2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Tese
Microencapsulação de carotenoides: caracterização, estabilidade e aplicação
em sistemas alimentícios
Josiane Kuhn Rutz
Pelotas, 2016
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Josiane Kuhn Rutz
Microencapsulação de carotenoides: caracterização, estabilidade e aplicação
em sistemas alimentícios
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, da Universidade Federal de
Pelotas, como requisito parcial à obtenção
do título de Doutora em Ciência e Tecnologia
de Alimentos.
Comitê de orientação: Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi
Profª. Drª. Caroline Dellinghausen Borges
Pelotas, 2016
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Josiane Kuhn Rutz
Microencapsulação de carotenoides: caracterização, estabilidade e aplicação em
sistemas alimentícios
Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutor em Ciência
e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de
Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
Data da Defesa: 18 de fevereiro de 2016.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Rui Carlos Zambiazi
(Orientador) Doutor em Food and Nutrition Science pela University of Manitoba
Profª. Drª. Andressa Carolina Jacques
Doutora em Ciência e Tecnologia Agroindustrial pela Universidade Federal de
Pelotas
Profª. Drª Márcia de Mello Luvielmo
Doutora em Ciência de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas
Drª. Marcia Vizzotto
Doutora em Horticulture Science pela Texas Agricultural & Mechanics University
Profª. Drª Milene Teixeira Barcia
Doutora em Ciência de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas
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Agradecimentos
À Deus por sempre ter me dado força para continuar minha jornada.
Aos meus pais Marisa Kuhn Rutz e José Francisco Rutz pelo amor, carinho,
pelo esforço para que eu pudesse chegar até aqui e por sempre terem acreditado
que eu iria conseguir.
Ao meu noivo, Ederson Blaas, pelo amor, carinho e companheirismo em
todos os momentos e por não me deixar desanimar diante das dificuldades
encontradas durante a realização deste trabalho.
Ao professor Rui Carlos Zambiazi pela orientação, ensinamentos e pela
oportunidade para que este trabalho fosse realizado.
À professora Caroline Dellinghausen Borges pela dedicação, ensinamentos e
pela grande ajuda, que foi fundamental para a realização deste trabalho.
Às colegas de pós-graduação, que considero como grandes amigas, pelo
carinho, amizade, companheirismo, auxílio e pelos momentos de descontração.
À todos que passaram pelo laboratório de cromatografia desde o início do
meu estágio, por terem contribuído de alguma forma para o meu crescimento
profissional. Às estagiárias pela ajuda.
À Cleonice da Rosa, Luiza Kuck e ao professor Dr. Caciano Noreña pela
ajuda em parte dos experimentos.
Aos professores e funcionários do DCTA.
Aos integrantes da banca pela disposição de participarem.
À UFPEL, CCQFA, DCTA, UFSC e UFRGS pela oportunidade para a
realização deste trabalho.
À Capes pela concessão da bolsa.
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Resumo
RUTZ, Josiane Kuhn. Microencapsulação de carotenoides: caracterização,
estabilidade e aplicação em sistemas alimentícios. 2016. 116f. Tese (Doutorado)
- Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas, 2016.
A aplicação de carotenoides em alimentos consiste em uma forma de enriquecê-los
com compostos benéficos saúde, no entanto esses compostos são suscetíveis à
degradação pela presença de oxigênio, luz e calor, o que pode acarretar a perda de
cor e da atividade antioxidante e vitamínica. A microencapsulação pode ser uma
alternativa para aumentar a estabilidade desses compostos e promover sua
liberação de forma controlada sob condições específicas. Sendo assim, no primeiro
estudo foram encapsulados óleo de palma e β-caroteno sintético, utilizando como
material de parede quitosana/carboximetilcelulose (Q/CMC) pelo método de
coacervação complexa e quitosana/tripolifosfato de sódio (Q/TPP) pelo método de
gelificação iônica, em ambos os métodos seguiu-se a liofilização, com o objetivo de
avaliar a influencia do material encapsulado e do método de encapsulação nas
características das micropartículas. No segundo estudo, foi encapsulado óleo de
palma utilizando como material de parede quitosana/goma xantana (Q/X) e
quitosana/pectina (Q/P), pelo método de coacervação complexa, seguido por
atomização ou liofilização, com o objetivo de avaliar a influencia do método de
secagem. Em ambos os estudos as micropartículas foram caracterizadas quanto à
morfologia, tamanho, eficiência de encapsulação, comportamento térmico e perfil de
liberação em água e em meios que simulam condições gastrointestinais. Aplicou-se
as micropartículas em pão e iogurte e avaliou-se a estabilidade e o perfil de
liberação dos microencapsulados durante o armazenamento destes produtos.
Avaliou-se os perfis de liberação dos microencapsulados aplicados nos sistemas
alimentícios, quando estes são expostos a condições que simulem as características
gastrointestinais. No primeiro estudo, de uma forma geral, a fonte dos carotenoides
não influenciou significativamente nos resultados. A eficiência de encapsulação foi
superior a 95 % para ambos os métodos, o rendimento das micropartículas
revestidas de Q/TPP foi de aproximadamente 55 %, enquanto que o das
micropartículas revestidas de Q/CMC foi de 87 %. A encapsulação foi confirmada
pela técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC), entretanto, não obtevese partículas de formato esférico. As partículas de Q/CMC apresentaram
comportamento ideal de liberação dos carotenoides na água e no fluido gástrico e
baixo percentual de liberação no fluido intestinal; no entanto, ocorreu maior liberação
quando aplicadas nos sistemas alimentícios. No segundo estudo, a encapsulação foi
confirmada pela técnica de DSC, onde somente as micropartículas atomizadas
apresentaram formato esférico. A liofilização proporcionou maior estabilidade aos
carotenoides durante o processo de encapsulação, e maior rendimento e eficiência
de encapsulação teórica. Em geral as micropartículas de Q/P liofilizadas
apresentaram perfil mais adequado de liberação em água e no fluido
gastrointestinal. Entretanto, após a aplicação em alimentos, as micropartículas de
Q/X foram mais adequadas. Antes da aplicação em alimentos as micropartículas
apresentaram maior percentual de liberação no fluido que simula condições
gastrointestinais, mas assim que liberados os compostos foram degradados. Após o
processamento, o percentual de liberação foi inferior e os compostos liberados não
5
foram degradados. Conclui-se que as micropartículas de quitosana/carboximetilcelulose demonstraram-se mais adequadas para a aplicação em pães,
enquanto que as micropartículas de quitosana/xantana foram as mais adequadas
para aplicação em iogurtes.
Palavras-chave: coacervação complexa; gelificação iônica; liofilização; atomização;
óleo de palma.
6
Abstract
RUTZ, Josiane Kuhn. Microencapsulation of carotenoids: characterization,
stability and application in food systems. 2016. 116f. Thesis (doctorate degree in
Food Science and Technology) - Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial,
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2016.
The application of carotenoids in foods consists of a way to enrich them with
beneficial compounds to health. However, these compounds are susceptible to
degradation by the presence of oxygen, light and heat, which can lead to loss of color
and antioxidant and vitamin activity. Microencapsulation can be an alternative for
increasing the stability of these compounds and promote its release in a controlled
way under specific conditions. Thus, in the first study it was encapsulated palm oil
and synthetic β-carotene using as wall material chitosan/carboxymethylcellulose
(C/CMC) by the complex coacervation method and chitosan/sodium tripolyphosphate
(C/TPP) by ionic gelation method, both methods followed by lyophilization, in aim to
evaluate the influence of the core material and the encapsulating method in the
characteristics of the microparticles. In the second study, palm oil was encapsulated
using as wall material chitosan/xanthan gum (C/X) and chitosan/pectin (C/P), by the
complex coacervation method, followed by atomization or lyophilization, to evaluate
the influence of the drying method. The morphology, size, encapsulation efficiency,
thermal behavior and release profile in water and in fluid simulating gastrointestinal
conditions of the microparticles were evaluated. The microparticles were apllied on
bread and yogurt and it was evaluated the stability and release profile of the
microencapsulated compound during storage. The microencapsulated release
profiles applied in food systems, when they are exposed to conditions simulating the
gastrointestinal characteristics were evaluated. In the first study, in general, the
source of carotenoids did not significantly influence the results. The encapsulation
efficiency was greater than 95% for both methods, the yield of C/TPP microparticles
was approximately 55%, while that for C/CMC microparticles was 87%.
Encapsulation was confirmed by differential scanning calorimetry (DSC) technique;
however, microparticles showed no spherical shape. Particles of C/CMC showed
optimal behavior of release of carotenoids in water and gastric fluid and low
percentage of release in the intestinal fluid; however, there was increased release
when applied in food systems. In the second study, the encapsulation was confirmed
by the DSC technique; only the atomized microparticles showed spherical shape.
Lyophilization afforded greater carotenoid stability during the encapsulation process,
and higher yield and theoretical encapsulation efficiency. In general, the lyophilized
microparticles Q/P presented a more adequate release profile in water and in
gastrointestinal fluid. However, after application on food, the microparticles C/X
showed better behavior. Before the application in foods, the microparticles showed
higher percentage of release in the fluid that simulates gastrointestinal conditions, but
once released the compounds suffered fast degradation. After processing, the
percentage of release was lower and the released compounds were not degraded. It
was concluded that chitosan/ carboxymethylcellulose microparticles were more
suitable for application in bread, while the microparticles chitosan/xanthan were the
most suitable for application in yogurt.
Keywords: complex coacervation; ionic gelation; lyophilization; atomization; palm oil.
7
Lista de Figuras
Figura 1
Palma...................................................................................................
15
Figura 2
Fluxograma do processo de obtenção do óleo de palma no
Brasil..................................................................................................... 16
Figura 3
Estrutura química dos carotenoides mais encontrados em
alimentos.............................................................................................. 19
Figura 4
Estrutura química da quitosana...........................................................
24
Figura 5
Estrutura química do tripolifosfato de sódio.........................................
25
Figura 6
Estrutura química da carboximetilcelulose sódica...............................
26
Figura 7
Estrutura química da goma xantana....................................................
27
Figura 8
Estrutura química primária da molécula de pectina, sem a presença
das ramificações.................................................................................. 28
Figura 9
SEM micrographs of microparticles. a1) palm oil microencapsulated
with chitosan/CMC; a2) β-carotene microencapsulated with
chitosan/CMC; b1) palm oil microencapsulated with chitosan/TPP;
b2)
β-carotene
microencapsulated
with
chitosan/TPP………………………………............................................. 49
Figura 10 DSC thermograms. a1, a3) palm oil; a2, a4) β-carotene; b1, b2)
chitosan/TPP; b3, b4) chitosan/CMC; c1) palm oil microencapsulated
with chitosan/TPP; c2) β-carotene microencapsulated with
chitosan/TPP; c3) palm oil microencapsulated with chitosan/CMC;
c4)
β-carotene
microencapsulated
with
chitosan/CMC………………………………….
50
Figura 11 Release profile of β-carotene and carotenoids from palm oil
encapsulated: a) in water and fluids that simulate b) gastric (GFS)
and c) intestinal (IFS) conditions…………………………...................... 52
Figura 12 Profile release of β-carotene and carotenoids from encapsulated
palm oil, and applied in yogurt during storage at 4 ° C and in bread
during storage at room temperature……………………………............. 55
Figura 13 Release profile of carotenoids from the microparticles applied in
yogurt, simulating a) gastric (GFS) and b) intestinal (IFS) conditions
and
breads
simulating
c)
gastric
and
d)
intestinal
conditions…………………………………………………………………… 57
Figura 14 SEM micrographs of the microparticles. a1) chitosan/xanthan lyophilization; a2) chitosan/xanthan - atomization; b1) chitosan/pectin
lyophilization;
b2)
chitosan/pectin
–
atomization…………………………………………………………………. 76
8
Figura 15 DSC thermograms. a1, a2, a3, a4) palm oil; b1) chitosan/xanthan lyophilization; c1) microparticles chitosan/xanthan - lyophilization;
b2)
chitosan/xanthan
atomization;
c2)
microparticles
chitosan/xanthan - atomization; b3) chitosan/pectin - lyophilization;
c3) microparticles chitosan/pectin - lyophilization; b4) chitosan/pectin
- atomization; c4) microparticles chitosan/pectin – atomization……… 77
Figura 16 Release profile of carotenoids from palm oil microencapsulated in
water and fluid that simulates gastrointestinal conditions…………….. 79
Figura 17 Release profile of carotenoids from palm oil encapsulated, applied to
yogurt during storage at 4 °C and bread during storage at room
temperature………………………………………………………………… 82
Figura 18 Release profile of carotenoids from the microparticles applied in
yogurt and bread, simulated gastrointestinal conditions………………. 83
9
Lista de Tabelas
Tabela 1
Encapsulation efficiency and yield of microparticles of palm oil
and degradation percentage of carotenoids during the
encapsulation process………………………………………………… 74
10
Sumário
1
Introdução ................................................................................................. 11
1.1
Hipóteses ............................................................................................... 13
1.2
Objetivos ................................................................................................ 14
1.2.1
Objetivo Geral ..................................................................................... 14
1.2.2
Objetivos específicos .......................................................................... 14
2
Revisão da Literatura ................................................................................. 15
2.1
Óleo de palma ........................................................................................ 15
2.2
Principais compostos presentes no óleo de palma oriundos do metabo-
lismo primário e secundário.............................................................................. 17
2.2.1
Lipideos ............................................................................................... 18
2.2.2
Carotenoides ....................................................................................... 19
2.3
Microencapsulação................................................................................. 20
2.3.1
Métodos de encapsulação e secagem ................................................ 22
2.3.2
Materiais de parede............................................................................. 24
2.3.3
Encapsulação de compostos lipofílicos ............................................... 29
3
Capítulo 1 – Elaboration of microparticles of carotenoids from natural and
synthetic sources for applications in food ......................................................... 39
3.1
Introduction ............................................................................................. 39
3.2
Material and methods ............................................................................. 41
3.3
Results and Discussion .......................................................................... 47
3.4
Conclusion .............................................................................................. 60
References ....................................................................................................... 60
4
Capítulo 2 – Microencapsulation of palm oil by complex coacervation for
application in food systems .............................................................................. 66
4.1
Introduction ............................................................................................. 66
4.2
Material and methods ............................................................................. 68
4.3
Results and discussion ........................................................................... 73
4.4
Conclusions ............................................................................................ 84
References ....................................................................................................... 84
5
Considerações Finais ................................................................................ 90
Referências ...................................................................................................... 91
Apêndices....................................................................................................... 109
11
1 Introdução
O dendezeiro, cujo nome científico é Elaeis guineenses, consiste em uma
palmeira originária da África, sendo também cultivada na América Central, América
do Sul e Ásia. Esta planta produz frutos denominados de palma, dos quais podem
ser obtidos dois tipos de óleos: o óleo de palmiste, que é obtido do endosperma, e o
óleo de palma obtido do seu mesocarpo fibroso (DE OLIVEIRA; RIBEIRO;
KIECKBUSCH, 2015; SEPTEVANI et al., 2015).
O óleo de palma é reconhecido pelo seu elevado teor de compostos bioativos,
principalmente de carotenoides, os quais contribuem para sua coloração
avermelhada,
estabilidade
e
valor
nutricional
(MUSTAPA
et
al.,
2011;
SZYDŁOWSKA-CZERNIAK et al., 2011). Os carotenoides consistem em um grupo
de pigmentos cuja coloração varia do amarelo ao vermelho. Sua estrutura química é
formada por oito unidades de isoprenos, formando assim um sistema de duplas
ligações conjugadas. Esse sistema possibilita aos carotenoides receberem elétrons
de espécies reativas, podendo neutralizar os radicais livres, caracterizando-se assim
como antioxidantes (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
Além de atuarem como antioxidantes, alguns carotenoides são precursores
da vitamina A, como o β-caroteno, α-caroteno e a β-criptoxantina. Esta atividade é
característica de compostos que apresentam em sua estrutura química pelo menos
1 anel β-ionona ligado a uma cadeia poliênica de 11 carbonos (RODRIGUEZAMAYA; KIMURA; AMAYA-FARFAN, 2008). No entanto, essas características
tornam estes compostos suscetíveis à isomerização e oxidação pela ação de
oxigênio, luz e altas temperaturas, podendo ocorrer a perda de cor e de sua atividade
antioxidante e vitamínica (GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
Uma maneira de proporcionar maior estabilidade a esses compostos e
promover sua liberação de forma controlada, sob condições específicas é a técnica
de encapsulação, pela qual é possível proteger substâncias sensíveis em função do
isolamento físico proporcionado por um ou mais materiais de parede, que podem ser
constituídos de proteínas, lipídeos ou carboidratos, bem como por polímeros
naturais ou sintéticos (DE ASSIS et al., 2012). Dependendo do método de
encapsulação podem ser utilizados materiais encapsulantes isolados ou de forma
combinada. A forma combinada é mais favorável pelo fato de um único agente
encapsulante não apresentar todas as propriedades ideais (MATSUNO; ADACHI,
12
1993). Dentre os métodos nos quais podem ser utilizados a combinação de agentes
encapsulantes podem ser citados a gelificação iônica e a coacervação complexa.
Na gelificação iônica, íons de baixo peso molecular atuam como agentes
reticulantes, promovendo ligações cruzadas através da sua complexação com
polímeros de carga oposta, formando estruturas de redes tridimensionais
(MESTDAGH; AXELOS, 1998). Este método de encapsulação foi utilizado na
encapsulação de quercetina (LIMA, 2013), palmitato de ascorbila (YOKSAN;
JIRAWUTTHIWONGCHAI; ARPO, 2010) óleo essencial de orégano (HOSSEINI et
al., 2013), óleo vegetal (BARRETO, 2008) e de luteína (ARUNKUMAR;
PRASHANTH; BASKARAN, 2013), dentre outros.
A coacervação complexa consiste na separação de fases ocasionada devido
à atração eletrostática entre, pelo menos, duas macromoléculas de cargas opostas.
Outras interações fracas como pontes
de hidrogênio e interações hidrofóbicas
também podem contribuir para a formação do complexo (ACH et al., 2015). Este
método é muito utilizado para encapsular compostos lipofílicos, dentre os quais
podem ser citados os óleos essenciais (Dima et al., 2014; PENG et al., 2014), óleos
vegetais (YANG et al., 2015; YANG et al., 2014) e óleo de peixe (WANG; ADHIKARI;
BARROW, 2014; PIACENTINI et al., 2013), dentre outros.
A secagem das micropartículas, também contribui para encapsulação dos
compostos bioativos, podendo em muitos casos ser utilizada como o próprio método
de encapsulação. Os processos mais utilizados são por atomização e por
liofilização. Na atomização a solução contendo as micropartículas é pulverizada em
uma câmara com fluxo de ar quente, fazendo com que ocorra a evaporação do
solvente, geralmente água. Este processo é um dos mais utilizados, por apresentar
baixo custo e ser relativamente rápido, no entanto o uso de altas temperaturas pode
comprometer a integridade dos compostos bioativos (BROADHEAD et al., 1992; DE
VOS et al., 2014). Na liofilização, a solução é congelada e após a água é removida
por sublimação devido a utilização de um sistema com baixa pressão (BARRESI et
al., 2009; KAUSHIK et al., 2014). Este método apresenta altos custos operacionais e
elevado tempo de processo, no entanto pelo fato de ser conduzido em baixas
temperaturas é bastante utilizado para desidratação de materiais sensíveis ao calor
(MARQUES; SILVEIRA; FREIRE, 2006; FANG; BHANDARI, 2010).
