Projeto_Pró-viral modificado pag-aids-2009

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Projeto_Pró-viral modificado pag-aids-2009
MINISTÉRIO DA SAÚDE
SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE
PROGRAMA NACIONAL DE DST E AIDS
Projeto de Pesquisa
Rede para Detecção do DNA Pró-viral em crianças nascidas
de mães soropositivas e gestantes com sorologia
indeterminada para o HIV-1 no Brasil.
Coordenação Geral do Projeto
Denise Ferreira Corrêa de Souza- ULAB – PN DST/AIDS
Coordenação Cientifica do Projeto
Dra Maria Inês de Moura Campos Pardini – Hemocentro de Botucatu
Co-investigadores do PN DST/AIDS
Diretoria – Dra. Mariângela Simão Galvão Batista
ULAB – Lílian do Amaral Inocêncio
Introdução
Desde a descoberta dos primeiros casos de aids ao final da década de
70, o perfil da epidemia vem sendo modificado e as investigações mais
recentes tentam estabelecer os grupos populacionais de maior risco, onde a
aids se disseminará de maneira mais intensa nos próximos anos. No Brasil a
epidemia adquiriu um caráter nacional em contraste com o perfil regional e
restrito a determinados segmentos populacionais observado anteriormente.
Considerando às categorias de exposição, a incidência de casos por
transmissão heterossexual foi a que mostrou o maior aumento, contribuindo de
forma decisiva, à expansão da epidemia entre as mulheres, sobretudo entre
aquelas em idade fértil (SZWARCWALD et al., 2000).
Em Dezembro de 2002, estimou-se que 42 milhões de pessoas
estavam infectadas por HIV em nível mundial, das quais 19,2 milhões eram
mulheres. A grande maioria das mulheres infectadas encontrava-se em idade
fértil, podendo transmitir o vírus aos filhos durante a gravidez, parto ou
aleitamento. Neste contexto, a transmissão vertical é a principal causa de
infecção HIV nas crianças, constituindo, por este motivo, uma grande
preocupação em Saúde Pública. No final de 2002, estimou-se que 3,2 milhões
de crianças viviam com HIV, tendo nesse ano ocorrido 610 000 novas
infecções pediátricas (UNAIDS).
A transmissão vertical do HIV é um processo multifatorial, que requer
intervenções que objetivam reduzir o risco de transmissão (EUROPEAN MODE
OF DELIVERY COLLABORATION, 1999; EUROPEAN COL. STUDY, 2001;
ISAACS et al., 2003; NEWELL & ROGERS, 2002; THORNE & NEWELL, 2003).
A taxa de transmissão vertical do HIV, sem qualquer intervenção, situase em torno de 20% (CONNOR et al., 1994; LUZURIAGA & SULLIVAN, 2002)
e com o uso combinado de determinadas intervenções pode ser reduzida para
menos de 1%. A transmissão pode ocorrer durante a gestação, no momento
do parto ou após o nascimento durante a amamentação. Excluindo-se a
transmissão após o nascimento, das crianças infectadas, 25 a 30% apresentam
DNA proviral detectável ao nascimento, sugerindo infecção intra-útero,
enquanto 70 a 75% apresentam provirus ou RNA do HIV-1 indetectável ao
nascimento, os quais se tornam detectáveis após uma ou duas semanas de
vida, sugerindo infecção no momento do parto (LUZURIAGA & SULLIVAN,
2002). Sendo assim, evitar a amamentação e recorrer à cesariana são métodos
preventivos que demonstraram ser eficazes, não só em ensaios clínicos, mas
também em populações infectadas (EUROPEAN MODE OF DELIVERY
COLLABORATION, 1999; EUROPEAN COL. STUDY, 2001; ISAACS et al.,
2003; NEWELL & ROGERS, 2002; THORNE & NEWELL, 2003).
A carga viral materna elevada e a ruptura prolongada das membranas
amnióticas são os principais fatores associados à transmissão vertical do HIV
(BURTON et al., 1996; COLL et al., 1997). Desta forma, assim como nas outras
formas de infecção, o risco da transmissão encontra-se na dependência da
viremia materna.
