Etest® ESBL Cefotaxima/cefotaxima + ácido

Etest® ESBL
Cefotaxima/cefotaxima + ácido clavulânico (CT/ CTL) e Ceftazidima/ceftazidima + ácido
clavulânico (TZ/ TZL)
Para confirmação in vitro de ESBL
USO
Etest® ESBL são fitas com: Cefotaxima/cefotaxima + ácido clavulânico (CT/ CTL) e
Ceftazidima/ceftazidima + ácido clavulânico (TZ/ TZL) projetadas para confirmar a presença de
enzimas ESBL (beta-lactamase de espectro estendido) inibíveis pelos ácidos clavulânicos em
E. coli, K. pneumoniae e K. oxytoca. A suspeita da presença de ESBL em cepas com padrões
fenotípicos de sensibilidade onde os valores da CIM do aztreonam, do cefotaxima, do
ceftazidima, do ceftriaxone ou do cefpodoxima são 1 µg/ml, pode ser confirmada usando
ambas as fitas Etest CT/CTL e TZ/TZL.
INTRODUÇÃO
ESBLs são enzimas plasmídeos-mediadas que evoluíram através de pontos de mutação nas
combinações dos pares de aminoácidos TEM e enzimas SHV. Embora ESBLs variem em suas
afinidades pelos substratos -lactâmicos e enzimas cinéticas, elas essencialmente inativam
todas as penicilinas e cefalosporinas. São inibidas geralmente pelos inibidores -lactamase tais
como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam, mas enzimas ESBL TEM (IRT)
resistentes ao inibidor foram relatadas. Atualmente ESBLs não são ativas contra cefamicinas e
aos carbapenêmicos. Múltiplas enzimas ESBL (1 a 5) e cromossomicamente ou plasmídeo
codificado Amp C -lactamases podem simultaneamente ser produzidos no mesmo isolado
clínico. Os plasmídeos que codificam ESBL podem também carregar genes da resistência para
trimetoprim/sulfametoxazole e aminoglicosídeos. A resistência cromossomal da fluoroquinolona
é geralmente encontrada em cepas produtoras de ESBL.
ESBLs foram selecionadas por após muitos anos do uso extensivo das cefalosporinas de
amplo espectro como o ceftazidima. Embora K.pneumoniae, E. coli fossem os principais
patógenos produtores de ESBLs, mais recentemente K. oxytoca, E. cloacae, E. aerogenes, S.
marcescens, C. diversus, P. stuartii, P. mirabilis, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. cepacia e
Acinetobacter spp foram incluídos também. ESBLs são freqüentemente produzidas por
patógenos hospitalares encontrados em unidades de terapia intensiva, em oncologia, em
unidades de queimados e neonatal, home cares e nas infecções associadas com cateteres.
Diversos surtos de ESBL ocorreram nos EUA, América do Sul e Europa ocidental e a
prevalência tem aumentando mundialmente.
Além de ser associada com o morbidade e o mortalidade elevadas, poucas opções
remanescem para o tratamento das infecções que envolvem as ESBLs. A eficácia da terapia
com -lactâmicos, incluindo as cefalosporinas de amplo espectro é comprometida, enquanto a
co-resistência ao sulfametoxazol, aos aminoglicosídeos e as fluoroquinolonas tem sido
relatada. Conseqüentemente, a detecção acurada in vitro de ESBLs é essencial guiar a
escolha da terapia. Os métodos atuais de sensibilidade não são úteis para a detecção de ESBL
porque os valores CIM e os tamanhos dos halos dos produtores de ESBL se sobrepõem com
aqueles das cepas suscetíveis. O CLSI recomenda critérios de triagem para ESBL de CIM 2
µg/ml de cefpodoxima ou ceftazidima ou cefotaxima ou ceftriaxone ou aztreonam, ou diâmetros
de halo
22 mm para a cefpodoxima ou ceftazidima,
27mmo para o aztreonam ou
cefotaxima ou 25 mm para o ceftriaxone. Os critérios confirmatórios do CLSI das CIMs para
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ESBL são uma redução de diluições de
presença de 4 µg/ml do ácido clavulânico.
3 log2 para o cefotaxima ou o ceftazidima na
PRINCIPIO
As fitas de Etest ESBL CT/CTL e TZ/TZL (figura 1) consistem de uma fita plástica fina, inerte,
não porosa (5 x 60 mm). De um lado calibradas com escalas de leitura de CIM em µg/ml de um
lado enquanto superfície reversa possui dois gradientes pré-definidos. O código CT para
cefotaxima (0.25-16 µg/ml) e CTL para o cefotaxima (0.016-1 µg/ml) mais 4 µg/ml de ácido
clavulânico e o código TZ para ceftazidima (0.5-32 µg/ml) e TZL para ceftazidima (0.064-4
µg/ml) mais 4 µg/ml de ácido clavulânico. O teste é ajustado acima como um procedimento
padrão de CIM do Etest MIC, entretanto, duas elipses da inibição no alinhamento opondo-se
podem aparecer nas extremidades da tira (figura 4).
