: MeOH 75 %
C8’
137,1
C9’
68,1
CHCl3
MeOH
Frações
As frações C1’, C2’, C4’, C8’ e C9’ não foram trabalhadas, porque
apresentaram um perfil cromatográfico muito complexo. As frações C3’, C5’, C6’ e
C7’ foram submetidas a colunas cromatográficas em sílica gel, mas não foi possível
obter substâncias puras, pela dificuldade de separação de uma mistura com perfil
cromatográfico complexo, pela presença de clorofila e compostos graxos em altas
concentrações.
144
5.1.3.2.3 Estudo das frações aquosa e hidrometanólica de P. crocea
As frações aquosa e hidrometanólica provenientes da extração ácido – base
do extrato bruto metanólico de P. crocea foram trabalhadas, tentando-se
precipitação e filtração em Sephadex. As análises por CCD das frações resultantes
mostraram uma mistura de substâncias.
5.2 Resultados e discussão do estudo químico de P. crocea
Os resultados e discussão do estudo químico de P.crocea inclui a elucidação
estrutural das substâncias isoladas desta planta e descreve o estudo farmacológico
realizado com o respectivo extrato bruto.
5.2.1
Determinação
estrutural
das
substâncias
isoladas
de
Palicourea crocea
A determinação estrutural descreve os resultados e discussões das análises
realizadas para a elucidação estrutural das substâncias isoladas de P.crocea. Os
estudos revelaram a presença de alcalóides indólicos codificados como Pc 1, Pc 2 e
Pc 3. A determinação estrutural da substância Pc Ac também é apresentada.
145
5.2.1.1 Determinação estrutural de Pc 1
O alcalóide codificado como Pc 1 foi isolado como um sólido amorfo da fração
alcaloidal proveniente da extração ácido base e das frações AcOEt e MeOH:H2O
provenientes do fracionamento em solventes de P. crocea.
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
(Pc 1)
A estrutura de Pc 1 foi identificada através da análise dos espectros de
massas (ESEMAR), RMN de 1H,
13
C, DEPT, COSY, HETCOR, HMBC, NOESY, [α]D
e CD.
ESEMAR, m/z: 529.2256 (100) Espectro 38, pág. 158.
RMN de 1H, 300,06 MHz / CD3OD, δ ppm e RMN de
13
C, DEPT (75,5 MHz /
CD3OD), δ ppm: dados descritos na Tabela 47, pág. 157 (Espectros 39, 40 e 41,
pág. 159, 160 e 161).
RMN 2D (13C x 1H HMBC), 75,5 MHz / CD3OD: Dados descritos na Tabela 43,
146
44, pág 151 (Espectro 43 , pág. 163).
RMN 2D (13C x 1H HETCOR), 75,5 MHz / CD3OD: dados descritos na Tabela
45, pág 153 (Espectro 44, pág 164).
RMN 2D (13C x 1H NOESY), 75,5 MHz / CD3OD: Dados descritos na Tabela
46, pág. 154 (Espectros 45 e 46, págs. 165 e 166).
[α]25 D –11 0(em MeOH, c=0,003 mg mg. mL-1)
O espectro de massas de alta resolução, obtido por “eletrospray” - ESEMAR
de Pc 1 (Espectro 38) apresentou pico em m/z 529.2256, condizente com a fórmula
molecular C27H32N2O9.
O espectro de RMN 1H (Espectro 39, pág. 159) apresentou sinais para quatro
hidrogênios aromáticos, sendo dois dubletos em δ 7,40 (J=7,5Hz, H-9) e 7,28
(J=7,5Hz, H-12) e dois duplo tripletos em δ 7,05 (J=7,5; 1,2Hz, H-11) e 6,97 (J=7,5;
1,2Hz, H-10). Estes sinais associados aos multipletos observados em δ 3,08-3,14
(H-5) e 2,78-2,84 (H-6) são característicos da presença de um sistema tetraidro-βcarbolínico. O espectro de RMN de 1H de Pc 1 mostrou ainda singletos em δ 7,55
(H-17) e δ 3,71 (3H), típico de um grupo carbometóxi α,β-insaturado, dois dubleto de
dubletos em δ 2,92 (J=15,9; 10,0; 2,7Hz) e δ 2,14 (J=15,9; 9,3; 1,0Hz,)
correspondentes aos hidrogênios metilênicos H-14, além do dubleto em δ 5,16
(J=9,0Hz, H-21) e dos multipletos em δ 3,30 (H-15) e δ 2,82 (H-20). Estes sinais em
conjunto com os observados na região de δ 3,07 a 3,84 e em δ 4,80 (H-anomérico)
147
sugeriram a presença de uma unidade secoiridoidal glicosilada. A unidade
glicosídica foi definida como uma β-glucopiranose, através do valor da constante de
acoplamento do hidrogênio anomérico em δ 4,80 (J=7,8Hz) e do deslocamento
químico relacionado ao respectivo carbono anomérico em δ 100,4.
13
C e DEPT de Pc 1 (Espectro 40 e 41, págs. 160 e
161) também mostrou sinais relacionados a carbonos aromáticos em δ 134,3 (C-2);
108,6 (C-7); 128,4 (C-8); 118,8 (C-9); 119,9 (C-10); 122,4 (C-11); 112,4 (C-12),
138,0 (C-13), além do sinal em δ 53,7 (C-3) e dos correspondentes aos carbonos
metilênicos em δ 41,8 (C-5) e 22,0 (C-6) que confirmaram o esqueleto carbônico
tetraidro-β-carbolínico. Além destes, os sinais em δ 37,5 (C-15); δ 112,2 (C-16); δ
153,5 (C-17); δ 49,0 (C-20); δ 98,9 (C-21) corresponderam a uma unidade
secologanínica.
Estas informações levaram-nos a propor inicialmente que a substância Pc 1
tratava-se de um alcalóide indólico monoterpênico glicosilado similar à aqueles
comumente isolados do gênero Palicourea. A comparação dos dados de RMN de
13
C e 1H publicados para o ácido estrictosidínico (ARBAIN et al., 1993) com os
obtidos para Pc 1 foi concordante para os deslocamentos químicos (δC/δH) dos sinais
correspondentes ao sistema tetraidro-β-carbolínico, à unidade glicosídica e à maioria
dos sinais correspondentes a unidade monoterpênica (Tabela 42).
No entanto, os sinais correspondentes aos carbonos e hidrogênios do grupo
vinilidênico (C-18 e C-19) da unidade monoterpênica não foram observados para Pc
1. Ao invés disto, observou-se a presença de sinais relacionados a carbono
quaternário em δ 142,9 (C-19) e metínico em δ 135,1 (C-18), de ligação dupla, o que
indicou uma unidade terpenoídica modificada em Pc 1. Outro indício observado no
espectro, foi que H-3 apareceu como um singleto em δ 4,94 e não como o dubleto no
ácido estrictosidínico.