Embora o risco de transmissão materno-fetal exista em qualquer nível de
carga viral materna, este risco é muito maior quando o nível de carga viral
materna é elevado. A transmissão é rara (<1%) quando a carga viral
plasmática materna é inferior a 1000 copies de RNA/ml. Alguns estudos vêm
demonstrando que o risco de transmissão vertical aumenta à medida que a
carga viral materna se eleva (BULTERYS & LEPAGE, 1998). No mesmo
sentido, pesquisas demonstram que a carga viral materna pode ser utilizada
como um marcador para a transmissão, sobretudo em mulheres que não
realizaram profilaxia medicamentosa, uma vez que a terapêutica antiviral reduz
o risco de transmissão (COUTOPOULOS-LOANNIDIS & LOANNIDIS, 1998).
No mesmo sentido, pesquisas vêm demonstrando que o risco de transmissão
aumenta à medida que a contagem de células T CD4 diminui (VAN DYKE et
al., 1999).
No entanto, presença de úlceras cervico-vaginais ou elevada carga viral
cervical ou vaginal vêm sendo associada a elevado risco de transmissão,
independente da carga viral plasmática (CHUACHOOWONG et al., 2000;
JOHN et al., 2001). Situação similar se observa quando se considera a carga
viral no leite materno, a qual vem se mostrando importante determinante de
risco de transmissão durante a amamentação (CHUACHOOWONG et al.,
2000).
Os maiores progressos na redução da transmissão vertical deste vírus
foram obtidos com a instituição de regimes de terapêutica antiretroviral ao
longo da gestação, parto e primeiras semanas de vida do recém-nascido
(KOURTIS, 2002). A terapêutica tem um forte impacto no decréscimo da carga
viral materna, conduzindo a uma diminuição da transmissão do vírus ao recémnascido (PETERS et al., 2003).
Assim, o diagnóstico da gestante é importante por permitir maior
agilidade na intervenção com os medicamentos antiretrovirais, cuja utilização
adequada associada a outras medidas profiláticas podem modificar o
panorama da epidemia em crianças (BRASIL, 2004).
Apesar da disponibilidade pelo Sistema Único de Saúde (SUS) do
exame diagnóstico para detecção da infecção pelo HIV e da medicação
antiretroviral, no Brasil ainda existem dificuldades na identificação de gestantes
soropositivas durante o pré-natal, o que faz com que gestantes cheguem ao
momento do parto desconhecendo sua condição sorológica (DATASUS, 2005).
A metodologia utilizada para o diagnóstico pré-natal é o ELISA para a
detecção de anticorpos anti-HIV, o qual não permite determinação imediata e,
portanto, não pode ser utilizado no momento do parto para as gestantes que
desconhecem sua sorologia. Nestas situações utilizam-se os denominados
testes rápidos, que permitem o diagnóstico imediato (DUARTE et al., 2001). Os
testes rápidos para o HIV se mostraram altamente específicos, sensíveis, de
baixo custo e de fácil execução (CARVALHO et al., 2004).
As crianças nascidas de mães soropositivas para o HIV devem ser
atendidas em unidades especializadas, pelo menos até a definição de seu
diagnóstico. Aquelas que se revelarem infectadas deverão permanecer em
atendimento nessas unidades, ao passo que as não infectadas poderão ser
encaminhadas para acompanhamento em unidades básicas de saúde. Nos
centros de atendimento em países desenvolvidos tem sido recomendado que
mesmo as crianças que soronegativaram devem ser submetidas a visitas
periódicas, até o final da adolescência, em unidades especializadas para
atendimento a pessoas com infecção pelo HIV, em virtude de terem sido
expostas não só ao HIV, mas, também, durante o período intra-uterino, a
drogas antiretrovirais. Esta preocupação reside no fato de não se saber as
possíveis repercussões da exposição a estes medicamentos a médio e a longo
prazo (BRASIL, 2004).
No entanto, o primeiro passo para uma intervenção pediátrica de
sucesso é o diagnóstico precoce e preciso da criança. Os métodos atualmente
disponíveis para detecção de anticorpos anti-HIV, como ELISA, Western Blot e
Imunofluorescência Indireta, não são aplicáveis em crianças com idade inferior
a 18 meses, devido a passagem transplacentária de anticorpos maternos do
tipo IgG, uma vez que a IgM, anticorpo pentamérico que não atravessa a
placenta só é detectável por tais metodologias após 18 meses de idade
(MARQUES, 2001). Para um diagnóstico preciso destas crianças torna-se
necessário o emprego de métodos que detectam o ácido nucléico viral como a
reação em cadeia da polimerase (PCR), o qual não se encontra disponível para
esta finalidade no Programa Nacional de DST/Aids (BRASIL, 2004). Assim, o
diagnóstico da criança vem sendo realizado através da quantificação do RNA
do HIV-1 (carga viral) segundo a figura 1.
