chamada clonagem celular.

CLONAGEM MOLECULAR E TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
I - INTRODUÇÃO
Atualmente é muito comum ouvirmos falar de clonagem em meios de
comunicação que atingem o grande público. É também bastante comum assistirmos a
discussões sobre ética e importância da clonagem entre pessoas que pouco sabem
sobre a parte técnica do que estão discutindo e, muitas vezes, também sabem pouco
sobre os objetivos dos pesquisadores com os experimentos que são mostrados de
forma sensacionalista na mídia. Esta situação acaba dificultando o julgamento final:
quem clona é do Bem ou do Mal?
O termo clonagem pode ser entendido como o processo de fazer cópias
exatas de um organismo ou de qualquer elemento. Portanto, quando dizemos que a
ovelha Dolly é um clone, queremos dizer que ela é uma cópia exata de outra ovelha.
Para obter este tipo de cópia, a clonagem é iniciada com células e, por esta razão, é
chamada clonagem celular.
O caso que vamos examinar, não consiste em fazer cópias de uma célula, mas
de uma molécula em particular. A clonagem de uma molécula (e não mais uma célula
ou um organismo) é chamada clonagem molecular, assunto deste texto. A molécula a
ser clonada é uma molécula de DNA. Além disto, o termo é utilizado, neste caso, não
mais para se referir a todo o processo de cópia da molécula, mas apenas à etapa
inicial de ligação do inserto no vetor. Vetor? Inserto? Ligação? Vamos por etapas.
Talvez isso já tenha aparecido antes por aí, mas vamos repetir.
Vetores são moléculas de DNA plasmidial (plasmídios) dupla-fita, circular,
que têm replicação independente da do DNA genômico da bactéria. Os plasmídios
são passados de geração para geração e podem ser facilmente introduzidos em
bactérias que não os contenham. Logo, se “grudarmos” um fragmento de DNA
(como, por exemplo, o gene que contém a informação para produção de insulina), em
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um vetor e o introduzirmos na bactéria, o gene da insulina passará a ser copiado
cada vez que o vetor é replicado. Os pesquisadores chamam os fragmentos
específicos de genes de insertos e o processo de “grudar” o inserto em vetores, de
ligação. O vetor que contém um inserto é chamado de vetor recombinante, ou então
de construção, e o processo de introduzir o vetor recombinante na bactéria, para
que ela o copie, é chamado de transformação bacteriana.
II – CLONAGEM MOLECULAR
Antes de clonarmos um gene, temos que obtê-lo em quantidade suficiente
para realizar o processo de ligá-lo ao vetor. Para a obtenção precisamos ter
informações sobre este gene: sua seqüência de nucleotídeos, organismos que o
contenham e tecidos em que é encontrado. A obtenção do gene ou do cDNA de
interesse (o nosso inserto) pode ser feita por PCR, RT-PCR ou outras técnicas
equivalentes, que são determinadas de acordo com o material de partida com o qual
estamos trabalhando. Se o material de partida é DNA podemos utilizar PCR; se é
RNA, temos que usar RT-PCR.
Às vezes clonamos genes com a intenção de expressá-los em um organismo.
Expressar um gene significa produzir a proteína que ele codifica. Quando estamos
trabalhando com genes de eucariotos e a intenção é utilizar estes genes para serem
expressos em bactérias, temos que levar em conta que estas, como procariotos, não
são capazes de distinguir exons de introns. Esta incapacidade leva as bactérias a
produzir uma proteína errada quando há introns presentes no gene que
pretendemos expressar. Nestes casos, o problema pode ser contornado clonando o
cDNA e não o gene inteiro. cDNA é uma seqüência de DNA obtida de uma
polimerização utilizando RNAm como molde e que, portanto, contém somente os
desoxirribonucleotídios correspondentes aos exons.
Após a obtenção do inserto, temos que ter em mãos o vetor já pronto para a
clonagem. Os vetores são plasmídios que recebem este nome porque transportam o
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inserto para dentro da bactéria. Na verdade, os vetores são plasmídios modificados
pelos cientistas para maximizar suas possibilidades de uso como ferramenta de
Engenharia Genética. Aos plasmídios foram adicionados alguns acessórios, como
sítios múltiplos de clonagem (SMC), cassetes de resistência a antibióticos,
marcadores para seleção e outros.
O sítio múltiplo de clonagem consiste em uma região que contém sítios para
várias enzimas de restrição, o que permite que este vetor possa ser aberto por
várias enzimas. É importante lembrar que para ligar duas moléculas de DNA que
tenham sido clivadas de forma coesiva é necessário que estas duas moléculas
tenham sido clivadas com a mesma enzima de restrição.
