Projeto_Pró-viral modificado pag-aids-2009
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Projeto_Pró-viral modificado pag-aids-2009
MINISTÉRIO DA SAÚDE SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE PROGRAMA NACIONAL DE DST E AIDS Projeto de Pesquisa Rede para Detecção do DNA Pró-viral em crianças nascidas de mães soropositivas e gestantes com sorologia indeterminada para o HIV-1 no Brasil. Coordenação Geral do Projeto Denise Ferreira Corrêa de Souza- ULAB – PN DST/AIDS Coordenação Cientifica do Projeto Dra Maria Inês de Moura Campos Pardini – Hemocentro de Botucatu Co-investigadores do PN DST/AIDS Diretoria – Dra. Mariângela Simão Galvão Batista ULAB – Lílian do Amaral Inocêncio Introdução Desde a descoberta dos primeiros casos de aids ao final da década de 70, o perfil da epidemia vem sendo modificado e as investigações mais recentes tentam estabelecer os grupos populacionais de maior risco, onde a aids se disseminará de maneira mais intensa nos próximos anos. No Brasil a epidemia adquiriu um caráter nacional em contraste com o perfil regional e restrito a determinados segmentos populacionais observado anteriormente. Considerando às categorias de exposição, a incidência de casos por transmissão heterossexual foi a que mostrou o maior aumento, contribuindo de forma decisiva, à expansão da epidemia entre as mulheres, sobretudo entre aquelas em idade fértil (SZWARCWALD et al., 2000). Em Dezembro de 2002, estimou-se que 42 milhões de pessoas estavam infectadas por HIV em nível mundial, das quais 19,2 milhões eram mulheres. A grande maioria das mulheres infectadas encontrava-se em idade fértil, podendo transmitir o vírus aos filhos durante a gravidez, parto ou aleitamento. Neste contexto, a transmissão vertical é a principal causa de infecção HIV nas crianças, constituindo, por este motivo, uma grande preocupação em Saúde Pública. No final de 2002, estimou-se que 3,2 milhões de crianças viviam com HIV, tendo nesse ano ocorrido 610 000 novas infecções pediátricas (UNAIDS). A transmissão vertical do HIV é um processo multifatorial, que requer intervenções que objetivam reduzir o risco de transmissão (EUROPEAN MODE OF DELIVERY COLLABORATION, 1999; EUROPEAN COL. STUDY, 2001; ISAACS et al., 2003; NEWELL & ROGERS, 2002; THORNE & NEWELL, 2003). A taxa de transmissão vertical do HIV, sem qualquer intervenção, situase em torno de 20% (CONNOR et al., 1994; LUZURIAGA & SULLIVAN, 2002) e com o uso combinado de determinadas intervenções pode ser reduzida para menos de 1%. A transmissão pode ocorrer durante a gestação, no momento do parto ou após o nascimento durante a amamentação. Excluindo-se a transmissão após o nascimento, das crianças infectadas, 25 a 30% apresentam DNA proviral detectável ao nascimento, sugerindo infecção intra-útero, enquanto 70 a 75% apresentam provirus ou RNA do HIV-1 indetectável ao nascimento, os quais se tornam detectáveis após uma ou duas semanas de vida, sugerindo infecção no momento do parto (LUZURIAGA & SULLIVAN, 2002). Sendo assim, evitar a amamentação e recorrer à cesariana são métodos preventivos que demonstraram ser eficazes, não só em ensaios clínicos, mas também em populações infectadas (EUROPEAN MODE OF DELIVERY COLLABORATION, 1999; EUROPEAN COL. STUDY, 2001; ISAACS et al., 2003; NEWELL & ROGERS, 2002; THORNE & NEWELL, 2003). A carga viral materna elevada e a ruptura prolongada das membranas amnióticas são os principais fatores associados à transmissão vertical do HIV (BURTON et al., 1996; COLL et al., 1997). Desta forma, assim como nas outras formas de infecção, o risco da transmissão encontra-se na dependência da viremia materna. Embora o risco de transmissão materno-fetal exista em qualquer nível de carga viral materna, este risco é muito maior quando o nível de carga viral materna é elevado. A transmissão é rara (<1%) quando a carga viral plasmática materna é inferior a 1000 copies de RNA/ml. Alguns estudos vêm demonstrando que o risco de transmissão vertical aumenta à medida que a carga viral materna se eleva (BULTERYS & LEPAGE, 1998). No mesmo sentido, pesquisas demonstram que a carga viral materna pode ser utilizada como um marcador para a transmissão, sobretudo em mulheres que não realizaram profilaxia medicamentosa, uma vez que a terapêutica