148
Tabela 42: Dados de RMN de 13C e 1H para o ácido estrictosidínico e de Pc 1
9
6
3
12
N
H H
OGlc
20
15 H
H3CCO2
O
17
17
H
21
Glc O
O
2
N
H
H
12
19
16
H
11
18
N
14
5
10
5
11
6
9
10
3
19
H
20
NH
18
14
H
H
15
16
CO 2C H 3
22
Nº C
δ
13
C
2
3
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
130,54
52,28
43,02
19,63
107,30
127,55
119,05
120,51
123,31
112,20
138,19
35,15
15
16
17
18
34,07
113,68
153,17
118,68
19
136,25
20
45,72
21
96,57
22
175,98
-OCH3
1’
100,35
2’
74,74
3’
77,99
4’
71,81
5’
78,72
6’
63,11
Ác. Estrictosidínico
1
δ H multiplicidade (J Hz) /
CD3OD
4,41d (11,8)
7,44 d (7,6)
7,02 dd (7,6; 7,2)
7,12 dd (8,1; 7,2)
7,30 d (8,1)
2,11 ddd (13,0; 11,8; 4,5)
2,36 dd (13,0; 13,0; 3,3)
2,97m
7,55 s
5,17 dd (10,7; 1,5; 1,0)
5,30 dd (17,4; 1,5; 1,0)
5,85 ddd (17,4; 10,7; 7,3)
2,69 ddd (9,5; 7,3; 4,5)
5,82 d (9,5)
4,81 d (7,9)
3,21 dd (9,1; 7,9)
3,42 dd (9,1; 8,9)
3,22 dd (10,5; 8,9)
3,40 ddd (10,5; 6,9; 2,0)
3,67 dd (11,7; 6,9)
4,01 dd (11,7; 2,0)
δ
13
C
134,3
53,7
41,8
22,0
108,6
128,4
118,8
119,9
122,4
112,4
138,0
40,1
37,5
112,2
153,5
135,1
142,9
49,0
98,9
169,5
52,0
100,4
74,7
77,8
71,4
78,6
62,6
Pc 1
1
δ H multiplicidade (J Hz) /
CD3OD
4,94 s
3,14-3,08 m
2,78-2,84 m
7,40 d (7,5)
6,97 td (7,5; 1,2)
7,05 td (7,5;1,2)
7,28 d (7,5)
2,14 ddd (15,9; 9,3;1,0)
2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
3,30 m
7,5 s (largo)
5,85 s
2,82 m
5,16 d (9,0)
3,71 s
4,80 d (7,8)
3,16 dd (9,0; 7,8)
3,36 t (9,0)
3,07 t (9,0)
3,27 m
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
149
A natureza da unidade monoterpênica foi deduzida com base na análise das
correlações observadas nos mapas de contorno COSY e HMBC. As correlações
observadas no mapa de contorno HMBC (Espectro 42, pág. 162, Tabela 43) de Pc
1 entre os sinais em δ 153,5 (C-17) e o multipleto em δ 3,30 (H-15); em δ 49,0 (C-20)
e o singleto em δ 4,94 (H-3); em δ 98,9 (C-21) e o singleto em δ 7,5 (H-17),
correspondentes à unidade secologanínica, além da correlação em δ 53,7 (C-3) e o
singleto em δ 5,85 (H-18) que confirmou a presença da unidade terpênica modificada
como a da estrutura proposta para Pc 1. Também foram observadas correlações
entre os sinais em δ134,3 (C-2) e o multipleto em δ 2,78-2,84 (H-6); em δ 53,7 (C-3)
e o multipleto em δ 3,08-3,14 (H-5); em δ 108,6 (C-7) e o dubleto em δ 7,40 (H-9);
em δ 118,8 (C-9) e o duplo tripleto em δ 7,05 (H-11) e em δ 138,0 (C-13) e o dubleto
em δ 7,40 (H-9), condizente com o sistema tetraidro-β-carbolínico.
150
Tabela 43: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HMBC de Pc 1
6
9
5
10
H
11
2
N
H
H
12
H
21
G lc O
O
17
NH
3
19
H
20
18
14
H
H
15
16
C O 2C H3
22
n.ºC
C
n.º H
2
3
134,3
53,7
3
4,94
5
6
7
41,8
22,0
108,6
6
5
6
2,78-2,84
3,08-3,14
2,78-2,84
8
128,4
9
7,40
9
10
11
12
13
118,8
119,9
122,4
112,4
138,0
10
11
12
11
6,97
7,05
7,28
7,05
14
40,1
15
37,5
15
18
20
14
3,23
5,86
2,82
2,92
16
112,2
17
15
7,53
3,23
17
18
153,5
135,1
19
142,9
14
14
20
3
2,14
2,92
2,82
4,94
20
49
21
98,9
15
21
20
15
3,23
5,16
2,82
3,23
δ
13
J2
n.º H
J3
6
5
18
3
2,78 –2,84
3,08 e 3,14
5,85
4,94
9
5
3
10
12
11
12
9
10
11
9
20
7,40
3,14 e 3,08
4,94
6,97
7,28
7,05
7,28
7,40
6,97
7,05
7,40
2,82
21
18
17
14
14
15
20
3
14
14
21
3
18
17
1’
5,16
5,85
7,5
2,14
2,92
3,30
2,82
4,94
2,14
2,92
5,16
4,94
5,85
7,5
4,80
151
Pelo mapa de contorno COSY de Pc 1 (Espectro 43, pág. 163, Tabela 44) foi
possível confirmar as conectividades entre os carbonos da unidade monoterpênica
proposta através das correlações observadas entre os sinais em δ 2,92 (H-14β) e δ
2,14 (H-14α); em δ 5,85 (H-18) e δ 2,92 (H-14 β); em δ 3,30 (H-15) e δ 2,92 (H-14β);
em δ 3,30 (H-15) e δ 2,82 (H-20); em δ 5,16 (H-21) e δ 2,82 (H-20). Além disto,
nenhuma correlação foi observada entre os hidrogênios da unidade monoterpênica e
H-3.
Tabela 44: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc 1
6
9
5
10
H
11
12
N
H
H
2
H
21
Glc O
O
17
3
19
H
20
NH
18
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
no. H
δ
1
no. H
δ
1
9
7,40 d (7,5)
10
6,97 td (7,5; 1,2)
12
7,28 d (7,5)
11
7,05 td (7,5; 1,2)
18
5,85 s
14β
2,92 ddd (15,9;8.0; 2,7)
21
5,16 d (9,0)
20
2,82 m
15
3,30 m
14β
2,92 ddd (15,9; 10.0; 2,7)
20
2,82 m
14α
2,14 ddd (15,9; 9,3; 1,0)
14β
2,92 ddd (15,9;8.0; 2,7)
As correlações observadas no mapa de contorno HETCOR (Espectro 44,
pág. 164, Tabela 45) permitiram a atribuição dos deslocamentos químicos de todos
os hidrogênios e carbonos de Pc 1. Além de outras, foram observadas correlações
entre os sinais correspondentes ao carbono metínico em δ 53,7 (C-3) e o
152
correspondente hidrogênio em δ 4,94 (s, H-3); ao carbono olefínico em δ 153,5 (C17) e o singleto em δ 7,55 (H-17); ao carbono metínico em δ 37,5 (C-15) e o
multipleto em δ 3,30 (H-15); entre o sinal em δ 49,0 (C-20) e o multipleto em δ 2,82
(H-20) e entre o sinal em δ 98,9 (C-21) e o dubleto em δ 5,16 (J=9,0Hz, H-21).
Outras correlações importantes foram observadas entre o carbono olefínico em δ
135,1 (C-18) e o singleto em 5,85 (H-18) e entre o carbono metilênico (C-14) e os
respectivos sinais em δ 2,14 (ddd, J=15,9; 9,3; 1,0Hz, H-14) e δ 2,92 (ddd, J=15,9;
10,0; 2,7Hz, H-14).
153
Tabela 45: Correlações heteronucleares no mapa de contorno HETCOR de Pc 1
6
9
5
10
H
11
12
N
H
H
2
H
21
Glc O
3
19
H
20
O
NH
18
14
H
H
15
17
16
CO2CH3
22
º
13
DEPT
3
53,7
CH
4,94 s
5
41,8
CH2
3,14-3,08 m
6
22,0
CH2
2,78-2,84 m
9
118,8
CH
7,40 d (7,5)
10
119,9
CH
6,97 td (7,5; 1,2)
11
122,4
CH
7,05 td (7,5; 1,2)
12
112,4
CH
7,28 d (7,5)
14
40,1
CH2
N do C
δ
C
δ
H multiplicidade (J em Hz) /CD3OD
α
2,14 ddd (15,9; 9,3; 1,0)
β
2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
15
37,5
CH
3,30 m
17
153,5
CH
7,5 s (largo)
18
135,1
CH
5,85 s
20
49,0
CH
2,82 m
21
98,9
CH
5,16 d (9,0)
-OCH3
52,0
CH3
3,71 s
’
100,4
CH
4,80 d (7,8)
’
2
74,7
CH
3,16 dd (9,0; 7,8)
’
3
77,8
CH
3,36 t (9,0)
4’
71,4
CH
3,07 t (9,0)
’
5
78,6
CH
3,27 m
’
62,6
CH2
3,58 dd (12,0; 6,6)
1
6
3,84 dd (12,0; 2,4)
154
A estereoquímica de Pc 1 foi determinada com base no mapa de contorno
NOESY (Espectros 45 e 46, págs. 165 e 166; Tabela 46) e nos dados obtidos da
curva de dicroismo circular. As correlações entre os sinais em δ 4,94 (H-3) e δ 2,82
(H-20); entre os sinais em δ 2,82 (H-20) e δ 3,30 (H-15); e entre os sinais em δ 2,82
(H-20) e δ 5,16 (H-21), no mapa de contorno NOESY, mostraram que estes
hidrogênios encontram-se no mesmo lado da molécula. Uma correlação não
esperada foi observada entre o sinal de H-3 (δ 4,94) e H-18 (δ 5,85).
Tabela 46: Correlações heteronucleares no mapa de contorno NOESY de Pc 1
6
9
5
10
H
11
12
N
H
H
2
H
21
Glc O
O
17
NH
3
19
H
20
18
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
no. do H
no. do H
9
7,40 d (7,5)
10
6,97 td (7,5; 1,2)
12
7,28 d (7,5)
11
7,05 td (7,5; 1,2)
18
5,85 s
21
5,16 d (9,0)
3
4,94 s
20
3
20
1’
20
2,82 m
4,94 s
2,82 m
4,80 d (7,8)
2,82 m
6’
3,84 dd (12,0; 2,4)
6’
3,58 dd (12,0; 6,6)
15
3,30 m
20
2,82 m
δ
1
δ
1
A análise da curva CD obtida para Pc 1 (Espectro 47, pág. 167) mostrou
efeito Cotton positivo na região de 230-250 nm e negativo em 290 nm,
característicos de alcalóides glicosilados tetraidro-β-carbolínicos de configuração “R”
em C-3 (ACHENBACH, 1997).
