“ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS

Transcrição

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
“ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS
GENÉTICOS Ile-58Thr y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala73Thr EN EL GEN CST3 y Ala-224Val EN EL GEN CTSD y SU
ASOCIACIÓN CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EN
PACIENTES DEL HOSPITAL ANDRADE MARÍN EN
ECUADOR”
PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO O TÍTULO DE:
INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA
ELABORADO POR:
CARLA GEOVANNA RODRÍGUEZ PROAÑO
SANGOLQUÍ, 25 de Febrero del 2013
HOJA DE LEGALIZACIÓN DE FIRMAS
ELABORADO POR:
Carla Geovanna Rodríguez Proaño
DIRECTORA DE LA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
Ing. Grace Tatiana Páez Barrera
DELEGADO UNIDAD DE ADMISIÓN Y REGISTRO
Abg. Carlos Orozco Bravo, MSc.
Sangolquí, 25 de Febrero del 2013
ii
CERTIFICACIÓN
Dr. Marcelo Grijalva
Ing. Paola Párraga
Certifican:
Que el trabajo titulado “ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS POLIMORFISMOS
GENÉTICOS Ile-58Thr Y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala-73Thr EN EL GEN CST3 y
Ala-224Val EN EL GEN CTSD Y SU ASOCIACIÓN CON LA ENFERMEDAD DE
ALZHEIMER EN PACIENTES DEL HOSPITAL ANDRADE MARÍN EN ECUADOR”,
realizado por Carla Geovanna Rodríguez Proaño, ha sido guiado y revisado
periódicamente y cumple normas estatutarias establecidas por la ESPE, en el
Reglamento de Estudiantes de la Escuela Politécnica del Ejército.
El mencionado trabajo consta de (un) documento empastado y (un) disco compacto el
cual contiene los archivos en formato portátil de Acrobat (pdf). Autorizan a Carla
Geovanna Rodríguez Proaño que lo entregue a Ing. Grace Tatiana Páez Barrera, en su
calidad de Coordinador de la Carrera.
Dr. Marcelo Grijalva
Ing. Paola Párraga
DIRECTOR
CODIRECTORA
iii
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD
CARLA GEOVANNA RODRÍGUEZ PROAÑO
Declaro que:
El proyecto de grado denominado ANÁLISIS DE FRECUENCIA DE LOS
POLIMORFISMOS GENÉTICOS Ile-58Thr Y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala73Thr EN EL GEN CST3 y Ala-224Val EN EL GEN CTSD Y SU ASOCIACIÓN
CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EN PACIENTES DEL HOSPITAL
ANDRADE MARÍN EN ECUADOR, ha sido desarrollado con base a una
investigación exhaustiva, respetando derechos intelectuales de terceros, conforme
las citas que constan al pie de las páginas correspondientes, cuyas fuentes se
incorporan en la bibliografía. Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.
En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y
alcance científico del proyecto de grado en mención.
iv
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
AUTORIZACIÓN
Yo, CARLA GEOVANNA RODRÍGUEZ PROAÑO
Autorizo a la Escuela Politécnica del Ejército la publicación, en la biblioteca virtual
de
la
Institución
del
trabajo
“ANÁLISIS
DE
FRECUENCIA
DE
LOS
POLIMORFISMOS GENÉTICOS Ile-58Thr Y Ala-9Val EN EL GEN MnSOD, Ala73Thr EN EL GEN CST3 y Ala-224Val EN EL GEN CTSD Y SU ASOCIACIÓN
CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EN PACIENTES DEL HOSPITAL
ANDRADE MARÍN EN ECUADOR”, cuyo contenido, ideas y criterios son de mi
exclusiva responsabilidad y autoría.
v
DEDICATORIA
A mis padres y a mi hermano, que han sido mi fuerza y apoyo para la
culminación de una etapa más de mi vida. Y lo más importante, por haberme dado
su amor incondicional.
Mamita mía sé que has hecho un gran esfuerzo para darme todo lo que
tengo y por eso esta tesis es para ti.
A mi Mamina, por haberme dado sus bendiciones, su apoyo y porque nunca
me ha dejado. Siempre estará presente en mi vida y en mi corazón.
vi
AGRADECIMIENTO
A mis padres, por estar en todo momento conmigo, por su amor y cariño. De
igual manera quiero agradecer a mi hermano, por los momentos alegres, risas,
enojos que me ha dado en toda mi vida. Siempre han llenado mi vida de felicidad y
sé que siempre nos apoyaremos como siempre lo hemos hecho.
A mi Mamina, abuelito Alfonso, tío Rommel, que siempre se han preocupado
por mí y me han ayudado en todas las formas posibles que se puede ayudar a una
persona.
A mi abuelito Enrique y abuelita Guillita, que desde el cielo me han cuidado.
Desde niña los he extrañado, pero siempre han estado en mi corazón.
A mis mejores amigos, Belu, Gordito, Pablito y Mono, por los grandes
momentos compartidos, diversión, tristezas a lo largo de toda mi vida. Agradezco
mucho haberles conocido desde el colegio y sé que nuestra amistad perdurará
para toda la vida. Los quiero muchísimo y gracias por su apoyo. Mi angelito
hermoso (Gordito) siempre estarás en mi corazón.
A mis amigos que encontré en la universidad: Majillo, Cheto, Estrella (Patricio
Orozco), porque sin esperar nada a cambio me brindaron su cariño, sus
vii
conocimientos y nos hemos apoyado a lo largo de nuestra carrera universitaria.
Encontré a unos grandes amigos.
A mis 16 años conocí a unas personitas muy importantes en mi vida, que
crecieron conmigo, me han apoyado, me han ayudado y puedo llamarles mis
mejores amigos, panitas, hermanos mayores, etc. Muchas gracias Caro, Michel,
Sebas y Natu, hermoso haberles conocido y hemos formado una gran amistad que
nunca terminará. Así como ustedes han estado para mí, yo estaré en lo que
ustedes necesiten.
De igual manera quisiera agradecer al Doctor Marcos Serrano, por haberme
ayudado a la recolección de muestras y al Hospital Carlos Andrade Marín.
A mi director Dr. Grijalva y codirectora Ing. Párraga, por el tiempo brindado
para que pueda finalizar mis estudios y por sus grandes enseñanzas que me
sirvieron y servirán a lo largo de mi profesión.
Quisiera expresar mi gratitud al Instituto de Genómica de la Universidad de
las Américas, en especial al Dr. César Paz-y-Miño, por haberme brindado la
oportunidad de realizar la tesis en el Instituto y por toda la ayuda brindada.
A todos mis compañeros del Instituto de Genómica, Majo, Santi A., Nadia,
Gaby J., Andy, Berni, Rouli, Jorge y Mariu por todos sus buenos consejos
viii
brindados a lo largo de mi estadía en el laboratorio. Por los buenos momentos y el
apoyo que me han dado.
Y por último, a todas las personas que intervinieron y/o colaboraron de
alguna u otra manera en la realización de esta tesis.
ix
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CERTIFICACIÓN .......................................................................................................... iii
DEDICATORIA ............................................................................................................. vi
AGRADECIMIENTO .................................................................................................... vii
LISTADO DE TABLAS ............................................................................................... xiii
LISTADO DE FIGURAS ............................................................................................. xiv
LISTADO DE ANEXOS .............................................................................................. xvi
NOMENCLATURA .................................................................................................... xvii
RESUMEN .................................................................................................................. xix
ABSTRACT ................................................................................................................. xx
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
1.1
Formulación del problema................................................................................. 1
1.2
Justificación del problema ................................................................................. 4
1.3
Objetivos ........................................................................................................... 7
1.3.1- Objetivo general ............................................................................................ 7
1.3.2- Objetivos específicos..................................................................................... 7
1.4
Marco Teórico ................................................................................................... 8
1.4.1- Enfermedades neurodegenerativas ............................................................... 8
x
1.4.2-
Superóxido dismutasa (SOD) ................................................................... 14
1.4.3-
Cistatina C ................................................................................................ 17
1.4.4-
Catepsina D.............................................................................................. 19
1.4.5-
Técnicas moleculares ............................................................................... 22
1.5
Hipótesis ......................................................................................................... 26
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................ 27
2.1
Participantes ................................................................................................... 27
2.2
Zona de Estudio .............................................................................................. 27
2.3
Periodo de tiempo de investigación ................................................................ 28
2.4
Diseño ............................................................................................................ 28
2.5
Procedimientos ............................................................................................... 28
2.5.1- Obtención de muestras ............................................................................... 28
2.5.2- Extracción de ADN a partir de muestras de sangre periférica...................... 29
2.5.3- Análisis cualitativo y cuantitativo del ADN extraído...................................... 31
2.5.4- Determinación del genotipo ......................................................................... 32
CAPÍTULO 3: RESULTADOS ..................................................................................... 44
3.1
Muestras Biológicas ........................................................................................ 44
3.2
Edad y Sexo ................................................................................................... 44
3.3
Extracción de ADN y cuantificación ................................................................ 45
3.4
Determinación del genotipo ............................................................................ 46
xi
3.4.1- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y RFLP del gen CTSD
(Ala-224Val) .......................................................................................................... 46
3.4.2- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y RFLP del gen CST3
(Ala-73Val) ............................................................................................................ 48
3.4.3- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del gen
MnSOD (Ile-58Thr) ................................................................................................ 51
3.4.4- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del gen
MnSOD (Ala-9Val) ................................................................................................. 52
3.5
Frecuencia de alelos ....................................................................................... 54
3.5.1- Polimorfismo MnSOD Ala-9Val (T>C).......................................................... 56
3.5.2- Polimorfismo CST3 Ala-73Thr (G > A)........................................................ 57
3.5.3- Polimorfismo CTSD Ala-224Val (C > T)....................................................... 58
3.6
Análisis estadístico ......................................................................................... 59
3.6.1- Pruebas de Chi-cuadrado ............................................................................ 59
3.6.2- Pruebas de Odds ratio................................................................................. 60
CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN.......................................................................................... 62
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES ................................................................................. 72
CAPÍTULO 6: RECOMENDACIONES......................................................................... 74
CAPÍTULO 7: BIBLIOGRAFÍA .................................................................................... 76
ANEXOS ............................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
xii
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1.1: Estimación y proyección de la población total y anciana, en 1990 y
2020. Fuente: World Health Organization, 2011 ............................................................ 5
Tabla 2.1: Conformación de la Reacción de PCR para MnSOD Ile-58Thr ................... 33
Tabla 2.2: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ile-58Thr .................... 34
Tabla 2.3: Conformación de la Reacción de PCR para MnSOD Ala-9Val .................... 35
Tabla 2.4: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ala-9Val ..................... 35
Tabla 2.5: Conformación de la Reacción de PCR para CST3 Ala-73Thr...................... 36
Tabla 2.6: Programa de PCR para la amplificación de CST3 Ala-73Thr ...................... 37
Tabla 2.7: Conformación de la Reacción de PCR para CTSD Ala-224Val ................... 38
Tabla 2.8: Programa de PCR para la amplificación de CTSD Ala-224Val .................... 38
Tabla 2.9: Cantidades utilizadas para la reacción de la PCR de secuenciación ........... 42
Tabla 2.10: Programa de PCR utilizado en el termociclador para la secuenciación. .... 43
Tabla 3.1: Resumen de los resultados obtenidos de los tres diferentes genotipos
de cada polimorfismo y la distribución de los alelos de la población ............................ 55
Tabla 3.2: Análisis Hardy-Weinberg para MnSOD Ala-9Val (T>C) ............................... 56
Tabla 3.3: Análisis Hardy-Weinberg para CST3 Ala-73Thr (G > A) ............................. 57
Tabla 3.4: Análisis Hardy-Weinberg para CTSD Ala-224Val (C > T) ............................ 58
Tabla 3.5: Análisis de Chi-cuadrado para los diferentes genes estudiados con sus
respectivos polimorfismos. ........................................................................................... 59
Tabla 3.6: Análisis de Odds ratio para los tres polimorfismos ...................................... 61
xiii
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1: Esquema del cromosoma 6. El gen MnSOD se localiza en la región
6q25. Fuente: GeneCards® .......................................................................................... 16
Figura 1.2: Esquema posicional de los polimorfismos Ile-58Thr y Ala-9Val en el
gen MnSOD. Fuente: NCBI dbSNP ............................................................................. 17
Figura 1.3: Esquema del cromosoma 20. El gen CST3 se localiza en la región
20p11.21. Fuente: GeneCards® ................................................................................... 18
Figura 1.4: Esquema posicional del polimorfismo Ala-73Thr en el gen CST3.
Fuente: NCBI dbSNP ................................................................................................... 18
Figura 1.5: Esquema del cromosoma 11. El gen CTSD se localiza en la región
11p15.5. Fuente: GeneCards® ..................................................................................... 20
Figura 1.6: Esquema posicional del polimorfismo Ala-224Val en el gen CTSD.