Nos alimentos, as micropartículas podem ser adicionadas com a função de
mascarar o sabor e aroma, alterar textura e cor, e também para atuar como agentes
13
antimicrobianos e antioxidantes. São poucos os estudos que relatam a aplicação de
micropartículas em alimentos, dentre esses podem ser citadas a adição de
microcápsulas de óleo de linhaça em pães (GALLARDO et al., 2013), de licopeno
em bolo (ROCHA; FÁVARO-TRINDADE; GROSSO, 2012), de curcumina em sorvete
(SOUSDALEFF et al., 2013) e iogurte (MANGOLIM et al., 2014), e de extratos de
carotenoides do pimentão vermelho em iogurte (GOMES et al., 2014). Estes
estudos, geralmente, abrangem apenas as características das micropartículas no
produto, avaliando sua influência na sua coloração e também sua estabilidade, mas
não avaliam o perfil de liberação dos compostos encapsulados simulando condições
gastrointestinais após sua incorporação na matriz alimentar. Sendo assim,
considera-se relevante avaliar o tipo de produto nos quais as micropartículas são
aplicadas, bem como a que processamento estes são submetidos e de que forma
isso irá influenciar na estabilidade e nas características de liberação dos compostos
encapsulados, principalmente quando os produtos são expostos a fluidos que
simulem condições gastrointestinais.
1.1 Hipóteses
É possível microencapsular óleo de palma com alto conteúdo de carotenoides
e
β-caroteno
sintético
utilizando
como
material
de
parede
quitosana/carboximetilcelulose e quitosana/tripolifosfato de sódio, pelos métodos de
coacervação complexa e gelificação iônica, respectivamente, seguidos de liofilização
como método de secagem.
É possível microencapsular óleo de palma com alto conteúdo de carotenoides
utilizando como material de parede quitosana/goma xantana e quitosana/pectina,
pelo método de coacervação complexa, seguido de atomização e liofilização, como
métodos de secagem.
A microencapsulação do óleo de palma e do β-caroteno sintético propicia a
liberação controlada dos carotenoides, mesmo após a aplicação das micropartículas
em sistemas alimentícios.
14
1.2 Objetivos
1.2.1 Objetivo Geral
Microencapsular carotenoides, utilizando diferentes métodos de encapsulação
e técnicas de secagem, bem como avaliar o perfil de liberação antes e após
aplicação das micropartículas em sistemas alimentícios.
1.2.2 Objetivos específicos
Microencapsular óleo de palma com alto conteúdo de carotenoides e βcaroteno sintético utilizando como material de parede quitosana/caroximetilcelulose
e quitosana/tripolifosfato de sódio, pelos métodos de coacervação complexa e
gelificação iônica, respectivamente, seguidos de liofilização como método de
secagem a fim de avaliar a influencia do material encapsulado e do método de
encapsulação nas características das micropartículas.
Microencapsular óleo de palma com alto conteúdo de carotenoides utilizando
como material de parede quitosana/goma xantana e quitosana/pectina, pelo método
de coacervação complexa, seguido de atomização e liofilização, como métodos de
secagem, a fim de avaliar a influencia no método de secagem nas características
das micropartículas.
Caracterizar as micropartículas quanto à morfologia, tamanho, eficiência de
encapsulação, comportamento térmico e perfil de liberação em água e em meios
que simulam condições gastrointestinais.
Aplicar as micropartículas em pão e iogurte e avaliar a estabilidade e o perfil
de liberação dos microencapsulados durante o armazenamento dos produtos.
Avaliar os perfis de liberação dos microencapsulados aplicados nos sistemas
alimentícios, quando estes são expostos a condições que simulem as características
gastrointestinais.
15
2
Revisão da Literatura
2.1 Óleo de palma
A palma é o fruto obtido de uma palmeira originária da África, que também é
cultivada na América Central, América do Sul e Ásia. Acredita-se ter sido introduzida
no Brasil por volta do século XVI, sendo conhecida como dendezeiro, cujo nome
científico é Elaeis guineenses (PINA, 2010; DE OLIVEIRA; RIBEIRO; KIECKBUSCH,
2015; SEPTEVANI et al., 2015). O fruto consiste em uma grupa séssil com formato
ovoide, que mede entre 2 e 5 cm, pesando entre 3 a 30 gramas, disposto em
cachos. O fruto apresenta várias camadas, sendo do interior para a superfície (Fig.
1) (MÜLLER; DE ANDRADE, 2010; MBA, DUMONT, NGADI, 2015):
a) Endosperma: apresenta formato ovoide, ocupando toda a cavidade do endocarpo,
sendo conhecido como palmiste, após sua secagem.
b) Endocarpo: esclerificado, escuro, bastante rígido e envolto por fibras.
c) Mesocarpo: polpa oleaginosa de coloração amarelo-alaranjada, contendo fibras
dispostas em feixes que se adensam nas proximidades do endocarpo.
e) Epicarpo: camada mais externa cutinada e lisa.
Figura 1- Palma
Fonte: Adaptado de Equipe Grupo Leste, 2015.
A partir do processamento da palma podem ser obtido o óleo de palmiste, que
compreende 1,5 % do peso total do fruto, sendo obtido a partir do endosperma; e o
óleo de palma, derivado do seu mesocarpo fibroso, representando 22 % do fruto. Os
produtos gerados na extração do óleo consistem na torta de palmiste (3,5 %),
cachos vazios (22 %), fibras (12 %) e cascas (5 %) (DE LIMA et al. 2010; DE
OLIVEIRA; RIBEIRO; KIECKBUSCH, 2015; SEPTEVANI et al., 2015). A obtenção
do óleo ocorre principalmente por processos físicos, sendo realizada logo após a
colheita (Figura 2).
16
Figura 2 - Fluxograma do processo de obtenção do óleo de palma no brasil.
Fonte: Parente, Oliveira Júnior e Da Costa (2003).
O óleo de palma apresenta consistência semi-sólida à temperatura ambiente,
por possuir ponto de fusão entre 32 e 40 ºC. Sua composição pode variar de acordo
com as condições climáticas e do solo, apresentando proporções percentuais muito
similares de ácidos graxos saturados e insaturados, sendo encontrados em maiores
proporções o ácido palmítico (44 %), oleico (40 %), linoleico (10 %) e esteárico (4,5
%) (DE LIMA et al., 2010; DE OLIVEIRA; RIBEIRO; KIECKBUSCH, 2015; MBA;
DUMONT; NGADI, 2015). Micronutrientes também estão presentes no óleo de
palma, incluindo carotenoides, tocoferois, tocotrienois, fosfolipídios, glicerolipídeos e
esqualeno. Os carotenoides, tocoferóis e tocotrienóis também são responsáveis pela
estabilidade e qualidade do óleo de palma, atuando também como antioxidantes
biológicos. A coloração laranja intensa do óleo de palma é atribuída a alta
17
concentração de carotenoides, que varia de 500 a 1500 ppm, sendo o β-caroteno o
carotenoide majoritário (MBA; DUMONT; NGADI, 2015).
De acordo com a United States Department of Agriculture (USDA) o óleo
vegetal mais produzido mundialmente é o de palma. Sua produção entre janeiro
2015/2016 foi de 62.675 mil toneladas, sendo aproximadamente 53 % deste óleo
produzido na Indonésia e 33 % na Malásia. O Brasil ocupa o 10º lugar produzindo
aproximadamente 340 mil toneladas, totalizando cerca 0,55 % da produção mundial
(USDA, 2016), sendo o estado do Pará o responsável por mais de 86 % da
produção brasileira de óleo de palma (PINA, 2010).
Este óleo é amplamente utilizado na indústria de alimentos, no preparo de
margarinas, elaboração de produtos de panificação, pó para sorvetes e como
substituto da manteiga de cacau. Também é utilizado para fins não alimentícios, na
indústria farmacêutica, química e siderúrgica, além de ter grande potencial para a
produção de biodiesel (PARENTE; OLIVEIRA JÚNIOR; DA COSTA, 2003; DE LIMA
et al., 2010).
2.2
Principais compostos presentes no óleo de palma oriundos do
metabolismo primário e secundário
No interior das células vegetais ocorre um conjunto de reações metabólicas,
denominado metabolismo, que pode ser classificado como primário e secundário. No
metabolismo primário ocorrem reações metabólicas que desempenham funções
essenciais para os vegetais, como fotossíntese, respiração e transporte de solutos,
sendo produzidos compostos comuns a todos os organismos, como ácidos
nucleicos, proteínas, carboidratos e lipídeos, que são utilizados como fonte de
energia pela planta e por quem as consome (GARCÍA; CARRIL, 2009).
No metabolismo secundário ocorre a síntese de compostos restritos a uma
espécie ou grupo de espécies vegetais relacionadas, que não necessariamente são
essenciais para o ciclo de vida da planta, mas auxiliam na interação planta-meio
ambiente. (BOURGAUD et al., 2001; TAIZ; ZEIGER, 2009). Metabólitos secundários
apresentam importante ação frente a fatores bióticos e abióticos. Dentre os fatores
bióticos podem ser citados herbivoria, ataque de patógenos e atração de
polinizadores, dispersores de sementes e micro-organismos simbiontes; e dentre os
fatores abióticos, mudanças de temperatura, conteúdo de água, deficiência de
minerais e exposição à luz e radiação ultra-violeta (VERPOORTE; MEMELINK,
18
2002; TAIZ; ZEIGER, 2009; EMERY; SANTOS; BIANCHI, 2011). Os compostos
oriundos do metabolismo secundário podem ser divididos em três grandes grupos,
sendo estes classificados como terpenos, compostos fenólicos e alcaloides (TAIZ;
ZEIGER, 2009).
2.2.1 Lipideos
Dentre os metabólitos primários, os lipídeos são uma classe de compostos
hidrofóbicos, ou seja, solúveis em solventes orgânicos e insolúveis em água. São
constituídos de carbono, hidrogênio e oxigênio, podendo também apresentar fosforo
e nitrogênio, que integram cadeias hidrocarbonadas alifáticas ou aromáticas. Eles
representam uma forma de carbono mais reduzida que os carboidratos, sendo que 1
g de óleo ou gordura gera 9,3 kcal de energia. No entanto, a biossíntese de
compostos pertencentes a esta classe requer grande investimento de energia
metabólica (DERGAL, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Os lipídeos encontram-se em plantas e animais, principalmente, na forma de
triacilglicerois, nos quais as moléculas de ácidos graxos estão unidas por ligações
ésteres aos três grupamentos hidroxila do glicerol. Os ácidos graxos comumente
encontrados em alimentos consistem em ácidos carboxílicos de cadeia linear com
um número par de átomos de carbonos, que podem ser saturados ou insaturados,
contendo até 6 duplas ligações (RIBEIRO; SERAVALLI, 2007; TAIZ; ZEIGER, 2009).
A síntese dos ácidos graxos ocorre nos plastídios e resultam da união sequencial de
duas unidades de carbono, através da carboxilação do Acetil-CoA a Malonil-CoA
pela enzima acetil-CoA carboxilase, que contém biotina como grupo prostético
(BELTRÃO; DE OLIVEIRA, 2007).
De acordo com seu estado físico, os lipídeos são classificados como óleos,
quando apresentam-se líquidos a temperatura ambiente, o que se deve a presença
de altas proporções de ácidos graxos insaturados; e gorduras, quando apresentamse sólidas a temperatura ambiente, devido a altas proporções de ácidos graxos
saturados (TAIZ; ZEIGER, 2009).
Os ácidos graxos pertencentes à fração lipídica possibilitam a reação com
bases, resultando na formação de sabões, sendo portanto denominados de
compostos saponificáveis. Dentre estes compostos estão presentes os triglicerídeos,
fosfoglicerídeos, esfingolípideos e a ceras. Os compostos que não apresentam
ácidos graxos em sua estrutura química são classificados como insaponificáveis,
19
incluindo os esteróis, clorofilas, carotenoides, tocoferóis, tocotrienóis, compostos
fenólicos e vitaminas lipossolúveis (DERGAL, 2006).
2.2.2 Carotenoides
Os metabólitos secundários podem ser subdivididos em três grandes grupos:
terpenos, compostos fenólicos e alcaloides. Os terpenos são sintetizados a partir de
duas rotas metabólicas principais, a do ácido mevalônico e a do metileritritol (MEP)
(TAIZ; ZEIGER, 2009; AHARONI; GALILI, 2011).
Os terpenos são classificados em função do número de unidades
pentacarbonadas
que
compõe
a
molécula.
Podem
ser
subdivididos
em
monoterpenos (com 2 unidades de isopreno), sesquiterpenos (com 3 unidades de
isopreno), diterpenos (com 4 unidades de isopreno), triterpenos (com 2 unidades de
sesquiterpeno) e tetraterpenos (com 2 unidades de diterpeno) (TAIZ; ZEIGER,
2009).
Dentre os tetraterpenos, destacam-se os carotenoides, que são um dos
grupos de pigmentos mais difundidos na natureza, responsáveis pela coloração
amarela, laranja e vermelha de grande número de vegetais, frutas, folhas e algumas
flores. Na célula vegetal esse grupo de compostos localiza-se nos cromoplastos e
também nos cloroplastos associados à clorofila (CHITARRA; CHITARRA, 2005),
podendo ser classificados como carotenos os compostos que são exclusivamente
formados por hidrocarbonetos, e xantofilas os que possuem oxigênio em sua
molécula (COULTATE, 2004). As estruturas químicas dos carotenoides mais
comumente encontrados nos alimentos estão representados na figura 3.
Figura 3 - Estrutura química dos carotenoides mais encontrados em alimentos.
Fonte: RODRIGUEZ-AMAYA; KIMURA; AMAYA-FARFAN, 2008.
20
Umas
das
propriedades
mais
importantes
que
alguns
carotenoides
apresentam é atividade provitamínica A. Essa característica esta relacionada com a
estrutura química, para a qual é necessária a presença de pelo menos 1 anel βionona ligado a uma cadeia poliênica de 11 carbonos. O β-caroteno é o carotenoide
com maior potencial provitamínico A, no entanto o α-caroteno e a β-criptoxantina
também são precursores dessa vitamina. Outros carotenoides, como luteína,
zeaxantina e o licopeno não apresentam capacidade vitamínica (RODRIGUEZAMAYA; KIMURA; AMAYA-FARFAN, 2008).
Os carotenoides são caracterizados como um grupo de compostos com
potencial antioxidante, devido ao sistema de duplas ligações conjugadas presente
em sua estrutura química, o que faz com que esses compostos sejam capazes de
receber elétrons de espécies reativas, neutralizando radicais livres. Entretanto, a
presença destas duplas ligações conjugadas, os tornam suscetíveis à isomerização
e oxidação pela presença de oxigênio luz e calor, o que pode acarretar a perda da
cor e do potencial antioxidante e provitamínica (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997;
GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
2.3 Microencapsulação
A microencapsulação consiste em uma tecnologia capaz de proteger
substâncias sensíveis, que podem estar no estado líquido, sólido ou gasoso, através
do seu isolamento físico em relação as condições ambientais, tais como luz,
umidade e oxigênio (MATSUNO; ADACHI, 1993; NEDOVIC et al., 2011).
Acidulantes, agentes aromatizantes, corantes, lipídios, vitaminas, minerais, enzimas
e micro-organismos são alguns exemplos de materiais que podem ser encapsulados
(FANG; BHANDARI, 2010). A estabilidade desses compostos é proporcionada pela
capacidade de minimizar a taxa de evaporação e de transferência de material do
núcleo para o ambiente, além de modificar as características físicas do material,
facilitando o manuseio das micropartículas (SCHROOYEN; VAN DER MEER; DE
KRUIF, 2001; FANG; BHANDARI, 2010).
As micropartículas podem ser separadas em dois grupos: aquelas nas quais
um invólucro polimérico está disposto ao redor do núcleo, podendo o composto
encapsulado estar dissolvido neste núcleo ou adsorvido à parede polimérica,
denominadas de microcápsulas, e aquelas nas quais o composto encapsulado está
21
uniformemente disperso no material de parede, denominadas microesferas
(AZEREDO, 2005; MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010).
O material de parede consiste, geralmente, em polímeros biodegradáveis que
podem ser naturais, naturais modificados ou sintéticos, no entanto os polímeros
naturais apresentam menor custo em relação aos outros polímeros utilizados na
microencapsulação (LIU et al., 2008). Os polímeros podem ser utilizados de forma
isolada, mas pelo fato de um único agente encapsulante não apresentar todas as
propriedades de um material de parede ideal, pode-se realizar a associação de
diferentes agentes (DE ASSIS et al., 2012). Dentre as técnicas de encapsulação
utilizadas na elaboração de micropartículas podem ser citadas spray-dryer, spray
cooling, coacervação, extrusão, recobrimento em leito fluidizado, lipossomas,
inclusão molecular e liofilização (DE VOS et al., 2010; KAUSHIK et al., 2014).
Além de proteger o composto encapsulado, a microencapsulação pode
proporcionar a liberação controlada das substâncias ativas, ou seja, de forma lenta e
gradual, e em locais específicos do organismo (JINGOU et al., 2011). A liberação
dos compostos encapsulados pode ocorrer por variação de temperatura, alteração
do pH, solubilidade do meio, difusão, ruptura mecânica e pela permeabilidade
seletiva, sendo que o mecanismo de liberação é dependente da natureza do agente
encapsulante (DE ASSIS et al., 2012).
Após a encapsulação, algumas análises devem ser realizadas, a fim de
verificar a eficiência do processo. Uma das principais técnicas consiste na
determinação da eficiência de encapsulação, que pode ser determinada
por
diferentes formas. Uma delas, conhecida como eficiência de encapsulação real
refere-se ao percentual de compostos encapsulados, que é calculada pela diferença
entre o total de compostos presentes nas micropartículas e o teor de compostos
presentes em sua superfície (RUTZ et al., 2013). Outra forma, denominada de
eficiência de encapsulação teórica, refere-se ao percentual de um determinado
composto encapsulado em relação ao teor inicialmente adicionado deste composto
(SOMCHUE et al., 2009). O rendimento das micropartículas é outra importante
avaliação, o qual é calculado com base no teor de sólidos adicionados durante o
processo de encapsulação em relação a massa de micropartículas obtida após o
processo de encapsulação (JUN-XIA; HAI-YAN; YANG JIAN, 2011).
Informações sobre morfologia e tamanho das micropartículas podem ser
obtidas pela técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), e através de
22
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) pode-se avaliar o comportamento
térmico das micropartículas. A técnica de DSC apresenta os efeitos do calor
associados com alterações físicas ou químicas na amostra e deve ser realizada no
material de núcleo, no material de parede e nas micropartículas, a fim de verificar
alterações que ocorreram nestes materiais após a encapsulação (IONASHIRO,
2005).
2.3.1 Métodos de encapsulação e secagem
2.3.1.1
Coacervação complexa
Este método é caracterizado pela ocorrência da separação de fases
ocasionada devido à atração eletrostática entre, pelo menos, duas macromoléculas
de cargas opostas. Após ocorrer a coacervação, em uma das fases fica a fração
polimérica, denominada de coacervado; e a outra fase caracterizada pela ausência
de polímeros, é denominada como solução de equilíbrio (KAUSHIK et al., 2014).
Outras interações fracas como ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas
também podem contribuir para formação do complexo (ACH et al., 2015).
A coacervação complexa é amplamente utilizada na encapsulação de
compostos lipofílicos como óleos essenciais (DIMA et al, 2014; PENG et al., 2014),
óleos vegetais (YANG et al., 2015; YANG et al., 2014), óleo de peixe (WANG,
ADHIKARI, BARROW, 2014; PIACENTINI et al., 2013), entre outros.
2.3.1.2
Gelificação iônica
A gelificação iônica ocorre através de ligações iônicas quando íons de baixo
peso molecular atuam como agentes reticulantes ao entrarem em contato com uma
solução polimérica de carga oposta. Nesta solução, os polieletrólitos interagem
formando um complexo, com estruturas de redes tridimensionais (MESTDAGH,
AXELOS, 1998).
Este método é amplamente utilizado para a formação de partículas de
quitosana com tripolifosfato de sódio como agente reticulante. Neste caso, em geral
utiliza-se uma solução ácida de quitosana, com pH entre 4,0 a 6,0, e uma solução
alcalina de tripolifosfato de sódio, com pH variando entre 7,0 e 9,0. Quando essas
soluções entram em contato, as partículas são formadas por meio de ligações inter e
intramoleculares entre os grupos fosfato do tripolifosfato de sódio e os grupamentos
amina da quitosana (JANES, CALVO, ALONSO, 2001; NEVES et al., 2014).