antiviral reduz o risco de transmissão (COUTOPOULOS-LOANNIDIS & LOANNIDIS, 1998). No mesmo sentido, pesquisas vêm demonstrando que o risco de transmissão aumenta à medida que a contagem de células T CD4 diminui (VAN DYKE et al., 1999). No entanto, presença de úlceras cervico-vaginais ou elevada carga viral cervical ou vaginal vêm sendo associada a elevado risco de transmissão, independente da carga viral plasmática (CHUACHOOWONG et al., 2000; JOHN et al., 2001). Situação similar se observa quando se considera a carga viral no leite materno, a qual vem se mostrando importante determinante de risco de transmissão durante a amamentação (CHUACHOOWONG et al., 2000). Os maiores progressos na redução da transmissão vertical deste vírus foram obtidos com a instituição de regimes de terapêutica antiretroviral ao longo da gestação, parto e primeiras semanas de vida do recém-nascido (KOURTIS, 2002). A terapêutica tem um forte impacto no decréscimo da carga viral materna, conduzindo a uma diminuição da transmissão do vírus ao recémnascido (PETERS et al., 2003). Assim, o diagnóstico da gestante é importante por permitir maior agilidade na intervenção com os medicamentos antiretrovirais, cuja utilização adequada associada a outras medidas profiláticas podem modificar o panorama da epidemia em crianças (BRASIL, 2004). Apesar da disponibilidade pelo Sistema Único de Saúde (SUS) do exame diagnóstico para detecção da infecção pelo HIV e da medicação antiretroviral, no Brasil ainda existem dificuldades na identificação de gestantes soropositivas durante o pré-natal, o que faz com que gestantes cheguem ao momento do parto desconhecendo sua condição sorológica (DATASUS, 2005). A metodologia utilizada para o diagnóstico pré-natal é o ELISA para a detecção de anticorpos anti-HIV, o qual não permite determinação imediata e, portanto, não pode ser utilizado no momento do parto para as gestantes que desconhecem sua sorologia. Nestas situações utilizam-se os denominados testes rápidos, que permitem o diagnóstico imediato (DUARTE et al., 2001). Os testes rápidos para o HIV se mostraram altamente específicos, sensíveis, de baixo custo e de fácil execução (CARVALHO et al., 2004). As crianças nascidas de mães soropositivas para o HIV devem ser atendidas em unidades especializadas, pelo menos até a definição de seu diagnóstico. Aquelas que se revelarem infectadas deverão permanecer em atendimento nessas unidades, ao passo que as não infectadas poderão ser encaminhadas para acompanhamento em unidades básicas de saúde. Nos centros de atendimento em países desenvolvidos tem sido recomendado que mesmo as crianças que soronegativaram devem ser submetidas a visitas periódicas, até o final da adolescência, em unidades especializadas para atendimento a pessoas com infecção pelo HIV, em virtude de terem sido expostas não só ao HIV, mas, também, durante o período intra-uterino, a drogas antiretrovirais. Esta preocupação reside no fato de não se saber as possíveis repercussões da exposição a estes medicamentos a médio e a longo prazo (BRASIL, 2004). No entanto, o primeiro passo para uma intervenção pediátrica de sucesso é o diagnóstico precoce e preciso da criança. Os métodos atualmente disponíveis para detecção de anticorpos anti-HIV, como ELISA, Western Blot e Imunofluorescência Indireta, não são aplicáveis em crianças com idade inferior a 18 meses, devido a passagem transplacentária de anticorpos maternos do tipo IgG, uma vez que a IgM, anticorpo pentamérico que não atravessa a placenta só é detectável por tais metodologias após 18 meses de idade (MARQUES, 2001). Para um diagnóstico preciso destas crianças torna-se necessário o emprego de métodos que detectam o ácido nucléico viral como a reação em cadeia da polimerase (PCR), o qual não se encontra disponível para esta finalidade no Programa Nacional de DST/Aids (BRASIL, 2004). Assim, o diagnóstico da criança vem sendo realizado através da quantificação do RNA do HIV-1 (carga viral) segundo a figura 1. Figura 1: Figura 1. Fluxograma para utilização de testes de quantificação de RNA visando a detecção da infecção pelo HIV em crianças com idade entre 2 meses e 2 anos, nascidas de mães infectadas pelo HIV No entanto, a dinâmica da infecção vertical pelo HIV é diferente da observada