Fuente: NCBI dbSNP ................................................................................................... 20
Figura 1.7: Procesos celulares que intervienen en la patogénesis de la enfermedad
de Alzheimer (Mucke, 2009) ........................................................................................ 21
Figura 3.1: ADN extraído de muestras de sangre periférica en gel de agarosa al
1% teñido con bromuro de etidio y la utilización de marcador molecular Low Mass
Ladder de 100pb .......................................................................................................... 45
Figura 3.2: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el
que se visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al
fragmento de CTSD (Ala-224Val) de 303pb. ................................................................ 46
xiv
Figura 3.3: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio,
revelando los diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala224Val con la enzima AciI. En el posillo 7 se representa el genotipo heterocigoto
C/T, en el posillo 11 el genotipo homocigoto raro T/T y en el posillo 13 el genotipo
homocigoto normal C/C. .............................................................................................. 48
fragmento de CST3 (Ala-73Val) de 262pb. .................................................................. 49
Figura 3.5: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio,
revelando los diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala-73Val
con la enzima EagI. En el posillo 2 se representa el genotipo heterocigoto G/A, en
el posillo 4 el genotipo homocigoto raro A/A y en el posillo 6 el genotipo
homocigoto normal G/G. .............................................................................................. 50
fragmento de MnSOD (Ile-58Thr) de 264pb. ................................................................ 51
Figura 3.7: Representación gráfica del genotipo normal T/T de la secuenciación
capilar de MnSOD (Ile-58Thr) ...................................................................................... 52
fragmento de MnSOD (Ala-9Val) de 217pb. ................................................................. 53
Figura 3.9: Representación gráfica de: a) genotipo normal T/T, b) genotipo
heterocigoto T/C y c) genotipo normal C/C de la secuenciación capilar de MnSOD
(Ala-9Val). .................................................................................................................... 54
xv
LISTADO DE ANEXOS
Anexo A. Modelo de hoja de consentimiento informado.. ¡Error! Marcador no definido.
Anexo B. Concentración de ADN de casos afectos ........ ¡Error! Marcador no definido.
Anexo C. Concentración de ADN de casos controles ..... ¡Error! Marcador no definido.
Anexo D. Matriz de resultados de los cuatro polimorfismos analizados con sus
diferentes genotipos ........................................................ ¡Error! Marcador no definido.
Anexo E. Agrupamiento de muestras secuenciadas de MnSOD Ala-9Val con la
secuencia del gen en SeqScape …………………………………………………...............96
xvi
NOMENCLATURA
ADN:
Ácido Desoxirribonucleico
A:
Adenina
T:
Timina
C:
Citosina
G:
Guanina
Kb:
Kilo bases
pb:
Pares de bases
PCR:
Reacción en Cadena de la Polimerasa
RFLP:
Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de
longitud de fragmentos de restricción)
EA:
Enfermedad de Alzheimer
Ta:
Temperatura de annealing o hibridación de los primers
UV:
Luz Ultravioleta
bp:
Base pairs (pares de bases)
Taq polimerasa:
Thermus aquaticus
Tm:
Temperatura de melting o fusión del DNA
dNTP´s:
Deoxiribonucleótido trifosfato
rpm:
Revoluciones por Minuto
TBE:
Tris Borato EDTA.
Ala:
Alanina
Val:
Valina
xvii
Ile:
Isoleucina
Thr:
Treonina
xviii
RESUMEN
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva
irreversible del cerebro, de patogenia compleja. La enfermedad se caracteriza
desde el punto de vista anatómico, por pérdida de neuronas y sinapsis,
presencia de placas seniles, ovillos neurofibrilares y de degeneración
neurofibrilar. En este estudio, se analizaron las frecuencias de los polimorfismos
de Ala-73Thr (G>A) en el gen CST3 y Ala-224Val (C>T) en el gen CTSD
mediante PCR-RFLP e Ile-58Thr (T>C) y Ala-9Val (T>C) en el gen MnSOD
mediante secuenciación automática, y su asociación con la enfermedad de
Alzheimer en pacientes del Hospital Andrade Marín (HCAM) en Ecuador. Se
analizaron muestras de sangre de 56 individuos afectos de EA del Servicio de
Neurología del HCAM y 55 individuos controles asintomáticos. Los resultados
de los genotipos obtenidos mediante la técnica PCR-RFLP y secuenciación
automática fueron analizados con el programa SSPS v.17. El polimorfismo
(T>C) de Ile-58Thr no presentó relación con la enfermedad ya que no se
encontraron variantes polimórficas. Al realizar el cálculo de Hardy Weinberg y el
análisis de Chi-cuadrado se mostró que al comparar la población afecta con los
controles para Ala-73Thr (G>A) existieron diferencias estadísticamente
significativas y adicionalmente que esta población no estaba en equilibrio. Para
Ala-9Val (T>C) no existieron diferencias estadísticas significativas y la población
mostraba equilibrio. Estas dos variantes no mostraron relación con la
enfermedad, lo que fue comprobado también con el análisis de Odds ratio. Por
otro lado, el polimorfismo Ala-224Val (C>T) mostró ser importante en los tres
análisis; el homocigoto raro TT presentó un valor significativo OR de 9, es decir,
que un portador que posea el genotipo TT tiene 9 veces más riesgo de
desarrollar la enfermedad de Alzheimer que un portador homocigoto CC normal.
xix
ABSTRACT
Alzheimer's disease is a progressive irreversible brain illness of complex
pathogenesis which is sometimes hereditary. From the anatomical point of view,
its findings include loss of neurons and synapses, presence of senile plaques,
neurofibrillar tangles and neurofibrillar degeneration. In this study, we analyzed
the frequencies of the Ala-73Thr polymorphisms (G>A) in the CST3 gene and
Ala-224Val (C>T) in the CTSD gene by PCR-RFLP and Ile-58Thr (T>C) and
Ala-9Val (T>C) in the MnSOD gene by capillary sequencing. The association of
the above variants with Alzheimer's disease in patients from the Carlos Andrade
Marín Hospital (HCAM) in Ecuador was then studied. Blood samples were
obtained from 56 affected individuals from the Neurology Department of HCAM,
and 55 control subjects. The results of genotypes obtained by PCR-RFLP and
capillary sequencing were analyzed by using the SSPS v. 17. Polymorphism
(T>C) of Ile-58Thr has no relationship with the disease since no polymorphic
variant was found. After calculating the Hardy Weinberg and Chi-square
analysis it was showed that, when comparing the frequency of Ala-73Thr (G>A)
in the affected population versus the control group, there was a statistically
significant difference while no equilibrium was demonstrated. For Ala-9Val
(T>C), there were no statistically significant differences and the population was
in equilibrium. These two variations were unrelated to the disease, which was
also found in the Odds ratio analysis. In contrast, Ala-224Val polymorphism
(C>T) was shown to be important in the three analyses; rare homozygote TT
showed a significant value of OR with 9, it means, when a carrier has the
genotype TT, it has 9 times higher risk of developing Alzheimer's disease than
the homozygous CC normal carrier.
xx
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN
1.1
Formulación del problema
El genoma humano contiene alrededor de 25,000 genes (Nussbaum et al,
2007), De los genes que codifican para proteínas del sistema nervioso, un número de
ellos se expresan en cuerpos y axones de neuronas. Por esta razón algunas
neuronas son vulnerables a los cambios que se producen por variaciones genéticas
y/o factores ambientales (Segovia de Arana et al, 2002).
Se considera que la enfermedad de Alzheimer (EA) puede estar involucrada
entre el 60% al 70% de los casos de deterioro cognitivo en ancianos. La afectación
es del 10% en individuos mayores a 65 años y de 40% en ancianos mayores a los
85 años (Jorde et al, 2008). Mundialmente, casi 35.6 millones de personas padecen
esta enfermedad. Se espera que para el año 2030 se incremente este valor a 65.7
millones y se triplique para el año 2050 (World Health Organization, 2012). Existen
7.7 millones de casos de EA cada año, determinando un nuevo caso en cualquier
parte del mundo cada 4 segundos (Alzheimer’s Disease International, 2012). La
enfermedad de Alzheimer causa morbilidad y mortalidad prematura en casi 2 de cada
3 individuos (Nussbaum et al, 2007).
Debido a que no existen datos sobre la epidemiología de la enfermedad en el
Ecuador, según el INEC en el año 2007 hubo un total de defunciones de 58,016
personas de las cuales hubo 161 casos registrados de muerte por demencia y
enfermedad de Alzheimer. En el año 2008 fallecieron 60,023 personas, 163 casos
fueron reportados de fallecimiento por demencia y enfermedad de Alzheimer. En el
año 2009 se incrementó la cifra de fallecidos a 226 por la enfermedad, lo que
evidencia un incremento en la mortalidad general y mortalidad por demencia y
enfermedad de Alzheimer.
Esta enfermedad está caracterizada por demencia, pérdida de memoria
progresiva, acumulación de placas de amiloide y formación de ovillos neurofibrilares
en el encéfalo, principalmente en la corteza cerebral y el hipocampo. La formación de
ovillos neurofibrilares y placas generan una pérdida neuronal progresiva y la muerte
se produce alrededor de 7 a 10 años después del inicio de los síntomas de la
enfermedad (Jorde et al, 2008). Según Jorde et al, la enfermedad de Alzheimer es un
trastorno genéticamente heterogéneo. Debido a que esta enfermedad tiene un patrón
de herencia multifactorial, depende de interacciones complejas entre varios factores
genéticos y ambientales.
Gracias al desarrollo de la genética molecular, se han podido realizar
estudios
acerca
de
enfermedades
neurodegenerativas,
logrando
un
mejor
entendimiento de la base genética de estos procesos con el objetivo de encontrar
curas o tratamientos más acertados para estas enfermedades.
Se han encontrado ciertos factores genéticos que influyen en el desarrollo de
la enfermedad como la APP (Precursor de la proteína β-amiloide). Esta proteína
desempeña un rol en la fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer, en gran parte
debido a las escisiones proteolíticas secuenciales que resultan en la generación de
péptidos de ß-amiloide. La investigación genética, bioquímica, y de comportamiento
sugiere que la generación fisiológica del neurotóxico péptido Aß de la proteólisis del
precursor de la proteína (APP) es la etapa crucial en el desarrollo de la EA. Esta es
una proteína transmembrana de paso único, que se expresa en altos niveles en el
cerebro y se metaboliza de una manera rápida y altamente compleja por una serie de
proteasas secuenciales, incluyendo el complejo intramembranoso γ-secretasa, que
también procesan otras moléculas reguladoras clave (O’Brien et al, 2011).
De igual manera, algunos estudios realizados muestran la relación entre
MnSOD y la actividad catalítica de cada polimorfismo (Ambrosone et al. 1999; Zhang
et al. 1999) y se ha reportado que, cuando Val muta a Ala-9, la estructura de los
aminoácidos N-terminales cambia y las moléculas mutantes MnSOD muestran
dificultades al entrar a la mitocondria (Shimoda-Matsubayashi et al. 1996, 1997). De
igual manera, cuando Ile-58 muta a Thr, el mutante Mn-SOD pierde la actividad de
recolección de superóxido (O 2 -) (Borgstahl et al. 1996). Debido a que estas variantes
en el gen MnSOD se asocian con enfermedades neurodegenerativas, su frecuencia
en individuos con la enfermedad de Alzheimer puede ser significativa (Checkoway et
al. 1998). En el gen CTSD que codifica para la proteína catepsina D existe un SNP
que corresponde a Ala+224Val, que según Ntais et al. (2004), tiene relación con la
enfermedad de Alzheimer. La expresión aberrante de este gen puede llevar a una
neurodegeneración en modelos experimentales en animales, siendo también
potencialmente importante en humanos (Steinfeld et al. 2006).
La catepsina D ha demostrado que presenta función beta-secretasa
(Chevallier et al. 1997) por lo que, en la presencia del polimorfismo, podría romper la
proteína precursora beta amiloide (APP) y promover una cascada de fragmentación
llevando a la deposición extracelular del péptido beta amiloide (Aβ), que es una
característica encontrada en la enfermedad de Alzheimer, más comúnmente
conocida como placas seniles (Hamazaki, 1996).
La cistatina C, una proteína amiloidógena es el inhibidor de proteasas
cistatínicas más abundante en el medio extracelular (Bobek y Levine, 1992). Cuando
hay depósitos de Aß en las paredes arteriolares cerebrales, se da lugar a la
angiopatía cerebral amiloidea (cerebral amyloid angiopathy - CAA), que es una de las
anomalías más frecuentes que se detectan en los cerebros de los pacientes con EA,
estando presente en el 83% de los casos (Ellis et al., 1996) estudios.
1.2
Justificación del problema
Cada año se realizan más estudios y se monitorea de mejor manera el
aparecimiento y evolución de las enfermedades neurodegenerativas, por ello existen
más investigaciones que han llevado a definir algunos tratamientos hasta el momento
no completamente eficientes.
La población mundial aumenta y con esto el número de personas en el grupo
de mayores de 65 años. En el año 2000 existían 410 millones de personas mayores
de 65 años en el mundo, con una tasa de crecimiento anual esperado del 2.4%
(World Health Organization, 2011).
Estimados regionales desde el año 1990 y proyecciones para el 2020 son
presentados en la siguiente Tabla:
Tabla 1.1: Estimación y proyección de la población total y anciana, en 1990 y 2020. Fuente:
World Health Organization, 2011
1990
Región
Total
Ancianosa
Mundo
5295.3
327.6
África
642.6
Asia
2020
Más
Más
Total
Ancianosa
52.9
8049.9
705.7
123.9
19.6
2.0
1421.1
51.3
6.4
3117.8
155.7
19.0
4688.6
398.2
61.5
Europa
509.0
68.2
15.4
541.8
97.7
23.7
Antigua USSR
289.3
26.9
5.3
344.9
43.4
10.3
Norte
276.7
34.5
7.7
351.8
57.6
12.4
Latino América
441.1
21.1
3.3
670.7
54.1
9.1
Oceanía
26.7
2.4
0.5
39.5
4.8
0.9
Ancianos
b
Ancianosb
América del
a
b
Acianos denotan las personas de 65 años y más
Más ancianos denotan las personas de 80 años y más
Entre 1990 y el año 2020 se espera un incremento del 52% de la población
mundial y de un 134% de la población mayor de 80 años (World Health Organization,
2011). Se proyecta que para el año 2050 aproximadamente el 15% de la población
global de 10 billones de personas, serán ancianos.
