Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do

Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do Tabaco Burley
com Pratylenchus brachyurus
Ana R. Figueiredo1
João P. Pimentel2
RESUMO
Severidade da murcha bacteriana em Virgínia e interações do Tabaco Burley com Pratylenchus
brachyurus. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos sintomas causados ​​pela interação
entre Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum (murcha-bacteriana ou selvagem Granville)
em plantas de cultivo do tabaco K326 e By21. As avaliações foram realizadas através da
monitorização das plantas diariamente, registando as datas de início e progressão dos
sintomas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em plantas inoculadas
com uma bacteriana de suspensão de R. solanacearum ajustado para 104CFU.g-1 inoculadas com
distintas densidades populacionais de ovos e larvas de P. brachyurus. Quando as plantas foram
inoculadas com ambos agentes patogênicos, os sintomas das selvagens, causada pela bactéria
R. solanacearum começaram mais cedo e também se desenvolveram mais rapidamente, mesmo
em um cultivo consideravelmente mais tolerante. Os resultados sugerem que a presença de P.
brachyurus no sistema radicular das plantas, favoreceu a infecção por R. solanacearum.
Palavras-chave: Pratylenchus brachyurus; Ralstonia solanacearum;Tabaco.
ABSTRACT
Severity of Bacterial Wilt on Virginia and Burley Tabacco Interactions with Pratylenchus
brachyurus. The aim of this study was evaluate the effect of symptoms caused by the interaction
between Pratylenchus brachyurus and Ralstonia solanacearum (Bacterial Wilt or Granville Wild) in
plants of tobacco cultivation K326 and By21. Evaluations were performed by monitoring the
plants daily, recording the dates of onset and progression of symptoms. The experimental
design was completely randomized design in plants inoculated with a suspension bacterial of
R. solanacearum adjusted to 104CFU.g-1 inoculated with different population densities of eggs
1UFRRJ
2 UFRRJ
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and larvae of P. brachyurus. When plants were inoculated with both pathogens, the symptoms
of wild, caused by the bacterial R. solanacearum began earlier and also developed more quickly,
even in the most tolerant cultivar considered. The results suggest that the presence of P.
brachyurus in the radicular system of these plants, favored infection by R. solanacearum.
Key words: Pratylenchus brachyurus; Ralstonia solanacearum;Tobacco.
INTRODUÇÃO
Doenças complexas envolvendo nematoides e outros agentes fitopatogênicos podem dizimar
extensas áreas produtoras em poucos anos (FILHO et al., 1995).
As associações bactérias-nematoides e suas interações com plantas cultivadas são comumente
encontradas na natureza. Bactérias fitopatogênicas podem penetrar nas raízes das plantas
mecanicamente, devido a ferimentos causados por nematoides, ou ainda, se beneficiar de
alterações fisiológicas provocadas pelos nematoides nas plantas parasitadas o que altera a
resistência das plantas (RIEDEL, 1988).
A murcha das solanáceas, causada pela bactéria Ralstonia solanacearum, é a principal doença
vascular de plantas em todo mundo, afetando o fumo e solanáceas em geral (TAKATSU &
LOPES,1997). Das interações envolvendo bactérias e nematoides destacam-se aquelas causas
por Rathayibacter toxicus e Anguina funesta em centeio (RILEI, 1996) e Ralstonia solanacearum e
Meloidogyne incognita em tomateiro (DEBERDT et al., 1999), não havendo relatos de estudos
voltados à interação de R. solanacearum e Pratylenchus brachyurus em fumo.
Nesse trabalho, objetivou-se avaliar a severidade da interação entre as variedades K326 e By21
de Tabaco (suscetíveis à e Ralstonia solanacearum), tendo em vista a escassez de estudos na
cultura do fumo para esses agentes.
MATERIAL E MÉTODOS
Preparo das mudas
As variedades de fumo escolhidas para este ensaio pertencem a dois grupos de fumo distintos:
tabaco de estufa (fumo Virgínia K326) e tabaco de galpão (fumo By21).
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As sementes de fumo Virgínia K326 e fumo By21 foram semeadas diretamente em substrato
comercial e mantidas em ambiente de casa de vegetação. As mudas após recém-emergidas,
foram selecionadas conforme a uniformidade e transplantadas para sacos plásticos de um Litro
de volume contendo uma mistura de areia e terra previamente autoclavadas, na proporção de
50% cada.
Preparo do inóculo de Pratylenchus brachyurus
Amostras de solo foram coletadas em diferentes áreas e processadas de acordo com Jenkins
(1964).
Para obtenção de Pratylenchus brachyurus em quantidade massal, os nematoides foram axenizados
e mantidos em discos de cenoura, conforme O`Bannon e Taylor (1968) & Moody et al. (1973).