155
Com base neste dado e naqueles obtidos através do espectro de NOESY
foram realizados estudos conformacionais, empregando-se o método ab initio HF
(Hatree Fock) para a otimização da geometria da molécula e o conjunto de bases 631G*, programa Gaussian 98, para obtenção da conformação mais estável (FRISCH
et al., 1998). A conformação de mais baixa energia adotada pela molécula está
representada pela figura 4.
Figura 4: Conformação de menor energia de Pc 1 e algumas correlações do
mapa de contorno NOESY
A estabilidade desta conformação provavelmente é devida à ocorrência de
uma ligação de hidrogênio entre a ligação Nβ-H e o átomo de oxigênio do grupo
hidroxila de C-2’ da unidade de glucose. A análise detalhada do espectro de NOESY
associada com as informações obtidas através da realização de cálculos teóricos
mostrou que há concordância quanto a distância calculada entre os átomos de
hidrogênio (menos que 4 A°) e todas as correlações observadas no espectro de
NOESY, inclusive aquela entre H-3 e H-18.
156
Um levantamento bibliográfico, utilizando o Chemical Abstract revelou que o
alcalóide Pc 1 é inédito, sendo identificado neste trabalho como croceaina “A”.
Recentemente foi relatado o isolamento de outro alcalóide indólico monoterpênico,
chamado braquicerina e isolado de Psychotria brachyceras (KERBER et al, 2001),
que também contém uma unidade terpênica similar à de Pc 1. A Tabela 47 mostra a
comparação dos dados publicados de RMN de 1H e
13
C da braquicerina, com os
obtidos de Pc-1. O isolamento e a elucidação estrutural destes alcalóides indólicos
monoterpênicos têm importância, pois sugerem a existência de um caminho
biossintético alternativo para estes metabólitos secundários.
157
Tabela 47: Dados de RMN de 13C e 1H da braquicerina e de Pc 1
H
N
H
H
12
Glc O
2
H
21
20
O
H
11
NH
OH
3
19
18
H
5
10
5
11
H
14
H
H
Glc O
N C
δ
C
2
3
5
130,7
54,7
41,8
6
7
8
9
10
11
12
13
14
24,4
108,3
127,7
118,9
120,2
123,2
112,3
137,4
43,5
15
16
17
18
19
20
21
22
1’
2’
3’
4’
5’
6’
35,5
111,8
153,5
74,3
49,0
41,9
99,0
169,1
100,6
74,0
71,1
78,3
77,7
62,1
-OCH3
51,8
* KERBER, 300 MHz
Braquicerina *
δ H multiplicidade (J Hz)/
CD3OD
1
4,78 d (8,2)
α 3,40 m
β 3,69 d (5,8)
2,98 m
7,45 dd (7,7; 1,0)
7,0 dd (7,4; 7,0; 0,9)
7,13 ddd (8,1; 7,4; 1,1)
7,37 dd (8,1; 1,0)
α
1,50 ddd (13,2; 12,7;
3,8)
β 2,44 dd (13,2; 6,0)
3,42 m
7,53 d (1,0)
4,36 dd (8,2; 3,8)
2,71 ddd (8,2; 8,2; 5,0)
2,33 ddd (8,4; 8,2; 5,0)
4,89 d (8,4)
4,70 d (8,0)
3,18 m
3,38 m
3,24
3,36
α 3,65 d (12,0; 5,3)
β 3,82 dd (12,0; 2,4)
3,72
H
21
20
3
19
H
NH
18
14
H
H
15
17
16
16
CO2CH3
CO2CH3
13
2
O
22
22
º
N
H
H
12
15
17
6
9
6
9
10
δ
13
C
134,3
53,7
41,8
22,0
108,6
128,4
118,8
119,9
122,4
112,4
138,0
40,1
37,5
112,2
153,5
135,1
142,9
49,0
98,9
169,5
100,4
74,7
77,8
71,4
78,6
62,6
52,0
δ
1
Pc 1
H multiplicidade (J Hz) /
CD3OD
4,94 s
3,14-3,08 m
2,78-2,84 m
7,40 d (7,5)
6,97 td (7,5; 1,2)
7,05 td (7,5;1,2)
7,28 d (7,5)
2,14 ddd (15,9; 9,3;1,0)
2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
3,30 m
7,5 s (largo)
5,85 s
2,82 m
5,16 d (9,0)
4,80 d (7,8)
3,16 dd (9,0; 7,8)
3,36 t (9,0)
3,07 t (9,0)
3,27 m
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
3,71 s
158
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 38: Espectro de massas de alta resolução, ESEMAR de Pc 1
158
159
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 39: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc 1
159
160
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 40: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz / CD3OD) de Pc 1
160
161
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 41: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz / CD3OD) de Pc 1
161
162
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 42: Mapa de contorno HMBC (CD3OD) de Pc 1.
162
163
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 43: Mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc 1.
163
164
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 44: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc 1
164
165
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 45: Mapa de contorno NOESY (CD3OD) de Pc 1
165
166
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 46: Expansão do mapa de contorno NOESY (CD3OD) de Pc 1
166
167
9
6
10
5
11
NH
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 47: Curva de dicroismo circular de Pc 1
167
168
5.2.1.2 Determinação estrutural de Pc 2
O alcalóide codificado como Pc 2 foi isolado da fração não alcaloidal,
proveniente da extração ácido-base e das frações AcOEt e MeOH:H2O do
fracionamento em solventes do extrato bruto de P. crocea.
6
9
5
10
11
3
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
NH Cl-
19 H
20
18
14
H
15
16
CO2CH3
22
(Pc 2)
Espectro de massas de alta resolução (ESEMAR) m/z: 529.2537 (100)
Espectro 48, pág. 171.
13
C, DEPT (75,5 MHz /
CD3OD), δ ppm : dados descritos na Tabela 48, pág. 170 (Espectros 49 e 50, pág.
172 e 173.
O espectro de massas de alta resolução (ESEMAR) de Pc-2 (Espectro 48,
pág. 171) mostrou o mesmo pico consistente com a fórmula C27 H32N2O9 e a análise
dos dados de RMN de 1H,
13
C, COSY e HETCOR (Espectros 49, 50, 51 e 52, págs.
172, 173, 174 e 175) indicou o mesmo esqueleto indólico monoterpênico glicosilado
estabelecido para Pc 1. A divergência entre os dados relacionou-se com o
169
deslocamento químico do sinal de H-3 (em δ 4,94/ Pc 1 e em δ 5,30/ Pc 2),
sugerindo diferença na configuração de C-3 (Tabela 48). Isto nos levou a sugerir que
o alcalóide Pc 2 seria um epímero de Pc 1, na posição C-3.
Para confirmar esta hipótese foram realizadas análises de dicroísmo circular,
visando a comparação com as obtidas de Pc 1. A curva de dicroísmo circular de Pc
2 mostrou-se idêntica à de Pc 1 e, conseqüentemente, abandonou-se a hipótese de
que Pc 1 e Pc 2 fossem epímeros. A diferença no valor do deslocamento de H-3 em
Pc 2 foi entendida, quando esta substância foi considerada como um sal de Pc 1,
formado durante os procedimentos de isolamento. A nova hipótese foi confirmada,
através da comparação dos dados de RMN de 1H de Pc 2 com os do hidrocloreto de
Pc 1. O espectro de RMN de 1H do hidrocloreto de Pc 1 (Espectro 53, pág. 176) foi
idêntico ao de Pc 2 e o tratamento com bicarbonato de sódio converteu o sal no
respectivo alcalóide livre.