23
Diversos tipos de compostos como quercetina (LIMA, 2013), palmitato de ascorbila
(YOKSAN; JIRAWUTTHIWONGCHAI; ARPO, 2010), óleo essencial de orégano
(HOSSEINI et al., 2013), óleo vegetal (BARRETO, 2008); luteína (ARUNKUMAR;
PRASHANTH; BASKARAN, 2013); entre outros, foram encapsulados por gelificação
iônica.
2.3.1.3
Atomização
Nesta técnica, o líquido é disperso em gotículas que entram em contato com
um fluxo de ar aquecido, o que faz com que o solvente (água) seja rapidamente
removido,
formando
partículas
sólidas
(BROADHEAD;
EDMOND
ROUAN;
RHODES, 1992; DE VOS et al., 2014). Estas partículas, geralmente, apresentam
forma esférica, de tamanhos similares, em função da forma da gotícula a qual se
originou (BROADHEAD; EDMOND ROUAN; RHODES, 1992). O tamanho da
cápsula é dependente da concentração de sólidos e das condições do processo,
podendo variar de 10 µm até 2 ou 3 mm (NEDOVIC et al., 2011; KAUSHIK et al.,
2014).
A técnica por atomização é um dos processos mais utilizados na
microencapsulação, por ser um procedimento rápido e relativamente barato (DE
VOS et al., 2014; KAUSHIK et al., 2014), além de poder ser utilizado na
encapsulação de compostos hidrofílicos e lipofílicos (BAKOWSKA-BARCZAK;
KOLODZIEJCZYK, 2011; JUN-XIA et al., 2011; SANSONE et al., 2011; ROCHA et
al., 2012; GALLARDO et al., 2013; YANG et al., 2015). Entretanto, por mais que a
atomização seja um método de baixo custo e adaptado às condições industriais,
pela necessidade da utilização de temperaturas entre 70 e 150 °C, pode ocasionar o
comprometimento da integridade de compostos bioativos presentes no material
(GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
2.3.1.4
Liofilização
No processo de liofilização a solução é congelada e, subsequentemente, a
água na forma de gelo cristalino é removida por sublimação sob baixa pressão, o
que resulta em uma estrutura porosa e friável (BARRESI et al., 2009; KAUSHIK et
al., 2014). Essa estrutura passa por uma desintegração onde são obtidas
micropartículas com formato irregular e não característico.
24
Este processo é utilizado para a desidratação de materiais sensíveis ao calor
devido à utilização de baixas temperaturas, proporcionando maior estabilidade; no
entanto, apresenta altos custos operacionais e longo tempo de processo
(MARQUES; SILVEIRA; FREIRE, 2006; FANG; BHANDARI, 2010). A liofilização,
assim como a atomização, é uma técnica utilizada como método para encapsular
tanto compostos hidrossolúveis quanto lipossolúveis (RUTZ et al., 2013;.
SOUSDALEFF et al., 2013; ZUANON, MALACRIDA, TELIS, 2013).
2.3.2 Materiais de parede
2.3.2.1 Quitosana
A quitosana consiste em um polissacarídeo de origem animal, que é obtida
naturalmente através de alguns fungos e quimicamente pela desacetilação do
polímero quitina, encontrado no exoesqueleto de insetos e crustáceos. É insolúvel
em água, no entanto apresenta solubilidade em soluções de ácidos diluídas em pH
abaixo de 6,0 (DASH et al., 2011).
Sua estrutura química (Figura 4) é formada por unidades de 2-amino-2desoxi-D-glicose e 2-acetamido-2-desoxi-D-glicose, unidas por ligação β-1,4, sendo
a proporção variável em função do grau de desacetilação. A presença de
grupamentos amino caracteriza a quitosana como um polímero policatiônico, pelo
fato de ser carregado positivamente (GOY; ASSIS; CAMPANA-FILHO, 2004; DASH
et al., 2011).
Figura 4 - Estrutura química da quitosana.
Fonte: DASH et al., 2011.
Este polímero atua como agente quelante, floculante e clarificante no
tratamento de água, e pode ser utilizado em alimentos na remoção de corantes e
substâncias ácidas, na clarificação de vinhos, em coberturas comestíveis e também
como espessantes e estabilizantes para molhos (GOY; ASSIS; CAMPANA-FILHO,
2004). A quitosana foi utilizada como agente encapsulante de uma ampla variedade
25
de classes de substâncias, incluindo enzimas (BRIONES; SATO, 2010; LIU et al.,
2011), compostos lipossolúveis (KLAYPRADIT; HUANG, 2008, RUTZ, 2013;
ESMAEILI; ASGARI, 2015), fármacos (SHUKLA; TIWARI, 2012; HASSAINI et al.,
2015),
corantes
naturais
(HIGUERA-CIAPARA,
2004;
PARIZE;
SOUZA;
BRIGHENTE, 2008) e extratos fenólicos provenientes de amora-preta (DA ROSA et
al., 2014), suco de pitanga roxa (RUTZ, 2013) e plantas medicinais (BELŠČAKCVITANOVIĆ et al., 2011).
2.3.2.2 Tripolifosfato de sódio
A partir da tríplice condensação de grupamentos fosfato (PO4-3), com perda
de dois moles de água, são formados os tripolifosfatos. Estes íons pentavalentes
apresentam a fórmula química Me5P3O10, na qual Me consiste em um metal
monovalente, predominantemente o sódio (Figura 5). Apesar de existir um grande
número de tripolifostatos, somente o sal pentassódico, também conhecido como
tripolifosfato de sódio ou trifosfato pentassódico, é produzido em escala comercial
(BRASIL, 2003; PALMEIRA-DE-OLIVEIRA et al., 2011).
Figura 5 - Estrutura química do tripolifosfato de sódio.
Fonte: Adaptado de Osório e De Oliveira (2001).
O tripolifosfato de sódio é obtido através da desidratação térmica de uma
mistura de fosfatos dissódico e monossódico formados a partir da reação de ácido
fosfórico e uma base alcalina, como hidróxido ou carbonato de sódio.
Comercialmente, este produto está disponível na forma de um sal anidro em pó ou
granulado (BRASIL, 2003; PALMEIRA-DE-OLIVEIRA et al., 2011). Esse composto
pode ser utilizado como aditivo, em uma grande variedade de alimentos de origem
vegetal e animal, podendo atuar como agente tampão, emulsificante, sequestrante e
agente de textura, podendo também ser utilizado na modificação de amidos
(WATTANCHANT et al., 2003; PALMEIRA-DE-OLIVEIRA et al., 2011).
Na encapsulação, este composto é usualmente utilizado associado à
quitosana. Este complexo tem sido utilizado para encapsular diversos tipos de
26
compostos, dentre os quais fármacos (EKINCI et al., 2015; HASSAINI et al., 2015;
LIU, HE, 2015), antioxidantes (LUPASCU et al., 2015; MADUREIRA et al., 2015;
NALLAMUTHU; DEVI; KHANUM, 2015) e óleos essenciais (ESMAEILI; ASGARI,
2015; MOHAMMADI; HASHEMI; HOSSEINI, 2015; HU et al., 2015).
2.3.2.3 Carboximetilcelulose sódica
A carboximetilcelulose (CMC) é obtida via reação de Williamson, na qual a
celulose é tratada com ácido monocloroacético e hidróxido de sódio sob pressão
atmosférica. Esse tratamento resulta na substituição parcial dos grupamentos
hidroxila da glicose por grupamentos carboximetílicos, o que facilita a hidratação da
molécula (FUJIMOTO et al., 2002; PAUNONEN, 2013).
A CMC apresenta a mesma estrutura química da celulose, unidades de
glicose unidas por ligações β-(1→4), mas com diferentes graus de substituição
(Figura 6), sendo estes responsáveis por suas características. Os grupamentos
carboxílicos adicionados durante a substituição conferem o caráter aniônico à
molécula. O grau de substituição da carboximetilcelulose geralmente varia de 0,4 a
1,5 e quando este grau for superior a 0,5 a molécula apresenta solubilidade em
água. Para aplicação em alimentos é comumente utilizado o polímero na forma de
sal sódio com grau de substituição de 0,6 a 0,95 (FUJIMOTO et al., 2002; DU et al.,
2009; GENG et al., 2014).
Figura 6 - Estrutura química da carboximetilcelulose sódica.
Fonte: Adaptado de Sannino, Demitri e Madaghiele (2009).
Este composto é amplamente aplicado na indústria de alimentos com a
função de espessante, estabilizante, para reter água e na elaboração de filmes,
sendo também utilizado em formulações farmacêuticas, de cosméticos, na indústria
têxtil, como adesivo e pela indústria cerâmica (DU et al., 2009; SANNINO; DEMITRI;
27
MADAGHIELE, 2009; SU et al., 2010; PAUNONEN, 2013; GENG et al., 2014). CMC
tem sido utilizada como material encapsulante de proteínas (KIM et al., 2012;
TRIPATHY; RAICHUR, 2013), enzimas (GASSARA-CHATTI et al., 2013), fármacos
(IANNUCCELLI et al., 1993; CHO et al.,2010) e de compostos bioativos (MUHAMAD
et al., 2011; SERRANO-CRUZ et al., 2013; LI et al., 2015).
2.3.2.4 Goma xantana
A goma xantana consiste em um polissacarídeo extracelular produzido por
micro-organismos, que apresenta solubilidade em água, tanto em baixas como em
altas temperaturas, sendo suas soluções altamente viscosas. A goma disponível
comercialmente é produzida por Xanthomonas campestris (SWORN, 2000RIBEIRO;
SERAVALLI, 2004).
Sua estrutura química (Figura 7) é composta por unidade repetidas de β-Dglicose unidas por ligação 1-4, com ramificações formadas de  -D-manose - 1,4- -Dácido glicurônico - 1,2--D-manose, podendo conter ácido pírúvico e acético. A
presença de grupamentos carboxílicos carregados negativamente caracteriza esta
goma como um polímero aniônico (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Figura 7 - Estrutura química da goma xantana.
Fonte: NERY et al., 2008
A goma xantana atua como agente espessante e estabilizante em
alimentos, no entanto também é utilizada em formulações farmacêuticas, em
cosméticos e em produtos agrícolas. Esta goma foi utilizada na encapsulação de
28
enzimas (LIU et al., 2011), de fármacos (LUNGAN et al., 2015), de micro-organismos
(JIMÉNEZ-PRANTEDA et al., 2012; TOMÁS et al., 2015), e de compostos fenólicos
presentes em extratos de amora-preta (DA ROSA et al., 2014) e de suco de pitanga
roxa (RUTZ et al., 2013).
2.3.2.5 Pectina
A pectina consiste em um polissacarídeo presente na parede celular de
plantas, juntamente com a celulose e a hemicelulose, sendo obtida, geralmente,
através do bagaço de maçã e de cascas de frutas cítricas por extração com ácido e
precipitação com álcoois ou sais de alumínio (MAY, 1990; SANTI, BERGER; DA
SILVA, 2014).
Sua estrutura é composta de unidades de ácido galacturônico unidas por
ligações α-(1→4), parcialmente esterificadas com grupamentos metoxila, formando a
cadeia principal, sendo os grupamentos carboxílicos responsáveis pelo caráter
aniônico à molécula (Figura 8). Esta cadeia compreende aproximadamente 70% do
polímero, podendo apresentar unidades de ramnose, galactose, arabinose e xilose
como cadeias laterais (WILLATS; KNOX; DALGAARD, 2006; MOHNEN, 2008
SANTI, BERGER, DA SILVA, 2014). A pectina, comercializada na forma de pó, pode
ser classificada de acordo com o seu grau de metoxilação, sendo de alto teor de
metoxilação se o percentual de grupamentos esterificados for superior a 50% e de
baixo teor de metoxilação se for inferior a 50 % (WILLATS; KNOX; DALGAARD,
2006; CANTERI et al., 2012).
Figura 8 - Estrutura química primária da molécula de pectina, sem a presença das
ramificações.
Fonte: Adaptado de Alkorta et al. (1998).
A pectina é, tradicionalmente, utilizada como agente gelificante em doces e
geleias, no entanto suas aplicações se estendem também a produtos lácteos,
sobremesas, refrigerantes, produtos a base de frutas e produtos de confeitaria,
29
atuando como estabilizantes; e também na elaboração de filmes biodegradáveis e
em produtos farmacêuticos (MAY, 1990; CANTERI et al., 2012). Este polímero foi
utilizado como material encapsulante de óleos (D AZ-ROJAS et al., 2004;
POLAVARAPU et al., 2011), de compostos bioativos (DE SOUZA et al., 2013;
DAVIDOV-PARDO; JOYE; MCCLEMENTS, 2015), de fármacos (PANDEY et al.,
2013; CARBINATTO et al., 2014) e de bactérias (SANDOVAL-CASTILLA et al.,
2010; ZHANG; LIN; ZHONG, 2015).
2.3.3 Encapsulação de compostos lipofílicos
Estudos referentes à encapsulação de compostos lipofílicos, como óleos e
carotenoides, geralmente abordam temas envolvendo a elaboração e caracterização
das micropartículas, eficiência de encapsulação, taxa de liberação e estabilidade dos
compostos encapsulados. No entanto, atualmente também vem sendo estudada a
aplicação de micropartículas de compostos lipofílicos em alimentos.
Dentre os trabalhos relacionados com a encapsulação de óleos, pode-se
constatar que os métodos coacervação complexa e atomização, utilizados
isoladamente ou de forma associada, bem como a utilização de propoções
superiores a 9:1 de material de parede em relação ao material encapsulado, são
capazes de proporcionar eficiência de encapsulação superior a 90 % além da
proteção contra oxidação lipídica (JUN-XIA;YANG JIAN, 2011; QUISPE-CONDORI;
SALDAÑA; TEMELLI, 2011; GOULA; ADAMOPOULOS, 2012, CARNEIRO et al.,
2013 YANG et al., 2014).
Em relação aos trabalhos nos quais foram encapsulados carotenoides,
destacam-se com eficiência de encapsulação de aproximadamente 90% aqueles em
que foram utilizados como material de parede polímeros de carboidratos, como
goma xantana, goma tara, maltodextrina e furcelana (LAOS et al., 2007; RUTZ et al.,
2013; INDRAWATI et al., 2015). Em relação ao perfil de liberação, o melhor
comportamento foi obtido através da combinação dos materiais de parede gelatina e
poli (ácido γ-glutâmico), não havendo liberação em pHs baixos, liberando entretanto,
de 71 a 98 % dos carotenoides entre pHs 5,5 e 7,0 (CHIU et al., 2007). Rutz et al.
(2013), utilizando a combinação da gomas xantana e tara também obtiveram
comportamento satisfatório em relação ao perfil de liberação, no qual 20 % dos
30
carotenoides foram liberados em fluido que simula condições gástricas, enquanto
que 85 % foram liberados em fluido que simula condições intestinais.
2.3.3.1
Óleos
Dentre os estudos realizados com encapsulação de óleos nos últimos anos
podem ser citados os seguintes.
Barreto (2008) promoveu a encapsulação de óleo de girassol, pelo método de
gelificação iônica, utilizando quitosana e soluções de tripolifosfato de sódio (TPP)
com diferentes concentrações e faixas de pH. A encapsulação foi confirmada
através das técnicas de espectroscopia de absorção na região do infravermelho
(FTIR) e por análise termogravimétrica (TGA). O rendimento das micropartículas
variou de 1 a 27 % e a maior eficiência de encapsulação (51 %) foi obtida quando foi
utilizado 10% de TPP em pH 10,5. O percentual de liberação do óleo in vitro no
fluído gástrico sem a presença de enzimas, foi de 39 % em 4 horas. Para o fluido
intestinal, também sem a adição de enzimas, foi obtido um percentual de liberação
de 43 % em 8 horas.
Jun-xia, Hai-yan e Yang Jian (2011) ao encapsular óleo essencial de laranja
doce utilizando proteína isolada de soja e goma arábica pelo método de
coacervação complexa, seguida por atomização, observaram que o maior
rendimento (aproximadamente 80 %) e eficiência de encapsulação (superior a 90 %)
foram obtidos utilizando os materiais encapsulantes na proporção de 1:1 e 10% de
material encapsulado, em pH 4,0. Essas micropartículas apresentaram formato
esférico, sem aberturas na superfície, com tamanho inferior a 10 µm. De acordo com
a análise realizada por cromatografia gasosa, os compostos presentes no óleo foram
preservados, indicando a eficiência do material de parede.
No estudo utilizando a proteína zeína na encapsulação do óleo de linhaça, a
encapsulação foi realizada com diferentes proporções de material de parede e de
material encapsulado, através dos métodos de liofilização e atomização. A máxima
eficiência de encapsulação para as micropartículas atomizadas foi de 93 %, para
aquelas na qual a proporção zeina:óleo de linhaça foi de 20:1. Em contra partida,
Para as micropartículas liofilizadas, a máxima eficiência foi de, aproximadamente, 60
%, na proporção de 12:1. O rendimento dessas micropartículas foi superior a 70 % e
a morfologia foi dependente da proporção material de parede:material encapsulado
e do método de encapsulação. As micropartículas atomizadas com altas proporções
31
zeína:óleo de linhaça apresentaram-se esféricas e de formato heterogêneo com
diferentes tamanhos; no entanto, em baixas proporções a superfície das
micropartículas tornou-se rugosa. A utilização do processo de liofilização resultou
em pequenas esferas aglomeradas (QUISPE-CONDORI; SALDAÑA; TEMELLI,
2011).
Goula e Adamopoulos (2012) realizaram a extração e encapsulação do óleo
da semente de romã em diferentes concentrações, utilizando diferentes proporções
de leite em pó desnatado pelo método de atomização, variando as condições do
processo. O tamanho das micropartículas variou de 5 a 20 µm e dentre as condições
avaliadas, as que resultaram em micropartículas com maior eficiência de
encapsulação (95,6 %) foram: proporção núcleo:material de parede de 1:9; solução
com 30 % de sólidos; temperatura do ar de entrada de 187°C; e fluxo do ar de
secagem de 22,80 m3/h.
Carneiro et al. (2013) avaliaram o potencial dos materiais de parede goma
arábica, amido modificado e concentrado proteico do soro do leite associados a
maltodextrina, na proporção 75:25, na encapsulação do óleo de linhaça por
atomização, a fim de minimizar a oxidação lipídica. Foram obtidas micropartículas
ocas de 15,32 a 23,03 µm, sem rachaduras ou fissuras aparentes, com o material
encapsulado incorporado ao material de parede. A combinação que proporcionou a
maior eficiência de encapsulação foi com maltodextrina:amido modificado (superior a
90 %). No entanto, mesmo a maltodextrina:concentrado proteico, tendo apresentado
a menor eficiência de encapsulação (cerca de 60 %), este foi o material que
proporcionou maior proteção contra a oxidação lipídica.
Gallardo et al. (2013) encapsularam óleo de girassol por atomização, com 4
formulações a base de goma arábica, maltodextrina, metilcelulose e isolado proteico
de soro de leite, com o objetivo de aumentar a estabilidade dos ácidos graxos ω-3.
As micropartículas elaboradas somente com goma arábica e com uma mistura entre
esta
goma,
maltodextrina
e
isolado
proteico
apresentaram
eficiência
de
encapsulação acima de 90 %, estrutura esférica com superfície lisa, medindo
aproximadamente 10 µm. A estabilidade oxidativa, avaliada através do teste
Rancimat, foi significativamente aumentada com estes materiais de parede, sendo
de 2,2 horas para óleo não encapsulado, e 8,0 e 9,5 horas para as micropartículas
de goma arábica e de goma arábica:maltodextrina:isolado proteico, respectivamente.
Devido a maior eficiência de encapsulação, as micropartículas com 100 % de goma
32
arábica foram as selecionadas para a aplicação em pães. Os pães elaborados com
e sem micropartículas apresentaram aparência semelhante, no entanto o teor do
ácido α-linolênico presente nas micropartículas reduziu significativamente após o
processamento, restando somente 33 % do teor adicionado inicialmente.
