quantex ASO plus standard

BIO-FLASH ®
®
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
BIO-FLASH anti-HIV 1+2
3000-8575
100 testes
BIO-FLASH anti-HIV 1+2 é um ensaio imunológico quimiluminescente de dois passos, totalmente
automatizado, para a determinação qualitativa de anticorpos contra HIV-1 e HIV-2 em soro ou plasma
humano com o instrumento BIO-FLASH.
Sumário
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi definido como o agente etiológico da síndrome de imunodeficiência
1,2
adquirida (AIDS) em 1983. A AIDS é uma patologia causada por dois retrovírus relacionados, chamados HIV-1 e
HIV-2. Esses vírus atacam o sistema imunológico reduzindo sua proteção e permitindo o aparecimento de
infecções oportunistas, infecções freqüentemente graves e fatais, e tumores. Em todo o mundo, o número de
3
pessoas que vivem com HIV vem aumentando – em 2008, esse número era estimado em cerca de 33 milhões.
Entretanto, o número de mortes por doenças relacionadas à AIDS vem diminuindo lentamente, graças às terapias
antirretrovirais. O HIV se transmite por contato direto de mucosas ou da corrente sanguínea com algum líquido
corporal que contenha o vírus. O padrão de transmissão varia nas diversas regiões do mundo. Na Europa
Ocidental, América do Norte e Austrália, a transmissão se dá, principalmente, na população de alto risco, como
homens que fazem sexo com homens e usuários de drogas injetáveis, enquanto na África subsaariana
predominam os casos de transmissão heterossexual e materno-infantil.
4
O HIV-1 é o agente causador da maioria das infecções por HIV em todo o mundo. O HIV-2, descoberto em 1986 ,
é menos virulento e contagioso que o HIV-1 estando limitado, sobretudo, à África Ocidental. A estrutura do HIV-1
consiste em um núcleo de RNA, proteínas de nucleocapsídeo e enzimas necessárias para desenvolvimento do
vírion, que é envolvido por um capsídeo formado pela proteína viral p24. O núcleo é envolvido por uma matriz que
se compõe da proteína viral p17. Toda essa estrutura é protegida pelo envelope viral, formado por uma dupla
camada de lipídeos que contém proteínas da célula hospedeira e uma glicoproteína complexa. Esse complexo se
constitui de três moléculas externas denominadas gp120, e uma glicoproteína transmembrana complexa formada
por três moléculas de gp41. O HIV-1 e o HIV-2 têm múltiplos epitopos em comum nos antígenos nucleares, mas
as glicoproteínas do envelope apresentam menor reatividade cruzada.
O ensaio imunológico BIO-FLASH anti-HIV 1+2 utiliza antígenos recombinantes com seqüências que pertencem
tanto ao HIV-1 quanto ao HIV-2. Esses vírus se distinguem pelo uso, respectivamente, de duas proteínas
recombinantes específicas do seu envelope: gp41 e gp36. A determinação dos anticorpos anti-HIV serve para a
triagem de sangue e hemoderivados, de modo a evitar a transmissão do HIV, e também para o diagnóstico de
infecção por HIV. A detecção da infecção por HIV é importante por razões de segurança, prevenção e prognóstico
individual.
Princípio
Quando as micropartículas paramagnéticas de BIO-FLASH anti-HIV 1+2 são misturadas e incubadas com a
amostra, se esta apresenta anticorpos específicos anti-HIV, estes se combinam com os antígenos de HIV que
recobrem as micropartículas. Depois de uma separação magnética e lavagem para eliminar resíduos da amostra
se adiciona um traçador que consiste em antígenos de HIV marcados com isoluminol, que se unem aos anticorpos
anti-HIV capturados pelas micropartículas. Depois de uma segunda incubação, separação magnética e lavagem,
adicionam-se os reagentes que ativam a reação quimiluminescente. O luminômetro do BIO-FLASH mede a luz
emitida em unidades relativas de luz (URL) que são diretamente proporcionais à concentração de anticorpos
anti-HIV na amostra.
O BIO-FLASH utiliza um método de redução de dados com ajuste a uma curva logística de 4 parâmetros (4PLC)
para gerar uma Curva de Calibração Mestre (CCM). Esta curva vem predefinida, depende do lote e é guardada no
instrumento através do código de barras do cartucho. Com a leitura dos calibradores (que se fornecem em um kit
separado), a CCM predefinida se transforma em uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT) nova e específica
para o instrumento. As concentrações dos calibradores estão incluídas nos códigos de barras dos tubos dos
calibradores.
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Esquema da reação:
Ativadores
(Triggers)
URL
Partícula magnética
Amostra
Traçador
Emissão de luz
Componentes
Cartucho de reagentes
O kit BIO-FLASH anti-HIV 1+2 contém um cartucho de reagentes para 100 determinações (REF 3000-8575).
NOTA: O desenho do cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Desenho CE 000762992-0001)
Composição do cartucho de reagentes:
O cartucho está composto por 3 frascos que contêm:
A.
1
frasco
cilíndrico
de
suspensão
de
micropartículas recobertas com antígenos
recombinantes de HIV purificados (p24 do núcleo
do HIV-1, gp41 do envelope do HIV-1 e gp36 do
envelope do HIV-2). Contém < 0,1% de azida
sódica.
B.
Posição sem frasco.
C.
1 frasco opaco de traçador, que consiste em
antígenos recombinantes de HIV purificados
(p24 do núcleo do HIV-1, gp41 do envelope do
HIV-1 e gp36 do envelope do HIV-2), marcados
com isoluminol. Contém < 1,0 % de Triton-X 100
e < 0,1% de azida sódica.
D.
1 frasco vazio.
Preparação
Veja a figura seguinte.
Cartucho: as micropartículas sedimentam durante o transporte e o armazenamento, por isso é preciso misturá-las
para voltar a ressuspendê-las.