Cassetes de resistência a antibióticos são genes que codificam fatores que
bloqueiam a ação de antibióticos como, por exemplo, a enzima β-lactamase. Quando
produzida, esta enzima destrói os antibióticos que contém em sua estrutura um anel
β-lactâmico: penicilina, ampicilina e derivados. As bactérias que contêm este
cassete são capazes de crescer em meio contendo aqueles antibióticos. Isso nos dá
uma grande vantagem, pois permite que cultivemos bactérias em meio de cultura
contendo antibióticos e possamos selecionar somente aquelas que contenham os
vetores que nos interessam. Esta é uma estratégia explorada diariamente nos
laboratórios de pesquisa no mundo todo, evitando que bactérias do ar contaminem
experimentos.
Marcadores de seleção são genes que codificam enzimas, como a βgalactosidade, por exemplo, e que se localizam sobre o sítio múltiplo de clonagem
(SMC). Quando um inserto é clonado no SMC o gene da β-galactosidase é
interrompido e deixa de produzir a referida enzima. A β-galactosidase é uma
enzima que catalisa a conversão de substratos cromogênicos incolores em
compostos coloridos. Logo, adicionando estes substratos ao meio e observando se a
colônia bacteriana produz compostos coloridos podemos saber quais colônias na
placa contêm o vetor recombinante. Esta característica pode ser explorada para a
identificação de vetores que realmente receberam um inserto.
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Agora que já temos vetor e inserto, proceder à clonagem é uma estratégia
simples. Basta misturar os dois em proporções adequadas, adicionar a enzima DNA
ligase e incubar para que a ligação ocorra. Existem cálculos que levam em conta a
massa dos DNAs e seu tamanho em pares de base para saber a proporção exata que
deve ser utilizada de vetor e inserto em uma reação de ligação mas, na prática, uma
dose de empirismo acaba fazendo com que se deixe os cálculos de lado.
Após a reação de ligação temos que fazer cópias desta construção que tanto
trabalho nos deu e para isto utilizamos as bactérias.
III – TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
A transformação bacteriana é o processo de inserir um vetor, recombinante
ou não, em uma bactéria e recebe este nome porque geralmente quando realizamos
este processo estamos conferindo características novas à bactéria, como por
exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibióticos. A
bactéria com novas características é dita transformada.
Basicamente, existem dois procedimentos para realizar a transformação
bacteriana: a eletroporação e a transformação com cloreto de cálcio.
A eletroporação é uma técnica na qual se misturam bactérias e o vetor em um
único tubo e aplica-se um choque elétrico na mistura, com o objetivo de
desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor na bactéria. Ela é então
rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que possa se
recuperar após o choque.
A transformação com cloreto de cálcio tem o mesmo objetivo. As bactérias e
o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio e sofrem um choque
térmico. Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA e
da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no
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momento do choque térmico (que, portanto, tem a mesma função do choque
elétrico).
Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas
para que possam se multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio sólido, para que
colônias possam ser isoladas. A identificação das colônias recombinantes é feita
utilizando as características conferidas pelos plasmídios. Uma vez identificada a
bactéria que contém a construção de interesse dentre as várias plaqueadas, basta
transferir a colônia para meio líquido para que se obtenha milhões de cópias da
bactéria e, conseqüentemente, da construção.
PERGUNTAs SOBRE PLASMÍDEO E CLONAGEM MOLECULAR
1. Considerando os esboços de um plasmídeo e de um fragmento de DNA
abaixo, como seria possível clonar este DNA no plasmídeo?
Leve em conta que o fragmento de DNA foi isolado com os oligos 1 e 2. O
primer 1 foi desenhado com um sítio de BamHI e o primer 2 com sítio de
XhoI como adapatadores.
Fragmento de DNA
Seqüência do fragmento:
ACTAGTGGATATGACTGGTGGA
CAGCAAATGGGTCGGGATCTGT
ACGACGATGACGATAAGGATCC
AACCCTTATTTTTGTTCCGCAGA
AGACGCAGGTTGTGACAAAAGA
AGAGTCTGAAATTGGAGTGAAA
TTTGCGTTTCTCACACCCTCTC
GACCTCCTTGA
GTGGAT: sítio de Bam HI
GACCTC: sítio de Xho I
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2. Associar as expressões com as definições.
1 DNA ligase
A
Antibiótico que discrimina bactéria com plasmídeo
B
Fragmento de DNA a ser clonado.
C
Enzima cuja ação permite identificar bactérias
com inserto.
D
Região do plasmídeo com vários sítios de restrição.
E
Enzima que catalisa a ligação de duas
extremidades de DNA.
6 Ampicilina
F
Inserção de um gene no plasmídeo.
7 β galactosidase
G
Inserção do plasmídeo na bactéria.
2
Transformação
bacteriana
3 Inserto
Sítio múltiplo de
clonagem
Clonagem
5
molecular
4
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