Gelatina de peixe (GP) e goma arábica (GA), em diferentes proporções e
valores de pH, utilizando glutaraldeído como reticulante foram utilizadas na
encapsulação de óleo de girassol, pelo método de coacervação complexa. O
rendimento máximo foi observado em pH 3,5, com a proporção de 50:50 dos
materiais de parede e 24 M de glutaraldeído, sendo obtidas micropartículas de 80 a
100 µm (PIACENTINI et al., 2013).
Como forma de aumentar a estabilidade de ácidos graxos ômega 3, o óleo de
atum foi encapsulado com gelatina e hexametafosfato de sódio (SHMP) pelo método
de coacervação complexa, variando as proporções dos materiais de parede e o pH.
Para aumentar ainda mais a estabilidade do óleo, foram adicionados antioxidantes
comerciais. As condições ótimas para a coacervação foram obtidas em pH 4,7 e com
a proporção de gelatina:SHMP de 1:15. A concentração de 1,2 % de antioxidantes
foi a mais eficiente para prevenir a oxidação. A estabilidade oxidativa do óleo de
atum não encapsulado, medida através do teste Rancimat, foi de 3,5 horas,
enquanto que para o óleo encapsulado e não encapsulado com a presença de
antioxidantes, foi de 40,2 e 29,3 horas, respectivamente. Assim, foi demonstrado
que a encapsulação foi eficaz na proteção contra a oxidação (WANG; ADHIKARI;
BARROW, 2014).
Yang et al. (2014) encapsularam óleo de baunilha com o intuito de promover a
liberação controlada e aumentar sua estabilidade térmica. A encapsulação foi
realizada pelo método de coacervação complexa utilizando como material de parede
goma arábica e quitosanas de baixa, média e alta viscosidade. A quitosana de
média viscosidade foi a que apresentou melhores resultados quanto a morfologia,
sendo obtidas micropartículas de formato esférico, superfície lisa, com boa
dispersibilidade, e tamanho de 5,2 a 10,3 µm. A maior eficiência de encapsulação
(94,2 %) foi obtida utilizando a proporção 2:1 de óleo de baunilha:quitosana. Nessa
condição também foi obtida a maior capacidade de carregamento de óleo (26,6 %).
Essas micropartículas foram armazenadas por 30 dias em três diferentes
temperaturas, e o percentual de liberação ao final do período foi de 40 % a 25 °C, 55
33
% a 50 °C e 75 % a 100 °C, sendo que o percentual de liberação foi mais
pronunciado nos primeiros 10 dias de armazenamento.
Óleo de sementes de papoula foi encapsulado utilizando goma arábica e
gelatina, em diferentes proporções, pelo método de coacervação complexa, seguido
por atomização. A encapsulação foi confirmada através das técnicas de
espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria
diferencial de varredura, análise termogravimétrica e difratometria de raio-x. As
micropartículas apresentaram forma esférica e distribuição regular com tamanho
inferior a 5 µm. A proporção de material de parede (goma arábica:gelatina) que
apresentou os melhores resultados foi de 1:3. Essa formulação apresentou eficiência
de encapsulação de 76,8 % e capacidade de carregamento de óleo de 18,2 %. As
micropartículas foram armazenadas a 40 ºC por 8 semanas e os resultados
demonstraram que a encapsulação aumentou a estabilidade do óleo (YANG et al.,
2015).
Inulina com dois diferentes graus de polimerização (>10 e >23) foi utilizada na
encapsulação de óleo de semente de urucum por meio da emulsificação por
ultrassom, seguida de liofilização. Através da avaliação da morfologia, eficiência de
encapsulação, perfil microestrutural e pelas análises de termogravimetria e
Rancimat, foi possível comprovar a eficácia da inulina como material de parede. A
inulina com maior grau de polimerização originou micropartículas com menor teor de
óleo na superfície (55 %), maior eficiência de encapsulação (45 %), baixa atividade
de água e o maior tamanho (158 µm), além de proporcionar a maior estabilidade ao
óleo (SILVA; ANGELA; MEIRELES, 2015).
O óleo de semente de urucum também foi encapsulado com goma arábica,
por meio de emulsificação em ultrassom de alta intensidade seguido de liofilização
ou atomização. A maior eficiência de encapsulação foi observada para as
micropartículas atomizadas (85 %) e, consequentemente, essas micropartículas
apresentaram menor teor de óleo em sua superfície. No entanto, as micropartículas
liofilizadas foram as que apresentaram maior estabilidade à oxidação, verificada
através do ensaio em Rancimat. Em relação à morfologia, as micropartículas
atomizadas apresentaram formato esférico com superfície áspera, sem fissuras ou
aberturas, medindo aproximadamente 14 µm. As micropartículas liofilizadas
apresentaram-se na forma de placas irregulares, com estrutura porosa, medindo em
torno de 171 µm (SILVA; et al., 2015).
34
Chatterjee e Judeh (2016) encapsularam óleo de peixe pelo método de
emulsificação por membrana, utilizando quitosana modificada com cloreto de lauroíla
como material de parede. A encapsulação foi confirmada pela técnica de
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier. As micropartículas
apresentaram formato esférico, medindo aproximadamente 4,3 µm. Através da
análise termogravimétrica foi possível constatar que as micropartículas eram
termicamente estáveis. A eficiência de encapsulação foi de 62,6 % e o máximo de
liberação obtido foi de 76,8 % em 30 dias. No ensaio in vitro simulando condições
gástricas e intestinais, com e sem enzimas, observou-se que a presença de enzimas
impediu o inchamento das micropartículas. Na ausência de enzimas as
micropartículas apresentaram maior índice de inchamento, sem ocorrer a dissolução
do material de parede, o que indica que a liberação estaria ocorrendo por difusão,
2.3.3.2
Carotenoides
A encapsulação de carotenoides de origem natural e sintética tem sido estuda
nos últimos anos, dentre entre estes estudos podem ser citados os seguintes.
Extratos com altas concentrações de carotenoides, obtidos a partir de resíduo
do processamento de camarão rosa, foram encapsulados por precipitação com Antisolvente Supercrítico (SAS) em pequena e grande escala, utilizando copolímero tribloco (pluronic F127) como material encapsulante, e pela Extração Supercrítica de
Emulsões (SFEE) utilizando amido modificado. O método SAS em pequena escala
proporcionou eficiência de encapsulação entre 19,7 a 74 %, sendo o melhor
resultado obtido quando foi utilizada uma maior concentração de extrato. Pelo
mesmo método, em grande escala, a eficiência de encapsulação variou entre 65 e
69 %. No entanto, para o método de SFEE a eficiência foi de 93,1 %, sendo
produzidas partículas de menor granulometria (aproximadamente 0,7 µm) em
relação às obtidas pelo método SAS (superior a 1 µm). A encapsulação foi
confirmada pela técnica de calorimetria diferencial de varredura, sendo que ambos
os métodos e materiais de parede utilizados foram capazes de proporcionar maior
estabilidade aos carotenoides, quando comparado com o extrato não encapsulado,
sem perda de cor nas primeiras 24 horas, o que evidencia a eficiência do processo
de encapsulação sob alta pressão (SAS) utilizado neste estudo (MEZZOMO et al.,
2012).
35
Suco de espinheiro-marítimo (Hippophae rhamnoides L.), contendo βcaroteno, foi encapsulado pelo método de gelificação iônica utilizando furcelana
como material de parede e cloreto de potássio (KCl) e cloreto de cálcio (CaCl2) como
agentes reticulantes. A concentração do cátion e a proporção entre polímero e o
material encapsulado influenciaram no tamanho e na firmeza das micropartículas.
Foi observado que quanto maior a concentração de furcelana, maior o diâmetro das
micropartículas (4,49 a 4,65 mm) e maior a firmeza. As micropartículas mais firmes e
esféricas foram obtidas quando uma solução contendo 8 % de furcelana foi gotejada
em uma solução de KCl 1,3 M, na proporção 1:3. Nestas condições, utilizando 100
% (m/m) de suco, a eficiência de encapsulação foi de 97% (LAOS et al., 2007).
O urucum, que tem sua coloração atribuída principalmente ao carotenoide
bixina, foi encapsulado utilizando quitosana, através das técnicas de impregnação,
coacervação simples e modificação química. A cor das micropartículas foi
dependente do método de encapsulação, sendo que as micropartículas obtidas por
impregnação e coacervação foram as que proporcionaram maior proteção ao
corante. Através da técnica de calorimetria diferencial de varredura foi possível
constatar que as micropartículas impregnadas e coacervadas apresentaram
interações de natureza física entre o corante e o polímero, enquanto que as
quimicamente modificadas apresentam interações de natureza química. A liberação
do corante foi avaliada em uma faixa de pH de 1 a 5, sendo observado liberação
mais rápida em pHs mais baixos (PARIZE; SOUZA; BRIGHENTE, 2008).
Suco de pitanga roxa (Eugenia uniflora L.), com alta concentração de
carotenoides, foi encapsulado por Rutz et al. (2013) nas matrizes de goma xantana,
goma tara e hidrogel formado pela associação de ambas, pelo método de
liofilização. A encapsulação foi confirmada através das técnicas de calorimetria
diferencial de varredura e difratometria de raio-x. Quando as gomas foram utilizadas
de forma isolada, a eficiência de encapsulação foi superior a 90 %, no entanto para
o hidrogel foi verificada eficiência de 74 %. O hidrogel apresentou comportamento
mais adequado, proporcionando liberação de 20 % dos carotenoides no fluido que
simula condições gástricas e de 85 % no fluido que simula condições intestinais. As
micropartículas foram armazenadas tanto na ausência e presença de luz como a 4 e
25 ºC. Em todas essas condições houve degradação dos carotenoides, no entanto
goma xantana e o hidrogel foram os revestimentos que proporcionaram maior
estabilidade para estes compostos.
36
A encapsulação de oleoresina de tomate, com alta concentração de licopeno,
foi realizada pela emulsificação com concentrações de zeína de 4 a 14 %, sendo
esta emulsão posteriormente submetida ao processo de atomização. O rendimento
das micropartículas variou de 67,41 a 76,12 % e a eficiência de encapsulação de
74,19 a 90,45%, sendo diretamente proporcional com a concentração de zeína. As
micropartículas foram armazenadas por 18 dias, a 4, 25 e 35 ºC, onde foi observado
que quanto maior a temperatura, maior o percentual de degradação do licopeno,
sendo de 23,63, 66,04 e 81,91%, respectivamente, ao final do período avaliado
(XUE et al., 2013).
Em estudo realizado por Chiu et al. (2007), a técnica por dióxido de carbono
(CO2) supercrítico foi utilizado para extrair licopeno de resíduos de polpa de tomate.
O extrato foi encapsulado com 4,5% de gelatina e 10% de poli (ácido γ-glutâmico),
sendo obtidas micropartículas com 38,7 µm que foram termicamente estáveis até
120 ºC. Durante o armazenamento as concentrações de cis e trans licopeno e de
licopeno total reduziram com o aumento do tempo e da temperatura. No estudo de
liberação simulando condições gástricas e intestinais, sem a presença de enzimas,
pode-se observar que entre os pHs 2,0 e 3,5 não houve liberação de licopeno, no
entanto na faixa de pH entre 5,5 e 7,0, o percentual de liberação variou de 71 a 98
%.
Rocha et al. (2012) encapsularam diferentes concentrações de licopeno
utilizando uma solução de amido modificado contendo 30% de sólidos (Capsul ®),
através da técnica de atomização. Foram obtidas micropartículas arredondadas de
tamanhos variados, com concavidades. A microencapsulação proporcionou maior
proteção ao licopeno, quando comparado com o licopeno não encapsulado, mesmo
com a baixa eficiência de encapsulação, de 21 a 29 %. As micropartículas foram
aplicadas em bolos e observou-se que estas foram capazes de liberar o pigmento,
alterando a coloração do produto de uma forma homogênea.
A eficiência de encapsulação do licopeno quando encapsulado pelo método
de atomização, utilizando como material de parede gelatina e sacarose foi
dependente dos parâmetros avaliados. As condições ótimas para a encapsulação
foram obtidas quando utilizou-se a proporção de sacarose:gelatina de 3:7 e a
proporção 1:4 de licopeno:material de parede. A encapsulação foi confirmada pela
técnica de Difratometria de Raio-X. As micropartículas apresentaram formato
esférico e superfície lisa, com diâmetro de 2 a 15 μm. O licopeno apresentou algum
37
grau de isomerização e degradação quando exposto ao calor de secagem, mas
apresentou boa estabilidade durante o armazenamento (SHU et al., 2006).
O estudo de Donhowe et al. (2014) teve como objetivo avaliar o efeito do
método de encapsulação no perfil de liberação in vitro simulando condições
gastrointestinais e biodisponibilidade de β-caroteno. Foram avaliadas 3 formulações:
β-caroteno encapsulado com maltodextrina submetido a secagem por atomização,
β-caroteno disponível comercialmente em forma de pó dispersível em água,
micropartículas de β-caroteno encapsulado com alginato de sódio, revestidas de
quitosana. As micropartículas de maltodextrina apresentaram menor teor de unidade
(3,5 %) e tamanho menor (10,5 µm), no entanto a menor atividade de água foi
verificada para aquelas revestidas de alginato de sódio/quitosana (0,195). A
eficiência de encapsulação dessas micropartículas foi de 37,7 % e 54,7 %,
respectivamente. O β-caroteno em pó dispersível em água apresentou maior
percentual de liberação, sendo este de 93,3 %, e maior percentual de incorporação
em micelas, de 36,4 %. Após a aplicação em matrizes alimentares (pudim e iogurte)
o percentual de liberação e incorporação em micelas diminuiu significativamente
para todas as micropartículas, sendo este efeito foi mais pronunciado no iogurte.
Toniazzo et al. (2014) produziram lipossomas carregados de β-caroteno e
avaliaram a incorporação em iogurtes. Após a secagem, os lipossomas foram
hidratados e uma mistura das gomas xantana e guar, em diferentes proporções
(10:90 e 20:80) e concentrações (0,10 % e 0,15 %), foi utilizada para estabilizar as
dispersões.
Os
lipossomas
apresentaram
formato
esférico,
medindo
aproximadamente 1 µm; no entanto, após o armazenamento das dispersões por 95
dias, foi observado um aumento no tamanho dos lipossomas nas micropartículas
que apresentavam 0,15 % da mistura dos estabilizantes. Durante o armazenamento
houve a retenção de aproximadamente 90 % dos carotenoides. As dispersões de
lipossomas mais estáveis foram aplicadas como corante na produção de iogurte, e
os resultados indicaram que lipossomas carregados de β-caroteno podem ser uma
alternativa para proporcionar ao produto coloração vermelha. A caracterização
físico-química dos iogurtes demonstrou que a textura não foi afetada pela
incorporação dos lipossomas.
Coronel-Aguilera e Martín-González (2015) encapsularam β-caroteno com
maltodextrina e caseinato de sódio, pelo método de atomização. Após a secagem,
as micropartículas foram submetidas ao revestimento por leito fluidizado com uma
38
solução de hidroxipropicelulose, variando a temperatura de entrada e a taxa de
alimentação. O tamanho das micropartículas variou de 48,5 a 69,5 µm e a
encapsulação foi influenciada pela temperatura de alimentação, sendo verificada
uma maior encapsulação de carotenoides em temperaturas mais baixas. O
revestimento a 70 °C, com taxa de alimentação de 7 mL.min-1 proporcionou maior
proteção ao β-caroteno, mantendo a intensidade da coloração das micropartículas
durante o armazenamento a 4 ºC, 25 ºC e 45 ºC, por 4 semanas. Nessas condições
as micropartículas também apresentaram maior teor de umidade e atividade de
água. As micropartículas foram aplicadas em iogurte e armazenadas por 4 semanas
sob refrigeração, sendo observadas,após este período mínimas alterações na cor.
Caseinato de sódio foi utilizado como agente encapsulante do β-caroteno no
estudo de Jarunglumlert, Nakagawa e Adachi (2015) . No processo de encapsulação
foram obtidos aglomerados de caseína com e sem ajuste de pH, e também micelas
de caseína pela adição de sais. As formulações foram estocadas antes de serem
submetidas a secagem por atomização pelo período de 0, 48, 72 e 120 horas. O
armazenamento somente proporcionou diferenças significativas na eficiência de
encapsulação dos aglomerados de caseína com ajuste de pH, aumentando de 73,0
% para aproximadamente 83,0 %, após 120 horas. Os demais revestimentos
apresentaram menor eficiência, sendo inferior a 60 %. As micropartículas obtidas
através da solução estocada apresentaram maior estabilidade em termos de
retenção de β-caroteno e alterações na coloração, quando armazenadas a 60 ºC
com 11 e 75 % de umidade relativa, por 21 dias. Essa tendência também foi mais
evidente para os aglomerados de caseína com ajuste de pH.
Algas castanhas ou pardas (Phaeophyceae) apresentam coloração castanha
esverdeada, a qual é atribuída ao carotenoide fucoxantina. Este grupo de pigmentos
foi extraído e microencapsulado utilizando maltodextrina e Tween-80 como material
de parede através da técnica de liofilização, sendo a eficiência de encapsulação de
88,94 %. As micropartículas foram armazenadas na ausência de luz nas
temperaturas de 28, 45 e 65 ºC pelos períodos de 28, 9 e 4 dias, respectivamente. O
tempo de meia vida dos pigmentos microencapsulados foi determinado após a
análise de degradação durante o armazenamento. As micropartículas armazenadas
a 28 ºC apresentaram tempo de meia vida de 63 dias; as armazenadas a 45 ºC de
15 dias e as micropartículas armazenadas a 65 ºC de 3 dias (INDRAWATI et al.,
2015).
39
3
Capítulo 1 – Elaboration of microparticles of carotenoids from natural and
synthetic sources for applications in food
Abstract: Carotenoids are susceptible to isomerization and oxidation upon exposure
to oxygen, light and heat, which can result in loss of color, antioxidant activity, and
vitamin activity. Microencapsulation helps retain carotenoid stability and promotes
their release under specific conditions. Thus, the aim of the study was to encapsulate
palm oil and synthetic β-carotene with chitosan/sodium tripolyphosphate by gelation
ionic method or chitosan/carboxymethylcellulose by complex coacervation method
and to assess the performance of these microparticles in food systems by analyzing
their release profile under simulated gastric and intestinal conditions. Encapsulation
efficiency was greater than 95%, and the yield of microparticles coated with
chitosan/sodium
tripolyphosphate
was
approximately
55%,
while
that
of
microparticles coated with chitosan/carboxymethylcellulose was 87%. Particles
encapsulated with chitosan/carboxymethylcellulose exhibited ideal release behavior
in water and gastric fluid, but showed low release in the intestinal fluid. However,
when applied to food systems these particles showed enhanced carotenoid release
but showed low release of carotenoids upon storage.
Keywords: microencapsulation; release profile; chitosan; carboxymethylcellulose;
sodium tripolyphosphate.
3.1 Introduction
Carotenoids are one of the most widespread pigment groups in nature and are
responsible for the yellow, orange or red color of fruits, leaves, and flowers
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1997). Synthetic β-carotene, with a molecular structure
identical to natural β-carotene, was first synthesized in the 1950s using β-ionone,
derived from acetone or butadiene, as the precursor (BRITTON; LIAAEN-JENSEN;
PFANDER, 1996).
Natural β-carotene can also be obtained from filamentous fungi, yeasts, microalgae, and bacteria using biotechnological processes, or by extraction from plant
sources. Using natural sources of carotenoids such as palm oil is distinctly
advantageous as it has not only β-carotene but also other carotenoids, albeit in lower
40
concentrations, which contribute to the health benefits associated with carotenoids
(DUFOSSE et al., 2005).