no adulto. A criança apresenta viremia primária no início da vida e seu sistema imune é relativamente imaturo. Desse modo, ela pode exibir cargas virais elevadas, ou seja, maiores de 106 cópias/ml, com taxas de declínio mais lentas do que as apresentadas em adultos, sendo difícil determinar limites precisos para a doença. Assim, apesar de se definir que quanto maior a carga viral maior o risco de progressão, existe considerável superposição de valores (BRASIL, 2004). Da mesma forma, a história natural da infecção pelo HIV em crianças tem espectro amplo, com pacientes variando de progressores rápidos à nãoprogressores. Cerca de 10 a 15% dos pacientes evoluem com imunodepressão precoce e deterioração clínica nos primeiros dois anos de vida, caracterizando padrão de progressão rápida. A maior parte, 50% a 70%, apresenta padrão de evolução intermediário, em que predominam sinais e sintomas leves nos primeiros 5 anos de vida. Um terceiro grupo, cerca 10 a 15%, tem progressão lenta e livre de manifestações da doença até 8 anos de idade. Até o presente, os esquemas terapêuticos potentes não resultaram na erradicação da infecção pelo HIV. Portanto, o tratamento antiretroviral objetiva controlar a replicação viral, preservar ou restaurar a integridade imunológica e impedir, postergar ou diminuir as conseqüências da infecção, proporcionando maior sobrevida com qualidade ao paciente (BRASIL, 2004). Assim, é importante instituir o esquema terapêutico em crianças infectadas. No entanto, os efeitos adversos dos medicamentos são agressivos e acabam comprometendo a qualidade de vida da criança, sobretudo àquela submetida a múltiplas drogas. No outro extremo, deve-se evitar a utilização do AZT em monoterapia na criança infectada, evitando, assim, a precoce seleção de mutantes resistentes, o que dificultaria uma terapia de resgate eficiente em longo prazo. Neste sentido, é fundamental avaliar com cautela a necessidade de instituição de um esquema terapêutico na criança, sendo imprescindível para este fim conhecer a real situação da criança (portadora ou não do HIV-1). Neste contexto, a utilização do exame de carga viral plasmática para o diagnóstico precoce da criança vem se mostrando ineficaz, pois cargas virais baixas ou indetectáveis podem indicar infecção quando consideramos os progressores lentos, ou crianças cujas mães fizeram quimioprofilaxia eficiente. Assim, o diagnóstico preciso da mãe e da criança com idade inferior a 18 meses é essencial para a tentativa de minimizar o risco de transmissão e, se isso não for possível, acompanhar da maneira mais precoce e eficiente possível à criança infectada, o que vem sendo dificultado atualmente pela indisponibilidade de métodos que detectem o ácido nucléico viral. Objetivos Objetivos Principais Implantar em dimensão nacional uma rede de laboratórios treinados para realizar a detecção do DNA pró-viral do HIV-1 em sangue periférico de crianças nascidas de mães infectadas a partir de 2 meses de idade e gestantes com sorologia indeterminada . Determinar a prevalência da transmissão vertical no Brasil. Objetivos Secundários Avaliar a prevalência de transmissão vertical do HIV em crianças nascidas de mães soropositivas com alta viremia. Avaliar a prevalência de transmissão vertical do HIV em crianças nascidas de mães com baixa viremia. Relacionar o risco de transmissão vertical à viremia materna. Monitorar, quantitativamente através da carga viral plasmática a modificação da viremia na criança identificada como portadora do HIV-1. Casuística e Métodos Casuística Participarão deste estudo crianças nascidas de mães soropositivas e gestantes com sorologia indeterminada para o HIV-1. Somente serão incluídos neste estudo, pacientes que fornecerem seu consentimento livre e esclarecido por escrito, segundo modelo em anexo, ou consentimento do responsável quando for o caso. Este estudo será submetido ao Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). Metodologia A metodologia empregada na realização deste estudo será a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) qualitativa para a detecção do HIV-1 utilizando o Kit HIV-1 DNA Test Amplicor® (Roche). O DNA próviral do HIV-1 é extraído a partir de sangue total utilizando uma solução detergente a base de