Según el Banco Mundial y la Organización Mundial de la Salud, la tasa de
mortalidad en el desarrollo mundial de personas mayores a 65 años, será por
enfermedades cerebro vascular y cardiovascular con un porcentaje de distribución
del 16.5% en mujeres y 13.8 en hombres.
Datos recientes reportados por la Organización Mundial de la Salud, sugieren
que en un futuro no muy distante puede esperarse un incremento en el número de
casos de enfermedades por Alzheimer, diabetes, fracturas osteoporóticas y
discapacidad visual y auditiva. Se estima tener más de 80 millones de personas con
demencia senil para el año 2025.
Tomando en cuenta todas estas consideraciones, es muy importante la
investigación básica y aplicada en este campo, con la esperanza de que estos
resultados ayuden al diagnóstico precoz de la enfermedad y al desarrollo de
fármacos y tratamientos preventivos para la población ecuatoriana y al resto del
mundo.
Este proyecto pretende descubrir marcadores de riesgo para la enfermedad
de Alzheimer, que podrían utilizarse para un mejor diagnóstico y tratamiento previo al
desarrollo de la enfermedad, que poco a poco está aumentando su incidencia en el
Ecuador.
1.3
Objetivos
1.3.1- Objetivo general
Analizar las frecuencias polimórficas de Ala-73Thr en el gen CST3 y Ala224Val en el gen CTSD mediante PCR-RFLP e Ile-58Thr y Ala-9Val en el gen
MnSOD mediante secuenciación y estudiar su asociación con la enfermedad de
Alzheimer en pacientes del Hospital Andrade Marín en Ecuador.
1.3.2- Objetivos específicos
Optimizar las condiciones de PCR-RFLP para los polimorfismos Ala-73Thr y
Ala-224Val a ser estudiados.
Optimizar las condiciones de PCR de secuenciación para los polimorfismos
Ile-58Thr y Ala-9Val a ser estudiados.
Probar los dos métodos optimizados en muestras de pacientes afectos por la
enfermedad de Alzheimer y en muestras de individuos sanos.
Determinar si existe correlación entre polimorfismos y riesgo de enfermedad
entre los grupos control y estudio para enfermedad de Alzheimer y los polimorfismos
estudiados.
1.4
Marco Teórico
1.4.1- Enfermedades neurodegenerativas
Las enfermedades neurodegenerativas generan daño en el sistema nervioso
central, ocasionando así una disfunción progresiva del mismo. Esta alteración se
ocasiona por la pérdida de función neuronal frecuentemente relacionada con atrofia
de estructuras afectadas del sistema nervioso. Estudios de la etiología de estas
enfermedades muestran una asociación con factores genéticos que son variables
entre poblaciones. La base molecular de los efectos de la variación genética, estilo
de vida y factores ambientales incluyendo trauma e infección involucran varias vías
de señalización (Crankshaw et al, 2012).
Existen diferentes tipos de desórdenes que causan neurodegeneración, entre
los cuales se encuentran:
•
La enfermedad de Alzheimer
•
La enfermedad de Parkinson
•
La enfermedad de Huntington
•
La esclerosis lateral amiotrófica
1.4.1.1- Enfermedad de Alzheimer
1.4.1.1.1- Características generales
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad progresiva irreversible del
cerebro de patogenia compleja, que se caracteriza desde el punto de vista anatómico
por pérdida de neuronas y sinapsis, presencia de placas seniles, ovillos
neurofibrilares y de degeneración neurofibrilar (Yanker et al, 1990).
Los ovillos neurofibrilares son complementos de la proteína microtubular
TAU. Estos se pueden observan mediante microscopio electrónico y tienen forma de
filamentos helicoidales apareados y son asociados con ubiquitina. Las placas seniles
o neuríticas están constituidas por la sustancia β-amiloide, resultado de acumulación
de varias proteínas en una reacción inflamatoria (Segovia de Arana et al, 2002).
Debido al impacto que tiene en la sociedad es muy importante la
investigación que se realiza para determinar la etiopatogenia, diagnóstico y
tratamiento de la EA. Gran parte de los casos estudiados son esporádicos y un 5%
tiene un patrón de herencia autosómica dominante (Guimerá et al, 2002).
1.4.1.1.2- Definición de demencia
La enfermedad de Alzheimer es el tipo más común de demencia. Según la
organización de Enfermedad de Alzheimer Internacional (2012), demencia se
describe como un nombre colectivo para síndromes progresivos degenerativos del
cerebro que afectan la memoria, el pensamiento, comportamiento y emociones. Los
síntomas pueden incluir:
•
Pérdida de memoria
•
Dificultad en encontrar las palabras precisas o entender que dicen las
otras personas
•
Dificultad en realizar rutinas previas
•
Cambios en la personalidad y humor
1.4.1.2- Clasificación de la enfermedad de Alzheimer
Existen 2 formas de la enfermedad de Alzheimer, las cuales dependen de la
edad de inicio del cuadro clínico (Guimerá et al, 2002):
•
La forma temprana, la que comienza antes de los 65 años de edad,
normalmente se da de por segregación familiar y constituye el 5 al 10% de
todos los casos.
•
La forma tardía, que aparece después de los 65 años de forma esporádica y
representa entre el 90 y 95% de todos los casos.
Según el cuadro clínico, existen 4 estados de desarrollo de la enfermedad de
Alzheimer:
1.4.1.2.1- Enfermedad de Alzheimer preclínica
La enfermedad de Alzheimer preclínica comienza en la corteza entorrinal
cerca del hipocampo. En esta región las neuronas comienzan a trabajar menos
eficientemente, pierden su habilidad de comunicación y por último mueren. Este
estado se dispersa al hipocampo y las regiones atrofiadas comienzan a deteriorarse.
Los síntomas característicos de la EA, en este estadío, aun no son desarrollados.
Las personas experimentan la condición de deterioro cognitivo leve, un porcentaje
elevado de casos desarrollarán la enfermedad (8 de cada 10 personas) y presentan
problemas de memoria más de lo esperado para su edad (National Institute on Aging,
2008).
1.4.1.2.2- Enfermedad de Alzheimer leve
Mientras que la EA se esparce a través del cerebro, crece el número de
placas amiloides y ovillos neurofibrilares, afectando más área de la corteza cerebral.
En este estado comúnmente es cuando se realiza el diagnóstico clínico. Algunos
síntomas son:
•
Pérdida de memoria
•
Confusión en la localización de familiares
•
Mayor dificultad para realizar actividades diarias
•
Cambio de ánimo y personalidad.
La persona con este cuadro clínico parece sana pero tiene más problemas al tratar
de darse cuenta de lo que pasa a su alrededor (National Institute on Aging, 2008).
1.4.1.2.3- Enfermedad de Alzheimer moderada
En esta etapa el daño de la enfermedad se ha esparcido a las áreas de la
corteza cerebral que controlan el lenguaje, razón, procesamiento sensorial y el
pensamiento consciente. Las zonas afectadas continúan encogiéndose. Los
síntomas pueden incluir: incremento de la pérdida de la memoria y confusión, déficit
de atención, momentos espontáneos de ira, problemas para reconocer amigos y
familia, dificultad para el lenguaje y problemas con lectura, escritura y razonamiento,
incapacidad de aprender nuevas cosas o encajar en nuevas situaciones inesperadas,
agitación, ansiedad, inquietud, llanto, alucinaciones, delirios, paranoia e irritabilidad.
El comportamiento es el resultado de un proceso complejo del cerebro. Este
proceso tarda un segundo en desarrollarse en un cerebro sano. En EA muchos de
estos procesos son perturbados, generando interrupciones de comunicación entre
las neuronas y son la base de los comportamientos inadecuados (National Institute
on Aging, 2008).
1.4.1.2.4- Enfermedad de Alzheimer severo
En esta última parte de EA, las placas y los ovillos neurofibrilares se han
extendido por todo el cerebro y la mayor parte de áreas del cerebro se han encogido
aún más. Las personas que ya desarrollan este estado no pueden reconocer a su
familia ni a seres queridos, o comunicarse en cualquier sentido. Otros síntomas
pueden ser: pérdida de peso, convulsiones, infecciones de la piel, dificultad al tragar,
incremento del sueño y pérdida del control de la vejiga
La causa más frecuente de muerte en personas con EA es neumonía por
aspiración. Este tipo de neumonía se desarrolla cuando una persona no puede tragar
apropiadamente y lleva fluidos o comida a los pulmones en vez de aire (National
Institute on Aging et al, 2008).
1.4.1.3- Diagnóstico de la enfermedad
Actualmente no existe una prueba que diagnostique si una persona posee la
enfermedad de Alzheimer o no. Para el diagnóstico de EA se realiza una evaluación
física, psiquiátrica y neurológica, que permite obtener un 90% de certeza y abarca los
siguientes aspectos: examen médico detallado, pruebas neuropsicológicas, pruebas
de sangre completas, electrocardiograma, electroencefalograma y tomografía por
emisión de positrones (PET).
Para obtener un 100% de certeza de que un paciente padeció de la
enfermedad, se realiza un examen de tejido de cerebro postmortem. El diagnóstico
diferencial de la enfermedad se lo establece en base a señales de: depresión, toma
de
medicamentos,
demencia
vascular,
enfermedad
de
Parkinson,
atrofias
multisistémicas, enfermedad con cuerpos de Lewy y demencia frontotemporal o
demencia con cuerpos argilófilos (Parquet et al, 2007).
1.4.2- Superóxido dismutasa (SOD)
1.4.2.1- Características generales
La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima antioxidante. Esta actúa
como un mecanismo de defensa de las células para atrapar los radicales libres de
oxígeno y evitar cualquier enfermedad relacionada. Existen 3 variantes de
superóxido dismutasa: SOD1 se encuentra en el citoplasma celular, SOD2 en las
mitocondrias y SOD3 en el líquido extracelular. Todas las SODs son metaloenzimas
que contienen un ión metálico de transición (cobre, hierro o manganeso) en su sitio
activo (De la Torre, 1994).
El gen MnSOD codifica la enzima SOD2 que será de interés en este estudio.
Este gen proviene de la familia hierro/manganeso superóxido dismutasa. La proteína
mitocondrial superóxido dismutasa forma un tetrámero y une un ion manganeso por
subunidad. Una mutasa es un tipo de enzima que reorganiza los átomos en una
molécula, por esta razón la SOD2 convierte a los subproductos de superóxido de la
fosforilación oxidativa (radicales libres superóxido O 2 ˉ) en peróxido de hidrogeno y
oxigeno diatómico. Las mutaciones de este gen se han asociado con miocardiopatía
idiopática (IDC), envejecimiento prematuro, enfermedades esporádicas de las
neuronas motoras y el cáncer” (NCBI, 2012).
MnSOD es la única enzima antioxidante primaria que ha demostrado ser
esencial para la sobrevivencia de organismos aeróbicos. Según evidencias
mostradas anteriormente, MnSOD parece ser crítica para la supervivencia de las
neuronas a daño oxidativo (Galecki et al, 2010).
La actividad biológica de la enzima codificada por el gen MnSOD está
localizada en la mitocondria (Church et al., 1992). Ya que SOD juega un papel
importante entre las enzimas antioxidantes, protege al cerebro contra ROS (especies
de oxígeno reactivo) y si es que existe un cambio en la actividad de esta enzima en
la mitocondria, existirán también disfunciones de los mecanismos de los que es
responsable la misma (Visner et al., 1990).
1.4.2.2- Polimorfismos del gen MnSOD
1.4.2.2.1- Ile-58Thr
Ile58Thr afecta la estabilidad de la interface de la proteína tetramérica SOD2
y reduce la actividad biológica de MnSOD. En este polimorfismo se sustituye T  C
(dbSNP ID = rs7855) que produce un cambio de isoleucina por una treonina, en el
codón 58 del exón 6 de 6q25 (Borgstahl et al., 1996).
1.4.2.2.2- Ala-9Val
Este polimorfismo es una sustitución de T  C (dsSNP ID = rs4880) en el
codón 9 del exón 2 de 6q25, que produce un cambio de valina a alanina. Esta
sustitución induce cambios de conformación en la secuencia mitocondrial de
orientación (MTS) de la estructura, de hojas plegadas β a α-hélix y por este cambio
no se puede realizar bien el transporte a la mitocondria (Shimoda-Matsubayashi et
al., 1996). Según Sutton et al. (2005), el transporte en la matriz mitocondrial baja y se
asocia al decaimiento de la estabilidad del mRNA.
Figura 1.1: Esquema del cromosoma 6. El gen MnSOD se localiza en la región 6q25. Fuente:
GeneCards®
Figura 1.2: Esquema posicional de los polimorfismos Ile-58Thr y Ala-9Val en el gen MnSOD.
Fuente: NCBI dbSNP
1.4.3- Cistatina C
La cistatina es una familia de proteínas, clasificadas en tres grupos, las
cistatinas tipo 1, cistatinas tipo 2 y los quininógenos. Las proteínas cistatinas de tipo
2 son una clase de inhibidores de la proteasa cisteína, encontrada en fluidos y
secreciones donde parece tener funciones protectoras. El gen CST3 se encuentra en
el locus cistatina del cromosoma 20 y codifica la mayor parte de inhibidores
extracelulares de las proteasas cisteínas. Una mutación en este gen ha sido
relacionada con angiopatía amiloide. La expresión de esta proteína en las células
vasculares del musculo liso de las paredes es muy reducida en lesiones
ateroscleróticas y aneurisma aórtico, estableciendo su rol en la enfermedad vascular
(NCBI, 2012).