Some carotenoids are precursors of vitamin A, if they have a chemical
structure with at least one β-ionone ring linked to a chain of 11 carbons, as in the
case of β-carotene which has greater pro-vitamin A potential compared to either αcarotene or β-cryptoxanthin (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
In addition to such pro-vitamin activity, some carotenoids also show high
antioxidant potential because the presence of conjugated double bonds enables
these molecules to accept electrons from reactive species, thus neutralizing free
radicals. However, the presence of conjugated double bonds also makes these
compounds susceptible to isomerization and oxidation in the presence of oxygen,
light, and heat, which then lead to loss in color, antioxidant property, and vitamin
activity (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997; GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
Microencapsulation is a process that increases the stability of these compounds by
physically isolating them from environmental conditions using wall materials
(MATSUNO; ADACHI, 1993).
Wall materials are usually biodegradable polymers that may be natural,
modified natural or synthetic. The natural polymers are less costly compared to other
polymers when used for microencapsulation (LIU et al., 2008). In addition to
protecting the core material, microencapsulation enables the controlled release of the
active substance(s) in specific parts of the body (JINGOU et al., 2011). Though a
single polymer can be used for microencapsulation, in most cases single
encapsulating agent does not possess all the properties of an ideal wall material, and
thus a combination of polymers is recommended (MATSUNO; ADACHI, 1993).
Encapsulation through the interaction between the different wall materials can
be achieved by different methods, such as complex coacervation and ionic gelation.
Complex coacervation requires an interaction between oppositely charged polymers,
and this method has been used for the encapsulation of vitamin E (ALENCASTRE et
al., 2006), essential oils (JUN-XIA et al., 2011), phenolic compounds (BELŠČAKCVITANOVIĆ et al., 2011, ZOU et al., 2012), iron (ARAÚJO, 2011). Ionic gelation
uses a multivalent anionic salt as the cross linker that promotes complexation with a
positively charged polymer, and this method has been used for the encapsulation of
ascorbyl palmitate (YOKSAN; JIRAWUTTHIWONGCHAI; ARPO, 2010), oregano
41
essential oil (HOSSEINI et al., 2013), vegetable oils (BARRETO, 2008), and lutein
(ARUNKUMAR; PRASHANTH; BASKARAN, 2013).
Food applications of encapsulated materials include providing supplements,
changes in solubility, taste, texture and color, and acting as sources of antioxidants
and antimicrobials. Several processes of nano- and micro-encapsulation have been
patented by companies for use in foods or as dietary supplements (FOLADORI;
INVERNIZZI, 2007); however, only a few studies relating to the application of
encapsulated compounds in foods have been reported, e.g., application of
microcapsules containing lycopene in cakes (ROCHA; FÁVARO-TRINDADE;
GROSSO, 2012), linseed oil in bread (GALLARDO et al., 2013), curcumin in ice
cream (SOUSDALEFF et al., 2013) and yogurt (MANGOLIM et al., 2014), and red
bell pepper pigments in yogurt (GOMES et al., 2014).
Among the vegetable oils consumed in the world, palm oil has the highest
concentration of carotenoids (ZAMBIAZI, 1997). Thus encapsulating this oil will
prevent carotenoid degradation during processing and storage and will facilitate the
incorporation and consumption of carotenoids from food products.
Given the above, the aim of the study was to prepare microparticles containing
synthetic β-carotene and palm oil with chitosan/carboxymethylcellulose as wall
material
by
the
complex
coacervation
method
and
with
chitosan/sodium
tripolyphosphate by the ionic gelation method, and to characterize these
microparticles with respect to encapsulation efficiency, morphology, and thermal
behavior. Furthermore, the aim was also to assess the release profile of the
microencapsulated compounds under simulated human gastric and intestinal
conditions, apply these microparticles in two food systems, namely bread and yogurt,
to assess their release profile and stability during storage and their release profile
upon exposure to simulated gastric and intestinal conditions.
3.2 Material and methods
3.2.1 Materials
The core materials used were trans β-carotene in powder form with 97% purity
(Sigma Aldrich Brazil Ltd, São Paulo, SP, Brazil), soybean oil (Soya, Bunge
Alimentos S.A., São Paulo, SP, Brazil), and pure palm oil (Hemmer, Cia Hemmer
Indústria e Comércio, Blumenau, SC, Brazil)
42
The encapsulating agents used were medium molecular weight chitosan (190310
KDa,
Sigma
Aldrich
Brazil
Ltd,
São
Paulo,
SP,
Brazil),
sodium
carboxymethylcellulose (Synth, LabSynth, Diadema, SP, Brazil), and sodium
tripolyphosphate (Synth, LabSynth, Diadema, SP, Brazil).
3.2.2 Methods
3.2.2.1 Content of carotenoids from core material
Quantification of carotenoid in palm oil (natural source) was performed by
dissolving 0.1 g of sample in 25 mL of hexane, and it was subsequently read
spectrophotometrically (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. The quantitation was
based on a calibration curve obtained using standard β-carotene (y=0.2191 x= –
0.0045, R2=0.9996) and results were expressed as µg of β-carotene.g-1 of sample
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
Pure β-carotene (synthetic source) was added to soybean oil, and the
carotenoid content of this oil was also evaluated in a similar way.
3.2.2.2 Preparation of microparticles
Encapsulation was performed according to the method described by Zou et al.
(2012), with a few modifications.
3.2.2.2.1 Wall materials
Chitosan (5 mg.mL-1) was dissolved in 0.1 M hydrochloric acid and neutralized
with 0.2 M sodium hydroxide solution till pH 5.6. The final volume of 1000 mL was
made up with distilled water.
Carboxymethylcellulose (CMC, 5 mg.mL-1) and sodium tripolyphosphate (TPP,
5 mg.mL-1) were dissolved in distilled water.
3.2.2.2.2 Core materials
Palm oil containing 1302.38 µg β-carotene.g-1, and soybean oil containing
1235.04 µg β-carotene.g-1 were used as core materials.
3.2.2.2.3 Encapsulation
Complex coacervation is characterized by the occurrence of phase separation
due to electrostatic attraction between two oppositely charged macromolecules such
43
as chitosan (positive charge) and carboxymethylcellulose (negative charge). For
encapsulation 100 mg of the core material (palm oil or soybean oil with β-carotene)
was added to 50 mL of chitosan solution; the solution was homogenized using an
ULTRA-TURRAX device (T18 Basic IKA) at 13500 rpm for 5 min; 50 mL of sodium
carboxymethylcellulose dispersion was added, and stirred further for 3 min. The pH
of the complex coacervation was 6.2. The dispersions were centrifuged (Eppendorf
5430 R) at 7000 ×g for 10 min. The supernatant was used for encapsulation
efficiency analysis and the precipitate containing palm oil microparticles or βcarotene microparticles was lyophilized and stored at –75 °C.
The process of ionic gelation uses a multivalent ionic salt as the cross linker
that promotes complexation with a positively charged polymer. In this study, chitosan
(positively charged) and sodium tripolyphosphate (negatively charged) were used.
The procedure for encapsulation by ionic gelation was identical to that of
coacervation and used 50 mL of sodium tripolyphosphate (5 mg.mL –1) instead of
sodium carboxymethylcellulose. The pH of the ionic gelation was 7.7.
3.2.2.3 Encapsulation efficiency (EE)
The supernatant (mentioned in Section 3.2.2.2) was made to a volume of 100
mL, and the precipitate was washed with distilled water. The supernatant (10 mL)
was mixed with 10 mL of hexane and homogenized on ULTRA-TURRAX (T18 Basic
IKA) at 13000 rpm for 20 s. The phases were separated, and the nonpolar phase
was collected, and spectrophotometrically read (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm.
The carotenoids that were not encapsulated were quantified as described in Section
3.2.2.1, and encapsulation efficiency was calculated using Equation 1, where Ct
represents total carotenoids and Cs the carotenoid content of the supernatant
(ALISHAHI et al., 2011).
% EE 
Ct  Cs
 100
Ct
Equation 1
3.2.2.4 Yield (Y)
The yield was calculated based on the solids content of the wall material
(M1=chitosan, and M2=CMC or TPP) and the amount of core material (N) used for
encapsulation, according to Equation 2 (JUN-XIA et al., 2011).
44
%Y 
Final weight of the microparticles
 100
(M 1  M 2  N )
Equation 2
3.2.2.5 Carotenoid content of microparticles
To estimate the carotenoid content of the microparticles, firstly the wall
material of 30 mg of the sample was dissolved using 2 M hydrochloric acid at 75 °C.
Subsequently, 10 mL of hexane was added, and the mixture was homogenized in
ULTRA-TURRAX (T18 Basic IKA) at 13000 rpm for 20 s. The hexane phase was
collected, volume was made up to 10 mL, and the sample was read
spectrophotometrically (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. The carotenoid content
was estimated as described in Section 3.2.2.1 and results are expressed as µg of βcarotene.g-1 of sample (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
3.2.2.6 Morphology
Microparticle morphology was analyzed by Scanning Electron Microscopy
(SEM, JEOL model JSM-6060 LV). Samples were fixed on a metal support with a
carbon double-surface band, covered by a fine gold layer, visualized using 2001500x magnification at an excitation voltage range between 10 and 15 kV.
3.2.2.7 Thermal behavior
The thermal behavior of palm oil, β-carotene, wall materials (chitosan/CMC
and chitosan/TPP) and microparticles was analyzed on DSC Q20 TA Instruments
using 2 mg of sample that was warmed in aluminum containers at a rate of 10 ºC
min-1. Thermal behavior was assessed between a temperature range of –30 C and
300 ºC with a 40 mL min-1 nitrogen flow.
3.2.2.8 Release profile of the encapsulated compounds
The release profile of the encapsulated material was evaluated by an in vitro
assay simulating gastric and intestinal conditions (CHIU et al., 2007; PARAMERA;
KONTELES; KARATHANOS, 2011), and in distilled water (BELŠČAK-CVITANOVIĆ
et al., 2011). Solutions of 0.1 M citric acid and di-sodium phosphate were mixed in
required proportions to reach a final pH of either 2.00 or 8.00 (CHIU et al., 2007). The
pH 2.00 solution (gastric fluid simulation - GFS) also contained 0.3% pepsin enzyme,
45
while the pH 8.00 solution (intestinal fluid simulation - IFS) also contained 0.1%
pancreatic enzyme (PARAMERA; KONTELES; KARATHANOS, 2011).
Approximately 20 mg of each type of microparticle was used in triplicate for
each of the seven time periods tested (0, 20, 40, 60, 120, 180 and 240 min). Distilled
water (10 mL), GFS and IFS were added to each sample and incubated at 37 °C.
After the indicated time periods 10 mL of hexane was added and the mixture
homogenized on ULTRA-TURRAX (T18 Basic IKA) at 13000 rpm for 20 s. The
hexane phase was collected, volume made to 10 mL, and then the sample was read
spectrophotometrically (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. Quantification of released
carotenoids was carried out as described earlier (Section 3.2.2.1) and the results are
expressed as percentage of released carotenoids.
3.2.2.9 Addition of microparticles to food systems
The quantity of microparticles added to the food systems was determined
according to yield and carotenoid content of the microparticles.
3.2.2.9.1 Microparticles in yoghurt
To produce yoghurt, 2 g of milk powder and 5.5 g of sucrose were added to 50
mL of milk, pasteurized at 95 °C for 5 min, cooled to 45 ° C, 10 mg of culture added
(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus mark Docina), and finally 0.25 g of chitosan/TPP microparticles or 0.50
g of chitosan/CMC microparticles added. The samples were then incubated at 45 °C
in an oven (Ethik - Ethiktechnology) until coagulum formation and attaining a pH
between 4.5 and 4.8. Subsequently, the samples were cooled and stored at 4 °C for
15 days, and evaluated every 5 days for carotenoid release.
3.2.2.9.2 Microparticles in bread
Bread was made using 70 g of flour, 1.23 g of salt, 3.5 g of sucrose, 2.1 g of
yeast; and 42.5 mL of water (GALLARDO et al, 2013); 0.25 g of chitosan/TPP
microparticles or 0.50 g of chitosan/CMC microparticles were also added. The solid
ingredients were homogenized, water added, mixed until the formation of a
homogeneous mass, allowed to stand for 1.5 h, and finally the bread was baked in
an electric oven at 200 °C for 30 min. The bread was stored at room temperature, in
46
the dark and in polyethylene packaging for a period of 9 days. The bread was
evaluated every 3 days for carotenoid release.
3.2.2.9.3 Release profile of carotenoids during storage
The release profile of the encapsulated carotenoids during storage was
evaluated immediately after processing (time 0) and every 5 days for 15 days for
yoghurt and every 3 days for 9 days for bread using the following procedure. Five
grams of each sample was weighed, hexane added, and the mixture stirred in
ULTRA-TURRAX (IKA T18 Basic) at 13000 rpm for 20 s. For bread samples, 10 mL
of water was added to facilitate homogenization. The hexane phase was collected,
volume made up to 10 mL, and spectrophotometrically (Jenway 6705 UV/Vis) read at
450 nm. Quantification of released carotenoids was performed as described earlier
(Section 3.2.2.1), and the results are expressed as percentage of released
carotenoids.
3.2.2.9.4 Release profile of carotenoids applied to food systems under
simulated gastric and intestinal conditions
The release profile under simulated gastric and intestinal conditions was
evaluated soon after processing as described earlier (Section 3.2.2.8). Each food
sample was weighed (5 g) in triplicate for each of the six time periods tested (0, 30,
60, 120, 180, and 240 min), simulated gastric (GFS) and intestinal (IFS) conditions
established, and incubated at 37 °C. Samples were removed at the specific time
points, hexane added and homogenized on ULTRA-TURRAX (T18 Basic IKA) at
13000 rpm for 20 s. The hexane phase was collected, volume made up to 10 mL,
and sample read spectrophotometrically (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. The
released carotenoid content was quantified as described earlier (Section 3.2.2.1),
and the results are expressed as percentage of released carotenoids.
3.2.3 Statistical analysis
The results are reported as means of three replicates and analyzed by
ANOVA.
The LSD test (p <0.05) was used to evaluate encapsulation efficiency, yield,
carotenoid content and release profile of the microparticles. For data obtained from
food systems, the LSD test was used to evaluate wall and core materials with respect
47
to release profile of the encapsulated compounds during storage and under
simulated gastric and intestinal conditions.
3.3 Results and Discussion
3.3.1 Carotenoid content
The chitosan/TPP microparticles had a significantly higher carotenoid content,
303.27 μg.g-1 to those with palm oil and 282.35 μg.g-1 to those with βcarotene/soybean oil. Chitosan/CMC microparticles with palm oil had 176.20 μg.g -1
and with β-carotene/soybean oil had 160.67 μg.g-1.
The microparticles containing palm oil probably showed a significantly higher
carotenoid content due to a higher concentration of carotenoids being present in
palm oil compared to the β-carotene/soybean oil mixture, where soybean oil was only
used as a vehicle for β-carotene.
3.3.2 Encapsulation efficiency and yield
A high encapsulation efficiency of greater than 95% was observed and it was
not significantly different between the two types of wall materials used. However, with
respect to core materials, the encapsulation efficiency differed significantly when they
were encapsulated with chitosan/TPP. The chitosan/CMC microparticles showed an
encapsulation efficiency of 97.4% and 96.3% for palm oil and β-carotene,
respectively, while that of the chitosan/TPP microparticles was 95.3% for palm oil and
96.8%for β-carotene.
Rutz et al. (2013) encapsulated purple Brazilian cherry juice (a natural source
of carotenoids like palm oil) by lyophilization technique, using xanthan gum, tara gum
and xanthan-tara hydrogel as wall materials. These authors suggested that dipoleinduced dipole interactions between the methyl groups of the carotenoids and those
of the polymers used as wall material helped achieve greater encapsulation
efficiency. Further, since the wall material used can also be considered as an ionic
compound, ion-induced dipole interactions may have also occurred.
Encapsulation efficiencies reported here are higher than those reported
previously. Rutz et al. (2013) evaluated the encapsulation efficiency of carotenoids
from purple Brazilian cherry juice, and reported an efficiency of 74-92% while
Alencastre et al. (2006) reported an efficiency of 81% when encapsulating Vitamin E
using chitosan/CMC.
48
Carotenoids have organic chains with a high carbon number that render these
molecules to have a hydrophobic character. The molecules possess the type of
interactions (lipophilicity) similar to oils; therefore, they are capable to interact
strongly with oils. Thus, during the encapsulation, the carotenoids are also
encapsulated. The high affinity between the carotenoids and the oil prevents
carotenoid loss to the aqueous medium during encapsulation. The lipophilicity
contributes to the high encapsulation efficiency of these compounds and
consequently increases their stability (GONNET et al., 2010).
Chitosan/TPP encapsulation of palm oil and β-carotene gave a yield of 54.6%
and 55.1%, respectively; however, when chitosan/CMC was used, the yield was
86.7% for palm oil and 87.7% for β-carotene. Further, the yield was found to be
inversely proportional to the carotenoid content of the microparticles.
The yield of microparticles appears to be dependent both on the type and
concentration of the wall material used for encapsulation. Barreto (2006) analyzed
sunflower oil encapsulation using different concentrations of chitosan and TPP and
found that microcapsule yield decreased non-linearly with decreasing TPP
concentration and ranged between 1 to 27%. This implies that low concentrations of
TPP would be ineffective as a cross linking agent in the chitosan solution, and thus
will result in a lower yield.
Jun-Xia et al. (2011) used complex coacervation to encapsulate the essential
oil of sweet orange using isolated soy protein and arabic gum and found that the
highest yield (about 55%) was obtained upon using wall materials at a ratio of 1:1 to
10% of the core material.
3.3.3 Morphology
The encapsulation of palm oil and β-carotene yielded irregular microparticles
with non-characteristic shape which was independent of the wall material used. Thus,
it was not possible to determine particle size (Figure 9).
49
Figura 9 - SEM micrographs of microparticles. a1) palm oil microencapsulated with
chitosan/CMC; a2) β-carotene microencapsulated with chitosan/CMC; b1) palm oil
microencapsulated with chitosan/TPP; b2) β-carotene microencapsulated with
chitosan/TPP.
This result is similar to other reports on particles with irregular shape,
especially where lyophilization combined with the use of encapsulation methods that
promote precipitation of the microparticles were the mainly used methods.
Additionally, they also did not use surfactants or organic solvents (ARAÚJO, 2011;
RUTZ et al., 2013; SOUSDALEFF et al., 2013; ZUANON; MALACRIDA; TELIS,
2013). These results suggest that such conditions are not ideal for the formation of
spherical microparticles.
3.3.4 Thermal behavior
Figure 10 shows the DSC thermograms for palm oil, β-carotene, wall materials
chitosan/TPP and chitosan/CMC, and the microparticles.
50
Figura 10 - DSC thermograms. a1, a3) palm oil; a2, a4) β-carotene; b1, b2)
chitosan/TPP; b3, b4) chitosan/CMC; c1) palm oil microencapsulated with
chitosan/TPP; c2) β-carotene microencapsulated with chitosan/TPP; c3) palm oil
microencapsulated with chitosan/CMC; c4) β-carotene microencapsulated with
chitosan/CMC.
This method permits an evaluation of the effects of heat on the physical or
chemical changes in the sample. An exothermic peak rises upwards (increase in
enthalpy), while an endothermic peak goes in the opposite direction. In general,
phase transitions, dehydration, and reduction produce endothermic effects while
crystallization, oxidation and certain decomposition reactions produce exothermic
effects. This technique also permits the study of transitions involving entropy
variations, of which the most common is the glass transition of polymers
(IONASHIRO, 2005).
In the present study, it is suggested that the endothermic and exothermic
events of core material are related to the melting of oil and the degradation of the
51
unsaturated compounds, respectively (CEDEÑO et al., 2001, MARTINI et al., 2010).
In the DSC thermogram of palm oil (Figure 10 - a1, a3), there was an endothermic
event at –1 °C and an exothermic event at 106.8 °C. For β-carotene (Figure 10 - a2,
a4), these events were observed at –8.5 °C and 90.9 °C, respectively. For the wall
materials used for encapsulation, endothermic peaks were obtained at 99.5 °C for
chitosan/TPP (Figure 10 - b1, b2) and 162.2 °C for chitosan/CMC (Figure 10 - b3 ,
b4); and these events are characteristic of dehydration (IONASHIRO, 2005).