proteinase K. O DNA extraído é utilizado em uma reação de PCR cujos primers selecionam uma região alvo de 155 nucleotídeos na região gag, a qual é amplificada. Um controle interno é utilizado na reação, o qual constitui um fragmento de DNA resultante de clonagem flanqueada pelas mesmas seqüências do DNA proviral alvo e uma região interna distinta, ou seja, o controle interno pode ser amplificado com os mesmos primers que amplificam o DNA alvo, no entanto, sondas específicas podem distingui-los. O controle interno é adicionado à reação em momento anterior a extração, assim, constitui controle de todas as etapas do processo: da extração à detecção. A detecção do produto da PCR é realizada por uma reação de hibridização, na qual sondas biotiniladas são adicionadas à reação e anelam-se especificamente ao DNA proviral alvo e ao controle interno. A visualização da reação ocorre quando se adiciona um conjugado constituído de peroxidase marcada com avidina, um substrato, o peróxido de hidrogênio e um cromógeno, o tetrametilbenzidina (TMB). Neste processo, o conjugado se liga as sondas (ligação avidina- biotina) e ocorre uma reação de hidrólise do substrato e oxidação do cromógeno, o qual passa de incolor para amarelo. Desenho Geral da Rede Implantação da Rede Os locais nos quais serão instalados os laboratórios da rede serão escolhidos segundo a capacidade técnico-científica e da estrutura física/ pessoal instalada. A localização destes laboratórios deverá ser determinada em consenso com o Programa Nacional de DST/Aids e as coordenações locais. Estados Quantidades de laboratórios Rio Grande do Sul 2 Santa Catarina 1 Paraná 1 São Paulo 2 Rio de Janeiro 2 Minas Gerais 1 Bahia 1 Pernambuco 1 Ceará 1 Mato Grosso do Sul 1 Espirito Santo 1 Distrito Federal 1 TOTAL 15 Os laboratórios receberão exames de diferentes regiões dos respectivos estados. A estimativa de testes por região, deverá considerar o número de gestantes soropositivas e gestantes indeterminadas da região, bem como a capacidade operacional dos laboratórios envolvidos. A aquisição será de 30.000 testes, que serão disponibilizados a medida que a rede for implantada. Fluxo da Rede O médico responsável pelo atendimento à gestante que apresenta um resultado indeterminado na sorologia para o HIV-1, fará a solicitação da realização do PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1. Quanto às crianças nascidas de mães soropositivas, serão encaminhadas para a realização do PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1no mesmo momento da solicitação da determinação da primeira carga viral, ou seja, aos 2 meses de idade, segundo o Guia de Tratamento vigente, podendo sofrer alteração. A solicitação far-se-á utilizando o mesmo formulário de carga viral, especificando o acréscimo da PCR para detecção do DNA pró-viral do HIV-1. A amostra de sangue será a mesma coletada para a carga viral, visando minimizar a espoliação da criança. Desta forma, não haverá coleta de sangue específica para a realização da PCR. Profissionais devidamente treinados com amplo conhecimento da metodologia a ser empregada executarão o exame em laboratório capacitado, credenciado e dotado da estrutura física adequada. O resultado encontrado pelo laboratório deverá ser encaminhado ao médico solicitante, na forma de um relato especificando tratar-se de um projeto de pesquisa, devendo, portanto ser analisado com parcimônia, juntamente com os dados clínicos e outros achados laboratoriais. Cronograma do Estudo Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Descrição Reunião para a elaboração do Protocolo de pesquisa e x x x passagem na CONEP Apresentação e discussão do Projeto para implantação do Pró-viral junto com as Coordenações Estadual de x x DST/Aids. Reunião com os laboratórios executores escolhidos para a pesquisa. Instalação dos equipamentos nos laboratórios Treinamento dos laboratórios envolvidos Encaminhamento de documento para as unidades x x solicitantes frente ao novo procedimento Inicio do estudo – Monitoramento Oficina de trabalho para avaliação do estudo x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Referências Bibliográficas Brasil. Ministério da Saúde. Coordenação Nacional de DST e Aids. 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