Antes de utilizar o cartucho pela primeira vez, inverta-o suavemente 30 vezes evitando a formação de
espuma (as bolhas podem fazer com que os sensores de líquido do instrumento dêem leituras errôneas).

Comprove que as micropartículas estejam totalmente em suspensão. Se não for assim, continue invertendo o
cartucho até que as micropartículas se ressuspendam totalmente.

Se as micropartículas não se ressuspendem ou detecta que o pré-cinto dos reagentes está furado NÃO
UTILIZE O CARTUCHO.

Uma vez que as micropartículas estejam em suspensão, coloque o cartucho sobre uma superfície sólida e
retire com cuidado a lingüeta vermelha de segurança para o transporte.

Mantendo o cartucho sobre a superfície sólida, aperte as duas abas situadas nos dois lados da tapa
perfurante (peça cinza) e pressione a parte superior do cartucho até que fique em posição de bloqueio. Uma
vez em posição de bloqueio, as abas têm que ficar ocultas. Não inverta o cartucho aberto.

Deixe o cartucho repousar durante 5 minutos antes de carregá-lo no instrumento.

Uma vez carregado o cartucho, o instrumento mistura seu conteúdo de forma automática em intervalos
periódicos.
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Precauções
Os reagentes BIO-FLASH são para diagnóstico IN VITRO.
Uso exclusivo para profissionais.
A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre originando azidas metálicas altamente
explosivas. Ao eliminar os restos de reagentes, fazê-lo em abundante volume de água.
ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO.
Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante.
Por favor, não reutilize nem reintroduza reagentes nos cartuchos ou frascos.
Coleta e conservação das amostras
Usar soro fresco (também se pode utilizar tubos com gel separador de soro) ou plasma (Li-heparina, Na-heparina,
Na-citrato, EDTA e ACD). Outros anticoagulantes devem ser comprovados antes de utilizar-se. Os anticoagulantes
líquidos como citrato de sódio exercem um efeito de diluição e podem reduzir a concentração nas amostras dos
pacientes. O uso de plasma com EDTA pode aumentar a concentração nas amostras individuais dos pacientes.
As amostras não devem ser inativadas por calor. As partículas em suspensão devem ser eliminadas por
centrifugação. Nas diretrizes CLSI H18-A3 e H21-A5 encontrará mais informação sobre o manuseio, o transporte,
o processamento e a conservação das amostras.
Soro
As amostras de soro podem ser conservadas a 2-8°C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo, devem
ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. As amostras podem congelar-se/descongelar-se no
máximo 3 vezes. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas amostras e, em caso
contrário, elimine-as todas antes da análise.
Plasma
As amostras de plasma podem ser conservadas a 2-8°C durante 8 dias. Para um período de tempo mais longo,
devem ser congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20°C. Descongelar o plasma a 37°C. Descongelar as
amostras somente uma vez. Misturá-las bem depois de descongelar. Comprove que não haja bolhas nas
amostras e, em caso contrário, elimine-as todas antes da análise.
Volume de amostra
O volume de amostra necessário para realizar um único teste com BIO-FLASH anti-HIV 1+2 varia em função do
tipo de recipiente que se utilize. Um teste requer ao menos 125 µL mais o volume morto, que é de 200 µL se é
utilizada a copa de amostra recomendado (REF 3000-8209).