170
Tabela 48: Dados de RMN de 13C e 1H de Pc 1 e Pc 2
6
9
5
10
6
9
5
10
11
12
N
H
H
Glc O
3
2
H
21
20
O
17
NH
H
19
18
H
11
2
N
H
HH
12
14
H
H
Glc O
21
15
O
16
CO2CH3
NH Cl
19 H
20
18
14
H
15
17
22
3
16
CO 2CH3
22
N 0. C
δ
δH
C
2
3
5
6
7
8
9
134,3
53,7
41,8
22,0
108,6
128,4
118,8
10
Pc-1
(JHz) / CD3OD
δ
C
δ
Pc-2
H (JHz) / CD3OD
7,40 d (7,5)
130,8
53,7
42,1
20,2
107,9
127,6
119,2
119,9
6,97 td (7,5; 1,2)
120,4
7,02 dd (7,5; 1,0)
11
122,4
7,05 td (7,5; 1,2)
123,3
7,10 td (7,5; 1,0)
12
112,4
7,28 d (7,5)
112,4
7,32 d (7,5)
13
14
138,0
40,1 α
β
15
16
17
18
37,5
112,2
153,5
135,1
19
20
142,9
49,0
21
22
1'
2'
98,9
169,5
100,4
74,7
3'
4'
5'
6'
77,8
71,4
78,6
62,6
-OCH3
52,0
4,94 s
3,14-3,08 m
2,78-2,84 m
2,14 ddd (15,9; 9,3; 1,0)
2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
3,30 m
138,3
40,5
7,5 s (largo)
5,85 sl
37,3
112,3
153,5
139,7
2,82 m
139,3
48,0
5,16 d (9,0)
4,80 d (7,8)
3,16 dd (9,0; 7,8)
3,36 t (9,0)
3,07 t (9,0)
3,27 m
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
3,71 s
99,5
169,3
101,2
74,6
77,6
70,9
78,1
61,6
51,8
5,30 s
3,50-3,70 m
3,06-2,80 m
7,42 d (7,5)
2,19 dd (16,8; 9,9)
2,93 ddd (16,8; 8,9; 1,5)
3,40m
7,5 s
6,07 sl
2,90 m
5,13 d (9,0)
4,84 d (7,8)
3.22 dd (8.7; 7.8)
3,38 t (8,7)
3,24 m
3,28 m
3,54 dd (12,0; 6,0)
3,83 dd (12,2; 2,1)
3,7 s
171
Espectro 48: Espectro de massas de alta resolução, EMAR de Pc 2
171
172
6
9
5
10
11
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
3
NH Cl
19 H
20
18
14
H
15
16
CO2CH3
22
172
173
6
9
5
10
11
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
3
19 H
20
-
NH Cl
18
14
H
15
16
CO 2CH3
22
173
174
6
9
5
10
11
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
3
NH Cl
19 H
20
18
14
H
15
16
CO2CH3
22
174
175
6
9
5
10
11
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
3
NH Cl
19 H
20
18
14
H
15
16
CO2CH3
22
Espectro 52: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc 2
175
176
6
9
5
10
11
2
12
Glc O
N
H
HH
21
O
17
3
NH Cl
19 H
20
18
14
H
15
16
CO2CH3
22
176
Espectro 53: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) do hidrocloreto de Pc 1
177
5.2.1.3 Identificação estrutural de Pc 3
A substância Pc 3 foi obtida como um sólido amorfo isolado da fração AcOEt
proveniente da partição em solventes do extrato bruto de P. crocea.
9
6
5
10
N
11
2
N
H
H
12
H
21
Glc O
18
H
20
14
O
17
3
19
H
H
15
16
CO2 CH3
22
(Pc 3)
A
estrutura
de
Pc
3
foi
proposta,
espectroscópicos de ESEMAR, RMN de
1
H,
através da análise de dados
13
C, DEPT, HMQC, COSY e por
comparação destes com os dados obtidos de Pc 1 e os publicados para o lialosídeo
(VALVERDE et al., 1999).
ESEMAR, m/z: 525.3324 (100)
δ
13
C, 75,5 MHz / CD3OD,
ppm: dados descritos na Tabela 52, pág. 183 (Espectros 54 e 55, págs. 184 e
185).
RMN 2D (13C x 1H HMQC) 75,5 MHz / CD3OD: dados descritos na Tabela 50,
pág.181 (Espectro 56, pág.186).
178
51, pág. 182 (Espectro 57, pág. 187).
Os dados do espectro de RMN de 1H de Pc 3 (Espectro 54, pág. 184) foram
comparados com os obtidos de Pc 1 e mostraram ausência dos sinais relacionados
ao H-3 e os correspondentes aos hidrogênios metilênicos H-5 e H-6. A presença dos
dois dubletos em δ 8,24 (H-5) e δ 7,96 (H-6) na região correspondente a hidrogênios
aromáticos, junto com os dubletos em δ 8,16 (H-9) e δ 7,61 (H-12) e os dois tripletos
em δ 7,24 (H-10) e δ 7,50 (H-11) indicaram a presença do sistema β-carbolínico.
Além destes, o espectro de RMN de
1
H mostrou a presença da unidade
secologanínica, através dos multipletos em δ 3,50 (H-15); 3,71 (H-20); do dubleto em
δ
5,50 (J=6,3Hz, H-21) e do singleto em δ 7,51 (H-17). Os sinais em δ 4,43 (d,
J=7,8Hz, H-1’); 2,47 (dd, J=9,0; 7,8Hz, H-2’); 3,12 (t, J=9,0Hz, H-3’); 2,64 (t,
J=9,0Hz, H-4’); 3,24 (m, H-5’) e 3,67 (dd, J=11,7; 6,6Hz, H-6’) indicaram uma
unidade glicosilada e o singleto em δ 6,59 (H-18), junto com os multipletos referentes
aos hidrogênios metilênicos em δ 2,64 e 3,12 (H-14) indicaram o anel ciclopentenodiidropirano na estrutura de Pc 3 (Tabela 49, pág. 179).
Os dados de RMN de
13
C (Espectro 55, pág. 185) confirmaram a estrutura
proposta para Pc 3, apresentando sinais correspondentes aos carbonos aromáticos
em δ 141,7 (C-3); 138,0 (C-5) e 114,8 (C-6), além dos sinais em δ 138,8 (C-2); 127,2
(C-7); 122,5 (C-8); 122,7 (C-9); 120,9 (C-10); 129,6 (C-11) e 113,2 (C-12). O
espectro de RMN de
13
C também apresentou sinais na região compreendida entre δ
62,8-99,9 e em δ 41,1 (C-14); 35,0 (C-15); 112,7 (C-16); 153,9 (C-17); 136,0 (C-18);
143,1 (C-19); 49,0 (C-20) e 97,1 (C-21) correspondentes a uma unidade
monoterpênica glicosilada (Tabela 49).
179
Tabela 49: Dados de RMN de 13C e 1H de Pc 1 e de Pc 3
9
6
9
11
2
12
Glc O
N
H
HH
19 H
20
21
5
11
NH
3
12
18
14
δ
13
C
Pc 1
1
H (JHz) / DMSO-d6
δ
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
22
0
20
17
16
CO2CH3
N .C/H
H
21
O
15
17
N
2
N
H
H
Glc O
H
O
6
10
5
10
δ
13
C
Pc 3
1
δ H (JHz) / CD3OD
2
3
5
134,3
53,7
41,8
4,94 s
3,08 - 3,14 m
138,8
141,7
138,0
8,24 d (5,2)
6
22,0
2,78-2,84 m
114,8
7,96 d (5,2)
7
8
9
10
108,6
128,4
118,8
119,9
7,47 d (7,5)
6,97 td (7,5; 1,2)
127,2
122,5
122,7
120,9
8,16 d (8,0)
7,24 t (8,0)
11
122,4
7,05 td (7,5; 1,2)
129,6
7,50 t (8,0)
12
13
14
112,4
138,0
40,1
7,28 d (7,5)
113,2
140,8
41,1
7,61 d (8,0)
15
16
17
18
19
20
37,5
112,2
153,5
135,1
142,9
49,0
35,0
112,7
153,9
136,0
143,1
49,0
3,50 m
21
22
1'
98,9
169,5
100,4
5,16 d (9,0)
2'
α 2,14 ddd (15,9; 9,3; 1,0)
β 2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
3,30 m
7,5 s (largo)
5,85 s
2,82 m
α 2,64 m
β 3,12 m
7,51 s
6,59 (largo)
3,71 m
5,50 d (6,3)
4,80 d (7,8)
97,1
169,5
99,9
74,7
3,16 dd (9,0; 7,8)
74,5
2,47 dd (9,0; 7,8)
3'
77,8
3,36 t (9,0)
77,6
3,12 t (9,0)
4'
5’
71,4
78,6
3,07 t (9,0)
3,27 m
71,6
77,9
2,64 t (9,0)
3,24 m
6'
62,6
62,8
CH3-O-
52,0
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
3,71 s
3,67 dd (11,7; 6,6)
3,86 m
3,75 s
51,8
4,43 d (7,8)
180
As atribuições dos deslocamentos químicos de Pc 3 basearam-se em
comparações com os dados obtidos de Pc 1 e os provenientes da análise dos
mapas de contorno HMQC (Espectro 56, pág. 186) e COSY (Espectro 57, pág.