Os discos de cenoura foram triturados em liquidificador com água, por 15 segundos. A solução
foi vertida em peneiras de 60 e 500 mesh e os nematoides separados pelo método do funil de
Baermann modificado (BAERMANN, 1917; HOPPER, 1970), para a obtenção de suspensão
de ovos, larvas e adultos de P. brachyurus.
Preparo do inóculo de Ralstonia solanacearum
Uma amostra de solo infestada naturalmente por Ralstonia solanacearum foi destorroada e
exposta ao ar para secagem. Um grama da amostra de solo seco foi diluída em tubo de ensaio
contendo 9 mL de solução salina estéril. A seguir, foi feita uma diluição seriada, retirando-se
1 mL de solução desse tubo onde foi feita a diluição da amostra de solo e transferindo-a para
outro tubo contendo 9 mL de água salina, e assim por diante até a diluição de 109. Logo após,
foram coletadas 0,3 mL de cada tubo de ensaio e espalhados em placas de petri contendo meio
de cultura de Kelman.
As placas de Petri foram colocadas em uma estufa incubadora, a uma temperatura de 27º C,
onde permaneceram por 72 horas. Decorrido esse período, as placas foram levadas para a
contagem de células de Ralstonia solanacearum. Estimou-se então a densidade populacional da
bactéria por grama de solo seco (106 CFU.g-1).
A amostra de solo seco, estimada quanto à concentração da bactéria, foi separada em volumes
de 50 mL que foram usados como inóculo.
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Interação P. brachyurus X R. solanacearum em fumo
O delinemaento experimental utilizado nesse ensaio foi o fatorial 2 X 4, ou seja, com dois
tratamentos (cultivares de Tabaco) e quatro variáveis (sem inóculo, somente com nematoide,
somente com bactéria e nematoide + bactéria) e 16 repetições por variável/cultivar (Tabela
1). Para variável somente inoculada com nematoides, plantas individuais de tabaco com quatro
pares de folhas definitivas foram inoculadas com uma suspensão de 3.000 ovos, larvas e
adultos de P. brachyurus / vaso. Com o auxílio de um pipetador automático, o inóculo foi
depositado ao redor do sistema radicular das mudas, em quatro orifícios que foram abertos
na hora da inoculação e fechados logo após. Foram feitas correlações entre o número de
espécimes inoculadas, número final de espécimes e dano às plantas. O programa estatístico
utilizado para as avaliações foi o SISVAR e para testar a homogeneidade dos dados foi usado
o teste Shapiro-Wilk que está disponível no mesmo programa.
A inoculação com R. solanacearum se deu através de solo naturalmente infestado. Para a variável
bactéria + nematoide, plantas de tabaco, cultivadas em solo naturalmente infestado com R.
solanacearuam, foram inoculadas com P. brachyurus, nas mesmas condições citadas anteriormente.
As testemunhas receberam amostra de solo previamente autoclavada sem qualquer fonte de
inóculo.
Tabela 1. Ensaio da interação Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum em fumo Virgínia
e Burley.
Variedade
s/i
Pb
Rs
Pb + Rs
N
Virgínia K326
16
16
16
16
64
Burley By21
16
16
16
16
64
S/i plantas não inoculadas;
Pb plantas inoculadas com Pratylenchus brachyurus por vaso;
Rs plantas inoculadas com amostra de solo infestado com Ralstonia solanacearum;
PB + Rs plantas inoculadas com Pratylenchus brachyurus e Ralstonia solanacearum;
N número total de plantas de cada variedade.
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Condução e avaliação dos ensaios
As plantas foram mantidas em ambiente de casa de vegetação, irrigadas e adubadas
equilibradamente com Ureia.
As plantas foram avaliadas desde os primeiros sintomas, anotando-se a data em que se iniciou até
a morte, quando ocorreu ou até 70 dias após as inoculações. Àquelas plantas que apresentavam
sintomas de murcha foram avaliadas por isolamento da bactéria em meio de cultura de Kelman
e também por inoculação com palito em plantas sadias suscetíveis e reprodução dos sintomas.
Independente da percepção de sintomas aparentes externos, todas as mudas foram analisadas.
Cada muda teve seu caule cortado a partir da epiderme, retirando-se parte do córtex até expor
o cilindro central, na região do sistema condutor. Foi retirada uma seção com um corte vertical,
pegando os tecidos do floema, câmbio, xilema e parênquima radial e analisado o fragmento
em teste de exudação em gota. Este procedimento foi repetido por diversas vezes, até chegar
a uma conclusão quanto a presença ou não da bactéria.