1.4.3.2- Polimorfismo del gen CST3 (Ala-73Thr)
Como la cistatina C es un inhibidor de la proteasa cisteína lisosomal
interviene en el envejecimiento neuronal o en la muerte celular en la enfermedad de
Alzheimer. El polimorfismo que causa este proceso corresponde al gen CST3
localizado en la posición 73 del exón 1, resultando en un cambio de G  A (ds SNP
ID = rs1064039), lo que lleva a una sustitución de alanina por treonina (Lin et al,
2003).
Figura 1.3: Esquema del cromosoma 20. El gen CST3 se localiza en la región 20p11.21.
Fuente: GeneCards®
Figura 1.4: Esquema posicional del polimorfismo Ala-73Thr en el gen CST3. Fuente: NCBI
dbSNP
1.4.4- Catepsina D
La aspartil proteasa lisosomal catepsina D está implicada en la patogénesis
de varias enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (NCBI, 2012).
La catepsina D es una proteasa acídica intracelular que tiene relación con el
desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, ya que genera fragmentos de betaamiloide (Aβ) a partir de la división de la proteína precursora amiloide APP y la
degradación de la proteína TAU en varios fragmentos (Chevallier et al., 1997).
1.4.4.2- Polimorfismo del gen CTSD (Ala-224Val)
El gen CTSD se encuentra en el cromosoma 11 en la región 15.5 y el
polimorfismo Ala-224Val está en el exón 2 en la posición 224. Este resulta en un
cambio de C  T (ds SNP ID = rs17571), que consiste en una sustitución de un
residuo de alanina por valina. Este polimorfismo causa un aumento de la secreción
pro-CTSD y la maduración intracelular (Mariani et al, 2006).
Figura 1.5: Esquema del cromosoma 11. El gen CTSD se localiza en la región 11p15.5.
Fuente: GeneCards®
Figura 1.6: Esquema posicional del polimorfismo Ala-224Val en el gen CTSD. Fuente: NCBI
dbSNP
En la Figura 1.5 se puede observar cómo actúan las acumulaciones de la
proteína amiloide y proteína TAU debido a los diferentes polimorfismos en la
enfermedad de Alzheimer. La agregación y acumulación de la proteína beta-amiloide
(Aβ) en el cerebro, puede deberse a una mayor producción neuronal de Aβ,
disminución de la actividad de las enzimas degradantes de Aβ o alteraciones en los
procesos de transporte que circula Aβ a través de la barrera sangre-cerebro. Los
oligómeros Aβ afectan las funciones sinápticas, mientras que las placas amiloides
fibrilares desplazan y distorsionan los procesos neuronales. De igual manera estos
oligómeros interactúan con las membranas y receptores de la superficie celular,
alterando las cascadas de transducción de señales, cambiando las actividades
neuronales y activando la liberación de mediadores neurotóxicos por la microglia
(células inmunes residentes). Las proteínas Tau y α-sinucleína pueden autoensamblarse para formar oligómeros de patógenos y así formar grandes agregados
intraneuronales, desplazando organelos vitales intracelulares.
Figura 1.7: Procesos celulares que intervienen en la patogénesis de la enfermedad de
Alzheimer (Mucke, 2009)
1.4.5- Técnicas moleculares
“Durante la última década, el rápido desarrollo de una amplia gama de
técnicas en los campos de la biología celular y molecular ha transformado zonas
enteras de la investigación a través de las ciencias biológicas” (Cambridge, 2012).
Por lo tanto se tomó en cuenta las siguientes técnicas moleculares para
desarrollarlas en este proyecto de investigación.
1.4.5.1- Extracción y cuantificación de ADN
Según Newsletter Microbial (2009), la extracción de ADN consta de una
etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y
liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la eliminación en la
solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en una PCR. La
confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un
gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o
directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm.
El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso
de fluoróforos específicos.
1.4.5.2- PCR-RFLP
La técnica de PCR o reacción en cadena de la polimerasa, crea varias copias
de un segmento específico de ADN a ser estudiado. La PCR está basada en los
conocimientos de que la ADN polimerasa requiere una cadena de ADN con un primer
hibridado a ésta con un extremo 3’ para que comience la extensión. Existen tres
pasos de la PCR que son: la denaturación, donde la doble cadena de ADN se separa
por altas temperaturas y en buffers apropiados. Después la hibridación con una
temperatura correspondiente a los primers utilizados. Estos se hibridan con su sitio
complementario en la secuencia. Y por último, la extensión, que ocurre hasta que la
polimerasa llega al extremo 5’ o cuando se la inactiva forzadamente (Krebs et al,
2011). Este proceso sigue varios ciclos hasta obtener los amplicones deseados.
Ya realizada la PCR se prosigue con la técnica de RFLP o también llamada
restricción de fragmentos de longitud polimórfica. Esta técnica es un proceso en el
que se corta secuencias específicas de nucleótidos en el ADN en sitios exclusivos de
reconocimiento por enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos a partir del
corte con enzimas pueden servir como marcadores moleculares. Una enzima puede
realizar un gran número de cortes en lugares específicos. Las secuencias de
restricción muestran comúnmente patrones de distancia, longitud y disposición
diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice
que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Los fragmentos
resultantes de la técnica son separados por electroforesis revelando un único patrón
característico de un genotipo específico. (NCBI, 2012).
1.4.5.3- Secuenciación de ADN por electroforesis capilar
Los principios de la replicación del ADN fueron utilizados por Sanger et al.
(1974) en el desarrollo de la secuenciación didesoxi de Sanger. En este proceso la
DNA polimerasa incorpora 2 ', 3'-didesoxinucleótidos, análogos de nucleótidos de
base que carecen del grupo 3'-hidroxilo esencial en la formación de enlace
fosfodiéster. Este proceso de secuenciación requiere un molde de ADN, un cebador
de secuenciación, DNA polimerasa, nucleótidos (dNTPs), didesoxinucleótidos
(ddNTPs), y tampón de reacción. Se establecen cuatro reacciones separadas, cada
uno contiene nucleótidos marcados radiactivamente y, o bien ddA, ddC, ddG, o ddT.
La hibridación, el marcaje, y los pasos de terminación se realizan a temperaturas
específicas. La síntesis de ADN se lleva a cabo a 37 ° C, temperatura a la cual la
ADN polimerasa T7 utilizada tiene la actividad enzimática óptima. DNA polimerasa
añade ya sea un didesoxinucleótido o la correspondiente 2, 3'-dididesoxinucleótido
en cada paso de extensión de cadena. Se añade un didesoxinucleótido dependiendo
de la concentración relativa de ambas moléculas. Cuando un didesoxinucleótido (A,
C, G o T) se añade al extremo 3', la extensión de la cadena puede continuar. Sin
embargo, cuando un dididesoxinucleótido (ddA, ddC, DDG, o DDT) se añade al
extremo 3', la extensión de la cadena termina. La secuenciación de Sanger da como
resultado la formación de productos de extensión de varias longitudes terminados
con didesoxinucleótidos en el extremo 3'. Los productos de extensión se separan por
electroforesis. Durante la electroforesis se aplica un campo eléctrico de modo que los
fragmentos de ADN con carga negativa se mueven hacia el electrodo positivo. La
velocidad a la que un fragmento de ADN se mueve a través del medio es
inversamente proporcional a su peso molecular. Este proceso de electroforesis
puede separar los productos de extensión por tamaño a una resolución de una base
(Applied Biosystems, 2009).
La diferencia de la secuenciación estándar de Sanger con la secuenciación
automatizada de Applied Biosystems, utilizada en el presente estudio, es que en vez
de utilizar un material radiactivo, el ciclo de secuenciación utiliza tintes fluorescentes
para etiquetar los productos de extensión y los componentes se combinan en una
reacción que se somete a ciclos de hibridación, extensión y desnaturalización en un
termociclador.
Los procedimientos automatizados de los ciclos de secuenciación incorporan
etiquetas
de
colorantes
fluorescentes
usando
tintes
marcados
con
dididesoxinucleótido trifosfato (dye terminators) o primers marcados. Ambas
químicas utilizan cuatro diferentes tintes. Debido a que cada colorante emite una
longitud de onda única cuando es excitado por la luz, el colorante fluorescente en el
producto de extensión identifica el dididesoxinucleótido terminal 3'como A, C, G o T.
Con la química Dye Terminator, cada una de las cuatro terminaciones de
didesoxinucleótidos se marca con un colorante fluorescente diferente. Una reacción
se realiza conteniendo la enzima, nucleótidos, y todos los didesoxinucleótidos
colorantes-marcados. Los productos de esta reacción se inyectan en un capilar
(Applied Biosystems, 2009).
1.4.5.4- Análisis de datos
Se empleó un análisis estadístico de tipo descriptivo que incluye el cálculo de
frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados, luego de obtenidos los
genotipos de los individuos controles y afectos. Se utilizó el análisis de equilibrio
Hardy-Weinberg para calcular las frecuencias genotípicas esperadas a partir de las
frecuencias alélicas. Para establecer si existían diferencias significativas entre los
dos grupos y los polimorfismos estudiados se realizó la prueba Chi-cuadrado de
Pearson y la prueba de Odds Ratio para determinar el riesgo de desarrollar la
Enfermedad de Alzheimer en presencia de los polimorfismos en los grupos
estudiados mediante el programa SPSS v.17 (SPSS, Chicago, Illinois) (Muñoz,
2008).
1.5
Hipótesis
Las combinaciones alélicas de los genes MnSOD (Ile-58Thr y Ala-9Val),
CST3 (Ala-73Thr) y CTSD (Ala-224Val) están asociados con el desarrollo la
enfermedad de Alzheimer.
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS
2.1
Participantes
Esta investigación fue realizada por Carla Geovanna Rodríguez Proaño. Los
colaboradores y asesores científicos fueron el Dr. César Paz-y-Miño y el Lic. Andrés
López, pertenecientes al Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UDLA y el Dr.
Marco Serrano del Servicio de Neurología, Hospital de la Seguridad Social “Carlos
Andrade Marín” Quito. Adicionalmente, el Dr. Marcelo Grijalva y la Ing. Paola
Párraga,
quienes
desempeñaron
las
funciones
de
director
y
codirector
respectivamente, pertenecientes al área de Biotecnología Humana de la Escuela
Politécnica del Ejército.
2.2
Zona de Estudio
Las muestras fueron recolectadas en el Hospital Carlos Andrade Marín y en
un consultorio privado llamado Centro Médico Orbe en Quito y Guayllabamba,
respectivamente. La investigación se desarrolló en el Instituto de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de las Américas, ubicado en Quito-Pichincha.
2.3
Periodo de tiempo de investigación
La investigación inició en Enero del 2012 y finalizó en Agosto del mismo año,
comprendiendo así un periodo de 8 meses.
2.4
Diseño
El diseño que se utilizó en este proyecto de investigación fue de tipo
exploratorio, con un grupo estudio y un grupo control.
El grupo estudio estuvo conformado con muestras provenientes del Hospital
Carlos Andrade Marín y el grupo control con muestras provenientes del Centro
Médico Orbe ubicado en Guayllabamba.
2.5
Procedimientos
2.5.1- Obtención de muestras
Para la obtención de muestras de sangre periférica recolectadas en el
Hospital Carlos Andrade Marín, se contactó al Dr. Marco Serrano, quien realizó un
análisis exhaustivo de sus pacientes con posible diagnóstico de Alzheimer. A los
pacientes con criterios de EA se les extrajo 3 mL de sangre y estas muestras fueron
trasladadas al Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UDLA, siguiendo la
cadena de frío.
Las muestras de sangre periférica para el grupo control de este estudio se
recolectaron en el Centro Médico Orbe ubicado en Guayllabamba por el Dr.
Edmundo Araujo, siguiendo las características requeridas de edad, sexo y que no
posean ningún otro factor que pueda intervenir en los resultados. El Dr. Edmundo
Araujo realizó solamente la extracción de sangre de acuerdo a mis requerimientos
pedidos. Las muestras de sangre fueron trasladadas al Instituto de Investigaciones
Biomédicas de la UDLA, siguiendo la cadena de frío.
En casos y controles se contó con información de edad, sexo y un historial
clínico con consentimiento informado (Anexo A). Los controles estuvieron libres de
antecedentes de enfermedades neurodegenerativas o exposición a genotóxicos. El
grupo de afectados contó con el diagnóstico confirmado de la enfermedad de
Alzheimer (Carrera, 2008).
2.5.2- Extracción de ADN a partir de muestras de sangre periférica
Una vez que las muestras de sangre periférica fueron recolectadas se
procedió a la extracción de ADN, con la utilización de PureLinkTM Genomic DNA Mini
Kit de Invitrogen.
Antes de comenzar la extracción se preparó un baño maría a 55°C.
Posteriormente, en un microtubo se añadieron 200µL de ADN con 20µL de
proteinasa K y 20µL de RNasa. Se agitó bien la mezcla mediante un vórtex y se la
incubó a temperatura ambiente por 2 minutos. Transcurrido ese tiempo se añadieron
200µL de Genomic Lysis / Binding Buffer del Mini Kit de Invitrogen y se agitó bien con
un vórtex hasta obtener una mezcla homogénea. Después, los microtubos se
incubaron a 55°C por 10min para promover la digestión de las proteínas. Se
añadieron al lisado 200µL de etanol al 95-100% y se mezcló bien en un vórtex hasta
que se obtuvo una solución homogénea. Todo el lisado formado se trasladó a una
columna de centrifugación sobre un tubo de recolección y se centrifugó a 10000 rpm
por 1 min a temperatura ambiente. Se descartó el tubo de recolección y se colocó
uno nuevo. Luego, se añadieron 500µL de Wash Buffer 1 proveniente del Mini Kit de
extracción de Invitrogen, previamente añadidos al mismo etanol al 96-100% de
acuerdo a las instrucciones de la etiqueta de la solución y se centrifugó a 10000 rpm
por 1 minuto. Se descartó el contenido del tubo de recolección y se colocó de nuevo
para el siguiente lavado con el Wash Buffer 2, utilizando 500µL del mismo con etanol
al 96-100%. Se centrifugó la columna a máxima velocidad por 3 min a temperatura
ambiente. Transcurrido ese tiempo se descartó el tubo de recolección y se colocó, la
columna, en un microtubo estéril. Se añadieron a la columna 50µL de Genomic
Elution Buffer y se incubó por 1 min a temperatura ambiente. Luego se centrifugaron
los microtubos a 16000rpm por 2 min a temperatura ambiente. Para obtener mayor
cantidad de ADN se añadió el mismo volumen de Buffer de elución y centrifugó por 2
min a 16000rpm. Se descartó la columna y los microtubos que contenían el ADN
genómico purificado se almacenaron a -20°C.