187)
O mapa de contorno HMQC de Pc 3 apresentou correlações relativas aos
carbonos e hidrogênios aromáticos em δ 138,0 (C-5) e 114,8 (C-6) e os respectivos
dubletos em δ 8,24 (J=5,2Hz, H-5) e 7,96 (J=5,2Hz, H-6), além das correlações entre
os sinais em δ 122,7 (C-9); 120,9 (C-10); 129,6 (C-11); 113,2 (C-12) e os
correspondentes dubleto em δ 8,16 (J=8,0Hz, H-9); dois tripletos em δ 7,24 e 7,50
(J=8,0Hz, H-10 e H-11) e dubleto em δ 7,61 (J=8,0Hz, H-12). Além destas, foram
observadas correlações entre os carbonos metilênico em δ 2,64 (C-14) e os
respectivos multipletos em δ 2,64 e 3,12 (H-14); entre os carbonos metínicos em
35,0 (C-15); 153,9 (C-17); 49,0 (C-20); 97,1 (C-21) e os sinais correspondentes aos
respectivos hidrogênios em δ 3,50 (m, H-15); em δ 7,51 (s, H-17); em δ 3,71 (m, H20) e em δ 5,50 (d, H-21). A unidade glucosídica foi identificada pelo valor do
deslocamento químico do carbono anomérico em δ 99,9 (C-1’) correlacionado ao
dubleto em δ 4,43 (J=7,8Hz, H-1’). As correlações em δ 74,5 (C-2’); 77,6 (C-3’); 71,6
(C-4’); 77,9 (C-5’); 62,8 (C-6’) e os respectivos hidrogênios em δ 2,47 (J=9,0; 7,8Hz,
H-2’); 3,12 (J=9,0Hz, H-3’); 2,64 (J=9,0Hz, H-4’); 3,24 (H-5’), os sinais em δ 3,67
(J=11,7; 6,6Hz, H-6’) e o multipleto em δ 3,86 (H-6’) auxiliaram na atribuição dos
deslocamentos químicos da unidade glucosídica (Tabela 50).
181
Tabela 50: Correlações do mapa de contorno HMQC de Pc 3
9
6
5
10
11
12
N
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
3
19
18
H
14
H
H
15
17
16
CO2 CH3
22
º
N do C
δ
13
C
DEPT
5
6
9
10
11
12
14
138,0
114,8
122,7
120,9
129,6
113,2
41,1
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH2
15
17
18
20
21
35,0
153,9
136,0
49,0
97,1
51,8
99,9
74,5
77,6
71,6
77,9
62,8
CH
CH
CH
CH
CH
CH3
CH
CH
CH
CH
CH
CH2
-OCH3
1’
2’
3’
4’
5’
6’
δ
1
H multiplicidade (J Hz) / CD3OD
8,24 d (5,2)
7,96 d (5,2)
8,16 d (8,0)
7,24 t (8,0)
7,50 t (8,0)
7,61 d (8,0)
α 2,64 m
β 3,12 m
3,50 m
7,51 s
6,59 (largo)
3,71 m
5,50 d (6,3)
3,75
4,43 d (7,8)
2,47 dd (9,0; 7,8)
3,12 t (9,0)
2,64 t (9,0)
3,24 m
3,86 m
No mapa de contorno COSY foram observadas correlações entre os sinais
em δ 8,24 (H-5) e 7,96 (H-6); em δ 8,16 (H-9) e em δ 7,24 (H-10); em δ 7,50 (H-11) e
δ
7,61 (H-12) e em δ 7,50 (H-11) com o tripleto em δ 7,24 (H-10) relativos à unidade
β-carbolínica.
As correlações entre os hidrogênios metilênicos H-14 em δ 3,12 e 2,64
182
e o multipleto em δ 3,50 (H-15); entre o dubleto em δ 5,50 (H-21) e o multipleto em δ
3,71 (H-20) estão de acordo com a unidade monoterpênica proposta. A partir das
correlações entre os sinais em δ 4,43 (H-1’) e δ 2,47 (H-2’) e entre este e o tripleto
em δ 3,12 (H-3’); e entre δ 3,67 (H-6’) e δ 3,24 (H-5’); entre δ 3,24 (H-5’) e o tripleto
em δ 2,64 (H-4’) foi possível a atribuir os valores dos deslocamentos relativos aos
sinais da unidade glicosidica (Tabela 51).
Tabela 51: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc 3
9
6
5
10
N
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
o
N .do H
δ
1
5
9
11
8,24 d (5,2)
8,16 d (8,0)
7,50 t (8,0)
14β
15
3,12 m
3,50 m
21
1’
2’
6’
5’
5,50 d (6,3)
4,43 d (7,8)
2,47dd (9,0; 7,8)
3,67 dd (11,7; 6,6)
3,24 m
No.do H
6
10
12
10
14α
14α
14β
20
2’
3’
5’
4’
δ
1
7,96 d (5,2)
7,24 t (8,0)
7,61 d (8,0)
7,24 t (8,0)
2,64 m
2,64 m
3,12 m
3,71 m
2,47 dd (9,0; 7,8)
3,12 t (9,0)
3,24 m
2,64 t (9,0)
Finalmente, os dados espectroscópicos de RMN de 1H e
13
C de Pc 3 foram
comparados com os publicados para o lialosídeo (VALVERDE et al., 1999) – Tabela
52, um alcalóide isolado do gênero Palicourea, e mostraram-se concordantes quanto
aos valores dos deslocamentos da unidade β-carbolínica. Um levantamento
183
bibliográfico sobre a estrutura proposta para Pc 3 mostrou que esta substância é
inédita, sendo identificada neste trabalho como croceaina “B”.
Tabela 52: Dados de RMN de 13C e 1H do lialosídeo e de Pc 3
9
9
6
10
6
5
10
5
11
11
12
18
N
N
H
12
19
3
14
OGlc
20
H
21
Glc O
20
O
15H
H3CCO2
N
2
N
H
H
16
O
18
H
14
H
H
15
17
17
3
19
16
CO 2 CH3
22
*
0
N .C/H
δ
13
C
2
3
5
6
7
8
9
133,2
143,6
134,5
112,5
126,0
120,9
121,6
10
11
12
13
14α
119,0
127,7
118,8
140,2
32,5
β
15
16
17
18
30,1
109,8
151,7
118,7
19
20
21
22
1'
2'
3'
4'
5’
6'
134,0
42,9
95,8
166,6
50,8
98,7
73,0
77,3
70,0
62,6
CH3-O-
52,0
VALVERDE, 600 MHz
δ
Lialosídeo
H (JHz) / DMSO-d6
1
8,26 d (5)
7,92 d (5)
8,17 d (8)
7,21 t (8)
7,50 t (8)
7,55 d (8)
3,13 m
3,55 m
3,71 m
7,47 d (1,5)
4,75 d (17)
4,94 m
5,66 m
2,73 m
5,37 d (5)
4,56 d (8)
3,02 m
3,18 m
3,07 m
3,18 m
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
3,71
δ
13
C
138,8
141,7
138,0
114,8
127,2
122,5
122,7
120,9
129,6
113,2
140,8
41,1
35,0
112,7
153,9
136,0
143,1
49,0
97,1
169,5
99,9
74,5
77,6
71,6
77,9
62,8
51,8
Pc 3
1
δ H (JHz) / CD3OD
8,24 d (5,2)
7,96 d (5,2)
8,16 d (8,0)
7,24 t (8,0)
7,50 t (8,0)
7,61 d (8,0)
2,64 m
3,12 m
3,50 m
7,51 s
6,59 (largo)
3,71 m
5,50 d (6,3)
4,43 d (7,8)
2,47 dd (9,0; 7,8)
3,12 t (9,0)
2,64 t (9,0)
3,24 m
3,67 dd (11,7; 6,6)
3,86 m
3,75
184
9
6
5
10
N
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
184
185
9
6
5
10
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
N
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
185
186
9
6
5
10
N
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2 CH3
22
Espectro 56: Mapa de contorno HMQC (CD3OD) de Pc 3
186
187
9
6
5
10
N
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
187
188
9
6
5
10
N
11
12
2
N
H
H
H
21
Glc O
20
O
17
3
19
18
H
14
H
H
15
16
CO2CH3
22
Espectro 58: Expansão do mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc 3.
188
189
5.2.1.4 Identificação estrutural de Pc Ac
A substância codificada como Pc Ac foi obtida por acetilação da fração
MeOH:H2O, proveniente da partição em solventes de P. crocea, utilizando-se
anidrido acético.
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
14
15
H
17
CO2CH3
(Pc Ac)
A estrutura de Pc Ac foi identificada através da análise dos espectros de IV,
massas (ESEMAR), RMN de 1H,
13
C, DEPT, COSY, HETCOR, NOESY e por
comparação com os dados espectroscópicos obtidos de Pc 1.
IV, νmáx.KBr cm-1: 3412, 1707, 1630, 1439 (Espectro 59, pág. 196).