Outros materiais
Os seguintes materiais não são fornecidos com o cartucho de reagentes e devem ser comprados por separado.
REF 3000-8576
BIO-FLASH anti-HIV 1+2 Calibrators (Calibradores)
REF 3000-8577
BIO-FLASH anti-HIV 1+2 Controls (Controles)
Leia com atenção as instruções correspondentes se deseja mais informação.
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Não utilize outros calibradores. A informação que necessita o instrumento BIO-FLASH para calibrar o ensaio
BIO-FLASH anti-HIV 1+2 está incluída nos códigos de barras dos tubos.
Utilizar controles de outros fabricantes pode dar lugar a resultados imprevistos.
Assegure-se de que no instrumento BIO-FLASH haja uma quantidade suficiente dos seguintes consumíveis antes
de processar amostras, calibradores ou controles:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas)
Nota: O desenho da cubeta está protegido por patente (US D560,816 / Desenho CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Ativadores)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Solução do sistema)
Instrumento / procedimento do ensaio
No Manual do Usuário do BIO-FLASH encontrará as instruções completas para realizar o ensaio.
Calibração
O código de barras do cartucho contém uma Curva de Calibração Mestre (CCM) que é válida para o lote de
reagentes. No entanto, para todos os reagentes se necessita uma Curva de Calibração de Trabalho (CCT), que é
específica para cada lote e válida até a data de validade do lote. É preciso obter uma nova CCT quando os
resultados dos controles saiam fora do intervalo de aceitação ou quando se tenha realizado ajustes no instrumento.
Leia com atenção o Manual do Usuário do BIO-FLASH para configurar uma CCT.
Controle de qualidade
Para realizar um programa completo de controle de qualidade é recomendável passar três controles. Os controles
BIO-FLASH anti-HIV 1+2 negativo, positivo de anti-HIV-1 e positivo de anti-HIV-2 foram desenhados para esse
programa. Os controles devem ser analisados ao menos uma vez cada 24 horas por dia de utilização. Assegure-se
de que os resultados dos controles se encontram dentro dos limites de aceitação já que, se não for assim, pode ser
indicativo de resultados não válidos, ante os quais o usuário deverá tomar medidas corretivas. Nesse caso, verifique
todos os resultados obtidos desde a última comprovação de controle de qualidade aceitável do analito em questão.
Pode ser necessário re-calibrar o instrumento. No Manual do Usuário do instrumento encontrará mais informação.
5
Para identificação e resolução de situações anormais de controle de qualidade, consulte Westgard et al.
Conservação e estabilidade
Os reagentes que não tenham sido abertos se mantêm estáveis até a data de validade indicada no rótulo do
cartucho se forem conservados a 2-8°C em posição vertical.
Uma vez aberto, a estabilidade do cartucho carregado no instrumento BIO-FLASH ou guardado a 2-8°C é de
10 semanas.
Interpretação de resultados
A quantidade de analito em cada amostra se determina a partir da luz emitida (URL), por interpolação na Curva de
Calibração de Trabalho guardada. Os resultados obtidos com o BIO-FLASH anti-HIV 1+2 são expressos em S/CO
(Sinal da amostra/Valor de corte). Como o ensaio é qualitativo, o valor numérico do resultado só é indicativo da
quantidade de anticorpo presente.
A determinação de anti-HIV utilizando o ensaio BIO-FLASH anti-HIV 1+2 é interpretada como segue:



As amostras com resultado < 0,90 S/CO são consideradas não reativas (negativas).
As amostras com resultado ≥ 0,90 e < 1,00 S/CO são consideradas indeterminadas (zona cinza).
As amostras com resultado ≥ 1,00 S/CO são consideradas reativas (positivas).
Amostras com resultado inicialmente reativo ou indeterminado devem ser re-analisadas por duplicado. Se na
repetição ambos os valores são inferiores a 0,90, a interpretação final do ensaio é de resultado negativo para
anti-HIV. Se algum dos resultados é positivo ou indeterminado, a amostra deve ser investigada com um teste
suplementar para confirmar o resultado. Um resultado repetidamente positivo é indicativo de infecção pelo HIV.
Amostras com concentração de anti-HIV acima de 100,00 S/CO são informadas como > 100,00.
Limitações
O resultado de uma única amostra não é suficiente para diagnosticar uma infecção por HIV. Portanto, os
resultados do BIO-FLASH anti-HIV 1+2 devem ser utilizados em conjunção com outros dados como, por exemplo,
a sintomatologia, a historia clínica, os resultados de outras provas e toda a informação adicional relevante.
Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HIV. Como em todos os ensaios
imunológicos sensíveis, existe a possibilidade de obter resultados positivos que não se repitam.
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Resultados esperados
A prevalência da infecção por HIV em adultos (de 15-49 anos de idade) varia muito dependendo da área geográfica,
de menos de 0,1% no leste asiático até 1,0% no Caribe, com casos de exceção como os 5,2% de prevalência da
África subsaariana e picos de 25% em alguns países. Na Europa, estima-se que a prevalência do HIV varie de
3
menos de 0,1% em algumas áreas da Europa central, a mais de 1,0% em partes da antiga União Soviética.
Características funcionais
NOTA: Os dados a seguir são representativos; os resultados em experimentos isolados podem variar respeito a
estes dados.
Especificidade
A avaliação de especificidade foi baseada em testar amostras de soro de doadores de sangue não selecionados,
incluindo doadores de primeira vez e pacientes internados. Foram testadas em total 9994 amostras frescas de
soro, não selecionadas, provenientes de dois bancos de sangue, 5060 das quais eram do Banc de Sang i de
Teixits de Catalunya (Espanha) e 4934 do Centro EFS Atlantique de Tours (França). Além disso, 499 amostras
não selecionadas de soro de pacientes internados no Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Espanha), foram
também avaliadas.
As amostras “repetidamente reativas” foram re-analisadas usando um teste comercial. A especificidade foi então
calculada, com os resultados mostrados na tabela seguinte:
n
Inicialmente
reativas
(IR)
n
Repetidamente
reativas
(RR)
n
Doadores de sangue de dois
bancos de sangue diferentes
9994
48
Pacientes hospitalizados
499
15
Amostras
testadas
n
RR
positivas
confirmadas
n
39
4
0
99,6%
15
1
14
99,8%
RR
indeterminadas
Especificidade
%
Sensibilidade
A sensibilidade foi avaliada testando amostras comprovadamente positivas para HIV, algumas delas do Instituto
de Medicina Tropical Príncipe Leopoldo de Antuérpia (Bélgica). A sensibilidade foi calculada para cada grupo de
amostras, obtendo-se os resultados mostrados na tabela seguinte:
Amostras
testadas
n
Anti-HIV-1 subtipo A (Grupo M)
4
Anti-HIV-1 subtipo C (Grupo M)
4
Anti-HIV-1 subtipo D (Grupo M)
4
Anti-HIV-1 subtipo F (Grupo M)
3
Anti-HIV-1 subtipo G (Grupo M)
3
Anti-HIV-1 subtipo H (Grupo M)
3
Anti-HIV-1 subtipo J (Grupo M)
3
Anti-HIV-1 subtipo K (Grupo M)
3
Anti-HIV-1 de subtipos misturados (Grupo M)
10
Anti-HIV-1 Grupo O
3
Anti-HIV-2
100
Anti-HIV-1
403
Mesmo dia (≤ 1 dia após a coleta da amostra)
25
Grupo de amostras
Amostras
reativas
n
4
4
4
3
3
3
3
3
10
3
100
403
25
Sensibilidade
%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Sensibilidade para soroconversão
A sensibilidade diagnóstica durante o período de soroconversão foi avaliada testando-se amostras de 30 painéis