The thermograms of all microparticles (Figure 10 - C1, C2, C3, C4) showed
the absence of the endothermic events of the encapsulated compounds, as well as a
predominance of the characteristic thermal profiles of the wall materials. This is
especially true for the microparticles with chitosan/CMC, suggesting protection of the
core material by the wall material. This result also confirms the observed high
encapsulation efficiency of both wall materials used.
Other reports on encapsulation of fat-soluble compounds also claim to have
observed a displacement and/or disappearance of the endothermic and exothermic
events that are characteristic of encapsulated compounds. Together, these results
also suggest that efficient encapsulation protects against thermal degradation
(ZHANG; ZHONG, 2013, CORONEL-AGUILERA; SAN MARTÍN-GONZÁLEZ, 2015).
Furthermore, the absence of exothermic peaks at 200 °C indicating
degradation suggests that these microparticles will maintain their integrity even when
applied to products, such as bread, which have to be heated to high temperatures
during production.
3.3.5 Release profile of carotenoids
Figure 11 (Apêndice A) shows the release profile of the encapsulated
carotenoids in aqueous medium (distilled water), and in simulated gastric and (GFS)
and intestinal (IFS) conditions. It was observed that the release profile was
dependent on the wall material, core material, and the release milieu studied.
52
Figura 11 - Release profile of β-carotene and carotenoids from palm oil
encapsulated: a) in water and fluids that simulate b) gastric (GFS) and c) intestinal
(IFS) conditions.
In aqueous media, chitosan/TPP coated microparticles showed a maximum
release of 43.75% for palm oil and 34.71% for β-carotene; the release was more
pronounced after 60 min. There were no significant differences in the release
percentage from the chitosan/CMC coated microparticles among the time points
tested and the release percentage at 240 min was 26.7% for palm oil and 20% for β-
53
carotene. Furthermore, between the two core materials used, β-carotene had
significantly lower release percentage at the end of the storage period irrespective of
the type of wall material used.
Under simulated gastric conditions, the palm oil-chitosan/TPP microparticles
released their contents gradually with a 53% release at 240 min. The β-carotene
microparticles produced with the same wall material, however, exhibited a more
pronounced release in the first 20 min, followed by a constant release till up to 60 min
with a total release of approximately 81%. In contrast, the chitosan/CMC
microparticles showed a much lower release rate of around 17% during dissolution
and this did not significantly change at 240 min. Moreover, both types of core
material showed higher release rates when encapsulated with chitosan/TPP.
Under simulated intestinal conditions palm oil microparticles encapsulated with
chitosan/TPP showed a release of approximately 40% between 20 to 60 min;
subsequent release was gradual with a total release of 67%. However, microparticles
of β-carotene with identical wall material released approximately 35% of β-carotene
at dissolution, and this did not significantly change during the storage period. In the
chitosan/CMC microparticles, core material release was only about 20%, and it did
not vary much over the time period tested, such as in other conditions. With respect
to core materials, the release behavior was similar to that observed in aqueous
media.
Wall materials must be able to protect the encapsulated compound and
release only small amounts of the core material under gastric conditions. However,
under intestinal conditions, they should completely and gradually release the core
material to facilitate better absorption of the nutrients in the intestine (SOMCHUE et
al., 2009).
Chiu et al. (2007) have evaluated the release of lycopene (extracted from
tomato paste waste) encapsulated with gelatin and poly-glutamic acid. While no
release was observed in gastric fluid (pH 2.0 to 3.5), 71-98% release was observed
in intestinal fluid (pH 5.5 to 7.0). Rutz et al. (2013) have evaluated the release profile
of carotenoids derived from purple Brazilian cherry juice that were encapsulated
using a xanthan-tara hydrogel. They observed an approximately 20% release of total
carotenoids under simulated gastric conditions (pH 2.0, pepsin enzyme) and 85%
release under simulated intestinal conditions (pH 8.00, pancreatic enzyme). In both
54
studies, an optimal release behavior was observed, different from that observed in
the present study.
The chitosan/CMC microparticles studied here showed low carotenoid release
in an aqueous medium and gastric condition, which is appropriate. However, the
percentage of carotenoids release in intestinal conditions was also low.
On the other hand, the chitosan/TPP microparticles showed inadequate
release in aqueous media and gastric conditions, but showed greatest release under
intestinal conditions. Under these conditions, the microparticles did not show ideal
behavior.
A possible reason for this difference could be that the chitosan/CMC wall
material enabled higher retention of carotenoids as it contains more groups capable
of lipophilic interaction compared to chitosan/TPP.
Another reason is related to the low efficiency of the ionic gelation process of
chitosan/TPP, which resulted in a low yield of microparticles. The observed low yield
could be due to an insufficient quantity of one of the wall materials resulting in
incomplete interaction between the two components. Nevertheless, this low yield did
not affect encapsulation efficiency, but might have caused the formation of more
fragile particles which released their contents more easily. It is worth mentioning here
that other factors such as pH, heat, and chemical composition can influence release
characteristics of these microparticles in food systems.
3.3.6 Incorporation of microparticles in food systems
According to RDC nº 269 (2005) of the National Health Surveillance Agency,
the recommended daily intake of vitamin A is 600 μg for adults and 375-500 μg for
children, where each 1 μg of β-carotene is equivalent to 0.167 μg of retinol (BRAZIL,
2005). Based on this and the quantity of carotenoids encapsulated, 200 mL of yogurt
or 200 g of bread will have about 10% of the carotenoid content required to meet the
vitamin A requirement of 500 µg/day for 7 to 10-year old children. However, as
encapsulation may improve stability and facilitate controlled release in specific parts
of the body, it will thus help avoid losses and increase the effective rate of
absorption.
55
3.3.6.1 Release of carotenoids during storage when applied to food systems
Figure 12 (Apêndice B) shows the release profiles of the encapsulated
compounds after processing and during storage of the food products.
Figura 12 - Profile release of β-carotene and carotenoids from encapsulated palm oil,
and applied in yogurt during storage at 4 ° C and in bread during storage at room
temperature.
The palm oil-chitosan/TPP microparticles released about 40% of the
carotenoids immediately after yogurt preparation, on the 10th day the release was
approximately 70% and remained constant thereafter.
The β-carotene microparticles with the same coating showed an initial release
of around 40%, but did not show any significant difference until day 5, and exhibited
a 46% release by the end of the storage period. Contrarily, the chitosan/CMC
microparticles with either of the core materials showed about 20% release within 5
days and no further significant changes in release percentage was observed.
Breads
containing
microparticles
coated
with
chitosan/TPP
released
approximately 45% of the carotenoids after processing and this remained constant
until day 6 of storage. After this period, microparticles containing palm oil released
56
about 60% of their content, while for the breads with β-carotene microparticles there
was a decrease in carotenoid content of approximately 10 percentage points. In the
chitosan/CMC microparticles, the release of carotenoids was significantly lower at
about 30% and this did not vary significantly during storage.
In the products containing chitosan/CMC microparticles, the release of
carotenoids was significantly lower. However, a standard release profile was not
verified when core materials were compared, because sometimes there was a higher
release of β-carotene, and at others, there was a greater release of carotenoids from
palm oil; also sometimes there was no significant differences in the percentage of
release.
3.3.6.2 Release profile of carotenoids under simulated gastric and intestinal
conditions when applied to food systems
The release profiles of carotenoids from microparticles added to the yogurt
and bread under simulated gastric and intestinal conditions are provided in Figure 13.
57
Figura 13 - Release profile of carotenoids from the microparticles applied in yogurt,
simulating a) gastric (GFS) and b) intestinal (IFS) conditions and breads simulating c)
gastric and d) intestinal conditions.
58
3.3.6.2.1 Yogurt
The release profiles of carotenoids from microparticles added to the yogurt
under simulated gastric and intestinal conditions are provided in Figure 13 (a and b –
Apêndice C).
Under
simulated
gastric
conditions
(GFS),
palm
oil-chitosan/TPP
microparticles initially released 77%, after the release was gradual up to 60 min, and
at 120 min the total content of carotenoids was released. The β-carotenechitosan/TPP microparticles released approximately 66% of the carotenoids upon
dissolution in GFS, presented a quick release in the first 30 min (91%) and remained
constant thereafter.
The microparticles with chitosan/CMC as wall material displayed much lower
release rates. Palm oil microparticles initially released only 27% of the carotenoids
which then increased to 36% at 30 min and remained constant thereafter till 240 min.
The β-carotene microparticles released about 19% of the carotenoids upon
dissolution in GFS, the release percentage remained at 28%, on average, from 30 to
180 min; and at the end of 240 min approximately 42% of the carotenoids was
released.
Under simulated intestinal conditions, the chitosan/TPP particles showed a
67% release of carotenoids with both palm oil and β-carotene, and complete release
occurred by 60 and 180 min for palm oil and β-carotene, respectively. The
chitosan/CMC particles displayed an initial release of 41% with palm oil, and this
remained unchanged until the end of the study period, while the β-carotene content
released in the first 30 min was about 27%, and this also did not significantly
increase by the end of 240 min.
Regardless of the fluid and the wall material used, the chitosan/TPP coating
resulted in greater release of carotenoids. The highest release percentage in GFS
was observed in palm oil microparticles at time points 0 min and 120 min. A similar
behavior was observed with chitosan/CMC microparticles but only at 180 min, and
there was no significant difference after this time point. Further, in IFS, the
chitosan/TPP microparticles showed greater release of β-carotene at 30 and 180 min
and the palm oil carotenoids at 60 to 120 min while the chitosan/CMC microparticles
showed greater carotenoid release percentage with palm oil.
59
3.3.6.2.2 Bread
Figure 13 (c and d – Apêndice D) shows the release profiles of carotenoids
upon exposure to simulated gastric and intestinal conditions for bread. In GFS,
chitosan/TPP particles displayed a gradual release with both core materials; this was
initially about 40% and reached 81% to 82% at 240 min. The chitosan/CMC particles
also showed similar behavior starting at 25% and 23% and ending at 65 % and 53%
for palm oil and β-carotene microparticles, respectively.
In IFS, the release was gradual for both the wall materials and the core
materials tested. In microparticles coated using chitosan/TPP, 40% of palm oil
carotenoids was released upon dissolution which subsequently reached 68% by 240
min. For β-carotene, this release ranged between 36% and 73%. In chitosan/CMC
particles, and for both types of core materials used, approximately 28% of the
carotenoids was released at time 0 and 52% release occurred at 240 min.
Similar to the release characteristics observed in yogurt, chitosan/CMC
particles released a significantly lower percentage of carotenoids in bread, and this
was independent of the fluid and the encapsulated compound. Between the two core
materials, palm oil microparticles had greater release percentages.
Electrostatic interactions between polyanions and polycations are responsible
for the formation of polyelectrolyte complexes. At pH values close to neutrality, there
is a balance between charges that favor complex formation because maximum
interaction occurs between the ionizable groups. As pH decreases, protonation of the
amino groups in the chitosan molecule occurs, which culminates in electrostatic
repulsion and a weakening of mechanical and chemical resistance. As pH increases
above 7, deprotonation of the reactive groups reduces the ionic interactions between
the biopolymers. Besides changes in pH, temperature elevation and enzymatic action
may also cause a weakening of the chemical bonds (NORDBY et al., 2003;
MENDES et al., 2011). These factors may have resulted in a greater release of the
encapsulated compounds under simulated gastric and intestinal conditions compared
to aqueous medium, both before and after food product processing.
The present study demonstrates the conditions of release of the encapsulated
carotenoids in simulated gastric and intestinal fluids, taking into consideration only
the pH and the presence of enzymes, before and after application of microparticles in
foods. However, further studies are needed to assess the influence of bile salts and
60
the transfer and incorporation of carotenoids from these microparticles into the
micelle, where they could be absorbed.
Furthermore, it was observed that processing, especially at high temperatures,
facilitated the release of the encapsulated carotenoids. However, in addition to
processing conditions such as temperature, the components present in foods may
also influence the release and absorption of encapsulated compounds. For example,
a higher concentration of lipids could facilitate carotenoid incorporation into micelles,
whereas high fiber content would inhibit the formation of micelles and reduce the
bioavailability of the carotenoids (TYSSANDIER; LYAN; BOREL, 2001, SAINI; NILE;
PARK, 2015).
3.4 Conclusion
The high encapsulation efficiency achieved in this study (greater than 95%)
indicates that it is possible to encapsulate carotenoids using the complex
coacervation and ionic gelation methods with chitosan/carboxymethylcellulose and
chitosan/sodium tripolyphosphate as wall materials, respectively. Even though the
microparticles did not display characteristic shape, encapsulation was successful
because the wall material could effectively protect the core material, as confirmed by
DSC analyses.
Generally, particles coated with chitosan/carboxymethylcellulose exhibited
ideal release behavior in aqueous media and in gastric fluid, but showed low release
percentage in intestinal fluid, which, however, increased when applied to food
systems such as yoghurt and bread. These particles also demonstrated lower
carotenoid release during storage.
Contrarily, the chitosan/sodium tripolyphosphate particles showed high
carotenoid release in aqueous media and gastric fluid, but satisfactory behavior in
intestinal fluid. Carotenoid release further increased when these microparticles were
added to food systems and they also tended to release more carotenoids during
storage.
Acknowledgments
The authors would like to thank Capes (Coordination of Improvement Higher
Education Personnel) and CNPq (National Council of Scientific Development) for
funding and support.
61
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66
4
Capítulo 2 – Microencapsulation of palm oil by complex coacervation for
application in food systems
Abstract: The aim of this study was to microencapsulate palm oil, which contains a
high carotenoid content, with chitosan/xanthan and chitosan/pectin by complex
coacervation method, followed by atomization and lyophilization. The encapsulation
was confirmed by the DSC technique, but only the atomized microparticles showed
characteristic shape. The lyophilization technique promoted greater carotenoid
stability during the encapsulation process, showing higher yield and theoretical
encapsulation efficiency. As well, there was a better release profile in both water and
gastrointestinal fluid. In general, the chitosan/pectin microparticles showed the most
suitable release profile in vitro in water and in gastrointestinal fluid. However, after an
application in yogurt and bread, the microparticles of chitosan/xanthan showed the
best results. Before application to food, the microparticles showed a greater
percentage of release in the fluid that simulates gastrointestinal conditions; however,
after being released the compounds were degraded. After processing, the release
rate was low and the released compounds were not degraded. In addition, during
storage a low percentage of carotenoids were released.
Keywords: carotenoids; chitosan; xanthan; pectin; release profile.
4.1 Introduction
The palm is the fruit obtained from Africa`s native palm tree, that is also
cultivated in Central America, South America, and Asia. It is known as “dendezeiro”,
or by the scientific name Elaeis guineenses. From this fruit two types of oils can be
obtained: palm kernel oil, which is derived from the almond of the fruit, and palm oil
which is derived from its mesocarp (DE OLIVEIRA; RIBEIRO; KIECKBUSCH, 2015;
Septevani et al., 2015).
Palm oil is known for its high content of bioactive compounds, particularly
carotenoids, which contribute to its stability and nutritional value (MUSTAPA et al.,
2011; SZYDŁOWSKA-CZERNIA et al., 2011). Carotenoids consist of a group of
pigments of which the color varies from yellow to red. Its chemical structure is formed
of eight isoprene units, thus forming a system of conjugated double bonds. This
system enables the carotenoids to receive electrons from reactive species,
67
neutralizing free radicals; therefore, they are characterized as antioxidants
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
Besides antioxidant activity, some carotenoids are precursors of vitamin A,
such as β-carotene, α-carotene, and β-cryptoxanthin. This characteristic is attributed
to the presence of at least one β-ionone ring, linked to a chain of 11 carbons in their
chemical structure (RODRIGUEZ-AMAYA, 1997). However, these characteristics
make them susceptible to isomerization and oxidation by oxygen, light and high
temperatures, and may result in loss of color, antioxidant effect and vitamin A activity
(GONNET; LETHUAUT; BOURY, 2010).
The microencapsulation consists of one way to provide stability to these
compounds and to make their release in a controlled way under specific conditions.
Appling this technique may protect sensitive substances through the physical
isolation provided by one or more encapsulating materials (MATSUNO; ADACHI,
1993). Proteins, lipids and carbohydrates may be used as encapsulating materials.
However, the choice of material should be based on non-reactivity with the material
to be encapsulated, by the encapsulation method used for microparticle formation
and by an ideal release mechanism (SHAHIDI; HAN, 1993; MATALANIS; JONES;
MCCLEMENTS, 2011).
Depending on the encapsulation method, only one or several encapsulating
materials may be used. Two or more encapsulating materials are usually applied
because a single agent does not present all the ideal properties (MATSUNO;
ADACHI, 1993).
One method which uses the combination of encapsulating agents is complex
coacervation. This method is characterized by the occurrence of the separation of
phases due to electrostatic attraction caused between at least two oppositely
charged macromolecules. Other weak interactions such as hydrogen bonding and
hydrophobic interactions may also contribute to a complex formation (ACH et al.,
2015). This method is widely used in the encapsulation of lipophilic compounds, such
as essential oils (DIMA et al., 2014; PENG et al., 2014), vegetable oils (YANG et al.,
2015; YANG et al., 2014), and fish oil (WANG; ADHIKARI; BARROW, 2014;
PIACENTINI et al., 2013), among others.
In foods, the microparticles can be added to mask flavor and aroma, to change
texture and color, and also as antimicrobials and antioxidants. However, there are
only a few studies reporting its application. Among these the flaxseed oil
68
microencapsulated in bread can be mentioned (GALLARDO et al., 2013), as well as
the lycopene microcapsules in cake (ROCHA; FÁVARO-TRINDADE; GROSSO,
2012).
Therefore, the aim of this study was to microencapsulate palm oil by complex
coacervation method using chitosan/xanthan gum and chitosan/pectin as wall
materials, comparing the drying methods of lyophilization and atomization. After, to
characterize the microparticles by the encapsulation efficiency, morphology, and
thermal behavior, and the release profile in water, as well as in a fluid that simulates
gastrointestinal conditions. This was followed by the aim to apply the microparticles
in bread and yogurt, and to evaluate the profile of the release of encapsulated
compounds when the fortified foods were exposed to fluids that simulate
gastrointestinal conditions.
4.2 Material and methods
4.2.1 Material
The encapsulated material was pure palm oil (Hemmer, Cia Hemmer Indústria
e Comércio, Blumenau, SC, Brazil). The encapsulating agents used were a medium
molecular weight chitosan 190 - 310 KDa (Sigma, Sigma Aldrich Brazil Ltda, São
Paulo, SP, Brazil) (C), xanthan gum (Sigma Aldrich, Sigma Aldrich Brazil Ltda, São
Paulo, SP, Brazil) (X) and pectin (CP Kelco, CP Kelco Brasil, Limeira, SP, Brazil) (P).
4.2.2 Methods
4.2.2.1 Content of carotenoids from palm oil
The quantification of the carotenoids was performed by dissolving 0.1 g of
palm oil in 25 mL of hexane with a subsequent reading by a spectrophotometer
(Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. Quantitation was performed based on a
calibration curve made with the standard β-carotene (y = 0.2191x – 0.0045, R2 =
0.9996). The results were expressed in µg of β-carotene.g-1 of sample
(RODRIGUEZ-AMAYA, 1997).
4.2.2.2 Elaboration of microparticles
The encapsulation was performed according to the method described by Zou
et al. (2012), with a few adaptations. Chitosan (5 mg.mL-1) was dissolved in a
hydrochloric acid 0.1M solution, after the neutralization was done with 0.2 M sodium
69
hydroxide to pH 5.6 and the desired volume was completed with distilled water. 100
mg of oil palm (with 1327.08 µg of β-carotene.g-1) was added to 50 mL of the
chitosan solution. The homogenization was promoted by an ultra turrax device (T18
Basic IKA) at 13500 rpm for 5 minutes.