2.5.3- Análisis cualitativo y cuantitativo del ADN extraído
Ya extraído el ADN se dio paso al análisis cualitativo, donde se corrieron 5µL
del mismo en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. El gel se lo
preparó mezclando 1 gramo de agarosa en 100mL de TBE 1X. A esta mezcla se
realizó 3 repeticiones de calentamiento de la solución hasta el punto de ebullición e
inmediatamente se lo enfriaba removiéndolo constantemente, hasta ver una solución
totalmente homogénea y transparente. Después se añadió 1µL de bromuro de etidio
por cada 10mL de gel preparado, directamente a la solución. Se mezcló lentamente
evitando que se formen burbujas y se añadió, la preparación, a una cámara de gel.
Una vez que la solución se haya solidificado se puso, el mismo, en una cámara
electroforética con TBE1X. Se cargaron en los pocillos del gel 5µL de las muestras y
se corrieron a 90V. Transcurridos 20 minutos se reveló el gel en un transiluminador y
se determinó que el ADN estuvo presente y no degradado.
Una vez confirmada la existencia del ADN se realizó la cuantificación
utilizando el Qubit® dsDNA HS Assay Kit. Se preparó una mix compuesta por 1µL de
Fluorocromo, 197µL de Buffer (incluido en el kit) y 2µL de DNA por muestra para la
lectura en dicho equipo. De igual manera se realizaron 2 estándares compuestos por
20µL del Estándar, 1µL de Fluorocromo y 179µL de Buffer para cada uno.
Primero, se calibró el Qubit® con el Estándar 1 y el Estándar 2, seguida de la
lectura del resto de muestras de ADN. Los resultados de concentración de ADN se
calcularon en el equipo Qubit® ingresando el volumen de ADN que se haya utilizado
y se expresó en µg de ADN por cada mL de solución.
2.5.4- Determinación del genotipo
La determinación del genotipo de cada individuo se determinó por PCR,
RFLP y secuenciación. La primera parte del proceso consistió en la amplificación de
las 4 regiones requeridas con los primers respectivos. En la segunda parte se realizó
una restricción enzimática para 2 polimorfismos (CST3 (Ala-73Thr) y CTSD (Ala224Val)) y secuenciación para los dos polimorfismos restantes (MnSOD (Ile-58Thr) y
(Ala-9Val)). Se determinó el genotipo en la restricción enzimática utilizando geles de
agarosa al 4% teñidos con bromuro de etidio con un marcador molecular TrackIt™ de
100pb de Invitrogen para la detección de las bandas. Los resultados de la
secuenciación se observaron en las curvas del ADN.
2.5.4.1- Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
Para la técnica de PCR se utilizaron los siguientes reactivos: H 2 O ultra pura,
Buffer, Mg++, dNTPs, Primer Forward, Primer Reverse (diseñados utilizando la base
de datos de GeneCards V3 1996-2012) y Taq polimerasa. Se realizó una mix de
reacción específica para cada polimorfismo con todos los reactivos antes
mencionados y con cantidades indicadas en las Tablas 2.1, 2.3, 2.5 y 2.7. Cada mix
se llevó al termociclador MultiGene de Labnet con el programa de PCR que se
detalla en las Tablas 2.2, 2.4, 2.4 y 2.8 para cada polimorfismo; obteniendo
amplicones deseados de: 264pb, 217pb, 262pb y 303pb correspondientes a Ile58Thr, Ala-9Val, Ala-73Thr y Ala-224Val, respectivamente.
2.5.4.1.1- Polimorfismo MnSOD Ile-58Thr
Para el análisis de este polimorfismo se obtuvo un fragmento de 264pb con
la utilización de los primers F: 5’ TCCAGGGGAAGTACTGTTTG 3’ y R: 5’
GCAGACCTCTTTGATGGTTG 3’, con la siguiente reacción y programa de
termociclado:
Tabla 2.1: Conformación de la Reacción de PCR para MnSOD Ile-58Thr
Volumen por Concentración
Concentración
Reactivos
reacción (µL)
inicial
final
H 2 O ultra pura
35.35
Buffer
5.00
10X
1X
Mg++
1.50
50mM
1.5mM
dNTPs
4.00
2,5mM
0.2mM
Primer F
1.00
10μM
0.2μM
Primer R
1.00
10μM
0.2μM
Taq polimerasa
0.15
5Units
2.5Units
ADN
2
Volumen Total
50.00
5ng/µL
Tabla 2.2: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ile-58Thr
Pasos
Temperatura °C
Tiempo
Acción
Desnaturalización inicial
95
10 min
Desnaturalización
95
45s
Desnaturalización
60.3
1min
Hibridación
72
45s
Extensión
Elongación Final
72
3min
Extensión Final
Conservación
4
∞
35 ciclos
Los fragmentos resultantes fueron observados en un gel de agarosa al 2%
por una corrida electroforética en el transiluminador ImageQuant 300.
2.5.4.1.2- Polimorfismo MnSOD Ala-9Val
la utilización de los primers F: 5’ GCTGTGCTTTCTCGTCTTCA 3’ y R: 5’
CAACGCCTCCTGGTACTTCT 3’, con la siguiente reacción y programa de
termociclado:
Tabla 2.3: Conformación de la Reacción de PCR para MnSOD Ala-9Val
Volumen por
Concentración
Concentración
reacción (µL)
inicial
final
Reactivos
H2O ultra pura
31.30
Buffer
5.00
10X
1X
Mg++
2.50
50mM
2.5mM
dNTPs
6.00
2,5mM
0.3mM
Primer F
1.00
10μM
0.2μM
Primer R
1.00
10μM
0.2μM
Taq polimerasa
0.20
5Units
2.5Units
ADN
3
Volumen Total
50.00
5ng/μL
Tabla 2.4: Programa de PCR para la amplificación de MnSOD Ala-9Val
Pasos
Temperatura °C
Tiempo
Acción
95
10 min
Desnaturalización
95
45s
Desnaturalización
62
1min
Hibridación
72
45s
Extensión
Elongación Final
72
3min
Extensión Final
Conservación
4
∞
36 ciclos
2.5.4.1.3- Polimorfismo CST3 Ala-73Thr
la utilización de los primers F: 5’ TATCTAGCTCCAGCCTCTCG 3’ y R: 5’
TACATGTCGTTGCTGGCTTT 3’, con la siguiente reacción y programa de
termociclado:
Tabla 2.5: Conformación de la Reacción de PCR para CST3 Ala-73Thr
Volumen por
Concentración
Concentración
reacción (µL)
inicial
final
Reactivos
H2O ultra pura
38.00
Buffer
5.00
10X
1X
Mg++
0.50
50mM
0.5mM
dNTPs
2.00
2,5mM
0.1mM
Primer F
1.00
10μM
0.2μM
Primer R
1.00
10μM
0.2μM
Taq polimerasa
0.50
5Units
2.5Units
DNA
2
Volumen Total
50.00
5ng/μL
Tabla 2.6: Programa de PCR para la amplificación de CST3 Ala-73Thr
Pasos
Temperatura °C
Tiempo
Acción
95
10 min
Desnaturalización
95
30s
Desnaturalización
53
30s
Hibridación
72
45s
Extensión
Elongación Final
72
3min
Extensión Final
Conservación
4
∞
35 ciclos
2.5.4.1.4- Polimorfismo CTSD Ala-224Val
la utilización de los primers F: 5’ GTCCATGTAGTTCTTGAGCA 3’ y R: 5’
GGTGACCACTTCTTAGGACT 3’, con la siguiente reacción y programa de
termociclado:
Tabla 2.7: Conformación de la Reacción de PCR para CTSD Ala-224Val
Volumen por
Concentración
Concentración
reacción (µL)
inicial
final
Reactivos
H2O ultra pura
35.00
Buffer
5.00
10X
1X
Mg++
1.50
50mM
1.5mM
dNTPs
2.00
2,5mM
0.1mM
Primer F
2.00
10μM
0.4μM
Primer R
2.00
10μM
0.4μM
Taq polimerasa
0.50
5Units
2.5Units
DNA
2
Volumen Total
50.00
5ng/µL
Tabla 2.8: Programa de PCR para la amplificación de CTSD Ala-224Val
Pasos
Temperatura °C
Tiempo
Acción
95
10 min
Desnaturalización
95
30s
Desnaturalización
60
45s
Hibridación
72
45s
Extensión
Elongación Final
72
3min
Extensión Final
Conservación
4
∞
35 ciclos
2.5.4.2- Digestión para análisis de los fragmentos de restricción de longitud
polimórfica (RFLP)
Después de realizar la técnica de PCR se realizó la restricción de fragmentos
de longitud polimórfica para los polimorfismos Ala-73Thr y Ala-224Val. A
continuación se detallan las enzimas de restricción que se utilizaron para cada
variante.
2.5.4.2.1- Polimorfismo CST3 Ala-73Thr (G > A)
Se utilizó la enzima EagI para la restricción de Ala-73Thr, que tiene como
sitio de restricción dentro del fragmento amplificado:
5'... C G G C C G ... 3'
3'... G C C G G C ... 5'
Para el proceso de restricción se utilizaron 30μL de producto de PCR,
obtenido previamente, con 0.4μL de Enzima EagI (10,000 U/mL) (New England
BioLabs), 5μL de NEBuffer 10X y 14.6μL de H 2 O ultra pura dando así un volumen
final de reacción de 50μL. La digestión se la realizó por 3 horas a 37°C y se lo
visualizó en un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio.
Un individuo podría presentar, de acuerdo a este polimorfismo, el siguiente
genotipo: homocigoto normal (GG), heterocigoto (GA) y homocigoto raro (AA). El
genotipo homocigoto normal (GG) se lo determinó al observar una banda que
corresponde a dos fragmentos de 132pb y 130pb. En el genotipo heterocigoto (GA)
se observaron dos bandas correspondientes a 132pb o 130pb y 262pb. Y por último
el genotipo homocigoto raro (AA) genera una banda de 262pb.
2.5.4.2.2- Polimorfismo CTSD Ala-224Val (C > T)
Se utilizó la enzima AciI para la restricción de Ala-224Val, que tiene como
sitio de restricción dentro del fragmento amplificado:
Para el proceso de restricción se utilizaron 20μL de producto PCR con 0.4μL
de Enzima EagI (10,000 U/mL) (New England BioLabs), 5μL de NEBuffer 10X y
4.6μL de H2O ultra pura dando así un volumen de 30μL. La digestión se la realizó
por 3 horas a 37°C y los resultados se los visualizaron en un gel de agarosa al 4%
teñido con bromuro de etidio.
Un individuo podría presentar, de acuerdo a este polimorfismo, el siguiente
genotipo: homocigoto normal (CC), heterocigoto (CT) y homocigoto raro (TT). El
genotipo homocigoto normal (CC) se lo determinó al observar tres bandas que
corresponde a un fragmento de 100pb, una banda de 76pb o 77pb, y uno de 50pb.
En el genotipo heterocigoto (CT) se observaron cuatro bandas correspondientes a un
fragmento de 153pb, otro de 100pb, una banda de 76pb o 77pb, y una de 50pb. Y
por último el genotipo homocigoto raro (TT) genera tres bandas de 153pb, 100pb y
50pb.
2.5.4.3- Protocolo de purificación de PCR mediante Agencourt® AMPure® XP de
Beckman Coulter
A 50µL de producto PCR, correspondiente al gen MnSOD (Ile-58Thr y Ala9Val), se le añadieron 90µL del reactivo ya temperado y se agitó la mezcla con un
vórtex por unos minutos. Posteriormente, los tubos se incubaron por 6 minutos a
temperatura ambiente y se pasó a la placa magnética (Agencourt SPRIPlate 96R)
(Agencourt SPRIPlate 96R), que es una placa de imánes, por el mismo tiempo.
Después, se extrajeron con una micropipeta multicanal todos los residuos líquidos de
los tubos, teniendo cuidado de no topar el anillo que se forma en los mismos. Se
realizaron 2 lavados, en la misma placa magnética (Agencourt SPRIPlate 96R), con
etanol al 70% por 30 segundos en cada lavado y se dejaron secar de 20-30 minutos
hasta que todo el alcohol de haya evaporado. Por último se añadieron 40uL de TE
1X fuera de la placa magnética (Agencourt SPRIPlate 96R) (Agencourt SPRIPlate
96R) y agitó con un vórtex por unos segundos. Los tubos se los pasaron de nuevo a
la placa magnética (Agencourt SPRIPlate 96R) (Agencourt SPRIPlate 96R) y se
retiraron 35µL del líquido sin topar el anillo, que contiene el producto PCR purificado
y se añadió a tubos nuevos. El producto se conserva a -20°C hasta 10 días.