comerciais de soroconversão para HIV: 25 da BBI Diagnostics (SeraCare) e 5 da Zeptometrix. Comparativamente
à maioria dos demais métodos comerciais, houve reatividade equivalente com 25 painéis, enquanto que uma
reatividade mais precoce foi observada com 5 painéis. O estudo dos 30 painéis de soroconversão mostrou que os
resultados atendem às Especificações Técnicas Comuns da CE (2009/886/EC).
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Precisão
A precisão intra-ensaio e a total (ensaio a ensaio e dia a dia) foram avaliadas em múltiplos ensaios, conforme as
diretrizes CLSI EP05-A2. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte:
Controle negativo
Controle positivo anti-HIV-1
Controle positivo anti-HIV-2
Próximo do valor de corte
Média (S/CO)
0,27
3,43
3,42
1,06
Intra-ensaio
0,039 SD
2,57% CV
3,52% CV
5,13% CV
Total
0,064 SD
4,42% CV
4,56% CV
7,60% CV
Reprodutibilidade
A repetibilidade entre réplicas, entre lotes e entre instrumentos foi avaliada utilizando-se 55 amostras. Os
resultados estão resumidos na tabela seguinte:
Réplica 2 vs. Réplica 1
Lote 2 vs. Lote 1
Instrumento 2 vs. Instrumento 1
n
55
55
55
Co-negatividade
100%
100%
100%
Co-positividade
100%
100%
100%
Interferências
Estudos conduzidos segundo as diretrizes CLSI EP7-A demonstraram que os resultados do BIO-FLASH anti-HIV 1+2
não são afetados pelas seguintes substâncias potencialmente interferentes:
Substância potencialmente interferente
Hemoglobina
Bilirrubina indireta
Bilirrubina direta
Triglicérides
Fator reumatóide
HAMA (anticorpo humano anti-murino)
Concentração
500 mg/dl
18 mg/dl
18 mg/dl
1300 mg/dl
800 UI/ml
1 µg/ml
% Interferência
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reatividade cruzada
Foram analisadas com o ensaio BIO-FLASH anti-HIV 1+2 107 amostras positivas para condições que potencialmente
poderiam produzir reação cruzada, incluindo de mulheres grávidas. Considera-se que ocorre uma reação cruzada
quando o diagnóstico muda de positivo a negativo ou vice-versa. As amostras reativas foram comparadas com um
ensaio de referência para o qual não foi observada reação cruzada com as substâncias potencialmente interferentes.
Uma amostra reativa para HIV foi confirmada. Os resultados estão resumidos na tabela seguinte:
Reação cruzada potencial
ANA (anticorpos antinucleares)
IgG anti-CMV (citomegalovírus)
IgM anti-CMV (citomegalovírus)
Anti-EBV (vírus Epstein-Barr)
Anti-E. coli
Anti-HCV (vírus da hepatite C)
IgG anti-HSV 1 (vírus herpes simplex tipo 1)
IgG anti-HSV 2 (vírus herpes simplex tipo 2)
Anti-rubéola
IgG anti-VZV (vírus da varicela zoster)
IgM anti-VZV (vírus da varicela zoster)
IgG elevada
IgM elevada
HBsAg (antígeno de superfície do vírus da hepatite B)
HTLV (vírus T-linfotrópico humano)
Mononucleose
Mulheres grávidas (multíparas incluídas)
RF (fator reumatóide)
RPR (reagina plasmática rápida)
IgG anti-Toxo (Toxoplasma gondii)
IgM anti-Toxo (Toxoplasma gondii)
Concordância
7/7
5/5
4/4
3/3
8/8
5/5
5/5
5/5
5/5
3/3
3/3
4/4
3/3
5/5
5/5
9/9
9/9
4/4
5/5
5/5
5/5
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Limite de detecção e sensibilidade analítica
O limite de detecção (LD), determinado segundo as diretrizes CLSI EP17-A, situa-se em 0,48 S/CO.
O teste do British Working Standard for anti-HIV 1 (código NIBSC 99/750-012) com o ensaio BIO-FLASH anti-HIV 1+2
teve como resultado 6,49 S/CO e o teste do 1 in 5 dilution British Working Standard for anti-HIV 1 (código NIBSC
99/710-011) teve como resultado 1,28 S/CO.
O teste da Monitor Sample for anti-VIH-2 (código NIBSC 99/674-099) com o ensaio BIO-FLASH anti-HIV 1+2 teve
como resultado 5,44 S/CO.
Efeito de prozona
O BIO-FLASH anti-HIV 1+2 é um ensaio de dois passos. O protocolo do teste inclui uma etapa de lavagem após
incubação da amostra, o que elimina o efeito de prozona. Experimentalmente não foi observado nenhum efeito de
prozona com amostras de até 12950 S/CO.
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3000-8575 R02 07.2012 por.doc
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