After this procedure, the encapsulation by the complex coacervation method was
performed by adding 50 mL of xanthan gum (5 mg.mL -1) or pectin (5 mg.mL-1)
dispersion. After the addition of the second wall material the solution was
continuously stirred for another 3 minutes.
Part of the sample was frozen at -75 °C and lyophilized (lyophilizer Terroni Enterpreise II) and the other part was subjected to atomization in a dual fluid
atomizer, which was a pneumatic type (Mini Spray Dryer LM MSDI 1.0 LABMAQ,
Brazil) with a feeding nozzle of 1.0 mm diameter. The power of the dryer was carried
out using a peristaltic pump with a flow rate of 0.60 L/h. The temperature of the
drying air was 140 °C, the air pressure was 3.5 kgf/cm², and the atomizing air flow
rate was 40.5 L/h.
4.2.2.3 Real encapsulation efficiency (REE)
The real encapsulation efficiency refers to the percentage of carotenoids
present in the microparticles that were actually encapsulated (RUTZ et al., 2013).
Then, 5 mL of distilled water and 5 mL of hexane were added to 30 mg of the
sample. The quantification of the total carotenoid content of the microparticles was
done by homogenizing the sample in an Ultra Turrax (T18 Basic IKA) at 13000 rpm
for 1 minute, followed by centrifugation (Fanem BL-206) at 3000 rpm for 3 minutes.
The quantification of the carotenoid content on the surface was done by
homogenizing the sample with a vortex mixer (Biomixer QL-901) for 1 minute,
followed by centrifugation (206 Fanem-BL) at 3000 rpm for 3 minutes. After
separation of the phases, the nonpolar phase was collected and the reading was
performed in a spectrophotometer (Jenway 6705 UV/Vis.) at 450 nm. The
quantification of the carotenoid content was performed according to that described in
the 3.2.2.1 item.
The real encapsulation efficiency was calculated using equation 3 where Ct
represents the total carotenoids present in the microparticles and Cs represents the
carotenoid content present on the surface of the microparticles (ALISHAHI et al.,
2011).
70
% REE 
Ct  Cs
 100
Ct
equation 3
4.2.2.4 Theoretical encapsulation efficiency (TEE)
The theoretical encapsulation efficiency refers to the percentage of carotenoids
encapsulated in relation to the carotenoid content initially added (SOMCHUE et al.,
2009). It was calculated using equation 4, where Ct represents the total carotenoids
of the microparticles, Cs represents the carotenoid content in the surface of the
microparticles (both evaluated as described in section 4.2.2.3), and Ca represents
the initial content of carotenoids.
%TEE 
Ct  Cs
 100
Ca
equation 4
4.2.2.5 Yield (Y)
The yield was calculated based on the solid content of the wall materials (M1 chitosan and M2 - X or P) and the amount of the core material (N) used in the
encapsulation, according to equation 5 (JUN-XIA et al., 2011).
%Y 
Final weight of the microparticles
 100
(M 1  M 2  N )
equation 5
4.2.2.6 Degradation during the drying process (D)
The percentage of degradation was calculated by equation 6, where Ct
represents the total carotenoids of the microparticles, and Ca represents the initial
carotenoid content added.
%D 
Ct
 100
Ca
equation 6
4.2.2.7 Morphology
Morphological analysis of the microparticles was performed by the Scanning
Electron Microscope (JEOL model JSM-6060 LV). Samples were fixed in a metal
support with a carbon double-surface band, covered by a fine gold layer, and then
visualized afterward by 100 - 5000 x enlargements, at an excitation voltage of 15 kV.
4.2.2.8 Thermal behavior
The analysis of the thermal behavior of palm oil, the wall materials
chitosan/CMC and chitosan/TPP, and the microparticles was performed by the DSC
71
Q20 TA Instruments. Furthermore, 2 mg of each sample were warmed in aluminum
containers at a rate of 10 ºC min-1, between -30 and 300 ºC, with a 40mL min-1 of
nitrogen flow.
4.2.2.9 Release profile of carotenoids in distilled water and simulated
conditions of gastrointestinal fluid from the human body
The release profile of the encapsulated compounds was evaluated in in vitro
study simulating the human body gastrointestinal fluid (GFS) (SANSONE et al., 2011;
PARAMERA; KONTELES; KARATHANOS, 2011) and in distilled water (BELŠČAKCVITANOVIĆ et al., 2011).
Approximately 20 mg of each of the microparticles were weighed in triplicate for each
of the eight time periods (0, 30, 60, 120, 180, 240, 300 and 360 minutes). Distilled
water or GFS was added to each sample; after that it was incubated at 37 ° C.
To simulate conditions from the human body, in the first 120 minutes, the
samples were mixed with 5 mL of a 0.1 M HCl solution of which the pH was adjusted
to 2.00 with 0.2 M NaOH, containing 0.3% pepsin enzyme. After this time 3.5 mL of a
0.56 M solution of Na2HPO4 was added, containing a pancreatin enzyme in sufficient
quantity that the final volume reached 0.1% of the enzyme.
The samples were removed at these time periods. The hexane was then
added and the mixture was homogenized in a vortex mixer (Biomixer QL-901) for 1
minute, followed by centrifugation (206 Fanem-BL) at 3000 rpm for 3 minutes. After
separation of the phases, the nonpolar phase was collected and the reading was
performed by a spectrophotometer (Jenway 6705 UV / Vis.) at 450 nm. The
quantification of the carotenoid was performed according to the description in item
4.2.2.1. The result was expressed as a % released carotenoids.
4.2.2.10 Food systems with microparticles
According to the best results, some of the lyophilized microparticles were
selected to be added into the food systems.
4.2.2.10.1 Elaboration of yogurt with microparticles
For the elaboration of yogurt, 2 g of milk powder and 5.5 g of saccharose in 50
mL of milk were added; and the pasteurization was done at 95 °C for 5 minutes. After
72
that, the mixture was cooled at 45 °C, and 10 mg of the culture of micro-organisms
(Lactobacillus delbruechii subsp. bulgaricus and Streptococcus salivarius subsp.
thermophilus mark Docina) and 0.50 g of the microparticles were also added. The
samples were incubated at 45 °C in a kiln (Ethik - Ethiktechnology) until they reached
a pH from 4.5 to 4.8 for the coagulum formation. Next, the samples were cooled and
stored at 4 °C for 15 days, and evaluated every 5 days.
4.2.2.10.2 Elaboration of bread with microparticles
To elaborate the bread, 70 g of flour; 1.23 g of salt, 3.5 g of saccharose, 2.1 g
of yeast; and 42.5 mL of water (GALLARDO et al., 2013.) were used, besides 0.50 g
of microparticles. The solid ingredients were homogenized, after the water was
added, and then mixed until a homogeneous mass was formed that was allowed to
stand for 1.5 h. Then the bread was finally baked in an electric oven at 200 °C for 30
minutes. Thereafter, the bread was stored at room temperature, in the dark, in
polyethylene packaging for a period of nine days. The bread was evaluated every 3
days.
4.2.2.10.3 Release profile of carotenoids of food systems during storage
For the analysis of the food systems during the storage period, 5 g of each
sample was weighed, hexane was added, and the mixture was homogenized in a
vortex mixer (Biomixer QL-901) for 1 minute, followed by centrifugation (206 FanemBL) at 3000 rpm for 3 minutes. 10 mL of water was added to the bread samples
before homogenization. The phase containing hexane was collected, the volume was
set to 10 mL, and the reading was performed in a spectrophotometer (Jenway 6705
UV/Vis.) at 450 nm. The quantification of the released carotenoid was performed as
described before (item 2.2.1). The result was expressed as % of released
carotenoids.
This
evaluation
was
performed
only
for
samples
containing
microparticles.
4.2.2.10.4 Release profile of carotenoids, applied in food systems, simulating
gastric and intestinal conditions
The release profile of the carotenoids applied in food systems when they were
exposed to conditions simulating the gastric and intestinal characteristics of the
human body was performed similarly as described before (item 4.2.2.9).
73
For the analysis of food systems, 5 g of each sample was weighed in triplicate for
each of the eight time periods (0, 30, 60, 120, 180, 240, 300 and 360 minutes), and
then the fluids that simulate gastrointestinal conditions (GFS) were added. The
samples were incubated at 37 °C, and each time, the samples were removed.
Hexane was then added and the mixture was homogenized in a vortex mixer
(Biomixer QL-901) for 1 minute, followed by centrifugation (206 Fanem-BL) at 3000
rpm for 3 minutes. The phase containing hexane was collected, the volume was set
to 10 mL, and the reading was performed in a spectrophotometer (Jenway 6705
UV/Vis.) at 450 nm. The quantification of the released carotenoid was determined as
described before (item 4.2.2.1). The result was expressed as a % of released
carotenoids.
4.2.3. Statistical analysis
The results were expressed as means, relating to determinations performed in
triplicate, and subjected to an analysis of variance.
The LSD test (p < 0.05) was used to evaluate the wall materials and the drying
method, in relation to the real and theoretical encapsulation efficiency, yield,
carotenoid content and release profile of the microparticles. With the data of food
systems, this test was conducted to evaluate the wall materials and drying method in
relation to the release profile of encapsulated compounds in gastrointestinal
conditions, with the release profile during storage
4.3 Results and discussion
4.3.1 Encapsulation efficiency, yield and degradation percentage
In Table 1 there are the results of real and theoretical encapsulation efficiency,
with the yield and degradation percentage of carotenoids during the encapsulation
process.
74
Tabela 1 - Encapsulation efficiency and yield of microparticles of palm oil and
degradation percentage of carotenoids during the encapsulation process
Microparticles
Theoretical
Real encapsulation
Wall
Drying
encapsulation
efficiency
material
Method
efficiency (%)
(%)
CP
Lyophilization
52.20 Ba
73.50 Bb
CP
Atomization
22.25 Bb
78.03 Aa
CX
Lyophilization
62.41 Aa
81.12 Aa
CX
Atomization
32.67 Ab
67.70 Bb
Wall
Drying
Yield
Degradation during
material
Method
(%)
the process (%)
CP
Lyophilization
99.51 Aa
28.97 Ab
CP
Atomization
28.57 Ab
71.48 Aa
CX
Lyophilization
98.90 Aa
23.06 Bb
CX
Atomization
16.29 Bb
60.90 Ba
CP: chitosan/pectin CX: chitosan/xanthan. Means followed by different capital letters in the column
differ by LSD test (p <0.05) evaluating the wall material in each drying method. Means followed by
different lower case letters in the column differ by LSD test (p <0.05) evaluating the drying method in
each wall material.
The theoretical encapsulation efficiency, which refers to the carotenoid content
added initially, was superior to the microparticles of CX and lyophilized, when
comparing, respectively the wall materials and the drying methods. In relation to the
real encapsulation efficiency, which refers to content of carotenoids present in the
microparticles, it was greater for the atomized ones in the CP microparticles;
therefore, this was the reverse of what was observed for CX microparticles, in which
the greater efficiency was observed when lyophilized. This data shows that the
behavior of the microparticles was dependent on the wall material related to the
drying method.
The encapsulation efficiency of lipophilic compounds might be dependent on
the wall material, the encapsulation method, and also on the methodology used in
determining the encapsulation efficiency, which is quite varied. The encapsulation
efficiency (theoretical) obtained by Rocha et al. (2012), encapsulating lycopene with
modified starch (Capsul ®) by atomization ranged from 21 to 29%, confirming the
results obtained in this study to theoretical encapsulation efficiency. Rutz et al. (2013)
75
encapsulated carotenoids of purple Brazilian cherry juice with xanthan gum, tara gum
and hydrogel formed by the combination of both, by lyophilization. The encapsulation
efficiency (real) was 74 to 92%, which was similar to real encapsulation efficiency of
palm oil.
As to yield, the lyophilized microparticles were higher than 98 % and did not
show any significant differences. However, the atomized microparticles had a low
yield, especially when the wall material was the CX, 16.29 %. In addition to a low
yield, a high percentage of degradation was observed during the atomization
process, which was higher for CP microparticles, 71.48 %. In this study, when
comparing the wall materials, the CX provided greater protection, regardless of the
drying method.
The yield may be influenced by the drying method and the concentration of the
wall material. The atomization associated with low concentrations of wall material
provided a low yield, and the opposite was observed for lyophilization. Jun-Xia et al.
(2011) encapsulated the essential oil of sweet orange by complex coacervation
which was then followed by atomization, using isolated soy protein and arabic gum.
They reported a maximum yield of approximately 55 % using wall materials in the
ratio 1:1 and 10% of core material. Wang et al. (2014) reported that the yield was
dependent on the proportion of wall materials and the pH. These authors found the
maximum yield, around 70%, for tuna oil encapsulation by complex coacervation
followed by lyophilization, using gelatin and sodium hexametaphosphate in the ratio
15:1 at pH 4.7.
Regarding degradation, even though the atomization is considered an
inexpensive method and adapted to industrial conditions, it may cause degradation of
bioactive compounds due to the use of temperatures between 70 and 150 °C
(GONNET et al., 2010), as verified in the present study. On the other hand,
lyophilization is a process used for dehydrating heat sensitive materials due to the
low temperature process, providing a greater stability. However, the process has high
operating costs and a long time period (MARQUES; SILVEIRA; FREIRE, 2006;
FANG; BHANDARI, 2010).
4.3.2 Morphology
Figure 14 shows the SEM micrographs of palm oil, wall materials and of
the
microparticles. The atomized microparticles showed spherical shape and irregular
76
size less that 5 µm, independent of the wall material used. However, the
encapsulation with both wall materials, followed by lyophilization, provided the
formation of irregular microparticles with non-characteristic shape; therefore, it was
not possible to determine their size. Thus the shape of microparticules was
dependent of drying method.
Figura 14 - SEM micrographs of the microparticles. a1) chitosan/xanthan lyophilization; a2) chitosan/xanthan - atomization; b1) chitosan/pectin - lyophilization;
b2) chitosan/pectin - atomization.
In the atomization process, the fluid is dispersed in droplets that come into
contact with a stream of heated air, than the solvent evaporates and solid particles
are formed. These particles show spherical shape, because generally they have the
same size and shape of the droplet from which it was originated (BROADHEAD;
EDMOND ROUAN; RHODES, 1992). Spherical microparticles also were obtained in
others studies that used atomization with drying method (JUN-XIA et al., 2011,
ROCHA et al., 2012, GALLARDO et al., 2013, YANG et al., 2015).
In the lyophilization process, the fluid is frozen and subsequently the water in
shape of crystalline ice is removed by sublimation, resulting in a porous and friable
structure (BARRESI et al, 2009). This structure is grinded and are formed
microparticles with irregular and not-characteristic shape. Other authors also
77
obtained particles lyophilized with non-characteristic shape (RUTZ et al., 2013;
SOUSDALEFF et al., 2013; ZUANON; MALACRIDA; TELIS, 2013).
4.3.3 Thermal behavior
Figure 15 shows the DSC thermograms of palm oil, wall materials, and
microparticles.
Figura 15 - DSC thermograms. a1, a2, a3, a4) palm oil; b1) chitosan/xanthan lyophilization;
c1)
microparticles
chitosan/xanthan
-
lyophilization;
b2)
chitosan/xanthan - atomization; c2) microparticles chitosan/xanthan - atomization;
b3) chitosan/pectin - lyophilization; c3) microparticles chitosan/pectin - lyophilization;
b4) chitosan/pectin - atomization; c4) microparticles chitosan/pectin – atomization.
In the DSC thermogram of palm oil (Figure 15 - a1, a2, a3, a4) an endothermic
event at temperature of -1 °C and an exothermic event between 90.5 and 123.4 °C
could be observed, this events can be related with melting of oil and degradation of
carotenoids, respectively (CEDEÑO et al., 2001, MARTINI et al., 2010). The wall
materials showed differences in the profiles when submitted to different drying
methods. Lyophilized CX (Figure 15 - b 1) showed a small exothermic event between
103.4 and 139.5 °C; however, atomized CX (Figure 15 - b 2) showed exothermic
78
events between 88.8 and 117.2 °C and 225.9 °C and endothermic events between
126.7 and 171.6 °C and 226.6 °C. These endothermic events are characteristic of
dehydration, while exothermic effects can be related with crystallizations, oxidations
or some decomposition reactions (IONASHIRO, 2005).
An exothermic event could be seen in the lyophilized CP between 90.9 and
127.1 °C, and an endothermic peak at 147.6 °C (Figure 15 - b3). For the same
atomized wall material (Figure 15 - b4) exothermic events between 82.9 and 115.7
°C and 213.3 °C, and endothermic between 126.3 and 184.3 °C and at 217.7 °C
could be seen.
The lyophilized CX microparticles (Figure 15 - c1) did not show the
characteristic endothermic event of palm oil, or a displacement of the exothermic
event from 84.0 and 120.8 °C. However, when these particles were obtained by
atomization (Figure 15 - c2) a reduction and a displacement of the endothermic event
to -0.31 ° C was observed, as well as the disappearance of the exothermic event of
palm oil. There was an exothermic event at 97.0 °C, characterized as a displacement
event of the wall material, and two endothermic events at 126.0 °C and 226.2, similar
to those of the wall material.
For lyophilized CP microparticles (Figure 15 - c3) an absence of endothermic
profiles of oil and wall material, and an exothermic event displaced between 82.2 and
133.7 °C was observed, characteristic of the wall material. When atomized (Figure 15
- c4), these microparticles showed an exothermic event between 84.9 and 103.1 °C
and an endothermic event between 117.1 and 176.6 °C, characteristic of the wall
material, even though it was displaced.
The
displacement
and/or
disappearance
of
thermal
profiles
of
the
encapsulated and wall materials, the detection only of the thermal trend of the
polymeric matrix, as well as the presence of different events observed in the thermal
profile of the encapsulated and wall materials, suggested interaction and
encapsulation. In the thermograms of the microparticles these behaviors could be
observed, as well as in other studies related to encapsulation of fat-soluble
compounds (LUO et al., 2011; RUTZ et al., 2013; CORONEL-AGUILERA; MARTÍNGONZÁLEZ, 2015; YANG et al., 2015).
4.3.4 Release profile of carotenoids
79
The release profile of carotenoids from palm oil microencapsulated in water
and in a fluid that simulates gastrointestinal conditions can be seen in Figure 16
(Apêncide E).
Figura 16 - Release profile of carotenoids from palm oil microencapsulated in water
and fluid that simulates gastrointestinal conditions.
In water, lyophilised CX microparticles released initially about 19%; after 30
minutes there were no significant variations, remaining around 26.5%, except at 240
minutes, when there was a 39.4% release. 26.5% of the carotenoids of the
lyophilized CP microparticles were released at the time of dissolution. The release
was gradual until 120 minutes, and remained constant until 300 minutes, when there
was a final release of 43% of the carotenoids. The atomized CX microparticles
released 65.3% of carotenoids in water in 30 minutes. This percentage did not
change until after 60 minutes, from which time there was a gradual decrease in
carotenoid content, culminating with a 42.4% release. The release of carotenoids of
the atomized CP microparticles began at approximately 22.0%, not significantly
different from 30 to 360 minutes, remaining on average at 29.3%.
In water, a low release of carotenoids is expected, thus avoiding exposure of
these compounds in conditions that would culminate its degradation. In this context,
80
the lyophilized microparticles and the atomized CP microparticles showed a more
appropriate behavior, with an average release of 30% of the carotenoids.
In the gastrointestinal fluid, the lyophilized CX microparticles released 56.4%
at 60 minutes. When the fluid was changed from gastric to intestinal fluid, a reduction
in the carotenoid content occurred after 120 minutes, remaining at approximately
39.2 %. At the dissolution of the lyophilized CP microparticles 32.0% of carotenoids
were released, until after 60 minutes about 38.0% was released. However, upon
contact with the intestinal fluid, there was a release of 85.1%; and from this moment
there was a gradual reduction in the carotenoid content up to 60.6% at 360 minutes.