Escala de notas
Para a avaliação dos sintomas de severidade da doença foi empregada uma escala de notas:
1- ausência de sinais e sintomas da doença;
2- sinais da doença ou 10% das folhas com sintoma de murcha;
3- folhas apresentando sintomas de murcha e amarelecimento acima de 10%;
4- folhas apresentando sintomas de murcha, amarelecimento, necrose e/ ou morte
da planta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As mudas de ambas as variedades que serviram de testemunhas recebendo apenas água destilada
e amostra de solo autoclavado permaneceram sadias, não exibindo quaisquer sintomas ou
sinais de murcha bacteriana até sessenta dias, quando terminou o ensaio. Também não foi
detectado sintoma de murcha nas plantas inoculadas apenas com o nematoide.
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Por outro lado, nas plantas inoculadas com a amostra de solo infestada com a bactéria Ralstonia
solanacearum (ASI-Rs), sintomas de murcha foram detectados nas duas variedades, tanto em
plantas inoculadas apenas com a bactéria quanto em plantas inoculadas previamente com o
nematoide, Pratylenchus brachyurus.
As plantas infectadas apresentaram sintoma de murcha unilateral, característico do parasitismo
por R. solanacearum (Fig. 2). Quando analisadas em teste de exudação em gota, a partir de
fragmentos de tecido vascular, foi observado intenso exsudado bacteriano, com motilidade
característica de bactéria lofotríquia. As bactérias isoladas em meio de cultura de Kelman
estavam livres de contaminações. As colônias apresentaram aspecto branco leitoso a opaco
com bordas irregulares e ligeiramente translúcidas.
No 5º dia a contar da inoculação com ASI-Rs, 100% das plantas das duas variedades, inoculadas
previamente com o nematoide, já demonstravam sintomas iniciais de murcha.
Na variedade By21, apenas 37,5% das plantas inoculadas exclusivamente com a ASI-Rs,
iniciaram a murcha no quinto dia, sendo que 100% das plantas apresentaram esse sintoma no
15º dia.
Na variedade K326, em plantas inoculadas exclusivamente com ASI-Rs, a murcha teve início
ao 10º dia após a inoculação, com apenas 12,5% das plantas apresentando o sintoma inicial.
No 45º dia após a inoculação com ASI-Rs, apenas 6,25% das plantas da variedade K326 não
apresentaram sintomas de murcha. Mesmo assim, essas plantas foram analisadas e chegou-se
a conclusão de que não apresentavam infecção por R. solanacearum.
Os ferimentos causados nas raízes por nematoides explica o efeito aditivo da interação com
bactérias em relação à ação individual de cada microorganismo (DEBERT at al., 1999).
Portanto, os ferimentos causados por P. brachyurus serviram de porta de entrada para Ralstonia
solanacearum nas raízes das plantas de fumo. Segundo Riedel (1988), os mecanismos que atuam
nessas interações são altamente desconhecidos.
Esses patógenos associados causam sinergismo (o dano dos dois juntos é maior do que a soma
dos dois separados) da doença causando morte de plantas de fumo (DUARTE, 2009).
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Neste ensaio, plantas de fumo mostraram incremento na severidade da doença murcha
bacteriana na presença de Pratylenchus brachyurus, principalmente na variedade K326. O aumento
na severidade da doença causada por Ralstonia solanacearum em interação com Meloidogyne foi
constatada por Cadet et al. (1986) e em tomateiro (Lycopersicon esculentum), quando a bactéria foi
inoculada simultaneamente com Meloidogyne arenaria (SALGADO et al., 2007).
O nematóide. Pratylenchus brachyurus, aumentou a severidade da doença murcha bacteriana,
causada por Ralstonia solanacearum, quando inoculado em conjunto em mudas de fumo das
duas variedades analisadas
Tabela 2. Percentual de plantas mortas e com sintomas iniciais de Murcha bacteriana n dias
após a 1ª inoculação.
Dias
Dias após a
após a
inoculação
inoculação
com ASI-Rs
com Pb
Tratamen
tos
S/i
Pb
Rs
Pb + Rs
By21
K326
By21
K326
By21
K326
By21
K326
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15
Inoculação
0
0
0
0
0
0
0
0
20
5
0
0
0
0
37,5
0
100
100
25
10
0
0
0
0
75
12,5
x
x
30
15
0
0
0
0
100
93,75
x
x
60
45
0
0
0
0
x
93,75
x
x
Ausência de sintomas e sinais de
100
Murcha bacteriana
100
100
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100
0
6,25
0
0
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Tabela 3. Notas de severidade da doença em plantas com sintomas.
Tratamentos
Variedade
Notas de severidade da doença em plantas
com sintomas
By21
0
S/i
K326
By21
PB
K326
0
0
0
By21
3
K326
2
By21
3
K326
3
RS
Pb + Rs
Figura 1. Sintomas iniciais de Murcha bacteriana em mudas de fumo variedade
By21: com sintomas (à esquerda) e sem sintomas (à direita).
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