O teste deve ser feito com ambas às fitas CT/CTL e TZ/TZL. A prsençã de ESBl é confirmada
pelo aparecimento de zona fantasma ou deformação das elipses do CT ou TZ (LEITURA E
INTERPRETAÇÂO, figuras 5 e 6) ou quando a CIM do CT ou TZ são reduzidas em diluições
3 log2 na presença de ácido clavulânico.
Figura 1. Configuração da fita de Etest ESBL
EMBALAGEM
As fitas de Etest vem em embalagens com 10 compartimentos selados individualmente,
contendo 3 ou 10 unidades em cada um; cada conjunto contém 30 ou 100 fitas de um
antibiótico.
Agente
Código
Apresentação
Cefotaxima/Cefotaxima + ácido clavulânico
CT/CTL
30 ou 100 fitas
Ceftazidima/Ceftazidima + ácido clavulânico
TZ/TZL
30 ou 100 fitas
ARMAZENAMENTO
Todas as embalagens devem ser conservadas a - 20ºC até a data de validade. As fitas de
Etest da embalagem aberta devem ser armazenadas em lugar seco ou tubo com dessecante a
- 20ºC. As fitas armazenadas e manuseadas corretamente podem ser usadas ate a data de
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validade. O número do lote e a data de validade estão impressos na embalagem. O lote e a
data de validade devem ser marcados no tubo de armazenamento.
MANUSEIO
Remover as fitas do freezer e aguardar aproximadamente 30 minutos para que atinjam a
temperatura ambiente (se á -70ºC, 60 minutos). A água de condensação da superfície externa
deve ser totalmente evaporada antes da abertura. Inspecione a embalagem e os tubos de
armazenamento e não use as fitas caso estas estes estejam danificadas.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS
.Etest ESBL deve ser utilizado somente para diagnóstico "in vitro".
.Embora o procedimento do Etest seja simples de realizar, a interpretação do teste deve ser
supervisionada por pessoal treinado em técnicas de teste de sensibilidade.
.Técnicas assépticas devem ser observadas sempre que se manipular espécimes, além de
esterilizar placas após o uso, antes de descartar.
.Quando não estiverem sendo utilizadas as fitas devem ser protegidas a todo o momento da
umidade, calor e exposição direta á luz forte.
.Não tocar ou raspar a superfície da fita com o gradiente do antibiótico.
.As fitas são extremamente finas e leves. Observar que estejam separadas quando usar.
.Devido à liberação imediata dos reagentes em contato com o agar, a fita não deve ser movida
após a aplicação.
.Observar que as fitas devem ter o seu gradiente colocado em contato com o agar. Se
colocada incorretamente, nenhum elipse se formará porque os reagentes não podem difundir
através da tira plástica não porosa.
. Consulte as referências de Etest e as guias técnicos ( www.abbiodisk.com) e leia
completamente o manual de instrução antes de usar Etest ESBL.
PROCEDIMENTO
- Materiais necessários, mas não fornecidos:
Agar Mueller Hinton(1)com profundidade de 4.0 ± 0.5 mm.
Salina estéril (NaCl 0.85% )
Alças estéreis, swabs, tubos de ensaio, pipetas, pinça, placas, tesoura.
Padrão 0.5 McFarland
Estufa 35º-37ºC
Cepas padrão.
Tubos com dessecante para guardar as fitas restantes.
Preparo do Inóculo
Homogeneizar bem as colônias isoladas a partir de uma placa de 24 horas em caldo adequado
para encontrar a turvação adequada comparando com a escala 0,5 de McFarland. Quando o
inóculo está correto haverá um crescimento confluente ou quase confluente após a incubação.
Realize contagens regulares para verificar se o seu procedimento oferece a correta
densidade em termos de UFC/ml.
Nota:
Como a quantidade de ESBL é dependente do inóculo, este quando demasiado pesado ou
fraco pode afetar resultados. O excesso de enzima pode extinguir o ácido clavulânico do teste
e reduzir potencialmente o grau de inibição da enzima. Assim a relação da CIM CT/CTL ou
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TZ/TZL pode diminuir e dar um resultado negativo falso. No contrário, pouca enzima pode dar
uma CIM de CT ou TZ mais baixa, outra vez afetando a relação de CT/CTL e de TZ/TZL.
Inoculação
Mergulhe o swab estéril e não tóxico (não gire muito firmemente) na suspensão do inoculo.