2.5.4.4- PCR de secuenciación
Para realizar PCR de secuenciación se utilizó BigDye® Terminator v3.1 y
v1.1 Cycle Sequencing Kit de Applied BiosystemsTM en MnSOD (Ile-58Thr y Ala-9Val)
respectivamente. La reacción de secuenciación fue la siguiente:
Tabla 2.9: Cantidades utilizadas para la reacción de la PCR de secuenciación
Reactivos
x1
H 2 O ultra pura
2.8 µL
Buffer 5x
2 µL
BDT
1 µL
Primer 1mM
3.2 µL
PCR purificada
2-4 µL
Volumen Final
11-13 µL
Y se trasladaron los tubos con la reacción al termociclador según el
programa que se detalla en la Tabla 2.10.
Tabla 2.10: Programa de PCR utilizado en el termociclador para la secuenciación.
Pasos
Temperatura °C
Tiempo
Acción
96
10 min
Desnaturalización
96
30s
Desnaturalización
50
45s
Hibridación
60
45s
Extensión
4
∞
Desnaturalización
inicial
25 ciclos
Conservación
2.5.4.5- Protocolo de purificación de PCR de secuenciación mediante Agencourt®
CleanSEQ® de Beckman Coulter
A los productos PCR de secuenciación se les agregaron 3µL de reactivo
Agencourt® CleanSEQ® de Beckman Coulter con 26.4µL de etanol al 85% y la
mezcla se agitó con un vórtex por unos segundos. Se los puso en la placa magnética
(Agencourt SPRIPlate 96R) y se los dejó por 3 minutos. A continuación, se retiraron
los desechos líquidos de los tubos y se realizaron 2 lavados con etanol al 85% en la
placa magnética (Agencourt SPRIPlate 96R), esperando 30 segundos entre cada
lavado. Se dejaron secar de 25-35 minutos, hasta observar que todo el alcohol se
haya evaporado. Se quitaron los tubos de la placa magnética (Agencourt SPRIPlate
96R) para añadirles 40µL de H 2 O ultra pura y se los agitó usando un vórtex por unos
segundos. A todos los tubos se volvieron a poner en la placa magnética (Agencourt
SPRIPlate 96R) y se cargó directamente a la placa de secuenciación, tomando 35µL
sin topar el anillo que se forma en el tubo.
CAPÍTULO 3: RESULTADOS
3.1
Muestras Biológicas
En este estudio se obtuvieron muestras de sangre de pacientes del Hospital
Carlos Andrade Marín y del Centro Médico Orbe. Se contó con 55 controles y 56
pacientes con EA.
3.2
Edad y Sexo
La totalidad de individuos con enfermedad de Alzheimer fue de 56 y su edad
media fue de 73.12± 10.38 años en un rango de 59 a 95 años con una mediana de
74 años. El 43% de los individuos tenían una edad inferior a la edad media, mientras
que el 57% de los individuos tenían una edad superior a la edad media. El grupo
afecto contó con 30 mujeres, es decir un 53.57%, mientras que 26 fueron hombres,
es decir un 46.43%.
El total de controles, en el estudio fue de 55 y su edad media fue de 72.38±
9.89 años en un rango de 60 a 89 años con una mediana de 68 años. El 55% de los
individuos tenían una edad inferior a la edad media, mientras que el 45% de los
individuos tenían una edad superior a la edad media. El grupo control contó con 24
mujeres, es decir un 43.64%, mientras que 31 fueron hombres, es decir un 56.36%.
3.3
Extracción de ADN y cuantificación
Para la extracción de ADN se utilizó el kit PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit
de Invitrogen y se obtuvieron 111 muestras de ADN entre individuos controles y
afectos.
Figura 3.1: ADN extraído de muestras de sangre periférica en gel de agarosa al 1% teñido
con bromuro de etidio y la utilización de marcador molecular Low Mass Ladder de 100pb
Para la cuantificación de las extracciones de ADN se utilizó el Kit Quant-iT
dsDNA BR Assay. Los resultados se los puede observar en las dos Tablas incluidas
en los Anexos.
El promedio de concentración de DNA extraído a partir de muestras de
pacientes fue de 49.25± 24.98 µg/mL con un rango de 3.24 – 75 µg/mL. El promedio
de concentración de DNA extraído a partir de las muestras de individuo control fue de
16.33± 9.5 µg/mL entre el rango de 7 – 72.7 µg/mL.
3.4
Determinación del genotipo
3.4.1- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y RFLP del gen CTSD (Ala224Val)
Mediante PCR se logró obtener una óptima amplificación del fragmento
deseado de 303pb en casos afectos y controles. Los resultados fueron observados
en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y mediante la utilización del
transiluminador.
Figura 3.2: Fotografía del gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio en el que se
visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de CTSD
(Ala-224Val) de 303pb.
Ya obtenido el producto PCR deseado, de 303pb, se lo sometió a digestión
enzimática con AciI. Esta enzima tuvo 4 sitios de restricción en el fragmento de PCR,
por lo cual hubo más cortes a parte del corte deseado del polimorfismo. Los
fragmentos que diferenciaron a los diferentes genotipos y que fueron de nuestro
interés fueron aquellos de 153pb, 76pb y 77pb.
Para el genotipo homocigoto CC se observó una banda que corresponde a
dos fragmentos de 76pb y 77pb, más dos bandas adicionales de 100pb y 50pb que
no interfieren con los resultados, ni con identificación de los genotipos. La enzima
realiza un corte en ambas cadenas del producto amplificado ya que esta reconoce el
sitio de restricción generando así dos fragmentos.
Para el genotipo homocigoto TT se observó una banda de 153pb, más dos
bandas adicionales de 100pb y 50pb que no interfirieron con los resultados ni con la
identificación de los genotipos. La presencia de solo una banda refleja que no hubo
un corte enzimático en esa región por el cambio de nucleótido, por lo tanto hubo un
cambio en el sitio de reconocimiento de la enzima en ambas cadenas del producto
amplificado.
Para el genotipo heterocigoto TC o CT se observó una banda que
corresponde a dos fragmentos de 76pb y 77pb, otra de 153pb, más dos bandas
adicionales de 100pb y 50pb que no interfirieron con los resultados ni con la
identificación de los genotipos. El corte de la enzima solo se genera en una cadena
del producto amplificado por lo que existe sólo un sitio de restricción de la enzima y
así se generan dos bandas.
En la siguiente Figura se pueden observar los diferentes genotipos
generados en un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio:
Figura 3.3: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio, revelando los
diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala-224Val con la enzima AciI. En
el posillo 7 se representa el genotipo heterocigoto C/T, en el posillo 11 el genotipo
homocigoto raro T/T y en el posillo 13 el genotipo homocigoto normal C/C.
3.4.2- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y RFLP del gen CST3 (Ala-73Val)
deseado de 262pb en casos afectos y controles. Los resultados fueron observados
en un gel de agarosa al 2% con la utilización de transiluminador.
visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de CST3
Ya obtenido el producto PCR deseado, de 262pb, se lo sometió a digestión
enzimática con EagI. Las bandas observadas son de 262pb y otra que corresponde a
dos fragmentos de 132pb y 130pb.
Para el genotipo homocigoto GG se observó una banda que corresponde a
dos fragmentos de 132pb y 130pb. La enzima realiza un corte en ambas cadenas del
producto amplificado ya que esta reconoce el sitio de restricción generando así dos
fragmentos.
Para el genotipo homocigoto AA se observa una banda de 262pb. La
presencia de sólo una banda da a entender que no hubo un corte enzimático en esa
región por el cambio de nucleótido, por lo tanto hubo un cambio en el sitio de
reconocimiento de la enzima en ambas cadenas del producto amplificado.
Para el genotipo heterocigoto GA o AG se observó una banda de 262pb y
otra que corresponde a dos fragmentos de 132pb y 130pb. El corte de la enzima sólo
se genera en una cadena del producto amplificado por lo que existe sólo un sitio de
reconocimiento de la enzima y así se generan dos bandas.
En la siguiente Figura se pueden observar los diferentes genotipos
generados en un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio:
Figura 3.5: Fotografía del gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio, revelando los
diferentes genotipos de la restricción para el polimorfismo Ala-73Val con la enzima EagI. En
el posillo 2 se representa el genotipo heterocigoto G/A, en el posillo 4 el genotipo homocigoto
raro A/A y en el posillo 6 el genotipo homocigoto normal G/G.
3.4.3- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del gen MnSOD
(Ile-58Thr)
deseado de 264pb en casos afectos y controles. Después de la purificación realizada
con Agencourt® AMPure® XP se observaron los resultados en un gel de agarosa al
2% teñido con bromuro de etidio con la utilización del transiluminador.
visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de MnSOD
(Ile-58Thr) de 264pb.
Al producto de PCR ya purificado se lo sometió a la reacción de
secuenciación, donde se añadieron los fluorocromos específicos para cada
nucleótido. Una vez terminada la reacción, se purificó al producto de secuenciación
mediante Agencourt® CleanSEQ® para introducirlo en el analizador genético 3130
de Applied Biosystems y así determinar la variante polimórfica. La Figura 3.7
representa los picos de fluorescencia de los diferentes genotipos observados en
electroforesis capilar.
Figura 3.7: Representación gráfica del genotipo normal T/T de la secuenciación capilar de
MnSOD (Ile-58Thr)
3.4.4- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del gen MnSOD
(Ala-9Val)
deseado de 217pb en casos afectos y controles. Después de la purificación realizada
con Agencourt® AMPure® XP se observaron los resultados en un gel de agarosa al
2% teñido con bromuro de etidio con la utilización de transiluminador.
visualizan los resultados de la PCR estandarizada correspondiente al fragmento de MnSOD
Al producto de PCR ya purificado se lo sometió a la reacción de
secuenciación, donde se añadieron los fluorocromos específicos para cada
nucleótido. Una vez terminada la reacción, se purificó al producto de secuenciación
mediante Agencourt® CleanSEQ® para introducirlo en el analizador genético 3130
de Applied Biosystems y así determinar la variante polimórfica. Los genotipos
resultantes en electroforesis capilar se observan en la Figura 3.9.
a)
b)
c)
Figura 3.9: Representación gráfica de: a) genotipo normal T/T, b) genotipo heterocigoto T/C y
c) genotipo normal C/C de la secuenciación capilar de MnSOD (Ala-9Val).
El agrupamiento de muestras secuenciadas diferenciando los polimorfismos
y comparándolos con la secuencia del gen MnSOD utilizando el programa SeqScape
se muestran en el Anexo E.
Se realizó adicionalmente una matriz que agrupa todos los resultados de
todos los polimorfismos analizados con sus diferentes genotipos (ver Anexo D).
3.5
Frecuencia de alelos
En la Tabla 3.1 se agruparon los resultados de los genotipos observados,
mostrando la distribución total de la población en estudio. En cuanto al polimorfismo
CST3 (Ala-73Val) (G>A), se puede constatar en el total de la población, conformado
por afectos y controles, un mayor porcentaje de individuos que poseen el alelo
normal G. De igual manera en el polimorfismo CTSD (Ala-224Val) (C>T) existe un
mayor porcentaje del alelo C normal en la población. Por su parte, en el polimorfismo
MnSOD (Ile-58Thr) (T>C) se encontró solamente el alelo G normal en toda la
población, por lo que no se realizó ningún cálculo estadístico adicional. Finalmente,
los datos obtenidos para el polimorfismo MnSOD (Ala-9Val) (T>C) revelan al alelo C
raro con un mayor porcentaje que el normal en la población.
Tabla 3.1: Resumen de los resultados obtenidos de los tres diferentes genotipos de cada
polimorfismo y la distribución de los alelos de la población
Gen (polimorfismo)
CST3 (G73A)
a
a
CTSD (C224T)
MnSOD (T58C)
MnSOD (T9C)
a
a
a
Genotipo
# de casos
% en la población
Alelo
%
G/G
90
81.08%
G
85.14%
G/A
9
8.11%
A
14.86%
A/A
12
10.81%
C/C
65
58.56%
C
77.03%
C/T
41
36.94%
T
22.97%
T/T
5
4.5%
T/T
111
100%
T
100%
C/T
-
-
C
-
C/C
-
-
T/T
21
18.92%
T
41.44%
C/T
50
45.06%
C
58.56%
C/C
40
36.02%
Para cada polimorfismo se realizó el análisis en una población de 111 individuos
3.5.1- Polimorfismo MnSOD Ala-9Val (T>C)
En la siguiente Tabla se describe la distribución de las frecuencias
genotípicas y alélicas. En la población de casos se encontró 13 individuos
homocigotos normales (T/T), 24 individuos heterocigotos (T/C) y 19 individuos
homocigotos raros (C/C). Por otro lado, en el grupo control se encontraron 8
individuos homocigotos normales (T/T), 26 individuos heterocigotos (T/C) y 21
individuos homocigotos raros (C/C). Respecto a la frecuencia del alelo T, para el
grupo de pacientes fue de 0.45 y para el grupo control fue de 0.38, mientras que la
frecuencia del alelo C en grupo de pacientes fue de 0.55 y en el grupo control fue de
0.62. Al realizar el análisis de chi cuadrado para cada población se estableció que los
dos grupos están en equilibrio Hardy-Weinberg y no existen diferencias significativas
en cada uno de ellos.