ESEMAR m/z (int. rel. %): 571.2241 [M + H]+ (100) Espectro 60, pág. 197.
13
C, DEPT (75,5 MHz /
CDCl3), δ ppm : dados descritos na Tabela 53, pág. 192 (Espectros 61, 62 e 63,
pág. 198, 199 e 200).
190
RMN 2D (1H x 1H COSY), 300,06 MHz / CDCl3: dados descritos na Tabela 54
, pág. 193 (Espectro 64, pág. 201).
RMN 2D (13C x 1H HETCOR), 75,5 MHz / CDCl3: dados descritos na Tabela
55, pág. 189 (Espectro 61, pág. 194).
RMN 2D (13C x 1H NOESY), 75,5 MHz / CDCl3: Dados descritos na Tabela 56,
pág. 195 (Espectros 66 e 67, págs. 203 e 204).
O espectro no IV de Pc-1 Ac (Espectro 59) mostrou bandas em 3412 cm-1
referente a absorções NH; em 1707 cm
-1
relacionada a grupo carbonila α,β-
insaturado; em 1630 banda correspondente a ligação dupla, e em 1439 cm
-1
referente à unidade aromática.
O espectro de massas de alta resolução (ESEMAR) de Pc Ac (Espectro 60,
pág. 197) apresentou pico em m/z 529.2256, consistente com a fórmula molecular
C27H32N2O9.
Os dados obtidos do espectro de RMN de 1H de Pc Ac (Espectro 61)
mostraram, além dos multipletos em δ 3,34-3,88 e 2,81-2,87 relacionados aos
hidrogênios metilênicos (H-5) e (H-6); o singleto em δ 6,48 (H-3) e os sinais
correspondentes aos hidrogênios aromáticos em δ 7,39 (d, J=7,5Hz, H-9); δ 6,95 (t,
J=7,5Hz, H-10); δ 7,01 (t, J=7,5Hz, H-11) e em δ 7,36 (d, J=7,5Hz, H-12) do sistema
tetraidro-β-carbolínico. A unidade secologanínica presente na estrutura de Pc Ac foi
evidenciada através dos sinais relativos ao multipleto em δ 3,04 (H-15); ao singleto
em δ 7,51 (H-17); ao duplo dubleto em δ 2,78 (J=8,7; 8,4, H-20) e dubleto em δ 4,95
(J=8,7Hz, H-21). Os dubletos em δ 4,81 (J=9,3Hz, H-1’); δ 3,88 (J=9,3Hz, H-2’); δ
191
4,55 (J=7,5Hz, H-3’); δ 3,55 (J=9,0Hz, H-5’), junto com os multipletos em δ 3,04 e
3,52/ 3,61 correspondentes a (H-4’) e (H-6’), mostraram a presença de uma unidade
glicosídica. O singleto em δ 5,43 (H-18) e os multipletos referentes aos hidrogênios
metilênicos em δ 2,05 e 2,76 (H-14) indicaram o ciclodiidropirano na estrutura de Pc
Ac.
Os espectros de RMN de
13
C e DEPT (Espectros 62 e 63) confirmaram a
presença do sistema tetraidro-β-carbolínico, apresentando os sinais em δ 49,9 (C-3);
41,3 (C-5); 21,8 (C-6) e os correspondentes aos carbonos aromáticos do núcleo
indólico em δ 131,6 (C-2); 107,8 (C-7); 126,2 (C-8); 117,8 (C-9); 119,4 (C-10); 121,9
(C-11): 111,6 (C-12) e 135,9 (C-13). O espectro de RMN de
13
C também mostrou os
sinais referentes à unidade secoiridoidal em δ 35,8 (C-15); 111,2 (C-16); 151,7 (C17); 45,5 (C-20); 98,4 (C-21); 167,6 (C-22) e 52,0 (-OCH3); bem como os
correspondentes aos carbonos metilênicos em δ 38,5 (C-14); metínico em δ 127,2
(C-18) e 138,9 (C-19); além dos relacionados à unidade glucosídica em δ 99,6 (C-1’);
73,2 (C-2’); 76,2 (C-3’); 68,3 (C-4’); 76,6 (C-5’) e 60,1 (C-6’).
A comparação dos dados de RMN 1H e de
13
C do produto acetilado com os
de Pc-1 (Tabela 53) comprovou a entrada do grupo acetil no átomo de nitrogênio do
anel C (-Nβ). Os espectros de RMN 1H e de
13
C / DEPT mostraram sinais adicionais
em δ 170,0 (C=O) e δH 2,10 / δC 21,1 (-NCOCH3), condizentes com a presença do
grupo acetil na estrutura de Pc-1 Ac. O espectro de RMN de
1
H de Pc Ac
apresentou valor diferente para o deslocamento químico do singleto relativo ao H-3
(em δ 4,94 para Pc 1 e em δ 6,48 para Pc Ac). Do mesmo modo, o espectro de
13
C
também mostrou deslocamento do sinal relacionado a C-3 (em δ 53,7 para Pc 1 e
em δ 49,9 para Pc Ac).
192
Tabela 53: Dados de RMN de 13C e 1H de Pc 1 e Pc Ac
6
9
5
10
11
2
3
N
H
HH
12
Glc O
21
O
17
NR
19 H
18
20
14
H
15
Pc-1 R = H
PcAc R = Acetil
16
CO2CH3
22
0
N . H/ C
δ
13
C
2
3
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
134,3
53,7
41,8
22,0
108,6
128,4
118,8
119,9
122,4
112,4
138,0
40,1
15
16
17
18
19
20
21
22
1’
2’
3’
4’
5’
6’
37,5
112,2
153,5
135,1
142,9
49,0
98,9
169,5
100,4
74,7
77,8
71,4
78,6
62,6
-0CH3
-NCO2CH3
-NCO2CH3
52,0
δ
Pc 1
H (JHz) / CD3OD
1
4,94 s
3,08 - 3,14 m
2,78-2,84 m
7,40 d (7,5)
6,97 td (7,5; 1,2)
7,05 td (7,5; 1,2)
7,28 d (7,5)
α 2,14 ddd (15,9; 9,3; 1,0)
β 2,92 ddd (15,9; 8,0; 2,7)
3,30 m
7,5 s (largo)
5,85 s
2,82 m
5,16 d (9,0)
4,80 d (7,8)
3,16 dd (9,0; 7,8)
3,36 t (9,0)
3,07 t (9,0)
3,27 m
3,58 dd (12,0; 6,6)
3,84 dd (12,0; 2,4)
3,71 s
δ
13
C
131,6
49,9
41,3
21,8
107,8
126,2
117,8
119,4
121,9
111,6
135,9
38,5
35,8
111,2
151,7
127,2
138,9
45,5
98,4
167,6
99,6
73,2
76,2
68,3
76,6
60,1
52,0
21,1
170,0
δ
Pc Ac
H (JHz) / CDCl3
1
6,48 s
3,34 - 3,88 m
2,81-2,87 m
7,39 d (7,5)
6,95 t (7,5)
7,01 t (7,5)7,36 d (7,5)
2,05 m
2,76 m
3,04 m
7,51 s
5,43 s
2,78 dd (8,7; 8,4)
4,95 d (8,7)
4,81 d (9,3)
3,88 d (9,3)
4,55 d (7,5)
3,04 m
3,55 d (9,0)
3,52 m
3,61 m
3,7 s
2,10
193
A análise das correlações nos mapas de contorno COSY e HETCOR
(Espectro 64 e 65, pág 201 e 202) auxiliou na atribuição dos hidrogênios e carbonos
de Pc Ac. O mapa de contorno COSY mostrou, entre outras, correlações entre os
hidrogênios aromáticos em δ 7,39 (H-9) e 6,95 (H-10); em δ 7,36 (H-12) e 7,01 (H11). Também foram observadas correlações correspondentes ao duplo dubleto em δ
2,78 (H-20) e 4,95 (H-21) e 2,78 (H-20) e 3,04 (H-15) da unidade secoiridoidal
(Tabela 54).
Tabela 54: Correlações homonucleares no mapa de contorno COSY de Pc Ac
9
6
10
5
11
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
n .H
δ
19
H
18
20
14
15
H
17
o
N Ac
3
1
CO2CH3
o
δ
n .H
1
9
7,39 d (7,5)
10
6,95 t (7,5)
12
7,36 d (7,5)
11
7,01 t (7,5)
21
4,95 d (8,7)
20
2,78 dd (8,7; 8,4)
15
3,04 m
20
2,78 dd (8,7; 8,4)
As
correlações
observadas
no
mapa
de
contorno
HETCOR
estão
apresentadas na Tabela 55. Destaca-se aqui a correlação entre os sinais referentes
ao carbono metínico em δ 49,9 (C-3) e o singleto em δ 6,48 (H-3), além da
correlação entre o carbono olefínico em δ 127,2 (C-18) e o singleto em 5,43 (H-18)
que auxiliaram a atribuição dos sinais relacionados com H-3 e H-18.