Remova o excesso pressionando o swab contra a parede do tubo. Semeie em três direções,
girando a placa aproximadamente 90º graus a cada vez. Aguardar cerca de 15 minutos para
que o excesso de umidade seja absorvido e então só com a superfície completamente seca
aplique as fitas de Etest.
Aplicação
Abra a embalagem do Etest como descrito no MANUSEIO. Com o auxílio de uma pinça
remova o número de fitas de Etest e coloque-as em uma superfície limpa e seca, por exemplo,
em uma placa de Petri ou em na bandeja do aplicador do Etest (fig. 2 e 3). Observar que a
escala numérica está na face superior, e não em contato com o agar. Colocar a fita com a
concentração máxima na periferia da placa; pressione a fita no agar para evitar formação de
bolhas. Uma vez aplicada no agar, a posição da fita não pode ser modificada.
Fig2
Fig 3
Fig2. Fitas de Etest em um aplicador
Fig3. Aplicação das fitas de Etest com o aplicador de Etest manual
Incubação
Incubar por 35ºC por 16-18 h em ar ambiente.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Leitura
Quando o crescimento bacteriano é claramente visível, leia os valores da CIM do CT, CTL, TZ
e TZL onde as respectivas elipses da inibição cruzam a tira. O crescimento ao longo do
gradiente inteiro, isto é, nenhuma elipse da inibição indica que as CIM são o valor o mais
elevado na escala de leitura. Uma elipse da inibição abaixo do gradiente indica uma CIM mais
baixa que o valor da escala.
Quando colônias mutantes estão presentes no interior da elipse, leia a CIM onde estas colônias
são inibidas. Para o CT e TZ os valores da CIM na escala elevada, as elipses da inibição
podem ser muito pequenas ou não claramente distinguíveis. Ocasionalmente, uma zona extra
(zona fantasma) pode ser vista entre as seções de CTL ou TZL (figura 5). As elipses da
inibição do CT ou TZ podem também ser deformadas em afilando-se no término (figura 6). A
presença de zona fantasma ou deformação da elipse indica a produção de ESBL e é devido ao
sinergismo entre CT e TZ e o ácido clavulânico que difunde transversalmente das seções de
CTL e TZL. Os diferentes padrões de crescimento-inibição são ilustrados nas figuras 4-7.
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PADRÕES DE CRESCIMENTO-INIBIÇÃO
Fig4: Claro corte de ESBL positivo: CIM CT/CTL = 1,5/0,047= 32
Fig5: Zona fantasma de inibição abaixo do CT indicativa de ESBL
Fig6: Deformação da elipse do TZ indicativa de ESBL
Fig7: Quando os valores da CIM estão abaixo ou acima dos valores da escala a interpretação
é não determinada (ND)
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Interpretação
Os resultados devem ser interpretados como descritos na tabela abaixo (Tabela 1)
ESBL
Positiva
Negativa
Não
determinada
(ND)
Relação CIM g/ml
CT 0,5 e CT/CTL 8
OU
TZ 1 e TZ/TZL 8
OU
Zona fantasma ou deformação da elipse
do CT ou TZ
CT 0,5 e CT/CTL 8
E
TZ 1 e TZ/TZL 8
CT
16 e CT/CTL 1
E
TZ 32 e TZ/TZL 4
OU
Quando uma fita é negativa e outra ND
Reporte
Produtora de ESBL
resistente a todas as
penicilinas, cefalosporinas e
aztreonam (ver CLSI
vigente)
Não produtora de ESBL
reportar as CIMs atuais de
todas as drogas relevantes
como encontradas pelo
método de CIM
Não determinável, reportar
as CIMs atuais de todas as
drogas relevantes como
encontradas pelo método
de CIM. Se for uma
suspeita produtora de ESBL
confirme os resultados pelo
método do CLSI e/ou
genotipagem
Exemplos de como interpretar os resultados e relações das CIM:
CT/CTL
8/0,125 = 64
= ESBL+
TZ/TZL
= ESBL+
32/ 0,064 = 500
CT/CTL
= ESBL+
1/ 0,016 = 62
CT/CTL
= ESBL4/ 1 = 4
1)
TZ/TZL
0,5 /0,25
= ESBL
CT/CTL
0,252) /0,19
= ESBL
TZ/TZL
1/42)
= ESBL
TZ/TZL
= Não 3)
32/ 4
CT/CTL
ESBL negativa e TZ/TZL ND
= Não Determinada4)
Notas:
1)
ESBL negativa quando CIM CT é 0,5 ou TZ é 1 g/ml
2)
Quando as CIMs do CTL ou TZL são mais altas que CT ou TZ, elas refletem a indução de
produção de -lactamase pelo ácido clavulânico
3)
Quando ambos os valores das CIMs estão acima dos intervalos do teste, a interpretação é
não determinada. Isto pode sugerir a presença de IRT (inibidor resistente TEM) ou Amp C
4)
Quando um resultado for negativo para ESBl e o outro ND, a interpretação para a cepa deve
ser ND
CONTROLE DE QUALIDADE
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O controle de qualidade de acordo com especificações esboçadas no PROCEDIMENTO para
verificar a qualidade dos reagentes e capacidade do teste escolhido confirmar a produção de
ESBL. Os valores das CIMs esperados e a interpretação para cepas controle estão na tabela 2.