Figura 1: Figura 1. Fluxograma para utilização de testes de quantificação de RNA
visando a detecção da infecção pelo HIV em crianças com idade entre 2 meses e 2 anos,
nascidas de mães infectadas pelo HIV
No entanto, a dinâmica da infecção vertical pelo HIV é diferente da
observada no adulto. A criança apresenta viremia primária no início da vida e
seu sistema imune é relativamente imaturo. Desse modo, ela pode exibir
cargas virais elevadas, ou seja, maiores de 106 cópias/ml, com taxas de
declínio mais lentas do que as apresentadas em adultos, sendo difícil
determinar limites precisos para a doença. Assim, apesar de se definir que
quanto maior a carga viral maior o risco de progressão, existe considerável
superposição de valores (BRASIL, 2004).
Da mesma forma, a história natural da infecção pelo HIV em crianças
tem espectro amplo, com pacientes variando de progressores rápidos à nãoprogressores. Cerca de 10 a 15% dos pacientes evoluem com imunodepressão
precoce e deterioração clínica nos primeiros dois anos de vida, caracterizando
padrão de progressão rápida. A maior parte, 50% a 70%, apresenta padrão de
evolução intermediário, em que predominam sinais e sintomas leves nos
primeiros 5 anos de vida. Um terceiro grupo, cerca 10 a 15%, tem progressão
lenta e livre de manifestações da doença até 8 anos de idade. Até o presente,
os esquemas terapêuticos potentes não resultaram na erradicação da infecção
pelo HIV. Portanto, o tratamento antiretroviral objetiva controlar a replicação
viral, preservar ou restaurar a integridade imunológica e impedir, postergar ou
diminuir as conseqüências da infecção, proporcionando maior sobrevida com
qualidade ao paciente (BRASIL, 2004).
Assim, é importante instituir o esquema terapêutico em crianças
infectadas. No entanto, os efeitos adversos dos medicamentos são agressivos
e acabam comprometendo a qualidade de vida da criança, sobretudo àquela
submetida a múltiplas drogas. No outro extremo, deve-se evitar a utilização do
AZT em monoterapia na criança infectada, evitando, assim, a precoce seleção
de mutantes resistentes, o que dificultaria uma terapia de resgate eficiente em
longo prazo. Neste sentido, é fundamental avaliar com cautela a necessidade
de instituição de um esquema terapêutico na criança, sendo imprescindível
para este fim conhecer a real situação da criança (portadora ou não do HIV-1).
Neste contexto, a utilização do exame de carga viral plasmática para o
diagnóstico precoce da criança vem se mostrando ineficaz, pois cargas virais
baixas ou indetectáveis podem indicar infecção quando consideramos os
progressores lentos, ou crianças cujas mães fizeram quimioprofilaxia eficiente.
Assim, o diagnóstico preciso da mãe e da criança com idade inferior a 18
meses é essencial para a tentativa de minimizar o risco de transmissão e, se
isso não for possível, acompanhar da maneira mais precoce e eficiente
possível à criança infectada, o que vem sendo dificultado atualmente pela
indisponibilidade de métodos que detectem o ácido nucléico viral.
Objetivos
Objetivos Principais
Implantar em dimensão nacional uma rede de laboratórios treinados
para realizar a detecção do DNA pró-viral do HIV-1 em sangue periférico de
crianças nascidas de mães infectadas a partir de 2 meses de idade e gestantes
com sorologia indeterminada .
Determinar a prevalência da transmissão vertical no Brasil.
Objetivos Secundários
Avaliar a prevalência de transmissão vertical do HIV em crianças
nascidas de mães soropositivas com alta viremia.
Avaliar a prevalência de transmissão vertical do HIV em crianças
nascidas de mães com baixa viremia.
Relacionar o risco de transmissão vertical à viremia materna.
Monitorar, quantitativamente através da carga viral plasmática a
modificação da viremia na criança identificada como portadora do HIV-1.
Casuística e Métodos
Casuística
Participarão deste estudo crianças nascidas de mães soropositivas e
gestantes com sorologia indeterminada para o HIV-1. Somente serão incluídos
neste estudo, pacientes que fornecerem seu consentimento livre e esclarecido
por escrito, segundo modelo em anexo, ou consentimento do responsável
quando for o caso. Este estudo será submetido ao Comitê Nacional de Ética
em Pesquisa (CONEP).