194
Tabela 55: Correlações do mapa de contorno HETCOR de Pc Ac
9
6
10
5
11
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
14
15
H
17
º
O
N C CH3
3
CO2CH3
13
DEPT
3
49,9
CH
6,48 s
5
41,3
CH2
3,34 - 3,88 m
6
21,8
CH2
2,81-2,87 m
9
117,8
CH
7,39 d (7,5)
10
119,4
CH
6,95 t (7,5)
11
121,9
CH
7,01 t (7,5)
12
111,6
CH
7,36 d (7,5)
14
38,5
CH2
2,76 m e 2,05 m
15
35,8
CH
3,04 m
17
151,7
CH
7,51 s
18
127,2
CH
5,43 s
20
45,5
CH
2,78 dd (8,7; 8,4)
21
N do C
δ
C
δ
1
H multiplicidade (J Hz) / CDCl3
98,4
CH
4,95 d (8,7)
’
1
99,6
CH
4,81 d (9,3)
’
2
73,2
CH
3,88 d (9,3)
’
3
76,2
CH
4,55 d (7,5)
’
4
68,3
CH
3,04 m
’
5
76,6
CH
3,55 d (9,0)
’
6
60,1
CH2
3,52 e 3,61m
-0CH3
52,0
CH3
3,70 s
-NCOCH3
21,1
CH3
2,10
195
O mapa de contorno NOESY (Espectros 66 e 67, págs. 203 e 204; Tabela
56) mostrou correlações entre os sinais correspondentes aos hidrogênios aromáticos
em δ 7,01 (H-11) e o dubleto em δ 7,36 (H-12) e em δ 6,48 (H-3) e o multipleto em δ
3,34-3,88 (H-5). A correlação entre o singleto em δ 6,48 (H-3) e o singleto em δ 5,43
(H-18) mostrou que H-3 e H-18 estão próximos. As correlações entre os sinais
correspondentes ao H-3 em δ 6,48; ao H-20 em δ 2,78; e, ao H-21 em δ 4,95
mostraram estes hidrogênios do mesmo lado da molécula.
Tabela 56: Correlações do mapa de contorno NOESY para Pc Ac.
9
6
10
5
11
N C CH3
3
N
H H
H H
12
GlcO
19
o
δ
1
H multiplicidade (JHz)
9,21
14
15
H
17
n . do H
N-H
(indólico)
H
18
20
21
O
O
CO 2CH3
o
n . do H
3
12
12
5
18
20
21
11
3
7,01 t (7,5)
6,48 s
15
3,04 dd (15,9; 8,4)
-NCOCH3
14β
21
4,95 d (8,7)
1’
4,81 d (9,3)
5
20
1’
20
3’
2’
3,88 d (9,3)
-NCOCH3
4’
δ
1
H multiplicidade (JHz)
6,48 s
7,36 d (7,5)
7,36 d (7,5)
3,34 – 3,88 m
5,43 s
2,78 dd (8,7; 8,4)
4,95 d (8,7)
2,1 s
2,81 m
3,34 – 3,88 m
2,78 dd (8,7; 8,4)
4,81 d (9,3)
2,78 dd (8,7; 8,4)
4,44 d (7,5)
2,1 s
3,04 m
196
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 59: Espectro no IV (pastilhas de KBr) de Pc Ac
196
197
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 60: Espectro de massas de alta resolução, ESEMAR de Pc Ac
197
198
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 61: Espectro de RMN de 1H, (300 MHz / CD3OD) de Pc Ac
198
199
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 62: Espectro de RMN de 13C (75,5 MHz / CD3OD) de Pc Ac
199
200
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO 2CH3
Espectro 63: Espectro de RMN de 13C, DEPT (75,5 MHz / CD3OD) de Pc Ac
200
201
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 64: Mapa de contorno COSY (CD3OD) de Pc Ac
201
202
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO 2CH3
Espectro 65: Mapa de contorno HETCOR (CD3OD) de Pc Ac
202
203
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 66: Mapa de contorno NOESY em CD3OD de Pc Ac
203
204
9
6
10
5
11
N Ac
3
N
H H
H H
12
GlcO
21
O
19
H
18
20
15
14
H
17
CO2CH3
Espectro 67: Expansão do mapa de contorno NOESY em CD3OD de Pc Ac
204
205
5.3 Estudo farmacológico do extrato bruto de P. crocea
O estudo farmacológico do extrato bruto de P.crocea compreende os
resultados das avaliações de suscetilibidade antibacteriana e antifúngica; atividade
5.3.1 Avaliação da suscetibilidade antibacteriana e antifúngica
A suscetibilidade antibacteriana e antifúngica foi avaliada pelo método de
microdiluição. A Tabela 57 apresenta concentrações mínimas inibitórias (CMI) e
concentrações mínimas bactericidas (CMB), do extrato bruto de P.crocea dissolvido
em DMSO, ante às bactérias Staphilococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli
e Pseudomona aeruginosa. A Tabela 57 também mostra concentração mínima
inibitória (CMI) e concentração mínima fungicida (CMF) do extrato bruto de P crocea
em DMSO, ante o fungo Candida albicans.
Tabela 57: Dados de suscetibilidade antibacteriana e antifúngica
Palicourea crocea
(extrato bruto dissolvido em DMSO)
Microorganismo
CMI
CMB
S. aureus
µ g/ mL
> 1000
µ g/ mL
> 1000
B. subtilis
>
1000
>
1000
E.coli
>
1000
>
1000
P. aeruginosa
>
1000
>
1000
CMF
>
Candida albicans
(CMI, CMB, CMF: > 500 µg/ mL inativa;
ativa; > 7,8 µg/ mL fortemente ativa)
>
1000
>
1000
250 – 125 µg/ mL moderadamente ativa;
>
15,6 µg/ mL
206
A análise dos dados apresentados pela Tabela 57 mostrou que o extrato
bruto da planta P. crocea não foi ativo diante dos microrganimos testados. A
concentração mínima inibitória do extrato bruto foi maior que 1000 µg/mL para todos
os casos.
5.3.2 Avaliação da atividade antiedematogênica
A atividade antiedematogênica foi verificada através da reação inflamatória ao
óleo de cróton aplicado na orelha de camundongo. A Tabela 58 mostra que a
aplicação tópica de 20 µL em dose única, da solução de extrato bruto de P.crocea
em acetona (2,5 mg/orelha) não provocou redução significativa na intensidade da
resposta inflamatória. Assim, os dados indicam que o extrato bruto de P.crocea não
apresentou efeito antiedematogênico neste modelo experimental.
Tabela 58: Efeito da aplicação tópica do extrato bruto de P.crocea em edema
de orelha induzido por óleo de cróton.
Tratamento
Inibição
(%)
Controle
Ä Aumento do peso da orelha
(mg)
6,08 ± 0,47
Extrato bruto de P.crocea
5,2 ± 0,33
9,08
Óleo de cróton (200 µg/orelha) foi utilizado como agente irritante. A solução de extrato bruto em
acetona foi administrada em dose única (2,5 mg/orelha). Valores representam a média ± E.P.M. de 11
a 22 camundongos. P < 0,001 comparado com o controle, ANOVA (teste de Tukey).
207
5.3.3 Avaliação da atividade moluscicida
A avaliação da atividade moluscicida do extrato bruto de P.crocea dissolvido
em DMSO também não mostrou alteração dos batimentos cardíacos dos caramujos
da espécie Biomphilaria glabrata, hospedeiro intermediário do parasita Shistosoma
mansoni, causador da esquistossomose. Assim, os resultados deste ensaio
indicaram que o extrato bruto de P.crocea não é ativo sobre o caramujo transmissor
da esquistossomose.
5.3.4 Avaliação da atividade antiproliferativa
A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada com o extrato bruto da
planta P.crocea em células tumorais humanas de melanoma (UACC.62), mamárias
(MCF.7), pulmonares pequenas (NCI.460), leucêmicas (K.562), ovárianas (OVCAR),
prostáticas (PCO.3), de cólon de útero (HT.29), renais (786.O) e mamárias
resistentes (NCI.ADR).
A análise dos dados da Figura 6 indicou diminuição do crescimento de
células leucêmicas (K.562), que não se manteve em concentrações maiores de
extrato bruto. Também foi observado diminuição do crescimento de células tumorais
renais (768.O) e pulmonares pequenas (NCI.460), mas em concentrações altas e
estes resultados não podem ser considerados como efeito antiproliferativo.