E. coli ATCC 35218 produz TEM-1 -lactamase (não ESBL) e serve como controle negativo
para o teste. K. pneumoniae ATCC 700603, um genótipo ESBL positivo, serve como controle
positivo. Quando os valores das CIMs de CTL ou TZL estão acima das especificações, isto
poderia implicar da degradação do ácido clavulânico ou inoculo excessivamente elevado.
Verifique o armazenamento e a manipulação das fitas e repita o teste usando o inoculo correto.
Tabela 2. Especificações para o Controle de Qualidade das fitas de
TZ/TZL
Cepa
CIM ( g/ml)
Cefotaxima
Cefotaxima + Ac. Clavulânico
(CT)
(CTL)
2)
E. coli
0,25
0,016-0,064
ATCC 35218
K. pneumoniae
1-43)
0,025-1
ATCC 700603
CIM ( g/ml)
Ceftazidima
Ceftazidima + Ac. Clavulânico
(TZ)
E. coli
ATCC 35218
K. pneumoniae
ATCC 700603
0,5
Etest ESBL CT/CTL e
Interpretação1)
Negativa
Positiva
(TZL)
2)
8- 32
0,1252)
Negativa
0,25-1
Positiva
1)
Veja LEITURA E INTERPRETAÇÃO
Valor da CIM abaixo da escala da fita
3)
Deformação da elipse da CT pode ser observada
2)
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Diversos em estudos in vitro compararam o desempenho das fitas de Etest ESBL CT/CTL e
TZ/TZL aos métodos genotípicos de caracterização e aos métodos de diluição em agar e
critérios para ESBL do CLSI. O Etest detectou todas as enzimas produzidas em um total de 73
cepas caracterizadas genotipicamente em estudos realizados em locais independentes. A
comparação do desempenho do Etest ao CLSI baseou-se nas determinações de 479 isolados
clínicos conhecidos e organismos desconhecidos testados em três locais independentes (328
fenótipos positivos de ESBL e 151 controles negativos) é sumariada na tabela 3.
Tabela 3. Desempenho das fitas de Etest ESBL CT/CTL e TZ/TZL comparadas aos métodos
de referência do CLSI
Concordância de ESBL n (%)
CLSI ESBL +
CLSI ESBL -
Etest ESBL +
324 (99)
0
Etest ESBL -
0
144 (95)
Etest ESBL ND
4 (1)
7 (5)
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LIMITAÇÔES
1. As enzimas ESBL resistentes ao inibidor TEM (IRT) não podem ser detectados pelas fitas de
Etest ESBL.
2. Um resultado negativo de ESBL com o CIMs elevadas para CT/CTL e TZ/TZL podem ser
devido a um IRT, a Amp C ou a uma ESBL mascarada por estas enzimas ou por outros
mecanismos da resistência.
3. As cepas com resultados (ND) não determináveis devem ser mais investigadas com o
método de referência de NCCLS e/ou genotipagem.
4. O desempenho do teste confirmatório de Etest ESBL é baseado no uso de fitas de TZ/TZL e
de CT/CTL simultaneamente. O uso de tiras individuais não é recomendado
REFERÊNCIAS E BIBLIOGRAFIA
1. Cormican M.G. et al. Detection of extended spectrum ß-lactamases (ESBL)producing strains
by the Etest ESBLscreen. Journal of Clinical Microbiology, vol. 34, no.8, p.1880-1884, 1996.
2. Gales A.C. et al. Antimicrobial susceptibility of Klebsiella pneumoniae producing extended
spectrum ß-lactamase (ESBL)isolated in hospitals in Brazil. Brazilian Journal of Infectious
Disease, vol. 1, no.4, p.196-203, 1997.
3. Bolmström A. et al. Validation of new Etest ESBL strips for the detection and confirmation of
strains producing extended spectrum ß-lactamases (ESBL): a trial using FDA criteria for
susceptibility testing devices. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (ICAAC), poster no.898, 1999.
4. Nas Y. et al. Detection of extended spectrum ß-lactamases in E. coli and K. pneumoniae.
Journal of Chemotherapy, vol.11, no.2, p.103-106, 1999.
5. NCCLS M7-A5, January 2000. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for
bacteria that grow aerobically.
6. NCCLS M100-S series, latest edition. MIC supplemental tables.
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