Metodologia
A metodologia empregada na realização deste estudo será a Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) qualitativa para a detecção do HIV-1 utilizando o
Kit HIV-1 DNA Test Amplicor® (Roche).
O DNA próviral do HIV-1 é extraído a partir de sangue total utilizando
uma solução detergente a base de proteinase K.
O DNA extraído é utilizado em uma reação de PCR cujos primers
selecionam uma região alvo de 155 nucleotídeos na região gag, a qual é
amplificada. Um controle interno é utilizado na reação, o qual constitui um
fragmento de DNA resultante de clonagem flanqueada pelas mesmas
seqüências do DNA proviral alvo e uma região interna distinta, ou seja, o
controle interno pode ser amplificado com os mesmos primers que amplificam o
DNA alvo, no entanto, sondas específicas podem distingui-los. O controle
interno é adicionado à reação em momento anterior a extração, assim, constitui
controle de todas as etapas do processo: da extração à detecção.
A detecção do produto da PCR é realizada por uma reação de
hibridização, na qual sondas biotiniladas são adicionadas à reação e anelam-se
especificamente ao DNA proviral alvo e ao controle interno. A visualização da
reação ocorre quando se adiciona um conjugado constituído de peroxidase
marcada com avidina, um substrato, o peróxido de hidrogênio e um
cromógeno, o tetrametilbenzidina (TMB). Neste processo, o conjugado se liga
as sondas (ligação avidina- biotina) e ocorre uma reação de hidrólise do
substrato e oxidação do cromógeno, o qual passa de incolor para amarelo.
Desenho Geral da Rede
Implantação da Rede
Os locais nos quais serão instalados os laboratórios da rede serão
escolhidos segundo a capacidade técnico-científica e da estrutura física/
pessoal instalada. A localização destes laboratórios deverá ser determinada em
consenso com o Programa Nacional de DST/Aids e as coordenações locais.
Estados
Quantidades de
laboratórios
Rio Grande do Sul
2
Santa Catarina
1
Paraná
1
São Paulo
2
Rio de Janeiro
2
Minas Gerais
1
Bahia
1
Pernambuco
1
Ceará
1
Mato Grosso do Sul
1
Espirito Santo
1
Distrito Federal
1
TOTAL
15
Os laboratórios receberão exames de diferentes regiões dos respectivos
estados. A estimativa de testes por região, deverá considerar o número de
gestantes soropositivas e gestantes indeterminadas da região, bem como a
capacidade operacional dos laboratórios envolvidos.
A aquisição será de 30.000 testes, que serão disponibilizados a medida
que a rede for implantada.
Fluxo da Rede
O médico responsável pelo atendimento à gestante que apresenta um
resultado indeterminado na sorologia para o HIV-1, fará a solicitação da
realização do PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1. Quanto às
crianças nascidas de mães soropositivas, serão encaminhadas para a
realização do PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1no mesmo
momento da solicitação da determinação da primeira carga viral, ou seja, aos 2
meses de idade, segundo o Guia de Tratamento vigente, podendo sofrer
alteração.
A solicitação far-se-á utilizando o mesmo formulário de carga viral,
especificando o acréscimo da PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1. A
amostra de sangue será a mesma coletada para a carga viral, visando
minimizar a espoliação da criança. Desta forma, não haverá coleta de sangue
específica para a realização da PCR.
Profissionais devidamente treinados com amplo conhecimento da
metodologia a ser empregada executarão o exame em laboratório capacitado,
credenciado e dotado da estrutura física adequada.
O resultado encontrado pelo laboratório deverá ser encaminhado ao
médico solicitante, na forma de um relato especificando tratar-se de um projeto
de pesquisa, devendo, portanto ser analisado com parcimônia, juntamente com
os dados clínicos e outros achados laboratoriais.
Cronograma do Estudo
Meses
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Descrição
Reunião para a elaboração do Protocolo de pesquisa e
x x x
passagem na CONEP
Apresentação e discussão do Projeto para implantação
do Pró-viral junto com as Coordenações Estadual de x x
DST/Aids.
Reunião com os laboratórios executores escolhidos para
a pesquisa.
Instalação dos equipamentos nos laboratórios
Treinamento dos laboratórios envolvidos
Encaminhamento de documento para as unidades
x x
solicitantes frente ao novo procedimento
Inicio do estudo – Monitoramento
Oficina de trabalho para avaliação do estudo
x
x x x x
x x x x
x x
x x x x x
x
x
x
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