208
Ensaio 020416 - Paulicorea craccea
100
Porcentagem de Crescimento
75
50
25
0
UACC.62
MCF.7
NCI.460
K.562
OVCAR
PC0.3
HT.29
786-0
NCI.ADR
-25
-50
-75
-100
-3
10
0
-2
10
-1
10
0,25
0
1
10
2
10
2,5
10
25
250
Concentração (µg/mL)
Figura 6: Ensaio de atividade antiproliferativa do extrato bruto metanólico da
planta P. crocea
209
6 CONCLUSÃO
O estudo químico das folhas e galhos da planta C.glabratus resultou no
isolamento do alcalóide heteroioimbínico pentacíclico tetraidroalstonina (Cg 4), dos
oxindóis heteroioimbínicos pentacíclicos mitrafilina (Cg 5) e uncarina “E” (Cg 9); dos
triterpenos ácido ursólico (Cg 3) e ácido 3-O-β-D-quinovopiranosídeo-28-O-βglucopiranosídeo quinóvico (Cg7), do ácido clorogênico 5-O-cafeoilquínico (Cg 8) e
do esteróide sitosterol (Cg 6).
O isolamento dos alcalóides tetraidroalstonina, mitrafilina e uncarina “E” da
espécie
Cephalanthus
glabratus
é
descrito
pela
primeira
vez
no
gênero
Cephalanthus. Os alcalóides desta classe são considerados importantes marcadores
taxonômicos e constituem o perfil alcaloidal dos gêneros Uncaria e Mitragyna. O
isolamento de mitrafilina e uncarina “E” em Cephalanthus revela com clareza a
afinidade existente entre estes gêneros e como, na literatura, não existe uma
metodologia taxonômica definida; este dado é essencial para classificação,
ratificando-se esta espécie na tribo Naucleeae.
Da espécie vegetal P. crocea foram isolados dois alcalóides indólicos inéditos,
sendo um tetraidro-β-carbolínico (Pc 1) identificado como croceaina “A” e o outro βcarbolínico, identificado como croceaina “B” (Pc 3). Isolou-se também o alcalóide Pc
2, que se trata do hidrocloreto de Pc 1, provavelmente formado durante os
procedimentos de isolamento.
A substância croceaina “A” (Pc 1) foi acetilada e produziu o derivado acetilado
(Pc Ac), que contribuiu para a elucidação estrutural de Pc 1, evidenciando o efeito
do grupo acetil sobre o valor do deslocamento químico (δH/ δC) na posição C-3 nos
espectros de RMN de 1H e de 13C.
210
Os alcalóides obtidos de P. crocea e a braquicerina, um outro alcalóide
indólico monoterpênico glicosilado da mesma classe, inédito e mencionado
recentemente na literatura, sugerem a existência de um caminho biossintético
alternativo para estes metabólitos secundários.
O estudo das atividades farmacológicas dos extratos brutos das espécies
vegetais P. crocea e C. glabratus não apresentou resultados positivos para os
ensaios antibacteriano, antifúngico, moluscicida e antiproliferativo.
O teste de atividade antiedematogênica do extrato bruto da planta
Cephalanthus glabratus foi o único que exibiu um resultado significativo,
possivelmente causado pela presença dos triterpenos: ácido ursólico e ácido 3-O-βD-quinovopiranosídeo-28-O-β-glucopiranosídeo
quinóvico,
cujas
atividades
antiinflamatórias estão descritas na literatura.
Com a realização deste trabalho estamos contribuindo para ampliar os
conhecimentos sobre as espécies presentes na planície de inundação do alto rio
Paraná, região de Porto Rico, especialmente daquelas pertencentes à grande
Família Rubiaceae. Esperamos que os dados aqui descritos possam auxiliar, de
alguma forma, a realização de trabalhos futuros nesta área.
211
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218
8 ANEXO: TRABALHOS PUBLICADO E SUBMETIDO
219
220
221
222
Alkaloids from Cephalanthus glabratus (Rubiaceae)
Tereza Cristina Marinho Jorge a, Ana Paula Ozima a, Lilian Tatiani
Düsman a, Maria Conceição de Souza b, Giovana Faneco Pereira b, and
Maria Helena Sarragiotto a, *
a
Departamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, Avenida Colombo, 5790,
Maringá 87020-900 PR, Brazil
b
Departamento de Biologia/NUPELIA, Universidade Estadual de Maringá, Avenida
Colombo, 5790, Maringá 87020-900 PR, Brazil
_________________________________________________________________________
Keywords: Cephalantus glabratus; Rubiaceae; Tetrahydroalstonine; Mitraphylline;
Uncarine E.
___________________________________________________________________________
1. Subject and source
Cephalanthus glabratus K. Schum. (Rubiaceae) is a shrub, which grows in Brazil,
Uruguay and Argentine. Plant material was collected in riparian vegetation of the Upper
Paraná River floodplain in Porto Rico-PR, Brazil, in December 2002. A voucher specimen is
deposited at the Herbarium of the Nupélia - Universidade Estadual de Maringá (HNUP 2971).
2. Previous work
No reporter on the chemical investigation of Cephalanthus glabratus species was found in
literature. Previous works on the genus are limited to two species. Cephalanthus occidentalis
has
been
shown
to
contain
the
indole
alkaloids
isorhynchophylline
and
anti-
isorhynchophylline N-oxide, rhynchophylline and its N-oxide, dihydrodrocorynanteine, and
hirsutine (Phillipson and Hemingway, 1974). Chemical investigation on Cephalanthus
spathelliferus showed the presence of umbelliferone, skimmin, 7,4’-dimethylkaempferol, and
7,4’-dimethylaromadendrin and its glucoside (Lima and Polonski, 1973).
223
3. Present study
The dried leaves (136 g) of C. glabratus were extracted by maceration with MeOH. The
methanolic extract (14.0 g) was dissolved in MeOH: H2O 1:1 and partitioned with n-hexane,
CHCl3 and AcOEt. One part of resulting CHCl3 fraction (570.0 mg) was subjected to CC on
silica gel (20 g) eluting with mixtures of increasing polarities of n-hexane:CHCl3 and
CHCl3:MeOH to give 8 fractions. The fraction 3, eluted with n-hexane:CHCl3 (7:3), yielded
3.4 mg of the heteroyohimbine-type alkaloid tetrahydroalstonine (Lounasmaa and Kan, 1980).
The addition of CHCl3 to the fraction eluted in CHCl3:MeOH 1:1 (fr 6, 129.5 mg) afforded
46.9 mg of a white solid identified as the triterpene ursolic acid (Mahato, 1994). Evaporation
of the liquor mother gives a solid residue, which was purified on preparative TLC (silica gel,
n-hexane: AcOEt 50%) to afford the oxindoles mitraphylline (3.5 mg) and uncarine E (3.8
mg) (Hiroko et al, 1993). The isolated compounds were identified by comparing their
spectroscopic data (IR, MS, 1H and 13C NMR) with those reported in literature.
4. Chemotaxonomic significance
The Cephalanthus genus is a member of the tribe Naucleeae, sensu lato and subtribe
Cephalanthinae, sensu. Intratribal classifications and generic delimitations in Naucleeae have
long been controversial and were subject of several studies. On the basis of molecular data
Razafimandimbison and Bremer (2002) considered the subtribe Cephalanthinae, with only the
genus Cephalanthus, as basal and sister to the rest of the Naucleeae.
Oxindole alkaloids are found in Uncaria and Mitragyna, two other genera of the tribe
Naucleeae and in Cephalanthus occidentalis. Mytraphilline was isolated from Uncaria
guianensis (Laus and Keplingler, 2003; Carbonezi et al, 2004), U. tomentosa (Wagner et al,
1985; Muhammad et al, 2001), U. elliptica (Diyabalanage et al, 1997; Herath et al, 1979), U.
glabrata (Arbain et al, 1993), U. attenuata (Tantivatana et al, 1980), U. quadrangularis
(Tantivatana et al, 1979), U. orientalis (Croquelois et al, 1977), U. longiflora (Phillipson and
Hemingway, 1973), U. bernaysii and U. ferrea (Johns and Lamberto, 1966), and from
Mitragyna stipulosa (Lala, 1985), and M. rubrostipulata (Shellard an Lala, 1978). Uncarine E
was isolated from Uncaria tomentosa (Muhammad et al, 2001), U. guianensis (Lee et al,
1999), U. glabrata (Arbain et al, 1993), U. orientalis (Croquelois et al, 1977) and Mitragyna
parvifolia (Shellard et al, 1968).
224
The isolation of mitraphylline and uncarine E from Cephalanthus glabratus suggested an
affinity between the genus Uncaria, Mitragyna and Cephalanthus within of the tribe
Nauclaeeae. These data can to contribute to the concept of monophyly suggested by
Razafimandimbison and Bremer (2002) for the genera Cephalanthus, Mitragyna and Uncaria.
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tese final 10.11.05 - DQI

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