Tabla 3.2: Análisis Hardy-Weinberg para MnSOD Ala-9Val (T>C)
No. de
Gen
Población
Genotipo
Frecuencia Frecuencia Frecuencia
%
individuos
HWE (P)
genotípica
esperada
alélica
0.45
T/T
13
23.21
0.23
0.20
T/C
24
42.86
0.43
0.49
C/C
19
33.93
0.34
0.31
0.55
0.38
0.99
(0.32)
Afectos
Total
MnSOD
T9C
56
T/T
8
14.55
0.15
0.15
T/C
26
47.27
0.47
0.47
C/C
21
38.18
0.38
0.38
0.0001
(0.99)
Controles
Total
55
0.62
3.5.2- Polimorfismo CST3 Ala-73Thr (G > A)
genotípicas y alélicas. En la población de pacientes se encontró 42 individuos
homocigotos normales (G/G), 6 individuos heterocigotos (G/A) y 8 individuos
homocigotos raros (A/A). Por otro lado, en los controles se encontró 48 individuos
homocigotos normales (G/G), 3 individuos heterocigotos (G/A) y 4 individuos
homocigotos raros (A/A). Respecto a la frecuencia del alelo G, para el grupo de
pacientes fue de 0.8 y para el grupo control fue de 0.9, mientras que la frecuencia del
alelo A en el grupo de pacientes fue de 0.2 y en el grupo control fue de 0.1. Al
realizar el análisis de chi cuadrado para cada población se estableció que los dos
grupos no están en equilibrio Hardy-Weinberg y existen diferencias significativas en
cada uno de ellos.
Tabla 3.3: Análisis Hardy-Weinberg para CST3 Ala-73Thr (G > A)
No. de
Gen
Población
Genotipo
Frecuencia
Frecuencia
Frecuencia
genotípica
esperada
alélica
0.80
%
individuos
HWE (P)
G/G
42
75.00
0.75
0.65
G/A
6
10.71
0.11
0.32
A/A
8
14.29
0.14
0.04
0.20
0.90
24.44
(0.00001)
Afectos
Total
CST3
G73A
56
G/G
48
87.27
0.87
0.81
G/A
3
5.45
0.05
0.18
A/A
4
7.27
0.07
0.01
26.72
(0.00001)
Controles
Total
55
0.10
3.5.3- Polimorfismo CTSD Ala-224Val (C > T)
genotípicas y alélicas. En la población de pacientes se encontraron 20 individuos
homocigotos normales (C/C), 32 individuos heterocigotos (C/T) y 4 individuos
homocigoto raro (T/T). Por otro lado, en el grupo control se encontraron 45 individuos
homocigotos normales (C/C), 9 individuos heterocigotos (C/T) y 1 individuos
homocigoto raro (T/T). Respecto a la frecuencia del alelo C, para el grupo de
pacientes fue de 0.64 y para el grupo control fue de 0.9, mientras que la frecuencia
del alelo T en el grupo de pacientes fue de 0.36 y en el grupo control fue de 0.1. Al
realizar el análisis de chi cuadrado para cada población se estableció que los dos
grupos están en equilibrio Hardy-Weinberg y no existen diferencias significativas
entre ellos.
Tabla 3.4: Análisis Hardy-Weinberg para CTSD Ala-224Val (C > T)
No. de
Gen
Población Genotipo
Frecuencia Frecuencia Frecuencia
%
individuos
HWE (P)
genotípica
esperada
alélica
0.64
C/C
20
35.71
0.36
0.41
C/T
32
57.14
0.57
0.46
T/T
4
7.14
0.07
0.13
0.36
0.90
3.35 (0.07)
Afectos
Total
CTSD
C224T
56
C/C
45
81.82
0.82
0.81
C/T
9
16.36
0.16
0.18
T/T
1
1.82
0.02
0.01
0.45 (0.5)
Controles
Total
55
0.10
3.6
Análisis estadístico
3.6.1- Pruebas de Chi-cuadrado
Se realizó una congruencia de datos de los dos grupos de cada
polimorfismo, para determinar la asociación que tienen las variantes genéticas en
cada gen y establecer su nivel de significancia. Para CST3 G73A presenta un valor
de X2 de 51.27. Por su parte, MnSOD T9C obtuvo un valor de Χ2 de 0.57 y CTSD
C224T adquirió un valor de X2 de 0.21, que indicaría una relevancia de las
diferencias entre los pacientes y controles.
Tabla 3.5: Análisis de Chi-cuadrado para los diferentes genes estudiados con sus
respectivos polimorfismos.
Gen
MnSOD T9C
CST3 G73A
CTSD C224T
ρ
X²
Genotipo
T/T
T/C
C/C
Afectos
13
24
19
Controles
8
26
21
Genotipo
G/G
G/A
A/A
Afectos
42
6
8
Controles
48
3
4
Genotipo
C/C
C/T
T/T
Afectos
20
32
4
Controles
45
9
1
Valores calculados con 1 grado de libertad, *:significativo, NS: no significativo
NS
0.57
51.27*
NS
0.21
0.45
0.00001
0.65
3.6.2- Pruebas de Odds ratio
Mediante la prueba de Odds ratio se logró determinar qué genotipo o alelo
específico genera un riesgo relativo en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.
En la siguiente Tabla se observan los riesgos relativos de los diferentes
polimorfismos. Los polimorfismos de MnSOD T9C y CST3 G73A no presentan un
valor relevante de Odds ratio, sin embargo
CTSD C224T presenta un valor
significativo para el heterocigoto C/T y homocigoto raro T/T. Para el grupo
conformado por el heterocigoto y homocigoto raro C/T + T/T presenta un OR de 8,1
(p<0,0001), esto quiere decir que un individuo que presente el alelo T tendrá 8.1
veces más riesgo en desarrollar la enfermedad de Alzheimer que uno normal. El
individuo que posea el genotipo homocigoto T/T tendrá 9 veces más riesgo de
desarrollar la enfermedad que un individuo normal, ya que se obtuvo como OR un
valor de 9 (p<0,025).
Tabla 3.6: Análisis de Odds ratio para los tres polimorfismos
Controles
Gen
Genotipo
Afectos N(%)
a
OR
b
P
95% IC
N(%)
r
T/T
13 (23.2)
8 (14.5)
1
T/C
24 (42.9)
26 (47.3)
0.6
0.2 - 1.6
0.42
C/C
19 (33.9)
21 (38.2)
0.6
0.2 - 1.6
0.42
T/C + C/C
43 (76.8)
47 (85.5)
0.6
0.2 - 1.5
0.36
G/G
42 (75.0)
48 (87.3)
1
G/A
6 (10.7)
3 (5.5)
2.3
0.5 - 9.7
0.43
A/A
8 (14.3)
4 (7.3)
2.3
0.6 - 8.1
0.32
G/A + A/A
14 (25.0)
7 (12.8)
2.3
0.8 - 6.2
0.16
C/C
20 (35.7)
45 (81.8)
1
C/T
32 (57.1)
9 (16.4)
8.0
3.2 - 19.8
0.0001*
T/T
4 (7.1)
1 (1.8)
9.0
0.9 - 85.7
0.025*
C/T + T/T
36 (64.2)
10 (18.2)
8.1
3.4 - 19.5
0.0001*
MnSOD T9C
NS
NS
NS
r
CST3 G73A
NS
NS
NS
r
CTSD C224T
*: significativo, NS: no significativo, a: Odds ratio, b: intervalos de confianza, r: referencia
CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN
El desorden neurodegenerativo, enfermedad de Alzheimer, cada vez es más
prevalente en poblaciones ancianas a nivel mundial, por esta razón el envejecimiento
se convierte en un factor de riesgo mayor para el desarrollo de la enfermedad y las
cifras de prevalencia se incrementan cada vez más mundialmente (Mucke, 2009).
Este estudio empleó muestras de sangre periférica para los 2 grupos
estudiados: casos y controles, de los cuales se realizó la extracción de ADN
mediante el uso de un kit de extracción de ADN de Invitrogen. Las muestras de
sangre de pacientes, provenientes del Servicio de Neurología, Hospital “Carlos
Andrade Marín”, con diagnóstico de EA de acuerdo a los criterios actualmente en
uso.
Los rangos de concentración de ADN son bien amplios debido a que, en
ocasiones, en la recolección de estas muestras se entregaron las mismas en grupos
máximo de 5 muestras que no habían sido extraídas el mismo día. Por lo que, con el
transcurso del tiempo, las muestras se degradaban. Las muestras de sangre
pudieron no haber tenido un refrigeramiento adecuado o inmediato que causa un
decremento en la concentración de ADN. Otra razón puede ser que algún individuo
pudo haber tenido mayor cantidad de glóbulos blancos que rojos, por lo que se
obtiene menor cantidad de ADN. Pero a pesar de que algunas muestras se
degradaron se pudo realizar el proyecto.
La técnica PCR-RFLP ha sido utilizada en varios estudios, como por ejemplo
en un estudio de polimorfismos en las regiones -31(T>C), -511(C>T) Y +3954(C>T)
del gen IL-1β de interleuquina-1β en población ecuatoriana con cáncer gástrico y
presencia de Helicobacter pylori (Cumbal, 2010). Los fragmentos de ADN
amplificados mediante PCR se trataron con enzimas de restricción, que los cortaron
en fragmentos más pequeños. Este proceso tiene una gran ventaja, ya que es más
económico y sencillo de realizar que otras técnicas moleculares. El estudio
presentado aquí sirvió para 2 polimorfismos, mientras que para los otros dos
polimorfismos no se pudo seguir esta técnica, debido a que no existían enzimas que
reconozcan
como
sitio
de
restricción
el
polimorfismo
deseado.
Para
la
estandarización de la PCR y restricción enzimática no presentaron mayor problema
los ADNs extraídos previamente.
La metodología de secuenciación capilar automatizada reemplaza al sistema
basado en geles de acrilamida/bisacrilamida, donde se sustituye este soporte por un
polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la
muestra de secuenciación y las muestras se van analizando una a una. La calidad de
los datos que se obtienen a partir de la secuenciación depende de la pureza y
cuantificación de las muestras de ADN. Después de haber realizado la PCR de los
otros dos polimorfismos restantes, se purificaron los productos de PCR para que no
exista interferencia alguna en la PCR de secuenciación y se obtengan buenos
resultados. Al realizar este proceso hubo un poco de dificultades ya que esta es una
técnica sensible a la luz, pero aun así se obtuvieron buenos resultados.
Debido a que la enfermedad de Alzheimer es una enfermedad multifactorial y
tiene una herencia autosómica dominante, el hecho de presentar la enfermedad
depende de varios factores, como ambientales o genéticos. Al parecer no sólo
interviene una variante polimórfica para el desarrollo de la enfermedad, sino de
varias. Se han identificado tres genes que incrementan el riesgo de presentar la EA.
El gen APP codifica la proteína precursora amiloide, que normalmente se fragmenta
para formar β-amiloide. Mutaciones en APP resultan en una incorrecta fragmentación
de la proteína, produciendo una versión de β-amiloide que es más afín a formar las
placas amiloide. El gen PSEN codifica para proteínas que funcionan en el corte de la
proteína precursora amiloide (APP). Mutaciones en PSEN1 y PSEN2 resulta en un
corte incorrecto de la APP. Estos genes intervienen en el inicio temprano de la EA
(Goedert et al, 2006). La mayoría de casos en la enfermedad de Alzheimer se
encuentran en la forma tardía y esta forma depende de varios polimorfismos en
diversos genes. De igual manera el desarrollo de la EA está ligado a la edad y a la
exposición de factores ambientales. El factor de riesgo genético en esta etapa es la
herencia del alelo ε4 del gen APOE y aún se desconoce el modo de acción de éste
en la progresión de la enfermedad de Alzheimer. Más del 50% de personas tienen al
menos un alelo APOE ε4. Sin embargo, este polimorfismo es de penetrancia
incompleta; quiere decir que la presencia de esta mutación no siempre incrementa el
riesgo de desarrollar la enfermedad y existen otras mutaciones que contribuyen al
desarrollo esporádico de inicio tardío de la enfermedad de Alzheimer (Xiong et al,
2005).
Así como existen polimorfismos en genes que intervienen en el riesgo de la
EA, también se ha encontrado mutaciones que protegen al individuo en contra de la
enfermedad. Un estudio realizado por Jonsson et al (2012), descubrió una mutación
codificante (A673T) en el gen APP que protege de enfermedad de Alzheimer y del
deterioro cognitivo en ancianos que no presentan la enfermedad. El fuerte efecto
protector de la sustitución A673T contra la enfermedad de Alzheimer apoya la
hipótesis de que la reducción de la β-escisión de APP puede proteger contra la
enfermedad. Según Cavalli-Sforza y Bodmer (1999), cuando el ambiente cambia, se
necesitan nuevas soluciones a nuevos problemas, que crea la posibilidad de que
algunos genes mutantes, previamente deletéreos, puedan ser beneficiosos. Aunque
el ambiente no cambie puede ocurrir un cambio genético al azar que es ventajoso.
En este estudio se analizaron 4 polimorfismos Ala-73Thr (G>A) del gen
CST3, Ala-224Val (C>T) del gen CTSD, Ile-58Thr (T>C) y Ala-9Val (T>C) del gen
MnSOD. En cuanto a las frecuencias genotípicas y alélicas para Ala-73Thr (G>A),
Ala-224Val (C>T) e Ile-58Thr (T>C) se observó un mayor porcentaje de individuos
que poseen el alelo normal, G (85.14%), C (77,03%) y T (100%) respectivamente.
Por otro lado para Ala-9Val (T>C) muestra más frecuencia el alelo raro C (59,56%)
en la población de estudio.
