Purificação de Proteínas

Aula de
Bioquímica I
Tema:
Purificação de Proteínas
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Proteínas: Isolamento e Purificação
Estudos e aplicações biotecnológicas de proteínas  Amostras Puras
Proteínas  Diferentes propriedades = Diferentes formas de isolamento
Considerações Gerais:
Qual é o uso da Proteína?
Qual é o material de partida?
O que deve ser removido da solução?
Quais as condições iniciais da solução?
Qual é a estabilidade da proteína?
Qual é a escala de purificação?
Qual é o custo econômico para a purificação?
Etc...
Proteínas: Isolamento e Purificação
A purificação de proteínas pode ser feita por uma série de etapas e técnicas
cromatográficas diferentes que devem obedecer uma sequência lógica.
Preparação, Captura, Transferência, Acondicionamento, etc
Múltiplas etapas ocasiona
perdas inerentes de amostras:
Rendimento
 Uma purificação eficiente
deve ser feita com o mínimo de
passos possíveis considerando o
uso da proteína e o custo.
Proteínas: Isolamento e Purificação
Fatores a considerar:
1) Objetivo para pureza
3) Manutenção da estrutura
5) Custo para o processo
2) Quantidade e Rendimento
4) Atividade biológica
6) Tempo
 Obter o máximo de informações sobre as propriedades da proteína alvo e dos
contaminantes.
 Atividade;
 Massa Molecular;
 Constituição de Aminoácidos
 pI teórico;
Estrutura Primária
(cDNA  tradução)
 ProtParam Toll
 Coeficiente de absortividade molar
 Estabilidade;
 Sednterp
 Estado oligomérico;
 Etc.
Purificação: Combinação de técnicas que exploram as diferentes propriedades da
proteína-alvo para isolá-la das demais.
Proteínas: Isolamento e Purificação
ANTES DE COMEÇAR!!!
1) Definir objetivos
 Pureza versus uso da proteína alvo
 Pureza versus custo
 Pureza versus tempo
 Qualidade final da amostra versus custo/tempo
“Over-purification versus under-purification”
Proteínas: Isolamento e Purificação
2) Definir propriedades do alvo e dos contaminantes
Tais informações guiarão a estratégia a ser montada para atingir os objetivos definidos.
 Contaminantes
“chave”: eliminá-los
primeiro!!!
Proteínas: Isolamento e Purificação
3) Testes de avaliação e/ou acompanhamento do processo
 Dependem dos objetivos estabelecidos
1) Testes de atividade biológica
- Teste enzimático, interação com ligantes, etc
2) Testes para avaliar a pureza
- Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS
3) Testes de quantificação
- Depende da origem da proteína
4) Testes para os contaminantes “chave”
- Idem anteriores
5) Testes estruturais
- Dicroísmo circular, fluorescência, etc.
Proteínas: Isolamento e Purificação
Estratégia de 3 fazes de purificação.
Definir objetivos para cada fase!!
 DEPENDE DAS PROPRIEDADES DO MATERIAL!!!
Captura: isolar, concentrar e estabilizar a proteína alvo
Purificação intermediária: retirar a maior parte das impurezas
Polimento: remover traços de contaminantes
Alta Pureza!
Rapidez!
Baixo Custo!
OBS: Minimizar ao máximo o
manuseio da amostra entre as
fazes!!!!
Proteínas: Isolamento e Purificação
Captura
 Objetivo: Isolar, concentrar e manter atividade
- Principais técnicas cromatográficas: Troca Iônica e Afinidade
- Resinas de alta Capacidade
- Separar de contaminantes críticos: DNA, proteases, etc
Purificação intermediária
 Objetivo: retirar a maior parte das impurezas
Separar contaminantes de propriedades similares
Usar técnicas complementares: Troca iônica, afinidade ou interação hidrofóbica
Polimento
 Objetivo: aumentar a pureza e preparar para armazenamento
Obs: sacrifica e dilui a amostra
Principal técnica: Filtração em Gel – CEM
Proteínas: Isolamento e Purificação
INÍCIO
PREPARAÇÃO - EXTRAÇÃO - CLARIFICAÇÃO
 Isolamento inicial da amostra protéica do material de origem;
 Lise das células/tecido de origem:
- Lise por Sonicação
- Lise por pressão
- Trituração do tecido
 Preparação da amostra para as etapas cromatográficas:
1) Adição de aditivos (Detergentes);
2) Ajuste do pH da amostra;
3) Adição de Sais;
4) Centrifugações;
5) Filtrações;
6) Diálises;
7) Etc...