The contact of atomized CX microparticles with the gastric fluid released 75.2
% of carotenoids. This percentage did not present significant variations until 60
minutes, from which time there was a gradual reduction of carotenoid content that
had been released, reaching 30.9 % at 360 minutes. At the dissolution of the
atomized CP microparticles 28.7 % of the carotenoids were released. This release
was gradual until 120 minutes reaching 43.1 %; after that there was a reduction of
carotenoid content until 180 minutes. Following this period, no significant changes
were observed, with a total average of 19.6 %.
In the human body, the encapsulated compounds are expected to be released
in small quantities in gastric conditions. However, in intestinal conditions, the release
should be gradual and complete. In this context, the lyophilized CP microparticles
showed the behavior most similar to the ideal.
Luo et al. (2011) evaluated the release of different tocopherol concentrations
(10, 20 and 30%) encapsulated in zein/chitosan simulating gastrointestinal
conditions. The authors found that microparticles with a higher tocopherol
concetration showed a lower release in gastric conditions. Particles with 30% of
tocopherol released no more than 80% of their content, having about 50% in gastric
conditions and 30% in intestinal conditions. In the study by Chiu et al. (2007), in
which the lycopene was encapsulated with gelatin and poly-glutamic acid, an ideal
release profile was obtained in gastrointestinal conditions, because there was no
release in gastric fluid. However, in the intestinal fluid 71-98% of encapsulated
lycopene was released.
There are different possibilities for the core material release. These
possibilities include the variation of the temperature and the pH, dissolution of the
wall material, diffusion, mechanical disruption, and selective permeability (SHAHIDI;
81
HAN, 1993, MATALANIS et al., 2011). It is suggested that, for complex coacervation
microparticles, the best form of release is by a pH variation. At a pH less than 6.5, the
amino groups of chitosan are positively charged, and therefore have the ability to
interact with negatively charged materials, such as xanthan gum and pectin (ARGINSOYSAL; KOFINAS; LO, 2009). In addition to the interaction between the polymers,
dipole-dipole induced interactions may possibly have occurred between the methyl
groups of carotenoids and polymers, as well as ion-dipole induced interactions with
charged groups (RUTZ et al., 2013).
Therefore, in pHs close to neutrality there is a balance between charges,
which favors a complex formation. However, in a lower pH, the degree of protonation
of the chitosan amino grouping is greater, resulting in an electrostatic repulsion and a
weakening of the mechanical and chemical resistance. The increase in the pH
promotes the deprotonation of reactive groups, reducing the interaction between the
polymers (NORDBY et al., 2003; MENDES et al., 2011). These factors may provide a
release of the encapsulated compounds when exposed to gastrointestinal conditions.
4.3.5 Application of the microparticles in food
4.3.5.1 Release of carotenoids during storage
The behavior of microparticles after their application in food can be seen in
figure 17 (Apêndice F).
82
Figura 17 - Release profile of carotenoids from palm oil encapsulated, applied to
yogurt during storage at 4 °C and bread during storage at room temperature.
After processing, regardless of the type of microparticles, an initial release of
approximately 20% of carotenoids was observed. For the yogurt this percentage
remained without significant changes until the end of the study period. For bread,
there was a decline in the first 3 days of storage, with respect to the carotenoid
content that was initially released. After this period, the carotenoid content of the
bread with the CP microparticles did not change significantly. The bread with CX
microparticles showed a release of carotenoids totaling 20%.
During the processing and storage the encapsulated compounds are not
expected to be released, or to be released only in small quantities, to avoid their
degradation. This behavior was observed in the products with microparticles.
4.3.5.2 Release profile of the microencapsulated carotenoids applied in food,
with simulated gastrointestinal conditions
The release profile of the carotenoids present in microparticles applied into
food, when they were exposed to the fluid that simulates gastrointestinal conditions,
can be seen in Figure 18 (Apêncide G).
83
Figura 18 - Release profile of carotenoids from the microparticles applied in yogurt
and bread, simulated gastrointestinal conditions.
The exposure of yogurt to CP microparticles in gastrointestinal fluid promoted
the initial release of 20.7% of carotenoids. This release was gradual until 240
minutes, after which there were no significant differences, yet totaling 39.0%. The
yogurt with CX microparticles released 32.2% of their contents up to 120 minutes
(gastric fluid), where the release was more pronounced, and totaling 50.1%. This
percentage did not change significantly until the end of the study period.
The breads containing microparticles showed a similar behavior when
exposed to fluid that simulated gastrointestinal conditions. At dissolution 11.7% and
17.1% of the carotenoids of the CP and CX microparticles were released,
respectively. After 30 minutes, the CP microparticles released on average 35.2%,
while the CX microparticles released 38.9%.
The behavior most similar to the ideal was the one with CX microparticles
applied in yogurt, which released approximately 50% of its content in the intestinal
fluid. The others microparticles showed a relatively low percentage of release.
In general, it can be observed that before any application in food, the
microparticles showed a greater release in the fluid that simulates gastrointestinal
conditions, and after this release the compounds suffered degradation. After an
84
application in food, the release was lower and the compounds released were not
degraded. This behavior may have occurred due to the fact that the food matrix has
the ability to interact in different ways with bioactive compounds, protecting them.
This implies that the effects of processing are different for each type of microparticle
(SUCUPIRA; XEREZ; DE SOUSA, 2012).
4.4 Conclusions
It is possible to encapsulate palm oil using chitosan/xanthan gum and
chitosan/pectin by a complex coacervation method. The encapsulation of palm oil
was confirmed by the DSC technique, but only the atomized microparticles showed
characteristic shape.
Lyophilization appears to be the most suitable drying method, because it
provides a higher yield and stability to the carotenoids during the encapsulation
process, and overall has the best results of encapsulation efficiency and release
profile in both water and gastrointestinal fluid.
In general, the chitosan/pectin microparticles showed a release profile the
most suitable in vitro in water and gastrointestinal fluid. However, after an application
in yogurt and bread, the chitosan/xanthan microparticles were better.
Before their application in food, the microparticles showed a greater
percentage of release in the fluid that simulates gastrointestinal conditions, but after
their release the compounds were degraded. After processing, the release was lower
and the released compounds were not degraded. In addition, during storage the
percentage of release of the carotenoids was low.
Acknowledgments
The authors would like to thank Capes (Coordination of Improvement Higher
Education Personnel) and CNPq (National Council of Scientific Development) for
funding and support.
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Considerações Finais
A maior eficiência de encapsulação foi obtida quando a quitosana foi
combinada com carboximetilcelulose e tripolifosfato de sódio. Foram obtidas
micropartículas de formato esférico apenas quando foi utilizada a atomização como
processo de secagem. No entanto, quanto ao rendimento os resultados mais
satisfatórios foram obtidos quando as micropartículas foram liofilizadas, sendo essas
também as micropartículas que apresentam menor percentual de degradação
durante o processo.
Em relação ao perfil de liberação, comportamentos distintos foram
observados nos dois estudos. De uma forma geral no primeiro estudo, as partículas
de quitosana/carboximetilcelulose apresentaram comportamento ideal de liberação
dos carotenoides na água e no fluido gástrico e baixo percentual de liberação no
fluido intestinal, enquanto que as micropartículas de quitosana/tripolifosfato de sódio
apresentaram altos percentuais de liberação em água e nos fluidos gástrico e
intestinal. A liberação foi maior quando as micropartículas foram aplicadas nos
sistemas alimentícios.
No segundo estudo, as micropartículas de quitosana/pectina liofilizadas
apresentaram perfil mais adequado de liberação na água e no fluido gastrointestinal.
No entanto, para todas as micropartículas, após a liberação observou-se que no
fluido que simula condições gastrointestinais os compostos sofreram degradação.
Após o processamento, o percentual de liberação foi menor, mas não houve
degradação
dos
compostos
liberados,
sendo
as
micropartículas
de
quitosana/xantana as que apresentaram comportamento mais adequado.
Assim, tendo em vista a aplicação em alimentos, conclui-se que as
micropartículas de quitosana/CMC demonstraram-se mais adequadas para a
aplicação em pães, enquanto que as micropartículas de quitosana/xantana foram as
mais adequadas para a aplicação em iogurtes.
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109
Apêndices
110
Apêndice A - Perfil de liberação do β-caroteno e dos carotenoides proveniente de óleo de palma encapsulados.
Micropartículas
Tempo (minutos)
0
20
40
60
120
180
240
31,18 Aa
35,04 Aa
40.42 Aa
43,75 Aa
25,97 Aa
25,88 Aa
31,76 Aa
34,58 Aa
34,71 Ab
25,16 Aa
26,23 Ba
25,25 Ba
28,25 Ba
25,87 Ba
26,80 Ba
15,72 Bb
15,52 Bb
19,72 Ab
22,81 Ab
19,69 Bb
20,05 Bb
Material
de
parede
Q/TPP
Material
encapsulado
Óleo de palma
31,40 Aa
27,25 Aa
30,65 Aa
Q/TPP
β-caroteno
23,71 Ab
24,45 Aa
Q/CMC
Óleo de palma
24,50 Ba
Q/CMC
β-caroteno
15,13 Bb
Liberação em água
Liberação simulando fluido gástrico
Q/TPP
Óleo de palma
21,45 Aa
25,47 Aa
31,48 Aa
43,18 Aa
39,88 Aa
54,87 Aa
52,68 Aa
Q/TPP
β-caroteno
16,42 Ab
55,89 Ab
55,37 Ab
56,08 Ab
77,63 Ab
77,72 Ab
81,17 Ab
Q/CMC
Óleo de palma
17,88 Aa
18,60 Ba
19,66 Ba
23,28 Ba
25,74 Ba
24,94 Ba
25,17 Ba
Q/CMC
β-caroteno
16,65 Aa
17,81 Ba
15,54 Bb
18,25 Bb
17,92 Bb
19,13 Bb
15,01 Bb
Liberação simulando fluido intestinal
39,41 Aa
38,29 Aa
37,46 Aa
43,11 Aa
55,84 Aa
67,47 Aa
β-caroteno
20,14
Aa
32,48 Ab
25,39 Ab
24,89 Ab
25,86 Ab
33,07 Ab
37,55 Ab
38,44 Ab
Q/CMC
Óleo de palma
20,32 Aa
17,30 Ba
18,03 Ba
17,70 Ba
18,59 Ba
14,98 Ba
16,62 Ba
Q/CMC
β-caroteno
19,33 Ba
12,70 Ba
16,70 Ba
15,26 Ba
15,05 Bb
15,33 Ba
14,84 Ba
Q/TPP
Óleo de palma
Q/TPP
Q/TPP:quitosana/tripolifosfato de sódio; Q/CMC: quitosana/carboximetilcelulose. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si
pelo teste de Tukey (p<0,05) avaliando o material de parede, dentro de cada material encapsulado e fluido de liberação, em de cada tempo. Médias seguidas
por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste LSD (p<0,05) avaliando o material encapsulado, dentro de cada material de parede e
fluido de liberação, em de cada tempo.
111
Apêndice B - Perfil de liberação do β-caroteno e dos carotenoides proveniente de óleo de palma encapsulados, e aplicados em
iogurtes, armazenados a 4°C e em pães armazenados a temperatura ambiente.
Iogurte
Micropartículas
Dias de armazenamento
Material de Parede
Material encapsulado
0
5
10
15
Q/TPP
Óleo de palma
40,38 Aa
50,86 Aa
69,73Aa
68,55 Aa
Q/TPP
β-caroteno
40,40 Aa
37,07 Ab
32,94 Ab
46,94 Ab
Q/CMC
Óleo de palma
12,68 Ba
22,41 Ba
20,01 Bb
26,61 Ba
Q/CMC
β-caroteno
14,43 Ba
22,32 Ba
26,11 Ba
23,51 Ba
Pão
Material de Parede
Material encapsulado
0
3
6
9
Q/TPP
Óleo de palma
45,42 Aa
35,27 Ab
43,33 Aa
61,26 Aa
Q/TPP
β-caroteno
44,05 Aa
37,71 Aa
42,15 Aa
34,26 Ab
Q/CMC
Óleo de palma
31,72 Ba
32,02 Ba
29,60 Ba
27,72 Bb
Q/CMC
β-caroteno
27,08 Bb
29,19 Bb
29,21 Ba
33,10 Aa
Q/TPP:quitosana/tripolifosfato de sódio; Q/CMC: quitosana/carboximetilcelulose. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si
pelo teste de LSD (p<0,05) avaliando o material de parede, dentro de cada material encapsulado, em de cada tempo. Médias seguidas por letras minúsculas
diferentes na coluna diferem entre si pelo teste LSD (p<0,05) avaliando o material encapsulado, dentro de cada material de parede, em de cada tempo.
112
Apêndice C - Perfil de liberação dos carotenoides provenientes das micropartículas aplicadas em iogurtes, simulando condições
gástricas e intestinais
Micropartículas
Tempo (minutos)
0
30
60
120
180
240
100,00 Aa
100,00 Aa
100,00 Aa
89,35 Aa
93,28 Ab
94,20 Ab
88,60 Ab
36,20 Ba
34,42 Ba
35,12 Ba
38,45 Ba
42,14 Ba
Material de
Material
parede
Encapsulado
Q/TPP
Óleo de palma
77,21 Aa
85,35 Aa
97,06 Aa
Q/TPP
β-caroteno
66,55 Ab
91,59 Aa
Q/CMC
Óleo de palma
27,30 Ba
38,57 Ba
Q/CMC
β-caroteno
19,24 Bb
26,56 Bb
Q/TPP
Óleo de palma
64,42 Aa
67,44 Aa
100,00 Aa
98,30 Aa
89,31 Aa
97,76 Aa
Q/TPP
β-caroteno
67,66 Aa
78,82 Ab
82,25 Ab
87,48 Ab
100,00 Ab
99,26 Aa
Q/CMC
Óleo de palma
41,18 Ba
37,50 Ba
35,84 Ba
32,52 Ba
39,88 Ba
Q/CMC
β-caroteno
24,12 Ba
27,00 Bb
36,72 Ba
32,79 Ba
29,81 Bb
40,59 Ba
28,73 Bb
Liberação simulando fluido gástrico
28,73 Bb
28,86 Bb
28,32 Bb
Liberação simulando fluido intestinal
Q/TPP:quitosana/tripolifosfato de sódio; Q/CMC: quitosana/carboximetilcelulose. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si
pelo teste de Tukey (p<0,05) avaliando o material de parede, dentro de cada material encapsulado e fluido de liberação, em de cada tempo. Médias seguidas
por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste LSD (p<0,05) avaliando o material encapsulado, dentro de cada material de parede e
fluido de liberação, em de cada tempo.
113
Apêndice D - Perfil de liberação dos carotenoides provenientes das micropartículas aplicadas em pães, simulando condições
gástricas e intestinais
Micropartículas
Tempo (minutos)
0
30
60
180
240
75,22 Aa
83,29 Aa
81,23 Aa
66,24 Aa
79,59 Ab
80,19 Ab
82,42 Aa
49,87 Ba
56,61 Ba
63,03 Ba
65,50 Ba
22,97 Bb
33,10 Bb
38,47 Bb
52,65 Bb
53,99 Bb
Liberação simulando fluido intestinal
53,39 Bb
Óleo de palma
39,98 Aa
57,63 Aa
54,86 Aa
64,46 Aa
64,62 Aa
67,80 Aa
Q/TPP
β-caroteno
36,33 Aa
56,46 Ab
60,41 Ab
65,11 Aa
68,84 Aa
73,45 Ab
Q/CMC
Óleo de palma
29,50 Ba
41,05 Ba
45,38 Ba
47,72 Ba
51,40 Ba
53,21 Ba
Q/CMC
β-caroteno
27,74 Ba
34,16 Bb
43,09 Bb
46,25 Bb
46,80 Bb
51,29 Bb
Material de
Material
parede
Encapsulado
Q/TPP
Óleo de palma
40,76 Aa
57,16 Aa
66,87 Aa
Q/TPP
β-caroteno
41,59 Aa
55,32 Aa
Q/CMC
Óleo de palma
25,72 Ba
41,47 Ba
Q/CMC
β-caroteno
Q/TPP
120
Liberação simulando fluido gástrico
Q/TPP:quitosana/tripolifosfato de sódio; Q/CMC: quitosana/carboximetilcelulose. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si
pelo teste de Tukey (p<0,05) avaliando o material de parede, dentro de cada material encapsulado e fluido de liberação, em de cada tempo. Médias seguidas
por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste LSD (p<0,05) avaliando o material encapsulado, dentro de cada material de parede e
fluido de liberação, em de cada tempo.
114
Apêndice E – Perfil de liberação dos carotenoides provenientes do óleo de palma encapsulados em água e fluido que simula
condições gastrointestinais
Micropartícula
Tempo (minutos)
0
30
60
120
240
300
360
37,86 Aa
36,65 Aa
36,37 Aa
42,98 Aa
32,45 Ba
32,02 Ba
28,12 Bb
27,62 Bb
26,21 Bb
21,29 Bb
27,39 Bb
30,36 Ab
39,40 Ab
27,04 Bb
26,08 Bb
64,73 Aa
51,60 Aa
53,49 Aa
49,62 Aa
45,09 Aa
42,43 Aa
Material de
Método de
Parede
Secagem
QP
Liofilização
26,50 Aa
26,91 Aa
31,16 Aa
36,73 Aa
QP
Atomização
21,97 Aa
28,78 Ba
30,16 Ba
QX
Liofilização
18,87 Ba
25,94 Ab
QX
Atomização
32,30 Aa
65,33 Aa
180
Liberação em água
Liberação simulando fluido gastrointestinal
QP
Liofilização
32,04 Ba
34,74 Ba
37,99 Ba
85,05 Aa
79,18 Aa
66,91 Aa
61,82 Aa
60,59 Aa
QP
Atomização
28,68 Ba
35,48 Ba
37,23 Ba
43,10 Bb
23,63 Bb
16,52 Bb
18,20 Bb
19,88 Bb
QX
Liofilização
49,63 Ab
43,36 Ab
56,38 Ab
40,29 Bb
39,26 Bb
39,40 Ba
39,72 Ba
37,31Ba
QX
Atomização
75,72 Aa
70,92 Aa
72,45 Aa
55,12 Aa
43,20 Aa
38,65 Aa
36,67 Aa
30,91 Ab
QP: quitosana/pectina, QX: quitosana/xantana. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste de LSD (p<0,05)
avaliando o material de parede, dentro de cada método de secagem. Médias seguidas por letras minúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste
LSD (p<0,05) avaliando o método de secagem, dentro de cada material de parede.
115
Apêndice F – Perfil de liberação dos carotenoides proveniente de óleo de palma encapsulados, aplicados em iogurtes,
armazenados a 4°C e em pães armazenados a temperatura ambiente.
Tempo (dias)
Micropartícula
Iogurte
0
5
10
15
QP
21,33 A
20,51 A
24,47 A
23,60 A
QX
20,92 A
19,23 A
21,04 B
23,05 A
Pão
0
3
6
9
QP
18,48 A
12,28 A
10,70 A
9,68 B
QX
21,32 A
12,07 A
10,93 A
19,86 A
QP: quitosana/pectina, QX: quitosana/xantana. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste de LSD (p<0,05)
avaliando o material de parede, em de cada produto.
116
Apêndice G - Perfil de liberação dos carotenoides provenientes das micropartículas aplicadas em iogurte e pão, quando estes
foram expostos a fluido que simula condições gastrointestinais
Tempo (minutos)
Micropartícula
0
30
60
120
180
240
300
360
Iogurte
QP
20,71 B
25,32 B
30,57 A
35,20 A
39,28 B
43,41 B
39,66 B
39,03 B
QX
25,28 A
28,51 A
30,06 A
32,42 A
50,98 A
51,85 A
48,83 A
47,02 A
Pão
QP
11,74 B
30.79 B
35,36 B
36,72 A
39,17 B
35,42 A
36,47 A
32,33 B
QX
17,11 A
38,40 A
43,14 A
38,22 A
40,02 A
38,32 A
36,53 A
37,35 A
QP: quitosana/pectina, QX: quitosana/xantana. Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna diferem entre si pelo teste de LSD (p<0,05)
avaliando o material de parede, em de cada produto.