Comparando las frecuencias genotípicas y alélicas con otras poblaciones, la
población del presente trabajo tiene un comportamiento afín a la de Polonia
(Kowalski et al, 2010) en cuanto al polimorfismo Ile-58Thr (T>C), pudiéndose
observar en ambas la ausencia del genotipo homocigoto raro CC, la baja frecuencia
del genotipo heterocigoto TC (Ecuador 0%, Polonia 1.3%) y por último el genotipo
homocigoto normal TT (Ecuador 100%, Polonia 98.7%). De igual, los resultados del
presente estudio coinciden con aquellos de un estudio en población de Taiwán donde
se halló una total ausencia de los genotipos heterocigoto TC y homocigoto raro CC
(Wang et al, 2010). Al igual que la frecuencia genotípica, la frecuencia alélica es igual
en la población ecuatoriana con relación a la población taiwanesa en el alelo T. Los
resultados de las frecuencias genotípicas y alélicas de Ala-9Val (T>C) tienen gran
similitud en la población de Polonia, observando para el genotipo heterocigoto TC
(55% Ecuador, 54.36% Polonia), el genotipo homocigoto raro CC (36% Ecuador,
23.15% Polonia) y el genotipo homocigoto normal TT (18.91%Ecuador, 22.81%
Polonia); y la frecuencia alélica de la población estudiada comparte también con
Polonia en mayor frecuencia el alelo C (Kowalski et al, 2010).
La información acerca de las tendencias genotípicas y alélicas de Ala-73Thr
(G>A) del presente estudio es diferente a las poblaciones de Taiwán, Italia y Japón.
Se pudo observar para el genotipo heterocigoto GA (8.11% Ecuador, 17.3% Taiwán),
genotipo homocigoto raro AA (10.81% Ecuador, 2.83 Taiwán) y el genotipo
homocigoto normal GG (81.08% Ecuador, 79.9% Taiwán), que es el que más se
aproxima. Con el resto de países de Italia y Japón los resultados son similares a
estas frecuencias genotípicas acercándose más a la frecuencia genotípica de
homocigoto normal (Nacmias et al, 2006; Yamamoto-Watanabe et al, 2010). Con
respecto a la frecuencia alélica en la población ecuatoriana se observó un mayor
porcentaje del alelo G al igual que en la población taiwanesa.
Los datos obtenidos, con relación a Ala-224Val (C>T), para las frecuencias
genotípicas y alélicas en este estudio, fueron diferentes a otras poblaciones en el
mundo: Italia, Korea, Alemania, Escocia, Polonia (Mariani et al, 2006; Jeong et al,
2011). En el genotipo heterocigoto CT se determinó una frecuencia de 36.94%
Ecuador, 80.14% Italia, 4.65% Korea, 13.6% Alemania, 18.1% Escocia y 9% Polonia.
El genotipo homocigoto raro TT tuvo 4,5% Ecuador, 3% Italia, 0.5% Korea, 0%
Alemania, 2% Escocia y 0% Polonia. Por último, para el genotipo homocigoto normal
CC se halló 58.56% Ecuador, 80.14% Italia, 95.1% Korea, 86.4% Alemania, 79.9%
Escocia y 91% Polonia (Mariani et al, 2006; Jeong et al, 2011). En todas las
poblaciones ya mencionadas se ha encontrado el alelo C en mayor frecuencia que el
alelo T.
A continuación se realizaron los análisis estadísticos para Ala-9Val (T>C),
Ala-224Val (C>T) y Ala-73Thr (G>A). No se realizaron las pruebas estadísticas para
Ile-58Thr (T>C) porque no se obtuvieron resultados de los genotipos heterocigoto y
homocigoto raro. En el Equilibrio Hardy-Weinberg se obtuvo que Ala-9Val (T>C) y
Ala-224Val (C>T) cumplen con el equilibrio y sugiere que no existen fuerzas externas
evolutivas (selección natural o mutación) que afecten el equilibrio de la población en
estudio; estas son estables. Mientras que para Ala-73Thr (G>A) se demostró una
desviación del equilibrio en los dos grupos afectos y controles con un valor X2 HW de
24.44; p<0.05 y 26.72; p<0.05 respectivamente, lo que sugiere que este polimorfismo
es susceptible a fuerzas externas evolutivas que afectan el equilibrio de la población
en estudio.
El siguiente paso fue realizar un análisis de Chi cuadrado con un grado de
libertad para
los
genotipos
encontrados
de cada
polimorfismo
estudiado,
determinando el nivel de significancia de la presencia de cada variante entre los dos
grupos; afectos y controles. Los resultados obtenidos para Ala-9Val (T>C) y Ala224Val (C>T) fueron de X2 = 0.57 y 0.21, respectivamente, estos valores se
consideran bajos lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre los
grupos afectos y control. Por su parte, el valor de X2 para Ala-73Thr (G>A) fue de
51.27, que indica una diferencia significativa entre los dos grupos, afectos y controles
y estos resultados concuerdan con el análisis de Hardy-Weinberg.
La última prueba estadística que se realizó en el presente estudió fue Odds
ratio, la cual se utilizó para determinar el riesgo que posee un individuo para
desarrollar la enfermedad en presencia de los polimorfismos Ala-9Val (T>C), Ala224Val (C>T) y Ala-73Thr (G>A). En este análisis se obtiene un cociente que
representa el número de veces que ocurre un suceso frente al número de veces en
que no ocurre. Así, se calcularon los valores de OR con IC 95% con respecto al
homocigoto normal de cada polimorfismo. Según Chistyakov et al (2000), la
superóxido dismutasa (SOD) es una importante enzima antioxidante que interviene
en la desintoxicación de los radicales superóxidos.
El daño de los radicales de
oxigeno libres puede afectar a neuronas a través de la vía de peroxidación lipídica
del ADN mitocondrial, la cadena respiratoria y la proteína de reticulación de los
neurofilamentos. De igual manera se ha encontrado relaciones del polimorfismo Ala9Val del gen SOD2 en desordenes neurodegenerativos; así como del polimorfismo
Ile-58Thr, debido a que desestabiliza la interface tetramérica de MnSOD y reduce su
actividad
enzimática.
Además
de
posibles
relaciones
con
enfermedades
neurodegenerativas, este estudio relacionó un determinado polimorfismo con
neuropatía diabética en la diabetes mellitus tipo 1, en el cual encontró únicamente
asociación del polimorfismo Ala-9Val con la enfermedad. Estudios realizados en la
enfermedad de Parkinson por Wang et al (2010) y en desordenes depresivos por
Galecki et al (2010), muestran posibles asociaciones con la variante Ala-9Val y
ninguna asociación con Ile-58Thr. Este polimorfismo se ha encontrado en menos del
1% en toda la población y en el estudio de desórdenes depresivos no se observó en
pacientes. En el presente trabajo, para el polimorfismo Ala-9Val (T>C) se obtuvieron
valores de OR no significativos para todos los genotipos, lo que determinó que esta
variante no presenta asociación con la enfermedad de Alzheimer.
Al realizar el análisis del polimorfismo Ala-73Thr (G>A) del gen CST3 en un
estudio de la población italiana por Nacmias et al (2006), no se encontró una
asociación significativa entre la enfermedad de Alzheimer con esta variante y así
mismo no se encontraron diferencias estadísticas de las frecuencias alélicas en los
dos grupos estudiados. En otros estudios se ha observado que el gen CST3 que
contiene este polimorfismo ha sido asociado con un elevado riesgo para la
enfermedad de Alzheimer en poblaciones caucásicas. Sin embargo, al igual que en
el estudio de población italiana, los resultados no muestran correlación con el
desarrollo de la enfermedad en Japón (Maruyama et. al: 2001), Alemania (Dodel et.
al: 2002) y Holanda (Roks et. al: 2001). En el presente estudio no se observaron
valores de OR importantes que muestren una relación entre la variante polimórfica
con la enfermedad, por lo que concuerda con los resultados que presentaron en
otros estudios.
En individuos que han fallecido por la enfermedad de Alzheimer se ha
observado una gran acumulación de placas seniles, que están conformadas por la
proteína β-amiloide. Genes como CTSD codifican para la proteína catepsina D, la
cual interviene en la síntesis de Aβ, en el depósito y eliminación. Esta proteína se ha
visto implicada en el proceso de degradación de APP y la proteína TAU. Por esta
razón puede que polimorfismos generados en CTSD intervengan en la acumulación
de la proteína TAU y ovillos neurofibrilares, generando así la enfermedad de
Alzheimer (Mariani et. al: 2006). En una publicación realizada por Jeong et al: 2011,
en demencia vascular, se determinó que el polimorfismo del gen CTSD no tenía
relación con la enfermedad en la población Koreana, a diferencia de otros estudios
realizados en poblaciones alemanas (P = 0.009), británicas (P < 0.001) o americanas
(P < 0.001). En el 2006 Mariani et al sugirieron, que la variante polimórfica Ala224Val (C>T) del gen CTSD incrementa el riesgo relativo en la enfermedad de
Alzheimer. En este estudio caso-control realizado en la población ecuatoriana, se
encontró que los datos obtenidos para el genotipo heterocigoto C/T es más común
en la población de pacientes que en los controles sanos. Al determinar el riesgo
relativo del genotipo heterocigoto C/T, éste fue altamente significativo, con un OR de
8 (IC 95% = 3.2 - 19.8). Para el genotipo homocigoto raro T/T se obtuvo resultados
significativos, con un OR de 9 (IC 95% = 0.9 - 85.7). Este intervalo de confianza es
amplio, debido a que hay pocos casos que poseen este genotipo, ya que la población
ecuatoriana es más susceptible a que se encuentren heterocigotos que homocigotos
raros para este polimorfismo y en esta enfermedad. Pero esto no quiere decir que
este genotipo no es importante, ya que se realizó el mismo análisis pero
conjuntamente con los genotipos heterocigoto C/T y homocigoto raro T/T, obteniendo
un OR de 8.1 (IC = 3.4 - 19.5) altamente significativo; sugiriendo que personas que
posean el alelo T tendrán 8.1 veces más riesgo en desarrollar la enfermedad de
Alzheimer que las personas que no tienen esta variante.
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES
El estudio de los polimorfismos Ala-73Thr (G>A) del gen CST3, Ala-224Val
(C>T) del gen CTSD, Ile-58Thr (T>C) y Ala-9Val (T>C) del gen MnSOD se llevó a
cabo mediante la utilización de la metodología PCR-RFLP (restricción de fragmentos
de longitud polimórfica) y secuenciación capilar en una muestra de 111 individuos de
nacionalidad ecuatoriana.
Se logró estandarizar la técnica de PCR-RFLP para los polimorfismos Ala73Thr y Ala-224Val, obteniendo las condiciones óptimas de trabajo para afectos y
controles. Así mismo, se obtuvieron óptimas condiciones de PCR de secuenciación
para los polimorfismos Ile-58Thr y Ala-9Val para afectos y controles.
La comparación de las frecuencias genotípicas y alélicas fueron similares
para Ala-9Val (T>C) y Ala-224Val (C>T) entre los grupos control y afectos. En el caso
de Ala-73Thr (G>A), las frecuencias genotípicas y alélicas fueron diferentes para el
grupo afecto y el grupo control, lo que sugiere que este polimorfismo estudiado para
la enfermedad de Alzheimer de origen genético, presenta un leve impacto en la
población ecuatoriana.
El análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg para Ala-9Val (T>C) y Ala-224Val
(C>T) confirmó que la población en estudio cumple con el equilibrio y que no fue
afectada por fuerzas externas evolutivas, que pueden ser selección natural o
mutación. Mientras que para Ala-73Thr (G>A) se obtuvieron valores que demuestran
un desequilibrio de la población y esta es afectada por las fuerzas evolutivas.
La prueba de Chi cuadrado confirmó los resultados del equilibrio de HardyWeinberg obteniendo valores no significativos para Ala-9Val (T>C) y Ala-224Val
(C>T); y significativos para Ala-73Thr (G>A).
Finalmente, los resultados de interés que se encontraron en la prueba
estadística de Odds ratio en la población ecuatoriana, fue de 8.1 veces más riesgo
de que un individuo portador del alelo T, ligado a la enfermedad, desarrolle
Alzheimer. Al tener las dos copias del alelo T, este riesgo se incrementa 9 veces
más. Por ello, esta variante polimórfica puede desempeñar un importante rol
biológico en la patogenia de EA.
CAPÍTULO 6: RECOMENDACIONES
Mantener las muestras de sangre siempre en frio y si se necesita realizar un
traslado de la muestra, se recomienda mantener la cadena de frío para evitar
degradación y daño a la muestra.
Es preferible realizar extracción de ADN a partir de sangre periférica el
mismo día que se realizó la extracción de la sangre periférica, para así evitar que
haya una degradación de la muestra por el transcurso del tiempo.
En la estandarización de la PCR es mejor trabajar primeramente con
volúmenes pequeños como 25µL para no malgastar los reactivos y ahorrar costos.
Cuando ya se haya logrado estandarizar la técnica se aumenta el volumen a lo que
se requiera.
Para que no exista error en el genotipaje, es necesaria una adecuada
optimización de las condiciones de PCR, debiéndose obtener bandas sólidas y de
buena concentración de producto
y de ese modo se puedan observar
adecuadamente los fragmentos resultantes de la digestión enzimática.
Si es que se utilizaría bromuro de etidio para la tinción de un gel de agarosa,
es muy importante que este paso sea efectuado en una cámara de flujo laminar para
evitar daños a nuestra salud, ya que el bromuro de etidio es altamente cancerígeno.
En la secuenciación capilar es necesario utilizar una buena concentración y
pureza de ADN, para obtener buenos resultados. De igual manera se debe realizar
un buen proceso de purificación para que no existan interrupciones en la PCR de
secuenciación, seguida de la electroforesis capilar de la misma.
Debido a que la enfermedad de Alzheimer es multifactorial y autosómica
dominante es importante realizar un estudio de más genes en la población
ecuatoriana, ya que estudios en otras poblaciones no se aplican a nuestro entorno y
así brindar un mejor entendimiento de la enfermedad en su complejidad molecular en
nuestro país.
CAPÍTULO 7: BIBLIOGRAFÍA
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