Proteínas: Metodologias de Isolamento
CLARIFICAÇÃO
Centrifugação, Filtração, ultrafiltração e Gel filtração
Ultracentrifugação
Precipitação em sulfato de amônio
“Salting out”  estrutura da água
Diálise
Separação pela M
Preparação da amostra para etapas subsequentes
 Somente se necessário
Proteínas: Isolamento e purificação
Métodos Cromatográficos  Separação por características:
Tamanho, solubilidade, carga e afinidade.
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia de exclusão molecular
Separação pela Massa Molecular
Proteínas maiores eluem primeiro  Menor caminho a percorrer
 Importante técnica
para avaliar a Massa
molecular de proteínas
e interações proteínaproteína
Detector de UV
M
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia por troca iônica
Alia resolução e capacidade
Interação reversível entre proteínas com cargas opostas à da resina
 Importante técnica de caracterização e quantificação de proteínas e peptídeos
Depende do pI da proteína alvo e do pH da solução
Troca aniônica
Resina Catiônica
Troca catiônica
Resina Aniônica
Separação por aumento da [Sal] ou por mudanças no pH
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia por troca iônica
1
2
3
4
5
1 = Condições iniciais
2 = Adsorção
3 = Início da Eluição
4 = Término da Eluição
[NaCl]
[Proteína]
5 = Regeneração
Cromatograma
[NaCl]
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia por interação hidrofóbica
Alia resolução e capacidade
Interação reversível entre proteínas hidrofóbicas com a resina hidrofóbica
[Proteína]
[NaCl]
Separação por diminuição
da [Sal] ou por mudanças
no pH, temperatura
[NaCl]
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia por Fase Reversa
Alia resolução e capacidade
Interação reversível entre proteínas hidrofóbicas com a resina hidrofóbica
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia por Fase Reversa
Eluição por solvente orgânico  Pode desnaturar a proteína
[Proteína]
- Comprometimento da Estrutura 3D
[Solvente Orgânico]
Proteínas: Metodologias de Purificação
Cromatografia de afinidade
 Importante técnica em Tecnologia de
DNA Recombinante
- Isolamento de mRNAs
- Isolamento de proteínas
recombinantes
 Perfil de eluição similar à Troca
Iônica
Proteínas: Isolamento e Purificação
Técnicas de purificação oferecem um balanço entre:
As técnicas
escolhidas devem
 Capacidade
suprir os objetivos
 Velocidade
definidos e as
 Recuperação
propriedades da
proteína alvo
 Resolução
A Ordem dos
“fatores” influencia
Captura  Capacidade, Velocidade e Recuperação
Purificação intermediária  Capacidade e Resolução
Polimento  Resolução e Recuperação
o resultado
Proteínas: Metodologias de Purificação
Comparativo das técnicas cromatográficas versus Etapa
Técnica
Principais
Vantagens
Troca
Iônica
HIC
Afinidade
CEM
Fase
Reversa
Captura
Pur. Intermediária
Polimento
Condição da Amostra
Início
Final
Capacidade
Velocidade
Resolução
Baixa [Sal];
Sem limite de
volume
Alta [Sal] ou mudança
de pH;
Amostra concentrada
Resolução,
Capacidade
Velocidade
Alta [Sal];
Sem limite de
volume
Baixa [sal];
Amostra Concentrada
Capacidade
Velocidade
Resolução
Condições
específicas para
a ligação; Sem
limite de
volume
Condições específicas
– presença de
competidor
Amostra Concentrada
Resolução
Fluxo e Volume
inicial limitado
(< 5% VC)
Amostra diluída
Requer Solvente
Orgânico
Presença de solvente
orgânico – Atividade
biológica
comprometida
Amostra Concentrada
Resolução
Proteínas: Isolamento e caracterização
A Eletroforese em gel de poli-acrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDSPAGE) é o principal método de acompanhamento do processo de Purificação e avaliação do
grau de pureza.
Pode requerer concentração da
amostra para avaliar o grau de
pureza
Proteínas: Isolamento e caracterização
SDS-PAGE
Separação por Massa Molecular
Influência da Z/M e forma
da partícula
Proteínas: Isolamento e Purificação
1) Defina claramente os objetivos;
2) Avalie as propriedades da proteína alvo e contaminantes;
3) Desenvolva métodos de avaliação da atividade ou da estrutura;
4) Minimize o manuseio da amostra;
5) Minimize o uso de aditivos;
6) Remova agentes de degradação;
7) Usar diferentes técnicas em cada etapa;
8) Minimize o número de etapas;
9) Robustez e Reprodutibilidade;
10) Use uma combinação lógica de etapas.
MANTENHA A SIMPLICIDADE!!!